JP2616784B2 - ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド - Google Patents
ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミドInfo
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- JP2616784B2 JP2616784B2 JP62292739A JP29273987A JP2616784B2 JP 2616784 B2 JP2616784 B2 JP 2616784B2 JP 62292739 A JP62292739 A JP 62292739A JP 29273987 A JP29273987 A JP 29273987A JP 2616784 B2 JP2616784 B2 JP 2616784B2
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- dna
- human interleukin
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/545—IL-1
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子組み換え法により大腸菌を用いてヒ
ト インターロイキン１ポリペプチドを生産するための
高度形質発現プラスミド及びそれを用いたイト インタ
ーロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
ト インターロイキン１ポリペプチドを生産するための
高度形質発現プラスミド及びそれを用いたイト インタ
ーロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
本発明は、更に詳しくはヒト インターロイキン１ポ
リペプチドをコードするDNAの塩基配列の上流に下記式
〔Ａ〕で示される塩基配列を有するDNA、該DNAが組み込
まれた形質発現プラスミド及び該形質発現プラスミドに
より形質転換された形質転換体を用いるヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
リペプチドをコードするDNAの塩基配列の上流に下記式
〔Ａ〕で示される塩基配列を有するDNA、該DNAが組み込
まれた形質発現プラスミド及び該形質発現プラスミドに
より形質転換された形質転換体を用いるヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの効率的製造法に関する。
５′−XGGAGGTTTYATTATG−３′ 式［Ａ］ ［式中、Ｘは（Ａ）ｘを意味し、ｘは１〜５を表わす。
Ｙは（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０
又は１を表わす。３′側のATGは翻訳開始コドンを意味
する。］ 本発明者らは、ヒト インターロイキン１ポリペプチ
ドを遺伝子組み換え技術を応用して、微生物菌体内で生
産する製造系を、既に確立している（ヨーロッパ公開特
許第0188920号）。
Ｙは（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０
又は１を表わす。３′側のATGは翻訳開始コドンを意味
する。］ 本発明者らは、ヒト インターロイキン１ポリペプチ
ドを遺伝子組み換え技術を応用して、微生物菌体内で生
産する製造系を、既に確立している（ヨーロッパ公開特
許第0188920号）。
本発明者らは、大腸菌中で、ヒト インターロイキン
１ポリペプチドを効率的に生産させるための形質発現プ
ラスミドの改良を試み、目的にかなう高度形質発現プラ
スミドの構築に成功し、本発明を完成した。
１ポリペプチドを効率的に生産させるための形質発現プ
ラスミドの改良を試み、目的にかなう高度形質発現プラ
スミドの構築に成功し、本発明を完成した。
本発明によれば、適当なプロモーター、例えばトリプ
トファン オペロンのプロモーター（以下、trpプロモ
ーターと記す）の下流に順次、上記式［Ａ］で示された
塩基配列を有するSD配列領域から翻訳開始コドンまでの
塩基配列、更にヒトインターロイキン１ポリペプチドを
コードする塩基配列及び翻訳終止コドンを結合し、この
DNAを、例えば大腸菌プラスミドpBR322又はその複製開
始点近傍のコピー数制御領域等を欠失させた変異プラス
ミドの適当な位置に挿入することにより、本発明のヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを作製することができる。
トファン オペロンのプロモーター（以下、trpプロモ
ーターと記す）の下流に順次、上記式［Ａ］で示された
塩基配列を有するSD配列領域から翻訳開始コドンまでの
塩基配列、更にヒトインターロイキン１ポリペプチドを
コードする塩基配列及び翻訳終止コドンを結合し、この
DNAを、例えば大腸菌プラスミドpBR322又はその複製開
始点近傍のコピー数制御領域等を欠失させた変異プラス
ミドの適当な位置に挿入することにより、本発明のヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを作製することができる。
そして該形質発現プラスミドを、常法に従い大腸菌に
導入し、形質転換させた大腸菌を培養することにより、
