JPH0321150B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の要約〕 α−型インターフエロン、その産生方法、α−
型ヒブリドインターフエロン、およびこれらα−
型インターフエロンを含有する処置組成物につき
開示する。また、本発明で用いるDNA配列は、
ひとインターフエロンの生物学的もしくは免疫学
的活性を示すポリペプチドをコードすることを特
徴とする。適当な宿主において、これらのDNA
配列および組替えDNA分子は、ひとインターフ
エロンの生物学的もしくは免疫学的活性を示す遺
伝子およびポリペプチドの生産および同定を可能
にすると共に、抗ウイルスおよび抗腫瘍もしくは
抗癌剤におけるその使用を可能にする。 本発明は、α−型インターフエロン、その産生
方法、α−型ヒブリドインターフエロンおよびこ
れらα−型インターフエロンを含有する処置組成
物に関するものである。本明細書中に開示する組
替えDNA分子は、ひと白血球インターフエロン
の免疫学学的もしくは生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードするDNA配列を特徴とする。
以下の記載から明らかなように、本発明のDNA
配列、組替えDNA分子およびその製造方法は、
抗ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤ならび
にその製造方法に有用なポリペプチドを製造する
のに使用することができる。本出願においては、
ネイチヤー誌第286巻、第2421頁（1980年７月10
日）に発表されたインターフエロンという名称を
使用する。この名称により、本出願の優先権とな
る原出願において使用された名称を置き換える。
たとえば、IFはここではIFNで表わされ、白血球
インターフエロンはここではIFN−αで表わされ
る。 インターフエロン（“IFN”）は２種類存存する
ことが知られている。種類Ｉのインターフエロン
は小さい酸安定性の（グリコ）−蛋白質であつて、
細胞をウイルス感染耐性にするものである〔エ
ー・イサークスおよびジエー・リンデンマン「ウ
イルス干渉。インターフエロン」、プロシーデ
イング・ロイヤル・ソサイエテイ・シリーズＢ、
第147巻、第258〜267頁（1957）およびダブリユ
ー・イー・スチユアート・、「ザ・インターフ
エロン・システム」、スプリンガー出版（1979）
（以下、「ザ・インターフエロン・システム」と云
う）〕。IFNは、或る程度、細胞特異性である
（ザ・インターフエロン・システム第135〜145頁）
が、ウイルス特異性でない。寧ろ、IFNは広範囲
のウイルスに対して細胞を保護する。 ひとインターフエロン（“HuIFN”）は３つの
群α，βおよびγに分類されている。HuIFN−
αすなわち白血球インターフエロンはひと白血球
中において、リンパ芽球細胞中の少量のHuIFN
−β（繊維芽細胞インターフエロン）と共に生産
される。HuIFN.αは均質になるまで精製されか
つ特性化されている〔たとえば、エム・ルーベン
スタイン等、「ひと白血球インターフエロン：生
産、均質までの精製および初期特性化」、プロシ
ーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
スUSA、第76巻、第640〜644頁（1979）〕。これ
は、恐らく炭水化物成分のため、寸法に関しては
不均質である。２種の成分が記載されており、そ
の一方は21000〜22000の分子量を有し、他方は
15000〜18000の分子量を有する。低分子量の方の
成分は非グリコシル化型を示すことが報告されて
いる。また、より小さいHuIFN−αの型が
HuIFN−α活性の大部分または全てを保持する
ことも報告されている〔ダブリユー・イー・スチ
ユアート・等、「ひと白血球インターフエロン
の生産および性質に対するグリコシル化抑制剤の
効果」、ビロロジー、第97巻、第473〜476頁
（1979）〕。リンパ芽球細胞からのHuIFN−αのア
ミノ酸配列の一部およびそのアミノ酸組成も報告
されている〔ケー・シー・ズーン等、「ひとリン
パ芽球細胞インターフエロンの主成分のアミノ末
端配列」、サイエンス、第207巻、第527〜528頁
（1980）ならびにエム・ハンカピラーおよびエ
ル・フード、私的通信（1980）〕。 さらに、HuIFN−αは幾つかの異なる型とし
て存在することも報告されている（たとえば、英
国特許出願第2037296A号）。これらの型は、構造
的におよび生理学的に互いに異なつていると思わ
れる。HuIFN−αのこれら型に関し、まだ認め
られた名称は採用されていない。したがつて、本
出願においては、各型を、一般的なHuIFN−α
の名称の後に数字を付して、すなわちHuIFN−
α1またはHuIFN−α3のように記載する。 HuIFN−αは、多くのひと蛋白質と同様に、
多形質である。したがつて、特定個人の細胞はよ
り一般的なHuIFN−α群内におけるHuIFN−α
種を生成することができ、或いはその群内におい
て生理学的には同じであるがその群とはもしくは
その一部である形態とは構造上僅かに異なる形態
を生成することができる。したがつて、HuIFN
−αの蛋白質構造は一般的には良く規定されてい
るが、特定個人はそれと僅かに異なるHuIFN−
αを生成することができ、この対立形質的変化は
恐らくHuIFN−αの種々の形態間における相違
ほど大きいものでない。 HuIFNは、通常、正常もしくは健全な細胞に
は検出されない（ザ・インターフエロン・システ
ム、第55〜57頁）。寧ろ、細胞をIFN誘発体に曝
す結果、蛋白質が生成される。IFN誘発体は一般
にウイルスであるが、性質上非ウイルス性のも
の、たとえば天然もしくは合成の二重鎖RNA、
細胞内微生物、微生物生成物および各種の化学薬
剤とすることもできる。ひと細胞をウイルス感染
耐性にすべく、これら非ウイルス性誘発体を利用
する多くの試みがなされている〔エス・バロンお
よびエフ・ジアンザニ編、テキサス・レポート・
オン・バイオロジー・アンド・メデイスン、第35
号（「テキサスレポート」）、第528〜540頁
（1977）〕。これらの試みは大して成功を収めてい
ない。寧ろ、現在では外来性HuIFNの使用が好
まれている。 ウイルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインタ
ーフエロン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾
つかの投与様式にて行なわれるいる〔ザ・インタ
ーフエロン・システム、第305〜321頁〕。たとえ
ば、インターフエロンは、経口的に或いは接種
（静脈内、筋肉内、鼻腟内、皮内および皮下）に
より、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤の形態で
効果的に投与されている。通常10⁴〜10⁷単位の投
与量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、患
者および処置すべき状態に依存する。たとえば、
ウイルス感染は通常数日間乃至２週間にわたり毎
日もしくは１日２回投与することにより処置さ
れ、腫瘍および癌は通常数ケ月乃至数年間にわた
り毎日または１日多数回投与することにより処置
される。勿論、或り患者に対し最も有効な治療
は、投与様式および投与量を選択するにあたり、
たとえば病気、従前の治療およびインターフエロ
ンに対する患者の反応など周知の因子を考慮する
担当医師により決定されねばならない。 抗ウイルス剤として、HuIFNは次の病気を処
置するために使用されている：呼吸器感染症（テ
キサスレポート、第486〜496頁）、単純疱疹性角
膜炎（テキサスレポート、第497〜500頁）、急性
出血性結膜炎（テキサスレポート、第501〜510
頁）、水痘性帯状疱疹（テキサスレポート、第511
〜515頁）、巨大ウイルス感染症（テキサスレポー
ト、第523〜527頁）、およびＢ型肝炎（テキサス
レポート、第516〜522頁）。ザ・インターフエロ
ン・システム、第307〜319頁も参照できる。しか
しながら、抗ウイルス剤としてのIFNの大規模な
使用は、従来入手し得るよりも多量のIFNを必要
とする。 HuIFNは、その抗ウイルス作用に加えて、他
の効果をも有する。たとえば、これはコロニー刺
戟因子の効果に拮抗し、造血性コロニー形成細胞
の成長を抑制し、かつまた顆粒状および大食球先
駆体の正常分化を阻害する（テキサスレポート、
第343〜340頁）。さらに、これはDMSO処理され
たフレンド白血病細胞における赤血球分化を抑制
する（テキサスレポート、第420〜428頁）。また、
HuIFNは、免疫反応の調整に役割を演ずる。抗
原に対する施用の量と時間とに応じて、HuIFN
−αは生体内および試験管内において免疫促進的
にも或いは免疫抑制的にもなりうる（テキサスレ
ポート、第357〜369頁）。さらに、特異的に感染
されたリンパ芽細胞は、抗原に接触すると、
HuIFNのαを生成することが観察された。した
がつて、この種の抗原誘発されたHuIFN−αは
免疫反応の調節体となり、循環抗原レベルと細胞
免疫性の発現との両者に作用することができる
（テキサスレポート、第370〜374頁）。さらに、
HuIFNはキラーリンパ球の活性および抗体依存
性の細胞媒介される細胞毒性を高めることも知ら
れている〔アール・アール・ハーバーマン等、
「ひと天然および抗体依存性細胞媒介細胞毒性の
インターフエロンによる促進」、ネイチヤー誌、
第277巻、第221〜223頁（1979）；ピー・ビバリー
およびデイー・ナイト、「死亡は自然に起こる」、
ネイチヤー誌、第278巻、第119〜120頁（1979）；
テキサスレポート、第375〜380頁〕。これらの両
種類は恐らく、腫瘍細胞に対する免疫学的攻撃に
含まれる。 したがつて、ひと抗ウイルス剤としての使用に
加え、HuIFNは抗腫瘍および抗癌治療において
有力な用途を有する（ザ・インターフエロン・シ
ステム、第319〜321頁）。現存、IFNは多くの動
物における多くの種類の腫瘍の成長に影響を与え
ることが知られている（ザ・インターフエロン・
システム、第292〜304頁）。それらは、他の抗腫
瘍剤と同様、小腫瘍に対して使用された場合、特
に効果的であると思われる。動物IFNの抗腫瘍効
果は投与量と時間とに左右されるが、これは毒性
レベル以下の濃度で示されたものである。したが
つて、IFNの抗腫瘍および抗癌性につき多くの研
究および臨床試験が過去に行なわれ、現在も行な
われ続けている。これらには、たとえば骨肉腫、
急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およびホジキン
ス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包含され
る（テキサスレポート、第429〜435頁）。さらに、
HuIFNは、黒腫症および胸部癌に侵された患者
における皮下腫瘍結節に注射すると、局部腫瘍退
化をもたらすことが最近示された〔テイー・ネモ
ト等、「黒腫症および脚部癌のひとインターフエ
ロンおよび内部治療」、アメリカン・アソシエー
シヨン・フオー・カンサー・リサーチ、アブスト
ラクト、第994号、第246頁（1979）〕。これら臨床
試験の結果は好ましいものであつたが、INFの抗
腫瘍および抗癌用途は、精製IFNの充分な供給が
得られないため、著しく妨げられている。 今日、HuIFN−αは、組織培養で増植させた
ひと細胞を介して、或いは供血者から集めたひと
白血球を介して生産される。2.6×10⁹IUの粗製
HuIFN−αが800の倍養ナマルバ（Namalva）
細胞から得られることが報告されている（ピー・
ジエー・ブリツジエン等、上記）。極めて大きな
血液センター、たとえばフインランド国ヘルシン
キ在のフインランド赤十字センターでは、その生
産能力は年間約10¹¹IUの粗製HuIFN−αである。
投与量は典型的には１患者当り毎日３×10⁶IUで
あるから、これら供給源はHuIFN−αの必要市
販量をまかなうには不充分である。したがつて、
他の方法によるHuIFN−αの生産が望まれる。
IFN−αの比活性は高く、4.0×10⁸〜10⁹IU／mg
の程度であるため、一般用途に必要とされる
HuIFN−αの量は小なくなる。たとえば、100g
の純HuIFN−αは３〜30×100万回の投与量をま
かなうであろう。 分子生物学における最近の進歩により、特異性
の非細菌性成熟核蛋白質をコード化するDNAを
細菌細胞中に導入することが可能となつた。一般
に、化学合成により製造されたもの以外のDNA
によれば、この種の組替えDNA分子の製造は、
所望蛋白質に対する精製メツセンジヤ−RNA
（mRNM）雛型の単一鎖DNAコピー（cDNA）
を生成させ、このcDNAを二重鎖DNAに変え、
このDNAを適当なクローン化ベヒクルにおける
適当な部位に結合させて組替えDNA分子を形成
させかつこの組替えDNA分子により適当な宿主
を形質転換させるという過程からなつている。こ
のような形質転換は、宿主が所望蛋白質を生産す
るのを可能にする。 数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、大腸菌
（イー・コリ）において組替えDNA技術を用いて
得られている。これらには、ラツテプロインシユ
リン抗原決定因子を示す蛋白質〔エル・ビラ−カ
マロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌ク
ローン」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカ
デミー・サイエンス・USA、第75巻、第3727〜
3731頁（1978）〕、ラツテ成長ホルモン〔ピー・エ
ツチ・シーブルグ等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネイチヤー誌、第276巻、第795〜798頁
（1978）〕、ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ〔エ
ー・シー・ワイ・チヤング等、「ねずみシヒドロ
葉酸レダクターゼを暗号化するDNA配列の、大
瘍菌（イー・コリ）における発現型」、ネイチヤ
ー誌、第275巻、第617〜624頁（1978）〕、ひとソ
マトスタチン〔ケー・イタクラ等、「ソマトスタ
チンホルモンに対する化学合成遺伝子の大腸菌に
おける発現」、サイエンス誌、第198巻、第1056〜
1063頁（1977）、およびヨーロツパ特許出願第
0001929号、第0001930号および第0001931号なら
びに他国における対応出願〕、ひとインシユリン
のＡおよびＢポリペプチド鎖〔デイー・ヴイー・
ゲデル等、「ひとインシユリンに対する化学合成
遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第76巻、第106〜110頁（1979）、ならびに
ヨーロツパおよび関連特許出願明細書（上記）〕、
ひとＢ型肝炎ウイルスの抗原〔シー・ジエー・バ
レル等、「プラスミドpBR322においてクローン
化されたＢ型肝炎ウイルスDNA配列：大腸菌に
おける発現」、ネイチヤー誌、第279巻、第43〜47
頁（1979）ならびにエム・パセク等、「Ｂ型肝炎
ウイルス遺伝子および大腸菌における発現」、ネ
イチヤー誌、第282巻、第575〜579頁（1979）〕、
ひと成長ホルモン（デイー・ヴイー・ゲデル等、
「ひと成長ホルモンをコードするDNA配列の大腸
菌における直接的発現」、ネイチヤー誌、第281
巻、第544〜551頁（1979）〕、SV40t抗原（テイ
ー・エム・ロバーツ等、「大腸菌における猿ウイ
ルス40t抗原の合成」、プロシーデイング・ナシヨ
ナル・アカデミー・サイエンス・USA、第76巻、
第5596〜5600頁（1979）〕、ならびにひと繊維芽細
胞インターフエロン（HuIFN−β）〔テイー・タ
ニグチ等、ひと繊維芽細胞インターフエロン遺伝
子配列を含有する細菌プラスミドの製造および同
定」、プロシーデイング・ジヤパン・アカデミー、
第55巻Ｂ号、第464〜469頁（1979）および私的通
信（1980）〕が包含される。 しかしながら、これら組替えDNA法のいずれ
も、本発明におけるように、HuIFN−αの合成
に向けられていない。これが、本発明の目標とす
る課題である。この解決は、合成遺伝子（たとえ
ばソマトスタチン）を調製するのに必要とされる
配列情報を入手することによる、或いは特定
DNA配列の豊富な細胞型もしはウイルス（たと
えば肝炎ウイルス抗原）または所望ヒブリド
DNAを含有する細菌クローンの調製および同定
を可能にするmRNA種（たとえばラツテインシ
ユリン）を入手することによる、或いは所望蛋白
質（たとえばねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ）
を発現する大腸菌宿主の選択を可能にする系を入
手することによる上記の組替えDNA系における
ようには簡単でない。さらに、卵母細胞において
HuIFN−β活性（たとえば、繊維芽細胞インタ
ーフエロン）をもたらすmRNAにポリ（Ａ）
RANからヒブリド化するようなDNA配列を含有
すると云われるプラスミドの報告は、何ら役に立
たない。また、本発明の解決法は、純粋もしくは
ほぼ純粋なHuIFN−αmRNAをHuIFN−α遺伝
子のクローン化前に調製するために研究報告第
18309号、第361〜362頁（1979）における示唆と
は異なる目的を有する。 最後に、DNA配列の選択または卵母細胞にお
いてHuIFN活性をもたらすようなmRNAにポリ
（Ａ）RANからヒブリド化する組替えDNA分子
の調製は、DNA配列または組替えDNA分子のヒ
ブリド挿入物がHuIFNに相当することを示すに
は充分でないことを認めるべきである。寧ろ、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドの生成によつてのみ、選択DNA配
列もしくは構成組替えDNA分子がHuIFNに相当
することが実際に示される。さらに重要なこと
は、HuIFN作用の後にのみDNA配列、組替え
DNA分子またはそれに関連する配列を用いて本
発明のHuIFNに対応する他の配列を選択しうる
ことが示される点である。 したがつて、組替えDNA技術を使用して
HuIFN−αを生産する問題は上記した方法のい
ずれとも極めて異なることが、上記から判るであ
ろう。ここでは、未知構造の特定DNA配列（適
当な宿主においてHuIFN−αの発現をコードす
る）を、極めて複雑なDNA配列の混合物におい
て見出しかつそこから分離してこれをHuIFN−
αの生産に使用する。さらに、この位置決定およ
び分離の問題は、複合混合物において所望DNA
配列の著しい低濃度が予想されること、および所
望配列を選択しかつ分離するため混合物の多くの
DNA配列を迅速分析する有効手段がないことに
より悪化される。 本発明は、適当な宿主においてHuIFN−αの
発現をコードするDNA配列を決定しかつ分離し
それによりDNA配列と、組替えDNA分子と、宿
主を形質転換させてひと白血球インターフエロン
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプ
チドを生産する方法とを提供することにより、上
記の問題を解決する。 本発明により、抗ウイルス剤、抗腫瘍または抗
癌剤および方法に使用するための、HuIFN−α
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプ
チドを得ることができる。本発明は、従来不可能
であつた量および方法でこれらポリペプチドの生
産を可能にする。 以下の開示から判るように、本発明のDNA配
列および組替えDNA分子は、HuIFN−αの免疫
学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
の、適当な宿主における生産を方向付けることが
