JP2620479B2 - 豚成長ホルモンのポリペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
豚成長ホルモンのポリペプチドおよびその製造方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、豚成長ホルモンおよび
豚成長ホルモン様ポリペプチドを生産するためのＤＮＡ
配列、組換ＤＮＡ分子およびその生産方法に関するもの
である。さらに詳細には、本発明は適当な宿主において
発現されるＤＮＡ配列およびその発現により生成される
生産物に関するものである。本発明のＤＮＡ配列および
組換ＤＮＡ分子は、豚成長ホルモンの成長促進性生物学
的活性を有するポリペプチドを暗号化することを特徴と
する。以下の記載から判るように、本発明のＤＮＡ配
列、組換ＤＮＡ分子および方法は、豚における一般的同
化作用剤として有用なポリペプチドの生産において、特
にこれら動物の成長速度、体重増加および肉生産を増大
させるために使用することができる。
豚成長ホルモン様ポリペプチドを生産するためのＤＮＡ
配列、組換ＤＮＡ分子およびその生産方法に関するもの
である。さらに詳細には、本発明は適当な宿主において
発現されるＤＮＡ配列およびその発現により生成される
生産物に関するものである。本発明のＤＮＡ配列および
組換ＤＮＡ分子は、豚成長ホルモンの成長促進性生物学
的活性を有するポリペプチドを暗号化することを特徴と
する。以下の記載から判るように、本発明のＤＮＡ配
列、組換ＤＮＡ分子および方法は、豚における一般的同
化作用剤として有用なポリペプチドの生産において、特
にこれら動物の成長速度、体重増加および肉生産を増大
させるために使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】豚成長ホルモン（「ＳＧＨ」）は、脳下
垂体の前葉で合成され、そこから分泌されるポリペプチ
ドホルモンである。ＳＧＨは、先駆蛋白質（豚前成長ホ
ルモン）として合成されかつホルモンが血流中へ分泌さ
れかつ放出される際に豚成長ホルモンまで成熟すると信
じられる。豚成長ホルモンの部分的アミノ酸配列は既に
報告されている［ジェー・ビー・ミルス等、「豚成長ホ
ルモンの臭化シアノーゲン開裂および部分的アミノ酸配
列」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２４５巻、第３４０７−１５頁（１９７０）；エー・イ
ー・ウイルヘルムおよびジェー・ビー・ミルス、「豚成
長ホルモンの主構造に関する研究」、グロース・アンド
・グロースホルモン、エー・ペシルおよびイー・イー・
ミュラー編、アムステルダム、エクセルプダメジカ・フ
ァンデーション（１９７２）、第３８−４１頁、インタ
ーナショナル・コングレス・シリーズ 第２４４号］。
垂体の前葉で合成され、そこから分泌されるポリペプチ
ドホルモンである。ＳＧＨは、先駆蛋白質（豚前成長ホ
ルモン）として合成されかつホルモンが血流中へ分泌さ
れかつ放出される際に豚成長ホルモンまで成熟すると信
じられる。豚成長ホルモンの部分的アミノ酸配列は既に
報告されている［ジェー・ビー・ミルス等、「豚成長ホ
ルモンの臭化シアノーゲン開裂および部分的アミノ酸配
列」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２４５巻、第３４０７−１５頁（１９７０）；エー・イ
ー・ウイルヘルムおよびジェー・ビー・ミルス、「豚成
長ホルモンの主構造に関する研究」、グロース・アンド
・グロースホルモン、エー・ペシルおよびイー・イー・
ミュラー編、アムステルダム、エクセルプダメジカ・フ
ァンデーション（１９７２）、第３８−４１頁、インタ
ーナショナル・コングレス・シリーズ 第２４４号］。
【０００３】成長ホルモンは、一般に生命サイクル全体
にわたって生産されるが、明らかに成体前の期間におい
て多量に生産される。これらホルモンは骨格の成長、窒
素保持、蛋白質合成を促進し、さらにグルコースおよび
脂質の代謝に影響を与えることが知られている。したが
って、成長ホルモンは一般的な同化作用剤として認識さ
れている。
にわたって生産されるが、明らかに成体前の期間におい
て多量に生産される。これらホルモンは骨格の成長、窒
素保持、蛋白質合成を促進し、さらにグルコースおよび
脂質の代謝に影響を与えることが知られている。したが
って、成長ホルモンは一般的な同化作用剤として認識さ
れている。
【０００４】成長ホルモンは、若干特異的な種類のもの
である。しかしながら、或る種の動物からの成長ホルモ
ンは、他の種類の動物において発生規模に関し生物学的
に活性が低いことがある。成長ホルモン活性のメカニズ
ムは充分には理解されていないが、成長ホルモンの投与
は動物の成長速度、体重増加および肉生産を著しく増大
させることが示されている。たとえば、或る試験におい
て、精製豚成長ホルモンを毎日注射した豚における体重
増加の平均速度は１日当たり２．２６ポンドであった
（これは比較豚における２．１９ポンド／日の平均体重
増加に対比される）。より重要なことに、処理された豚
は比較豚よりも１日当りの餌消費量が著しく少ない
（８．４０ポンドに比較して７．０３ポンド）。さら
に、処理した豚は死体品質における著しい改善を示し
た。成長ホルモンで処理した豚の死体は平均して３０．
５７インチの長さを示し、かつ背脂肪の厚さは１．４０
インチを有したのに対し、比較豚のそれは平均して２
９．３３インチの長さおよび１．７７インチの背脂肪を
有した。可食肉の化学組成も成長ホルモン処理した動物
において著しく改善され、すなわち蛋白質１３．５０
％、水分４９．１３％および脂肪３６．７６％であるの
に対し、比較群においては蛋白質１０．８％、水分３
９．４３％および脂肪４９．２７％であった［イー・ジ
ェー・ターマン、「豚に対する脳下垂体前葉成長ホルモ
ンの効果」、論文；プルジュ大学（１９５３年４
月）］。残念ながら、豚成長ホルモンを使用する豚にお
ける前記の改善された成長および肉生産は、ＳＧＨの入
手が不充分であるため広く実現化することができない。
今日、ＳＧＨは豚の脳下垂体腺から抽出される。要する
に、この原料は、ＳＧＨの必要とされる産業的量を与え
るには殆ど不充分である。
である。しかしながら、或る種の動物からの成長ホルモ
ンは、他の種類の動物において発生規模に関し生物学的
に活性が低いことがある。成長ホルモン活性のメカニズ
ムは充分には理解されていないが、成長ホルモンの投与
は動物の成長速度、体重増加および肉生産を著しく増大
させることが示されている。たとえば、或る試験におい
て、精製豚成長ホルモンを毎日注射した豚における体重
増加の平均速度は１日当たり２．２６ポンドであった
（これは比較豚における２．１９ポンド／日の平均体重
増加に対比される）。より重要なことに、処理された豚
は比較豚よりも１日当りの餌消費量が著しく少ない
（８．４０ポンドに比較して７．０３ポンド）。さら
に、処理した豚は死体品質における著しい改善を示し
た。成長ホルモンで処理した豚の死体は平均して３０．
５７インチの長さを示し、かつ背脂肪の厚さは１．４０
インチを有したのに対し、比較豚のそれは平均して２
９．３３インチの長さおよび１．７７インチの背脂肪を
有した。可食肉の化学組成も成長ホルモン処理した動物
において著しく改善され、すなわち蛋白質１３．５０
％、水分４９．１３％および脂肪３６．７６％であるの
に対し、比較群においては蛋白質１０．８％、水分３
９．４３％および脂肪４９．２７％であった［イー・ジ
ェー・ターマン、「豚に対する脳下垂体前葉成長ホルモ
ンの効果」、論文；プルジュ大学（１９５３年４
月）］。残念ながら、豚成長ホルモンを使用する豚にお
ける前記の改善された成長および肉生産は、ＳＧＨの入
手が不充分であるため広く実現化することができない。
今日、ＳＧＨは豚の脳下垂体腺から抽出される。要する
に、この原料は、ＳＧＨの必要とされる産業的量を与え
るには殆ど不充分である。
【０００５】分子生物学における最近の進歩は、特異的
な非細菌性蛋白質を暗号化するＤＮＡを細菌細胞中へ導
入することを可能にした。一般に、化学合成で製造され
るもの以外のＤＮＡを用いるこの種の組換ＤＮＡ分子の
作成は、所望蛋白質を暗号化するメッセンジャＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成
させ、このｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換し、この二重
鎖ｃＤＮＡを適当なクローン化ベヒクルにおける適当な
部位に結合させて組換ＤＮＡ分子を生成させ、かつこの
組換ＤＮＡ分子により適当な宿主を形質転換させる工程
からなっている。かくして、形質転換宿主の培養は、こ
の宿主がＤＮＡ配列を発現しかつ所望蛋白質を生産する
ことを可能にする。
な非細菌性蛋白質を暗号化するＤＮＡを細菌細胞中へ導
入することを可能にした。一般に、化学合成で製造され
るもの以外のＤＮＡを用いるこの種の組換ＤＮＡ分子の
作成は、所望蛋白質を暗号化するメッセンジャＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成
させ、このｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換し、この二重
鎖ｃＤＮＡを適当なクローン化ベヒクルにおける適当な
部位に結合させて組換ＤＮＡ分子を生成させ、かつこの
組換ＤＮＡ分子により適当な宿主を形質転換させる工程
からなっている。かくして、形質転換宿主の培養は、こ
の宿主がＤＮＡ配列を発現しかつ所望蛋白質を生産する
ことを可能にする。
【０００６】組換ＤＮＡ技術を用いる幾つかの非細菌性
蛋白質の生産が報告されている。これらには、牛前成長
ホルモン［たとえば、ダブリュー・エル・ミラー等、
「牛成長ホルモンｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡの分
子クローン化」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー、第２５５巻、第７５２１−２４頁（１９８
０）、ヨーロッパ特許出願第４７６００号および英国特
許出願第２０７３２４５Ａ号］およびひと前成長ホルモ
ン［たとえば、ジェー・エー・マーシャル等、「ひと成
長ホルモン：細菌における補完的ＤＮＡクローン化およ
び発現」、サイエンス誌、第２０５巻、第６０２−０６
頁（１９７９）およびヨーロッパ特許出願第２０１４７
号］が包含される。
蛋白質の生産が報告されている。これらには、牛前成長
ホルモン［たとえば、ダブリュー・エル・ミラー等、
「牛成長ホルモンｍＲＮＡに対して相補的なＤＮＡの分
子クローン化」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー、第２５５巻、第７５２１−２４頁（１９８
０）、ヨーロッパ特許出願第４７６００号および英国特
許出願第２０７３２４５Ａ号］およびひと前成長ホルモ
ン［たとえば、ジェー・エー・マーシャル等、「ひと成
長ホルモン：細菌における補完的ＤＮＡクローン化およ
び発現」、サイエンス誌、第２０５巻、第６０２−０６
頁（１９７９）およびヨーロッパ特許出願第２０１４７
号］が包含される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
組換ＤＮＡはいずれも本発明におけるような豚成長ホル
モンのポリペプチドもしくは豚成長ホルモン様ポリペプ
チド或いはこれら豚成長ホルモンもしくは豚成長ホルモ
ン様ポリペプチドが産業的量で入手し得れば達成される
ような肉生産における著しい改善に関するものでない。
組換ＤＮＡはいずれも本発明におけるような豚成長ホル
モンのポリペプチドもしくは豚成長ホルモン様ポリペプ
チド或いはこれら豚成長ホルモンもしくは豚成長ホルモ
ン様ポリペプチドが産業的量で入手し得れば達成される
ような肉生産における著しい改善に関するものでない。
【０００８】本発明は、ＳＧＨまたはＳＧＨ様ポリペプ
チドを暗号化するＤＮＡ配列を単離しかつこれら配列を
適当な宿主中で発現されてＳＧＨの成長促進性生物学的
活性を示すポリペプチドを生産させることにより上記の
問題を解決する。
チドを暗号化するＤＮＡ配列を単離しかつこれら配列を
適当な宿主中で発現されてＳＧＨの成長促進性生物学的
活性を示すポリペプチドを生産させることにより上記の
問題を解決する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、豚の成
長速度および肉生産を増大させる種々の用途に使用する
ため、ＳＧＨの活性を示すポリペプチドを産業的量で得
ることが初めて可能になった。
長速度および肉生産を増大させる種々の用途に使用する
ため、ＳＧＨの活性を示すポリペプチドを産業的量で得
ることが初めて可能になった。
【００１０】以下の記載から判るように、本発明のＤＮ
Ａ配列および組換ＤＮＡ分子は、適当な宿主における豚
成長ホルモンまたは豚成長様ポリペプチド、すなわちＳ
ＧＨの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチドの生
産を可能にする。本発明のポリペプチドは、宿主中で生
産されたままの形態において、或いは組成および豚にお
ける成長速度および肉生産の改善方法を改変した後に使
用することができる。
Ａ配列および組換ＤＮＡ分子は、適当な宿主における豚
成長ホルモンまたは豚成長様ポリペプチド、すなわちＳ
ＧＨの成長促進性生物学的活性を示すポリペプチドの生
産を可能にする。本発明のポリペプチドは、宿主中で生
産されたままの形態において、或いは組成および豚にお
ける成長速度および肉生産の改善方法を改変した後に使
用することができる。
【００１１】したがって、上記から判るように、本発明
の基本的面は、ＳＧＨの成長促進性生物学的活性を示す
ポリペプチドを暗号化することを特徴とするＤＮＡ配列
の製造である。この種のＤＮＡ配列はｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＳＧＨ−９Ｄ、ｐＳＧＨ−△７、ｐＳＧＨ−
（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）のＤＮＡ挿入物、これら挿入物にヒ
ブリド化しかつＳＧＨ様ポリペプチドを暗号化するＤＮ
Ａ配列ならびに前記ＤＮＡ配列もしくは挿入物のいずれ
かにより発現の際に暗号化されたポリペプチドを発現に
際し暗号化するＤＮＡ配列よりなる群から選択される。
の基本的面は、ＳＧＨの成長促進性生物学的活性を示す