目的とするヒト インターロイキン１ポリペプチドを効
率よく産生せしめることができる。
導入し、形質転換させた大腸菌を培養することにより、
目的とするヒト インターロイキン１ポリペプチドを効
率よく産生せしめることができる。
本発明に用いられるヒト インターロイキン１ポリペ
プチドをコードするDNAとしては、第１表に掲げた式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を有するDNA、例えば第２表で掲げ
た式［Ｂ］で示される塩基配列を有するDNA及びその縮
重が最も好ましいものとして挙げられるが、この他に式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を部分的に変換したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列を
有するDNAが挙げられる。ここにおける部分的に変換し
たアミノ酸配列としては、例えばＮ末端側の１〜14個の
アミノ酸残基を欠失させたもの、Ｎ末端側を除く構成ア
ミノ酸の１〜数個のアミノ酸を欠失させたもの及び構成
アミノ酸の１〜数個のアミノ酸をアミノ酸に置換したも
のが挙げられる。
プチドをコードするDNAとしては、第１表に掲げた式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードする塩基配列を有するDNA、例えば第２表で掲げ
た式［Ｂ］で示される塩基配列を有するDNA及びその縮
重が最も好ましいものとして挙げられるが、この他に式
［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を部分的に変換したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列を
有するDNAが挙げられる。ここにおける部分的に変換し
たアミノ酸配列としては、例えばＮ末端側の１〜14個の
アミノ酸残基を欠失させたもの、Ｎ末端側を除く構成ア
ミノ酸の１〜数個のアミノ酸を欠失させたもの及び構成
アミノ酸の１〜数個のアミノ酸をアミノ酸に置換したも
のが挙げられる。
以下に、本発明の形質発現プラスミドの効果について
説明する。
説明する。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒトインタ
ーロイキン１ポリペプチドをコードするDNAが組み込ま
れた各種形質発現プラスミドを、大腸菌HB101株に導入
して作製した形質転換体のヒト インターロイキン１ポ
リペプチドの生産効率について検討を行った。
ーロイキン１ポリペプチドをコードするDNAが組み込ま
れた各種形質発現プラスミドを、大腸菌HB101株に導入
して作製した形質転換体のヒト インターロイキン１ポ
リペプチドの生産効率について検討を行った。
以下の実施例で示す形質発現プラスミドは、いずれも
プロモーターとしては、trpプロモーターを用い、プラ
スミドベクターには、pBR322のコピー数制御領域を欠失
させた変異プラスミドpBRS6（参考例参照）を用いた。
プロモーターとしては、trpプロモーターを用い、プラ
スミドベクターには、pBR322のコピー数制御領域を欠失
させた変異プラスミドpBRS6（参考例参照）を用いた。
ヒト インターロイキン１ポリペプチドの生産量比
は、一定の生産菌数（波長600nmにおける吸光度値が１
の生産菌懸濁液の1ml中に含まれる菌数）当りのヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産量に基づく比率で
示す。
は、一定の生産菌数（波長600nmにおける吸光度値が１
の生産菌懸濁液の1ml中に含まれる菌数）当りのヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産量に基づく比率で
示す。
ヒト インターロイキン１ポリペプチド量は、特開昭
62−91197号に開示され２種類の抗ヒト インターロイ
キン１モノクローナル抗体＃0374と＃0964を用いた酵素
標識イムノアッセイ法［砂原ら、第45回日本癌学界総会
記事、343頁（1986）］にて、特開昭61−271222号記載
の方法に従って製造されたヒト インターロイキン１ポ
リペプチドを標準品として用いて定量した。
62−91197号に開示され２種類の抗ヒト インターロイ
キン１モノクローナル抗体＃0374と＃0964を用いた酵素
標識イムノアッセイ法［砂原ら、第45回日本癌学界総会
記事、343頁（1986）］にて、特開昭61−271222号記載
の方法に従って製造されたヒト インターロイキン１ポ
リペプチドを標準品として用いて定量した。
ヒト インターロイキン１生産菌の作製方法、培養条
件及び菌体からの該ポリペプチドの抽出条件は、次の通
りである。
件及び菌体からの該ポリペプチドの抽出条件は、次の通
りである。
即ち、ヒト インターロイキン１生産用形質発現プラ
スミドを、例えばCohenらの方法［Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,69巻、2110頁（972）］に準じて大腸菌HB101株
に導入して作製した生産菌を、LBブロス［組成:1％トリ
プトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.5］中、37℃
で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液を改良M9培地［組
