KR890001828B1 - 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

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Description

인터페론-형의 폴리펩티드의 제조방법

제 1 도는 재조합 DNA분자 혼합물을 제조하기 위한 본 발명 방법의 한 예를 개요한 것으로, 그 일부분의 재조합 DNA분자는 본 발명의 폴리펩티드를 암호하는 삽입 DNA서열로써 특징지워진다.

제 2 도는 본 발명의 최초 클론스크리닝 방법을 개요한 것이다.

제 3 도는 본 발명에 의해 제조된 DNA서열을 사용하는 클론스크리닝 방법의 한 가지 예를 개요한 것이다.

제 4 도는 본 발명의 여러가지 클론들중 한 가지의 제한지도로, 그 클론에서 각 제한 부위의 절대적 위치는 결정되지 못한다. 제 8 도-제 10 도에서 이들 억제위치에 대한 좀 더 확실한 위치를 나타낸다.

제 5 도는 본 발명의 한 가지 재조합 DNA분자내에서 DNA삽입체의 방향을 결정하는 방법을 개요한 것이며, 제 6 도는 본 발명에 유용한 몇 가지 클로닝 매개체의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 나타내며,

제 7 도는 본 발명의 박테리아 배양으로 부터 제조한 상청액의 Sephadex G-100분획화의 결과를 나타내며,

제 8 도-제 10 도는 본 발명의 재조합 DNA분자에 대한 DNA삽입체의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호는 폴리 A잔기앞의 뉴클레오티드에 대한 폴리 G5'말단 및 폴리 C3'말단을 따르는 뉴클레오티드로 부터 붙여진다. 뉴클레오티드는 57-125는 시그날 서열, 뉴클레오티드 126-623은 성숙("mature")인 인터페론을 나타낸다. 시그날 서열의 아미노산 서열은 이것의 뉴클레오티드 서열위에 표시되며, "성숙"인터페론의 아미노산 서열은 이것의 뉴클레오티드 서열위에 표시된다. 이 유전자에서 다양한 제한 엔도뉴클레아제 인식부위가 제 8 도-제 10 도에 표시되어 있는데 이들 부위는 제 4 도에서 나타낸것 보다 확실하게 위치하고 있다.

제11도는 본 발명의 재조합 DNA분자의 두 가지 삽입체의 제한지도를 도해적으로 비교한 것이다.

본 발명은 재조합 DNA분자와 그 분자를 이용한 인터페론류의 폴리펩티드 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 적합한 숙주에서 표현되는 재조합 DNA분자에 관한 것이다.

본 명세서로 공지되는 재조합 DNA분자는 면역작용 또는 생물학적 작용을 갖는 인체 인터페론의 폴리펩티드를 암호하는 DNA로써 특징지워진다. 후술하는 바와같이, 본 발명의 재조합 DNA분자는 항바이러스 및 항종양 또는 항암인자로서 유용한 폴리펩티드의 생산에 이용될 수 있다.

현재, 두종의 인터페론이 있는 것으로 알려져 있다. I형의 인터페론은 숙주세포에 작용, 숙주세포를 항비루스 상태로 하는 작고, 산에 안정한(글리코)-프로틴이다.

(A. Issacs와 J. Lindenmann, "Virus Interference I. The Interferon", Proc. Royal Soc.Ser.B.,147,pp.258-67(1957)와 W.E.Stewart,II,The Interferon System,Springer-Verlag(1979)(이후에서는 "The Interferon System"으로 약칭함))

II형의 인터페론은 상에 불안정하다. 아직까지, 이들의 특징은 상세히 밝혀지지 않았다. 어느 정도는 세포 특이성을 띠지만 (The Interferon System,PP.135-45), 인터페론은 비루스 특이성이 아니다. 그러므로, 인터페론은 광범위한 비루스로 부터 세포를 보호한다. 향원성으로 구별되는 두개 종류의 I형 인체인터페론("HIF")이 IF작용을 억제하는 것으로 알려졌다. 하나의 IF종류(F-IFN)은 이배체의 섬유 아세포에서 생산된다. 다른 IF종(Le)은 인체 백혈구와 임파아구에서 소량의 F-IFN과 함께 생산된다. 이들은 크기에 있어서 이형으로 이것은 아마도 탄수화물기에 의한 것으로 보인다. F-IFN은 정제되어, 널리 그 특성이 밝혀져 있다.

(E. Knight, Jr., "Interferon : Purification and Initial Characterization from Humam Diploid Cells", Proc. Natl.Acad.Sci.USA,73,PP.520-23(1976)). 이것은 20,000-26,500분자량의 글리코-프로틴이다(J.Wassenbach등의 "Identification OF The Translation Products of Human Fibroblast Interferon mRNA In Reticulocyte Lysates", Eur.J.Biochem.98,PP.1-8(1979))이것의 아미노산 서열의 규명은 진행중이다. 염색체 2와 5에 위치한 2가지 서로 다른 유전자가 F인터페론을 암호한다.[D.L.Slate와 F.H.Ruddle, "Fibroblast Interferon In Man Is Coded By Two Loci On Separate Chromosomes"-"인체의 섬유 아세포 인터페론은 별개 염색체상의 두개 유전자 좌에 의해 암호된다. ", Cell,16,pp171-80(1979)].

Le인터페론도 역시, 정제되었고 그 특성이 밝혀졌다. 두 가지 성분이 보고 되었는데, 하나는 21000 내지22000의 분자량을 다른 하나는 15000 내지 18000의 분자량을 갖는다. 저분자량 성분은 비글리코실화 형태로 나타난다(W.E.Stewart,II등의 "Effect Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon-인체 백혈구 인터페론의 생산과 특성에 대한 글리코실화 억제제의 효과 "Virology,97,pp.473-76(1979) ; M.Rubinstein 등의, "Human Leukocyte Interferon : Production, Purification To Homogeneity And Initial Characterization- 인체 백혈구 인터페론 : 생산, 동질물 정제및 초기 특성화 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,pp.640-44(1979) ; M.Rubenstein 등의, "Human Leukocyte Interferon Purified to Homogeneity"-"동질물로 정제된 인체 백혈구 인터페론"Science,202,pp.1289-90(1978) ; P.J.Bridgen 등의 "Human Lympho-blastoid Interferon -인체 임파아구 인터페론", J.Biol.Chem.,252,pp.6585-87(1977) ; K.C.Zoon 등의 "Purification And Partial Characterization of Human Lymphoblastoid Interferon"-"인체 임파아구 인터페론의 정제와 부분적 특성", Proc.Natl.Adad.Sci.USA,76,pp.5601-05(1979) ; The Interferon System, p 173 및 그것에 인용된 참고 서적).

임파아구 인터페론의 아미노산 서열의 일부 즉, 폴리펩티드의 아미노 말단에서 35개의 아미노산 및 그것의 아미노산 서열이 보고되었다.

(K.C.Zoon 등의 "Amino Terminal Sequence Of The Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon"-"인체 임파아구 인터페론의 주성분의 아미노 말단 서열", Science,207,pp.527-28(1980)과 M.Hunkapiller와 L. Hood의 개인 발표문(1980))

인체 인터페론의 2가지 종은 그 특성이 서로 다르다. 예를들면, 항-인체 Le IF항체는 F인터페론에 감소된 작용을 보이나 항인체-F인터페론 항체는 Le인터페론에 대하여 전혀 작용하지 않는다. (The Interferon System,p.151). Le IF는 또한 F인터페론이 거의 활성을 나타내지 못하는 소, 고양이, 돼지 유래의 세포배양물에서 높은 활성을 보인다. 그 외에도 이들 두 가지 인터페론은 다른 1차 염기 서열의 폴리펩티드를 암호하는 각기 다른 mRNA에서 유래한다. (그러므로 서로 다른 구조 유전자를 가질 것으로 추정됨) (R.L. Cavalieri 등의 "Synthesis Of Human Interferon By Xenopus laevis Oocytes : Two Structural Genes For Interferon In Human Cells"-제노푸스 레비스 난모 세포에 의한 인체 인터페론 합성 : 인체 세포에서 인터페론에 대한 두개 구조 유전자", Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,pp.3287-91(1977)

Le와 F인터페론 모두가 글리코실화 형태로 발생하기는 하지만, 탄수화물기를 제거하거나 (P.J.Bridgen등의 상기 참조 문헌) 또는 글리코실화를 방해하는 억제제의 존재하에서의 인터페론을 함성하면 (W.E. Stewart II 등의 Virology, 상기 참조) ; J.Fujisawa 등의 "Nonglycosylated Nouse L Cell Interferon Produced By The Action Of Tunicamycin-투니카마이신 작용으로 생산된 비글리코실화 마우스 L세포 인터페론", J.Biol.Chem,253,pp,8677-79(1978), 그 인터페론 작용을 대부분 또는 모두 지니고 있는 보다 작은 형태의 인터페론이 생산된다. F인터페론과 Le인터페론은 많은 인체 단백질과 마찬가지로 다형성이다. 그러므로, 특정한 개체의 세포는 구조적으로는 약간씩 다르지만 생리적으로는 유사한 F IF와 Le IF의 인터페론종을 생산할 것이다.

그러므로, F인터페론 또는 Le인터페론의 단백질 구조가 일반적으로 공지 규명될수 있지만 특정 개체는 그것과는 약간 변형된 인터페론을 생상할 수 있다. 인터페론은 정상 또는 건강 세포에서는 일반적으로 검출되지 않는다.

(The Interferon System,pp.55-57). 인터페론은 그 유발인자에 세포가 노출될때 비로소 생산된다. 인터페론 유발인자는 일반적으로 비루스이지만, 천연 또는 합성의 이중구조 RNA, 세포내 미생물, 미생물의 부산물과 그외의 화학적 요인과 같은 특질에 의해 비비루스성인 것도 있다. 인체 세포에 비루스 감염에 대한 저항성을 부여하기 위하여 이들 비비루스 유발인자를 이용한 다양한 시도가 실시되어 왔다. (S.Baron and F.Dianzani (eds.), Texas Reports On Biology And Medicine,35("Texas Reports"),pp.528-40(1977))

이러한 시도들은 성과를 거두지 못하였고, 반면 외인성 인터페론의 이용이 현재 바람직하다. 항비루스 인자로서, 인체 인터페론은 다음 질병치료에 이용된다 : 호흡기 질환(텍사스 리포트,p.486-96) 헤르페스 심플렉스 캐라티티스(텍사스 리포트,p.497-500) 급성 출혈성 결막염(텍사스 리포트,p.501-10) 수두 대상포진(텍사스 리포트,p.511-15) 거대세포 비루스병(텍사스 리포트,p.523-27) B형 간염(텍사스 리포트,p.516-22). 또한 The Interferon System p.307-19)를 참조. 그러나 인터페론의 대량 수요량은 현재의 공급량을 훨씬 상회한다.

인터페론은 항비루스 작용 외에도 다른 작용을 갖고 있다. 예를들면, 콜로니자극 인자의 효과에 대항하거나, 조혈설 콜로니-형성 세포 성장을 저해하고, 대식세포 전구물질과 과립백혈구의 정상적인 분화를 방해한다. (텍사스 리포트 ; p.343-49). 또한 DMSO로 처리된 Friend 백혈병 세포에서 적혈구 분화를 억제한다.(텍사스 리포트,p.420-28).

또한, 인터페론은 면역 조걸기구에 대하여 작용한다. 항원에 따라 복용량과 시간을 조절하면, Le인터페론은 생체내 및 생체외에서 면역항진과 면역 억제의 양역활을 할 수 있다(텍사스 보고서, P.357-69).

또한 특이하게 감작된 임파구가 항원과 접촉한 후에 인터페론을 생산함이 관찰되었다. 그러므로 상기 항원으로 유도된 인터페론은 순환 항원 수준과 세포면역성의 표현에 영향을 주는 면역반응의 조절자가 될 것이다(텍사스 리포트,p.370-74).인터페론은 또한 임파구 및 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 증가시키는 것으로 알려졌다. (R.R.Herberman 등의"Augmentation By Interferon Of Human Natural And Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity"-"인체 인터페론 및 항체 의존성 세포매개 세포독성에 의한 증감", Nature,277,pp.221-23(1979) ; P.Beverley와 D.Knight의 "Killing Comes Naturally"-"죽음은 자연히 온다" Neture,pp.119-20(1979) : Texas Reports,pp.375-80). 두 가지 형의 인터페론이 모두 종양세포의 면역학적 공격에 참여한다.

그러므로, 인체 인터페론은 인체 항 비루스제로서만 아니라, 항종양 및 항암치료제로서의 사용이 가능하다. (The Interferon System,pp.319-21) 현재, 인터페론은 많은 동물에서 여러 종류의 종양성장에 영향을 미친다고 알려져 있다. (The Interferon System p.292-304). 다른 향종양 치료제와 마찬가지로 작은 종양에 적용될때 가장 효과적인 것 같다. 동물 인터페론의 항종양 효과는 복용량과 시간에 의존하지만 독성 이하의 농도에서 실현된 것이다. 따라서, 많은 연구와 임상 시험이 인체 인터페론의 항종양 및 항암특성에 대하여 집중적으로 실시되어 있다. 이들은 골종양, 급성 골수성 백혈병, 다중골수종 호드킨병과 같은 여러 악성질병 치료를 포함한다(텍사스 보고서,p.429-35).

이들의 임상결과가 고무적이기는 하지만, 순수 정제된 인체 인터페론의 공급량의 절대적인 부족으로 인해 인체 인터페론의 항암 및 항종양 치료는 심각하게 곤란받고 있다. 생화학적 수준에서 인터페론은 적어도 3개 단백질의 합성을 유도하는데 그들은 단백질 키나제(B.Lebleu 등의"Interferon, Double-Stranded RNA And Protein Phosphorylation", Proc.Natl.Acad.Sci.USA,73,pp.3107-11(1976),A.G.Hovanessian와 I.M.Kerr의 "The(2'-5') Oligoadenylate (ppp A2'-5'A2°5'A) Synthetase And Protein Kinase(s) Form Interferon -Treated Cells", Eur.J.Biochem.,93,pp.515-26(1979))와 (2'-5') 올리고 (A)중합효소(A.G.Hovanessian 등의 "Synthesis Of Low-Molecular Weight Inhibitor Of Protein Synthesis With Enzyme From Interferon-Treated Cells", Nature,268,pp,537-39(1977), A.G.Hovanessian과 I.M.Kerr의Eur.J.Biochem.)와 포스포디에스 테라제(A.Schmidt 등의 "An Interferon-Induced Phosphodiesterase Degrading(2'-5') oligoisoadeny -late And The C-C-A Terminus of tRNA", Proc. Natl. Acad. -Sci. USA,76,pp.4788-92(1979))이다. 인터페론으로 처리된 세포내에서 이들 효소의 출현은 그들 단백질이 인터페론류의 작용을 갖는다는 것을 생각케 한다.

현재, 인체 백혈구 인테페론은 조직배양에서 자란 인체 세포 또는 공혈자로 부터 수집된 인체 백혈구를 통해서 생산된다. 배양된 나말바 세포(Namalva cell)의 800l에서 2.6.×10⁹IU의 조 인터페론이 생산되었음이 보고되어 있다. (P.J.Bridgen 등의 상기 서적). 대규모의 혈액센터중, 예로써 핀란드 헬싱키의 피니쉬 적십자 센터에서는, 연간 생산능이 약 3×10⁹IU이다. 하루평균 한 환자당 일반적으로 3×10⁶이 필요하므로 수요량의 인체 이터페론을 제공하기에는 이들 공급원이 절대적으로 부족한 것이다. 그러므로, 다른 방법에 의한 인터페론의 생산이 바람직하다.

상기의 조 인테페론은 더욱 특이활성이 높은 것으로 정제될 수 있다. 예컨대, 약 25% 수득에서, 혈액 세포에서 분리된 Le인테페론은 약 10⁹IU/mg까지 정제되었다(L.S.Lin 등의 "Purification Of Human Leukocyte Interferon To Apparent Homogeneity : Criteria For Purity"-"완전 동질물로의 인체 백혈구 인터페론의 정제 ; 정제에 대한 기준"Abs.Am.Meeting Amer.Soc.Microbiol.(1978)과 The Interferon System,pp.156-71). 인터페론의 특이 활성은 4.0×10⁸-10⁹IU/mg정도로 높기때문에, 시판 상품의 인터페론 단백질의 양은 적다. 예를들면, 순수 인터페론100그람은 3백만 내지 3천만의 복용량이 될 것이다.

오늘날 분자 생물학의 발전으로 박테리아 세포내로 특이한 비박테리아성의 진핵단백질을 암호하는 DNA를 주입하는 것이 가능해졌다.

화학 합성이 아닌 다른 방법으로 생산된 DNA 즉, 재조합 DNA분자의 조립은 하기와 같다 ; 목적 단백질을 생산하는 정제된 mRNA주형의 일본쇄 DNA카피(cDNA)의 생산 ; cDNA를 이본쇄 DNA로 전환 ; 이 DNA를 적합한 클로닝 매개체에 적합한 부위에 결합시켜 재조합 DNA분자를 제조 ; 재조합 DNA분자로 적합한 숙주를 형질전환시킨다. 이러한 형질전환은 그 숙주로 하여금 목적 단백질을 생산하게 한다. 몇가지 비박테리아성 단백질과 유전자가 재조합 DNA기술을 사용하여 대장균(E.coli)에서 생산되었다. 예를들면, 쥐의 프로인슐린 항원 결정 인자유전소(L.Villa-komaroff 등의 "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin-프로인슐린을 합성하는 박테리아 클론", Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,pp.3727-31(1978), 쥐의 생장홀몬(P.H.Seeburg 등의 "Synthesis Of Growh Hermone By Bacteria", Nature,pp.795-98(1978)) 쥐의 디히드로폴레이트 환원효소(A.C.Y.Chang 등의 "Phenotypic Expression in E.coli Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Ruductase-마우스 디히드로폴레이트 리덕타제를 암호하는 DNA서열의 E.coli내의 표현형의 발현", Nature,275, pp.617-24(1978)), 인체의 소마토스타틴(K.Itakura 등의 "Expression in E.coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin-홀몬 소마토스타틴의 화학적 합성 유전자의 E.coli내에서의 표현", Science,198 pp.1056-63(1977) ; 유럽 특허 출원 제0,001,929, 0,001,930 0.001,931), 인체인슐린의 A 및 B의 폴리펩티드 쇄(D.V.Goeddel 등의 "Expression in E.coli Of Chemecally Synthesized genes For Human Insulin-인체인슐린의 화학 합성된 유전자의 E.coli내에서의 표현", Proc.Natl.Acad.Sic.USA,76,pp.106-10(1979)와 상기의 유럽특허 명세서, 인체 B형 간염 비루스의 항원(C.J.Burrell 등의 "Expression in E.coli : Of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR 322-플라스미드 pBR 322에서 클론된 B형간염 비루스 DNA서열의 E.coli내에서의 표현"Nature,279,pp.43-7(1979)와 M.Pasek 등의 "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli -B형 간염 비루스 유전자와 그것의 E. coli내에서의 표현, Nature, 282,pp.275-79(1979), 인체 생장 홀몬(D.V.Goeddel 등의 "Direct Expression In E. coli Of A DNA Sequence Coding For Human Griwth Hormone-인체 생장 홀몬을 암호하는 DNA서열의 E.coli내의 직접적 표현", Nature,281,pp.544-51(1979)),SV40t항원(T.M.Roberts 등의 Synthesis Of Simian Virus 40 t Antigen In E.coli-E.coli내에서의 시미안 비루스 40t항원의 합성", Proc.Natl.Acad.Sic.USA,76,pp.5596-600(1979)), 인체 섬유 아세포 인터페론(T.Taniguchi 등의 "Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Sepuence-인체 섬유 아세포 인터페론 유전자 서열을 함유한 박테리아 플라스미드의 조립 및 동정", Proc.Japan Acad.55,Ser.B,pp.464-69(1979))이 이에 포함된다. 또한, 예를들어 난알부민의 경우에, 강력한 박테리아성 프로모터나 표현유전자 조절 서열의 DNA에 특별한 DNA를 융합 시킴으로써 목적의 난알부민류 단백질을 대량생산할 수 있는데, 즉 E.coli세포의 약 0.5 내지 1%의 총 단백질량으로 생산할 수 있다.

