CN104114695B - 二聚噬菌体溶素 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离的二聚链球菌属(streptococcus)‑特异性噬菌体溶素具有彼此共价连接的2个链球菌属(streptococcus)‑特异性噬菌体溶素单体，及针对一种或更多链球茵属(streptococcus)细菌具有杀灭活性。也提供二聚溶素的药物组合物和它们用于治疗性治疗或缓和感染或细菌定居的用途。二聚溶素也可用于净化多孔和非‑多孔表面或装置。

Description

二聚噬菌体溶素
【技术领域】
本发明涉及用于检测及杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的二聚溶素的产生和使用，尤其是突变体溶素，其能二聚化为具有增强的活性和/或稳定性的二聚溶素。本发明涉及用于细菌，特别链球菌属(Streptococcus)细菌株，及相关的病情的预防性和治疗性改善，去定居和处理的方法。本发明的方法利用二聚噬菌体溶素，特别二聚肺炎球菌噬菌体溶素，包括Cpl-1裂解性酶和其变体。
【背景技术】
随着更多抗生素用于广泛的病和其他病情，药物抗性细菌的出现已是医学中的主要问题。医院感染是美国死亡的第8号主导原因，大多由于耐药的和新出现的病原体。更多抗生素使用和显示抗性的细菌数提示了更长治疗时间。此外，现在更频繁地使用广谱非特异性抗生素，其中一些对患者具有有害效应。随此增加的使用的相关的问题是许多抗生素不容易穿透粘液衬。此外，对抗生素过敏的人数呈现增加。因此，对新抗细菌方法，尤其经新模式操作或提供杀灭病原性细菌的新手段的那些有商业需求。
革兰氏阳性细菌被含有多肽和多糖的细胞壁围裹。革兰氏阳性细胞壁呈现为广泛密壁，其20～80nm厚及由多个肽聚糖互连层组成。60％和90％之间的革兰氏阳性细胞壁是肽聚糖，提供细胞形状，刚性结构，及对渗透休克的抗性。细胞壁不排斥革兰氏染色结晶紫，允许细胞染成紫色，由此称为“革兰氏阳性”。革兰氏阳性细菌包括但不限于放线菌属(Actinomyces)，芽孢杆菌属(Bacillus)，利斯特菌属(Listeria)，乳球菌属(Lactococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，棒杆菌属(Corynebacterium)和梭菌属(Clostridium)。医学上关联物种包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
抑制细胞壁合成的抗细菌剂，诸如青霉素和头孢菌素，干扰肽聚糖肽间连接及减弱革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁。因为革兰氏阳性细菌的肽聚糖被暴露，革兰氏阳性细菌是更敏感于这些抗生素。有利地，缺乏细胞壁的真核生物细胞及不敏感于这些药物或其他细胞壁剂。
已尝试通过使用噬菌体治疗细菌疾病。但是，噬菌体直接导入动物来预防或抵御疾病具有特定缺点。特别是，细菌和噬菌体需处于用于噬菌体附着的正确及同步的生长循环。此外，必需有正确数量的噬菌体以附着于细菌；如果有太多或太少噬菌体，会无附接或无裂解酶产生。噬菌体必需也有足够活性。噬菌体也被许多物质抑制，包括来自其欲攻击的生物的细菌碎片。使直接使用噬菌体治疗细菌感染变得更复杂的是致使噬菌体非-功能性的免疫学反应的可能性。
新抗微生物治疗方法包括基于酶的抗生素(“酶抗生素”)诸如噬菌体溶素。噬菌体使用这些溶素消化它们的细菌宿主的细胞壁，通过低渗裂解释放病毒后代。当纯化的、重组溶素被外部添加到革兰氏阳性细菌时，导致类似结果。针对革兰氏阳性病原体的溶素的高致死活性使得它们成为作为治疗剂开发的有吸引力的候选体。噬菌体溶素起初被建议用于根除病原性链球菌的鼻咽集落(Loeffler,J.M.et al(2001)Science 294:2170-2172；Nelson,D.et al(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。溶素是双链DNA(dsDNA)噬菌体用以使宿主裂解与完成病毒组装配合而使用的裂解性机理的部分(Wang,I.N.等人(2000)Annu Rev Microbiol 54:799-825)。噬菌体编码在细菌膜打开孔隙的穿孔素，及被称为使细菌壁中的键断裂的溶素的肽聚糖水解酶。在感染后期，溶素转位进细胞壁基质中，其中其快速水解对于肽聚糖完整性必要的共价键，导致细菌裂解和相伴的后代噬菌体释放。
溶素家族成员呈现模块设计，其中催化性结构域融合到特异性或结合结构域(Lopez,R.等人(1997)Microb Drug Resist 3:199-211)。溶素可从细菌基因组之内的病毒原噬菌体序列克隆，并用于治疗(Beres,S.B.等人(2007)PLoS ONE 2(8):1-14)。当外部添加时，溶素能接近革兰氏阳性细胞壁的键(图1)(Fischetti,V.A.(2008)Curr OpinionMicrobiol 11:393-400)。溶素已显示针对多种革兰氏阳性病原体(尤其克隆它们的细菌)展示高致死活性，提起它们作为治疗剂开发的可能性(Fischetti,V.A.(2008)CurrOpinion Microbiol 11:393-400；Nelson,D.L.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。
噬菌体裂解性酶已建立为在评定和通过各种施用途径特定治疗各种类型的受试者感染中有用。例如，美国专利5,604,109(Fischetti等人)涉及通过酶促消化(通过半-纯化的组C链球菌噬菌体关联的溶素酶)而快速检测临床样本中的组A链球菌。此酶工作成为另外的研究的基础，导致治疗疾病的方法。Fischetti及Loomis专利(美国Patents 5,985,271,6,017,528和6,056,955)公开了由用C1噬菌体感染的组C链球菌细菌产生的溶素酶的使用。美国专利6,248,324(Fischetti和Loomis)公开了用于皮肤病学感染的组合物，其使用在由在适合局部应用于真皮组织的载体中的裂解性酶。美国专利6,254,866(Fischetti和Loomis)公开了治疗消化道细菌感染的方法，包括施用特异于感染细菌的裂解性酶。用于递送至少一种裂解性酶至消化道的载体选自：栓剂灌肠剂，糖浆或肠包被的丸剂。美国专利6,264,945(Fischetti和Loomis)公开了由肠胃外导入(肌内,皮下或静脉内)由用特异于该细菌的噬菌体感染的细菌产生的至少一种裂解性酶和用于将裂解性酶递送进患者的适当的载体来治疗细菌感染的方法和组合物。
已自各种噬菌体鉴定及克隆噬菌体关联的裂解性酶，各显示在杀灭特定细菌株中有效。美国专利7,402,309，7,638,600及公开的PCT申请WO2008/018854提供作为治疗或减少炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)感染的抗细菌剂有用的不同噬菌体-关联的裂解性酶。美国专利7,569,223描述肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌噬菌体裂解性酶Pal。对于肠球菌属(Enterococcus)(粪肠球菌(E.faecalis)及屎肠球菌(E.faecium)，包括万古霉素抗性株)有用的溶素描述于美国专利7,582291。US 2008/0221035描述在杀灭组B链球菌中高度有效的突变Ply GBS溶素。表示为ClyS的嵌合溶素，其具有针对葡萄球菌属(Staphylococci)细菌，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的活性，详述于WO 2010/002959。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎链球菌(S.pneumoniae))，革兰氏阳性包裹的双球菌，是人病诸如菌血症，脑膜炎，肺炎，中耳炎及鼻窦炎的主要病原因子。此细菌负责每年世界上>1百万5岁以下儿童的死亡(English,M(2000)Paediatr Respir Rev1:21-5)和社区-获取的肺炎是USA中死亡的第6大最常见原因(File,TM(2004)Am J Med117Suppl 3A：39S～50S)。而且，肺炎链球菌(S.pneumoniae)是世界上急性中耳炎的主要原因，每年在USA影响多于5百万儿童的疾病(CDC(2009)Pneumococcal diseases,p.217-30.In W.Atkinson,et al(ed.),Epidemiology and prevention of vaccine-preventable diseases(11th ed),Public Health Foundation,Washington DC)。最后，流感大流行病所致的继发感染占>90％的死亡，其中肺炎链球菌(S.pneumoniae)是这些死亡的主导原因(Brundage,JF Shanks GD(2008)Emerg Infect Dis 14:1193-9；Brundage,JFShanks GD(2007)J Infect Dis 196:1717-8；Morens,DM et al(2009)N Engl J Med 361:225-9；Morens,DM et al(2009)Public Health Rep 124:22-5)。肺炎球菌感染常常用抗生素治疗，但由于就大环内酯，氟喹诺酮和头孢菌素报道的增加的抗性发生率(Reinert,RR(2009)Clin Microbiol Infect 15Suppl 3:1-3)而细菌学地被确认治疗失败(Mandell,LAet al(2002)Clin Infect Dis 35:721-7)。治疗百万中耳炎病例所致的抗生素的过度使用和误用仅贡献于抗性株的出现(Goossens,H(2009)Clin Microbiol Infect 15Suppl 3:12-5)。总之，这些观察促使了对于由完全不同机理的发挥作用，用于治疗和预防肺炎球菌关联的疾病的新药物的需求。
在发现抗生素之前，噬菌体，细菌的天然主要捕食者，被视为控制病原性细菌的可能的方法。那时公开了成功的使用噬菌体治疗感染的几则报道(Sulakvelidze,A andBarrow,P(2005)Phage therapy in animals and agribusiness,p.335-71.In E.Kutterand A.Sulakvelidze(ed.),Bacteriophages:Biology and Applications,CRC Press,USA；Sulakvelidze,A and Kutter,E(2005)Bacteriophage therapy in humans,p.381-426.In E.Kutter and A.Sulakvelidze(ed.),Bacteriophages:Biology andApplications,CRC Press,USA)，但40年代抗生素的出现导致西方世界噬菌体治疗研究的快速减少。过去的几十年见到对噬菌体治疗和噬菌体来源的抗-细菌化合物的新兴趣(Borysowski,J等人(2006)Exp Biol Med 231:366-77；Fischetti,VA(2008)Curr OpinMicrobiol 11:393-400)。
这些产品之一，噬菌体内溶素或溶素，已被开发用于它们对革兰氏阳性细菌的快速杀灭作用(Borysowski,J等人(2006)Exp Biol Med 231:366-77；Fischetti,VA(2008)Curr Opin Microbiol 11:393-400)。这些特定酶在噬菌体后代要逃脱细菌宿主时产生。肺炎球菌噬菌体Cp-1产生溶素Cpl-1，37kDa酶。此溶素如全部此类内溶素一样构成，具有2个由柔性的接头连接的良好定义的结构域。催化性活性局限于N-端结构域，而含有6个胆碱-结合重复子(ChBR)和13个氨基-酸的C-端尾的C-端部分，在肺炎球菌细胞壁中的底物结合中需要。Cpl-1属于靶向肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺残基之间的β1,4连接的溶菌酶的家族(Perez-Dorado,INE et al(2007)J Biol Chem 282:24990-9)。其胆碱-依赖性活性使Cpl-1高度特异于肺炎链球菌(S.pneumonia)(Garcia,JL等人(1987)J Virol61:2573-80)。Cpl-1基因已被克隆进高表达载体pinIIIAn，然后被过表达及纯化(Loeffler,JM et al(2003)Infect Immun 71:6199-204)。
纯化的Cpl-1已成功地在啮齿动物模型中被测试用于治疗肺炎球菌脓毒症(Jado,I et al(2003)J Antimicrob Chemother 52:967-73；Loeffler,JM and Fischetti,VA(2003)Antimicrob Agents Chemother 47:375-7)，心内膜炎(Entenza,JM et al(2005)Antimicrob Agents Chemother 49:4789-92)，肺炎球菌脑膜炎(Grandgirard,D et al(2008)J Infect Dis 197:1519-22)，及肺炎(Witzenrath,M等人(2009)Crit Care Med37:642-9)。然而，蛋白通常快速体内清除，而在至今实施的许多研究中需要Cpl-1的重复的注射或甚至连续输注(Entenza,JM et al(2005)Antimicrob Agents Chemother 49:4789-92.31；Witzenrath,M et al(2009)Crit Care Med 37:642-9)。
这些结果可为Cpl-1和类似溶素的临床开发的缺点。本领域需要具有杀灭活性且增强的临床-关联参数，诸如更长半衰期或减少的体内清除的可用于治疗肺炎球菌疾病的改良的溶素。
【发明概述】
在总的方面，本发明提供突变体溶素，突变得具有容易二聚化的能力，由此产生具有增强的活性或细菌杀灭活性，及更大稳定性，包括在动物或哺乳动物中更长期稳定性和在临床学相关的或生物学相关的环境中更久发挥细菌杀灭能力的二聚溶素。
一方面，本发明提供分离的二聚抗-细菌噬菌体溶素，其包含2个特异于细菌的彼此共价连接的噬菌体溶素单体，其中所述二聚体针对一种或更多特定细菌具有杀灭活性。一方面，本发明提供分离的二聚链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素，其包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性。在特定实施方式中，溶素单体与图1和6和SEQ ID NO:1中所示未突变的Cpl-1溶素具有至少80％，至少90％，至少95％氨基酸序列同一性。在特定实施方式中，溶素单体与图7和SEQ ID NO:5中所示未突变的Pal溶素具有至少80％，至少90％，至少95％氨基酸序列同一性。
在特定实施方式中，溶素单体彼此化学交联。在一该实例中，单体可经反应性基团或经单体序列中的氨基酸，包括修饰的，改变的或突变氨基酸化学交联。溶素单体可彼此由二硫键共价连接。在特定例示实施方式中，各溶素单体在紧邻于C-端，特别在自C-端14和20个氨基酸之间具有Cys残基。在特定实施方式中，溶素单体在头45个残基中不具有Cys残基。例示突变Cpl-1溶素在本文提供，包括在图6和表1中。在一特定实施方式中，溶素单体具有图6中所示或表1中提供的氨基酸序列。在另一实施方式中，溶素单体具有图7所示的氨基酸序列。在特定实施方式中，溶素单体包含第1链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素的催化性结构域和第2链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素的结合结构域。
本发明提供通过施用包含治疗有效量的包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素的组合物来治疗由链球菌感染导致的哺乳动物患疾病或病情的方法，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性。在特定实施方式中，感染由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)导致。由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染导致的疾病或病情可为菌血症，脑膜炎，肺炎，中耳炎，或鼻窦炎中的至少一种。
本发明提供通过施用包含治疗有效量的包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素的组合物来抑制或去定居哺乳动物中的链球菌感染的方法，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性。在特定实施方式中，感染由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)导致。由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染导致的疾病或病情可为菌血症，脑膜炎，肺炎，中耳炎，或鼻窦炎中的至少一种。
在本发明的一方面，提供杀灭革兰氏阳性细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭革兰氏阳性细菌有效的突变二聚溶素多肽的组合物接触的步骤，其中单体溶素被修饰或改变为包含彼此共价连接的2个抗细菌性噬菌体溶素单体和对于杀灭革兰氏阳性细菌有效的二聚溶素多肽。在特定该方面，提供杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的突变二聚溶素多肽的组合物接触的步骤，其中单体链球菌属(Streptococcus)溶素被修饰或改变为包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)噬菌体溶素单体和对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的二聚溶素多肽。
由此，提供杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的分离的二聚链球菌属(Streptococcus)Cpl-1溶素多肽(含有包含彼此共价连接的2个Cpl-1溶素单体的突变Cpl-1溶素的分离的溶素多肽)的组合物接触的步骤。在特定方面，提供杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的分离的溶素多肽(包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％同源性，85％同源性，90％同源性或95％同源性和对于杀灭革兰氏阳性细菌有效的其变体的分离的溶素多肽)的组合物接触的步骤。
还提供杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的分离的二聚链球菌属(Streptococcus)Pal溶素多肽(含有包含彼此共价连接的2个Pal溶素单体的突变Pal溶素的分离的溶素多肽)的组合物接触的步骤。在特定方面，提供杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌的方法，包括使细菌与包含一定量的对于杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌有效的分离的溶素多肽(包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％同源性，85％同源性，90％同源性或95％同源性和对于杀灭革兰氏阳性细菌有效的其变体的分离的溶素多肽)的组合物接触的步骤。
