KR860001558B1

KR860001558B1 - 인터페론의 제조방법

Info

Publication number: KR860001558B1
Application number: KR1019810002386A
Authority: KR
Inventors: 반노만 괴델 데이비드; 페스트카 시드니
Original assignee: 에프. 호프만-라 롯슈 앤드 캄파니 아크티엔게젤샤프트; 쿠르트 네셀보쉬, 한스 스튀클린; 제넨텍 인코포레이티드,; 프레드 시. 미들톤
Priority date: 1980-07-01
Filing date: 1981-07-01
Publication date: 1986-10-04
Also published as: KR830006422A; US6610830B1; GEP20074163B; US6482613B1; CA1341583C; MD430C2; ZW14781A1

Abstract

내용 없음.

Description

인터페론의 제조방법

제 1 도는 인체의 백혈구로부터 분리시켜 균질하게 정제된 모든 인터페론에 공통적인, T-1 및 T-13으로 표시되는 두개의 아미노산 서열.

제 2도는 잠재적 LeIF 플라스미드와³²P-표지된 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 나타내는 방사선도.

제 3 도는 각기 "A" 내지 "H"로 표시되는, 백혈구 인터페론의 발현에 사용되는 분리된 8개의 유전자 단편의 뉴클레오타이드 서열 (코드화 나선).

제 4 도는 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 8개의 LeIF 단백질 서열의 비교도시.

제 5 도는 8종의 LeIF 클론화_cDNA(A 내지 H)의 제한 엔도뉴클레아제 지도.

제 6 도는 성숙 LeIF A의 직접적 미생물적 합성을 코드화하는 유전자의 구성도식.

제 7 도는 성숙 백혈구 인터페론 LeIF B발현에 사용되는 두개의 유전자단편의 제한 지도.

제 8도 및 제 9도는 타입 I 및 J를 포함하여 5개의 LeIF 단백질의 DNA 및 아미노산 서열.

본 발명은 재조합 DNA 기술을 사용하는 인터페론의 제조방법에 관한 것이다.

더 상세히 말하면, 본 발명은 폴리펩타이드, 특히 성숙 인체 백혈구 인터페론, 이들을 함유하는 약제학적조성물, 및 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 복제성 미생물 발현 비히클(vehicle)에 의해 형질전환된 미생물을 배양하여 성장시켜 폴리펩타이드를 발현시킴을 특징으로 하는 상기 인터페론의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 제조방법에 사용된 발현 비히클 및 이들 발현 비이클을 함유하는 신규의 미생물 뿐만아니라 이들의 제조방법도 포함한다. 결국 본 발명은 성숙 인체 백혈구 인터페론의 아미노산 서열을 코드화하는 서열로 구성되는 DNA 서열에 관한 것이다.

인체 백혈구 인터피론(LeIF)은 이삭과 린덴만에 의해 최초로 발견되어 매우 조잡한 침전물의 형태로 제조되었다.(참조: Proc. R. Soc. B 147, 258-267(1957); 미합중국 특허 제3,699,222호). 그때이래 이 물질을 정제하고 특징지우는 노력이 진전되어, 정상 백혈구 또는 백혈병을 일으키는 백혈구로부터 유도된 비교적 균질한 백혈구 인터페론을 제조하기에까지 이르렀다(참조 : 독일연방공화국 공개공보 제2,947,134호). 이들 인터페론은 이들의 표적 세포에 바이러스 내성을 제공하는 능력을 지닌 것으로 알려진 단백질 균이다. 또한 인터페론은 세포 증식을 억제하고 면역반응을 조절할 수 있다. 이러한 작용에 의해서 바이러스 감염증 및 악성종양 치료제로서 백혈구 인터페론을 임상적으로 사용하도록 촉구되어 왔다.

백혈구 인터페론은 본질적인 형질 동종성에 따라 정제시키며(참조 : Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. sci. U.S.A. 76, 640-644(1979); Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605(1979)), 분자량은 약 17,500 내지 약 21,000인 것으로 보고되었다.

이들 제제의 고유 활성도는 매우 높아 단백질 mg 당 2×19⁸내재 1×10⁹단위이나, 세포 배양법에 의한 수율은 예상외로 낮다. 그럼에도 불구하고 단백질 서열 검사기술의 발전으로 부분적인 아미노산 서열의 측정이 가능하게 되었다(참조: Zoon et al., Science 207, 527(1980); Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 5102-5104(1980)). 수종의 백혈구 인터페론의 글리코실화에 관해서 현재로는 완전히 밝혀지진 않았으나, 과원(family members)간 글리코실화에서의 차이를 분자량의 스펙트럼만으로 설명할 수 없다는 것 만큼은 분명하다. 그보다도 백혈구 인터페론은 아미노산 조성 및 서열에 있어서 현저히 차이가 있으며, 몇몇 경우에서 아미노산 상동 관계가 80% 미만이다.

