JPH04504953A - ヒトリラキシンの単離のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトリラキシンの単離のための方法および組成物本発明は、タンパク質の単離の ための改善された方法および組成物、ならびに所望のタンパク質またはペプチド 、特にアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基を本質的に欠くヒトリラキシンなどの複数 鎖タンパク質の容易な単離を可能にする新規な遺伝子構築物に関する。

組換え法による所望のタンパク質の製造および単離、例えば遺伝子操作された配 列または単離された遺伝子配列を用いる方法は、最近の数年でかなり精巧なレベ ルにまで達した。事実、現在では真核および原核の両宿主を含む多種の宿主にお いて、いくつかの例を挙げれば例えば組換えヒトインターフェロン、ヒト成長ホ ルモン、またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を含む種々のタンパク質を 組換え法によって製造することが可能である［Ｍａｎｉａｔｉｓら、　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２） ］。さらに、ＤＮＡ配列をある関係位置から他の関係位置に移動または「操作」 するための方法、例えば配列をある組換えベクターまたは宿主から他のベクター または宿主に移動させるための方法は、現在では常法に基づいて達成することが できる。このような方法は、多数の重要な薬学的および生物工学的産物を、天然 環境においてこのタンパク質に通常伴われている物質を本質的に含まない形態で 製造することおよびそれを容易に入手することを可能にした。

残念なことに、一部のタンパク質はある種の困難を伴ってしか組換え法によって 発現されない。例えば、ある種のタンパク質、特にある種のタンパク質ホルモン 類は、通常、その細胞形成期の形態とは全く異なる成熟形態で存在し、プロセッ シング（一連の酵素の作　−用であることが多い）を必要とする。このようなタ ンパク質は、プレ、プロ、またはプレ／プロ形態で存在すると言われる。また、 このようなタンパク質のプロセッシングによって２またはそれ以上の別々のペプ チド鏑が生成する結果になることが多（、これら鎖の一方または両方が生物学的 活性を有していることもあり、また、これら自体が結合または架橋を形成して複 数鎖のタンパク質（例えば、インスリンまたはりラキンン）を与えることもある 。

このようなタンパク質を生成させる際に遭遇する主な問題は、プレおよびボスト 配列または内部に位置する配列を何らかの方法で除去して成熟タンパク質を得る ことが必要になることである。ある種の状況のもとでは、このような問題は、発 現されたタンパク質またはペプチドが真核宿主によって適切にプロセッシングさ れる真核発現系を使用することによって減少させるか、または最少化されている 。しかし、このようなインビボでのプロセッシングは必ずしも完全に信頼できる というものではない。このような場合には、それはプレまたはプロタンパク質物 質とともに残され、ご（わずかまたは低い固有レベルの生物学的活性を示すこと が多い。これらタンパク質をさらにプロセッシングする好都合な手段がないと、 これらは医学その他に用途がないかまたは最少の用途しかない。また、ある場合 には、さらに大量の発現産物をさらに経済的に製造しつる、細菌などの原核宿主 において組換え発現産物を製造するのが好ましい。

通常、翻訳後に例えば別々のタンパク質鎖に修飾されなければならないタンパク 質の例はヒトリラキシンである。リラキシンは、恥骨結合を拡張するその作用に よって出生過程を容易にするのに重要な役割を果たす哺乳動物ペプチドホルモン である［例えば、Ｈｉｓａｗ。

Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　２３：　６６１　（１９２６ ）を参照コ。リラキシンは、妊娠中の卵巣の黄体で合成されて貯蔵され、そして 分娩前に血流中に放出される。その主な生理学的作用は、雌性の分娩用生殖路の 調製に関係しているようである。これらの作用には、子宮頚管の拡張および軟化 、子宮収縮の抑制、および恥骨結合およびその他の骨盤結合の弛緩が含まれる。

妊娠動物の卵巣を利用して、ブタ［例えば、Ｓｃｈｗａｂｅら、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、７５：　５０３−５１０　（１９７７）； 　Ｊａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２６７＋　５４４−５４６　（１９７７）を参 照］、ラット［Ｊｏｈｎら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１０８：　７２６ −７２９　（１９８１）］、およびサメ［Ｓ（ｈｗａｂｅら、　Ｒｅｃ、Ｐｒｏ ｇｒ、Ｈｏｒｍ、Ｒｅｓ、　３４：　１２３−２１１　（１９７ｇ））由来のり ラキンンの単離およびアミノ酸配列決定が可能になった。さらに、組換えＤＮＡ 法によって、特にブタリラキソン［ＥＰＯ公開Ｎ　ｏ、　８６．６４９を参照］ およびヒトリラキシン［例えば、ＥＰｏ公開Ｎｏ、　１０１．３０９および米国 特許Ｎｏ、　２．７５８．５１６ヲ参照］ヲ含む種々のりラキシンのクローニン グおよび発現が可能になった。

上記およびその他の研究により、現在ではりラキシン分子［その最初の翻訳転写 体（プレプロリラキシン）およびプロセッシングされた成熟形態（リラキシン） の両方を含むコがインスリンの対応する形態に顕著な類似性を有していることが わかっている。例えば、リラキシンは初めに、Ｂ、ＣおよびＡ鎖暗号領域と呼ば れる３つの領域（通常はこの順に並ぶ）からなるプロホルモン配列とプレホルモ ン配列（小胞体におけるペプチドの排出と恐らくは折畳みにある役割を果たすも のと考えられる）を有する「プレプロ」形態で翻訳される。

プレプロリラキンンを翻訳後プロセッシングして成熟リラキシンを形成すること には、その天然の細胞環境においてプレ領域およびＣ領域ペプチドを酵素切断し て、システィン残基を介するジスルフィド結合ならびにＡ鎖目体中の鎖内ジスル フィド架橋によって結合したＢおよびＡ鎖ペプチドを残すことが関係している。

ヒトにおいては、リラキシンは、ヒトゲノムにおける２つの可能性ある遺伝子産 物に対応する２つの可能性ある形態［本明細書では、ＡｓｐｌまたはＨ２（ヒト ２）およびＬｙｓ、またはＨｌ（ヒト１）形態と呼ぶ］のどちらかで見い出され るのみである。両形態において、Ａ鎖はＡｓｐ残基を欠いている。しかし、Ｈ２ 形態のりラキシンＢ鎖は１個のＡｓｐ残基を位置１に含有しているが、Ｈ１形態 のリラキシンＢ鎖はＡｓｐ残基を位置４と５に含有している。

末端および／または内部ペプチドの除去によって太き（加工しなければならない 組換えタンパク質の単離に特に適合する組成物および方法に対する必要性が存在 していた。

臭化シアンによる切断用に融合連結点にメチオニル残基を含有する融合ポリペプ チドが、適当な微生物クローニング系から調製されている［例えば、米国特許Ｎ 　ｏ、　４．３５６．２７０（１９８２年１０月２６日発行）を参照コ。さらに 、融合タンパク質の切断用にタンパク質加水分解酵素の特異的な切断部位となる アミノ酸配列をコードしているリンカ−が考案されている［例えば、米国特許Ｎ ｏ、　４．７６９．３２６（１９８８年９月６日発行）を参照］。このような方 法は、真核細胞発現に対する別法を組換え法に与えるものである。

さらに、アスパルチル残基のペプチド結合の優先的な加水分解が希釈酸中で起こ り、ペプチド鎖の切断が得られることがわかっている［例えば、Ｌｉｇｈｔ、　 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、　Ｖｏｌ、ＸＩ、　ｐ、４１７−４２０　（１９６７）； 　Ｉｎｇｒａｍ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、、ｖｏｌ、ＶＩ、ｐ、８３１−８３４　（ １９６３）；　Ｉｎｇｌｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＰｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ中、　Ｂｉｒｒ編（Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅ ｄｆｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８０）、　ｐｐ、３２９−３４３；Ｉｎｇｌｉ ｓ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、９１．　３２４−３３２　（１９８３）；　５ｃｈｒｏ ｅｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２：　９９２−１００８　（１９６３ ）（特に、１００５頁の左欄）；および５ｃｈｕｌｔｚ、　！ｅｔｈ、Ｅｎｚ、 、　Ｖｏｌ、ＸＩ、　ｐ、２５５−２６３　（１９６７）を参照］。また、アス パルチル−プロリルのペプチド結合の優先的切断が希釈酸中で起こることもわか っている［Ｍａｒｃｕｓ、　ＩｎｔＪ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｒ ｅｓ、　２５：　５４２−５４６　（１９８５）：　Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚら 、ＢｉｏｃｈｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗｓ、４０：　１１７３−１１ ７８　（１９７０）；　Ｊａｕｒｅｇ、ｕｉ−＾ｄｅｌｌおよび１ｌａｒｔｉ、 ＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６９：　４このＪ　ａｕｒｅｇｕｉ−Ａｄｅｌ、 １の論文は、強力な変性物質の存在下でＡｓｐ−Ｐｒｏ結合を切断して相応の収 量を得ることを示唆している。Ｌ　ａｎｄ。

ｎの概説論文は、あるタンパク質の収量を増加させ他のタンパク質の収量は増加 させないためには塩化グアニジニウムの使用が必要であることを開示している。

Ｉ　ｎｇｌｉｓらの論文の３３８頁には、アスパラギン酸残基の周囲の環境およ びアミノ酸配列における変異が切断収率に影響を及ぼすこともあることが示唆さ れている。タンパク質の優先的かつ選択的な切断および修飾に関する全ての非酵 素法の詳細な概説については、Ｗｉｔｋｏｐ［Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ａｎｆｉｎｓｅｎら編、Ｖｏｌ、１６　（Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９６１）、　ｐｐ、２２１ −３２１コの特にアスパラギン酸切断に関する２２９−２３２頁を参照。

Ｕ　Ｋ　２．１４２．０３３は、適切な融合連結点において操作されたＡｓｐ残 基を有する融合タンパク質の変異体の希釈酸処理による、ＩＧＦ−■とプロティ ンＡの融合タンパク質の切断を開示している。

このような知見にもかかわらず、組換えタンパク質（特に、中央部および末端ペ プチドの除去によって大きくプロセッシングされなければならないタンパク質） を高収率で製造および単離するための改良法、ならびに、組換え産物をさらに望 ましい形態に再構成するための（例えば、発現用にさらに望ましい構造を有する さらに多量のペプチドを製造するための）改良法に対する必要性がなお存在して いる。

これらの必要性を認識した上で、本発明の一般的な目的は、タンパク質またはペ プチドをコードしているＤＮＡ配列を製造するための改良された組換え法および 組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、遺伝子操作された組成物を用いて所望のタンパク質を製造 するための改良法を提供することである。

本発明のさらに具体的な目的は、組換えリラキシン、特にヒトリラキシンを得る ための改良法を提供することである。

即ち、本発明は、ポリペプチドをポリペプチド切断産物に切断するための方法で あって、ポリペプチド切断産物の間の所望の連結点においてポリペプチドを切断 するための条件下で、還元された遊離システィン型のポリペプチドを切断物質で 処理することからなる方法に関する。

さらに具体的な態様においては、本発明は、ポリペプチドをポリペプチド切断産 物に切断するための方法であって、以下からなる方法を提供するものである： （ａ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有する細胞を培コードしてい るＤＮＡ配列の間の連結点に存在しており、この培養によってＤＮＡが発現して 宿主細胞培養物中にポリペプチドが産生される結果になる）：そして （ｂ）　Ａ　ｓｐ連結点でポリペプチドを切断するための条件下で、還元された 遊離システィン型のポリペプチドをｐＨが約１〜３の酸で処理する。

工程（ａ）の前に、細胞を、この細胞が認識するコントロール配列に機能的に結 合させた該ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換するのが好ましい。追加す るに好ましい工程には、宿主細胞培養物からのポリペプチドの回収とこの回収し たポリペプチドの酸処理前の非酸化雰囲気下での維持、酸処理後の少なくとも１ つのポリペプチド切断産物の分離と単離、およびこの単離した切断産物と別のペ プチジルフラグメントまたは成分（例えば、このポリペプチドの切断産物）の混 合が含まれる。

別の態様においては、本発明は、以下からなる方法を提供するものである： （ａ）ポリペプチドを還元条件下に供し、それによってポリペプチドのシスティ ン残基がジスルフィド結合しないようにし：そして（ｂ）ポリペプチド中の予め 決めたペプチド結合を加水分解する。

さらに別の態様においては、本発明は、生物学的に活性なヒトリラキシンの製造 方法であって、以下の工程からなる方法を提供するものである： （ａ）ヒトリラキシンＡ鎖を構成するポリペプチドをコードしているＤＮＡを含 有する発現ベクターを得（ここで、ＡｓｐコドンはＡ鎖の一方または両方の末端 に導入されており、ＤＮＡは宿主細胞によって認識されるコントロール配列に機 能的に結合している）；（ｂ）適当な宿主細胞を該ベクターで形質転換し：（ｃ ）　Ｄ　Ｎ　Ａが発現されるように該形質転換細胞を培養して、該リラキシンＡ 鎖を構成するポリペプチド配列を産生させ；（ｄ）該培養物からポリペプチドを 回収し：（ｅ）還元された遊離システィン型の回収ポリペプチドを、Ａｓｐ連結 点でこのポリペプチドを切断する条件のもと、ｐＨが約１〜３の酸で処理して切 断産物を得： （ｆ）該切断産物を分離し：そして （ｇ）該Ａ鎖をヒトリラキシンＢ鎖と結合させて生物学的に活性なヒトリラキシ ンを得る。

他の態様においては、本発明は、切断されるのが所望であるポリペプチドをコー ドしている核酸を得るための方法であって、アミノ酸配列： Ｘ、−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、ＸはＰｒｏ、Ａｌａ、　Ｓｅｒ、　ＧｌｙｌまたはＧｌｕのいずれか であり、ＹはＡｌａＸＳｅｒ、またはＧｌｙであり、モしてｎはＯまたはそれ以 上であるコ をコードしているコドンを所望の切断点に導入することからなる方法を提供する ものである。

さらに具体的な態様においては、本発明は、Ｃ鎖およびＡｒ４からなる前駆体ヒ トリラキシンの変異体をコードしている核酸を得るための方法であって、配列： 　Ｘ、−Ｙ−［ここで、Ｘ、Ｙおよびｎは上記定義に同じである〕、好ましくは Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｌａをコードしているコドンをＣ鎖 のＣ−末端に導入し、そしてＣ鎖とＡ鎖の間にＡｓｐのコドンを挿入することか らなる方法を提供するものである。