できる。適当な宿主におけるこれらDNA配列と
組替えDNA分子との複製は、これらポリペプチ
ドをコードする遺伝子を多量に生産することを可
能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分
子構造および性質は、容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主で生産さ
れたまま或いは適当な誘導化もしくは改変の後、
組成物中におよびこれら生成物自身の生産を検知
かつ改善する方法に使用することができ、かつ抗
ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤および方
法に使用することができる。 したがつて、この方法は、上記の従来方法とは
異なり、DNA配列とHuIFN−αの免疫学的もし
くは生物学的活性を示す少なくとも一種のポリペ
プチドをコードする適当なDNA配列を含んだ組
替えDNA分子との調製および選択を含む点にお
いて、上記従来方法と区別できる。 上記から判るように、本発明の基本的局面は、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドをコードすることを特徴としかつＺ
−pBR322（Pst）／HcIF−4c、Ｚ−pBR322
（Pst）／HcIF−2h、Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF
−SN35、Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN42、
Ｚ−pKT287（Pst）／HcIF−2h−AH6のDNA挿
入物と、これらDNA挿入物のいずれかにヒブリ
ド化するDNA配列と、これらDNA配列もしくは
挿入物のいずれかに対し単一もしくは多重のベー
ス置換、欠失、挿入および転位を含め突然変異に
関連して得られる天然、合成もしくは半合成の供
給源を包含するあらゆる供給源からのDNA配列
と、前記DNA配列および挿入物のいずれかのコ
ドンの発現においてコードされるポリペプチドに
類似した免疫学的もしくは生物学的活性を発現に
おいてコードするコドンの配列からなるDNA配
列とよりなる群から選択されるDNA配列を提供
することであり、これらの配列は宿主においてイ
ンターフエロンおよびインターフエロン様ポリペ
プチドの生産を可能にする。 ここに記載した本発明をより充分に理解するた
め、以下詳細に説明する。 本明細書中において、次の用語を使用する。 ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩
と含窒素複素環塩基とからなるDNAもしくは
RNAの単量体単位。塩基は、グリコシド炭素
（ペントースの1′炭素）を介して糖成分に結合さ
れる。塩基と糖との結合体はヌクレオシドと呼ば
れる。各ヌクレオチドはその塩基を特徴とする。
４種のDNA塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン
（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン（“Ｔ”
）
である。４種のRNA塩基はA.G.Cおよびウラシ
ル（“Ｕ”）である。 DNA配列：隣接ペントースの3′炭素と5′炭素
との間のホスホジエステル結合により互いに結合
されたヌクレオチドの線状列。 コドン：mRNAを介してアミノ酸と翻訳開始
信号と翻訳終了信号とをコードする３種のヌクレ
オチド（トリプレツト）のDNA配列。たとえば
ヌクレオチドトリプレツトTTA、TTG、CTT、
CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（Leu”）をコードし、TAG、TAAおよびTGAは
翻訳停止信号であり、ATGは翻訳開始信号であ
る。 解続枠：アミノ酸配列までmRNAを翻訳する
際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切な解続
枠を維持せねばならない。たとえば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つの解続枠（すなわち
相）において翻訳することができ、その各々は異
なるアミノ酸配列 GCT GGT TGT AAG−−Ala−Gly−Cys−
Lys Ｇ CTG、GTT、GTA、AG−−Leu−Val
−Val GC TGG TTG、TAA Ｇ−−Trp−Leu−
（停止）を与える。 ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ
基とカルボキシル基との間のペプチド結合により
互いに結合されたアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNA。こ
れは、特に物質のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよび
リボソーム結合ならびにたとえばシヤイン−ダル
ガーノ配列のような配列を含めて相互作用配列を
包含する。 構造遺伝子：雛型もしくはメツセンジヤー
RNA（“mRNA”）を介して、特定ポリペプチド
に特徴的なアミノ酸配列をコードするDNA配列。 転写：構造遺伝子からmRNAを生成する過程。 翻訳：mRNAからポリペプチドを生成する過
程。 発現：ポリペプチドを生成するため構造遺伝子
により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合
せである。 プラスミド：完全「レプリコン」からなる非ク
ロモソーム二重鎖DNA配列であり、これにより
プラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミ
ドを単細胞微生物に入れると、その生物の特性が
プラスミドのDNA挿入の結果として変化または
形質転換する。たとえば、テトラサイクリン耐性
（Tet^R）についての遺伝子を担持するプラスミド
は従前テトラサイクリンに感受性であつた細胞を
それに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラ
スミドにより形質転換された細胞を「形質転換
体）」と呼ぶ。 フアージまたはバクテリオフアージ：細菌性ウ
イルスであり、その多くは蛋白質エンベロプもし
くは被覆（「カプシド」）中にカプセル化された
DNA配列からなつている。 クローン化ベヒクル（cloning vehicle）：宿主
細胞中で複製しうるプラスミド、フアージDNA
またはその他のDNA配列であり、これは１個ま
たは小数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴と
し、この部位においてこのDNA配列はDNAの本
質的な生物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋
白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、また
この部位は形質転換細胞の同定（たとえばテトラ
サイクリン耐性またはアンピシリン耐性）に使用
するのに適する標識を有する。クローン化ベヒク
ルはしばしばベクター（Vector）と呼ばれる。 クローン化：微生物またはDNA配列の増殖を
得る過程であつて、無性増殖によりこの種の１種
の微生物または配列から得られる。 組替えDNA分子すなわちヒブリドDNA：生体
細胞の外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞に
感染してそこに維持される能力を有する、異なる
ゲノムからのDNA断片よりなる分子。 発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合
これら遺伝子の発現を制御および調整するヌクレ
オチドの配列。それらには、ac系、trp系、フ
アージλの主要オペレータおよびプロモータ領
域、fdコード蛋白質の制御領域ならびに原核もし
くは真核細胞およびウイルスの遺伝子の発現を制
御することが知られたその他の配列が包含され
る。 IFN−α型のポリペプチドすなわちα型インタ
ーフエロン：ひと白血球インターフエロンの免疫
学的または生物学的活性を有するポリペプチド 第１図について述べれば、これは組替えDNA
分子の混合物の製造方法における一実施態様の概
略図であり、ここで組替えDNA分子の幾つかは
ひと白血球インターフエロンの免疫学的もしくは
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする
挿入DNA配列を特徴とする。 ひとインターフ
エロンmRNA（IFN−αmRNA）を含有するポリ
（Ａ）RNAの製造 センダイ（Sendai）ウイルスを用いてひと白
血球を37℃で５時間誘発させ、次いで抽出してひ
と白血球インターフエロンmRNA（“HuIFN−
αmRNA”）を含有するポリ（Ａ）RNA混合物を
得た。誘発はカンテル法によつて行なわれた
〔ザ・インターフエロン・システム、第130〜131
頁およびそこに挙げられた引用文献〕。ポリ（Ａ）
RNA混合物を、その実際の割合とは無関係に第
１図に示す。誘発白血球を収穫し、10¹¹個の細胞
を水１中NaCl8gとKCl0.2gとNa₂HPO₄・
2H₂O1.15ｇとKH₂PO₄0.2gとを溶解含有する溶液
（“PBP”）１に再懸濁させ、これを激しく撹拌
しながら50分液濾斗中の20mMトリスーHCl
（PH7.5）とImM EDTA（“TE緩衝液”）と２％ド
デシル硫酸ナトリウム（“SDS”）の17に加え
た。自己消化したプロナーゼ（カルビオケム社）
を200μg／mlまで加え、そしてこの溶液を室温で
１時間撹拌した。10⁶カウント／分（“cpm”）の
1¹²⁵−グロビンmRNAを、ポリ（Ａ）RNAを回
収しかつ次工程におけるmRNA分解を管理する
ための標識として加えた。全容量の1/20に等しい
量（“1/20容量”）の2Mトリス−HCl（PH９）を加
え、そして混合物を15の再蒸留フエノールによ
り激しく撹拌しながら10分間抽出した。３のク
ロロホルムを加えて混合物を５分間撹拌した。30
分間相分離させた後、水相を除去して再びフエノ
ールとクロロホルムとで抽出した。得られた水相
は全部で19.1であり、これを60gのSDSと合し
た。この水相から、1/10容量の3M酢酸ナトリウ
ム（PH5.5）と２容量のエタノールとによつて核
酸を沈澱させた。 −20℃で一晩保存した後、プラスチツク製篩を
通しての濾過により繊維状の核酸沈澱を取出し
た。次いでこの物質を、0.5％SDSを含有する200
mlのTNE〔50mMトリス−HCI（PH7.5）、100mM
NaCl、5mM EDTA〕と共に撹拌した。次いで
これを、さらにこの溶液350mlの添加により溶解
させた。非繊維状沈澱を、ソルバールRC−３型
遠心分離器において１ソルバール瓶中に
5000rpmにて15分間遠心分離することにより集
め、0.5％SDSを含有するTNE350ml中に溶解さ
せた。２つのTNE溶液を合し、そして１容量の
フエノールで３回、1/2容量のエーテルで３回お
よび１容量のエーテルで３回それぞれ抽出した。
水相からのRNA回収は、260nmでの吸光度によ
り測定して全部で775mgであつた。 ポリ（Ａ）RNA混合物の単離は、オリゴ
（dT）セルロース（タイプ７、Ｐ−Ｌビオケミカ
ル社）に対する反復バツチ吸着により行なつた。
2.7gのオリゴ（dT）セルロースを、500mlすなわ
ち上記のRNA含有溶液の約半量に加えた。室温
で１時間撹拌してポリ（Ａ）RNAをオリゴ
（dT）セルロースに吸着させた後、セルロースと
これに結合されたmRNAの混合物とを遠心分離
によつて集め、50mlのTNEで１回、次いで15ml
のTNEで１回洗浄した。次いで、結合したポリ
（Ａ）RNAを、H₂O2mlでの５回連続洗浄によつ
て溶出させた。収量は、光学密度で測定してポリ
（Ａ）RNA860μgであつた（調製物Ａ）。第一吸
着から得た上澄RNA溶液を、正確に上記と同様
にしてさらに２回の吸着サイクルにかけた。第二
および第三吸着は、それぞれ600μgおよび170μg
のRNAを与え、これらを合した（調整物Ｂ）。 RNAをクセノプス・レビス（Xenopus
laevis）の卵母細胞に注入してHuIFN−
αmRNAにつき分析した（ザ・インターフエロ
ン・システム、第93〜95頁）。RNAを15mMトリ
ス−HCl（PH7.5）、88mM NaCl（“TNK緩衝液”）
に溶解させて約１mg／mlの濃度を得た。この溶液
50nを各50個の卵母細胞中に注入した。これら
卵母細胞をバース（Barth）培地において室温で
一晩培養した〔ゴードン、ジヤーナル・エムブリ
オール・アンド・エキスペリメンタル・モーホロ
ジー、第20巻、第401〜414頁（1968）および同第
７巻、第210〜222頁（1959）。次いで、培養卵母
細胞を洗浄し、パツスールピペツトを用い1.5ml
エツペンドルフ遠心分離管中で0.5mlの52mMト
リスグリシン緩衝液（PH8.9）中においてホモジ
ナイズした。混合物をエツペンドルフ遠心分離器
にて２分間遠心分離し、上澄液を抜き取りそして
−20℃で凍結させて分析した。IFN−α活性はプ
ラーク減少分析によつて測定した〔エツチ・スト
ランダーおよびケー・カンテル｛試験管中におけ
るひと白血球によるインターフエロンの生産」、
Ann.Med.exp.Fenn.第44巻、第265〜273頁
（1966）〕。１単位のIFN−αはウイルスプラーク
を50％減少させる。IFN−α調製物の活性は、ひ
と基準HuIFN−α69／19に関して表わす〔インタ
ーフエロンおよびインターフエロン誘発剤の基準
化に関する国際シンポジユウム、1969〕。代案と
して、分析は主として次の文献に記載された細胞
病理学的効果の減少に基づいて行ない〔ダブリユ
ー・イー．スチユアート・およびエス・イー・
スルキン、「ラビースウイルスを実験的に感染さ
せたハムスターにおけるインターフエロン生産」、
プロシーデイング・ソサイエテイ・エキスペリメ
ンタル・バイオロジカル・メデイスン、第123巻、
第650〜653頁（1966）〕、ただしこの場合ひと
CCL−23細胞を使用しかつメンゴウイルスを用
いて実験した。卵母細胞抽出物は、注入RNAの
1μg当り300IUのIFN−α活性を有した。後者の
分析においては、注入卵母細胞の培養を48時間行
ない、大部分のインターフエロンが卵母細胞によ
り分泌されるため、培養倍地のみを分析した〔エ
ー・コールマンおよびジエー・モルサー、「キセ
ノプス・レビスの卵母細胞からの蛋白質の分泌」、
セル誌、第17巻、第517〜526頁（1979）〕。ポリ
（Ａ）RNAをさらに精製するため、充分量の
0.5Mエチレンジアミンテトラ酢酸（“EDTA”）
をポリ（Ａ）RNA調製物Ａに加えて濃度を5mM
EDTAにした。得られた溶液を等容量のTNE−
飽和フエノールで２回および等容量のエーテルで
５回抽出した。次いで、これを0.1mlのチエレツ
クス−100ビオーラドカラム（Chelex−100Bio−
Rad column）に通し、100℃にて90秒間加熱し、
そして50mMトリス−HCl（PH7.5）と1mM
EDTAと0.2M NaClとを含有する13mlの５〜23
％蔗糖濃度勾配に曝した。制限酵素Hindと
PstIとによりpBR322を同時切断して生成させた
5′−末端P³²ラベルしたDNA断片（ニユーイング
ランドビオラブス社）の10000cpmをサイズ標識
として加えた。SW40型ロータで10℃かつ
35000rpmにて16時間遠心分離した。フラクシヨ
ン（0.6mlづつ）をISCOグラジエントコレクター
により１ml／min.の速度で集めた。これらのフ
ラツクシヨンを上記したように、HuIFN−
αmRNAにつき分析し、P³²−DNA標識に対する
それらの位置を、後の参考のため記録した。後の
遠心分離において、HuIFN−αmRNA含有フラ
クシヨンを標識と比較して同定した。HuIFN−
αmRNA活性を有するフラクシヨンは80μgのポ
リ（Ａ）RNAを含有した。これらを、0.5％SDS
および0.02％ポリビニルサルフエート（後の調製
においてはポリビニルサルフエートを省略した）
を含有する２容量のTNEと混合し、50μのオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに加えた。上記した
ようにカラムを洗浄した後、RNA混合物40μgを
0.6mlの無菌蒸留水で４回洗浄して溶出させた。
エタノール沈澱させた後、RNAを0.5mMの
EDTA中に１mg／mlとなるよう溶解させた。 HuIFN−αmRNA活性の分析を、上記したよ
うに、ポリ（Ａ）RNA沈澱の一部について行な
つた。これは、注入RNA1μg当り3600IUのイン
ターフエロンの比活性を有した。したがつて、庶
糖濃度勾配は、ポリ（Ａ）RNAをHuIFN−
αmRNAに関し約10倍濃化させた。次の同様な調
製において、約40倍の濃化が得られた。調製物Ｂ
を同様に精製し、そしてこれは調製物Ａと同様な
比活性を有したので、両者をプールした。 この時点において、庶糖濃度勾配処理から得ら
れたポリ（Ａ）RNA生成物でさえ極めて多数の
異なるmRNAを含有することを認めるべきであ
る。IFN−αに対して特異的なmRNAを除き、
他のmRNAは望ましくない汚染物である（第１
図）。不都合なことに、これら汚染RNAは、本発
明の残余のクローン化過程全体においてHuIFN
−αmRNAと同様に挙動する。したがつて、ポリ
（Ａ）RNA中にそれらが存在すると、IFN−α以
外のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する
多数の望ましくない細菌クローンの最終的調製物
が生ずる。この汚染は、所望のIFN−αヒブリド
クローンの単離において複雑な選別問題を提起す
る。IFN−αの場合、この選別問題は、所望クロ
ーンを固定するための選別比較試料として作用す
るHuIFN−αmRNAまたはDNAもしくはその一
部の精製試料が充分存在しないためさらに悪化す
る。したがつて、IFN−αクローンの選別過程は
極めて時間がかかりかつ困難となる。さらに、極
めて少割合のIFN−αクローンしか生物学的活性
型または免疫学的活性型においてIFN−αを発現
することが期待されないので、活性クローンの単
離はわら山から針を探すような選別過程になる。 有利なことに、本発明は組替えDNA技術を用
いて、HuIFN−αmRNAまたはcDNAもしくは
その一部の精製試料得ることができる。この精製
mRAまたはcDNAを使用して極めて多数の細菌
クローンを迅速に選別しかつそれにより活性型で
IFN−αを発現するクローンを単離する確率が著
しく増大する。 HuIFN−αcDNAを含有するcDNA混合物の合
成 IFN−αmRNAが濃化されたポリ（Ａ）RNA
調製物（Ａ＋Ｂ）わ雛型として使用して、単一鎖
の相補DNA（cDNA）を調製した（第１図）〔エ
ー・エフストラチアジス等、「グリビンおよびコ
リオンmRNAの全体的および個々の部分的な逆
転写」、セル誌、第４巻、第367〜378頁（1975）
およびそこに引用されている文献〕。800μの反
応混合物は40mMのトリス−HCl（PH7.5）と、
30mMのNaClと、5mMのMgCl₂と、0.5mMの
DTT（カルビオケム社）と、20μg／mlのオリゴ
（dT）12〜18（Ｐ＆Ｌビオケミカルス社）と、
5mMのdGTP（シユワルツ社）、dCTP（レボサン
社）およびdTTP（シグマ社）と、5mMのP³²−
dATP（NEN、比活性100000cpm／ｎモル）と、
60μg／mlのポリ（Ａ）RNAと、280単位の鳥類
骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素〔フロ
リダ州セントピータースブルグ在ライフサイエン
ス社から寄贈〕とを含有した。37℃で１時間培養