ポリペプチドを暗号化することを特徴とするＤＮＡ配列
の製造である。この種のＤＮＡ配列はｐＢＲ３２２（Ｐ
ｓｔ）／ＳＧＨ−９Ｄ、ｐＳＧＨ−△７、ｐＳＧＨ−
（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）のＤＮＡ挿入物、これら挿入物にヒ
ブリド化しかつＳＧＨ様ポリペプチドを暗号化するＤＮ
Ａ配列ならびに前記ＤＮＡ配列もしくは挿入物のいずれ
かにより発現の際に暗号化されたポリペプチドを発現に
際し暗号化するＤＮＡ配列よりなる群から選択される。
【００１２】
【実施例】本発明を一層よく理解するよう、以下詳細に
説明する。以下の説明において、次の用語を使用する。
説明する。以下の説明において、次の用語を使用する。
【００１３】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡ
のモノマー単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１′炭素）を介して糖成分に結合される。塩基と糖
との組合せをヌクレオチドと呼ぶ。各ヌクレオチドはそ
の塩基により特性化される。４種のＤＮＡ塩基はアデニ
ン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン
（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮ
Ａ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）であ
る。
酸と含窒素複素環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡ
のモノマー単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントー
スの１′炭素）を介して糖成分に結合される。塩基と糖
との組合せをヌクレオチドと呼ぶ。各ヌクレオチドはそ
の塩基により特性化される。４種のＤＮＡ塩基はアデニ
ン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン
（「Ｃ」）およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮ
Ａ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）であ
る。
【００１４】ＤＮＡ配列：隣接ペントースと３′炭素と
５′炭素との間でホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。
５′炭素との間でホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。
【００１５】コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸、翻訳
開始信号または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレ
オチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴ
Ｃ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）を暗号化し、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止信号であり、またＡＴＧは翻訳開始信号である。
開始信号または翻訳停止信号を暗号化する３個のヌクレ
オチド（トリプレット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌク
レオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴ
Ｃ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（「Ｌｅ
ｕ」）を暗号化し、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳
停止信号であり、またＡＴＧは翻訳開始信号である。
【００１６】読枠：ｍＲＮＡをアミノ酸配列まで翻訳す
る際のコドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維
持しなければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴ
ＧＴＡＡＧは３つの読枠もしくは相で翻訳することがで
きる。これら相のそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を
与える：ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −− Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −− Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −− Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−（停止）
る際のコドンのグループ化。翻訳の際、適正な読枠を維
持しなければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴ
ＧＴＡＡＧは３つの読枠もしくは相で翻訳することがで
きる。これら相のそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を
与える：ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ −− Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −− Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −− Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−（停止）
【００１７】ポリペプチド：隣接アミノ酸のα−アミノ
基とカルボキシ基との間でペプチド結合により互いに接
続されたアミノ酸の線状列。
基とカルボキシ基との間でペプチド結合により互いに接
続されたアミノ酸の線状列。
【００１８】ゲノム：細胞またはウイルスの全ＤＮＡ。
これは特に物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、な
らびにオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合か
つ相互作用配列を包含し、たとえばシャイン−ダルガル
ノ配列のような配列をも含む。
これは特に物質のポリペプチドを暗号化する遺伝子、な
らびにオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合か
つ相互作用配列を包含し、たとえばシャイン−ダルガル
ノ配列のような配列をも含む。
【００１９】遺伝子：雛型またはメッセンジャーＲＮＡ
（「ｍＲＮＡ」）を介して特定のポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
（「ｍＲＮＡ」）を介して特定のポリペプチドに特性的
なアミノ酸の配列を暗号化するＤＮＡ配列。
【００２０】転写：遺伝子からｍＲＮＡを生産する過
程。
程。
【００２１】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生産す
る過程。
る過程。
【００２２】発現：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子によりポ
リペプチドを生産するために受ける過程。これは転写と
翻訳との組合せである。
リペプチドを生産するために受ける過程。これは転写と
翻訳との組合せである。
【００２３】プラスミド：プラスミドが宿主細胞で複製
されるような完全「レプリコン」からなる非染色体二重
鎖ＤＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物内に挿入する
と、この生物の特性はプラスミドのＤＮＡの結果として
変化し、或いは形質転換することができる。たとえば、
テトラサイクリン耐性（ＴｅｔR ）に対する遺伝子を有
するプラスミドは、予めテトラサイクリンに対し感受性
の細胞をテトラサイクリンに対し耐性の細胞まで形質転
換することができる。プラスミドにより形質転換された
細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
されるような完全「レプリコン」からなる非染色体二重
鎖ＤＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物内に挿入する
と、この生物の特性はプラスミドのＤＮＡの結果として
変化し、或いは形質転換することができる。たとえば、
テトラサイクリン耐性（ＴｅｔR ）に対する遺伝子を有
するプラスミドは、予めテトラサイクリンに対し感受性
の細胞をテトラサイクリンに対し耐性の細胞まで形質転
換することができる。プラスミドにより形質転換された
細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
【００２４】ファージまたはバクテリオファージ：細菌
性ウイルスであって、その多くは蛋白質エンベロプまた
はコート（「カプシド」）にカプセル化されたＤＮＡ配
列よりなっている。
性ウイルスであって、その多くは蛋白質エンベロプまた
はコート（「カプシド」）にカプセル化されたＤＮＡ配
列よりなっている。
【００２５】クローン化ベヒクル：宿主細胞において複
製しうるプラスミド、ファージＤＮＡまたはその他のＤ
ＮＡ配列であって、これはＤＮＡの本質的生物学機能、
たとえば複製、コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、
或いはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決
定可能に前記ＤＮＡ配列を切断することができ、かつ形
質転換の同定に使用するのに適する標識、たとえばテト
ラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個
もしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とす
る。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。
製しうるプラスミド、ファージＤＮＡまたはその他のＤ
ＮＡ配列であって、これはＤＮＡの本質的生物学機能、
たとえば複製、コート蛋白質の生成の喪失を伴わずに、
或いはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決
定可能に前記ＤＮＡ配列を切断することができ、かつ形
質転換の同定に使用するのに適する標識、たとえばテト
ラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を有する１個
もしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とす
る。クローン化ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。
【００２６】クローン化：前記１種の生物もしくは配列
から誘導される生物またはＤＮＡ配列の集落を無性繁殖
によって得る過程。
から誘導される生物またはＤＮＡ配列の集落を無性繁殖
によって得る過程。
【００２７】組換ＤＮＡ分子またはヒブリドＤＮＡ：生
細胞の外部で端部結合されておりかつ或る種の宿主細胞
に感染してそこに維持される能力を有する異なるゲノム
からのＤＮＡ断片よりなる分子。
細胞の外部で端部結合されておりかつ或る種の宿主細胞
に感染してそこに維持される能力を有する異なるゲノム
からのＤＮＡ断片よりなる分子。
【００２８】発現制御配列：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子
の発現を、これら配列に作用結合された際、制御かつ調
整するヌクレオチドの配列。これらはファージλのｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、主オペレータおよびプロモータ領域、
ｆｄコート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは
成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現を制御す
ることが知られたその他の配列またはそれらの組合せを
包含する。
の発現を、これら配列に作用結合された際、制御かつ調
整するヌクレオチドの配列。これらはファージλのｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、主オペレータおよびプロモータ領域、
ｆｄコート蛋白質の制御領域、ならびに原始核もしくは
成熟核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現を制御す
ることが知られたその他の配列またはそれらの組合せを
包含する。
【００２９】ＳＧＨ：豚成長ホルモン。
【００３０】ＳＧＨ様ポリペプチド：ＳＧＨの成長促進
性生物学的活性を示すポリペプチド。
性生物学的活性を示すポリペプチド。
【００３１】図１は、組換ＤＮＡ分子の混合物を製造す
るための方法の一具体例の略図であり、これら組換ＤＮ
Ａ分子の幾つかはＳＧＨまたはＳＧＨ様ポリペプチドを
暗号化する挿入ＤＮＡ配列を特徴とする。
るための方法の一具体例の略図であり、これら組換ＤＮ
Ａ分子の幾つかはＳＧＨまたはＳＧＨ様ポリペプチドを
暗号化する挿入ＤＮＡ配列を特徴とする。
【００３２】ポリＡ+ ＲＮＡ含有の豚成長ホルモンｍＲ
ＮＡ（ＳＧＨ−ｍＲＮＡ）の製造 ドライアイス中で凍結させた４〜６ｇの豚脳下垂体前葉
腺（ペルフリーズ社、アーカンサス州）を、５Ｍのチオ
シアン酸グアニジウムと５０ｍＭのクエン酸ナトリウム
と、０．５％のナトリウムラウリルサルコシルと０．１
Ｍのβ−メルカプトエタノールとからなる溶液へ加えた
（１０ｍｌ／ｇ脳下垂体腺）［ジェー・エム・チャーグ
ウイン等、バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４
