ES2683035T3 - Lisinas de bacteriófago diméricas - Google Patents

Abstract

Una lisina de fago específico de Streptococcus dimérica y aislada que comprende dos monómeros de lisina de fago específico de Streptococcus unidos covalentemente entre sí, donde dicho dímero posee actividad destructiva contra una o más bacterias de Streptococcus y donde cada monómero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoácidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monómeros de lisina están unidos covalentemente entre sí por un enlace disulfido, y donde dichos monómeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

Description

DESCRIPCION

Lisinas de bacteriofago dimericas 5 CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a la generacion y uso de lisinas dimericas para detectar y destruir las bacterias de Streptococcus, en particular lisinas mutantes capaces de dimerizacion en lisinas dimericas que poseen una actividad y/o estabilidad mejoradas. La presente invencion se refiere a procedimientos para la mejora profilactica y 10 terapeutica, descolonizacion, y tratamiento de bacterias, en particular las cepas bacterianas de Streptococcus, y afecciones relacionadas. Los procedimientos de la invencion utilizan lisinas de fago dimericas, en concreto lisinas de fago de neumococos dimericas, que incluyen las enzimas lfticas Cpl-1 y variantes de las mismas.

ANTECEDENTES

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Un problema importante en medicina ha sido el desarrollo de bacterias resistentes a los farmacos, ya que se usan mas antibioticos para una amplia variedad de enfermedades y otras afecciones. Las infecciones hospitalarias son la 8a causa principal de muerte en los Estados Unidos debido en gran parte a patogenos resistentes a farmacos y de reciente aparicion. El uso de mas antibioticos y el numero de bacterias que muestran resistencia han dado lugar a 20 tiempos de tratamiento prolongados. Ademas, ahora se estan usando con mas frecuencia antibioticos inespecfficos de amplio espectro, algunos de los cuales tienen efectos nocivos sobre el paciente. Un problema relacionado con este uso aumentado es que muchos antibioticos no penetran facilmente los revestimientos de la mucosidad. Adicionalmente, parece que esta en aumento el numero de personas alergicas a los antibioticos. En consecuencia, existe la necesidad comercial de propuestas antibacterianas nuevas, especialmente las que operen mediante 25 modalidades nuevas o que proporcionen medios nuevos para destruir a las bacterias patogenas.

Las bacterias gram positivas estan rodeadas por una pared celular que contiene polipeptidos y polisacaridos. La pared celular gram positiva aparece como una pared amplia y densa con un grosor de 20-80 nm que consiste en muchas capas de interconexion de peptidoglucano. Entre el 60 % y el 90 % de la pared celular gram positiva es 30 peptidoglucano, dandole forma a la celula, una estructura rfgida y una resistencia al choque osmotico. La pared celular no excluye el violeta de metilo de la tincion de Gram, dejando que las celulas se tinan de purpura y sean por lo tanto "gram-positivas". Las bacterias gram positivas incluyen, aunque sin limitacion, los generos: Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, y Clostridium. Las especies medicamente relevantes incluyen: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, 35 Staphylococcus aureus, y Enterococcus faecalis.

Los antibacterianos que inhiben la sfntesis de la pared celular, como las penicilinas y cefalosporinas, interfieren en el enlace de los interpeptidos del peptidoglucano y debilitan la pared celular de bacterias tanto gram positivas como gram negativas. Como los peptidoglucanos de las bacterias gram positivas estan expuestos, las bacterias gram 40 positivas son mas susceptibles a estos antibioticos. Ventajosamente, las celulas eucariotas carecen de paredes celulares y no son susceptibles a estos farmacos u otros agentes de pared celular.

Se ha intentado tratar enfermedades bacterianas usando bacteriofagos. Sin embargo, la introduccion directa de bacteriofagos en un animal para prevenir o combatir enfermedades tiene ciertas desventajas. Especfficamente, tanto 45 la bacteria como el fago tienen que estar en los ciclos de crecimiento correctos y sincronizados para que el fago se una. Adicionalmente, debe haber el numero correcto de fagos para que se unan a la bacteria; si hay demasiados o muy pocos fagos, no habra union o no habra produccion de enzima lisina. El fago tambien debe ser suficientemente activo. Los fagos tambien son inhibidos por muchas cosas que incluyen desechos bacterianos del organismo que van a atacar. La posibilidad de reacciones inmunologicas complica mas el uso directo de un bacteriofago para tratar 50 infecciones bacterianas, haciendo al fago no funcional.

Las propuestas novedosas de terapia microbiana incluyen antibioticos basados en enzimas ("enzibioticos"), tales como las lisinas de bacteriofago. Los fagos usan estas lisinas para digerir la pared celular de sus huespedes bacterianos, liberando la progenie viral por medio de lisis hipotonica. Se produce un resultado similar cuando lisinas 55 recombinantes purificadas son anadidas externamente a bacterias gram positivas. La alta actividad letal de las lisinas contra los patogenos gram positivos las hace candidatas atractivas para su desarrollo como agentes terapeuticos. Las lisinas de bacteriofago fueron propuestas inicialmente para erradicar el transporte nasofarfngeo de estreptococos patogenos (Loeffler, J. M. y col. (2001) Science 294: 2170-2172; Nelson, D. y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112). Las lisinas son parte del mecanismo lftico usado por el fago de ADN de doble cadena 60 (ADNdc) para coordinar la lisis del huesped con la terminacion del ensamblaje viral (Wang, I. N. y col. (2000) Annu

Rev Microbiol 54:799-825). El fago codifica tanto holinas que abren un poro en la membrana bacteriana como peptidoglucano hidrolasas denominadas lisinas, que rompen los enlaces de la pared bacteriana. Despues en la infeccion, la lisina se traslada a la matriz de la pared celular en donde hidroliza rapidamente enlaces covalentes esenciales para la integridad del peptidoglucano, ocasionando lisis bacteriana y liberacion concomitante de fago de 5 progenie.

Los miembros de la familia de lisinas exhiben un diseno modular en el que el dominio catalftico esta fusionado con un dominio de especificidad o union (Lopez, R. y col. (1997) Microb Drug Resist 3:199-211). Las lisinas pueden ser clonadas de secuencias de profago virales dentro de los genomas bacterianos y pueden usarse para tratamientos 10 (Beres, S.B. y col. (2007) PLoS ONE 2(8):1-14). Cuando se administran externamente, las lisinas son capaces de tener acceso a los enlaces de una pared celular gram positiva (Figura 1) (Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400). Se ha demostrado que las lisinas tienen una actividad letal superior contra numerosos patogenos gram positivos (especialmente las bacterias de las que fueron clonadas), haciendo posible su desarrollo como agentes terapeuticos (Fischetti, V.A. (2008) Curr Opinion Microbiol 11:393-400;Nelson, D.L. y col. (2001) Proc 15 Natl Acad Sci USA 98:4107-4112).

Se ha establecido que las enzimas lfticas de bacteriofago son utiles en la evaluacion y tratamiento especffico de varios tipos de infeccion en sujetos y a traves de varias vfas de administracion. Por ejemplo, la patente de EE. UU. con n.° 5.604.109 (Fischetti y col.) se refiere a la deteccion rapida de estreptococos del grupo A en especfmenes 20 clfnicos, por medio de la digestion enzimatica con una enzima lisina semipurificada y asociada con un fago estreptococico del grupo C. Este trabajo de la enzima se convirtio en la base de investigacion adicional, llevando a procedimientos de tratamiento de enfermedades. Las patentes de Fischetti y Loomis (patentes de EE. UU. 5.985.271, ,6.017.528y 6.056.955) describen el uso de una enzima lisina producida por bacterias estreptococicas del grupo C infectadas con un bacteriofago C1. La patente de EE. UU. 6.248.324 (Fischetti y Loomis) describe una 25 composicion para infecciones dermatologicas mediante el uso de una enzima lftica en un vehfculo adecuado para aplicacion topica en tejidos dermicos. La patente de EE. UU. 6.254.866 (Fischetti y Loomis) describe un procedimiento de tratamiento de infecciones bacterianas del tubo digestivo, que comprende administrar una enzima lftica especffica para las bacterias infecciosas. El vehfculo para suministrar por lo menos una enzima lftica al tubo digestivo se selecciona de entre el grupo que consiste en supositorios, enemas, jarabes o pfldoras con recubrimiento 30 enterico. La patente de EE. UU. 6.264.945 (Fischetti y Loomis) describe un procedimiento y composicion para el tratamiento de infecciones bacterianas, mediante la introduccion parenteral (por via intramuscular, subcutanea o intravenosa) de, por lo menos, una enzima lftica producida por una bacteria infectada con un bacteriofago especffico para esa bacteria, y un vehfculo apropiado para suministrar la enzima lftica a un paciente.

35 Las enzimas lfticas asociadas con fago se han identificado y clonado de varios bacteriofagos, cada uno mostrando eficacia para destruir cepas bacterianas especfficas. Las patentes de EE. UU. 7.402.309,7.638.600 y la solicitud publicada de PCT WO2008/018854 proporcionan distintas enzimas lfticas asociadas con fago, que son utiles como agentes antibacterianos para el tratamiento o reduccion de infecciones de Bacillus anthracis. La patente de EE. UU. 7.569.223 describe la enzima lftica Pal de fago neumococica para Streptococcus pneumoniae. Una lisina util 40 para Enterococcus (E. faecalis y E. faecium, incluso cepas resistentes a vancomicina) se describe en lapatente de EE. UU. 7.582.291. La US 2008/0221035 describe lisinas Ply-GBS mutantes y altamente eficaces para destruir estreptococos del grupo B. Una lisina quimerica denominada ClyS, con actividad contra bacterias estafilococicas, que incluyen Staphylococcus aureus, se detalla en WO 2010/002959.

45 La Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), un diplococo encapsulado gram positivo, es un agente etiologico primario en enfermedades humanas como bacteriemia, meningitis, neumonfa, otitis media, y sinusitis. Esta bacteria es responsable de la muerte de mas de 1 millon de ninos menores de 5 anos, anualmente y en todo el mundo (English, M (2000) Paediatr Respir Rev 1:21-5), asf, la neumonfa extrahospitalaria es la sexta causa mas comun de muerte en los EE. UU. (File, TM (2004) Am J Med 117 Suppl 3A:39S-50S). Ademas, la S. pneumoniae es una causa 50 principal de otitis media aguda en todo el mundo, una enfermedad que afecta a mas de 5 millones de ninos anualmente en EE. UU. (CDC (2009) Pneumococcal diseases, p. 217-30. En W. Atkinson, y col. (ed.), Epidemiology and prevention of vaccine-preventable diseases (11th ed), Public Health Foundation, Washington DC). Finalmente, las infecciones secundarias como resultado de la pandemia de gripe son responsables de mas del 90 % de las muertes, siendo la S. pneumoniae la causa principal de estas muertes (Brundage, JF Shanks GD (2008) Emerg 55 Infect Dis 14:1193-9;Brundage, JF Shanks GD (2007) J Infect Dis 196:1717-8;Morens, DM y col (2009) N Engl J Med 361:225-9;Morens, DM y col (2009) Public Health Rep 124:22-5). Las infecciones neumococicas son, a menudo, tratadas con antibioticos, pero los fracasos en el tratamiento, confirmados bacteriologicamente, debidos al aumento de la incidencia en la resistencia (Reinert, RR (2009) Clin Microbiol Infect 15 Suppl 3:1-3) hizo informar sobre macrolidos, fluoroquinolonas, y cefalosporinas (Mandell, LA y col. (2002) Clin Infect Dis 35:721-7). El uso excesivo e 60 indebido de los antibioticos como resultado del tratamiento de millones de casos de otitis media solo contribuyo a la

aparicion de cepas resistentes (Goossens, H (2009) Clin Microbiol Infect 15 Suppl 3:12-5. En conjunto, estas observaciones han puesto de relevancia la necesidad de nuevos farmacos, que actuen mediante mecanismos totalmente diferentes, para el tratamiento y prevencion de las enfermedades asociadas a neumococos.

5 Antes del descubrimiento de los antibioticos, los fagos, un importante depredador de las bacterias por naturaleza, fueron considerados como un procedimiento posible para el control de las bacterias patogenicas. En su momento, se publicaron varios informes sobre el exitoso uso del fago para tratar infecciones (Sulakvelidze, A y Barrow, P (2005) Phage therapy in animals and agribusiness, p. 335-71. En E. Kutter y A. Sulakvelidze (ed.), Bacteriophages: Biology and Applications, CRC Press, USA; Sulakvelidze, A and Kutter, E (2005) Bacteriophage therapy in humans, p. 38110 426. En E. Kutter y A. Sulakvelidze (ed.), Bacteriophages: Biology and Applications, CRC Press, USA), pero el advenimiento de los antibioticos en la decada de los 40 condujo a un rapido declive en la investigacion sobre terapias con fago en occidente. En la pasada decada se ha presenciado un renovado interes en relacion a la terapia con fago, asf como en compuestos antibacterianos derivados de fago (Borysowski, J y col. (2006) Exp Biol Med 231:366-77;Fischetti, VA (2008) Curr Opin Microbiol 11:393-400).

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Uno de estos productos, lisinas o endolisinas de fago, ha sido explotado por su rapida accion destructiva en las bacterias gram positivas (Borysowski, J y col. (2006) Exp Biol Med 231:366-77;Fischetti, VA (2008) Curr Opin Microbiol 11:393-400). Estas enzimas especfficas se producen en un momento en el que la progenie de fago necesita escapar del huesped bacteriano. El fago neumococico Cp-1 produce la lisina Cpl-1, una enzima de 37 kDa. 20 Esta lisina se construye como todas dichas endolisinas, poseedoras de dos dominios bien definidos y conectados por un conector flexible. La actividad catalftica se restringe al dominio del extremo N-terminal, mientras que la parte con el extremo C-terminal, que contiene 6 repeticiones de union a colina (ChBR) y una cola de extremo C-terminal de 13 aminoacidos, es necesaria para la union a sustrato en la pared celular neumococica. La Cpl-1 pertenece a familia de las lisozimas que se dirigen a uniones (31,4 entre acido N-acetilmuramico y residuos N-acetil-D- 25 glucosamina en el peptidoglucano (Perez-Dorado, INE y col. (2007) J Biol Chem 282:24990-9). Su actividad dependiente de colina hace a la Cpl-1 altamente especffica a S. pneumonia (Garcia, JL y col. (1987) J Virol 61:257380). El gen Cpl-1 ha sido clonado en el vector de alta expresion pinlllAn y despues sobreexpresado y purificado (Loeffler, JM y col. (2003) Infect Immun 71:6199-204).

30 La CpI-1 ha sido probada con exito para tratar la sepsis neumococica (Jado, I y col. (2003) J Antimicrob Chemother 52:967-73;Loeffler, JM y Fischetti, VA (2003) Antimicrob Agents Chemother 47:375-7), endocarditis (Entenza, JM y col. (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:4789-92), pneumococcal meningitis (Grandgirard, D y col. (2008) J Infect Dis 197:1519-22), and pneumonia (Witzenrath, M y col. (2009) Crit Care Med 37:642-9) en modelos de roedores. No obstante, las proteinas normalmente son eliminadas rapidamente in vivo y se han necesitado 35 inyecciones repetidas o incluso continuas de Cpl-1 en muchos estudios realizados hasta la fecha (Entenza, JM y col. (2005) Antimicrob Agents Chemother 49:4789-92. 31; Witzenrath, M y col. (2009) Crit Care Med 37:642-9).

Resch, G. y col. (2009, Abs. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 102:1-2) describe que la PEGilacion puede extender la vida media del suero de una proteina de minutos a horas, llevando a un aumento general de la eficacia. El 40 conjugado descrito retiene el 25 % de la actividad antimicrobiana de la Cpl-1 frente a la S. pneumoniae.

Resch, G. y col. (2011, Int. J. Antimicrob. Agents 38:516-521) describe un dimero de lisina de fago (Cpl-1) estable con aumento de la actividad antineumococica y disminucion de la eliminacion de plasma.

45 Resch, G. y col. (2011, AMB Express, 1:29) describe que la PEGilacion de una endolisina de bacteriofago inhibe la actividad bactericida.

Estos resultados pueden ser una deficiencia para el desarrollo clinico de la Cpl-1 y lisinas semejantes. Lo necesario en la tecnica son lisinas mejoradas que puedan usarse para tratar enfermedades neumococicas que tengan 50 actividad destructiva y parametros mejorados clinicamente relevantes, tales como una mayor vida media o una disminucion de la eliminacion in vivo.

RESUMEN DE LA INVENCION

55 En un aspecto general, la presente invencion provee lisinas mutantes, mutadas para adquirir la capacidad de dimerizar facilmente, generando, de este modo, lisinas dimericas que poseen una actividad mejorada o una actividad destructiva bacteriana, y mayor estabilidad, que incluye mejor estabilidad a largo plazo en un animal o mamifero y capacidad destructiva bacteriana de accion prolongada en un ambito biologica o clinicamente relevante.

60 En un aspecto, la presente invencion provee lisinas de fago antibacterianas dimericas aisladas que comprenden dos

monomeros de lisina de fago especffico para bacterias unidos covalentemente entre si, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias especfficas. En un aspecto, la presente invencion proporciona lisinas de fago especffico de Streptococcus dimericas y aisladas que comprenden dos monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra 5 una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre sf por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

En ciertas realizaciones, los monomeros de lisina son monomeros de Cpl-1 que tienen, al menos, un 90 % de 10 identidad de secuencia con una Cpl-1 no mutada (SEQ ID NO: 1), y que tienen un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, o son monomeros Pal que tienen, al menos, una identidad de secuencia del 90 % con Pal no mutada (SEQ ID NO: 5) y que tiene un residuo Cys que esta entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal.

15 En ciertas realizaciones, los monomeros de lisina tienen, al menos, un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % de identidad de secuencia con la lisina Cpl-1 no mutada tal como se expone en la Figura 1 y la 6 y la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, los monomeros de lisina tienen, al menos, un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la lisina Pal no mutada tal como se expone en la Figura 7 y la SEQ ID NO: 5.

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La presente descripcion provee monomeros de lisina que estan unidos covalentemente entre sf por un enlace disulfido. En ciertos aspectos ejemplares, cada monomero de lisina tiene un residuo Cys ubicado en estrecha proximidad con el extremo C-terminal, particularmente entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal. La presente descripcion provee monomeros de lisina que no tienen un residuo Cys entre los primeros 45 residuos. Se 25 proveen lisinas CpI-1 mutantes y ejemplares en el presente documento, incluidas en la Figura 6 y en la Tabla 1. En una realizacion particular, los monomeros de lisina tienen una secuencia de aminoacidos tal como se expone en la Figura 6 o como se provee en la Tabla 1. En otra realizacion, los monomeros de lisina tienen una secuencia de aminoacidos tal como se expone en la Figura 7. En ciertas realizaciones, los monomeros de lisina comprenden un dominio catalftico de una primera lisina de fago especffica de Streptococcus y un dominio de union de una segunda 30 lisina de fago especffico de Streptococcus.

La presente invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina para uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de estreptococos donde la lisina es una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de lisina 35 de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre sf por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos. En ciertas realizaciones, la infeccion es causada por la Streptococcus pneumoniae. La 40 enfermedad o afeccion causada por la infeccion de Streptococcus pneumoniae puede ser, al menos, una de bacteriemia, meningitis, neumonfa, otitis media o sinusitis.

La presente invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina para uso en la descolonizacion de estreptococos en un mamffero que padece de o esta en riesgo de contraer 45 una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de estreptococos donde la lisina es una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo de Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre sf 50 por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos. En ciertas realizaciones, la infeccion es causada por la Streptococcus pneumoniae. La enfermedad o afeccion causada por la infeccion de Streptococcus pneumoniae puede ser, al menos, una de bacteriemia, meningitis, neumonfa, otitis media o sinusitis.

55 Tambien se describe un procedimiento para destruir las bacterias gram positivas que comprende la etapa de contacto de la bacteria con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina dimerico mutante y efectivo para destruir bacterias gram positivas, donde una lisina monomerica es modificada o alterada para ser un polipeptido de lisina dimerico que comprende dos monomeros de lisina de fago antibacterianos covalentemente unidos entre sf y efectivos para destruir bacterias gram positivas. En un aspecto particular, se 60 proporciona un procedimiento para destruir bacterias de Streptococcus que comprende la etapa de contacto de la

bacteria con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina dimerico mutante y efectivo para destruir bacterias de Streptococcus, donde una lisina de Streptococcus monomerica es modificada o alterada para ser un polipeptido de lisina dimerico que comprende dos monomeros de lisina de fago de Streptococcus covalentemente unidos entre si y efectivo para destruir bacterias de Streptococcus.

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Por lo tanto, tambien se describe un procedimiento para destruir bacterias de Streptococcus que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina Cpl-1 de Streptococcus dimerico aislado y efectivo para destruir las bacterias de Streptococcus, el polipeptido de lisina aislado que comprende una lisina Cpl-1 mutante que comprende dos monomeros de lisina Cpl-1 unidos 10 covalentemente entre si. En un aspecto particular, se provee un procedimiento para destruir bacterias de Streptococcus que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina aislado y efectivo para destruir las bacterias de Streptococcus, y el polipeptido de lisina aislado que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o variantes de los mismos que tienen por lo menos una homologfa del 80 %, una homologfa del 85 %, una homologfa del 90 % o una homologfa del 95 % 15 con el polipeptido de la SEQ ID NO: 3, y efectivo para destruir las bacterias gram positivas.

Tambien se describe un procedimiento para destruir bacterias de Streptococcus que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina Pal de Streptococcus dimerico aislado y efectivo para destruir las bacterias de Streptococcus, el polipeptido de lisina aislado 20 que comprende una lisina Pal mutante que comprende dos monomeros de lisina Pal unidos covalentemente entre si. En un aspecto particular, se provee un procedimiento para destruir bacterias de Streptococcus que comprende la etapa de poner en contacto las bacterias con una composicion que comprende una cantidad de un polipeptido de lisina aislado y efectivo para destruir las bacterias de Streptococcus, y el polipeptido de lisina aislado que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 6 o variantes de los mismos que tienen por lo menos una homologfa del 25 80 %, una homologfa del 85 %, una homologfa del 90 % o una homologfa del 95 % con el polipeptido de la SEQ ID NO: 6, y es efectivo para destruir las bacterias gram positivas.

La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de 30 lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre sf por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

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La descripcion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina dimerica que comprende dos monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee una actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde dicha actividad destructiva es mayor que la actividad destructiva de uno cualquiera de los 40 monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la presente invencion se provee un uso de composiciones antimicrobianas con objeto de sanear o descontaminar superficies porosas o no porosas que comprenden una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de lisina de fago especfficos de Streptococcus 45 unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre sf por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

50 Las composiciones de la invencion pueden particularmente mostrar o tener actividad destructiva contra una o mas cepas de bacterias de Streptococcus, seleccionadas particularmente del grupo que consiste en Streptococcus suis, Streptococcus equi, Streptococcus agalactiae (GBS), Streptococcus pyogenes (GAS), Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus GES y Streptococcus pneumonia.

55 La presente invencion proporciona procedimientos para descontaminar superficies inanimadas sospechosas de contener bacterias infecciosas que comprenden el tratamiento de dichas superficies con una cantidad efectiva bacteriocidamente o bacteriostaticamente de una composicion antimicrobiana que comprende una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas 60 bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20

aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre si por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

La presente invencion incluye una protefna dimerica que comprende dos dominios de union a lisina de fago 5 especffico de Streptococcus y covalentemente unidos entre si. Tambien se describe una protefna dimerica que comprende dos dominios de union a lisina de fago especffico de Streptococcus covalentemente unidos entre sf, donde al menos uno de dichos dominios de union a lisina de fago esta ademas conjugado con una marca. Una marca puede ser cualquier molecula que produzca, o pueda ser inducida a producir, una senal detectable. Ejemplos no limitantes de marcas incluyen isotopos radioactivos, enzimas, fragmentos de enzimas, sustratos de enzimas, 10 coenzimas, catalizadores, fluoroforos, colorantes, sustancias quimioluminiscentes, luminiscentes, o sensibilizadores; una partfcula magnetica o no magnetica, un soporte solido, un liposoma, un ligando, o un receptor.

La utilidad diagnostica de la presente invencion se extiende al uso de los presentes polipetidos de lisina en ensayos para cribar la presencia de bacterias gram positivas, para cribar la presencia de bacterias gram positivas 15 susceptibles, o para determinar la susceptibilidad de bacterias de destruirse o lisarse mediante uno o mas polipeptido(s) de lisina de la invencion.

Los polipeptidos de lisina que son modificados y son protefnas de fusion o quimericas, o bien han sido marcados, se incluyen y describen en el presente documento. En una protefna de fusion o quimerica, los polipeptidos de lisina de 20 la invencion pueden unirse covalentemente a una entidad que puede proporcionar una funcion adicional o bien mejorar el uso o aplicacion de los polipeptidos de lisina, incluyendo, por ejemplo, una etiqueta, marca, resto o ligando de diana, una celula que se una a o celula que reconozca un motivo o agente, un agente antibacteriano, un anticuerpo, un antibiotico. Las marcas ejemplares incluyen una marca radioactiva, tal como los isotopos 3H,14C,P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,I,131I, y186Re. La marca puede ser una enzima, y la deteccion de 25 polipeptido de lisina marcado se puede efectuar mediante cualquiera de las tecnicas conocidas, actualmente utilizadas y aceptadas de colorimetrfa, espectrofotometrfa, fluoroespectrofotometrfa, amperometria o gasometrfa.

Otros objetos y ventajas se haran evidentes para el experto en la materia a partir de una revision de la siguiente descripcion, que procede haciendo referencia a los siguientes dibujos ilustrativos.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Alineacion del programa Clustal W de la Cpl-1 (SEQ ID NO: 1) y las secuencias de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) de la LytA de S. pneumoniae. Los dos residuos catalfticos (D10 y E94) se encuentran en rojo. Los 13 35 aminoacidos implicados en la dimerizacion natural de la LytA y los aminoacidos correspondientes en la Cpl-1 se indican subrayados. El residuo D324 se indica en azul.