した後、0.5MのEDTAと20％のSDS（再結晶した
もの）を10mMのEDTAおよび0.1％のSDSまで
加えた。この混合物を１容量のフエノール（蒸留
物）で抽出した。フエノール相を200μの
200mMトリス−HCl（PH7.5）と1mM EDTAと
0.1％SDSとで洗浄し、水相を合した。これらを
等容量のエーテル（フルカ社、プロアナル）で抽
出し、TNE中５mlのセフアデツクスＧ−100カラ
ムにてクロマトグラフにかけた。0.1mlづつのフ
ラクシヨンを0.3ml／min.の速度で集めた。放射
能（セレンコフ放射線により測定）を示すフラク
シヨンを合し、3Mの酢酸ナトリウムを0.3Mまで
加えた。この核酸を2.5容量のエタノールで沈澱
させた。−20℃で一晩保存した後、試料を遠心分
離しそして上澄液を捨てた。この沈澱を180μ
の蒸留水中に溶解させ、シリコーンライニングし
たエツペンドルフ管に移した。20μの5M
NaOHを加え、混合物を室温で40分間保つた。
20μの5M酢酸ナトリウムと100μの蒸留水と
500μのエタノールとを加えた。−20℃にて一晩
冷却した後、生じた沈澱を重力の10000倍
（10000xg）に相当する力で０℃にて20分間遠心
分離することにより、回収した。単一鎖cDNAの
収量は10μgであつた。 ここでも、上記のように調製した単一鎖cDNA
生成物は実際的に、ポリ（Ａ）RNA混合物中に
存在する対応のmRNAから転写された多数の異
なるcDNAの複合混合物であるとを理解すべきで
ある（第１図）。これらcDNAのうち極めて少量
のみがIFN−α関連性、すなわちHuIFN−
αcDNAである。他の要因も作用してcDNA混合
物を複雑化させ、ポリ（Ａ）RNA混合物の各
mRNA種は通常完全には転写されない。寧ろ、
各mRNA種に関し、転写過程はmRNAの末端に
達する前に停止することがある。したがつて、各
mRNA種から多種類のcDNAが生成されうる
（第１図に示さず）。各種類は後のクローン化過程
において多かれ少なかれ同様に挙動し、したがつ
て特定蛋白質に関する遺伝子の断片のみを有する
組替えDNA分子を含有した細菌クローンが生産
されるであろう。これ断片含有クローンの存在
は、さらに最終的なクローン選別過程を複雑化さ
せる。 各種の単一鎖cDNAの寸法は、少量をアルカリ
性２％アガロースゲル上に、電解質として30mM
のNaOHと2mMのEDTAとを使用して電気泳動
させることにより測定した〔エム・ダブリユー・
マクドネル等、「T7DNAの制限断片の分析なら
びに中性およびアルカリ性ゲルにおける電気泳動
による分子量の測定」、ジヤーナル・モレキユラ
ー・バイオロジー、第110巻、第119〜146頁
（1977）〕。P³²−cDNAは、サイズ標識として使用
した単一鎖グロビンcDNAおよびP³²−標識した
DNA断片に比べ、600〜1000ヌクレオチドの長さ
を有した。 二重鎖cDNAの調製 単一鎖cDNAは、DNAポリメラーゼＩで処理
して二重鎖にすることができる〔テイー・マニア
チス等、「試験管中で合成したβ−グロブビン遺
伝子の拡大および特性化」、セル誌、第８巻、第
163〜182頁（1976）〕。上記からの沈澱した単一鎖
cDNAを200αのH₂O中に溶解させ、100℃にて
２分間加熱し、そして500μの0.1M熱変性隣酸
カリウム緩衝液（PH6.9）と10mMのMgCl₂と
10mMのDTT（カルビオケム社）と各1mMの
dATP（メルク社）、dGTP（シユワルツ社）およ
びdCTP（レボサン社）とlmMのH³−dTTP
（NEN、比活性100000cpm／ｎモル）と150単
位／mlのイー・コリDNAポリメラーゼｌ（ベーリ
ンガー・マンハイム社）とにおいて培養した。15
℃にて6.5時間の後、0.5MのEDTAと20％のSDS
を10mMのEDTAおよび0.1％のSDSまで加えた。
次いで混合物を500μlのフエノールで抽出し、フ
エノール相を250μの20mMトリス−HCl（PH
7.5）と5mM EDTA（“TE緩衝液”）とで再抽出
した。２つの水相を合し、前記したと同じ条件下
で５mlのセフアデツクスＧ−100カラム上でクロ
マトグラフにかけた。酢酸ナトリウム（3M）を
0.3Mまで加え、2.5容量のエタノールを混合して
DNAを沈澱させた。全部で13μgのDNAが回収
された。 DNAをヌクレアーゼS₁で処理した〔このヌク
レアーゼS₁は、アール・シー・ビーガンド等、
「アスベルギルス・オリゼーからのS₁ヌクレアー
ゼの特異性」、ジヤーナル・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第250巻、第8848〜8855頁（1975）
の方法により調製した〕。沈澱したDNAを250μ
のS₁緩衝液（0.2MのNaCl、50mMの酢酸ナト
リウム（PH4.5）、10mMの硫酸亜鉛）に溶解さ
せ、37℃にて30分間加温した。1.5μのS₁酵素
（11単位／μ）を加え、混合物を37℃で30分間
培養した。SDSとEDTAとを0.1％SDSおよび
5mM EDTAまで加え、そして混合物を250μ
のフエノールで抽出した。フエノール相を100μ
のTE緩衝液で洗浄した。水相を合し、TNEに
おいてセフアデツクスＧ−100（フアーマシア社）
カラム上でクロマトグラフにかけ、0.1mlづつの
フラクシヨンを0.3ml／min.の速度で集めそして
各フラクシヨンのセレンコフ放射線を測定した。
上記したようにエタノールと酢酸ナトリウムとで
沈澱させた後、8μgの二重鎖cDNAを回収した。 ここでも、上記で生産した二重鎖cDNAは多数
のcDNAとその断片との混合物であり、その極く
少数のみがHuIFN−αcDNAもしくはその断片で
あることを認めねばならない（第１図）。 二重鎖DNAのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクルの組合せ物
を使用して、上記のように調製された二重鎖
cDNAをクローン化させた。たとえば、有用なク
ローン化ベヒクルは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、たとえば各種公知の細菌プラ
スミド、たとえばcolEl、pCRl、ｐ（RlBR322お
よびそれらの誘導体を含む大腸菌（イー・コリ）
からのプラスミド、広範囲の宿主のプラスミド、
たとえばRP4、フアージDNA、たとえばフアー
ジλの多数の誘導体、たとえばNM989、ならび
にプラスミドとフアージDNAとの組合せから生
じたベクター、たとえばフアージDNAもしくは
他の発現制御配列を用いて改変させたプラスミド
または酵母プラスミド、たとえば2μプラスミド
もしくはその誘導体から構成することができる。
有用な宿主は細菌宿主、たとえば大腸菌の菌株、
たとえばイー・コリHB101、イー・コリX1776、
イー・コリX2282、イー・コリMRCIおよびシユ
ードモナス（Pseudomonas）、枯草菌（Bacillus
subtilis）、高熱菌（Bacillus
stearothermophilus）およびその他バチルスの菌
株、酵母およびその他の真菌類、動物もしくは植
物宿主、たとえば動物（人間を含む）もしくは培
養した植物細胞またはその他の宿主を包含する。
勿論、必ずしも全ての宿主／ベクター組合せ物が
同等に有効ではない。宿主／クローン化ベヒクル
組合せの特定の選択は、示した原理を適当に考慮
して当業者により、本発明の範囲を逸脱すること
なく行なうことができる。 さらに、各特定クローン化ベヒクル内におい
て、種々の部位を選択して二重鎖DNAを挿入す
ることもできる。これらの部位は通常、これらを
切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名する
ことができる。たとえば、pBR322においてPstI
部位は、β−ラクタマーゼ用の遺伝子において、
その蛋白質のアミノ酸181および182をコードする
ヌクレオチドトリプレツトの間に位置する。この
部位は、ラツテのプロインシユリン抗原決定因子
を示す蛋白質の合成において、ピラーカマロフ等
（上記）によつて用いられた。２つのHindエン
ドヌクレアーゼ認識部位の一方はアミノ酸101お
よび102をコードするトリツプレツトの間に存在
し、また数個のTaq部位の一つはpBR322におけ
るβ−ラクタマーゼのアミノ酸45をコードするト
リツプレツトに存在する。同様に、このプラスミ
ドにおけるEcoRI部位およびPvu部位は、コー
ド化域の外部に存在し、EcoRI部位はそれぞれテ
トラサイクリンおよびアンピシリン耐性をコード
する遺伝子の間に位置する。この部位は、イタク
ラ等およびゲデル等により、組替え合成法（上
記）において使用された。これらの部位は当業者
により充分認識されている。勿論、本発明に有用
なクローン化ベヒクルは、選択DNAを挿入する
ために制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要
のないことを理解すべきである。寧ろ、ベヒクル
は別の手段により断片に結合させうるであろう。 ベクター、すなわちクローン化ベヒクル、特に
選択DNA断片を結合させて組替えDNA分子を生
成させるためそこに選択される部位は、種々の要
因たとえば特定制限酵素に対し感受性部位の数、
発現すべき蛋白質の大きさ、宿主細胞酵素により
蛋白質分解を受ける所望蛋白質の感受性、精製の
際除去困難な宿主細胞蛋白質より発現すべき蛋白
質の汚染、たとえばベクター配列に関する開始お
よび停止コドンの位置のような発現特性ならびに
当業者により認められるその他の要因のような各
種の要因により決定される。ベクターおよび特定
遺伝子用の挿入部位は、これら要因のバランスに
より決定され、必らずしも全ての選択が一定の場
合に対し同等に有効であるとは限らない。 外来DNAをクローン化ベヒクルすなわちベク
ター中に挿入して組替えDNA分子を生成させる
には幾つかの方法が当分野で知られているが、本
発明による第一の構成に好ましい方法はピラーカ
マロフ等（上記）により記載され、第１図に示さ
れている。この方法は、プラスミド（特に
pBR322）を挿入用に選択された部位（特にPstI）
に特異的な制限酵素により切断し、そしてdGMP
末端を末端トランスフエラーゼにより末端付加さ
せることを特徴とする。dGMP末端は切断プラス
ミドの5′末端に付加されて、PstI部位を再生する
と共に、相補的末端を有するcDNA断片への結合
を可能にする。同様に、二重鎖cDNAは、dCMP
末端を処理プラスミドに対する結合を可能にする
3′末端に付加させて伸長される。次いで処理プラ
スミドとcDNAとをアニールして、プラスミドの
適当な部位にcDNAを挿入すると共にヒブリド
DNAを環化させ、末端の相補的性質はそれらの
凝集を可能にする（第１図）。かくして、生じた
組替えDNA分子は、選択制限部位に遺伝子を有
する（第１図）。 勿論、DNA配列をクローン化ベヒクル中に挿
入して組替えDNA分子を生成させるその他の公
知方法も、同等に本発明において有用である。こ
れらは、たとえば直接的結合、合成リンカー、エ
キソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反
応に続く結合、或いはDNAポリメラーゼと適当
な単一鎖雛型とによるDNA鎖の伸長に続く結合
を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択位置に挿入さ
れたヌクレオチド配列またはcDNA断片は、所望
ポリペプチド用の実際の構造遺伝子の一部でない
ヌクレオチドも包含することができ、或いは所望
蛋白質用の完全構造遺伝子の断片のみも包含する
ことができることを了解すべきである。何らかの
DNA配列が挿入されて形質転換した宿主が
HuIFN−αの生物学的もしくは免疫学的活性を
有するポリペプチドを生産すること、或いは
HuIFN−αの免疫学的もしくは生物学的活性を
有するポリペプチドの生産に有用なDNA配列を
含んだクローンを選択するためDNA配列自身が
ヒブリド化試料として使用できるのみが必要とさ
れる。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルすな
わちベクターを使用して、ヒブリドDNAにより
コードされる蛋白質またはその一部を宿主が発現
しうるようこの宿主を形質転換させる。適当な宿
主の選択も、当分野で知られた多くの要因により
管理される。これら要因には、たとえば選択ベク
ターとの適合性、ヒブリドプラスミドによりコー
ドされる蛋白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易
さ、発現特性、生物安全性および価格が包含され
る。これら要因をバランスさせるには、必らずし
も全ての宿主が特定の組替えDNA分子を発現す
るのに同等に有効でないと云う理解を考慮せねば
ならない。 この合成において、好適な初期クローン化ベヒ
クルは細菌性プラスミドpBR322であり、好適な
初期制限エンドヌクレアーゼ部位はPstI部位であ
る（第１図）。このプラスミドは、抗生物質アン
ピシリン（Amp）およびテトラサイクリン
（Tet）に対する耐性遺伝子を有する小型（分子
量約2.6メガダルトン）のプラスミドである。プ
ラスミドは完全に特性化されている「エフ・ボリ
バール等、「新規クローン化ベヒクルの構成お
よび特性化。多目的クローン化システム」、ジー
ン誌、第95〜113頁（1977）；ジエー・ジー・サツ
トクリツフ、「DNA配列から生ずるpBR322制限
地図。4361ヌクレオチド対の長さまでの正確な
DNAサイズ標識」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第５巻、第2721〜2728頁（1978）〕。この
部位におけるDNA生産物の挿入は多数の細菌ク
ローンを与え、その各々は予め調製されたDNA
生産物に存在するDNA遺伝子もしくはその断片
の一つを含有する。ここでも、これらのクローン
の極く少数のみがIFN−αもしくはその断片用の
遺伝子を含有する（第１図）。本発明における初
期クローン化用の好適宿主はイー・コリHB101
である。イー・コリX1776を用いて他の実験を行
なつたが、この宿主は英国特許第1516458号に記
載されており、アメリカ合衆国、メリーランド州
ロツクビル在のアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（ATCC）に寄託され、ATCC
番号第31244号が付与されている。 １ PstI−開裂され、dGMP−伸長された
pBR322の調製 プラスミドpBR322（20μg）を21単位のPstIエ
ンドヌクレアーゼ（MREポートンダウンス社ま
たはニユーイングランド・ビオラブス社）によ
り、150μの10mMトリス−HC1（PH7.5）と
6mMのMgCl₂と50mMのNaClと6mMの２−メ
チカプトエタノールと200mg／μの牛血清アル
ブミン（“BSA”）（カルビオケム社）との中で切
断した。37℃にて２時間の後、混合物を１容量の
フエノール−クロロホルム（１：１）と１容量の
エーテルとで抽出しそしてエタノールにより沈澱
させた。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ（TdT）〔エフ・ジエー・ボルム、「子牛胸腺
からのデオキシヌクレオチド重合酵素」、メソツ
ド・イン・エンチモロジー（エル・グロスマンお
よびケー・モルデーブ編）、アカデミツク・プレ
ス社、ニユーヨーク、第128巻、第591〜611頁
（1968）により精製〕により重独重合dGMP末端
の付加（第１図）を、100mMのカコジル酸ナト
リウム（PH7.2）と10mMのNaH₂PO₄と5mMの
MgCl₂と1mMのdGTPと50μg／μのBSAと３
〜６単位のTdT（上記のように精製）とを
DNA1μg当りに含有する328μの反応容量にて
行なつた。培養を37℃にて20分間行なつた。
EDTAを10mMまで加えそして混合物を上記のよ
うに抽出し、TNE緩衝液に対し２日間透析した。
２ dCMP伸長させたDNAの調製 二重鎖DNAを標準法（たとえば、ビラーカマ
ロフ等、上記）によりdCMP残基で伸長させた。
上記の二重鎖cDNA150ngを、100mMのカコジル
酸ナトリウム（PH7.2）と2.5mMのCoCl₂と
50μg／μのBSAとDNA1μg当り３〜６単位の
精製TdTを含む0.1mMのdCTPとの8μ中で27
℃にて８分間培養し、次いで−20℃にて凍結させ
た、前記と同様、dCMP伸長させたDNAは種々
異なる種類の混合物であり、そのうち極く少数の
みがIFN関連性であつた（第１図）。 ３ Ca⁺⁺処理されたイー・コリX1776の調製 イー・コリX1776の単一コロニーを、100μg／
mlのジアミノピメリン酸（コツホライト・ラボラ
トリース社）と10μg／mlのナリジキシン酸（カ
ルビオケム社）と10μg／mlのテトラサイクリン
（アクロマイシン 、アメリカンシアナミド社）
とが加えられた100mlのトリプトン搭地中に接種
した〔シー・ワイスマンおよびダブリユー・ボ
ル、「組替えプラスミドDNAの調製における起こ
りうる害の減少」、ネイチヤー誌、第261巻、第
428〜429頁（1976）〕。培養物を、650nm（OD650）
にて0.6の見掛け光学密度（ベツクマンDB型分光
光度計にて測定）まで37℃にて生育させ、氷中で
30分間冷却させた。次いで、培養物をソルバール
H4型スウイングバケツトロータにて4000rpmで
沈降させ、細胞を50mlの10mM NaClで洗浄し、
遠心分離によつて分離除去しそして20mlの
100mM CaCl₂中に再懸濁させた、懸濁物を氷中
で30分間冷却し、遠心分離により粒状化させて４
mlの100mM CCl₂中に再懸濁させ、そして氷上で
一晩放置した後使用した。形質転換用としてイ
ー・コリHB101をエム・マンデルおよびエー・
ヒガの方法（〔カルシウム依存性バクテリオフア
ージDNA感染」、ジヤーナル・モレキユラー・バ
イオロジー、第53巻、第159〜162頁（1970）〕に
より調製した。一部（0.5ml）を−70℃で凍結状
態に保ち、少なくとも３ケ月間その活性を保持し
た。 ４ dGMP伸長されたpBR322およびdCMP伸長
されたDNAのアニール化 末端PstI−開裂pBR322と末端cDNAとのアニ
ール化を文献〔ジエー・フアン・デン・ベルグ
等、「２つの同族対のイントロンの強力な多様性
を示すクローン化された兎とねずみとのβ−グロ
ビン遺伝子の比較」、ネイチヤー誌、第276巻、第
37〜44頁（1978）〕に記載されているように行な
つた。8ngのdCMP伸長されたDNA生成物を
22ngのdGMP伸長されたPstI−開裂pBR322と、
TNE緩衝液50μ中で混合した。培養を65℃、46
℃、37℃および20℃にて順次に４段階で１時間づ
つ行なつた。100mMのトリス−HC1（PH7.5）と
100mMのCaCl₂と100mMのMgCl₂と50μの
TNE緩衝液とを含有する20μを加えそして混合
物を氷中で20分間冷却した。 勿論、生成物は種々異なる組替えDNA分子と、
挿入DNA配列のない若干のクローン化ベヒクル
との混合物である。しかしながら、各組替え
DNA分子はPstI部位にcDNA断片を含有する。
この種のcDNAの各々は遺伝子またはその断片か
らなることができる。cDNA断片の極く少数のみ
がIFNまたはその部分をコードする（第１図）。
大多数は他の蛋白質またはその部分の一種をコー
ドし、それらのmRNAは本発明の方法に使用さ
れるポリ（Ａ）RNAの一部であつた。 ５ アニールされたヒブリドプラスミドによるイ
ー・コリX1776の形質転換 組替えDNA分子の混合物によるイー・コリ
X1776の形質転換はジエー・フアン・デン・ベル
グ等（上記）により記載されているように行なつ
た。P3封鎖手段を用いて形質転換過程と全ての
次工程とを行ない、そこにおいて得られた形質転
換細菌を処理した。アニールしたpBR322組替え
DNA分子を100μの予め調製されたCa⁺⁺処理し