さらに本発明によって提供されるのは、切断されるのが所望であるポリペプチド をコードしている核酸であって、アミノ酸配列：Ｘ、−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、Ｘ１Ｙおよびｎは上記定義に同じである］を所望の切断点にコードし ている核酸である。

さらに具体的な態様においては、Ｃ鎖およびＡ鎖からなる前駆体ヒトリラキシン の変異体をコードしている核酸であって、配列：Ｘ。

−Ｙ［ここで、Ｘ、Ｙおよびｎは上記定義に同じである］、好ましくはＳ　ｅｒ 　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｌａをコードしているコドンをＣ鎖のＣ−末 端に含有し、そしてＣ−とＡ鎖の間にＡｓｐのコドンが挿入された核酸が提供さ れる。

さらに本発明に含まれるのは、上記核酸を含有する発現ベクターおよび該ベクタ ーで形質転換された宿主細胞である。

さらに本発明に意図されているのは、切断されるのが所望であるポリペプチドで あって、アミノ酸配列：Ｘ、−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、Ｘ、Ｙおよびｎは上記定義に同じであるコを所望の切断点に含有して いるポリペプチドである。

さらに具体的な本発明の態様は、Ｃ鎖およびＡ鎖からなる前駆体ヒトリラキシン の変異体であって、配列：Ｘ、、−Ｙ［ここで、Ｘ％Ｙおよびｎは上記定義に同 じである］をＣ鎖のＣ−末端に有しく好ましくは、Ｃ鎖の４個のＣ−末端アミノ 酸がＳ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−、Ａ　ｌａで置換されている）、モ してＣ鎖とＡ鎖の間にＡｓｐ残基が挿入された変異体である。

本発明は、所望のタンパク質、タンパク質鎖またはさらに小さいペプチドをイン ビトロで合成およびプロセッシングするための改良法を提供することによって上 記の問題を解決することに関する。ある態様では、本発明は、ＤＮＡ分子のタン パク質をコードしている領域中へのＡｓｐ残基コドンの特別の配置を利用し、こ のコドンが該領域とともに「突然変異」タンパク質中に発現される。次いで、還 元条件を用い、さらに穏やかな酸を使用するタンパク質切断法を用いて還元化タ ンパク質のＡｓｐ残基のアミノ部分およびカルボキシ部分の両方で特異的に切断 し、Ａｓｐ残基に隣接するペプチジル領域を個々に切断する。

この方法の具体的な使用の１つは、ジスルフィド結合によって互いに架橋したＡ およびＢペプチド鎖として天然に比較的高活性型で存在する「複数鎖」タンパク 質（ヒトリラキシンなど）の生成においてである。このような態様においては、 一方のペプチド鎖をコードしているＤＮＡ配列を、１またはそれ以上のＡｓｐコ ドン（ＧＡＴまたはＧＡＣ）によって、他方の鎖をコードしている配列から分離 するように遺伝子操作する。即ち、このような突然変異タンパク質をせることが できる。このＡ鎖を実質的に純粋な形態で単離し、Ｂ鎖とインビトロで再構成し てさらに天然に近いタンパク質を得るのは容易である。

本発明方法の使用によって、最大の切断特異性でもって産物の収量の増加が得ら れる。

勿論、本発明の利用は小さなそして／または複数鎖のペプチドに関係した利用に 限定されるものではなく、他の多数の利用が本明細書に照らして当業者に明らか になるであろう。

図１は、多数の現在既知のりラキシン構造のアミノ酸配列を比較するものである 。明らかに保存されている残基を筒中に囲んだ。

図２ＡおよびＢは、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐ（図２Ａ）およびｐ ＴＲ４１１（図２Ｂ）中のＨ２プロリラキシン遺伝子挿入体のタンパク質配列お よびそのＤＮＡ配列を示すものである。

図３は、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌの構築を図式的に示すものである。

図４は、プラスミドｐＦ　Ｅ　ｐｒｏＨ２の構築を図式的に示すものである。

図５は、プラスミドｐＴｒｐＳｔＩ工ＰｒｏＲｅｌの構築を図式的に示すもので ある。

図６は、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐの構築を図式的に示すものであ る。

図７は、プラスミドｐＴＲ３９０−７の構築を図式的に示すものである。

図８は、プラスミドｐＴＲ４００−２０の構築を図式的に示すものである。

図９は、ｐＴＲ３９０−７、ｐＴＲ４００−２０およびｐＴｒｐＰｒｏＲｅＩＡ ｓｐのフラグメントからのプラスミドｐＴＲ４１１の構築を図式的に示すもので ある。

図１０は、プラスミドｐＴＲ５４０−２の構築を図式的に示すものである。

図１１は、プラスミドｐＴＲ５５０−８の構築を図式的に示すものである。

図１２は、ｐＴＲ５４０−２およびｐＴＲ５５ｏ−８のフラグメントからのプラ スミドｐＴＲ５６１の構築を図式的に示すものである。

図１３は、ｐＴＲ５６１およびｐＢＲ３２２のフラグメントがらのプラスミドｐ ＴＲ６０１の構築を図式的に示すものである。

図１４は、プラスミドｐＤＨ９８およびｐＤＨ９９の構築を図式的に示すもので ある。

図１５は、プラスミドｐＤＨ１００およびｐＤＨｌｏｌの構築を図式的に示すも のである。

本明細書で用いる「ポリペプチド」なる用語は、切断しようとする２またはそれ 以上のポリペプチド成分を有するポリペプチド（融合タンパク質など）を指す。

このようなポリペプチドには、ある種の困難を伴ってしか組換え法によって発現 されない一部のタンパク質が含まれる。例えば、ある種のタンパク質、特に一部 のタンパク質ホルモン類は、天然においてはそれらの細胞形成期形態とは全く異 なる成熟形態で存在し、一連の酵素の作用によることが多いプロセッシングを必 要とする。このようなタンパク質はブレ、プロまたはプレプロ形態で存在すると 言われ、このようなタンパク質にはりラキシンおよびインスリンが含まれる。通 常、このようなタンパク質のプロセッシングによって、２またはそれ以上の個々 のペプチド鎖（成分）が生成する結果になる・それらの１つまたは全てが生物学 的活性を有するか、またはそれら自体が結合または架橋を形成して複数路のタン パク質を与えることもある。さらに、本明細書におけるポリペプチドは、酸化さ れた状態にあるときにはジスルフィド結合を有する。本発明における好ましいポ リペプチドは、適当な切断物質によっては切断しようとする成分の間゛の所望の 連結点のところで容易に切断されないポリペプチドである（ジスルフィド結合し ているために切断部位に接近することができないため、非特異的切断または自己 切断のため、あるいはＡｓｐ残基の周囲のアミノ酸環境のためであると否とを問 わない）。また、好ましいポリペプチドは、複数鑓を含むポリペプチドであって その内部配列が切断物質によって認識されるかまたは作用される切断部位を含有 していないポリペプチドである。例えば、切断物質が酸であるときには、ポリペ プチド成分（「切断産物」）それ自体は、所望の切断に干渉する（即ち、悪影響 を及ぼすか、または阻害する）であろうアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基（または 、アスパラギン残基などの干渉する可能性のある他の残基）を含まないものであ るのが好ましい。より好ましくはこれら成分は内部のＡｓｐ残基を含まないもの であり、最も好ましくはＡｓｐ残基を完全に欠（ものである。

Ａｓｐ残基を欠く多数の生物学的に活性なポリペプチドが当分野で知られている 。例示のためにＡｓｐ残基を欠くタンパク質を挙げると、成長−変調ペプチド、 好酸球遊走因子、タフトシン、カイネチンシン、オキシトシン、ゴナドリベリン 、ゴナドトロピン放出ホルモン、ニューロテンンン（ラン）、ボンベシン、フィ ブリノペプチドＡ（イヌ）、モチリン（ブタ）、好中球走化ペプチド、Ｂ−エン ドルフィン、アリテシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、サ ブスタンスＰ１リドリン、チロトロピン放出ホルモン、カリクレイン、内因子− 胃液、カルシトニン（ブタ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｂ、　ｓｔｅａｒ ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロインスリン（ブタ）、およびインターフェ ロン−γ誘導のタンパク質前駆体が含まれる。

通常、切断されるべきポリペプチドはこの目的に望ましい任意のポリペプチドで あるが、ある好ましい態様においては、酸切断に向けられたポリペプチドは後記 でさらに定義するような増強された切断部位を含み、これらには前駆体ポリペプ チド、例えばプレプロ、プロもしくはプレ形態、または増強された切断部位を含 有する突然変異の前駆体ポリペプチドが含まれる。これらの中でより好ましいの は、プロリラキシン、ブレブａリラキシン、プレリラキシン、プロインスリン、 プレプロインスリン、プレインスリン、または生物学的に機能的なそれらの類似 体である。さらに好ましいのは、ヒトプレプロまたはプロリラキシンである。本 発明において最も好ましいポリペプチドはＨ２ブロリラキシンである。Ｈ２プロ リラキシン配列に対して最も好ましい配列は、Ａ鎖の２４残基、Ｃ鎖の１０８残 基、およびＢ鎖の最初の２９アミノ酸を含有する配列、即ちヒト血清および黄体 において天然に見い出されるリラキシンの形態であ動物リラキンンのいずれか、 またはこのようなりラキシンの生物学的に機能的な類似体を意味する。即ち、リ ラキシンおよびリラキシンの生物学的に機能的な類似体とは、出生過程を容易に するのに作用を有する機能的タンパク質を意味する。生殖道の変形には、子宮頚 管の成熟化：妊娠子宮内膜が厚（なること、ならびにこの領域の血管新生の増加 ：および、コラーゲン合成に及ぼす作用などの生理学的作用が含まれるものと理 解されている。リラキシンは雌性の胸部にも見い出されており、乳汁分泌に関係 しているものと考えられている。さらに、リラキシンは精液中にも見い出されて おり、精子の移動を増強する際の役割が示唆されている。また、結合組織にその 作用が与えられると、リラキシンは皮膚の伸縮性の改善にある役割を果たすもの と考えられている。

リラキシンの「生物学的活性」の測定法は当分野で広く知られており、これらに は平滑筋もしくは子宮収縮の測定、恥骨結合の弛緩の測定、または環状ＡＭＰの 測定が含まれる［例えば、ＥＰ公開Ｎｏ。

２５１、６１５（１９８８年１月７日公開）を参照コ。

本明細書で用いる「導入」なる用語は、Ａｓｐコドンを含む別のコドンもしくは コドン群をＤＮＡ配列中に導入すること、または既存のコドンを変化または突然 変異させてＡｓｐコドンを得ることを意味する。このようにして、タンパク質配 列中に、所望のタンパク質またはペプチドを含有し、そのアミノ末端、カルボキ シ末端またはそれらの両末端に隣接して少なくとも１つの追加のＡｓｐ残基を含 有する配列の突然変異タンパク質が得られる。次いで、これらの突然変異タンパ ク質種を穏やかな酸処理によって切断して所望のタンパク質を放出させることが できる。

本明細書で用いる「還元された遊離システィン型」なる用語は、還元された状態 にある、即ち、所望の特定部位における選択的切断に干渉するであろうシステイ ニル残基のジスルフィド結合を含有しないポリペプチド形態を意味し、さらに、 ジペプチドを含むジスルフィド結合を含有する他のポリペプチドの存在を排除す る形態を意味する。例えば、プロリラキンンは、ジスルフィド架橋によるジシス テイニルペプチドが存在することなく還元された状態で維持される。このような ペプチドは、プロリラキシンが還元状態に維持されているときであっても切断に 干渉する。従って、このようなペプチドは、切断物質による処理のための反応混 合物中に存在していることができない。ポリペプチドをその還元された形態に維 持し、そうしてポリペプチドを本明細書で用いる語句である「還元条件のもとて 」得るためには、このポリペプチドを含有する緩衝液中に還元物質（例えば、β −メルカプトエタノール）を添加すること、またはこのポリペプチドを含有する 容器の脱ガスを含むあらゆる方法を用いることができる。ジチオトレイトールは この目的には使えない。しかし、ポリペプチドを非酸化雰囲気の条件のもとで、 即ち非オキシダントガス、例えばヘリウム、アルゴン、ネオンもしくはクリプト ン、または窒素から選ばれる不活性ガスの存在下で維持するのが好ましい。

本明細書で用いる「切断物質」なる用語は、ポリペプチドを特異的に切断して所 望のようにその遊離成分を放出させるのに用いる試薬を意味する。本発明におけ る適切な切断物質には、セリンプロテアーゼ類、ユビキチンヒドロラーゼ類、ク ロモトリプシン、トリプシン、ブドウ球菌プロテアーゼもしくはスブチリシンま たはその突然変異体などの酵素類、ならびに有機もしくは無機酸、ヒドロキシル アミン、Ｎ−ブロモスクシンイミドおよび臭化シアンなどの化学試薬が含まれる 。種々のタンパク質加水分解酵素によって触媒されるペプチド結合の加水分解は 、以下の文献に教示されている：　Ｔｈｅ＾ｃａｄｅｒｎｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 １９７６）：　Ｄｒａｐｅａｕ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３：　５８ ９９−５９０１（１９７８）およびＤｒａｐｅａｕ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ ｌ、　４７：　８９−９１　（１９７７）。化学試薬を広範囲に挙げるものとし ては、ｆｉｔｃｏｐのＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔ ｒｙ（上記）中の２２６頁の表ＩＩＩなどを参照。さらに、ｆａｎｇおよびＹｏ ｕｎｇ［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９１：　６９６−６９９　（１９７８） コの教示のようにＡｓｐ残基を修飾してトリプシン切断を誘導することができ、 また、Ｒｕｔｔｅｒの米国特許Ｎｏ、　４．７６９．３２６（１９８８年９月６ 日発行）　ｉ：：　教示（Ｄ切断ヲ用いることもできる。本発明において適切な 他の切断物質は、切断のための所望の連結点、および試薬が還元形態のポリペプ チドに作用しつるか否かを考慮することにより専門家には明らかであろう。