−９９頁（１９７９）］。次いで、これらの脳下垂体腺
をその溶液中で４℃まで解凍させ、かつこの混合物を２
０秒間６回破裂させてホモジナイズした（ポリトロ
ン）。このホモジナイズ物を遠心分離した後（ソルバー
ル型遠心分離器、６０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）、
７．０ｍｌの核酸含有上澄液を２．５ｍｌのＣｓＣｌ
（０．１ＭのＥＤＴＡ中０．５Ｍ）の上に層状化させ、
これをパラフィン油で覆った。次いで、この試験管を遠
心分離して（ＳＷ４１型、３００００ｒｐｍ、１８時
間、２０℃）ＲＮＡ含有フラクションをペレット化させ
た。
ＮＡ（ＳＧＨ−ｍＲＮＡ）の製造 ドライアイス中で凍結させた４〜６ｇの豚脳下垂体前葉
腺（ペルフリーズ社、アーカンサス州）を、５Ｍのチオ
シアン酸グアニジウムと５０ｍＭのクエン酸ナトリウム
と、０．５％のナトリウムラウリルサルコシルと０．１
Ｍのβ−メルカプトエタノールとからなる溶液へ加えた
（１０ｍｌ／ｇ脳下垂体腺）［ジェー・エム・チャーグ
ウイン等、バイオケミストリー、第１８巻、第５２９４
−９９頁（１９７９）］。次いで、これらの脳下垂体腺
をその溶液中で４℃まで解凍させ、かつこの混合物を２
０秒間６回破裂させてホモジナイズした（ポリトロ
ン）。このホモジナイズ物を遠心分離した後（ソルバー
ル型遠心分離器、６０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）、
７．０ｍｌの核酸含有上澄液を２．５ｍｌのＣｓＣｌ
（０．１ＭのＥＤＴＡ中０．５Ｍ）の上に層状化させ、
これをパラフィン油で覆った。次いで、この試験管を遠
心分離して（ＳＷ４１型、３００００ｒｐｍ、１８時
間、２０℃）ＲＮＡ含有フラクションをペレット化させ
た。
【００３３】上澄液を捨てかつＲＮＡ含有ペレットを全
部水中へ再懸濁させた後、水溶液を同容量のフェノール
−クロロホルム（１：１）で２回および同容量のエーテ
ルで２回それぞれ抽出した。次いで、ＲＮＡを３倍容量
のエタノールで水相から沈澱させ、生じた沈澱物を遠心
分離により回収した。全ＲＮＡの収量：８ｍｇ
部水中へ再懸濁させた後、水溶液を同容量のフェノール
−クロロホルム（１：１）で２回および同容量のエーテ
ルで２回それぞれ抽出した。次いで、ＲＮＡを３倍容量
のエタノールで水相から沈澱させ、生じた沈澱物を遠心
分離により回収した。全ＲＮＡの収量：８ｍｇ
【００３４】上記の全ＲＮＡ４ｍｇを１ｍｌのトリス−
ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）
（「ＴＥ緩衝液」）に再懸濁し、そしてこの溶液を６５
℃にて１０分間加熱した。２ＭのＫＣｌを０．５Ｍの最
終濃度まで加えた後、この混合物をオリゴ−ｄＴ−セル
ロースカラムに加え、そしてこのカラムを０．５ＭのＫ
Ｃｌで洗浄してリボソームＲＮＡの全部を除去した。最
後に、カラムに結合したポリＡ+ ＲＮＡを１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて室温で溶出させ、この
ポリＡ+ ＲＮＡ含有フラクションを貯蔵した。上記のよ
うに結合したフラクションからＲＮＡを、エタノールお
よび塩での沈澱、遠心分離および水中への再懸濁によっ
て回収した。ポリＡ+ ＲＮＡの収量：２００μｇ。
ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）
（「ＴＥ緩衝液」）に再懸濁し、そしてこの溶液を６５
℃にて１０分間加熱した。２ＭのＫＣｌを０．５Ｍの最
終濃度まで加えた後、この混合物をオリゴ−ｄＴ−セル
ロースカラムに加え、そしてこのカラムを０．５ＭのＫ
Ｃｌで洗浄してリボソームＲＮＡの全部を除去した。最
後に、カラムに結合したポリＡ+ ＲＮＡを１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて室温で溶出させ、この
ポリＡ+ ＲＮＡ含有フラクションを貯蔵した。上記のよ
うに結合したフラクションからＲＮＡを、エタノールお
よび塩での沈澱、遠心分離および水中への再懸濁によっ
て回収した。ポリＡ+ ＲＮＡの収量：２００μｇ。
【００３５】単離したポリＡ+ ＲＮＡの活性を検査する
ため、２μｇのこのポリＡ+ ＲＮＡをうさぎ網様細胞溶
解物Ｓ35−メチオニン無細胞系（ＮＥＮ）を用いて試験
管中で翻訳し［エッチ・アール・ビー・ペルハムおよび
アール・ジェー・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ル・バイオケミストリー、第６７巻、第２４７頁以降
（１９７６）］、そしてこの生成物をオートラジオグラ
フィーによりＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。この分析は、単離したポリＡ+ ＲＮＡが翻訳されて
豚前成長ホルモンにつき予想される寸法（約２４，００
０）に相当する分子量を有するポリペプチドを生産する
ことを示した。
ため、２μｇのこのポリＡ+ ＲＮＡをうさぎ網様細胞溶
解物Ｓ35−メチオニン無細胞系（ＮＥＮ）を用いて試験
管中で翻訳し［エッチ・アール・ビー・ペルハムおよび
アール・ジェー・ジャクソン、ヨーロピアン・ジャーナ
ル・バイオケミストリー、第６７巻、第２４７頁以降
（１９７６）］、そしてこの生成物をオートラジオグラ
フィーによりＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで分析し
た。この分析は、単離したポリＡ+ ＲＮＡが翻訳されて
豚前成長ホルモンにつき予想される寸法（約２４，００
０）に相当する分子量を有するポリペプチドを生産する
ことを示した。
【００３６】勿論、ポリＡ+ ＲＮＡは多数の異なるＲＮ
Ａの混合物であることを理解すべきである（図１）。Ｓ
ＧＨまたはＳＧＨ様ポリペプチドに対し特異的なｍＲＮ
Ａを除いて、これらＲＮＡは望ましくない不純物である
（図１）。残念ながら、これら不純ＲＮＡはクローン化
工程の残部においてＳＧＨ−ｍＲＮＡと同様に挙動す
る。したがって、ポリＡ+ ＲＮＡにおけるその存在は多
数の無用のクローンを生ずると共に、正確なクローン、
すなわちＳＧＨを暗号化するクローンを極めて多数の不
純物から選択するという複雑な選別問題を提起する。
Ａの混合物であることを理解すべきである（図１）。Ｓ
ＧＨまたはＳＧＨ様ポリペプチドに対し特異的なｍＲＮ
Ａを除いて、これらＲＮＡは望ましくない不純物である
（図１）。残念ながら、これら不純ＲＮＡはクローン化
工程の残部においてＳＧＨ−ｍＲＮＡと同様に挙動す
る。したがって、ポリＡ+ ＲＮＡにおけるその存在は多
数の無用のクローンを生ずると共に、正確なクローン、
すなわちＳＧＨを暗号化するクローンを極めて多数の不
純物から選択するという複雑な選別問題を提起する。
【００３７】ＳＧＨ−ｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡ混合物の合成 ポリＡ+ ＲＮＡに補完的な単一鎖ＤＮＡを調製するた
め、２０μｌのポリＡ+ＲＮＡ（１０μｇ、水中）と２
μｌの０．１５Ｍ ＣＨ3 Ｈｇとを混合し、得られた溶
液を室温にて１５分間静置した。次いで、この溶液へ１
０μｌのオリゴｄＴ（１μｇ／ｍｌ）と１００μｌのｄ
ＮＴＰ（２．５ｍＭ、すなわち最終濃度０．５ｍＭま
で）と２０μｌのα−Ｐ32−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍ
ｌ）５０μｌの逆転写酵素（１６単位／ｍｌ、ライフ・
サイエンス社）と同容量の緩衝液（１００ｍＭ トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４
０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ水中）とを加えた。溶
液の全容量は４０４．４μｌであった。この溶液を４２
℃にて９０分間培養した後、これを１００℃にて数分間
加熱し、そしてこれを遠心分離した（１００００Ｇ、５
ｍｉｎ．）。上澄液はポリＡ+ ＲＮＡに補完的な単一鎖
ｃＤＮＡを含有した。ｃＤＮＡの収量：１４３８μｇ
（少量のＴＣＡ沈澱による）。
め、２０μｌのポリＡ+ＲＮＡ（１０μｇ、水中）と２
μｌの０．１５Ｍ ＣＨ3 Ｈｇとを混合し、得られた溶
液を室温にて１５分間静置した。次いで、この溶液へ１
０μｌのオリゴｄＴ（１μｇ／ｍｌ）と１００μｌのｄ
ＮＴＰ（２．５ｍＭ、すなわち最終濃度０．５ｍＭま
で）と２０μｌのα−Ｐ32−ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍ
ｌ）５０μｌの逆転写酵素（１６単位／ｍｌ、ライフ・
サイエンス社）と同容量の緩衝液（１００ｍＭ トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４
０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ水中）とを加えた。溶
液の全容量は４０４．４μｌであった。この溶液を４２
℃にて９０分間培養した後、これを１００℃にて数分間
加熱し、そしてこれを遠心分離した（１００００Ｇ、５
ｍｉｎ．）。上澄液はポリＡ+ ＲＮＡに補完的な単一鎖
ｃＤＮＡを含有した。ｃＤＮＡの収量：１４３８μｇ
（少量のＴＣＡ沈澱による）。
【００３８】ここでも、単一鎖ｃＤＮＡは実際上ポリＡ
+ ＲＮＡ混合物中に存在する対応のｍＲＮＡから転写さ
れた多数の異なるｃＤＮＡの複雑な混合物であることを
理解すべきである（図１）。他の因子も作用して、この
ｃＤＮＡ混合物を複雑化する。ポリＡ+ ＲＮＡの各ｍＲ
ＮＡ種は完全には転写することができない。寧ろ、各ｍ
ＲＮＡ種から多くの種類のｃＤＮＡが生成され得る（図
１に図示せず）。これら不完全ｃＤＮＡのそれぞれは、
工程の残部において所望のｃＤＮＡと同様に挙動するの
で、ｃＤＮＡ混合物におけるその存在はさらに最終的ク
ローン選別工程を複雑化するだけである。
+ ＲＮＡ混合物中に存在する対応のｍＲＮＡから転写さ
れた多数の異なるｃＤＮＡの複雑な混合物であることを
理解すべきである（図１）。他の因子も作用して、この
ｃＤＮＡ混合物を複雑化する。ポリＡ+ ＲＮＡの各ｍＲ
ＮＡ種は完全には転写することができない。寧ろ、各ｍ
ＲＮＡ種から多くの種類のｃＤＮＡが生成され得る（図
１に図示せず）。これら不完全ｃＤＮＡのそれぞれは、
工程の残部において所望のｃＤＮＡと同様に挙動するの
で、ｃＤＮＡ混合物におけるその存在はさらに最終的ク
ローン選別工程を複雑化するだけである。
【００３９】二重鎖ｃＤＮＡの製造 上記で調製したｃＤＮＡを二重鎖ｃＤＮＡまで変換する
ため、前記ｃＤＮＡの１／２（０．７μｇ）を採取し、
そして５０μｌのクレノー（０．７単位／μｌ）と１．
５μｇのＭｇＣｌ2 （１Ｍ）と同容量のＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（４００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．
９）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）とを加え、そして混合
物を１６℃にて１７時間培養し、次いでさらに３７℃に
て３０分間培養した。次いで、１／８容量の２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５）と２．５容量のエタノールとを
加えかつ−７０℃まで１５分間冷却することによりＤＮ
Ａを沈澱させた。遠心分離（１００００Ｇ、１０ｍｉ
ｎ．）により沈澱物を回収した後、このペレットをエタ
ノールで洗浄し、これを水中に再懸濁させそしてこれを
セフアデックスＧ−７５カラムに加えた。ＤＮＡを１０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡによって
溶出させ、そしてＤＮＡ含有フラクションを貯蔵した。
ＤＮＡ含有フラクションの全容量は３７７μｌであっ
た。
ため、前記ｃＤＮＡの１／２（０．７μｇ）を採取し、
そして５０μｌのクレノー（０．７単位／μｌ）と１．
５μｇのＭｇＣｌ2 （１Ｍ）と同容量のＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液（４００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．
９）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）とを加え、そして混合
物を１６℃にて１７時間培養し、次いでさらに３７℃に
て３０分間培養した。次いで、１／８容量の２Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５）と２．５容量のエタノールとを
加えかつ−７０℃まで１５分間冷却することによりＤＮ
Ａを沈澱させた。遠心分離（１００００Ｇ、１０ｍｉ
ｎ．）により沈澱物を回収した後、このペレットをエタ
ノールで洗浄し、これを水中に再懸濁させそしてこれを
セフアデックスＧ−７５カラムに加えた。ＤＮＡを１０
ｍＭ トリス−ＨＣｌ−０．１ｍＭ ＥＤＴＡによって
溶出させ、そしてＤＮＡ含有フラクションを貯蔵した。
ＤＮＡ含有フラクションの全容量は３７７μｌであっ
た。
【００４０】貯蔵したＤＮＡ含有フラクションへ２Ｍ
ＮａＣｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
５）、１０ｍＭ 硫酸亜塩および８μｌＳＩ（１０００
単位／μｌ、ベーリンガーマンハイム社）よりなる溶液
４２μｌを加え、そしてこの溶液を３０℃にて３０分間
静置した。次いで、混合物を同容量のフェノールおよび
次いでエタノールで３回抽出し、得られた水相をセフア
テックス（登録商標）Ｇ−７５カラムに加え、ＤＮＡを
５ｍＭのＫＣｌで溶出させた。ＤＮＡ含有フラクション
を貯蔵し、そしてこれを前記と同様にエタノールで沈澱
させた。
ＮａＣｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
５）、１０ｍＭ 硫酸亜塩および８μｌＳＩ（１０００
単位／μｌ、ベーリンガーマンハイム社）よりなる溶液
４２μｌを加え、そしてこの溶液を３０℃にて３０分間
静置した。次いで、混合物を同容量のフェノールおよび
次いでエタノールで３回抽出し、得られた水相をセフア
テックス（登録商標）Ｇ−７５カラムに加え、ＤＮＡを