たイー・コリX1776に加え、混合物を氷中で20分
間冷却し、20℃にて10分間加熱し、そして0.6ml
のトリプトン倍地を加えた。混合物を、上記のよ
うに添加さた２枚のトリプトン倍地寒天板に接種
した。形質転換効率はアニールpBR322の1μg当
り3.3×10⁴個のコロニーであり、原pBR322は1μg
当り３×10⁶個のコロニーを与えた。 プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性に
関する遺伝子を含むので、その完全遺伝子を有す
るプラスミドで形質転換させたイー・コリ宿主
は、そのように形質転換させてない細菌を除き、
その抗生物質を含有する培養物において増殖する
であろう。したがつて、テトラサイクリン含有培
養物における増殖は、組替えDNA分子または再
使用ベクターにより形質転換させた宿主の選択を
可能にする。 37℃にて48時間の後、個々のコロニーを採取し
てこれらをミクロ測定板（ダイナテク社）の穴部
における100μのトリプトン倍地（上記のよう
に添加したもの）に懸濁させた。37℃にて一晩培
養した後、100μの40％グリセリンを各穴中に
混入した。測定板を−20℃に保存し、そして形質
転換イー・コリX1776の10000個の個々のクロー
ンを調製した。 これら100000個のクローンは、IFN生成性白血
球からのポリ（Ａ）RNA調製物においてmRNA
の混合物の完全もしくは部分的コピーを示す各種
の組替えDNA分子を含有する（第２図）。これら
の大多数は単一の組替えDNA分子のみを含有す
るであろう。これら組替えDNA分子の極く少数
のみがIFNに関連する。したがつて、クローンを
選別してIFN関連クローンを他のものから分離せ
ねばならない。 HuIFN−αCDNAを含有するクローン化の選
別 ひと白血球インターフエロンcDNA （“HuIFN−αcDNA”）を含有する細菌クロー
ンを選別するための幾つかの方法がある。これら
には、たとえばRNA選択ヒブリド化〔アルウイ
ン等、（下記）〕、差別ヒブリド化〔テイー．ピ
ー・セントジヨーンおよびアール・ダブリユー・
デービス、「差別プラークフイルターヒブリド化
によるサツカロミセス・セレビシエからのガラス
トース誘発DNA配列の単離」セル誌、第16巻、
第443〜452頁（1979）；ヘージメーカース等、下
記）、合成試料によるヒブリド化〔ビー・ノイエ
ス等、「オリゴデオキシヌクレオチド試料を使用
するガストリンmRNAの検出および部分的配列
分析」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデ
ミー・サイエンス・USA、第76巻、第1770〜
1774頁（1979）または免疫学分析（エル・ビラー
カマロフ等、上記）もしくは生物学的分析（エ
ー・シー・ワイ・チヤング等、上記）による所望
蛋白質を生成するクローンの選別が包含される。
本発明は、IFN−αcDNAを含有するクローンの
第一次選別のための最も便利かつ有望な方法とし
てRNA選択ヒブリド化を選択した。 Ａ RNA選択ヒブリド化分析 １ 初期分析の概要 次に第２図について述べれば、組替えDNAを、
上記クローン貯蔵物（第２図に示した２クローン
の２つの混合物）における512個のクローンの混
合物の培養物から単離した（工程Ａ）。このバツ
チサイズを選別する理選別する理由を以下に説明
する。組替えDNA分子を開裂させ、変性させそ
して前記したように調製したIFN−αmRNAを含
有する白血球ポリ（Ａ）RNAまでヒブリド化さ
せた（工程Ｂ）。全ての組替えDNA分子−ポリ
（Ａ）RNAヒブリドを非ヒブリド化ポリ（Ａ）
RNAから分離した（工程Ｃ）。ポリ（Ａ）RNA
をヒブリドから回収しかつ精製した（工程Ｄ）。
回収したRNAを上記のようにIFN−αmRNA活
性につき分析した（工程Ｅ）。もしも組替えDNA
分子の混合物が厳格なヒブリド化条件の下でポリ
（Ａ）RNA中のIFN−mRNAにヒブリド化しう
る挿入ヌクレオチド配列を持つた組替えDNA分
子を含有するならば、そのヒブリドから遊離され
たmRNAは卵母細胞中においてIFN−αの生成
をもたらすであろう。何故なら、その他の如何な
る組替えDNA分子−ポリ（Ａ）RNAヒブリドか
ら遊離されたmRNAもIFN−α関連性でないか
らである。512個のクローンの群が正の反応を示
せば、これらクローンを64個づつの８ロツトに再
組分けして、各ロツトにつき上記のように分析し
た。この処理を、この分析に応答する単一のクロ
ーンが同定されるまで続けた。 形質転換されかつこのように同定された組替え
DNA分子および細菌クローンがIFN−αの完全
なIFN−αcDNA配列を含有したり、或いはDNA
配列が実際にIFN−αをコードする保証はない。
しかしながら、組替えDNA分子はIFN−
αmRNAコード配列に相補的な広汎なヌクレオチ
ド配列を確実に含有する。したがつて、組替え
DNA分子は、他の組替えDNA分子およびそれに
より形質転換されたクローンを迅速選別するため
の試料の供給源として使用することにより、標準
的および完全なIFN−αヌクレオチドコード配列
を含有しうる別の群のクローンを同定することが
できる。 ２ 理論的考察 ヒブリド化（工程Ｂ）の条件は臨界的である。
組替えDNA分子とポリ（Ａ）RNAとの絶対濃度
および比は、反応速度と化学量論とを考慮して選
択せねばならない。適正な選択は、ポリ（Ａ）
RNAにおけるIFN−αmRNAの割合が未知であ
るため、困難である。制御されかつ充分な速度を
確保するため、組替えDNA分子からのDNA配列
の濃度が推定IFN−αmRNA濃度に比較して過剰
となる条件の下で行なつた。512個の可能な種々
異なる組替えDNA分子の混合物において、IFN
−α関連DNA配列（“IFN−αRDNA”）は全く
生じない（負の分析値を与える）か、或いは組替
えDNA分子の少なくとも約1/512を構成する。組
替えDNA分子混合物の濃度およびしたがつて
IFN−αRDNAの濃度をヒブリド化工程で調製し
て、充分なヒブリド化割合を確保することができ
る。さらに、反応混合物中のIFN−αRDNAの量
は、ポリ（Ａ）RNAからの充分な量のIFN−
αmRNAを結合して、組替えDNA分子−ポリ(A)
RNAヒブリドから回収されたmRNAを卵母細胞
に注入した後にIFN−αの検出を可能にするのに
足る量でなければならない。 用いうる分析によりIFN−αを検出するには、
その濃度は100IU／mlもしくはそれ以上にしなけ
ればならない。反復測定のためには0.5mlづつを
必要とするので、50IUを卵母細胞中に発生させ
るべきである。前記で使用した誘発白血球からの
ポリ（Ａ）RNAは、その1μgを卵母細胞中に注
入すると、約500IUのIFN−αを発生する。した
がつて、必要とする50IUを発生させるには、少
なくとも0.1μgのポリ（Ａ）RNAを注入せねばな
らない。兎グロビンmRNAと兎β−グロビン
cDNAクローンとを用いたモデル実験は、ヒブリ
ド化ミツクスに加えたI₁₂₅−グロビンmRNAに対
し卵母細胞中のI₁₂₅−グロビンmRNAの全回収率
が約10％であり、かつmRNA活性の回収率が約
５％であることを示した。したがつて、ヒブリド
化分析用には少なくとも0.1／0.05＝2μgの白血球
ポリ（Ａ）RNAを使用すべきである。充分安全
な限界を確保するには、１回の分析当り12μgの
ポリ（Ａ）RNAを使用した。 12μgのポリ（Ａ）RNA中のIFN−αmRNAを
結合させるには、組替えDNA分子からのどの程
度のDNAが必要とされるかを計算するため、ポ
リ（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含有量を推定し
た。1μgのポリ（Ａ）RNAは500IUのIFを発生さ
せる。IFN−αの比活性は２×10⁸〜10⁹IU／mg蛋
白質である。したがつて、500IUのIFN−αは
500／２×10⁸＝2.5×10^-6mg（2.5ng）〜500×／
10⁹＝５×10−⁷mg（0.5ng）のインターフエロン
に対応する。 卵母細胞中に注入したIFN−αmRNAの量と生
成されたIFN−αの量との間の関係は末知であ
る。β−グロビンmRNAの場合、mRNA1分子
当り約30分子の蛋白質が１時間当り生成され、こ
の値はβ−グロビンに対し約６である〔ジエー・
ビー・グルドン等、「注入フロツグ卵母細胞にお
ける伝達安定性：長寿命の哺乳動物およびβ−グ
ロビン伝達」、ジヤーナル・モレキユラー・バイ
オロジー、第80巻、第539〜551頁（1973）〕。IFN
−αに関し平均値が20であり、IFN−αに関し分
子量が18000でありかつIFN−αmRNAに関し分
子量が330000であると仮定すれば、26mg
（18000／330000×20×24）のIFN−αが注入IFN
−αmRNA1mg当りに24時間で生成される筈であ
る。もしIFN−αの比活性が２×10⁸／mg（２×
10²IU／ng）であるとすれば、1ngのIFN−
αmRNAは26×２×10²＝5.2×10³IUのIFN−α
を生成するであろう。比活性が10⁹／mg（10³IU／
ng）であるとすれば、生成するIFN−αの量は
2.6×10⁴IUとなるであろう。1μgの白血球ポリ
（Ａ）RNAは上記の仮定条件の下で500IUのIFN
−αを生成するので、1μgのポリ（Ａ）RNA中
のIFN−αmRNAの濃度は0.1ng〜0.02ngに低下
し、白血球ポリ（Ａ）RNAにおけるIFN−
αmRNAの割合は１：10000〜１：50000となるで
あろう。したがつて、12μgのポリ（Ａ）RNAは
約1.2ng〜0.2ngのIFN−αmRNAを含有する。 卵母細胞中のIFN−αmRNAの翻訳比がグロビ
ンmRNAに対する平均値よりも大きさの次数
（order of magnitude）だけ抵ければ、ポリ
（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含量は、上記計算値
よりも10倍高くなるか、或いは約１：1000〜１：
5000となるであろう。その場合、12μgのポリ
（Ａ）RNAは約12ng〜2ngのIFN−αmRNAを含
有するであろう。他方、卵母細胞中のIFN−
αmRNAの翻訳比がグロビンmRNAの平均値よ
りも大きさの次数だけ高ければ、ポリ（Ａ）
RNAのIFN−αmRNA含量は上記計算値よりも
10倍低くなるか、或いは約１：100000〜１：
500000となるであろう。その場合、12μgのポリ
（Ａ）RNAは0.1ng〜0.02ngのIFN−αmRNAを
含有するであろう。 プラスミドpBR322は4361b.p.を有する。IFN
−αmRNAの完全cDNAは、全部で約5200〜
5400b.p.となるようpBR322−IFN−αCDNAの生
成の際、pBR322に対し約800〜1000b.p.を付加す
るであろう。したがつて、その分子量はIFN−
αmRNA単独のそれの約12倍（２×5200／800）
となるであろう。したがつて、上記に計算した
IFN−αmRNAを結合して分析に必要な12μgの
ポリ（Ａ）RNA中に存在させるには、IFN−
αmRNAの量の12倍に等しい組替えDNA分子の
量が必要となるであろう（化学量論量）。 組替えDNA分子を調製するのに使用されるポ
リ（Ａ）RNAのIFN−αmRNA含量は粗ポリ
（Ａ）RNAのそれよりも10〜40倍増大したので、
512個のクローンの群は、上記から計算したより
も10〜40倍多い所望IFN−αmRNA含有のクロー
ンを有する筈である。 IFN−αmRNAが1000の粗ポリ（Ａ）RNAの
うち１部であれば、12μgのポリ（Ａ）RNAは
12ngのIFN−αmRNAを含有しかつ化学量論量
のIFN−αCDNAプラスミドは144ngである。512
個のクローンの群は少なくとも５個のIFN−
αCDNA挿入物を含有するので、必要とされる全
ヒブリドプラスミドDNAは14.8μg（144×512／５
×10^-3）である。IFN−αmRNAが10000のうち
１部であれば、12μgのポリ（Ａ）RNAは1.2ngの
IFN−αmRNAを含有しかつ必要とされるIFN−
αcDNAの量は14.4ngである。512個のクローンの
群は０もしくは１個のIFN−αCDNA挿入物を含
有し、したがつて必要とされる全ヒブリドプラス
ミドDNAの量は7.4μg（14.4×512×10^-3）である。
IFN−αmRNAが100000のうち１部であれば、必
要とされる全ヒブリドプラスミドDNAの量は
0.74μg（1.44×512×10^-3）である。ヒブリド化反
応がDNA過剰条件下（すなわち、ポリ（Ａ）
RNAに比較して過剰の組替えDNA）で進行する
よう確保するため、20μgの混合物（約1.4〜30倍
過剰）を分析用に選択した。 ヒブリド化は、(a)ポリ（Ａ）RNAのヒブリド
化された部分が完全かつ生物学的活性の型で回収
されること、(b)非特異的なDNA−mRNA結合が
防止されることおよび(c)ヒブリド化反応が少なく
とも75％完結まで進行することを確保するような
条件下で行なわねばならない。これらの条件は、
特に80％ホルムアミド、0.4MNaCl中におけるヒ
ブリド化により満たされると思われる〔ジエー・
カセイおよびエヌ・ダビドソン、「高濃度のホル
ムアミドにおけるRNA：DNAおよびDNA：
DNA複合体の生成速度および熱安定性」、ヌクレ
イツク・アシツド・リサーチ、第４巻、第1539〜
1552頁（1977）〕。この溶液において、ヒブリド化
は約40℃で行なうことができる（ホルムアミドを
省略すると、60〜70℃が必要とされる）。ポリ
（Ａ）RNAに対する損害を最小にするには、より
低温度が好適である。本発明は56℃のヒブリド化
温度を選択する。これはＴ1/2ｉより約３℃低く
〔ジエー・カセイおよびエヌ・ダビドソン、上記〕
かつＴ1/2ｄより約10〜13℃低い〔ハマグチおよ
びガイヅシエク、ジヤーナル・アメリカン・ケミ
カル・ソサイエテイ、第84巻、第1329頁〕。した
がつて、この温度は約87％以下のホモロジーをも
つて、配列をヒブリド化させない筈である。何故
なら、１％の差はＴ1/2ｄを１℃だけ低下させる
からである〔テイー・エフ・ボナー等、「配列多
様化によるDNA再結合の速度低下」、ジヤーナ
ル・モレキユラー・バイオロジー、第81巻、第
123〜135頁（1973）〕。 このヒブリド化において、DNAの自己ヒブリ
ド化は主たる問題でない。何故なら、使用される
DNAの混合物は同じベクター（pBR322）およ
び各種のcDNA挿入物よりなるからである。した
がつて、大抵のDNA配列はヘテロ複合体となり、
ここで挿入物はポリ（Ａ）RNAにヒブリド化さ
せるのに使用することができる。異なる複合体の
一部を形成する相補的cDNA挿入物は、トポロジ
ー的拘束により殆んど相互作用することがない。
いずれにせよ、DNA：DNA再結合は、使用反応
条件下で最小化される（ジエー・カセイおよびエ
ヌ・ダビドソン、上記）。 少なくとも75％反応を確保するのに必要とされ
るヒブリド化時間を決定するため、２次速度式を
使用した： ｔ＝lnCo−Ro＋Ro（１−Ｒ／Ro）／（１−Ｒ／Ro）Co／
K_R（Co−Ro）＝3.9h 〔式中、 Ｒ＝ヒブリド化RNAのヌクレオチドモル濃度、 Co＝ヒブリド化すべき初期DNAのヌクレオチド
モル濃度、 Ro＝ヒブリド化すべき初期RNAのヌクレオチド
モル濃度、 K_R＝RNA−DNAヒブリド化に関する速度恒数、 ｔ＝時間（秒）、 Ｒ／Ro＝0.75（75％反応完結）、 K_R＝472〔K_R＝１／12Kd（ジエー・カセイおよび
エヌ・ダビドソン、上記）であり、ここで Kd＝ヒブリド化の選択条件下におけるDNAの２
次速度恒数、かつ Kd＝1.7×10⁵×L1／２×N^-1〔ジエー・アール・
ハツトンおよびジエー・ジー・ウエトムア、「バ
クテリオフアージX174DNA−RNAヒブリドの
変性：RNA長さ効果および核化速度恒数」、ジヤ
ーナル・モレキユラー・バイオロジー、第77巻、
第495〜500頁（1973）〕、 Ｌ＝900〓ｂ・p.における鎖長；約900は完全IFN
−αCDNA挿入物中に存在する〕 Ｎ＝900〔ヒブリド鎖のb.p.における複合度；ここ
で複合度が900である理由は、IFN＝αmRNAの
900個のヌクレオチドがIFN−αcDNA挿入物の
900個の相補的ヌクレオチドと結合するからであ
る〕 Co＝2.5×10^-7〔分析に使用すべき予め測定された
20μgの組替えDNA分子を含有する40μの溶液
に基づいており、ここでもIFN−αcDNA挿入物
は組替えDNA分子の1/12でありかつ512個のクロ
ーンの少なくとも１個に生ずると仮定し、一つの
DNA塩基対の平均分子量として662を与える〕 Ro＝8.7×10^-8〔分析に使用すべき予め測定された
12μgのポリ（Ａ）RNAを含有する40μの溶液
に基づいており、ここでもポリ（Ａ）RNAは
１：10000部のIFN−αmRNAを含有すると仮定
し（大過剰のDNAを与えれば異なる比率はヒブ
リド化の割合に対し殆んど影響を与えない）かつ
RNAの１個のリボヌクレオチドの平均分子量と
して343を与える〕である】。 ３ 初期分析の実施 工程Ａ：組替えDNA分子混合物の調製および
開裂 所望数の細菌クローンを、上記のように添加さ
れたトリプトン培地寒天板の上に接種し、これは
機械用具を使用して各ミクロ測定穴から一部を寒
天板上に移して行なつた。37℃で培養した後、各
クローンは直径数mmのコロニーを形成した。全て
のコロニーを寒天板から洗い取つて保存し、これ
を接種物として使用して上記のように添加された
トリプトン培地１に三角フラスコ２中にて接
種した。この培養物を37℃にて約0.8の見掛け
OD₆₅₀（肉眼推定）まで振とうした。１容量の添
加トリプトン培地と170μg／mlまでのクロラムフ
エニコールを培養物に加え、これをさらに37℃に
て16時間振とうした。20mlのクロロホルムを加
え、培養物を37℃にてさらに10分間振とうするこ
とにより細菌を殺した（シー・ワイスマンおよび
ダブリユー・ボル、上記）。培養物をクロロホル
ムからデカントしそして細胞を6000rpmかつ４℃
にて15分間遠心分離（ソルバールGS3型ロータ）
して集めた。各１の調製物につき約１〜2gの
細胞が得られた。細胞を30mlの20mMトリス−
HCl（PH7.5）中に懸濁させ、5000rpmかつ４℃に
て20分間遠心分離し（ソルバールSW型ロータ）、
そして30mlの50mMトリス−HC1（PH7.5）中に再
懸濁させた。0.25容量のリゾチーム溶液〔50mM
トリス−HC1（PH7.5）中10mg／ml〕を加え、０℃
にて10分間冷却した後0.33容量（初期50mMトリ
ス−HC1培養物懸濁液の容量に対し）の0.5M
EDTA（PH8.0）を振とうなしに静かに混入させ
た。０℃でさらに10分間の後、1/16容量（初期容
量に対し）の２％トリトンＸ−100を加えた。60
分後、試料をソルバールSW型ロータにて
10000rpmかつ０℃で60分間遠心分離した。上澄
液を磁気撹拌機を備えたビーカー中に移し、3M
のNaOHを撹拌下に加えてPH12.5に到らしめた
〔ガラス電極と、オリオンリサーチ601型PH計とを
使用し、ベツクマンPH10炭酸塩緩衝液（No.3505）
にて較正し、20℃にて測定した〕。20℃にて10分
間撹拌した後、PHを8.5に調整した。さらに３分
間撹拌した後、1/9容量の5M NaClと１容量のフ
エノール（蒸留しかつ9.5M NaClで平衡化させ
たもの）とを加えて激しく撹拌を５分間続けた。
10000rpmかつ０℃にて10分間遠心分離（ソルバ
ールGSA型ロータ）して相分離させた。型１の
DNA（環状二重鎖DNA）を含有する上澄液を中
間相（単一鎖DNAを含有する）から注意して取
り出し、クロロホルムで３回抽出した（フエノー
ルは大部分がこの工程で除去された）。型１の
DNAフラクシヨンは、分析用に選択された512個
のクローンの一部を構成するような宿主細胞を形
質転換させるのに最初に使用した組替えDNA分
子（pBR322−cDNA挿入物）を含有するであろ