(O.Mercereau-Puijalon 등의 "Synthesis Of An Ovalbumin-Like Protein By Escherichia coli K 12 Harboring A Recombinant Plasmid-재조합 플라스미드 함유의 E.coli K 12에 의한 난알부민류 단백질의 합성", Nature,275,pp.505-10(1978)); T.H.Fraser B.J.Bruce,"Chicken Ovalbumin Is Synthesized And Secreted By E.coli-난 알부민이 E.coli에 의해 합성되고 분비된다", Proc.Natl. Acad. Sci.USA ,75,pp.5936-40(1978)).

그러나 상기의 어떠한 것도, 본 발명과 같이, 재조합 DNA기술을 사용하는 인체 인터페론의 합성에 관한것이 아니다. 재조합 DNA기술을 사용하여 인체 인터페론의 합성 문제를 해결하지 않았다는 것을 전술한바를 통하여 알수 있을 것이다. 이것이 본 발명이 제기하는 문제이며, 예컨대 함성 유전자를 제조하기 위해 필요한 서열정보(Itakura 등의 상기 문헌) 또는 특정한 DNA서열이 풍부한 세포형태 또는 비루스(C.J.Burrell 등의 상기 문헌) 또는 목적하는 하이브리드 DVA를 함유하는 박테리아클론의 제조와 동정을 가능하게 하는 mRNA종류 (Villa-Komaroff등의 상기 문헌), 또는 목적 단백질을 표현하는 E.coli의 선택을 가능케하는 시스템(A.C.Y.Chang 등의 상기 문헌)의 이용에 의해서도 쉽게 해결되어 지지는 않았다. 이것은 폴리(A)RNA로 부터의, 난모세포에서 섬유 아세포 활성을 생성시키는 mRNA로 하이브리드 되는 DNA서열을 함유하는 플라스미드의 보고에 의해서도 해결되지 못했다.

마지막으로, 인체 인터페론 유전자의 클로닝전에 순수한 인터페론 mRNA제조에 대한 Research Disclosure No.18309 pp.361-62(1979)의 명백한 제안으로도 본 발명의 해결이 제시되지 않았다.

본 발명은 인체 인터페론의 면역학적 또는 생물학적 작용을 나타내는 폴리펩티드를 암호하는 구조 유전자로 특징지워지는 최소한 하나의 재조합 DNA분자를 제공하는 것과 관련된 문제들을 해소한다.

본 발명에 의해 항비루스, 항암, 함종양 인자로 쓰이는 인체 인터페론의 면역학적 또는 생물학적 작용을 나타내는 폴리펩티드의 대량생산이 가능해진다. 본 발명이 재조합 DNA분자는 적합한 숙주내에서 인체 인터페론의 면역학적 또는 생물학적 작용을 나타내는 폴리펩티드를 생산한다. 이들 재조합 DNA분자의 적합한 숙주내의 복제는 또한 이들 폴리펩티드를 암호하는 유전자의 대량생산을 가능케한다. 이들 폴리펩티드와 유전자의 분자구조와 특성은 쉽게 결정될 수 있다.

이 폴리펩티드와 유전자는, 숙주에서 생산된대로 또는 적절한 유도작용과 수정후에, 항비루스, 항종양과 항암인자로 사용되거나 또는 이들 생산물을 개선하거나 추적하는 조성물과 방법에 유용하다.

본 발명의 방법은 위에서 언급했듯이, 면역학적 또는 생물학적 인체 인터페론 작용을 나타내는 폴리펩티드를 암호하는 적합한 유전자 삽입체를 함유한 재조합 DNA분자를 제조하는 것으로써 전자의 여러방법들과 뚜렷이 구별되는 것이다. 목적의 폴리펩티드를 암호하지 않는 유전자 삽입체를 가진 분자로 부터 그 암호 유전자 삽입체를 갖는 재조합 DNA분자를 분리하기 위하여 본 발명가들은 후술하는 스크리닝법을 사용한다.

본 발명의 보다 충분한 이해를 위하여, 본 발명을 실시아는 베스트모드(최적 형태)를 하기에 설명한다. 하기 기술에서는 다음과 같은 용어를 사용한다.

뉴클레오티드 : 당(5탄당), 인사염, 질소성 헤테로 사이클릭염기로 구성된 DNA나 RNA의 단량체 단위. 그 염기는 배당 탄소(5탄당의 1번 탄소)를 통해 당기에 결합되어 있다. 그리고 이들 염기와 당이 결합한 것이 뉴클레오시드이다. 염기로써 뉴클레오티드가 특징지워진다 : 4개의 DNA염기는 아데닌("A"), 구아닌("G"), 시토신("C"), 티민("T")이다. 4개의 RNA염기는 A,G,C,우라실("U")이다.

DNA서열 : 인접한 오탄당들의 3'와 5'탄소사이의 포스포디에스테르 결합에 서로 연결된 뉴클레오티드의 선상배열.

코톤 : mRNA를 통해 아미노산, 번역개시 시그날 또는 번역종말 시그날을 암호하는 3개의 뉴클레오티드(트리플레트)로딘 DNA서열, 예를들어, 뉴클레오티드 트리플레티드 TTA,TTG,CTT,CTC,CTA와 CTG는 아미로산 로이신("Leu")를 암호하고 TAG,TAA와 TGA는 번역 정지시그날이며, ATG는 번역개시 시그날이다.

해독 프레임 : mRNA를 아미노산 서열로 번역하는 동안의 코돈그룹, 번역중, 적합한 해독 프레임이 유지 되어야 한다. 예컨대, GCTGGTTGTAAG는 세가지 해독 프레임으로 번역될 수 있는데 각 해독 프레임은 다른 아미노산 서열을 제공한다.

GCT GGT TGT AAG : Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG : Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA G : Trp-Leu-(정지)

폴리펩티드 : 인접한 아미노산의

-아미노와 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산의 직선행 배열.

게놈 : 세포 또는 비루스내의 완전한 DNA. 그중에서도 특히, 물질의 폴리펩티드를 암호하는 구조유전자, 작동유전자, 프로모터와 Shine-Dalgarno서열과 같은 리보소옴 결합 및 상호작용 서열을 포함한다.

구조유전다 : 주형 또는 mRNA통해 특이한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호하는 DAN서열,

전사 : 구조유전자로 부터 mRNA가 생산되는 과정.

번역 : mRNA에서 폴리펩티드를 만드는 과정.

표현 : 구조유전자에 의해 행해지는 폴리펩티드를 생산하는 과정, 전사 및 번역의 과정.

플라스미드 : 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 완전한 "리플리콘(replicon)"을 가진, 비염색체의 이본쇄 DNA서열. 이것이 단세포 생물에 삽입되면, 그 생물의 특성이 플라스미드의 DNA에 의해 변이 또는 형질 전환된다. 예를들어 테트라사이클린 내성(Tet^R)을 지닌 유전자를 삽입한 플라스미드를 종전에 테트라사이클린에 민감한 반응을 보이던 세포에 주입하면 테트라사이클린에 내성을 지닌것으로 형질전환된다. 플라스미드로 형질전환된 세포를 "변이주"라 한다.

피지 또는 박테리오파지 : 단백질막("캡시드")에 포괄된 DNA서열로 이루어진 박테리아성 비루스.

클로닝 매개체 : 플라스미드, 파아지 DNA 또는 숙주세포에서 복제가능한 그 DNA서열이 예컨대 복제, 막 단배질 생산과 같은 생물학적 기능의 손실이나 프로모터 또는 결합부위 손실없이 결정된 양식으로 절단될 수 있는 하나 또는 소수의 엔도뉴클레아제 인식부위가 있으며, 형질전환된 세포의 동정에 적합한 마커(유전형질), 예컨대 테드라사이클린 저항성 또는 암피실린 저항성을 포함한다. 클로닝 매개물체는 흔히 벡터로 호칭된다.

클로닝 : 하나의 유기체 또는 DNA서열로 부터 무성생식에 의해 유기체 또는 DNA서열의 군집을 얻는 과정.

재조합 DNA분자 또는 하이브리드 DNA : 상이한 게놈으로 부터의 DNA분체로 이루어지며 숙주 세포를 감염시키는 능력을 가지며 그 숙주 세포에 유지되어지는 분자.

표현 조절서열 : 구조 유전자에 조작적 방법으로 연결될때 구조유전자 표현을 통제, 조절하는 뉴클레오티드 서열.

인체 인터페론 mRNA(IFmRNA)를 함유한 폴리(A) RNA의 제조

인체 백혈구를 37℃로 센다이 비루스로 5시간동안 유도시켜 추출하고, 인체 인터페론 mRNA를 함유한 폴리 (A) RNA혼합물을 얻는다. 상기 유도는 Cantell과정으로 수행한다.(The Interferon Systme,pp.130-31)

제 1 도에서 폴리(A) RNA혼합물은 실제비율을 고려치 않고 해설되어 있다. 유도된 백혈구를 수집해서 8g NaCl,0.2g Kcl, 0.2g KH₂PO₄·2H₂O를 함유한 1l의 용액(PBS)에 10¹¹의 세포를 현탁시키고, 50l의 분별깔대기에서 격렬하게 교반하면서 17l의 20mM의 트리스-염산(pH7.5), 1mM EDTA("ET완충제"), 2% 도데실 황산염나트륨("SDS")에 천천히 첨가한다. 자가분해된 프로나제(Calbiochem) 200μ g/ml를 가하고, 용액을 실온에서 1시간 교반한다. 폴리(A) RNA의 마커로 125I-글로불린 mRNA 10⁶카운트/분("cpm")을 첨가한다. 전체부피의 1/20("1/20부피")부피의 2M 트리스-염산(pH 9)을 가하고, 재증류된 페놀 15l로 급격히 교반하면서 10분간 혼합물에 추출한다. 클로로포름 3l를 가하고, 5분간 교반한다. 상분리를 위해 30분간 방지후, 액상을 제거한 후 페놀과 클로로포름으로 다시 추출한다. 전체 19.1l인 산출액상을 60g의 SDS와 결합시킨다. 1/10부피 3M소디움 아세테이트(pH 5.5)와 2부피 에탄올 헥산을 침전시킨다. -20℃에서 하룻밤 재운 후, 섬유상의 핵산침전물을 플라스틱망으로 거른다. 0.5% SDS를 함유한 200ml TNE(50mM 트리스-염산 (pH 7.5), 10mM 염화나트륨, 5mM EDTA)와 이것을 교반시킨다. 이것을 그 용액 300ml를 더 가해 용해시킨다. 비섬유상의 침전물은 5000rpm으로 15분간 Sorvall RC-3원심관내의 1l sorvall에서 수집해서, 0.5% SDS를 함유한 350ml TNE에 용해한다. 상기의 2개 TNE액을 결합해서, 1부피 페놀로 3번 추출하고, 1/2부피 에테르와 3번 1부피 에테르와 3번 추출한다.

RNA회수량은 260nm흡광도에서 775mg이다. 올리고 (dT)셀룰로즈(7 Type, P-L Biochimecals, Inc.)에 반복 뱃취흡착으로 폴리(A) RNA혼합물의 분리를 수행한다.

상기의 RNA함유액의 1/2인 500ml에 2.7g의 올리고(dT)셀룰로즈를 첨가한다. 폴리(A) RNA를 1시간동안 교반시켜 올리고(dT)셀룰로즈에 흡착시킨 후, 원심분리로 흡착된 mRNA혼합물을 수집하고, TNE 50ml로 세척하고, 물 2ml로 5번 계속 용출한다. 흡광도(준비 A)로 측정한 바에 의하면, 폴리(A) RNA 860μg이 생산되었다. 일차 흡착을 거친 상층 RNA액은 다시 2회의 흡착 싸이클을 상술한 바대로 거친다. 이차와 삼차의 흡착은 각기 600μg과 170μg을 보이고, 이것을 결합한다(준비 B).

제노푸스 래비스(Xenopus laevis)난모세포에 주입하여 IFmRNA에 대하여 RNA를 분석한다. (The Intreferon System,pp.93-95)약 1mg/ml농도가 되게 15mM 트리스-염산(pH 7.5), 88mM 염화나트륨("TNK완충액")에 RNA를 용해한다. 50개 난모세포에 이용액 50ml를 각기 주사한다. 실온에서 하룻밤 Barth배지에서 배양한다. (Gurdon의 J.Embryol and Exper.Morph.20,pp.401-414(1968) 그리고 Barth의 J.Embryol and Exper.Morph.,7,pp.210-222(1959)). 배양된 난모세포를 세척하고, 0.5ml 52mM 트리스 글리신 완충액(pH 8.9)을 담은 1.5ml에펜도르프 원심관에서 파스퇴르피펫으로 균질화시킨다. 혼합물은 Eppendorf원심기로 2분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 -20℃로 냉동시킨다.

H. Strander and K.Cantell의 "Production of Intreferon By Human Leukocytes In Vitro", Ann.Med.exp.Fenn.,44,p.265-73(1966)에서 설명된 플라크감소 분석법에 의해 인터페론활성을 측정한다. 1단위 인터페론은 비루스플라크를 50%까지 감소시킨다. 인터페론제제의 효능은 인체 표준 인터페론 69/19에 대하여 상대적으로 표현된다. (인터페론 및 그 유도체의 표준화에 대한 국제 심포지움,1969) 또는, 인체의 CCL-23세포가 사용되며, Mengo비루스로 공격한다는 것을 제외하고는 W.E.Stewart 2세와 S.E.Sulkin의 "Intreferon Production In Hamsters Experimentally Infected with Rabies Virus-광견병비루스로 실험 접종된 Hamsters 에서의 인터페론의 생산)", Proc.Soc.Exp.Biol.Med,123,pp.650-3(1966)에 설명된바의 세포 변성효과 감소를 근거로 하는 분석을 실시한다. 난모세포 추출물은 주입된 RNA의μg당 300IU의 활성도를 갖는다. 후자의 분석에서는 주입된 난모세포가 배양된 후에는, 대부분의 인터페론을 분비하므로 배양배지만을 분석한다.

(A.Colman 과 J.Morser의"Export of proteins From Oocytes Of Xenopus laevis-제노푸스 레비스의 난모세포로 부터의 단백질 유출", Cell 17,pp.517-26(1979)).

폴리(A) RNA를 더욱 정제하기 위해, 농도가 5mM의 EDTA가 되게 충분한 0.5M 에틸렌 디아민 테트라아세트산("EDTA")를 폴리(A) RNA제조물(A)에 가한다. 이 용액을 동일부피의 TNE-포화페놀로 2번 추출하고, 동일부피의 에테르로 5번 추출한다.

0.1ml chelex -100Bio-Rad컬럼을 통과시키고, 100℃에서 90초 가열후, 50mM 트리스-염산(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.2M 염화나트륨을 함유한 13ml의 자당구배에 엷게 깐다. 제한 효소 Hind III과 Pst I(New England Biolabs)로써 pBR 322 322를 분해시켜 얻은, 5'말단에 32p가 표지된 DNA분체 10,000cpm을 사이즈 마커로서 첨가한다. 10℃에서 35,000rpm으로 16시간 SW40회전기로 원심분리한다. 1ml/분으로 ISCO구배 수집기에 의해 분획을 수거한다.(0.6ml).

상술한 바와같이 IFmRNA를 분석하고, 32p-DNA마커에 대한 그들의 위치를 표시한다. 후속적인 원심분리에서, IFmRNA-함유 분획을 그 마커에 대하여 동정한다.

IFmRNA활성을 지닌 분획은 80μg의 폴리(A) RNA를 함유한다. 0.5% SDS와 0.02% 폴리비닐 설페이트(하기 제조물에서는 폴리비닐 설페이트가 제외된다)를 함유한 2부피의 TNE와 함께 이들을 혼합하고, 50μ 1의 올리고(dT)셀룰로즈 칼렴에 가한다.

상술한 바와같이 컬럼을 세척하면 (0.6ml의 증류수로 4번), 40μg의 RNA 혼합물을 용출할 수 있다. 에탄올 침전후에, 0.5mM EDTA에 RNA를 농도 1mg/ml가 되게 용해한다.

상술한 바와같이 IFmRNA활성에 대한 분석을 1부의 폴리(A) RNA침전물 대하여 실시한다.

이것은 주입된 RNAμg당 3600IU 인터페론의 특이 활성을 보인다. 그러므로, 그자당 구배는 IFmRNA에 대하여 약 10배로 농축된 폴리(A) RNA를 갖는다. 연속적으로, 약 40배가 증가된 유사 제조물을 얻었다. 제조물 B는 제조물 A와 유사한 특이 활성을 가지므로, 유사하게 정제한 후 두 개를 혼주(pool)한다. 이때, 상기의 자당 구배에서 얻은 폴리(A) RNA는 수많은 종류의 mRNA의 것을 함유하고 있음을 상기하여야 한다. 인터페론에 특이성이 있는것 이외의 다른 mRNA는 바람직스럽지 못한 오염물이다(제 1 도). 유감스럽게도, 이들 오염 RNA는 본 발명의 클로닝 과정의 모든 잔여물에서 IFmRNA와 유사하게 작용한다. 그러므로, 폴리(A) RNA내에서 이들의 존재는 인터페론과는 다른 폴리펩티드를 암호하는 유전자를 함유하는 원치않는 수많은 박테라아클론의 최종 제조물을 초래한다. 이 오염은 목적의 IF하이브리드 클론을 분리하는 복잡한 스크리닝의 문제를 안고 있다.