La Figura 2A-2C describe (A) Un gel de SDS-PAGE no reductor con tincion de Coomassie de la Cpl-1 purificada. Carril 1, marcador de peso molecular, y carril 2, Cpl-1 purificada obtenida mediante purificacion de afinidad en

1 J 11 1 C'ziaq

40 DEAE-Sepharose.(B) Gel de SDS-PAGE no reductor con tincion de Coomassie de la mutante Cpl-1 , purificada. Carril 1, marcador de peso molecular. Carril 2, Cpl-1 , purificada obtenida mediante purificacion de afinidad en DEAE-Sepharose, y carril 3, Cpl-1C45S,D324C reducida con 10 mM de DTT. (C) Gel de SdS-PAGE no

1 J ' C45S D324c

reductor con tincion de Coomassie de enriquecimiento de dfmero mutante de Cpl-1 purificada despues de

1 1 1 C45S D324C

filtracion de gel en Sephadex G100. Carril 1, marcador de peso molecular. Carril 2, dfmero de Cpl-1 45 purificada obtenido mediante filtracion de gel en Sephadex G100 (primera purificacion) y carril 3, dfmero de Cpl- 1C45S,D324C purificada obtenido mediante filtracion de gel en Sephadex G100 (segunda purificacion).

La Figura 3 muestra actividad antibacteriana in vitro de Cpl-1 en una suspension de 5,108 UFC/ml de la cepa DCC1490 de S. pneumoniae despues de 15 minutos de incubacion a 37 °C. Tipo silvestre de Cpl-1 (cfrculos

1 1 C45S D324C 1 1 C"-'"'

50 rellenos), forma monomerica de Cpl-^ en 1 mM de DTT (cuadrados abiertos), y dfmero de Cpl-1

(cfrculos abiertos). N=4 para cada enzima y condicion.

C45S,D324C

Figura 4. Eliminacion en plasma de enzibioticos en ratones. En ratones Balb C se inyectaron 12,16 nmoles en 100 ul

C45S,D324C

PB 50 mM, pH de 7,4 de Cpl-1 (cfrculos rellenos) o dfmero Cpl^ (cfrculos abiertos), n=3 para cada punto

55 temporal.

Figura 5. Actividad antimicrobiana in vitro de varios dfmeros mutantes de Cpl-1 purificada en una suspension de 5,108 UFC/ml de la cepa DCC1490 de S. pneumoniae a 37 °C. Tipo silvestre de Cpl-1 (cfrculos rellenos), dfmero de Cpl-1C45S,Q85C (rombos rellcnosV dfmero de Cpl-1C45S,D194C(triangulos rellenosD2 dfmero de Cpl-1C45S,N214C (cuadrados 60 rellenos), dfmero de Cpl-1C453, 16C(triangulos abiertos), dfmero de Cpl-1C453, 56C (rombos abiertos), dfmero de Cpl-

1 c45s,s269c (cfrculos abiertos), dfmero de Cpl-1C45S,D324C(cuadrados abiertos). Todas las enzimas se analizaron a una concentracion de 0,5 mg/ml. Cada punto representa el valor medio de 3 experimentos.

La Figura 6 describe secuencias de aminoacidos alineadas de Cpl-1 (no mutada) (SEQ ID NO:1), y lisinas mutantes 5 C45S (SEQ ID NO:4) y C45S, D324C (SEQ ID NO:3). Los cambios en aminoacidos de las mutantes estan subrayados.

La Figura 7 describe secuencias de aminoacidos alineadas de Cpl-1 (SEQ ID NO:1), Pal (SEQ ID NO: 5) y las secuencias de aminoacidos de LytA de S. pneumoniae (SEQ ID NO: 2). Los aminoacidos identicos dentro de las tres 10 secuencias se indican con un asterisco *. Los 13 aminoacidos implicados en la dimerizacion natural de la LytA y los aminoacidos analogos en la Cpl-1 y la Pal se indican subrayados y en negrita. Los correspondientes aminoacidos mutados en los mutantes de dfmero ejemplares de Cpl-1 (residuo d324) y Pal (residuo D280) se indican en una caja.

DESCRIPCION DETALLADA

15

En el presente documento se describen las lisinas dimericas de bacteriofago especffico de Streptococcus con actividad destructiva contra la S. pneumoniae. Normalmente, las lisinas de fago dimericas contienen dos monomeros de lisina de fago especffico de estreptococo unidos covalentemente entre sf, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de estreptococo. Los monomeros de lisina del dfmero de lisina pueden tener 20 al menos una identidad de secuencia de aminoacidos del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, o de incluso al menos el 99,5 % con la Cpl-1 no mutada (Figura 1, SEQ ID NO: 1). Los monomeros de lisina del dfmero de lisina pueden tener al menos una identidad de secuencia de aminoacidos del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %,

0 de incluso al menos el 99,5 % con la Pal no mutada (Figura 7, SEQ ID NO: 5). Las lisinas dimericas estabilizadas que se proveen en el presente documento demuestran una actividad destructiva de bacterias creciente,

25 aproximadamente el doble en la actividad antibacteriana in vitro en comparacion a la molecula monomerica original. Las lisinas dimericas tambien muestran una eliminacion en plasma disminuida con un factor cercano a 10 entre 5 minutos y 5 horas despues de la infeccion, con una eliminacion en plasma disminuida o bien una estabilidad aumentada en plasma o en un animal.

30 La Figura 1 demuestra que las secuencias de aminoacidos de las regiones de extremos C-terminal de LytA y la Cpl-

1 de lisina del estreptococo son homologas (73/142 de residuos identicos, y con 55/69 de residuos siendo sustituciones conservativas). Los 13 aminoacidos del extremo C-terminal son responsables de la dimerizacion de la autolisina LytA de Streptococcus pneumoniae. De manera interesante, dentro de esta region, 10/13 aminoacidos son identicos entre la Cpl-1 y la LytA. La LytA activa enteramente es un homodfmero ligado a colina compuesto por la

35 asociacion de cola a cola de dos monomeros de LytA iniciados por la interaccion de colina. La principal fuerza impulsora para la dimerizacion se proporciona mediante un nucleo hidrofobico resultante de las interacciones hidrofobicas e intermoleculares entre varios residuos en las regiones 6 y 7 de union a colina del extremo C-terminal (8). Los 13 residuos de extremo C-terminal de la LytA son responsables de la formacion del homodfmero activo, cuya actividad es significativamente mayor que la del monomero nativo. De hecho, una forma monomerica 40 recombinante de LytA que carece de este tramo de 13 aminoacidos (27) retiene menos del 10 % de la eficiencia catalftica de la enzima (24). La alineacion de la secuencia de Cpl-1 y LytA revelo mayores similitudes, especialmente dentro de la cola del extremo C-terminal de la enzima implicada en la dimerizacion de LytA (Figura 1). La existencia de un umbral de filtracion glomerular estimado en alcanzar aproximadamente los 60-65 kDa en humanos (17) sugiere que la forma dimerica de la Cpl-1 (PM de 74 kDa) podrfa mostrar una disminucion significante en la 45 eliminacion sistemica al compararla con el monomero. Un dfmero de Cpl-1 compuesto por dos monomeros unidos covalentemente y estabilizados por un enlace disulfido ha sido disenado, de este modo, en el presente documento, examinandose su actividad in vitro, asf como su eliminacion en plasma in vivo en comparacion con la forma monomerica de Cpl-1. Ademas, y debido a que otras y diversas lisinas de fago han demostrado o han sido sospechosas de dimerizacion (25, 26), esto representa una forma general de aumento en la actividad y/o en la 50 farmacocinetica de ciertas lisinas de fago.

De acuerdo con la presente invencion, pueden emplearse tecnicas de biologfa molecular, microbiologfa y de ADN recombinante dentro del ambito de la tecnica. Tales tecnicas se describen enteramente en la bibliograffa. Vease, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" 55 Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (m.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)];B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

En consecuencia, de aparecer en el presente documento, los terminos siguientes tendran las definiciones provistas y expuestas a continuacion y en esta seccion.

Los terminos "lisina(s) de dfmero/dimerica(s) de Streptococcus", "lisina(s) dimerica(s) de Cpl-1", "dfmero(s) de Cpl- 5 1", "Cpl-1 dimerica" y cualquier variante no mencionada especfficamente, se pueden usar indistintamente en el presente documento, y tal como se usan en toda la presente solicitud y en las reivindicaciones se refiere a un material proteinaceo que incluye protefnas solas o multiples, y particularmente protefnas de dfmero, y que se extiende a las protefnas que tienen los datos de secuencia de aminoacidos descritos en el presente documento y presentados en la Figura 6 y en la Tabla 1 y en la SEQ ID NO: 3, y el perfil de actividades indicadas en el presente 10 documento y en las reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan similarmente las protefnas que exhiben actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, modificaciones obtenidas por medio de mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como las obtenidas por medio de mutaciones en los huespedes que son productores del complejo o sus subunidades mencionadas. Tambien, los terminos "lisina(s) de dfmero/dimerica(s) de Streptococcus", "lisina(s) dimerica(s) de Cpl-1", "dfmero(s) 15 de Cpl-1", "Cpl-1 dimerica" incluyen dentro de su alcance las protefnas citadas especfficamente en el presente documento, ademas de todos los analogos, fragmentos o formas truncadas sustancialmente homologas, y las variaciones alelicas.

Los terminos "lisina(s) de dfmero/dimerica(s) de Streptococcus", "lisina(s) dimerica(s) de Pal", "dfmero(s) de Pal", 20 "Pal dimerica" y cualquier variante no mencionada especfficamente, se pueden usar indistintamente en el presente documento, y tal como se usan en toda la presente solicitud y en las reivindicaciones se refiere a un material proteinaceo que incluye protefnas solas o multiples, y particularmente protefnas de dfmero, y que se extiende a las protefnas que tienen los datos de secuencia de aminoacidos descritos en el presente documento y presentados en la Figura 7 yenla SEQ ID NO: 5, y el perfil de actividades indicadas en el presente documento y en las 25 reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan similarmente las protefnas que exhiben actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, modificaciones obtenidas por medio de mutagenesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como las obtenidas por medio de mutaciones en los huespedes que son productores del complejo o sus subunidades mencionadas. Tambien, los terminos "lisina(s) de dfmero/dimerica(s) de Streptococcus", "lisina(s) dimerica(s) de Pal", "dfmero(s) de Pal", "Pal dimerica" incluyen 30 dentro de su alcance las protefnas citadas especfficamente en el presente documento, ademas de todos los analogos, fragmentos o formas truncadas sustancialmente homologas, y las variaciones alelicas.

Polipeptidos y enzimas liticas

35 Una "enzima lftica" incluye cualquier enzima lftica de la pared celular bacteriana que destruye una o mas bacterias bajo las condiciones adecuadas y durante un periodo relevante. Los ejemplos de las enzimas liticas incluyen, sin limitacion, varias enzimas liticas amidasa de la pared celular.

Una "enzima lftica de Streptococcus" incluye una enzima lftica que es capaz de destruir por lo menos una o mas 40 bacterias de Streptococcus bajo condiciones adecuadas y durante un periodo relevante.

Una "enzima lftica de bacteriofago" se refiere a una enzima lftica extrafda o aislada de un bacteriofago, o una enzima lftica sintetizada con una estructura de protefna similar que mantiene la funcionalidad de enzima lftica.

45 Una enzima lftica es capaz de escindir especfficamente los enlaces que estan presentes en el peptidoglucano de las celulas bacterianas para desestabilizar la pared celular bacteriana. Actualmente tambien se postula que el peptidoglucano de la pared celular bacteriana esta muy conservado entre la mayorfa de las bacterias y la escision de apenas unos pocos enlaces pueden desestabilizar la pared celular bacteriana. La enzima lftica de bacteriofago puede ser una amidasa, aunque son posibles otros tipos de enzimas. Los ejemplos de enzimas liticas que escinden 50 estos enlaces son varias amidasas, tales como muramidasas, glucosaminidasas, endopeptidasas, o N- acetilmuramoil-L-alanina amidasas. Fischetti y col. (2008) informaron de que la enzima lisina del fago estreptococico C1 era una amidasa. Garcia y col. (1987, 1990) informaron de que la lisina Cpl de S. pneumoniae de un fago Cp-1 era una lisozima. Caldentey y Bamford (1992) informaron de que una enzima lftica del fago phi 6 de Pseudomonas era una endopeptidasa, partiendo el puente peptfdico formado por el acido melo-diaminopimflico y D-alanina. Las 55 enzimas liticas de fago T1 y T6 de E. coli son amidasas igual que la forma lftica de fago de Listeria (ply) (Loessner y col., 1996). Tambien hay otras enzimas liticas conocidas en la tecnica que son capaces de escindir una pared celular bacteriana.

Una "enzima lftica codificada geneticamente por un bacteriofago" incluye un polipeptido capaz de destruir una 60 bacteria huesped, por ejemplo teniendo por lo menos algo de actividad lftica de pared celular contra la bacteria

huesped. El polipeptido puede tener una secuencia que abarca la enzima litica de secuencia nativa y variantes de la misma. El polipeptido se puede aislar de una variedad de fuentes, tales como de un bacteriofago ("fago"), o se puede preparar mediante procedimientos sinteticos o recombinantes, tales como los descritos por Garcia y col., y tambien los provistos en el presente documento. El polipeptido puede comprender una porcion de union de colina en 5 el lado terminal carboxilo y puede ser caracterizado como una enzima con actividad capaz de escindir el peptidoglucano de la pared celular (como la actividad amidasa para actuar sobre enlaces de amida en el peptidoglucano) en el lado terminal amino. Se han descrito enzimas liticas que incluyen multiples actividades enzimaticas, por ejemplo dos dominios enzimaticos, tales como la lisina PlyGBS. Hablando en terminos generales, una enzima litica puede tener un peso molecular de entre 25.000 y 35.000 Da y puede comprender una sola cadena 10 de polipeptido; sin embargo, esto puede variar dependiendo de la cadena de la enzima. Mas convenientemente, el peso molecular se puede determinar mediante un ensayo sobre electroforesis en gel desnaturalizante con dodecilsulfato de sodio y en comparacion con marcadores de peso molecular.

"Una enzima litica asociada al fago con secuencia nativa" incluye un polipeptido que tiene la misma secuencia de 15 aminoacidos que una enzima derivada de una bacteria. Tal enzima de secuencia nativa se puede aislar o se puede producir por medios recombinantes o sinteticos.

El termino "enzima de secuencia natural" abarca formas que ocurren naturalmente (p. ej., formas con splicing alternativo o alteradas) y variantes que ocurren naturalmente de la enzima. En una realizacion de la invencion, la 20 enzima de secuencia nativa es un polipeptido maduro o de longitud completa que es codificado geneticamente por un gen de un bacteriofago especffico para Streptococcus y en particular el de la lisina de Cpl-1 nativa o el de la lisina de Pal nativa. Desde luego, son posibles y conocidas algunas variantes, como se reconoce en publicaciones tales como Lopez y col., Microbial Drug Resistance 3: 199-211 (1997);Garcfa y col., Gene 86: 81-88 (1990);Garcfa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988);Garcfa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918 (1988);Garcfa y 25 col., Streptococcal Genetics (J. J. Ferretti and Curtis eds., 1987);Lopez y col., FEMS Microbiol. Lett. 100: 439-448 (1992);Romero y col., J. Bacteriol. 172: 5064-5070 (1990);Ronda y col., Eur. J. Biochem. 164: 621-624 (1987) y Sanchez y col., Gene 61: 13-19 (1987)).

Una "enzima litica de secuencia variante" incluye una enzima litica caracterizada por una secuencia de polipeptido 30 que es diferente de una enzima litica, pero que retiene actividad funcional. En algunas realizaciones, la enzima litica puede ser codificada geneticamente por un bacteriofago especffico para estreptococo que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos particular con la(s) secuencia(s) de enzima litica de este documento como se provee en la Figura 1, Figura 6 y Figura 7, incluyendo las enzimas liticas variantes de las SEQ ID NO: 3, 4, y 5. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una enzima litica funcionalmente activa puede destruir bacterias de Streptococcus y otras 35 bacterias susceptibles como se provee en este documento, o como se describe previamente y es conocido por el experto en la materia, mediante la alteracion de la pared celular de las bacterias. Una enzima litica activa puede tener una identidad de secuencia de aminoacidos de 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 o 99,5 % con la(s) secuencia(s) de enzima litica de este documento como se provee en la Figura 1, Figura 6 y Figura 7, incluyendo las enzimas liticas variantes de las SEQ ID NO: 3, 4, y 5. Tales variantes de enzima litica asociadas a fago incluyen, por 40 ejemplo, polipeptidos de enzimas liticas donde se anaden o suprimen uno o mas residuos de aminoacido en los extremos N- o C-terminal de las secuencias de enzimas liticas de este documento. En un aspecto particular, una enzima litica asociada a fago tendra por lo menos aproximadamente un 80 % o un 85 % de identidad de secuencia de aminoacidos con las secuencias nativas de la enzima litica asociada a fago, particularmente por lo menos aproximadamente el 90 % (p. ej., el 90%) de identidad de secuencia de aminoacidos. Mas particularmente, una 45 variante de enzima litica dimerica asociada a fago tendra por lo menos aproximadamente el 95 % (p. ej., el 95 %) de identidad de secuencia de aminoacidos con la(s) secuencia(s) nativas de la enzima litica asociada a fago en este documento, como se indica en la Figura 1, Figura 6 y Figura 7 o en la Tabla 1 o bien en las secuencias de este documento incluidas en las SEQ ID NO: 1 o 5, o las secuencias mutantes de las SEQ ID NO: 3, 4, o 6.

50 El "porcentaje de identidad de secuencias de aminoacidos" con respecto a las secuencias de la enzima litica asociada a fago identificada, se define en el presente documento como el porcentaje de residuos de aminoacido en una secuencia candidata que son identicos a los residuos de aminoacido de la secuencia de enzima litica asociada a fago, despues de alinear las secuencias en el mismo marco de lectura e introduciendo espacios, si resulta necesario, para lograr el porcentaje maximo de identidad de secuencias, y sin considerar ninguna sustitucion 55 conservativa como parte de la identidad de secuencias.

El "porcentaje de identidad de secuencias de acido nucleico" con respecto a las secuencias de la enzima litica asociada a fago identificada en el presente documento se define aquf como el porcentaje de nucleotidos en una secuencia candidata que es identico a los nucleotidos en la secuencia de enzima litica asociada a fago, despues de 60 alinear las secuencias e introducir espacios, si resulta necesario, para lograr el porcentaje maximo de identidad de

secuencias.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos, las secuencias se alinean para fines de comparacion optima (p. ej., se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera 5 secuencia de nucleotidos). Despues se comparan los nucleotidos o aminoacidos en las posiciones de nucleotido o aminoacido correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo nucleotido o aminoacido que en la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones identicas / n.° total de posiciones x 10 100).

La determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matematico. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993). Tal algoritmo se 15 incorpora en el programa NBLAST, que se puede usar para identificar secuencias que tienen la identidad deseada con las secuencias de nucleotidos de la invencion. Para obtener alineaciones con espacios para fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul y col., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parametros predeterminados de los programas respectivos (p. ej., NBLAST). Veanse los programas proporcionados por el National Center for 20 Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health. En una realizacion, los parametros para comparacion de secuencias se pueden poner en W=12. Los parametros tambien se pueden variar (p. ej., W=5 o W=20). El valor "W" determina cuantos nucleotidos continuos deben ser identicos para que el programa identifique que dos secuencias contienen regiones de identidad.

25 "Polipeptido" incluye una molecula de polfmero comprendida de multiples aminoacidos unidos de manera lineal. En algunas realizaciones, un polipeptido puede corresponder a moleculas codificadas por una secuencia de polinucleotido que ocurre naturalmente. El polipeptido puede incluir sustituciones conservativas en donde el aminoacido que ocurre naturalmente es reemplazado por uno que tiene propiedades similares, en donde tales sustituciones conservativas no alteran la funcion del polipeptido (vease, por ejemplo, Lewin "Genes V" Oxford 30 University Press Chapter 1, pp. 9-13 1994).

El termino "enzimas lfticas alteradas" incluye enzimas lfticas barajadas y/o quimericas.

Se ha hallado que las enzimas lfticas de fago especfficas para bacterias infectadas con un fago especffico rompen 35 eficaz y eficientemente la pared celular de la bacteria en cuestion. Se cree que la enzima lftica carece de actividad enzimatica proteolftica y por lo tanto no es destructiva de las protefnas y tejidos de mamffero cuando esta presente durante la digestion de la pared celular bacteriana. Como se muestra en Loeffler y col., "Rapid Killing of Streptococcus pneumoniae with a Bacteriophage Cell Wall Hydrolase," Science, 294: 2170-2172 (Dec. 7, 2001), y material complementario del mismo publicado en Internet por la revista Science, una enzima lftica de bacteriofago 40 neumococico purificada, tal como Pal, es capaz de destruir varios neumococos. Loeffer y col. han mostrado por medio de estos experimentos que en el transcurso de segundos despues del contacto, la enzima lftica Pal es capaz de destruir cepas clfnicas de S. pneumoniae, incluso los serogrupos aislados mas frecuentemente y cepas resistentes a penicilina, in vitro. El tratamiento de ratones con Pal tambien pudo eliminar o reducir significativamente el transporte nasal del serotipo 14 de manera dependiente de la dosis. Ademas, como se encontro que la accion de 45 Pal, como otras enzimas lfticas de fago, pero a diferencia de los antibioticos, fue mas bien especffica para el patogeno diana, es probable que la flora normal permanezca esencialmente intacta. (M. J. Loessner, G. Wendlinger, S. Scherer, Mol Microbiol 16, 1231-41. (1995)). Como se demuestra en el presente documento, por ejemplo, la lisina Cpl-1 mutante, en particular la lisina dimerica, la lisina Cpl-1 dimerica, es efectiva para destruir cepas de Streptococcus, incluyendo Streptococcus pneumonia.

50

Una enzima lftica o polipeptido de la invencion puede ser producido por el organismo bacteriano despues de ser infectado con un bacteriofago particular, ya sea como un tratamiento profilactico para impedir que enfermen quienes han estado expuestos a otros que tengan sfntomas de una infeccion, o como un tratamiento terapeutico para quienes ya esten enfermos por la infeccion. Puesto que las secuencias del polipeptido de lisina y acidos nucleicos 55 que codifican los polipeptidos de lisina se proveen en el presente documento, la(s) enzima(s)/polipeptido(s) lftico(s) se pueden producir preferiblemente mediante el gen aislado de la enzima lftica del genoma del fago, poniendo el gen en un vector de transferencia, y clonando dicho vector de transferencia en un sistema de expresion, usando los metodos estandares de la tecnica que incluyen los ejemplificados en el presente documento. Las enzimas lfticas o polipeptidos pueden ser truncados, quimericos, barajados o "naturales" y pueden estar en combinacion. La patente 60 de EE. UU. con n.° 5.604.109 tambien es relevante. Una enzima lftica "alterada" se puede producir de varias

maneras. En una realizacion preferida, un gen de una enzima litica alterada del genoma del fago se pone en un vector de transferencia o movible, preferiblemente un plasmido, y el plasmido se clona en un vector de expresion o sistema de expresion. El vector de expresion para producir un polipeptido o enzima lisina de la invencion puede ser adecuado para E. coli, Bacillus, u otras bacterias adecuadas. El sistema vector tambien puede ser un sistema de 5 expresion libre de celulas. Todos estos procedimientos de expresion de un gen o grupo de genes son conocidos en la tecnica. La enzima litica tambien puede ser creada infectando Streptococcus con un bacteriofago especffico para Streptococcus, donde dicha enzima litica produce exclusivamente la lisis de la pared celular de dicha Streptococcus, teniendo a lo sumo mfnimos efectos sobre otra flora bacteriana presente, por ejemplo bacterias naturales o comensales.

10

Una "proteina quimerica" o "proteina de fusion" comprende todo o parte (preferentemente una parte biologicamente activa) de un polipeptido de la invencion enlazado operativamente a un polipeptido heterologo. Las protefnas o peptidos quimericos se producen, por ejemplo, combinando dos o mas protefnas que tienen dos o mas sitios activos. Las protefnas y peptidos quimericos pueden actuar independientemente sobre las mismas moleculas o sobre 15 moleculas diferentes, y por lo tanto tienen el potencial de tratar dos o mas infecciones bacterianas diferentes al mismo tiempo. Las protefnas y peptidos quimericos tambien se pueden usar para tratar una infeccion bacteriana escindiendo la pared celular en mas de un sitio, proporcionando asf potencialmente una destruccion mas rapida o eficaz (o sinergica) partiendo de una sola molecula de lisina o peptido quimerico.

20 Una region "heterologa" de un constructo de ADN o constructo de peptido es un segmento de ADN identificable dentro de una molecula de ADN mas grande, o peptido dentro de una molecula de peptido mas grande, que no se encuentran en la naturaleza en asociacion con la molecula mas grande. De esta manera, cuando la region heterologa codifica un gen de mamffero, normalmente el gen estara flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genomico de mamffero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia heterologa codificadora 25 es un constructo en donde la secuencia codificadora misma no se encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc en donde la secuencia codificadora genomica contiene intrones o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes de gen nativo). Las variaciones alelicas o eventos mutacionales naturales no producen una region heterologa del ADN o peptido como se define en este documento.

30 El termino "enlazado operativamente" significa que el polipeptido de la descripcion y el polipeptido heterologo estan fusionados en marco. El polipeptido heterologo puede estar fusionado con el extremo N-terminal o el extremo C- terminal del polipeptido de la descripcion. Las protefnas quimericas se producen enzimaticamente o mediante sfntesis qufmica, o mediante tecnologfa de ADN recombinante. Se han producido y estudiado varias enzimas lfticas quimericas. El gen E-L, una lisis quimerica construida de las protefnas E y L de los bacteriofagos phi X174 y MS2, 35 respectivamente, se sometio a supresiones internas para crear una serie de clones E-L nuevos con propiedades alteradas de lisis o destruccion. Las actividades lfticas de los genes parentales E, L, E-L y las formas truncadas internas de E-L se investigaron en este estudio para caracterizar el mecanismo de lisis diferente, basandose en las diferencias de arquitectura de las diferentes membranas que abarcan los dominios. La microscopfa electronica y la liberacion de enzimas marcadoras para los espacios citoplasmico y periplasmico revelaron que se pueden distinguir 40 dos mecanismos de lisis diferentes dependiendo de la penetracion de las protefnas de la membrana interna o la membrana interna y externa de E. coli (FEMS Microbiol. Lett. (1998) 164(1):159-67. Un ejemplo de una proteina de fusion util es una proteina de fusion GST, en donde el polipeptido se fusiona con el extremo C-terminal de una secuencia GST. Tal proteina quimerica puede facilitar la purificacion de un polipeptido recombinante de la descripcion.