う。 パンクレアチンRNAアーゼＡ（５mg／ml、85℃
にて10分間予備加熱）を型１のDNAに20μg／ml
の濃度まで加え、混合物を37℃にて60分間培養し
た。1/5容量の5MNaClを加え、この混合物を30
％ポリエチレングリコール6000（ユニオンカーバ
イド社、120℃にて20分間オートクレーブにかけ
たもの）により最終濃度7.5％PEGまで調整した。
−10℃にて２〜16時間の後、沈澱を8000rpmかつ
０℃にて20分間ソルバールSW型ロータで遠心分
離して集め、0.075MのNaClと0.0075Mのクエン
酸ナトリウムとの中に吸光度20（260nmにて）ま
で溶解させ、そして0.5％SDSに調整した。この
溶液をプロナーゼ0.5mg／ml（20mg／mlにて37℃
で２時間自己消化させたもの）と共に37℃にて30
分間培養し、１容量の蒸留フエノールで３回およ
び１容量％のクロロホルムで２回抽出した。試料
（１mg／mlDNA溶液の２mlまで）を50mMトリス
−HCl（PH7.5）、1mM EDTA中の５〜23％庶糖濃度勾配にて、ベツ
クマンSW27型ロータにより21000rpmかつ15℃で
15時間遠心分離した。フラクシヨンを集めて
OD₂₆₀を測定した。DNA含有フラクシヨンを集
め、DNAを酢酸ナトリウムとエタノ−ルとによ
り沈澱させた。遠心分離により20〜100μgの型ｌ
のDNA混合物が回収された。 20μgの精製された型ｌのDNAを、150μの
10mMトリス−HC1（PH7.5）、6mM MgCl₂、
50mM NaCl、6mM2−メルカプトエタノール、
200μg／mlBSAもしくはゼラチン、および20単位
のHind（ニユーイングランド・ビオラブ社）
の中で切断した。このHind制限酵素はpBR322
成分内の部位において型ｌのDNAを開裂させる
（cDNA成分も開裂されるとは思われず、もしそ
うならば分析は実質的に影響を受けない筈であ
る）。37℃で２時間の後、一部（１％）を50mM
トリス−酢酸（PH7.8）、2mM EDTA中の１％ア
ガロースゲルにより50mAで１時間電気泳動して
分析し、切断が完結したかどうか確認した。切断
が未完結であれば、さらにHindを加えて培養
を２時間続けた。型ｌのDNAが完全に線状分子
まで変換されたら、プロナーゼ（カルビオケム
社）とEDTAとSDSとをそれぞれ0.5mg／ml、
10mMおよび0.5％となるまで加えた。37℃で30
分間の後、溶液を30μフエノール−クロロホル
ム（１：１）にて抽出した。有機相を50μの
20mMトリス−HCl（PH7.5）、1mM EDTAで洗浄
し、そして合した水相をエーテルで３回抽出し、
0.1mlチエレツクスカラムを通して濾過し、
EDTA−煮沸したパイレツクスチユーブに集め
て、1/10容量の3M酢酸ナトリウムと2.5容量のエ
タノールとにより再沈澱させた。−20℃にて一晩
静置した後、DNAを遠心分離により集めた。 工程Ｂ：ポリ（Ａ）RNAによるDNAのヒブリド
化 ２種のヒブリド化混合物を調製した。混合
物Ｉは、4μの10培濃度のヒブリド化緩衝液
（4M NaCl、0.1パイプス（PH6.4、１、４ピペラ
ジン−ジエタンスルホン酸、シグマ社）と、
50mMEDTAと、0.5μの約5ngのI¹²⁵−グロビン
mRNA（5000cpm）、6μの誘発白血球ポリ（Ａ）
RNA（2μg／μ）とを、卵母細胞中に注入した
場合、6000IUのIFNを発生するに足る量で含有
した。混合物は、10μの上記からのHindで
切断された型ＩのDNAと、0.1μgのPstI−切断さ
れたＺ−pBR322（H3）／RcβG−4.13（Hind部
位にβ−グロビン配列を含有するpBR322誘導
体）〔マンテイ等、「クローン化した兎β−グロビ
ン染色体DNAにより形質転換させたねずみＬ細
胞における兎β−グロビンmRNAの生産」、ネイ
チヤー誌、第281巻、第40〜46頁（1979）〕とを含
有した。混合物ＩにおけるI¹²⁵−グロビンmRNA
および混合物におけるβ−グロビンDNAは、
ヒブリド化分析に対する内部陽性比較として作用
する。両混合物を窒素ガス流中にて乾燥した。
40μの80％ホルムアミドを混合物の残部に加
え、溶液を100℃にて10分間変性させて、氷中に
て迅速に冷却した。変性溶液を使用して混合物Ｉ
の残部を溶解させ、得られた溶液を56℃にて４時
間培養した。 工程Ｃ：非ヒブリド化ポリ（Ａ）RNAからのヒ
ブリド化ポリ（Ａ）RNA−DNAの分離 １mlを冷0.9M NaClと0.09Mクエン酸ナトリウ
ムとホルムアアミド（100％）とで４％（容量で）
まで希釈した後、溶液をミリポアフイルター
（0.45μm孔径）にて0.5ml／min.の速度で濾過し、
フイルターを先ずRNA−DNAヒブリドを保持す
る能力について試験した。何故なら、製造業者か
ら得られたフイルターは必ずしも全てが同等に効
果的でないからである。 工程Ｄ：ヒブリド化ポリ（Ａ）RNAの精製 ポリ（Ａ）RNAヒブリドを付着した上記のフ
イルターを１mlの0.15M NaCl、0.015Mクエン酸
ナトリウム、0.5％SDSに37℃にて10分間浸漬し、
50mMトリス−HCl（PH7.5）、10mM MgCl₂、
2mM CaCl₂で洗浄しそして0.6mlの新たな緩衝液
中に入れた。5μのヨード酢酸処理したDNAア
ーゼ（５mg／ml）を添加した後〔エス・ビー・チ
ンメルマンおよびジー・サンデイーン、アナリテ
イカル・バイオケミストリー、第14巻、第269頁
（1966）、ピー・エー・プライス等、「牛膵臓デオ
キシリボヌクレアーゼの活性部位におけるヒスチ
ジン残基のアルキル化」、ジヤーナル・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第244巻、第924〜932頁
（1969）〕、フイルターを37℃にて10分間培養した。 フイルターを除去し、溶液を１容量のフエノー
ルと１容量のエーテルとで抽出しそして0.1mlチ
エレツクスカラムに通した。5μgのキヤリヤ
RNA（精製酵母RNA）を溶液に加え、RNAを酢
酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。
10000xgでの遠心分離により沈澱を集め、100μ
の1mM EDTA中に溶解させ、100℃にて90秒間
加熱し、TNEとSDSとを2xTNEおよび0.5％
SDSになるまで加えた。RNAを100μのオリゴ
（dT）セルロースカラムに吸着させ、0.3mlの蒸
留水で４回洗浄して溶出させ、酢酸ナトリウムと
エタノールとで沈澱させた。−20℃で16時間の後、
沈澱したRNAを遠心分離により分離し、2μの
TNK緩衝液中に溶解させた。 工程Ｅ：IFN−αmRNA活性の測定 上記からのポリ（Ａ）RNA溶液を40個の卵母
細胞中に注入した（卵母細胞１個当り約50n）。
卵母細胞を23℃にて24〜48時間培養し、ホモジナ
イズしそして遠心分離し（または培養培地を回収
し）、前記したようにIFN−αにつき分析した。 ４ 後分析：フイルター結合したDNAに対する
ヒブリド化 単一クローンからの組替えDNA分子の後分析
は大部分、DBMもしくはDPT紙結合したDNA
について行なつた。何故なら、分析条件はもはや
臨界的でなくかつ分析がより便利となるからであ
る。DPT紙はより低い誤差を与え、したがつて
優先的に使用した。DBM紙は文献〔ジエー・シ
ー・アルウイン等、「ジアゾベンジルオキシメチ
ル紙への移行によるアガロースゲルにおける特定
RNAの検出およびDNA試料によるヒブリド化の
方法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデ
ミー・サイエンス・USA、、第14巻、第5350〜
5354頁（1977）に記載されているように調製し
た。APT紙はビー・シード（ベルス・コミユー
ニケーシヨン）の方法により調製した：ワツトマ
ン540の紙片（20g）を70mlの0.5M NaOH、２
mg／ml NaBH₄および30mlの１，４−ブタンジ
オールジグリシジルエーテルの混合物と共に20℃
にて16時間撹拌した。次いで、この紙をアセトン
40ml中の２−アミノチオフエノール10mlの溶液に
移し、10時間撹拌した。紙をアセトン、0.1N
HCl、H₂O、0.1N HCl、H₂Oで徹底的に洗浄し
そして乾燥させた。APT紙を、ABM紙から
DBM紙への変換について記載されていると同様
に、DPT紙に対しジアゾ化させた〔アルウイン
等、上記〕。 DNA（15μgまで）を50mm²のジアゾ化ABM
（DBM）またはジアゾ化APT（DPT）紙に結合
させ〔ジエー・エツチ・ジエー、ヘイジメーカー
等、「トリパノソマ・ブルセイの表面グリコ蛋白
変種のためのメツセンジヤーRNAに相補的な
DNAを含有するプラスミドの単離」、ジーン誌、
印刷中（1980）〕、これを下記に示す。 ヒブリドプラスミドDNAをエンドヌクレアー
ゼPstIで切断し、１ml当り500μgのプロナーゼと
0.5％のSDSと10mMのEDTAとで37℃にて30分
間処理し、フエノールとエーテルとで抽出し、
0.1mlのチエレツクスカラムに通しそしてエタノ
ールで沈澱させた。熱変性したDNA（5μgまで、
少量のP³²−DNAをトレーサーとして加えた）を
１cm²のDBMもしくはDPT紙と共に200μの
25mM燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）中で０℃に
て一晩培養した。濾紙を、50mM燐酸カリウム緩
衝液（PH6.5）、１％グリシンにて室温で５分間３
回および99％再結晶化ホルムアミドで３回洗浄し
た。99％ホルムアミドと共に68℃にて２分間さら
に培養した後、50mM燐酸カリウム緩衝液（PH
6.5）中で20℃にて３回および0.4M NaOH中で
37℃にて10分間２回洗浄した。約40〜60％の放射
能がフイルター上に保持された。フイルターを、
１％グリシンを添加した予備ヒブリド化培地Ａ中
で38℃にて３時間培養し、この場合フイルター１
個当り330μを使用した。培地Ａは、50％ホル
ムアミドと、５×SSCと0.04％ポリビニルピロリ
ドンと0.04％フイコール（フアーマシア社）と
0.1％SDSと25μgポリ（Ａ）（ピー・アンド・エル
社）と100μg酵母RNA（BDH、フエノールで６回
抽出し、エタノールで沈澱させたもの）とを含有
する。フイルターを培地Ａ中で２回洗浄し、次い
で培地Ａ中にてパラフイン油の下で上記したよう
にポリ（Ａ）RNAにより（通常５〜8μg）38℃
にて16時間ヒブリド化させた。RNAは次のよう
にして付加させた。一枚の濡れたDNAフイルタ
ーを吸水させ、無菌ペトリ皿中に入れ、このフイ
ルター上に20〜40μのRNA溶液をピペツトで
載置し、第二のDNAフイルター（再現または比
較）をその上に載せ、そしてこのサンドイツチを
無菌パラフイン油で覆つた。ヒブリド化の後、フ
イルターを順次に培地Ａ（２回）、１×SSCと0.2
％SDSと1mM EDTAとを含有する溶液（それぞ
れ20℃で10分間３回）、培地Ａ（38℃で２時間）お
よび50％ホルムアミド、５×SSC、0.1％SDS（20
℃で10分間３回）で洗浄した。ヒブリド化した
RNAを、200μの10mMトリス−HCl（PH7.4）、
1mM EDTAおよび１％SDS中で100℃にて１分
間加熱することにより溶出させた、溶出工程を２
回反復し、溶出液を合し、そしてRNAを2μgの
酵母DNA（上記のように精製したもの）の添加の
後、エタノールにて沈澱させた。洗浄したペレツ
トを減圧乾燥し、3μのH₂O中に溶解させそし
て卵母細胞中に注入した。IFN−α活性を上記の
ように分析した。 ５ RNA選択ヒブリド化分析の結果 512個のクローンの８群（すなわち、群Ｔ、Ｙ、
Ｊ、Ｋ、・、Ｏ、εおよびπ）の分析は陰性であ
つた。512個のクローンの４群（すなわち、Ｉ、
δ、Ｎおよびλ）の分析は陽性であり、ただし同
一でなかつた。陽性分析は次のように記録され
る。：ポリ（Ａ）RNA−DNAヒブリドからの遊
離されたRNAにより生成されたIFN−αのIU／
ml〔Ｚ−pBR322（H3）／RcBG−4.13（上記）を
使用する比較ヒブリド化の分析）；ここで実験結
果が比較よりも高い分析値には下線を施こした。 群 IU／ml Ｉ＜60（＜60）；110（＜20）；＜110（＜110）；＜110
（＜110；＜35（＜35） δ20（＜20） N35（＜20）；＜110（＜110）；200（＜110） λ＜60（＜60）；60（＜20）；＜110（＜110）；＜110
（＜110） 群λを64個のクローンの８つのサブグループに
分割し、ヒブリド化させ、そして前記のように分
析した。サブグループは上記と同様に表わして、
次の結果を与えた： サブグループ IU／ml λ−＜35（＜35）；＜35（＜35） λ−130（＜30）；＜45（＜45） λ−225（＜35）；35（＜305；35（＜30）；600
（＜30）；＜20（＜20） λ−85（＜35）；＜25（＜25） λ−＜35（＜35） λ−＜35（＜35） λ−＜35（＜35） λ＜35（＜35） サブグループλ−を８個のクローンの８組に
分割し、ヒブリド化させそして分析した。 組 IU／ml λ−−１ ＜20（＜20）；＜20（60）；35（＜30） λ−−２ ＜35（＜35）；＜30（＜30）；150（＜
20）；600（＜35）；110（60） λ−−３ ＜25（＜25）；＜30（＜30） λ−−４ 30（＜30）；＜20（＜20）；＜20（60） λ−−５ 30（？）（＜35）；＜20（＜20）；＜
35（60） λ−６ ＜30（＜30）；＜20（＜20） λ−−７ ＜30（＜20） λ−−８ ＜30（＜20） 第一の陽性結果は組λ−−４により達成され
たので、この組の個々のコロニー（Ａ〜Ｈと云
う）をヒブリド化させかつ分析した。 λ−−４−Ｂ ＜35＊（＜35）；＜20（60） λ−−４−Ｃ 35（60）；60＊（＜35）；111＊
（＜11）；11＊（＜11）；20（＜20） ＊DBM紙をこの分析に使用した。 したがつて、クローンλ−−４−Ｃは、
IFN.αmRNAをヒブリド化しうる組替えDNA分
子を含有する。 このクローンにおける組替えDNA分子は次の
通りである：Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4C
（“Hif−4C”）およびこれを含有する細菌菌株：
イー・コリX1776（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
4C）（“イー・コリHif−4C”）。この名称は、組替
えDNA分子がチユーリツヒ（Ｚ）に起源しかつ
PstI部位にHIFN−αcDNA（“HcIF”）を含有す
るプラスミドpBR322であることを示し、特定の
組替えDNA分子はクローンλ−−４−Ｃ
（“4C”）に由来する。 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4Cの再クローン
化および特性化 形質転換細胞の第一次クローンはしばしば２種
以上の組替えDNA分子を含有するので、〔エフス
トラチアジス等、「クローン化DNAから決定され
た兎β−グロビンmRNAの第一次構造」、セル
誌、第10巻、第571〜585頁（1977）〕、Hif−4Cを
イー・コリX1776（Hif−4C）クローンから単離
して上記のように精製した。Hif−4Cおよび
pBR322の試料をPstIで切断し、１％アガロース
ゲル上での電気泳動による分析した。Hif−4Cは
２つのバンドを与え、１つはPst−開裂pBR322
の移動度を有し、他方は約320b.p.に相当する移
動度を有した。 イー・コリHB101を上記のように単離しHif−
4Cにより形質転換させた。テトラサイクリン耐
性かつ形質転換した細菌の６個のクローンを採取
し、小培養物を調製し、型ＩのDNAを精製しそ
してPstI開裂およびアガロースゲル電気泳動によ
り前記と同様に分析した。全ての試料は、Hif−
4Cと同一の開裂様式を示した。これらの再クロ
ーン化した組替えDNA分子の１つはＺ−
pBR322（Pst）／HcIF−4c（“Hif−4c”）と呼ば
れ、後の実験用に使用した。小文字“ｃ“は再ク
ローン化したDNA分子を意味する。 IFN−αmRNAにヒブリド化するHif−4cおよ
びそのcDNA挿入物の能力を測定するため、Hif
−4c（115μg）を125単位のPstIにより完結するま
で切断し、フエノールとクロロホルムとで抽出し
そして上記したようにエタノールで沈澱させた。
１部（10μg）を5′末端標識した（後の工程におけ
るトレーサーとして役立つ）が、これは100μ
の50mMトリス−HCl（PH7.5）中に１部を溶解さ
せ、これを0.1mlのチエレツクス100型カラムに通
しそしてこれを0.6単位の細菌性アルカリホスフ
アターゼにより65℃で１時間処理して行なつた。
10培濃度のTNE（40μ）を加え、この溶液を１
容量のフエノールで３回および１容量のクロロホ
ルムで３回抽出した。DNAを２容量のエタノー
ルで−20℃にて一晩沈澱させ、遠心分離によつて
回収した。さらに精製するため、0.5mlTNA中の
試料を0.25mlのDEAEセルロース（ワツトマン
DE52、２mlの150mM NaCl、50mMトリス−
HCl（PH7.5）、2mM EDTAにて予備洗浄）
（“NET−緩衝液”）に吸着させ、２mlのNET−
緩衝液で洗浄し、0.4mlの1.5M NaCl、20mMト
リス−HCl（PH7.5）、2mM EDTAにて溶出させ
そして上記のようなエタノールで沈澱させた。
DNAをγ−P³²−ATP（比活性約5000Ci／ミリモ
ル）およびポリヌクレオチドキナーゼと共に培養
し〔エー・エム・マクサムおよびダブリユー・ギ
ルバート、「DNAの新規な配列決定方法」、プロ
シーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンス・USA、第74巻、第560〜564頁（1977）〕、
そしてTNE中３mlのセフアデツクス−G50カラ
ムでクロマトグラフにかけて精製した。溶出させ
たフラクシヨンを集め、P³²−DNAを上記のよう
にエタノールで沈澱させた。収量は約10⁷dpmで
あつた。 未標識PstI−開裂Hif−4cDNA
（90μg）を上記からの６×10⁵dpmのP³²−標識
PstI−開裂Hif−4cDNAと混合し、50mMトリス
−酢酸緩衝液（PH7.8）中の10×20×0.7cmの２％
水平アガロースゲルに2.5cmスロツトにより通し
て電気泳動させた。Ｘ線フイルムをゲルに露出さ
せ、320bp断片の位置を決定した。放射能バンド
を有するゲル片（1.3×10⁵dpm）を切り取り、プ
ラスチツク製２ml注射器で圧砕し、ゲル容積の10
培量のNET緩衝液と共に撹拌することにより４
℃で一晩抽出した。DNAを0.1mlのヒドロキシア
パタイトカラム（１mlのNET緩衝液で予備洗浄）
に吸着させた。カラムを１mlの0.1M燐酸カリウ
ム緩衝液（PH7.5）で洗浄し、DNAを0.2mlの1M
燐酸カリウム緩衝液（PH7.5）で溶出させた。溶
出液を滅菌蒸留水で10培に希釈し、DNAを
DEAEに吸着させかつそこから溶出させそして上
記したようにエタノールで沈澱させた。この
DNAを“Hif−4c断片”と呼ぶ。 Hif−4c断片（120ng）をDPT紙（0.5×0.5cm）
に上記のようにして結合させた。比較としては、
120ngのβ−グロビンcDNA断片をヒブリドプラ
スミドＺ−pBR322（H3）RcβG−4.13からHind
により切断し〔エフ・マイヤー等、「ベクトル
からベクトルへの、AT結合したクローン化
DNAの転位」、エキスペリメンチア、第35巻、第
972頁（1979）；エヌ・マンテイ等、上記〕、そし
て同様に処理した。ポリ（Ａ）RNA（20μ）に
対する複製フイルターのヒブリド化と、フイルタ
ーの洗浄と、フイルターからのRNAの回収とは
上記と同様にして行なつた。卵母細胞中に注入し
た後、次のIFN−α活性が検出された。