本明細書で用いる「希釈酸」なる用語は、そのＤＫ、に依存するであろうモル濃 度を有する酸を意味する。必要な酸濃度は、Ａｓｐ残基のところでポリペプチド を切断するに十分であるが、切断が望ましくない他の残基のところで切断するに は十分ではない濃度である。

通常、この濃度は約１〜３のｐＨが得られる濃度である。適当な酸の例には、有 機および無機酸の両方、例えばクエン酸、ギ酸（不溶性ペプチド用）、ンユウ酸 、酢酸、硫酸、および塩酸などが含まれる。より好ましい酸は酢酸、塩酸および 硫酸であり、最も好ましい酸は酢酸である。代表的なプロトコールでは、発現さ れたタンパク質を、約０．１〜１．０Ｍのオーダーの酢酸を用いて約９０〜１２ ０℃で約４〜２４時間処理する。

「穏やかな加水分解条件」なる用語は、所望のペプチド結合だけが加水分解され る結果になる切断条件を意味する。即ち、加水分解条件は所望の部位での十分な ペプチド結合切断に相応するものでなければならず、アスパラギン酸残基での酸 切断のためにはｐＨは約１〜３であるのが好ましい。

１、ＤＮＡ配列への切断認識コドンの導入切断過程のためには、本発明に従って 製造するように所望のポリペプチドを選択したときに、所望のタンパク質の遺伝 子配列を変化させて、適当な単一部位または複数部位での切断物質による認識に 必要なコドン（群）を導入することが必要どなるであろう。所望のポリペプチド がその配列内にそのような残基を有していないときには、通常、所望のポリペプ チドをコードしている配列の上流に、好ましくは５−末端コドンに隣接して（こ の場合、所望のペプチドのカルボキン末端は予想翻訳産物のカルボキシ末端でも ある）、所望のポリペプチド成分の下流に、好ましくはカルボキシ末端コドンに 隣接して（この場合、所望のポリペプチドのアミノ末端は予想翻訳産物のアミン 末端でもある）、またはその両方に（この場合、単離しようとする所望のポリペ プチド成分は予想翻訳産物の内部ポリペプチドである）、適当なコドンを挿入す ることが必要となるであろう。

勿論、予想翻訳産物が切断物質によって認識される内部または末端残基を天然に 含んでいるときには、通常は、単離しようとする領域の上流または下流であって かつその領域に隣接する位置に該残基をコードしているコドンを１つだけ導入す ることが必要になるであろう。即ち、例えばポリペプチド成分がそのアミノ末端 領域（即ち、アミノ末端側の半分）またはそのカルボキシ末端領域（即ち、カル ボキン末端側の半分）内にＡｓｐ残基を含有しているときには、通常は、最終的 に調製しようとしているペプチジル領域に依存して、それぞれカルボキシ末端ま たはアミン末端の上流かつ隣接してＡｓｐ残基を導入するのが望ましいであろう 。

酸による認識のための切断部位は、配列：Ｘ、−Ｙ−Ａｓｐ Ｅ配列中、ＸはＡｌａ、　５ｅｒＳＧｌｕ、　Ｐｒｏ、またはＧｉｙのいずれか であり、ＸはＡｌａ、　Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、モしてｎは０またはそれ 以上である］ などの切断を増強する配列であるのが好ましい。このような配列の例には、Ｓ　 ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｐｌおよびその保存性のアミノ酸 置換体、例えばＡ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｐ、　Ｓ　ｅ ｒ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ、　５ｅｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−３ｅ ｒ−Ａｓｐなどが含まれる。

後記の実施例においては配列Ｓ　ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓ ｐを選んだが、これはこの配列が極めて容易に切断されることがわがっているヒ ト上２リラキシンのＣ鎖の内部配列であるためである。即ち、好ましい態様にお いては、Ｃ鎖の４個のＣ−末端アミノ酸が配列Ｓ　ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ａ　１ａ− Ａ　ｌａ−をコードしているコドンで置換され、がっＣ鎖がＡｓｐ残基を介して Ａ鎖に結合している前駆体ヒトＨ２リラキンンの変異体を調製する。しかし、ヒ トリラキシンのＢ鎖およびＣ鎖が担体ポリペプチドであり、ヒトプロリラキシン に由来するポリペプチド以外のポリペプチドを上記のような増強された酸切断部 位を介してヒトリラキシンＡ鎖に結合させうることは理解されよう。

別の好ましい態様においては、Ａｓｐコドンによって隔てられた複ＮＡを構築す ることによって、いくつかのポリペプチド鎖（例えば、ヒトリラキシンＡ鎖）を 同時に調製する。このような複数鎖セグメントは、好ましくは、配列： Ｘ　、−Ｙ−Ａｓｐ−（ｐｐｔ）−［Ａｓｐ−Ｘ　、−Ｙ−Ａｓｐ−（ｐｐｔ） コ。

［配列中、ｐｐｔはポリペプチド切断産物（ポリペプチドの所望のペプチド結合 の切断によって得られるポリペプチド成分）であり、ｍは０またはそれ以上であ り、そしてｎ、ＸおよびＹは上記定義に同じである］ を有している。好ましくは、ｍは１またはそれ以上であり、より好ましくは２ま たは３であり、ｎは０〜１０であり、より好ましくは約３である。また、好まし いポリペプチド切断産物はＡｓｐ残基を含まないものであり、より好ましくはり ラキシンのＡ鎖であり、最も好ましくはヒト上２リラキシンのＡ鎖である。この 鎖セグメントは、最も好ましくは、配列・ ５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＲｌｘＡ−［Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ｅ ｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＲｌｘＡコ。

［配列中、ｍは上記定義に同じであり、最も好ましくは２または３であり、そし てＲＩＸＡはりラキシンのＡ鎖であり、最も好ましくはヒト上２リラキシンのＡ 鎖である〕 を有している。

コドンの挿入または既存コドンを変化させることによってＤＮＡ配列の選択した 領域中に１またはそれ以上の特定のコドンを導入することは、当分野で周知の方 法を用いて容易に達成される。このような方法の１つは、部位指向性のインビト ロの突然変異誘発と呼ばれている［Ｂｏｌｌｅｒら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、　１０：　６４８７−６５００　（１９８２）］。この方法においては 、Ｍ１３ファージ系を用いて出発ＤＮＡ配列の１本鎖鋳型を調製する。次いで、 短い１本鎖のプライマー配列（通常は長さが約１２〜１００ヌクレオチド）を合 成によって調製する［例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、１４：　５３９９−５４０７　（１９８６））のＨ−ホスホネート法によ って］。この合成によって調製したプライマーは、突然変異ＤＮＡに望ましい配 列を含んでいるであろう。即ち、このプライマーは鋳型に相補性のＤＮＡ配列を コードしているが、所望の置換点（群）に所望のコドン（群）をも含んでいる。

このプライマーを鋳型とアニーリングした後、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大 腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、フレノウフラグメント）を用いてプライマーを延長し て、一方の鎖が元の配列を有し、他方の鎖が所望の「突然変異した」配列を有す る２本鎖のＤＮＡ分子を得る。

次いで、この構築物を用いて適当なＭ１３宿主（例えば、大腸菌ＪＭＩ０１）を 形質転換すると、一部の子孫は所望の「突然変異した」配列を有し、一部の子孫 は元の出発配列を有するであろう。次に、突然変異配列を有する子孫を常法によ って選択することができる。次いで、この単離した構築物を、結果としての突然 変異タンパク賀を適当な宿主において発現させるのに望ましいように操作するこ とができる。

所望のコドン（群）を導入するのに用いることができる他の方法は、単純な制限 酵素フラグメント置換によるものである。この方法を実施するためには、通常、 変化させようとする遺伝子領域を包含する唯一の制限フラグメントを最初に同定 するのが望ましい。このことは常法であり、操作しようとする配列の周囲の制限 部位の位置の知識が必要になるだけである。既知のＤＮＡ配列がら、最も簡単に は配列を酵素特異性の一覧表と比較するコンピュータープログラムの使用によっ て、制限部位を確認する。次いで、この既知の制限地図から、所望のコドン（群 ）を挿入すべきＤＮＡ領域を包含するフラグメントを同定しなければならない。

このフラグメントは、フラグメントをベクターから遊離するように消化するとき に、ベクターの残りの部分が無傷のままであるという意味において「唯一」であ るのが好ましい。しかし、操作しつる長さの唯一のフラグメントは入手できない か、または実行不可能であることも多い。このような場合には、通常、最も少な いベクター断片化の結果になるフラグメントを使用するのが望ましいであろう。

次いで、元の配列を有してはいるが、適当な点に導入された所望のコドン（群） を有する対応する置換２本鎖ＤＮＡを、通常は合成によって調製する。この突然 変異配列を有する置換フラグメントは、適当な制限「接着末端」（または、場合 によっては平滑末端）を有するように調製して、この突然変異フラグメントが消 化された遺伝子配列とアニーリングして切開された部分を容易に置換するように するのが好ましい。この合成フラグメントをベクターフラグメントとアニーリン グさせて元のフラグメントを有効に置換した後、適当な宿生細胞を形質転換し、 選択する。

このような残基の導入に用いた方法に関係なく、適当なコドン挿入を有する突然 変異ＤＮＡ配列が得られ、次いでこの配列を原核または真核を問わず適当な宿主 において発現させることができる。本明細書に開示したベクターおよび方法は、 原核および真核生物の広い範囲にわたる宿主細胞において使用するのに適してい る。

２　代表的なりローニング系および方法通常、原核生物がＤＮＡ配列のクローニ ングおよび本発明で有用なベクターの構築に好ましいのは勿論のことである。例 えば、大腸菌に１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．、４４６）およびその誘 導体である大腸菌ＭＭ　２９４　ｔｏｎ、Ａ　［Ｔ　１フアージに耐性であり、 通常はＥＰ　１８３．４６９（１９８６年６月４日公開）に記載のプロトコール を用いる形質導入によって得られるコは特に有用である。使用することができる 他の微生物株には、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ　１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、　３ １．５３７）などの大腸菌株が含まれる。Ｍ１３ファージクローニングの場合に は、通常の好ましい宿主は大腸菌ＪＭＩＯＩである。また、原核生物を発現のた めに用いることもできる。上に挙げた菌株、ならびに大腸菌株Ｗ３１１０（Ｆ− １λ、原栄養株；　ＡＴＣＣＮｏ、　２７．３２５）、バシラス種、例えばＢ　 ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ、およびその他゛の腸内細菌、例えばＳａｌ ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳ　ｅｒｒａｔｉａ　ａ＋ａｒ ｃｅｓａｎｓ、および種々のシュードモナス種を用いることができる。発現およ びその他の目的に多数の細菌株が周知であり、当業者に広く利用されているので 、勿論、ここに挙げた例は限定のためのものではなく、例示のだめのものである 。

通常、宿主細胞に適合する種から導かれるレプリコンおよびコントロール配列を 含有するプラスミドベクターをこれら宿主と組合せて用いる。このベクターは、 複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を可能にするマーカ ー配列を担持しているのが普通である。例えば、大腸菌は、大腸菌種から導いた プラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換するのが普通である［Ｂｏｌｉ ｖａｒら、蝕匹２　：　９５　（１９７７）］。ｐＢＲ３２２はアンピシリンお よびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しており、従って形質転換細胞 を同定するための容易な手段を与える。また、ｐＢＲ３２２プラスミドまたはそ の他の微生物プラスミドは、自身のタンパク質を発現させるために微生物が利用 することができるプロモーターを含有しているか、または含有するように修飾し なければならない。組換えＤＮＡ構築において最も普通に用いられるプロモータ ーには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターが 最も普通に用いられるものであるが、他の微生物プロモーターが発見され、利用 されており、そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されており、 当業者はこれらをプラスミドベクターに機能的に連結することができる［５ｉｅ ｂｅｎｌｉｓｔら、　Ｃｅ１ｌ　２０　＋　２６９　（１９８０）］。

原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物を用いることもできる。ｓ　ａｃ ｃｈａｒｏｒＡｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通常のパン酵母が真核微 生物のなかで最も普通に用いられるが、他の多数の菌株も普通に用いることがで きる。通常、Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現させるためには、（１９８ ０）］が用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠 く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４．０７６またはＰ　Ｅ　Ｐ　４ −１　［Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５　：　１２　（１９７７）］の ための選択マーカーを与えるｔｒｐ　１遺伝子を既に含有している。次いで、酵 母宿主細胞ゲノムの性質としてｔｒｐ　ｌ欠損が存在すると、トリプトファンの 非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境が得られる。

酵母ベクターにおける適当な促進配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼの ためのプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５ ５　：　２０７３　（１９８０）］、またはその他のグルコース分解酵素、例え ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキ ソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコ ース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピル ベートキナーゼ、トリオセホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメ ラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプロモーター［Ｈｅ５ｓら、　Ｊ、Ａｄｖ 、ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、ヱ：　１４９　（１９６ｇ）　；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：　４９００　（１９７８）］が含まれる。

また、適当な発現プラスミドを構築する際には、これらの遺伝子と結合した終止 配列を、発現ベクター中の発現させることが所望である配列の３°に連結して、 ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を得る。増殖条件によってコントロールさ れる転写の別の利点を有しているその他のプロモーターは、アルコールデヒドロ ゲナーゼ２、イソチトクロムＣ１酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵 素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびに マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である［ Ｈｏ１ｌａｎｄ　；上記コ。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終止 配列を含有するあらゆるプラスミドベクターが適している。

微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主として用いることもできる 。原理的には、を推動物または非を推動物の培養物の由来を問わず、そのような 任意の細胞培養物が使用可能である。

胞の増殖（組織培養）は最近の数年で常法となった［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ。

＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１ ９７３）］。そのような有用な宿主セルラインの例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ 細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルライン、ならびにＷ２Ｂ５ 、ＢＨＫ、ＣＯ５−７、およびＭＤＣＫセルラインである。通常、このような細 胞のための発現ベクターは、必要なら、複製起点、発現させようとする遺伝子の 前に位置するプロモーターを、任意の必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプラ イス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列と共に含有している。