45

En otra realizacion, la proteina o peptido quimerico contiene una secuencia de senal heterologa en su extremo N- terminal. Por ejemplo, la secuencia de senal nativa de un polipeptido de la descripcion se puede quitar y reemplazar con una secuencia de senal de otra proteina. Por ejemplo, la secuencia secretoria gp67 de la proteina de envoltura de baculovirus se puede usar como una secuencia de senal heterologa (Current Protocols in Molecular Biology, 50 Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, 1992,). Otros ejemplos de secuencias de senal heterologas eucarioticas incluyen las secuencias secretorias de melitina y fosfatasa alcalina placentaria humana (Stratagene; La Jolla, Calif.). En otro todavfa ejemplo, las secuencias de senal heterologas procarioticas utiles incluyen la senal secretoria phoA (Sambrook y col., supra) y la senal secretoria de la proteina A (Pharmacia Biotech; Piscataway, N.J.).

55 La proteina de fusion puede combinar un polipeptido de lisina con una proteina o polipeptido que tiene una capacidad diferente o que provee una capacidad adicional, o que anade una caracterfstica al polipeptido de lisina. La proteina de fusion puede ser una proteina de fusion de inmunoglobulina en la que una parte o todo el polipeptido de la descripcion se fusiona con secuencias derivadas de un miembro de la familia de las protefnas de inmunoglobulinas. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo dirigido a una proteina de 60 superficie o epftopo de una bacteria susceptible o diana. Una proteina de fusion inmunoglobulina se puede

incorporar en una composicion farmaceutica y administrarse a un sujeto para inhibir una interaccion entre un ligando (soluble o unido a membrana) y una protema sobre la superficie de una celula (receptor), para suprimir, con ello, la transduccion de senal in vivo. La protema de fusion inmunoglobulina puede alterar la biodisponibilidad de un ligando cognado de un polipeptido de la descripcion. La inhibicion de la interaccion ligando/receptor puede ser 5 terapeuticamente util tanto para tratar enfermedades y trastornos asociados con bacterias como para modular (es decir, promover o inhibir) la supervivencia celular. Ademas, una protema de fusion inmunoglobulina de la descripcion se puede usar como un inmunogeno para producir anticuerpos dirigidos contra un polipeptido de la descripcion en un sujeto, para purificar ligandos, y en ensayos de cribado para identificar moleculas que inhiben la interaccion de receptores con ligandos. Las protemas y peptidos quimericos y de fusion de la descripcion se pueden producir por 10 medio de tecnicas estandares de ADN recombinante.

El gen de fusion puede sintetizarse mediante tecnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede llevarse a cabo la amplificacion por PCR de fragmentos genicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que 15 pueden reasociarse y reamplificarse posteriormente, generando una secuencia genica quimerica (vease, p. ej., Ausubel y col., supra). Ademas, estan comercialmente disponibles muchos vectores de expresion que ya codifican un resto de fusion (p. ej., un polipeptido de GST). Un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion puede clonarse en dicho vector de expresion tal que el resto de fusion este conectado en marco con el polipeptido de la invencion.

20

Como se usa en este documento, las protemas o peptidos, productos de gen o peptidos barajados para mas de una protema o fragmento de protema o peptido de fago relacionado se han escindido aleatoriamente y reensamblado en una protema mas activa o espedfica. Oligonucleotidos, peptidos o moleculas de fragmento de peptido barajados se criban o exploran para identificar una molecula que tiene una propiedad funcional deseada. Este procedimiento se 25 describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. de Stemmer, con n.° 6.132.970. (Method of shuffling polynucleotides);Kauffman, patente de EE. UU. n.° 5.976.862 (Evolution via Condon-based Synthesis) yHuse, patente de EE. UU. con n.° 5.808.022(Direct Codon Synthesis). Se puede usar barajado para crear una protema que es mas activa, por ejemplo hasta 10 a 100 veces mas activa que la protema molde. La protema molde se selecciona de entre diferentes variedades de protemas lisinas. La protema o peptido barajado constituye, por ejemplo, uno o 30 mas dominios de union y uno o mas dominios catalfticos. Cada dominio de union o catalftico se deriva de un fago o protema de fago igual o diferente. Los dominios barajados son moleculas basadas en oligonucleotido, como gen o producto de gen, que solos o en combinacion con otros genes o productos de gen son traducibles en un fragmento de peptido, o son moleculas basadas en peptido. Los fragmentos de gen incluyen cualquier molecula de ADN, ARN, hfbrido ADN-ARN, ARN de antisentido, ribozimas, EST, SNIP, y otras moleculas basadas en oligonucleotido que, 35 solas o en combinacion con otras moleculas, producen una molecula de oligonucleotido capaz o incapaz de traducirse en un peptido.

La(s) forma(s) modificada(s) o alterada(s) de la protema o peptido y fragmento de peptido, como se describe en el presente documento, incluye(n) protemas o peptidos y fragmentos de peptido que son sintetizados qmmicamente o 40 preparados mediante tecnicas de ADN recombinante, o ambas. Estas tecnicas incluyen, por ejemplo, quimerizacion y barajado. Cuando la protema o peptido se produce mediante smtesis qmmica, prefe rente me nte esta sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros compuestos qmmicos, es decir, esta separado de los precursores qmmicos u otros compuestos qmmicos implicados en la smtesis de la protema. Por consiguiente, tales preparaciones de la protema tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de 45 precursores o compuestos qmmicos diferentes del polipeptido de interes.

Una secuencia senal de un polipeptido puede facilitar el movimiento transmembrana de la protema y peptido y los fragmentos de peptido de la descripcion hacia y desde las membranas mucosas, y tambien facilitar la secrecion y aislamiento de la protema secretada u otras protemas de interes. Normalmente las secuencias senal se caracterizan 50 por un nucleo de aminoacidos hidrofobos que generalmente son escindidos de la protema madura durante la secrecion, en uno o mas eventos de escision. Tales peptidos de senal contienen sitios de procesamiento que permiten la escision de la secuencia senal de las protemas maduras a medida que estas pasan por la ruta secretoria. De esta manera, la descripcion puede referirse a los polipeptidos descritos que tienen una secuencia senal, y tambien a la secuencia senal misma, y al polipeptido en ausencia de la secuencia senal (es decir, los 55 productos de escision). Una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia senal de la descripcion se puede enlazar operativamente en un vector de expresion a una protema de interes, tal como una protema que normalmente no es secretada o siendo, en caso contrario, difmil de aislar. La secuencia senal dirige la secrecion de la protema, tal como de un huesped eucariota en el que se transforma el vector de expresion, y subsiguientemente o concurrentemente la secuencia senal es escindida. Despues, la protema se puede purificar facilmente del medio 60 extracelular mediante los procedimientos reconocidos en la tecnica. Alternativamente, la secuencia senal se puede

enlazar con una protefna de interes usando una secuencia que facilita la purificacion, tal como con un dominio GST. La presente descripcion tambien se refiere a otras variantes de los polipeptidos de la invencion.

5 Tales variantes pueden tener una secuencia de aminoacidos alterada que pueden funcionar como agonistas (mimeticos) o como antagonistas. Las variantes pueden ser generadas por mutagenesis, es decir, mutacion puntual discreta o truncamiento. Un agonista puede retener sustancialmente las mismas actividades biologicas, o subgrupo de las mismas, de la forma natural de la protefna. Un antagonista de una protefna puede inhibir una o mas actividades de la forma natural de la protefna, por ejemplo, uniendose competitivamente a un miembro del inicio o 10 final de una cascada de senalizacion celular que incluye la protefna de interes. De esta manera, se pueden provocar efectos biologicos especfficos por tratamiento con una variante de funcion limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subgrupo de las actividades biologicas de la forma natural de la protefna puede tener menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma natural de la protefna. Las variantes de una protefna de la descripcion que funcionan como agonistas (mimeticos) o como antagonistas se 15 pueden identificar cribando bibliotecas combinacionales de mutantes, es decir, mutantes de truncamiento, de la protefna de la descripcion, para determinar su actividad agonista o antagonista. En un aspecto, se genera una biblioteca abigarrada de variantes por medio de mutagenesis combinatoria en los acidos nucleicos que es codificada por una biblioteca genica abigarrada. Una biblioteca abigarrada de variantes se puede producir, por ejemplo, ligando enzimaticamente una mezcla de oligonucleotidos sinteticos en secuencias de gen, de tal manera que un conjunto 20 degenerado de posibles secuencias de protefna es expresable como polipeptidos individuales, o alternativamente como un conjunto de protefnas de fusion mas grandes (es decir, para expresion en fago). Existe una variedad de procedimientos que se pueden utilizar para producir bibliotecas de posibles variantes de los polipeptidos de la descripcion a partir de una secuencia de oligonucleotido degenerada. Los procedimientos para sintetizar oligonucleotidos degenerados son conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Narang (1983) Tetrahedron 39:3;Itakura y 25 col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;Itakura y col. (1984) Science 198:1056;Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).

Ademas, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificadora de un polipeptido de la descripcion para generar una poblacion abigarrada de polipeptidos para cribado y subsiguiente seleccion de variantes, 30 fragmentos activos o truncamientos. Por ejemplo, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencia codificadora tratando un fragmento de PCR de doble cadena de la secuencia codificadora de interes con una nucleasa, bajo condiciones donde ocurre corte solo aproximadamente una vez por molecula, desnaturalizando el ADN de doble cadena, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble cadena que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos cortados, quitando porciones de una sola cadena de los duplex 35 reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligando la coleccion de los fragmentos resultantes en un vector de expresion. Mediante este procedimiento se puede derivar una biblioteca de expresion que codifica fragmentos de extremos N-terminal e internos de varios tamanos de la protefna de interes. Se conocen varios metodos en la tecnica para el cribado de productos genicos de bibliotecas combinatoriales fabricadas mediante mutaciones o truncamientos puntuales y para el cribado de genotecas de ADNc para productos genicos que tienen una propiedad 40 seleccionada. Habitualmente, las tecnicas usadas mas ampliamente, que son susceptibles de analisis de alto rendimiento, para el cribado de genotecas grandes, incluyen la clonacion de la genoteca en vectores de expresion replicables, la transformacion de las celulas apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresion de los genes combinatoriales en condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto. La mutagenesis de ensamblado recursivo (REM), una tecnica 45 que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinacion con los ensayos de cribado para identificar variantes de una protefna de la descripcion (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815;Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331) las porciones inmunologicamente activas de un fragmento de protefna o peptido incluyen regiones que se unen a anticuerpos que reconocen la enzima del fago. En este contexto, la porcion mas pequena de una protefna (o acido nucleico que 50 codifica la protefna) -de acuerdo con las realizaciones- es un epftopo que es reconocible como especffico para el fago que hace la protefna lisina. Por consiguiente, el polipeptido mas pequeno (y acido nucleico asociado que codifica el polipeptido) que se puede esperar que se una a un anticuerpo, y es util en algunas realizaciones, puede tener 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 85, o 100 aminoacidos de longitud. Aunque las secuencias pequenas tan cortas como 8, 9, 10, 11, 12 o 15 aminoacidos de largo comprenden confiablemente 55 estructura suficiente para actuar como objetivos o epftopos, secuencias mas cortas de 5, 6, o 7 aminoacidos de largo pueden exhibir estructura epitopica en algunas condiciones y son de valor en un aspecto.

Las porciones biologicamente activas de una protefna o fragmento de peptido de las realizaciones que se describen en el presente documento incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente 60 identicas a, o derivadas de, la secuencia de aminoacidos de la protefna de fago de la descripcion, que incluyen

menos aminoacidos que la protefna de longitud completa de la protefna de fago y exhiben por lo menos una actividad de la protefna de longitud completa correspondiente. Normalmente, las porciones biologicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la protefna correspondiente. Una porcion biologicamente activa de una protefna o fragmento de protefna de la descripcion puede ser un polipeptido que tiene 5 una longitud, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 mas o menos aminoacidos. Ademas, se pueden preparar otras porciones biologicamente activas en las que son suprimidas o anadidas otras regiones de la protefna mediante tecnicas recombinantes, y se evaluan para determinar una o mas de las actividades funcionales de la forma nativa de un polipeptido de las realizaciones.

10 Se pueden preparar protefnas y acidos nucleicos homologos que comparten funcionalidad con tales protefnas y/o acidos nucleicos pequenos (o regiones de protefna y/o acido nucleico de moleculas mas grandes), como sera apreciado por el experto en la materia. Tales moleculas pequenas y regiones cortas de moleculas mas grandes que pueden ser homologas se consideran especfficamente como realizaciones. Preferentemente la homologfa de tales regiones valiosas es de por lo menos el 50 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, y preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 15 %, 98 %, o por lo menos el 99 % con respecto a los polipeptidos de lisina proporcionados en el presente documento, incluyendo lo senalado en las Figuras 1 y 6. Estos valores de porcentaje de homologfa no incluyen alteraciones debido a las sustituciones conservativas de aminoacidos.

Dos secuencias de aminoacidos son "sustancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente el 70 % de 20 los residuos de aminoacidos (preferentemente, al menos aproximadamente el 80 %, por lo menos aproximadamente el 85 %, y preferentemente al menos aproximadamente el 90 o 95 %) son identicos, o representan sustituciones conservativas. Las secuencias de lisinas comparables, como las lisinas Cpl-1 comparables, o las lisinas de Streptococcus comparables, son sustancialmente homologas cuando uno o mas, o varios, o hasta el 10 %, o hasta el 15 %, o hasta el 20 % de los aminoacidos del polipeptido de lisina estan sustituidos con una sustitucion de 25 aminoacidos similar o conservativa, y donde las lisinas comparables tienen el perfil de actividades, efectos antibacterianos y/o especificidades bacterianas de una lisina, como las lisinas Cpl-1, descritas en este documento.

Los residuos de aminoacido que se describen en este documento se prefieren en la forma isomerica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomerica "D" pueden sustituir a cualquier residuo de L-aminoacido, siempre que 30 la propiedad funcional deseada de union de inmunoglobulina sea retenida por el polipeptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo terminal amino de un polipeptido COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente el extremo terminal carboxilo de un polipeptido. De acuerdo con la nomenclatura estandar de polipeptido, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas de residuos de aminoacidos se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:

35

TABLA DE CORRESPONDENCIA

SiMBOLO

AMINOACIDO

Una letra

T res letras

Y

Tyr tirosina

G

Gly glicina

F

Phe fenilalanina

M

Met metionina

A

Ala alanina

S

Ser serina

I

He isoleucina

L

Leu leucina

T

Thr treonina

V

Val valina

P

Pro prolina

K

Lys lisina

H

His histidina

Q

Gln glutamina

E

Glu acido glutamico

W

Trp triptofano

R

Arg arginina

D

Asp acido aspartico

N

Asn asparagina

C

Cys cistefna

Cabe senalar que todas las secuencias de residuos de aminoacido estan representadas aquf por formulas cuya orientacion izquierda y derecha estan en la direccion convencional de extremo terminal amino a extremo terminal carboxilo. Ademas, cabe senalar que un guion al principio o al final de una secuencia de residuos de aminoacido indica un enlace peptfdico a una secuencia adicional de uno o mas residuos de aminoacido. La Tabla anterior se 5 presenta para correlacionar las notaciones de tres letras y una letra que pueden aparecer alternativamente en este documento.

Se pueden hacer mutaciones en las secuencias de aminoacidos o en las secuencias de acidos nucleicos que codifican los polipeptidos y lisinas del presente documento, incluso en las secuencias de lisina indicadas en la Figura 10 1, Figura 6 o en la Figura 7, en la SEQ ID NO: 1 o 5, o en fragmentos activos o productos truncados de los mismos, de tal manera que un codon particular se cambia a un codon que codifica un aminoacido diferente, un aminoacido se sustituye por otro aminoacido, o uno o mas aminoacidos se suprimen. Tal mutacion generalmente se realiza haciendo los menos cambios posibles de aminoacido o nucleotido. Una mutacion de sustitucion de esta clase se puede hacer para cambiar un aminoacido en la protefna resultante de manera no conservativa (por ejemplo,

15 cambiando el codon de un aminoacido que pertenece a un grupo de aminoacidos que tienen un tamano o

caracterfstica particular a un aminoacido que pertenece a otro grupo), o de manera conservativa (por ejemplo,

cambiando el codon de un aminoacido que pertenece a un grupo de aminoacidos que tienen un tamano o

caracterfstica particular a un aminoacido que pertenece al mismo grupo). Este cambio conservativo generalmente produce un cambio menor en la estructura y funcion de la protefna resultante. Es mas probable que un cambio no 20 conservativo altere la estructura, actividad o funcion de la protefna resultante. Se debe considerar que la presente invencion incluye secuencias que contienen cambios conservativos que no alteran significativamente la actividad o caracterfsticas de union de la protefna resultante.

El siguiente es un ejemplo de diversos agrupamientos de aminoacidos:

25

Aminoacidos con grupos R no polares

Alanina, Valina, Leucina, lsoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metionina Aminoacidos con grupos R polares no cargados Glicina, Serina, Treonina, Cistefna, Tirosina, Asparagina, Glutamina 30 Aminoacidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente con pH 6,0)

Acido aspartico, Acido glutamico

Aminoacidos basicos (cargados positivamente con pH 6,0)

Lisina, Arginina, Histidina (con pH 6,0)

35 Otra agrupacion puede ser aquellos aminoacidos con grupos fenilo:

Fenilalanina, Triptofano, Tirosina

Otra agrupacion puede ser segun su peso molecular (es decir, el tamano de los grupos R):

Glicina

75 Alanina 89

Serina

105 Prolina 115

Valina

117 Treonina 119

Cistefna

121 Leucina 131

lsoleucina

131 Asparagina 132

Acido aspartico

133 Glutamina 146

Lisina

146 Acido glutamico 147

Metionina

149 Histidina (con pH de 6,0) 155

Fenilalanina

165 Arginina 174

Tirosina

181 Triptofano 204

40

Las sustituciones particularmente preferidas son:

- Lys por Arg y viceversa, de tal manera que se pueda mantener 45 una carga positiva;

- Glu por Asp y viceversa, de tal manera que se pueda mantener una carga negativa;

- Ser por Thr, de tal manera que se pueda mantener un -OH libre; y

- Gln por Asn, de tal manera que se pueda mantener un NH2 libre.

Las sustituciones conservativas de aminoacidos ejemplares y preferidas incluyen cualquiera de: glutamina (Q) por acido glutamico (E) y viceversa; leucina (L) por valina (V) y viceversa; serina (S) por treonina (T) y 5 viceversa; isoleucina (I) por valina (V) y viceversa; lisina (K) por glutamina (Q) y viceversa; isoleucina (I) por metionina (M) y viceversa; serina (S) por asparagina (N) y viceversa; leucina (L) por metionina (M) y viceversa; lisina (L) por acido glutamico (E) y viceversa; alanina (A) por serina (S) y viceversa; tirosina (Y) por fenilalanina (F) y viceversa; acido glutamico (E) por acido aspartico (D) y viceversa; leucina (L) por isoleucina (I) y viceversa; lisina (K) por arginina (R) y viceversa.

10

Tambien se pueden introducir sustituciones de aminoacidos para sustituir un aminoacido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir una Cys como un sitio potencial de puentes disulfuro con otra Cys. Se puede introducir una His como un sitio particularmente "catalftico" (es decir, His puede actuar como un acido o base y es el aminoacido mas comun en la catalisis bioqufmica). Se puede introducir una Pro debido a su 15 estructura particularmente plana, que induce vueltas p en la estructura de la protefna.

El polipeptido o epftopo que se describe en el presente documento se puede usar para generar un anticuerpo, y tambien se puede usar para detectar la union a la lisina o a moleculas que reconocen la protefna lisina. Otro aspecto es una molecula tal como un anticuerpo u otro agente de union especffico, que se puede crear usando un epftopo tal 20 como por inmunizacion regular o mediante un enfoque de presentacion de fase en donde un epftopo se puede usar para cribar una biblioteca de agentes de union potenciales. Tales moleculas reconocen uno o mas epftopos de la protefna lisina o un acido nucleico que codifica la protefna lisina. Un anticuerpo que reconoce un epftopo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, o una porcion de una protefna de anticuerpo. Deseablemente, la molecula que reconoce un epftopo tiene una union especffica para ese epftopo que es al menos 10 veces mas 25 fuerte que la union de la molecula a la albumina de suero. La union especffica puede medirse como afinidad (Km). Mas deseablemente, la union especffica es por lo menos 102, 103, 104, 105, 106, 10 7, 108, mas alta, o incluso mas, que la union a albumina de suero bajo las mismas condiciones.

En un aspecto deseable, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta en una forma util para detectar la presencia 30 de la protefna lisina, o alternativamente para detectar la presencia de una bacteria susceptible a la protefna lisina. En un aspecto adicional, el anticuerpo se puede unir o asociar de otra manera con el polipeptido de lisina de la invencion, por ejemplo en una protefna quimerica o de fusion, y puede servir para dirigir la lisina a una celula o cepa bacteriana de interes u objetivo. Alternativamente, el polipeptido de lisina puede servir para dirigir el anticuerpo o actuar en conjunto con el anticuerpo, por ejemplo para lisar parcial o totalmente la pared celular bacteriana, de tal 35 manera que el anticuerpo se puede unir especfficamente a su epftopo en la superficie o debajo de la superficie de la bacteria. Por ejemplo, una lisina de la invencion puede unirse a un anticuerpo anti-estreptococico y dirigir el anticuerpo a su epftopo.

Como apreciara el experto en la materia, se conoce una variedad de formas y procedimientos de sfntesis de 40 anticuerpo. El anticuerpo se puede conjugar (en complejo covalente) con una molecula o atomo reportero, tal como fluor, una enzima que crea una senal optica, un quimioluminoforo, una micropartfcula, o un atomo radioactivo. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede sintetizar in vivo despues de la inmunizacion de un animal, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede sintetizar mediante cultivo celular despues de recombinacion genetica. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede preparar mediante una combinacion de 45 sfntesis celular y modificacion qufmica.

Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epftopo especffico. El termino abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quimericos, estos ultimos descritos en mayor detalle en las patentes de EE. UU. con n.os 4.816.397y4.816.567. El termino "anticuerpo" describe una 50 inmunoglobulina, ya sea natural o producida parcial o totalmente por sfntesis. El termino tambien abarca cualquier polipeptido o protefna que tiene un dominio de union que es un dominio de union de anticuerpo, o es homologo al mismo. Este termino tambien contempla anticuerpos injertados con CDR. Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epftopo especffico. El termino abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quimericos, estos ultimos descritos en mayor detalle en las 55 patentes de EE. UU. con n.os 4.816.397y 4.816.567. El termino "anticuerpo(s)" incluye una molecula de inmunoglobulina (lg) de tipo silvestre, que comprende generalmente cuatro cadenas de polipeptido de longitud completa, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o un homologo de lg equivalente de la misma (p. ej., un nanoanticuerpo de camelido, que comprende solo una cadena pesada); incluso mutantes, variantes o derivados funcionales de longitud completa de los mismos, que retienen las caracterfsticas esenciales de union de epftopo de 60 una molecula de lg, e incluyen anticuerpos doblemente especfficos, biespecfficos, multiespecfficos y de doble

dominio variable; las moleculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), o subclase (p. ej., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2). El significado del termino "anticuerpo" tambien incluye cualquier "fragmento de anticuerpo".

5 Un "fragmento de anticuerpo" significa una molecula que comprende por lo menos una cadena de polipeptido que no es de longitud completa, que incluye (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios ligero variable (VL), pesado variable (VH), ligero constante (CL) y pesado constante 1 (CH 1); (ii) un fragmento F(ab')2 que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) una porcion de cadena pesada de un fragmento Fab (Fd), que consiste en los 10 dominios VH y CH 1 ; (iv) un fragmento variable (Fv), que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) que comprende un solo dominio variable (Ward, E.S. y col., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) un anticuerpo camelido; (vii) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada; (viii) un fragmento Fv de una sola cadena en donde un dominio VH y un dominio VL estan enlazados por un conector peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union de antfgeno 15 (Bird y col., Science, 242, 423-426, 1988;Huston y col., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (ix) un dianticuerpo, que es un anticuerpo bivalente biespecffico en el cual los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipeptido, pero usando un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento de los dos dominios en la misma cadena, forzando asf a los dominios a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union de antfgeno (WO94/13804; P. Holliger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 20 (1993)); y (x) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tandem (VH-CH1-VH-CH1 ) que, junto con polipeptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de union de antfgeno; (xi) fragmentos de anticuerpo multivalentes [dfmeros, trfmeros y/o tetrameros de scFv (Power and Hudson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 (2000)]; y (xii) otras porciones de longitud incompleta de cadenas pesadas y/o ligeras, o mutantes, variantes, o derivados de los mismos, solos o en cualquier combinacion.

25

Como los anticuerpos se pueden modificar de varias maneras, se debe considerar que el termino "anticuerpo" cubre cualquier miembro de union especffico o sustancia que tiene un dominio de union con la especificidad requerida. De esta manera, este termino abarca fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homologos de anticuerpos, que incluyen cualquier polipeptido que comprende un dominio de union de inmunoglobulina, ya sea 30 natural o parcial o totalmente sintetico. Por lo tanto, se incluyen moleculas quimericas que comprenden un dominio de union de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado con otro polipeptido. La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describe en EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en las patentes de EE. UU. con n.os 4.816.397 y 4.816.567.

35 Un "sitio de combinacion de anticuerpo" es aquella porcion estructural de una molecula de anticuerpo comprendida de regiones variables e hipervariables de cadena ligera o cadena pesada y ligera que se unen especfficamente al antfgeno.

La expresion "molecula de anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales, como se usa en el presente documento, 40 contempla una molecula de inmunoglobulina intacta y una porcion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina. Las moleculas de anticuerpo ejemplares son moleculas de inmunoglobulina intactas, moleculas de inmunoglobulinas sustancialmente intactas, y las porciones de una molecula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, que incluye las porciones conocidas en la tecnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v); dichas porciones son preferidas para usarse en los metodos terapeuticos descritos en el presente documento.

45

La expresion "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solo un sitio de combinacion de una especie de anticuerpo capaz de reaccionar inmunologicamente con un antfgeno particular. De esta manera, un anticuerpo monoclonal normalmente presenta una sola afinidad de union por cualquier antfgeno con el cual reacciona inmunologicamente. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener 50 una molecula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinacion de anticuerpo, cada uno inmunoespecffico para un antfgeno diferente; p. ej., un anticuerpo monoclonal biespecffico (quimerico).

El termino "especffico" se puede usar para hacer referencia a la situacion en la que un miembro de un par de union especffico no mostrara union significativa a moleculas diferentes de su(s) socio(s) de union especfficos. El termino 55 tambien es aplicable en donde, p. ej., un dominio de union de antfgeno es especffico para un epftopo particular que es llevado por varios antfgenos, en cuyo caso el miembro de union especffico que lleva el dominio de union de antfgeno sera capaz de unirse a los diversos antfgenos que llevan el epftopo.

El termino "comprende" se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o mas 60 caracterfsticas o componentes.