【表】

【表】 かくして、Hif−4cはIFN−αmRNAにヒブリ
ド化しうる挿入物を含有する。 Hif−4c中の挿入物にクロスヒブリド化する組
替えDNA分子を含有する大腸菌のクローンの同
定 組替えDNA分子Hif−4cにおけるcDNA挿入物
は僅か約320b.p.であつたか、またはIFN−
αmRNAの第三の推定寸法であつたので、上記の
精製Hif−4c断片を試料として使用し、関連ヒブ
リドDNA挿入物を有する組替えDNA分子を含有
する細菌クローンを選別した。 上記したサブグループλ−を構成する64個の
細菌クローンをミリポア膜（直径８cm）上にスタ
ンプし、寒天板（ジアミノピメリン酸、ナリジキ
シン酸およびテトラサイクリンを上記のように添
加）上に載置しそして37℃で24時間培養した。フ
イルターを0.75ml液滴の0.5M NaOH上に載せ、
２〜３分間後に紙タオル上に移して過剰の液体を
除去し、工程を反復した。1Mトリス−HCI（PH
7.5）を用いてフイルターを中和し、上記と同様
にして1.5M NaCl−0.5Mトリス−HCl（PH7.4）
で洗浄し、そして風乾させた。フイルターを
0.3M NaCl中に浸漬し、風乾し、そして80℃に
て減圧下に２時間加熱した。 Hif−4c Pst断片（30ng）を、β−P³²−
dATPとα−P³²−dCTP（それぞれ、比活性
40Ci／ミリモル）とを用いてニツク翻訳〔エー・
ジエー・ジエフリーおよびアール・エー・フラブ
ベル、「兎β−グロビン遺伝子はコード配列中に
大きな挿入物を含有する」、セル誌、第12巻、第
1097〜1108頁（1977）によりP³²−標識した。λ
−コロニーを有するフイルターを４セツト〔ゼ
ツトは0.15M NaCl、30mMトリス−HCl（PH
8.0）、1mM EDTAである〕と0.1％（Ｗ／Ｖ）フ
イコールと、0.1％ポリビニルピロリジンと0.1％
（Ｗ／Ｖ）BSAと、0.5％SDSと200μg／ml変性断
片化鮭精子DNAとにおいて68℃で７時間予備ヒ
ブリド化させ、次いで４セツトと0.02％（Ｗ／
Ｖ）フイコールと0.02％ポリビニルピロリジンと
0.02％（Ｗ／Ｖ）BSAと0.5％SDSと200μg／ml変
性鮭精子DNAとにおいて２×10⁵cpmのP³²−標
識Hif−4c断片にて68℃で16時間ヒブリド化させ
た。このフイルターをセツト−0.5％SDSにより
室温で洗浄し、２セツト−0.5％SDSにて68℃で
５時間洗浄し、溶液を１回交換し、3mMトリズ
マベースにより室温で４時間洗浄し、溶液を１回
交換した。フイルターを乾燥した後、Ｘ線フイル
ムをスクリーンによりフイルターに80時間露出さ
せた。３つのコロニー、すなわちλ−−7D、
λ−−2Hおよびλ−−4Cは強力な陽性反応
を示し、そして２つのコロニー、すなわちλ−
−1Eおよびλ−−3Dは弱い反応を示した。 Hif−4c開連クローンから小培養物を調製し、
型ＩのDNAを精製し、PstIで開裂させそして上
記のようにアガロースゲル電気泳動により分析し
た。全ての型ＩのDNAは大きな断片（プラスミ
ドpBR322成分）と小さい断片（ヒブリド挿入
物）とを生じた。λ−−2Hからの組替えDNA
分子は、最大の挿入物、すなわち約900b.p.を遊
離した。この組替えDNA分子をＺ−pBR322
（Pst）／HcIF−2H（“Hif−2H”）と名付け、そ
の挿入物を“Hif−2H断片“）と名付ける。 Hif−2Hを、そのIFN−αmRNAを結合する能
力につき試験し、これは全て上記したように
DPT紙（4μg／100mm²）に結合させてポリ（Ａ）
RNA（0.3μg／μ）に16時間ヒブリド化させ、
そしてIFN−αmRNA活性を測定することにより
行なつた。

【表】 別の実験において、組替えDNA分子を含有す
るさらに一組の大腸菌クローンを調製し、標識
Hif−4c断片にヒブリド化するコロニーを同定し
た。長cDNA挿入物を有するプラスミドの高収量
を確保するため、白血球ポリ（Ａ）RNAから酵
素的に調製した二重鎖P³²−標識白血球cDNAの
１部を、ポリ（Ａ）RNAの遠心分離について記
載したと同じ手順で庶糖濃度勾配により遠心分離
して寸法的に分別した。600b.p.DNA断片もしく
はそれ以上に対応した沈降速度を有するCDNA
を含有するフラクシヨンを集め、エタノール沈澱
の後にcDNAを回収した。cDNAをdCMP残部に
より伸長させ、dGMP伸長したPstI開裂pBR322
にヒブリド化させそしてこのヒブリドDNAを使
用して前記のように大腸菌を形質転換させ、この
場合大腸菌としてイー・コリHB101を使用した。
細菌を直径８cmのミリポアフイルター上に分布さ
せ、トリプトン培地寒天板（10μg／mlのテトラ
サイクリンを含有する）の上に載置しその小コロ
ニーが出現するまで生育させた。新たな濡れたミ
リポアフイルターをコロニー保持フイルターの上
に押圧させ、剥離し、その面を上に向けて4.4％
グリセリン含有の寒天板の上に載置しそして小コ
ロニーが出現するまで培養することにより、複製
フイルターを調製した。このコロニー保持フイル
ターをさらにミリポアフイルターで覆い、−55℃
にて凍結させて貯蔵した（デイー・ハナハンおよ
びエム・メセルソン、「高密度プラスミド選別に
関する記録」、1978年９月私的通信〕。全部で約
5000個のコロニーを保持する15枚のフイルターを
調製した。各フイルターの一複製物を用いて、上
記したと正確に同様に、P³²−標識PstI−切断Hif
−4cDNA断片にヒブリド化させた。約185個の陽
性コロニーが放射能写真上で同定され、ミリポア
フイルター上で再クローン化させそしてヒブリド
化により再度同定した。最強のヒブリド化反応を
示す95個のクローンをＺ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN1乃至SN95と名付け、後の研究に使用
した。 勿論、HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活
性（下記）を示すポリペプチドを生産する能力が
Hif−2hに与えれているので、このHif−2hおよ
びその他のこれに関連するDNA配列、たとえば
Hif−4cをこのクローンン選別法に使用すること
ができ、さらに組替えDNA技術、合成、天然源
もしくはそれらの組合せから生ずるDNA配列を
含有する他のクローン、或いは単一もしくは多重
のベース置換、挿入、転位もしくは欠失を含む突
然変異により他のDNA配列を選別するよう上記
DNA配列のいずれかに関連するクローンおよび
HuIFNをコードするクローンについても全く同
様に使用できることが明らかである。したがつ
て、この種のDNA配列およびそれらの同定も本
発明の範囲内である（たとえば下記）。また、上
記DNA配列により選別されず、しかもそれらの
ヌクレオチド配列の結果、上記DNA配列の発現
によりコードされたポリペプチドを発現において
コードするようなDNA配列も本発明の範囲内で
ある。 Hif−2hDNA挿入物の他の特性化 上記したように組替えDNA分子Hif−2hは約
900b.p.の挿入物を含有し、ひと白血球インター
フエロンmRNAにヒブリド化する。下記の付加
的特性をさらに決定した。 １ ヒブリド抑制翻訳 mRNAをクローン化された相補的cDNAにヒ
ブリド化させれば、mRNAの翻訳は抑制される
が、ヒブリドの熱変性は翻訳可能なmRNAを遊
離する〔ビー・エム・パターソン等、「DNA−
mRNAヒブリド−抑制された無細胞翻訳による
構造遺伝子同定および地図化」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第74巻、第4370〜4374頁（1977）〕。2.2μg
のPstI−切断Hif−2hおよび比較として2μgの
Hind−切断Ｚ−pBR322（H3）／RcβG−4.13
（“RcβG”）を、10μlの80％（ｖ／ｖ）脱イオン化
ホルムアミド−20mMパイプス緩衝液（PH6.4）
において80℃で10分間変性させた。溶液をエツペ
ンドルフ管に加え、ここには予め白血球ポリ(A)
RNA（5μg）とNaCl（4μモル）とEDTA（10nモ
ル）とを乾燥させておいた。混合物をパラフイン
油層の下で48℃にて７時間加熱し、冷却しそして
200μlのH₂Oで希釈した。２つの試料を等部に分
割し、それぞれの一方を100℃にて30秒間加熱し
た。核酸をエタノールにより沈澱させ、3μlの
H₂O中に溶解させそして上記のように卵母細胞
中でIFN−αmRNA活性につき分析した。

【表】

【表】 したがつてHif−2hは、ポリ(A)RNAにヒブリ
ド化させると、ポリ(A)RNAにおけるIFN−
αmRNAの翻訳を抑制し、そしてヒブリドを変性
させるとIFN−αmRNAは再び翻訳可能になつ
た。この実験により、Hif−2hがIFN−αmRNA
に相補的な配列を含有することが確認される。 ２ 制限酵素開裂による分析ならびにヌクレオチ
ド／アミノ酸配列および制限地図の決定 各種制限酵素（ニユーイングランド・ビオラブ
社）によるHif−2hの切断を行ない、生じた生成
物をアガロースゲル電気泳動により分析した。下
線を施こした断片はpBR322およびHif−2hに対
し共通でない。