本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性，及药学可接受的载体。
本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性，且其中所述杀灭活性大于链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体中的任何一种的杀灭活性，及药学可接受的载体。
在另外的方面，本发明提供用于清洁或净化多孔或非-多孔表面的抗-微生物组合物，其包含包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性。
本发明的组合物可针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌株特别展示或具有杀灭活性，特别选自：猪链球菌(Streptococcus suis)，马链球菌(Streptococcusequi)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(GBS)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(GAS)，血链球菌(Streptococcus sanguinis)，格氏链球菌(Streptococcusgordonii)，停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)，链球菌属(Streptococcus)GES和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)。
本发明提供净化怀疑含有感染性细菌的无生命的表面的方法，包括用杀细菌地或抑细菌地有效量的包含包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体的二聚溶素的清洁或净化多孔或非-多孔表面的抗-微生物组合物处理所述表面，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有杀灭活性。
本发明包括包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素结合结构域的二聚蛋白。本发明提供包含彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素结合结构域的二聚蛋白，其中所述噬菌体溶素结合结构域中的至少一个还缀合标记物。标记物可为产生，或可被诱导产生，可检测的信号的任何分子。标记物的非限制性例包括放射性同位素，酶，酶片段，酶底物，酶抑制物，辅酶，催化剂，荧光团，染料，化学发光剂，发光剂或敏化剂；非-磁或磁粒子，固体支持物，脂质体，配体，或受体。
本发明的诊断实用性延伸至将本溶素多肽用于筛选革兰氏阳性细菌的存在，筛选易感的革兰氏阳性细菌的存在，或测定细菌对由本发明的一种或更多溶素多肽杀灭或裂解的易感性的测定。
在本文涵盖及提供被修饰及嵌合或是融合蛋白，或被标记的溶素多肽。在嵌合或融合蛋白中，本发明的溶素多肽可共价附接于可提供另外的功能或增强溶素多肽的用途或应用的实体，包括例如标签，标记物，靶向部分或配体，细胞结合或细胞识别基序或试剂，抗细菌剂，抗体，抗生素。例示标记物包括放射性标记物，诸如同位素3H，14C，32P，35S，36Cl，51Cr，57Co，58Co，59Fe，90Y，125I，131I和186Re。标记物可为酶，标记的溶素多肽的检测可由本领域知道的任何目前利用的或接受的比色，分光光度计测量，荧光分光光度计测量，电流测定或气体定量技术实现。
本领域技术人员参看以下说明，参照以下例示图而明晰其他目的和优势。
【附图说明】
图1.Cpl-1(SEQ ID NO:1)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)LytA(SEQ ID NO:2)氨基酸序列的ClustalW比对。2个催化性残基(D10和E94)以红色显示。lytA的天然的二聚化中涉及的13个氨基酸及Cpl-1中的对应氨基酸通过加下划线显示。残基D324以蓝色显示。
图2A～2C描绘(A)纯化的Cpl-1的考马斯染色的非-还原SDS-PAGE凝胶。泳道1，分子量标志物，及泳道2，由在DEAE-琼脂糖上亲和纯化获得的纯化的Cpl-1。(B)纯化的Cpl-1C45S,D324C突变体的考马斯染色的非-还原SDS-PAGE凝胶。泳道1，分子量标志物。泳道2，由在DEAE-琼脂糖上亲和纯化获得的纯化的Cpl-1C45S,D324C，及泳道3，用10mM的DTT还原的Cpl-1C45S,D324C。(C)在Sephadex G100上凝胶过滤之后纯化的Cpl-1C45S,D324C突变二聚体富集物的考马斯染色的非-还原SDS-PAGE凝胶。泳道1，分子量标志物。泳道2，由在Sephadex G100上凝胶过滤获得的纯化的Cpl-1C45S,D324C二聚体(第1纯化)，及泳道3，由在Sephadex G100上凝胶过滤获得的纯化的Cpl-1C45S,D324C二聚体(第2纯化)。
图3显示于37℃温育15分钟之后Cpl-1对肺炎链球菌(S.pneumoniae)DCC1490的5.108CFU/ml悬浮液的体外抗-细菌活性。Cpl-1wt(实心圆形)，1mM DTT中的Cpl-1C45S,D324C单体形式(空心矩形)，及Cpl-1C45S,D324C二聚体(开环)。对于各酶和条件n＝4。
图4.小鼠中酶抗生素的血浆清除。给Balb/c小鼠注射100μl PB50mM，pH7.4中的12.16nmol的Cpl-1(实心圆形)或Cpl1C45S,D324C二聚体(开环)，对于各时间点n＝3。
图5.于37℃，几种纯化的Cpl-1突变二聚体对肺炎链球菌(S.pneumoniae)DCC1490的5.108CFU/ml悬浮液的体外抗-微生物活性。Cpl-1wt(实心圆形)，Cpl-1C45S,Q85C二聚体(实心菱形)，Cpl-1C45S,D194C二聚体(实心三角形)，Cpl-1C45S,N214C二聚体(实心矩形)，Cpl-1C45S ,G216C二聚体(空心三角形)，Cpl-1C45S,D256C二聚体(菱形)，Cpl-1C45S,S269C二聚体(开环)，Cpl-1C45S,D324C二聚体(空心矩形)。以0.5mg/ml的浓度测试全部酶。各点表示3次实验的平均值。
图6描绘(未突变的)Cpl-1(SEQ ID NO:1)，及突变体溶素C45S(SEQ ID NO:4)和C45S,D324C(SEQ ID NO:3)的对齐的氨基酸序列。突变体中的氨基酸变化加了下划线。
图7描绘Cpl-1(SEQ ID NO:1)，Pal(SEQ ID NO:5)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)LytA(SEQ ID NO:2)氨基酸序列的对齐的氨基酸序列。在全部3个序列之中相同的氨基酸由星号*表示。LytA的天然的二聚化中涉及的13个氨基酸和Cpl-1及Pal中的类似氨基酸通过加下划线及加粗指示。框住Cpl-1(残基D324)和Pal(残基D280)的例示二聚体突变体中突变的对应氨基酸。
【发明详述】
在本文描述针对肺炎链球菌(S.pneumoniae)具有杀灭活性的二聚链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素。一般而言，二聚噬菌体溶素含有彼此共价连接的2个链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素单体，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌具有活性。溶素二聚体的溶素单体可与未突变的Cpl-1(图1,SEQID NO:1)具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或甚至至少99.5％氨基酸序列同一性。溶素二聚体的溶素单体可与未突变的Pal(图7,SEQ ID NO:5)具有至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或甚至至少99.5％氨基酸序列同一性。本文提供的稳定化的二聚溶素展示增加的细菌杀灭活性，原单体分子的大致两倍体外抗-细菌活性。二聚溶素也在感染后5分钟和5小时之间显示接近10倍降低的血浆清除，在血浆或动物中具有降低的血浆清除或增加的稳定性。
图1展示LytA的C-端区的氨基酸序列和链球菌属(Streptococcus)溶素Cpl-1同源(73/142相同残基,及55/69个残基是保守性取代)。C-端13个氨基酸负责肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)自溶素LytA的二聚化。有趣的是，在此区内，Cpl-1和LytA之间10/13氨基酸是同一的。完全有活性的LytA是由通过胆碱相互作用起始的2个LytA单体的尾尾关联组成的胆碱-结合同源二聚体。二聚化的主驱动力由C-端胆碱结合区6和7中的几个残基之间的分子间疏水相互作用产生的疏水核心提供(8)。LytA的13个C-端残基负责有活性的同源二聚体的形成，其活性显著地大于天然单体。实际上，缺少此13个氨基酸延伸物的LytA的重组单体形式(27)保留小于10％的酶的催化效率(24)。Cpl-1和LytA的序列比对揭示的延伸的相似性，尤其在LytA二聚化中涉及的酶的C-端尾之内(图1)。人中被估计大致60～65kDa的血管球过滤阈值的存在(17)提示Cpl-1的二聚形式(74kDa的MW)可显示相比单体系统性清除显著减小。由共价键连接及由二硫键稳定化的2个单体组成的Cpl-1二聚体由此已在本文加工及检查其相比Cpl-1的单体形式的体外活性和体内血浆清除。而且，及因为几种其他噬菌体溶素已显示或怀疑二聚化(25,26)，此代表增加特定噬菌体溶素的活性和/或药代动力学的一般方式。
根据本发明可采用本领域技术人员的技能之内的常规分子生物学，微生物学和重组DNA技术。该技术在文献中完全解释。见，例如，Sambrook等人，"Molecular Cloning:ALaboratory Manual"(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III[Ausubel,R.M.,ed.(1994)]；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III[J.E.Celis,ed.(1994))]；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III[Coligan,J.E.,ed.(1994)]；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed.1984)；"Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；"TranscriptionAnd Translation"[B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)。
因此，如果在本文出现，以下术语应具有如以下及此部分提供及给出的定义。
术语"链球菌属(Streptococcus)二聚体溶素"，"Cpl-1二聚溶素"，"Cpl-1二聚体”，“二聚Cpl-1”和未特别列出的任何变体，可在本文互换使用，及如贯穿本申请和权利要求使用指称包括单或多个蛋白，及特别二聚体蛋白的蛋白性物质，及延伸至具有本文所述的及图6和表1，及SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列数据，及本文及权利要求中所述的活性特征的那些蛋白。因此，同样涵盖显示基本上相当或改变的活性的蛋白。这些修饰可为有意的，例如，诸如通过定点诱变获得的修饰，或可为意外的，诸如通过作为复合物或其命名的亚基的生产者的宿主中突变获得的那些。而且，术语"链球菌属(Streptococcus)二聚体溶素"，"Cpl-1二聚溶素"，"Cpl-1二聚体”，“二聚Cpl-1”旨在包括在本文特别引用的蛋白以及全部基本上同源类似物，片段或截短，及等位基因变异的范围之内。
术语"链球菌属(Streptococcus)二聚体溶素"，"pal二聚溶素"，"pal二聚体”，“二聚Pal”和未特别列出的任何变体，可在本文互换使用，及如贯穿本申请和权利要求使用指称包括单或多个蛋白，及特别二聚体蛋白的蛋白性物质，及延伸至具有本文所述及图7中，及SEQ ID NO:5中显示的氨基酸序列数据，及本文及权利要求中所述的活性特征的那些蛋白。因此，蛋白显示基本上相当体或改变的活性同样涵盖。这些修饰可为有意的，例如，诸如通过定点诱变获得的修饰，或可为意外的，诸如通过作为复合物或其命名的亚基的生产者的宿主中突变获得的那些。而且，术语"链球菌属(Streptococcus)二聚体溶素"，"pal二聚溶素"，"pal二聚体”，“二聚Pal”旨在包括在本文特别引用的蛋白以及全部基本上同源类似物，片段或截短，及等位基因变异的范围之内。
【多肽和裂解性酶】
"裂解性酶"包括在适合的条件下及在关联时期期间杀灭一种或更多细菌的任何细菌细胞壁裂解性酶。裂解性酶的例包括，无限制地，各种酰胺酶细胞壁裂解性酶。
"链球菌属(Streptococcus)裂解性酶"包括能在适合的条件下及在关联时期期间杀灭至少一种或更多链球菌属(Streptococcus)细菌的裂解性酶。
"噬菌体裂解性酶"指称自噬菌体提取的或分离的裂解性酶或具有维持裂解性酶功能性的类似蛋白结构的合成的裂解性酶。
裂解性酶能特别切割存在于细菌细胞的肽聚糖的键而破坏细菌细胞壁。目前也假定细菌细胞壁肽聚糖在多数细菌之中高度保守，及仅少个键合的切割可破坏细菌细胞壁。噬菌体裂解性酶可为酰胺酶，尽管其他类型的酶是可能的。切割这些键的裂解性酶的例是各种酰胺酶诸如胞壁质酶，氨基葡萄糖苷酶，内肽酶或N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。Fischetti等人(2008)报道C1链球菌噬菌体溶素酶是酰胺酶。Garcia等人(1987,1990)报道来自Cp-1噬菌体的来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cpl溶素是溶菌酶。Caldentey及Bamford(1992)报道来自phi 6假单胞菌属(Pseudomonas)噬菌体的裂解性酶是分裂由间-二氨基庚二酸和D-丙氨酸形成的肽桥的内肽酶。大肠埃希氏菌(E.coli)T1和T6噬菌体裂解性酶是如来自利斯特菌属(Listeria)噬菌体(ply)的裂解性酶的酰胺酶(Loessner等人,1996)。也有本领域知道的能切割细菌细胞壁的其他裂解性酶。
"由噬菌体遗传编码的裂解性酶"包括能例如通过具有针对宿主细菌的至少一些细胞壁裂解性活性杀灭宿主细菌的多肽。多肽可具有包括天然序列裂解性酶和其变体的序列。多肽可从各种来源，诸如自噬菌体("噬菌体")分离，或由重组或合成方法制备，诸如由Garcia等人描述的那些和也如在本文提供。多肽可在羧基末端侧包含胆碱结合部分和可特征在于在氨基末端侧能切割细胞壁肽聚糖的酶活性(诸如作用于肽聚糖中的酰胺键的酰胺酶活性)。已描述包括多种酶活性，例如2个酶促结构域的裂解性酶，诸如PlyGBS溶素。一般而言，裂解性酶的分子量可在25,000和35,000Da之间及包含单个多肽链；但是，此可依赖于酶链改变。分子量可通过在变性十二烷基硫酸钠凝胶电泳上测定和与分子量标志物比较来最便利地测定。
"天然序列噬菌体关联的裂解性酶"包括与源于细菌的酶具有相同的氨基酸序列的多肽。该天然序列酶可是分离的或可由重组或合成手段产生。
术语"天然序列酶"包括酶的天然存在的形式(例如,替代性地剪接的或改变的形式)和天然存在的变体。在本发明的一实施方式中，天然序列酶是由来自特异于链球菌属(Streptococcus)的噬菌体的基因遗传编码，及特别是天然Cpl-1溶素或天然Pal溶素的成熟或全长多肽。当然，许多变体是可能的及知道的，如在出版物诸如Lopez et al.,Microbial Drug Resistance 3:199-211(1997)；Garcia et al.,Gene 86:81-88(1990)；Garcia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:914-918(1988)；Garcia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:914-918(1988)；Garcia et al.,Streptococcal Genetics(J.J.Ferretti and Curtis eds.,1987)；Lopez et al.,FEMS Microbiol.Lett.100:439-448(1992)；Romero et al.,J.Bacteriol.172:5064-5070(1990)；Ronda et al.,Eur.J.Biochem.164:621-624(1987)and Sanchez et al.,Gene 61:13-19(1987)中公认的。各这些参考文献的内容，特别序列表及比较序列的关联的文本，包括关于序列同源性的声明，特别通过引用以它们的整体并入本文。
"变体序列裂解性酶"包括由不同于裂解性酶的多肽序列，但保留功能活性表征的裂解性酶。裂解性酶可，在一些实施方式中，由特异于链球菌属(Streptococcus)的噬菌体遗传编码，其与本裂解性酶序列，如图1，图6和图7中提供的，包括SEQ ID NO:3，4和5的变体裂解性酶具有特定氨基酸序列同一性。例如，在一些实施方式中，有功能活性的裂解性酶可通过破坏细菌的细胞壁杀灭链球菌属(Streptococcus)细菌，及其他敏感的细菌，如在本文提供，或如之前描述及本领域技术人员知道的。有活性的裂解性酶(如图1，图6和图7中提供的，包括SEQ ID NO:3，4和5的变体裂解性酶)可与本裂解性酶序列具有60，65，70，75，80，85，90，95，97，98，99或99.5％氨基酸序列同一性。该噬菌体关联的裂解性酶变体包括，例如，包括在本裂解性酶序列的序列N或C末端改变或添加或删除一个或更多氨基酸残基的裂解性酶多肽。在特定方面，噬菌体关联的裂解性酶会与天然噬菌体关联的裂解性酶序列具有至少约80％或85％氨基酸序列同一性，特别至少约90％(例如90％)氨基酸序列同一性。最特别噬菌体关联的二聚裂解性酶变体会与本天然噬菌体关联的裂解性酶序列(如在图1，图6和图7或表1中提供的或包括SEQ ID NO:1或5的本序列，或SEQ ID NO:3，4或6的突变体序列)具有至少约95％(例如.95％)氨基酸序列同一性。
关于本文鉴定的噬菌体关联的裂解性酶序列的"百分率氨基酸序列同一性"在本文被定义为，在相同的阅读框对齐序列及，如果必需，导入间隔而达到最大百分率序列同一性，及不考虑作为序列同一性的部分的任何保守性取代之后，与噬菌体关联的裂解性酶序列中的氨基酸残基同一的候选序列中的氨基酸残基的百分率。
