JPH0776599A - ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウシ成長ホルモンを効率よく生産し得る微生
物を提供する。 【構成】 改良された翻訳特性を有する伝令ＲＮＡを与
えるＤＮＡを組み込んだ微生物を培養することにより、
効率よくウシ成長ホルモンを生産することができる。
物を提供する。 【構成】 改良された翻訳特性を有する伝令ＲＮＡを与
えるＤＮＡを組み込んだ微生物を培養することにより、
効率よくウシ成長ホルモンを生産することができる。
Description
【０００１】本発明は改良された翻訳特性を有する伝令
(メッセンジャ)ＲＮＡを与えるＤＮＡ配列を利用した、
ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物に関する。本発明
によれば、そのような改良された伝令ＲＮＡは翻訳の際
に極めて有効であって、宿主微生物に対して通常異種の
ポリペプチド生産物の実質的な量を生ずる。前記ＤＮＡ
配列は最終的に発現され、即ち、ＤＮＡ配列は伝令ＲＮ
Ａ(mＲＮＡ)に転写され、このmＲＮＡは引き続きポリペ
プチド生産物に翻訳されるが、本発明によるＤＮＡ配列
の本質的な部分は、対応する転写されたmＲＮＡ中の二
次及び／又は三次構造の実質的な削減(reduction)又は
除去(elimination)に好都合な手段を用いて合成的に製
造される。mＲＮＡの５'−末端を含むそのような二次／
三次構造が存在しないか又は実質的に削減されると、認
識と次の翻訳のためのmＲＮＡに対するリボゾームの結
合が有効に行なわれ得る。このようにして、翻訳効率
は、転写されたmＲＮＡの構造中の立体配座の障害によ
って妨害されたり又は損なわれたりしない。二次／三次
構造がある好ましい範囲以内に保持されることを保証す
るために選定された関連手段は勿論、mＲＮＡの二次／
三次構造を測定するための方法と手段とが説明される。
本発明は各種の好ましい蛋白質生産物を製造することに
よって例示される。
(メッセンジャ)ＲＮＡを与えるＤＮＡ配列を利用した、
ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物に関する。本発明
によれば、そのような改良された伝令ＲＮＡは翻訳の際
に極めて有効であって、宿主微生物に対して通常異種の
ポリペプチド生産物の実質的な量を生ずる。前記ＤＮＡ
配列は最終的に発現され、即ち、ＤＮＡ配列は伝令ＲＮ
Ａ(mＲＮＡ)に転写され、このmＲＮＡは引き続きポリペ
プチド生産物に翻訳されるが、本発明によるＤＮＡ配列
の本質的な部分は、対応する転写されたmＲＮＡ中の二
次及び／又は三次構造の実質的な削減(reduction)又は
除去(elimination)に好都合な手段を用いて合成的に製
造される。mＲＮＡの５'−末端を含むそのような二次／
三次構造が存在しないか又は実質的に削減されると、認
識と次の翻訳のためのmＲＮＡに対するリボゾームの結
合が有効に行なわれ得る。このようにして、翻訳効率
は、転写されたmＲＮＡの構造中の立体配座の障害によ
って妨害されたり又は損なわれたりしない。二次／三次
構造がある好ましい範囲以内に保持されることを保証す
るために選定された関連手段は勿論、mＲＮＡの二次／
三次構造を測定するための方法と手段とが説明される。
本発明は各種の好ましい蛋白質生産物を製造することに
よって例示される。
【０００２】組換えＤＮＡ技術の出現によって、莫大な
数の有用なポリペプチドの制御された微生物生産が可能
になり、ホルモン類、酵素類、抗体類及び広範な疾病に
対して有用なワクチン類の微生物による管理された生産
が可能になりつつある。ヒト成長ホルモン及び白血球イ
ンターフェロン等の多くの哺乳動物のポリペプチド類も
各種の微生物によって既に生産されている。
数の有用なポリペプチドの制御された微生物生産が可能
になり、ホルモン類、酵素類、抗体類及び広範な疾病に
対して有用なワクチン類の微生物による管理された生産
が可能になりつつある。ヒト成長ホルモン及び白血球イ
ンターフェロン等の多くの哺乳動物のポリペプチド類も
各種の微生物によって既に生産されている。
【０００３】組換えＤＮＡ技術の基本的な要素の一つ
は、プラスミド即ち頻々細胞１個当たりマルチコピーと
して細菌中に見出される二本鎖ＤＮＡの染色体外ループ
である。娘細胞中でプラスミドを複製するのに必要とさ
れる遺伝情報(即ち“レプリコン")と、通常抗生物質に
対する耐性等の１種又は２種以上の選択特性とが、プラ
スミドＤＮＡ中にコードされている遺伝情報中に含まれ
る。これらの選択特性は、選択培地中で認識され且つ優
先的に成長させられるべき目的とするプラスミドを包含
する宿主細胞のクローンを可能にする。そのような細菌
プラスミドの有用性は、これらのプラスミドを一つ又は
別の制限エンドヌクレアーゼ又は“制限酵素"によって
特異的に開裂することができ、これらがそれぞれプラス
ミドＤＮＡ上の異なる部位を認識するという事実にあ
る。異種遺伝子又は遺伝子断片は、開裂部位又は開裂部
位に隣接する再生末端において末端−末端結合させるこ
とによってプラスミド中に挿入されうる。(既に用いら
れたように、用語“異種"は、所与の微生物中に通常見
出されない遺伝子又は通常所与の微生物によって生産さ
れないポリペプチド配列を指称し、一方、用語“同種"
は、対応する野性型微生物中に見出される又は対応する
野性型の微生物によって産生される遺伝子又はポリペプ
チドを指称する。)所謂複製可能発現ベヒクルはこのよ
うにして形成される。
は、プラスミド即ち頻々細胞１個当たりマルチコピーと
して細菌中に見出される二本鎖ＤＮＡの染色体外ループ
である。娘細胞中でプラスミドを複製するのに必要とさ
れる遺伝情報(即ち“レプリコン")と、通常抗生物質に
対する耐性等の１種又は２種以上の選択特性とが、プラ
スミドＤＮＡ中にコードされている遺伝情報中に含まれ
る。これらの選択特性は、選択培地中で認識され且つ優
先的に成長させられるべき目的とするプラスミドを包含
する宿主細胞のクローンを可能にする。そのような細菌
プラスミドの有用性は、これらのプラスミドを一つ又は
別の制限エンドヌクレアーゼ又は“制限酵素"によって
特異的に開裂することができ、これらがそれぞれプラス
ミドＤＮＡ上の異なる部位を認識するという事実にあ
る。異種遺伝子又は遺伝子断片は、開裂部位又は開裂部
位に隣接する再生末端において末端−末端結合させるこ
とによってプラスミド中に挿入されうる。(既に用いら
れたように、用語“異種"は、所与の微生物中に通常見
出されない遺伝子又は通常所与の微生物によって生産さ
れないポリペプチド配列を指称し、一方、用語“同種"
は、対応する野性型微生物中に見出される又は対応する
野性型の微生物によって産生される遺伝子又はポリペプ
チドを指称する。)所謂複製可能発現ベヒクルはこのよ
うにして形成される。
【０００４】ＤＮＡ組換えは微生物の外側で行われ、得
られる“組換体"プラスミドを形質転換として知られる
方法によって微生物中に導入することができ、形質転換
体を成長させることによって、大量の異種遺伝子を含む
組換体プラスミドを得る。更に、コードＤＮＡの転写と
翻訳を支配するプラスミドの構成部分に対して遺伝子を
適切に挿入した場合には、挿入された遺伝子がコードし
ているポリペプチド配列を実際に産生する(発現と指称
される過程)ために、得られるプラスミドを用いること
ができる。(異種)遺伝子を発現するプラスミドを、複製
可能発現ベヒクルと指称する。
られる“組換体"プラスミドを形質転換として知られる
方法によって微生物中に導入することができ、形質転換
体を成長させることによって、大量の異種遺伝子を含む
組換体プラスミドを得る。更に、コードＤＮＡの転写と
翻訳を支配するプラスミドの構成部分に対して遺伝子を
適切に挿入した場合には、挿入された遺伝子がコードし
ているポリペプチド配列を実際に産生する(発現と指称
される過程)ために、得られるプラスミドを用いること
ができる。(異種)遺伝子を発現するプラスミドを、複製
可能発現ベヒクルと指称する。
【０００５】発現は、プロモーターとして公知のＤＮＡ
領域において開始される。ある場合には、後述のlac及
びtrpシステムにおけるように、プロモーター領域は
“オペレーター"領域とオーバーラップして、結合プロ
モーター−オペレーター(combinedpromotor−operator)
を形成する。オペレーターはいわゆるリプレッサー蛋白
質によって認識されるＤＮＡ配列であって、このリプレ
ッサー蛋白質は特定のプロモーターからの転写開始の頻
度を調節するのに役立つ。発現の転写期において、ＲＮ
ＡポリメラーゼはプロモーターＤＮＡ中のある配列を認
識し、且つプロモーターＤＮＡに結合する。結合相互作
用は、この領域においてＤＮＡのほぐれ(unwinding)を
生起させ、且つ伝令ＲＮＡ合成用の鋳型としてＤＮＡを
露出させる。伝令ＲＮＡはリボゾームのための鋳型とし
て役立つ。このリボゾームは、伝令ＲＮＡと結合し、且
つmＲＮＡをＲＮＡ／ＤＮＡがコードしているアミノ酸
配列を有するポリペプチド鎖に翻訳する。それぞれのア
ミノ酸はヌクレオチドトリプレット、即ち“コドン"に
よってコードされる。これらのコドンが集まって“構造
遺伝子"即ち発現されるポリペプチド生産物のアミノ酸
配列をコードしているＤＮＡ配列の部分を構成する。
領域において開始される。ある場合には、後述のlac及
びtrpシステムにおけるように、プロモーター領域は
“オペレーター"領域とオーバーラップして、結合プロ
モーター−オペレーター(combinedpromotor−operator)
を形成する。オペレーターはいわゆるリプレッサー蛋白
質によって認識されるＤＮＡ配列であって、このリプレ
ッサー蛋白質は特定のプロモーターからの転写開始の頻
度を調節するのに役立つ。発現の転写期において、ＲＮ
ＡポリメラーゼはプロモーターＤＮＡ中のある配列を認
識し、且つプロモーターＤＮＡに結合する。結合相互作
用は、この領域においてＤＮＡのほぐれ(unwinding)を
生起させ、且つ伝令ＲＮＡ合成用の鋳型としてＤＮＡを
露出させる。伝令ＲＮＡはリボゾームのための鋳型とし
て役立つ。このリボゾームは、伝令ＲＮＡと結合し、且
つmＲＮＡをＲＮＡ／ＤＮＡがコードしているアミノ酸
配列を有するポリペプチド鎖に翻訳する。それぞれのア
ミノ酸はヌクレオチドトリプレット、即ち“コドン"に
よってコードされる。これらのコドンが集まって“構造
遺伝子"即ち発現されるポリペプチド生産物のアミノ酸
配列をコードしているＤＮＡ配列の部分を構成する。
【０００６】プロモーターに結合した後に、ＲＮＡポリ
メラーゼは、翻訳開始信号即ち“スタート"シグナル(通
常ＡＴＧ、得られる伝令ＲＮＡではＡＵＧになる)を含
むリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡの転写を開始
し、その後に、構造遺伝子自体をコードするＤＮＡ配列
を転写する。構造遺伝子の末端でいわゆる翻訳停止コド
ン(ストップコドン)が転写され、その後で、ポリメラー
ゼは伝令ＲＮＡの付加配列を形成しうる。この翻訳停止
信号が存在するために、伝令ＲＮＡの付加配列はリボゾ
ームによって翻訳されずに存在するであろう。リボゾー
ムは、通常細菌中でmＲＮＡが形成されるとすぐ伝令Ｒ
ＮＡ上に構成された結合部位に結合し、次に、コードさ
れたポリペプチドの生産を指令し、翻訳開始信号で開始
し、前述の停止信号で停止する。宿主細胞を溶菌し、且
つ適切な精製によって生産物を他の細菌蛋白質から回収
することによって、得られる生産物を取得しうる。
メラーゼは、翻訳開始信号即ち“スタート"シグナル(通
常ＡＴＧ、得られる伝令ＲＮＡではＡＵＧになる)を含
むリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡの転写を開始
し、その後に、構造遺伝子自体をコードするＤＮＡ配列
を転写する。構造遺伝子の末端でいわゆる翻訳停止コド
ン(ストップコドン)が転写され、その後で、ポリメラー
ゼは伝令ＲＮＡの付加配列を形成しうる。この翻訳停止
信号が存在するために、伝令ＲＮＡの付加配列はリボゾ
ームによって翻訳されずに存在するであろう。リボゾー
ムは、通常細菌中でmＲＮＡが形成されるとすぐ伝令Ｒ
ＮＡ上に構成された結合部位に結合し、次に、コードさ
れたポリペプチドの生産を指令し、翻訳開始信号で開始
し、前述の停止信号で停止する。宿主細胞を溶菌し、且
つ適切な精製によって生産物を他の細菌蛋白質から回収
することによって、得られる生産物を取得しうる。
【０００７】組換えＤＮＡ技術を用いることによって発
現されるポリペプチドは、ヒト成長ホルモンの直接発現
の場合のように完全に異種の機能性蛋白質であるか、も
しくはその代わりに、ソマトスタチン中間体及びせヒト
インシュリンの成分の産生の場合のように生物活性異種
ポリペプチド部分とそれに融合した同種ポリペプチドの
アミノ酸配列部分とを含み得る。後者の場合には、例え
ば、融合した同種ポリペプチドはベータ ガラクトシダ
ーゼのアミノ酸配列部分を含んでいた。これらの場合、
所期の生物活性生産物は、細胞外の環境で開裂されるま
では、融合した同種／異種ポリペプチド内で生物不活性
にされている。今、述べたような融合蛋白質は、例えば
メチオニンに対する臭化シアンの作用により又は酵素開
裂によって、所期の生産物から前駆体蛋白質を極めて特
異的に開裂し得るようにすることができる。例えば、英
国特許出願公開第２,００７,６７６Ａ号を参照された
い。
現されるポリペプチドは、ヒト成長ホルモンの直接発現
の場合のように完全に異種の機能性蛋白質であるか、も
しくはその代わりに、ソマトスタチン中間体及びせヒト
インシュリンの成分の産生の場合のように生物活性異種
ポリペプチド部分とそれに融合した同種ポリペプチドの
アミノ酸配列部分とを含み得る。後者の場合には、例え
ば、融合した同種ポリペプチドはベータ ガラクトシダ
ーゼのアミノ酸配列部分を含んでいた。これらの場合、
所期の生物活性生産物は、細胞外の環境で開裂されるま
では、融合した同種／異種ポリペプチド内で生物不活性
にされている。今、述べたような融合蛋白質は、例えば
メチオニンに対する臭化シアンの作用により又は酵素開
裂によって、所期の生産物から前駆体蛋白質を極めて特
異的に開裂し得るようにすることができる。例えば、英
国特許出願公開第２,００７,６７６Ａ号を参照された
い。
【０００８】組換えＤＮＡ技術が嘱望に完全に応えるに
は、制御された環境において且つ高収率で所期のポリペ
プチド生産物を入手することができるように、遺伝子挿
入物の発現を最大限に活用するシステムが考え出さねば
ならない。
は、制御された環境において且つ高収率で所期のポリペ
プチド生産物を入手することができるように、遺伝子挿
入物の発現を最大限に活用するシステムが考え出さねば
ならない。
【０００９】例えば、異種ポリペプチドの微生物生産を
開始させ且つ維持するために、ベータラクタマーゼ及び
ラクトースプロモーターシステムとが有利に使用されて
きた。これらのプロモーターシステムの調製と構成に関
する詳細は、Ｃｈａｎｇ等のＮature,２７５巻、６１７
頁(１９７８年)及びＩtakura等のＳcience, １９８巻、
１０５６頁(１９７７年)によって発表された。これらは
参考のためにここに引用する。比較的最近、トリプトフ
ァンに基づくシステム、いわゆるtrpプロモーターシス
テムが開発された。このシステムの調製と構成に関する
詳細は、Ｇoeddel等のＮucleic Ａcids Ｒesearch,
８巻、４０５７頁(１９８０年)及び１９８０年３月２４
日に出願されたＫleid等のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.第１３３,２９
６号によって発表された。これらの参考のためにここに
引用する。莫大な他の微生物プロモーターが発見され利
用されてきた。これらのプロモーターのヌクレオチド配
列に関する詳細は、当業者がこれらのプロモーターをプ
ラスミドベクター内に機能的に結合することを可能にす
る。その詳細は発表されており、例えば、参考のために
ここに引用するＳiebenlist等のＣell, ２０巻、２６９
頁(１９８０年)を参照されたい。
開始させ且つ維持するために、ベータラクタマーゼ及び
ラクトースプロモーターシステムとが有利に使用されて
きた。これらのプロモーターシステムの調製と構成に関
する詳細は、Ｃｈａｎｇ等のＮature,２７５巻、６１７
頁(１９７８年)及びＩtakura等のＳcience, １９８巻、
１０５６頁(１９７７年)によって発表された。これらは
参考のためにここに引用する。比較的最近、トリプトフ
ァンに基づくシステム、いわゆるtrpプロモーターシス
テムが開発された。このシステムの調製と構成に関する
詳細は、Ｇoeddel等のＮucleic Ａcids Ｒesearch,
８巻、４０５７頁(１９８０年)及び１９８０年３月２４
日に出願されたＫleid等のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.第１３３,２９
６号によって発表された。これらの参考のためにここに
引用する。莫大な他の微生物プロモーターが発見され利
用されてきた。これらのプロモーターのヌクレオチド配