哺乳動物細胞において用いるためには、発現ベクター上のコントロール機能はウ ィルス供給源から得ることが多い。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポ リオーマ、アデノウィルス２から、そして最も多くはサルウィルス４０（ＳＶ４ ０）から得られる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、これら がＳＶ４０ウィルス複製起点をも含有するフラグメントとしてこのウィルスから 容易に得られるので特に有用である［ＦｉｅｒＳら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７３　 ：　１１３　（１９７８）］。また、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウィルス複製起点 中に位置するＢｇＩＩ部位まで伸びる約２５０ｂｐの配列が含まれているなら、 もつと小さいか、またはもっと大きいＳＶ４０フラグメントを用いることもでき る。さらに、プロモーターまたはコントロール配列が宿主細胞系に適合するなら 、所望の遺伝子配列に通常は結合しているプロモーターまたはコントロール配列 を利用することができるし、また、それが望ましいことも多い。

複製起点は、外来の起点を含むようにベクターを構築することによって、例えば ＳＶ４０もしくは他のウィルス（例えば、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）供給源から導くことによって得ることができるし、また、宿主細胞の 染色体複製機序によって得ることができる。ベクターが宿主細胞染色体に組込ま れるときには、後者が十分であることが多い。

以下に説明する例は、ｔｒｐプロモーター系を用いる大腸菌の使用を説明するも のである。しかし、同様の方法を用いて別の原核または真核宿主細胞培養におい て所望のタンパク質配列を発現させるための発現ベクターを構築することは当業 者の十分に理解するところ強固な細胞膜障壁を持たない細胞を宿生細胞として用 いるときには、Ｇ　ｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ［ＶｉｒｏｌＯｇＶ 　５２：　５４６　（１９７８）コの記載のようなリン酸カルシウム沈澱法によ ってトランスフェクションを行う。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の 方法、例えば核注入法またはプロトプラスト融合法などを用いることもできる。

原核細胞または強固な細胞壁構造を有する細胞を用いるときには、好ましイトラ ンスフェクション法は、Ｃｏｈｅｎら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、ＵＳＡ６９・２１１０　（１９７２）］が記載しているような塩化カル シウムを用いるカルシウム処理法である。

所望の暗号配列およびコントロール配列を含有する適当なベクターの構築には通 常の連結法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、 加工し、そして必要なプラスミドを調製するのに望ましい形態で再連結する。

ＤＮＡの切断は、適当な緩衝液中での制限酵素（または、酵素群）による処理に よって行う。通常は、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２ ０μｍの緩衝液中、約１単位の酵素とともに用いる（特定の制限酵素に対する適 当な緩衝液および基質の量は製造元が指定している）。３７℃で約１時間のイン キュベート時間が実施可能である。インキュベートの後、タンノくり買をフェノ ールとクロロホルムによる抽出によって除去し、核酸をエタノール１こよる沈澱 によって水性分画から回収する。

平滑末端が必要であるときには、調製物を１５℃で１５分間、１０単位のポリメ ラーゼＩ（フレノウ）で処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタ ノール沈澱させる。

切断したフラグメントの大きさによる分離は、Ｇ　ｏｅｄｄｅｌら［独立≧ｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　４０５７　（１９８０）］が記載している６ ％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。

連結のためには、はぼ等モル量の所望の成分（正ししλ適合が得られるように末 端を適切に加工する）を、Ｏ５５μｇのＤＮＡあたり約１０単位のＴ４　ＤＮＡ リガーゼで処理する（切断したベクターを成分として用いるときには、細菌性ア ルカリホスファターゼで前処理してこの切断ベクターの再連結を防止するのが有 用であろう）。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認する分析のために、この連結混合物を 用いて大腸菌に１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１，４４６）またはその誘導体を形 質転換し、適当なところで成功裏の形質転換体をアンピシリンまたはテトラサイ クリン耐性によって選択する。Ｍｅｓｓｉｎｇら［Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ ｓ、　’ｉ　：　３０９　（１９８１）コの方法またはＭａｘａｍら［鴫Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ　６５　：　４９９　（１９８０）コの方法によって、形質転換 体からプラスミドを調製し、制限マツピングによって分析し、そして／または配 列決定を行う。

３、還元されたポリペプチドの切断 ポリペプチドが組換えＤＮＡ法によって得られると否とにかかわらず、ポリペプ チドを適当な切断物質による処理にかける。ポリペプチドが組換え発現されると きには（これが好ましい）、ポリペプチドを宿主細胞培養物から回収するのが好 ましい。即ち、細胞を溶解し、これを遠心してポリペプチドを含有する適当な分 画を得、そして所望により細胞封入体からタンパク質を回収するための方法を用 いて該分画から精製し、緩衝液中に入れ、次いで切断物質で処理する。いずれに しても、生成物収量を実質的に増加させるためには、後記実施例に示したように ポリペプチドを切断物質に暴露する前にポリペプチドを還元された形態にしなけ ればならない。上記のように、還元型での維持は多数の方法のいずれかによって 、例えば切断物質に暴露する前に容器中の酸素を除去すること（アルゴン、ヘリ ウムまたは窒素などの非オキシダントガスでパージするなど）やポリペプチドに 還元物質を添加することなどによって行われる。

次いで、ポリペプチドを、所望のペプチドまたはそれに含まれるペプチドが放出 されることになる条件のもと、切断物質で処理する。

勿論、この処理は使用する切断物質に依存し、その条件は使用する切断物質に応 じて当業者には明らかであろう。種々の切断物質の例およびそのそれぞれに伴う 条件は、Ｗｉｔｋｏｐの＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ一般的に言う と、Ａｓｐ残基での加水分解は、Ｓ　ｃｈｕｌｔｚ［１ｌｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、１１：　２５５−２６３　（１９６７）コ　；　Ｌｉｇｈｔ［Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１１：　４１７−４２０　（１９６７）］の方法に 従い、ポリペプチドを希釈酸中で一定時間加熱することによって行われる。しか し、ある種の状況のもとでは、酸素の分圧（存在）、約Ｏ３↓〜１ｍｇ／ｍｌの 範囲となるであろうタンパク質濃度（量が多いと収量に悪影響を及ぼす）、所望 の出発原料の純度、および望ましくない化学的副反応の可能性を考慮に入れて、 上記の条件を変えるのが適切となろう。

即ち、切断しようとするタンパク質に依存して、酢酸濃度は約０゜１Ｎ〜１．Ｏ Ｎの範囲であり、ＭＣＩ濃度は約０．０１Ｎ〜０．ＩＮの範囲であり、硫酸濃度 は約０．００１Ｎ〜０．ＩＮの範囲であろう。

さらに、酢酸またはＨＣＩに対するインキュベート時間は約２〜１０時間の範囲 であり、インキュベート温度は約９０〜１２０℃の範囲であろう。硫酸に対する インキュベート時間は１〜８時間の範囲であり、インキュベート温度は８５〜１ ３０℃の範囲であろう。さらに好ましくは、酢酸濃度は約０．２５Ｎ〜約０．７ ５Ｎ（ＭＣＩは約０．０２５Ｎ〜約０．０５Ｎ、硫酸は約０．００３Ｎ〜約０． ０ＩＮ）の範囲であり、約１００〜約１１５℃の温度で、酢酸とＨＣＩのインキ ュベート時間は約４〜８時間、硫酸のインキュベート時間は約２〜４時間であろ う。最も好ましくは、約０．５Ｎの酢酸濃度（約０゜０５ＨのＨＣＩまたは約０ ．００５Ｎの硫酸）を、約４時間のインキュベート時間および約１１０℃のイン キュベート温度とともに選択する。

後記の突然変異プロリラキシンの切断に関連して十分に実施しうろことがわかっ た代表的なプロトコールにおいては、発現された比較的純度の高い突然変異タン パク質の試料を、初めに酢酸に対して透析濾過した後、０〜４８時間以内に、ヘ リウムまたはアルゴンガスでパージされたβ−メルカプトエタノール含有の尿素 緩衝液中に透析濾過する。この透析濾過の後、試料を約０．２５〜１．０ｍｇ／ ｍｌのタンパク質濃度で約２〜１０時間（通常は約４〜８時間）、約１１０℃に 加熱し、次いでＡ鎖を単離し、精製する。

切断産物の精製は、例えばゲルまたはペーパー電気泳動、クロマトグラフィー、 勾配遠心などの多数のペプチド精製法のし）ずれか番二よって得られる。酸切断 したペプチドの分離および精製には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が 特に良い結果を与えることがわＥＰ公開Ｎ　ｏ、　２５１．６１５（上記）に教 示されている方法を用Ｌ％でリラキシン鎖を結合させることができる。簡単に説 明すると、この出願は、還元された遊離システィン型のＡ鎖と還元された遊離シ スティン型のＢ鎖を、酸素暴露のもとｐＨが約７．０〜１２の水性溶媒中、Ｂ鎖 は変性するがリラキシン産物は変性しな（、ｚ条件のもとで混合することからな るヒトリラキシンのＡ鎖およびＢ鎖を結合させる方法を教示している。

５、艶剤 薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法を用（Ａでヒトリラキシンを 薬学的に許容しうる担体と混合すること１こよってヒトリラキシンを製剤化する ことができる。適当な担体およびそれらの製剤（ヒト血清アルブミンなどの他の 必要なヒトタンパク質を含む）Ｗ０８９１０７９４５（１９８９年９月８日公開 ）に記載されているようにヒトリラキシンを製剤化するのが好ましい。簡単に説 明すると、全身投与に特に有用な液体製剤のためには、組成物のｐＨを約４〜約 ７以下に維持することができる緩衝液中にリラキシンを有効量で含有させる。

子宮頚管内または膣内適用を含む局所投与用に製剤を設計するときには、リラキ シンをゲル形式で供するのが好都合である。ゲル用に適当な担体には、水溶性ポ リサツカリド、例えばメチルセルロースまたはポリエチレングリコールなどの物 質が含まれる。このゲルが光感受性であるときには、光暴露を避ける条件下また は適当な安定剤の存在下で保存しなければならない。

以下に挙げる実施例は、容易に酸切断されて精製されたＡ鎖タンパク質を与える リラキシンタンパク質をコードしている組換えプラスミドとの関係で本発明を説 明するものである。本実施例で用いた方法は単なる例示にすぎない。本発明の思 想および範囲から逸脱することな（本明細書および当分野の通常の技術レベルに 照らして、これら方法の種々の修飾およびこれら方法からの種々の展開が為され てよいことは明らかであろう。

Ａｓｐが挿入されたヒト上２プロリラキシンの突然変異体をコードするｐＴＲ４ １１と称する組換えプラスミドを構築した。様々な中間体を経て調製される、Ｈ ２プロリラキシンをコードしているｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐと称する親プラ スミドを出発物質として、このプラスミドを調製した。この遺伝子操作の最終産 物は、プラスミドｐＴＲ４１１であり、これはＬｅｕ３３と５ｅｒ３４、および Ａｒｇ＋３７とＧ　ｉｎ、　２Ｉｌのアミノ酸のコドンの間に挿入された付加的 なＡｓｐのコドンを有する、Ｈ２ブロリラキシンＤＮＡの配列を含んでいた。プ ラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐおよびｐＴＲ４１１のタンパク質配列およ びその基礎をなすＤＮＡ配列の両者を、図２Ａおよび２Ｂに各々示す。

Ａ、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐの調製親プラスミドｐＴｒｐＰｒｏ ＲｅｌＡｓｐの合成は、最初のプラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅＬそれに続＜ｐＴ ｒｐｓｔＩＩＰｒｏＲｅｌを含む数多くの中間体を経て行われた。ｐＴｒｐＰｒ ｏＲｅｌは、プロリラキシンＨ２をコードしているＤＮＡ配列の前にＴｒｐプロ モーターおよびメチオニンのコドンを含むように構築されたプラスミドである。

ｐＴ　ｒｐ　Ｓ　ｔＩＩ　Ｐ　ｒｏＲｅｌはＳ　ｔＩＩリーダー配列を含むよう に構築された（米国特許Ｎ　ｏ、　４．６８０、２６２）。次いで、ｐＴｒｐＰ ｒｏＲｅｌＡｓｐは、ｐＴｒｐｓｔＩＩＰｒｏＲｅｌからＳｔＨリーダー配列お よびＨ２ブロリラキシン（Ｓｅ’ｒ、から始まる）の最初の１１アミノ酸を除去 し、Ｍｅｔ−Ａｓｐ、とそれに続＜Ｈ２プロリラキシンのアミノ酸２〜１２をコ ードしている配列で置き換えることにより調製した。

１、ｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌ 図３によれば、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌは二段階で構築されることがわ かる。第一段階では、Ｔｒｐプロモーターおよびメチオニンコドンをプロリラキ ンン暗号配列の最初の半分の前に導入し、プロリラキシン遺伝子の後ろ半分に加 えた。

図４に示される第一段階は、３つのフラグメントを連結してプラスミドｐＦ　Ｅ ｐｒｏＨ２を形成することにより行われた。３つのフラグメントの第一番目であ る、Ｍｅｔプロリラキシンの１〜１６アミノ酸鋳型を使用するプライマー延長法 により調製した［例えば、米国特許Ｎｏ、　４．７５８．５１６およびＨｕｄｓ ｏｎら、　ＥＭＢＯＪｒｎｌ、　３二２３３３−２３３９　（１９８４）を参照 コ。

手短に述べると、元のｃＤＮＡクローンは次の様にして単離した。

すなわち、ヒト黄体の試料を、子宮外妊娠における外科的介入の結果としてもし くは帝王切開時の黄体切除により入手した。１個の黄体から単離したＲＮＡから 、ｐＢＲ３２２中にｃＤＮＡライブラリーを作成し、約３００の独立した組換え プラスミドを得た。このライブラリーを、３′非翻訳領域の８０塩基を含み、ア ミノ酸６４から終止コドンまでのＣ−鎖およびＡ−鎖をコードしている４００ヌ クレオチドのセグメントに対応するＨｌ−ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし た。ｐＢＲ３２２ライブラリーから得られる１個の陽性ｃＤＮＡクローンを単離 し、配列決定して、ヒトリラキシンＨ１に配列の相同性を有することが見いださ れた。このような子官組織の少量から得た組換えクローンの全数を、ラムダ−Ｇ ＴＩＯクローニング系を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成することにより増加 させた。

リラキシンに特異的なプローブを用いたスクリーニングにより、２３の独立した ｃＤＮＡクローンが同定され、そのうち６個は米国４，７５８、５１６の図１に 示される様に特徴付けられた。ヌクレオチド配列の分析により、６個全てのｃＤ ＮＡ組換えクローンは、同じリラキシン構造遺伝子のフラグメントをコードして いるが、この配列はゲノムのＨ１クローンの配列とは異なることが明らかとなっ た。