关于本文鉴定的噬菌体关联的裂解性酶序列的"百分率核酸序列同一性"在本文定义为，在对齐序列及，如果必需，导入间隔而达到最大百分率序列同一性之后，与噬菌体关联的裂解性酶序列中的核苷酸同一的候选体序列中的核苷酸的百分率。
为了测定2个核苷酸或氨基酸序列的百分率同一性，为最佳比较目的对齐序列(例如,可在第1核苷酸序列的序列中导入间隔)。然后比较在对应核苷酸或氨基酸位置的核苷酸或氨基酸。当第1序列中的位置被与第2序列中的对应位置的相同的核苷酸或氨基酸占据，则分子在该位置同一。2个序列之间的百分率同一性是由序列共享的同一位置数的函数(即,％同一性＝同一位置#/位置总#×100)。
2个序列之间的百分率同一性的测定可通过使用数学算法实现。用于比较2个序列的数学算法的优选的，非限制性例是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)的算法。该算法将合入NBLAST程序，其可用于鉴定与本发明的核苷酸序列具有期望的同一性的序列。为了比较目的而获得带空位的比对，可如描述于Nucleic Acids Res,25:3389-3402(1997)使用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如,NBLAST)的默认参数。见由National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine,National Institutes of Health提供的程序。在一实施方式中，用于序列比较的参数可设置为W＝12。参数也可改变(例如,W＝5或W＝20)。值"W"决定对于将2个序列鉴定为含有同一性区的程序而言，多少连续核苷酸必需是同一的。
"多肽"包括聚合物分子由以线性方式接合的多个氨基酸组成。多肽可，在一些实施方式中，对应于由天然存在的多核苷酸序列编码的分子。多肽可包括保守性取代，其中天然存在的氨基酸被具有类似性质的氨基酸取代，其中该保守性取代不改变多肽的功能(见,例如,Lewin"Genes V"Oxford University Press第1章,pp.9-13 1994)。
术语"改变的裂解性酶"包括改组的和/或嵌合裂解性酶。
特异于用特定噬菌体感染的细菌的噬菌体裂解性酶已发现有效和高效破坏目标细菌的细胞壁。裂解性酶被认为缺乏蛋白水解酶促活性，因此当在细菌细胞壁的消化期间存在时对于哺乳动物蛋白和组织是非-毁坏性的。如由科学期刊在线公开的Loeffler等人，"Rapid Killing of Streptococcus pneumoniae with a Bacteriophage Cell WallHydrolase,"Science,294:2170-2172(2001年12月7日)和其补充性材料(其通过引用以它们的整体并入本文)显示，纯化的肺炎球菌噬菌体裂解性酶，诸如Pal，能杀灭各种肺炎球菌。Loeffler等人通过这些实验显示，在接触之后数秒内，裂解性酶Pal能体外杀灭肺炎链球菌(S.pneumoniae)的15个临床染色斑，包括最常分离的血清群和青霉素抗性染色斑。用Pal治疗小鼠也能以剂量-依赖性方式消除或显著减少血清型14的鼻集落。此外，因为已发现Pal的作用(像其他噬菌体裂解性酶，但不像抗生素)，更特异于靶向病原体，正常菌群会保持基本上完整是可能的(M.J.Loessner,G.wendlinger,S.scherer,Mol Microbiol 16,1231-41。(1995)通过引用在本文合并)。如在本文展示，例如，突变Cpl-1溶素，特别是二聚溶素，二聚Cpl-1溶素，在杀灭链球菌属(Streptococcus)株，包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)中有效。
本发明的裂解性酶或多肽可作为为预防已暴露于其他具有感染症状者的那些得病的预防性治疗，或作为为已成为由感染患病的那些的治疗性治疗，用特定噬菌体感染后由细菌生物产生。由于在本文提供了溶素多肽序列和编码溶素多肽的核酸，裂解性酶/多肽可优选经来自噬菌体基因组的分离的裂解性酶的基因产生，其中将基因放入转移载体，及将所述转移载体克隆进表达系统(使用本领域标准方法，包括本文所例示的那些)。裂解性酶或多肽可为截短，嵌合，改组的或"天然的",且可为这些的组合。关联美国专利No.5,604,109以其整体通过引用并入本文。"改变的"裂解性酶可以许多方式产生。在优选的实施方式中，将来自噬菌体基因组的改变的裂解性酶基因投入转移或可移动的载体，优选质粒，及将质粒克隆进表达载体或表达系统。用于产生本发明的溶素多肽或酶的表达载体可适宜于大肠埃希氏菌(E.coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)或许多其他适合的细菌。载体系统也可为无细胞的表达系统。表达基因或基因组合的全部这些方法为本领域所知。裂解性酶也可通过用特异于链球菌属(Streptococcus)的噬菌体感染链球菌属(Streptococcus)来产生，其中所述至少一种裂解性酶唯独裂解对其他，例如天然的或共生的，存在的细菌菌群具有至多最小效应的所述链球菌属(Streptococcus)的细胞壁。
"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含可操作地连接至异源多肽的本发明的多肽的全部或(优选有生物学活性的部分或结构域)部分。嵌合蛋白或肽，例如，通过组合具有2个或更多活性位点的2种或更多蛋白来产生。嵌合蛋白和肽可独立地作用于相同的或不同分子，及因此具有同时治疗2种或更多不同细菌感染的潜力。嵌合蛋白和肽也可用于通过在多于一个位置切割细胞壁来治疗细菌感染，由此潜在地提供由单溶素分子或嵌合肽更快速或有效(或协同)杀灭。
DNA构建体或肽构建体的"异源"区是未发现天然地与更大分子关联的更大DNA分子之内的DNA或更大肽分子之内的肽的可鉴定的段。由此，当异源区编码哺乳动物基因时，基因侧翼通常会有在源生物基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。异源编码序列的另一例是编码序列本身未在自然中发现的构建体(例如,基因组编码序列含有内含子的cDNA,或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生本文定义的DNA或肽的异源区。
术语"可操作地连接的"是指公开的多肽和异源多肽是框内融合的。异源多肽可融合到公开的多肽的N-端或C-端。嵌合蛋白由化学合成酶学地产生，或由重组DNA技术产生。许多嵌合裂解性酶已被产生及研究。使分别自噬菌体phiX174和MS2裂解蛋白E和L构建的基因E-L，嵌合裂解经历内部缺失，以产生具有改变的裂解或杀灭性质的一系列新E-L克隆。在此研究中研究亲本基因E，L，E-L，及E-L的内部截短的形式的裂解性活性，以基于不同跨膜结构域的体系结构的差异表征不同裂解机理。电子显微镜检和用于细胞质和周质空间的标志物酶的释放揭示，2种不同裂解机理可依赖于大肠埃希氏菌(E.coli)的内膜或内和外膜的蛋白的穿透区别(FEMS Microbiol.lett。(1998)164(1):159-67(通过引用在本文合并)。有用的融合蛋白的一例是公开的多肽融合到GST序列的C-端的GST融合蛋白。该嵌合蛋白可辅助公开的重组多肽的纯化。
在另一实施方式中，嵌合蛋白或肽在其N-端含有异源信号序列。例如，公开的多肽的天然信号序列可去除及被来自另一蛋白的信号序列取代。例如，可将杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelet al.,eds.,John Wiley&Sons,1992,通过引用在本文合并)。真核生物异源信号序列的其他例包括蜂毒肽和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla,Calif.)。在仍另一例中，有用的原核生物异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人,见上)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway,N.J.)。
融合蛋白可组合溶素多肽与具有不同能力，或给溶素多肽提供另外的能力或添加的特征的蛋白或多肽。融合蛋白可为公开的多肽的全部或部分融合到源于免疫球蛋白家族成员的序列的免疫球蛋白融合蛋白。免疫球蛋白可为抗体，例如针对敏感的或靶向细菌的表面蛋白或表位的抗体。可将免疫球蛋白融合蛋白掺入药物组合物，并施用于受试者而抑制(可溶性或膜结合)配体和细胞表面上的蛋白(受体)之间的相互作用，由此抑制体内信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可改变公开的多肽的同源配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制可为有用的治疗，二者用于调节(即促进或抑制)细胞存活的治疗细菌-关联的疾病和病症。而且，可将公开的免疫球蛋白融合蛋白用作免疫原来在受试者中产生针对公开的多肽的抗体，纯化配体及在筛选测定中鉴定抑制受体与配体的相互作用的分子。公开的嵌合和融合蛋白和肽可由标准重组DNA技术产生。
融合基因可由常规技术，包括自动化的DNA合成仪合成。或者，基因片段的PCR扩增可使用在随后可退火及再扩增而产生嵌合基因序列的2个连续基因片段之间引起互补悬伸的锚定引物实施(见,即,Ausubel等人,见上)。而且，许多表达载体是已编码融合部分(即,GST多肽)的可商购品。编码本发明的多肽的核酸可克隆进该表达载体使得融合部分框内连接至本发明的多肽。
如本文所用，已随机切割用于多于一种相关的噬菌体蛋白或蛋白肽片段的改组的蛋白或肽，基因产物，或肽及重组装为更有活性的或特异性蛋白。选择或筛选改组的寡核苷酸，肽或肽片段分子来鉴定具有期望的功能性质的分子。此方法描述于，例如，Stemmer，美国专利No.6,132,970.(改组多核苷酸的方法)；Kauffman，美国专利No.5,976,862(经基于密码子的合成演化)和Huse，美国专利No.5,808,022(直接密码子合成)。这些专利的内容通过引用并入本文。改组可用于产生更有活性的蛋白，例如有达模板蛋白的10～100倍活性的蛋白。在不同种溶素蛋白之中选择模板蛋白。改组的蛋白或肽构成，例如，一个或更多结合结构域及一个或更多催化性结构域。各结合或催化性结构域源于相同的或不同噬菌体或噬菌体蛋白。改组的结构域是基于寡核苷酸的分子，如单独或与其他可翻译成肽片段的基因或基因产物组合的基因或基因产物，或它们是基于肽的分子。基因片段包括DNA，RNA，DNA-RNA杂交体，反义RNA，核酶，EST，SNIP和其他基于寡核苷酸的分子的任何分子，其单独或与其他分子组合而产生能或不能翻译成肽的寡核苷酸分子。
如在本文公开的溶素蛋白或肽和肽片段的二聚形式包括化学合成的或由重组DNA技术制备的，或兼二者得到的蛋白或肽和肽片段。这些技术包括，例如，嵌合及改组。当蛋白或肽由化学合成产生时，其优选基本上无化学前体或其他化学品，即，其从涉及蛋白的合成的化学前体或其他化学品分离。因此该蛋白制备物具有少于约30％，20％，10％，5％(以干重计)的非目标多肽的化学前体或化合物。
多肽的信号序列可辅助公开的蛋白和肽和肽片段跨膜移动至粘膜及自粘膜跨膜移动，以及辅助目标分泌的蛋白或其他蛋白的分泌和分离。信号序列一般特征在于在一次或更多切割事件中，在分泌期间通常自成熟蛋白切割的疏水氨基酸核心。该信号肽含有允许信号序列随它们经过通过分泌通路自成熟蛋白切割的加工位点。由此，公开可涉及具有信号序列的描述的多肽，以及涉及信号序列本身及涉及缺失信号序列的多肽(即,切割产物)。公开的编码信号序列的核酸序列可在表达载体中可操作地连接于目标蛋白，诸如通常不分泌的或难分离的蛋白。信号序列指导蛋白，诸如自转化进表达载体的真核生物宿主分泌，及信号序列随后或同时被切割。蛋白可然后由领域认可的方法容易自细胞外培养基纯化。或者，可将信号序列使用辅助纯化的序列，诸如用GST结构域连接到目标蛋白。
本发明也涉及本发明的多肽的其他变体。该变体可具有可发挥激动剂(模仿物)或拮抗剂功能的改变的氨基酸序列。变体可由诱变，即，离散点突变或截短产生。激动剂可保留基本上相同的，或子集的蛋白的天然存在的形式的生物学活性。蛋白的拮抗剂可通过，例如，与包括目标蛋白的细胞信号传导级联的下游或上游成员竞争性地结合来抑制一种或更多蛋白的天然存在的形式的活性。由此，特定生物学效应可通过用具有有限的功能的变体处理来引发。相对于用蛋白的天然存在的形式处理，用具有蛋白的天然存在的形式的子集的生物学活性的变体处理受试者可在受试者中具有更少副作用。发挥激动剂(模仿物)或拮抗剂功能的公开的蛋白变体可通过就激动剂或拮抗剂活性筛选公开的蛋白的突变体，即，截短突变体的组合库来鉴定。在一实施方式中，变体杂库由在核酸水平组合的诱变产生及由杂基因库编码。变体杂库可产生由，例如，将合成寡核苷酸的混合物酶学地连接进基因序列，使得简并组的潜在蛋白序列可作为个体多肽，或替代性地，作为一组更大融合蛋白(即,为噬菌体展示)表达。有可用于自简并寡核苷酸序列产生公开的多肽的潜在变体库的各种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法为本领域所知(见,即,Narang(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura et al.(1984)Science198:1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11:477,全部通过引用在本文合并)。
此外，公开的多肽的编码序列的片段库可用于产生多肽用于筛选及随后选择变体，活性片段或截短的杂群。例如，编码序列片段库可通过在切割以仅约每分子一次发生的条件下用核酸酶处理目标编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，自不同切割的产物复性DNA而形成可包括正义/反义对的双链DNA，由用S1核酸酶处理而从改性的双联体移出单链部分，及将得到的片段库连接进表达载体来产生。由此方法，可衍生编码各种尺寸的目标蛋白的N-端和内部片段的表达库。用于筛选由点突变或截短制造的组合库的基因产物，及就具有选择的性质的基因产物筛选cDNA库的几种技术为本领域所知。服从高通量分析，用于筛选大基因库的最广泛使用的技术一般包括将基因库克隆进可复制的表达载体，用得到的载体库转化适当的细胞，及在期望的活性的检测辅助编码检测其产物的基因的载体的分离的条件下表达组合的基因。递归总体诱变(REM)，增强库中功能突变体频度的技术，可与筛选测定组合使用来鉴定公开的蛋白的变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering6(3):327-331)蛋白或肽片段的有免疫学活性的部分包括与识别噬菌体酶的抗体结合的区。在此情景中，蛋白(或编码蛋白的核酸)的最小部分根据实施方式是可识别为特异于制造溶素蛋白的噬菌体的表位。因此，可被预期结合抗体和对于一些实施方式有用的最小多肽(及编码多肽的关联的核酸)可为8，9，10，11，12，13，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，75，85或100个氨基酸长。尽管短至8，9，10，11，12或15个氨基酸长的小序列可靠地包含足够的结构而发挥表位的作用，5，6或7个氨基酸长的更短序列可在一些条件呈现表位结构及在一实施方式中具有价值。
实施方式的蛋白或肽片段的有生物学活性的部分，如本文所述，包括包含足够同一于或源于公开的噬菌体蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其相比噬菌体蛋白的全长蛋白包括更少氨基酸及呈现对应全长蛋白的至少一种活性。一般而言，有生物学活性的部分包含具有对应蛋白的至少一种活性的结构域或基序。公开的蛋白或蛋白片段的有生物学活性的部分可为例如，长度少于或多于10，25，50，100个氨基酸的多肽。而且，删除，或添加其他蛋白区的其他有生物学活性的部分，可由重组技术制备及就一种或更多实施方式的多肽的天然形式的功能活性进行评价。
本领域技术人员会同意可制备与该小蛋白和/或核酸(或更大分子的蛋白和/或核酸区)共享功能性的同源蛋白和核酸。可同源的更大分子的该小分子和短区特别旨在包括在实施方式中。优选地，该有价值的区与本文提供的溶素多肽(包括图1和6所示的多肽)具有至少50％，65％，75％，80％，85％和优选至少90％，95％，97％，98％或至少99％的同源性。这些百分率同源性值不包括由于保守性氨基酸取代所致的改变。
当至少约70％的氨基酸残基(优选至少约80％,至少约85％,及优选至少约90或95％)相同，或表示保守性取代时，2个氨基酸序列是"基本上同源的"。当溶素多肽的一个或更多，或几个，或达10％，或达15％，或达20％的氨基酸被类似或保守性氨基酸取代取代时，相当的溶素，诸如相当的Cpl-1溶素，或相当的链球菌属(Streptococcus)溶素的序列是基本上同源的，且其中相当的溶素具有在本文公开的溶素，诸如Cpl-1溶素的活性特征，抗-细菌效应和/或细菌特异性。
本文所述的氨基酸残基优选为"L"异构体形式。但是，可用"D"异构体形式的残基代替任何L-氨基酸残基，只要多肽保留免疫球蛋白-结合的期望的功能性质。NH2指游离的氨基存在于多肽的氨基末端。COOH指游离的羧基存在于多肽的羧基末端。与标准多肽命名法保持一致，J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)，氨基酸残基的缩写显示于以下对应表：
【对应表】
【氨基酸符号】
1-字母 3-字母
Y Tyr 酪氨酸
G Gly 甘氨酸
F Phe 苯丙氨酸
M Met 甲硫氨酸
A Ala 丙氨酸
S Ser 丝氨酸
I Ile 异亮氨酸
L Leu 亮氨酸
T Thr 苏氨酸
V Val 缬氨酸
P Pro 脯氨酸
K Lys 赖氨酸
H His 组氨酸
Q Gln 谷氨酰胺
E Glu 谷氨酸
W Trp 色氨酸
R Arg 精氨酸
D Asp 天冬氨酸
N Asn 天冬酰胺
C Cys 半胱氨酸
需知，全部氨基-酸残基序列在本文由其左和右取向是氨基-端至羧基-端的常规方向的式表示。此外，需知，在氨基酸残基序列的开始或端的破折号指示与一个或更多氨基-酸残基的再一序列的肽键。提供以上表来关联可在本文交替出现的3-字母和1-字母标记。
可在氨基酸序列，或编码本文多肽和溶素的核酸序列，包括图1，图6或图7中，SEQID NO:1或5所示的溶素序列，或其活性片段或截短中制造突变，使得特定密码子变化为编码不同氨基酸的密码子，氨基酸用另一氨基酸代替，或删除一个或更多氨基酸。该突变通常通过制造可能的最少氨基酸或核苷酸变化来制造。可制造此分选的取代突变而以非-保守性方式(例如,通过将密码子从属于具有特定尺寸或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一分组的氨基酸)或以保守性方式(例如,通过将密码子从属于具有特定尺寸或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于相同的分组的氨基酸)改变得到的蛋白中的氨基酸。该保守性变化通常导致得到的蛋白的结构和功能的更少变化。非-保守性变化更可能改变得到的蛋白的结构，活性或功能。本发明应被认为包括含有不显著地改变得到的蛋白的活性或结合特征的保守性变化的序列。
以下是氨基酸的各种分组的一例：
具有非极性的R基的氨基酸
丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸
具有不带电的极性R基的氨基酸
甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺
具有带电的极性R基的氨基酸(在pH 6.0带负电的)
天冬氨酸，谷氨酸
碱性氨基酸(在pH6.0带正电的)
赖氨酸，精氨酸，组氨酸(在pH6.0)
另一分组可为那些具有苯基的氨基酸：
苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸
另一分组可根据分子量(即，R基尺寸):
甘氨酸 75 丙氨酸 89
丝氨酸 105 脯氨酸 115
缬氨酸 117 苏氨酸 119
半胱氨酸 121 亮氨酸 131
异亮氨酸 131 天冬酰胺 132
天冬氨酸 133 谷氨酰胺 146
赖氨酸 146 谷氨酸 147
甲硫氨酸 149 组氨酸(在pH 6.0) 155
苯丙氨酸 165 精氨酸 174
酪氨酸 181 色氨酸 204
特别优选的取代是：
●Lys取代Arg和反之亦然，使得可维持正电荷；
●Glu取代Asp和反之亦然，使得可维持负电荷；
●Ser取代Thr，使得可维持游离的-OH；以及
●Gln取代Asn，使得可维持游离的NH2。
例示及优选的保守性氨基酸取代包括以下任何：
谷氨酰胺(Q)取代谷氨酸(E)和反之亦然；亮氨酸(L)取代缬氨酸(V)和反之亦然；丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)和反之亦然；异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)和反之亦然；赖氨酸(K)取代谷氨酰胺(Q)和反之亦然；异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)和反之亦然；丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)和反之亦然；亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)和反之亦然；赖氨酸(L)取代谷氨酸(E)和反之亦然；丙氨酸(A)取代丝氨酸(S)和反之亦然；酪氨酸(Y)取代苯丙氨酸(F)和反之亦然；谷氨酸(E)取代天冬氨酸(D)和反之亦然；亮氨酸(L)取代异亮氨酸(I)和反之亦然；赖氨酸(K)取代精氨酸(R)和反之亦然。
也可导入氨基酸取代而用特别可优选的性质取代氨基酸。例如，可导入Cys，用于与另一Cys形成二硫桥的潜在位点。His可作为特别"催化性"位点导入(即,His可发挥酸或碱的作用，且是在生物化学催化中最常见的氨基酸)。Pro可因为其特别的平面结构而导入，其在蛋白的结构中诱导β-转角。
本文所述的多肽或表位可用于产生抗体和也可用于检测与溶素或识别溶素蛋白的分子的结合。另一实施方式是分子，诸如可诸如由常规免疫或由相显示方法通过使用表位产生的抗体或其他特异性结合剂，其中表位可用于筛选库是否是潜在结合剂。该分子识别溶素蛋白的一种或更多表位或编码溶素蛋白的核酸。识别表位的抗体可为单克隆抗体，人源化的抗体，或部分抗体蛋白。期望地，识别表位的分子以该分子结合血清白蛋白的特异性至少10倍的特异性结合表位。特异性结合可测量为亲和性(Km)。更期望地，特异性结合是在相同的条件下相比结合血清白蛋白高至少102，103，104，105，106，107，108或甚至更高。
在期望实施方式中，抗体或抗体片段处于对于检测溶素蛋白的存在，或替代性地检测对溶素蛋白敏感的细菌的存在有用的形式。在进一步实施方式中，抗体可附接或另外连接于本发明的溶素多肽，例如在嵌合或融合蛋白中，及可用于将溶素导向目标细菌细胞或株或靶。或者，溶素多肽可用于指导抗体或与抗体联合作用，例如在完全或部分裂解细菌细胞壁中，从而抗体可特异性结合在细菌上的表面或在表面下或在细菌中的其表位。例如，可将本发明的溶素附接于抗-链球菌抗体及将抗体导向其表位。
如本领域技术人员会同意，已知用于抗体合成的各种形式和方法。抗体可缀合(共价复合的)报告子分子或原子诸如荧光(fluor)，产生光信号的酶，化学发光团，微粒，或放射性原子。抗体或抗体片段可，在动物免疫之后体内合成，例如，抗体或抗体片段可在遗传重组之后经细胞培养合成。抗体或抗体片段可通过组合细胞合成和化学修饰来制备。
"抗体"是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体和其片段。术语包括多克隆，单克隆和嵌合抗体，最后提及的还详细描述于美国专利No.4,816,397和4,816,567。术语“抗体”描述免疫球蛋白，无论是天然的或部分或整体合成产生的。术语也涵盖具有是或同源于抗体结合结构域的结合结构域的任何多肽或蛋白。CDR移植的抗体也由此术语涵盖。"抗体"是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体和其片段。术语包括多克隆，单克隆和嵌合抗体，最后提及的还详细描述于美国专利No.4,816,397和4,816,567。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，通常包含4个全长多肽链，2个重(H)链和2个轻(L)链，或其相当的Ig同源物(例如,骆驼科动物纳米抗体,其仅包含重链)；包括保留Ig分子的必要的表位结合特征的全长功能突变体，变体或其衍生物，及包括双特异性，双特异性，多特异性和双可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可具有任何类(例如,IgG,IgE,IgM,IgD,IgA和IgY)，或亚类(例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)。也包括在术语“抗体”的含义内的是任何“抗体片段”。
“抗体片段”是指包含至少一个不是全长的多肽链的分子，包括(i)Fab片段，其是由可变轻(VL)，可变重(VH)，恒定轻(CL)和恒定重1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区由二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，其由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，其包含单可变结构域(Ward,E.S.等人,Nature341,544～546(1989))；(vi)骆驼科动物抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域由允许2个结构域连接而形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等人,Science,242,423～426,1988；Huston等人,PNAS USA,85,5879-5883,1988)；(ix)双抗体，其是二价，双特异性抗体、其中VH和VL结构域在单多肽链上表达，但使用对于使在相同的链上2个结构域之间配对而言太短的接头，由此迫使结构域与另一链的互补性结构域配对及产生2个抗原结合位点(WO94/13804；P.Holliger et alProc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448，(1993))；及(x)线性抗体，其包含一对串联Fv段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体，三聚体和/或四聚体(Power and Hudson,J Immunol.Methods 242:193-2049(2000))；及(xii)其他重和/或轻链的非-全长部分，或突变体，变体或其衍生物，单独或以任何组合。
抗体可以许多方式修饰，术语"抗体"应解释为覆盖任何特异性结合成员或具有有需要的特异性的结合结构域的物质。由此，此术语覆盖抗体的抗体片段，衍生物，功能相当体和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论天然的或整体或部分合成。因此包括与另一多肽融合的包含免疫球蛋白结合结构域的嵌合分子，或相当体。嵌合抗体的克隆及表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美国专利No.4,816,397和4,816,567。
"抗体组合位点"是包含特异性结合抗原的轻链或重和轻链可变和高可变区的抗体分子的结构部分。
本文所用的各种语法形式的短语"抗体分子"涵盖完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学有活性的部分。例示抗体分子是完整免疫球蛋白分子，基本上完整免疫球蛋白分子和含有互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域知道的那些部分，如Fab，Fab'，F(ab')2和F(v)，该部分优选用在本文所述的治疗性方法中。
各种语法形式的短语"单克隆抗体"指称具有仅一个能与特定抗原免疫反应的抗体组合位点的抗体。单克隆抗体由此一般显示对与其免疫反应的任何抗原的单结合亲和力。单克隆抗体可因此含有具有多个抗体组合位点的抗体分子，各免疫特异于不同抗原；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。
术语“特异性”可用于指称特异性结合对的一个成员不会显示与非其特异性结合偶体的分子的显著结合的情况。术语是也可在例如抗原结合结构域特异于由许多抗原携带的特定表位时应用，在该情况中，携带抗原结合结构域的特异性结合成员能结合各种携带表位的抗原。
术语“包含”通常以包括的意义使用，是说允许一种或更多特征或组分的存在。
术语“基本上由...组成”指称产品，特别是未共价附接于更大产品的确定数的残基的肽序列。在本文本发明的肽的情况中，本领域技术人员会认可可涵盖对肽的N-或C-端的少数修饰，诸如末端的化学修饰而添加保护基等，例如C-端的酰胺化。
术语“分离的”指称本发明的溶素多肽，或编码该多肽的核酸会根据本发明所处于的状态。多肽和核酸会无或基本上无与它们天然地结合的物质，诸如与它们见于它们的天然的环境或它们的制备环境(当该制备由重组DNA技术体外或体内实践时，例如细胞培养)中的其他多肽或核酸。多肽和核酸可用稀释剂或佐剂配制和仍为实践目的，是分离的-例如多肽会正常与聚合物或粘膜粘着剂或其他载体混合，或当在诊断或治疗中使用时会与药学可接受的载体或稀释剂混合。
本发明的二聚溶素单体可由共价键，包括尤其是诸如位于自Cpl-1溶素多肽(图1和SEQ ID NO:1)或Pal溶素(图7和SEQ ID NO:5)的C-端约14和20个氨基酸之间的氨基酸之间的共价键或其他结合化学交联在一起。单体可通过使用化学交联剂交联。例如，第1单体可在2个半胱氨酸残基之间与第2单体交联。半胱氨酸-反应性交联试剂的例包括试剂诸如1,6-双马来酰亚胺己烷(BMH)，1,3-二溴-2-丙醇(DBP)和芥气体(双(2-氯乙基)硫化物；芥)。知道替代性的或其他交联试剂，且可包括使胺与胺，马来酰亚胺连接的N-羟基琥珀酸酰胺(NHS)和使巯基与巯基连接的吡啶基二硫醇。各可合并间隔而增加空间和柔性。溶素单体可经与它们的C-末端或区融合的接头肽共价结合或交联。可利用用于二聚化的任何本领域手段，只要是维持溶素的C-端胆碱结合功能和N-端酶促功能。
溶素单体可在2个半胱氨酸残基之间由二硫键连接在一起。在特定实施方式中，单体是在位于自Cpl-1或Pal的C-端14和20个氨基酸之间的2个Cys残基之间由二硫键交联在一起。交联的半胱氨酸残基可在溶素单体多肽链上的相同的位置。在特定情况中，在溶素的头45个残基中可不存在半胱氨酸残基。由在324位的Cys残基交联的溶素单体的一例是Cpl-1C45S,D324C(SEQ ID NO:3)。由在280位的Cys残基交联的溶素单体的一例是PalD280C(SEQ IDNO:6)。
一般而言，溶素具有由用于肽聚糖水解的催化性结构域和用于识别细菌细胞壁上的表面部分的结合结构域组成的2个不同功能结构域。催化性结构域在溶素之中相对保守。由此，二聚溶素可天然嵌合及包括包含第1肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)-特异性噬菌体溶素的催化性结构域和第2链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素的结合结构域的溶素单体的二聚体。在特定实施方式中第1链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素的催化性结构域来自Cpl-1或其他肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体溶素催化性结构域。在其他实施方式中，第2肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)-特异性噬菌体溶素的结合结构域来自Cpl-1或其他肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)噬菌体溶素结合结构域。催化性结构域的例包括Cpl-1的氨基酸1-190。在其他特定实施方式中，第1链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素的催化性结构域来自Pal或其他肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体溶素催化性结构域。在其他实施方式中，第2肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)-特异性噬菌体溶素的结合结构域来自Pal或其他肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)噬菌体溶素结合结构域。催化性结构域的其他例尤其是ClyS溶素和PlyG溶素的N-端一半。结合结构域的例包括Cpl-1的氨基酸191-326。结合结构域的例包括Pal的氨基酸155-296。结合结构域的其他例尤其是ClyS和PlyG溶素的C-端一半。本领域技术人员可由序列分析和序列比对容易确定包括这些结构域的确切的氨基酸。
二聚溶素呈现针对一种或更多链球菌细菌诸如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的杀灭活性。杀灭活性可通过使用杀灭测定，诸如下文实施例部分中描述的杀灭测定来测定。
【核酸】
能编码本发明的二聚溶素多肽的核酸构成本发明的一方面。在此情景中代表性的核酸序列是编码图1，6和7和表1，SEQ ID NO:3或6之任何的二聚多肽单体的多核苷酸序列，及在严格条件下与所述核酸序列的互补序列杂交的序列。也涵盖这些序列和与这些图中显示的序列杂交的核酸序列的进一步变体而用以产生根据公开的裂解酶，包括可获得的天然的变体。编码噬菌体关联的裂解酶的广泛的分离的核酸序列或cDNA序列和与该基因序列杂交的部分序列对于本发明的溶素酶或多肽的重组产生有用。
"复制子"是发挥体内DNA复制的自主单元的功能；即，能在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如,质粒,染色体,病毒)。
"载体"是可向其附接另一DNA段而使附接的段复制的复制子，诸如质粒，噬菌体或粘粒。
"DNA分子"指称以其单链形式，或双-链化的螺旋的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。此术语仅指称分子的一级和二级结构，及不限制其为任何特定三级形式。由此，此术语包括尤其，见于线性DNA分子(例如,限制片段)，病毒，质粒和染色体的双-链化的DNA。在讨论特定双-链化的DNA分子的结构时，序列可在本文根据仅给出沿着DNA的非转录的链(即,具有与mRNA同源的序列的链)的5'至3'方向的序列的正常约定描述。
"复制起点"指称参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA"编码序列"是当放置在适当的调控序列控制下时体内转录及翻译为多肽的双-链化的DNA序列。编码序列的边界通过在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括，但不限于，原核生物序列，自真核生物mRNA的cDNA，自真核生物(例如,哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。多聚腺苷酸化信号和转录终止序列会通常位于编码序列的3'。
转录和翻译控制序列是保证编码序列在宿主细胞中表达的DNA调控序列，诸如启动子，增强子，多聚腺苷酸化信号，终止子，等。
"启动子序列"是能在细胞中结合RNA聚合酶及起始下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调控区。为定义本发明的目的，启动子序列在其3’末端与转录起始位点结合及向上游(5’方向)延伸而包括对于以背景以上的可检测的水平起始转录必需的最小数的碱基或元件。在启动子序列之内，会发现转录起始位点(通过用核酸酶S1标位便利地定义)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。真核生物启动子会常常但不总是含有"TATA"盒和"CAT"盒。原核生物启动子在-10和-35共有序列之外还含有Shine-Dalgarno序列。
"表达控制序列"是控制及调控另一DNA序列的转录和翻译的DNA序列。编码序列在细胞中在转录和翻译控制序列"控制下"，当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，该mRNA然后翻译为由编码序列编码的蛋白。
可在编码序列之前包括"信号序列"。此序列编码信号肽，在多肽的N-端，其与宿主细胞通信而将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到培养基中，且此信号肽在蛋白离开细胞之前被宿主细胞剪切掉。信号序列可被发现与原核生物和真核生物中天然的各种蛋白结合。
本文就本发明的探针所用的术语"寡核苷酸"被定义为包含2或更多核糖核苷酸，优选多于3个核糖核苷酸的分子。其确切的尺寸会依赖于许多因素，其进而依赖于寡核苷酸的最终功能和用途。
本文所用的术语"引物"指称当放置在这样的条件下，即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶的存在下及在适合的温度和pH下互补于核酸链的引物延伸产物合成被诱导的条件下时能发挥合成起始点的作用的无论是纯化的限制消化中天然地产生的或合成产生的寡核苷酸。引物可为单链或双链，且必需对于在诱导剂的存在下引发期望的延伸产物的合成而言足够长。引物的确切的长度会依赖于许多因素，包括温度，引物源和方法的使用。例如，为诊断性应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25个或更多核苷酸，尽管其可含有更少核苷酸。
在本文引物选择为"基本上"互补于特定靶向DNA序列的不同链。这是指引物必需足够互补，以与它们的相应链杂交。因此，引物序列无需反映模板的确切的序列。例如，可将非-互补核苷酸片段附接于引物的5'端，而引物序列的其余部分互补于链。或者，非-互补碱基或更长序列可散在于引物内，只要是引物序列和与之杂交的链序列具有足够的互补性，且由此形成用于延伸产物合成的模板。
如本文所用，术语"限制性内切酶"和"限制酶"指称细菌酶，各在或接近特定核苷酸序列切割双-链DNA。