列に関する詳細は、当業者がこれらのプロモーターをプ
ラスミドベクター内に機能的に結合することを可能にす
る。その詳細は発表されており、例えば、参考のために
ここに引用するＳiebenlist等のＣell, ２０巻、２６９
頁(１９８０年)を参照されたい。
【００１０】歴史的には、組換クローニングベヒクル
(とりわけ、複製の機能源(オリジン)を有する染色体外
二本鎖ＤＮＡ)が調製され、微生物を形質転換するのに
用いられた------Ｕllrich等のＳcience, １９６巻、１
３１３頁(１９７７年)を参照されたい。後に、異種ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子挿入体を実際に発現
する試みが行われた。Ｉtakura等(Ｓcience, １９８
巻、１０５６頁(１９７７年)はソマトスタチンをコード
する遺伝子をＥ．coli中で発現した。その他の同様な成
功が続いたが、この場合、遺伝子挿入物は、新規で精巧
な技術を用いる有機合成によって構成された。とりわ
け、微生物内でポリペプチド生産物の起こりうる蛋白質
分解を避けるように、前駆体ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列に遺伝子を結合した。上述した如く、細胞外
開裂によって所期の蛋白質生産物が得られた。
(とりわけ、複製の機能源(オリジン)を有する染色体外
二本鎖ＤＮＡ)が調製され、微生物を形質転換するのに
用いられた------Ｕllrich等のＳcience, １９６巻、１
３１３頁(１９７７年)を参照されたい。後に、異種ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子挿入体を実際に発現
する試みが行われた。Ｉtakura等(Ｓcience, １９８
巻、１０５６頁(１９７７年)はソマトスタチンをコード
する遺伝子をＥ．coli中で発現した。その他の同様な成
功が続いたが、この場合、遺伝子挿入物は、新規で精巧
な技術を用いる有機合成によって構成された。とりわ
け、微生物内でポリペプチド生産物の起こりうる蛋白質
分解を避けるように、前駆体ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列に遺伝子を結合した。上述した如く、細胞外
開裂によって所期の蛋白質生産物が得られた。
【００１１】より大きな蛋白質の場合には、基本的なＤ
ＮＡ配列の化学合成は実用的でないことが判明した。従
って、必要な組織及び／又は培養細胞から得られる対応
する伝令ＲＮＡからの逆転写による遺伝子配列の調製に
頼らねばならなかった。これらの方法は、完全な配列が
不足して転写が終了するために、必ずしも満足すべきも
のでないことが判明し、及び／又は、所望の配列は天然
に存在する前駆体リーダー又はシグナルＤＮＡを伴うで
あろう。このようにして、これらの試みは不完全な蛋白
質生成物及び／又は開裂しえない共役形態の蛋白質生成
物を頻々生成した----Ｖilla−Ｋomaroff等のＰroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ), ７５巻、３７２７頁(１
９７８年)及びＳeeburg等のＮature, ２７６巻、７９５
頁(１９７８年)を参照されたい。
ＮＡ配列の化学合成は実用的でないことが判明した。従
って、必要な組織及び／又は培養細胞から得られる対応
する伝令ＲＮＡからの逆転写による遺伝子配列の調製に
頼らねばならなかった。これらの方法は、完全な配列が
不足して転写が終了するために、必ずしも満足すべきも
のでないことが判明し、及び／又は、所望の配列は天然
に存在する前駆体リーダー又はシグナルＤＮＡを伴うで
あろう。このようにして、これらの試みは不完全な蛋白
質生成物及び／又は開裂しえない共役形態の蛋白質生成
物を頻々生成した----Ｖilla−Ｋomaroff等のＰroc．Ｎ
atl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ), ７５巻、３７２７頁(１
９７８年)及びＳeeburg等のＮature, ２７６巻、７９５
頁(１９７８年)を参照されたい。
【００１２】これらの困難を回避するために、Ｇoeddel
等(Ｎature, ２８１巻、５４４頁(１９７９年))は酵素
的に合成されたＤＮＡと共に化学的に合成されたＤＮＡ
を用いて、とりわけヒト成長ホルモンをコードするＤＮ
Ａを組み立てた。このようにして、この知見により、雑
種(ハイブリッド)ＤＮＡ(化学的に合成されたＤＮＡと
酵素的に合成されたＤＮＡとの組み合わせ)の微生物発
現を可能にする手段が利用できるようになった。この雑
種ＤＮＡは、特に入手が限られている蛋白質をコードす
る。この蛋白質は、他の方法では経済的に恐らく生産さ
れなかったであろう。異種ポリペプチドをコードする雑
種ＤＮＡは、実質的部分、好ましくは大部分がmＲＮＡ
の逆転写によって構成され、一方、残余の部分は化学合
成によって構成される。好ましい具体例において、ヒト
成長ホルモン(ＨＧＨ)の最初の２４個のアミノ酸をコー
ドする合成ＤＮＡは、ＨＧＨアミノ酸の２３番目と２４
番目に対応するＤＮＡ中にエンドヌクレアーゼ制限部位
を組み入れる計画に従って組み立てられた。これは下流
のＨＧＨ cＤＮＡ配列との連結を容易にするために行
われた。次に、遺伝子合成に関する公知の下記基準に従
って、ＤＮＡの合成部分を造っている１２個の各種オリ
ゴヌクレオチドの長い断片が選択された: 当然ではある
が、二本鎖配列の対向する部分を占めるべく予定された
断片を除いて、断片同士の余分な相補性の回避; 転写終
了を最小にすべく、ＡＴに富む領域の回避; 及び“微生
物に好ましいコドン"の選択。合成に続いて、断片は相
補水素結合を行うことを許容され、それ自体公知の方法
に従って結合された。この研究は、１９７９年７月５日
に出願されたＧoeddel等のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.第５５１２６号
に対応する英国特許出願公開第２０５５３８２Ａ号明細
書に記載されている。これを参考のためにここに引用す
る。
等(Ｎature, ２８１巻、５４４頁(１９７９年))は酵素
的に合成されたＤＮＡと共に化学的に合成されたＤＮＡ
を用いて、とりわけヒト成長ホルモンをコードするＤＮ
Ａを組み立てた。このようにして、この知見により、雑
種(ハイブリッド)ＤＮＡ(化学的に合成されたＤＮＡと
酵素的に合成されたＤＮＡとの組み合わせ)の微生物発
現を可能にする手段が利用できるようになった。この雑
種ＤＮＡは、特に入手が限られている蛋白質をコードす
る。この蛋白質は、他の方法では経済的に恐らく生産さ
れなかったであろう。異種ポリペプチドをコードする雑
種ＤＮＡは、実質的部分、好ましくは大部分がmＲＮＡ
の逆転写によって構成され、一方、残余の部分は化学合
成によって構成される。好ましい具体例において、ヒト
成長ホルモン(ＨＧＨ)の最初の２４個のアミノ酸をコー
ドする合成ＤＮＡは、ＨＧＨアミノ酸の２３番目と２４
番目に対応するＤＮＡ中にエンドヌクレアーゼ制限部位
を組み入れる計画に従って組み立てられた。これは下流
のＨＧＨ cＤＮＡ配列との連結を容易にするために行
われた。次に、遺伝子合成に関する公知の下記基準に従
って、ＤＮＡの合成部分を造っている１２個の各種オリ
ゴヌクレオチドの長い断片が選択された: 当然ではある
が、二本鎖配列の対向する部分を占めるべく予定された
断片を除いて、断片同士の余分な相補性の回避; 転写終
了を最小にすべく、ＡＴに富む領域の回避; 及び“微生
物に好ましいコドン"の選択。合成に続いて、断片は相
補水素結合を行うことを許容され、それ自体公知の方法
に従って結合された。この研究は、１９７９年７月５日
に出願されたＧoeddel等のＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.第５５１２６号
に対応する英国特許出願公開第２０５５３８２Ａ号明細
書に記載されている。これを参考のためにここに引用す
る。
【００１３】そのような雑種ＤＮＡに関して好結果を与
える製造と発現は、異種ポリペプチド製造のための有用
な手段を与えたけれども、この手段は、多量の最終生産
物を与える方法の場合に、真核生物遺伝子が原核生物発
現機構によって必ずしも認識されないという一般的問題
を処理してなかった。進化は個々の微生物に独特な複雑
化(sophistication)を組み入れた。真核生物遺伝子挿入
物が原核生物に対して異種であることを考慮すると、遺
伝子がcＤＮＡから化学的に生産されるか、又は雑種と
して化学的に生産されても、頻々観察される発現上の相
対的な無効力は、いずれの遺伝子挿入物に対しても真実
でありうる。このように、上に規定したＨＧＨ用の遺伝
子の合成部分を組み立てるために使用した基準は、発現
レベルに影響を与える唯一の要因ではない。例えば、以
前の研究者が行ったように(英国特許出願公開第２００
７６７６Ａ号を参照されたい)コドン選択に全力を注い
でも、発現の効率を最大の発現レベルに上昇せしめる点
には完全には成功しなかった。
える製造と発現は、異種ポリペプチド製造のための有用
な手段を与えたけれども、この手段は、多量の最終生産
物を与える方法の場合に、真核生物遺伝子が原核生物発
現機構によって必ずしも認識されないという一般的問題
を処理してなかった。進化は個々の微生物に独特な複雑
化(sophistication)を組み入れた。真核生物遺伝子挿入
物が原核生物に対して異種であることを考慮すると、遺
伝子がcＤＮＡから化学的に生産されるか、又は雑種と
して化学的に生産されても、頻々観察される発現上の相
対的な無効力は、いずれの遺伝子挿入物に対しても真実
でありうる。このように、上に規定したＨＧＨ用の遺伝
子の合成部分を組み立てるために使用した基準は、発現
レベルに影響を与える唯一の要因ではない。例えば、以
前の研究者が行ったように(英国特許出願公開第２００
７６７６Ａ号を参照されたい)コドン選択に全力を注い
でも、発現の効率を最大の発現レベルに上昇せしめる点
には完全には成功しなかった。
【００１４】数種の雑種リボゾーム結合部位を用いて実
験したＧuarante等のＳcience, ２０９巻、１４２８頁
(１９８０年)は、シン−デルガルノ配列(Ｓhine−Ｄelg
arnoＳequence)と若干の公知のＥ．coli結合部位との間
で塩基対の数を一致させるべく計画したけれども、これ
らの研究は、原核生物による真核生物遺伝子発現につい
て比較的低い効率を得た理由がより微妙であることを示
唆している。
験したＧuarante等のＳcience, ２０９巻、１４２８頁
(１９８０年)は、シン−デルガルノ配列(Ｓhine−Ｄelg
arnoＳequence)と若干の公知のＥ．coli結合部位との間
で塩基対の数を一致させるべく計画したけれども、これ
らの研究は、原核生物による真核生物遺伝子発現につい
て比較的低い効率を得た理由がより微妙であることを示
唆している。
【００１５】mＲＮＡ翻訳の開始は多成分プロセスであ
りうることが、Ｉserentant及びＦiersのＧene, ９巻、
１頁(１９８０年)によって報告された研究によって説明
される。これらの研究者は、mＲＮＡの二次構造は翻訳
効率に影響する成分の一つであることを仮定し、且つ二
次構造の折り畳まれたmＲＮＡの開始コドン及びリボゾ
ームとの相互作用部位が“受け入れ得る(accessible)"
筈であることを示唆している。しかしながら、これらの
研究者が“受け入れ得る"と言っていることは、明らか
に、このコドンと部位が仮定した二次構造モデルの幹(s
tem)よりはむしろループ(loop)上に存ることを指すもの
である。
りうることが、Ｉserentant及びＦiersのＧene, ９巻、
１頁(１９８０年)によって報告された研究によって説明
される。これらの研究者は、mＲＮＡの二次構造は翻訳
効率に影響する成分の一つであることを仮定し、且つ二
次構造の折り畳まれたmＲＮＡの開始コドン及びリボゾ
ームとの相互作用部位が“受け入れ得る(accessible)"
筈であることを示唆している。しかしながら、これらの
研究者が“受け入れ得る"と言っていることは、明らか
に、このコドンと部位が仮定した二次構造モデルの幹(s
tem)よりはむしろループ(loop)上に存ることを指すもの
である。
【００１６】本発明は、mＲＮＡの二次／三次立体配座
構造の存在が、異種遺伝子発現の翻訳期にリボゾーム結
合の開始と持続とを妨害するという知見に基づくもので
ある。
構造の存在が、異種遺伝子発現の翻訳期にリボゾーム結
合の開始と持続とを妨害するという知見に基づくもので
ある。
【００１７】本発明は、これらの知見に関連して、必要
な微生物宿主によって異種遺伝子挿入体の効果的な発現
を与えるための方法と手段とを独自に提供するものであ
る。本発明は、更に、微生物発現ベヒクル中で、特異的
に調製された異種遺伝子挿入体を用いて、異種ポリペプ
チドを微生物によって産生する方法並びにその関連手段
を意図するものである。本発明は、特に、所望のポリペ
プチド生産物をコードすべく、且つ最小の二次／三次構
造を有し、従って、効率的なリボゾーム翻訳を得やすい
mＲＮＡを構成すべく調製される化学的に誘導された遺
伝子挿入部分を用いることを意図するものである。
な微生物宿主によって異種遺伝子挿入体の効果的な発現
を与えるための方法と手段とを独自に提供するものであ
る。本発明は、更に、微生物発現ベヒクル中で、特異的
に調製された異種遺伝子挿入体を用いて、異種ポリペプ
チドを微生物によって産生する方法並びにその関連手段
を意図するものである。本発明は、特に、所望のポリペ
プチド生産物をコードすべく、且つ最小の二次／三次構
造を有し、従って、効率的なリボゾーム翻訳を得やすい
mＲＮＡを構成すべく調製される化学的に誘導された遺
伝子挿入部分を用いることを意図するものである。
【００１８】本発明によれば、合成ＤＮＡは、異種遺伝
子挿入体の初期コード配列の実質的部分、及び、任意に
ＡＴＧ翻訳開始コドンとリボゾーム結合部位を介して前
記実質的部分より上流の部分を備えている。２つの要
因: １)機能性蛋白質又はその生物活性部分を含むポリ
ペプチドの初期(Ｎ−末端)アミノ酸配列をコードする配
列の創製、及び２)前記配列が転写の際に、伝令ＲＮＡ
を与えることの保証、このＲＮＡは二次／三次立体配座
構造を有し、この構造は上に規定した如く、効果的なリ
ボゾーム翻訳の受け入れ易さを妨害するには不充分であ
る; これらの要因を心に留めて、ＤＮＡのこの重要な部
分を化学的に合成する。そのような化学合成は、例え
ば、Ｃrea等のＮucleic Ａcids Ｒesearch, ８巻、２
３３１頁(１９８０年)の方法に従って、構成ブロック(b
uilding blocks)として変性モノヌクレオチド類を用い
る標準的な有機合成、Ｒazin等のＰroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．(ＵＳＡ)、７５巻、４２６８頁(１９７８年)
の方法によるようなＤＮＡ断片の管理された突然変異誘
発部位の使用、及びある適切に配列されたＤＮＡ断片上
で合成プライマーを用い、次に、所望の領域を特異的に
開裂することを包含する。
子挿入体の初期コード配列の実質的部分、及び、任意に
ＡＴＧ翻訳開始コドンとリボゾーム結合部位を介して前
記実質的部分より上流の部分を備えている。２つの要
因: １)機能性蛋白質又はその生物活性部分を含むポリ
ペプチドの初期(Ｎ−末端)アミノ酸配列をコードする配
列の創製、及び２)前記配列が転写の際に、伝令ＲＮＡ
を与えることの保証、このＲＮＡは二次／三次立体配座
構造を有し、この構造は上に規定した如く、効果的なリ
ボゾーム翻訳の受け入れ易さを妨害するには不充分であ
る; これらの要因を心に留めて、ＤＮＡのこの重要な部
分を化学的に合成する。そのような化学合成は、例え
ば、Ｃrea等のＮucleic Ａcids Ｒesearch, ８巻、２
３３１頁(１９８０年)の方法に従って、構成ブロック(b
uilding blocks)として変性モノヌクレオチド類を用い
る標準的な有機合成、Ｒazin等のＰroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．(ＵＳＡ)、７５巻、４２６８頁(１９７８年)
の方法によるようなＤＮＡ断片の管理された突然変異誘
発部位の使用、及びある適切に配列されたＤＮＡ断片上
で合成プライマーを用い、次に、所望の領域を特異的に
開裂することを包含する。
【００１９】本発明は、所与のポリペプチドの適切なア
ミノ酸配列をコードするように継続的に配列されたヌク
レオチドから成るＤＮＡ配列を製造する方法を意図する
ものである。この方法は、化学合成以外の手段、最も頻
繁には必要な組織及び／又は培養細胞伝令ＲＮＡからの
逆転写による所与のポリペプチドのＤＮＡコード配列の
実質的部分の取得を包含する。この断片はポリペプチド
のＣ−末端部分をコードし、且つ、それと合わせて、化
学合成によって得られた残りのコード配列、即ちリボゾ
ーム結合部位及び得られる伝令ＲＮＡの第１ヌクレオチ
ド(＋１)を介して適切に配置された翻訳開始信号及び翻
訳停止信号並びに上流のＤＮＡを含む残部に結合され