米国特許Ｎ　ｏ、　４．７５８．５１６の図１に示されており、ａ、ｂまたはＣ と称されるｃＤＮＡクローンを旦互１およびＨｐａＩで消化した。得られたＰｓ ｔｆ／Ｈｐａｌフラグメントおよびアミノ酸Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ− Ｇ　ｌｕをコードしている１５−ｍｅｒの５゛−＾ＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡ Ｇをプライマー修復反応（例えば、米国特許Ｎｏ、　４．６６３．２８３を参照 ）において用いて、平滑末端／Ｂｓ５ＨＩＩフラグメントを創製した。

第二の断片は、米国特許Ｎｏ、　４．７５８．５１６の図１に示される元のｃＤ ＮＡクローンから単離されたプロリラキシンの１７〜１５３コドンを含む４１０ 塩基対Ｂ　ｓｓＨＩＩ／　Ｂ　ｇｌＩＩフラグメントであった。

２０７−１本りから調製したクローニング媒体であった［ｐＨＧＨ２０７−１本 りは、Ｔｒｐプロモーターの上流にあるＥｃｏＲＩ部位がＥｃｏＲＩ消化および ＤＮＡポリメラーゼ・フレノウでの平滑化により除去されティることを除いては 、ｐＨＧＨ２０７（米国特許Ｎ　ｏ、　４．６６３．２８３）と同一である］。

これより、ｍｅｔＨＧ　Ｈの最初の１３７アミノ酸をコードしている４２０塩基 対のフラグメントが除かれ、クローニングベクターは無傷のまま残された。この フラグメントはアンピンリンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含ん でいた。

連結混合物を用いて、大腸菌に１２株２９４を形質転換した。

コロニーをアンピノリン耐性で選択し、上述の１５−ｍａｒを用いたコロニーハ イブリダイゼーションによりスクリーニングした。陽性のクローンをＭ１３ジデ オキシ配列決定により同定した。

図３に示す様に、第二段階によりプラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌが形成された 。この構築のために、３個の断片の連結が行われた。第一のセグメントは、Ｈ２ プロリラキシン暗号配列のアミノ末端側の半分を含有するｐＦ　Ｅ　ｐｒｏＨ２ から得た１５１０塩基対のＰ　ｓｔＩ／　Ｂ　ｇｌＩＩフラグメントであった。

第二のセグメントは、ΔｖａＩＩ部位がＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）を用い た処理により平滑となっている元のｃＤＮＡりｏ　−ン（Ｈｕｄｓｏｎら、玉揚 ）から得た１００塩基対のＡ　ｖａｌＩ／Ｂ　ｇｌＩＩフラグメントであった。

このフラグメントは、プロリラキシンの最後の６コドンを含んでいた。第三の部 分は、ＥｃｏＲＩ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）およびＰ　ｓｔＩで処理し てβ−ラクタマーゼ遺伝子の前半部分をコードしている７５０塩基対のフラグメ ントを除去したｐＢＲ３２２ＸＡＰであった［ｐＢＲ３２２ＸＡＰは、６４誘導 体である］。

連結混合物を用いて、大腸菌株２９４を形質転換し、コロニーをテトラサイクリ ン耐性で選択し、制限分析によりスクリーニングした。

２、ｐＴｒｐｓｔＩＩＰｒｏＲｅｌ プラスミドｐＴｒｐＳｔＩＩＰｒｏＲｅｌは、ｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐの構 築における中間体である。図５に示した様に、ｐＴｒｐｓｔＩＩＰｒｏＲｅｌは 二段階で構築され、その第一段階は、プロリラキシン暗号配列を５ｔＩＩシグナ ル配列のそれに正確に融合するＭ１３部位−指向性突然変異誘発からなっていた 。これは、ＸｂａＩ部位がＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）を用いて平滑化され たｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌから得た９５０塩基対クターに連結することにより行っ た。Ｍ１３ベクターは、Ｂ　ｇｌＩＬＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）、次いで ＢａｍＨＩで予め処理しておいた。次いで、部位−指向性の突然変異誘発のため の標準的な方法を行った［例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（１９８３）、　ＤＮＡ、 　２：１８３を参照］。

正しいＭ１３クローンを同定した後に、プロリラキシン遺伝子に正確に融合され ているＳ　ｔＩＩシグナル配列をコードしている１０２除去されているｐＴｒｐ Ｓ　ｔＩＩＨＧ　Ｈ（米国特許Ｎ　ｏ、　４．６８０．２６２）と同一のベクタ ーに連結した。

３、ｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌ、Ａｓｐ 図６によれば、プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐがプラスミドｐＴｒｐＳ ｔＩＩＰｒｏＲｅｌから、Ｈ２ブロリラキシンの最初の１１アミノ酸およびＳ　 ｔＩＩ配列を含む１０５塩基対のＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントの除去によっ て調製されたことがわかる。このフラグメントを、合成により製造した以下に示 すＤＮＡ二本鎖と置換した：この合成配列がＨ２プロリラキシンの最初の１２ア ミノ酸（プロリラキシンのＡｓｐ、を含む）をコードしていることは理解される であろう。

この構築物を用いて大腸菌株２９４を形質転換し、コロニーをテトラサイクリン 耐性により選択した。

Ｂ、プラスミドｐＴＲ４１１の調製 プラスミドｐＴＲ４１１は、族プラスミドｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐ、ならび に各々Ｂ／ＣおよびＣ／Ａの界面を包含する領域のためのＡｓｐコドン操作され た置換フラグメントを与えるように設計された２つのプラスミド、ｐＴＲ３９０ −７オヨヒｐＴＲ４００−２０７７）計３）（７）プラスミドから構築した。プ ラスミドｐＴＲ４１１の構築において用いられたこの全体の工程図を図９に示す 。

１、ｐＴＲ３９０−７ プラスミドｐＴＲ３９０−７は、Ｂ鎖の末端をコードしているＤＮＡ配列および Ｃ鎖の最初をコードしているＤＮＡ配列の間のＭｅｔ−プロリラキシン遺伝子に Ａｓｐコドンを導入するために設計した。図７かられかるように、プラスミドｐ ＴＲ３９０−７は、４つのフラグメントを連結することにより構築され、その第 一番目は、必須ではないＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントが除去された単純 なりローニングベクター（ｐＰＡ７８１；以下を参照）である。このクローニン グベクターに対する挿入物は、３つのフラグメントからなる。その１つ目は、Ｍ ｅｔ−プロリラキシンの最初の２７コドンを含むｐＴＲ３１から得た８０塩基対 のＥ　ｃｏＲＩ　−ＨｇｉＡ　Ｉフラグメントである。ｐＴＲ３１＋ｊ、４０塩 基対のＸｂａＩ／ＮｏｔＩフラグメントが以下の合成りＮＡ二本鎖で置換された ｐＴｒｐＰｒｏＲｅｌＡｓｐの誘導体である：第二のフラグメントは、３６０塩 基対のＳ　ｆａＮ　ｒ−Ｂ　ｇｌＨフラグメントであり、これも２丁Ｒ３１から 得られ、Ｍｅｔ−プロリラキシンの３４〜１５５コドンを含んでおり、第三のフ ラグメントは以下の配列を有する合成りＮＡ二本鎖である二 理解されるであろうが、上記の配列はプロリラキシンのアミノ酸２８〜３３をコ ードしており、それに続いてＡｓｐのコドンＧＡＴを有している。この合成フラ グメントは、通常はトリエステル法により調製した（Ｃｒｅａら、玉揚）。

［ｐＰＡ７８１は、プラスミドＪＨＩＯＩの誘導体である（Ｊｒｎｌ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、、　１５４：　１５１３−１５１５　（１９８３））。このプラ スミド由来の２９塩基対のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩフラグメントは、Ｐ ａｃプロモーター（叩ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ １：　４３９−４４３　（１９８４））、Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ　ａｍｙ１ｏ１ｉ ｑｕｉｆａｃｉｅｎｓアルファーアミラーゼシグナル配列（Ｇｅｎｅ、　１５： 　４３−５１　（１９８１））、およびヒト成長ホルモン遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ 、　２８１：　５４４−５４８　（１９７９））を含む８１０塩基対のＤＮＡフ ラグメントで置換されている。］ ４つのフラグメントを共に連結して大腸菌細胞を形質転換するために用いた。形 質転換体をアンピシリンで選択し、プラスミドｐＴＲ３９０−７を制限分析およ びジデオキシ配列決定により選択した。

２、ｐＴＲ４００−２０ プラスミドｐＴＲ４００−２０は、Ｍｅｔ−プロクラキシン遺伝子中のＣ＠の末 端（Ａｒｇ＋３７）およびＡ鎖の初め（Ｇ１ｎ＋３ｇ）をコードしている領域の 間に、Ａｓｐコドンを導入するために設計した。図８かられかるように、このプ ラスミドは３つのフラグメントを共に連結することにより構築された。ｐＴＲ３ ９０−７と同様に、最初のフラグメントは、必須でないＥ　ｃｏＲＩ　−Ｂ　ｇ ｌＩＩフラグメントが除去された、単なるクローニングベクター（ｐＰＡ７８１ ）である。第二のフラグメントは、プラスミドｐＴＲ３１からＥｃｏＲＩ−Ｔａ ｑＩ消化により得たＭ　ｅ　ｔ−プロリラキンンの１〜１３４コドンを有する４ ０５塩基対のＥｃｏＲｒ−Ｔａｑｒフラグメントである。第三の断片は、上述の 方法により合成された合成りＮＡ二本鎖であり、以下の配列を有していた： 理解されるであろうが、上記の合成フラグメントは、Ｍｅｔ−プロリラキンンの アミノ酸１３５〜１５４をコードしており、アミノ酸コドン１３７（ＡＧＡ）と １３８（ＣＡＡ）の間にＡｓｐのコドン（ＧＡＴ）が付加されている。

３つのフラグメントを共に連結して、大腸菌に１２株２９４細胞を形質転換する ために用いた。形質転換体をアンピシリン耐性により選択し、プラスミドｐＴＲ ４００−２０を制限分析により選択し、ジデオキシ配列決定を行った◇ ３、ｐＴＲ４１１ 図９によれば、プラスミドｐＴＲ４１１はＤＮＡの３つの断片を共に連結するこ とにより構築した。第一の断片は、４１０塩基対のｅｌＡｓｐである。従って、 この線状となったプラスミドは、プロリラキシンのアミノ酸１〜１８および１５ ６〜１６１に対するコドンを有している。第二の断片は、アミノ酸１９〜９７に 対するコドンを含むｐＴＲ３９０−７から得た２３５塩基対の且朋ＨＩＩ−且劫 ｆＩフラグメントであり、アミノ酸３３　（１ｅｕ）と３４　（ｓｅｔ）に対す るコドンの間にＡｓｐのコドンが付加されている。第三の断片は、ｍｅｔ−プロ リラキシンの９９〜１５５のコドンを含むｐＴＲ４００−２０から得た１７５塩 基対のＨ１ｎｆＩ−Ｂ　ｇｌＩＩフラグメントであり、アミノ酸１３７（ａｒｇ ）と１３８　（ｇｉｎ）のコドンの間に余分な、へｓｐコドンを有している。

この３つのフラグメントを連結した後、この混合物を用いて大腸菌に１２株２９ ４細胞を形質転換した。形質転換体をアンピシリン耐性により選択し、プラスミ ドｐＴＲ４１１を制限分析により選択した。

実施例２　増強された酸切断部位を有する。Ａｓｐが挿入されたヒトブロリラキ シンをコードする組換えベクターの構築プラスミドｐＴＲ６０１（図１３）は、 リラキシンＡ鎖の前に増強された酸切断部位を有するタンパク賃を製造するため にプロリラキシンをコードする配列を変更した、ｐＴＲ４１１（図９）の誘導体 である。ｐＴＲ４１１中のＡ鎖のすぐ前のアミノ酸ＡｒｇＡＬｙｓＬｙｓＡｒｇ Ａｓｐのコドンを、ｐＴＲ６０１においてはＳ　ｅｒＧ　１ｕＡ　１ａＡ　１ａ Ａ　ｓｐのコドンに変化させた。さらに、９９．１２０および１３２に位置する ＡｓｐコドンをＧｌｕコドンに変化させた。ｐＴＲ６０１の構築には、以下に示 すように４段階が必要とされ、中間体プラスミドｐＴＲ５４０−２、ｐＴＲ５５ ０−８およびＩ）ＴＲ５６１が結果として得られた。

ｐＴＲ５４０−２の調製（図１０） プラスミドｐＴＲ５４０−２は３つのＤＮＡフラグメントから構築され、その第 １は小さなＸｂａｒ−ＢａｏＨＩフラグメントが除去されたベクターｐＨＧＨ２ ０７−１（米国特許Ｎ　ｏ、　４．６６３．２８３）である。２つ目は、Ａｓｐ が挿入されたプロリラキシンの最初の９４アミノ酸をコードしているｐＴＲ４１ １から単離された２８５ｂｐのＸｂａＩ−ＲｓａＩフラグメントである。３つ目 は、以下の配列を有する７６ｂｐの合成りＮＡ二本鎖Ｒｅ１ＸＸＩＩである。

３つのフラグメントをＴ４リガーゼを用いて共に連結し、大腸菌細胞を形質転換 するのに用いた。形質転換体をアンピシリン・プレート上で選択し、プラスミド ｐＴＲ５４０−２を制限分析およびＤＮＡ配列決定により選択した。この調製の 工程図を図１０に示す。

ｐＴＲ５５０−８の調製（図１１） プラスミドｐＴＲ５５０−８は、３つのＤＮＡフラグメントから調製した。その １つ目は利用可能なＥｃｏＲＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩ制限部位を含み、ＥｃｏＲ ＩおよびＨ１ｎｄＩＩＩで処理されたクローニングベクターｐＴ１１１から単離 した。ベクターｐ”ｒ　Ｉｌｌは、ヒト成長ホルモンをコードする配列がヒトイ ンターロイキン−１の配列で置換されているｐＨＧＨ２０７−１の誘導体である 。この構築のための別のベクターは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化さ れたｐＢＲ３２２から単離されるベクターフラグメントである。