El termino "que consiste esencialmente en" se refiere a un producto, particularmente una secuencia de peptido, de un numero definido de residuos que no estan unidos covalentemente a un producto mas grande. En el caso del peptido de la invencion, los expertos en la tecnica apreciaran que se pueden contemplar modificaciones menores al 5 extremo N- o C-terminal del peptido, tal como la modificacion qufmica del extremo terminal para anadir un grupo protector o similar, p. ej., la amidacion del extremo C-terminal.

El termino "aislado" se refiere al estado en el cual los polipeptidos de lisina de la invencion, o el acido nucleico que codifica este/os polipeptido(s), estara de acuerdo con la presente invencion. Los polipeptidos y acidos nucleicos 10 estaran libres o sustancialmente libres del material con el cual estan asociados naturalmente, tales como otros polipeptidos o acidos nucleicos con los cuales se encuentran en su medio natural, o el medio en el que se preparan (p. ej., un cultivo celular) cuando esta preparacion es mediante tecnologfa de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los polipeptidos y acidos nucleicos se pueden formular con diluentes o adyuvantes, y todavfa para efectos practicos, estan aislados -por ejemplo, los peptidos normalmente se mezclaran con polfmeros o mucoadhesivos u 15 otros vehfculos, o se mezclaran con vehfculos o diluentes farmaceuticamente aceptables cuando se usan en diagnostico o terapia.

Los monomeros de lisina dimericos de la invencion pueden estar qufmicamente reticulados entre si por un enlace covalente, incluyendo en particular un enlace covalente u otra asociacion tal como entre los aminoacidos ubicados 20 entre aproximadamente 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal del polipeptido de lisina Cpl-1 (Figura 1 y SEQ iD NO:1) o de lisina Pal (Figura 7 y SEQ ID NO:5). Los monomeros pueden ser reticulados usando agentes qufmicos reticulantes. Por ejemplo, un primer monomero puede estar reticulado con un segundo monomero entre dos residuos de cistefna. Ejemplos de reactivos reticulantes reactivos a la cistefna incluyen 1,6-bismaleimidohexano (BMH), 1,3-dibromo-2-propanol (DBP), y gas mostaza (bis(2-cloroetil)sulfido; mostaza). Se conocen otros y 25 alternativos reactivos reticulantes y pueden incluir N-hidroxisuccinimida (NHS) que unen amina a amina, maleimidas y piridilditioles que unen sulfhidrilos con sulfhidrilos. Cada uno podrfa incorporar espaciadores para aumentar el espacio y la flexibilidad. Los monomeros de lisina pueden asociarse o reticularse covalentemente a traves de un conector peptfdico fusionado con sus regiones o extremos C-terminales. Puede utilizarse cualquier medio de la tecnica para dimerizar, siempre que se mantenga tanto la funcion de union de colina del extremo C-terminal como la 30 funcion enzimatica del extremo N-terminal.

Los monomeros de lisina pueden unirse juntos mediante enlaces disulfido entre dos residuos de cistefna. En algunos aspectos los monomeros se reticulan entre si mediante un enlace disulfido entre dos residuos Cys localizados entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal de la Cpl-1 o la Pal. Los residuos de cistefna reticulada pueden 35 estar en la misma posicion sobre las cadenas de polipeptido del monomero de lisina. En algunos casos, los residuos de cistefna en los primeros 45 residuos de una lisina pueden no estar presentes. Un ejemplo de un monomero de

1 1 C45S D324C J 1

lisina que esta reticulado por residuos Cys en la posicion 324 es Cpl-^ (SEQ ID NO: 3). Un ejemplo de un

monomero de lisina que esta reticulado por residuos Cys en la posicion 280 es PalD280C (SEQ ID NO: 6).

40 Normalmente, las lisinas poseen dos dominios funcionalmente distintos que consisten en un dominio catalftico para hidrolisis de peptidoglucano y un dominio de union para el reconocimiento de restos de superficie sobre las paredes celulares de las bacterias. Los dominios catalfticos son conservados relativamente entre las lisinas. De este modo, una lisina dimerica puede ser quimerica por naturaleza y comprender un dfmero de monomeros de lisina que comprenda un dominio catalftico de una primera lisina de fago especffico de estreptococo y un dominio de union de 45 una segunda lisina de fago especffico de estreptococo. En ciertas realizaciones, el dominio catalftico de una primera lisina de fago especffico de estreptococo parte de la Cpl-1 o de otros dominios catalfticos de lisina de fago de Streptococcus pneumoniae. En otras realizaciones, el dominio de union de una segunda lisina de fago especffico de Streptococcus pneumoniae parte de la Cpl-1 o de otros dominios de union de lisina de fago de Streptococcus pneumoniae. Ejemplos de un dominio catalftico incluyen los aminoacidos 1-190 de la Cpl-1. En ciertas realizaciones 50 diferentes, el dominio catalftico de una primera lisina de fago especffico de estreptococo parte de la Pal o de otros dominios catalfticos de lisina de fago de Streptococcus pneumoniae. En otras realizaciones, el dominio de union de una segunda lisina de fago especffico de Streptococcus pneumoniae parte de la Pal o de otros dominios de union de lisina de fago de Streptococcus pneumoniae. Algunos ejemplos de dominios catalfticos son la mitad del extremo N- terminal de la lisina ClyS y la lisina PlyG, entre otras. Ejemplos de dominios de union incluyen los aminoacidos 19155 326 de la Cpl-1. Ejemplos de dominios de union incluyen los aminoacidos 155-296 de la Pal. Algunos ejemplos de dominios de union son la mitad del extremo C-terminal de las lisinas ClyS y PlyG, entre otras. Aquellos expertos en la tecnica podran determinar facilmente los aminoacidos exactos que abarcan estos dominios a partir del analisis de la secuencia, asf como las alineaciones de la secuencia.

60 Las lisinas dimericas exhiben actividad destructiva contra una o mas bacterias estreptococicas como son las

Streptococcus pneumoniae. La actividad destructiva puede determinarse mediante el uso de un ensayo de destruccion tal como el descrito en la seccion de ejemplo a continuacion.

Acidos nucleicos

5

Se proveen aquf acidos nucleicos capaces de codificar el/los polipeptido(s) de lisina dimerico(s) de la invencion. Las secuencias de acido nucleico representativas en este contexto son las secuencias de polinucleotido que codifican los monomeros de polipeptido dimerico de cualquiera de las Figuras 1,6 y 7 y la Tabla 1, las SEQ ID NO: 3 o 6, y las secuencias que se hibridan, bajo condiciones rigurosas, con secuencias complementarias de secuencia(s) de acido 10 nucleico. Tambien se contemplan variantes adicionales de estas secuencias, y secuencias de acidos nucleicos que se hibridan con las que se muestran en las Figuras, para usarse en la produccion de las enzimas lisinas de acuerdo con la descripcion, que incluyen las variantes naturales que se pueden obtener. Una gran variedad de secuencias de acido nucleico aisladas o secuencias de ADNc que codifican enzimas lisinas asociadas a fago, y secuencias parciales que se hibridan con estas secuencias de gen, son utiles para la produccion recombinante de la(s) 15 enzima(s) lisina(s) o polipeptido(s) de la invencion.

Un "replicon" es cualquier elemento genetico (p. ej., plasmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autonoma de replicacion de ADN in vivo; es decir, capaz de replicacion bajo su propio control.

20 Un "vector" es un replicon, tal como un plasmido, fago o cosmido, al que se le puede unir otro segmento de ADN a fin de producir la replicacion del segmento anadido.

Una "molecula de ADN" se refiere a la forma polimerica de los desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de una sola cadena o de helice de doble cadena. Este termino se refiere solo a la estructura 25 primaria y secundaria de la molecula y no se limita a cualquier forma terciaria particular. De esta manera, este termino incluye ADN de doble cadena encontrado, entre otras partes, en moleculas de ADN lineales (p. ej., fragmentos de restriccion), virus, plasmidos y cromosomas. Al tratar la estructura de moleculas particulares de ADN de doble cadena, las secuencias se pueden describir aquf de acuerdo con la convencion normal de dar solamente la secuencia en direccion 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una 30 secuencia homologa al ARNm).

Un "origen de replicacion" se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la sfntesis de ADN.

Una "secuencia codificadora" de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena que es transcrita y traducida a un 35 polipeptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los lfmites de la secuencia codificadora son determinados por un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de detencion de traduccion en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificadora puede incluir, sin limitacion, secuencias procarioticas, ADNc de ARNm eucariotico, secuencias de ADN genomico de ADN eucariotico (p. ej., de mamffero), e incluso secuencias de ADN sinteticas. Una senal de poliadenilacion y una secuencia de terminacion de transcripcion 40 normalmente estaran localizadas en direccion 3' a la secuencia codificadora.

Las secuencias de control de transcripcion y traduccion son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, mejoradores, senales de poliadenilacion, terminadores y similares, que proporcionan la expresion de una secuencia codificadora en una celula huesped.

45

Una "secuencia promotora" es una region reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificadora en direccion 3'. Para fines de definicion de la presente invencion, la secuencia promotora esta unida en su extremo 3' por un sitio de iniciacion de transcripcion y se extiende en direccion 5' para incluir el numero mfnimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion 50 a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de iniciacion de transcripcion (definido convenientemente mapeando con nucleasa S1), asf como tambien dominios de union de protefna (secuencias de consenso) responsables de la union de ARN polimerasa. Los promotores eucarioticos frecuentemente, pero no siempre, contendran cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarioticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno ademas de las secuencias de consenso -10 y -35.

55

Una "secuencia de control de expresion" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripcion y traduccion de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora esta "bajo el control" de secuencias de control de transcripcion y traduccion en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que es entonces traducido a la protefna codificada por la secuencia codificadora.

Una "secuencia senal" se puede incluir antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un peptido senal, de extremo N-terminal al polipeptido, que se comunica con la celula huesped para dirigir al polipeptido a la superficie celular o secretar el polipeptido hacia el medio, y este peptido senal es cortado por la celula huesped antes de que la protefna deje la celula. Las secuencias de senal pueden encontrarse asociadas con una variedad de protefnas 5 nativas para procariotas y eucariotas.

El termino "oligonucleotido", como se usa en este documento al hacer referencia a la sonda de la presente invencion, se define como una molecula que comprende dos o mas ribonucleotidos, preferentemente mas de tres. Su tamano exacto dependera de muchos factores que, a su vez, dependen de la funcion y uso final del 10 oligonucleotido.

El termino "cebador'', como se usa en este documento, se refiere a un oligonucleotido, ya sea natural como en un producto de digestion de restriccion purificado o producido sinteticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de sfntesis cuando se pone bajo condiciones en las que se induce la sfntesis de un producto de extension de 15 cebador, que es complementario a una cadena de acido nucleico, es decir, en presencia de nucleotidos y un agente inductor como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser de una cadena o de doble cadena, y debe ser suficientemente grande para iniciar la sfntesis del producto de extension deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependera de muchos factores que incluyen la temperatura, la fuente del cebador y el uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones diagnosticas 20 dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el oligonucleotido cebador normalmente contiene 15-25 nucleotidos o mas, aunque puede contener menos nucleotidos.

Los cebadores del presente documento se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente 25 complementarios para hibridarse con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia de cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, se puede unir un fragmento de nucleotido no complementario al extremo 5' del cebador, y con el resto de la secuencia del cebador siendo complementaria a la cadena. Alternativamente, en el cebador se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias mas grandes, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena por 30 hibridar con la misma, y forme asf el molde para la sfntesis del producto de extension.

Tal como se usan en este documento, los terminos "endonucleasas de restriccion" y "enzimas de restriccion" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN de doble cadena en, o cerca de, una secuencia de nucleotidos especffica.

35

Una celula ha sido "transformada" por ADN exogeno o heterologo cuando dicho ADN ha sido introducido en la celula. El ADN transformante puede o no ser integrado (enlazado covalentemente) al ADN cromosomico que forma el genoma de la celula. En procariotas, levaduras y celulas de mamffero, por ejemplo, el ADN transformante se puede mantener sobre un elemento episomico tal como un plasmido. Con respecto a las celulas eucariotas, una 40 celula transformada establemente es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de tal manera que es heredado por las celulas hijas por medio de replicacion del cromosoma. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la celula eucariota para establecer lfneas o clones de celulas comprendidos de una poblacion de celulas hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una poblacion de celulas derivadas de una sola celula o ancestro comun mediante mitosis. Una "lfnea celular'' es un clon de una celula primaria que es 45 capaz de tener un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" cuando por lo menos aproximadamente el 75 % (preferentemente por lo menos aproximadamente el 80 %, y con la maxima preferencia por lo menos aproximadamente el 90 o 95 %) de los nucleotidos concuerdan sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. 50 Las secuencias que son sustancialmente homologas se pueden identificar comparando las secuencias y usando el software estandar disponible en los bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridacion de Southern, por ejemplo bajo condiciones rigurosas definidas para ese sistema particular. La definicion de las condiciones de hibridacion apropiadas es del dominio del experto en la materia. Vease, p. ej., Maniatis y col., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

55

Muchas de las moleculas de ADN variantes contempladas en el presente documento incluyen las creadas por tecnicas estandares de mutagenesis de ADN, tal como mutagenesis de cebador M13. Detalles de estas tecnicas se proporcionan en Sambrook y col. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. Usando estas tecnicas se pueden crear variantes que difieren menormente de aquellas descritas. La descripcion 60 contempla moleculas de ADN y secuencias de nucleotidos que son derivadas de las que se describen aquf

especfficamente, y que difieren de las descritas por la supresion, adicion o sustitucion de nucleotidos, pero que todavfa codifican una protefna que posee las caracterfsticas funcionales de los polipeptidos de lisina. Tambien se incluyen moleculas de ADN pequenas que se derivan de las moleculas de ADN descritas. Estas moleculas de ADN pequenas incluyen oligonucleotidos adecuados para usarse como sondas de hibridacion o cebadores de reaccion en 5 cadena de polimerasa (PCR). Por lo tanto, estas moleculas de ADN pequenas comprenderan por lo menos un segmento de una enzima lftica codificada geneticamente por un bacteriofago de Streptococcus, y para los fines de la PCR, comprenderan por lo menos una secuencia de 10-15 nucleotidos, y mas preferentemente una secuencia de 15-30 nucleotidos del gen. Las moleculas de ADN y secuencias de nucleotidos que se derivan de las moleculas del ADN descrito que se describe anteriormente tambien se pueden definir como secuencias de ADN que se hibridan 10 bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ADN descritas, o fragmentos de las mismas.

Las condiciones de hibridacion que corresponden a grados particulares de rigurosidad varfan dependiendo de la naturaleza del procedimiento de hibridacion de eleccion, asf como de la composicion y longitud del ADN hibridante utilizado. Generalmente, la temperatura de hibridacion y la fuerza ionica del tampon de hibridacion (especialmente la 15 concentracion del ion sodio) determinaran la rigurosidad de la hibridacion. Los calculos con respecto a las condiciones de hibridacion requeridas para alcanzar grados particulares de rigor se tratan en Sambrook y col. (1989), en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., capftulos 9 y 11.

Un ejemplo de este calculo es como sigue. Un experimento de hibridacion se puede efectuar por hibridacion de una 20 molecula de ADN (por ejemplo, una variacion natural de la enzima lftica codificada geneticamente por un bacteriofago especffico para Bacillus anthracis) a una molecula de ADN diana. Un ADN diana, por ejemplo, puede ser el ADNc correspondiente que se ha sometido a electroforesis en un gel de agarosa y transferido a una membrana de nitrocelulosa por Southern blot (Southern (1975). J. Mol. Biol. 98:503), una tecnica muy conocida y descrita en Sambrook y col. (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. La 25 hibridacion con una sonda diana marcada con dCTP de P32 isotopico se efectua en una solucion de fuerza ionica alta, tal como SSC x6 a una temperatura que es 20-25 grados Celsius menor que la temperatura de fusion, Tm (que se describe infra). Para estos experimentos de hibridacion de Southern en donde la molecula de ADN diana en el Southern blot contiene 10 ng de ADN o mas, la hibridacion se efectua por 6-8 horas usando una sonda radiomarcada a 1-2 ng/ml (de actividad especffica igual a 109 CPM/pg o mayor). Despues de la hibridacion, el filtro 30 de nitrocelulosa se lava para eliminar la hibridacion de fondo. Las condiciones de lavado son tan rigurosas como sea posible para eliminar la hibridacion de fondo pero al mismo tiempo reteniendo una senal de hibridacion especffica. El termino "Tm" representa la temperatura por arriba de la cual, bajo las condiciones ionicas predominantes, la molecula de sonda radiomarcada no se hibrida con su molecula de ADN diana. La Tm de esta molecula hfbrida puede ser calculada a partir de la siguiente ecuacion: Tm=81,5°C-16,6(log10 de la concentracion de ion 35 sodio)+0,41(% G+C)-0,63(% formamida)-(600/l), en donde l = a la longitud del hfbrido en pares de bases. Esta ecuacion es valida para concentraciones de ion sodio en la escala de 0,01 M a 0,4 M, y menos exacta para calculos de Tm en soluciones de concentracion de ion sodio mas altas (Bolton and McCarthy (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390). La ecuacion tambien es valida para ADN que tiene un contenido de G+C dentro del 30 % al 75 %, y tambien se aplica a hfbridos de longitud mayor de 100 nucleotidos. El comportamiento de las sondas de 40 oligonucleotido se describe en detalle en el capftulo 11 de Sambrook y col. (1989), en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. Las condiciones ejemplificadas preferidas descritas en este documento se contemplan particularmente para usarse en la seleccion de variaciones del gen lftico.

En aspectos preferidos de la presente descripcion, las condiciones rigurosas se pueden definir como aquellas bajo 45 las cuales las moleculas de ADN con mas del 25 % de variacion de secuencia (tambien denominada "discordancia") no se hibridaran. En un aspecto muy preferido, las condiciones rigurosas son aquellas bajo las cuales las moleculas de ADN con mas del 15 % de discordancia no se hibridaran, y todavfa mas preferentemente las condiciones rigurosas son aquellas bajo las cuales las secuencias de ADN con mas del 10 % de discordancia no se hibridaran. Preferentemente, las condiciones rigurosas son aquellas bajo las cuales las secuencias de ADN con mas del 6 % de 50 discordancia no se hibridaran.

La degeneracion del codigo genetico amplia adicionalmente el alcance, ya que permite variaciones mayores de la secuencia de nucleotidos de una molecula de ADN, manteniendo al mismo tiempo la secuencia de aminoacidos de la protefna codificada. Por ejemplo, un residuo de aminoacido representativo es la alanina. Esta puede ser 55 codificada en el ADNc por el triplete de codon de nucleotidos GCT. Debido a la degeneracion del codigo genetico, otros tres tripletes de codon de nucleotidos --GCT, GCC y GCA- tambien codifican alanina. De esta manera, la secuencia de nucleotidos del gen podrfa cambiarse en esta posicion a cualquiera de estos tres codones sin afectar a la composicion de aminoacidos de la protefna codificada o a las caracterfsticas de la protefna. El codigo genetico y las variaciones de los codones de nucleotidos para aminoacidos particulares son muy conocidos para el experto en 60 la materia. Basandose en la degeneracion del codigo genetico, se pueden derivar moleculas de ADN variantes a

partir de las moleculas de ADNc descritas en el presente documento usando las tecnicas estandares de mutagenesis de ADN que se describen anteriormente, o por sfntesis de secuencias de ADN. Las secuencias de ADN que no se hibridan bajo condiciones rigurosas con las secuencias de ADNc descritas, en virtud de la variacion de secuencia basada en la degeneracion del codigo genetico, estan incluidas aquf por esta descripcion.

5

Tambien se describen las secuencias de ADN que codifican una lisina en la presente invencion, que incluyen lisinas Cpl-1 y/o Pal dimericas, cuyas secuencias codifican un polipeptido que tiene la misma secuencia de aminoacidos provista en las Figuras y en la Tabla 1, pero que son degeneradas para las mismas. Por "degeneradas" se entiende que se usa un codon de tres letras diferente para especificar un aminoacido particular.

10

Aunque el sitio para introducir una variacion en la secuencia de aminoacidos puede ser predeterminado, no es necesario predeterminar la mutacion per se. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se puede realizar mutagenesis aleatoria en el codon o region diana, y las variantes de protefna expresadas se criban para determinar la combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para hacer mutaciones de 15 sustitucion en sitios predeterminados del ADN que tiene una secuencia conocida como se describe anteriormente son muy conocidas.

Normalmente las sustituciones de aminoacidos son de residuos individuales, o pueden ser de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoacidos; y las supresiones variaran aproximadamente de 1 a 30 residuos. Las supresiones o 20 inserciones pueden ser en una forma individual, pero preferentemente se hacen en pares adyacentes, es decir, una supresion de 2 residuos o insercion de 2 residuos. Las sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinacion de las mismas se pueden combinar para llegar a un constructo final. Obviamente, las mutaciones que se hacen en el ADN que codifica la protefna no deben poner la secuencia fuera del marco de lectura, y preferentemente no crean regiones complementarias que pudieran producir una estructura secundaria de ARNm (EP 25 75.444A).

Las variantes de sustitucion son aquellas en las que por lo menos un residuo de la secuencia de aminoacidos se ha eliminado y un residuo diferente se inserta en su lugar. Estas sustituciones se pueden hacer para no generar un efecto significativo sobre las caracterfsticas de la protefna, o cuando se desea modular finamente las caracterfsticas 30 de la protefna. Los aminoacidos que se pueden sustituir por un aminoacido original en una protefna y que se consideran como sustituciones conservativas se describen arriba y seran reconocidos por el experto en la materia.

Se pueden hacer cambios sustanciales en la funcion o identidad inmunologica, seleccionando sustituciones que son menos conservativas, por ejemplo seleccionando residuos que difieren mas significativamente en su efecto sobre el 35 mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto de polipeptido en el area de sustitucion, por ejemplo, una conformacion de lamina o helicoidal; (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana; o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios mas grandes en las propiedades de la protefna seran aquellos en los que: (a) un residuo hidrofilo, p. ej., serilo o treonilo, es sustituido por un residuo hidrofobo, p. ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistefna o prolina es sustituida 40 por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, p. ej., lisilo, arginilo o histadilo, es sustituido por un residuo electronegativo, p. ej., glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, p. ej., fenilalanina, es sustituido por uno que no tiene una cadena lateral, p. ej., glicina.

Los efectos de estas sustituciones o supresiones o adiciones de aminoacidos se pueden evaluar para derivados o 45 variantes del/los polipeptido(s) lftico(s) analizando la capacidad de las protefnas derivadas o variantes para lisar o destruir las bacterias susceptibles, o para complementar la sensibilidad a los agentes de reticulacion de ADN exhibida por los fagos en huespedes bacterianos infectados. Estos ensayos se pueden efectuar transfectando moleculas de ADN que codifican las protefnas derivadas o variantes en las bacterias como se describe anteriormente, o incubando bacterias con las protefnas expresadas de huespedes transfectados con las moleculas 50 de ADN que codifican las protefnas derivadas o variantes.

Aunque el sitio para introducir una variacion en la secuencia de aminoacidos puede ser predeterminado, no es necesario predeterminar la mutacion per se. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se puede realizar mutagenesis aleatoria en el codon o region diana, y las variantes de protefna expresadas se 55 criban para determinar la combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para hacer mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados del ADN que tiene una secuencia conocida como se describe anteriormente son muy conocidas.

Otra caracterfstica de esta invencion es la expresion de las secuencias de ADN que codifican lisinas dimericas 60 descritas en el presente documento. Como es bien conocido en la tecnica, las secuencias de ADN se pueden

expresar ligandolas operativamente a una secuencia de control de expresion en un vector de expresion apropiado y, despues, utilizar ese vector de expresion para transformar un huesped unicelular apropiado. Este enlazamiento operativo de una secuencia de ADN de esta descripcion a una secuencia de control de expresion, desde luego, incluye, si todavfa no es parte de la secuencia de ADN, la provision de un codon de iniciacion, ATG, en el marco de 5 lectura correcto en direccion de la secuencia de ADN. Se puede utilizar una extensa variedad de combinaciones de huesped/vector de expresion para expresar las secuencias de ADN de esta descripcion. Los vectores de expresion utiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosomicas, no cromosomicas y sinteticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plasmidos bacterianos conocidos, p. ej., los plasmidos E. coli, colEl, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plasmidos tales como RP4; ADN de fago, p. ej., los 10 muchos derivados del fago A, p. ej., NM989, y otro ADN de fago, p. ej., M13 y ADN de fago filamentoso de una sola cadena; plasmidos de levadura tales como el plasmido 2: o derivados de los mismos; vectores utiles en celulas eucariotas, tales como vectores utiles en celulas de insecto o mamffero; vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fago, tales como plasmidos que han sido modificados para utilizar ADN de fago u otras secuencias de control de expresion; y similares.

15

En estos vectores, se puede usar cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresion -- secuencias que controlan la expresion de una secuencia de ADN operativamente enlazadas a ella-- para expresar secuencias de ADN de esta descripcion. Tales secuencias de control de la expresion utiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardfos del SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el 20 sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones importantes de operador y promotor del fago A, las regiones de control de la protefna de cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolfticas, los promotores de la fosfatasa acida (p. ej., Pho5) los promotores de los factores a de apareamiento de la levadura, y otras secuencias conocidas para el control de la expresion de genes de celulas procariotas y eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos.

25

Una amplia variedad de celulas huesped unicelulares tambien son utiles para expresar las secuencias de ADN de esta descripcion. Estos huespedes pueden incluir huespedes eucariotas y procariotas muy conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras y celulas de animal, tales como celulas CHO, R1.1, B-W y L-M, celulas de rinon de mono verde africano (p. ej., COS 1 , COS 7, BSC1 , BSC40 30 y BMT10), celulas de insecto (p. ej., Sf9) y celulas humanas y celulas de plantas en cultivo de tejido.

Se entendera que no todos los vectores, secuencias de control de expresion y huespedes funcionaran igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la descripcion. Tampoco todos los huespedes funcionaran igualmente bien con el mismo sistema de expresion. Sin embargo, el experto en la materia sera capaz de seleccionar los 35 vectores, secuencias de control de expresion y huespedes adecuados sin mayor experimentacion para obtener la expresion deseada.