인터페론의 경우, 그 스크리닝의 문제는 목적클론의 동정을 위한 스크리닝 프로오브(probe)로서 작용하는 IFmRNA 또는 DNA 또는 그 부분의 충분히 정제된 샘플이 부족하다는 사실에 의해 더욱 큰 문제가 된다.

그러므로, 인터페론 클론에 대한 스크리닝 방법은 대단한 시간소비를 요하며 어려운 것이다. 더구나, 소량의 인터페론 클론만이 생물학적으로 활성이거나 또는 면역학적으로 활성 형태의 인터페론을 표현하는 것으로 기대되므로 활성클론의 분리는 "건초에서 바늘 찾기"와 같은 것이다. 유리하게 본 발명자들은 재조합DNA기술을 사용하여 IFmRNA 또는 cDNA 또는 그 부분의 정제 샘플을 제공할 수 있다. 이 정제된 mRNA 또는 cDNA는 수많은 박테리아 클론을 빠르게 스크린하기 위해 사용될 수 있으며, 그로써 활성 형태의 인터페론을 표현하는 클론 분리의 가능성을 크게 증가시킨다.

인터페론 cDNA를 함유하는 cDNA혼합물의 합성

IFmRNA가 풍부한 폴리(A) RNA(제조물 A+N)를 일본쇄 보족 DNA(cDNA) (제 1 도)를 제조하기 위한 주형으로 사용한다. (참조.A.Efstratiadis 등의 "Full Length And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And Chorion mRNAs-글로부틴과 융모막 mRNA의 전 길이 및 부분 역 전사",Cell,4,pp.367-78(1975) 및 그에 인용된 참조 문헌)

40mM 트리스-염산(pH 7.5), 30mM 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘 0.5mM DTT(Cal-Biochem),20ug/ml의 올리고(dT) 12-18(P&L Biochemicals), 5mM DGPT (Schwarz), dCTP(Lasevosan)과 dTTP(Sigma), 5mM 32p-dATP(NEW,특이활성 100,000 cpm/nmole). 60μg/ml 폴리(A) RNA와 280단위 새의 골수 아세포 비루스(AMV)역 전사효고(Life Sciences, Inc.,St.Petersburg,Florida)를 함유하는 반응 혼합물 800-/ul를 제조한다.

37℃에서 1시간 배양시킨후, 0.5M EDTA의 20% SDS(재결정된 것)를 10mM EDTA와 0.1% SDS가 되게 첨가한다. 1부피 페놀(증류된 것)로 추출한다. 200μ l의 200mM 트리스-염산(pH 7.5), 1mM EDTA의 0.1% SDS로 그 페놀상을 세척하고, 액상을 결합한다.

이들을 동일 부피의 에테르로 추출하고 (Fluka,Pro,Anal.), TNE로 5-ml Sephadex G-100컬럼상에서 크로마토그라피 처리한다. 0.1ml의 분획을 0.3ml/min에서 수거한다. 방사성을 나타내는 분획(Cerenkov 방사로서 측정)을 결합하고, 3N 소디움 아세테이트를 0.3M이 되도록 가한다. 핵산을 2.5부피 에탄올로 침전시킨다.

-20℃에서 하룻밤 재운후, 원심분리하고, 상청액은 분리한다. 180μ l증류수에 침전물을 용해하고, 실리콘화된 Eppendorf튜브에 옮긴다. 20μl의 5M수산화나트륨을 가하고, 실온에서 40분 방치한다. 20μ l의 5M소디움 아세테이트, 100μ l증류수와 500μ l에탄올을 가한다. -20℃로 하룻밤 냉각후, 0℃로 20분간 10,000g의 힘으로 원심분리하여 침전물을 수집한다. 일본쇄 cDNA의 수득양은 10μ g이다. 그런데 상기 제조된 일본쇄 cDNA산물은 실제로는 폴리(A) RNA혼합물에 존재하는 해당 mRNA로 부터 전사된 수많은 여러 cDNA의 복합 혼합물이다(제 1 도 참조).

이들중 몇가지만 인터페론과 관련되는데, 즉, IFcDNA인 것이다. 또 다른 요인이 cDNA혼합물을 복잡해지도록 작용한다. 폴리(A)/ RNA혼합물의 각 mRNA종류가 항시 완전하게 전사하는 것이 아니다. 각mRNA종에 있어서 그 전사과정이 mRNA가 도달하는 말단전에 정지될수 있다. 따라서 다양한 cDNA종이 각 mRNA종으로 부터 생산될 수 있다(제 1 도에 없음). 특정 단백질에 대한 유전자 본체만을 갖는 제조합DNA분자를 함유하는 박테리아 클론이 생성되도록 각 cDNA종류가 연속적인 클론 과정에서 유사하게 작위할 것이다. 이들 분획-함유 클론의 존재로 인해 최종 클론 스크리닝 과정이 더욱 복잡해진다.

전해질로서 230mM수산화나트륨 2mM EDTA를 사용한 알카리상의 2% 아가로스 겔상에서 소량의 부분 표본을 전기 영동하여 여러가지 일본쇄 cDNA의 크기를 측정한다. (M.W.McDonell 등의 "Analysis Of Restriction Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis In Neutral And Alkaline Gels-중성 및 알카리성겔 전기영동에 의한 T7 DNA의 제한분체의 분석 및 분자량 결정"J.Mol.Biol.,110,pp.119-46(1977).32 p-라벨된 cDNA분체는 일본쇄 글로빈 cDNA에 대한 600-1000뉴클레오티드의 길이를 가지며 32p-라벨된 DNA분체가 사이즈마커로 사용되었다.

이본쇄 cDNA의 제조

DNA중합효소로 처리함으로서 일본쇄 DNA 를 이본쇄로 할 수 있다(T.Maniatis 등의 "Amplification And Characteriz-ation of A β -Globin Gene Synthesized In Vitro-생체외에서 합성된 β -글로빈유 전자의 증식과 특성", Cell,8,pp.163-82(1976)).

침전된 일본쇄 cDNA를 200μ l H₂O에 용해시키고, 2분간 100℃로 가열하고, 0.1M의 열변성된 인산칼륨 완충액(pH 6.9), 10mA 염화마그네슘 10mM DTT (Calbiochem), 1mM의 DATP(Merck)와 dGTP(Schwarz)와 dCTD(Laevosan), 1mM3H-dTTP(NEW, 특이활성 100,000 cpm/nmole)과 E.coli DNA중합효소 I(Boehringer-Mannheim)150단위/ml에서 배양한다.

15℃에서 6.5시간후, 0,5M EDTA와 20% SDS를 10mM EDTA와 0.1% SDS가 되도록 가한다. 500μ l페놀로 추출하고, 이것을 20mM 트리스-염산(pH 7.5), 5mM EDTA("TH완충액")250μ l로 재추출한다. 2개의 액상을 결합하고, 상술한 바와같은 조건상태에서 5-ml의 Sephadex G-100컬럼상에서 크로마토그래피한다. 소디움 아세테이트(3M)를 0.3M되게 가하고 2.5부피 에탄올을 그 침전물에 혼합한다. 총 13μg 의 DNA가 회수되었다.

R.C Wiegand 등의 "Specificity of The S₁Nuclease From Asperhillus oryzal-아스퍼질러스오리잘에서의 S₁뉴클레아제의특이성", J.Biol. Chem., 250, pp. 8848-55(1975)의 방법으로 제조된 뉴클레아제 S₁으로 DNA를 처리한다. 침전된 DNA를 250μ S₁완충액(0.2M 염화나트륨, 50mM 소디움 아세테이트(pH 4.5), 10mM 아연황산염)에 녹이고, 30분간 37℃로 가온한다. 15μl/의 효소(11단위/μl)를 가하고 37℃로 30분간 배양한다.

SDS와 EDTA를 각각 0.1%와 5mM되게 가하고, 250μl 페놀로 추출한다. 이것을 100μl의 TE완충액으로 추출한다. 액상을 결합하고, TNE의 Sephadex G-100(Pharmacia)컬럼상에서 크로마토그라피한다. 0.3ml/분의 속도로 0.1ml의 분획을 수거하고, 각 분획의 Cerenkov방사능을 측정한다. 상술한 바와같은 에탄올과 소디움 아세테이트로 침전시킨후 8μg 의 cDNA가 수집된다.

그런데 이 산출된 이본쇄 cDNA는 그중 극히 일부만이 IFcDNA 또는 그것의 분체인 많은수의 cDNA와 그것의 분체의 혼합물임을 알아야 한다(제 1 도).

이본쇄 DNA의 클로닝

광범위한 종류의 숙주/클로닝 매개체 결합이 상기 제조된 이본쇄 cDNA의 클로닝에 사용될 수 있다. 예를들오, 유용한 클로닝 매개체는 염색분체, 비염색체 및 합성 DNA서열로 이루어질 수 있는데, 예로서 col El,pCRl,pBR322 및 그들의 유도체를 포함하는 E.coli로 부터의 플라스미드와 같은 공지의 여러 박테리아플라스미드, 광범위한 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 RP4, 파아지DNA, 그 예로 NM989와 같은 파아지λ 의 수많은 유도체와 파아지 DNA 또는 다른 표현 조절 서열을 포함하도록 변형된 플라스미드 또는 2μ 플라스미드와 같은 효모 플라스미드와 같은, 플라스미드와 파아지 DNA의 결합에서 유도된 벡터 등이다.

유용한 숙주는 E.coli HB 101,E.coli X 1776,E.coli X 2282,E.coli MRCI와 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스 서브틸리스(B.subtilis), 바실러스 스태로 터모필러스(b.stearother-mophilus)와 다른 간균류, 효모 및 진균, 배양중의 동식물세포 등일 수 있다. 물론, 모든 숙주/벡터결합이 효과적이지는 않다. 숙주/클로닝 매개체 결합의 특정한 선택은 설명된 기본 원리를 고찰한후, 기술 숙련가에 의해 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고서 아루어질 수 있다. 또한 각 특정 클로닝 매개체내에서, 이본쇄 DNA 삽입을 위해 여러 부위가 선택될 수 있다. 이들 부위는 그들을 전달하는 제한 엔도뉴클레아제로 일반적으로 지시된다.

예를들면, pBR 322에서 Pst I부위는 β-락타아제에 대한 유전자에서 그 단백질의 아미노산 181과 182를 암호하는 뉴클레오티드 트리플레트들 사이에 소재한다. 이 부위는 상기의 Villa-Komaroff등에 의하여 쥐의 프로인슐린 항원결정기를 나타내는 단백질합성시에 사용되었다. pBR 322에서 두개의 Hind II엔도뉴클라제 인식부위중 하나는 β-락타아제의 아미노산 101과 102를 암호하는 트리플레트들 사이에 소재한다. 비슷한 방식으로, 플라스미드내에서 EcoRI부위와 PvuII부위는 암호부위의 외부에 있는데 EcoRI부위는 각각 테트라사이클린과 암피실린에 대한 내성을 암호하는 유전자사이에 소재한다.

이 부위는 Itakura 등과 Goeddel등에 의해 재조합 합성 기획에 사용되었다. 이 부위들은 기술 숙련가들에게 널리 공지된 것들이다. 물론 본 발명에 유용한 클로닝 매개체는 선택된 DNA분체의 삽입을 위한 제한엔도뉴클레아제 부위를 가질 필요가 없다. 대신, 그 매개체는 다른 방법에 의해 그 분체에 결합될 수 있다.

벡터 또는 클로닝 매개체와 재조합 DNA분자를 형성하도록 선택된 DNA분체를 접착시키기위한 위치는 여러가지 인자로 결정되는데, 예를들면, 특정한 제한 효소에 대한 감수성 부위의 수, 표현될 단백질의 크기, 숙주세포 효소에 의한 단백질 분해에 대한 목적하는 단백질의 감수성, 정제중에 제거하기 어려운 숙주 세포 단백질에 의한 단백질오염, 벡터서열에 대한 개시와 정지 코돈 위치와 같은 표현특성등에 의해 결정된다. 즉, 삽입부위나 벡터의 선택은 이들 여러 요인을 평형시킴으로서 결정되며, 모든 선택이 언제나, 주어진 경우에서 똑같이 효과적일 수는 없다.

외인성 DNA 를 클로닝 매개체에 삽입시키는 몇가지 방법이 알려져 있지만, 본 발명에 보다 바람직한 방법은 Villa-Komaroff등의 상기 문헌에 설명되어 있고, 제 1 도에 전개되어 있다. 이 방법은 삽입을 위해 선택된 부위(특히 PstI)에 특이한 제한효소로 플라스미드를 효소분해시키고 그 말단에 말단 전이 효소에 의해 dGMP쇄(tail)를 붙이는 것을 특징으로 한다. dGMP쇄를 절단된 플라스미드의 5'말단에 접착시켜 PstI부위를 재생시키고 보족쇄를 가진 cDNA분체에 결합되도록 한다.

마찬가지 식으로, 이본쇄 cDNA를 3'말단에 dGMP쇄를 붙여 연장시키고 상기의 쇄가 부착된 플라스미드(taild plesmid)에 결합되도록 한다. 쇄 부착된 플라스미드와 cDNA는 아닐링되어 그 플라스미드의 적합한 부위에 cGNA가 삽입되고 하이브리드 DNA가 환상이 되는데, 그 쇄(tail)들의 보족 특성(상보성)이 그들의 부착을 가능하게 한것이다(제 1 도). 결과의 재조합 DNA분자는 선택된 제한 부위에서 유전자를 가진다(제 1 도).

물론, 재조합 DNA분자를 제조하기 위하여 클로닝 매개체에 DNA서열을 삽입하는 다른 공지의 방법도 본 발명에서는 유용하다. 예로서, 직접 결찰이나 또는 합성 링커, 엑소뉴클레아제와 중합효소-결합 복고 반응후 결찰하거나 또는 DNA중합효소와 적합한 일본쇄 주형으로서 DNA쇄를 연장하여 결찰시키는 것을 포함한다. 물론, 클로닝 매개체의 선택부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열 또는 cDNA본체는 목적 폴리펩티드에 대한 실제적 구조 유전자의 부분이 아닌 뉴클레오티드를 함유할 수 있거나 또는 목적 단백질에 대한 완전한 구조유전자의 분체만을 함유할 수도 있다.

어떠한 DNA서열이 삽입되었든지, 형질전환된 숙주는 HIF의 생물학적 또는 면역학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하거나 또는 생물학적 그 DNA서열이 HIF의 면역학적 또는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 데 유용한 DNA서열을 함유하는 클론을 선택하기 위한 하이브리드화 프로오브로서 사용된다는 것이 요구되어질 뿐이다.

외래 유전자를 함유한 클로닝 매개체 또는 벡터는 하이브리드 DNA에 의해 단백질 또는 그 부분을 표현하도록 숙주를 형질전환시키기 위해 사용된다. 적합한 숙주의 선택은 수많은 인자에 의해 또한 조절된다. 예컨대 벡터와의 적합성, 하이브리드 플라스미드로 암호된 단백질의 독성, 목적단백질 회수의 용이성, 표현특성, 생안정성, 비용등에 따라 선택된다. 모든 숙주가 특정한 재조합 DNA분자 표현에 똑같이 유효하지 않다는 것을 이해하여 그들 인자들을 조화시켜야 한다.

본 발명에서, 적절한 클로닝 매개체는 박테리아 플라스미드 pBR 322이고, 바람직한 제한 부위는 PstI 부위이다(제 1 도). 그 플라스미드는 항생물질 암피실린(Amp)과 테트라사이클린(Tet)에 대한 내성 유전자를 지닌 작은 플라스미드이다(분자량은 약 2.6메가 달톤) 이 플라스미드는 그 특성이 완전히 규명되었다.

(F.Bolivar등dml "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System-신규 클로닝 매체의 조립과 특징. 다목적 클로닝 시스템", Gene,pp.95-113(1977) ; J.G.Sutcliffe,"pBR 322 Restriction Map Derived From the DNA Sequence : Accurate DNA Size. Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long-DNA서열에서 유래된 pBR 322제한 지도 : 4361뉴클레오티드 까지의 정확한 DNA사이즈 마커", Nucleic Acids Research, 5,pp.2721-28(1978))이 부위에 DNA산물을 삽입하면 각 클론이 미리 제조되었던 DNA에 존재하는 DNA유전자들 또는 그것의 분체들의 하나를 함유하는 수많은 박테리아 클론이 제공된다. 이들중 소수의 클론만이 인터페론 유전자 또는 그것의 부분을 함유할 것이다.

본 발명에서 적절한 숙주는 E.coli HB 101이다. 영국 특허1,516,458에서 공지되고 미합중국, 매릴랜드주, 룩크빌시의 ATCC(American Type Culture Collection) 에 ATCC 31244호로 기탁 보관된 E.coli X 1776으로 다른 실험을 수행하였다.

1. PstI-분해되고 dGMP-연장된 pBR 322의 제조

150μ l의 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 50mM 염화나트륨, 6mM2-메르캅토 에탄올, 200mg/μ l 소혈청 알부민("BSA")(Calbiochem)중에서 PstI엔도뉴클레아제(MRE Porton Downs or New England Biolabs) 21단위로 플라스미드 pBR 322(20μ g)을 효소분해한다 2시간후 37℃로 1부피 페놀-클로로포름(1 : 1)과 1부피 에테르로 추출하고, 에탄올로 침전시킨다.

100mM 소디움 카고딜레이트(pH 7.2), 10mM 5mM 염화마그네슘, 1mM dGTP, 50μ g/μ l BSA와 DNA 1ug당 3-6단위의 TdT를 함유한 328μ l반응액에서 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)

(F.J.Bollum, "Deoxyncleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland-송아지 흉선으로 부터의 데옥시뉴클레오티드 중합효소 "Methods in Enzymology,(L.Grossman and K.Moldave,eds.)에 의해 정제)로써 호모폴리머릭 dGMP쇄(tail)를 가한다(제 1 도)

37℃로 20분간 배양한다. EDTA 10mM을 가한후, 상술한 바와같이 그 혼합물을 추출하며, TNE완충액에서 2일간 투석한다.

2. dGMP-연장된 DNA의 제조

이본쇄 DNA를 표준방법에 의해 dCMP잔기로 연장시킨다. (예 Villa-Komaroff의 상기 문헌). 8ul의 100mM 소디움 카코딜레이트(pH 7.2), 2.5mM 염화코발트 50ug/ul BSA, 1μg DNA당 정제된 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 3-6단위를 함유한 0.1mM dCTP에서 27℃로 8분간 150ng의 이본쇄 cDNA를 배양한다. 전술한 바와같이 dCMP로 연장된 DNA는 서로 다른 여러종의 혼합물로, 극히 일부만이 인터페론과 관련된 것이다(제 1 도).