２つ目のフラグメントは、以下の配列を有する６５ｂｐの合成二本鎖Ｒｅ１ＸＸ ＩＩＩであった： 第三の部分は、Ａｓｐが挿入されたプロリラキシンのアミノ酸１４０〜１６４を コードしているｐＴＲ４１１から得た１８３ｂｐの主凹３Ａ　Ｉ−Ｈ１ｎｄＩＩ Ｉフラグメントである。この最後のフラグメントは、まずｐＴＲ４１１由来の３ ０６　ｂｐの旦ハＦＩ−比鯵ｄＩＨフラグメントを単離し、次いでこのフラグメ ントをΣａｕ３ＡＩで部分消化することによって得た。

この３つのフラグメントを共に連結し、この混合物を用いて大腸菌株２９４を形 質転換した。形質転換体はアンピシリン耐性で選択し、プラスミドｐＴＲ５５０ −８を制限分析およびＤＮＡ配列決定により選択した。ＴＲ５５０−８の調製の ための工程図を図１１に示す。

ｐＴＲ５６１の調製（図１２） プラスミドｐＴＲ５６１は、Ａｓｐが挿入されたプロリラキシンの暗号配列の全 てを増強された酸切断部位と組合せる。３つのＤＮＡフラグメントが構築に用い られ、その第一番目は、小さなりｓｓＨＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが除去さ れたベクターｐＴＲ４１１である。

２つ目はｐＴＲ５４０−２から得た２９７ｂｐの且憇ＨＩＩ−且胚ＩＩフラグメ ントである。３つ目は、増強されたＡｓｐ挿入挿入プロキラキシン後の４５アミ ノ酸をコードしているｐＴＲ５５０−８から得た９００ｂｐのＳ　ａｃＩＩ−Ｅ 　ａ！ＨＩフラグメントである。また、この最後のフラグメントはＨｉｎｄＩＩ ＩとＢａｍＨ１部位の間にインターロイキン−１配列の一部を有しているが、こ れはこの構築には重要でない。

３つのフラグメントをＴ４リガーゼを用いて共に連結し、大腸菌株２９４細胞の 形質転換に用いた。形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、プラスミド ｐＴＲ５６１を制限分析により選択した。ＴＲ５６１の構築のための工程図を図 １２に示す。

ｐＴＲ６０１の調製（図１３） 最終的なプラスミドｐＴＲ６０１は、ｐＴＲ５６１由来の不要なインターロイキ ン−１配列の全てを除去し、テトラサイクリン耐性遺伝子を回復させたものであ る。３つのフラグメントを用いてｐＴＲ６０１を構築した。その１つ目は小さい ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントが除去されたベクターｐＴＲ５６１である 。次いで、このベクターを細菌性アルカリホスファターゼで処理して、ベクター の再環化を防止した。２つ目はｐＴＲ５６１から得た２６ｂｐの且ｇｌＩＩ−卸 Ｉフラグメントであり、これはプロリラキシンの最後の６アミノ酸をコードして いる。３つ目は、ＥｃｏＲＩ部位がＤＮＡポリメラーゼ・フレノウを用いて充填 された、ｐＢＲ３２２由来の３７７ｂｐのＥｃ。

ＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントである。

この３つのフラグメントを共に連結し、大腸菌２９４細胞の形質転換に用いた。

形質転換体をテトラサイクリン耐性で選択し、プラスミドｐＴＲ６０１を制限分 析により選択した。ｐＴＲ６０１の構築のための工程図を図１３に示す。

実施例３　増強された酸切断部位を有するＡｓｐが挿入されたヒトブロリラキシ ンをコードする遺伝子の発現および切断実施例２で述べたプラスミドｐＴＲ６０ １を用いて、以下に述べるプロトコールに従い宿主細胞Ｗ３１１０±Ａを形質転 換した。

大腸菌Ｗ３１１０ｔｏｎＡ宿主は、本質的にＴ１ファージに耐性であり、Ｐｌか ら得たファージを用いた形質導入を含む標準的な実験技術を用いて作成される株 である（例えば、Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｐｒｅｓｓ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７２を参照）。通常、この宿主は欧州 特許Ｎ　ｏ、　１８３．４６９（１９８６年６月４日公開）に記載されているよ うにして得た。

約２５ｍ１のＬＢブロスにＷ３１１０ｔｏｎＡ宿主細胞の１コロニーを接種した 。この混合物をＡ　Ｓ　Ｓ　ｏが約１．０となるまでインキュベートした。次い でこのインキュベーション混合物を、冷却した遠沈管に移し、約５〜１０分間氷 上に設置し、次いで６００　ｒｐｍで５分間遠心した。次いでペレットを８．０ １０１の水冷０．１ＭＣａＣ１□中で再懸濁し、渦巻撹拌し、氷上に４時間設置 した。この後に、混合物を６、ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを１５％ グリセロール中の０゜１Ｍ　ＣａＣ１２（１，０１１１）中に再懸濁した。この 懸濁液を氷上に一晩設置した。

形質転換のために、約０．２５〜０．５ｎｇのｐＴＲ６０１プラスミドＤＮＡを ５０μｍのＣａＣｌ２処理したコンピテントな細胞に加え、この混合物を氷上に １時間設置した。４２℃で９０秒間の熱ショックの後に、混合物を水に１分間移 し、この後にＱ、１ｍｌのＬＢブロスを加えた。３７℃で１時間のインキュベー ション時間の後に、混合物を２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天 板にプレートした。３７℃でＡＳ５゜が約１．０となるまで増殖させた５μｇ／ ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培養液中の１コロニーから、凍結保存培養物 を作成した。培養物は１０％ＤＭＳＯ中、−７０℃で凍結した。

形質転換された細胞の培養のために、ＬＢブロス（５００Ｆｌ）に凍結保存培養 物（０，５ｍ１）を接種し、３７℃、２０　Ｏｒｐｍで８時間インキュベートし た。この様にして得られた種培養物をＴｒｐ８塩を添加した１０リツトルの発酵 器に移した。Ｔｒｐ８塩は、硫酸アンモニウム（５，０ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４ （６，０ｇ／Ｌ）、Ｎａ８２Ｐ○４（３，０ｇ／Ｌ）およびクエン酸ナトリウム ・２ＨｚＯ（Ｉｇ／Ｌ）からなる。このＴｒｐｇ塩（１０Ｌ）を、蒸留水（７Ｌ ）中で発酵器において滅菌した。発酵器を冷却した後に、次の成分を加えた・５ ０％グルコース（５００ｍｌ）、Ｉ　Ｍ　ＭｇＳ　Ｏ＜（１００ｍｌ）、鉄を含 む微量金属（５ｍｌ）、２．７％ＦｅＣＦｅＣ１３（５，２０％ヒカーゼ（Ｈｙ ｃａｓｅ）（２５０ｍｌ）、２０％酵母抽出物（２５０ｍｌ）および５ＩＩ１ｇ ／ｒｎ１テトラサイクリン（１０ｍｌ）。

培養物を１１０１ｐでの通気、１１０００ｒｐでの撹拌およびＱ、３ｂａｒの背 圧のもと、３７℃、ｐＨ７，０で増殖させた。ＯＤ、５゜わ、が約２０になった 時点でグルコースの緩やかな供給を始めた。３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ ）の２５　ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍｌ）の全量をＯＤ、、。

、１が３０になった時点で添加した。ＩＡＡ添加の８時間後に培養物を集めた。

細胞ペレットを５ｏｒｖａｌｌ　Ｒ３ＣＢによって集め、−２０℃で凍結した。

ｐＴＲ６０１由来のＡｓｐが挿入された突然変異体であるヒトプロリラキシンを 細胞ペーストから以下の様にして精製した。

ｐＴＲ６０１−形質転換細胞から得た細胞ペーストを溶菌緩衝液（２０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ８，５００ｍＭ　ＮａＣＬ　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に１： １０の比で懸濁することにより処理した。懸濁液を、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕ１ｉ ｎホモジナイザーに約６，０ＯＯｐｓｉで３回通した。６０００ｘｇで３０分間 遠心した後、ペレットを４Ｍグアニジン−ＨＣｌ／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 　ｐＨ８１０，１％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中に溶解した。この溶 液について限外濾過および透析濾過を行い、２０　ｍＭ　Ｎ　Ｈ４酢酸緩衝液、 ｐＨ４，５，６Ｍ尿素１０１％ＢＭＥに移した。この物質をスルホプロピル−ト リスアクリル（ＳＰＴＡ）カラム（Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ）にロード した。

突然変異体であるＡｓｐ挿入挿入プロキラキシン初の精製を行うために５ＰＴＡ 分画化を行った。カラムの大きさは、約ｌＯｘ１２ｃｍであり、これは約９５０ １０１のベッド容量に対応していた。用いた緩衝液は２５ｍＭ酢酸アンモニウム ／６Ｍ尿素１０．１％ＢＭＥであった。用いた流速は、約３０ｍ１／分であり、 これは１時間当たり約１゜８すνトルに匹敵した。カラム緩衝液中のＯ〜０．６ ５Ｍ勾配ＮａＣ■を５カラム容量用いた。通常の分画化においては、各２．５リ ツトルの樹脂に対して約１ｋｇの細胞ペーストが分画された。

プールのパラメーターを決定するために様々な分画について５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動（１５％）を行った。Ａｓｐが挿入されたヒトブロリラキ シンタンパク質の突然変異体を含有しているプールを限外濾過／透析濾過して、 ４Ｍグアニジン−Ｃ１／２０＋１１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ８，０１０，１ ％ＢＭＨに移し、同じ緩衝液中でセファクリル−３００カラムにかけた。

用いられたセファクリル−３００カラムは、５．　ＯＸ　９０ｃｍ（１，７リツ トルベツド容量）の大きさであり、流速は約１００　ｍｌ／時であった。通常、 樹脂／ペーストの比として、１４Ｌ／ｋｇペーストの比を用いた。カラムの分画 についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をもう一度行い、プールのパラ メーターを決定した。

実質的に精製されたＡｓｐ挿入Ｍｅｔ−プロリラキシンの突然変異体を含むプー ルを集め、４容量の７．５Ｍ尿素および０．１％ＢＭＥを用いて透析濾過し、次 いで２０容量の０．５Ｎ酢酸を用いて透析濾過した。第二の透析濾過の工程は、 プロリラキシンを還元型に維持するために、反応容器にヘリウムガスを吹き込む ことにより酸素の非存在下で行った。

増強された酸切断は、以下の条件下で行った；即ち、タンパク質濃度は約１　ｍ ｇ／ｍｌであり、インキュベートは１１０℃で４時間であり、反応容器の排気は 行わなかった。次いで、加水分解物を回転式エバポレーターで乾燥させ、４Ｍ尿 素、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓおよび１００ｍＭＤＴＴＳｐＨ８の緩衝液中に溶解し、 溶液を該緩衝液で平衡化したＳ−セファロース・ファスト・フロー・カラムにロ ードした。

Ａ鎖はカラムに吸着され、塩化ナトリウム勾配を用いてＡ鎖を溶離した。Ａ鎖の プールをＧ２５ゲル濾過樹脂で０．５Ｎ酢酸に交換し、回転式エバポレーターで 乾燥した。次いで、Ａ鎖を４Ｍグアニジン−Ｃ１，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ 、ｐＨ８および１００ｍＭＤＴＴに溶解した。最後に、サンプルを以下に述べる ようにＨＰＬＣにより予備的に精製した。

以下の条件の下でＶｙｄａｃ　Ｃ−４逆層カラムによるＨＰＬＣを行っＶｙｄａ ｃ　Ｃ−４ＲＰＣ（４，６Ｘ２５０ｍｍ、３００Ａ、５μ）０．１％ＴＦＡ／水 ０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル １５〜５５％勾配 置分間当たり０．５％、１分間当たり２Ｉ１１１２８Ｏｎ＠−ＡＵＦＳ　Ｏ，０ ２；　２１４ｎｍ−ＡＵＦＳ　Ｏ，１１分藺当たり０．２ＣＩ１１のチャートス ピード評価されるであろうが、３つの主なピークが得られ、各々１．２および３ と名付けた。ピーク１．２および３に対応している分画を集め、配列決定してア ミノ酸組成を決定した。ピーク１から得たペプチドは、プロリラキシンのＣペプ チド領域由来の切断フラグメントに対応する配列を含んでいることが見いだされ た。ピーク２から得たペプチドは、Ｎ−末端グルタミンが環化してエドマン分解 に応答しないビローグルタミン酸型になるために、明らかな配列は見いだされな かった。アミノ酸組成分析および質量スペクトルにより、ピーク２のペプチドは Ａ鎖であることが決定された。ピーク３から得たペプチドは、ｄｅｓ（Ａｓｐ＋ ）−Ｂ鎖に対応することが見いだされた。

３つのペプチドのおおよその溶離位置は以下の通りである：　ｐｙｒ。

Ｇ１ｕＡ鎖（ペプチド２）は見かけのアセトニトリル濃度が約２６．０％の位置 で溶離され、ｄｅｓ（Ａｓｐ＋）−Ｂ鎖は見かけのアセトニトリル濃度が約４３ ．６％の濃度で溶離された。

酢酸切断プロトコールにおける出発物質であるＭｅｔ−Ａｓｐ−挿入プロリラキ シンにおいて存在する量に対する、Ａ鎖の質量に基づくＡ鎖ペプチドのおおよそ の回収率は、約３８〜４２％であった。第二の透析濾過においてヘリウムガスの 吹込みを行わない同じ実験における収率は２７％であった。

カラムで精製したＡ鎮の物質を含むサンプルは、使用時まで一２０℃で保存した 。

発現ベクターとしてｐＴＲ４１１を用いた比較実験を、切断を以下のようにして 行う以外は上記のプロトコールを繰り返して行った。

セファクリル−３００カラムから得た精製したばかりのサンプルを、約１００容 量の０．５Ｍ酢酸に対して一晩透析した。切断は以下の条件の下で行った：２１ ｉ常は約０．２５〜２　、０　ｍｇ／ｍｌの範囲のりンパク質濃度を用いた。サ ンプルを１１０℃で１８時間インキュベートし、約２ｔｏｒｒの最終条件まで吸 引した。次いでサンプルを分析時までまたはＨＰＬＣにより予備的に集める時ま で、−２０℃で保存した。