백혈병을 일으키는 백혈구로부터 분리되는 균질한 백혈구 인터페론으로는 부분적 특징화 및 제한된 임상시험을 제공하므로, 대규모의 임상시험후에 광범위한 예방적 및 /또는 치료적 용도에 필요한 인터페론을 공급하기에는 매우 불충분하다. 실제로 현재 항종양제 및 항바이러스제 시험에 인체의 백혈구로부터 유도된 인터페론을 사용하여 수행하여 임상 연구는 주로 조물질(<1%순도)제제로 국한되며, 충분량의 제조에는 오랜시간 및 비현실적인 가격이 요구되므로 연구는 현저히 지연되고 있다.

그러나 재조합 DNA 기술의 발전에 따라서 매우 다양한 유용한 폴리펩타이드의 미생물적 조절 생산이 가능하게 되었다. 이미 착수된 것은 이기술에 의해서 박테리아를 변경시키는 방법으로, 이로부터 인체 인슐린 및 인체 성장 호르몬의 A 및 B 쇄인 소마토스타닌과 같은 폴리펩타이드 생성물의 제조가 가능하다(참조 : Itakura et al., Science 198, 1056 -1063(1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 - 548(1979)).

더욱 최근에는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 프로인슐린 및 티모신 알파 1의 박테리아 제조가 가능하게되었으며, 여러 문헌에 인체의 백혈구 인터페론을 코드화하는 DNA의 제조 및 이로부터 수득되는 백혈구 인터페론 활성을 지닌 단백질이 보고되었다(참조 : Nagata et al., Nature 284, 316 -320(1980) ; Mantei et al., Gene 10, 1 -10 (1980) ; Taniguchi et al., Nature 285, 547 - 549(1980)).

재조합 DNA 기술의 주작용인자는 플라스미드, 박테리아에서 발견되는 이중나선 DNA 의 비염색체성 루우프 및 흔히 세포당 수회 복사에 관여하는 기타의 미생물이다. 플라스미드 DNA 내에 코드화된 정보에 의해서 자세포(즉 복제물질 "레플리콘")에서 이 플라스미드를 재생시킬 수 있어야 하고, 통상 하나 이상의 선택적 특징, 예를들어 박테리아의 경우 항생제에 대한 내성을 지녀, 흥미있는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포의 클론을 인지하여 선택적 매질중에서 바람직하게 성장시킬 수 있어야 한다.

플라스미드는 플라스미드 DNA상의 다른 부위를 인지하는 제한 엘도뉴클레아제(endonuclease)또는 "제한효소"에 의해서 특히 분해될 수 있다는데 그 효용이 있다. 이어서 이종 유전자 또는 유전자 단편을 분해부위 또는 분해 분위에 인접한 재구성된 말단에서 말단 결합시킴으로써 플라스미드내에 삽입시킨다. DNA재조합은 세포외에서 행해지아 생성된 "재조합" 플라스미드는 형질 전환법으로 알려져 있는 방법에 의해 도입시킬 수 있으며 형질 전환체를 성장시켜 이종 유전자 - 함유 재조합 플라스미드를 대량 수득한다.

또한 유전자를, 코드화된 DNA 메시지를 전사 및 번역하는 플라스미드와 함께 삽입할 경우, 생성된 발현 비히클을 사용하여 삽입된 유전자 코드에 따른 폴리펩타이드 서열을 실제 제조할 수 있으며 이러한 방법을 "발현"이라 한다.