成:1.5％Na2HPO4・12H2O、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、
0.1％NH4Cl、2mg/lビタミンB1、0.5％カゼミノ酸、2mM
MgSO4、0.1mM CaCl2、0.5％ブドウ糖］中に、１％濃度
に接種し37℃で１時間培養後、インドール−３−アクリ
ル酸を最終濃度20μg/mlになるように添加し、更に一夜
培養した。培養終了後、その菌体懸濁液の波長600nmの
濁度を測定し、遠心分離にて菌体を採取した。得られた
菌体を酵素消化液［組成:0.1％リゾチーム及び30mM NaC
lを含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）］中に懸濁さ
せ、０℃で30分間静置した後、ドライアイス／エタノー
ル浴での凍結及び37℃での融解を繰り返すことにより、
菌体を破壊した。遠心分離により、菌体残査糖を除去し
てヒト インターロイキン１ポリペプチド抽出液を得
た。この抽出液中のヒト インターロイキン１ポリペプ
チド量を、上記の酵素標識イムノアッセイ法により定量
した。
スミドを、例えばCohenらの方法［Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,69巻、2110頁（972）］に準じて大腸菌HB101株
に導入して作製した生産菌を、LBブロス［組成:1％トリ
プトン、0.5％酵母エキス、１％NaCl、pH7.5］中、37℃
で一夜振盪培養した。その菌体懸濁液を改良M9培地［組
成:1.5％Na2HPO4・12H2O、0.3％KH2PO4、0.05％NaCl、
0.1％NH4Cl、2mg/lビタミンB1、0.5％カゼミノ酸、2mM
MgSO4、0.1mM CaCl2、0.5％ブドウ糖］中に、１％濃度
に接種し37℃で１時間培養後、インドール−３−アクリ
ル酸を最終濃度20μg/mlになるように添加し、更に一夜
培養した。培養終了後、その菌体懸濁液の波長600nmの
濁度を測定し、遠心分離にて菌体を採取した。得られた
菌体を酵素消化液［組成:0.1％リゾチーム及び30mM NaC
lを含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）］中に懸濁さ
せ、０℃で30分間静置した後、ドライアイス／エタノー
ル浴での凍結及び37℃での融解を繰り返すことにより、
菌体を破壊した。遠心分離により、菌体残査糖を除去し
てヒト インターロイキン１ポリペプチド抽出液を得
た。この抽出液中のヒト インターロイキン１ポリペプ
チド量を、上記の酵素標識イムノアッセイ法により定量
した。
実験例１ 自然界に存在するtrpプロモーター・オペレーター領
域に続くtrpＬタンパクをコードする塩基配列の上流に
あるSD配列（trpＬのSD配列と記す）を利用して、参考
例に記載したヒト インターロイキン１生産用の形質発
現プラスミド（プラスミド番号pHILT383）を作製した。
更に、trpＬのSD配列の代わりに、蛋白翻訳に必要なリ
ボゾームの結合がより効率的なSD配列、SD配列から翻訳
開始コドン間の距離及び塩基配列の変換及びSD配列領域
の５′末端のＡ残基数の生産効率に及ぼす効果を検討し
た。形質発現プラスミドpHIPH383a〜pHIPH383hの構築方
法は、実施例１に示す。形質発現プラスミドpHIPH383の
構築方法は、参考例に示す。尚、SD配列から上流部分の
制限酵素Hpa Iの切断認識部位までの塩基配列は、すべ
ての形質発現プラスミドについて同一であり次の配列を
有する： ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGT−３′ 本発明のヒト インターロイキン１生産用形質発現プ
ラスミドを用いて作製した生産菌によるヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの生産効率を、第３表に示す。
域に続くtrpＬタンパクをコードする塩基配列の上流に
あるSD配列（trpＬのSD配列と記す）を利用して、参考
例に記載したヒト インターロイキン１生産用の形質発
現プラスミド（プラスミド番号pHILT383）を作製した。
更に、trpＬのSD配列の代わりに、蛋白翻訳に必要なリ
ボゾームの結合がより効率的なSD配列、SD配列から翻訳
開始コドン間の距離及び塩基配列の変換及びSD配列領域
の５′末端のＡ残基数の生産効率に及ぼす効果を検討し
た。形質発現プラスミドpHIPH383a〜pHIPH383hの構築方
法は、実施例１に示す。形質発現プラスミドpHIPH383の
構築方法は、参考例に示す。尚、SD配列から上流部分の
制限酵素Hpa Iの切断認識部位までの塩基配列は、すべ
ての形質発現プラスミドについて同一であり次の配列を
有する： ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGT−３′ 本発明のヒト インターロイキン１生産用形質発現プ
ラスミドを用いて作製した生産菌によるヒト インター
ロイキン１ポリペプチドの生産効率を、第３表に示す。
ヒト インターロイキン１の生産効率は、形質発現プ
ラスミドのSD配列、SD配列から翻訳開始コドン間の塩基
配列及びSD配列の５′末端のＡ残基数により影響され、
これらの配列の変換により、生産量を有意に増加させる
ことができた。
ラスミドのSD配列、SD配列から翻訳開始コドン間の塩基