Se pueden usar bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificadora de un polipeptido para generar una poblacion abigarrada de polipeptidos para cribado y subsiguiente seleccion de variantes. Por ejemplo, se puede 40 generar una biblioteca de fragmentos de secuencia codificadora tratando un fragmento de PCR de doble cadena de la secuencia codificadora de interes con una nucleasa, bajo condiciones donde ocurre corte solo aproximadamente una vez por molecula, desnaturalizando el ADN de doble cadena, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble cadena que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos cortados, quitando porciones de una sola cadena de los duplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligando la coleccion de los fragmentos 45 resultantes en un vector de expresion. Mediante este procedimiento se puede derivar una biblioteca de expresion que codifica fragmentos de extremos N-terminales e internos de varios tamanos de la protefna de interes.

Se conocen varios procedimientos en la tecnica para el cribado de productos genicos de bibliotecas combinatoriales fabricadas mediante mutaciones o truncamientos puntuales y para el cribado de genotecas de ADNc para productos 50 genicos que tienen una propiedad seleccionada. Habitualmente, las tecnicas usadas mas ampliamente, que son susceptibles de analisis de alto rendimiento, para el cribado de genotecas grandes incluyen la clonacion de la genoteca en vectores de expresion replicables, la transformacion de las celulas apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresion de los genes combinatoriales en condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto. La mutagenesis de 55 ensamblado recursivo (REM), una tecnica que incrementa la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinacion con los ensayos de cribado para identificar variantes de una protefna (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815;Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Composiciones

De acuerdo con la invencion se proporcionan composiciones terapeuticas o farmaceuticas que comprenden la(s) enzima(s)/polipeptido(s) lftico(s) dimerico(s) de la invencion, asf como tambien procedimientos de uso y procedimientos de fabricacion relacionados. Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas pueden comprender uno o mas polipeptidos lfticos dimericos, y opcionalmente incluyen enzimas lfticas truncadas, quimericas o 5 barajadas, combinadas opcionalmente con otros componentes tales como un vehfculo, polipeptido, polinucleotido, protefna(s) holina, uno o mas antibioticos o excipientes, o vehfculos adecuados. La descripcion provee composiciones terapeuticas o composiciones farmaceuticas de las lisinas de la invencion, que incluyen Cpl-1 dimericas, y Cpl-1C45S,D324C de realizacion, para usarse en la destruccion, alivio, descolonizacion, profilaxis o tratamiento de bacterias gram positivas, que incluyen infecciones bacterianas o afecciones relacionadas. Tambien 10 se describen composiciones terapeuticas o composiciones farmaceuticas de las lisinas de la invencion, que incluyen Pal dimericas, y PalD280C de realizacion, para usarse en la destruccion, alivio, descolonizacion, profilaxis o tratamiento de bacterias gram positivas, que incluyen infecciones bacterianas o afecciones relacionadas. Las composiciones que comprenden lisinas dimericas, particularmente Pal dimerica o Cpl-1 dimerica, o combinaciones de las mismas, incluyendo productos truncados o variantes de las mismas, tal como se provee en este documento 15 para usarse en la destruccion, alivio, descolonizacion, profilaxis o tratamiento de bacterias gram positivas, que incluyen infecciones bacterianas o afecciones relacionadas, en particular de Streptococcus.

La invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina para uso en el tratamiento de un mamffero que padece una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de 20 estreptococos o para la descolonizacion de estreptococos en un mamffero que padece de o esta en riesgo de contraer una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de estreptococos donde la lisina es una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre si, donde dicho dfmero posee actividad destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 25 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre si por un enlace disulfido y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

La(s) enzima(s) o polipeptido(s) incluidos en las composiciones terapeuticas pueden ser una o mas de, o cualquier combinacion de, enzima(s) lftica(s) dimerica(s) asociada(s) con fago, polipeptidos lfticos dimericos truncados, 30 polipeptido(s) lftico(s) dimerico(s) variantes, y enzimas lfticas dimericas y quimericas y/o barajadas. Adicionalmente se pueden utilizar diferentes polipeptidos lfticos codificados geneticamente por un fago diferente para el tratamiento de la misma bacteria. Estas enzimas lfticas pueden ser tambien cualquier combinacion de enzimas o polipeptidos lfticos dimericos "no alterados", polipeptido(s) lftico(s) dimerico(s) truncado(s), polipeptido(s) lftico(s) dimerico(s) variantes, y enzimas lfticas dimericas quimericas y barajadas. El/los/la(s) enzima(s)/polipeptido(s) lftico(s) en una 35 composicion terapeutica o farmaceutica para bacterias gram positivas, que incluyen Streptococcus, se pueden usar solos o en combinacion con antibioticos o agentes bactericidas o bacteriostaticos o, si hay otros organismos bacterianos invasores por tratar, en combinacion con otras enzimas lfticas asociadas a fago especffico para otras bacterias diana. La enzima lftica, enzima truncada, enzima variante, enzima quimerica, y/o enzima lftica barajada se puede usar en conjunto con una protefna holina. La cantidad de la protefna holina tambien se puede variar. 40 Opcionalmente se pueden incluir varios antibioticos en la composicion terapeutica con las enzimas o polipeptidos, con o sin la presencia de lisostafina. Se puede incluir mas de una enzima o polipeptido lftico en la composicion terapeutica.

La composicion farmaceutica tambien puede incluir una o mas enzimas lfticas dimericas, que incluyen isozimas, 45 analogos o variantes de las mismas, producidas mediante sfntesis qufmica o tecnicas de ADN recombinante. En particular, la protefna lftica alterada se puede producir por sustitucion, supresion, truncamiento, quimerizacion o barajado de aminoacidos, o combinaciones de los mismos. La composicion farmaceutica puede contener una combinacion de una o mas protefnas lfticas dimericas y una o mas protefnas lfticas truncadas, variantes, quimericas o barajadas. La composicion farmaceutica tambien puede contener un peptido o fragmento de peptido de por lo 50 menos una protefna lftica dimerica derivada de la misma especie de bacteria o de una diferente, con una adicion opcional de uno o mas agentes complementarios, y un vehfculo o diluente farmaceuticamente aceptable.

La presente descripcion provee lisinas dimericas bacterianas, particularmente lisinas dimericas generadas de forma recombinante de lisinas monomericas naturales que incluyen una variante de polipeptido de lisina Cpl-1 que posee 55 actividad destructiva bacteriana. La invencion describe mutantes de lisina Cpl-1 que contienen cistefnas mutantes para la dimerizacion y la retencion de la actividad antibacteriana gram positiva. Se provee aquf una composicion que comprende una lisina de Streptococcus dimerica, que incluye una lisina mutante Cpl-1 dimerica, que tiene una actividad destructiva igual o mayor contra las celulas de Streptococcus, en comparacion con la protefna lisina Cpl-1 no mutada y monomerica, que incluye las lisinas Cpl-1 y Cpl-1C45S,D342C dimericas.

La presente descripcion provee lisinas dimericas bacterianas, particularmente lisinas dimericas generadas de forma recombinante de lisinas monomericas naturales que incluyen una variante de polipeptido de lisina Pal que posee actividad destructiva bacteriana. La invencion describe mutantes de lisina Pal que contienen cistefnas mutantes para la dimerizacion y la retencion de la actividad antibacteriana gram positiva. Se provee aquf una composicion que 5 comprende una lisina de Streptococcus dimerica, que incluye una lisina mutante Pal dimerica, que tiene una actividad destructiva igual o mayor contra las celulas de Streptococcus, en comparacion con la protefna lisina Pal no mutada y monomerica, que incluye las lisinas Pal y PalD280C dimericas.

La composicion terapeutica tambien puede comprender una protefna holina. Las protefnas holinas (u "holinas") son 10 protefnas que producen agujeros en la membrana celular. Las protefnas holinas pueden formar lesiones letales de la membrana que interrumpen la respiracion celular de las bacterias. Igual que las protefnas lfticas, las protefnas holinas son codificadas y transportadas por un fago. De hecho, es muy comun para el codigo genetico de la protefna holina estar junto al codigo de la protefna lftica del fago, o incluso dentro del mismo. La mayorfa de las secuencias de protefna holina son cortas y en general de naturaleza hidrofoba, con un dominio carboxi-terminal muy hidrofilo. En 15 muchos casos, la protefna holina putativa es codificada en un marco de lectura diferente dentro del dominio enzimaticamente activo del fago. En otros casos, la protefna holina es codificada en el ADN adyacente o cercano al ADN que codifica la protefna lftica de pared celular. Las protefnas holinas son sintetizadas frecuentemente durante la ultima etapa de la infeccion del fago y se encuentran en la membrana citoplasmica en donde causan lesiones de la membrana. Las holinas se pueden agrupar en dos clases generales basandose en un analisis de la estructura 20 primaria. Las holinas de clase I son normalmente de 95 residuos o mas grandes y pueden tener tres dominios de transmembrana potenciales. Las holinas de clase II normalmente son mas pequenas, aproximadamente 65-95 residuos, con la distribucion de residuos cargados e hidrofobos indicando dos dominios TM (Young, y col. Trends in Microbiology v. 8, No. 4, March 2000). Por lo menos para los fagos de los huespedes gram positivos, sin embargo, el sistema de lisis de componente doble puede no ser universal. Aunque la presencia de las holinas ha sido mostrada o 25 sugerida para varios fagos, todavfa no se han encontrado genes que codifican holinas putativas para todos los fagos. Se ha demostrado que las holinas estan presentes en varias bacterias que incluyen, por ejemplo, bacteriofago lactococico Tuc2009, lactococico NLC3, bacteriofago neumococico EJ-1, bacteriofago de Lactobacillus gasseri Nadh, bacteriofago de Staphylococcus aureus Towrt, bacteriofagos de Listeria monocytogenes, fago neumococico Cp-1, fago de Bacillus subtillis M29, lisina LL-H de bacteriofago de Lactobacillus delbrueckki, y bacteriofago N 11 de 30 Staphylococcus aureus. (Loessner, y col., Journal of Bacteriology, August 1999, p. 4452-4460).

Por ejemplo, las protefnas holinas se pueden usar en conjunto con las enzimas lfticas para acelerar la velocidad y eficiencia a la que son destruidas las bacterias. Las protefnas holinas tambien pueden estar en forma de enzimas quimericas y/o barajadas. Las protefnas holinas tambien se pueden usar solas en el tratamiento de infecciones 35 bacterianas de acuerdo con algunos aspectos.

La composicion farmaceutica puede contener un agente complementario que incluye uno o mas agentes antimicrobianos y/o uno o mas antibioticos convencionales. Para acelerar el tratamiento de la infeccion, el agente terapeutico puede incluir adicionalmente por lo menos un agente complementario que tambien puede potenciar la 40 actividad bactericida de la enzima lftica. Los antimicrobianos actuan principalmente alterando la estructura o funcion de una celula bacteriana por inhibicion de la sfntesis de la pared celular, inhibicion de la funcion de la membrana celular, y/o inhibicion de las funciones metabolicas, incluso la sfntesis de protefna y ADN. Los antibioticos se pueden subclasificar ampliamente en los que afectan a la biosfntesis de peptidoglucano de la pared celular y los que afectan a la sfntesis de ADN o protefna en bacterias gram positivas. Los inhibidores de la sfntesis de la pared celular, que 45 incluyen penicilina y antibioticos similares, interrumpen la pared celular externa rfgida de tal manera que la celula relativamente sin soporte se hincha y finalmente se rompe. Los antibioticos que afectan a la biosfntesis de peptidoglucano de la pared celular incluyen: glicopeptidos que inhiben la sfntesis de peptidoglucano impidiendo la incorporacion de acido N-acetilmuramico (NAM) y subunidades de N-acetilglucosamina (NAG) de peptido a la matriz de peptidoglucano. Los glicopeptidos disponibles incluyen vancomicina y teicoplanina; que actuan inhibiendo la 50 formacion de reticulaciones de peptidoglucano. El grupo funcional de penicilinas, el resto p-lactama, se une a la DD- transpeptidasa que enlaza las moleculas de peptidoglucano en las bacterias, y la inhibe. Las enzimas hidrolfticas continuan rompiendo la pared celular, causando citolisis o muerte debido a la presion osmotica. Las penicilinas comunes incluyen oxacilina, ampicilina y cloxacilina; y polipeptidos que alteran la desfosforilacion de la C55- isopenilpirofosfato, una molecula que lleva bloques de construccion de peptidoglucano fuera de la membrana 55 plasmatica. Un polipeptido que tiene impacto sobre la pared celular es la bacitracina.

El agente complementario puede ser un antibiotico, tal como eritromicina, claritromicina, azitromicina, roxitromicina, y otros miembros de la familia de los macrolidos, penicilinas, cefalosporinas, y cualquier combinacion de las mismas en cantidades que son eficaces para mejorar sinergicamente el efecto terapeutico de la enzima lftica. El antibiotico o 60 agente(s) bactericida(s) o bacteriostatico(s) pueden estar en concentraciones o en cantidades con el fin de provocar

la viabilidad o crecimiento bacteriano o pueden tener sub-MIC o bien estar por debajo de la concentracion inhibitoria minima que alcanza o a la que asciende. Virtualmente se puede usar cualquier otro antibiotico con la enzima litica alterada y/o no alterada. Similarmente, se pueden incluir otras enzimas lfticas en el vehiculo para tratar otras infecciones bacterianas. Se pueden usar suplementos de antibioticos virtualmente en todos los usos de la enzima 5 cuando se tratan diferentes enfermedades. La composicion farmaceutica tambien puede contener un peptido o un fragmento de peptido de por lo menos una protefna litica, una protefna holina, o por lo menos una protefna holina y una litica, cada una de estas protefnas litica y holina derivada de las mismas especies bacterianas o de diferentes, con la adicion opcional de agentes complementarios y un vehiculo o diluente adecuado.

10 Tambien se proveen composiciones que contienen moleculas de acido nucleico que, solas o en combinacion con otras moleculas de acido nucleico, son capaces de expresar una cantidad eficaz de un polipeptido lftico dimerico o un fragmento de peptido de un polipeptido lftico dimerico in vivo. Tambien se proveen cultivos celulares que contienen estas moleculas de acido nucleico, polinucleotidos y vectores que llevan y expresan estas moleculas in vitro e in vivo.

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Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas pueden comprender polipeptidos lfticos dimericos, incluso uno o mas polipeptido(s) de lisina dimerico(s) dirigidos contra las mismas, diferentes, o solapadas bacterias susceptibles, combinados con una variedad de vehfculos para tratar las enfermedades causadas por las bacterias gram positivas susceptibles. El vehiculo contiene adecuadamente cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que 20 mejoran la estabilidad e isotonicidad qufmica. Estos materiales son inocuos para los receptores, a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato, succinato, acido acetico y otros acidos organicos o sus sales; antioxidantes como acido ascorbico; polipeptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente diez residuos), p. ej., poliarginina o tripeptidos; protefnas tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; glicina; aminoacidos como acido glutamico, 25 acido aspartico, histidina o arginina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, trehalosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azucar como manitol o sorbitol; contraiones como sodio; agentes tensioactivos no ionicos como polisorbatos, poloxameros o polietilenglicol (PEG); y/o sales neutras, p. ej., NaCI, KCI, MgCl2, CaCl2, y otras. La glicerina o glicerol (1,2,3- propanotriol) esta disponible comercialmente para uso farmaceutico. Se puede diluir en agua esteril para inyeccion, 30 o inyeccion de cloruro de sodio, u otro fluido inyectable acuoso farmaceuticamente aceptable, y se usa a concentraciones del 0,1 al 100 % (v/v), preferentemente del 1,0 al 50 %, mas preferentemente a aproximadamente el 20 %. El DMSO es un disolvente aprotico con una capacidad notable para incrementar la penetracion de muchos farmacos aplicados localmente. El DMSO se puede diluir en agua esteril para inyeccion, o inyeccion de cloruro de sodio, u otro fluido inyectable acuoso farmaceuticamente aceptable, y se usa a concentraciones del 0,1 al 100 % 35 (v/v). El vehiculo tambien puede incluir solucion de Ringer, una solucion tamponada, y solucion de dextrosa, particularmente cuando se prepara una solucion intravenosa.

Cualquiera de los vehfculos para los polipeptidos lfticos dimericos se puede fabricar mediante los medios convencionales. Sin embargo, se prefiere que cualquier enjuague bucal o producto de tipo similar no contenga 40 alcohol para impedir la desnaturalizacion del polipeptido/enzima. Similarmente, en el procedimiento de fabricacion de pastillas para la tos, chicle, caramelo o pastilla disoluble con el polipeptido lftico, la introduccion de este se debe hacer antes del endurecimiento de la pastilla o caramelo pero despues de que la pastilla o caramelo se ha enfriado un poco, para evitar la desnaturalizacion por calor de la enzima.

45 Un polipeptido lftico dimerico se puede anadir a estas sustancias en forma lfquida o en un estado liofilizado, despues de lo cual se solubilizara al encontrar los fluidos corporales como la saliva. Los polipeptidos/enzimas tambien pueden estar en una micela o liposoma.

Las escalas de dosis o cantidades efectivas de un polipeptido/enzima litica dimerica para tratar la infeccion 50 dependeran en parte de si la enzima/polipeptido lftico dimerico se usara de manera terapeutica o profilactica, la duracion de exposicion del receptor a la bacteria infecciosa, el tamano y peso del individuo, etc. La duracion del uso de la composicion que contiene la enzima/polipeptido tambien depende de si el uso es para fines profilacticos, en donde el uso puede ser cada hora, cada dfa o cada semana, durante un periodo breve; o si el uso es para fines terapeuticos, donde el uso puede ser necesario en un regimen de uso mas intenso de la composicion, de tal manera 55 que el uso puede durar por horas, dfas o semanas, y/o en una periodicidad diaria, o a intervalos regulares durante el dfa. Cualquier forma de dosis utilizada debe proveer un numero mfnimo de unidades para una cantidad minima de tiempo. La concentracion de las unidades activas de enzima que se cree proveen una cantidad o dosis eficaz de enzima puede estar en la escala de aproximadamente 100 unidades/ml a aproximadamente 500.000 unidades/ml de fluido en el medio humedo o mojado de los conductos nasales y orales, y posiblemente en la escala de 60 aproximadamente 100 unidades/ml a aproximadamente 50.000 unidades/ml. Mas especfficamente, el tiempo de

exposicion a la enzima/polipeptido activo puede afectar la concentracion deseada de las unidades de enzima activa por ml. Los veldculos que se clasifican como veldculos de liberacion "prolongada "o "retardada" (tal como por ejemplo algunos aerosoles nasales o pastillas) podnan tener o proveer una concentracion mas baja de unidades de ingrediente activo (enzima) por ml, pero durante un periodo mas largo, mientras que un veldculo de liberacion "corta" 5 o "rapida" (tal como, por ejemplo un gargarismo) podna tener o proveer una concentracion alta de unidades de ingrediente activo (enzima) por ml, pero durante un periodo mas corto. La cantidad de unidades activas por ml y el tiempo de exposicion dependen de la naturaleza de la infeccion, de si el tratamiento es profilactico o terapeutico, y de otras variables. Existen situaciones en donde puede ser necesario tener una dosis de unidades/ml mucho mas alta, o una dosis de unidades/ml mas baja.

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La enzima/polipeptido lftico dimerico estana en un medio que tiene un pH que permita la actividad de la enzima/polipeptido lftico dimerico. Por ejemplo, si un individuo humano se expone a otro humano con un trastorno respiratorio superior bacteriano, la enzima/polipeptido lftico dimerico residira en el revestimiento de la mucosa e impedira cualquier colonizacion de la bacteria infecciosa. Antes de poner la enzima lftica dimerica en el sistema 15 veldculo o modo de administracion oral, se prefiere que la enzima este en un medio tamponado estabilizador para mantener el pH en una escala de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 9,0, mas preferentemente entre 5,5 y aproximadamente 7,5.

Un tampon estabilizador puede permitir la actividad optima de la enzima lisina/polipeptido dimerico. El tampon puede 20 contener un reactivo reductor, tal como ditiotreitol. El tampon estabilizador tambien puede ser, o incluir, un reactivo quelante de metal, tal como la sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico, o tambien puede contener un tampon de fosfato o citrato-fosfato, o cualquier otro tampon. El ADN que codifica estos fagos y otros fagos puede ser alterado para permitir que una enzima recombinante ataque una pared celular en mas de dos sitios, para permitir que la enzima recombinante corte la pared celular de mas de una especie de bacterias, para permitir que la enzima 25 recombinante ataque otras bacterias, o cualquier combinacion de las mismas. El tipo y numero de alteraciones de una enzima recombinante producida por bacteriofago son incalculables.

Se puede incluir un agente tensioactivo suave en una composicion terapeutica o farmaceutica, en una cantidad eficaz para potenciar el efecto terapeutico de la enzima/polipeptido lftico dimerico, que se pueda usar en una 30 composicion. Los agentes tensioactivos suaves adecuados incluyen, entre otros, esteres de polioxietilensorbitan y acidos grasos (la serie Tween), octilfenoxipolietoxietanol (serie Triton-X), n-octil-beta-D-glucopiranosido, n-octil-beta- D-tioglucopiranosido, n-decil-beta-D-glucopiranosido, n-dodecil-beta-D-glucopiranosido, y agentes tensioactivos que se dan biologicamente, p.ej., acidos grasos, gliceridos, monogliceridos, desoxicolato y esteres de desoxicolato.

35 En esta invencion tambien se pueden usar conservantes, y comprenden preferentemente y aproximadamente del 0,05 % al 0,5 % en peso de la composicion total. El uso de conservantes asegura que, si el producto se contamina microbianamente, la formulacion impedira o disminuira el crecimiento del microorganismo. Algunos conservantes utiles en esta invencion incluyen alcohol bendlico, metilparabeno, propilparabeno, butilparabeno, cloroxilenol, benzoato sodico, DMDM hidantoma, carbamato de 3-yodo-2-propilbutilo, sorbato de potasio, digluconato de 40 clorhexidina, o una combinacion de los mismos.

Los agentes o sustancias farmaceuticas para uso en todos los aspectos de la invencion incluyen agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes anestesicos locales, corticosteroides, agentes de terapia destructiva, antimicoticos y antiandrogenos. En el tratamiento del acne, los agentes 45 farmaceuticos activos que se pueden usar incluyen agentes antimicrobianos, especialmente los que tienen propiedades antiinflamatorias, tales como dapsona, eritromicina, minociclina, tetraciclina, clindamicina y otros agentes antimicrobianos. Los porcentajes en peso preferidos de los antimicrobianos son de 0,5 % a 10 %.

Los anestesicos locales incluyen tetracama, clorhidrato de tetracama, lidocama, clorhidrato de lidocama, diclonina, 50 clorhidrato de diclonina, clorhidrato de dimetisoqum, dibucama, clorhidrato de dibucama, butambenpicrato y clorhidrato de pramoxina. Una concentracion preferida de anestesicos locales es de 0,025 % a 5 % en peso de la composicion total. Tambien se pueden usar anestesicos como benzocama, a una concentracion preferida de aproximadamente 2 % a 25 % en peso.

55 Los corticosteroides que se pueden usar incluyen dipropionato de betametasona, fluocinolona actinida, valerato de betametasona, triamcinolona actinida, propionato de clobetasol, desoximetasona, diacetato de diflorasona, amcinonida, flurandrenolida, valerato de hidrocortisona,y butirato de hidrocortisona, y desonida; se recomiendan a concentraciones de aproximadamente 0,01 % a 1,0 % en peso. Las concentraciones preferidas de corticosteroides como hidrocortisona o acetato de metilprednisolona son de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 5,0 % en 60 peso.

Adicionalmente, la composicion terapeutica puede comprender otras enzimas, tales como la enzima lisostafina, para el tratamiento de cualquier bacteria de Staphylococcus aureus presente junto con las bacterias gram positivas susceptibles. Se ha sugerido que peptidos mucoftticos tales como lisostafina son eficaces en el tratamiento de 5 infecciones de S. aureus en humanos (Schaffner y col., Yale J. Biol. & Med., 39:230 (1967). La lisostafina, un producto genico de Staphylococcus simulans, ejerce un efecto bacteriostatico y bactericida sobre S. aureus degradando enzimaticamente las reftculas de poliglicina de la pared celular (Browder y col., Res. Comm., 19: 393400 (1965)). La patente de EE. UU. con n.° 3.278.378 describe procedimientos de fermentacion para producir lisostafina a partir de medio de cultivo de S. staphylolyticus, mas tarde renombrada S. simulans. Otros 10 procedimientos para producir lisostafina se describen adicionalmente en las patentes de EE. UU. n.° 3.398.056y n.°3.594.284. El gen de lisostafina se clono y secuencio subsiguientemente (Recsei y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1127-1131 (1987)). La protema bactericida mucofttica recombinante, tal como r-lisostafina, puede superar potencialmente los problemas asociados con la terapia de antibiotico actual debido a su especificidad dirigida, baja toxicidad y posible reduccion de residuos biologicamente activos. Ademas, la lisostafina tambien es activa contra 15 celulas que no estan en division, mientras que la mayona de antibioticos requieren celulas que se dividen activamente para mediar sus efectos [Dixon y col., Yale J. Biology and Medicine, 41: 62-68 (1968))]. La lisostafina, en combinacion con la enzima lftica alterada, pueden usarse en presencia o ausencia de antibioticos. Existe un grado de importancia anadida en el uso tanto de lisostafina como de la enzima lisina en el mismo agente terapeutico. Frecuentemente, cuando un humano tiene una infeccion bacteriana, la infeccion de un genero de bacterias debilita al 20 cuerpo humano o cambia la flora bacteriana del cuerpo, permitiendo que otras bacterias potencialmente patogenas infecten el cuerpo. Una de las bacterias que algunas veces infecta conjuntamente el cuerpo es Staphylococcus aureus. Muchas cepas de Staphylococcus aureus producen penicilinasa, de tal manera que Staphylococcus, Streptococcus, y otras cepas bacterianas gram positivas no seran destruidas con los antibioticos estandares. Consecuentemente, el uso de la lisina y lisostafina, posiblemente en combinacion con antibioticos, puede servir 25 como el tratamiento mas rapido y efectivo en las infecciones bacterianas. Una composicion terapeutica tambien puede incluir mutanolisina y lisozima. Una composicion antibacteriana o terapeutica puede comprender combinaciones de peptidos ftticos dimericos, tales como combinaciones de dfmero Cpl-1 y dfmero Pal.