る。この合成断片は、既に述べたような基準に従って、
対応する伝令ＲＮＡの立体配座に依存するヌクレオチド
選択によって指定される。
ミノ酸配列をコードするように継続的に配列されたヌク
レオチドから成るＤＮＡ配列を製造する方法を意図する
ものである。この方法は、化学合成以外の手段、最も頻
繁には必要な組織及び／又は培養細胞伝令ＲＮＡからの
逆転写による所与のポリペプチドのＤＮＡコード配列の
実質的部分の取得を包含する。この断片はポリペプチド
のＣ−末端部分をコードし、且つ、それと合わせて、化
学合成によって得られた残りのコード配列、即ちリボゾ
ーム結合部位及び得られる伝令ＲＮＡの第１ヌクレオチ
ド(＋１)を介して適切に配置された翻訳開始信号及び翻
訳停止信号並びに上流のＤＮＡを含む残部に結合され
る。この合成断片は、既に述べたような基準に従って、
対応する伝令ＲＮＡの立体配座に依存するヌクレオチド
選択によって指定される。
【００２０】そのように調製されたＤＮＡ配列は、形質
転換体微生物中で異種ポリペプチドの産生を行うべく指
定された複製しうる発現ベヒクルへの挿入及び使用に適
している。これらのベヒクル中で、ＤＮＡ配列はその発
現を調節するプロモーターシステムと有効に発現するよ
うに結合される。本発明は、更に、通常の発酵培地中で
のこれらの微生物の培養(カルチャー)は勿論、複製しう
る発現ベヒクル及びそのように生産された形質転換体微
生物を意図するものである。本発明は、さらに、関連方
法と関連手段及び効率的なリボゾーム翻訳を受け入れ得
る伝令ＲＮＡ転写体の管理された産生の特定具体例を意
図するものである。
転換体微生物中で異種ポリペプチドの産生を行うべく指
定された複製しうる発現ベヒクルへの挿入及び使用に適
している。これらのベヒクル中で、ＤＮＡ配列はその発
現を調節するプロモーターシステムと有効に発現するよ
うに結合される。本発明は、更に、通常の発酵培地中で
のこれらの微生物の培養(カルチャー)は勿論、複製しう
る発現ベヒクル及びそのように生産された形質転換体微
生物を意図するものである。本発明は、さらに、関連方
法と関連手段及び効率的なリボゾーム翻訳を受け入れ得
る伝令ＲＮＡ転写体の管理された産生の特定具体例を意
図するものである。
【００２１】Ｇoeddel等のＮature, ２８１巻、５４４
頁(１９７９年)によって開示されたようなヒト成長ホル
モン(ＨＧＨ)をコードする雑種ＤＮＡは、本発明から明
確に除外される。この特殊な雑種ＤＮＡがうまく発現さ
れて意図した生産物を産生したけれども、本発明の概念
はこれらの研究者によって認識されておらず(従って、
これらの研究者によって教示されなかった)、その結
果、ＨＧＨを発現しうるこれらの研究者の雑種ＤＮＡを
幸運にも調製した際にも、本発明の理念は実行されてい
なかった。この雑種ＤＮＡの配列を図１に示した。
頁(１９７９年)によって開示されたようなヒト成長ホル
モン(ＨＧＨ)をコードする雑種ＤＮＡは、本発明から明
確に除外される。この特殊な雑種ＤＮＡがうまく発現さ
れて意図した生産物を産生したけれども、本発明の概念
はこれらの研究者によって認識されておらず(従って、
これらの研究者によって教示されなかった)、その結
果、ＨＧＨを発現しうるこれらの研究者の雑種ＤＮＡを
幸運にも調製した際にも、本発明の理念は実行されてい
なかった。この雑種ＤＮＡの配列を図１に示した。
【００２２】本発明の化学合成ＤＮＡ配列は、好ましく
は、ＡＴＧ翻訳開始部位から所望のポリペプチドの実質
的部分をコードする下流の配列まで伸び、更に任意にＡ
ＴＧの上流にほぼ転写開始部位(習慣によって＋１とラ
ベルする)を介して所与の距離だけ伸びる。なるべくな
ら、合成ＤＮＡは、意図するポリペプチドの基部(proxi
mal, Ｎ−末端)にある約２５個のアミノ酸を表わす構造
遺伝子のうち約７５個又は７６個以上のヌクレオチド対
からなる。特に好ましい具体例においては、合成ＤＮＡ
配列は、ほぼ翻訳開始部位(ＡＴＧ)から異種遺伝子のほ
ぼ７５ヌクレオチドまで伸びる。別の言い方をすると、
合成ＤＮＡ配列は＋１(転写開始)から転写体のヌクレオ
チド１００付近までのヌクレオチド対から成る。
は、ＡＴＧ翻訳開始部位から所望のポリペプチドの実質
的部分をコードする下流の配列まで伸び、更に任意にＡ
ＴＧの上流にほぼ転写開始部位(習慣によって＋１とラ
ベルする)を介して所与の距離だけ伸びる。なるべくな
ら、合成ＤＮＡは、意図するポリペプチドの基部(proxi
mal, Ｎ−末端)にある約２５個のアミノ酸を表わす構造
遺伝子のうち約７５個又は７６個以上のヌクレオチド対
からなる。特に好ましい具体例においては、合成ＤＮＡ
配列は、ほぼ翻訳開始部位(ＡＴＧ)から異種遺伝子のほ
ぼ７５ヌクレオチドまで伸びる。別の言い方をすると、
合成ＤＮＡ配列は＋１(転写開始)から転写体のヌクレオ
チド１００付近までのヌクレオチド対から成る。
【００２３】遺伝暗号(コード)の縮重のために、任意の
所与のアミノ酸配列に関してコドンを選択するに当たっ
ては実質的な自由度が存在する。この自由度により任意
の所与のアミノ酸配列をコードする異なるＤＮＡヌクレ
オチド配列の数は異常に多くなり、例えば、僅か１４個
のアミノ酸から成るソマトスタチンについては２．６×
１０5以上の可能性となる。更に、本発明は、これらの
ＤＮＡ配列のうち、機能性生産物を効率的に調製するい
くつかのＤＮＡ配列を選択するための方法と手段とに関
する。所与のポリペプチド生産物については、本発明
は、ありうる多数の中から、機能作動し得且つ効率的な
リボゾーム翻訳を得やすい立体配座構造を有する転写体
を与えるＤＮＡ配列を選択するための手段を提供する。
所与のアミノ酸配列に関してコドンを選択するに当たっ
ては実質的な自由度が存在する。この自由度により任意
の所与のアミノ酸配列をコードする異なるＤＮＡヌクレ
オチド配列の数は異常に多くなり、例えば、僅か１４個
のアミノ酸から成るソマトスタチンについては２．６×
１０5以上の可能性となる。更に、本発明は、これらの
ＤＮＡ配列のうち、機能性生産物を効率的に調製するい
くつかのＤＮＡ配列を選択するための方法と手段とに関
する。所与のポリペプチド生産物については、本発明
は、ありうる多数の中から、機能作動し得且つ効率的な
リボゾーム翻訳を得やすい立体配座構造を有する転写体
を与えるＤＮＡ配列を選択するための手段を提供する。
【００２４】mＲＮＡ転写体の立体配座構造は、相補的
ヌクレオチド配列間の水素結合の結果できるものであ
る。これらのヌクレオチド配列は非相補的ヌクレオチド
の配列によって相互に分離されうる。そのような結合は
通常二次構造と指称される。全分子の立体配座に、いわ
ゆる三次構造が加わり得る。これらの構造は分子中の１
つ又は２つ以上の部分内での空間的な相互作用------い
わゆるスタッキング相互作用(重層相互作用)の結果であ
ると考えられる。いずれにしても、所与のmＲＮＡ分子
の立体配座構造を決定し、且つ測定することができる。
更に、本発明によって、mＲＮＡ転写体の立体配座構造
のある一定のレベルは効率的な蛋白質合成を妨害し、従
って、これらのレベルは、ポリペプチド生産物への翻訳
の開始及び／又は継続(延長)を効果的に阻止することが
決定された。従って、そのような立体配座構造が生じな
いか、又は少なくとも最小となるレベルは予測しうる。
立体配座構造の予知し得、且つ許容しうるレベルを基礎
にしてヌクレオチド選択を予測することができ、従っ
て、好ましい遺伝子配列を決定することができる。
ヌクレオチド配列間の水素結合の結果できるものであ
る。これらのヌクレオチド配列は非相補的ヌクレオチド
の配列によって相互に分離されうる。そのような結合は
通常二次構造と指称される。全分子の立体配座に、いわ
ゆる三次構造が加わり得る。これらの構造は分子中の１
つ又は２つ以上の部分内での空間的な相互作用------い
わゆるスタッキング相互作用(重層相互作用)の結果であ
ると考えられる。いずれにしても、所与のmＲＮＡ分子
の立体配座構造を決定し、且つ測定することができる。
更に、本発明によって、mＲＮＡ転写体の立体配座構造
のある一定のレベルは効率的な蛋白質合成を妨害し、従
って、これらのレベルは、ポリペプチド生産物への翻訳
の開始及び／又は継続(延長)を効果的に阻止することが
決定された。従って、そのような立体配座構造が生じな
いか、又は少なくとも最小となるレベルは予測しうる。
立体配座構造の予知し得、且つ許容しうるレベルを基礎
にしてヌクレオチド選択を予測することができ、従っ
て、好ましい遺伝子配列を決定することができる。
【００２５】本発明では、mＲＮＡ分子の立体配座構造
に関連するエネルギーレベルを測定することによって、
mＲＮＡ立体配座構造を測定する。
に関連するエネルギーレベルを測定することによって、
mＲＮＡ立体配座構造を測定する。
【００２６】そのようなエネルギーレベルを測定する際
には、例えば、Ｔinoco等の法則(Ｎature Ｎew Ｂio
l., ２４６巻、４０頁(１９７３年))に従って、１つ又
は一連の相同塩基対合に関連する熱力学的解離エネルギ
ーを計算する。この計算において、約−１．２kcal／mo
leの関連(結合)エネルギーレベルはＡＴ塩基対合に割り
当てられ、一方、約−２kcal／moleの関連エネルギーレ
ベルはＣＧ塩基対合に割り当てれる。隣接相同対合は、
疑いもなくスタッキング相互作用及び他の関連因子のた
めに、付加的なもの以上のものである。いずれにして
も、局所での塩基対合相互作用が所与の相同配列につい
て約−１２kcal／mole以上のエネルギーレベル(即ち、
約−１２kcal／mole未満の数で算術的に表わされた値)
を生ずる場合には、恐らくは必要なリボゾーム結合を受
け入れる可能性を妨害することによって、そのような相
互作用は発現の翻訳期を妨害又は阻止するに充分であり
うることが決定された。
には、例えば、Ｔinoco等の法則(Ｎature Ｎew Ｂio
l., ２４６巻、４０頁(１９７３年))に従って、１つ又
は一連の相同塩基対合に関連する熱力学的解離エネルギ
ーを計算する。この計算において、約−１．２kcal／mo
leの関連(結合)エネルギーレベルはＡＴ塩基対合に割り
当てられ、一方、約−２kcal／moleの関連エネルギーレ
ベルはＣＧ塩基対合に割り当てれる。隣接相同対合は、
疑いもなくスタッキング相互作用及び他の関連因子のた
めに、付加的なもの以上のものである。いずれにして
も、局所での塩基対合相互作用が所与の相同配列につい
て約−１２kcal／mole以上のエネルギーレベル(即ち、
約−１２kcal／mole未満の数で算術的に表わされた値)
を生ずる場合には、恐らくは必要なリボゾーム結合を受
け入れる可能性を妨害することによって、そのような相
互作用は発現の翻訳期を妨害又は阻止するに充分であり
うることが決定された。
【００２７】所与のＤＮＡ配列は次の如くスクリーニン
グされる。塩基対の最初の系列、例えば、おおよそ６個
の最初の塩基対の相同性を、遺伝子の対応する逆向の最
後の塩基対と比較する。そのような相同が見出されれ
ば、上記考察に従って関連エネルギーレベルを計算す
る。次に、塩基対の最初の系列は、遺伝子の終わりから
２番目の(ペナルティメート)塩基対までの対応する最後
の塩基対と比較され、いずれかの相同の関連エネルギー
レベルが計算される。引き続いて、次に塩基対の最初の
系列が、終わりから第３番目の塩基対(antipenultimate
basepair)までの対応する番号の塩基対と比較され、そ
れから、前後を逆にして全部の遺伝子配列を比較するま
で続ける。次に、最初の系列から下方の系列の最初の部
分をなす塩基対系列、例えば、前の例の塩基対２〜７が
最後からの対応する番号と比較され、前述の如く、遺伝
子の前部に向かって漸次比較される。それぞれの塩基対
が相同について遺伝子の他のすべての領域と比較される
まで、この手順を繰り返して関連エネルギーレベルが決
定される。このようにして、例えば、下記表１には２つ
の遺伝子−天然のウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)と合成(即
ち、雑種)ＢＧＨをコードする遺伝子について、そのよ
うな走査と計算の結果を示した。天然のＢＧＨはここで
関連があると考えられる相同の２つの部位(即ち、約−
１２kcal／moleを越えるエネルギーレベル)、即ち、相
同対９６〜１０１と塩基対３３〜３８の６個の(相同)塩
基対及び７３〜７８と４６〜５１の６個の(相同)塩基対
を含んでいることを知ることができる。この最初の６個
の塩基対は、エネルギーレベル(−１５．４０kcal／mol
e)に拘わらず、現在の目的に対しては重要ではない、そ
れは、恐らく翻訳効率に影響しないように、相同の領域
が充分な距離で下流に存在するからである。本文中(以
下を参照されたい)で説明されるような生産物の低収率
によって証明されるように、第２の領域は重要である。
相同のそのような領域が除去された場合、合成ＢＧＨ遺
伝子は意図する蛋白質を高収率で与えた。
グされる。塩基対の最初の系列、例えば、おおよそ６個
の最初の塩基対の相同性を、遺伝子の対応する逆向の最
後の塩基対と比較する。そのような相同が見出されれ
ば、上記考察に従って関連エネルギーレベルを計算す
る。次に、塩基対の最初の系列は、遺伝子の終わりから
２番目の(ペナルティメート)塩基対までの対応する最後
の塩基対と比較され、いずれかの相同の関連エネルギー
レベルが計算される。引き続いて、次に塩基対の最初の
系列が、終わりから第３番目の塩基対(antipenultimate
basepair)までの対応する番号の塩基対と比較され、そ
れから、前後を逆にして全部の遺伝子配列を比較するま
で続ける。次に、最初の系列から下方の系列の最初の部
分をなす塩基対系列、例えば、前の例の塩基対２〜７が
最後からの対応する番号と比較され、前述の如く、遺伝
子の前部に向かって漸次比較される。それぞれの塩基対
が相同について遺伝子の他のすべての領域と比較される
まで、この手順を繰り返して関連エネルギーレベルが決
定される。このようにして、例えば、下記表１には２つ
の遺伝子−天然のウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)と合成(即
ち、雑種)ＢＧＨをコードする遺伝子について、そのよ
うな走査と計算の結果を示した。天然のＢＧＨはここで
関連があると考えられる相同の２つの部位(即ち、約−
１２kcal／moleを越えるエネルギーレベル)、即ち、相
同対９６〜１０１と塩基対３３〜３８の６個の(相同)塩
基対及び７３〜７８と４６〜５１の６個の(相同)塩基対
を含んでいることを知ることができる。この最初の６個
の塩基対は、エネルギーレベル(−１５．４０kcal／mol
e)に拘わらず、現在の目的に対しては重要ではない、そ
れは、恐らく翻訳効率に影響しないように、相同の領域
が充分な距離で下流に存在するからである。本文中(以
下を参照されたい)で説明されるような生産物の低収率
によって証明されるように、第２の領域は重要である。
相同のそのような領域が除去された場合、合成ＢＧＨ遺
伝子は意図する蛋白質を高収率で与えた。
【００２８】
【表１】 天然ＢＧＨ 合成ＢＧＨ ５' ３' 長さ kcal／mol ５' ３' 長さ kcal／mol １４ ４５ ８ −１１.８０ １４ ７９ ７ −５.５０ １６ ３１ ６ ４.００ １６ ３７ ６ −４.００ ３３ １０１ ６ −１５.４０ ３８ １０４ ６ −１５.４０ ４６ ７８ ６ −１５.２０ ５２ ８４ − ＞−１０
【００２９】表１は、天然ＢＧＨと合成ＢＧＨの転写体
中の二次構造の位置と安定性とを示す(図４参照)。これ
らの位置と安定性は、上述のように、ヌクレオチドバイ
ヌクレオチド分析(nucleotide by nucleotide analysi
s)によって決定された。遺伝子の各基部の重要な二次構
造をもつ各領域をそれぞれの表中に記入する。このよう
にして、合成ＢＧＨ対天然ＢＧＨについては、翻訳され
うる転写体の対応部分(即ち、天然ＢＧＨのヌクレオチ
ド４６〜７８は、合成ＢＧＨのヌクレオチド５２〜８４
に対して、６ヌクレオチドの長幹(long stem)を含む)に
おける“二次構造"のエネルギーレベルは顕著に相違し
(−１０kcal／mole以上に対して−１５．２kcal／mol
e)、これらのエネルギーレベルは天然ＢＧＨ遺伝子発現
に比べた場合の良好な合成ＢＧＨ遺伝子発現の観察結果
を説明する(以後を参照されたい)ことが注目される。こ
のエネルギーレベルは、許容しうる“二次構造"の相対
的な量、即ち、熱力学的考察に基づいて約−１２kcal／
moleを算術的に越える値の重要性を示す。合成ＢＧＨの
位置３８〜１０４対位置３３〜１０１それぞれについて
計算したエネルギーレベルは発現レベルに大きく影響し
なかったという事実によって、“二次構造"の位置の重
要性を認識することができる。
中の二次構造の位置と安定性とを示す(図４参照)。これ
らの位置と安定性は、上述のように、ヌクレオチドバイ
ヌクレオチド分析(nucleotide by nucleotide analysi
s)によって決定された。遺伝子の各基部の重要な二次構
造をもつ各領域をそれぞれの表中に記入する。このよう
にして、合成ＢＧＨ対天然ＢＧＨについては、翻訳され
うる転写体の対応部分(即ち、天然ＢＧＨのヌクレオチ