발현은 RNA 폴리머라제에 의해 인지 및 결합되는 프로모터로 알려진 영역에서 개시된다. 본 발명의 수행에서는 트립토판 또는 "trp"프로모터에서 개시되는 것이 바람직하기 때문에, 몇몇 경우에 프로모터 영역과 "오퍼레이터" 영역이 중복되어 결합된 프로모터 - 오퍼레이터가 형성된다. 오퍼레이터는 특정 프로모터 영역에서 개시되는 전사 빈도를 조절하는 소위 리프레서(repressor) 단백질에 의해 인지되는 DNA 서열이다. 폴리머라제는 DNA를 따라 진행하며, 코드화 나선에 들어 있는 정보를 이의 5'말단에서 3'말단으로 mRNA에 전사시키고, 또한 mRNA는 DNA를 코드화하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 번역된다. 각 아미노산은 "구조 유전자"라 지칭되는 3개의 뉴클레오타이드 또는 "코돈"에 의해 코드화되며, 상기 구조 유전자는 발현된 생성물의 아미노산 서열을 코드화한 부위이다. 프로모터에 결합한 후, RNA 폴리머라제는 우선 리보솜 결합부위를 코드화하는 뉴클레오타이드를 전사시키고 번역개시 또는 "출발" 시그날(통상 ATG, 생성된 mRNA에서 AUG로됨)을 전사시킨 후, 구조 유전자 자체내의 뉴클레오타이드 코돈을 전사시킨다. 소위 정지 코돈은 폴리머라제가 mRNA의 추가서열을 형성할 수 있는 구조 유전자의 말단에서 전사되나, 이추가 서열은 정지시그날의 존재에 기인하여 리보솜에서 번역되지 않는다. mRNA가 형성됨에 따리 통상 박테리아내에서 리보솜 mRNA 상의 결합부위에 결합한 후, 이로부터 번역 출발시그날에서 시작하여 상기한 정지 시그날에서 종료되면서 코드화 폴리펩타이드가 제조된다. 바람직한 생성물은 리보솜 결합부위를 코드화하는 서열이 AUG 개시 코돈에 대하여 적절히 위치하고 모든 잔류 코돈이 상기한 개시 코돈에 따라 차례로 위치할 경우에 제조된다. 생성물은 숙주 세포를 용해시키고 다른 발테리아 단백질로부터 적절히 정제하여 생성물을 회수함으로써 수득할 수 있다.

본 발명자들은 재조합 DNA기술(즉, 미생물 발현 비히클에 인터페론 유전자를 삽입시키고 미생물 유전자 조절 원소의 통제하여 발현시키는 방법)이 백혈구 인터페론을 다량 수득할 수 있는 가장 효과적인 방법이며, 따라서 인체에서 유도된 물질을 글리코실화하여 생성된 물질과는 달리 광법위한 바이러스성 및 종양질환치료에 임상적으로 사용할 수 있다는 점을 간파했다.

본 발명에 따른 백혈구 유전자를 수득하기 위해서는 다음단계들을 실시한다.

(1) 균질하게 정제시킨 인체 백혈구 인터페론의 부분적 아미노산 서열을 사용하여 합성 DNA 프로우브(probe)세트를 작제하고 이의 코돈을 종합하여 부분적 아미노산 서열을 코드화할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오타이드 조합을 표시한다.

(2) 유도된 mRNA로부터 상보성 DNA(cDNA)를 함유하는 박테리아 콜로니 뱅크를 제조한다.

이들중에서 방사선 - 표지된 기타의 유도 mRNA를 하이브리드화시켜 플라스미드 cDNA를 제조한다. 하이브리드화 mRNA를 용출시키고 난모세포 분석법에 의해서 인터페론으로 번역되었는가를 시험한다. 이러한방법에 의해서 인터페론 활성을 나타내는 콜로니에서 얻은 플라스미드 DNA를 시험하여 상기(1)에서 기술된 바와 같이 제조된 프로우브로 하이브리드화하에 대하여 시험한다.

(3) 상기(2)와 병행하여, 플라스미드중의 유도된 mRNA - 유도 cDNA를 사용하여 형질 전환체 콜로니의 독립뱅크를 제조한다. (1)의 프로우브를 사용하여 방사선 - 표지된 단일나선 cDNA를 합성하고 이를 하이브리드화 프로우브로 사용한다. 상기 합성 프로우브를 템플레이드(template)인 유도된 mRNA와 하이브리드화시키고 역전사시켜 신장시킴으로써 유도된, 방시선 - 표지된 cDNA를 제조한다. 이러한 방법에 의해 수득된 방사선 -표지된 cDNA로 하이브리드화된 콜로니 뱅크중의 클론을 더욱 조사하여 유전자를 코드화하는 인테페론 전장이 존재하는가를 확인한다. (1) 또는 (2)에서 수득된 부분적 유전자단편 어느것도 전장의 유전자 추정을 위한 프로우브로 사용할 수 있다.

(4) 상기 수득된 전장의 유전자를 합성 DNA를 사용하여 맞추면, 성숙 폴리펩타이드의 미생물 발현을 억제할 수 있는 어떤 리더(leader)서열도 제거되고 발현 비히클중 출발 시그날 및 미생물 프로모터의 리보솜 결합부위를 적절히 위치지울 수 있다. 발현된 인터페론을 이의 특성 및 활성도가 확인될 때까지 정제한다.

(5) 상기 방법에 따라서 제조된 인터페론 유전자 단편 자체를 하이브리드화시켜 기타의 부분적 동종 백혈구 인터페론종의 프로우빙(probing)에 사용할 수 있다.