Los medios de aplicacion de la composicion terapeutica que comprende una enzima/polipeptido lftico dimerico 30 incluyen, pero sin limitacion, medios directos, indirectos, de vetftculo, y especiales, o cualquier combinacion de los medios. La aplicacion directa de la enzima/polipeptido lftico dimerico puede ser mediante cualquier procedimiento adecuado para llevar directamente el polipeptido en contacto con el sitio de infeccion o colonizacion bacteriana, tal como el area nasal (por ejemplo, aerosoles nasales), aplicaciones dermicas o cutaneas (por ejemplo unguentos o formulaciones topicas), supositorios, aplicaciones de tampon, etc. Las aplicaciones nasales incluyen, por ejemplo, 35 aerosoles nasales, gotas nasales, unguentos nasales, lavados nasales, inyecciones nasales, taponamientos nasales, aerosoles e inhaladores bronquiales, o indirectamente utilizando pastillas para la garganta, enjuagues bucales o gargarismos, o utilizando unguentos aplicables en las fosas nasales o la cara, o cualquier combinacion de estos procedimientos de aplicacion y otros similares. Las formas en las que la enzima lftica dimerica se puede administrar incluyen, pero sin limitacion, pastillas, pastillas disolubles, caramelos, inyectables, gomas de mascar, 40 comprimidos, polvos, ftquidos pulverizados, ftquidos, unguentos y aerosoles.

Cuando la enzima/polipeptido lftico dimerico se introduce directamente utilizando aerosoles, gotas, unguentos, lavados, inyecciones, taponamientos e inhaladores, preferentemente la enzima esta en un medio ftquido o gel, con el ftquido actuando como el vetftculo. Una version anhidra seca de la enzima alterada se puede administrar por medio 45 del inhalador y aerosol bronquial, aunque se prefiere una forma ftquida de administracion.

Una composicion que comprende una enzima/polipeptido lftico dimerico se puede administrar en forma de un caramelo, goma de mascar, pastilla, pastilla que se disuelve, comprimido, polvo, aerosol, ftquido, aerosol ftquido o pasta de dientes, para la prevencion o tratamiento de infecciones bacterianas asociadas con enfermedades del 50 aparato respiratorio superior. La pastilla, comprimido o goma de mascar en la que se agrega la enzima/polipeptido lftico dimerico puede contener azucar, jarabe de mafz, una variedad de colorantes, edulcorantes diferentes del azucar, saborizantes, cualquier aglutinante, o combinaciones de los mismos. Similarmente, cualquier producto basado en goma de mascar puede contener acacia, cera carnauba, acido cftrico, almidon de mafz, colorantes de alimentos, saborizantes, edulcorantes diferentes del azucar, gelatina, glucosa, glicerina, base de goma, goma laca, 55 sacarina de sodio, azucar, agua, cera blanca, celulosa, otros aglutinantes, y combinaciones de los mismos. Las pastillas pueden contener tambien sacarosa, almidon de mafz, acacia, goma de tragacanto, anetol, aceite de linaza, oleorresina, aceite mineral y celulosa, otros aglutinantes y combinaciones de los mismos. Tambien se pueden usar sustitutos de azucar en lugar de dextrosa, sacarosa, u otros azucares.

60 Las composiciones que comprenden las enzimas ftticas dimericas o sus fragmentos de peptido dimerico se pueden

dirigir al revestimiento de la mucosa en donde, en residencia, destruiran las bacterias colonizadoras de la enfermedad. El revestimiento de la mucosa, como se divulga y describe en el presente documento, incluye por ejemplo el aparato respiratorio superior e inferior, el ojo, la cavidad bucal, la nariz, recto, vagina, cavidad periodontal, intestinos y colon. Debido a los mecanismos naturales de eliminacion o limpieza de los tejidos mucosales, las formas 5 de dosis convencionales no son retenidas en el sitio de aplicacion durante un tiempo significativo.

Puede ser conveniente tener materiales que exhiban adhesion a los tejidos mucosales, para ser administrados con una o mas enzimas de fago y otros agentes complementarios durante un tiempo. Los materiales que tienen capacidad de liberacion controlada son particularmente convenientes, y el uso de mucoadhesivos de liberacion 10 sostenida ha recibido una atencion considerable. J. R. Robinson (la patente de EE. UU. con n.° 4.615.697) ofrece una buena revision de las diversas composiciones polimericas de liberacion controlada usadas en el suministro mucosal de farmacos. La patente describe una composicion para tratamiento de liberacion controlada que incluye un bioadhesivo y una cantidad efectiva de agente de tratamiento. El bioadhesivo es un polfmero reticulado, carboxi- funcional, fibroso, hinchable en agua pero insoluble en la misma, que contiene (a) una pluralidad de unidades 15 repetidas de las cuales por lo menos aproximadamente el 80 por ciento contienen al menos una funcionalidad carboxilo, y (b) aproximadamente del 0,05 a aproximadamente el 1,5 por ciento de agente de reticulacion sustancialmente libre de polieter de polialquenilo. Aunque los polfmeros de Robinson son hinchables pero insolubles en agua, estan reticulados, no son termoplasticos y no son faciles de formular con agentes activos y en las diversas formas de dosis como los sistemas de copolfmero de la presente solicitud. Tambien se pueden usar micelas y 20 micelas multilaminares para controlar la liberacion de la enzima.

Se conocen otras propuestas que incluyen mucoadhesivos que son la combinacion de materiales hidrofilos e hidrofobos. OrahesiveRTM de E.R. Squibb & Co es un adhesivo formado por una combinacion de pectina, gelatina y carboximetilcelulosa de sodio en un polfmero de hidrocarburo viscoso, para adherirse a la mucosa oral. Sin 25 embargo, estas mezclas ffsicas de componentes hidrofilos e hidrofobos finalmente se separan. En contraste, los dominios hidrofilo e hidrofobo en esta solicitud producen un copolfmero insoluble. La patente de EE. UU. con n.° 4.948.580 describe un sistema de suministro oral de farmaco de bioadhesivo. La composicion incluye una mezcla de polfmero liofilizada formada del copolfmero poli(eter metilvinflico/anhfdrido maleico) y gelatina, disperso en una base de unguento como aceite mineral que contiene polietileno disperso. La patente de Ee. UU. con n.° 30 5.413.792describe preparaciones de tipo pasta que comprenden (A) una base de tipo pasta que comprende un poliorganosiloxano y un material polimerico soluble en agua, que esta presente preferentemente en una relacion en peso de 3:6 a 6:3, y (B) un ingrediente activo. La patente de EE. UU. con n.° 5.554.380 reivindica un sistema de suministro de farmaco semisolido bioadherente, ingerible oralmente, que contiene un sistema de agua en aceite que tiene por lo menos dos fases. Una fase comprende de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 % en 35 volumen de una fase hidrofila interna, y la otra fase comprende de aproximadamente el 23 % a aproximadamente el 75 % en volumen de una fase hidrofoba externa, donde la fase hidrofoba externa esta comprendida de tres componentes: (a) un emulsionante, (b) un ester de glicerido, y (c) un material de cera. La patente de EE. UU. con n.° 5.942.243 describe algunos materiales de liberacion representativos utiles para administrar agentes antibacterianos.

40 Las composiciones terapeuticas o farmaceuticas tambien pueden contener mucoadhesivos polimericos que incluyen un copolfmero de injerto, que comprende una cadena principal hidrofila y cadenas de injerto hidrofobas para la liberacion controlada de agentes biologicamente activos. El copolfmero de injerto es un producto de reaccion de (1) un macromonomero de poliestireno que tiene un grupo funcional etilenicamente insaturado, y (2) por lo menos un monomero de acido hidrofilo que tiene un grupo funcional etilenicamente insaturado. La cadena de injerto consiste 45 esencialmente en poliestireno, y la cadena de polfmero principal de restos monomericos hidrofilos, algunos de los cuales tienen funcionalidad acida. El porcentaje en peso del macromonomero de poliestireno en el copolfmero de injerto es entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 20 %, y el porcentaje en peso del total de monomero hidrofilo en el copolfmero de injerto es entre el 80 % y el 99 %, y donde por lo menos el 10 % de dicho total de monomero hidrofilo es acido, dicho copolfmero de injerto cuando esta completamente hidratado tiene un contenido 50 de agua en equilibrio de por lo menos el 90 %. Las composiciones que contienen los copolfmeros se hidratan gradualmente por sorcion de fluidos de tejido en el sitio de la aplicacion para producir una masa de tipo gelatina muy suave que exhibe adhesion a la superficie de la mucosa. Durante el periodo en que la composicion se adhiere a la superficie de la mucosa, provee la liberacion sostenida del agente farmacologicamente activo, que es absorbido por el tejido mucosal.

55

Las composiciones de esta solicitud pueden contener opcionalmente otros materiales polimericos, tales como plastificantes de poli(acido acrflico), poli(vinilpirrolidona), y plastificantes de carboximetilcelulosa de sodio, y otros excipientes farmaceuticamente aceptables en cantidades que no causan efecto nocivo sobre la mucoadhesividad de la composicion.

60

Las formas de dosis de las composiciones de esta invencion se pueden preparar mediante los procedimientos convencionales. En los casos en donde la inyeccion intramuscular es el modo de administracion elegido, preferentemente se usa una formulacion isotonica. Generalmente, los aditivos de isotonicidad pueden incluir clorudo de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotonicas como solucion 5 salina tamponada de fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albumina. Se puede agregar un agente de vasoconstriccion a la formulacion. Las preparaciones farmaceuticas de acuerdo con esta solicitud se proveen esteriles y libres de pirogenos.

Una enzima/polipeptido lftico dimerico de la invencion tambien se puede administrar por via parenteral. Por ejemplo, 10 la enzima/polipeptido lftico dimerico se puede administrar por via intramuscular, intratecal, subdermica, subcutanea o intravenosa para tratar infecciones por bacterias gram positivas. En los casos en donde la inyeccion parenteral es el modo de administracion elegido, preferentemente se usa una formulacion isotonica. Generalmente, los aditivos de isotonicidad pueden incluir clorudo de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotonicas como solucion salina tamponada de fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albumina. 15 Se puede agregar un agente de vasoconstriccion a la formulacion. Las preparaciones farmaceuticas de acuerdo con esta solicitud se proveen esteriles y libres de pirogenos.

Para cualquier compuesto, la dosis terapeuticamente eficaz se puede calcular inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos de animal, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal tambien se usa 20 para obtener una escala de concentracion y via de administracion convenientes. Esta informacion se puede usar para determinar las dosis y vfas de administracion utiles para los humanos. La dosis exacta es elegida por el medico individual en vista del paciente a tratar. La dosis y la administracion se ajustan para proporcionar suficientes niveles del resto activo o para mantener el efecto deseado. Factores adicionales que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado patologico, la edad, peso y genero del paciente; la dieta, duracion deseada del tratamiento, 25 procedimiento de administracion, tiempo y frecuencia de administracion, la combinacion de farmacos, la sensibilidad de reaccion y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmaceuticas de accion prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 dfas, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la velocidad de eliminacion de la formulacion particular.

30 Las escalas o cantidades de dosis eficaces de la enzima/polipeptido lftico dimerico por administrar parenteralmente, y la duracion del tratamiento, dependeran en parte de la gravedad de la infeccion, el peso del paciente, particularmente humano, la duracion de la exposicion del receptor a la bacteria infecciosa, el numero de centfmetros cuadrados de piel o tejido que estan infectados, la profundidad de la infeccion y una variedad de otras variables. La composicion se puede aplicar en cualquier parte, desde una a varias veces al dfa, y se puede aplicar durante un 35 periodo corto o largo. El uso puede durar dfas o semanas. Cualquier forma de dosis utilizada debe proveer un numero mfnimo de unidades para una cantidad minima de tiempo. Se cree que la concentracion de las unidades activas de enzimas provee una cantidad o dosis eficaz de enzimas que puede seleccionarse segun sea apropiado. La cantidad de unidades activas por ml y la duracion del tiempo de exposicion dependen de la naturaleza de la infeccion y la cantidad de contacto que el vehfculo le permite a la enzima/polipeptido lftico.

40

Procedimientos y ensayos

La capacidad de destruccion bacteriana y, de hecho, la estabilidad significativamente mejorada, asf como la disminucion de la eliminacion en plasma exhibida por los polipeptidos de lisina de la invencion, proveen varios 45 procedimientos basados en la eficiencia antibacteriana de los polipeptidos de la invencion. De esta manera, la presente invencion contempla procedimientos antibacterianos que incluyen la lisina de la invencion para su uso en procedimientos para destruir bacterias gram positivas, para reducir una poblacion de bacterias gram positivas, para tratar o aliviar una infeccion bacteriana, para tratar a un sujeto humano expuesto a una bacteria patogena, y para tratar a un sujeto humano en riesgo de dicha exposicion. Las bacterias susceptibles pueden rapidamente ser 50 determinadas o confirmadas por el experto en la materia, demostrandose tambien aquf que se incluyen las bacterias de las que derivan originalmente las enzimas de fago de la invencion, Streptococcus pneumoniae, asf como tambien otras cepas bacterianas estreptococas. Tambien se describe la lisina de la invencion para uso en procedimientos para tratar diversas afecciones, lo que incluye procedimientos de tratamientos profilacticos de infecciones de estreptococos, tratamientos de infecciones de estreptococos, reduciendo la poblacion o el transporte de 55 estreptococos, tratando infecciones del aparato respiratorio inferior, tratando infecciones de ofdos, tratando otitis media, tratando endocarditis, y mediante el tratamiento o la prevencion de otras afecciones o infecciones sistemicas o locales.

En un aspecto de la descripcion, esta invencion tambien puede usarse para tratar la septicemia, particularmente en 60 humanos. Para el tratamiento de una infeccion septicemica, tal como neumonfa o meningitis bacteriana, debe haber

un flujo intravenoso continuo del agente terapeutico en la corriente sangufnea. La concentracion de las enzimas para el tratamiento de septicemia depende del conteo bacteriano en la sangre y del volumen de la sangre.

Tambien se describe al menos una enzima/polipeptido lftico dimerico de la invencion para uso en un procedimiento 5 para tratar una infeccion, transporte o poblacion de estreptococos, en particular una lisina Cpl-1 dimerica que se incluye como se describe particularmente en este documento. Mas especfficamente, la enzima/polipeptido lftico dimerico, capaz de lisar la pared celular de cepas bacterianas de estreptococos, es producida del material genetico de un bacteriofago especffico para Streptococcus o de uno o mas plasmidos, vectores, u otros medios recombinantes. En un aspecto de la descripcion, los polipetidos de lisina dimericos de la presente invencion, que 10 incluyen lisina dimerica Cpl-1, son utiles y productivos en procedimientos profilacticos y de tratamiento dirigidos contra bacterias gram positivas, particularmente en infecciones o colonizacion bacteriana de estreptococos. Las cepas de bacterias susceptibles y relevantes como objetivos de los procedimientos de la invencion, incluyen y pueden seleccionarse de entre Streptococcus suis, Streptococcus equi, Streptococcus agalactiae (GBS), Streptococcus pyogenes (GAS), Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus dysgalactiae, 15 Streptococcus GES y Streptococcus pneumonia.

La descripcion incluye la lisina de la invencion para uso en procedimientos de descolonizacion, tratamiento o alivio de infecciones o afecciones relacionadas con estreptococos, que incluyen bacterias resistentes a antibioticos, donde la bacteria o un sujeto humano infectado o expuesto a la bacteria particular, o en sospecha de haber estado 20 expuesto o en riesgo, se pone en contacto con, o se le administra, una cantidad del polipeptido de lisina aislado de la invencion, eficaz para destruir la bacteria particular. De esta manera, una o mas Cpl-1 dimericas, que incluyen dichos polipeptidos tal como se provee aquf en la Figura 6 y la Tabla 1, y en la SEQ ID NO: 3, se ponen en contacto o se administran para ser eficaces para destruir las bacterias relevantes, descolonizar las bacterias relevantes, o aliviar de otra manera o bien tratar la infeccion bacteriana. En un aspecto adicional, una o mas Pal dimericas, que 25 incluyen dichos polipeptidos se proveen aquf y en la Figura 7 y la SEQ ID NO: 6, se ponen en contacto o se administran para ser eficaces para destruir las bacterias relevantes o aliviar de otra manera o bien tratar la infeccion bacteriana.

El termino 'agente' significa cualquier molecula, que incluye polipeptidos, anticuerpos, polinucleotidos, compuestos 30 qufmicos y moleculas pequenas. En particular, el termino agente incluye compuestos tales como compuestos de prueba, compuestos adicionales anadidos, o compuestos de enzima lisina.

El termino 'agonista' se refiere a un ligando que estimula el receptor al que se une el ligando en el sentido mas amplio.

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El termino 'ensayo' significa cualquier proceso usado para medir una propiedad especffica de un compuesto. Un 'ensayo de cribado' significa un proceso usado para caracterizar o seleccionar compuestos de una biblioteca de compuestos, basandose en su actividad.

40 El termino 'prevenir' o 'prevencion' se refiere a una reduccion del riesgo de adquirir o desarrollar una enfermedad o trastorno (es decir, que hace que por lo menos uno de los sfntomas clfnicos de la enfermedad no se desarrolle), en un sujeto que puede estar expuesto a un agente causante de la enfermedad, o predispuesto a la enfermedad con antelacion al inicio de la enfermedad.

45 El termino 'profilaxis' esta relacionado con el termino 'prevencion' y es abarcado por el mismo, y se refiere a una medida o procedimiento cuyo proposito es prevenir, en lugar de tratar o curar una enfermedad. Ejemplos no limitativos de medidas profilacticas pueden incluir la administracion de vacunas; la administracion de heparina de peso molecular bajo en pacientes de hospital en riesgo de trombosis debido a, por ejemplo, inmovilizacion; y la administracion de un agente contra la malaria tal como cloroquina, con antelacion a una visita a una region 50 geografica en donde la malaria sea endemica, o el riesgo de contraer la malaria sea alto.

'Cantidad terapeuticamente efectiva' significa aquella cantidad de un farmaco, compuesto, agente antimicrobiano, anticuerpo, polipeptido o agente farmaceutico que provoca la respuesta biologica o medica de un sujeto que es buscada por un doctor especialista u otro medico. En particular, con respecto a infecciones bacterianas gram 55 positivas y el crecimiento de bacterias gram positivas, el termino 'cantidad efectiva' incluye una cantidad efectiva de un compuesto o agente que produce una disminucion biologicamente significativa de la cantidad o magnitud de infeccion de bacterias gram positivas, que incluye un efecto bactericida y/o bacteriostatico. La expresion "cantidad terapeuticamente efectiva", se usa aquf para indicar una cantidad suficiente para prevenir, y preferentemente reducir por lo menos aproximadamente el 30 por ciento, mas preferentemente por lo menos el 50 por ciento, con la maxima 60 preferencia por lo menos el 90 por ciento un cambio clfnicamente significativo en el crecimiento o cantidad de

bacterias infecciosas, u otra caracterfstica de patologfa tal como, por ejemplo, fiebre elevada o conteo de leucocitos que puedan acompanar a su presencia y actividad.

El termino 'tratar' o 'tratamiento' de cualquier enfermedad o infeccion se refiere, en un aspecto, a mitigar la 5 enfermedad o infeccion (es decir, detener la enfermedad o crecimiento del agente infeccioso o bacterias o reducir la manifestacion, extension o gravedad de por lo menos uno de los sfntomas clfnicos de la misma). En otro aspecto, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a mejorar por lo menos un parametro ffsico, que puede no ser discernible por el sujeto. En todavfa otro aspecto, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a modular la enfermedad o infeccion, ya sea ffsicamente (p. ej., estabilizacion de un sfntoma discernible), fisiologicamente (p. ej., estabilizacion de un parametro 10 ffsico), o ambos. En aspecto adicional, 'tratar' o 'tratamiento' se refiere a retardar el avance de una enfermedad o reducir una infeccion.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y normalmente no producen reaccion secundaria alergica o similar, tal como malestar 15 gastrico, mareos, etc., cuando se administran a un humano.

Es de advertir que en el contexto de los procedimientos de tratamiento efectuados in vivo o procedimientos de tratamiento medicos y clfnicos de acuerdo con la presente solicitud y reivindicaciones, el termino sujeto, paciente o individuo se refiere a un humano.

20

Los terminos "bacterias gram positivas", "gram positivas", y cualquier variante no mencionada especfficamente, se pueden usar aquf indistintamente, y como se usa en toda la presente solicitud y las reivindicaciones, se refieren a bacterias gram positivas que son conocidas y/o pueden ser identificadas por la presencia de ciertas caracterfsticas en la pared celular y/o membrana celular y/o por tincion con colorante de Gram. Las bacterias gram positivas son 25 conocidas y pueden ser identificadas facilmente y se pueden seleccionar, pero sin limitacion, de entre los generos Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium y Clostridium, e incluyen todas y cada una de las especies o cepas reconocidas o no reconocidas de las mismas.

El termino "bactericida" se refiere a la capacidad de destruir celulas bacterianas.

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El termino "bacteriostatico" se refiere a la capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano, que incluye inhibir el crecimiento de celulas bacterianas.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son 35 fisiologicamente tolerables y normalmente no producen reaccion secundaria alergica o similar, tal como malestar gastrico, mareos, etc., cuando se administran a un humano.

La expresion "cantidad terapeuticamente efectiva", se usa aquf para indicar una cantidad suficiente para prevenir, y preferentemente reducir por lo menos aproximadamente el 30 por ciento, mas preferentemente por lo menos el 50 40 por ciento, con la maxima preferencia por lo menos el 90 por ciento un cambio clfnicamente significativo en la actividad de la fase S de una masa celular objetivo, u otra caracterfstica de patologfa tal como, por ejemplo, presion sangufnea elevada, fiebre o conteo de leucocitos que puedan acompanar a su presencia y actividad.

Las enfermedades o afecciones causadas por una infeccion de estreptococos (tales como las causadas por 45 Streptococcus pneumoniae) pueden tratarse mediante la administracion de una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina dimerica a un mamffero que padece de una enfermedad o afeccion. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afeccion es bacteriemia, meningitis, neumonfa, otitis media o sinusitis.

La descripcion proporciona la lisina de la invencion para uso en un procedimiento para tratar infecciones bacterianas 50 de tejidos o sistemicas causadas por la bacteria Streptococcus, que comprende el tratamiento parenteral de la infeccion con un agente terapeutico que comprende una cantidad efectiva de uno o mas polipeptidos de lisina dimerica de la invencion, particularmente Cpl-1 dimerica que incluye dichos polipeptidos como se provee en el presente documento en la Figura 6 y en la Tabla 1, y/o una Pal dimerica que incluye polipeptidos como se provee en el presente documento en la Figura 7 yla SEQ ID NO: 6, y un vehfculo apropiado. Un numero de otros 55 procedimientos diferentes puede usarse para introducir las/los enzimas/polipeptidos lfticos/as dimericos/as. Estos procedimientos incluyen introducir las/los enzimas/polipeptidos lfticos/as dimericos/as por via intravenosa, intramuscular, subcutanea, intratecal y subdermica. El experto en la materia, que incluye el personal medico, sera capaz de evaluar y reconocer el modo o medio de administracion mas apropiado y los polipeptidos que serfan mas beneficiosos para el tratamiento de meningitis bacteriana.

60

Las infecciones tambien se pueden tratar inyectando en el tejido infectado del paciente humano un agente terapeutico que comprende la enzima/polipeptido lftico dimerico apropiado y un vehmulo para la enzima. El vehmulo puede estar comprendido de agua destilada, solucion salina, albumina, un suero, o cualquier combinacion de los mismos. Mas espedficamente, se pueden preparar soluciones para infusion o inyeccion de la manera convencional, 5 p. ej., agregando conservantes tales como p-hidroxibenzoatos, o estabilizadores tales como sales de metal alcalino de acido etilendiaminotetraacetico, y luego pueden ser transferidas a recipientes de fusion, viales de inyeccion o ampollas. Alternativamente, el compuesto para inyeccion se puede liofilizar con o sin los otros ingredientes, y se puede solubilizar en una solucion tamponada o agua destilada, segun sea apropiado, en el momento de uso. Vehmulos no acuosos tales como aceites fijos, liposomas y oleato de etilo tambien son utiles en el presente 10 documento. Se pueden incluir en la composicion otras enzimas lfticas asociadas a fago junto con una protema holina.

La lisina de la invencion tal como Cpl-1 dimerica o lisina Pal dimerica, o combinaciones de las mismas que se ejemplifican aqm, pueden ser usadas en varios procedimientos de tratamiento como un tratamiento profilactico para 15 eliminar o reducir el transporte de bacterias susceptibles, impidiendo que enfermen los humanos que han estado expuestos a otros que tienen los smtomas de una infeccion, o como un tratamiento terapeutico para aquellos que estuvieran ya enfermos por la infeccion. Similarmente, las enzimas/polipeptidos lfticos dimericos se pueden usar para tratar o aliviar, por ejemplo, enfermedades del aparato respiratorio inferior, particularmente utilizando aerosoles bronquiales o mediante administracion intravenosa de la enzima. Por ejemplo, se puede usar una enzima lftica para 20 el tratamiento profilactico y terapeutico de infecciones del ojo, tales como conjuntivitis. El procedimiento de tratamiento, tal como se describe, comprende administrar gotas oftalmicas o un lavado oftalmico que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un polipeptido lftico de la invencion y un vehmulo capaz de ser aplicado con seguridad al ojo, el vehmulo conteniendo las enzimas lfticas. Las gotas oftalmicas o lavado oftalmico preferentemente estan en forma de una solucion isotonica. El pH de la solucion se debe ajustar de tal manera que 25 no haya irritacion del ojo, que a su vez resultana en posible infeccion con otros organismos y posible dano en el ojo. Mientras que la escala de pH sena la misma escala que para otras enzimas lfticas, el pH optimo estara en la escala que se muestra y provee en el presente documento. Similarmente, tambien se pueden usar tampones de la clase anteriormente descrita para otras enzimas lfticas. Otros antibioticos que son adecuados para usarse en gotas oftalmicas se pueden agregar a la composicion que contiene las enzimas. Tambien se pueden agregar bactericidas 30 y bacteriostaticos. La concentracion de la(s) enzima(s) en la solucion puede estar en la escala de aproximadamente 100 unidades/ml a aproximadamente 500.000 unidades/ml, con una escala mas preferida de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 unidades/ml, y de aproximadamente 100 a aproximadamente 50.000 unidades/ml. Las concentraciones pueden ser mas altas o mas bajas que las escalas provistas.