ド４６〜７８は、合成ＢＧＨのヌクレオチド５２〜８４
に対して、６ヌクレオチドの長幹(long stem)を含む)に
おける“二次構造"のエネルギーレベルは顕著に相違し
(−１０kcal／mole以上に対して−１５．２kcal／mol
e)、これらのエネルギーレベルは天然ＢＧＨ遺伝子発現
に比べた場合の良好な合成ＢＧＨ遺伝子発現の観察結果
を説明する(以後を参照されたい)ことが注目される。こ
のエネルギーレベルは、許容しうる“二次構造"の相対
的な量、即ち、熱力学的考察に基づいて約−１２kcal／
moleを算術的に越える値の重要性を示す。合成ＢＧＨの
位置３８〜１０４対位置３３〜１０１それぞれについて
計算したエネルギーレベルは発現レベルに大きく影響し
なかったという事実によって、“二次構造"の位置の重
要性を認識することができる。
【００３０】図１は、ヒト成長ホルモン(ＨＧＨ)をコー
ドする雑種ＤＮＡ(Ｇoeddel et, al., Ｎature, ２８
１、５４４(１９７９)参照)のヌクレオチド配列を示
す。
ドする雑種ＤＮＡ(Ｇoeddel et, al., Ｎature, ２８
１、５４４(１９７９)参照)のヌクレオチド配列を示
す。
【００３１】図２は、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)をコー
ドする雑種遺伝子のヌクレオチド配列(及びそれから推
定されるアミノ酸配列)を示す。
ドする雑種遺伝子のヌクレオチド配列(及びそれから推
定されるアミノ酸配列)を示す。
【００３２】図３は天然ＢＧＨ、合成ＨＧＨ及び合成Ｂ
ＧＨの基部のアミノ酸配列とヌクレオチド配列とを示
す。合成ＨＧＨ中のアミノ酸及びヌクレオチドとは違っ
た天然ＢＧＨ中のアミノ酸及びヌクレオチドとに下線が
引かれている。天然のＢＧＨ遺伝子中のヌクレオチドと
違った合成ＢＧＨ遺伝子の基部のヌクレオチドにも下線
が引かれている。これらの遺伝子の基部末端にＰvuＩＩ
制限部位の位置が示される。
ＧＨの基部のアミノ酸配列とヌクレオチド配列とを示
す。合成ＨＧＨ中のアミノ酸及びヌクレオチドとは違っ
た天然ＢＧＨ中のアミノ酸及びヌクレオチドとに下線が
引かれている。天然のＢＧＨ遺伝子中のヌクレオチドと
違った合成ＢＧＨ遺伝子の基部のヌクレオチドにも下線
が引かれている。これらの遺伝子の基部末端にＰvuＩＩ
制限部位の位置が示される。
【００３３】ＢＧＨの適切なアミノ酸配列をコードする
合成ＢＧＨ遺伝子が得られた際に、天然ＢＧＨと合成Ｈ
ＧＨのヌクレオチド配列を比較した。合成ＨＧＨ配列か
らの最小のヌクレオチド変更を利用して、遺伝暗号の縮
重によって許容される範囲をも考慮しながら、合成ＢＧ
Ｈ遺伝子を組み立てるために、合成ＨＧＨ遺伝子に基づ
いてヌクレオチド選択が行われた。
合成ＢＧＨ遺伝子が得られた際に、天然ＢＧＨと合成Ｈ
ＧＨのヌクレオチド配列を比較した。合成ＨＧＨ配列か
らの最小のヌクレオチド変更を利用して、遺伝暗号の縮
重によって許容される範囲をも考慮しながら、合成ＢＧ
Ｈ遺伝子を組み立てるために、合成ＨＧＨ遺伝子に基づ
いてヌクレオチド選択が行われた。
【００３４】図４は先行するtrp−プロモーター配列の
それぞれを転写した部分を伴った天然ＢＧＨ遺伝子と合
成ＢＧＨ遺伝子双方のセンスストランドのヌクレオチド
配列を示す。各転写体の第１のヌクレオチドは“＋１"
として指示され、次のヌクレオチドは引き続いて番号が
付される。それぞれの開始コドン“ＡＴＧ"(上部に線を
引いた)に始まって、双方の遺伝子の翻訳されるコード
領域を相対させるために配列を並記した。天然のＢＧＨ
遺伝子の転写体は、ヌクレオチド７３〜７８とヌクレオ
チド４６〜５１との相互作用に起因する“二次構造"領
域(表１参照)を示し、このようにして、図示されたステ
ム−ループ構造を創製する。この領域は、ヌクレオチド
変更(図３参照)によって除かれた合成ＢＧＨ遺伝子中に
は存在しないが、それにも拘わらずこの遺伝子は正しい
アミノ酸配列を保有している。
それぞれを転写した部分を伴った天然ＢＧＨ遺伝子と合
成ＢＧＨ遺伝子双方のセンスストランドのヌクレオチド
配列を示す。各転写体の第１のヌクレオチドは“＋１"
として指示され、次のヌクレオチドは引き続いて番号が
付される。それぞれの開始コドン“ＡＴＧ"(上部に線を
引いた)に始まって、双方の遺伝子の翻訳されるコード
領域を相対させるために配列を並記した。天然のＢＧＨ
遺伝子の転写体は、ヌクレオチド７３〜７８とヌクレオ
チド４６〜５１との相互作用に起因する“二次構造"領
域(表１参照)を示し、このようにして、図示されたステ
ム−ループ構造を創製する。この領域は、ヌクレオチド
変更(図３参照)によって除かれた合成ＢＧＨ遺伝子中に
は存在しないが、それにも拘わらずこの遺伝子は正しい
アミノ酸配列を保有している。
【００３５】図５は図６に示される如く使用されるpＢ
ＧＨ３３の構成を示す。
ＧＨ３３の構成を示す。
【００３６】図６は雑種ポリペプチドのＤＮＡ配列を収
容するプラスミド、即ち図８に示されるようにして用い
られるpＢＧＨ３３−１、ウシ成長ホルモン配列とヒト
成長ホルモン配列の雑種のpＢＨＧＨ及びヒト配列とウ
シ配列の雑種のpＨＢＧＨの構成を示す。
容するプラスミド、即ち図８に示されるようにして用い
られるpＢＧＨ３３−１、ウシ成長ホルモン配列とヒト
成長ホルモン配列の雑種のpＢＨＧＨ及びヒト配列とウ
シ配列の雑種のpＨＢＧＨの構成を示す。
【００３７】図７は、図８に示される構成の際に用いら
れるＢＧＨ遺伝子の合成基部pＢＲ３２２−０１を組み
立てるために用いられる技術を示す。
れるＢＧＨ遺伝子の合成基部pＢＲ３２２−０１を組み
立てるために用いられる技術を示す。
【００３８】図８は、図７に示されるような合成基部を
含むＢＧＨの遺伝子を収容するプラスミド(pＢＧＨ３３
−３)の構成を示す。
含むＢＧＨの遺伝子を収容するプラスミド(pＢＧＨ３３
−３)の構成を示す。
【００３９】図９は雑種ＢＧＨ遺伝子を収容する発現プ
ラスミドpＢＧＨ３３−４の構成を示す。
ラスミドpＢＧＨ３３−４の構成を示す。
【００４０】図１０は細胞蛋白質のポリアクリルアミド
ゲル分離の結果を示す図である。部分Ａは、天然ＢＧＨ
遺伝子を含むカルチャーを用いる任意の細胞密度ではＢ
ＧＨ生産がないことを示す。部分Ｂは、部分Ａについて
用いたと同じ培地における合成ＢＧＨ遺伝子(レーンＢ
ＧＨ＃１と＃２)の発現を示す。部分Ａと対照した場
合、部分Ｂに示された発現のレベルは、細胞当たり約１
００,０００個のコピーを越える量でＢＧＨが生産され
たことを表わす。
ゲル分離の結果を示す図である。部分Ａは、天然ＢＧＨ
遺伝子を含むカルチャーを用いる任意の細胞密度ではＢ
ＧＨ生産がないことを示す。部分Ｂは、部分Ａについて
用いたと同じ培地における合成ＢＧＨ遺伝子(レーンＢ
ＧＨ＃１と＃２)の発現を示す。部分Ａと対照した場
合、部分Ｂに示された発現のレベルは、細胞当たり約１
００,０００個のコピーを越える量でＢＧＨが生産され
たことを表わす。
【００４１】最も好ましい具体例において、ウシ成長ホ
ルモン(ＢＧＨ)の微生物生産によって本発明を説明す
る。ＢＧＨはうし科(bovine)の動物、例えば畜牛(cattl
e)の体内に由来するものであって、動物の適切な物理的
成熟を担っている。ＢＧＨは、体重増加、食物変換効
率、脂肉に対する赤身の割合及び牛乳生産を促進するの
にも有用である。ＢＧＨの１９０個のアミノ酸配列が公
知である。ＤayhoffのＡtlas of Ｐrotein Ｓequenc
e and structure １９７２ (Ｎational Ｂiomedic
al Ｒesearch Ｆoundation, Ｗashington, Ｄ．Ｃ．)
を参照されたい。本発明はこの化合物を商業的な量で生
産することを可能にし、酪農産業においてこの化合物を
大規模に使用することを可能にする。ＢＧＨを微生物に
よって製造するための最初のアプローチはウシ下垂体由
来のものを利用した。抽出と精製によって、ＢＧＨに必
要なmＲＮＡを単離し、このmＲＮＡから対応するcＤＮ
Ａを製造した。このようにして、この最初の研究は、Ｂ
ＧＨの天然のＤＮＡ配列に対応し、且つすべての意図と
目的に適する遺伝子に帰着した。プレシーケンスをコー
ドするＤＮＡを除去し、開始コドンを加えた後に、プロ
モーターの適切な制御下にプラスミドベクターにcＤＮ
Ａを結合させた。通常の条件下で増殖したＥ．coli宿主
を形質転換するために、このプラスミドが使用された。
ＢＧＨ生産物の発現効率は劣っており、伝令ＲＮＡの立
体配座構造の影響が知見された。この構造はリボゾーム
翻訳を受け入れる可能性を大きく減少させた(表１参
照)。
ルモン(ＢＧＨ)の微生物生産によって本発明を説明す
る。ＢＧＨはうし科(bovine)の動物、例えば畜牛(cattl
e)の体内に由来するものであって、動物の適切な物理的
成熟を担っている。ＢＧＨは、体重増加、食物変換効
率、脂肉に対する赤身の割合及び牛乳生産を促進するの
にも有用である。ＢＧＨの１９０個のアミノ酸配列が公
知である。ＤayhoffのＡtlas of Ｐrotein Ｓequenc
e and structure １９７２ (Ｎational Ｂiomedic
al Ｒesearch Ｆoundation, Ｗashington, Ｄ．Ｃ．)
を参照されたい。本発明はこの化合物を商業的な量で生
産することを可能にし、酪農産業においてこの化合物を
大規模に使用することを可能にする。ＢＧＨを微生物に
よって製造するための最初のアプローチはウシ下垂体由
来のものを利用した。抽出と精製によって、ＢＧＨに必
要なmＲＮＡを単離し、このmＲＮＡから対応するcＤＮ
Ａを製造した。このようにして、この最初の研究は、Ｂ
ＧＨの天然のＤＮＡ配列に対応し、且つすべての意図と
目的に適する遺伝子に帰着した。プレシーケンスをコー
ドするＤＮＡを除去し、開始コドンを加えた後に、プロ
モーターの適切な制御下にプラスミドベクターにcＤＮ
Ａを結合させた。通常の条件下で増殖したＥ．coli宿主
を形質転換するために、このプラスミドが使用された。
ＢＧＨ生産物の発現効率は劣っており、伝令ＲＮＡの立
体配座構造の影響が知見された。この構造はリボゾーム
翻訳を受け入れる可能性を大きく減少させた(表１参
照)。
【００４２】例えば、“天然"ＢＧＨ mＲＮＡ中には相
補相同領域が存在することが判った。一つの重要な領域
がmＲＮＡ転写体の＋４６〜＋５１の位置に、これと相
同な領域が＋７３〜＋７８の位置に夫々存在する。これ
ら２つの明確な領域において、二次構造を考察すると、
翻訳開始コドンＡＴＧとリボゾーム結合部位から直ぐ下
流でヘアピン配列(hairpin arrangement)を生成すると
考えられる。この立体配座配列がリボゾーム結合を妨害
するか、又はリボゾーム結合を早期に分裂させ、従っ
て、この配列が翻訳を阻害する。
補相同領域が存在することが判った。一つの重要な領域
がmＲＮＡ転写体の＋４６〜＋５１の位置に、これと相
同な領域が＋７３〜＋７８の位置に夫々存在する。これ
ら２つの明確な領域において、二次構造を考察すると、
翻訳開始コドンＡＴＧとリボゾーム結合部位から直ぐ下
流でヘアピン配列(hairpin arrangement)を生成すると
考えられる。この立体配座配列がリボゾーム結合を妨害
するか、又はリボゾーム結合を早期に分裂させ、従っ
て、この配列が翻訳を阻害する。
【００４３】この現象を認識したことによって、これら
の領域におけるＤＮＡ配列の性質を究明し、この問題を
除去する方法と手段とを知見した。
の領域におけるＤＮＡ配列の性質を究明し、この問題を
除去する方法と手段とを知見した。
【００４４】本発明においては、アミノ酸２４に対応す
るＢＧＨ ＤＮＡにおけるＰvuＩＩエンドヌクレアーゼ
制限部位を利用した。ＢＧＨの最初の２４個のアミノ酸
に対するＤＮＡが化学的に合成され、ヌクレオチドの選
択に当たっては、適切なコード配列と得られるmＲＮＡ
二次／三次構造の考慮すべき事項を厳格に配慮した。上
で規定した方法を用いて、ＢＧＨを適切にコードするけ
れども問題となる立体配座構造のない遺伝子配列を製造
するには、予測される立体配座構造のエネルギーレベル
に基づいて、ある一定のヌクレオチド塩基を選択するの
が適当であると判明した。これらのヌクレオチド塩基
(配列)の一つが選択され、合成された。合成断片のＰvu
ＩＩ末端で、このＰvuＩＩ末端より下流のcＤＮＡと結
合して、所望の雑種遺伝子を造った。操作しうる挿入体
としての前記異種遺伝子を含む複製しうる発現ベヒクル
を構成することによって、形質転換されたＥ．coli宿主
中での効率的なＢＧＨ発現が首尾よく達成された。
るＢＧＨ ＤＮＡにおけるＰvuＩＩエンドヌクレアーゼ
制限部位を利用した。ＢＧＨの最初の２４個のアミノ酸
に対するＤＮＡが化学的に合成され、ヌクレオチドの選
択に当たっては、適切なコード配列と得られるmＲＮＡ
二次／三次構造の考慮すべき事項を厳格に配慮した。上
で規定した方法を用いて、ＢＧＨを適切にコードするけ
れども問題となる立体配座構造のない遺伝子配列を製造
するには、予測される立体配座構造のエネルギーレベル
に基づいて、ある一定のヌクレオチド塩基を選択するの
が適当であると判明した。これらのヌクレオチド塩基
(配列)の一つが選択され、合成された。合成断片のＰvu
ＩＩ末端で、このＰvuＩＩ末端より下流のcＤＮＡと結
合して、所望の雑種遺伝子を造った。操作しうる挿入体
としての前記異種遺伝子を含む複製しうる発現ベヒクル
を構成することによって、形質転換されたＥ．coli宿主
中での効率的なＢＧＨ発現が首尾よく達成された。
【００４５】このようにして構成された雑種ＢＧＨ遺伝
子の完全なヌクレオチド(及び推定されたアミノ酸)配列
を図２に示す。
子の完全なヌクレオチド(及び推定されたアミノ酸)配列
を図２に示す。
【００４６】ＢＧＨ遺伝子基部の合成 １２個の断片、Ｕ１〜６(上部ストランド)及びＬ１〜６
(下部ストランド)が合成された。遺伝子の３'−末端を
修復するために、２個の断片、即ちＢＧＨ修復部(１)
(上部ストランド)とＢＧＨ修復部(２)(下部ストランド)
も合成された。
(下部ストランド)が合成された。遺伝子の３'−末端を
修復するために、２個の断片、即ちＢＧＨ修復部(１)
(上部ストランド)とＢＧＨ修復部(２)(下部ストランド)
も合成された。
【００４７】Ｃrea等のＮucleic Ａcids Ｒesearch,
８巻、２３３１頁(１９８０年)の方法に従ってこれらの
１４個の断片が合成された。適切な固体支持体(セルロ
ース)から出発して、完全に保護された適切なダイマー
ブロック又はトリマーブロックを継続して加えることに
よって、断片の合成を完成した。オリゴチミジル酸合成
(Ｃrea等、上掲参照)について記載されたのと同じ条件
下で、上記合成の繰り返しを行った。最終ポリマーを塩
基(濃ＮＨ3水)と酸(８０％のＨoＡc水)で処理し、この
ポリマーをペレット状にし、上澄液を蒸発乾固した。４
％ＮＨ3水中に溶解した際、残留物をエーテル(３×)で
洗浄し、完全に保護されてない断片を単離するのに使用
した。精製はＲsil ＮＨ2 u−パーティキュレートカラ
ムのhplc上で行われた。Ｇel電気泳動分析によって、断
片、Ｕ１〜６、Ｌ１〜６及びＢＧＨ修復部(１)と(２)の
それぞれが正しい寸法をもっていることが判った。
８巻、２３３１頁(１９８０年)の方法に従ってこれらの
１４個の断片が合成された。適切な固体支持体(セルロ
ース)から出発して、完全に保護された適切なダイマー
ブロック又はトリマーブロックを継続して加えることに
よって、断片の合成を完成した。オリゴチミジル酸合成
(Ｃrea等、上掲参照)について記載されたのと同じ条件
下で、上記合成の繰り返しを行った。最終ポリマーを塩
基(濃ＮＨ3水)と酸(８０％のＨoＡc水)で処理し、この
ポリマーをペレット状にし、上澄液を蒸発乾固した。４
％ＮＨ3水中に溶解した際、残留物をエーテル(３×)で
洗浄し、完全に保護されてない断片を単離するのに使用
した。精製はＲsil ＮＨ2 u−パーティキュレートカラ
ムのhplc上で行われた。Ｇel電気泳動分析によって、断
片、Ｕ１〜６、Ｌ１〜６及びＢＧＨ修復部(１)と(２)の
それぞれが正しい寸法をもっていることが判った。
【００４８】 断片 配 列 寸法 Ｕ１ 5'AAT.TCT.ATG.TTC.C3' 13−マー Ｕ２ 5'CAG.CTA.TGT.CTC.T3' 13−マー Ｕ３ 5'ATC.TGG.TCT.ATT.C3' 13−マー Ｕ４ 5'GCT.AAC.GCT.GTT.C3' 13−マー Ｕ５ 5'TTC.GTG.CTC.AGC.A3' 13−マー Ｕ６ 5'TCT.TCA.TCA.GCT.GA3' 14−マー Ｌ１ 5'ATA.GCT.GGG.AAC.ATA.G3' 16−マー Ｌ２ 5'ACC.AGA.TAG.AGA.C3' 13−マー Ｌ３ 5'CGT.TAG.CGA.ATA.G3' 13−マー Ｌ４ 5'GCA.CGA.AGA.ACA.G3' 13−マー Ｌ５ 5'ATG.AAG.ATG.CTG.A3' 13−マー Ｌ６ 5'AGC.TTC.AGC.TG3' 11−マー ＢＧＨ修復部(１) 5'AA.TTC.AGC.TGC.GCA.TTC.TAG.A3' 21−マー ＢＧＨ修復部(２) 5'AG.CTT.CTA.GAA.TGC.GCA.GCT.G3' 21−マー