当该DNA已被导入细胞内时，细胞已被外源或异源DNA"转化"。转化DNA可或可不整合(共价连接)进构成细胞的基因组的染色体DNA。在原核生物，酵母和哺乳动物细胞中，例如，转化DNA可维持在附加体元件诸如质粒上。关于真核生物细胞，稳定地转化的细胞是转化DNA已整合进染色体从而其通过染色体复制被后代细胞遗传的细胞。此稳定性由真核生物细胞建立包含含有转化DNA的一群后代细胞的细胞系或克隆的能力展示。"克隆"是由有丝分裂源于单细胞或共同祖先的一群细胞。"细胞系"是能稳定体外生长许多代的原代细胞克隆。
当至少约75％(优选至少约80％,及最优选至少约90或95％)的核苷酸在定义的长度的DNA序列上匹配时，2个DNA序列是"基本上同源的"。基本上同源的序列可通过使用在序列数据银行中可利用的标准软件比较序列，或例如，在如对于该特定系统定义的严格条件下的Southern杂交实验中鉴定。定义适当的杂交条件在本领域技术人员的技能之内。见，例如，Maniatis等人，见上；DNA Cloning,Vols.I&II，见上；Nucleic Acid Hybridization，见上。
许多在本文涵盖的变体DNA分子包括由标准DNA诱变技术，诸如M13引物诱变产生的那些。这些技术的细节提供于Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港，N.Y(在本文通过引用合并)。通过使用该技术，可产生略不同于公开的那些的变体。本公开涵盖是本文特别公开的DNA分子和核苷酸序列的衍生物及通过核苷酸的缺失，添加或取代而不同于公开的DNA分子和核苷酸序列，但仍编码具有溶素多肽的功能特征的蛋白的DNA分子和核苷酸序列。也包括的是源于公开的DNA分子的小DNA分子。该小DNA分子包括适合于用作杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物的寡核苷酸。像这样，这些小DNA分子会包含由链球菌属(Streptococcus)的噬菌体遗传编码的裂解性酶的至少一段及，为PCR目的，会包含基因的至少10～15个核苷酸序列及，更优选地，15～30个核苷酸序列。源于上述公开的DNA分子的DNA分子和核苷酸序列也可定义为在严格条件下与公开的DNA序列杂交的DNA序列，或其片段。
对应于特定程度的严格度的杂交条件依赖于选择的杂交方法的性质和使用的杂交DNA的组成和长度而改变。一般而言，杂交温度和杂交缓冲剂的离子强度(尤其钠离子浓度)会决定杂交的严格度。关于达到特定程度的严格度需要的杂交条件的计算由Sambrook等人。(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港，N.Y，第9和11章讨论(通过引用在本文合并)。
该计算的一例如下。杂交实验可通过DNA分子(例如,由特异于炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的噬菌体遗传编码的裂解性酶的天然的变异)与靶向DNA分子的杂交实施。靶向DNA可为，例如，已在琼脂糖凝胶上电泳并由DNA印迹转移至硝酸纤维素膜的对应cDNA(Southern(1975).J.Mol.Biol.98:503)，这是本领域熟知的技术，并描述于Sambrook等人(1989)(分子克隆：实验室手册，冷泉港，N.Y。通过引用在本文合并)。与用同位素P32标记的-dCTP标记的靶向探针的杂交在熔解温度，Tm以下的20～25℃的温度，在高离子强度溶液诸如6×SSC中实施(见下文描述)。为该Southern杂交实验，其中DNA印迹上的靶向DNA分子含有10ng的DNA或更多，杂交使用1～2ng/ml放射性标记的探针实施6～8小时(比活性等于109CPM/μg或更大)。杂交后，将硝酸纤维素滤器洗涤，以去除背景杂交。洗涤条件尽可能严格，以去除背景杂交而保留特异性杂交信号。术语"Tm"表示这样的温度，在该温度以上，在富含离子条件下，放射性标记的探针分子不会与其靶向DNA分子杂交。该杂交体分子的Tm可根据以下方程估算：Tm＝81.5℃-16.6(钠离子浓度的log10)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/l)其中l＝碱基对中杂交体的长度。此方程对于0.01M～0.4M范围内的钠离子浓度有效，及其对于更高钠离子浓度溶液中Tm的计算欠精确(Bolton and McCarthy(1962)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)(通过引用在本文合并)。该方程也对于具有30％～75％内的G+C含量的DNA有效，且也应用于长度大于100个核苷酸的杂交体。寡核苷酸探针的行为详细描述于Sambrook等人(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港，N.Y的第11章(通过引用在本文合并)。为在选择裂解性基因的变异中使用而特别涵盖本文所述的优选的例示的条件。
在本公开的优选的实施方式中，严格条件可定义为具有多于25％序列变异(也称的"错配")的DNA分子不会杂交的条件。在更优选的实施方式中，严格条件是具有多于15％错配的DNA分子不会杂交的条件，及更优选仍，严格条件是具有多于10％错配的DNA序列不会杂交的条件。优选地，严格条件是具有多于6％错配的DNA序列不会杂交的条件。
遗传密码的简并性还加宽实施方式的范围，由于其致使主要DNA分子的核苷酸序列的变异，而维持编码的蛋白的氨基酸序列。例如，代表性的氨基酸残基是丙氨酸。此可在cDNA中由核苷酸密码子三联体GCT编码。因为遗传密码的简并性，3种其他核苷酸密码子三联体--GCT，GCC和GCA--也编码丙氨酸。由此，基因的核苷酸序列可在此位置变化为任何这种3密码子而不影响编码的蛋白的氨基酸组成或蛋白特征。本领域技术人员熟知特定氨基酸的遗传密码和核苷酸密码子的变异。基于遗传密码的简并性，变体DNA分子可使用上述标准DNA诱变技术，或由DNA序列的合成而源于本文公开的cDNA分子。基于遗传密码的简并性依靠序列变异不在严格条件下与公开的cDNA序列杂交的DNA序列包括在本公开中。
由此，应同意，也在本发明的范围之内的是编码本发明的溶素，包括二聚Cpl-1和/或Pal溶素的DNA序列，该序列编码与在本文及图和表1中提供的具有相同的氨基酸序列的多肽，但其是其简并体。由"简并体"意指不同3-字母密码子用于确定特定氨基酸。
尽管预定了导入氨基酸序列变异的位点，突变本身不需要预定。例如，为了优化在给定位点的突变的性能，可在靶密码子或区进行随机诱变和就期望的活性的最佳组合筛选表达的蛋白变体。熟知用于在具有上述知道的序列的DNA中在预定的位点制造取代突变的技术。
氨基酸取代一般是单残基取代；插入通常会在约1～10个氨基酸残基的量级；及缺失会在约1～30个残基的范围内。缺失或插入可为单个的形式，但优选以相邻对制造，即，2个残基的缺失或2个残基的插入。可组合取代，缺失，插入或其任何组合而得到最终构建体。显然，在编码蛋白的DNA中制造的突变不能使得序列位于阅读框之外和优选不会产生可产生二级mRNA结构的互补区(EP 75,444A)。
取代变体是已去除氨基酸序列中的至少一个残基并在该位置插入不同残基的那些。可制造该取代，使得不对蛋白特征产生显著效应，或在期望精致地调节蛋白特征时。以上描述了可用于代替蛋白中的原氨基酸，且被认为是保守性取代的氨基酸，且会被本领域技术人员认可。
功能或免疫学同一性的实质性变化可通过选择欠保守性的取代，例如通过选择在它们维持以下特征上的效应中更显著地不同的残基来制造：(a)取代区中多肽主链的结构，例如，为片或螺旋构象；(b)在靶位点分子的电荷或疏水性；或(c)侧链本体。通常被预期产生蛋白性质的最大变化的取代会是以下那些：(a)亲水残基，例如，丝氨酰基或苏氨酰基，用(或被)疏水残基，例如，亮氨酰基，异亮氨酰基，苯丙氨酰基，缬氨酰基或丙氨酰基代替；(b)半胱氨酸或脯氨酸用(或被)任何其他残基代替；(c)具有正电性侧链的残基，例如，赖氨酰基，精氨酰基或组氨酰基，用(或被)负电性残基，例如，谷氨酰基或天冬氨酰基代替；或(d)具有大块的侧链的残基，例如，苯丙氨酸，用(或被)不具有侧链的氨基酸，例如，甘氨酸代替。
可就裂解性多肽的衍生物或变体，通过分析衍生物或变体蛋白裂解或杀灭敏感的细菌，或补充感染的细菌宿主中由噬菌体呈现的对DNA交联剂的敏感度的能力来评定这些氨基酸取代或缺失或添加的效应。这些测定可通过将编码衍生物或变体蛋白的DNA分子转染进上述细菌或通过使细菌与从用编码衍生物或变体蛋白的DNA分子转染的宿主表达的蛋白温育来实施。
尽管可预定导入氨基酸序列变异的位点，不需预定突变本身。例如，为了优化在给定位点突变的性能，可在靶密码子或区进行随机诱变，和就期望的活性的最佳组合筛选表达的蛋白变体。熟知用于在具有上述知道的序列的DNA中在预定的位点制造取代突变的技术。
本发明的另一特征是编码本二聚溶素的DNA序列的表达。如本领域所熟知，可通过在适当的表达载体中使它们可操作地连接于表达控制序列及采用该表达载体转化适当的单细胞宿主来表达DNA序列。本发明的DNA序列与表达控制序列的该操作性连接，当然，包括，如果不已是DNA序列的部分，在DNA序列上游的正确的阅读框内提供起始密码子，ATG。可在本发明的DNA序列的表达中采用广泛的宿主/表达载体组合。有用的表达载体，例如，可由染色体段，非-染色体和合成DNA序列组成。适合的载体包括SV40及知道的细菌质粒的衍生物，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)质粒colEl，pCR1，pBR322，pMB9和它们的衍生物，质粒诸如RP4；噬菌体DNAS，例如，噬菌体λ的多种衍生物，例如，NM989和其他噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒诸如2□质粒或其衍生物；在真核生物细胞中有用的载体，诸如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已被修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等。
可将任何广泛的表达控制序列--控制与其可操作地连接的DNA序列的表达的序列--用于这些载体来表达本发明的DNA序列。该有用的表达控制序列包括，例如，SV40，CMV，痘苗，多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，LTR系统，主要操作子和噬菌体λ的启动子区，fd包被蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶(例如,Pho5)的启动子，酵母-交配因子的启动子，及知道控制原核生物或真核生物细胞或它们的病毒基因的表达的其他序列，及其各种组合。
广泛的单细胞宿主细胞也在表达本发明的DNA序列中有用。这些宿主可包括熟知的真核生物和原核生物宿主，诸如大肠埃希氏菌(E.coli)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，真菌诸如酵母株，及组织培养中的动物细胞，诸如CHO，Rl.l，B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾细胞(例如,COS 1,COS 7,BSC1,BSC40和BMT10)，昆虫细胞(例如,Sf9)和人细胞和植物细胞。
需知，并非所有载体，表达控制序列和宿主会等同良好发挥功能而表达本发明的DNA序列。不会有全部宿主与相同的表达系统等同良好发挥功能。但是，本领域技术人员能无需过度实验选择适当的载体，表达控制序列，及宿主而实现期望的表达而不离开本发明的范围。
多肽的编码序列的片段库可用于产生用于筛选及随后选择变体的多肽杂群。例如，编码序列片段库可通过在切割仅约每分子一次发生的条件下用核酸酶处理目标编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，自不同切割的产物复性DNA而形成可包括正义/反义对的双链DNA，由用S1核酸酶处理而从改性的双联体移出单链部分，及将得到的片段库连接进表达载体来产生。由此方法，可衍生编码各种尺寸的目标蛋白的N-端和内部片段的表达库。
用于筛选由点突变或截短制造的组合库的基因产物，及就具有选择的性质的基因产物筛选cDNA库的几种技术为本领域所知。服从高通量分析，用于筛选大基因库的最广泛使用的技术一般包括将基因库克隆进可复制的表达载体，用得到的载体库转化适当的细胞，及在期望的活性的检测辅助编码检测其产物的基因的载体的分离的条件下表达组合的基因。递归总体诱变(REM)，增强库中功能突变体频度的技术，可与筛选测定组合使用来鉴定公开的蛋白的变体(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
【组合物】
根据本发明提供包含本发明的二聚裂解性酶/多肽的治疗或药物组合物，以及相关的使用方法和制备方法。治疗或药物组合物可包含一种或更多二聚裂解性多肽，及任选地包括截短的，嵌合或改组的裂解性酶，其任选地与其他组分诸如载体，媒质，多肽，多核苷酸，穿孔素蛋白，一种或更多抗生素或适合的赋形剂，载体或媒质组合。本发明提供本发明的溶素的治疗组合物或药物组合物，包括二聚Cpl-1，及实施方式Cpl-1C45S,D324C，用于杀灭，缓和，去定居，预防或治疗革兰氏阳性细菌，包括细菌感染或相关的病情。本发明提供本发明的溶素的治疗组合物或药物组合物，包括二聚Pal，及实施方式PalD280C，用于杀灭，缓和，去定居，预防或治疗革兰氏阳性细菌，包括细菌感染或相关的病情。在本文提供包含二聚溶素，特别二聚Cpl-1，二聚Pal或其组合，包括截短或其变体的组合物，用于杀灭，缓和，去定居，预防或治疗革兰氏阳性细菌，包括细菌感染或相关的病情，特别是链球菌属(Streptococcus)的感染或相关的病情。
在治疗组合物中包括的酶或多肽可为噬菌体关联的二聚裂解性酶，截短的二聚裂解性多肽，变体二聚裂解性多肽，及嵌合和/或改组的二聚裂解性酶的一种或更多或任何组合。此外，可使用用于处理相同细菌的不同噬菌体遗传编码的不同裂解性多肽。这些裂解性酶也可为"未改变的"二聚裂解性酶或多肽，截短的二聚裂解性多肽，变体二聚裂解性多肽，及嵌合及改组的二聚裂解性酶的任何组合。用于革兰氏阳性细菌，包括链球菌属(Streptococcus)的治疗或药物组合物中的二聚裂解性酶/多肽，可单独或与抗生素或杀细菌或抑细菌剂组合或，如果有其他待处理的侵袭性细菌生物，与特异于靶向的其他细菌的其他噬菌体关联的裂解性酶组合而使用。裂解性酶，截短的酶，变体酶，嵌合酶和/或改组的裂解性酶可结合穿孔素蛋白使用。穿孔素蛋白的量也可改变。各种抗生素可任选地随酶或多肽及在溶葡萄球菌酶存在或不存在下包括在治疗组合物中。多于一种裂解性酶或多肽可包括在治疗组合物中。
药物组合物也可包括一种或更多由化学合成或DNA重组技术产生的二聚裂解性酶，包括同工酶，类似物或其变体。尤其是，改变的裂解性蛋白可由氨基酸取代，缺失，截短，嵌合，改组或其组合产生。药物组合物可含有一种或更多二聚裂解性蛋白及一种或更多截短的，变体，嵌合或改组的裂解性蛋白的组合。药物组合物也可含有至少一种源于相同的或不同细菌物种的二聚裂解性蛋白的肽或肽片段，任选添加一种或更多补充剂，及药学可接受的载体或稀释剂。
本发明提供细菌二聚溶素，特别是来自天然单体溶素的重组-产生的二聚溶素，包括包含具有细菌杀灭活性的二聚Cpl-1溶素多肽变体。本发明描述含有二聚化用突变半胱氨酸及保留革兰氏阳性抗细菌性活性的二聚Cpl-1溶素突变体。在本文提供包含二聚链球菌属(Streptococcus)溶素，包括二聚Cpl-1突变体溶素的组合物，其相比单体未突变的Cpl-1溶素蛋白，针对链球菌属(Streptococcus)细胞具有等于或更大杀灭活性，包括二聚CPl-1溶素Cpl-1C45S,D342C。
本发明提供细菌二聚溶素，特别是来自天然单体溶素的重组-产生的二聚溶素，包括包含具有细菌杀灭活性的二聚Pal溶素多肽变体。本发明描述含有二聚化用突变半胱氨酸及保留革兰氏阳性抗细菌性活性的二聚Pal溶素突变体。在本文提供是的包含二聚链球菌属(Streptococcus)溶素，包括二聚Pal突变体溶素的组合物，其相比单体未突变的Pal溶素蛋白，针对链球菌属(Streptococcus)细胞具有等于或更大杀灭活性，包括二聚Pal溶素PalD280C。
治疗组合物也可包含穿孔素蛋白。穿孔素蛋白(或"穿孔素")是在细胞膜产生孔洞的蛋白。穿孔素蛋白可形成在细菌中终结细胞呼吸的致死膜损伤。如裂解性蛋白，穿孔素蛋白由噬菌体编码及携带。实际上，其对于邻近或甚至在噬菌体裂解性蛋白的编码之内的穿孔素蛋白的遗传密码是相当地常见的。多数穿孔素蛋白序列短，及总体上是疏水性的，具有高度亲水羧基-端结构域。在许多情况中，在噬菌体的有酶活性的结构域内的不同阅读框上编码推定的穿孔素蛋白。在其他情况中，在邻近或紧邻编码细胞壁裂解性蛋白的DNA的DNA上编码穿孔素蛋白。穿孔素蛋白常在噬菌体感染的晚期阶段期间合成，并见于它们导致膜损伤的细胞质膜。穿孔素可基于一级结构分析被分为2个大类。I类穿孔素通常为95个残基或更长，且可具有3个潜在跨膜结构域。II类穿孔素通常更小，大致65-95个残基，分布有指示2个TM结构域的带电的及疏水残基(Young,et al.Trends in Microbiology v.8,No.4,March 2000)。但是，至少对于革兰氏阳性宿主的噬菌体而言，双-组分裂解系统可不是普遍的。尽管几种噬菌体已显示或提示穿孔素的存在，尚未发现基因编码全部噬菌体的推定的穿孔素。穿孔素已显示存在于几种细菌中，包括，例如，乳球菌噬菌体Tuc2009，乳球菌NLC3，肺炎球菌噬菌体EJ-1，加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)噬菌体Nadh，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体Twort，单核细胞增多性利斯特菌(Listeriamonocytogenes)噬菌体，肺炎球菌噬菌体Cp-1，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体M29，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckki)噬菌体LL-H溶素，及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的噬菌体N 11。(Loessner,等人,Journal of Bacteriology,August 1999,p.4452-4460)。
例如，穿孔素蛋白可结合裂解性酶使用以加速杀灭细菌的速度和效率。穿孔素蛋白也可为嵌合和/或改组的酶形式。根据一些实施方式，穿孔素蛋白也可在处理细菌感染中单独使用。
药物组合物可含有补充剂，包括一种或更多抗微生物剂和/或一种或更多常规抗生素。为了加速感染的治疗，治疗剂可还包括也可增强裂解性酶的杀细菌活性的至少一种补充剂。抗微生物剂通过抑制细胞壁合成，抑制细胞-膜功能和/或抑制代谢功能，包括蛋白和DNA合成来通过干扰细菌细胞的结构或功能来大大地发挥作用。抗生素可广泛地亚分组为影响细胞壁肽聚糖生物合成的那些和影响革兰氏阳性细菌中DNA或蛋白合成的那些。细胞壁合成抑制物，包括青霉素和抗生素等，破坏刚性外部细胞壁，从而相对未支持的细胞膨胀及最终破裂。影响细胞壁肽聚糖生物合成的抗生素包括：糖肽，其通过防止N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)肽亚基并合进肽聚糖基质中来抑制肽聚糖合成。可利用的糖肽包括万古霉素和替考拉宁；青霉素，其通过抑制肽聚糖交联的形成来发挥作用。青霉素的官能团，β-内酰胺部分，结合及抑制细菌中连接肽聚糖分子的DD-转肽基酶。水解性酶持续断裂细胞壁，导致细胞由于渗透压溶解或死亡。常见的青霉素包括苯唑西林，氨苄西林和氯唑西林；及多肽，其干扰C55-异戊二烯基焦磷酸酯(在质膜之外携带肽聚糖构件的分子)的去磷酸化。影响细胞壁的多肽是杆菌肽。