５ｍＭのＫＣｌで溶出させた。ＤＮＡ含有フラクション
を貯蔵し、そしてこれを前記と同様にエタノールで沈澱
させた。
【００４１】二重鎖ＤＮＡのクローン比 多種類の宿主／クローン化ベヒクル組合物を、二重鎖ｃ
ＤＮＡのクローン比および発現に使用することができ
る。さらに、それぞれ特定のクローン化ベヒクルにおい
て、二重鎖ｃＤＮＡを挿入するため種々の部位を選択す
ることができる。クローン化および発現の特定の選択
は、本発明の範囲を逸脱することなく当業者により容易
に行うことができる。
ＤＮＡのクローン比および発現に使用することができ
る。さらに、それぞれ特定のクローン化ベヒクルにおい
て、二重鎖ｃＤＮＡを挿入するため種々の部位を選択す
ることができる。クローン化および発現の特定の選択
は、本発明の範囲を逸脱することなく当業者により容易
に行うことができる。
【００４２】最初のクローン化において、細菌性プラス
ミドｐＢＲ３２２を選択した［エフ・ボリバール等、
「新規クローン化ベヒクルIIの作成および特定化。多目
的クローン化系」、ジーン誌、第９５−１１３頁（１９
７７）；ジェー・ジイー・サットクリフ、「ＤＮＡ配列
から誘導されたｐＢＲ３２２ 制御地図、長さ４３６１
ヌクレオチド対までの正確なＤＮＡ寸法標識」、ヌクレ
イック・アシッド・リサーチ、第５巻、第２７２１−２
８頁（１９７８）］、さらにそのＰｓｔＩ部位［エル・
ビラ−コマロフ等、「プロインシュリンを合成する細菌
クローン」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス・ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７−３１
頁（１９７８）］、およびイー・コリＫ１２ ＭＣ１０
６１［エム・カサダバンおよびエス・エヌ・コーヘン、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１３８
巻、第１７９−２０７頁（１９８０）］を選択した。
ミドｐＢＲ３２２を選択した［エフ・ボリバール等、
「新規クローン化ベヒクルIIの作成および特定化。多目
的クローン化系」、ジーン誌、第９５−１１３頁（１９
７７）；ジェー・ジイー・サットクリフ、「ＤＮＡ配列
から誘導されたｐＢＲ３２２ 制御地図、長さ４３６１
ヌクレオチド対までの正確なＤＮＡ寸法標識」、ヌクレ
イック・アシッド・リサーチ、第５巻、第２７２１−２
８頁（１９７８）］、さらにそのＰｓｔＩ部位［エル・
ビラ−コマロフ等、「プロインシュリンを合成する細菌
クローン」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス・ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７−３１
頁（１９７８）］、およびイー・コリＫ１２ ＭＣ１０
６１［エム・カサダバンおよびエス・エヌ・コーヘン、
ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第１３８
巻、第１７９−２０７頁（１９８０）］を選択した。
【００４３】 １．ＰｓｔＩ−開裂したｄＧ−末端ｐＢＲ３２２の製造 ２回の連続するＣｓＣｌ濃度勾配でプラスミドｐＢＲ３
２２を精製し、かつその２５μｇを標準条件下でＰｓｔ
Ｉエンドヌクレアーゼによって分解した（図１）。次い
で、Ｐｓｔ- Ｉ開裂したプラスミドへ５０μｌの水と３
μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）と１．５μｌのｄＧＴＰ（１
０ｍＭ）と１０μｌのゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）と１０
μｌの末端トランスフェラーゼ緩衝液［１０ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 、１．４Ｍカコジル酸カリウムおよび０．３Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］と０．９μｌの末端デオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１６０単位／
ｍｌ、ラットクリフ・バイオケミカルス社）とを加え
た。この溶液を１０℃にて１３分間培養した後、５μｌ
のＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）を加え、そして得られた混合
物を同容量のフェノール−クロロホルム（１：１）で２
回および同容量のエーテルで３回抽出した。水相をｄＣ
−末端二重鎖ｃＤＮＡと後に組合せるため保存した。
２２を精製し、かつその２５μｇを標準条件下でＰｓｔ
Ｉエンドヌクレアーゼによって分解した（図１）。次い
で、Ｐｓｔ- Ｉ開裂したプラスミドへ５０μｌの水と３
μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）と１．５μｌのｄＧＴＰ（１
０ｍＭ）と１０μｌのゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）と１０
μｌの末端トランスフェラーゼ緩衝液［１０ｍＭ Ｃｏ
Ｃｌ2 、１．４Ｍカコジル酸カリウムおよび０．３Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］と０．９μｌの末端デオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１６０単位／
ｍｌ、ラットクリフ・バイオケミカルス社）とを加え
た。この溶液を１０℃にて１３分間培養した後、５μｌ
のＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）を加え、そして得られた混合
物を同容量のフェノール−クロロホルム（１：１）で２
回および同容量のエーテルで３回抽出した。水相をｄＣ
−末端二重鎖ｃＤＮＡと後に組合せるため保存した。
【００４４】２．ｄＣ−末端化ｃＤＮＡの製造 前記のように調製したｃＤＮＡの約１／５（１００μ
ｇ）を２５μｌの水中に再懸濁し、５０μｌのＨ2 Ｏと
３μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）と１．５μｌのｄＣＴＰ
（１０ｍＭ）と１０μｌのゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）と
１０μｌの末端トランスフェラーゼ緩衝液［１０ｍＭ
ＣｏＣｌ2 、１．４Ｍカコジル酸カリウム、０．３Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］と０．９μｌの末端デオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１６０単位／
ｍｌ、ラットクリフ・バイオケミカルス社）とを加える
ことにより二重鎖ｃＤＮＡへｄＣ末端を加えた（図
１）。この混合物を１０℃にて１３分間培養した後、５
μｌのＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）を加え、そして得られた
混合物を同容量のフェノール−クロロホルム（１：１）
で２回および同容量のエ−テルで３回抽出した。ここで
も、水相をｄＧ末端化されたＰｓｔ−開裂ｐＢＲ３２２
と組合せるために保存した。
ｇ）を２５μｌの水中に再懸濁し、５０μｌのＨ2 Ｏと
３μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）と１．５μｌのｄＣＴＰ
（１０ｍＭ）と１０μｌのゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）と
１０μｌの末端トランスフェラーゼ緩衝液［１０ｍＭ
ＣｏＣｌ2 、１．４Ｍカコジル酸カリウム、０．３Ｍト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）］と０．９μｌの末端デオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（１６０単位／
ｍｌ、ラットクリフ・バイオケミカルス社）とを加える
ことにより二重鎖ｃＤＮＡへｄＣ末端を加えた（図
１）。この混合物を１０℃にて１３分間培養した後、５
μｌのＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）を加え、そして得られた
混合物を同容量のフェノール−クロロホルム（１：１）
で２回および同容量のエ−テルで３回抽出した。ここで
も、水相をｄＧ末端化されたＰｓｔ−開裂ｐＢＲ３２２
と組合せるために保存した。
【００４５】 ３．ｄＧ末端ｐＢＲ３２２とｄＣ末端ｃＤＮＡの融合 ｄＧ末端Ｐｓｔ- Ｉ開裂ｐＢＲ３２２（５０μｇ）１μ
ｌとｄＣ末端ｃＤＮＡ（１μｇ）２．５μｌとを融合用
緩衝液［１Ｍ ＮａＣｌ、２００ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］５μｌ中で混合
し、そして最終容量５０μｌまで水を加えた。混合物を
８０℃にて３分間および４５℃にて更に２時間加熱した
後、溶液の温度を４℃まで降下させ、これを１晩静置し
た。ここでも、この融合により生成された極めて僅かの
組換ＤＮＡ分子のみが、ＳＧＨに関連するｃＤＮＡ挿入
物を含有することを理解すべきである。（図１）。
ｌとｄＣ末端ｃＤＮＡ（１μｇ）２．５μｌとを融合用
緩衝液［１Ｍ ＮａＣｌ、２００ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］５μｌ中で混合
し、そして最終容量５０μｌまで水を加えた。混合物を
８０℃にて３分間および４５℃にて更に２時間加熱した
後、溶液の温度を４℃まで降下させ、これを１晩静置し
た。ここでも、この融合により生成された極めて僅かの
組換ＤＮＡ分子のみが、ＳＧＨに関連するｃＤＮＡ挿入
物を含有することを理解すべきである。（図１）。
【００４６】４．ヒブリドによるイー・コリＫ１２ Ｍ
Ｃ１０６１のトランスフェクション上記で融合させたｄ
Ｇ末端ｐＢＲ３２２とｄＣ末端ＤＮＡとをコロジオン袋
（ＵＨ１００−２５）中で１／１０の融合用緩衝液（上
記）に対し、４℃で２時間透析して、全ての低分子量の
ものを除去した。次いで、この混合物を２００μｌのイ
ー・コリＫ１２ ＭＣ１０６１［予めジー・エム・ブエ
ル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２５４巻、第９２７９〜８３頁（１９７９）に実質的に
記載されたように作成］へ加えた。プラスミドｐＢＲ３
２２は、テトラサイクリン耐性を暗号化する遺伝子とア
ンピシリン耐性を暗号化する遺伝子とを含むので（図
１）、また後者の遺伝子はｃＤＮＡがＰｓｔＩ部位に挿
入されると失活されるので、ＰｓｔＩ部位にＤＮＡ挿入
物を有する組換ＤＮＡ分子で形質転換された集落を、こ
のように形質転換されていない集落から選別することが
できる（図１）。１ｎｇのｃＤＮＡから約１００００個
の形質転換された集落を単離した。これら集落は、ポリ
Ａ+ ＲＮＡにおけるＲＮＡの混合物の完全もしくは部分
コピーを示す種々の組換ＤＮＡ分子を包含する（図
１）。これら分子の大部分はＳＧＨ関連ＤＮＡ挿入物を
含有しない。
Ｃ１０６１のトランスフェクション上記で融合させたｄ
Ｇ末端ｐＢＲ３２２とｄＣ末端ＤＮＡとをコロジオン袋
（ＵＨ１００−２５）中で１／１０の融合用緩衝液（上
記）に対し、４℃で２時間透析して、全ての低分子量の
ものを除去した。次いで、この混合物を２００μｌのイ
ー・コリＫ１２ ＭＣ１０６１［予めジー・エム・ブエ
ル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
２５４巻、第９２７９〜８３頁（１９７９）に実質的に
記載されたように作成］へ加えた。プラスミドｐＢＲ３
２２は、テトラサイクリン耐性を暗号化する遺伝子とア
ンピシリン耐性を暗号化する遺伝子とを含むので（図
１）、また後者の遺伝子はｃＤＮＡがＰｓｔＩ部位に挿
入されると失活されるので、ＰｓｔＩ部位にＤＮＡ挿入
物を有する組換ＤＮＡ分子で形質転換された集落を、こ
のように形質転換されていない集落から選別することが
できる（図１）。１ｎｇのｃＤＮＡから約１００００個
の形質転換された集落を単離した。これら集落は、ポリ
Ａ+ ＲＮＡにおけるＲＮＡの混合物の完全もしくは部分
コピーを示す種々の組換ＤＮＡ分子を包含する（図
１）。これら分子の大部分はＳＧＨ関連ＤＮＡ挿入物を
含有しない。
【００４７】ＳＧＨ−ｃＤＮＡを含有するクローンの選別 特定組換ＤＮＡ分子を含有するクローン、すなわちＳＧ
Ｈ関連ＤＮＡ挿入物を含有するクローンにつき、クロー
ンの保存物を選別するには幾つかの方法がある。最初の
クローン選別法において、牛成長ホルモンを暗号化する
ｃＤＮＡの４００ｂｐＰｓｔＩ断片を使用した［たとえ
ば、ミラー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５５巻、第７５２１−２４頁（１９８０）］
（図２）。この配列も、１９８２年８月１６日付けでア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れ、ＡＴＣＣ番号３９１７３を付与されたｐＢＧＨ−
（Ｍｅｔ−Ａｌａ）のＰｓｔＩ制限によって得ることが
できる。
Ｈ関連ＤＮＡ挿入物を含有するクローンにつき、クロー
ンの保存物を選別するには幾つかの方法がある。最初の
クローン選別法において、牛成長ホルモンを暗号化する
ｃＤＮＡの４００ｂｐＰｓｔＩ断片を使用した［たとえ
ば、ミラー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５５巻、第７５２１−２４頁（１９８０）］
（図２）。この配列も、１９８２年８月１６日付けでア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れ、ＡＴＣＣ番号３９１７３を付与されたｐＢＧＨ−
（Ｍｅｔ−Ａｌａ）のＰｓｔＩ制限によって得ることが
できる。
【００４８】上記と同様に調製されたクローンの保存物
につきヒブリド化選択を行うため、この試料を使用した
（図２）。先ず、この試料をエム・グルンシュタインお
よびデイー・デイー・ホグネスにより「コロニ−ヒブリ
ド化：特定遺伝子を含有するクローン化ＤＮＡの単離方
法」、プロシーデイング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１−６５頁（１