【００４９】pＢＧＨ ３３の構成 凍結された新鮮なウシ下垂体をメーザ処理(maserate)し
て、グアニジウムチオシアネート法でＲＮＡを抽出した
(Ｈarding等のＪ．Ｂiol．Ｃhem．, ２５２巻(２０)、
７３９１頁(１９７７年)及びＵllrich等のＳcience, １
９６巻、１３１３頁(１９７７年))。次に、ＲＮＡ抽出
物全体をオリゴ−dＴセルロースカラムに通して、ポリ
Ａを含有する伝令ＲＮＡ(mＲＮＡ)を精製した。逆転写
酵素とプライマーとしてオリゴ−dＴを用いて、このmＲ
ＮＡから単一ストランドcＤＮＡを造った。ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片(Ｋlenow fragment)を用い
て、第２のストランド合成を達成した。Ｓ１酵素処理と
アクリルアミドゲル電気泳動に続いて、全cＤＮＡのサ
イズカット(約５００〜１５００bp)を溶出し、通常のテ
ーリング(tailing)条件とアニーリング条件を用いてpＢ
Ｒ３２２のampR遺伝子のＰstＩ部位中にクローン化し
た。
て、グアニジウムチオシアネート法でＲＮＡを抽出した
(Ｈarding等のＪ．Ｂiol．Ｃhem．, ２５２巻(２０)、
７３９１頁(１９７７年)及びＵllrich等のＳcience, １
９６巻、１３１３頁(１９７７年))。次に、ＲＮＡ抽出
物全体をオリゴ−dＴセルロースカラムに通して、ポリ
Ａを含有する伝令ＲＮＡ(mＲＮＡ)を精製した。逆転写
酵素とプライマーとしてオリゴ−dＴを用いて、このmＲ
ＮＡから単一ストランドcＤＮＡを造った。ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片(Ｋlenow fragment)を用い
て、第２のストランド合成を達成した。Ｓ１酵素処理と
アクリルアミドゲル電気泳動に続いて、全cＤＮＡのサ
イズカット(約５００〜１５００bp)を溶出し、通常のテ
ーリング(tailing)条件とアニーリング条件を用いてpＢ
Ｒ３２２のampR遺伝子のＰstＩ部位中にクローン化し
た。
【００５０】cＤＮＡを含むpＢＲ３２２プラスミドを
Ｅ．coli Ｋ−１２菌株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４
４６)に形質転換させた。組換プラスミドを含むコロニ
ーを、コロニーのテトラサイクリン耐性とアンピシリン
感受性によって選択した。コロニーの雑種形成(colony
hybridization)によって、これらのクローンの中の約
２０００個をＢＧＨ用としてスクリーニングした。
Ｅ．coli Ｋ−１２菌株２９４(ＡＴＣＣ Ｎo．３１４
４６)に形質転換させた。組換プラスミドを含むコロニ
ーを、コロニーのテトラサイクリン耐性とアンピシリン
感受性によって選択した。コロニーの雑種形成(colony
hybridization)によって、これらのクローンの中の約
２０００個をＢＧＨ用としてスクリーニングした。
【００５１】ＨＧＨのcＤＮＡクローンは内部５５０bp
ＨaeＩＩＩ断片を含有する。この領域のアミノ酸配列
は、ＢＧＨのアミノ酸配列に極めて類似する。このＨＧ
Ｈ ＨaeＩＩＩ断片は放射性元素によって標識をつけら
れ、２０００個のクローン中で対応するＢＧＨ配列を見
付けるためのプローブとして用いた。
ＨaeＩＩＩ断片を含有する。この領域のアミノ酸配列
は、ＢＧＨのアミノ酸配列に極めて類似する。このＨＧ
Ｈ ＨaeＩＩＩ断片は放射性元素によって標識をつけら
れ、２０００個のクローン中で対応するＢＧＨ配列を見
付けるためのプローブとして用いた。
【００５２】８個の陽性のクローンが同定された。これ
らの中の一つ、即ちpＢＧＨ１１２が、配列分析によっ
て、ＢＧＨと確認された。この完全な長さをもつクロー
ンは、１９１個のアミノ酸蛋白質配列は勿論、２６アミ
ノ酸プレシーケンスのコード領域を含んでおり、９４０
bpの長さである。
らの中の一つ、即ちpＢＧＨ１１２が、配列分析によっ
て、ＢＧＨと確認された。この完全な長さをもつクロー
ンは、１９１個のアミノ酸蛋白質配列は勿論、２６アミ
ノ酸プレシーケンスのコード領域を含んでおり、９４０
bpの長さである。
【００５３】ＢＧＨ直接発現を達成するために、配列
５'−ＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧ−３'を有する合
成“発現プライマー"を製造した。pＢＧＨ１１２の配列
データによって決定されるように、第４位から第１５位
にあるヌクレオチドは、成熟ＢＧＨ蛋白質中の最初の４
個のアミノ酸のコドンと同一である。５'−ＡＴＧ(メチ
オニン)のみが、この蛋白質のこの領域とは性質を異に
する。本発明におけるＢＧＨクローンのプレシーケンス
領域を除去し、且つ蛋白質合成用に適切な開始コドンを
準備するためには、このことが必要であった。一連の酵
素反応によって、ＢＧＨ１１２ cＤＮＡ挿入体上でこの
合成プライマーを延長させた。この用意された生成物を
ＰstＩで開裂して、アミノ酸９０までのコード情報を含
む２７０bpをもつＤＮＡ断片を得た(図５)。この“発
現"ＢＧＨ cＤＮＡ断片は、trpプロモーターを含んだp
ＢＲ３２２ベクター中に結合された。このベクターはp
ＬeＩＦ Ａ trp２５から誘導された(Ｇoeddel等のＮa
ture, ２８７巻、４１１頁(１９８０年))。インターフ
ェロンcＤＮＡを除去し、ゲル電気泳動によってtrp２５
−３２２ベクターを精製した。組換プラスミド(pＢＧＨ
７１０)は、trpプロモーターに直接結合した成熟ＢＧＨ
蛋白質のアミノ酸１〜９０に対するコード情報を含んで
いた。この連鎖は、ＤＮＡ配列分析によって確認され
た。ＰstＩ制限消化とアクリルアミドゲル電気泳動によ
って、pＢＧＨ１１２からコード領域の残りの半分と３'
−非翻訳領域を単離した。次に、５４０bpのこの“後
部"断片(back−end fragment)をpＢＧＨ７１０中のア
ミノ酸９０の部位に結合した。制限分析とＤＮＡ配列検
査(ＤＮＡ sequencing)とによって、この組換プラスミ
ドを照合した。この組換プラスミド、即ちpＢＧＨ３３
は、ＡＴＧを介して成熟ＢＧＨの完全なＤＮＡコード配
列と直接結合されたtrpプロモーターをもっている。
５'−ＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧ−３'を有する合
成“発現プライマー"を製造した。pＢＧＨ１１２の配列
データによって決定されるように、第４位から第１５位
にあるヌクレオチドは、成熟ＢＧＨ蛋白質中の最初の４
個のアミノ酸のコドンと同一である。５'−ＡＴＧ(メチ
オニン)のみが、この蛋白質のこの領域とは性質を異に
する。本発明におけるＢＧＨクローンのプレシーケンス
領域を除去し、且つ蛋白質合成用に適切な開始コドンを
準備するためには、このことが必要であった。一連の酵
素反応によって、ＢＧＨ１１２ cＤＮＡ挿入体上でこの
合成プライマーを延長させた。この用意された生成物を
ＰstＩで開裂して、アミノ酸９０までのコード情報を含
む２７０bpをもつＤＮＡ断片を得た(図５)。この“発
現"ＢＧＨ cＤＮＡ断片は、trpプロモーターを含んだp
ＢＲ３２２ベクター中に結合された。このベクターはp
ＬeＩＦ Ａ trp２５から誘導された(Ｇoeddel等のＮa
ture, ２８７巻、４１１頁(１９８０年))。インターフ
ェロンcＤＮＡを除去し、ゲル電気泳動によってtrp２５
−３２２ベクターを精製した。組換プラスミド(pＢＧＨ
７１０)は、trpプロモーターに直接結合した成熟ＢＧＨ
蛋白質のアミノ酸１〜９０に対するコード情報を含んで
いた。この連鎖は、ＤＮＡ配列分析によって確認され
た。ＰstＩ制限消化とアクリルアミドゲル電気泳動によ
って、pＢＧＨ１１２からコード領域の残りの半分と３'
−非翻訳領域を単離した。次に、５４０bpのこの“後
部"断片(back−end fragment)をpＢＧＨ７１０中のア
ミノ酸９０の部位に結合した。制限分析とＤＮＡ配列検
査(ＤＮＡ sequencing)とによって、この組換プラスミ
ドを照合した。この組換プラスミド、即ちpＢＧＨ３３
は、ＡＴＧを介して成熟ＢＧＨの完全なＤＮＡコード配
列と直接結合されたtrpプロモーターをもっている。
【００５４】pＨＧＨ２０７−１の構成 プラスミドpＧＭ１は欠失ＬＥ１４１３を含むＥ．coli
トリプトファンオペロンを担持し(Ｇ．Ｆ．Ｍiozzari等
のＪ．Ｂacteriology, １４５７頁〜１４６６頁(１９７
８年))、従って、trpプロモーター−オペレーターシス
テムの制御のもとで、trpＤポリペプチド全体は勿論、t
rpリーダーの最初の６個のアミノ酸及びtrpＥポリペプ
チドのおおよそ最後から第３番目のアミノ酸(以後、Ｌ
Ｅ'と指称する)を含む融合蛋白質を発現する。プラスミ
ドを５個の部位で開裂する制限酵素ＰvuＩＩを用いて、
プラスミド２０μgを消化した。次に、ＥcoＲＩリンカ
ー(配列pＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧを有する自己相補的
オリゴヌクレオチドから成る)を用いて、この遺伝子断
片を組み合わせた。このリンカーは、後にＥcoＲＩ部位
を含むプラスミド中にクローンするためのＥcoＲＩ開裂
部位を与える。５'−リン酸合成オリゴヌクレオチドpＣ
ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ ２００ピコモルの存在下、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ緩衝液(２０mＭトリス、pＨ７．６、
０．５mＭ ＡＴＰ、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭジチオス
レイトール)２０μl中、４℃で一晩、pＧＭ１から得ら
れたＤＮＡ断片２０μgを１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼ
で処理した。次に、この溶液を７０℃で１０分間加熱し
て、リガーゼを不活性化した。このリンカーをＥcoＲＩ
消化によって開裂し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(以後“ＰＡＧＥ"と指称する)を用いて、現在ではＥco
ＲＩ末端を備える断片を分離した。先づ、エチジウムブ
ロマイドで染色し、紫外線を用いて断片の位置を捜しだ
し、ゲルから必要な部分を切除することによって、３個
の最も大きな断片をゲルから単離した。透析バッグ中
に、３００μlの０．１×ＴＢＥと共にそれぞれのゲル
断片を置き、０．１×ＴＢＥ緩衝液(ＴＢＥ緩衝液は、
水１l中に１０．８gのトリス塩基、５．５gの硼酸、
０．０９gのＮa2ＥＤＴＡを含有する)中で１時間１００
Ｖで電気泳動にかけた。透析バッグから水溶液を捕集
し、フェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し、０．
２Ｍ塩化ナトリウムにし、エタノールで沈澱させた後に
ＤＮＡを水中に回収した。(以下に説明するＤＮＡ断片
の単離はすべて、ＰＡＧＥを用い、次に、今述べた電気
溶出法によって行われる。)ＥcoＲＩ粘着性末端を備え
るtrpプロモーター−オペレーター含有遺伝子を、次に
述べる手順で同定した。この手順は、プロモーター−オ
ペレーターを挿入した場合にテトラサイクリン耐性にな
るテトラサイクリン感受性プラスミド中に、断片を挿入
する必要がある。
トリプトファンオペロンを担持し(Ｇ．Ｆ．Ｍiozzari等
のＪ．Ｂacteriology, １４５７頁〜１４６６頁(１９７
８年))、従って、trpプロモーター−オペレーターシス
テムの制御のもとで、trpＤポリペプチド全体は勿論、t
rpリーダーの最初の６個のアミノ酸及びtrpＥポリペプ
チドのおおよそ最後から第３番目のアミノ酸(以後、Ｌ
Ｅ'と指称する)を含む融合蛋白質を発現する。プラスミ
ドを５個の部位で開裂する制限酵素ＰvuＩＩを用いて、
プラスミド２０μgを消化した。次に、ＥcoＲＩリンカ
ー(配列pＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧを有する自己相補的
オリゴヌクレオチドから成る)を用いて、この遺伝子断
片を組み合わせた。このリンカーは、後にＥcoＲＩ部位
を含むプラスミド中にクローンするためのＥcoＲＩ開裂
部位を与える。５'−リン酸合成オリゴヌクレオチドpＣ
ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ ２００ピコモルの存在下、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ緩衝液(２０mＭトリス、pＨ７．６、
０．５mＭ ＡＴＰ、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭジチオス
レイトール)２０μl中、４℃で一晩、pＧＭ１から得ら
れたＤＮＡ断片２０μgを１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼ
で処理した。次に、この溶液を７０℃で１０分間加熱し
て、リガーゼを不活性化した。このリンカーをＥcoＲＩ
消化によって開裂し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(以後“ＰＡＧＥ"と指称する)を用いて、現在ではＥco
ＲＩ末端を備える断片を分離した。先づ、エチジウムブ
ロマイドで染色し、紫外線を用いて断片の位置を捜しだ
し、ゲルから必要な部分を切除することによって、３個
の最も大きな断片をゲルから単離した。透析バッグ中
に、３００μlの０．１×ＴＢＥと共にそれぞれのゲル
断片を置き、０．１×ＴＢＥ緩衝液(ＴＢＥ緩衝液は、
水１l中に１０．８gのトリス塩基、５．５gの硼酸、
０．０９gのＮa2ＥＤＴＡを含有する)中で１時間１００
Ｖで電気泳動にかけた。透析バッグから水溶液を捕集
し、フェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し、０．
２Ｍ塩化ナトリウムにし、エタノールで沈澱させた後に
ＤＮＡを水中に回収した。(以下に説明するＤＮＡ断片
の単離はすべて、ＰＡＧＥを用い、次に、今述べた電気
溶出法によって行われる。)ＥcoＲＩ粘着性末端を備え
るtrpプロモーター−オペレーター含有遺伝子を、次に
述べる手順で同定した。この手順は、プロモーター−オ
ペレーターを挿入した場合にテトラサイクリン耐性にな
るテトラサイクリン感受性プラスミド中に、断片を挿入
する必要がある。
【００５５】プラスミドpＢＲＨ１(Ｒ．Ｉ．Ｒodriguez
等のＮucleic Ａcids Ｒesearch,６巻、３２６７〜３
２８７頁[１９７９年])はアンピシリン耐性を発現し、
且つテトラサイクリン耐性遺伝子を含むけれども関連プ
ロモーターが存在しないために、テトラサイクリン耐性
を示さない。従って、このプラスミドはテトラサイクリ
ン感受性である。ＥcoＲＩ部位にプロモーター−オペレ
ーターシステムを導入することによって、このプラスミ
ドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
等のＮucleic Ａcids Ｒesearch,６巻、３２６７〜３
２８７頁[１９７９年])はアンピシリン耐性を発現し、
且つテトラサイクリン耐性遺伝子を含むけれども関連プ
ロモーターが存在しないために、テトラサイクリン耐性
を示さない。従って、このプラスミドはテトラサイクリ
ン感受性である。ＥcoＲＩ部位にプロモーター−オペレ
ーターシステムを導入することによって、このプラスミ
ドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
【００５６】pＢＲＨ１をＥcoＲＩで消化し、フェノー
ル／クロロホルム抽出に続いてクロロホルム抽出するこ
とによってこの酵素を除去して、エタノールで沈澱させ
た後に水中に回収した。得られるＤＮＡ分子を、上述の
如くして得られた３個のＤＮＡ断片のそれぞれと別個の
反応混合物中で組み合わせ、前述のようにＴ4ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。標準的技術(Ｖ．Ｈershfie
ld等のＰroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ７１巻、
３４５５〜３４５９頁(１９７４年))により、受容能力
のあるＥ．coli Ｋ−１２菌株２９４(Ｋ．Ｂackman等の
Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ７３巻、４１７
４〜４１９８頁(１９７６年)(ＡＴＣＣＮo．３１４４
６))を形質転換するために、この反応混合物中に存在す
るＤＮＡを使用した。２０μg／mlのアンピシリンと５
μg／mlのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート
で、このバクテリヤを平板培養した。数個のテトラサイ
クリン耐性コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素分析によって、所望の断片の存在を確認し