上記の条件の下で、得られたＡＭペプチドのおおよその回収率は、酢酸切断プロ トコールにおけるＭｅｔ−Ａｓｐ−挿入プロリラキシン出発物質中に存在する量 に対するＡ鎖の質量に基づいて、本来ｐＧ　１ｕ−Ａ−鎖に対して約４０〜５０ ％であると考えられていた。実験を数回繰返し、生成物がＨＰＬＣおよび質量ス ペクトルによってより十分に分析すると、Ａ鎖と考えられていたものは、伸長さ れたＡ鎖であり、Ａ鎖の回収率は約５〜１０％であることが見いだされた。ヘリ ウムガス吹込みと吸引の交互のサイクルで行うことにより実験を繰り返した場合 には、リラキシンＡ鎖の収率は顕著には改善されなかった。

増強されたＡｓｐ切断プロリラキンン（ｐＴＲ６０１由来）から得たＡ鎖の収率 は、以下に述べるいくつかのパラメーターにより劇的に変化することが明らかと なった。

１１０℃での０．５Ｎ酢酸による最良の切断時間は、約２〜１０時間であり、中 でも最も好ましいのは約４〜８時間であった。

増強された酸切断実験を、組換えリラキシンＡではな（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ１ｄペ プチド合成により製造されたりラキシンＡを用いて繰り返した場合には、約５０ ％の回収可能なタンパク質が分解した。加水分解の主な部位のいくつかがシステ ィン残基にあり、より低度でセリン残基にあるようであった。

０．００１〜０００３Ｎトリフルオロ酢酸、０．００５Ｎ硫酸、または０．０３ 〜０．０５Ｎ塩酸を用いた以外は、増強された酸切断実験を繰り返した場合には 、試験を行った全ての酸の中で５ｍＭ硫酸および０．５Ｎ酢酸が最も良い収率を 与えた。

プロリラキシン濃度が１　ｍｇ／ｍｌ〜１９ｍｇ／ｍｌに増加された以外は、増 強された酸切断実験を繰り返した場合に、Ａ鎖に対するＨＰＬＣＣ４のピークが 約１　ｍｇ／ｍｌでの約９ｃｍからＦ３　ｍｇ／ｍｌでの６．４ｃｍそして約１ ９　ｍｇ／ｍｌでの５．５ｃｍまで減少することが見いだされた。

最初の透析濾過の工程においてＢＭＥの代わりに１〜１０ｍＭジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）を用いた以外は増強された酸切断実験を繰り返した場合には、Ａ鎖 の収率は実質的に減少した。

工ないし１０ＩＩＩＭの酸化されたシスティン（シスチン）を酢酸加水分解混合 物に加えた以外は増強された酸切断実験を繰り返した場合には、Ａ鎖の収率は著 しく減少した。

最初の透析後、酢酸を用いて透析する前に、３日より長い期間プロリラキシンの サンプルを尿素／ＢＭＥ透析緩衝液中に静置させたことを除いては増強された酸 切断実験を繰り返した場合には、Ａ鎖の収率は２４〜２５％まで減少した。還元 条件が課された後に切断を始める適当な時間は、０〜２日であり、好ましくは０ 〜２４時間で、最も好ましくは即時である。これらの実験により、加水分解反応 物からの最大収率を得るためには分子中のジスルフィド結合の形成を避けるべき であることが示唆される。さらに、これらの結果により、予期しなかったことで あるが、酸の条件下でジスルフィド結合は形成されつるが、これはそのための助 けとはならないことが示されている。

ＨＰＬＣにより精製されたＡ鎖を含むサンプルを、実施例４に記載のようにリラ キシン再構成のために用いることができる。

実施例４　リラキシンペプチドを用いたりラキシンの再構成上で得られた精製さ れたＡ鎖を用いてリラキシンを再構成するために、以下に示すプロトコールを用 いることができる。

方法Ｉ　以下からなる全容量的１１４２．５μｍ中で再折り畳みを行う：Ｑ、５ Ｍグリシン（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１００１１１）、ｐ Ｈ１０゜５．６Ｍ尿素（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）（１００μｍ）、水（７２ ５４１）、アセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ）（５Ｑ 　μｌ）、１−プロパツール（Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　ＪａｃｋｓｏｎＸｌ　 ５　μｌ）、Ａ鎖溶液（水中３　ｍｇ／ｍｌリラキシンＡ鎖）（１００μｍ）お よびＢ鎖溶液（リラキシンＢ鎖５０４μｇ／６Ｍ尿素３５０μＩＸ、６２．５μ ｌ）。サンプルを一晩２０℃で緩やかに混合しながら再折り畳みを行う。

方法ＩＩ　以下からなる混合物中で再折り畳みを行う、０．２〜ＩＭＣＡＰＳ緩 衝液（３−［シクロへキンルアミノ］プロパンスルホン酸、ＣａｌＢｉｏＣｈｅ ｍ）、ｐＨ１０，２，０，７５Ｍ塩酸グアニジン、１０％（Ｖ／Ｖ）メタノール （Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ）、および全タンパク質濃度の範囲 は０．２５〜２　、０　ｍｇ／＋１である。リラキシンＡ鎖のリラキシンＢ鎖に 対するタンパク質比は、約４部のＡ鎖に対して１部のＢ鎖となっているべきであ る。溶液は窒素もしくはアルゴンなどの不活性ガスを充分に吹き込み、２０℃で 一晩（１２〜１８時間）、空気の存在下で撹拌すべきである。

全ての折り畳まれたサンプルについて活性を試験しても良いし、さらに／または 本質的には先に述べたようにして（実施例３）ＨＰＬＣによる再精製を行っても 良い。

大規模の再折り畳みは、原料の全体量を比例的に増加させることにより得られる 。

実施例５　Ａｓｐ−挿入ポリマー型Ａ鎖ヒトブロリラキシン突然変異体をコード する遺伝子の構築および発現ならびにその切断ポリマーを加水分解するための酢 酸による切断を用いた発現を改良するために、Ａ鎖のポリマー型を作成すること がこの実施例において研究された。

次の配列と結合した３つもしくは４つのりラキンンＡ鎖を共に有する４つのプラ スミドを構築した。

−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｒ１ｘ＾−［Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−＾ １ａ−Ａｓｐ−Ｒ１ｘ＾］２−３、または−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｌａ−Ａｓｐ− Ｒ１ｘＡ−［Ａｓｐ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｒ１ｘ＾コ、−３、［ 配列中、Ｒ１ｘ＾はリラキシンＡ鎖である］。これらのプラスミドの構築につい て詳しくは以下ならびに図１４および図１５に各々述べる。

Ａ鎖の後部末端を適当なリンカ−を通してＡ鎖の前部末端に結合している２つの 中間体プラスミドｐＲＰ１２およびｐＲＰ３４を以下のようにして調製した。以 下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドリンカーをホスホルアミド合成により 調製した：く−ＡのＣ末端−〉〈−リンカーーー〉次の断片は、リラキシンＡ鎖 の全体を含み、上に示したリンカ−の最後のＡｓｐをリラキンンの最初のアミノ 酸の前に設置した、ｐＴＲ４１１（図９）から得た部分−８ａｕ　３　Ａ−Ｈ１ ｎｄＩＩＩフラグメントであった。ｐＴＲ４１１から得たフラグメント：Ｔ４リ ガーゼおよび以下の成分を用いて２つの連結を行った：ｐＲＰ１２：ＰＲ１＋Ｐ Ｒ２＋ｐＴＲ４１１フラグメント＋ｐＢＲ３２２のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩ ＩＩベクターフラグメント：およびｐＲＰ３４　：ＰＲ３＋ＰＲ４＋ｐＴＲ４１ １フラグメント＋ｐＢＲ３２２のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩＩＩベクタ一フラ グメントＭＭ　２９４　ｔｏｎＡ株（１９８６年６月４日に公開の欧州特許１８ ３．４６９において一般的に記載されている標準的形質導入方法により調製され る）を、標準の大腸菌形質転換プロトコールを用いて上記のプラスミドの各々で 形質転換した。ミニスクリーン制限分析および配列決定を行い、正しい配列が得 られたことを確認した。ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ消化によりこれらの各プラスミ ドからＡ鎖の後部末端、適当なリンカ−フラグメントおよびＡ鎖の前部末端を含 むフラグメントが解離されるだろう。

発現プラスミドｐＴＲ６０１を、このプラスミド中のＡ鎖暗号領域において一度 切断するＢ　ｇｌＩＩで消化し、次いで細菌性アルカリホスファターゼで処理し てベクターの連結を減少させた。

ｐＲＰ１２およびｐＲＰ３４の両方を各々旦虹ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、 約９０ｂｐのフラグメントをアクリルアミドゲルから単離した。これらのフラグ メントは、自ずから連結してポリマーを形成し、以下に示すように様々な方法で 一緒になることができる。

［ここで、−〉は１鯵からＢｇｌであり、〈−は１虹から旦すである］。

旦ｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて引き続き消化を行っても、頭部から尾部ま でのポリマーを残すだけであろう。なぜなら、これらの連結部は両酵素による切 断に対して耐性であるからである。この消化の後に、ＤＮＡをアクリルアミドゲ ル上で流し、ｐＲＰ１２およびｐＲＰ３４フラグメントに各々対応する約１８０ の二量体のバンドおよび約２７０の三量体のバンドをゲルから溶離した。これら のＤＮＡフラグメントを上述のｐＴＲ６０１ベクターフラグメントに連結して、 得られた連結構築物を上述のようにして株ＮＭ２９４ｔｏｎＡ中に形質転換した 。形質転換体を、ミニスクリーン制限分析により正しいプラスミドについて分析 した。以下に示すように４つのプラスミドが単離された。

名称　Ａ鎖　図の番号　リンカ− ｐＤＨ９８３１４ＡｓｐＰｒｏＳｅｒＡ１ａＡｓｐｐＤＨ９９４１４ＡｓｐＰｒ ｏＳｅｒＡｌａＡｓｐｐＤＨ１００３１５ＡｓｐＧｌｙＳｅｒＡｌａＡｓｐｐＤ ）（１０１４１５ＡｓｐＧｌｙＳｅｒＡｌａＡｓｐこれらのプラスミドの各々を 用いてＷ３１１０±Ａ細胞を形質転換して得られた細胞培養物を、ｐＴＲ６０１ 形質転換細胞について上で述べた条件を用いて増殖させた。各々は、予想された 分子量のタンパク質を発現した。大腸菌培養ペーストを一８０℃で保存した。

発酵器から得た細胞ペースト（１ｇ）を１０容量の水冷細胞懸濁緩衝液（２５ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、５ｒｒｒＭ　ＥＤＴＡｌｌ　０ｍＭ　ＤＴＴ　ｐＨ７， ５，２５℃）中に懸濁し、Ｕ　１ｔｒａｓｏｎｉｃｓソニケーターにおいてＭｉ ｃｒｏｔｉｐプローブを用い、出力６で４０％仕事サイクルにセットして氷／エ タノール浴に浸すことにより冷却しながら５分間超音波処理した。１２．０００ Ｘｇ、４℃で１０分間の遠心の後に、ペレットを同様の容量の７Ｍ尿素、２５ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭ　ＤＴＴ、　ｐＨ７，５，２５℃中に再懸濁し、上記と同様にして超音 波処理した。４℃、２７．　ＯＯＯＸｇで２０分間の遠心の後、上清を静かに注 いで０６４５ミクロンのＭｉｌｌｅｘ　ＨＡフィルターを通した。グリセロール を１０％ｖ／ｖまで添加することにより上清の濃度を上昇させ、サンプルについ て６Ｍ尿素、ＩＭＮａＣｌ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 １０ｍＭ　ＤＴＴ　ｐＨ７，５で平衡化したセファクリル３２００カラム（５Ｘ 　８０ｃｍ）上でクロマトグラフィーを行った。カラムを４℃、平衡緩衝液中、 １　、５　ｍｌ／分の流速で展開した。ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲル（８ 〜２５％）でのタンパク質検出に基づいて分画をプールし、加水分解の工程まで ４℃で保存した。Ｎ末端配列分析により同定を行った。

サンプルを５２００溶離液プールから取り、８Ｋｄ分子量透析チューブ（Ｓｐｅ ｃｔｒａｐｏｒ）中、１０００容量の０．５Ｎ酢酸に対して４℃で一晩透析した 。１　、０　ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を通常用いた。気密性ことにより切断 を行った。次いでサンプルを希釈し、既に述べたようにして以下に示す条件を用 いて、高速液体クロマトグラフィーにより分析した。

５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ　Ｃ−４ＲＰＣ（４，５ｘ　１００ｍｍ、　３００Ａ）０ ．１％Ｔ　Ｆ　、Ａ　／水 ０．０８％ＴＦＡ／アセトニトリル １５〜５５％勾配 置半穴たり１．０％、１半穴たり１ｍ１２８０ｎａ＋−ＡＵＦＳ　Ｏ，０２：２ １４ｎｍ−ＡＵＦＳ　Ｏ，２１分半穴り２ｍ１１のチャートスピードＨＰＬＣカ ラムにおいて真正な標準合成Ａ鎖と共に溶離するビークは、ピログルタミンＡ鎖 であることが質量スペクトルにより示された。

Ａ鎖ペプチドのおおよその回収率は、融合タンパク質１ｇの出発物質量に正規化 すると、加水分解後に以下のようであった：ｐＤＨ９８（Ｄ−Ｐ　３−ｍａｒ） 　８７ｍｇｐＤＨ９９（Ｄ−Ｐ　４−ｍｅｒ）　１４５ｍｇｐＤＨ１０１（Ｄ− Ｇ４−ｍａｒ）　５５ｍｇＡｓｐ−プロリラキシン　５５ｍｇ 従って、Ｄ−Ｐ融合タンパク質からのＡ鎖の回収率は、理論値の約３６％であり 、融合タンパク質におけるＡ鎖車量体の数に応じて、Ａｓｐ−挿入プロリラキシ ンの１．６〜２．６倍であった。

Ａ鎖をいくつプラスミドに設定するかという選択は、４つのＡ鎖を有するポリマ ーが回収される最大の連結ポリマーであるという事実によって支配された。より 大きなポリマーを合成する方法については、どの当業者にとっても明白であろう 。