９７５）に記載されているようにこの試料を標識し、次
いでこれを使用して下記するようにＳＧＨ−Ｍｓｐ断片
試料を用いてクローンの保存物を選別した。
につきヒブリド化選択を行うため、この試料を使用した
（図２）。先ず、この試料をエム・グルンシュタインお
よびデイー・デイー・ホグネスにより「コロニ−ヒブリ
ド化：特定遺伝子を含有するクローン化ＤＮＡの単離方
法」、プロシーデイング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１−６５頁（１
９７５）に記載されているようにこの試料を標識し、次
いでこれを使用して下記するようにＳＧＨ−Ｍｓｐ断片
試料を用いてクローンの保存物を選別した。
【００４９】ヒブリド化陽性クローンの１種から、挿入
ｃＤＮＡ断片を有する組換ＤＮＡ分子を単離し、前記断
片はＳＧＨのアミノ酸配列の１部を暗号化するヌクレオ
チド配列決定により決定した［報告された部分アミノ酸
配列（上記）との比較による］（図２）。
ｃＤＮＡ断片を有する組換ＤＮＡ分子を単離し、前記断
片はＳＧＨのアミノ酸配列の１部を暗号化するヌクレオ
チド配列決定により決定した［報告された部分アミノ酸
配列（上記）との比較による］（図２）。
【００５０】次いで、この陽性ｃＤＮＡの２００ｂｐ断
片を調製し（Ｍｓｐによる分解、図２参照）かつこれを
標識し（グルンシュタインおよびホグネス、上記）、１
００００個のクローンの保存物に対するヒブリド化試料
として使用した（図２）。ヒブリド化するため、１００
００個の集落をニトロセルロースフィルタ（ミリポア
社）に移し、これらフィルタを３７℃にて１晩培養し
た。これら集落を０．５ＭのＮａＯＨで７分間溶解させ
た後、フィルタを１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
と０．６ＭのＮａＣｌ（それぞれ３分間２回）で中和
し、そしてフィルタを２Ｘ ＳＳＣ［０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）］中
に浸漬した。フィルタを空気乾燥した後、これを８０℃
にて減圧オーブン内で２時間加熱し、次いでこれらを４
Ｘ ＳＳＣ（上記）、１０Ｘデンハルト溶液および０．
１％ＳＤＳ中で６５℃にて２時間２回浸漬した。次い
で、２５０００Ｐ32カウント／フィルタの上記２００ｂ
ｐ試料（２分間煮沸しかつ急速に冷却する）および４Ｘ
ＳＳＣと１０Ｘデンハルト溶液と０．１％ＳＤＳとを
加え、これらフィルタを６５℃にて１２〜１４時間ヒブ
リド化させ、これらを４ＸＳＳＣ、１０Ｘデンハルト溶
液および０．１％ＳＤＳにて６５℃で２時間洗浄し、さ
らにこれらを２Ｘ ＳＳＣにて６５℃で３０分間洗浄
し、そして乾燥させた。Ｘ線フィルムに１日間露出させ
た後、前記試料にヒブリド化されたＤＮＡ挿入物を含有
する約１００個の集落を同定した。
片を調製し（Ｍｓｐによる分解、図２参照）かつこれを
標識し（グルンシュタインおよびホグネス、上記）、１
００００個のクローンの保存物に対するヒブリド化試料
として使用した（図２）。ヒブリド化するため、１００
００個の集落をニトロセルロースフィルタ（ミリポア
社）に移し、これらフィルタを３７℃にて１晩培養し
た。これら集落を０．５ＭのＮａＯＨで７分間溶解させ
た後、フィルタを１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
と０．６ＭのＮａＣｌ（それぞれ３分間２回）で中和
し、そしてフィルタを２Ｘ ＳＳＣ［０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ−０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）］中
に浸漬した。フィルタを空気乾燥した後、これを８０℃
にて減圧オーブン内で２時間加熱し、次いでこれらを４
Ｘ ＳＳＣ（上記）、１０Ｘデンハルト溶液および０．
１％ＳＤＳ中で６５℃にて２時間２回浸漬した。次い
で、２５０００Ｐ32カウント／フィルタの上記２００ｂ
ｐ試料（２分間煮沸しかつ急速に冷却する）および４Ｘ
ＳＳＣと１０Ｘデンハルト溶液と０．１％ＳＤＳとを
加え、これらフィルタを６５℃にて１２〜１４時間ヒブ
リド化させ、これらを４ＸＳＳＣ、１０Ｘデンハルト溶
液および０．１％ＳＤＳにて６５℃で２時間洗浄し、さ
らにこれらを２Ｘ ＳＳＣにて６５℃で３０分間洗浄
し、そして乾燥させた。Ｘ線フィルムに１日間露出させ
た後、前記試料にヒブリド化されたＤＮＡ挿入物を含有
する約１００個の集落を同定した。
【００５１】これら陽性クローンの４０種を選択して制
限分析および寸法決定に使用した（ＰｖｕＩ／Ｂｇｌ
Ｉ）（図３）。この分析から、これらクローンの１種が
約７５０ｐｂのＤＮＡ挿入物を有することが確認され
た。このクローンをイー・コリＫ１２ＭＣ１０６１［ｐ
ＢＲ３２２（Ｐｓｔ／ＳＧＨ−９Ｄ）］と命名し、その
組換ＤＮＡ分子をｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＳＧＨ−９
Ｄと命名し、さらにその挿入物をＳＧＨ−９Ｄと命名し
た。この名称は、クローンがｐＢＲ３２２およびＳＧＨ
−９Ｄよりなる組換ＤＮＡ分子で形質転換されたイー・
コリＫ１２ＭＣ１０６１からなることを示し、挿入物Ｓ
ＧＨ−９ＤはｐＢＲ３２２におけるＰｓｔＩ部位に存在
する（図３）。
限分析および寸法決定に使用した（ＰｖｕＩ／Ｂｇｌ
Ｉ）（図３）。この分析から、これらクローンの１種が
約７５０ｐｂのＤＮＡ挿入物を有することが確認され
た。このクローンをイー・コリＫ１２ＭＣ１０６１［ｐ
ＢＲ３２２（Ｐｓｔ／ＳＧＨ−９Ｄ）］と命名し、その
組換ＤＮＡ分子をｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ＳＧＨ−９
Ｄと命名し、さらにその挿入物をＳＧＨ−９Ｄと命名し
た。この名称は、クローンがｐＢＲ３２２およびＳＧＨ
−９Ｄよりなる組換ＤＮＡ分子で形質転換されたイー・
コリＫ１２ＭＣ１０６１からなることを示し、挿入物Ｓ
ＧＨ−９ＤはｐＢＲ３２２におけるＰｓｔＩ部位に存在
する（図３）。
【００５２】挿入物ＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチド配列決定 ＳＧＨを暗号化するＤＮＡ配列およびその推定信号配列
は約６４８ヌクレオチドからなることが予想されたの
で、制限地図化およびヌクレオチド配列決定による分析
のため挿入物ＳＧＨ−９Ｄを選択した。
は約６４８ヌクレオチドからなることが予想されたの
で、制限地図化およびヌクレオチド配列決定による分析
のため挿入物ＳＧＨ−９Ｄを選択した。
【００５３】図３は、ＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチド配列
を決定するために使用した方法を示している。ＤＮＡを
配列決定するため、エー・エム・マキサムおよびダブリ
ュー・ギルバートにより実質的に記載された方法を使用
した［「ＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、
第７４巻、第５６０−６４頁（１９７７）］。挿入物Ｓ
ＧＨ−９Ｄの全長を両ストランドから配列決定し、標識
末端（図３における黒点）として作用する殆どの制限部
位をこれらを離間する断片によって配列決定した。この
ように得られたヌクレオチド配列を図４乃至図５に示
す。
を決定するために使用した方法を示している。ＤＮＡを
配列決定するため、エー・エム・マキサムおよびダブリ
ュー・ギルバートにより実質的に記載された方法を使用
した［「ＤＮＡの新規な配列決定方法」、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、
第７４巻、第５６０−６４頁（１９７７）］。挿入物Ｓ
ＧＨ−９Ｄの全長を両ストランドから配列決定し、標識
末端（図３における黒点）として作用する殆どの制限部
位をこれらを離間する断片によって配列決定した。この
ように得られたヌクレオチド配列を図４乃至図５に示
す。
【００５４】図４および図５を参照して、５′末端にお
ける１１Ｇ残基および１０Ａ残基（恐らくｍＲＮＡのポ
リＡ＋末端を反映する）および次いで３′末端における
２４Ｃ残基により挿入物を整列させた。対照のため、挿
入物をｄＧ末端に続く最初のヌクレオチドからポリＡ ＋
残基の前の最後のヌクレオチドまで番号を付した。
ける１１Ｇ残基および１０Ａ残基（恐らくｍＲＮＡのポ
リＡ＋末端を反映する）および次いで３′末端における
２４Ｃ残基により挿入物を整列させた。対照のため、挿
入物をｄＧ末端に続く最初のヌクレオチドからポリＡ ＋
残基の前の最後のヌクレオチドまで番号を付した。
【００５５】ＳＧＨにつき報告された部分アミノ酸配列
と比較して判るように、ヌクレオチド１−５７０はＳＧ
Ｈを暗号化し、ヌクレオチド５７１−５７３は停止コド
ンである。したがって、ＳＧＨは１９０個のアミノ酸の
蛋白質であることが判る。さらに、この配列から判るよ
うに、豚前成長ホルモンが存在する。しかしながら、Ｓ
ＧＨの推定信号もしくは予備配列の正確な長さまたは組
成はまだ決定していない。何故なら、ＳＧＨ−９Ｄは豚
前成長ホルモンの５′暗号化および非暗号化末端の全部
を含まないと思われるからである。推定信号配列の最初
の３個のアミノ酸を酸−１、−２および−３として記載
した（図４および図５）。ＳＧＨ−９Ｄは、ポリＡ+ 残
基が存在するため３′非暗号化領域の全部を含まないと
思われる。
と比較して判るように、ヌクレオチド１−５７０はＳＧ
Ｈを暗号化し、ヌクレオチド５７１−５７３は停止コド
ンである。したがって、ＳＧＨは１９０個のアミノ酸の
蛋白質であることが判る。さらに、この配列から判るよ
うに、豚前成長ホルモンが存在する。しかしながら、Ｓ
ＧＨの推定信号もしくは予備配列の正確な長さまたは組
成はまだ決定していない。何故なら、ＳＧＨ−９Ｄは豚
前成長ホルモンの５′暗号化および非暗号化末端の全部
を含まないと思われるからである。推定信号配列の最初
の３個のアミノ酸を酸−１、−２および−３として記載
した（図４および図５）。ＳＧＨ−９Ｄは、ポリＡ+ 残
基が存在するため３′非暗号化領域の全部を含まないと
思われる。
【００５６】勿論、全５′暗号化および非暗号化領域を
含有するクローンの選択および豚前成長ホルモンの完全
予備配列の同定は、本発明の範囲を逸脱することなく当
業者によりなしうることが了解されよう。たとえば、同
定された陽性クローンは上記と同様に挿入ＳＧＨ−９Ｄ
の５′末端から採取された試料を用いて選別することが
できる。たとえば、この種の試料はＳＧＨ−９ＤをＮａ
ｒＩによって分解しかつヌクレオチド−５および−６０
の間の断片を単離することによって調製することができ
る（図４）。次いで、この断片を前記と同様に標識し、
そしてこれをＳＧＨのより完全な５′部分を含有するク
ローンを選択するために使用することができる。このク
ローンは、ＳＧＨ−９Ｄの完全３′端部を含まなけれ
ば、当業界で周知されているように共通の制限部位を介
してＳＧＨ−９Ｄの全部もしくは１部と組合わせて、Ｓ
ＧＨの全暗号化および非暗号化領域からなる単一ＤＮＡ
配列を生成させることができる。
含有するクローンの選択および豚前成長ホルモンの完全
予備配列の同定は、本発明の範囲を逸脱することなく当
業者によりなしうることが了解されよう。たとえば、同
定された陽性クローンは上記と同様に挿入ＳＧＨ−９Ｄ
の５′末端から採取された試料を用いて選別することが
できる。たとえば、この種の試料はＳＧＨ−９ＤをＮａ
ｒＩによって分解しかつヌクレオチド−５および−６０
の間の断片を単離することによって調製することができ
る（図４）。次いで、この断片を前記と同様に標識し、
そしてこれをＳＧＨのより完全な５′部分を含有するク
ローンを選択するために使用することができる。このク
ローンは、ＳＧＨ−９Ｄの完全３′端部を含まなけれ
ば、当業界で周知されているように共通の制限部位を介
してＳＧＨ−９Ｄの全部もしくは１部と組合わせて、Ｓ
ＧＨの全暗号化および非暗号化領域からなる単一ＤＮＡ
配列を生成させることができる。
【００５７】勿論、ＳＧＨ−９Ｄにつき図４および図５
に図示したポリペプチドの構造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコシル化により生体内で生ずる蛋白
質に対する改変を考慮していない。したがって、この構
造は豚中で生成されるＳＧＨとは同一でないと理解され
るが、生成促進性生物学的特性が同一でないにしても極
めて類似していると了解される。図４および図５に図示
した蛋白質構造は、遺伝子レベルまたはアミノ酸自身に
おける他の改変、たとえば突然変異、単一もしくは多重
の塩基交換、削除、挿入もしくは転換、化学的誘導化ま
たはこれら構造の活性断片の選択がＳＧＨの活性を示さ
ない化合物を生成することを意味しない。さらに、コン
ピュータによりＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチド配列を分析
し制限エンドヌクレアーゼ部位の幾つかの本体および位
置を決定した。この分析の結果を図６に示す。
に図示したポリペプチドの構造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコシル化により生体内で生ずる蛋白
質に対する改変を考慮していない。したがって、この構
造は豚中で生成されるＳＧＨとは同一でないと理解され
るが、生成促進性生物学的特性が同一でないにしても極
めて類似していると了解される。図４および図５に図示
した蛋白質構造は、遺伝子レベルまたはアミノ酸自身に
おける他の改変、たとえば突然変異、単一もしくは多重
の塩基交換、削除、挿入もしくは転換、化学的誘導化ま
たはこれら構造の活性断片の選択がＳＧＨの活性を示さ
ない化合物を生成することを意味しない。さらに、コン
ピュータによりＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチド配列を分析
し制限エンドヌクレアーゼ部位の幾つかの本体および位
置を決定した。この分析の結果を図６に示す。
【００５８】ＳＧＨ様ポリペプチドの合成 蛋白質の生産レベルは、２つの主要な因子により支配さ
れる：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、ならびに
これら遺伝子コピーが転写かつ翻訳される効率である。
転写および翻訳の効率（これは一緒になって発現を構成
する）は、一般に所望の暗号化配列の前方に位置するヌ
クレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列
または発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互
作用して転写を開始する位置（プロモータ配列）と、リ
ボソームがｍＲＮＡ（転写の生成物）と結合して相互作
用し翻訳を開始する位置とを規定する。必ずしも全ての
発現制御配列が同じ効率を持って機能するとは限らな
い。したがって、所望の蛋白質に対して特異的な暗号化
配列をそれらの隣接するヌクレオチド配列から分離して
これらを他の発現制御配列に融合させ、より高いレベル
の発現を生ぜしめるのが有利である。これが達成された
後、新たに作成されたＤＮＡ断片を複数コピーのプラス
ミドまたはバクテリオファージ誘導体中へ挿入して、細
胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれによりさら
に発現蛋白質の収量を向上させることができる。
れる：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数、ならびに
これら遺伝子コピーが転写かつ翻訳される効率である。
転写および翻訳の効率（これは一緒になって発現を構成
する）は、一般に所望の暗号化配列の前方に位置するヌ
クレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチド配列
または発現制御配列は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互
作用して転写を開始する位置（プロモータ配列）と、リ
ボソームがｍＲＮＡ（転写の生成物）と結合して相互作
用し翻訳を開始する位置とを規定する。必ずしも全ての
発現制御配列が同じ効率を持って機能するとは限らな
い。したがって、所望の蛋白質に対して特異的な暗号化
配列をそれらの隣接するヌクレオチド配列から分離して
これらを他の発現制御配列に融合させ、より高いレベル
の発現を生ぜしめるのが有利である。これが達成された
後、新たに作成されたＤＮＡ断片を複数コピーのプラス
ミドまたはバクテリオファージ誘導体中へ挿入して、細
胞内の遺伝子コピー数を増加させ、かつそれによりさら
に発現蛋白質の収量を向上させることができる。
【００５９】従って、本発明の方法にしたがいＳＧＨ様
ポリペプチドを生産する際、多種類の宿主−発現制御配
列ベクターの組合せを使用することができる。たとえ
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のＤ
ＮＡ配列の断片、例えばｃｏｌＥＩ、ｐＣＲＩ、ｐＢＲ
３２２およびそれらの誘導体を含むイー・コリからの各
種公知の細菌性プラスミド、より広範な宿主範囲のプラ
スミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばフ
ァージλの多数の誘導体ならびに上記の組合せから誘導
されるベクター、たとえばｐＢＲ３２２の１部、ファー
ジλの１部および合成部分を含むベクターから構成する
ことができる。有用な宿主は、たとえばイー・コリＫ１
２ＭＣ１０６１、イー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ
１７７６、イー・コリＸ２２８２、イー・コリＭＲＣＩ
の菌株およびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌および
その他の細菌類のような細菌性宿主、酵母およびその他
の真菌類、動物もしくは植物宿主、たとえば動物（ひと
を含む）もしくは植物細胞の培養物、或いはその他の宿
主を包含する。有用な発現制御配列は、イー・コリの乳
糖オペロンのオペレータ、プロモータおよびリボソーム
結合および相互作用配列（たとえばシャイン−ダルガル
ノ配列のような配列を含む）（「ｌａｃ系」）、イー・
コリのトリプトファン合成酵素系の対応する配列（「ｔ
ｒｐ系」）、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域（ＯL ＰL およびＯR ＰI R ）、ファージｆｄコ
ート蛋白質の制御領域、或いは原始核もしくは成熟核細
胞およびそのウイルスの発現を制御しまたは促進するそ
の他の配列、或いはこれらの各種の組合せを包含する。
ポリペプチドを生産する際、多種類の宿主−発現制御配
列ベクターの組合せを使用することができる。たとえ
ば、有用なベクターは染色体、非染色体および合成のＤ
ＮＡ配列の断片、例えばｃｏｌＥＩ、ｐＣＲＩ、ｐＢＲ
３２２およびそれらの誘導体を含むイー・コリからの各
種公知の細菌性プラスミド、より広範な宿主範囲のプラ
スミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばフ
ァージλの多数の誘導体ならびに上記の組合せから誘導
されるベクター、たとえばｐＢＲ３２２の１部、ファー
ジλの１部および合成部分を含むベクターから構成する
ことができる。有用な宿主は、たとえばイー・コリＫ１
２ＭＣ１０６１、イー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ
１７７６、イー・コリＸ２２８２、イー・コリＭＲＣＩ
の菌株およびシュードモナス、枯草菌、高熱細菌および
その他の細菌類のような細菌性宿主、酵母およびその他
の真菌類、動物もしくは植物宿主、たとえば動物（ひと
を含む）もしくは植物細胞の培養物、或いはその他の宿
主を包含する。有用な発現制御配列は、イー・コリの乳
糖オペロンのオペレータ、プロモータおよびリボソーム
結合および相互作用配列（たとえばシャイン−ダルガル
ノ配列のような配列を含む）（「ｌａｃ系」）、イー・
コリのトリプトファン合成酵素系の対応する配列（「ｔ
ｒｐ系」）、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域（ＯL ＰL およびＯR ＰI R ）、ファージｆｄコ
ート蛋白質の制御領域、或いは原始核もしくは成熟核細
胞およびそのウイルスの発現を制御しまたは促進するそ
の他の配列、或いはこれらの各種の組合せを包含する。
【００６０】勿論、必ずしも全ての宿主−発現制御配列
−ベクター組合せが、特定のＤＮＡ暗号化配列につき同
等の効率を有するとは限らない。しかしながら、本発明
で説明したように、生物安全性、特定の作成につき本発
明のＳＧＨ暗号化ＤＮＡ配列に使用しうる部位、発現す
べきＳＧＨ様ポリペプチドの寸法、宿主細胞酵素による
蛋白質分解に対するこれらポリペプチドの感受性、精製
の際に除去するのが困難な宿主細胞蛋白質によるこれら
ポリペプチドの汚染、ＳＧＨおよびＳＧＨ様暗号化配列
の発現特性、たとえばＤＮＡ配列の構造ならびに発現制
御配列に関する開始および停止コドンの位置、ならびに
当業者により認識されたその他の因子を考慮して、適当
な組合せを選択することができる。
−ベクター組合せが、特定のＤＮＡ暗号化配列につき同
等の効率を有するとは限らない。しかしながら、本発明
で説明したように、生物安全性、特定の作成につき本発
明のＳＧＨ暗号化ＤＮＡ配列に使用しうる部位、発現す
べきＳＧＨ様ポリペプチドの寸法、宿主細胞酵素による
蛋白質分解に対するこれらポリペプチドの感受性、精製
の際に除去するのが困難な宿主細胞蛋白質によるこれら
ポリペプチドの汚染、ＳＧＨおよびＳＧＨ様暗号化配列
の発現特性、たとえばＤＮＡ配列の構造ならびに発現制
御配列に関する開始および停止コドンの位置、ならびに
当業者により認識されたその他の因子を考慮して、適当
な組合せを選択することができる。
【００６１】さらに、ＤＮＡ配列および発現制御配列を
ベクター中へ挿入するには、各種の方法が当業界で知ら
れている。これらは、たとえば直接結合、合成リンカ
ー、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修
復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼおよび適
当な単一鎖雛型によるＤＮＡ鎖の延長に続く結合を包含
する。本発明のＳＧＨ様ポリペプチドを合成するには、
これらのいずれを選択してもよい。
ベクター中へ挿入するには、各種の方法が当業界で知ら
れている。これらは、たとえば直接結合、合成リンカ
ー、エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合した修
復反応に続く結合、或いはＤＮＡポリメラーゼおよび適
当な単一鎖雛型によるＤＮＡ鎖の延長に続く結合を包含
する。本発明のＳＧＨ様ポリペプチドを合成するには、
これらのいずれを選択してもよい。
【００６２】さらに、選択された宿主−発現制御配列−
ベクター組合せで発現される実際のＤＮＡ配列は、成熟
ＳＧＨとは同一でない生産物を生成しうることを了解す
べきである。たとえば、発現されるＤＮＡ配列は、成熟
ＳＧＨ＋メチオニンまたはＳＧＨの推定信号配列の１部
もしくは全部、或いはＳＧＨに関連のない他のアミノ酸
を暗号化することもある。或いは、発現ＤＮＡ配列はＳ
ＧＨの１部のみ或いはメチオニンもしくはその他のアミ
ノ酸を共に暗号化することもある。いずれの場合も本発
明に包含される。たとえば、豚前成長ホルモン、もしく
はｆ−ｍｅｔ−ＳＧＨを暗号化するヌクレオチド配列で
形質転換された宿主は、そのＳＧＨ様化合物を単独で生
産することができ、或いは他のアミノ酸に融合すること
もでき、さらに成熟ＳＧＨ生成物を分泌することもでき
る。必要なことは、発酵培養物から単離した後に或いは
たとえば開裂、合成結合またはその他周知の方法のよう
な慣用の処理の後に得られる生産物がＳＧＨの成長促進
性生物学的活性を示すことだけである。※※ ｆ−ｍｅ
ｔもしくはその他の非ＳＧＨ関連アミノ酸またはＳＧＨ
自身の非活性必須アミノ酸は、生産物を使用する前に化
学的または酵素的に除去しうることを了解すべきであ
る。さらに、これらは発現の際に宿主細胞により開裂す
ることもできる。
ベクター組合せで発現される実際のＤＮＡ配列は、成熟
ＳＧＨとは同一でない生産物を生成しうることを了解す
べきである。たとえば、発現されるＤＮＡ配列は、成熟
ＳＧＨ＋メチオニンまたはＳＧＨの推定信号配列の１部
もしくは全部、或いはＳＧＨに関連のない他のアミノ酸
を暗号化することもある。或いは、発現ＤＮＡ配列はＳ
ＧＨの１部のみ或いはメチオニンもしくはその他のアミ
ノ酸を共に暗号化することもある。いずれの場合も本発
明に包含される。たとえば、豚前成長ホルモン、もしく
はｆ−ｍｅｔ−ＳＧＨを暗号化するヌクレオチド配列で
形質転換された宿主は、そのＳＧＨ様化合物を単独で生
産することができ、或いは他のアミノ酸に融合すること
もでき、さらに成熟ＳＧＨ生成物を分泌することもでき
る。必要なことは、発酵培養物から単離した後に或いは
たとえば開裂、合成結合またはその他周知の方法のよう
な慣用の処理の後に得られる生産物がＳＧＨの成長促進
性生物学的活性を示すことだけである。※※ ｆ−ｍｅ
ｔもしくはその他の非ＳＧＨ関連アミノ酸またはＳＧＨ
自身の非活性必須アミノ酸は、生産物を使用する前に化
学的または酵素的に除去しうることを了解すべきであ
る。さらに、これらは発現の際に宿主細胞により開裂す
ることもできる。
【００６３】本発明の合成において、豚成長ホルモン用
ポリペプチドを発現するため次の構造を選択した：ＳＧ
Ｈ−Δ７。この組換ＤＮＡ分子は図７に示したように作
成した。
ポリペプチドを発現するため次の構造を選択した：ＳＧ
Ｈ−Δ７。この組換ＤＮＡ分子は図７に示したように作
成した。
【００６４】先ず、イー・コリＫ１２λ（ｐＢＧＨ−Δ
９（Ｓｅｒ））［ゲーリー・ブエルの寄贈物であり、１
９８２年８月１６日付けでアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託し、寄託番号３９１７４が付
与された］からｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）を単離し、そ
の場合実質的にアール・デイー・クライン等、プラスミ
ド、第３巻、第８８−９１頁（１９８０）に記載された
プラスミド単離法を使用した。次いで、このプラスミド
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
によって開裂させ、そしてＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片
（断片Ａ）を単離した（図７）。さらに、同じプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＨｇｉＡ１で開裂させ、そして約
８８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＨｇｉＡ１断片（断片Ｂ）を
単離した（図７）。さらに、同じプラスミドをＰｖｕII
およびＢａｍＨＩで開裂させ、そして約１０３塩基対の
ＰｖｕII−ＢａｍＨＩ断片（断片Ｃ）を単離した（図
７）。
９（Ｓｅｒ））［ゲーリー・ブエルの寄贈物であり、１
９８２年８月１６日付けでアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託し、寄託番号３９１７４が付
与された］からｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）を単離し、そ
の場合実質的にアール・デイー・クライン等、プラスミ
ド、第３巻、第８８−９１頁（１９８０）に記載された
プラスミド単離法を使用した。次いで、このプラスミド
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
によって開裂させ、そしてＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片
（断片Ａ）を単離した（図７）。さらに、同じプラスミ
ドをＥｃｏＲＩおよびＨｇｉＡ１で開裂させ、そして約
８８塩基対のＥｃｏＲＩ−ＨｇｉＡ１断片（断片Ｂ）を
単離した（図７）。さらに、同じプラスミドをＰｖｕII
およびＢａｍＨＩで開裂させ、そして約１０３塩基対の
ＰｖｕII−ＢａｍＨＩ断片（断片Ｃ）を単離した（図
７）。
【００６５】次いで、上記のｐＳＧＨ−９ＤをＨｇｉＡ
１およびＰｖｕIIにより実質的に同じ条件下で制限し、
そしてＨｇｉＡ１部位（ＧＴＧＣＴ↓Ｃ）からＰｖｕII
部位（ＣＡＧ↓ＣＴＧ）まで延在するＳＧＨ暗号化配列
のその部分を単離した（図７および図８）。次いで、こ