补充剂可为抗生素，诸如红霉素，克拉霉素，阿奇霉素，罗红霉素，万古霉素，苯唑西林，多西环素，大环内酯家族的其他成员，青霉素，头孢菌素和对于协同增强裂解性酶的治疗效果有效的量的其任何组合。抗生素或杀细菌或抑菌剂可在临床上有效于细菌生长或活力的浓度或量或可为亚-MIC或在最低限度抑制性浓度以下或量。实际上，可随改变的和/或未改变的裂解性酶使用任何其他抗生素。类似地，其他裂解性酶可包括在载体中，以治疗其他细菌感染。当治疗不同疾病时，抗生素补充物可在酶的实际上是全部用途中使用。药物组合物也可含有至少一种裂解性蛋白，一种穿孔素蛋白，或至少一种穿孔素及一种裂解性蛋白的肽或肽片段，该裂解性蛋白和穿孔素蛋白各源于相同或不同细菌物种，任选添加补充剂，及适合的载体或稀释剂。
也提供的是含有单独或与其他核酸分子组合的核酸分子的组合物，能体内表达有效量的二聚裂解性多肽或二聚裂解性多肽的肽片段。也提供含有这些核酸分子，多核苷酸和携带及体外或体内表达这些分子的载体的细胞培养物。
治疗或药物组合物可包含二聚裂解性多肽，包括针对相同，不同或重叠敏感的细菌的一种或更多二聚溶素多肽，与各种载体组合而治疗由易感的革兰氏阳性细菌导致的病。载体适宜地含有少数量的添加剂，诸如增强等渗性和化学稳定性的物质。该物质在采用的剂量和浓度对受者是非-毒性的，及包括缓冲剂诸如磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，乙酸，及其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂诸如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，诸如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸诸如谷氨酸，天冬氨酸，组氨酸或精氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，海藻糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或山梨糖醇；对离子诸如钠；非-离子表面活性剂诸如聚山梨酯，泊洛沙姆或聚乙二醇(PEG)；和/或中性盐，例如，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2和其他。用于药物用途的甘油或甘油(1,2,3-丙三醇)是可商购的。可将其稀释于无菌注射用水，或氯化钠注射，或其他药学可接受的水性注射流体，且以0.1～100％(v/v)，优选1.0～50％更优选约20％的浓度使用。DMSO是具有显著的增强许多局部应用的药物的穿透的能力的非质子溶剂。可将DMSO稀释于无菌注射用水，或氯化钠注射，或其他药学可接受的水性注射流体，及以0.1～100％(v/v)的浓度使用。载体媒质也可包括Ringer溶液，缓冲溶液和右旋糖溶液，特别是当制备静脉内溶液时。
用于二聚裂解性多肽的任何载体可由常规手段生产。但是，优选的是，任何漱口水或类似类型产品不含有醇，以防止多肽/酶的变性。类似地，当在生产加工期间将裂解性多肽放入咳嗽滴，胶，糖果或锭剂时，该布置应在锭剂或糖果硬化之前，但在咳嗽滴或糖果多少冷却之后实施，以避免酶的加热变性。
可以液体形式或以冷冻干燥的状态将二聚裂解性多肽加入这些物质，之后其会在其遇到体液诸如唾液时溶解。多肽/酶也可在微团或脂质体中。
对于处理感染的二聚裂解性酶/多肽的有效剂量速度或量会部分依赖于是否二聚裂解性酶/多肽会被治疗或预防性地使用，受者暴露于感染性细菌的持续时间，个体的尺寸和重量，等。含有酶/多肽的组合物的使用的持续时间也依赖于是否该用途是预防性目的，其中使用可为以小时计，以天计或以周计的短时期，或是否用途会是可需要组合物的更密集方案的使用的治疗性目的，使得利用可持续数小时，数天或数周，和/或每天，或在一天期间以定时的间隔。采用的任何剂型应保证最小数的单元经最小量的时间。被认为保证酶的有效量或剂量的酶的活性单位的浓度可在鼻和口腔道的湿或潮环境中约100U/ml～约500,000U/ml的流体范围内，及可能在约100U/ml～约50,000U/ml范围内。更特别是，暴露于活性酶/多肽单元的时间可影响期望的浓度的活性酶单位/ml。被分类为"长"或"慢"释放载体的载体(诸如,例如,特定鼻喷雾剂或锭剂)可具有或提供更低浓度的活性(酶)单位/ml，但经更长时间，然而"短"或"快"释放载体(诸如,例如,含漱液)可具有或提供高浓度的活性(酶)单位/ml，但经较短时间。活性单位/ml量和暴露的持续时间依赖于感染的性质，是否处理是预防或治疗性的，及其他变量。有可必需具有更高得多单位/ml剂量或更低单位/ml剂量的情况。
二聚裂解性酶/多肽应处于具有允许裂解性酶/多肽有活性的pH的环境中。例如，如果人个体已暴露于患细菌上呼吸道病症的另一人，二聚裂解性酶/多肽会位于粘膜衬，并预防任何感染细菌的定居。在将二聚裂解性酶放入载体系统或口腔递送模式前或时，优选的是，酶在维持pH范围约4.0和约9.0之间，更优选约5.5和约7.5之间的稳定化缓冲剂环境中。
稳定化缓冲剂可允许二聚溶素酶/多肽的最佳活性。缓冲剂可含有还原剂，诸如二硫苏糖醇。稳定化缓冲剂也可为或包括金属螯合剂，诸如乙二胺四乙酸二钠盐，或其也可含有磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂，或任何其他缓冲剂。可改变这些噬菌体和其他噬菌体的DNA编码，以允许重组酶在多于2个位置攻击一个细胞壁，允许重组酶切割多于一种物种的细菌的细胞壁，允许重组酶攻击其他细菌，或其任何组合。对产生酶的重组噬菌体的改变的类型和数是无法计算的。
弱表面活性剂可以对于增强可在组合物中使用的二聚裂解性酶/多肽的治疗效果有效的量包括在治疗剂或药物组合物中。适合的弱表面活性剂包括，尤其是，聚氧乙烯山梨糖醇酐和脂肪酸的酯(吐温系列)，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton-X系列)，n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，n-辛基-β-D-硫吡喃葡萄糖苷，n-癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷，n-十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和以生物学方式发生表面活性剂，例如，脂肪酸，甘油酯，单甘油酯，脱氧胆酸酯和脱氧胆酸盐的酯。
也可在本发明中使用防腐剂和优选包含以总组合物重量计约0.05％～0.5％。防腐剂的使用保证如果产物微生物混杂，制剂会防止或减少微生物生长。一些在本发明中有用的防腐剂包括羟苯甲酯，羟苯丙酯，羟苯丁酯，氯二甲酚，苯甲酸钠，DMDM乙内酰脲，3-碘-2-丙基丁基氨基甲酸酯，山梨酸钾，二葡萄糖酸氯己定或其组合。
用于在本发明的全部实施方式中使用的药物或剂包括抗微生物剂，抗-炎性剂，抗病毒剂，局部麻醉剂，皮质类固醇，毁坏性治疗剂，抗真菌剂和抗雄激素剂。在痤疮的治疗中，可使用的有活性的药物包括抗微生物剂，尤其具有抗-炎性性质的那些诸如氨苯砜，红霉素，米诺环素，四环素，克林霉素和其他抗微生物剂。抗微生物剂的优选的重量百分率是0.5％～10％。
局部麻醉剂包括丁卡因，盐酸丁卡因，利多卡因，盐酸利多卡因，达克罗宁，盐酸达克罗宁，盐酸奎尼卡因，辛可卡因，盐酸辛可卡因，苦味酸氨苯丁酯和盐酸普莫卡因。优选的局部麻醉剂的浓度是以总组合物重量计约0.025％～5％。麻醉剂诸如苯佐卡因也可以重量计约2％～25％的优选的浓度使用。
可使用的皮质类固醇包括二丙酸倍他米松，氟轻松锕系元素，戊酸倍他米松，曲安西龙锕系元素，丙酸氯倍他索，去羟米松，二乙酸二氟拉松，安西奈德，氟氢缩松，戊酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，及地奈德，被建议以重量计约0.01％～1.0％的浓度使用。皮质类固醇诸如氢化可的松或乙酸甲泼尼龙的优选的浓度是以重量计约0.2％～约5.0％。
此外，治疗组合物可还包含其他酶，诸如用于治疗任何随易感的革兰氏阳性细菌存在的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细菌的酶溶葡萄球菌酶。粘液裂解性肽，诸如溶葡萄球菌酶，已被推荐在治疗人的金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染中有效(Schaffner等人，Yale J.Biol.&Med，39:230(1967))。溶葡萄球菌酶，溶血性葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的基因产物，通过酶学地降解细胞壁的多聚甘氨酸交联来对金黄色葡萄球菌(S.aureus)发挥抑菌和杀细菌效应(Browder等人,Res.Comm.,19：393～400(1965))。美国专利No.3,278,378描述了自溶葡萄性葡萄球菌(S.staphylolyticus)(随后被重命名为溶血性葡萄球菌(S.simulans))的培养基产生溶葡萄球菌酶的发酵方法。产生溶葡萄球菌酶的其他方法还描述于美国专利No.3,398,056和3,594,284。已随后克隆及测序溶葡萄球菌酶的基因(Recsei等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:1127-1131(1987))。重组体粘液裂解性杀细菌蛋白，诸如r-溶葡萄球菌酶，可因为其靶向的特异性，低毒性和有生物学活性的残留物的可能的减小而潜在地防止与当前抗生素治疗关联的问题。此外，溶葡萄球菌酶针对非-分裂细胞也是有活性的，而多数抗生素需要活跃地分裂的细胞来介导它们的效应(Dixon等人,Yale J.Biology and Medicine,41：62～68(1968))。与改变的裂解性酶组合的溶葡萄球菌酶可在抗生素的存在或缺失下使用。在相同的治疗剂中使用溶葡萄球菌酶和溶素酶有一定程度的附加的重要性。经常地，当人被细菌感染时，被一个属的细菌感染使人体变弱或改变身体的细菌菌群，允许其他潜在的病原性细菌感染身体。有时共感染身体的细菌之一是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。许多株系的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生青霉素酶，使得葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococcus)和其他革兰氏阳性细菌株会不被标准抗生素杀灭。因而，溶素和溶葡萄球菌酶的使用，可能组合抗生素，可作为细菌感染的最快速和有效治疗。治疗组合物也可包括变溶菌素，及溶菌酶。治疗或抗细菌组合物可包含二聚裂解性肽的组合，诸如Cpl-1二聚体和Pal二聚体的组合。
包含二聚裂解性酶/多肽的治疗组合物的应用手段包括，但不限于直接，间接，载体和特定手段或手段的任何组合。二聚裂解性酶/多肽的直接应用可由任何适合的手段直接使多肽接触感染或细菌定居的位点，诸如至鼻区(例如鼻喷雾剂)，真皮或皮肤应用(例如经皮制剂,局部软膏或制剂)，栓剂，塞应用，等。鼻应用包括例如鼻喷雾剂，鼻滴，鼻软膏，鼻洗剂，鼻注射，鼻填塞术，支气管喷雾剂和吸入器，或间接通过使用喉锭剂，漱口水或含漱液，或通过使用应用于鼻孔或面的软膏或这些和类似应用方法的任何组合。二聚裂解性酶可施用的形式包括但不限于锭剂，含片，糖果，注射物，口香糖，片剂，粉，喷雾剂，液体，软膏和气雾剂。
当二聚裂解性酶/多肽通过使用喷雾剂，滴，软膏，洗剂，注射物，填塞物及吸入器直接导入时，酶优选处于液体或凝胶环境中，液体发挥载体的作用。可由吸入器和支气管喷雾剂施用干无水形式的改变的酶，尽管优选递送的液体形式。
包含二聚裂解性酶/多肽的组合物可以用于预防或治疗与上呼吸道病关联的细菌感染的糖果，口香糖，锭剂，含片，片剂，粉，气雾剂，液体，液体喷雾剂，或牙膏形式施用。添加二聚裂解性酶/多肽的锭剂，片剂或胶可含有糖，玉米糖浆，各种染料，非-糖甜味剂，调味品，任何粘合剂，或其组合。类似地，任何基于胶的产品可含有阿拉伯胶，巴西棕榈蜡蜡，柠檬酸，玉米淀粉，食品着色，调味，非-糖甜味剂，明胶，葡萄糖，甘油，胶碱，紫胶，糖精钠，糖，水，白蜡，纤维素，其他结合剂，及其组合。锭剂可还含有蔗糖，玉米淀粉，阿拉伯胶，黄蓍胶，茴香脑，亚麻子，油树脂，矿物油，及纤维素，其他粘合剂，及其组合。也可代替右旋糖，蔗糖或其他糖使用糖代用品。
包含二聚裂解性酶，或它们的二聚肽片段的组合物可导入粘膜衬，在这里驻留过程中，它们杀灭定居疾病细菌。粘膜衬，和在本文公开及描述，包括，例如，上和下呼吸道，眼，口腔前庭，鼻，直肠，阴道，牙周袋，肠和结肠。由于粘膜组织的天然的消除或净化机理，常规剂型未在应用位点保留任何显著长度的时间。
具有呈现向粘膜组织粘接的物质可有利，其随一种或更多噬菌体酶和其他补充剂施用一段时间。具有受控释放能力的物质是特别期望的，及持续释放粘膜粘着剂的使用受到了显著程度的关注。J.R.Robinson(美国专利No.4,615,697,通过引用在本文合并)提供在粘膜药物递送中使用的各种受控释放聚合物组合物的良好综述。本专利描述包括生物粘附剂和有效量的处理剂的受控释放处理组合物。生物粘附剂是水可膨胀的，但水不溶性纤维状，交联的，羧基功能聚合物，其含有：(a)多个以至少约80％含有至少一种羧基官能性的重复单元，及(b)基本上无聚烯基聚醚的约0.05～约1.5％交联剂。而Robinson聚合物是水可膨胀的，但不溶性的，它们是交联的，不是热塑性的，且不像本申请的共聚物系统那么容易与活性剂配制，并成各种剂型。微团和多层微团也可用于控制酶的释放。
知道涉及是亲水和疏水物质的组合的粘膜粘着剂的其他方法。自E.R。squibb&Co的Orahesive.RTM.是在粘的烃聚合物中果胶，明胶和羧甲基纤维素钠的组合的粘合剂，其用于粘附到口腔粘膜。但是，该亲水和疏水组分的物理混合物最终分开。相反，本申请中的亲水和疏水结构域产生不溶性共聚物。美国专利No.4,948,580(也通过引用合并入本文)描述生物粘附剂口腔药物递送系统。组合物包括由在软膏基料中分散的共聚物聚(甲基乙烯基醚/马来酸酐)和明胶形成的冷冻干燥的聚合物混合物，诸如含有分散的聚乙烯的矿物油。美国专利No.5,413,792(在本文通过引用合并)公开糊剂-样制备物，其包含：(A)包含优选以重量计3:6至6:3的比存在的聚有机硅氧烷和水溶性聚合物物质的糊剂-样基料，及(B)活性成分。美国专利No.5,554,380要求保护含有具有至少2相的油包水系统的固体或半固体生物粘附性可经口摄入的药物递送系统。一相包含约25体积％～约75体积％的内部亲水相，另一相包含约23体积％～约75体积％的外部疏水相，其中外部疏水相包含3种组分：(a)乳化剂，(b)甘油酯，及(c)蜡物质。美国专利No.5,942,243描述对于施用抗细菌剂有用的一些代表性的释放物质，其通过引用合并。
治疗或药物组合物也可含有包括包含用于生物学活性剂的受控释放的亲水主链和疏水接枝链的接枝共聚物的聚合物粘膜粘着剂。接枝共聚物是(1)具有经乙烯键合不饱和的官能团的聚苯乙烯大分子单体，和(2)至少一种具有经乙烯键合不饱和的官能团的亲水酸性单体的反应产物。接枝链基本上由聚苯乙烯，及亲水单体部分的主要聚合物链组成，其中一些具有酸性官能性。接枝共聚物中聚苯乙烯大分子单体的重量百分率在约1和约20％之间，和接枝共聚物中总亲水单体的重量百分率在80和99％之间，且其中至少10％的所述总亲水单体是酸性的，所述接枝共聚物当完全水合时具有至少90％的平衡含水量。含有共聚物的组合物在应用位点通过组织流体的吸附逐渐水合而产生呈现向粘膜表面粘接的非常软的胶冻剂样团块。在该期间，组合物粘附于粘膜表面，其提供药理学活性剂的持续释放，其由粘膜组织吸收。
本申请的组合物可以不对组合物的粘膜粘着性造成有害的效应的量任选地含有其他聚合物物质，诸如聚(丙烯酸)，聚,-(乙烯基吡咯烷酮)和羧甲基纤维素钠增塑剂，及其他药学可接受的赋形剂。
本发明的组合物的剂型可由常规方法制备。在肌内注射是选择的施用模式的情况中，优选使用等渗制剂。一般而言，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠，右旋糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖。在一些情况中，优选等渗溶液诸如磷酸盐缓冲液。稳定剂包括明胶和白蛋白。可将血管收缩剂加入制剂。本申请的药学制备物无菌和无热源地提供。
本发明的二聚裂解性酶/多肽也可肠胃外施用。例如，二聚裂解性酶/多肽可肌内，鞘内，皮下地，皮下或静脉内施用，以治料被革兰氏阳性细菌感染。在肠胃外注射是选择的施用模式的情况中，优选使用等渗制剂。一般而言，用于等渗性添加剂的可包括氯化钠，右旋糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖。在一些情况中，优选等渗溶液诸如磷酸盐缓冲液。稳定剂包括明胶和白蛋白。可将血管收缩剂加入制剂。根据本申请的药学制备物无菌和无热源地提供。
对于任何化合物，治疗有效剂量可起初在细胞培养测定中或在动物模型，通常小鼠，兔，狗或猪中估计。动物模型也用于达到期望浓度范围和施用途径。该信息可然后用于测定用于人中施用的有用的剂量和途径。由个体医师考虑待治疗的患者选择确切的剂量。调整剂量和施用，以提供足够的水平的有活性的部分或以维持期望效果。可考虑的另外的因素包括患者的疾病状态的严重性，龄，重量和性别；膳食，期望的治疗持续时间，施用方法，施用时间和频度，药物组合，对治疗的反应灵敏度和耐受性/应答。长作用药物组合物可每3～4天，每周或每2周一次施用，依赖于特定制剂的半衰期和清除速度。
待肠胃外施用的二聚裂解性酶/多肽的有效剂量速度或量，及治疗持续时间会部分依赖于感染的严重性，患者特别人的重量，受者暴露于感染性细菌的持续时间，感染的皮肤或组织的平方厘米数，感染深度，感染的严重性，及各种许多其他变量。组合物可在任何处每天一次到几次应用，及可应用短或长期时期。利用可持续数天或数周。采用的任何剂型应保证最小数的单元经最小量的时间。酶活性单位的浓度被认为提供可适当选择的酶的有效量或剂量。活性单位/ml的量和暴露的持续时间依赖于感染的性质，及载体允许裂解性酶/多肽所具有的接触量。
【方法和测定】
由本发明的溶素多肽呈现的细菌杀灭能力，及的确显著地改善的稳定性及降低的血浆清除，基于本发明的多肽的抗细菌有效性提供各种方法。由此，本发明涵盖抗细菌方法，包括杀灭革兰氏阳性细菌，减少一革兰氏阳性细菌群，治疗或缓和细菌感染，治疗暴露于病原性细菌的人受试者，及治疗处于该暴露风险的人受试者的方法。敏感的细菌可由本领域技术人员容易测定或确认，且也在本文被证实包括本发明的噬菌体酶原初所来源的细菌，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，以及各种其他链球菌细菌株。也提供治疗各种病情的方法，包括预防性治疗链球菌感染，治疗链球菌感染，减少链球菌群或座，治疗下呼吸道感染，治疗耳感染，治疗中耳炎，治疗心内膜炎，及治疗或预防其他局部或系统性感染或病情的方法。
本发明也可用于治疗，特别是人中的败血症。为治疗败血症感染，诸如肺炎，或细菌脑膜炎，应有治疗剂向血流的连续静脉内流。用于治疗败血症的酶浓度依赖于血中的细菌计数和血量。