【表】 さらに、5′末端P³²−標識Pst切断Hif−2hを
数種の制限酵素で開裂させ、組替えDNA分子中
のcDNA挿入物から生じた放射性断片の寸法を測
定した。 制限酵素 P³²−断片＊ EcoR 676、209 Hind 開裂せず Bsp 799、86 Hpa 開裂せず Hha 開裂せず BamH 開裂せず Hinf 210、62 Bgl 545、340 ＊ 内部的に一致しているが、これら断片の絶対
寸法は第８〜１０図を参照して最も良く示され
る。 これらのデータから、Hif−2hの制限地図を推
定した（第４図）。この地図は部位の絶対位置に
関し決定的でなく、挿入物内のMbo部位に関
し不完全であろう。挿入物に最も近い部位のみが
pBR322成分内に示されている。矢印はIFN−
αcDNAコードストランド方向性を示している。 本発明のクローンにおけるHif−2h断片もしく
はその他挿入物の実際的構造またはそれからコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列もしくは構
造は本発明を実施する上で当業者に必要とされな
いが、上記データおよび制限地図を本願出願時に
おける断片構造に関し最も良く利用しうる情報と
して本出願中に含ませる。爾来、期待されるよう
に（上記）、Hif−2h断片に関するこれらデータ
および制限地図は、ヌクレオチド配列決定および
制限分析の周知技術を用いて精選されている〔た
とえば、エー・エム・マクサムおよびダブリユ
ー・ギルバート、「DNAの新規な配列決定方法」、
プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第74巻、第560〜564頁
（1977）〕。プラスミドDNAをウイルキーの論文第
861〜862頁に記載された方法Ｂにより調製し〔エ
ヌ・エム・ウイルキー等、「単純疱疹ウイルス
の活性チミジンキナーゼ遺伝子を含有するヒブリ
ドプラスミド」、ヌクレイツク・アシツド・リサ
ーチ、第７巻、第859〜877頁（1979）〕、業者によ
り推奨されるように各種制限酵素で制限化し、た
だし200μg／mlのゼラチンを牛血清アルブミンの
代りに酵素緩衝液中に使用した。〔EcoRIはダブ
リユー・ボルから寄贈され、BspIはエー・キス
から寄贈され、その他の酵素はニユーイングラン
ド・ビオラブ社から得られた〕。 制限DNA（20μg）をフエノールで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、0.05Mトリス−HCl（PH８）
中に溶解させそしてチエレツクス100の小カラム
に通した。フラツシユ（flush）もしくは5′−結
合末端を有する断片を、200μlの0.05Mトリス−
HCl（PH８）中においてDNA5′末端ｐモル当り0.2
単位の子牛腸アルカリホスフアターゼ（ベーリン
ガー社）により37℃で60分間処理して脱燐酸化さ
せた。酸素を65℃で60分間加熱することにより失
活させた。3′結合末端を有するDNA断片につい
ては、細菌性アルカリホスフアターゼ（ワーシン
グトン社）を文献〔エー・エム・マキサムおよび
ダブリユー・ギルバート、上記〕に記載されてい
るように使用し、ただし培養は65℃にて30分間行
なつた。脱燐酸化DNAはDEAE−セルロースに
吸着および溶出させて精製し〔ダブリユー・ミユ
ーラー等、「DNAにおける部位指向性変異：アミ
ノ酸121〜123に対応する位置におけるクローン化
β−グロビン相補DNAのポイント変異の発生」、
ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第
124巻、第343〜358頁（1978）〕、或いはこれを必
要に応じポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た（下記参照）。ポリアクリルアミド（もしくは
アガロース）ゲルから0.15M NaCl、0.05Mトリ
ス−HCl（PH８）中に回収した断片を0.1mlのヒド
ロキシアパタイト（ビオラドHTP社）カラムに
吸着させ、0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH７）１
mlで４回洗浄しそして0.3mlの1M燐酸カリウム緩
衝液（PH７）で溶出させた。この溶液を10培希釈
し、DNAをDEAE−セルロースに吸着させ、上
記のように回収した〔ダブリユー・ミユーラー
等、上記〕。 エタノール沈澱の後、DNAを〔γ−P³²ATP
（DNA5′末端ｐモル当り12〜34μCi）およびポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ニユーイングランド・ビ
オラブ社またはＰ−Ｌビオケミカルス社）にて、
実質的にエー・エム・マキサムおよびダブリユ
ー・ギルバート（上記）により記載されているよ
うに5′末端標識したが、ただしキナーゼ反応の前
にDNAを変性させなかつた。DNA5′末端ｐモル
当り１〜1.5μCi〔P³²〕ホスフエートの比活性が得
られた。 配列決定のため、標識断片を第二の制限酵素で
開裂させ、そして生成物をトリス−硼酸−
EDTA緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲルでの電気泳動により分離した。所望の断片を
このゲルから抽出して精製した（ミユーラー等、
上記〕。配列決定用の各種断片を次のようにして
調製した（数は、ベース対における名目断片鎖長
を示し、標識部位は星印により示される〕。 (1) BspによるHif−2hの開裂ならびに、レー
ニング緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるBsp−Bsp−232およ
びBsp−Bsp−949の単離〔ユー・イー・
レーニング、「ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による高分子量リボ核酸の分別」、ジヤーナ
ル・バイオケミストリー、第102頁（1967）〕、 (2) BspによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂ならびにBsp＊−Pst−83およ
びBsp＊−Pst−827の単離、 (3) BglによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂ならびにBgl＊−Pst−336およ
びBgl＊−Pst−570の単離、 (4) MboによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびHindによる切断（阻害性350bp
pBR322断片を開裂させる）、ならびにMbo
＊−Pst−519およびMbo＊−Pst−351
の単離、 (5) EcoRによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂、ならびにEcoR＊−Pst−
708およびEcoR＊−Pst−198の単離、 (6) PstによるHif−2hの開裂、標識化、Bgl
による開裂ならびにPst＊−Bgl−570およ
びPst＊−Bgl−336の単離、 (7) AvaによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびBglによる開裂ならびにAva＊−
Pst−186およびAva＊−Bgl−147の単
離、 (8) PvuによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびBglによる開裂ならびにPvu＊−Pst
−486の単離。 断片を、エ・エム・マキサムおよびダブリユ
ー・ギルバート（上記）の方法により減成させた
が、この場合同著者により1978年９月に示された
報告の変法を用いた。生成物を、50mMトリス−
硼酸、1mM EDTA（PH8.3）中で0.1×25×36cmの
12％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／
ビスアクリルアミド＝18/1）により分別化させ、
その際700ボルトで６時間の予備処理の後、900ボ
ルトで２，８，18および26時間処理した。最良の
結果は、ゲルを使用前２〜３日間にわたり室温に
維持した場合に得られた。 各長さのcDNA挿入物を両ストランドから配列
決定し、標識末端として役立つ各制限部位を緊張
させた断片により配列決定した。かく得られたヌ
クレオチド配列を第８〜１０図に示す。予期され
るように、この挿入物における各制限部位の位置
は、制限酵素開裂のみにより測定される位置より
も完全に位置決定され、これを第４図に示す。 第８〜１０図について見ると、挿入物のヘテロ
重合部分は5′末端における23G残基および7A残基
（恐らくmRNAのポリ(A)末端を反映する）によ
り、ならびに3′末端における15C残基により示さ
れる。参考のため、挿入物は、dG末端に続く第
一ヌクレオチドからポリ(A)残基の前の最終ヌクレ
オチドまで番号が付けられる。位置57〜59におけ
るATG開始トリプレツトおよび位置624〜626に
おけるTAA停止トリプレツトは、ナンセンスコ
ドンにより中断されない解読枠を規定する。挿入
物におけるこの領域内の２つの他の解読枠はそれ
ぞれ18個および12個のナンセンスコドンを有す
る。さらに異なる解読枠におけるATGもしくは
GTGおよび停止信号により示されて25個以上の
アミノ酸のポリペプチドをコードする他の配列
は、それぞれヌクレオチド226と304との間、640
と778との間および683と743との間に存在する。
したがつて、ヌクレオチド57と626との間の領域
は、恐らく本発明におけるIFN−αの生物学的も
しくは免疫学的活性を示すポリペプチドをコード
するようなHif−2h断片のヌクレオチド配列を含
むと思われる。 勿論、通常の方法〔エー・エフストラチアジス
等、上記〕によるポリ(A)RNAからのクローン化
cDNAは5′末端ヌクレオチドを欠失しかつ人工的
配列さえ含みうることを了解すべきである〔アー
ル・アイ・リチヤード等、「成鶏β−グロビン
cDNAの分子クローン化および配列分析」、ヌク
レイツク・アシツド・リサーチ、第７巻、第1137
〜1146頁（1979）〕。したがつて、ヌクレオチド57
〜59に位置するATGが標準mRNAの最初の
ATGであるとは限らない。しかしながら、以下
の説明の目的で、ヌクレオチド57〜59における
ATGが標準mRNAの最初のATGであると仮定
する。 挿入物のこの領域によりコードされるポリペプ
チドを標準ひとリンパ芽球細胞インターフエロン
の35個末端アミノ酸、すなわち、−−
SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgAr
ｇＡｌａＬｅｕＩｌｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｎＭｅｔ
ＧｌｙＡｒｇＩｌｅＳｅｒＬｅｕ
ＰｈｅＳｅｒＣｙｓＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｒｇＨｉｓＡ
ｓｐ−−〔ケー・シ
ー・ズーン等（上記）およびエム・フンカピラー
およびエル・フード（上記）により決定〕と比較
すれば、選択解読枠は適正であり、ヌクレオチド
57〜124は「成熟」ポリプチドをコードするヌク
レオチド配列に先立つ信号配列をコードしうるも
のと思われる。何故なら、公表された配列と決定
された配列とを並べて見ると（第24番目以降のア
ミノ酸）、顕著な一致性を示すからである（すな
わち26〜35アミノ酸）。 成熟核mRNAにおいて、5′末端からの第一
AUGトリプレツトは通常、蛋白合成に対する開
始部位である〔エム・コザツク、「成熟核リボソ
ームはどのようにしてメツセンジヤーRNAにお
ける開始域を選択するか」、セル誌、第15巻、第
1109〜1125頁（1978）〕。リンパ芽球細胞インター
フエロンの第一アミノ酸に対応するHif−2h断片
中のコドンは第一AUGからの22個のコドン（お
よび第二AUGからの14個のコドン）であり、こ
れはインターフエロンをコードする配列に先立つ
て、23個（もしくはそれ以下の恐らく15個）のア
ミノ酸の信号ペプチドを決定する配列があること
を示している。長い方の推定信号配列は11個の疎
水性アミノ酸の非中断系列を含有し、短い方のも
のは６個の疎水性アミノ酸のものを含有する。疎
水性残基のこの蓄積が信号配列の特徴である〔ビ
ー・デイー・デビスおよびピー・シー・タイ、
「膜を透過する蛋白質分泌のメカニズム」、ネイチ
ヤー誌、第283巻、第433〜438頁（1980）〕。 「成熟」IFN−αポリペプチドに明らかに対応
するヌクレオチド配列は498個のヌクレオチドか
らなり、166個のアミノ酸をコードする。カルボ
キシ末端処理がないと仮定すれば、インターフエ
ロンポリペプチドの分子量は19388である。コー
ド配列の基本組成は50％GCである。インターフ
エロンコード配列内のコドン使用は、一般に哺乳
類mRNAに対して示されたものとよく一致する
〔アール・グランタム等、「コドンカタログ使用お
よびゲイム仮説」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第８巻、第49〜62頁（1980）〕。観察され
る全ての変化は、関与する少数に起因する。 勿論、Hif−2h断片につき第８〜１０図に示さ
れたポリペプチドの構造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコソレーシヨン
（glycosolation）によりもたらされたポリペプチ
ドに対する変更を何も考慮に入れていない。した
がつて、この構造は生体内で生産されるIFN−α
とは同一でないが、たとえ同一でないにしろ極め
て類似した生物学的および免疫学的性質を有する
と理解せねばならない。さらに、この構造は、た
とえば単一もしくは多重のベース置換、欠失、挿
入もしくは転位を含む突然変異またはこの構造の
化学的誘導化のような他の変化がIFN−α活性を
も示す化合物を生成させうることを示唆する。 ３ 挿入IFN−αcDNAのプラスストランドの決
定 mRNAと同じ配列を有するDNA鎖をプラスス
トランドと名付け、その相補体をマイナスストラ
ンドと名付ける。IFN−αcDNA挿入物のプラス
ストランドは第５図に示すように同定された。
Hif−2hDNAを制限酵素Bglによつて開裂さ
せ、末端をP³²−燐酸によつて標識し（Pst−開
裂末端について記載したように）そしてDNAを
Pstにより切断して、より長い（545b.p.（上記
した精度のより大きい分析法により測定して
570b.p.））放射性断片と、より短い（340b.p.（上
記した精度のより大きい分析により測定して
336b.p.））ものとを生成させた。これら断片を変
性させそして誘発白血球からのポリ(A)RNAに対
し80％ホルムアミド、0.4M NaCl中において、
すなわちDNA−DNA再結合が生じないような条
件（上記）の下でヒブリド化させた。核酸をヌク
レアーゼS1で切断し、これは全ての単一鎖核酸、
特に非ヒブリド化P³²−DNAを減成し、そして生
成物をポリアクリルアミドゲルで分離した〔アー
ル・エフ・ウイーバーおよびシー・ワイスマン、
「バークーシヤープ法の変法によるRNAの地図
化」、ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第７
巻、第1175〜1193頁（1979）〕。放射能写真は、短
い方のヌクレオチド断片のみがヒブリド化されか
つポリ(A)RNAにより保護されていることを示し、
この5′−標識短ヌクレオチド鎖をマイナスストラ
ンドと同定した。プラスストランドの方向性は、
したがつて、第４図および第５図（右手側）に示
される通りである。 ４ 非誘発ひと白血球からのポリ(A)RNAはHif
−2hDNAにヒブリド化しない例 前節に記載したと同じ実験を行なつたが、ポリ
(A)RNAは、センダイウイルス誘発白血球の場合
と同じ手順により調製した非誘発ひと白血球から
のものとした。検出しうる量の標識DNAは保護
されなかつた。前節の結果と比較して、非誘発細
胞からのポリ(A)RNAは、誘発細胞からのポリ(A)
RNAにおけるよりも約1/20以下の量の、Hif−
2hにヒブリド化しうるmRNAを含有する。 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4cに関連した組
替えDNA分子を含有する大腸菌による、イン
ターフエロン活性を有するポリペプチドの合成 pBR322のPst部位は、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）遺伝子内に存在する。したが
つて、コードDNA断片（たとえば、遺伝子の全
部または一部からなるcDNA）を適正方向および
適正解読枠における位置に結合すれば、融合蛋白
質が得られる。この蛋白質は、β−ラクタマーゼ
のアミノ末端部分からなり、それに続いて挿入
DNA配列がコードするアミノ酸配列が存在する
（エル・ビラーカマロフ等、上記）。挿入DNA断
片がそれ自身の開始信号を含むDNA配列からな
りかつβ−ラクタマーゼ配列と一致する停止信号
を備えた配列を有すれば、停止および再開始が第
二開始信号において起こり、非融合活性蛋白質が
生ずるであろう（エー・シー・ワイ・チヤング
等、上記）。Hif−4cに関連したDNA挿入物が適
正解読枠中に挿入されてβ−ラクタマーゼ遺伝子
内で発現するのを確保するため、一組のpBR322
の誘導体、すなわちpKT279、pKT280および
pKT287〔ケー・タルマツジ等、「信号配列コード
化領域における独特なPstクローン化部位を有
するプラスミドベクターの作成」、ジーン誌、第
12巻、第235〜241頁（1980）に記載されて手法に
より作成〕を使用した。これら誘導体の各々は
Pst部位を有し、その位置はその部位に結合さ
れたDNA挿入物が他の誘導体のPst部位におけ
る挿入物からの異なる解読枠中に存在するような
位置である。すなわち、第６図から判るように、
pKT279はプラスミドのプレペニシリナーゼ遺伝
子のヌクレオチド74に位置するPst部位を有し、
pKT280はヌクレオチド75に、またpKT287はヌ
クレオチド82にそれぞれPst部位を有する。各
プラスミドの残余の配列はpBR322における周知
配列である。したがつて、この組みは、全ての３
つの解読枠におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子中へ
のDNAの挿入を可能にする。Hir−2hからのPst
切断挿入物を、Hif−4c断片について記載した
ように調製した。Hif−2hPst断片（10ng）を、
20μlの10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM
MgCl₂、100mM NaCl、6mM β−メルカプト
エタノール、200μg／mlゼラチンおよび0.1mM
ATPの中でPst開裂pBR322、pKT279、
pKT280またはpKT287（それぞれ10ng）と混合
し、0.1単位のT₄DNAリガーゼ（ニユーイングラ
ンド・ビオラブ社）と共に10℃にて16時間培養し
た。得られた組替えDNA分子をＺ−pBR322
（Pst）／HcIF−2h、Ｚ−pKT279（Pst）／HcIF
−2h、Ｚ−pKT280（Pst）／HcIF−2hおよびＺ
−pKT287（Pst）／HcIF−2hと名付ける。イ
ー・コリHB101をこれら組替えDNA分子のそれ
ぞれにより形質転換させ、そして形質転換したコ
ロニーを前記したようにテトラサイクリン含有寒
天板の上で選択した。形質転換細菌のテトラサイ
クリン耐性クローンは循環ベクターを含有するの
で、各組の細菌コロニーをミリポアフイルター上
で生育させ、そしてP³²−標識Hif−4c断片にヒ
ブリド化するコロニーを上記のように同定しかつ
選択した。これらの菌株は次のように名付けられ
た： イー・コリHB101（Ｚ−pBR322 （Pst）／HcIF−2h−AH1）乃至 （−AH3）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT279 （Pst）／HcIF−2h−AH1）乃至 （−AH8）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT280 （Pst）／HcIF−2h−AH1）乃至 （−AH8）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT287 （Pst）／HcIF−2h−AH1）乃至 （−AH8） 上記菌株の幾種かならびに菌株Ｚ−pBR322
（Pst）／HcIF−SN1〜95の幾種かの抽出物を、
IFN−α活性につき試験した。細菌をトリプトン
培地において固定相で増殖させ、回収し、1/20容
量（培養物の容量に対し）の50mMトリス−HCl
（PH８）、30mM NaClで洗浄しそして凍結させ
た。解凍後、細胞を下記容量の前記緩衝液に再懸
濁させそしてリゾチームを１mg／mlまで加えた。
０℃にて60分間の後、懸濁物を凍結させ（エタノ
ール−ドライアイス浴）、５回解凍させ（37℃に
て）、ソルバールGSA型ロータで12000rpmにて
10分間遠心分離した。或る場合には上澄液
（S30）の一部をさらにスピンコ65型ロータで
100000xgにて遠心分離し、上澄液（S100）を回
収した。このような上澄液を、細胞病理学的効果
減少分析によりIFN−α活性について選別した
（実験１）。実験１において陽性反応を示すコロニ
ーならびに上記の組Ｚ−pBR322／HcIF−SN1
〜SN95からのクローンを、より低希釈にて再分
析した（実験２）。 抽出物源：

【表】 抽出物源：

【表】 上記からの、より活性の大きいものの幾つかを
さらに詳細に検査した。培養物を対数相の後期ま
で増殖させ（見掛け0D₆₅₀は約0.9）＊、細胞を1/
５０の培養物容量にて上記のように溶菌させた。若
干活性を有するが陰性比較（S30；S100：０；
０）としてＺ−pBR322（Pst）／HcIF−SN32を
用いれば、次の結果が得られる； 抽出物源