3. Ca⁺⁺로 처리한 E.coli X1176의 제조

100ug/ml의 디아미노피멜산(Koch-Light Laboratories), 10ug/ml 나리딕시 산(Calbiochem)과 10ug/ml의 테트라사이클린(아크로마이신 R.Amercan Cyanamid)으로 보충된 100ml트립톤 배지(C.Weissmann and W.Boll, "Reduction of Possible Hazards In The Preparation of Recombinant Plasmid DNA-재조합 플라스미드 DNA제조시 위험성 감소", Nature, 261 pp. 428-29(1976), 에 E.coli X1776의 단일 콜로니를 접종시킨다.

37℃에서 OD650에서 광학 밀도가 될때까지 배양한다.

Sorvall H4 에서 4000rpm으로 피스톤 회전기를 써서 침전시키고, 500ml 10mM 염화나트륨으로 세척하고, 원심분리하여 200ml 100mM 염화칼슘에 재부유시킨다. 이것을 30분간 얼음에 냉동시키고, 얼음 원심분리로 펠렛트화 시킨후 4ml의 100mM 염화칼슘에 재부유시키고, 하룻밤 얼음에 재운다. E.coli HB101은 M.Mandel과 A.Higa의 "Callcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection-칼슘-의존성 박테리오파이지DNA감염", J.Mol.Biol.,53,pp.159-62(1970)의 방법으로 형질전환된 것이다. -70℃에서 부분분획(0.5ml)을 냉동시키면, 최소한 3개월간 활성을 유지한다.

4. dGMP-연장된 pBR 322와 dCMP -연장된 DNA의 아닐링

J.Van den Gerg 등의 "Comparision Of Cloned Rabbit And Mouse β-Globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Introns-인스론의 두 가지 동질쌍의 강진화성 이탈을 나타내는 클론화 레벳과 마우스 β-글로빈 유전자의 비교", Nature, 276, pp.37-44(1978)에서 설명된 바와같이 Pstl-절단되고 쇄(tail)부착된 pBR 322와 쇄 부착된 cDNA를 아닐링한다. 50μl TNE 완충액에서 22ng의 dGMP-연장된 Pst I-분해된 pBR 322와 함께 8ng의 dCMP-연장된 DNA산물을 혼합한다. 4연속으로 각 1시간동안 65℃, 46℃, 37℃, 20℃에서 배양한다. 20μl의 100mM 트리스-염산(pH7.5), 100mM 염화칼슘, 100mM 염화마그네슘과 50μl TNE 완충액을 가하고, 20분간 얼음에서 냉동시킨다.

물론, 이들은 삽입된 유전자가 없는 여러가지 재조합 DNA분자와 클로닝 매개체의 혼합물이다. 그러나 각 재조합 DNA분자는 Pst I부위에 cDNA를 함유하고 있다. 이같이 상기의 약 cDNA단편은 하나의 유전자 또는 그것의 분체를 함유할 수 있다. 단지 이들중 극히 일부만이 cDNA단편이 인터페론을 암호한다(제 1 도).

5. 아닐링된 하이브리드 플라스미드로써의 E.coil×1776의 트란스펙션

J.Van den Berg 등의 상기 문헌에 공지된 바와같이 재조합 DNA분자 혼합물로써 E.coil×1776의 트란스펙숀을 실시한다. P3봉쇄설비를 트란스펙숀 과정과 그 결과의 형질전환된 박테리아를 다루는 모든 단계에서 사용한다. 아닐링된 pBR 322 재조합 DNA분자를 100μl의 Ca⁺⁺처리한 E.coil×1776에 가하고 그 혼합물을 20분간 얼음속에서 냉동시키고, 10분간 20℃로 가열한후, 0.6ml 트립톤 배지를 가한다. 이 혼합물을 상기와 같이 보충된 2트립톤 배지 아가플레이트상에 넣는다. 트란스펙숀 효과는 아닐링된 pBR 322는 트란스펙트 DNAμg당 3.3×10⁴콜로니이다 : 천연 pBR 322는 3×10⁶콜로니를 제공한다. 플라스미드 pBR 322는 테트라사이클린 내성유전자를 지녔으므로, 그 유전자 전체를 지닌 플라스미드로 형질전환된 E.coil숙주는 그 항생제가 있는 배지에서도 생장할 수 있다. 즉, 테트라 사이클린을 함유한 배양배지를 사옹하여 재조합 DNA분자 또는 환상벡터로 변형된 숙주를 분리할 수 있다.

37℃에서 48시간후, 각 콜로니를 수집하고, 마이크로타이터 플레이트(Dynatech)의 웰에서 100μl 트립토판 배지(상기와 같이 보충)에 현탁시킨다. 37℃로 하룻밤 배양후, 40%글리세롤 100μl를 각웰에 가한다. 이 플레이트를 -20℃에 보관하면, 형질전환된 E.coil×1776의 100,000개의 각 클론의 라이브러리(library)가 제조된다. 이들 100,000개 클론은 IF-생산백혈구로부터의 폴리(A) RNA 제조물에서 mRNA의 혼합물의 완전한 또는 부분적인 복사를 나타내는 여러가지 재조합 DNA분자를 함유한다(제 2 도). 이들의 대부분이 단일 재조합 DNA분자만을 함유할 것이다. 이들 재조합 DNA분자중 극히 일부분만이 IF에 관련된다. 따라서, 인터페론을 생산하는 클론을 분리해내야 한다.

IFcDNA를 함유한 클론의 스크리닝

인터페론 cDNA("IFcDNA")를 함유한 클론의 분리에는 몇가지 방법이 있다. 예를들면 RNA 선택하이브리드화법(Alwine 등 하기 문헌), 분화 하이브리드화법(T.P.St.John과 R.W.Davis의 "Isolation of Galactose-Inducible DNA Sequences from Saccharomyces Cerevisiae by Differenetial Plaque Filter Hybridization", Cell, 16, pp.443-452(1979) ; Hoeijmakers 등의 하기 문헌), 합성소식자와의 하이브리드화법(B.Noyes 등의 Detection and Partial Sequence Analysis of Gastrin mRNA by Using An Oligodeoxyuncleotide Prode", Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76, pp.1770-1774(1979) 또는 면역학(L.Villa-Komaroff등의 상기 문헌) 또는 생물학적(A.C.Y.Chang등의 상기 문헌)분석에 의한 목적단백질을 생산하는 클로운 스크린방법등이 있다. 본 발명가들은 RNA선택 혼합화법을 사용했다.

가. RNA 선택하이브리드화 분석

1. 최초분석의 개요

제 2 도를 설명하자면, 상기의 클론라이브러리(제 2 도의 2클론이 두가지 혼합물)로부터의 512개 클론 혼합물 배양물로부터 재조합 DNA분자를 분리한다(단계 A). 재조합 DNA분자는 분해해서, 변성시키고, 상기에서 제조한 IFmRNA를 지닌 백혈구 폴리(A)RNA에 하이브리드화 시킨다. (단계 B). 모든 재조합 DNA분자-폴리 (A)RNA 하이브리드를 비하이브리드화 폴리(A)RNA와 분리한다(단계 C). 그 하이브리드로부터 분리된 폴리(A)RNA를 정제한다(단계 D). 회수된 RNA를 IFmRNA활성에 대하여 상기와 같이 분석한다(단계 E). 만일 엄중한 하이브리드화 조건하에서 재조합 DNA분자 혼합물이 폴리(A)RNA내에 IFmRNA에 하이브리드화 할 수 있는 삽입된 뉴클레오티드 서열을 지닌 재조합 DNA분자를 포함한다면, 어떠한 다른 재조합 DNA분자-폴리(A)RNA 하이브리드로부터의 mRNA 인터페론과는 무관할 것이므로, 상기의 하이브리드로부터의 mRNA는 난모세포내에서 인터페론을 생산할 것이다. 만일 512개 클론그룹에 양성반응을 보이면, 64개씩된 8개 로트로 분리하고, 각 로트별로 전술한 바와같이 분석한다. 이 분석에 반응하는 단일클론이 동정될때까지 이 과정을 계속 실시한다.

재조합 DNA분자와 그에 의한 형질전환된 박테리아클론이 IF의 IFcDNA의 완전한 서열을 함유한다거나 또는 그 DNA 서열이 실제로 IF를 암호한다는 보장은 없다.

그러나, 그 재조합 DNA분자는 틀림없이 IFmRNA 암호서열에 상보하는 광범위한 뉴클레오티드 서열을 함유할 것이다.

그러므로, 그 재조합 DNA분자는 확실하고 완전한 인터페론 뉴클레오티드 암호서열을 지닌 클론을 동정하기 위하여 다른 재조합 DNA분자와 그들로써 변형된 클론을 신속히 스크린하기 위한 프로오보의 소오스로서 사용될 수 있다.

2. 이론적 고찰

하이브리드화조건(단계 B)은 극히 정밀해야 한다. 반응속도와 화학양론을 고려하여, 재조합 DNA분자와 폴리(A)RNA내의 절대농도의 비율이 선택되어야 한다. 폴리(A)RNA내의 IFmRNA비율이 알려지지 않았으므로, 정확한 선택이 이루어지기가 어렵다. 재조합 DNA분자로부터의 DNA 서열 농도를 측정된 IFmRNA농도보다 과량인 조건하에서 하이브리드화를 실시한다. 512개의 여러 재조합 DNA분자 혼합물에서, IF-관련 DNA 서열이 발생하지 않거나(음성분석) 또는 이것은 적어도 약 1/512의 재조합 DNA분자를 이룰 것이다. 재조합 DNA분자 혼합물과 IFR DNA의 농도는 필요하다면, 적절한 하이브리드 속도를 유지하기 위하여 하이브리드화 단계에서 조절될 수 있다. 또한, 그 반응혼합물에서 IFR DNA의 양은 재조합 DNA분자-폴리(A)RNA 하이브리드로부터 회수된 mRNA가 난모세포내로 주입된후 IF를 검출하기에 충분한, 폴리(A)RNA로부터의 IFmRNA를 결합하기에 충분한 양이어야만 한다.

현재 이용되는 분석에 의해 인터페론을 검출하기 위해 그의 농도가 100IU/ml이상이어야 한다. 리클리케이트 측정에 0.5ml 부분표본이 필요하므로, 50IU가 난모세포에서 재생되어야 한다. 유도 백혈구로부터의 폴리(A)RNA는 난모세포내에 1μg을 주사하면 약 500IU의 인터페론을 생산한다. 그러므로 적어도 0.1μg의 폴리(A)RNA가 50IU를 생산하기위해 주입되어야 한다. 토끼의 글로빈 mRNA와 β-글로빈 cDNA클론으로 모델 실험결과 하기의 사실이 나온다.

하이브리드화 혼합물에 첨가한¹²⁵I-글로빈 mRNA에 대한 난세포에서의¹²⁵I-글로빈의 전체회수율은 약 10%이고, mRNA 활성의 회수율은 약 5%이다. 그러므로, 최소한 0.1/0.05=2μg의 백혈구 폴리(A)RNA가 하이브리드화 분석에 사용되어야 한다. 적절한 안전 여유분을 위하여, 각 분석마다 12ug의 폴리(A)RNA를 사용한다.

12μg 폴리(A)RNA내에서 IFmRNA 결합에 필요한 재조합 DNA분자로부터의 DNA양을 개선하기 위해, 폴리(A)RNA의 IFmRNA 함량을 측정한다. 폴리(A)RNA의 1μg은 500IU의 인터페론을 생산한다.

인터페론 특이활성은 2×10⁸과 10⁹IU/mg단백질 사이이다. 그러므로 인터페론 500IU는 500/2×10⁸=2.5×10⁶mg(2.5ng) 내지 500/2× 10⁹=2.5×10^-7mg(0.5ng)의 인터페론에 해당한다. 난모세포에 주입된 IFmRNA의 양과 생산된 인터페론의 양의 관계는 미지이다. β-글로빈 mRNA의 경우, mRNA분자당 약 30분자가 시간당 생산된다 ; 이 값은 베타-글로빈의 경우 약 6이다. (J.B.Gurdon 등의 "Message Stability In Injected Frog Oocyter : Long Life of Mammalian And β-Globin Messages-주입된 개구리 난모세포에서의 메세지 안정 : 포유류와 β-글로빈 메시지의 장 수명 "J.Mol.Biol., 50, pp.539-51(1973))인터페론에 대해 20의 평균치, Le IF에 18000의 분자량, IFmRNA에 330,000분자량을 가정하면, 주입된 IFmRNA의 mg당 29mg(18000/330,000×20×24)의 인터페론이 24시간내에 생산될 것이다. 만일 인터페론의 특이활성이 2×10⁸/mg(2×10²IU/ng)이면, 1ng의 IFmRNA은 26×2×10²=5.2×10³IU의 인터페론을 생산할 것이다. 만일 특이활성이 10⁹/mg(10³IU/ng)이면, 생상된 인터페론의 양은 2.6×10⁴가 될 것이다. 상기의 가정된 조건에서는, 백혈구 폴리(A)RNA의 1μg이 인터페론 50IU를 산출하므로, 1μg의 폴리(A)RNA내에서 IFmRNA 농도는 0.1ng에서 0.20ng사이에 해당하며, 백혈구 폴리(A)RNA내에서 IFmRNA비율은 1:10,000과 1:50,000 사이이내에 놓일 것이다. 따라서 폴리(A)RNA의 12μg은 약 1.2에서 0.2ng의 IFmRNA를 함유한다.

난모세포내에서 IFmRNA의 번역비가 글로빈 mRNA 평균치에 비해 배수비로 낮아진다면, 폴리(A)RNA의 IFmRNA 농도는 상기 계산보다 10배가 높거나, 또는 약 1:1000에서 1:5000 사이가 될 것이다. 그리고, 12 μg의 폴리(A)RNA는 IFmRNA 12ng 내지 2ng을 함유할 것이다. 한편, IFmRNA의 번역비가 글로빈 mRNA에 대한 평균치보다 배수비로 높을 경우, IFmRNA 함량은 상기의 계산보다 10배가 낮거나, 약 1:100,000과 1:500,000 사이가 될 것이다. 그리고 12μg의 폴리(A)RNA는 0.1ng에서 0.02ng의 IFmRNA를 함유할 것이다.

플라스미드 pBR 322는 4361의 염기쌍을 가진다. IFmRNA 의 완전한 cDNA가 pBR 322-IFcDNA를 이루면서 pBR 322에 약 800-1000염기쌍이 첨가되어 총 약 5200-5400의 염기쌍이 된다. 이것의 분자량은 IFmRNA 단독의 것보다 약 12배가 된다(2×5200/800). 그러므로, 그 분석에 필요한 12μg의 폴리(A)RNA에 존재하는 상기 계산된 IFmRNA를 결합시키기 위하여는 IFmRNA양의 12배에 해당하는 재조합 DNA분자의 양이 필요하다(화학적양론적인 양).

재조합 DNA분자 제조에 사용되는 IFmRNA 함량이 조 폴리(A)RNA의 것보다 10 내지 40배 증가했으므로, 512개의 클론 그룹은 상기의 계산보다 10 내지 40배의 목적의 IFmRNA를 함유할 것이다.

단일 IFmRNA가 조 폴리(A)RNA의 1000분의 1일 경우, 이때 12ug의 폴리(A)RNA는 12ng의 IFmRNA를 함유하고, IFmRNA의 양은 화학양론적으로 144ng이다. 512개 클론그룹은 최소한 IFcDNA삽입체를 지닌 것 5개를 포함하므로, 필요한 총 하이브리드 플라스미드 DNA양은 1408μg이다(144×512/5×10^-3). 만일 IFmRNA가 10,000분의 1일 경우, 이때 12μg의 폴리(A)RNA는 1.2ng의 IFmRNA를 함유하고, 필요한 IFcDNA 플라스미드양은 14.47ng이다. 512개 클론그룹은 0 또는 1개의 IFcDNA 삽입체를 함유할 것이고 그러므로 필요한 전체 하이브리드 플라스미드 DNA양은 7.4μg이다(14.4×512×10^-3). 하이브리드화 반응이 DNA과량 조건(즉, 폴리(A)RNA에 대한 과량의 재조합 DNA)하에 진행되기 위하여서는 20μg의 혼합물(약 1.4 내지 30배 과량)이 이분석에서 선택되었다. 하이드리드화는 하기 조건하에서 수행되어야 한다 : (a) 폴리(A)RNA의 하이브리드된 부분이 완전하고, 생물학적으로 활성된 형태로 회수되어야 한다. (b) 비특이성 DNA-mRNA결합이 억제되어야 하고, (c) 하이브리드화 반응이 최소한 75% 완결되어야 한다.

이들 조건은 80%포름아미드, 0.4몰 염화나트륨에서의 혼성화와 가장 잘 부합되는 것 같다(J.Casey 와 N.Davidson의 "Rates of Formation and Thermal Stability of RNA : DNA and DNA : DNA Duplexes At High Concebntrations of Formamide-고농도 포름아미드에서 RNA : DNA와 DNA : DNA의 열안정성과 생성속도", Nucleic Acids Res., 4, pp.1539-53(1977)). 이 용액에서 하이브리드화는 약 40℃에서 수행될 수 있다.(포름아미드가 없으면 60℃-70℃). 온도가 낮을 수록 폴리(A)RNA에 대한 손상이 감소된다. 본 반응은 56℃에서 수행되었다. 이것은 T_1/21(J.Casey와 N. Davidson등의 상기 문헌)보다 약 3°가 낮고, T_1/2d(Hamaguchi와 Geidushek의 J.Amer.Shem.Soc., 84, P.132)보다 약 10-13°낮다. 1%부정합(mismatch)은 T_1/2d를 1°낮추므로, 이 온도는 서열의 하이브리드화를 87%이하의 동질성으로는하지 않는다. (T.F.Bonner등의 "Reduction In The Rate of DNA Reassociation By Sequence Devergence-서열 전환에 의한 DNA 재조합 속도의 감소", J.Mol.Biol, 81, p. 123-35(1973)).

이 하이브리드화에서, 사용된 DNA혼합물이 동일한 베터(pBR 322)와 다양한 cDNA 삽입물로 이루어졌으므로, DNA의 자체-하이브리드화는 중대한 문제가 아니다. 그러므로, 대부분의 DNA 서열은 그 삽입물이 폴리(A)RNA 하이브리드화에 이용될 수 있는 이질쌍 복합물(hetero duplex)이 될 것이다. 서로 다른 쌍복합물(duplex)부분을 형성하는 보족 cDNA 삽입체는 위상 수학적 구속(topological constraints)때문에 상호작용하지 않을 것이다. 여하튼, DNA : DNA 재조합은 사용된 반응조건하에서 최소화 된다(J.Casey와 N.Davidso의 상기 문헌).