也提供的是用于治疗链球菌感染，座或群的方法，包含用包含有效量的至少一种本发明的二聚裂解性酶/多肽，特别二聚Cpl-1溶素，包括如本文特别所述的溶素的治疗剂治疗感染。更特别是，能裂解链球菌细菌株的细胞壁的二聚裂解性酶/多肽从来自特异于链球菌属(Streptococcus)的噬菌体的遗传物质或自一种或更多质粒，载体或其他重组体手段产生。在本发明的方法中，本发明的二聚溶素多肽，包括Cpl-1二聚溶素，能用于的针对革兰氏阳性细菌，特别链球菌感染或细菌定居的预防和处理方法中。在本发明的方法中作为靶敏感的和关联的细菌株包括及可选自：猪链球菌(Streptococcus suis)，马链球菌(Streptococcus equi)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(GBS)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GAS)，血链球菌(Streptococcus sanguinis)，格氏链球菌(Streptococcus gordonii)，停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)，链球菌属(Streptococcus)GES和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
本发明包括去定居，治疗或缓和链球菌相关的感染或病情的方法，包括耐抗生素的细菌，其中所述细菌或被特定细菌感染或暴露于特定细菌，或怀疑暴露或处于风险的人受试者接触或被施用一定量的对于杀灭特定细菌有效的分离的本发明的二聚溶素多肽。由此，接触或施用一种或更多二聚Cpl-1，包括如在本文及图6和表1和SEQ ID NO:3中提供的该多肽，使得对于杀灭关联细菌有效，去定居关联细菌，或另外缓和或治疗细菌感染。在进一步或另外的方面，接触或施用一种或更多二聚Pal，包括如在本文及在图7和SEQ ID NOL6中提供的该多肽，使得对于杀灭关联细菌或另外缓和或治疗细菌感染有效。
术语‘剂’是指任何分子，包括多肽，抗体，多核苷酸，化合物和小分子。尤其是术语剂包括化合物诸如测试化合物，添加的另外的化合物，或溶素酶化合物。
术语‘激动剂’最广义上指称刺激配体所结合的受体的配体。
术语‘测定’是指用以测量化合物的特定性质的任何过程。‘筛选测定’是指用于基于它们的活性从一批化合物表征或选择化合物的过程。
术语‘预防’或‘防止’指称减小可暴露于导致疾病的剂，或疾病发作前易患疾病的受试者获取或发展疾病或病症的风险(即,导致疾病的至少一个临床症状不发展)。
术语‘预防’关联于及包括在术语‘防止’中，及指称目的是预防，而非治疗或治愈疾病的措施或操作。预防性措施的非限制性例可包括施用疫苗；给由于，例如，不动而处于血栓形成的风险的医院患者施用低分子量肝素；及在访问疟疾是地方性的或患疟疾风险高的地区之前施用抗-疟疾剂诸如氯喹。
‘治疗有效量’是指会引发受试者的被医生或其他临床医师寻求的生物学或医学应答的药物，化合物，抗微生物剂，抗体，多肽或药物剂的量。尤其是，关于革兰氏阳性细菌感染和革兰氏阳性细菌的生长，术语“有效量”旨在包括会带来革兰氏阳性细菌的感染的量或程度的有生物学意义的减小，包括具有杀细菌和/或抑菌剂效应的化合物或剂的有效量。短语"治疗有效量"在本文用来指足以预防，及优选减少感染性细菌的生长或量，或其他病理学特征诸如例如，升高的发热或如可获知其存在和活性的白细胞计数的量，其中的减少是指至少约30％，更优选至少50％，最优选至少90％(临床显著变化)的减少。
在一实施方式中，术语任何疾病或感染的‘治疗’或‘治疗’指称改善疾病或感染(即,阻拦传染性病原体或细菌的疾病或生长或减少其临床症状中的至少一个的表现,程度或严重性)。在另一实施方式中，‘治疗’或‘治疗’指称改善不可被受试者辨别的至少一种物理参数。在仍另一实施方式中，‘治疗’或‘治疗’指称物理学地，(例如,可辨别的症状的稳定)，生理学地，(例如,物理参数的稳定)，或二者兼地调节疾病或感染。在进一步实施方式中，‘治疗’或‘治疗’涉及减缓疾病的进展或减少感染。
短语"药学可接受的"指称是生理学容许的，且当施用给人时一般不产生过敏性或类似不利的反应，诸如嘈杂，头晕等的分子实体和组合物。
需知，在根据本申请和权利要求的体内实施的治疗方法或医疗和临床治疗方法的情景中，术语受试者，患者或个体旨在指称人。
术语“革兰氏阳性细菌”，“革兰氏阳性细菌”，“革兰氏阳性”和不特别列的任何变体，可在本文互换所用，及如贯穿本申请和权利要求使用指称已知的和/或可由特定细胞壁和/或细胞膜特征的存在鉴定的和/或通过用革兰氏染色剂染色的革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌是已知的及可容易鉴定的及可选自但不限于利斯特菌属(Listeria)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，链球菌属(Streptococcus)，肠球菌属(Enterococcus)，分枝杆菌属(Mycobacterium)，棒杆菌属(Corynebacterium)和梭菌属(Clostridium)，及包括任何和全部认识的或未认识的物种或其株。
术语“杀细菌”指称能杀灭细菌细胞。
术语“抑菌性”指称能抑制细菌生长，包括抑制生长中的细菌细胞。
短语"药学可接受的"指称是生理学容许的，且当施用给人时一般不产生过敏性或类似不利的反应，诸如嘈杂，头晕等的分子实体和组合物。
短语"治疗有效量"在本文用于指足以预防，及优选减少靶细胞物质的S期活性，或其他病理学特征诸如例如，升高的血压，发热或如可获知其存在和活性的白细胞计数的量，其中所述减少是指至少约30％，更优选至少50％，最优选至少90％(临床显著变化)的减少。
由链球菌感染导致的疾病或病情(诸如由肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)导致的那些，可通过给患疾病或病情的哺乳动物施用包含治疗有效量的二聚溶素的组合物来治疗。在特定实施方式中，疾病或病情是菌血症，脑膜炎，肺炎，中耳炎，或鼻窦炎。
治疗由链球菌属(Streptococcus)细菌导致的系统性或组织细菌感染的一种方法包括用包含有效量的一种或更多本发明的二聚溶素多肽，特别二聚Cpl-1，包括在本文，在图6和表1提供的该多肽，和/或包括在本文在图7和SEQ ID NO:6中提供的多肽的二聚Pal，及适当的载体的治疗剂肠胃外治疗感染。许多其他不同方法可用于导入二聚裂解性酶/多肽。这些方法包括静脉内，肌内，皮下，鞘内和皮下导入二聚裂解性酶/多肽。只要给出涉及的或怀疑的细菌条件和株或细菌类型的性质和程度，本领域技术人员，包括医疗人员，将能评价及识别最适当的施用模式或手段。例如，一种或更多二聚裂解性多肽的鞘内使用和施用会是对于治疗细菌脑膜炎最有益的。
感染可也通过向人患者的感染的组织注射包含适当的裂解性酶/多肽和用于酶的载体的治疗剂来治疗。载体可包含蒸馏水，盐溶液，白蛋白，血清，或其任何组合。更特别是，用于输注或注射的溶液可以常规方式制备，例如添加防腐剂诸如p-羟基苯甲酸酯或稳定剂诸如亚乙基-二胺四乙酸的碱金属盐，可然后转移进融合容器，注射管形瓶或安瓿。或者，注射用化合物可随或不随其他成分冷冻干燥及在使用时适当地溶解于缓冲溶液或蒸馏水。非-水性媒质诸如不挥发油，脂质体和油酸乙酯也在本文有用。其他噬菌体关联的裂解性酶，随穿孔素蛋白，可包括在组合物中。
提供各种治疗方法以使用二聚裂解性酶/多肽，诸如二聚Cpl-1溶素或二聚Pal溶素，或其组合或与其组合的，如本文例示，作为消除或减少敏感的细菌座的预防性治疗，预防已暴露于具有感染症状的其他人的那些人患病，或作为已自感染患病的那些的治疗性治疗。类似地，二聚裂解性酶/多肽可用于治疗或缓和，例如，下呼吸道病，特别通过使用酶的支气管喷雾或静脉内施用。例如，裂解性酶可用于眼感染，诸如结膜炎的预防性和治疗性治疗。治疗方法包括随含有裂解性酶的载体施用能安全地应用于眼的包含有效量的至少一种本发明的二聚裂解性多肽和载体的滴眼剂或眼洗剂。滴眼剂或眼洗剂优选为等渗溶液形式。应调整溶液的pH，从而无眼的刺激，其进而会导致被其他生物可能的感染，及可能损伤眼。尽管pH范围应在与其他裂解性酶相同的范围，最佳pH会处在本文展示的及提供的范围内。类似地，应也使用用于其他裂解性酶的上述种类的缓冲剂。可将适宜于在滴眼剂中使用的其他抗生素加入含有酶的组合物。也可添加杀菌剂和抑菌化合物。溶液中的酶浓度可在约100U/ml～约500,000U/ml的范围内，约100～约5,000U/ml的更优选的范围，及约100～约50,000U/ml。浓度可相比提供的范围更高或更低。
本发明的二聚裂解性多肽也可用于接触镜溶液，用于接触镜的浸没及清洁。此溶液，其为正常等渗溶液，可含有，除了酶之外，氯化钠，甘露糖醇和其他糖醇，硼酸盐，防腐剂，等。本发明的裂解性酶/多肽也可施用于患者耳。由此，例如，本发明的二聚裂解性多肽可用于治疗例如由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)导致的耳感染。中耳炎是由症状诸如耳痛，听力损失和发热表征的中耳发炎。这些症状的主要成因之一是中耳内流体形成(泻流)。并发症包括永久听力损失，鼓膜穿孔，获得性胆脂瘤，乳突炎和粘连性中耳炎。出生后第1年发生中耳炎的儿童处于复发的急性或慢性疾病的风险。中耳炎的主要成因之一是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。可通过将裂解性酶/多肽在适当的载体中递送酶至耳道来应用于感染的耳。载体可包含无菌水性或油性溶液或悬浮液。可将裂解性酶加入载体，其也可含有适合的防腐剂，及优选表面-活性剂。优选包括在滴中的杀细菌及杀真菌剂是硝酸或乙酸苯汞(0.002％)，苯扎氯铵(0.01％)和乙酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的适合的溶剂包括甘油，稀释的醇和丙二醇。此外，可使用任意数的其他滴耳剂载体。用于治疗中耳炎和其他类似耳感染的浓度和防腐剂与就眼感染讨论的相同，及携带酶的载体与用于治疗眼感染的载体类似或相同。此外，载体可一般包括维生素，矿物质，碳水化合物，糖，氨基酸，蛋白性物质，脂肪酸，磷脂，抗氧化剂，酚化合物，等渗溶液，基于油的溶液，基于油的悬浮液，及其组合。
通过本发明的二聚溶素多肽的识别及产生提起的诊断，预防和治疗可能性和应用，源于本发明的多肽在敏感的细菌中导致直接及特定效应(例如杀灭)的事实。由此，本发明的多肽可用于消除，表征或鉴定关联和敏感的细菌。
由此，本发明的诊断方法可包括以测定是否其含有敏感的细菌，或是否样品或培养基中的细菌是敏感的目的，利用包括有效量的一种或更多二聚溶素多肽和用于表征样品中的一种或更多细胞，或测定是否细胞裂解发生了或在发生的手段的测定检查细胞样品或培养基。能从此方法受益的患者包括患未确定的感染，识别的细菌感染，或怀疑暴露于或携带特定细菌的那些。可就敏感的细菌检查会与受试者或患者接触的流体，食品，医疗装置，组合物或其他此类样品或可消除关联细菌。在一该方面流体，食品，医疗装置，组合物或其他此类样品可通过与一种或更多本发明的裂解性多肽温育或暴露于一种或更多本发明的裂解性多肽来灭菌或另外处理而消除或去除任何潜在关联细菌。
过程和它们的应用全部由本领域技术人员熟知，因此可在本发明的范围之内利用。在一实例中，本发明的裂解性多肽复合于或另外结合或缔合于样品中的关联或敏感的细菌，并将复合物的一个成员用可检测的标记物标记。形成了复合物的事实及，如果需要，其量，可通过可应用于标记物检测的知道的方法测定。为这些研究最通常采用的标记物是放射性元件，酶，当暴露于紫外光时发荧光的化学品，及其他。知道许多荧光物质及可用作标记物。这些包括，例如，荧光素，若丹明，金胺，德克萨斯红，AMCA蓝和Lucifer黄。放射性标记物可由任何目前可利用的计数方法检测。优选的同位素可选自3H，14C，32P，35S，36Cl，51Cr，57Co，58Co，59Fe，90Y，125I，131I和186Re。酶标记物是同样有用的，及可由任何目前利用的比色，分光光度计测量，荧光分光光度计测量，电流测定或气体定量技术检测。将酶通过与桥分子诸如碳二亚胺，二异氰酸酯，戊二醛等反应而缀合于选定的粒子。知道及可利用可用于这些过程的许多酶。优选的是过氧化物酶，β-葡萄糖醛酸糖苷酶，β-D-葡萄糖苷酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。为它们的替代性标记材料和方法的公开，以例示方式引用美国专利No.3,654,090；3,850,752；及4,016,043。
本发明可通过引用作为本发明的例示提供的以下非限制性例而更佳明白。但是，下列实施例旨在更完全地例证本发明的优选的实施方式，且不应解释为限制本发明的广范围。
【实施例】
【实施例1：具有增加的抗-肺炎球菌活性的稳定的噬菌体溶素(Cpl-1)二聚体】
噬菌体(噬菌体)作为它们的裂解性循环的部分产生内溶素(溶素)而为噬菌体后代的释放而降解感染的细菌的肽聚糖层。因为这些酶当非固有地添加到细胞时保持它们的针对革兰氏阳性细菌的裂解性和致死活性，它们已被活跃地开发为新抗-感染剂，有时称为酶抗生素。如其他相对小肽，它们的临床开发中的一个问题是通过蛋白水解降解，免疫学阻断或肾清除而快速灭活。抗-肺炎球菌溶素Cpl-1显示逃过蛋白水解和免疫学阻断。但是，其短血浆半衰期(在小鼠中20.5min)可呈现临床有用性的缺点。在这里我们报道考虑到Cpl-1抗-肺炎球菌比活性和血浆半衰期的增加而构建了Cpl-1二聚体。通过在酶的C-端导入特定半胱氨酸残基而实现二聚化，由此有利于二硫化物键合。相比天然单体，构建的二聚体展示特异性抗-肺炎球菌活性的2-倍增加，及血浆半衰期的几乎10-倍增加(即.0.028对比0.27ml.min-1)。由于几种溶素被怀疑与它们的细胞壁底物接触后二聚化进而完全活化，稳定的预二聚化的酶可代表天然单体的更有效替代物。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎链球菌(S.pneumoniae))是负责广泛的人感染的包裹的革兰氏阳性双球菌。其是每年在USA影响>5百万儿童的中耳炎的第1成因(4)，及鼻窦炎，社区-获取性肺炎，菌血症和脑膜炎的共同原因(13)。其在全世界，在5岁以下儿童之中负责每年>1百万死亡(5)，及肺炎球菌肺炎保持在USA全部年龄组死亡的第6大常见原因(8)。肺炎链球菌(S.pneumoniae)也是负责流感A呼吸道感染之后的超-感染(在流感大流行病期间占>90％的死亡的并发症)的主要细菌病原体(2，3，20，21)。
肺炎球菌感染通常用抗生素治疗。但是，它们在通常是病毒来源的耳炎及鼻窦炎的百万轻度病例的治疗中的过度使用，给了抗性选择巨大的压力(11)。因此，现在广泛报道细菌学地确认的治疗失败，这是由于对多种药物类，包括通常使用的β-内酰胺，大环内酯和氟喹诺酮(19，23)的抗性增加。由此，高度期望由完全不同机理作用的新药物。
噬菌体，其为细菌的天然主要捕食者，在临床开发抗生素之前几十年被视为潜在抗-细菌剂(28，29).然而，将天然噬菌体开发为依从工业产品的复杂性导至西方国家自1940年代放弃其开发。但是，今天，抗生素抗性的问题扩大重燃了对源于噬菌体的分子作为潜在临床有用的抗-细菌化合物的贡献的兴趣(9，27)。
已就其对革兰氏阳性细菌的快速杀灭作用开发了这些化合物类之一，即噬菌体溶素(1，9)。当噬菌体后代要逃脱细菌宿主时及时产生噬菌体溶素。肺炎球菌噬菌体Cp-1产生溶素Cpl-1，特异水解肺炎球菌肽聚糖的37kDa酶。此溶素如全部该内溶素构建，具有由柔性的接头连接的2个良好定义的结构域。催化性活性局限于N-端结构域，而含有6个胆碱-结合重复子(ChBR)和13个氨基-酸的C-端尾的C-端部分用于在肺炎球菌细胞壁中特异性底物结合(10)。Cpl-1属于靶向肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺残基之间的β1,4连接的溶菌酶家族(22)。我们的实验室将Cpl-1基因克隆进高表达载体pinIIIA及实现其过表达和纯化(15)。纯化的Cpl-1成功地在啮齿动物模型中治疗了肺炎球菌脓毒症(14，16)，心内膜炎(6)，脑膜炎(12)，及肺炎(31)。然而，Cpl-1自血快速体内清除，及需要重复的注射或连续输注，以在一些感染模型中优化活性(6，31)。此短半衰期可为Cpl-1和类似溶素的临床开发的缺点。
为了构建更有效的Cpl-1，我们利用了对溶素二聚化的新近知识。为了完全有活性，主要肺炎球菌自溶素(LytA)需要先二聚化，其通过其C-端胆碱-结合结构域与胆碱的相互作用起始，导致相比天然单体显著地更有活性的同源二聚体的形成(7，26，30)。Cpl-1和LytA的序列比对揭示了扩展的相似性，尤其在参与二聚化的酶的C-端尾之内。由此，我们假定，就全活性，Cpl-1可与LytA具有相同的二聚化需求。此外，Cpl-1的二聚形式可具有肾清除的显著减小，因为其分子量(74kDa对比单体的37kDa)大于60～65kDa，人中血管球过滤的阈值(18)。
在此工作中，我们构建了在C-端由二硫键连接的稳定的Cpl-1同源二聚体，并检查了其相比亲本单体的体外活性和体内血浆清除。结果为在感染模型中进一步研究此类型的二聚体的生物活性提供基础。
【材料与方法】
【试剂】
来自Qiagen的质粒miniprep试剂盒(Valencia,USA)和来自Stratagene的QuickChange II Site-Directed诱变试剂盒(Cedar Creek,USA)。DEAE-琼脂糖和凝胶过滤HiLoad 16/60SuperdexTM 200prep级柱从GE Healthcare Bio-Sciences公司(Piscataway,USA)得到。诱变引物由Fisher Scientific(Pittsburgh,USA)合成。全部其他化学品购自Sigma-Aldrich(Saint Louis,USA)。用于蛋白浓度测量的快速Start Bradford染料试剂和牛γ球蛋白(BGG)标准物来自Biorad(Hercules,USA)。Amicon ultra离心装置购自Millipore(Billerica,USA)和0.45μm Acrodisc注射器式滤器来自Pall(Ann Arbor,USA)。
【Cpl-1突变体的构建】
全部突变体通过使用QuickChange II Site-Directed诱变试剂盒，用旨在导入期望的突变的适当的引物，并根据生产商使用说明构建。突变的存在由在Genewiz(SouthPlainfield,NJ USA)实施的DNA测序确证。
【Cpl-1和Cpl-1突变体溶素的产生和纯化】
将自选择的携带野生型及突变的Cpl-1基因的克隆的质粒DNA分离，并进一步转化进大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α，以便过表达对应蛋白。从在DH5α大肠埃希氏菌(E.coli)细胞中pJML6的表达得到野生型Cpl-1蛋白。根据已在别处描述的过程产生和纯化溶素(15)。简言之，使株于37℃，在Luria-肉汤中，在以225rpm搅拌下生长过夜。用20g/L的乳糖过夜诱导蛋白表达。在收获及重悬浮于酶缓冲剂(50mM磷酸盐缓冲剂,pH7.4)之后，将细胞在冰上超声处理(Sonopuls,Bandelin electronics,Berlin,Germany)。将细胞碎片通过离心沉淀(15,000rpm,1h于37℃)，上清液于室温用20U(20U)的DNA酶I处理1h。将0.45μm过滤的上清液应用于之前用酶缓冲剂平衡的DEAE-琼脂糖快流柱。用含有1M NaCl的酶缓冲剂洗涤步骤之后，将酶用含有10％胆碱的酶缓冲剂洗脱。在相对酶缓冲剂扩展透析(MWCO 12-14,000)之后，将纯化的酶冷冻干燥及存储于-20℃。
【Cpl-1突变二聚体的分离】