【表】

【表】 これら株菌により生産された実際の蛋白質は、
IFNに無関係にアミノ酸に融合してまたはIFNの
信号配列の全部もしくは一部を含んで生産された
かどうかを決定するよう構造的に分析しなかつた
ことを了解すべきである。しかしながら、少なく
とも蛋白質が生成されれば、これはIFNの免疫学
的もしくは生物学的活性を示す。したがつて、こ
の発現した蛋白質は有用である。この蛋白質をコ
ードするDNA配列がHuIFN−αに関連する
DNA配列であることを蛋白質の活性が示すこと
は特に重要である。かくして、例示したような
DNA配列を使用して他の同様なHuIFN−α関連
DNA配列を選択すること、および成熟インター
フエロンもしくはその変種を発現し或いは特定の
発現蛋白質の収量を向上させるような他の構成に
対し基礎を与えることは当業者の範囲内にある。 蛋白質の生産レベルは２つの要因により支配さ
れる：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とそ
れら遺伝子コピーが転写されかつ翻訳される効率
とである。転写および翻訳（これらは共同して発
現となる）の効率は次いでヌクレオチド配列に依
存し、これは通常所望のコード配列の前方に位置
する。これらのヌクレオチド配列すなわち発現制
御配列は、特にRNAポリメラーゼが相互作用し
て転写を開始させる（プロモータ配列）と共にリ
ボソームがmRNA（転写の生成物）と結合し、か
つ相互作用して翻訳を開始させる位置を規定す
る。必ずしもこの種の全ての発現制御配列が同等
の効率をもつて作用するとは限らない。したがつ
て、所望蛋白質に対する特異的コード配列をその
隣接するヌクレオチド配列から分離し、これらを
寧ろ他の公知の発現制御配列に融合させてより高
レベルの発現に好適とするのが有利である。これ
も達成されるが、新たに処理されたDNA断片を
多重コピープラスミドまたはバクテリオフアージ
誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピーの数を増
加させ、それによりさらに発現蛋白質の収量を向
上させることもできる。 幾つかの発現制御配列を上記のように使用する
ことができる。これらには、イー・コリのラクト
ースオペロンのオペレータ，プロモータおよびリ
ボソーム結合かつ相互作用配列（たとえばシヤイ
ン−ダルガルノ配列のような配列を含む）（“lac
系”）、イ−・コリのトリプトフアン合成酵素系の
対応配列（“trp系”）、フアージλの主要なオペレ
ータおよびプロモータ域（O_LP_LおよびO_RP_R ¹）、
フアージfdコート蛋白の制御域、或いは原子核
（原核）もしくは成熟核（真核）細胞およびその
ウイルスの遺伝子の発現を制御するその他の配列
が包含される。したがつて、適当な宿主において
特定ポリペプチドの生産を向上させるには、その
ポリペプチドをコードする遺伝子を前記のように
調製し、これを含有する組替えDNA分子から取
出して、前記発現制御配列に一層近接して或いは
上記発現制御配列の一つを管理しながら組替え
DNA分子中に再挿入する。この種の方法は当分
野で公知である。 所望生成物の細胞収量の増加は、細胞中で使用
しうる遺伝子数の増加に依存する。これは、たと
えば組替えDNA分子を前記したように中庸のバ
クテリオフアージλ（NM989）中に挿入すること
により、特に簡単には制限酵素でプラスミドを切
断することにより達成され、それにより線状分子
を生成させて、これを次いで制限フアージλクロ
ーン化ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレイ
等、「試験管内組替え遺伝子の回収を簡単にする
λフアージ」、モレキユラー・ジーン・ゲネチツ
クス、第150巻、第53〜61頁（1977）およびエ
ヌ・イー・ムレイ等、「バクテリオフアージT₄か
らのDNAリガーゼ遺伝子の分子クローン化」、ジ
ヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第132
巻、第493〜505頁（1979）に記載されている種
類〕と混合し、そしてDNAリガーゼと共に培養
して組替えDNA分子を生成させる。次いで、所
望の組替えフアージを前記のように選択しかつ使
用して宿主菌株の大腸菌を溶菌させる。 特に有用なλクローン化ベヒクルは、抑圧遺伝
子cIにおける感温性突然変異と遺伝子ｓにおける
抑圧性突然変異とを含み、その生成物は宿主細胞
の溶菌に必要でありかつ遺伝子Ｅ、すなわちその
生成物はウイルスの主要なカプシド蛋白質であ
る。この系を用いて、溶菌細胞を32℃で生育さ
せ、次いで45℃まで加熱してプロフアージの切断
を誘導させる。37℃における長期生育は高レベル
の蛋白質生産をもたらし、これらは細胞内に保持
される。何故なら、これらは通常の方法でフアー
ジ遺伝子生成物によつて溶菌されずかつフアージ
遺伝子挿入物はカプセル化されていないで転写用
に利用され続けるからである。次いで、細胞の人
工的溶菌は所望生成物を高収量で遊離する。 上記した過程によりＺ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN35で形質転換させた宿主から生産され
てひと白血球インターフエロンの生物学的もしく
は免疫学的活性を示すようなポリペプチドの収量
を増加させる初期の試みにおいて、ヒブリド中の
DNA挿入物の制限地図を決定した。この地図は、
Hif−2hと比較して、Hif−SN35が配列の3′末端
を示すPst部位を欠失しており、信号配列の一
部が欠失しており（コドン７まで）かつ信号配列
におけるAva部位がBsp部位により交換され
ていることを示した。したがつて、Hif−SN35
はHif−2hの多形的もしくは対立的変種であると
思われる。 プラスミドHif−SN35をPstにより開裂さ
せ、得られたDNA鎖を標準法により両端部で復
帰（chew back）させ、そしてそこにLAC−Alu
断片（下記）を挿入してプラスミドを再び閉環さ
せた。Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN35−
AHL6と同定された変型プラスミドの実際の構造
および大腸菌中に生産された蛋白質のアミノ末端
におけるアミノ酸配列を決定した。この構造のヌ
クレオチド配列は、LAC−Alu断片がIFN−α1
（SN35）の第一アミノ酸から離れた１個のアミノ
酸を結合したことを示している。大腸菌で発現さ
れた蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配列は、
IFN−α1（SN35）配列に融合した６個のアミノ
酸を有する融合蛋白質が生産されたことを示して
いる。しかしながら、変型プラスミドにより形質
転換された宿主は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN35により形質転換された宿主と比較し
て、ひと白血球インターフエロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す約100培多いポリペプチ
ドを生産する。 第２５図を参照すれば、Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN35（第２５図におけるSN35）で形質転
換させた宿主により生産されて、ひと白血球イン
ターフエロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
示すようなポリペプチドの収量を向上させる他の
試みが図示されている。Bsp（キツス博士より
寄贈）により標準法を用いてヒブリドプラスミド
を開裂させた。なお、このBspは当業界で既知
の容易に入手しうる制限酵素であつて、たとえば
A.キツス等「バチルス・スフアエリクスからの
新配列−特異性エンドヌクレアーゼ（Bsp）」、ジ
ーン誌、第１巻、第323〜329頁（1977）の論文に
詳述されている。このBspは、第８図に示すよ
うに、DNAを配列GGCCにて切断する。制限酵
素を熱失活（65℃、30分）させた後、混合物を
50mMトリス−HCl（PH８）に調製して加熱した
（37℃、30分）。フエノールとエタノールとで抽出
した後、最大のα1cDNA断片を低温ゲル化アガ
ロース（0.8％）上で単離しそしてHindリンカ
ーを結合させた。次いで、この変型断片をHind
−開裂プラスミドHS−pBR322（Eco）／
lacUV5−150（“Lac−150”）＊（エツチ・シヤー
ラーにより寄贈）に結合させたが、これは断片含
有ゲル片（それぞれ約20μl）を65℃にて溶融さ
せ、37℃まで冷却しかつ1μl当り20UのT4DNAリ
ガーゼを加えて行なつた

【＊このプラスミドは
lacプロモータHae−202b.p.断片を含有し〔ダ
ブリユー・ギルバート等、「Lac抑圧剤のラクト
ースオペレータ配列および作用」、蛋白質リガン
ド相互作用、エツチ・スンドおよびジー・ブラウ
アー編（ベルリン、ワルター・デ・グルイター）、
第193〜206頁およびケー・バツクマン等、「試験
管内において組替え処理を使用するプラスミドに
対する遺伝子発現の最大化」、セル誌、第13巻、
第65〜71頁（1978）〕、その3′末端にてEcoRIリン
カにより示される】。15℃にて16時間の後、固化
ゲルにおいて結合が生じた〔エツチ・レーラツ
ハ、私的通信、1980〕。 1/10容量の100mMトリス−HCl（PH7.5）、
100mM CaCl₂、100mM MgCl₂を試料に加え、
これを65℃にて５分間加熱し、37℃まで冷却し
た。次いで、この試料を使用してCa⁺⁺処理イ
ー・コリHB101を形質転換させ、０℃にて20分
間培養し、42℃にて１分間および20℃にて10分間
加熱した。１モルのトリプトン培地を加えた後、
試料を37℃にて60分間培養しそしてアンピシリン
を含有する寒天板上に接種した。プラスミド
DNAをこれら培養物から前記のように分離しそ
してLAC断片に隣接する5′末端を持つたIFN−
α1挿入物を含有するヒブリドプラスミドを制限
分析により同定した。次いで、プラスミドを常法
によりEcoRIで開裂させかつエンドヌクレアーゼ
BAL−31で切断させ（0.06U／ml、30℃で２〜４
分間）、LAC断片の結合EcoRI末端を除去しかつ
β−ガラクトシダーゼコード部分を短縮させた。 処理プラスミドが完全なIFN−α1コード配列
を含有するのを確実にするため、次いでプラスミ
ドを常法によりBglで開裂させ、上記のように
後処理しそして最大断片をアガロースゲル（0.8
％）上で分離した。次いで、この断片をＺ−
pBR322（Pst）／HcIF−SN35からのBsp−Bgl
断片と合し、得られたヒブリドプラスミドを使
用して上記のようにイー・コリHB101を形質転
換させた。この形質転換したコロニーをIFN活性
につき選別し、高レベルのIFN活性を有する１つ
のクローンを選択した。このクローンをイー・コ
リHB101（C8−IFN−α1）およびそのヒブリドプ
ラスミドC8−IFN−αと名付けた。 C8−IFN−α1のDNA配列分析は、開始トリプ
レツトの後のコード配列がβ−ガラクトシダーゼ
の最初の７個のアミノ酸と、融合により生成した
Pro残基と、IFN−α1信号配列およびIFN−α1
（SN35）配列のアミノ酸16〜23とを決定したこと
を示している。ヒブリドプラスミドC8−IFN−
α1で形質転換させたイー・コリミニセル菌株
（DS410）は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）／Hif−
SN35で形質転換させたミニセルと比較し、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドを１当り約5000万単位すなわち約
2500培多く生産する。プラスミドC8−IFN−α1
により生産されたポリペプチドのアミノ酸配列
は、生産物がβ−ガラクトシダーゼからの７個の
アミノ酸と融合により生じた１個のアミノ酸と
IFN−α1に融合されたIFN−α1信号配列のアミ
ノ酸16〜23とを有する融合蛋白質であることを確
認させた。 さらに、本発明により蛋白質収量を向上させる
種々の構成の例を、他の型のIFN−αに関連して
検討した（下記）。 ヒブリドプラスミドで形質転換させた大腸菌に
より生産されるインターフエロン活性の性質 １ トリプシンに対するIFN−α活性の感受性 標準HuIFN−α（比活性、1.2×10⁶U／mg、
50U）ならびにイー・コリHB101（Ｚ−pKT287
（Pst）／HcIF−2h−AH6）のS100抽出物（“Hif
−287−６抽出物”）（200U／ml、10U）およびイ
ー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
SN35）のS100抽出物（“Hif−35抽出物”）
（1000U／ml、50U）の試料50μlを、下記のよう
に種々な量のトリプシンと共に、37℃にて30分間
培養した。S100抽出物は高蛋白質含量を有する
一方、HuIFN−αはそうでないので、HuIFN−
αと比較S100抽出物Hif−32との混合物を並行的
に試験した。

【表】 したがつて、抽出物のIFN−αは、トリプシン
およびしたがつて蛋白質に対し感受性である。 Hif−35 S100抽出 ０ 30 物（50単位） 0.1 20 １ 20 10 ２ 50 ０ ２ セフアデツクスＧ−100上のクロマトグラフ
イーにおける挙動 抽出物Hif−35（１ml）およびイー・コリ
HB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN32）の
S100抽出物（“Hif−32抽出物”）を32mlのセフア
デツクスＧ−100カラム上で、50mM燐酸カリウ
ム緩衝液（PH7.4）にて４℃でクロマトグラフに
かけた。チトクロームｃ（0.2mg）を内部標識とし
て加えた。流速を２ml／hrとし、1.0mlづつのフ
ラクシヨンを集めた。280nmおよび405nm（チト
クロームｃ）における吸光度とIFN−α活性とを
測定した。第７図に示すように、Hif−35抽出物
のIFN−α活性は、チトクロームｃの前に、約
0.45のK_D値をもつて溶出された。したがつて、こ
の物質の見掛け分子量は約20000〜30000〔ヌクレ
オチド配列決定により、カルボキシ末端処理なし
と仮定して測定した分子量は19388〕であり、比
較抽出物Hif−32のフラクシヨンには活性が検出
されなかつた。 ３ ひと白血球インターフエロンに対する抗体に
よる、Hif−35およびHif−287−６のインター
フエロン活性の阻害 HuIFN−α（比活性1.2×10⁶IU／mg）とHif−
35／Hif−287−６のS100抽出物とを、10％子牛
血清を含む100μlの改変イーグル培地（MEM）
中において、HuIFN−α〔ケー・カンテル、1976
年２月24日に調製、比活性450000単位／ml〕に対
する羊抗血清の種々な希釈により37℃で30分間培
養し、45μlを細胞病理学的効果減少分析により
IFN−α活性につき分析した〔抗体自身は細胞病
理学的効果を起こさなかつた〕。

【表】

【表】 抗体の作用が、たとえば蛋白質分解のような非
特異的作用に基づくものでないことを示すため、
ねずみインターフエロン系を用いて同様な実験を
行なつた。

【表】 かくして、特にHuIFN−αに向けられた抗体
は、HcIF−2h DNA配列を含有する或る種の組
替えDNA分子により形質転換させた大腸菌で生
産されるポリペプチドのIFN−α活性を阻害す
る。大腸菌で生産されたIFN−αに対する抗体の
明らかな低親和性は、これと天然HuIFN−αと
の間の構造上の相違を反映し、たとえば炭水化物
成分の不存在、信号配列の存在またはβ−ラクタ
マーゼ配列の一部に対する融合を反映する。 ４ ねずみ細胞に対するHif−35およびHif287−
６抽出物の活性低下 ひとCCL23細胞またはねずみL929細胞をイ
ー・コリ抽出物、HuIFN−α〔ケー・カンテルの
方法により調製、比活性1.2×10⁶単位／mg〕また
はねずみIF（N.I.H.標準）で処理し、これにウイ
ルスを接種し（ひと細胞の場合はメンゴウイルス
を用い、ねずみ細胞の場合はVSVを用いた）、そ
してIFN−α活性を細胞病理学的効果減少分析に
よつて測定した。

【表】

【表】 添加物 ひと系 ねずみ系

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−インターフエロンを産生させるに際し (a) Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−2h［DSM1700］、
   Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN35
   ［DSM1701］、Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
   SN42［DSM1702］、およびＺ−pKT287
   （Pst）／HcIF−2h−AH6［DSM1703］の
   DNA挿入部、 (b) Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−−206 ［ACTT 31633］およびＺ−pBR322
   （Pst）／HcIF−SN35−AHL6［ATCC 31634］
   のDNA挿入物、 (c) 前記DNA挿入物のいずれかにヒブリド化し
   かつIFN−α型のポリペプチドをコードする
   DNA配列、および (d) (a)、(b)および(c)で特定されるDNA挿入物お
   よび配列によりコードされるのと同じアミノ酸
   をコードするシノニウムコドンによつて１以上
   のコドンが交換されかつIFN−α型のポリペプ
   チドをコードするDNA配列であつて、前記
   DNA配列が組替えDNA分子中で発現制御配列
   に作用結合しているDNA配列、 よりなる群から選択されるDNA配列からなる
   DNA配列からなる組替えDNA分子によつて形質
   転換された微生物またはねずみ細胞を培養し、ポ
   リペプチドを回収する工程からなることを特徴と
   するα−インターフエロンの産生方法。 ２ DNA挿入物(a)のいずれか１つにヒブリド化
   するDNA配列(c)を、 (g) Hif−chr3のHind断片［DSM 1914］、Hif
   −chr12のEco RI断片［DSM 1915］、Hif−
   chr12のHind断片［DSM 1916］、Hif−
   chr13のEcoRI断片［DSM 1917］、Hif−chr23
   のEcoRI断片［DSM 1918］、Hif−chr23の
   Hind断片［DSM 1919］、Hifchr26のEcoRI
   断片［DSM 1920］、Hif−chr26のHind断片
   ［DSM 1921］、Hif−chr35のHind−BanHI
   断片［DSM 1922］、Hif−chr35のBam HI断
   片［DSM 1923］、Hif−chr23のTac−Tac断
   片［ACTT 31760］、Hif−chr10lのBgl −
   Bgl 断片［ATCC 31761］、Hif−chr10rの
   Hind−Hind断片［ATCC 31762］、Hif−
   chr26のBgl −Bgl 断片［ATCC
   31763］、Hif−chr30のHind−Hind断片
   ［ATCC 31764］、Hif−chr13のBgl −Tac
   断片［ATCC 31765］およびHif−chr16lの
   Bgl −Tac断片［ATCC 31766］ のいずれかのヒブリド化部分、(h) 前記DNA挿
   入物のいずれかにヒブリド化しかつIFN−α型
   のポリペプチドをコードするDNA配列、およ
   び (i) (g)および(h)で特定されるDNA挿入物および
   配列によりコードされるのと同じアミノ酸をコ
   ードするシノニムコドンによつて１以上のコド
   ンが交換されかつIFN−α型のポリペプチドを
   コードするDNA配列、 よりなる群から選択することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ DNA配列を式： 【表】 【表】 のDNA配列から選択することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ４ DNA配列を式： 【表】 のDNA配列から選択することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５ DNA配列を式： 【表】 のDNA配列から選択することをを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 発現制御配列をlac系、β−lac系、trp系、
   フアージλの主オペレータおよびプロモータ領
   域、fdコート蛋白の制御領域並びに原核もしくは
   真核細胞およびそのウイルスの遣伝子の発現を制
   御するその他の配列よりなる群から選択すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
   ７ 微生物をイー・コリとすることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。