た。得られるプラスミド、pＢＲＨtrpと指称される、は
β−ラクタマーゼを発現し、アンピシリン耐性を伝え
る。このプラスミドは、trpプロモーター−オペレータ
ーを含み、且つtrpリーダーの最初の６個のアミノ酸とt
rpＥポリペプチドのほぼ最後から３番目のアミノ酸(こ
のポリペプチドをＬＥ'と指称する)との融合体から成る
最初の蛋白質と、trpＤポリペプチドのほぼ最初の半分
(このポリペプチドをＤ'と指称する)に相当する２番目
の蛋白質と、テトラサイクリン耐性遺伝子によって指定
される３番目の蛋白質とをコードするＤＮＡ断片を含ん
でいる。
ル／クロロホルム抽出に続いてクロロホルム抽出するこ
とによってこの酵素を除去して、エタノールで沈澱させ
た後に水中に回収した。得られるＤＮＡ分子を、上述の
如くして得られた３個のＤＮＡ断片のそれぞれと別個の
反応混合物中で組み合わせ、前述のようにＴ4ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。標準的技術(Ｖ．Ｈershfie
ld等のＰroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ７１巻、
３４５５〜３４５９頁(１９７４年))により、受容能力
のあるＥ．coli Ｋ−１２菌株２９４(Ｋ．Ｂackman等の
Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ７３巻、４１７
４〜４１９８頁(１９７６年)(ＡＴＣＣＮo．３１４４
６))を形質転換するために、この反応混合物中に存在す
るＤＮＡを使用した。２０μg／mlのアンピシリンと５
μg／mlのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート
で、このバクテリヤを平板培養した。数個のテトラサイ
クリン耐性コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素分析によって、所望の断片の存在を確認し
た。得られるプラスミド、pＢＲＨtrpと指称される、は
β−ラクタマーゼを発現し、アンピシリン耐性を伝え
る。このプラスミドは、trpプロモーター−オペレータ
ーを含み、且つtrpリーダーの最初の６個のアミノ酸とt
rpＥポリペプチドのほぼ最後から３番目のアミノ酸(こ
のポリペプチドをＬＥ'と指称する)との融合体から成る
最初の蛋白質と、trpＤポリペプチドのほぼ最初の半分
(このポリペプチドをＤ'と指称する)に相当する２番目
の蛋白質と、テトラサイクリン耐性遺伝子によって指定
される３番目の蛋白質とをコードするＤＮＡ断片を含ん
でいる。
【００５７】ＥcoＲＩ制限酵素を用いて、pＢＲＨtrpを
消化し、得られた断片１をＰＡＧＥ及び電気溶出によっ
て単離した。ＥcoＲＩで消化したプラスミドpＳom１１
(Ｋ．Ｉtakura等のＳcience, １９８巻、１０５６頁(１
９７７年); 英国特許出願公開第２,００７,６７６Ａ号)
をこの断片１と組み合わせた。前述の如く、この混合物
をＴ4ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、得られたＤＮ
Ａを、前述の如くして、Ｅ．coliＫ−１２菌株２９４に
形質転換した。アンピシリン含有プレート上で、形質転
換された細菌を選択した。Ｐ32で放射性に標識を付され
たpＢＲＨtrpから単離されたtrpプロモーター−オペレ
ーター含有断片１をプローブとして用いて、コロニー雑
種形成(Ｍ．Ｇruenstein等のＰroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓ
ci．ＵＳＡ、７２巻、３９５１〜３９６５頁[１９７５
年])により、得られたアンピシリン耐性コロニーを仕分
けた。コロニー雑種形成によって陽性を示した数個のコ
ロニーをスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼ
ーションにより正を示すいくつかのコロニーを選択し、
プラスミドＤＮＡを単離し、挿入された断片の方向性
(オリエンテーション)を、二重消化に当たって制限酵素
Ｂgl ＩＩとＢamＨＩを用いて、制限分析によって決定
した。所望のオリエンテーションのtrpプロモーター−
オペレーター断片をもつpＳＯＭ７Δ２と呼ばれるプラ
スミドを含むＥ．coli２９４を、１０μg／mlアンピシ
リンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。細胞を、光学
密度１(５５０nＭで)まで増殖させ、遠心分離によって
収集して、１０倍希釈のＭ９培地中に再び懸濁した。細
胞を２〜３時間、再び光学密度１まで増殖させ、次に溶
菌して、細胞蛋白質全体をＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリ
ウム)エリア(１５％)ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(Ｊ．Ｖ．Ｍaizel Ｊr．等のＭeth．Ｖiral., ５巻、
１８０〜２４６頁(１９７１年))によって分析した。
消化し、得られた断片１をＰＡＧＥ及び電気溶出によっ
て単離した。ＥcoＲＩで消化したプラスミドpＳom１１
(Ｋ．Ｉtakura等のＳcience, １９８巻、１０５６頁(１
９７７年); 英国特許出願公開第２,００７,６７６Ａ号)
をこの断片１と組み合わせた。前述の如く、この混合物
をＴ4ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、得られたＤＮ
Ａを、前述の如くして、Ｅ．coliＫ−１２菌株２９４に
形質転換した。アンピシリン含有プレート上で、形質転
換された細菌を選択した。Ｐ32で放射性に標識を付され
たpＢＲＨtrpから単離されたtrpプロモーター−オペレ
ーター含有断片１をプローブとして用いて、コロニー雑
種形成(Ｍ．Ｇruenstein等のＰroc．Ｎat'l．Ａcad．Ｓ
ci．ＵＳＡ、７２巻、３９５１〜３９６５頁[１９７５
年])により、得られたアンピシリン耐性コロニーを仕分
けた。コロニー雑種形成によって陽性を示した数個のコ
ロニーをスクリーニングした。コロニーハイブリダイゼ
ーションにより正を示すいくつかのコロニーを選択し、
プラスミドＤＮＡを単離し、挿入された断片の方向性
(オリエンテーション)を、二重消化に当たって制限酵素
Ｂgl ＩＩとＢamＨＩを用いて、制限分析によって決定
した。所望のオリエンテーションのtrpプロモーター−
オペレーター断片をもつpＳＯＭ７Δ２と呼ばれるプラ
スミドを含むＥ．coli２９４を、１０μg／mlアンピシ
リンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。細胞を、光学
密度１(５５０nＭで)まで増殖させ、遠心分離によって
収集して、１０倍希釈のＭ９培地中に再び懸濁した。細
胞を２〜３時間、再び光学密度１まで増殖させ、次に溶
菌して、細胞蛋白質全体をＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリ
ウム)エリア(１５％)ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(Ｊ．Ｖ．Ｍaizel Ｊr．等のＭeth．Ｖiral., ５巻、
１８０〜２４６頁(１９７１年))によって分析した。
【００５８】ＥcoＲＩを用いて、プラスミドpＳom７Δ
２ １０μgを開裂し、トリプトファン遺伝子因子を含
むＤＮＡ断片１をＰＡＧＥと電気溶出とにより単離し
た。各分子中のほぼ５個のＴaqＩ部位のうち平均して１
つの部位のみが開裂されるように、制限エンドヌクレア
ーゼＴaqＩ２単位を用いて、３７℃で１０分間、この断
片２μgを消化した。ＰＡＧＥによって、この部分消化
された断片混合物を分離して、１個のＥcoＲＩ末端と１
個のＴaqＩ末端を含んだ約３００個の塩基対断片２を電
気溶出によって単離した。転写開始部位と翻訳開始部位
との間に、対応するＴaqＩ部位の位置が見出された。こ
の部位は、trpリーダーペプチドのＡＴＧコドンからヌ
クレオチド５個上流にある。この部位近辺のＤＮＡ配列
が図５に示される。前述のような方法によって、trpオ
ペロンのすべての調節因子(control element)、即ちプ
ロモーター−オペレーターシステム、転写開始シグナル
及びtrpリーダーリボゾーム結合部位の一部分を含む断
片を単離することができた。
２ １０μgを開裂し、トリプトファン遺伝子因子を含
むＤＮＡ断片１をＰＡＧＥと電気溶出とにより単離し
た。各分子中のほぼ５個のＴaqＩ部位のうち平均して１
つの部位のみが開裂されるように、制限エンドヌクレア
ーゼＴaqＩ２単位を用いて、３７℃で１０分間、この断
片２μgを消化した。ＰＡＧＥによって、この部分消化
された断片混合物を分離して、１個のＥcoＲＩ末端と１
個のＴaqＩ末端を含んだ約３００個の塩基対断片２を電
気溶出によって単離した。転写開始部位と翻訳開始部位
との間に、対応するＴaqＩ部位の位置が見出された。こ
の部位は、trpリーダーペプチドのＡＴＧコドンからヌ
クレオチド５個上流にある。この部位近辺のＤＮＡ配列
が図５に示される。前述のような方法によって、trpオ
ペロンのすべての調節因子(control element)、即ちプ
ロモーター−オペレーターシステム、転写開始シグナル
及びtrpリーダーリボゾーム結合部位の一部分を含む断
片を単離することができた。
【００５９】次に、trpリーダー配列に対する翻訳開始
シグナルに隣接する得られた断片の３'−末端でのＴaq
Ｉ残基をＸbaＩ部位に転換した。この転換は、上で得ら
れた断片２を、単一の(即ち唯一の)ＥcoＲＩ部位と単一
のＸbaＩ部位を含むプラスミドに結合することによって
行われた。この目的のためには、整然とレプリコン、抗
生物質耐性等の選択マーカー、ＥcoＲＩ部位、ＸbaＩ部
位及びＢamＨＩ部位を含む実質的に任意のプラスミドを
使用しうる。このようにして、例えば、ＨindＩＩＩを
用いてプラスミドの単一ＨindＩＩＩ部位で開裂し、次
に、得られる粘着末端を単一鎖特異ヌクレアーゼで消化
して、ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧ等の認識部位を含む自己ア
ンニーリング性二本鎖合成ヌクレオチドを平滑末端で結
合することによって、pＢＲ３２２(Ｆ．Ｂolivar等のＧ
ene、２巻、９５〜１１９頁[１９７７年])のＥcoＲＩ部
位とＢamＨＩ部位の間に、ＸbaＩ部位を導入することが
できる。その他の方法として、ＥcoＲＩ開裂残基とＢam
ＨＩ開裂残基の間に単一のＸbaＩ部位を含む天然起源の
ＤＮＡ断片を、本発明の場合に行ったようにして用いて
もよい。このようにしてＢ型肝炎ウイルスゲノムのＥco
ＲＩとＢamＨＩによる消化生成物を通常の方法で取得
し、プラスミドpＧＨ６(Ｄ．Ｖ．Ｇoeddel等のＮatur
e、２８１巻、５４４頁[１９７９年])のＥcoＲＩ部位と
ＢamＨＩ部位にクローン化して、プラスミドpＨＳ３２
を形成させた。プラスミドpＨＳ３２をＸbaＩによって
開裂し、フェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させた。次に、０．１mＭ dＴＴ
Ｐと０．１mＭ dＣＴＰを含む３０μlのポリメラーゼ
緩衝液(５０mＭ燐酸カリウム、pＨ７．４、７mＭ Ｍg
Ｃl2、１mＭβ−メルカプトエタノール)中のＥ．coliポ
リメラーゼＩ Ｋlenow断片(Ｂoehringer−Ｍannheim)
１μlを用いて、０℃で３０分間処理し、次に３７℃で
２分間処理した。この処理によって、ＸbaＩ開裂部位の
５'−突出末端に相補的な４個のヌクレオチドのうち２
個が充填された。
シグナルに隣接する得られた断片の３'−末端でのＴaq
Ｉ残基をＸbaＩ部位に転換した。この転換は、上で得ら
れた断片２を、単一の(即ち唯一の)ＥcoＲＩ部位と単一
のＸbaＩ部位を含むプラスミドに結合することによって
行われた。この目的のためには、整然とレプリコン、抗
生物質耐性等の選択マーカー、ＥcoＲＩ部位、ＸbaＩ部
位及びＢamＨＩ部位を含む実質的に任意のプラスミドを
使用しうる。このようにして、例えば、ＨindＩＩＩを
用いてプラスミドの単一ＨindＩＩＩ部位で開裂し、次
に、得られる粘着末端を単一鎖特異ヌクレアーゼで消化
して、ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧ等の認識部位を含む自己ア
ンニーリング性二本鎖合成ヌクレオチドを平滑末端で結
合することによって、pＢＲ３２２(Ｆ．Ｂolivar等のＧ
ene、２巻、９５〜１１９頁[１９７７年])のＥcoＲＩ部
位とＢamＨＩ部位の間に、ＸbaＩ部位を導入することが
できる。その他の方法として、ＥcoＲＩ開裂残基とＢam
ＨＩ開裂残基の間に単一のＸbaＩ部位を含む天然起源の
ＤＮＡ断片を、本発明の場合に行ったようにして用いて
もよい。このようにしてＢ型肝炎ウイルスゲノムのＥco
ＲＩとＢamＨＩによる消化生成物を通常の方法で取得
し、プラスミドpＧＨ６(Ｄ．Ｖ．Ｇoeddel等のＮatur
e、２８１巻、５４４頁[１９７９年])のＥcoＲＩ部位と
ＢamＨＩ部位にクローン化して、プラスミドpＨＳ３２
を形成させた。プラスミドpＨＳ３２をＸbaＩによって
開裂し、フェノールで抽出し、クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させた。次に、０．１mＭ dＴＴ
Ｐと０．１mＭ dＣＴＰを含む３０μlのポリメラーゼ
緩衝液(５０mＭ燐酸カリウム、pＨ７．４、７mＭ Ｍg
Ｃl2、１mＭβ−メルカプトエタノール)中のＥ．coliポ
リメラーゼＩ Ｋlenow断片(Ｂoehringer−Ｍannheim)
１μlを用いて、０℃で３０分間処理し、次に３７℃で
２分間処理した。この処理によって、ＸbaＩ開裂部位の
５'−突出末端に相補的な４個のヌクレオチドのうち２
個が充填された。
【００６０】
【化２】
【００６１】２個の５'−突出ヌクレオチドをもつ末端
を与える２個のヌクレオチドdＣとdＴが組み込まれた。
プラスミドpＨＳ３２(フェノールとクロロホルムにより
抽出し、エタノールにより沈澱させた後、水中に回収し
たもの)中のこの鎖状残基をＥcoＲＩで開裂した。比較
的小さなＥcoＲＩ−ＸbaＩ断片から、この大きなプラス
ミド断片をＰＡＧＥによって分離し、電気溶出の後にこ
の大きなプラスミド断片を単離した。上述の条件と同様
な条件下で、pＨＳ３２(０．２μg)からのこのＤＮＡ断
片をトリプトファンオペロン(０．０１μg)のＥcoＲＩ
−ＴaqＩ断片に結合した。この過程において、たとえＷ
atson−Ｃrick塩基対を完全には構成しないにしても、
ＴaqＩ突出末端をＸbaＩの残余突出末端に結合させる。
を与える２個のヌクレオチドdＣとdＴが組み込まれた。
プラスミドpＨＳ３２(フェノールとクロロホルムにより
抽出し、エタノールにより沈澱させた後、水中に回収し
たもの)中のこの鎖状残基をＥcoＲＩで開裂した。比較
的小さなＥcoＲＩ−ＸbaＩ断片から、この大きなプラス
ミド断片をＰＡＧＥによって分離し、電気溶出の後にこ
の大きなプラスミド断片を単離した。上述の条件と同様
な条件下で、pＨＳ３２(０．２μg)からのこのＤＮＡ断
片をトリプトファンオペロン(０．０１μg)のＥcoＲＩ
−ＴaqＩ断片に結合した。この過程において、たとえＷ
atson−Ｃrick塩基対を完全には構成しないにしても、
ＴaqＩ突出末端をＸbaＩの残余突出末端に結合させる。
【００６２】
【化３】
【００６３】この結合反応混合物の一部分を、上述の如
く、Ｅ．coli２９４細胞に形質転換し、加熱処理し、ア
ンピシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。２４
個のコロニーを選択し、３mlのＬＢ培地中で増殖させ
て、プラスミドを単離した。これらの中６個が、Ｅ．co
liによって触媒されるＤＮＡ修復と複製とによって再生
されたＸbaＩ部位をもっていることが判った。
く、Ｅ．coli２９４細胞に形質転換し、加熱処理し、ア
ンピシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。２４
個のコロニーを選択し、３mlのＬＢ培地中で増殖させ
て、プラスミドを単離した。これらの中６個が、Ｅ．co
liによって触媒されるＤＮＡ修復と複製とによって再生
されたＸbaＩ部位をもっていることが判った。
【００６４】
【化４】
【００６５】これらのプラスミドも、ＥcoＲＩとＨpaＩ
の双方によって開裂されて、所期の制限断片を与えるこ
とが判った。次に述べるように、異種ポリペプチドを発
現するために、１個のプラスミド１４、pＴrp１４と指
称される、が使用された。
の双方によって開裂されて、所期の制限断片を与えるこ
とが判った。次に述べるように、異種ポリペプチドを発
現するために、１個のプラスミド１４、pＴrp１４と指
称される、が使用された。
【００６６】プラスミドpＨＧＨ１０７(Ｄ．Ｖ．Ｇoedd