の断片をｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）から予め作成した３
種の断片（Ａ、ＢおよびＣ）と結合させ、その際標準条
件とＴ４ＤＮＡリガーゼとを１６℃にて１晩使用した。
１およびＰｖｕIIにより実質的に同じ条件下で制限し、
そしてＨｇｉＡ１部位（ＧＴＧＣＴ↓Ｃ）からＰｖｕII
部位（ＣＡＧ↓ＣＴＧ）まで延在するＳＧＨ暗号化配列
のその部分を単離した（図７および図８）。次いで、こ
の断片をｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）から予め作成した３
種の断片（Ａ、ＢおよびＣ）と結合させ、その際標準条
件とＴ４ＤＮＡリガーゼとを１６℃にて１晩使用した。
【００６６】ｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）およびｐＳＧＨ
−９ＤのＢＧＨ暗号化配列と遺伝子暗号の退化との間に
は類似性が存在するので、上記の結合から生ずる組換Ｄ
ＮＡ分子はｆ−Ｍｅｔ開始の後にその最初の７個のアミ
ノ酸を喪失するＳＧＨ様ポリペプチドを暗号化する（図
７および図８）。
−９ＤのＢＧＨ暗号化配列と遺伝子暗号の退化との間に
は類似性が存在するので、上記の結合から生ずる組換Ｄ
ＮＡ分子はｆ−Ｍｅｔ開始の後にその最初の７個のアミ
ノ酸を喪失するＳＧＨ様ポリペプチドを暗号化する（図
７および図８）。
【００６７】この分子を特性化するＳＧＨ暗号化配列
は、ｐＳＧＨ−９ＤにおけるＳＧＨを暗号化するものと
は異なる３個のヌクレオチドを有する（図４および図
５）。これらの差のうち２つは、ＢＧＨ暗号化配列とＳ
ＧＨ暗号化配列との間の差から生ずる（ＡおよびＣ、図
８）。第３の差は、ｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）を生成さ
せるために使用した特定の構造に起因する（Ｃ、図
８）。これらのヌクレオチドの差はいずれも、ｐＳＧＨ
−Δ７の挿入ＤＮＡ配列により暗号化されるＳＧＨ様ポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させない。
は、ｐＳＧＨ−９ＤにおけるＳＧＨを暗号化するものと
は異なる３個のヌクレオチドを有する（図４および図
５）。これらの差のうち２つは、ＢＧＨ暗号化配列とＳ
ＧＨ暗号化配列との間の差から生ずる（ＡおよびＣ、図
８）。第３の差は、ｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）を生成さ
せるために使用した特定の構造に起因する（Ｃ、図
８）。これらのヌクレオチドの差はいずれも、ｐＳＧＨ
−Δ７の挿入ＤＮＡ配列により暗号化されるＳＧＨ様ポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させない。
【００６８】次いで、競合イー・コリＫ１２λ（ワルタ
ー・ファイエルスの寄贈物）２００μｌを１０μｌの
０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 の存在下で形質転換させ、その際
これら細胞を氷中で１５分間急冷し、４２℃で２分間培
養しかつ室温で１０分間培養した。２ｍｌのＬ−ブロス
を加えた後、細胞を３７℃にて１時間増殖させ、２００
μｌ部分を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された
Ｌ−ブロスを含有するペトリ皿に接植した。３７℃で１
６時間集落を増殖させ、そしてアンピシリン耐性の２４
種のクローンをランダムに選択した。
ー・ファイエルスの寄贈物）２００μｌを１０μｌの
０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 の存在下で形質転換させ、その際
これら細胞を氷中で１５分間急冷し、４２℃で２分間培
養しかつ室温で１０分間培養した。２ｍｌのＬ−ブロス
を加えた後、細胞を３７℃にて１時間増殖させ、２００
μｌ部分を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された
Ｌ−ブロスを含有するペトリ皿に接植した。３７℃で１
６時間集落を増殖させ、そしてアンピシリン耐性の２４
種のクローンをランダムに選択した。
【００６９】これらクローンのそれぞれの培養物を、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＬ−ブロス５
ｍｌ中で３７℃にて１２時間増殖させ、そしてクライン
等（上記）により記載されたミニ調製法により各培養物
の細胞１ｍｌからプラスミドＤＮＡを精製した。次い
で、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限およびポリアクリルア
ミドゲル分別によって２４種のプラスミドにおけるＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物を寸法決定した。適当な寸法
の挿入物を有する９個の断片を選択した。次いで、ジー
・エヌ・ブエル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー・第２５４巻、第９２７９−８３頁（１９７
９）に実質的に記載されたように、イー・コリＭＣ１０
６１をｐＳＧＨ−Δ７と命名したこれらクローンの１種
により形質転換させた。さらに、これら細胞をｐｃＩ８
５７（ダブリュー・ファイエルスの寄贈物）により形質
転換させた。※ 集落をアンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）およびカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）が補充され
たＬ−ブロス中で３０℃にて１６時間増殖させることに
よりｐＳＧＨ−Δ７およびｐｃＩ８５７で形質転換され
た細胞を選択した。※ ｐｃＩ８５７は感温性ＰL リプ
レッサおよびカナマイシン耐性を暗号化する遺伝子を有
する小型プラスミドである。
０μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＬ−ブロス５
ｍｌ中で３７℃にて１２時間増殖させ、そしてクライン
等（上記）により記載されたミニ調製法により各培養物
の細胞１ｍｌからプラスミドＤＮＡを精製した。次い
で、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限およびポリアクリルア
ミドゲル分別によって２４種のプラスミドにおけるＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物を寸法決定した。適当な寸法
の挿入物を有する９個の断片を選択した。次いで、ジー
・エヌ・ブエル等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー・第２５４巻、第９２７９−８３頁（１９７
９）に実質的に記載されたように、イー・コリＭＣ１０
６１をｐＳＧＨ−Δ７と命名したこれらクローンの１種
により形質転換させた。さらに、これら細胞をｐｃＩ８
５７（ダブリュー・ファイエルスの寄贈物）により形質
転換させた。※ 集落をアンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）およびカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）が補充され
たＬ−ブロス中で３０℃にて１６時間増殖させることに
よりｐＳＧＨ−Δ７およびｐｃＩ８５７で形質転換され
た細胞を選択した。※ ｐｃＩ８５７は感温性ＰL リプ
レッサおよびカナマイシン耐性を暗号化する遺伝子を有
する小型プラスミドである。
【００７０】次いで、アンピシリン耐性かつカナイマイ
シン耐性の集落をランダムに吊上げ、そしてこれらを前
記と同様にアンピシリンおよびカナイマイシンが補充さ
れたＬ−ブロス５ｍｌ中で３０℃にて１晩増殖させた。
次いで、培養物を２５ｍｌのＬ−ブロスで４２℃にて希
釈し、そしてこれら細胞を４２℃で２時間増殖させた
（Ｏ．Ｄ．＝１）。
シン耐性の集落をランダムに吊上げ、そしてこれらを前
記と同様にアンピシリンおよびカナイマイシンが補充さ
れたＬ−ブロス５ｍｌ中で３０℃にて１晩増殖させた。
次いで、培養物を２５ｍｌのＬ−ブロスで４２℃にて希
釈し、そしてこれら細胞を４２℃で２時間増殖させた
（Ｏ．Ｄ．＝１）。
【００７１】形質転換された細胞により生産されたＳＧ
Ｈ様ポリペプチドを単離するため、細胞１ｍｌを採取
し、これを遠心分離し（８０００ｒｐｍ、４ｍｉｎ）、
５０μｌのレムリ緩衝液（１％ ＳＤＳ）［レムリ、ネ
イチャー誌、第２２７巻、第６８１頁以降（１９７
０）］を加え、混合物を１５分間煮沸し、そして再び細
胞を遠心分離して（８０００ｒｐｍ、４ｍｉｎ）細胞の
残骸を除去した。標準ＢＧＨに対するうさぎ抗血清を使
用するＳＧＨ競合放射免疫分析により上澄液を分析し
た。収率：ＳＧＨ活性（ｍｇ／ｌ）３２；細胞１個当り
のＳＧＨ様分子１．６×１０6 。
Ｈ様ポリペプチドを単離するため、細胞１ｍｌを採取
し、これを遠心分離し（８０００ｒｐｍ、４ｍｉｎ）、
５０μｌのレムリ緩衝液（１％ ＳＤＳ）［レムリ、ネ
イチャー誌、第２２７巻、第６８１頁以降（１９７
０）］を加え、混合物を１５分間煮沸し、そして再び細
胞を遠心分離して（８０００ｒｐｍ、４ｍｉｎ）細胞の
残骸を除去した。標準ＢＧＨに対するうさぎ抗血清を使
用するＳＧＨ競合放射免疫分析により上澄液を分析し
た。収率：ＳＧＨ活性（ｍｇ／ｌ）３２；細胞１個当り
のＳＧＨ様分子１．６×１０6 。
【００７２】
【発明の効果】したがって、本発明のＤＮＡ配列および
組換ＤＮＡ分子は、ＳＧＨ様ポリペプチドの生産を高収
率で可能にする。さらに、本発明の配列、分子および方
法は、慣用の方法を使用する精製の後に豚における一般
的同化作用剤としてこれら動物における成長速度、体重
増加および肉生産を特に増加させるのに有用な新規なＳ
ＧＨ様ポリペプチドの生産を可能にする。
組換ＤＮＡ分子は、ＳＧＨ様ポリペプチドの生産を高収
率で可能にする。さらに、本発明の配列、分子および方
法は、慣用の方法を使用する精製の後に豚における一般
的同化作用剤としてこれら動物における成長速度、体重
増加および肉生産を特に増加させるのに有用な新規なＳ
ＧＨ様ポリペプチドの生産を可能にする。
【００７３】本発明によるＳＧＨ様ポリペプチドの生産
方法の上記具体例は標準ＳＧＨに比較してその最初の７
個のアミノ酸を喪失しかつｆ−Ｍｅｔを有するＳＧＨ様
ポリペプチドを与えるが、当業者はその他の作成を用い
て本発明の範囲を逸脱することなくその他のＳＧＨ様ポ
リペプチドを生成させることもできる。たとえば、ＡＴ
Ｇ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンとその他のコドン
を標準ＳＧＨの最初のアミノ酸を暗号化するＴＴＣコド
ンに直接に融合させるような作成を行うこともできる。
この種の作成は、ｆ−Ｍｅｔに融合された、または他の
アミノ酸を介してｆ−Ｍｅｔに融合された成熟ＳＧＨの
生産を可能にする。※ しかしながら、本発明のＳＧＨ
様ポリペプチドを生産するには、ずっと高い収率が得ら
れるためｐＳＧＨ−Δ７をイー・コリＨＢ１０１におい
て使用するのが好ましい。※ 成熟ＳＧＨの一部でない
任意のアミノ酸或いはＳＧＨ自身の非活性必須アミノ酸
を発現の際、或いはそれに続いて除去した後、ポリペプ
チドを使用して動物を処理しうることを了解すべきであ
る。
方法の上記具体例は標準ＳＧＨに比較してその最初の７
個のアミノ酸を喪失しかつｆ−Ｍｅｔを有するＳＧＨ様
ポリペプチドを与えるが、当業者はその他の作成を用い
て本発明の範囲を逸脱することなくその他のＳＧＨ様ポ
リペプチドを生成させることもできる。たとえば、ＡＴ
Ｇ開始コドンまたはＡＴＧ開始コドンとその他のコドン
を標準ＳＧＨの最初のアミノ酸を暗号化するＴＴＣコド
ンに直接に融合させるような作成を行うこともできる。
この種の作成は、ｆ−Ｍｅｔに融合された、または他の
アミノ酸を介してｆ−Ｍｅｔに融合された成熟ＳＧＨの
生産を可能にする。※ しかしながら、本発明のＳＧＨ
様ポリペプチドを生産するには、ずっと高い収率が得ら
れるためｐＳＧＨ−Δ７をイー・コリＨＢ１０１におい
て使用するのが好ましい。※ 成熟ＳＧＨの一部でない
任意のアミノ酸或いはＳＧＨ自身の非活性必須アミノ酸
を発現の際、或いはそれに続いて除去した後、ポリペプ
チドを使用して動物を処理しうることを了解すべきであ
る。
【００７４】ｆ−Ｍｅｔ−成熟ＳＧＨを暗号化する構造
の有用な製造方法の１つを図９および図１０に示す。こ
の具体例においては、ｐＳＧＨ−９ＤをＨａｅIIにより
制限し、成熟ＳＧＨのアミノ酸１を暗号化するＴＴＣコ
ドンの前方に残存するヌクレオチドを除去し、かつ残存
する断片をＡｖａＩにより制限してＴＴＣで始まる成熟
ＳＧＨの５′暗号化末端を単離した。次いで、この断片
を、成熟ＳＧＨの３′暗号化末端を暗号化するｐＳＧＨ
−Δ７からのＡｖａＩ−ＢａｍＨＩ断片と組合せた。次
いで、この断片を上記したｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）か
ら誘導したクローン化ベクター中へ挿入し、ＴＴＣコド
ンをＡＴＧコドンに対し鈍端化させた。したがって、こ
の構造［ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）］は、適当な宿
主においてｆ−Ｍｅｔ−成熟ＳＧＨの生産を可能にす
る。
の有用な製造方法の１つを図９および図１０に示す。こ
の具体例においては、ｐＳＧＨ−９ＤをＨａｅIIにより
制限し、成熟ＳＧＨのアミノ酸１を暗号化するＴＴＣコ
ドンの前方に残存するヌクレオチドを除去し、かつ残存
する断片をＡｖａＩにより制限してＴＴＣで始まる成熟
ＳＧＨの５′暗号化末端を単離した。次いで、この断片
を、成熟ＳＧＨの３′暗号化末端を暗号化するｐＳＧＨ
−Δ７からのＡｖａＩ−ＢａｍＨＩ断片と組合せた。次
いで、この断片を上記したｐＢＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）か
ら誘導したクローン化ベクター中へ挿入し、ＴＴＣコド
ンをＡＴＧコドンに対し鈍端化させた。したがって、こ
の構造［ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）］は、適当な宿
主においてｆ−Ｍｅｔ−成熟ＳＧＨの生産を可能にす
る。
【００７５】或いは、標準ＳＧＨからの削除を含む、或