以上述べた本発明は、特許法における必要条件に合致するよう、また説明および 例示の目的のために、特に好ましい態様に向けられたものである。しかしながら 、本発明の範囲および思想から逸脱する事なく、本明細書中に開示した技術に多 くの修飾および変更を行いうることは、当業者にとって明らかであろう。例えば 、ＤＮＡ配列における特定の突然変異体を得るために当業者に利用可能な数多く の方法がある。さらに、宿主細胞での発現および組換え産物の単離を行うために 多（の既知の方法が存在する。本明細書中で用いられる特定の方法において多く の変更をなすことができ、それにもかかわらず同様の結果が得られることを当業 者は認識するであろう。

本発明のこれらのそして全ての他の修飾は、添付の請求の範囲により規定される 本発明の範囲内に含まれるものとする。

ａ　５　Ｈ５ｐ　ｇ３　、、；　ｆ１ １コ１１１１目目 目　５５５　日　日　日　日　日 ｖｒｖｒｖｃｈＺＺｖｖｒ トドこと一一ト； ＋−１−、Ｊ−ＬＩＣ５Ｊ− ＺＺ：）：１＞Ｚ闇〆 Ｉ／１ψ−ＪＪＪＡＪ ＜＜ＱＱｃ５Ｑｔ−＋Ｚ ＃１亜裂裂剛＃目 日残弓日口μｍ１ ゛Ｈ１１暦Ｓ日１鋒 １裂２１１ｉ足ミ 仁　仁　に　さ　目　目　（支）ポ ＝　′５　に　以　分　百　目 日舞　ρ年毎−５５ｊｊｊ　ツ七＝臣瓢エニーＩ−１Σ：Ｅ：　＜　＜　＜　＜ 　４゜Ｑ−一ト国際調査報告 １ｍｅｍＭｌｅ＊ａｌ　ＡＳ＠＋ｌｃ８１ｍＭ　Ｎψ　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０ ２０８５国際調査報告 ＵＳ　９００２０８５ Ｓ＾　３６２９５

Claims (72)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリペプチドをポリペプチド切断産物に切断するための方法であって、ポリ ペプチド切断産物の間の所望の連結点においてポリペプチドを切断するための条 件下で、還元された遊離システイン型のポリペプチドを切断物質で処理すること からなる方法。
2. ２．切断物質が酵素である請求項１に記載の方法。
3. ３．切断を行う条件が穏やかな加水分解条件である請求項１に記載の方法。
4. ４．切断物質が化学的試薬である請求項１に記載の方法。
5. ５．該処理工程の前にポリペプチドを非酸化雰囲気下で維持する請求項１に記載 の方法。
6. ６．ポリペプチドをポリペプチド切断産物に切断するための方法であって、以下 からなる方法： （ａ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有する細胞を培養し：ここで 、Ａｓｐのコドンが該ＤＮＡ中のそれぞれの切断産物をコードしているＤＮＡ配 列の間の連結点に存在しており、この培養によってＤＮＡが発現して宿主細胞培 養物中にポリペプチドが産生される結果になる；そして （ｂ）Ａｓｐ連結点でポリペプチドを切断するための条件下で、還元された遊離 システイン型のポリペプチドをｐＨが約１〜３の酸で処理する。
7. ７．工程（ｂ）の前にポリペプチドを宿主細胞培養物から回収する請求項６に記 載の方法。
8. ８．工程（ｂ）の前に回収したポリペプチドを非酸化雰囲気下で維持する請求項 ７に記載の方法。
9. ９．非酸化雰囲気が不活性ガスまたは窒素雰囲気である請求項８に記載の方法。
10. １０．工程（ａ）の前に、細胞を、この細胞が認識するコントロール配列に機能 的に結合させた該ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換する請求項６に記載 の方法。
11. １１．細胞が原核性である請求項１０に記載の方法。
12. １２．細胞が大腸菌である請求項１１に記載の方法。
13. １３．発現ベクターがプラスミドである請求項１２に記載の方法。
14. １４．ＤＮＡによってコードされているポリペプチドが、配列：【配列がありま す】 ［配列中、ｍは０またはそれ以上であり、ｎは０またはそれ以上であり、ＸはＡ ｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、またはＧｌｕであり、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、ま たはＧｌｙであり、そしてｐｐｔはポリペプチド切断産物である］ を有するものである請求項６に記載の方法。
15. １５．ｍが１またはそれ以上であり、ｎが０〜１０である請求項１４に記載の方 法。
16. １６．ポリペプチドがＡｓｐ残基を含まないものである請求項１４に記載の方法 。
17. １７．ポリペプチド切断産物が内部Ａｓｐ残基を含まないものである請求項１４ に記載の方法。
18. １８．ポリペプチド切断産物がＨ２リラキシンのＡ鎖である請求項１７に記載の 方法。
19. １９．ポリペプチドが、配列： 【配列があります】 ［配列中、ｍは０またはそれ以上であり、Ｒ１ｘＡはリラキシンＡ鎖である］ を有するものである請求項１８に記載の方法。
20. ２０．ｍが２または３である請求項１９に記載の方法。
21. ２１．工程（ｂ）の後に少なくとも１つのポリペプチド切断産物を分離し、単離 する工程をさらに含む請求項６に記載の方法。
22. ２２．単離した切断産物をポリペプチドの別のペプチジルフラグメントと混合す ることをさらに含む請求項２１に記載の方法。
23. ２３．単離した切断産物がリラキシンのＡ鎖であり、ペプチジルフラグメントが リラキシンのＢ鎖である請求項２２に記載の方法。
24. ２４．リラキシンのＡ鎖およびＢ鎖がＨ２リラキシン鎖である請求項２３に記載 の方法。
25. ２５．ポリペプチドをコードしているＤＮＡが該ポリペプチドのプレ、プレプロ またはプロ形態をコードしている請求項６に記載の方法。
26. ２６．ポリペプチドをコードしているＤＮＡがプレインスリン、プレプロインス リン、プロインスリン、プレリラキシン、プレプロリラキシン、またはプロリラ キシンをコードしている請求項２５に記載の方法。
27. ２７．ＤＮＡがＨ１またはＨ２プレリラキシン、プレプロリラキシンまたはプロ リラキシンであり、ＡＳＰコドンが該連結点に導入されている請求項２６に記載 の方法。
28. ２８．ＤＮＡがＨ２プロリラキシンである請求項２７に記載の方法。
29. ２９．工程（ｂ）の後にプロリラキシンのＡ鎖を分離し、単離することをさらに 含む請求項２８に記載の方法。
30. ３０．酸が酢酸、塩酸または硫酸である請求項６に記載の方法。
31. ３１．（ａ）ポリペプチドを還元条件下に供して該ポリペプチドのシステイン残 基がジスルフィド結合しないようにし；そして（ｂ）該ポリペプチド中の予め決 めたペプチド結合を加水分解することからなる方法。
32. ３２．加水分解を無酸素雰囲気下で行う請求項３１に記載の方法。
33. ３３．工程（ａ）のポリペプチドをｐＨが約１〜３の酸と接触させることによっ て加水分解を行う請求項３１に記載の方法。
34. ３４．生物学的に活性なヒトリラキシンの製造方法であって、以下の工程からな る方法： （ａ）ヒトリラキシンＡ鎖を構成するポリペプチドをコードしているＤＮＡを含 有する発現ベクターを得：ここで、該Ａ鎖の一方または両方の末端にＡｓｐコド ンが導入されており、該ＤＮＡは宿主細胞によって認識されるコントロール配列 に機能的に結合してい。；（ｂ）適当な宿主細胞を該ベクターで形質転換し；（ ｃ）ＤＮＡが発現されるように該形質転換細胞を培養して、該リラキシンＡ鎖を 構成するポリペプチド配列を産生させ；（ｄ）該培養物からポリペプチドを回収 し；（ｅ）還元された遊離システイン型の回収ポリペプチドを、Ａｓｐ連結点で このポリペプチドを切断する条件のもと、ｐＨが約１〜３の酸で処理して切断産 物を得； （ｆ）該切断産物を分離し；そして （ｇ）該Ａ鎖をリラキシンＢ鎖と結合させて生物学的に活性なヒトリラキシンを 得る。
35. ３５．工程（ｅ）の前に工程（ｄ）で回収したポリペプチドを、非酸化雰囲気下 に維持した還元物質を含む緩衝液中に透析または透析濾過する請求項３４に記載 の方法。
36. ３６．非酸化雰囲気がアルゴンまたはヘリウム雰囲気であり、工程（ｅ）が、最 初の透析または透析濾過工程後の０〜２４時間の酸溶液中へのポリペプチドの透 析または透析濾過、および２〜１０時間のポリペプチドと酸の接触維持からなる 請求項３５に記載の方法。
37. ３７．Ｂ鎖がそのＮ−末端から始まって２６以上のアミノ酸残基を含有する請求 項３４に記載の方法。
38. ３８．Ｂ鎖がそのＮ−末端から始まって２９または３３のアミノ酸残基を含有す る請求項３７に記載の方法。
39. ３９．ＤＮＡがコードしているポリペプチドがヒトリラキシンＢ鎖からなる請求 項３４に記載の方法。
40. ４０．ポリペプチドがヒトリラキシンＣ鎖もしくはシグナル配列またはその両方 をさらに含有している請求項３９に記載の方法。
41. ４１．ポリペプチドがＨ１またはＨ２プレプロリラキシンまたはプロリラキシン である請求項４０に記載の方法。
42. ４２．ポリペプチドがＨ２プロリラキシンである請求項４１に記載の方法。
43. ４３．プロリラキシンが次のようなものである請求項３４に記載の方法： （ａ）リラキシンＣ鎖の４個のＣ−末端アミノ酸が、配列：Ｘｎ−Ｙ ［配列中、ＸはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、ＹはＡ ｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上である］ で置換されており；そして （ｂ）リラキシンＡ鎖がＡｓｐ残基によって先行されている。
44. ４４．配列Ｘｎ−Ｙが、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａである請求項４３に記 載の方法。
45. ４５．酸が酢酸、塩酸または硫酸である請求項３４に記載の方法。
46. ４６．ＤＮＡが少なくとも２つのリラキシンＡ鎖をコードしている請求項３４に 記載の方法。
47. ４７．ＤＮＡが、配列： 【配列があります】 ［配列中、ｍは０またはそれ以上であり、ｎは０またはそれ以上であり、ＸはＡ ｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、ま たはＧｌｙであり、そしてＲ１ｘＡはリラキシンＡ鎖である］を有するポリペプ チドをコードしている請求項３４に記載の方法。
48. ４８．ｍが１またはそれ以上であり、ｎが０〜１０である請求項４７に記載の方 法。
49. ４９．配列が、 【配列があります】 である請求項４７に記載の方法。
50. ５０．ｍが２または３である請求項４９に記載の方法。
51. ５１．切断されるのが所望であるポリペプチドをコードしている核酸を得るため の方法であって、アミノ酸配列：Ｘｎ−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、ＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ をコードしているコドンを所望の切断点に導入することからなる方法。
52. ５２．ｎが０〜１０であり、該導入前にポリペプチドが切断に干渉するであろう Ａｓｐ残基を含んでいない請求項５１に記載の方法。
53. ５３．Ｃ鎖およびＡ鎖からなる前駆体ヒトリラキシンの変異体をコードしている 核酸を得るための方法であって、配列：Ｘｎ−Ｙ− ［配列中、ＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ をコードしているコドンをＣ鎖のＣ−末端に導入し、そしてＣ鎖とＡ鎖の間にＡ ｓｐのコドンを挿入することからなる方法。
54. ５４．核酸がＨ２プロリラキシンまたはプレプロリラキシンをコードしている請 求項５３に記載の方法。
55. ５５．核酸がＨ２プロリラキシンをコードしているＤＮＡである請求項５４に記 載の方法。
56. ５６．配列が、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａである請求項５５に記載の方法 。
57. ５７．切断されるのが所望であるポリペプチドをコードしている核酸であって、 アミノ酸配列： Ｘｎ−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、ＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ を所望の切断点にコードしている核酸。
58. ５８．ｎが０〜１０であり、ポリペプチドが所望の切断に干渉するであろうＡｓ ｐ残基を含んでいない請求項５７に記載の核酸。
59. ５９．Ｃ鎖およびＡ鎖からなる前駆体ヒトリラキシンの変異体をコードしている 核酸であって、配列： Ｘｎ−Ｙ ［配列中、ＸはＰｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ をコードしているコドンをＣ鎖のＣ−末端に含有し、そしてＣ鎖とＡ鎖の間にＡ ｓｐのコドンが挿入された核酸。
60. ６０．Ｈ２プロリラキシンまたはプレプロリラキシンをコードしている請求項５ ９に記載の核酸。
61. ６１．Ｈ２プロリラキシンをコードしているＤＮＡである請求項６０に記載の核 酸。
62. ６２．配列が、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａである請求項６１に記載の核酸 。
63. ６３．宿主細胞によって認識されるコントロール配列に機能的に結合した請求項 ５７に記載の核酸を含有する発現ベクター。
64. ６４．宿主細胞によって認識されるコントロール配列に機能的に結合した請求項 ５９に記載の核酸を含有する発現ベクター。
65. ６５．請求項６３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
66. ６６．請求項６４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
67. ６７．切断されるのが所望であるポリペプチドであって、アミノ酸配列： Ｘｎ−Ｙ−Ａｓｐ ［配列中、ＸはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ を所望の切断点に含有しているポリペプチド。
68. ６８．ｎが０〜１０であり、ポリペプチドが所望の切断に干渉するであろうＡｓ ｐ残基を含んでいない請求項６７に記載のポリペプチド。
69. ６９．Ｃ鎖およびＡ鎖からなる前駆体ヒトリラキシンの変異体であって、配列： Ｘｎ−Ｙ ［配列中、ＸはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏのいずれかであ り、ＹはＡｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、そしてｎは０またはそれ以上で ある］ をＣ鎖のＣ−末端に含有し、そしてＣ鎖とＡ鎖の間にＡｓｐ残基が挿入された変 異体。
70. ７０．前駆体がＨ２プロリラキシンまたはプレプロリラキシンである請求項６９ に記載の変異体。
71. ７１．前駆体がＨ２プロリラキシンである請求項７０に記載の変異体。
72. ７２．Ｃ鎖の４個のＣ−末端アミノ酸が、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａで置 換された請求項７１に記載の変異体。