el等のＮature、２８１巻、５４４頁(１９７９年))は、
合成ＤＮＡ断片から製造された２３個のアミノ酸コドン
と、ヒト成長ホルモン伝令ＲＮＡの逆転写によって製造
された相補ＤＮＡから得られた１６３個のアミノ酸コド
ンとから構成されるヒト成長ホルモン用の遺伝子を含
む。この遺伝子３はヒト成長ホルモンの“プレシーケン
ス"に関するコドンを欠いているけれども、ＡＴＧ翻訳
開始コドンを含んでいる。上述の如く、この遺伝子は、
ＥcoＲＩで処理され、次いで、Ｅ．coliポリメラーゼＩ
クレノー断片とdＴＴＰ及びdＡＴＰを用いて処理された
後に、１０μgのpＨＧＨ１０７から単離された。フェノ
ール抽出、クロロホルム抽出及びエタノールによる沈澱
に続いて、プラスミドはＢamＨＩで処理された。ヒト成
長ホルモン(“ＨＧＨ")遺伝子含有断片３が、ＰＡＧＥ
により、続いて電気溶出によって単離された。得られた
ＤＮＡ断片もテトラサイクリン耐性構造遺伝子の最初の
３５０個のヌクレオチドを含むけれども、テトラサイク
リンプロモーター−オペレーターシステムを欠くので、
後に発現プラスミドにクローン化した場合に、テトラサ
イクリン耐性が回復するために挿入体を含むプラスミド
の位置を見つけ出すことができる。クレノーポリメラー
ゼＩの手順によって、断片３のＥcoＲＩ末端が充填され
たために、この断片は１個の平滑末端と１個の粘着性末
端を有し、後に発現プラスミド中に挿入された場合に、
適切なオリエンテーションを保証する。
el等のＮature、２８１巻、５４４頁(１９７９年))は、
合成ＤＮＡ断片から製造された２３個のアミノ酸コドン
と、ヒト成長ホルモン伝令ＲＮＡの逆転写によって製造
された相補ＤＮＡから得られた１６３個のアミノ酸コド
ンとから構成されるヒト成長ホルモン用の遺伝子を含
む。この遺伝子３はヒト成長ホルモンの“プレシーケン
ス"に関するコドンを欠いているけれども、ＡＴＧ翻訳
開始コドンを含んでいる。上述の如く、この遺伝子は、
ＥcoＲＩで処理され、次いで、Ｅ．coliポリメラーゼＩ
クレノー断片とdＴＴＰ及びdＡＴＰを用いて処理された
後に、１０μgのpＨＧＨ１０７から単離された。フェノ
ール抽出、クロロホルム抽出及びエタノールによる沈澱
に続いて、プラスミドはＢamＨＩで処理された。ヒト成
長ホルモン(“ＨＧＨ")遺伝子含有断片３が、ＰＡＧＥ
により、続いて電気溶出によって単離された。得られた
ＤＮＡ断片もテトラサイクリン耐性構造遺伝子の最初の
３５０個のヌクレオチドを含むけれども、テトラサイク
リンプロモーター−オペレーターシステムを欠くので、
後に発現プラスミドにクローン化した場合に、テトラサ
イクリン耐性が回復するために挿入体を含むプラスミド
の位置を見つけ出すことができる。クレノーポリメラー
ゼＩの手順によって、断片３のＥcoＲＩ末端が充填され
たために、この断片は１個の平滑末端と１個の粘着性末
端を有し、後に発現プラスミド中に挿入された場合に、
適切なオリエンテーションを保証する。
【００６７】次に、上で製造されたＨＧＨ遺伝子含有断
片を収容するために、発現プラスミドpＴrp１４が製造
された。このようにして、pＴrp１４はＸbaＩによって
消化され、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ及びdＣＴＰを用
いて、クレノーポリメラーゼＩ手法によって、得られた
粘着性末端が充填された。フェノールとクロロホルムに
よる抽出及びエタノールによる沈澱の後に、得られたＤ
ＮＡをＢamＨＩで処理して、得られた大きなプラスミド
断片をＰＡＧＥと電気溶出とによって単離した。このp
Ｔrp１４−起源の断片は１個の平滑末端と１個の粘着性
末端とをもっており、前述のＨＧＨ遺伝子含有断片３と
の適切なオリエンテーションでの組み換えを可能にし
た。
片を収容するために、発現プラスミドpＴrp１４が製造
された。このようにして、pＴrp１４はＸbaＩによって
消化され、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ及びdＣＴＰを用
いて、クレノーポリメラーゼＩ手法によって、得られた
粘着性末端が充填された。フェノールとクロロホルムに
よる抽出及びエタノールによる沈澱の後に、得られたＤ
ＮＡをＢamＨＩで処理して、得られた大きなプラスミド
断片をＰＡＧＥと電気溶出とによって単離した。このp
Ｔrp１４−起源の断片は１個の平滑末端と１個の粘着性
末端とをもっており、前述のＨＧＨ遺伝子含有断片３と
の適切なオリエンテーションでの組み換えを可能にし
た。
【００６８】ＨＧＨ遺伝子断片３とpＴrp１４Ｘba−Ｂa
mＨＩ断片が、上述の条件と類似の条件下で組み合わさ
れ且つ結合された。充填されたＸbaＩ末端とＥcoＲＩ末
端とが、平滑末端結合によって結合して、ＸbaＩ部位と
ＥcoＲＩ部位の双方を再形成した。
mＨＩ断片が、上述の条件と類似の条件下で組み合わさ
れ且つ結合された。充填されたＸbaＩ末端とＥcoＲＩ末
端とが、平滑末端結合によって結合して、ＸbaＩ部位と
ＥcoＲＩ部位の双方を再形成した。
【００６９】
【化５】
【００７０】この構造もテトラサイクリン耐性遺伝子を
再生した。プラスミドpＨＧＨ１０７は、ＨＧＨ遺伝子
から上流にあるプロモーター(lacプロモーター)から、
テトラサイクリン耐性を発現する。pＨＧＨ２０７と呼
ばれるこの構造は、トリプトファンプロモーター−オペ
レーターの調節下で、テトラサイクリン耐性に関する遺
伝子の発現を可能にする。このようにして、結合混合物
は、Ｅ．coli２９４に形質転換され、５μg／mlのテト
ラサイクリンを含むＬＢプレート上でコロニーが選択さ
れた。
再生した。プラスミドpＨＧＨ１０７は、ＨＧＨ遺伝子
から上流にあるプロモーター(lacプロモーター)から、
テトラサイクリン耐性を発現する。pＨＧＨ２０７と呼
ばれるこの構造は、トリプトファンプロモーター−オペ
レーターの調節下で、テトラサイクリン耐性に関する遺
伝子の発現を可能にする。このようにして、結合混合物
は、Ｅ．coli２９４に形質転換され、５μg／mlのテト
ラサイクリンを含むＬＢプレート上でコロニーが選択さ
れた。
【００７１】pＢＧＨ３３−１の構成(図６) 完全なヒト成長ホルモン遺伝子配列をもつpＨＧＨ２０
７−１の構造が示される。この遺伝子の前部は、Ｇoedd
el等のＮature、２８１巻、５４４頁(１９７９年)によ
って説明されているように合成のものである。下記にお
いて、trp−プロモーターに関してpＨＧＨ２０７−１の
ＨＧＨ遺伝子と同じオリエンテーションと同じ位置にＢ
ＧＨ遺伝子を含むプラスミドが組み立てられた。
７−１の構造が示される。この遺伝子の前部は、Ｇoedd
el等のＮature、２８１巻、５４４頁(１９７９年)によ
って説明されているように合成のものである。下記にお
いて、trp−プロモーターに関してpＨＧＨ２０７−１の
ＨＧＨ遺伝子と同じオリエンテーションと同じ位置にＢ
ＧＨ遺伝子を含むプラスミドが組み立てられた。
【００７２】下記のように、ＢamＨＩとＰvuＩＩを用い
て、プラスミドＤＮＡ２０μl(即ち１０μg)を消化し
た。ＤＮＡ２０μlに、５μlの１０×制限酵素緩衝液
(５００mＭ ＮaＣl、１００mＭトリスＨＣl、pＨ７．
４、１００mＭ ＭgＳＯ4及び１０mＭ ＤＴＴ)、２０
μlのＨ2Ｏ及び１０単位のＢamＨＩ制限酵素と２μlの
ＰvuＩＩ制限酵素が添加された。次に、この反応混合物
を３７℃で９０分間インキュベートした。この混合物を
６％アクリルアミドゲル上に置き、５０mＡで２時間電
気泳動を行った。このゲル中のＤＮＡをエチジウムブロ
マイドで染色し、紫外線で見えるようにした。３６５bp
(pＢＲ３２２のＨaeＩＩＩ消化物について)断片に対応
するバンドが切除され、透析バッグ中に挿入され、１０
０mＡの電流を用いてＤＮＡが電気溶出された。バッグ
から液体を除き、液体の塩濃度を０．３Ｍ ＮaＣlに調
節した。エタノール２容を加え、−７０℃でＤＮＡを沈
澱させた。エペンドルフ(Ｅppendorf)遠心分離機中でＤ
ＮＡを回転沈降させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥
して、１０μlのＴＡＥ(１０mＭトリスＨＣl、pＨ７．
４、０．１mＭ ＥＤＴＡ)中に再び懸濁した。同様にし
て、pＨＧＨ２０７−１中の大きなＸbaＩ−ＢamＨＩ断
片及びpＢＧＨ３３中のＸbaＩ−ＰvuＩＩ(部分消化)断
片を単離した。
て、プラスミドＤＮＡ２０μl(即ち１０μg)を消化し
た。ＤＮＡ２０μlに、５μlの１０×制限酵素緩衝液
(５００mＭ ＮaＣl、１００mＭトリスＨＣl、pＨ７．
４、１００mＭ ＭgＳＯ4及び１０mＭ ＤＴＴ)、２０
μlのＨ2Ｏ及び１０単位のＢamＨＩ制限酵素と２μlの
ＰvuＩＩ制限酵素が添加された。次に、この反応混合物
を３７℃で９０分間インキュベートした。この混合物を
６％アクリルアミドゲル上に置き、５０mＡで２時間電
気泳動を行った。このゲル中のＤＮＡをエチジウムブロ
マイドで染色し、紫外線で見えるようにした。３６５bp
(pＢＲ３２２のＨaeＩＩＩ消化物について)断片に対応
するバンドが切除され、透析バッグ中に挿入され、１０
０mＡの電流を用いてＤＮＡが電気溶出された。バッグ
から液体を除き、液体の塩濃度を０．３Ｍ ＮaＣlに調
節した。エタノール２容を加え、−７０℃でＤＮＡを沈
澱させた。エペンドルフ(Ｅppendorf)遠心分離機中でＤ
ＮＡを回転沈降させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥
して、１０μlのＴＡＥ(１０mＭトリスＨＣl、pＨ７．
４、０．１mＭ ＥＤＴＡ)中に再び懸濁した。同様にし
て、pＨＧＨ２０７−１中の大きなＸbaＩ−ＢamＨＩ断
片及びpＢＧＨ３３中のＸbaＩ−ＰvuＩＩ(部分消化)断
片を単離した。
【００７３】このようにして単離したＤＮＡ断片それぞ
れの２μlを混合した。１０mＭ ＡＴＰ１μl、１０×
リガーゼ緩衝液(２００mＭトリスＨＣl、pＨ７．５、１
００mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ)１μl、Ｔ4ＤＮＡ
リガーゼ１μl及びＨ2Ｏ２μlを加えた。結合を４℃で
一晩行った。この混合物を用いて受容能力のあるＥ．co
li Ｋ−１２ ２９４細胞を次のようにして形質転換し
た。Ｌ−ブロス１０mlにＥ．coli Ｋ−１２ ２９４を
接種し、３７℃の振盪浴中で３７℃でインキュベートし
た。ソルバル(Ｓorvall)遠心分離機中６０００rpmで５
分間回転させることによって、０．８のＯＤ550におい
て、細胞を回収した。細胞ペレットを０．１５Ｍ Ｎa
Ｃl中で洗浄／再懸濁し、再び遠心分離にかけた。細胞
を７５mＭＣaＣl2、５mＭ ＭgＣl2及び１０mＭトリス
ＨＣl pＨ７．８中に再懸濁し、氷上で少なくとも２０
分間インキュベートした。２５００rpmで５分間細胞を
回転沈降させ、同じ緩衝液中に再懸濁した。この細胞懸
濁液２５０μlに結合混合物それぞれを加え、氷上で６
０分間インキュベートした。４２℃で９０秒間細胞に熱
衝撃を与え、冷却して、２mlのＬ−ブロスを添加した。
３７℃で１時間インキュベーションすることにより、細
胞を回復させた。この細胞懸濁液１００μlを適切なプ
レート上で平板培養した。次に、このプレートを３７℃
で一晩インキュベートした。このようにして得られたコ
ロニーの数個の中のプラスミドの構造が図６に示され
る。(pＢＧＨ３３−１)
れの２μlを混合した。１０mＭ ＡＴＰ１μl、１０×
リガーゼ緩衝液(２００mＭトリスＨＣl、pＨ７．５、１
００mＭ ＭgＣl2、２０mＭ ＤＴＴ)１μl、Ｔ4ＤＮＡ
リガーゼ１μl及びＨ2Ｏ２μlを加えた。結合を４℃で
一晩行った。この混合物を用いて受容能力のあるＥ．co
li Ｋ−１２ ２９４細胞を次のようにして形質転換し
た。Ｌ−ブロス１０mlにＥ．coli Ｋ−１２ ２９４を
接種し、３７℃の振盪浴中で３７℃でインキュベートし
た。ソルバル(Ｓorvall)遠心分離機中６０００rpmで５
分間回転させることによって、０．８のＯＤ550におい
て、細胞を回収した。細胞ペレットを０．１５Ｍ Ｎa
Ｃl中で洗浄／再懸濁し、再び遠心分離にかけた。細胞
を７５mＭＣaＣl2、５mＭ ＭgＣl2及び１０mＭトリス
ＨＣl pＨ７．８中に再懸濁し、氷上で少なくとも２０
分間インキュベートした。２５００rpmで５分間細胞を
回転沈降させ、同じ緩衝液中に再懸濁した。この細胞懸
濁液２５０μlに結合混合物それぞれを加え、氷上で６
０分間インキュベートした。４２℃で９０秒間細胞に熱
衝撃を与え、冷却して、２mlのＬ−ブロスを添加した。
３７℃で１時間インキュベーションすることにより、細
胞を回復させた。この細胞懸濁液１００μlを適切なプ
レート上で平板培養した。次に、このプレートを３７℃
で一晩インキュベートした。このようにして得られたコ
ロニーの数個の中のプラスミドの構造が図６に示され
る。(pＢＧＨ３３−１)
【００７４】これ以上の構成はすべて、上述と同じ手順
を用い、必要な変更を加えて実施された。
を用い、必要な変更を加えて実施された。
【００７５】雑種成長ホルモン遺伝子ＨＢＧＨとＢＨＧ
Ｈの構成(図６) ＨＧＨ遺伝子及びＢＧＨ遺伝子中の２個のＰvuＩＩ部位
は同じ位置にある。ＰvuＩＩ断片は、これらの遺伝子に
関する伝令ＲＮＡの解読わく(reading frame)を変える
ことなく交換可能である。双方の遺伝子の発現上大きく
相違するところは、伝達暗号(message)のはじめに蛋白
質合成の開始に差があることに起因する。従って、転写
の際に、雑種伝令ＲＮＡを与える雑種遺伝子をそのよう
に組み立てて、双方の遺伝子の前部を交換した。２個の
プラスミド、即ちpＢＨＧＨとpＨＢＧＨが下記の如く組
み立てられた。
Ｈの構成(図６) ＨＧＨ遺伝子及びＢＧＨ遺伝子中の２個のＰvuＩＩ部位
は同じ位置にある。ＰvuＩＩ断片は、これらの遺伝子に
関する伝令ＲＮＡの解読わく(reading frame)を変える
ことなく交換可能である。双方の遺伝子の発現上大きく
相違するところは、伝達暗号(message)のはじめに蛋白
質合成の開始に差があることに起因する。従って、転写
の際に、雑種伝令ＲＮＡを与える雑種遺伝子をそのよう
に組み立てて、双方の遺伝子の前部を交換した。２個の
プラスミド、即ちpＢＨＧＨとpＨＢＧＨが下記の如く組
み立てられた。
【００７６】pＨＧＨ２０７−１から、ＢamＨＩ−Ｘba
Ｉ大断片と、前部を伴わないＨＧＨ遺伝子を含む８５７
bp ＢamＨＩ−ＰvuＩＩ(部分)断片が単離された。pＢＧ
Ｈ３３−１から、ＢＧＨ遺伝子の前部を含む７５bp Ｘb
aＩ−ＰvuＩＩ断片が単離された。結合と形質転換を行
った後に、pＢＨＧＨを得た。pＨＢＧＨはpＢＨＧＨと
類似の方法で組み立てられた。この場合、後部はpＢＧ
Ｈ３３−１から誘導された、一方前部、即ち７５bp Ｘb
aＩ−ＰvuＩＩ断片はpＨＧＨ２０７−１から誘導され
た。
Ｉ大断片と、前部を伴わないＨＧＨ遺伝子を含む８５７
bp ＢamＨＩ−ＰvuＩＩ(部分)断片が単離された。pＢＧ
Ｈ３３−１から、ＢＧＨ遺伝子の前部を含む７５bp Ｘb
aＩ−ＰvuＩＩ断片が単離された。結合と形質転換を行
った後に、pＢＨＧＨを得た。pＨＢＧＨはpＢＨＧＨと
類似の方法で組み立てられた。この場合、後部はpＢＧ
Ｈ３３−１から誘導された、一方前部、即ち７５bp Ｘb
aＩ−ＰvuＩＩ断片はpＨＧＨ２０７−１から誘導され
た。
【００７７】ＢＧＢ遺伝子の合成前部の構成とクローニ
ング(図７) ＢＧＨとＨＧＨ遺伝子のＰvuＩＩ部位までのＤＮＡ配列
は２２個のアミノ酸をコードする。ＨＧＨ遺伝子の前部
が優れた蛋白質合成開始特性をもつために、ＢＧＨの前
部配列は、ＢＧＨ遺伝子中のヌクレオチド変更の数がＨ
ＧＨ遺伝子に対して最小になるように構成される。適切
なＢＧＨアミノ酸配列をコードし、且つ将来のmＲＮＡ
中の立体配座構造を削減させるために、１４個の塩基対
のみが天然のＢＧＨ配列から変更された。このＤＮＡ配
列を図７に示す。ベクター中でのクローニングを容易に
するために、この配列はＥcoＲＩ粘着性末端とＨindＩ
ＩＩ粘着性末端で終了する。ＢＧＨ遺伝子の残部の適切
に接合させるためのＰvuＩＩ部位は、このＨindＩＩＩ
部位に近接する。
ング(図７) ＢＧＨとＨＧＨ遺伝子のＰvuＩＩ部位までのＤＮＡ配列
は２２個のアミノ酸をコードする。ＨＧＨ遺伝子の前部
が優れた蛋白質合成開始特性をもつために、ＢＧＨの前
部配列は、ＢＧＨ遺伝子中のヌクレオチド変更の数がＨ
ＧＨ遺伝子に対して最小になるように構成される。適切
なＢＧＨアミノ酸配列をコードし、且つ将来のmＲＮＡ
中の立体配座構造を削減させるために、１４個の塩基対
のみが天然のＢＧＨ配列から変更された。このＤＮＡ配
列を図７に示す。ベクター中でのクローニングを容易に
するために、この配列はＥcoＲＩ粘着性末端とＨindＩ
ＩＩ粘着性末端で終了する。ＢＧＨ遺伝子の残部の適切
に接合させるためのＰvuＩＩ部位は、このＨindＩＩＩ
部位に近接する。
【００７８】上述の手順に従って、断片Ｕ１〜Ｕ６と断
片Ｌ１〜Ｌ６を化学的に合成した。Ｕ１とＬ６以外の断
片はすべて、混合されて、キナーゼで処理された。Ｕ１
とＬ６を添加した後、混合された断片を結合し、６％ポ
リアクリルアミドゲル上で精製し、７５bpバンド抽出を