配列及びSD配列の５′末端のＡ残基数により影響され、
これらの配列の変換により、生産量を有意に増加させる
ことができた。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列のＮ末端側の５個の
アミノ酸を欠失させたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド生産用形質発現プラスミドについても、上記とほぼ同
様な結果が得られた。
アミノ酸を欠失させたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド生産用形質発現プラスミドについても、上記とほぼ同
様な結果が得られた。
実験例２ ヒト インターロイキン１生産用形質発現プラスミド
の生産効率に及ぼす蛋白翻訳領域の塩基配列の部分的変
換、即ちコードするアミノ酸の種類を変えることなく他
の塩基へ変換すること（縮重コドンの使用）の効果につ
いて検討した。
の生産効率に及ぼす蛋白翻訳領域の塩基配列の部分的変
換、即ちコードするアミノ酸の種類を変えることなく他
の塩基へ変換すること（縮重コドンの使用）の効果につ
いて検討した。
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒト イン
ターロイキン１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸から５番
目までのアミノ酸配列、それをコードするcDNAの塩基配
列（以下、天然の塩基配列と記す）及び縮重コドンによ
る変換例を、第４表に示す。
ターロイキン１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸から５番
目までのアミノ酸配列、それをコードするcDNAの塩基配
列（以下、天然の塩基配列と記す）及び縮重コドンによ
る変換例を、第４表に示す。
縮重コドンを用いて作製した形質発現プラスミドを用
いた場合の生産効率は、天然の塩基配列を用いて作製し
たものに比べて、勝っていた。
いた場合の生産効率は、天然の塩基配列を用いて作製し
たものに比べて、勝っていた。
以上の実験例に示すごとく、ヒト インターロイキン
１ポリペプチド生産用形質発現プラスミドの構築にあた
り、SD配列機能を有する塩基配列、SD配列から翻訳開始
コドン間の塩基の種類及び距離、更にヒト インターロ
イキン１をコードする塩基配列中の塩基の種類などを変
換することにより、その生産効率を上昇させることがで
きた。
１ポリペプチド生産用形質発現プラスミドの構築にあた
り、SD配列機能を有する塩基配列、SD配列から翻訳開始
コドン間の塩基の種類及び距離、更にヒト インターロ
イキン１をコードする塩基配列中の塩基の種類などを変
換することにより、その生産効率を上昇させることがで
きた。
尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を
使用する。
使用する。
A アデニン C シトシン G グアニン T チミン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 bp 塩基対 kbp キロ塩基対 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 形質発現プラスミドpHIPH383a〜pHIPH383hの構築 第１表の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を有するヒ
トインターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラ
スミドを構築した。
トインターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラ
スミドを構築した。
参考例に記載したヒト インターロイキン１前駆体ポ
リペプチドをコードするクローン化cDNAが組み込まれた
組み換え体プラスミドpHL4から、制限酵素EcoR IとBstN
Iにて消化し、第５表に示した塩基配列の第398〜808番
目までに相当するDNA断片を単離した。
リペプチドをコードするクローン化cDNAが組み込まれた
組み換え体プラスミドpHL4から、制限酵素EcoR IとBstN
Iにて消化し、第５表に示した塩基配列の第398〜808番
目までに相当するDNA断片を単離した。
このDNA断片に、下記の式［Ｃ］及び［Ｄ］で示され
る２種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT4
DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られたDNA断
片を、SD−IL1断片という。但し、式［Ｃ］の化学合成
オリゴヌクレオチド アダプターとは、下記式［ａ］〜
［ｅ］で示される５種類のDNA断片を、順次結合させて
作製したDNAアダプターである（以下化学合成DNA［ｃ］
と記す）。
る２種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをT4
DNAリガーゼを用いて結合させた。ここで得られたDNA断
片を、SD−IL1断片という。但し、式［Ｃ］の化学合成
オリゴヌクレオチド アダプターとは、下記式［ａ］〜
［ｅ］で示される５種類のDNA断片を、順次結合させて
作製したDNAアダプターである（以下化学合成DNA［ｃ］