최소한 75%의 반응을 위한 하이브리드화 시간결정을 위해, 다음 2차 방정식이 사용된다 :

이때, R=하이브리드된 RNA의 뉴클레오티드의 몰 농도

Co=하이브리드화 되는 최초 DNA의 뉴크레오티드의 몰 농도

Ro=하이브리드화 되는 최초 RNA의 뉴크레오티드의 몰 농도

K_R=RNA-DNA 하이브리드화 비율 상수

t=시간(초)

그리고, R/Ro=0.75(75%반응완결)

k_R=472[k_R=1/12k_d(J.Casey와 N.Davidson의 상기 문헌)]

k_d=선택된 하이브리드화 조건하에서 DNA에 대한 이차속도 상수

또한, k_d=1.7×10⁵×L^1/2×N^-1(J.R.Hutton과 J.G.Wetmur의 "Renaturation BacteriophageΦ×174 DNA-RNA 하이브리드 : RNA Length Effect And Nucleation Rate Constant-박테리오 파지 Φ×174 DNA-RNA 혼성물의 원상 복귀 : RNA 길이 효과의 핵생성 속도 상수", J.Mol.Biol., 77, p. 495-500(1973)).

L=900(염기쌍에서의 쇄길이 : 약 900이 완전한 IFcDNA 삽입물에 존재한다)

N=900(하이브리드 쇄의 염기쌍에서 복잡성 : IFmRNA의 900개 뉴클레오티드가 인터페론 cDNA 삽입체와 900개의 보족 뉴클레오티이드와 결합했기 때문에 그 복잡성는 900이다)

Co=2.5×10^-7(IFcDNA 삽입체가 재조합 DNA분자의 1/12이고 512개 클론 중 적어도 1개에서 발생할것을 가정하고 또한 한개 DNA염기상의 평균 분자량이 662임을 설정하여, 분석에 사용되는 재조합 DNA분자의 20μg을 함유한 40μ l의 용액을 기준으로 함).

Ro=8.7×10⁸(폴리(A)RNA가 1:10000의 IFmRNA를 함유했음을 전제로 하고(여러 비율의 과량의 RNA를 제공하여도 하이브리드화 속도에는 거의 영향이 없다), RNA의 리보 뉴클레오티드의 평균분자량을 343로 설정하고 그 분석에 사용되는 폴리(A)RNA의 12μg을 함유한 40μ l의 용액에 기준함

3. 최조 분석의 실시

단계 A-재조합 DNA분자 혼합물의 제조와 분해.

상술한 바의 보충 트립톤 아가배양배지 플래이트상에 목적하는 수의 박테리아클론을 접종시키기 위하여 각 마이크로타이터 웰로부터 부분표본을 그 배지에 전이시킨다. 37℃에서 배양시키면, 각 클론은 수 mm직경으로 자란다. 모든 콜로니는 세척하고 혼주하여, 21 Erlennyer 플라스크내외 1l의 상술한 바와 같이 보충된 트립톤 배양배지를 접종하는데 사용될 접종물을 만든다. 이것을 OD₆₅₀이 약 0.8(육안으로 측정)이 되도록 37℃에서 교반한다. 1부피의 보충 트립톤 배지와 클로르 암페니콜을 170μg/ml가 되게 그 배양체에 가한후 37℃에서 16시간동안 교반한다. 클로로포름 20ml를 가하고, 그 배양체를 다시 37℃에서 10분간 교반하여 박테리아를 사멸시킨다. (C.Wesissmann과 W.Bell의 상기 문헌). 클로로포름에서 배양체를 떠낸다음, 4℃에서 6000rpm으로 20분간 원심분리하여 세포를 수거한다. (Sorvall GS3 회전지). 1l제조몰당 약 1-2그람의 세포가 수집된다. 30ml의 20mM 트리스-염산(pH7.5)에 그 세포를 현탁시키고, 4℃에서 500rpm으로 20분간 원심분리후 30ml의 50mM 트리스-염산(pH7.5)에 재현탁시킨다. 0.25부피 리소자임 용액(50mM 트리스-염산(pH7.5)중에 10mg/ml)을 가하고, 0℃에서 10분간 냉각시킨후, 0.33부피(원래의 50mM 트리스-염산-배양체 현탁액의 부피기준)의 0.5mM EDTA(pH8.0)을 교반하지 않고 조심스럽게 혼합한다. 0℃로 다시 10분후, 1/16부피(원부피 기준)의 2% 트리톤 X-100을 가한다. 60분후, Sorvall SW 교반기에서 0℃, 1000rpm으로 60분간 원심분리한다. 자기교반기가 있는 비이커에 그 상청액을 옮기고, pH가 12.5가 될때까지 3몰 수산화나트륨을 교반하면서 가한다. (Beckman pH10 탄산염 촨충액(No .3505)으로 표준화된 Orion Research Model 601 pH 메터와 유리전극을 사용)10분간 20℃로 교반후 pH를 8.5로 조절한다. 3분간 더 교반하고, 1/9부피의 5몰 염화나트륨과 '1'부피의 페놀(증류되고, 9.5몰 염화나트륨으로 평형시킨 것)을 가하고, 급격한 교반을 5분간 행한다. 10분간 0℃와 10,000rpm으로 원심분리하여 층을 분리시킨다.

제 I형의 DNA를 함유한 상청액(환상의 이본쇄 DNA)을 중간층(일본쇄 DNA 함유)으로부터 조심스럽게 제거하고, 클로로포름으로 3번 추출한다(이 단계에서 대부분의 페놀이 제거되어야 함). 제 I형의 DNA분획은 분석용으로 선택한 512개 클론의 일부를 이루는, 숙주세포를 형질전환시키는데 사용된 재조합 DNA분자(pBR 322-cDNA 삽입체)를 포함할 것이다. 제 I형의 DNA에 20μg/ml 농도가 되게 췌액 RNA ase A(5mg/ml, 85℃로 10분간에 가열됨)를 가하고, 37℃로 60분간 배양한다. 1/5부피 5몰 염화나트륨을 가하고, 최종농도 7.5% 되게 30%폴리에틸렌글리콜 6000(Union Carbide, 120℃로 20분간 고압살균)을 가한다. -10℃에서 2-16시간후, 0℃, 8000rpm으로 20분간 Sorvall SW 교반기에서 침전물을 수집한다. 260nm에서 흡광도 20이 되게 0.07몰 염화나트륨, 0.0075몰 나트륨-시트레이트에 용해시키고 0.5% SDS로 조절한다. 0.5mg/ml의 프로나제(37℃로 2시간, 20mg/ml에서 자가효소분해된 것)로 37℃에서 30분간 배양하고, 1부피 증류된 페놀로 3번 추출하고,1부피 클로로포름으로 2번 추출한다. 그 샘플은 SW 27 Beckmann 회전기를 써서 21000rpm으로 15℃로 15시낙 동안, 50mM 트리스-염산(pH7.5), 1mM EDTA 에서 5 내지 23%자당구배를 통해 원심분리한다. 분획을 수집하고 OD₂₆₀으로 모니터한다. DNA를 함유한 분획을 혼주하고, 소디음 아세테이트와 에탄올로 DNA를 침전시킨다. 제 I형의 DNA혼합물의 20-100μg을 원심분리에의해 수거한다. 정제된 제 I형의 DNA 20μg을 150μ l의 10mM 트리스-염산(pH7.5), 6mM 염화마그네슘, 50mM 염화나트륨, 6mM 2-메르캅토에탄올, 200μg/ml의 BSA 또는 젤라틴, 20단위 Hind III(New England Biolabs)에서 분해시킨다. Hind III 제한효소는 제 I형의 DNA를 pBr 322 부분내의 부위에서 분해한다(cDNA 부분도 또한 분해되지만, 만일 분해될지라도, 분석에 크게 영향을 미치지 못함). 37℃에서 2시간후에 분해가 완결되었는지를 확인하개 위하여 50mM 트리스-아세테이트(pH7.8), 2mM EDTA에서 1%아가로스겔을 통해 50mA에서 1시간동안 전기영동법으로 부분표본(1%)을 분석한다.

분해가 완결되지 않았다면, Hind III를 더 가하고 2시간 배양을 계속한다. 제 I형의 DNA가 완전히 직선형분자로 전환되면, 프로나제(Calbiochem)0.5mg/ml, 10mM의 EDTA와 0.5%의 SDS를 가한다. 37℃로 30분후 30μ l 페놀-클로로포름(1 : 1)으로 용액을 추출한다. 20mM 트리스-염산(pH7.7), 1mM EDTA 50μ l로 세척하고, 이것을 에테르로 3번 추출하고, 0.1ml Chelex 컬럼을 통해 여과시킨후, EDTA로 끓인 Pyrex_R시험관에 수집한후, 1/10부피 3몰 소디움 아세테이트와 2.5부피에탄올로 침전시킨다. 120℃에서 하룻밤 재운후, 원심분리로 DNA를 수집한다.

단계 B-폴리(A)RNA와 DNA의 하이브리드화 2가지 하이브리드화 혼합물을 제조한다. 제 1 혼합물은, 난모세포에 주입했을때 6000IU 인터페론을 생산하는 충분한 양, 즉, 10배 농축 혼성 완충액(4몰 염화나트륨, 0.1 1,4-피페라진-디에탄설포닉산)(pH6.4, 시그마), 50mM EDTA 0.5μ l (약 5ng)¹²⁵I-글로빈 mRNA(500cpm)와 6μ l 유도백혈구 폴리(A)RNA (2ug/ul))4ul를 함유한다.

혼합물 II는 10μ g의 Hind III 분해된 상기의 제I형의 DNA와 0.1μ g의 PstI-분해된 Z-pBR 322(H3)/Rc β G-4.13 (Hind III 부위에서 β-글로빈 서열을 함유하는 pBR 322 유도체)를 함유한다(Mantei등의 "Rabbit β-globin mRNA Production In Mouse L Cells Transformed With Cloned Rabbit β-globin Chromosomal DNA-클론된 토끼 β-글로빈 염색체 DNA로 형질전환된 마우스 L세포에서의 토끼 β-글로빈 mRNA 생산", Nature 281, pp.40-46(1979)). 제 1 혼합물과 제 2 혼합물에서의¹²⁵I-글로빈 mRNA와 β-글로빈 DNA는 하이브리드화 분석에 대한 내적 양성의 대조로 작용한다. 두개 혼합물을 질소가스 기류에서 건조시킨다. 제 2 혼합물에 80% 포름아미드 40μ l를 가하고, 이것을 100℃에서 10분간 변성시킨후, 얼음에서 급히 냉각시킨다. 이 변성액은 제 1 혼합물을 용해하는데 사용되고, 이렇게 산출된 액은 56℃로 4시간 배양한다.

단계 C-비하이브리드화 폴리(A)RNA로부터의 하이브리드된 폴리(A)RNA의 분리

차거운 0.9몰 염화나트륨 0.09몰 나트륨-시트레이트와 포름아미드(100%)로 1ml 4%(부피비)로 희석하고 그 용액을 밀리포어 여과지(0.45μ m 포오크기)를 통해 0.5ml/min으로 여과시킨후 모든 여과물이 똑같이 유효한 것이 아니므로 일단, 그 여과물의 RNA-DNA 하이브리드 보유성에 대하여 테스트한다.

단계 D-하이브리드된 폴리(A)RNA의 정제

상기의 폴리(A)RNA 하이브리드가 결합된 여과물을 1ml의 0.15몰 염화나트륨, 0.015몰 나트륨-시트레이트, 0.5% SDS에 37℃로 10분간 담그고, 50mM 트리스-염산(pH7.5), 10mM 염화마그네슘, 2mM 염화칼슘으로 세척한후, 신선한 완충액에 담근다. 5μ l의 요오드 아세테이트로 처리한 DNA ase(5mg/ml) 첨가한후 (S.B.Simmermann과 G.Sandeen, Anal.Biochem., 14, p.269(1966) ; P.A.Price 등의 "Alkylation of Histidine Residus At The Active Site Of Bovine Pancertic Deoxyibonuclease-소위췌장 데옥시리보 뉴클레아제의 활성부위에서 히스티딘잔기의 알킬화", J.Biol.Chem., 244, pp.924-32(1969)), 이 여과물을 37℃에서 10분간 배양한다.

여과물을 제거하고, 1부피 페놀과 1부피 에테르로 이 용액을 추출하고, 0.1ml Chelex 컬럼에 통과시킨다. 담체 RNA(정제된 효모 RNA)5μ g를 가하고, 소디움 아세테이트와 에탄옥로 RNA를 침전시킨다. 10,000xg에서 원심분리로 침전물을 분리하고, 1m EDTA 100μ 1에 용해 시킨후, 100℃로 90초간 가열한다. 여기에 2×TNE와 0.5% SDS를 가한다. 100-μ 1 올리고(dT)셀룰로스컬럼에 RNA를 흡착시키고, 0.3ml 증류수로 4번 세척하고, 소다움 아세테이트와 에탄올로 침전시킨다. -20℃로 16시간 지난후, 원심분리로 침전된 RNA를 분리하고, 2μ 1의 TNK완충액에 용해한다.

단계 E-IFmRNA 활성의 측정

상기의 폴리(A)RNA용액을 40개 난모세포에 주입한다(각 난모세포당 약 50ml). 23℃에 24-48시간 배양한후, 균질화하고, 원심분리한후(또는 배양배지를 회수), 상술한 바와 같이 IF에 대하여 본석한다.

4. 연속분속-여과물-결합된 DNA에 대한 혼성화

단일클론으로부터의 재조합 DNA분자의 대부분의 연속적 분석은 DBM 또는 DPT 페이퍼-결합된 DNA로써 실시하는데 왜냐하면 이 분석조건이 엄격하지 않고, 간편하기 때문이다. DPT 페이퍼는 저 배경을 제공하며 우선적으로 사용된다. DBM페이퍼는 J.C.Alwine등의 "Method For Detecion of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl-Paper And Hybridization with DNA Probes-디아조벤질 옥시메틸-용지에의 전이와 DNA 프로오브로써의 하이브리드화에 의한 아가로즈겔에서의 특히 RNA의 검출방법", Proc.Nartl.Acad.Sci.USA, 14, pp.5350-54(1977))에 설명된 것과 같이 준비한다.

APT 페이퍼를 B Seed의 방법으로 제조한다 : 70ml 0.5몰 수산화나트륨, 2mg/ml NaBH₄와 30ml 1.4-부탄이올디글리시딜에테르의 혼합물과 함께 20℃에서 16시간 Whatman 540페이퍼(20g)를 진탕시킨다. 이 페이퍼를 40ml 아세톤에서 10ml 2-아미노티오페놀용액에 옮긴다. 10시간 교반, 아세톤, 0.1 노르말염산, 물로 완전히 세척하고 건조시킨다. ABM을 DBM 페이퍼로 전환시키는 방법에 대하여 설명된 바와 같이(Alwine등의 상기 문헌) APT 페이퍼를 DPT 페이퍼로 디아조화시킨다. J.H.J.Hoeijmaker등의 "The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary To Messenger RNA for Variant Surface Glycoproteins of Trypanosoma Brucei-트립파노소마 부루세이의 변형세이의 변형표면 글리코프로틴의 mRNA에 대한 보족 DNA를 함유하는 플라스미드의 분리", Gene, in press, (1980)와 하기 설명과 같이 DNA(15μ g 이하)를 50㎟ 디아조화된 ABM(DBM) 또는 디아조화된 APT(DPT) 페이퍼에 결합시킨다.

엔도뉴클레아제 Pst I로 하이브리드 플라스미드 DNA를 효소분해시키고, 1ml당 500μ g의 프로나제, 0.5% SDS와 10mM EDTA로 처리한후, 페놀과 에테르로 추출하고, 0.1ml Chelex 칼럼을 통과시킨후, 에탄올로 침전시킨다. 열변성된 DNA를 (소량의³²P-DNA가 추적자로 첨가된, 5μ g이하의 DNA) 0℃에서 1cm²DBM 또는 DPR 페이퍼로, 200μ 1의 25mM 인산칼륨 완충액에서, 하룻밤 배양한다. 50mM 인산칼륨 완충액(pH6.5), 1%글리신으로 실온에서 5분간 3번 세척하고, 99% 재결정된 포름아미드로 3번 세척한다. 99%포름아미드와 함께 2분간 68℃에서 배양한후 50mM 인산칼륨 완충액(pH6.5)에서 20℃로 세번 세척한후 0.4M NaOH 에서 37℃로 10분간 두번 세척한다. 여과지상에 약 40-60% 방사성이 보유된다. 이 여과지를 1%글리신(여과지당 330μ 1사용)으로 보충된 예-하이브리드화배지 A에서 3시간동안 38℃에서 배양한다. 배지(A)는 50%포름아미드, 5×SSC, 0.04%폴리비닐 피롤리딘, 0.04% Ficoll(Pharmacia), 0.1% SDS, 폴리(A)RNA 25μ g(P&L), 효모 RNA 100μ g(BDH, 페놀로 6번 추출되고, 에탄올로 침전된것)을 포함한다. 배지(A)에서 여과지를 2번 세척하고, 파라핀유 하에서 배지(A)에서 나타낸바의 (항시 5-6μ g)폴리(A)RNA로써 하이브리드화 시킨다. (38℃, 16시간). 하기와 같이 RNA를 가한다 : 하나의 젖은 DNA 여과지에 얼룩을 스미게하고 살균된 페트리 디쉬에 장치하고, 이 여과지 위에서 20-40μ 1의 RNA용액을 피펫트하고, 두번째 DNA 여과지(듀플리케이트 또는 콘트롤)를 위에 놓고, 살균된 파라핀유로 씌운다. 하이브리드화 시킨후 하기의 용액에 연속해서 그 여과지를 세척한다. 배지 A(2회), 1×SSC, 0.2% SDS, 1mM EDTA (3회, 각각 20℃에서 10분간), 배지A(2시간, 38℃)와 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS를 함유한 용액(3번, 10분, 20℃), 200μ 1의 10mM 트리스-염산(pH7.4), 1mM EDTA와 0.1% SDS에서 1분간 100℃로 가열시켜 하이브리드 RAN 를 용출한다.

용출과정은 2번 반복하고, 용출물은 조합해서, 2μ g 효모 RNA를 첨가한후 에탄올로 용출한다. 세척한 펠릿을 진공 건조하고, 3μ 1 물에 녹인후, 난모세포에 주입한다. 상술한 바와 같이 인터페론 활성을 측정한다.

5. RNA 선택하이브리드화 분석의 결과

512개 클론의 8개 그룹(즉, T,Y,j,K, , 0,Σ,π)으로부터의 분석은 음성이다.

4개그룹(I, δ, N, λ)은 양성이다. 하기의 양식으로 양성분석을 보고한다. 폴리(A)RND-DNA 하이브리드로부터 방출된 RNA에 의해 생성된 인터페론의 IU/ml(Z-pBR 322(H3)/Rc β G-4.13을 사용한 대조 하이브리드화로부터 분석) : 실험결과가 대조보다 높은 분석은 밑줄쳐 있다.