35 Los polipeptidos lfticos dimericos de la invencion tambien se pueden usar en una solucion de lentes de contacto, para el enjuague y limpieza de las lentes de contacto. Esta solucion, que normalmente es una solucion isotonica, puede contener, ademas de la enzima, cloruro de sodio, manitol y otros alcoholes de azucar, borato, conservantes y similares. Una enzima/polipeptido lftico de la invencion tambien se puede administrar en el ofdo de un paciente. De esta manera, por ejemplo, un polipeptido lftico dimerico de la invencion se puede usar para tratar infecciones del 40 ofdo, por ejemplo causadas por Streptococcus pneumoniae. La otitis media es una inflamacion del ofdo medio caracterizada por smtomas tales como otalgia, perdida auditiva y fiebre. Una de las causas principales de estos smtomas es una acumulacion de fluido (efusion) en el ofdo medio. Las complicaciones incluyen perdida de audicion permanente, perforacion de la membrana timpanica, colesteatoma adquirido, mastoiditis y otitis adhesiva. Los ninos que desarrollan otitis media en los primeros anos de su vida estan en riesgo de enfermedad aguda o cronica 45 recurrente. Una de las causas principales de la otitis media es Streptococcus pneumoniae. La enzima/polipeptido lftico se puede aplicar a un ofdo infectado suministrando la enzima en un vehmulo apropiado al canal auditivo. El vehmulo puede comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas esteriles. La enzima lftica se puede agregar al vehmulo, que tambien puede contener conservantes adecuados y preferentemente un agente tensioactivo. Los agentes bactericidas y fungicidas incluidos preferentemente en las gotas son nitrato o acetato 50 fenilmercurico (0,002 %), cloruro de benzalconio (0,01 %) y acetato de clorhexidina (0,01 %). Los disolventes adecuados para la preparacion de una solucion oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol. Adicionalmente se puede usar cualquiera de varios vehmulos para gotas oticas. Las concentraciones y conservantes usados para el tratamiento de la otitis media y otras infecciones oticas similares son las mismas mencionadas para infecciones del ojo, y el vehmulo en el que va la enzima es similar o identico a los vehmulos para el tratamiento de 55 las infecciones del ojo. Adicionalmente, el vehmulo incluye normalmente vitaminas, minerales, carbohidratos, azucares, aminoacidos, materiales proteinaceos, acidos grasos, fosfoftpidos, antioxidantes, compuestos fenolicos, soluciones isotonicas, soluciones basadas en aceite, suspensiones basadas en aceite, y combinaciones de los mismos.

60 Las posibilidades y aplicaciones diagnosticas, profilacticas y terapeuticas que surgen por el reconocimiento y

generacion de los polipeptidos de lisina dimericos de la invencion derivan del hecho de que los polipeptidos de la invencion causan efectos directos y especfficos (p. ej., destruccion) en bacterias susceptibles. De esta manera, los polipeptidos de la invencion se pueden usar para eliminar, caracterizar o identificar las bacterias relevantes y susceptibles.

5

De esta manera, tambien se describe la lisina de la invencion para uso en un procedimiento diagnostico en donde el procedimiento diagnostico puede comprender examinar una muestra o medio celular con la finalidad de determinar si contiene bacterias susceptibles, o si las bacterias de la muestra o medio son susceptibles, por medio de un ensayo que incluye una cantidad efectiva de uno o mas polipeptidos de lisina dimericos y medios para caracterizar 10 una o mas celulas en la muestra, o para determinar si ha ocurrido o esta ocurriendo o no lisis celular. Los pacientes susceptibles de beneficiarse de este procedimiento incluyen los que padecen una infeccion no determinada, una infeccion bacteriana reconocida, o con sospecha de exposicion o transporte de una bacteria particular. Un fluido, alimento, dispositivo medico, composicion u otra de tales muestras que estara en contacto con un sujeto o paciente, se puede examinar para detectar bacterias susceptibles, o bien puede ser limpiado de las bacterias relevantes. En 15 uno de tales aspectos, un fluido, alimento, dispositivo medico, composicion u otra de esta clase de muestras se puede esterilizar o tratar de otra manera para eliminar o quitar cualquier bacteria relevante potencial por incubacion o exposicion a uno o mas polipeptidos lfticos de la invencion.

Los procedimientos y su aplicacion son familiares para los expertos en la materia y se pueden utilizar 20 consecuentemente dentro del alcance de la presente invencion. En un aspecto, los polipeptidos lfticos de la invencion forman complejos o se unen o se asocian de otra manera con bacterias relevantes o susceptibles en una muestra, y un miembro del complejo se marca con una marca detectable. El hecho de que se haya formado un complejo y, si se desea, la cantidad del mismo puede determinarse mediante los procedimientos conocidos y aplicables a la deteccion de marcas. Las marcas utilizadas mas comunmente para estos estudios son elementos 25 radioactivos, enzimas, sustancias qufmicas que son fluorescentes cuando se exponen a la luz ultravioleta, y otros. Se conocen varios materiales fluorescentes y se pueden utilizar como marcas. Estos incluyen, por ejemplo, fluorescefna, rodamina, auramina, rojo de Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer. La marca radioactiva puede ser detectada mediante cualquiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isotopo preferido se puede seleccionar de 3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I, y 186Re. Similarmente son utiles las marcas 30 de enzima y pueden ser detectadas mediante cualquiera de las tecnicas colorimetricas, espectrofotometricas, fluoroespectrofotometricas, amperometricas o gasometricas actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la partfcula seleccionada por reaccion con moleculas de formacion de puente, tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehfdo, y similares. Muchas enzimas que se pueden usar en estos procedimientos son conocidas y se pueden utilizar. Las preferidas son peroxidasa, 13-giucuronidasa, 13-D-glucosidasa, 13-D-galactosidasa, ureasa, 35 glucosa oxidasa mas peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes de EE. UU. con n.os 3.654.090; 3.850.752; y 4.016.043 son referidas a manera de ejemplo por su descripcion de materiales y procedimientos de marcacion alternativos.

La invencion se puede entender mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos, no limitativos, que se 40 proporcionan como ejemplares de la invencion. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar mas completamente las realizaciones preferidas de la invencion, y de ninguna manera se deben considerar, sin embargo, como limitativos del amplio alcance de la invencion.

EJEMPLO 1

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DIMERO (Cpl-1) DE LISINA DE FAGO ESTABLE CON ACTIVIDAD ANTI-NEUMOCOCICA AUMENTADA

Los bacteriofagos (fagos) producen endolisinas (lisinas) como parte de su ciclo lftico para degradar la capa de peptidoglucano de las bacterias infectadas con el fin de liberar la progenie de fago. Debido a que estas enzimas 50 mantienen su actividad letal y lftica contra las bacterias gram positivas cuando son anadidas extrfnsecamente a las celulas, dichas enzimas han sido explotadas activamente como novedosos antiinfecciosos y a veces denominados enzibioticos. Como otros relativamente pequenos peptidos, un problema en su desarrollo clfnico ha resultado ser su rapida inactivacion a traves de degradacion proteolftica, bloqueo intestinal, o eliminacion renal. La lisina Cpl-1 antineumococica ha demostrado escapar tanto a la proteolisis como al bloqueo inmunologico. Sin embargo, su corta 55 vida media en plasma (20,5 min en ratones) puede representar un inconveniente para su utilidad clfnica. Aquf presentamos la construccion de un dfmero de Cpl-1 en vista del aumento tanto de la actividad antineumococica como de la vida media en plasma de Cpl-1. La dimerizacion se ha logrado mediante la introduccion de residuos de cistefna especfficos en el extremo C-terminal de la enzima, favoreciendo, de este modo, el enlace disulfido. En comparacion a los monomeros nativos, el dfmero construido demostro un incremento del doble en la actividad 60 antineumococica especffica y, ademas, casi 10 veces mas de aumento en la vida media en plasma (es decir, 0,028

frente a 0,27 ml/min'1). Como varias lisinas son sospechosas de dimerizar en contacto con sus sustratos de pared celular para resultar totalmente activas, las enzimas pre-dimerizadas estables pueden representar una alternativa mas eficiente frente al monomero nativo.

5 El Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) es un diplococo encapsulado gram positivo responsable de una amplia variedad de infecciones en humanos. Es la primera causa de otitis media y afecta a mas de 5 millones de ninos cada ano en EE. UU. (4), siendo tambien una causa comun de sinusitis, neumonfa extrahospitalaria, bacteriemia y meningitis (13). Es responsable de mas de 1 millon de muertes al ano entre los ninos menores de 5 anos a nivel mundial (5), permaneciendo, la neumonfa neumococica, como la sexta causa mas comun de muerte en 10 EE. UU. y en todos los grupos de edad (8). Es tambien el patogeno bacteriano principal responsable de superinfeccion tras la infeccion respiratoria de la gripe A, una complicacion responsable de mas del 90 % de muertes durante las pandemias de gripe (2, 3, 20, 21).

Las infecciones neumococicas son normalmente tratadas con antibioticos. Sin embargo, su abuso en el tratamiento 15 de millones de casos leves de otitis y sinusitis, en su mayorfa de origen viral, ha planteado una gran presion en la seleccion de resistencia a farmacos (11). Por ello, en la actualidad se ha informado extensamente de fracasos en tratamientos bacteriologicamente confirmados, debido a un aumento en la resistencia a numerosos tipos de farmacos, que incluyen los comunmente usados beta-lactamicos, macrolidos y fluoroquinolonas (19, 23). Asf, se hacen muy necesarios nuevos farmacos que actuen mediante mecanismos totalmente diferentes.

20

Los fagos, que constituyen el principal depredador de las bacterias por naturaleza, fueron considerados como agentes antibacterianos potenciales decadas antes del desarrollo de los antibioticos (28, 29). No obstante, la complejidad en el desarrollo de los fagos nativos para los productos industriales susceptibles, llevo a los pafses occidentales a abandonar su desarrollo a partir de los anos 40 del siglo pasado. En la actualidad, sin embargo, la 25 problematica expansion de la resistencia a antibioticos justifica un renovado interes en la contribucion de moleculas derivadas de fagos como compuestos antibacterianos clfnicamente utiles (9, 27).

Uno de estos tipos de compuestos, es decir, las lisinas de fago, ha sido explotado por su rapida accion destructiva de las bacterias gram positivas (1, 9). Las lisinas de fago son producidas oportunamente cuando la progenie del fago 30 necesita escapar del huesped bacteriano. El fago neumococico Cp-1 produce la lisina Cpl-1, una enzima de 37 kDa que hidroliza especfficamente peptidoglucano neumococico. Esta lisina se construye como todas dichas endolisinas, ya que tienen dos dominios bien definidos y conectados por un conector flexible. La actividad catalftica se restringe al dominio del extremo N-terminal, mientras que la parte con extremo C-terminal, que contiene 6 repeticiones de union a colina (ChBR) y una cola de extremo C-terminal de 13 aminoacidos, es necesaria para la union a sustrato en 35 la pared celular neumococica (10). La Cpl-1 pertenece a familia de las lisozimas que se dirigen a uniones (31,4 entre acido N-acetilmuramico y residuos N-acetil-D-glucosamina en el peptidoglucano (22). Nuestro laboratorio clono el gen Cpl-1 en el vector de alta expresion pinlllA logrando, despues, su sobreexpresion y purificacion (15). La Cpl-1 purificada trato con exito sepsis neumococica (14, 16), endocarditis (6), meningitis (12), y neumonfa (31) en modelos de roedores. Sin embargo, esta Cpl-1 fue rapidamente eliminada de la sangre in vivo, y se necesitaron inyecciones 40 repetidas o se realizo infusion continua para optimizar la actividad en algunos modelos de la infeccion (6, 31). Esta corta vida media puede ser una deficiencia para el desarrollo clfnico de la Cpl-1 y lisinas semejantes.

Para desarrollar una Cpl-1 mas eficaz, aprovechamos los avances recientes sobre la dimerizacion de lisina. Para resultar totalmente activa, la principal autolisina neumococica (LytA) necesita una dimerizacion previa, que se inicia 45 mediante la interaccion de sus dominios de union a colina del extremo C-terminal con colina, llevando a la formacion de un homodfmero que es significativamente mas activo que el monomero nativo (7, 26, 30). La alineacion de la secuencia de Cpl-1 y LytA revelo amplias similitudes, especialmente dentro de la cola del extremo C-terminal de la enzima implicada en la dimerizacion. Asf, se hipotetizo que la Cpl-1 puede tener el mismo requisito de dimerizacion que el de LytA para lograr total actividad. Ademas, la forma dimerica de Cpl-1 podrfa tener una disminucion 50 significante con la eliminacion renal debido a que su peso molecular (74 kDa frente a 37 kDa para el monomero) es mayor de 60-65 kDa, el umbral para la filtracion glomerular en humanos (18).

En este trabajo desarrollamos un homodfmero de Cpl-1 estable unido al extremo C-terminal mediante un enlace disulfido, y examinamos su eliminacion en plasma respecto a su actividad in vitro e in vivo, comparandolo con el 55 monomero parental. Los resultados proporcionan la base para mayores estudios de bioactividad en este tipo de dfmero en modelos de infeccion.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

60 Reactivos

El kit de Minipreps de plasmido era de Qiagen (Valencia, EE. UU.), mientras que el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuickChange II perteneda a Stratagene (Cedar Creek, EE. UU.). La columna de nivel de preparacion HiLoad 16/60 Superdex™ 200 de filtracion de gel y DEAE-Sepharose fueron obtenidos de GE Healthcare Bio-Sciences 5 Corporation (Piscataway, EE. UU.). Los cebadores mutagenicos fueron sintetizados por Fisher Scientific (Pittsburgh, EE. UU.). El resto de sustancias qmmicas se adquirieron de Sigma-Aldrich (Saint Louis, EE. UU.). El reactivo colorante Quick Start Bradford y los estandares de gamma globulina bovina (BGG) para las mediciones de concentracion de protemas proveman de Biorad (Hercules, EE. UU.). Los dispositivos ultracentnfugos Amicon se adquirieron de Millipore (Billerica, EE. UU.) mientras que los filtros de jeringa Acrodisc de 0,45 pm fueron adquiridos 10 de Pall (Ann Arbor, EE. UU.).

Construccion de mutantes de Cpl-1

Todos los mutantes se construyeron usando el kit de mutagenesis dirigida a sitio QuickChange II con los cebadores 15 apropiados para introducir las mutaciones deseadas, y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se verifico la presencia de mutaciones mediante la secuenciacion de ADN realizada en Genewiz (South Plainfield, NJ, EE. UU.).

Produccion y purificacion de lisinas de Cpl-1 y de la mutante de Cpl-1

20 Los ADN de plasmido de clones seleccionados que llevaban los genes de Cpl-1 mutado y los de tipo silvestre fueron aislados para despues transformarlos en la cepa DH5a de E. coli con el objetivo de sobreexpresar las protemas correspondientes. La protema de Cpl-1 de tipo silvestre se obtuvo a partir de la expresion de pJML6 en las celulas de E. coli de la cepa DH5a. La produccion y purificacion de las lisinas fue siguiente al procedimiento que se describe en otra parte (15). Brevemente, las cepas se desarrollaron durante una noche a 37 °C en Luria-Broth en agitacion a 25 225 rpm. La expresion de la protema se indujo en una noche con 20 g/l de lactosa. Despues de la recoleccion y resuspension en tampon de enzimas (tampon fosfato de 50 mM, y pH a 7,4), las celulas se sometieron a ondas sonoras en hielo (Sonopuls, Bandelin electronics, Berlin, Alemania). Los restos celulares se sedimentaron por centrifugacion (15.000 rpm, durante 1 hora a 37 °C) y los sobrenadantes se trataron con 20 unidades (20U) de ADNasa I durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes filtrados de 0,45 pm se aplicaron a una 30 columna de flujo rapido DEAE-Sepharose previamente equilibrada con tampon de enzimas. Despues de la fase de lavado con tampon de enzimas que contema NaCl 1M, las enzimas se eluyeron con tampon de enzimas que contema un 10 % de colina. Despues de una amplia dialisis (MWCO entre 12-14.000) en tampon de enzimas, las enzimas purificadas se liofilizaron y almacenaron a -20 °C.

35 Aislamiento de los dfmeros mutantes de Cpl-1

Todos los dfmeros fueron ademas aislados en una columna Hiload 16/60 Superdex conectada al aparato AKTA Prime (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, Piscataway, EE. UU.). Brevemente, para cada mutante, la mezcla de monomeros y dfmeros obtenida espontaneamente despues de la sobreexpresion, mediante induccion de lactosa 40 (ver anteriormente), fue aplicada a 1 ml/min a la columna equilibrada previamente con tampon de enzimas. Las fracciones que conteman los dfmeros fueron agrupadas y concentradas con unidades de filtro ultracentnfugo Amicon (MWCO de 30.000, Millipore, Carrigtwohill, Irlanda) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se realizo una segunda etapa de purificacion en la Hiload 16/60 Superdex con la muestra concentrada. Las fracciones finales que conteman los dfmeros fueron agrupadas, concentradas a 1 mg/ml, y almacenadas a -20°C hasta uso posterior.

45

Ensayo de destruccion in vitro

El ensayo de destruccion se realizo usando la cepa DCC1490 de S. pneumoniae, habiendose descrito en otra parte (17). Brevemente, la DCC1490 se desarrollo hasta una fase de crecimiento logantmico (DO595nm de 0,3) en Brain 50 Heart Infusion (BHI). Despues de la centrifugacion y resuspension de las celulas en el tampon de enzimas a una concentracion de aproximadamente 109UFC/ml, se anadieron directamente las diluciones en serie de lisinas a la suspension bacteriana (concentracion final de aproximadamente 5,108 UFC/ml) en placas de 96 pocillos. La cinetica de reaccion se obtuvo con la medicion de la DO595nm a 37 °C durante un penodo de 15 minutos con un lector de placas de 96 pocillos EL808 (Biotek Instruments, Lucerna, Suiza). 1 U de enzima se definio como la cantidad de 55 enzima necesaria para lograr una disminucion a la mitad de la DO595nm(que corresponde a 1 log de reduccion en la UFC/ml) de una solucion con 5,108 UFC/ml de la DCC1490 de S. pneumoniae tras 15 minutos a 37 °C.

Medicion de la eliminacion de lisina en plasma de raton

60 Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices federales e

institucionales. En ratones macho Balb C con un peso medio de 22 g, obtenidos de Charles River Laboratories (Wilmington, EE. UU.), se inyecto via intravenosa (i.v.) en la vena lateral de la cola la misma cantidad de moles de tanto la enzima Cpl-1 dimerica, como de la enzima de tipo silvestre. Asf, el bolo unico (100 pl) de tanto la Cpl-1 (4,5

1 C45S D324C 1 ' 1 ' 1 '

mg/ml) como el dfmero Cpl-1 (9 mg/ml) fueron administrados en dos grupos distintivos de 15 ratones. Tras

5 la anestesia, se recogieron muestras de sangre mediante puncion cardfaca a los 5, 30, 60, 180 y 300 min despues de la administracion, y se colocaron directamente en hielo.

Se preparo el plasma a partir de muestras de sangre heparinizadas y enfriadas en hielo mediante centrifugacion a 3000 x g durante 10 min, a 4 °C. Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Las concentraciones de

^ C45S D324C

10 plasma de la Cpl-1 y el dfmero Cpl-1 se determinaron mediante un ensayo ELISA sandwich indirecto. Se

cubrieron las placas de 96 pocillos con una solucion de 5 ug/ml de anticuerpo anti-Cpl1 monoclonal en solucion salina tamponada con fosfato IX (PBS IX), con pH a 7,4 (3 horas a 37 °C y despues una noche a 4 °C). Despues de 5 lavados con 200 pl de tampon de lavado (pBs IX,150 mM NaCl, Brij-35 al 0,05 %, azida sodica al 0,02 %, pH a 7,4),100 pl de muestras de plasma y estandares diluidos en tampon de dilucion (PBS 1X, NaCl 0,5 M, Brij-35 al 0,25 15 %, azida sodica al 0,02 %, pH a 7,4) fueron anadidos a los pocillos y placas incubados durante 3 horas a 37 °C. Las placas ademas se lavaron 5 veces con 200 pl de tampon de lavado, y 100 pl/pocillo de anticuerpo primario (anticuerpo anti-Cpl-1 policlonal de conejo) diluido en 2 pg/ml en tampon de dilucion fueron anadidos a los pocillos, y las placas se incubaron durante otras 3 horas a 37 °C. Despues de 5 lavados adicionales con 200 pl de tampon de lavado, las placas se incubaron una noche a temperatura ambiente en presencia de 100 pl/pocillo del anticuerpo 20 secundario (conjugado de fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG de conejo) diluido en proporcion 1/1000 en tampon de dilucion. A la manana siguiente, los pocillos se lavaron 5 veces con 200 pl de tampon de lavado, y la actividad enzimatica se midio a 405 nm mediante deteccion colorimetrica con 200^ pl del sustrato de fosfatasa alcalina (1 mg/ml en dietanolamina al 10 %,1 mM de MgCh) a temperatura ambiente. Se uso un lector de placas Spectra Max 5e (Molecular Devices, Sunnyvale, EE. UU.), y los resultados fueron analizados con el software SoftMax Pro.

25

Debido a que las formas monomericas y dimericas de la Cpl-1 reaccionan diferentemente con los anticuerpos especfficos de Cpl-1, se hizo necesario utilizar dos estandares diferentes en el ensayo ELISA. Los monomeros de Cpl-1 purificados de concentraciones conocidas se usaron en los experimentos con la enzima nativa y los dfmeros

1 1 C45S D324C 1 J

de Cpl-1 purificados de concentraciones conocidas se usaron para los experimentos con el dfmero de Cpl-

30 1 C45S'D324C

RESULTADOS Y ANALISIS

Se comprobo que las secuencias de aminoacidos de las regiones del extremo C-terminal de LytA y Cpl-1 eran 35 homologas (73/142 de residuos identicos, y 55/69 residuos siendo sustituciones conservativas), y que los 13 aminoacidos del extremo C-terminal eran responsables de la dimerizacion de LytA (Figura 1). De manera interesante, dentro de esta region, 10/13 aminoacidos son identicos entre la Cpl-1 y la LytA. Asf, hemos especulado que la Cpl-1 podrfa tambien dimerizar hasta ser totalmente activa.

40 Construccion y purificacion del dfmero Cp|-1C45SD324C

Nuestra estrategia para crear una enzima predimerizada se centro en la formacion de un puente disulfido entre dos monomeros. La enzima Cpl-1 de tipo silvestre contiene tres residuos de cistefna en las posiciones 45, 108 y 239. Gracias al uso del servidor Accpro en el sitio web del predictor de protefnas SCRATCH 45 (scratch.proteomics.ics.uci.edu/index), unicamente la cistefna 45 (C45) se previo accesible al disolvente. De este modo, para evitar posibles interacciones con este residuo de cistefna, disenamos la Cpl-1C45S mutante. Esta mutante era soluble y completamente activa en comparacion a la Cpl-1 nativa (datos no disponibles).

Para construir la forma predimerizada de Cpl-1, mutamos ademas la Cpl-1C45S en Cpl-1C45S,D324C. Introducimos 50 especfficamente el nuevo residuo de cistefna antes del tramo del aminoacido 13 en la cola del extremo C-terminal de la Cpl-1 para impedir alteraciones de la estructura clave en esta region. La mutacion fue confirmada mediante secuenciacion de ADN. La Cpl-1 y la Cpl-^ se sobreexpresaron con exito en las celulas de la cepa DH5a de

E. coli y se purificaron para lograr homogeneidad en la columna DEAE-Sepharose (Figura 2A, carril 2, y Figura 2B, carril 2). Tal como se predijo para Cpl-1C45S,D324C, aparecio espontaneamente una banda a 74 kDa en el gel de SDS- 55 PAGE no reductor con tincion de Coomassie (Figura 2B, carril 2). La reduccion de esta muestra con 10 mM de ditiotreitol (DTT), llevo a la desaparicion total de la banda de 74 kDa (Figura 2B, carril 3), lo que confirmo que la forma dimerica relacionada con el enlace disulfido para Cpl-1C45S,D324C resulto reducible. La purificacion adicional en homogeneidad (~94 %) del dfmero de Cpl-^ se logro mediante un proceso de purificacion en dos etapas en

el Sephadex G-100, (Figura 2C, carriles 2 y 3).

60

C45S D324C

Actividad antimicrobiana in vitro de los monomeros de Cpl-1 ’

C45S D324C

Hallamos que 1 mM de DTT resulto suficiente para lograr la reduccion completa del dfmero Cpl-1 en

monomeros (datos no disponibles). En este experimento, la actividad antimicrobiana de la forma monomerica

' C45S D324C ' 1

5 purificada de Cpl-1 fue, por consiguiente, cuantificada en presencia de 1 mM de DTT. De acuerdo con esta

condicion, la enzima mutante retuvo el 100 % de la actividad antibacteriana in vitro en comparacion con la Cpl-1 nativa. Como se observo en la Figura 3, mediante el ensayo de destruccion in vitro, se logro una disminucion del 50 % de la DO595nm en S. pneumoniae despues de 15 minutos con 0,5 nmol/ml y para ambos monomeros de Cpl-1 y

C45S D324C * 1 J ' ' J

Cpl-1 . Las actividades especfficas calculadas fueron de 6,7 U/nmol de enzima en ambos casos. Puede

10 concluirse que el reemplazo de un acido aspartico por una cistefna dentro de la region del extremo C-terminal no

1 1 1 C45S D324C ^

posee efectos significantes en la actividad de Cpl-^ . Con la sustitucion localizada justo antes de la cola de

13 aminoacidos necesaria para la dimerizacion nativa de LytA (y posiblemente de Cpl-1), se puede, por consiguiente, concluir que el nuevo residuo de cistefna no interfiere con el proceso de dimerizacion nativa de Cpl-1

^ 1 1 C45S D324C

sospechosa y que es necesario para una actividad completa. Finalmente, especulamos que la Cpl-^ ,

15 cuando se convierte en monomeros mediante un tratamiento con DTT, se reasocia con la misma eficacia en dfmeros al interactuar con la colina en la pared celular.

Actividad antimicrobiana in vitro de dfmeros de Cpl-1C45S,D324C

C45S D324C

20 En nuestro ensayo in vitro de dfmeros de Cpl-^ purificada (Figura 2C, carril 3) se demostro un aumento de la

actividad antibacteriana con un factor de 2 al compararlo con la Cpl-1 [se logro una disminucion del 50 % de la

1 C45S D324C l ^

DO595nm en 0,25 frente a 0,5 nmol/ml, para el dfmero Cpl-1 y Cpl-1, respectivamente (Figura 3). Las

actividades especfficas calculadas fueron de 13,33 y 6,67 U/nmol, para los dfmeros de Cpl-1C45 ,D 24C y Cpl-1, respectivamente. Este resultado no resulta sorprendente dado que, de acuerdo a la caracterfstica de mol a mol, se 25 necesitan el doble de moleculas de monomeros para producir un numero fijo de dfmeros. Ademas, los dfmeros contienen dos sitios activos (frente a uno en los monomeros) y se espera, por ello, que tengan el doble de actividad que los monomeros. Finalmente, este resultado nos indica la evidencia de que la dimerizacion del extremo C- terminal no impide la actividad de la Cpl-1, es decir, si se da una dimerizacion en la naturaleza semejante a la de LytA para el caso de la Cpl-1, aquella no impedirfa la actividad enzimatica.