全部二聚体还在与AKTA Prime设备(GE Healthcare Bio-SciencesCorporation,Piscataway,USA)连接的Hiload 16/60Superdex柱上分离。简言之，对于各突变体，将在由乳糖诱导过表达之后自发获得的单体和二聚体的混合物(见以上)以1ml/min应用于之前用酶缓冲剂平衡的柱。将含有二聚体的级分合并，用Amicon Ultra离心过滤单元(MWCO 30,000,Millipore,Carrigtwohill,爱尔兰)根据生产商建议浓缩。用浓缩的样品实施在Hiload 16/60Superdex上的第2纯化步骤。将含有二聚体的最终级分合并，浓缩至1mg/ml，及存储于-20℃直到进一步使用。
【体外杀灭测定】
杀灭测定通过使用肺炎链球菌(S.pneumoniae)株DCC1490实施，且已在别处描述(17)。简言之，使DCC1490在脑心脏输注(BHI)中生长至对数期(0.3的OD595nm)。在使细胞离心和在酶缓冲剂中重悬浮至大致109CFU/ml的浓度之后，将溶素的系列稀释直接添加到96-孔板中的细菌悬浮液中(大致5.108CFU/ml的终浓度)。通过于37℃在EL80896-孔平板读数仪(Biotek Instruments,Luzern,Switzerland)中测量OD595nm经15分钟时期来获得反应动力学。1U的酶被定义为于37℃经15分钟后达到肺炎链球菌(S.pneumoniae)DCC1490的5.108CFU/ml溶液的OD595nm减小一半(对应于CFU/ml减小1个对数)所需要的酶量。
【小鼠血浆中溶素清除的测量】
全部动物实验根据联邦和制度指南实施。给来自Charles River Laboratories(Wilmington,USA)获得的平均重量22g的雄性Balb/c小鼠在侧尾静脉中静脉内(iv)注射相同的摩尔量的野生型和二聚Cpl-1酶。由此，给2个不同组的15只小鼠Cpl-1(4.5mg/ml)或Cpl-1C45S,D324C二聚体(9mg/ml)的单次推注(100μl)。在麻醉之后，在施用后5，30，60，180和300min由心脏穿刺收集血样品，并直接放置在冰上。
通过于4℃以3000×g离心10min从冰冷的肝素化的血样品制备血浆。将血浆样品存储于-20℃直到使用。Cpl-1和Cpl-1C45S,D324C二聚体的血浆浓度通过使用间接夹层ELISA测定测定。给96孔板包被磷酸盐缓冲剂盐水1×(PBS 1×)，pH7.4中的单克隆抗-Cpl1抗体的5μg/ml溶液(于37℃经3h然后于4℃过夜)。在用200μl的洗涤缓冲剂(PBS 1×,NaCl150mM,Brij-350.05％,叠氮化钠0.02％,pH7.4)5次洗涤之后，将100μl的血浆样品和在稀释缓冲剂(PBS 1×,0.5M NaCl,0.25％Brij-35,0.02％叠氮化钠,pH7.4)中稀释的标准物加入孔，并将板于37℃温育3h。将板用200μl洗涤缓冲剂再洗涤5次，及将在稀释缓冲剂中稀释至2μg/ml的100μl/孔的第一抗体(兔多克隆抗-Cpl-1抗体)加入孔，并将板于37℃再温育3h。经用200μl洗涤缓冲剂5次另外的洗涤之后，将板在稀释缓冲剂中稀释至1/1000的100μl/孔的第二抗体(碱性磷酸酶缀合的山羊抗-兔-IgG)的存在下于室温温育过夜。次日上午，将孔用200μl洗涤缓冲剂洗涤5次，在于室温用200μl的碱性磷酸酶底物(10％二乙醇胺中1mg/ml,1mM MgCl2)温育之后由比色检测测量在405nm处的酶促活性。使用Spectra Max 5e平板读数仪(分子Devices,Sunnyvale,USA)，结果用SoftMax Pro软件分析。
由于Cpl-1的单体和二聚形式与Cpl-1-特异性抗体不同地反应，在ELISA测定中必需使用2不同标准物。将知道的浓度的纯化的Cpl-1单体用于使用天然酶的实验，将知道的浓度的纯化的Cpl-1C45S,D324C二聚体用于使用Cpl-1C45S,D324C二聚体的实验。
【结果与讨论】
需知，LytA和Cpl-1的C-端区的氨基酸序列同源(73/142个相同残基,及55/69个残基是保守性取代)，及C-端13个氨基酸负责LytA的二聚化(图1)。有趣的是，在此区之内，10/13个氨基酸在Cpl-1和LytA之间相同。我们由此推测，Cpl-1也可二聚化而变得完全有活性。
【Cpl-1C45S,D324C二聚体的构建和纯化】
我们的产生预二聚化的酶的策略集中于2个单体之间二硫桥的形成。野生型Cpl-1酶在第45，108和239位含有3个半胱氨酸残基。在SCRATCH蛋白预测机网站(scratch.proteomics.ics.uci.edu/index)上使用Accpro服务器，仅半胱氨酸45(C45)被预测可接近溶剂。由此，为避免与此半胱氨酸残基的可能的相互作用，我们加工了突变Cpl-1C45S。此突变体是可溶性的，且相比天然Cpl-1完全有活性(数据未显示)。
为了构建Cpl-1的预二聚化的形式，我们还将Cpl-1C45S突变为Cpl-1C45S,D324C。我们在Cpl-1的C-端尾中的13个氨基-酸延伸物之前特别导入新半胱氨酸残基，以防止此区中关键结构的干扰。突变由DNA测序确认。Cpl-1和Cpl-1C45S,D324C在大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α细胞中成功地过表达，并在DEAE-琼脂糖柱上纯化至同质(图2A,泳道2和图2B,泳道2)。如对于Cpl-1C45S,D324C预测，在考马斯染色的非-还原SDS-PAGE凝胶上在74kDa自发呈现第2条带(图2B,泳道2)。用10mM二硫苏糖醇(DTT)还原此样品，导致74kDa条带完全消失(图2B,泳道3)，确认Cpl-1C45S,D324C的二硫键-相关的二聚形式是可还原的。由在Sephadex G-100上2步骤纯化过程达到Cpl-1C45S,D324C二聚体进一步纯化至同质(～94％)(图2C,泳道2,及3)。
Cpl-1C45S,D324C单体的体外抗-微生物活性
我们发现，1mM DTT足以实现Cpl-1C45S,D324C二聚体完全还原为单体(数据不显示的)。在此实验中，因此，在1mM DTT的存在下测量纯化的Cpl-1C45S,D324C单体形式的抗-微生物活性。在此条件下，相比天然Cpl-1，突变酶保留100％的体外抗-细菌活性。如见于图3，使用体外杀灭测定，在以0.5nmol/ml用Cpl-1和Cpl-1C45S；D324C单体经15分钟之后达到肺炎链球菌(S.pneumoniae)的OD595nm的50％减小。计算的比活性在两种情况中是6.7U/nmol的酶。其可得出，在C-端区之内用半胱氨酸取代天冬氨酸对Cpl-1C45S,D324C的活性无显著效应。取代刚好位于LytA(及可能Cpl-1)的天然二聚化所需要的13个氨基酸尾之前，其可因此得出，新半胱氨酸残基不干扰全活性需要的怀疑的Cpl-1天然的二聚化过程。最终，我们推测，Cpl-1C45S,D324C，当由DTT处理转变为单体时，当其与细胞壁中的胆碱相互作用时，再以相同的功效结合为二聚体。
【Cpl-1C45S,D324C二聚体的体外抗-微生物活性】
在我们的体外测定中，纯化的Cpl-1C45S,D324C二聚体(图2C,泳道3)显示相比Cpl-1呈2倍增加的抗-细菌活性(对于Cpl-1C45S,D324C二聚体和Cpl-1，分别由0.25对比0.5nmol/ml达到50％OD595nm减小)(图3)。对于Cpl-1C45S,D324C二聚体和Cpl-1，计算的比活性分别是13.33和6.67U/nmol。由于基于mol-对-mol，此观察不是惊人的，产生固定的数的二聚体需要两倍多分子的单体。而且，二聚体含有2个活性位点(对比单体中的1个)，因此预期具有单体的两倍活性。最终，此结果提供证据，C-端二聚化不损伤Cpl-1活性，即就算Cpl-1实质上发生LytA-样二聚化，其也不会损伤酶活性。
【仅Cpl-1C45S,D324C二聚体是完全有活性的】
将13种Cpl-1C45S突变体各加工为在蛋白序列之内的13个不同位置具有另外的半胱氨酸。在那些之中，当在对肺炎链球菌(S.pneumoniae)DCC1490的体外杀灭测定中，在1mM的DTT存在下测试它们的单体状态时，6/13突变体显示与天然Cpl-1相同的抗-微生物活性(表1)。至于含有暴露的半胱氨酸的全部Cpl-1突变体，在对应6种突变体溶素的乳糖诱导之后发生自发二聚化。我们纯化了对应二聚体，并在我们的体外杀灭测定中测试了它们的抗-微生物活性(图5)。以0.5mg/ml，全部二聚体(除了Cpl-1C45S,D324C之外)显示它们的抗-微生物活性≥87.5％的减小。由此，相比C-端部分的最末端，其他位置的二聚化显著地损伤Cpl-1酶促活性。这些观察揭示2个单体之间二硫桥形成中涉及的新半胱氨酸残基的良好定位的重要性。
【表1：0.5mg/ml的Cpl-1突变体的抗-微生物活性】
突变名称 突变单体的活性的％ 纯化的突变二聚体的活性的％
Cpl-1C45S；Q85C 100 0
Cpl-1C45S；D194C 100 <1
Cpl-1C45S；S206C 25 n.d
Cpl-1C45S；N214C 100 5
Cpl-1C45S；G216C 100 3
Cpl-1C45S；F217C 25 n.d
Cpl-1C45S；E249C 75 n.d
Cpl-1C45S；D256C 100 12.5
Cpl-1C45S；S269C 100 3
Cpl-1C45S；M301C 18.75 n.d
Cpl-1C45S；G310C 75 n.d
Cpl-1C45S；N319C 50 n.d
Cpl-1C45S；D324C 100 100
wt，野生型，n.d，未测定
【小鼠中Cpl-1和Cpl-1C45S,D324C二聚体的血浆清除】
给Balb/c小鼠在侧尾静脉中注射100μl的4.5mg/ml(12.16nmole/100μl)的天然Cpl-1或9mg/ml(12.16nmole/100μl)浓度的Cpl-1C45S,D324C二聚体的药团。在注射后5，30，60，180和300分钟取血样品。使用夹层ELISA检定，发现在各时间点Cpl-1C45S,D324C二聚体浓度相比对照单体显著地更高(图4)。例如，相比Cpl-1单体，在注射后30分钟检测到血浆中20.32倍更多二聚体分子(对于Cpl-1C45S,D324C二聚体和Cpl-1,分别4,764.32±788.55对比234.5±48.93pmol/ml)。在5小时之后，差异是7.76(对于Cpl-1C45S,D324C二聚体和Cpl-1,分别116.8±22.85对比15.05±1.82pmol/ml)。表示实验过程中血浆中残留的溶素的计算的曲线下面积(AUC)是：单体为44.417nmol/min-1/ml-1，对比二聚体为435.026nmol/min-1/ml-1。由此，对于12.16nmol的注射的剂量，相比Cpl-1C45S,D324C二聚体的0.028ml/min-1，发现Cpl-1单体的0.274ml/min-1的清除值，使稳定化的二聚体的清除相比单体降低～9.8倍。
通过二聚化倍增Cpl-1的尺寸被发现对酶自小鼠血浆清除具有显著效应，提示肾过滤可在其消除中起到实质性作用。我们的发现指示，相比在肺炎球菌败血症小鼠模型中之前测试的并显示具有20.5分钟半衰期(12，15)的天然Cpl-1单体，Cpl-1C45S,D324C二聚体是远更有力的静脉内分子。而且，更大量的二聚体是在血中可利用于系统性分布，由此，Cpl-1C45S,D324C二聚体预期在其他肺炎链球菌(S.pneumoniae)关联的疾病中显示改善的治疗效果。例如，在新近出版物中，通过每12小时腹膜内递送溶素将单体形式的Cpl-1用于治疗肺炎小鼠(31)。尽管溶素的短半衰期，此治疗的有效性提示，二聚形式可证明在治疗类似感染中显著地更有效。当然，需在体内环境中评价在感染位点二聚体的生物利用度。
总之，我们在此报道，构建的稳定化的二聚溶素是原单体的体外活性的两倍(以1/1摩尔比)，及在血中具有大致10倍的生物利用度。我们也证明，需导入的参与二聚化的新导入的半胱氨酸的位置的选择是关键的。持久的Cpl-1溶素可代表针对抗生素-敏感的及-抗性肺炎球菌的新替代品。而且，因为几种其他噬菌体溶素已显示或怀疑二聚化(7，24，25)，此策略可代表增加特定噬菌体溶素的活性和/或药代动力学的一般方式。
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【实施例2：体内动物研究】
静脉内杀灭功效。将4周至6周龄雌性C3H/HeJ小鼠通过尾静脉用3×107CFU的对数期肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型14(株DCC1490,青霉素敏感的)感染及在感染后10h用100μl不同浓度(100～2000μg)Cpl-1或相同的体积(100μl)的缓冲剂静脉内处理。在处理之前和15和120min之后获得血样品，及通过系列稀释测定细菌滴度，并在血琼脂上平铺。通过使用奥普多兴盘确认α-溶血集落中肺炎链球菌(S.pneumoniae)的存在。
【实施例3：二聚化的PAL酶】
Pal是自在数秒内特异性消化肺炎球菌细胞壁的肺炎球菌噬菌体分离的链球菌溶素(Loeffler,JM等人(2001)Science 294：2170-2172；美国专利7,569,223)。Pal是具有34kDa的分子质量的296个氨基酸裂解性蛋白，且是酰胺酶，在N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之间切割肽聚糖。以上描述的Cpl-1是339个氨基酸的蛋白，且是溶菌酶，在N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间切割糖苷键(Garcia,P et al(1997)Microb Drug Resist 3:165–176)。尽管两种酶具有非常不同的N-端催化性位点，它们共享类似C-端细胞壁附接位点，其结合于胆碱。已描述Pal和Cpl-1的组合对肺炎链球菌(S.pneumoniae)，包括青霉素抗性株的增强的杀灭功效(Loeffler,JM and Fischetti,VA(2003)Antimicrob Agents and Chemoth47(1):375-377；公开的PCT WO2004/058182)。
如Cpl-1，Pal酶C-端区包括与LytA对应的胆碱结合重复子和C-端氨基酸，实际上，Pal的C-端14个氨基酸中的11个与LytA序列的相同。当比较Pal和Cpl-1时，Pal的C-端14个氨基酸中的9个与Cpl-1的相同。Pal与Cpl-1和LytA在其C-端区显示总体相似性，特别是氨基酸155至296，其中在Pal，Cpl-1和LytA之中，该142个氨基酸中的60个相同。图7描绘Cpl-1，Pal和LytA的氨基酸序列及展示这3种酶的同源C-端区。
使用以上就Cpl-1描述的相当的方法，加工及构建由二硫键共价连接的及稳定化的2个单体组成的Pal二聚体。使用Pal酶的2个单体之间二硫桥的形成，如同Cpl-1，产生例示预二聚化的Pal酶。
野生型Pal酶在氨基酸第34，113和250位含有3个半胱氨酸残基。在SCRATCH蛋白预测机网站(scratch.proteomics.ics.uci.edu/index)上使用Accpro服务器，无Pal半胱氨酸残基被预测可接近溶剂。由此，在进行预二聚化Pal之前加工缺少任何天然酶半胱氨酸的Pal突变体不被认为是必需的。为了构建Pal的预二聚化的形式，将C末端区氨基酸突变为Cys。新半胱氨酸残基被特别导入到Pal的C-端尾中最终14个氨基-酸延伸物之前，以防止此同源区中任何关键结构的干扰。突变由DNA测序确认及野生型和突变Pal在大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α细胞中过表达，并在DEAE-琼脂糖柱上纯化至同质。预二聚化的突变Pal由在考马斯染色的非-还原SDS-PAGE凝胶上约70kDa处呈现第2条带确认。用10mM二硫苏糖醇(DTT)还原，其导致更高kDa条带的消失，确认Pal的二硫键-相关的二聚形式是可还原的。构建氨基酸280突变为半胱氨酸的PalD280C，确认及测试以建立预二聚化的Pal酶的产生。PalD280C突变体在与Pal的LytA类似C-端14个氨基酸相邻的相当位置预二聚化中与Cpl-1C45S,D324C类似。如以上对Cpl-1描述进行突变体二聚化的Pal的杀灭活性和功效的体外和体内测试，以展示突变体二聚化的Pal的抗-肺炎球菌活性。
尽管已在本文通过引用各种特定材料，过程和实施例描述及例证本发明，需知，本发明不局限于为该目的选择的特定材料，材料组合，及过程。可暗示该细节的多种变异及会由本领域技术人员同意。

Claims (13)

1.分离的二聚链球菌属(Streptococcus)-特异性噬菌体溶素，其包含彼此共价连接的2个链球菌属特异性噬菌体溶素单体，其中所述二聚体针对一种或更多链球菌属细菌的杀灭活性高于所述链球菌属特异性噬菌体溶素单体中任一种的杀灭活性，其中所述溶素单体选自：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、并被突变成在所述溶素的开始45个残基内不具有Cys残基、而自C-端14和20个氨基酸之间包含Cys残基的突变Cp1-1溶素，由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的突变Cpl-1溶素，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、并被突变成在自C-端14和20个氨基酸之间包含Cys残基的突变Pal溶素，和由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的突变Pal溶素。
2.权利要求1的溶素，其中所述溶素单体彼此化学交联。
3.权利要求2的溶素，其中所述溶素单体彼此由二硫键共价连接。
4.权利要求1～3之任一项的溶素，其针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)具有杀灭活性。
5.权利要求1的溶素，其中一个或多个溶素单体是Cpl-1C45S,D324C或PalD280C。
6.包含治疗有效量的权利要求1～5之任一项的溶素的组合物在制备用于治疗患有由链球菌感染导致的疾病或病情的哺乳动物的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述感染由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)导致。
8.权利要求6的用途，其中所述疾病或病情是选自下列的一种或更多疾病或病情：菌血症，脑膜炎，肺炎，中耳炎及鼻窦炎。
9.包含治疗有效量的权利要求1～5之任一项的溶素的组合物在制备用于使患有由链球菌感染导致的疾病或病情或处于由链球菌感染导致的疾病或病情风险的哺乳动物中的链球菌去定居的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述感染由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)导致。
11.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1～5之任一项的二聚溶素，及药学可接受的载体。
12.抗-微生物组合物，其用于清洁或净化多孔或非-多孔表面，所述组合物包含权利要求1－5中任一项的二聚溶素。
13.净化怀疑含有感染性细菌的无生命的表面的方法，包括用杀细菌地或抑细菌地有效量的权利要求12的组合物处理所述表面。
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