と記す）。
式［Ｄ］の化学合成オリゴヌクレオチド オダプター
の塩基配列は、次の通りである。
の塩基配列は、次の通りである。
別途に、古谷らの方法［Nucleic Acids Res.,13巻、
5869頁（1985）］に従って作製した形質発現ベクターpE
P302を、制限酵素Hpa IとBamH Iにて消化し、trpプロモ
ーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大き
なDNA断片（以下、ベクター断片という）を単離した。
5869頁（1985）］に従って作製した形質発現ベクターpE
P302を、制限酵素Hpa IとBamH Iにて消化し、trpプロモ
ーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大き
なDNA断片（以下、ベクター断片という）を単離した。
このベクター断片と上述のSD−IL1断片を、T4DNAリガ
ーゼを用いて結合させることにより、新規形質発現プラ
スミドを構築した。この形質発現プラスミドをpHIPH383
aと名づけた（第１図参照）。
ーゼを用いて結合させることにより、新規形質発現プラ
スミドを構築した。この形質発現プラスミドをpHIPH383
aと名づけた（第１図参照）。
また、上記の方法に従い、ただし化学合成DNA［Ｃ］
を構築する断片［ｂ］の代わりに、下記式で示されるDN
A断片、［１］〜［７］のいずれかを用いることによ
り、それぞれ形質発現プラスミドpHIPH383b、pHIPH383
c、pHIPH383d、pHIPH383e、pHIPH383f、pHIPH383g及びp
HIPH383hを構築することができる。
を構築する断片［ｂ］の代わりに、下記式で示されるDN
A断片、［１］〜［７］のいずれかを用いることによ
り、それぞれ形質発現プラスミドpHIPH383b、pHIPH383
c、pHIPH383d、pHIPH383e、pHIPH383f、pHIPH383g及びp
HIPH383hを構築することができる。
以下に、形質発現プラスミドの名称と、その構築に用
いる上記のDNA断片［ｂ］に代わる各々のDNA断片
（［１］〜［７］）の塩基配列を示す。
いる上記のDNA断片［ｂ］に代わる各々のDNA断片
（［１］〜［７］）の塩基配列を示す。
pHIPH383b構築用DNA断片： pHIPH383c構築用DNA断片： pHIPH383d構築用DNA断片： pHIPH383e構築用DNA断片： pHIPH383f構築用DNA断片： pHIPH383g構築用DNA断片： pHIPH383h構築用DNA断片： 実施例２ ヒトインターロイキン１の製造 実施例１で得た形質発現プラスミドpHIPH383a、次の
方法に従って大腸菌BH101株に導入し形質転換体を作製
した。
方法に従って大腸菌BH101株に導入し形質転換体を作製
した。
即ち、大腸菌HB101株をLBブロスに接種し、30℃で一
夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100mlのLBブロスに
接種し、濁度（波長600nmの吸光度）が約0.6になるま
で、30℃で培養した。この培養液を、氷水中で30分間静
置したのち、遠心分離にて菌体の採取した。この菌体を
50mlの50mM CaCl2に再懸濁させ、氷水中で60分間静置し
たのち、遠心分離にて菌体を採取し20％グリセリンを含
む50mM CaCl2の10mlに懸濁させた。
夜培養した。その菌体懸濁液の1mlを100mlのLBブロスに
接種し、濁度（波長600nmの吸光度）が約0.6になるま
で、30℃で培養した。この培養液を、氷水中で30分間静
置したのち、遠心分離にて菌体の採取した。この菌体を
50mlの50mM CaCl2に再懸濁させ、氷水中で60分間静置し
たのち、遠心分離にて菌体を採取し20％グリセリンを含
む50mM CaCl2の10mlに懸濁させた。
この懸濁液に、上記の形質発現プラスミドpHIPH383a
を添加し、氷水中で20分間、室温で10分間処理したの
ち、LBブロスを加え、37℃で60分間振盪培養した。その
菌体懸濁液の一定量を、25μg/ml濃度のアンピシリンを
含むLB寒天平板（寒天濃度1.5％）に播き、37℃で一夜
培養したのちアンピシリン耐性クローンを得た。この形
質転換体を、ヒト インターロイキン１ポリペプチド生
産菌（HB101/pHIPH383aと名づける）とした。
を添加し、氷水中で20分間、室温で10分間処理したの
ち、LBブロスを加え、37℃で60分間振盪培養した。その
菌体懸濁液の一定量を、25μg/ml濃度のアンピシリンを
含むLB寒天平板（寒天濃度1.5％）に播き、37℃で一夜
培養したのちアンピシリン耐性クローンを得た。この形
質転換体を、ヒト インターロイキン１ポリペプチド生
産菌（HB101/pHIPH383aと名づける）とした。
ヒト インターロイキン１ポリペプチド生産菌HB101/
pHIPH383aを、LBブロス中37℃で一夜培養したのち、そ
の菌体懸濁液を約100倍量の改良M9培地に接種し、37℃
で１時間培養した。更に、インドール−３−アクリル酸
を最終濃度20μg/mlになるように添加したのち、24時間
培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を採取し、
0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM Trs−HCl緩