30

Unicamente el dfmero de Cpl-1C45S,D324C es totalmente activo

Trece (13) mutantes de Cpl-1C45S fueron disenados por separado para tener una cistefna adicional en 13 posiciones diferentes dentro de la secuencia de protefnas. Entre ellos, 6/13 de los mutantes mostraron la misma actividad 35 antimicrobiana que la Cpl-1 nativa al analizarlos en su estado monomerico y en presencia de 1 mM de DTT en el ensayo de destruccion in vitro de la cepa DCC1490 de S. pneumoniae (Tabla 1). Respecto a todos los mutantes de Cpl-1 que contenfan una cistefna expuesta, se dio la dimerizacion espontanea tras la induccion de lactosa de las 6 correspondientes lisinas mutantes. Purificamos los dfmeros correspondientes y analizamos sus actividades antimicrobianas en nuestro ensayo de destruccion in vitro (Figura 5). Con 0,5 mg/ml, todos los dfmeros (excepto Cpl- 40 1 c45s,d324C) mostraron una reduccion > 87,5 % en sus actividades antimicrobianas. Asf, la dimerizacion en otras posiciones diferentes al extremo mas distante de la parte C-terminal impide marcadamente la actividad enzimatica de la Cpl-1. Estas observaciones revelaron la importancia de una posicion optima del nuevo residuo de cistefna implicado en la formacion del puente disulfido entre dos monomeros.

45 TABLA 1

Actividades antimicrobianas de los mutantes de Cpl-1 con 0,5 mg/ml

Nombre del

% de actividad para % de actividad para dfmeros

mutante

monOmeros mutantes mutantes purificados

Cpl 1C45S;Q85C

100 0

Cpl 1 C45S; D194C

100 <1

Cpl 1C45S;S20bC

25 ND

Cpl-1C45SN214C

100 5

Cpl 1C45S;G2lbC

100 3

Cpl-1C45S;F217C

25 ND

Cpl-1C45S;t24SC

75 ND

Cpl 1C45S;D25bC

100 12,5

Cpl 1C45S;S2b9C

100 3

Cpl 1C45S;M301C

18,75 ND

Cpl 1C45S;G310C

75 ND

Cp| 1C45S;N319C-----

50 ND

Cp| iC45S;D324C

100 100

TS: tipo silvestre, ND: no determinado

C45S D324C

Eliminacion en plasma de Cpl-1 y dimeros Cpl-1 ’ en ratones

Se inyecto a ratones Balb C en la vena lateral de la cola un bolo de 100 pl de tanto la Cpl-1 nativa a 4,5 mg/ml

5 (12,16 nmoles/100 pl) como los dimeros Cpl-1C45S,D324C con una concentracion de 9 mg/ml (12,16 nmoles/100 pl). Las muestras de sangre se tomaron a los 5, 30, 60, 180, y 300 minutos tras la inyeccion. Gracias a un ensayo ELISA

^ J C45S D324C J J

sandwich, se hallo que la concentracion de dimeros de Cpl-^ era significativamente mas elevada que el

monomero de control en cada punto temporal (Figura 4). Por ejemplo, en comparacion con el monomero Cpl-1, se detectaron 20,32 veces mas de moleculas de dfmero en el plasma 30 minutos despues de la inyeccion (4.764,32 10 ±788,55 frente a 234,5 ±48,93 pmol/ml para el dfmero Cpl-1C45S,D324C y el Cpl-1, respectivamente). Despues de 5 horas, la diferencia fue de 7,76 (116,8 ±22,85 frente a 15,05 ±1,82 pmol/ml, para el dfmero Cpl-1C45 ,D324C y el Cpl-1, respectivamente). El area calculada bajo la curva (AUC) que represento la lisina residual en plasma durante el

transcurso del experimento fue de 44,417 nmol/min'1/ml'1 para el monomero frente a 435,026 nmol/min'1/ml'1 para el

dfmero. De este modo, para la dosis inyectada de 12,16 nmoles, se encontraron valores de eliminacion de 0,274 15 ml/min-1 para el monomero Cpl-1 en comparacion a 0,028 ml/min-1 para el dfmero Cpl-1C45S,D324C, haciendo que la eliminacion de los dimeros estabilizados disminuyera con un factor de ~9,8 sobre el monomero.

Se hallo que la duplicacion del tamano del Cpl-1 mediante dimerizacion tuvo un efecto significante en la eliminacion de la enzima a partir del plasma de ratones, lo que sugiere que la filtracion renal podrfa tener un papel sustancial en 20 su eliminacion. Nuestros hallazgos indican que el dfmero Cpl-1C45S,D324C resulta una molecula intravenosa mucho mas potente en comparacion con el monomero de Cpl-1 nativa previamente analizado en un modelo de raton con septicemia neumococica y habiendo mostrado 20,5 minutos de vida media (12, 15). Ademas, existe una mayor cantidad de dfmero disponible en la sangre para distribucion sistemica y, de este modo, se espera que el dfmero Cpl-1C45S,D324C muestre efectos terapeuticos mejorados en otras enfermedades asociadas a S. pneumoniae. Por 25 ejemplo, en una publicacion reciente, la forma monomerica de Cpl-1 se uso para curar la neumonfa en ratones mediante el suministro de lisina por via intraperitoneal cada 12 horas (31). La efectividad de este tratamiento a pesar de la corta vida media de la lisina sugiere que la forma dimerica podrfa demostrar ser significativamente mas eficaz al tratar infecciones similares. Huelga decir que la biodisponibilidad del dfmero en el sitio de la infeccion tiene que evaluarse en un entorno in vivo.

30

En resumen, en el presente documento indicamos que la construccion de una lisina dimerica estabilizada es el doble de activa in vitro que el monomero original (en una relacion molar de 1/1), y cuenta ademas aproximadamente con 10 veces mas de biodisponibilidad en sangre. Tambien presentamos evidencia de la gran importancia de la eleccion de la posicion en la cual la nueva cistefna introducida e implicada en la dimerizacion tiene que introducirse. Una 35 lisina de Cpl-1 de accion prolongada podrfa representar una novedosa alternativa contra tanto los neumococos susceptibles como los resistentes a los antibioticos. Ademas, y debido a que otras y diversas lisinas de fago han demostrado o han sido sospechosas de dimerizacion (7, 24, 25), esta estrategia podrfa representar una forma general de aumento en la actividad y/o en la farmacocinetica de ciertas lisinas de fago.

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10. Garcia, J. L., E. Garcia, A. Arraras, P. Garcia, C. Ronda, y R. Lopez. 1987. Cloning, purification, and biochemical 5 characterization of the pneumococcal bacteriophage Cp-1 lysin. J Virol 61:2573-80.

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20 18. Maack, T., V. Johnson, S. T. Kau, J. Figueiredo, y D. Sigulem. 1979. Renal filtration, transport, and metabolism of low-molecular-weight proteins: a review. Kidney Int 16:251-70.

19. Mandell, L. A., L. R. Peterson, R. Wise, D. Hooper, D. E. Low, U. B. Schaad, K. P. Klugman, y P. Courvalin. 2002. The battle against emerging antibiotic resistance: should fluoroquinolones be used to treat children? Clin Infect Dis 35:721-7.

25 20. Morens, D. M., J. K. Taubenberger, y A. S. Fauci. 2009. The persistent legacy of the 1918 influenza virus. N Engl J Med 361:225-9.

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cell wall by modular pneumococcal phage endolysin CPL-1. J Biol Chem 282:24990-9.

23. Reinert, R. R. 2009. The public health ramifications of pneumococcal resistance. Clin Microbiol Infect 15 Suppl 3:1-3.

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25. Romero, P., R. Lopez, y E. Garcia. 2007. Key role of amino acid residues in the dimerization and catalytic activation of the autolysin LytA, an important virulence factor in Streptococcus pneumoniae. J Biol Chem 282:1772937.

40 26. Sanchez-Puelles, J. M., J. L. Garcia, R. Lopez, y E. Garcia. 1987. 3'-end modifications of the Streptococcus pneumoniae lytA gene: role of the carboxy terminus of the pneumococcal autolysin in the process of enzymatic activation (conversion). Gene 61:13-9.

27. Sulakvelidze, A., Z. Alavidze, y J. G. Morris, Jr. 2001. Bacteriophage therapy. Antimicrob Agents Chemother 45:649-59.

45 28. Sulakvelidze, A., y P. Barrow. 2005. Phage therapy in animals and agribusiness, p. 335-71. En E. Kutter y A. Sulakvelidze (ed.), Bacteriophages: Biology and Applications. CRC Press, USA.

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30. Varea, J., J. L. Saiz, C. Lopez-Zumel, B. Monterroso, F. J. Medrano, J. L. Arrondo, I. Iloro, J. Laynez, J. L. 50 Garcia, y M. Menendez. 2000. Do sequence repeats play an equivalent role in the choline-binding module of

pneumococcal LytA amidase? J Biol Chem 275:26842-55.

31. Witzenrath, M., B. Schmeck, J. M. Doehn, T. Tschernig, J. Zahlten, J. M. Loeffler, M. Zemlin, H. Muller, B. Gutbier, H. Schutte, S. Hippenstiel, V. A. Fischetti, N. Suttorp, y S. Rosseau. 2009. Systemic use of the endolysin Cpl-1 rescues mice with fatal pneumococcal pneumonia. Crit Care Med 37:642-9.

55

EJEMPLO2

ESTUDIOS IN VIVO EN ANIMALES

60 Eficacia destructiva intravenosa. Se infecto a ratones hembra C3H/HeJ de cuatro a seis semanas de edad a

traves de la vena de la cola con 3x107UFC de serotipo 14 de S. pneumoniae en fase logarftmica (cepa DCC1490, susceptible a la penicilina) y fueron tratados con diferentes concentraciones (100-2000 ug) Cpl-1 en 100 ul o el mismo volumen (100 ul) de tampon via intravenosa a las 10 horas tras la infeccion. Se extrajeron muestras de sangre previamente y a los 15 y 120 minutos tras el tratamiento, y se determinaron los tftulos bacterianos mediante 5 dilucion en serie y en placas en agar de sangre. La presencia de S. pneumoniae en colonias alfa-hemolfticas fue confirmada con el uso de discos de optochin.

EJEMPLO 3

10 ENZIMA PAL DIMERIZADA

Pal es una lisina estreptococica aislada a partir de un bacteriofago neumococico que digiere especfficamente la pared celular neumococica en segundos (Loeffler, JM y col. (2001) Science 294: 2170-2172; Patente de EE. UU. n.° 7.569.223). Pal es una protefna lftica de 296 aminoacidos con una masa molecular de 34 kDa y es una amidasa, 15 que escinde el peptidoglucano entre acido N-acetilmuramico y L-alanina. Cpl-1, descrita anteriormente, es una protefna de 339 aminoacidos y es una lisozima, que escinde el enlace glicosfdico entre acido N-acetilmuramico y N- acetilglucosamina (Garcia, P y col (1997) Microb Drug Resist 3:165-176). Mientras que ambas enzimas poseen muy diferentes sitios catalfticos de extremo N-terminal, estas comparten un sitio similar de union a la pared celular del extremo C-terminal, que las une a colina. Se ha descrito la eficacia destructiva mejorada de una combinacion de Pal 20 y Cpl-1 para S. Pneumoniae, que incluye cepas resistentes a penicilina (Loeffler, JM y Fischetti, VA (2003) Antimicrob Agents and Chemoth 47(1):375-377; PublishedPCT WO2004/058182).

Como en la Cpl-1, la region del extremo C-terminal de la enzima Pal incluye repeticiones de union a colina y aminoacidos de extremo C-terminal con correspondencia a LytA, de hecho 11 de los 14 aminoacidos del extremo C- 25 terminal de Pal son identicos a los de la secuencia de LytA. Al comparar Pal con Cpl-1, 9 de los 14 aminoacidos del extremo C-terminal de Pal resultan identicos a Cpl-1. Pal muestra una similitud global con Cpl-1 y LytA en su region del extremo C-terminal, en particular, a partir de los aminoacidos 155 a 296, donde 60 de estos 142 aminoacidos son identicos entre Pal, Cpl-1 y LytA. La Figura 7 representa las secuencias de aminoacidos de Cpl-1, Pal y LytA y evidencia las regiones del extremo C-terminal homologas en estas tres enzimas.

30

Mediante un enfoque comparable al descrito anteriormente para Cpl-1, el dfmero Pal compuesto de dos monomeros covalentemente unidos y estabilizados por un enlace disulfido es disenado y construido. La formacion de un puente disulfido entre dos monomeros de la enzima Pal se usa, como en la Cpl-1, para generar la enzima Pal predimerizada ejemplar.

35

La enzima Cpl-1 de tipo silvestre contiene tres residuos de cistefna en las posiciones de aminoacido 34, 113 y 250. Gracias al uso del servidor Accpro en el sitio web del predictor de protefnas SCRATCH (scratch.proteomics.ics.uci.edu/index), ninguno de los residuos de cistefna de Pal se previo accesible al disolvente. Asf, no se considero necesario disenar un mutante de Pal que careciera de cualquiera de las cistefnas de enzima 40 nativa antes de proceder a predimerizar Pal. Para construir la forma predimerizada de Pal, los aminoacidos de la region del extremo C-terminal son mutados en Cys. El nuevo residuo de cistefna se introduce especfficamente antes del tramo del aminoacido 14 en la cola del extremo C-terminal de la Pal para impedir alteraciones de cualquier estructura clave en esta region homologa. La mutacion se confirma mediante secuenciacion de ADN y la Pal mutante de tipo silvestre es sobreexpresada en las celulas de la cepa DH5a de E. coli y purificada para lograr 45 homogeneidad en una columna DEAE-Sepharose. La Pal mutante predimerizada es confirmada mediante una segunda banda que aparece a aproximadamente 70 kDa en el gel SDS-PAGE no reductor con tincion de Coomassie. La reduccion con 10 mM de ditiotreitol (DTT) llevo a la desaparicion de la banda mas alta de kDa, lo que

' ' 1 D280C 1

confirma que la forma dimerica relacionada con el enlace disulfido para Pal es reducible. La Pal que cuenta con el aminoacido 280 mutado en cistefna se construye, confirma y analiza para establecer la produccion de la enzima 50 Pal predimerizada. El mutante de PalD280C es analogo a Cpl-1C45S,D324C al ser predimerizado en una ubicacion comparable y adyacente a los 14 aminoacidos del extremo C-terminal analogos a LytA de Pal. Las pruebas in vitro e in vivo en relacion con la actividad y eficacia destructiva de la Pal dimerizada mutante se realizaron tal como se describe anteriormente para la Cpl-1 con el fin de demostrar la actividad antineumococica de la Pal dimerizada mutante.

55

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Universidad Rockefeller,

Fischetti, Vincent A

60 <120> Lisinas de bacteriofago dimericas

<130> 3268-1-008PCT <140> No asignado <141> 05/10/2012 <150>US 61/543.803 5 <151> 05/10/2011 <160> 6

<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 339 10 <212> PRT

<213> Streptococcus pneumoniae <400> 1

Met

Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ser Ser His Asn Gly

1

5 10 15

Tyr

Asp He Thr Gly lie Leu Glu Gin Met Gly Thr Thr Asn Thr He

20 25 30

He

Lys I le Ser Glu Ser Thr Thr Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala

35 40 45

Gin

Val Glu Gin Ser Asn Pro lie Gly Phe Tyr His Phe Ala Arg Phe

50 55 60

Gly

Gly

Asp Val Ala Glu Ala Glu Arq Glu Ala Gin Phe Phe Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Pro Met Gin Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp Asp 85 90 95

Pro Ser Gly Asp Ala Gin Ala Asn Thr Asn Ala Cys Leu Arg Phe Met 100 105 110

Gin Met lie Ala Asp Ala Gly Tyr Lys Pro lie Tyr Tyr Ser Tyr Lys

115 120 125

Pro Phe Thr His Asp Asn Val Asp Tyr Gin Gin lie Leu Ala Gin Phe

130 135 140

15

Pro Asn Ser Leu Trp lie Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160

Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly lie Arg Trp Trp Gin Tyr

165 170 175

Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn lie Val Leu Leu Asp Asp Glu Glu

180 185 190

Asp Asp Lys Pro Lys Thr Ala Gly Thr Trp Lys Gin Asp Ser Lys Gly 195 200 205

Trp Trp Phe Arg Arg Asn Asn Gly Ser Phe Pro Tyr Asn Lys Trp Glu

210 215 220

Lys lie Gly Gly Val Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Lys Gly Tyr Cys Leu 225 230 235 240

Thr—Ser—Glu Trp Leu Lys Asp Asn Asp Lys—Trp—Tyr—Tyr—Leu Lys—Asp 245 250 255

Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Val Leu Val Gly Ser Glu Trp Tyr

260 265 270

Tyr Met Asp Asp Ser Gly Ala Met Val Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys 275 280 285

Asn Asn Trp Tyr Tyr Met Thr Asn Glu Arg Gly Asn Met Val Ser Asn 290 295 300

Glu Phe lie Lys Ser Gly Lys Gly Trp Tyr Phe Met Asn Thr Asn Gly 305 310 315 320

Glu Leu Ala Asp Asn Pro Ser Phe Thr Lys Glu Pro Asp Gly Leu lie

325 330 335

Thr Val Ala

<210>2 <211> 318 5 <212> PRT

<213> Streptococcus pneumoniae <400>2

Met Glu lie Asn Val Ser Lys Leu Arg Thr Asp Leu Pro Gin Val Gly

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una lisina de fago especffico de Streptococcus dimerica y aislada que comprende dos monomeros de

   lisina de fago especffico de Streptococcus unidos covalentemente entre si, donde dicho dfmero posee actividad 5 destructiva contra una o mas bacterias de Streptococcus y donde cada monomero tiene un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, donde dichos monomeros de lisina estan unidos covalentemente entre si por un enlace disulfido, y donde dichos monomeros de lisina no poseen un residuo Cys en los 45 primeros residuos.

   10 2. La lisina de la reivindicacion 1, donde dichos monomeros de lisina son monomeros de Cpl-1 que

   tienen, al menos, un 90 % de identidad de secuencia con una Cpl-1 no mutada (SEQ ID NO: 1), y que tienen un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, o son monomeros Pal que tienen, al menos, una identidad de secuencia del 90 % con Pal no mutada (SEQ ID NO: 5) y que tiene un residuo Cys que esta entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal.

   15
2. 3. La lisina de la reivindicacion 1, donde dichos monomeros de lisina son seleccionados de entre (a) lisinas de Cpl-1 que comprenden una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y que tienen un residuo Cys que esta entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, tal como lisinas de Cpl-1 mutante que comprenden una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3 y (b) lisinas de Pal mutante que comprenden una secuencia de

   20 aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, y que tienen un residuo Cys que se encuentra entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, tales como lisinas de Pal mutante que comprenden una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.
3. 4. La lisina de la reivindicacion 1, donde dichos monomeros de lisina comprenden un dominio catalftico 25 de una primera lisina de fago especffico de Streptococcus y un dominio de union de una segunda lisina de fago

   especffico de Streptococcus.
4. 5. La lisina de la reivindicacion 4, donde el dominio catalftico de una primera lisina de fago especffico de Streptococcus es el dominio catalftico de la Cpl-1 (SEQ ID NO: 1), el dominio catalftico de una Cpl-1 mutante (SEQ

   30 ID NO:3), el dominio catalftico de Pal (SEQ ID NO:5) o el dominio catalftico de una Pal mutante (SEQ ID NO:6) y el dominio de union de una segunda lisina de fago especffico de Streptococcus es el dominio de union de Cpl-1 (SEQ ID NO:1) y tiene un residuo Cys que esta entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, tal como el dominio de union de la Cpl-1 mutante (SEQ ID NO:3) o el dominio de union de Pal (SEQ ID NO:5), y tiene un residuo Cys que esta entre 14 y 20 aminoacidos desde el extremo C-terminal, tal como el dominio de union de la Pal 35 mutante (SEQ ID NO:6).
5. 6. Una composicion que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de un mamffero que padece una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de estreptococos, o para la descolonizacion de estreptococos en un mamffero que

   40 padece o esta en riesgo de contraer una enfermedad o afeccion causada por una infeccion de estreptococos.
6. 7. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, donde dicha infeccion esta causada por la Streptococcus pneumoniae.

   45 8. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, donde dicha enfermedad o afeccion es

   una o mas enfermedades o afecciones seleccionadas de entre el grupo de bacteriemia, meningitis, neumonfa, otitis media y sinusitis.
7. 9. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de una lisina 50 dimerica de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y un vehfculo aceptable farmaceuticamente.
8. 10. Uso de una composicion antimicrobiana que comprende una lisina de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para sanear o descontaminar superficies porosas o no porosas.

   55 11. Un procedimiento para descontaminar superficies inanimadas sospechosas de contener bacterias

   infecciosas, que comprende el tratamiento de dichas superficies con una cantidad bacteriocidamente o bacteriostaticamente efectiva de una composicion antimicrobiana que comprende una lisina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

   60 12. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 9, donde la composicion comprende

   ademas uno o mas antibioticos.

   I -1

   LytA

   -1

   LytA.

   FIGURA 1

   MVKKNDLFVEVSSKNGYDITGILEQMGTTNT11KISESTTYLNPCLSAQVEQSNPIGFYH 60 -----MEINVS----KLRTDLPQVGVQPYRQVHAHSTG—NPHSTVQNEAD-----YH 42

   + + ■*■ +

   FARF GGD VAEAERE AQ FFLDNVPMQVKY LVL DY £ D DPSGDAQANTNACLR FMQMIADAGY 120 WRKD---PELGFFSHIVGNGCIMQVG-PVDNGAWDVGGGWNAETYAAVELIESHSTKEE 97

   + k * k » k k

   Cpl-1 KPIYYSY KPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGY GLNDGTANFEY FPSMDGIRVMQY SSNP 180

   LytA FMT DYRLYIELLRNLADE AG1PKTLDTGSLAGIKTHEYCTNNQPNNHSDHVDPY PY LAK- 156

   
   Cpl-1 FDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCL 240

   
   LytA WGISREQFKHDIENGLTIETGWQKNDTGYWYVHSDGSYPKDKFEKINGTWYYFDSSGYML 216

   ■ • • •• ■£• • • • k » k • • *k‘k»k*k*kkk-kkkk~kkkkkk

   • • « • •••♦» ♦ •••••*•••* * « ♦ • « *

   
   Cpl-1 rSEWLKDND-KWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERG 299

   
   LytA ADRWRKHT DGNWYWFDNSGEMAT GWKKIAD KWYY FNEEGAMKTGWVKY KDTWYY LDAKEG 27 6

   ■ if k k • k k • • • k k k k k k • • k k k • m • -k -k k kkkkkkk» k -k k • ■ k

   Cpl-1 NMVSNEFIK— SGKGWYFMNTNGELADHPSFTKEPDGLITVA 33 9

   LytA AMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLADRTEFTVEPDGLITVK 318

   k k k k kk *

   imagen1

   imagen2

   imagen3

   imagen4

   FIGURA 6

   Cpl-l

   C45S

   C45S,D324C

   Cpl-l

   C45S

   C45SJ3324C

   Cpl-l

   C45S

   C45S.D324C

   Cpl-l

   C45S

   C45S.D324C

   Cpl-l

   C45S

   C45SJ3324C

   Cpl-l

   C45S

   MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPCLSAQVEQSNPIGFYH 60 MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPSLSAQVEQSNPIGFYH 60 MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPSLSAQVEQSNPIGFYH 60

   FARFGGDVAE AERE AQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDD PSGDAQANTNACLRFMQMI ADAGY 120 FARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGY 120 FARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGY 120

   KP1YYSYKPFTHDNVDYQQXLAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNP 180 KPIYYSYKPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNP 180 KPIYYSYKPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNP 180

   FDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCL 240 FDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCL 240 FDKNIVLLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVWYYFDSKGYCL 240

   TSEWLKDNDKWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERG 299 TSET^KDNDKWY YLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERG 2 99 TSEWLKDNDKWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERG 2 99

   NMVSNEFIKSGKGWYFMNTNGELADNPSFTKEPDGLITVA 339 NMVSNEFIKSGKGWYFMNTNGELADNPSFTKEPDGLITVA 339 NMVSNEFIKSGKGWYFMNTNGELACNPSFTKEPDGLITVA 339

   C45SJJ324C

   imagen5

   FIGURA 7

   Cpl-l MVKKN’DLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPCLSAQVEQSNPIGFYH 60

   Pal

   LytA

   Cpl-l

   Pal

   LytA

   -MEINVS-

   MGVDIEKGVAWMQ 13 -KLRTDLPQVGVQPYRQVHAHSTG--NPHSTVQNEAD----YH 42

   FARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYEDDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGY 120 ARKGRVSYSMDFRDGPDSYDCSSSMYYALRSAGASSAGWAVNTEYMHAW1IENGYELISE 73 WRKD---PELGFFSHIVGNGCIMQVG-PVDNGAWDVGGGWNAE T YAAVE LIESHSTKEE 97

   Cpl-l KPIYYSYKPFTHDNVDYQQILAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNP 180 Pal NAPWDAKRGDIFIWGRKGASAGAGGHTGMFIDSDNIIHCNYAYDGIVNDHDERWYYAGQP 134 LytA FMTDYRLYIELLRNLADEAGLPKTLDTGSLAGIKTHEYCTNNQPNNHSDHVDPYPYLAK- 156

   Cpl-l FDKNIVLL DDEEDDKPKTAGTWKQDS KGWWF RRNNGSF PYNKWEKI--GGVWYYFDS KGYC L 240 Pal YYYVYRLTNANAQPAEKKLG-WQKDATGFWYARANGTYPKDEFEYIEENKSWFYFDDQGYML 195 LytA WGISREQFKHDIENGLTIETGWQKNDTGYWYVHSDGSYPKDKFEKI—NGTWYYFDSSGYML 216

   Cpl-l TSEWLKDND-KWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYMDDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERG 299 Pal AEKWLKHTDGNWYWFDRDGYMATSWKRIGESWYYFNRDGSMVTGWIKYYDNWYYCDATNG 255 LytA ADRWRKHLDGNWYWFDNSGEMATGWKKIADKWYYFNEEGAKKTG'WVKYKETWYYLDAKEG 27 6

   *****

   * * *** **

   Cpl-l NMVSNEFIK--SGKGWYFMMTNGELAC NPSFTKEPDGLITVA 339 Pal DMKSNAFIR—YNDGWYLLLPDGRLACI "

   LytA AMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLABl

   KPQFTVEPDGLITAKV 296 KPEFTVEPDGLITVK 318

   k + ■*• k k

   k k k k k k k k k k k k k