그룹 IU/ml

I <60(<60) ; 110(<20) ; <110(<110 ; <35(<35)

δ 20(<20)

N 35(<20) ; <110(<110) ; 200(<110)

λ <60(<60 ; 60(<20) ; 110(<110) ; <110(<110)

λ 그룹을 64개 클론의 8개 소그룹으로 나누고, 하이브리드화 시킨후, 전술한대로 분석한다. 소그룹은 하기 결과를 제공함.

소그룹 IU/ml

λ -I <35(<35) ; <35(<35)

λ -II 130(<30) ; <45(<45)

λ -III 225(<35) ; 35(<30) ; 35(<30) ; 600(<30) ; <20(<20)

λ -IV 85(<35) ; <25(<25)

λ -V <35(<35)

λ -VI <35(<35)

λ -VII <35(<35)

λ -VIII <35(<35)

소그룹 λ -III 을 8개 클론의 8개 조합으로 나누고, 하이브리드화 시킨후 분석함 :

세트 IU/ml

λ -III-1 <20(<20) ; <20(60) ; 35(<30)

λ -III-2 <35(<35) ; <30(<30) ; 150(<20) ; 600(<35 ; 110(60)

λ -III-3 <25(<25) ; <30(<30)

λ -III-4 30(<30) ; <20(<20) ; <20(60)

λ -III-5 30( ? )(<35 ; <20(<20) ; <35(60)

λ -III-6 <30(<30) ; <20(<20)

λ -III-7 <30(<20)

λ -III-8 <30(<20)

첫번째 양성결과가 λ -III-4에서 나왔으므로, 이 세트의 각 콜로니(A-H로 지명)를 하이브리드화시켜 분석함 :

λ -III-4-B <35^*(<35) ; <20(60)

λ -III-4-C 35(60) ; 60^*(<35) ; 111^*(<11) ; <11^*(<11) ; 20(<20)

(^*DBM용지법을사용하여 분석)

그러므로 λ -III-4-C가 IFmRNA를 하이브리드화할 수 있는 재조합 DNA분자를 함유한다. 이 클론에서 재조합 DNA분자는 하기와 같이 칭호됨 : Z-pBR 322(Pst)/HcIF-4c("Hif-4c"), 이것을 함유한 박테리아균주는 E.coli × 1776(Z-pBR 322 Pst)/HcIF-4c("E.coli Hif-4c")로 칭호됨. 이 명칭은 제조합DNA분자가 Zurich(Z)에서 유리됐으며, Pst I 부위에 HcIFcDNA("HcIF")를 함유한 플라스미드 pBR 322이며 ; 또한 특정한 재조합 DNA분자가 클론 λ -III-4-C("4c")에서 유도된 것임을 알려준다.

Z-pBR 322(Pst)/HcIF-4c의 리클로닝과 특징규명

형질전환된 세포의 일차클론이 때때로 한개이상의 재조합 DNA분자를 함유하므로 (Efstratiadis등의 "The Primary Structure Of Rabbit β-Globin mRNA As Determined Form Cloned DNA-클론된 DNA로부터 결정된 토끼의 β-글로빈 mRNA의 일차구조", Cell, 10, pp. 571-85(1977), E.coli X 1776(HΦf-4c)클론으로부터 Hif-4c 를 분리하고 상기와 같이 정제한다. Pst l으로 Hif-4c와 pBR 322를 분해하고, 1% 아가로즈겔상에서 전기영동에 의해 분석한다.

Hif-4c는 Pst-분해된 pBR 322의 유동성을 지닌것과 약 320 염기쌍에 해당하는 유동성을 지닌것의 2가지 밴드를 산출한다.

분리된 Hif-4c로서 E.coli HB 101을 형질전환시킨다. 테트라사이클린에 저항성을 띄도록 형질전환된 박테리아 6개 클론을 수집해서, 소 배양체를 제조하고, 제 I 형의 DNA를 정제하고 전술한대로 Pst I 분해법과 아가로즈겔 전기영동에 의해 분석한다. 모든 샘플을 Hif-4c와 동일한 분해 패턴을 보인다. 이들 리클론된 재조합 DNA분자중 한가지를 Z-pBR 322(Pst)/Hif-4c("Hif-4c")로 명명하고, 실험에 사용한다.

소문자"c"는 리클론화된 DNA분자를 말한다.

Hif-4와 이것의 cDNA삽입체의 IFmRNA에 대한 하이브리드화 능력을 측정하기 위해, 125단위 Pst I 로 Hif-4c(115마이크로그람)를 완전히 분해하고, 페놀과 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킨다. 부분표본(10μ g)를 100μ l의 50mM 트리스-염산(pH7.5)에 용해하고, 0.1ml Chelex 100컬럼에 통과시킨후, 0.6단위 박테리아성 알카리 인산염에 통과시킴으로서(65℃, 1시간) 5'말단에 라벨한다.(연속적 단계에서 추적자로서 작용하기 위함). 10배 농축된 TNE(40μ l)를 가하고, 1부피 페놀로 3회, 1부피 플로로포름으로 3회 추출한다. -20℃에서 하룻밤 2부피 에탄올로 DNA를 침전시키고, 원심분리로써 수집한다. 더욱 정제하기 위해, 0.5ml의 TNA중의 샘플을 0.25ml DEAE 셀룰로즈(2ml의 150mM 염화나트륨, 50mM 트리스-염산(pH7.5), 2mM EDTA로 예세척한 Whatman DE 52)("NET-완충액")에 흡착시킨다. 2ml의 NET 완충액으로 세척하고, 0.4ml의 1.5몰 염화나트륨, 20mM 트리스-염산(pH7.5), 2mM EDTA로 용출한후, 에탄올로 침전시킨다. 이 DNA를 δ-³²P-ATP(특이활성 약 5000ci/mmole)와 폴리뉴클레오티드키나제로 배양하고(A.B.maxam과 W.Gilbert, "A New Method for Sequencing DNA-DNA 배열의 새로운 방법" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, pp. 560-564(1977)TNE중에서 3-ml 세파덱스-G50컬럼상에서 크로마토그래피하여 정제한다. 용출분획을 혼주하고, 에탄올로³²P-DNA를 침전시킨다 ; 수율 약 10⁷dpm.

상기의³²P-라벨 Pst I 분해된 Hif-4c DNA의 6×10⁵dpm과 비라벨된 Pst I- 분해된 Hif-4c DNA(90μ g)를 혼합한다. 2.5cm 슬로트를 사용하여, 50mM 트리스-아세테이트 완충액(pH7.8)에서 10×20×0.7cm, 2% 수평 아가로스겔을 통해 전기영동 시킨다. 겔에 X-광선을 쏘이고, 320-염기쌍 분체의 위치를 결정한다. 방사상 밴드를 지닌 겔 스트립(1.3-10dpm)을 2ml 플라스틱 주사기에 통과시켜 압착시키고, NET완충액의 10배 겔부피로 4℃에서 진탕시켜 하룻밤동안 추출한다. 0.1ml 하이드록시인 희석컬럼에 DNA를 흡착시킨다(1ml NET 완충액으로 미리 세척함). 1ml의 0.1몰 인산칼륨 완충액으로 이 컬럼을 세척하고, 0.2ml의 1몰 인산칼륨 완충액으로 DNA를 용출한다. 용출물을 살균 증류수로 10배 희석하고 DNA를 DEAE에 흡수시키고, 그로부터 용출한후, 에탄올로 침전시킨다. 이것을 "Hif-4c분획"이라 칭한다.

전술한 DPT페이퍼(0.5×0.5cm)에 이 분획(120mg)을 결합시킨다. 대조로서 하이브리드 플라스미드 Z-pBR 322(H₃)/RcβG-4.13로부터 Hind III으로 120ng의 β-글로빈 cDNA를 절단하고, (F.Meyer등의 "Transposition of ATIinked, Cloned DNA From One Vector To Another-한 백터로 부터 다른 벡터로의 AT-결합, 클론된 DNA의 전이",Experimentia, 35, P, 972(1970) : N.Mantei등의 상기 문헌) 마찬가지 방법으로 진행한다.

듀플리케이트 여과지의 폴리(A)RNA에의 하이브리드화, 여과지의 세척, 여과지에서의 RNA회수는 전술한 바와같다. 난모세포에 주입시킨후, 다음의 인터페론 활성이 검출되었다 :

즉, Hif-4c는 IFmRNA에 하이브리드화될 수 있는 삽입체를 함유한다.

* 이 RNA의 1μ g은 4600IU/ml을 제공

**48시간 배양후의 난모상청액, 세포변성효과 감소법으로 분석

(W.E.Stewart 2세와 S.E.Sulkin의 상기 문헌)

Hif-4c내에 그 삽입체에 교차-하이브리드된 재조합 DNA분자를 함유한 E.coli클론의 동정

재조합 DNA분자 Hif-4c내에서 cDNA삽입체는 단지 약 320 염기쌍, 또는 측정된 IFmRNA크기의 1/3이므로 정제된 Hif-4c분체를 관련 하이브리드 DNA 삽입체를 지닌 재조합 DNA분자를 함유하고 있는 박테리아 클론을 스크린하는 프로오브로서 사용한다(제 3 도)

전술한 λ-III 소그룹으로 구성된 64개 박테리아클론을 밀러포어막(8cm직경)상에 스탬프하고, 아가플레이트(디아이모피멜릭산, 난리딕식산, 테트라사이클린을 보충함)상에 놓고 24시간동안 37℃에서 배양한다.

0.75ml의 0.5몰 수산화나트륨에 여과지를 장치하고, 2-3분후 과량의 액을 제거하기 위해 페이퍼타올에 옮긴다 ; 이 과정을 반복한다. 1몰 트리스-염산(pH7.5)으로 그 여과지를 중화시킨다. 상기의 방법과 동일하게 1.5몰 염화나트륨-0.5몰 트리스-염산(pH7.4)을 사용하여 세척하고, 공기중에서 건조시킨다. 0.3몰의 염화나트륨에 여과지를 담근후, 건조시켜 진공상태에서 2시간동안 80℃에서 가열한다.

α-³²P-dATP와 α-³²P-dCTP(특이활성, 40Ci/mmole)를 사용해서, 니크 번역(nick translation)에 의해 Hif-4c Pst 분체를³²P 라벨표시한다.(A.J.Jeffreys와 R.A.Flavell의 "The Rabbit β-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Sequence-토끼의 β-글로빈 유전자는 암호서열에서 큰 삽입물을 지닌다", Cell, 12, pp. 1097-1108(1977). λ-III클로니를 가지는 여과지를 4×SET(SET는 0.15몰 염화나트륨, 30mM 트리스-염산(pH8.0) 1mM EDTA임), 0.1%(w/v)Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리딘, 0.1%(w/v) BSA, 0.5% SDS와 200μ g/ml의 변성된 연어 정액 DNA에서 68℃에서 7시간동안 예하이브리드화 시킨후, 4×SET, 0.02% (w/v)Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리딘, 0.02% w/v의 BSA, 0.5% SDS와 200μ g/ml의 변성된 연어 정액 DNA에서 2×10⁵cpm의³²P-라벨된 Hif-4c분체와 68℃에서 16시간동안 하이드리드화시킨다. 실온에서 SET-0.5% SDS로 여과지를 세척하고 2×SET-0.5% SDS로 5시간동안 68℃로 세척한후 용액을 한번 갈아주고, 실온에서 4시간동안 3mM 트리즈마(Trizma)염기로 세척하고 용액을 갈아준다. 여과지를 건조시킨후, 스크린을 사용해서 여과지에 X-광선필름을 80시간 쏘인다. 3개 콜로니는 강한 양성반응을 보이고(λ-III-7D, λ-III-2H, λ-III-4C), 2개의 콜로니는 약한 양성반응을 나타낸다(λ-III-1E, λ-III-3D).

Hif-4c 관련 큰론으로부터 소 배양물을 제조한 후, 제 I 형의 DNA를 정제하고, Pst I 로 분해한후, 전술한 바와같이 아가로즈겔 전기영동에 의해 분석한다. 모든 제 I 형의 DNA는 큰 분체(플라스미드 pBR 322부분)와 작은 분체(하이브리드 삽입물)로 유발된다. λ-III-2H로부터의 재조합 DNA분자는 가장 커다란 삽입체(약 900염기성)을 방출한다. 이 재조합 DNA분자를 Z-pBR 322(Pst) HcIF-2H("Hif-2H")로 지칭한다.

전술한 바와같이, Hif-2H를 DPT 페이퍼에 결합시키고, 폴리(A)RNA에 16시간동안 하이브리드화시켜서, IFmRNA에 결합하는 능력을 테스트하고 IFmRNA활성을 결정한다 :

DNA 샘플 인터페론 활성(IU/ml)^*

Hif-2H 250±50(4개 측정물의 평균치)

Z-pBR 322(H3)/RcβG-4.13 30(2개 측정물의 평균)

pBR 322 20

* 세포변성효과 감소법으로 분석

Hif-4c에 대한 전술한 바와같이 Hif-2H를 리클론시키고, Hif-2H로 칭한다.

또다른 실험을 위하여 재조합 DNA분자를 함유한 E.coli클론세트를 준비하고, 라벨된 Hif-4c분체에 하이브리드화한 큰로니를 동정한다. 긴 cDNA삽입체를 지닌 플라스미드를 산출하기 위해, 백혈구 폴리(A)RNA로부터 효소적으로 제조된 이본쇄³²P-라벨된 백혈구 cDNA부분을 폴리(A)RNA 원심분리에서 설명한 것과 같은 방법으로 자당농도구배를 통해 원심분리하여 크기별로 분획시킨다. 600염기성 DNA분획에 해당하는 침당속도를 cDNA함유 분획들을 혼주한 후, 에탄올 침전후에 cDNA를 회수한다.

cDNA를 dCMP잔기로 연장시킨후, dGMP-연장된 Pst I-분해된 pBR 322에 하이브리드화시키고, 하이브리드 DNA를 E.coli를 형질전환시키는데 사용한다. 8cm 직경 밀리포어에 박테리아를 분배하고, 트립톤 아가배양 배지(10μ g 테트라사이클린을 함유한것)에 유치시킨후 작은 콜로니가 나타날때까지 생장시킨다. 콜로니 함유 여과지위에 신선한 밀리포어 여과지를 압축한후에 제거하고 4.4% 글리세롤을 함유한 아가플레이트에 표면을 위로 향하게해 놓고서 작은 콜로니가 나타날때까지 배양시킴으로써 리플라카 여과지를 제조한다. 이 콜로니를 함유하는 여과지를 밀리포어 여과지로 덮고, -55℃에 냉동시키고, 보존한다(D.Hanahan과 M.Meselson의 "A Protocol For High Density Plasmid Screening-고농도 플라스미드 스크리닝의 원칙", 1978, 10월, 개인발표). 총 약 500개 콜로니를 함유한 18개 여과지를 제조한다. 전술한 바와같이,³²P-라벨된, Pst I -분획된 Hif-4cDNA분체에 하이브리드화 시키는데 각 여과지중 한가지 리플리카를 사용한다. 약 185개 양성콜로니를 오토다이어그람위에서 동정하고, 포어필터 위에서 리클론한후, 하이브리드화로 재차 동정한다. 가장 강한 하이브리드화 반응을 보이는 95개 콜로니를 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN 1 내지 SN 95로 지칭하고 계속적인 연구를 위해 사용한다. 물론, 이 클론 스크리닝의 방법은 제조합 DNA 기술, 합성, 천연자원 또는 그 조합으로부터의 DNA서열을 함유하는 다른 클론, 또는 단일 또는 다수의 염기 치환, 삽입, 전위 또는 삭제를 비롯한 돌연변이에 의한 상기 DNA서열의 어떠한 것과 관련된 DNA 서열을 함유하는 클론에 대하여도 마찬가지로 공히 사용될 수 있다. 그러므로, 상기 DNA서열과 그들의 동정 또한 본 발명에 속한다. 상기 DNA서열에 의해 스크린되지 않은 DNA서열 또한 본 발명의 범주에 속한다.

Hdf-2h DNA삽입체의 특징규명

전술한대로 재조합 DNA분자 Hif-2h는 약 900염기쌍의 삽입체를 함유하며, 인체 백혈구mRNA에 하이브리드된다. 하기의 부수적인 특징이 규명되었다.

1. 하이브리드는 번역을 제동함

만일 mRNA가 하나의 클론된 보족 cDNA에 하이브리드화 되면, mRNA의 번역은 제동되지만, 그 하이브리드를 열번성시키면 번역가능한 mRNA가 방출된다. (B.M.Paterson등의 "Structural Gene Identification And Mapping By DNA-mRNA Hybrid-Arrested Cell-Free Translation-DNA-mRNA 하이브리드-제동세포-자유번역에 의한 구조 유전자 동정 및 지도작성", Proc. Nat′l, Acad. Sci. USA, 74, pp. 4370-74(1977)). 10μ l의 80부피%의 탈이온 포름아미드-20mM PIPES완충액(pH6.4)내에서 Pst I -분해된 Hif-2h의 2.2μ g과, 대조용으로 Hind III-분해된 Z-pBR 322(H3)/RcβG-4.13("RcβG")를 10분간 80℃에서 변성시킨다. 백혈구 폴리(A)RNA(5μ g),염화타트륨(4mmol), (10nmole)을 건조시킨 Eppendorp튜브에 이 용액을 가한다. 이 혼합물을 파라핀유의 층하에서 48℃로 7시간동안 가열한후, 냉각시키고, 200μ l로 희석한다. 두개 샘플을 동량부로 나누고 그 각각을 100℃에서 30초간 가열한다. 에탄올로 헥산을 침전시키고, 3μ l 물에 녹인후, 난모세포내에서 IFmRNA활성에 대해 분석한다 :

*세포변성효과가 저해법에 의해 48시간후 난모세포 배양배지를 분석함.

그러므로, 폴리(A)RNA와 하이브리드화될때, Hif-2h는 폴리(A)RNA내에서 IFmRNA의 번역을 저해한다 ; 하이브리드를 변성시킨후, IFmRNA는 다시 번역가능하게 된다. 이 실험으로 Hif-2h가 Le IFmRNA에 대한 보족서열을 지녔음을 확인할 수 있다.

2. 제한효소 분해와 뉴클레오티드/아미노산 서열 및 제한지도 결정에 의한 분석

다양한 제한효소(New England Biolab)로써 Hif-2h를 분해하여, 이 결과의 산출물을 아가로스겔 전기 영동에 의해 분석한다. 하기에 밑줄친 분획은 pBR 322와 Hif-2h에 공통되는 것이 아니다 :

*세포변성효과 저해법에 의하여 48시간후에 난모세포배지를 분석했음.