行い、標準的手法によって単離した。ＥcoＲＩとＨind
ＩＩＩを用いて切断したpＢＲ３２２中に、この断片を
挿入した。このようにして、プラスミドpＢＲ３２２−
０１が得られた。
片Ｌ１〜Ｌ６を化学的に合成した。Ｕ１とＬ６以外の断
片はすべて、混合されて、キナーゼで処理された。Ｕ１
とＬ６を添加した後、混合された断片を結合し、６％ポ
リアクリルアミドゲル上で精製し、７５bpバンド抽出を
行い、標準的手法によって単離した。ＥcoＲＩとＨind
ＩＩＩを用いて切断したpＢＲ３２２中に、この断片を
挿入した。このようにして、プラスミドpＢＲ３２２−
０１が得られた。
【００７９】ＢＧＨ遺伝子中の天然前部の合成前部によ
る置換(図８) Ｅco ＲＩとＰvuＩＩを用いて、ＢＧＨ遺伝子のクローン
した合成前部をpＢＲ３２２−０１から切除して、得ら
れた７０bp断片を単離した。pＢＧＨ３３−１から、Ｅc
oＲＩ−ＢamＨＩ大断片と８７５bp ＢamＨＩ−ＰvuＩ
Ｉ(部分)断片を単離した。３個の断片が単離され、結合
されて、前述の如くＥ．coli Ｋ−１２２９４を形質転
換するために使用された。このようにして、pＢＧＨ３
３−２が得られた。このプラスミドは完全なＢＧＨ遺伝
子を含むけれども、プロモーターを含んでいない。従っ
て、ＥcoＲＩを用いてpＢＧＨ３３−２を切断し、pＨＧ
Ｈ２０７−１から誘導された３１０bp ＥcoＲＩ断片を
含むtrp−プロモーターを結合によって挿入した。形質
転換後、テトラサイクリン耐性コロニーを分析した。そ
の結果、図に示されるように、これらのコロニーはＨＧ
Ｈ遺伝子とtet−遺伝子の方向に指向づけされた挿入trp
−プロモーターを含んでいた。
る置換(図８) Ｅco ＲＩとＰvuＩＩを用いて、ＢＧＨ遺伝子のクローン
した合成前部をpＢＲ３２２−０１から切除して、得ら
れた７０bp断片を単離した。pＢＧＨ３３−１から、Ｅc
oＲＩ−ＢamＨＩ大断片と８７５bp ＢamＨＩ−ＰvuＩ
Ｉ(部分)断片を単離した。３個の断片が単離され、結合
されて、前述の如くＥ．coli Ｋ−１２２９４を形質転
換するために使用された。このようにして、pＢＧＨ３
３−２が得られた。このプラスミドは完全なＢＧＨ遺伝
子を含むけれども、プロモーターを含んでいない。従っ
て、ＥcoＲＩを用いてpＢＧＨ３３−２を切断し、pＨＧ
Ｈ２０７−１から誘導された３１０bp ＥcoＲＩ断片を
含むtrp−プロモーターを結合によって挿入した。形質
転換後、テトラサイクリン耐性コロニーを分析した。そ
の結果、図に示されるように、これらのコロニーはＨＧ
Ｈ遺伝子とtet−遺伝子の方向に指向づけされた挿入trp
−プロモーターを含んでいた。
【００８０】ＢＧＨ遺伝子の３'−末端の修復(図９) ＢＧＨ遺伝子の第２のＰvuＩＩ部位を超える部分の配列
が、ＨＧＨ遺伝子から誘導された。末端のアミノ酸の１
つは、天然ＢＧＨ遺伝子中のアミノ酸と相違する。この
３'−末端を次のようにして修復した。示されるような
合成ＤＮＡ断片が合成された。クローニングを容易にす
るために、このＤＮＡは、ＥcoＲＩ末端とＨindＩＩＩ
末端によって側方に接合される。このＤＮＡは、ＢＧＨ
遺伝子自体の解読わく中に、ＰvuＩＩ部位、３個のアミ
ノ酸コドン及び停止コドンを含む。この断片を、ＥcoＲ
Ｉ−ＨindＩＩＩで切開したpＢＲ３２２中に挿入した。
このようにして、pＢＲ３２２−０２が得られた。次
に、このプラスミドをＰvuＩＩとＢamＨＩによって切断
し、３６０bp断片を単離した。合成前部を備えた完全な
ＢＧＨ遺伝子をもつpＢＧＨ３３−３から、ＢamＨＩ−
ＸbaＩ大断片及び５７０bp ＸbaＩ−ＰvuＩＩ(部分)断
片が単離された。これらの３個の断片を結合し、細胞の
形質転換に使用した。このようにして、pＢＧＨ３３−
４が得られた。このプラスミド中には、ＢＧＨ遺伝子の
停止コドンとtet−mＲＮＡの開始コドンとの間に、単一
のＨindＩＩＩ部位が存在する。双方の遺伝子がtrp−プ
ロモーターの指示の下で転写される。
が、ＨＧＨ遺伝子から誘導された。末端のアミノ酸の１
つは、天然ＢＧＨ遺伝子中のアミノ酸と相違する。この
３'−末端を次のようにして修復した。示されるような
合成ＤＮＡ断片が合成された。クローニングを容易にす
るために、このＤＮＡは、ＥcoＲＩ末端とＨindＩＩＩ
末端によって側方に接合される。このＤＮＡは、ＢＧＨ
遺伝子自体の解読わく中に、ＰvuＩＩ部位、３個のアミ
ノ酸コドン及び停止コドンを含む。この断片を、ＥcoＲ
Ｉ−ＨindＩＩＩで切開したpＢＲ３２２中に挿入した。
このようにして、pＢＲ３２２−０２が得られた。次
に、このプラスミドをＰvuＩＩとＢamＨＩによって切断
し、３６０bp断片を単離した。合成前部を備えた完全な
ＢＧＨ遺伝子をもつpＢＧＨ３３−３から、ＢamＨＩ−
ＸbaＩ大断片及び５７０bp ＸbaＩ−ＰvuＩＩ(部分)断
片が単離された。これらの３個の断片を結合し、細胞の
形質転換に使用した。このようにして、pＢＧＨ３３−
４が得られた。このプラスミド中には、ＢＧＨ遺伝子の
停止コドンとtet−mＲＮＡの開始コドンとの間に、単一
のＨindＩＩＩ部位が存在する。双方の遺伝子がtrp−プ
ロモーターの指示の下で転写される。
【００８１】抑制を解除し、且つ１l当たり高いレベル
のＢＧＨを生産するために用いられる代表的な増殖培地
(図１０)は、５．０gの(ＮＨ4)2ＳＯ4、６．０gのＫ2Ｈ
ＰＯ4、３．０gのＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、１．０gのク
エン酸ナトリウム、２．５gのグルコース、５mgのテト
ラサイクリン、７０mgのチアミンＨＣl、及び６０gのＭ
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
のＢＧＨを生産するために用いられる代表的な増殖培地
(図１０)は、５．０gの(ＮＨ4)2ＳＯ4、６．０gのＫ2Ｈ
ＰＯ4、３．０gのＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、１．０gのク
エン酸ナトリウム、２．５gのグルコース、５mgのテト
ラサイクリン、７０mgのチアミンＨＣl、及び６０gのＭ
gＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
【００８２】Ｅ．coli形質転換体を使用することに関し
て、好ましい具体例によって、本発明を説明したけれど
も、必要な変更を加えて、他の微生物を使用しうること
が認識されよう。そのようなものの例は、他のＥ．coli
微生物、例えばＥ．coli Ｂ．, Ｅ．coli Ｗ ３１１
０ ＡＴＣＣ Ｎo．３１６２２(Ｆ-, λ-, gal-, 原栄
養株)、Ｅ．coli Ｘ １７７６, ＡＴＣＣ Ｎo．３１
５３７, Ｅ．coli Ｄ１２１０, Ｅ．coli ＲＶ ３０
８, ＡＴＣＣ Ｎo．３１６０８等である。バシラスサ
ブチリス(Ｂacillus subtilis)菌株、プソイドモナス
(Ｐseudomonas)菌株等及び各種の酵母菌、例えば、サッ
カロマイセスセレビジアエ(Ｓaccharomyces cerevisia
e)等の多くのものが寄託され、且つ承認された寄託団
体、例えばＡＴＣＣから(潜在的に)入手可能である。本
発明を実施し、且つ所期のポリペプチド生成物を最終的
に発現した後の抽出技術と精製技術は、この分野で通常
使用され且つそれ自体公知の技術である。
て、好ましい具体例によって、本発明を説明したけれど
も、必要な変更を加えて、他の微生物を使用しうること
が認識されよう。そのようなものの例は、他のＥ．coli
微生物、例えばＥ．coli Ｂ．, Ｅ．coli Ｗ ３１１
０ ＡＴＣＣ Ｎo．３１６２２(Ｆ-, λ-, gal-, 原栄
養株)、Ｅ．coli Ｘ １７７６, ＡＴＣＣ Ｎo．３１
５３７, Ｅ．coli Ｄ１２１０, Ｅ．coli ＲＶ ３０
８, ＡＴＣＣ Ｎo．３１６０８等である。バシラスサ
ブチリス(Ｂacillus subtilis)菌株、プソイドモナス
(Ｐseudomonas)菌株等及び各種の酵母菌、例えば、サッ
カロマイセスセレビジアエ(Ｓaccharomyces cerevisia
e)等の多くのものが寄託され、且つ承認された寄託団
体、例えばＡＴＣＣから(潜在的に)入手可能である。本
発明を実施し、且つ所期のポリペプチド生成物を最終的
に発現した後の抽出技術と精製技術は、この分野で通常
使用され且つそれ自体公知の技術である。
【図１】 図１はＨＧＨをコードする雑種ＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す模式図である。
レオチド配列を示す模式図である。
【図２】 図２はＢＧＨをコードする雑種ＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す模式図である。
レオチド配列を示す模式図である。
【図３】 図３は天然のＢＧＨ、合成ＨＧＨ及び合成Ｂ
ＧＨの基部のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す模
式図である。
ＧＨの基部のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示す模
式図である。
【図４】 図４はtrp−プロモーター配列と共に天然Ｂ
ＧＨ遺伝子と合成ＢＧＨ遺伝子双方のセンスストランド
のヌクレオチド配列を示す模式図である。
ＧＨ遺伝子と合成ＢＧＨ遺伝子双方のセンスストランド
のヌクレオチド配列を示す模式図である。
【図５】 図５は図６に示されるようにして用いられる
pＢＧＨ３３の構成を示す模式図である。
pＢＧＨ３３の構成を示す模式図である。
【図６】 図６は雑種ポリペプチドのＤＮＡ配列を収容
するプラスミド、即ちpＢＧＨ３３−１、pＢＨＧＨ及び
pＨＢＧＨの構成を示す模式図である。
するプラスミド、即ちpＢＧＨ３３−１、pＢＨＧＨ及び
pＨＢＧＨの構成を示す模式図である。
【図７】 図７は図８に示される構成の際に用いられる
ＢＧＨ遺伝子の合成基部、pＢＲ３２２−０１を組み立
てるために用いられる技術を示す模式図である。
ＢＧＨ遺伝子の合成基部、pＢＲ３２２−０１を組み立
てるために用いられる技術を示す模式図である。
【図８】 図８は図７に示されるような合成基部を含む
ＢＧＨ遺伝子を収容するプラスミドpＢＧＨ３３−３の
構成を示す模式図である。
ＢＧＨ遺伝子を収容するプラスミドpＢＧＨ３３−３の
構成を示す模式図である。
【図９】 図９は雑種ＢＧＨ遺伝子を収容する発現プラ
スミドpＢＧＨ３３−４の構成を示す模式図である。
スミドpＢＧＨ３３−４の構成を示す模式図である。
【図１０】 図１０Ａ及びＢは細胞蛋白質のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動写真の模写図である。
ルアミドゲル電気泳動写真の模写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/27 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハーバート・エル・ハイネカー アメリカ合衆国、カリフォルニア・94010、 バーリンゲイム、イーストン・ドライヴ・ 2621 (72)発明者 ピーター・エイチ・シーバーグ アメリカ合衆国、カリフォルニア・94122、 サン・フランシスコ、カークハム・800
Claims (3)
- 【請求項１】 ウシ起源の他の蛋白質を含まないウシ成
長ホルモンを含む物質からなる組成物。 - 【請求項２】 細胞当り約１００,０００個のコピーを
越える量で、ウシ成長ホルモンを生産しうる微生物。 - 【請求項３】 機能性蛋白質又はその生物活性部分を含
むポリペプチドをコードする伝令ＲＮＡ用のＤＮＡであ
って、微生物発現ベクターの微生物内で作用しうるプロ
モーターの制御下に、適切に配置された翻訳開始シグナ
ルおよび翻訳停止シグナルと共に挿入されるＤＮＡ、で
あって、 a）前記ポリペプチドのＣ−末端部分をコードする前記
ＤＮＡの第１断片を調製し、該第１断片は前記ポリペプ
チドの天然の配列と合致する配列を有するポリペプチド
をコードするものであり、 b）前記ポリペプチドのＮ−末端部分をコードする遺伝
子の翻訳開始部位からヌクレオチド番号が約＋１００に
至るまでの前記ＤＮＡの第２断片であって、牛成長ホル
モンをコードする天然の伝令ＲＮＡのヌクレオチド４６
番から５１番とヌクレオチド７３番から７８番の間で、
ホモローガス塩基対形成によって形成される二次構造の
熱力学的エネルギーと、計算上等しいかまたはそれより
低い熱力学的エネルギーを持った二次構造を含む伝令Ｒ
ＮＡを、転写により生成させるＤＮＡ第２断片を調製
し、 c）上記工程b)のＤＮＡ第２断片に対応する伝令ＲＮＡ
に於ける局所的塩基対形成反応の熱力学的エネルギーを
決定し、その決定に基づき、 d）以下の条件： （１）ヌクレオチド＋１〜＋１００の領域に、牛成長ホ
ルモンをコードする天然の伝令ＲＮＡのヌクレオチド４
６番から５１番とヌクレオチド７３番から７８番の間で
ホモローガス塩基対形成によって形成される二次構造の
熱力学的エネルギーと、計算上等しいかまたはそれより
低い熱力学的エネルギーを持った二次構造を含んでいな
い、（２）上記工程b)の第２断片によってコードされる
ものと同じアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含んでい
る、を満たす対応する伝令ＲＮＡを転写により生成する
様に選択されたヌクレオチドからなる合成ＤＮＡ第３断
片を調製し、 e）工程a)の第１断片と工程c)の合成第３断片とを、互
いにとって適切な解読相内で結合させることからなる方
法により得られるＤＮＡ（ただし、前記ＤＮＡは、以下
の配列式 【化１】 で示されるヒト成長ホルモンの雑種ＤＮＡではない）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30368781A | 1981-09-18 | 1981-09-18 | |
| US303687 | 1981-09-18 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57161536A Division JP2539775B2 (ja) | 1981-09-18 | 1982-09-16 | Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0776599A true JPH0776599A (ja) | 1995-03-20 |
| JP2766781B2 JP2766781B2 (ja) | 1998-06-18 |
Family
ID=23173239
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57161536A Expired - Lifetime JP2539775B2 (ja) | 1981-09-18 | 1982-09-16 | Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物 |
| JP6183278A Expired - Lifetime JP2766781B2 (ja) | 1981-09-18 | 1994-08-04 | ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57161536A Expired - Lifetime JP2539775B2 (ja) | 1981-09-18 | 1982-09-16 | Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0075444B1 (ja) |
| JP (2) | JP2539775B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127518T1 (ja) |
| AU (2) | AU563347B2 (ja) |
| BR (1) | BR8205453A (ja) |
| CA (1) | CA1340371C (ja) |
| DE (2) | DE3280422T2 (ja) |
| DK (1) | DK172897B1 (ja) |
| ES (1) | ES515800A0 (ja) |
| GB (2) | GB2106119B (ja) |
| IE (1) | IE53897B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ201918A (ja) |
| ZA (1) | ZA826802B (ja) |
Families Citing this family (169)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0095361B1 (en) * | 1982-05-25 | 1989-07-26 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
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