衝液（pH8.0）に懸濁させ、氷水中で30分間静置したの
ちドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融解
を繰り返して菌体を破壊した。これに、1/50容量の10％
ポリエチレンイミンを加えて静置のうち、遠心分離にて
菌体残査等を除いた抽出液を得た。
pHIPH383aを、LBブロス中37℃で一夜培養したのち、そ
の菌体懸濁液を約100倍量の改良M9培地に接種し、37℃
で１時間培養した。更に、インドール−３−アクリル酸
を最終濃度20μg/mlになるように添加したのち、24時間
培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を採取し、
0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM Trs−HCl緩
衝液（pH8.0）に懸濁させ、氷水中で30分間静置したの
ちドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融解
を繰り返して菌体を破壊した。これに、1/50容量の10％
ポリエチレンイミンを加えて静置のうち、遠心分離にて
菌体残査等を除いた抽出液を得た。
この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水溶液を
添加し、静置ののち遠心分離により沈澱画分を採取し
た。この沈澱を、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて
溶解し、同緩衝液に対して十分透析した。これを、同緩
衝液にて平衡化したDEAE−セファロースCL−6Bカラムに
負荷し、同緩衝液にてカラムを洗浄したのち、カラムに
吸着したヒト インターロイキン１ポリペプチドを、０
〜0.5MのNaCl濃度勾配にて溶出した。インターロイキン
１活性を有する画分を集め、限外過にて濃縮したの
ち、セファクリルＳ−200カラムを用いるゲル過によ
り精製した。更に、このDEAE−セファロースCL−6Bカラ
ム及びセファクリルＳ−200カラムを用いた精製を繰り
返すことにより、高度に精製した。
添加し、静置ののち遠心分離により沈澱画分を採取し
た。この沈澱を、20mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0）にて
溶解し、同緩衝液に対して十分透析した。これを、同緩
衝液にて平衡化したDEAE−セファロースCL−6Bカラムに
負荷し、同緩衝液にてカラムを洗浄したのち、カラムに
吸着したヒト インターロイキン１ポリペプチドを、０
〜0.5MのNaCl濃度勾配にて溶出した。インターロイキン
１活性を有する画分を集め、限外過にて濃縮したの
ち、セファクリルＳ−200カラムを用いるゲル過によ
り精製した。更に、このDEAE−セファロースCL−6Bカラ
ム及びセファクリルＳ−200カラムを用いた精製を繰り
返すことにより、高度に精製した。
１リットルの培養により採取した菌体から、最終的に
約85mgの高度精製ヒトインターロイキン１ポリペプチド
が得られた。ここで得たヒトインターロイキン１ポリペ
プチドのアミノ酸配列を、蛋白分解酵素による断片化と
自動エドマン分解法により分析し、第１表の式［Ｉ］に
示されるアミノ酸配列と完全に一致することを確認し
た。
約85mgの高度精製ヒトインターロイキン１ポリペプチド
が得られた。ここで得たヒトインターロイキン１ポリペ
プチドのアミノ酸配列を、蛋白分解酵素による断片化と
自動エドマン分解法により分析し、第１表の式［Ｉ］に
示されるアミノ酸配列と完全に一致することを確認し
た。
参考例 形質発現プラスミドpHILT383及びpHIPH383の構築 特開昭61−149092号に記載の方法で得たヒト イター
ロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするクローン化
cDNAが組み込まれた組み換え体プラスミドpHL4から、制
限酵素Pst Iによる消化にて、cDNA領域を切り出した。
このcDNAがコードするヒト インターロイキン１前駆体
ポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩基配列を第５表
に示す。このクローン化cDNAを、制限酵素Alu Iにて消
化し、第５表に示した塩基配列の第351番目から下流の
約533bpのDNA断片を単離し、得られたこの断片に更に制
限酵素BstN Iを作用させ、第５表の第351〜808番目まで
に相当するDNA断片を単離した。
ロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするクローン化
cDNAが組み込まれた組み換え体プラスミドpHL4から、制
限酵素Pst Iによる消化にて、cDNA領域を切り出した。
このcDNAがコードするヒト インターロイキン１前駆体
ポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩基配列を第５表
に示す。このクローン化cDNAを、制限酵素Alu Iにて消
化し、第５表に示した塩基配列の第351番目から下流の
約533bpのDNA断片を単離し、得られたこの断片に更に制
限酵素BstN Iを作用させ、第５表の第351〜808番目まで
に相当するDNA断片を単離した。
このDNA断片に、常法により化学合成した次式［Ｅ］