**비록 내부적으로 일관될지라도 이들 분체의 절대적 크기는 제8도-제10도를 참고함으로서가장 잘 지적될수 있음.

***상기 Sutcliffe로부터.

또한, 몇가지 제한효소로서 5'말단에³²P-라벨된 Pst I 분해된 Hif-2h를 분해하고, 재조합 DNA분자내에서 cDNA삽입체로부터의 방사성 분체의 크기를 결정한다:

제한효소³²P-분체

Ecor I 676,209

Hind III 분해없음

Bsp I 799,26

Hpa II 분해없음

Hpa I 분해없음

BamH I 분해없음

Hinf 210,62

Bg III 545,340

이 데이타에 의해 Hif-2h의 제한지도를 추론할 수 있다(제 4 도). 그 부위의 위치가 완전하게 정의되지 않았으며, 삽입체내에서 Mbo II부위에 대해서는 아마도 불완전한 것이다. 그 삽입체에 가장 가까운 부위들만이 pBR 322부분내에 주어져 있다. 화살표는 IFcDNA암호쇄의 방향을 표시한다.

비록 Hif-2h분체의 실제구조 또는 본 발명의 클론들중에서의 다른 삽입체들 또는 아미노산 서열 또는 그것으로부터 암호된 플리펩티드들의 구조가 기술상의 숙련가가 본 발명을 실시하고 사용하는데에 있어서 필요치 않을지라도, 특허출원시 분체의 구조에 대한 가장 좋은 정보로서 상기의 데이타 및 억제지도가 본 명세서에 설명되었다. Hif-2h분체에 대한 이들 데이타 및 제한지도는 뉴클레오티드 서열화 및 제한분석의 공지 기술을 사용해서 규명되었다. 예, A.M.Maxam과 W.Gilbert의 "A New Method For Sequencing DNA-DNA 서열화의 새로운 방법", Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, p. 560-64(1977). 플라스미드 DNA를 방법(B)에 의하여 제조하며(N.M.Wilkio등의 "Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpes Simplex Virus 1-헤르페스 심플렉스 비루스의 1의 활성 티미딘 키나제 유전자를 함유한 하이브리드 플라스미드", Nucleic Acids Research, 7, pp. 859-77(1979)) 그 추천된 바의 여러가지 제한효소로 제한한다.(효소 완충액에서 소 혈정알부민 대신 200μ g/ml의 젤라틴을 사용함)(EcoR I 는 W.Boll로부터 Bsp I 는 A.Kiss로부터, 그 밖의 효소들은 New England Biolad으로부터 제공됨).

제한된 DNA(20μ g)는 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시키며, 0.05몰 트리스-염산(pH8)에 용해하여, Chelex-100의 작은 컬럼에 통과시킨다. 평활 또는 5'-돌출 말단의 분체들을 37℃에서 60분간 200μ l의 0.05몰 트리스-염산(pH8)에서 DNA 5'말단의 pmole당 송아지 내분비 알카리성 포스페라제(Boehringer) 0.2단위로 처리해서 탈인산화시킨다. 그 효소를 65℃에서 30분간 가열시켜 불활성시킨다. 3'돌출 말단분체에 대해 , 박테리아 알카리성 포스페타제(Worthington)를 M.A.Maxam과 W.Gilbert등의 문헌에서 설명한 바와같이 사용하며 65℃에서 30분간 배양한다. 디포스포릴화된 DNA를 DEAE셀룰로스에 흡착 및 용출시켜 정제하며(W.Muller 등의 "Site-Directed Mutagenesis In DNA : Generation Of Point Mutations In Cloned B-grobin Complementary DNA At The Positions Corresponeing To amino acids 121-123-DNA에서 부위 지정 변이유전소 : 클론된 B-글로빈 보족 DNA에서 아미노산 121-123위치에서 포인트 돌연변이의 발생", J.Mol.Biol., 124. pp. 343-58(1978)) 또는 필요한 경우 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 실시한다(하기 참조). 0.15몰 염화나트륨, 0.05몰 트리스-염산(pH8)에서 폴리아크릴아미드(또는 아가토스)겔로부터 회수된 분체를 0.1ml히드록시아파티드(Biorad HTP)에 흡착시키고, 0.1몰 인산칼륨 완충액(pH7) 1ml로 4번 세척하고, 1몰 0.3ml의 인산칼륨 완충액(pH7)으로 용출한다. 이 용액을 10배 희석하고, DNA를 DEAE셀룰로스에 흡착시키고, 회수한다. (W.Muller 등의 상기 문헌 참조)

에탄올 침전후, DNA가 키나제 반응이전에 변성되는 것 이외에는 A.M.Maxam과 W.Gilbert등의 문헌에서 설명된 바와같이 [δ-³²P]ATP(12-34μ Ci/pmol DNA 5'말단) 및 폴리뉴클레오타이드 키나제(New England Biolabs 또는 P-L Biochemicals Inc)로 DNA를 5'말단에 라벨한다. DNA 5'말단의 pmol당 1-1.5μ Ci[³²P]인산염의 특이활성이 산출되었다.

서열화을 위해, 라벨된 분체를 두번째 제한효소로 분해하고, 그 생성물을 트리스-보레이트-EDTA완충액에서 5% 폴리아크릴아미드겔을 통해 전기영동에 의해 분리된다. 목적분체를 그 겔로 부터 추출하여 정제한다.(Muller등의 상기 문헌). 서열화를 위한 여러 분체들을 하기와 같이 제조한다. (숫자는 염기쌍에서 액면의 분체쇄 길이를 나타내며, 라벨된 부위는 별표에 의하여 표시됨) : (1) Bsp I 로써 Hif-2h를 분해, Loening 완충액에서 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 Bsp I -Bsp I-232 및 Bsp I-Bsp I-949를 분리 U.,E.Loening의 "The Fraction Of High Molecular Wrighr Ribonucleic Acid By Ployacrylamide Gel Electropgoreses-아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 고분자 라이트 리보핵산의 분획", J.Biochem p, 102(1967)] ; (2) Bsp I 로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 으로 분해, Bsp I^*-Pst I -83과 Bsp I^*-Pst I -827를 분리 ; (3) Bg III로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 로 분해, Bg III^*-Pst I-336와 Bg III^*Pst I-570를 분리. (4) Mbo II로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 및 Hind II로 효소분해(방지하는 35열기쌍 pBR 332분체를 분해하기 위해), Mbo II^*Pst I-519와 Mbo II -Pst I-351를 분리 (5) EcoR I로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 으로 분해, EcoR I^*-Pst I -708와 EcoR I^*-Pst I -198를 분리 (6) Pst I 로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Bg III로 분해, Pst I^*-Bg III-570와 Pst III-336를 분리 ; (7) Ava II 로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 와 Bg III로써 분해, AvaII^*-Pst I 186와 Ava II^*-Bg III-147를 분리 (8) Pvu II로써 Hif-2h를 분해, 라벨링, Pst I 및 Bg III로써 분해, Pvu II^*-Pst I -486를 분리

이 본체들은 A.M.Maxam과 W.Gilbert등의 상기 문헌 방법에 따라 분해하였다. 이 산물들은 700V에서 6시간 미리 행하고 900V에서 2,8,18 및 26시간의 순으로 50mM 트리스-보레이트, 1mM EDTA(pH8.3)에서 0.1×25×36cm 12% 폴리아크릴아미드겔(아크릴아미드/비스아크릴아미드=18/1)상에서 분획한다. 사용전에 겔을 2-3일간 실온에서 유지시켰을때 가장 좋은 결과가 얻어졌다. 각 cDNA삽입체를 양 쇄로부터 서열화하여 연장시키고 라벨된 말단으로 작용하는 각 제한부위를 이것을 연결하는 분체를 사용하여 서열화한다. 결과의 뉴클레오티드 서열을 제8도-제10도에 나타낸다. 예상대로 이 삽입체에서 여러 제한부위의 위치는 제한효소 분해만으로 결정된 것보다는 보다 더 정확하게 결정되었으며 제 4 도에 나타내었다.

제8도-제10도를 보면, 삽입체의 헤테로폴리머릭 부분은 5'말단에서 23G잔기들 및 3'말단에서 15C잔기로 연쇄되는 7A잔기들(아마도 mRNA의 포리(A)RNA말단을 반영함)에 접하고 있다. 참고를 위해 이 삽입체는dG쇄를 따르는 첫번째 뉴클레오티드로부터 폴리 A잔기앞의 마지막 뉴클레오티드에 까지 번호가 붙여진다. 위치 57-59에서 ATG 개시 트리플렛과 위치 624-626에서 TAA종말 트리플렛은 무의미한 코돈에 의하여 방해받지 않은 해독 프레임이다. 삽입체의 이 위치에서 양 해독 플레임들은 각기 18 및 12개 무의미 코돈을 갖는다. 더우기 25개 이상의 아미노산의 폴리펩티드를 암호하는 ATG 또는 GTG 및 종말 시그날에 측면 인접된 다른 서열들이, 즉, 다른 해독 플레임에서, 뉴클레오티드 226과 304, 640과 778 그리고 683과 743사이에 각각 놓여있다. 그러므로, 뉴클레오티드 57과 626사이의 부분이 본 발명에 의한 인터페론의 생물학적 또는 면역학적 활성을 보이는 폴리 펩티드를 암호하는 Hif-2h분페의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 추정된다.

물론 일반적 방법(상기의 A.Efstratiadis등)에 의하여 폴리(A)RNA로부터의 클론화된 cDNA는 5'말단의 뉴클레오티드가 결핍되며 인공의 서열을 함유할 수 있다[R.I.Richards등의 "Molecular Cloning And Sequence Analysis Of Adult Chicken β-Globin cDNA-성숙한 닭의 β-글로빈 cDNA의 분자 클로닝 및 서열분석", Nucleic Acids Research 7, pp. 1137-46(1979)]. 그러므로 뉴클레오티드 57-59에 위치한 ATG는 사실 확실한 mRNA의 첫번째 ATG라는 것이 확실치 않다. 그러나 하기 설명을 위하여 뉴클레오티드 57-59에서 ATG가 진정한 mRNA의 첫번째 ATG임을 가정한다. 상기의 K.C.Zoon등과 M.Hunkapiller과 L.Hood에 의해 결정된 진정한 인체 임파아구 인터페론의 35개 아미노 말단 아미노산의 서열- SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleLeuLeu-AlaGlnMetGlyArgIleSerLeuPheSerCysLeuLysAspArgHisAsp-과 그 삽입체의 이 부분에 의해 암호된 폴리펩티드를 비교함으로써, 선택된 해독 플레임이 정확한 것이며 결정된 서열(24번째 아미노산이 상부)를 지닌 공지의 서열의 정렬이 거의 일치하므로(즉, 35개 아미노산중 26개)뉴클레오티드 57-124가 "성숙"폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 진행시키는 시그날 서열을 암호할 수 있다는 것을 나타낸다. 진행 mRNA에서 5'말단으로부터의 첫번째 AUG트리플렛은 일반적으로 단백질 합성의 개시부위이다. [M.Kozak, "How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions In Messenger DNA"-"진핵 리보솜들은 mRNA에서 개시부위를 어떻게 선택하는가?", Cell, 15, pp. 1109-25(1978)]. 임파아구 인터페론의 첫번째 아미노산에 해당하는 Hif-2h분체에서의 코돈은 23개 (또는 15개이하 정도)아미노산의 시그날 펩티드를 결정하는 서열이 인터페론 암호서열에 선행될 수 있음을 지적하는 첫번째 AUG(그리고 두번째 AUG로부터 14개 코돈)으로부터의 22개 코돈들이다. 보다 긴 추정상의 시그날 서열은 비간섭의 11개 소수성 아미노산을 함유한다(그리고 보다 짧은 것은 6개의 소수성 아미노산을 갖는다.). 소수성 잔기의 이 집적은 시그날 서열의 특징이다. [참고,B.D.Davis와 P.C.Tai의 "The Mechanism Of Proctein Secretion Acrose Mintranes"Nature, 283, pp. 433-38(1980)],"숙성"Le인터페론 폴리펩티드에 해당하는 뉴클레오티드 서열은 166개 아미노산을 암호하는 498개 뉴클레오티드를 함유한다. 전혀 카르복시 말단화가 없다는 것을 가정하면, 인터페론 폴리펩티드의 분자량은 19,388이다. 암호 서열의 염기조성은 50%가 GC이다.

물론 Hif-2h분체에 대한 제8도-제10도에서 설명된 폴리펩티드의 구조는 생체내 효소와의 상호작용, 예, 글리코실화에 의하여야기된 폴리펩티드에 대한 어떠한 변형도 고려하지 않았다. 따라서 이 구조가 생체내에서 생산된 LeIF과 동일하지 않을 수 있지만, 만일 동일하지만 않다면, 이것은 매우 유사한 생물학적 및 면역학적 특징으로 지닌다. 또한, 이 구조의 화학적 파생과, 전화, 삽입,삭제, 단일 또는 다중 염기치환을 포함한 돌연변이와 같은 다른 변형이 상기 활성을 보이는 화합물을 생산하지 않을 것이라는 가능성을 이런 구조는 배제하지 않는다.

3. 삽입된 IFcDNA 의 양성(plus)쇄의 결정

mRNA와 동일한 서열을 지닌 DNA쇄를 양성쇄로 칭하며, 이것과 보족되는 것을 음성쇄로 칭한다. 인터페론 cDNA삽입체의 양성쇄를 제 5 도에 대략적으로 나타내었다. 제한효소 Bg III로 Hif-2h DNA를 분해 시키고,³²P-인산염으로 말단에 라벨하고, 더 길거나 [545염기쌍에서 보고된 좀 더 세밀화된 분석에서 결정된 바와같은 578/570염기쌍)] 더 짧은 [340염기쌍(상기에서 보고된 좀 더 세밀화된 분석에서 결정된 바와 같은 344/336염기쌍)]방사성 분체를 제조하기위해, DNA를 Pst I 로 분해한다. 이것을 변성시킨 후, DNA-DNA재조합이 일어나지 않는 조건하에서, 즉, 80% 포름아미드, 0.4몰 염화나트륨에서 유도된 백혈구로부터 폴리(A)RNA에 하이브리드화 시킨다. 비혼성화된³²P-DNA(일본쇄 핵산)를 분해하는 뉴클레아제 S1으로 핵산을 효소분해하고, 이것을 폴리아크릴아미드 상에서 분리한다("R.F.Weaver과 C.Weissmann의 "Mapping Of RNA By A Modification Of The Berk-Sharp Procedure", Nucleic Acid Research, 7, pp. 1175-93(1979))

4. 비-유도된 인체 백혈구로부터의 폴리(A)RNA는 Hif- -2h DNA에 하이브리드되지 않음의 증명

전기부분에서 설명한 것과 동일한 실험을 실시하는데, 폴리(A)RNA는 비유도 인체 인터페론에서 유래되고 센다이비루수-유도된 백혈구의 경우에서와 같은 방법으로 제조된다. 주목할만한 양의 라벨된 DNA가 보호되지 않았다 : 앞서의 결과와 비교하면, 비유도성 세포로부터의 폴리(A)RNA는 유도 세포에서로부터의 폴리(A)RNA보다 는 Hif-2h 에 하이브리드화 될 수 있는 양이 약 1/20로 감소된 mRNA를 함유한다.

Z-pBR 322(Pst)/HcIF-4c 에 대한 재조합 DNA 분자를 함유하는 E.coli에 의한 인터페론 활성의 폴리펩티드의 합성 pBR 322의 PstI 부위는 β-락타마제(페니실리나제)유전자내에 존재한다. 적합한 방향과 해독 플래임으로 그 위치에 암호 DNA 단편(즉, 유전자의 모든 부준 또는 일부분을 함유하는 cDNA)이 결합될때,β-락타마제의 아미노-말단 부분과 삽입된 DNA 서열이 암호하는 아미노산 서열로 이루어지는 융합 단백질이 생산된다(상기의 L.Viller-Komaroff 등). 만일 삽입된 DNA 단편이 그 자신의 개시 시그날을 함유하는 DNA 서열을가지며, β-락타마제 서열을 가진 상에서 종말시그날과 함께 이것을 진행하는 서열을 가진다면, 개시가 그 개시 시그날에서 발생해서 융합안된, 활성 단백질이 생산될 것이다(상기의 A.C.Y.Chang 등), Hig-4c에 대한 DNA 삽입물이 β-락타마제 -유전자내에서 적합한 해독 플레임에 삽입 됐는지 확인하기 위해, pBR 322 유도체 즉, pKT 279, pKT 280, pBR 287(K.Talmadge에 의해 구성됨)을 사용한다. 각 유도체들은 pst I 부위를 가지는데, 그 부위들은 각 유도체들의 그 부위에 결합된 DNA 삽입물이 서로 다른 해독 플래임을 갖도록 배치되었다(제 6 도). 그러므로 이 세트는 DNA가 상기의 3가지 해독 플래임으로 β-락타마제 유전자내에 삽입될 수 있도록 되었다. Hif-2h으로부터의 Pst I절단삽입체를 Hif-4c 분체에서 설명한 바와같이 제조한다. 20μ 1 의 10mM 트리스-염산 (pH7.5), 6mM 염화마그네슘, 10mM 염화나트륨, 6mM β-메르캅도 에탄올, 200μ g젤라틴, 0.1mM APT 내에서 Pst I-절단된 pBR 322, PKT 279, pKT 280, pKT287(각각 10mg)과 함께 Hif-2h Pst I- 분체(10mg)를 혼합한다. 0.1단위 T₄DNA 리가제(New England Biolab)와 함께 배양한다(16시간, 10℃). 산출된 재조합 DNA 분자는 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-2h, Z-pKT 279(Pst)/HcIF-2h, Z-pKT 280(Pst)/HcIF-2h, Z-pKT 287(Pst)/HcIF-2h로 호칭한다. E.coli HB 101를 상기 각 재조합 DNA 분자로 형질전환 시키고, 형질전환 된 것을 전술한 바와같은 테트라사이클린-함유 아가플레이트 상에서 선별한다. 형질전환된 박테리아의 테트라사이클린-내성클론은 환상벡터를 함유할 수 있기 때문에 각 세트의 박테리아 콜로니들은 밀리포어 여과지상에서 생장되면, 32p-라벨된 Hif-4c 분체에 하이브리드화된 콜로니들를 동정하여 전술한 바와같이 선별한다. 이들 균주들을 하기와 같이 호칭한다.