いは標準ＳＧＨからのアミノ酸改変を含むその他の新規
のＳＧＨ様ポリペプチドを、ＤＮＡレベルに対する適当
な構造により或いはポリペプチド生成後の化学的もしく
は酵素的反応により作成することもできる。たとえば、
上記の技術を用いてΔ３−ＳＧＨを作成した。これらの
構造およびポリペプチドも本発明の一部である。
いは標準ＳＧＨからのアミノ酸改変を含むその他の新規
のＳＧＨ様ポリペプチドを、ＤＮＡレベルに対する適当
な構造により或いはポリペプチド生成後の化学的もしく
は酵素的反応により作成することもできる。たとえば、
上記の技術を用いてΔ３−ＳＧＨを作成した。これらの
構造およびポリペプチドも本発明の一部である。
【００７６】必ずしも全てこれら構造が本発明の所望Ｓ
ＧＨ様ポリペプチドの生産において同等に有効であると
は限らない。しかしながら、当業者はここに記載した方
法および分析を用いて、特定の発現系、宿主および使用
に適する構造およびポリペプチドを選択することができ
る。
ＧＨ様ポリペプチドの生産において同等に有効であると
は限らない。しかしながら、当業者はここに記載した方
法および分析を用いて、特定の発現系、宿主および使用
に適する構造およびポリペプチドを選択することができ
る。
【００７７】精製後の上記ＳＧＨ様ポリペプチドを使用
しかつ成長ホルモンを動物へ投与するために従来知られ
た手段および方法［たとえば、イー・ジェー・ターマ
ン、上記］により豚を処理して、それらの成長速度およ
び肉生産を改善した。たとえば、上記のように生成され
たＳＧＨ−Δ７は、ラットの試験における天然のＳＧＨ
と同様な体重増加活性を示した。
しかつ成長ホルモンを動物へ投与するために従来知られ
た手段および方法［たとえば、イー・ジェー・ターマ
ン、上記］により豚を処理して、それらの成長速度およ
び肉生産を改善した。たとえば、上記のように生成され
たＳＧＨ−Δ７は、ラットの試験における天然のＳＧＨ
と同様な体重増加活性を示した。
【００７８】本発明の方法により作成された微生物およ
び組換ＤＮＡ分子は１９８２年９月１５日付けでメリー
ランド州・ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託された培養物を例とし、これ
ら培養物はＳＧＨ−ＡおよびＢとして同定された： Ａ：イー・コリ Ｋ１２ ＭＣ１０６１（ｐＳＧＨ−９
Ｄ） Ｂ：イー・コリ Ｋ１２ λ（ｐＳＧＨ−Δ７） これら培養物には、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ３９１９
１および３９１９２が付与された。
び組換ＤＮＡ分子は１９８２年９月１５日付けでメリー
ランド州・ロックビル在のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに寄託された培養物を例とし、これ
ら培養物はＳＧＨ−ＡおよびＢとして同定された： Ａ：イー・コリ Ｋ１２ ＭＣ１０６１（ｐＳＧＨ−９
Ｄ） Ｂ：イー・コリ Ｋ１２ λ（ｐＳＧＨ−Δ７） これら培養物には、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ３９１９
１および３９１９２が付与された。
【００７９】以上、本発明の多くの具体例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および構成
を利用するその他の具体例も提供することができる。し
たがって、本発明はその思想および範囲を逸脱すること
なく多くの変更および改変をなしうることが了解されよ
う。
たが、この基本構成を改変して本発明の方法および構成
を利用するその他の具体例も提供することができる。し
たがって、本発明はその思想および範囲を逸脱すること
なく多くの変更および改変をなしうることが了解されよ
う。
【図１】本発明のポリペプチドを暗号化する挿入ＤＮＡ
配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子の混合物を製造するた
めの本発明の方法の一具体例を示す略図である。
配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子の混合物を製造するた
めの本発明の方法の一具体例を示す略図である。
【図２】本発明のＤＮＡ配列を選択するためのクローン
選別法の２つの例を示す略図であって、第１のものは牛
成長ホルモンからの試料へヒブリド化させてＳＧＨ関連
ｃＤＮＡ配列を選択するものであり、第２のものはＳＧ
Ｈ関連ｃＤＮＡの処理により作成された試料を使用する
ものである。
選別法の２つの例を示す略図であって、第１のものは牛
成長ホルモンからの試料へヒブリド化させてＳＧＨ関連
ｃＤＮＡ配列を選択するものであり、第２のものはＳＧ
Ｈ関連ｃＤＮＡの処理により作成された試料を使用する
ものである。
【図３】本発明のＤＮＡ配列ＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチ
ド配列を決定するために使用される配列決定法の略図で
ある。
ド配列を決定するために使用される配列決定法の略図で
ある。
【図４】本発明のＤＮＡ配列ＳＧＨ−９Ｄのヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列を示す配列図である。
ド配列およびアミノ酸配列を示す配列図である。
【図５】図４に続く本発明のＤＮＡ配列ＳＧＨ−９Ｄの
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す配列図であ
る。
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す配列図であ
る。
【図６】図４および図５に示されたヌクレオチド配列の
コンピュータ分析により決定された制限部位の部分図で
ある。
コンピュータ分析により決定された制限部位の部分図で
ある。
【図７】本発明の組換ＤＮＡ分子ｐＳＧＨ−Δ７の作成
における一具体例を示す略図である。
における一具体例を示す略図である。
【図８】ｐＳＧＨ−Δ９（Ｓｅｒ）、ｐＳＧＨ−９Ｄお
よびｐＳＧＨ−Δ７の適切なヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す配列図である。
よびｐＳＧＨ−Δ７の適切なヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列を示す配列図である。
【図９】本発明の組換ＤＮＡ分子ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−
Ｐｈｅ）の作成の一具体例を示す略図である。
Ｐｈｅ）の作成の一具体例を示す略図である。
【図１０】図９に関連する本発明の組換ＤＮＡ分子ｐＳ
ＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）の作成の一具体例を示す略図
である。
ＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）の作成の一具体例を示す略図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 １．Ｊ．ＣＬＩＮ．ＥＮＤＯＣＲＩＮ ＯＬ．ＭＥＴＡＢ．，1976〜42！Ｐ. 1127−1132 ２．ＩＮＴ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．, 1973〜４！Ｐ．421−424 ３．Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，1970 〜245！Ｐ．3402−3406
Claims (9)
- 【請求項１】 豚成長ホルモンの成長促進性生物学的活
性を示すポリペプチドであって、前記ポリペプチドは豚
起源の他の蛋白質を本質的に含有せず、かつ （ａ）ｐＳＧＨ−９Ｄのアミノ酸配列：【数１】 （ｂ）ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）のアミノ酸配列：【数２】 （ｃ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列からのアミノ末
端欠失を特徴とするポリペプチドのアミノ酸配列よりな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。 - 【請求項２】 （ａ）に記載されたアミノ酸配列のアミ
ノ末端欠失が、ポリペプチドの最初の７個のアミノ酸の
１個以上の欠失を生じる請求項１（ｃ）に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項３】 （ａ）に記載されたアミノ酸配列のアミ
ノ末端欠失が、ポリペプチドの最初の７個のアミノ酸の
全部の欠失を生じる請求項１（ｃ）に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項４】 豚成長ホルモンの成長促進性生物学的活
性を示すポリペプチドであって、ＳＧＨ−Δ７のアミノ
酸配列：【数３】 を有するポリペプチド。 - 【請求項５】 豚成長ホルモンの成長促進性生物学的活
性を示すポリペプチドを製造する方法であって、発現制
御配列に作用結合された前記ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を特徴とする組換ＤＮＡ分子により形質転換
された宿主を培養する工程からなり、前記ポリペプチド
は、 （ａ）ｐＳＧＨ−９Ｄのアミノ酸配列：【数４】 （ｂ）ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）のアミノ酸配列：【数５】 （ｃ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列からのアミノ末
端欠失を特徴とするアミノ酸配列よりなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有している、ポリペプチドを製造す
る方法。 - 【請求項６】 前記アミノ酸配列がポリペプチドの最初
の７個のアミノ酸の１個以上の欠失を特徴とする請求項
５（ｃ）に記載の方法。 - 【請求項７】 前記アミノ酸配列がポリペプチドの最初
の７個のアミノ酸の全部の欠失を特徴とする請求項５
（ｃ）に記載の方法。 - 【請求項８】 前記アミノ酸配列が、ＳＧＨ−Δ７のア
ミノ酸配列：【数６】 である請求項５（ｃ）に記載の方法。 - 【請求項９】 動物における成長速度、体重増加速度お
よび産肉量を高める組成物であって、豚成長ホルモンの
成長促進性生物学的活性を示し、かつ （ａ）ｐＳＧＨ−９Ｄのアミノ酸配列： 【数７】 （ｂ）ｐＳＧＨ−（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ）のアミノ酸配列： 【数８】 （ｃ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列からのアミノ末
端欠失を特徴とするアミノ酸配列 （ｄ）（ａ）の豚成長ホルモンポリペプチドに比べて最
初の７個のアミノ酸の１個以上の欠失を特徴とするポリ
ペプチドのアミノ酸配列 （ｅ）（ａ）の豚成長ホルモンポリペプチドに比べて最
初の７個のアミノ酸の全部の欠失を特徴とするポリペプ
チドのアミノ酸配列 （ｆ）ＳＧＨ−Δ７のＤＮＡ配列によってコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列：【数９】 よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを特徴とする組成物。
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| GB8227493 | 1982-09-27 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| DD (1) | DD219505A5 (ja) |
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| IL (1) | IL69810A (ja) |
| MX (1) | MX164375B (ja) |
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| NZ (1) | NZ205675A (ja) |
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| CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
| US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
| CA1301094C (en) * | 1984-08-31 | 1992-05-19 | Helen Riaboff Whiteley | Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment |
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| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4786501A (en) * | 1985-07-15 | 1988-11-22 | International Minerals & Chemical Corp. | Cylindrical implants for the controlled release of growth hormones |
| JPH0771508B2 (ja) * | 1986-12-29 | 1995-08-02 | 東ソー株式会社 | ポリペプチド及びその製造方法 |
| KR920003663B1 (ko) * | 1986-12-31 | 1992-05-06 | 주식회사 럭키 | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 돼지 성장 호르몬의 제조방법 |
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-
1983
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-
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