及び［Ｆ］で示されるオリゴヌクレオチド アダプター
を、T4DNAリガーゼを用いて結合させた。
及び［Ｆ］で示されるオリゴヌクレオチド アダプター
を、T4DNAリガーゼを用いて結合させた。
及び ここで得たDNA断片は、ヒト インターロイキン１を
コードする塩基配列の両端に翻訳開始コドン（ATG）と
終止コドン（TGA）が付加された構造を有している。こ
のDNA断片を、HIL−１断片という。
コードする塩基配列の両端に翻訳開始コドン（ATG）と
終止コドン（TGA）が付加された構造を有している。こ
のDNA断片を、HIL−１断片という。
別途に、形質発現ベクターpEP302を、制限酵素Cla I
及びHind IIIにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子及び
テトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きなDNA断片を単
離した。このDNA断片に、前述のHIL−１断片をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させ、ヒト インターロイキン１ポ
リペプチド生産用形質発現プラスミドを構築した。この
形質発現プラスミドをpHIPH383と名づけた（第２図参
照）。
及びHind IIIにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子及び
テトラサイクリン耐性遺伝子を含む大きなDNA断片を単
離した。このDNA断片に、前述のHIL−１断片をT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させ、ヒト インターロイキン１ポ
リペプチド生産用形質発現プラスミドを構築した。この
形質発現プラスミドをpHIPH383と名づけた（第２図参
照）。
一方、プラスミドpCT−１［Ikeharaら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA,81巻、5956頁（1984）］を制限酵素Aat II
とCla Iで消化して、trpプロモーター領域からtrpＬのS
D配列領域にわたる約420bpのDNA断片を切り出して、単
離した。
ad.Sci.,USA,81巻、5956頁（1984）］を制限酵素Aat II
とCla Iで消化して、trpプロモーター領域からtrpＬのS
D配列領域にわたる約420bpのDNA断片を切り出して、単
離した。
このDNA断片に、前述のHIL−１断片をT4DNAリガーゼ
を用いて結合させた。得られたこのDNA断片を、プロモ
ーターHIL断片という。
を用いて結合させた。得られたこのDNA断片を、プロモ
ーターHIL断片という。
別途に、プラスミドpBR322を制限酵素Ava IとPvu II
にて消化し、得られた大きなDNA断片（約3.7kbp）を単
離した。このDNA断片の両端を、DNAポリメラーゼＩ（ク
レノー フラグメント）及びdGTP、dATP、dCTP、dTTPを
用いて平滑末端とした後、その両端をT4DNAリガーゼに
て結合させ、pBR322の複製開始点近傍のコピー数制御領
域を欠失させたプラスミドベクター（pBRS6という）を
作製した。
にて消化し、得られた大きなDNA断片（約3.7kbp）を単
離した。このDNA断片の両端を、DNAポリメラーゼＩ（ク
レノー フラグメント）及びdGTP、dATP、dCTP、dTTPを
用いて平滑末端とした後、その両端をT4DNAリガーゼに
て結合させ、pBR322の複製開始点近傍のコピー数制御領
域を欠失させたプラスミドベクター（pBRS6という）を
作製した。
このプラスミドベクターpBRS6を制限酵素Aat IIとHin
d IIIにて消化し、得られた大きなDNA断片（約3.6kbp）
を単離し、このDNA断片に前述のプロモーターHIL断片を
T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。この形質発現プラスミドをpHILT383と
名づけた。
d IIIにて消化し、得られた大きなDNA断片（約3.6kbp）
を単離し、このDNA断片に前述のプロモーターHIL断片を
T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより、ヒト
インターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラス
ミドを構築した。この形質発現プラスミドをpHILT383と
名づけた。
第１図は、形質発現プラスミドpHIPH383aの構築工程を
示す。図中の合成DNAアダプター［Ｃ］と［Ｄ］は、実
施例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプ
ターである。 第２図は、形質発現プラスミドpHIPH383の構築工程を示
す。図中の合成DNAアダプター［Ｅ］と［Ｆ］は、参考
例に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプター
である。
示す。図中の合成DNAアダプター［Ｃ］と［Ｄ］は、実
施例１に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプ
ターである。 第２図は、形質発現プラスミドpHIPH383の構築工程を示
す。図中の合成DNAアダプター［Ｅ］と［Ｆ］は、参考