E.coli HB 101[Z-pBR 322(Pst)/HcIF-2h-AH1]-[AH3] ; E.coli HB 101[Z-pKT 279(Pst)/HcIF-2h-AH1]-[AH8] ; E.coli HB 101[Z-pKT 280(Pst)/HcIF-2h-AH]-[AH8] ; E.coli HB 101[Z-pKT 287(Pst)/HcIF-2h-AH1]-[AH8] Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN 1 내지 95중 몇가지 추출물과 더불어 상기 균주 일부의 추출물에 대하여 인터페론 활성에 대해 검사한다. 박테리아를 트립톤 배지에서 정지기까지 배양하여, 수집한 후, 1/20 부피의 50mM 트리스-염산(pH 8) 30mM 염화나트륨의 배양물로 세척하고, 냉동시킨다. 해빙시킨후, 종전완충액 보다 적은 부피에 세포를 재현탁시키고, 1mg/ml의 리소자임을 가한다. 60분후 0℃에서 현탁액을 동결시키고(에탄올-건조 얼음욕조에서), 5번 해빙시키고(37℃에서), 회전기로 10분간 12,000rpm으로 원심분리 시킨다. 일부의 상청액(S 30)을 65 Spinco 회전기에서 100,000×g으로 원심분리하고, 상청액(S 100)을 회수한다. 세포변성 효과 분석에 의해 이 상청액을 인터페론 활성에 대해 스크린한다(Expt 1). Expt 1에서 양성 반응을 보이는 콜로니들을 상술한 Z-pBR 322/HcIT-SN-1 에서 SN-95까지의 49클론들과 더불어 더욱 낮은 희석에서 재분석한다(Expt. 2).

추출재료

*Expt 1; 1 : 150의 최종 희석액에서 분석된 추출물

추출재료

*Expt. 2 ; 1: 6의 최종 희석액에서 분석한 추출물

상기 보다 활성인 생산자의 일부를 더욱 상세하게 검사한다. 후기의 로그상태까지 배양하고(OD₆₅₀=1.9)세포를 1/50의 배양 부피로 상기와 같이 용해시킨다. 음성 대조로서 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN32를 사용해서, 하기의 활성을 측정하였다 :

추출재료

물론, 상기의 결과는 페니실리나제 표현 조절서열의 통제하에서의 유전자에 의한 인터페론 생산을 반영하는 것이다. 기술상 공지된 바와같이, 표현수준을 몇가지 방법으로 향상시킬 수 있다. 단백질 생산수준은 다음 2가지 주요인 ; 세포내 유전자 복사물의 수와 이들 유전자 복사물을 전사하거나 번역하는 효율에 의해 지배된다. 차례로, 전사와 번역의 효율은 목적하는 암호서열의 상부에 일반적으로 위치하는 뉴클레오티드 서열에 좌우한다. 이들 뉴클레오티드 서열 또는 표현 조절 서열은 특히 RNA 폴리머라제가 전사를 개시하도록 작용하는 위치와, 리보소옴이 결합하여, 전사를 개시하는 mRNA(전사 생성물)와 작용하는 위치를 한정한다. 모든 표현 조절서열이 동일한 효능을 발휘하지는 않는다. 그러므로 목적하는 단백질에 대한 특정한 암호 서열을 그들의 인접한 뉴클레오티드로부터 분리하여, 고수준 표현을 위하여 다른 공지된 표현 조절서열에 융합시키는 것이 유리하다. 이것이 이루어지고, 새롭게 제조된 DNA 분체가 세포내에서 유전자 복사의 수를 증가시키고 그로써 표현된 단백질의 수율을 더욱 향상시키기 위하여 다중 복사 플라스미드 또는 박테리오파지 유도체에 삽입할 수 있다.

몇가지 표현 조절 서열을 상술한 바와같이 사용할 수 있다. 이들은 E.coli의 락토즈 오페론("lac 시스템")오포레이터, 프로모터와 리보소옴 결합 및 상호 작용서열(shine-Dalgarno 서열 포함)을 포함하여 또한 트립토판 합성효소 시스템의 그해당 서열 파아지 λ의 주요 오포레이터와 프로모터 부분 (O_LP_L과 O_RP_RI),파아지 fd 막 단백질의 조절 부분 또는 원핵세포나 진핵세포 및 그것이 비루스의 유전자 표현을 조절하는 그 밖의 서열을 포함한다. 그러므로 적합한 숙주내에서 특이한 폴리펩티드의 생산을 향상시키기 위해, 그 폴리펩티드를 암호하는 유전자를 전술한 바와같이 제조해서, 그것을 함유한 재조합 DNA 분자에서 뽑아내서, 이전의 표현조절 서열에 인접한 또는 상기의 표현조절 서열들중 한가지의 조열하에 있는 재조합 DNA분자에 재삽입할 수 있다. 이 방법은 기술상 공지되어 있다.

세포내에서이용될 수 있는 유전자수가 증가하면 원하는 생산물의 세포수율이 더욱 증가될 수 있다. 예시의 목적으로, 이것은 용원화(만성)박테리오파지 λ (NM989)에 재조합 DNA분자를 삽입함으로써 이루어지는데, 가장 간단하게 제한 효소로 플라스미드를 분해시켜 직서형 분자를 만들고서 제한된 파아지 λ클로닝 매개체와 혼합하고(예. N.E.Murray 등의 "Lambdoid Phages That Sinplify of In Vibo Recombinants-실험관대 재조합물의 회수를 간소화하는 Lambdoid 파아지", Molec.gen.Genet. 150, pp. 53-61(1977)과 N.E.Murray 등의"molecular cloning of The DNA Ligase gene From Bacteriophage T4-박테리오파지 T4-로부터의 DNA리가제 유전자의 분리클로닝", J.Mol.Biol., 132,pp.493-505(1979))DNA라가제로 배양시켜 재조합 DNA분자를 제조함으로써 이루어진다. 목적하는 재조합 파아지를 전술한 바와같이 선택하여 E.coli의 숙주를 용원화시키는데 사용한다.

특히 유용한λ클로닝 매개체는 억제 유전자 cI 에서 온도 감수성 돌연변이와, 숙주 세포의 용해를 위해 필요한 산물을 생산하는 S유전자와 그 생산물이 그 비루스의 주요 캡시드 단백질인 E유전자에서의 억압성 돌연변이를 함유한다. 이 시스템으로 용원세포를 32℃에서 생장시키며, 프로파지의 절단을 유도하기 위해 45℃까지 가열한다. 이 세포들은 파아지 유전자생산물에 의해 일반방법으로 용해되지 않으므로, 37℃에서 연장생장시키면 단백질 생산을 고수준으로 유도할 수 있으며, 파아지 유전자 삽입제가 함입(encapsidate)되지 않았으므로, 이것은 또 다른 전사에 있어서 유용할 수 있다. 그 세포를 인공적으로 용해시켜 고수준의 목적생산물을 방출시킨다.

상술한 방법에 의해 Z-pBR322(Pst)HcIF-SN 35로 형질전환된 숙주로부터 생산된, 인체 백혈구 인터페론의 생물학적 또는 면역학적 활성을 보이는 폴리펩티드의 수율을 높이기 위해, 하이브리드에서 DNA 삽입체의 제한지도를 결정한다. 이러한 지도 작성은 그 삽입체가 하나의 PstI부위가 결핍됐음을 나타낸다. 그러므로, 그 플라스미드는 PstI로 개열되며, 이 결과의 DNA쇄는 표준방법을 사용해서 양 말단에서 새김질되어 다시 밀페된다. Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6으로써 동정된 변형 플라스미드의 실제구조는 결정되지 않았다. 그러나 변형 플라스미드로 형질전환된 숙주는 비변형된 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35로 형질 전환된 숙주보다 100배의 인체 백혈구 인터페론의 생물학적 또는 면역학적 활성의 폴리펩티드를 생산한다.

하이브리드 플라스미드로 형질전환된 E.coli에 의해 생산되는 인터페론 활성의 특성

1. 트립신에 대한 인터페론 활성의 민감성

인체 백혈구 인터페론의 50μ 1 샘플(특이활성, 1.2×10⁵U/mg ; 50U)과 E.coli HB 101(Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6)의 상술한 S100추출물("Hif-287-6추출물")(200U/ml, 10U) 및 E.coli HB101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35)의 S100 추출물("Hif-35 추출물")(1000U/ml ; 50U)을 37℃에서 30분간 여러가지 양의 트립신으로 배양한다. Le 인터페론과는 반대로 S100추출물은 고단백질 함량을 가지므로, Le 인터페론과 대조 S100추출물 Hif-32의 혼합물을 동일하게 검사한다.

2. Sephadex G-100 크로마토그라피상의 반응

추출물 Hif-35(1ml)와E.coli HB 101(Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32)의 S 100추출물"Hif-32 추출물")을 4℃에서 50mM 인산칼슘 완충용액(pH 7.4)중의 312ml의 Sephadex G-100 컬럼상에서 크로마토그래피시킨다. 내부 마커로 치토크롬 C(0.2mg)를 가한다. 유속을 2ml/1시간으로 하고 1.0ml분획을 회수한다. 280 nm, 405nm(치토크롬 C)에서 흡광도와 인터페론 활성을 결정한다. 제 7 도에 나타난것처럼, Hif-35 추출물의 IF활성은 치토크롬 C의 부가전에 Kd값이 약 0.45로 용출된다. 그러므로, 이물질의 분자량은 약 20,000과 30,000^*사이이다 : 대조 추출물 Hif-32분획에서는 어떠한 활성도 검출되지 않았다.

*뉴클레오티드 서열화로 측정되도 카르복시 말단 과정이 없었던 것으로 가정하는 분자량은 19,388이다.

3. 인체 백혈구 인터페론에 대한 항체에 의한 Hif-35와 Hif-287-6의 인터페론 활성의 저해

10%의 송아지 혈청을 지닌 100μl 의 보완된 Eagles 배지(MEM) 에서 인체 Le인터페론에 대한 양(sheep)의 항혈청의 여러가지 희석액으로(K..Cantell, 1976, 2.24 특이활성 450,000단위/ml)인체 Le 인터페론(특이활성 1.2×10₆IU/mg)과 Hif-35/Hif-287-6-S100 추출물을 배양한후(37℃, 30분)45μl를 취해 세포 변성효과 감소법을 사용하여 인터페론의 활성을 분석한다(항체 그 자체는 세포 변형효과를 일으키지 않는다) :

항체의 작용이 단백질 분해와 같은 비특이성 효과에 기인되는 것이 아님을 보이기 위하여 마우스 인터페론 시스템으로 유사한 실험을 실시한다 :

그러므로, 이테 Le 인터페론에 대한 항체는 Hif-2h DNA 서열을 지닌 재조합 DNA분자로써 형질전환된 E.coli에서 생산된 폴리펜티드의 인터페론 활성을 특이적으로 저해한다. E.coli에서 생산된 인터페론에대한 항체의 낮은 친화도는 천연의 Le인터페론과 E.coli 의 인터페론 사이의 구조적 차이를 반영하는 것으로 예컨대, 탄수화물기의 탈락, 시그날 서열의 존재, 또는 β-락타마제 서열의 일부에 대한 융합등에 기인된다.

4. 마우스 세포상에서 Hif-35와 Hif-287-6 추출물의 감소된 활성

E.coli 추출물, 인체백혈구 인터페론(K.Cantell, 특이활성 1.2×10⁶단위/mg), 또는 마우스 인터페론(N.I.H. 표준)으로 처리한 인체 CCL 23 세포 또는 마우스 L 929 세포를 비루스로 감염시킨다(인체세포에는 Mengo 비루스를 마우스 세포에서 VSV를 감염시킨다). 세포변성표과감소 분석법에 의해 인터페론 활성을 측정한다.

이들 결과는 Hif-35와 Hif-287-6 추출물이 인체세포에 대한 보호작용과, 마우스 세포에 대해서는 약간의 보호작용(~10%)을 갖는다는 것을 보여준다.

그것의 DNA 삽입체가 Hif-4c에서 그 삽입물에 약하게 교차 하이브리드화되고 Hif-2h 분체와는 다른 제한지도를 갖는 재조합 DNA 분자를 함유하는 E.coli클론의 동정

입파아구 인터페론의 처음 35개 아미노산(상기의 Zoon 등과 M.Hunkapiller 과 L.Hood 문헌)을 Hif-2h 분체로부터 추론된 서열과 비교할때 9개의 차이를 보인다. 모든 경우에, 서로다른 아미노산의 코돈은 한개 염기 변화에 의한 것일 수 있다. 한편으로는 임파아구 인터페론에 대하여 직접 결정되고 또 한편으로는 Hif-2h 분체의 서열에서 추론된 그 아미노산 조성물은 또한 Gly, Pro, Cys 와 Met의 함량에 대하여 큰차이를 보인다. 이러한 차이들은 다형성으로 설명하기에는 너무나 많은 것이다. 대신 두개 단백질의 부정합정도(26% 부정합)는 예를들어 사람과 양의 β-글로빈 사이에서 부정합(23% 부정합)과 비슷하기 때문에 상기 차이점은 대부분이 최소한 2가지의 비대립형질 유전자의 존재로 설명될 수 있다. 따라서, 상기에서 동정된 분체 Hif-4c에 약하게 하이브리드 되었음을 나타내는 클론들이 시험되고 E.coli HB101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-II-206)이 동정되었다. 이 클론의 하이브리드 플라스미드 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-II-206("HcIF-II-206")과 이것의 DNA 삽입체"Hif-II-206 분체"는 Hif-4c 및 Hif-2h 분체에 약하게 하이브리드되어 있다. 플라스미드 Hif-II-206으로 형질전환된 E.coli는 인체 백혈구 인터페론과 같은 생물학 또는 면역학적 활성을 나타내는 펄리펩티드를 생산한다.

Hif-II-206 분체"는 Hif-2h 분체에 대하여 결정된 것과는 다른 제한지도를 갖는다. 그 2개의 억제지도가 제11도에 비교되어 있다. 한편, Hif-II-206 분체에서 제한부위의 절대적인 위치는 결정되지 않았다. 그러나, 상기에서와 같이, 이 삽입체의 뉴클레오티드 서열의 서열화는 이들 위치가 보다 정확하게 결정될수 있도록 할 것이다. Hif-2h 분체와 Hif-II-206 분체의 제한지도의 차이로써 두개 삽입체의 인터페론 유전자들이 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 가진다는 것이 명확히 나타난다. 그러나, Hif-II-206 분체의 인터페론 유전자가 인체 임파아구 인터페론에 대해 상기에서 결정된 것과 처음의 35개 아미노 말단아미노산을 가지거나 또는 인체 임파아구 인처페론에 대해 결정된것과 같이 아미노산 조성물을 갖는 폴리펩티드를 암호하는 유전자와 동일한것인지 아닌지는 알려지지않았다.

최종 결론적으로, 본 발명자들은 Sendai 비루스-처리된 인체 백혈구로부터의 폴리(A)RNA에서 제조된 cDNA를 함유하며 하기의 특징(1)-(4)를 가지는 재조합 DNA 분자세트를 분리하였다 :

(1)그 재조합 DNA 분자는 비유도성 인체 백혈구로부터가 아닌 유도성 인체 백혈구의 폴리(A)RNA에 하이브리드화된다.

(2)RNA 혼합물에서 이 RNA를 선택하며 하이브리드 억제번역분석에서 인터페론 mRNA의 번역을 억제하는 능력으로 나타난 바와같이 백혈구 인터페론 mRNA에 하이브리드화 된다.

(3)이 재조합 DNA분자를 지닌 E.coli는 하기 특징을 갖는 화합물을 생산한다 : ㄱ트립신에 민감 ㄴ인체세포계에서는 인터페론 활성을 나타내고 마우스 세포계에서는 약간의 인터페론 활성을 나타냄. ㄷ분자량이20,000에서 30,000사이임(제8도-제10도의 뉴클레오티드 서열화에 의하면 19,388) ㄹ인체 백혈구 인터페론에 대한 항체에 의해 인터페론 활성이 특이석으로 저해됨.

(4)이들 재조합 DNA분자의 DNA삽입체들의 뉴클레오티드 서열중 적어도 두개는 서로 다르며 이것은 백혈구 인터페론에 대해 적어도 두개의 비대립형질 유전자가 존재함을 암시한다.

이러한 특징들은 본 발명에 의해 기술된 재조합 DNA분자가 인체 백혈구 인터페론 암호 서열중 적어도 일부분을 함유하고 있으며, 이들 플라스미드중 몇몇은 인체 백혈구 인터페론과 같은 면역 또는 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 E.coli내에서 표현되도록 유도한다는 것을 입증하는 것이다. 또한 이 폴리펩티드는, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서, 단백질 기술분야에서 공지된바에 의해 분획, 변형 떠는 유도될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 미생물과 재조합분자는 1980년 1월 7일 서독 고팅겐의 독일연방공화국 삼룽 배양물 수집소(Deurscbe Sammlung von Mikoorganismen)에 기탁된 배양물들로 예시될 수 있으며 하기의 Hif-A 내지 E로 동정되었다.

A : E.coli HB 101(Z-pBR 322)Pst)/HcIF-4c) B : E.coli HB 101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-2h) C : E.coli HB 101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN 35) D : E.coli HB 101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN 42) E : E.coli HB 101(Z-pKT 287 (Pst) /HcIF-2h-AH 6).

상기의 배양물들은 수탁번호 DSM 1699-1703으로 각각 수탁되었다. 또한, 상술한 방법에 의해 제조된 미생물과 재조합 DNA분자는 1980년 3월27일 미합중국 메릴랜드 롤크빌에 소재한 미합중국 배양물수집소(American Type Culture Collection)에 기탁된 배양물에 의해 예시되며 HcIF-G와 HcIF-H로 동정되어 각각 ATCC 수탁번호 3/633과 3/643으로 기탁되었다 : G : E.coli HB 101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-II-206) H : E.coli HB 101(Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6).

본 발명의 많은 구체적인 예시가 본 명세서에 설명되었지만 본 발명의 기본 구조가 본 발명의방법과 조성물을 이용하는 다른 구체적 예시를 제공하기 위하여 변화될 수 있다는 것은 자명한 것이다. 그러므로, 본 발명의 범주는 실시예로서 제시된 특정한 설명보다는 첨부된 특허청구범위로써 한정된다.

Claims (1)

1. 하기 (a), (b), (c)로부터 선택된 DNA 서열을 함유한 재조합 DNA 분자로써 원핵 또는 진핵의 단세포 숙주를 형질전환시켜 배양하는 단계를 특징으로 하는 IFN-α형의 폴리펩티드의 제조방법 ; (a)Z-pBR 322(Pst)/HcIF-4c, Z-pBR 322(Pst)/HcIF-2h, Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35, Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN42, Z-pBR 287(Pst)/HcIF-2h-AH6, Z-pBR 322(Pst)/HcIF-II-206 및 Z-pBR 322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6의 DNA 삽입체들, (b)상기의 DNA 삽입체들에 하이브리드화 되며 IFN-α의 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열, (c)상기의 DNA 서열과 삽입체들에 의해 암호되는 IFN-α형의 폴리펩티드를 암호하는 DNA 서열들.

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