例に記載した化学合成オリゴヌクレオチド アダプター
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３ （1985）Ｐ．141−153 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，14（1986）Ｐ．3167−3179
Claims (6)
- 【請求項１】下記式〔Ｉ〕で示されるアミノ酸配列から
なるヒトインターロイキン１ポリペプチド 又はその配列を部分的に変換した配列を有するポリペプ
チドをコードするDNAの塩基配列の上流に、下記式
〔Ａ〕で示される塩基配列を有するDNA。 〔式中、Ｘは（Ａ）ｘ意味し、ｘは１〜５を表す。Ｙは
（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０又は
１を表す。 ３′側のATGは翻訳開始コドンを意味する。〕 - 【請求項２】式〔Ｉ〕で示されるアミノ酸配列からなる
ヒトインターロイキン１ポリペプチドをコードする塩基
配列の上流に、下記式の塩基配列を有する特許請求の範
囲第１項記載のDNA。 ５′−AAAAGGAGGTTTAAATTATG−３′ - 【請求項３】下記式〔Ｉ〕で示されるアミノ酸配列から
なるヒトインターロイキン１ポリペプチド 又はその配列を部分的に変換した配列を有するポリペプ
チドをコードするDNAの塩基配列の上流に、下記式
〔Ａ〕で示される塩基配列を有し、さらにその上流に大
腸菌体内で転写を制御するプロモーター活性を有するDN
Aが結合したDNA。 ５′−XGGAGGTTTYATTATG−３′ 式〔Ａ〕 〔式中、Ｘは（Ａ）ｘ意味し、ｘは１〜５を表す。Ｙは
（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０又は
１を表す。 ３′側のATGは翻訳開始コドンを意味する。〕 - 【請求項４】プロモーターが、トリフトファン オペロ
ンのプロモーターである特許請求の範囲第３項記載のDN
A。 - 【請求項５】下記式〔Ｉ〕で示されるアミノ酸配列から
なるヒトインターロイキン１ポリペプチド 又はその配列を部分的に変換した配列を有するポリペプ
チドをコードするDNAの塩基配列の上流に、下記式
〔Ａ〕で示される塩基配列を有し、さらにその上流に、
大腸菌体内で転写を制御するプロモーター活性を有する
DNAが結合したDNAが大腸菌体内で自律増殖可能なプラス
ミドに組み込まれた組み換え体プラスミド。 ５′−XGGAGGTTTYATTATG−３′ 式〔Ａ〕 〔式中、Ｘは（Ａ）ｘ意味し、ｘは１〜５を表す。Ｙは
（Ａ）ｙ（Ｔ）ｚを意味し、ｙは０〜３を、ｚは０又は
１を表す。 ３′側のATGは翻訳開始コドンを意味する。〕 - 【請求項６】組み換え体プラスミドが、pHIPH383a,pHIP
H383b,pHIPH383c,pHIPH383d,pHIPH383e,pHIPH383f,pHIP
H383g又はpHIPH383hである特許請求の範囲第５項記載の
組み換え体プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292739A JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292739A JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01137977A JPH01137977A (ja) | 1989-05-30 |
| JP2616784B2 true JP2616784B2 (ja) | 1997-06-04 |
Family
ID=17785699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62292739A Expired - Lifetime JP2616784B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | ヒトインターロイキン１ポリペプチド生産用高度形質発現プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2616784B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK172424B1 (da) * | 1988-07-29 | 1998-06-08 | Otsuka Pharma Co Ltd | IL-1alfa-Derivater, farmaceutisk præparat omfattende sådanne derivater, anvendelse af IL-1alfa-derivater, DNA sekvenser kod |
-
1987
- 1987-11-19 JP JP62292739A patent/JP2616784B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（１９８５）Ｐ．１４１−１５３ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４（１９８６）Ｐ．３１６７−３１７９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01137977A (ja) | 1989-05-30 |
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