상기한 바와 같은 재조합 DNA기술을 사용하면, 상응하는 전서열 또는 그의 일부를 거의 수반하지 않는 성숙 폴리펩타이드로서 동종의 백혈구 인터페론(글리코실화되지 않은)이 고수율 및 고순도로 미생물적으로 제조된다. 이러한 인테론은 동물 및 인체의 바이러스성 및 악성종양 질환치료에 사용하기에 적합한 정도로 직접 발현, 회수 및 전제시킬 수 있다. 그렇게 표현된 인터페론들은 시험관내 및 생체내 시험에서 효과적임이 증명되었으며, 후자의 시험에서는 미생물적으로 제조된 최초의 성숙 백혈구 인터페론임이 증명되었다.

본 명세서에 사용된 "성숙 백혈구 인터페론"이란 용어는 미생물적으로(박테리아에 의해) 제조된 인터페론분자로서 글리코실 그룹이 없는 인터페론으로 정의된다.

본 발명에 따른 성숙 백혈구 인터페론은 천연생성물의 첫째 아미노산 코돈 직전의 번역 출발 시그날(ATG)로부터 즉시 발현된다. 따라서 "성숙" 폴리펩타이드는 이의 서열중 첫째 아미노산으로서 메티오닌(ATG 코드에 따라)을 이의 특성을 본질적으로 변화시킴이 없이 함유할 수 있다. 한편 미생물 숙주는 번역 생성물에서 개시 메티오닌을 제거할 수도 있다. 성숙 백혈구 인터페론은 통사의 리더 이외에 접합 단백질과 함께 발현될 수 있고, 상기 접합체는 세포내 또는 세포외에서 특히 분해될 수 있다(참조 : 영국 특허공보 제2007676A호). 결국 성숙 인터페론은 상기 접합체를 세포벽에 전달시키는 미생물 "시그날" 펩타이드와 함께 생성될수 있고, 세포벽에서 시그날이 통과하여 성숙 폴리펩타이드가 분비된다. 성숙 백혈구 인터페론의 "발현"이란 글리코실 그룹이나 전서열을 함유하지 않고 인체 백혈구 인터페론 제놈의 mRNA 번역이 즉시 이루어지는, 박테리아 또는 기타 미생물에 의한 인터페론 분자의 제조를 의미한다.

특정의 백혈구 인터페론 단백질은 결정된 DNA 유전자(제 3 및 8도)와 추론된 아미노산 서열화(제 4 및 9도)를 사용하여 정의되었다. 이들 특정 인터페론에서는 실로 모든 백혈구 인터페론 단백질균이 포함되어 있으며, 개개마다 상이한 천연의 대립형질이 존재할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 차이는 서열 전반에 걸친 아미노산 차이를 나타내거나, 동일 서열중 아미노산의 삭제, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가를 나타낸다. 각 백혈구 인터페론 단백질에 있어서, 표지된 LeIF A에서 LeIF J까지 대립형질에 차이가 있으며 이는 본 발명의 범위내에 포함된다.

제 1도에서 펩타이드를 코드화하는 모든 잠재적 mRNA서열이 표시되고 상응하는 DNA 서열도 표시되어 있다. A,T,G,C 및 U는 각기 염기로서 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신 및 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. N은 뉴클레오타이드A,G,C 및U 중 어느 하나를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 5'(좌측)에서 3'(우측)방향으로 판독하도록 표시되고, 여기서 이중 나선("d.s")DNA는 하단 또는 비코드화 나선에 대해 역으로 일치하도록 표시된다.

제 3도에서 각 LeIF에 대한 ATG 번역 개시 코돈 및 종료 트리플렛(triplet)에는 밑줄이 그어져 있다. 정지 코돈 또는 종료 트리플렛 뒤에는 3'비번역 영역이 있다. LeIF A의 전장 유전자에는 다른 유전자에서 발견되는 하나의 코돈이 빠져 있고, 이는 제 3도의 세번째 A라인에 표시되어 있다. 5'비변역 영역은 리더 서열의 앞에 위치한다. 분리된 단편 E 는 리더의 완전서열을 결여하고 있으나 추정되는 성숙 LeIF E에서는 유전자 전부를 포함하고 있다. 분리된 단편 G 는 완전한 코드화 서열을 결여하고 있다.

제 4도에서 약어는 IUPAC -IUB 생화학 명명위원회에서 추천된 것을 사용하며, 다음과 같다 :

A, 알라닌 ; C, 시스테인 ; D, 아스파르트산 ; E, 글루탐산 ; F, 페닐알라닌 ; G, 글리신 ; H, 히스티딘 ; I, 이소로이신 ; K, 라이신 ; L, 로이신 ; M,메티오닌 ;N,아스파라긴 ; P,프롤린 ; Q,글루타민 ; R,아르기닌 ; S,세린 ; T,트레오닌 ; V,발린 ; W,트립토판 ; 및 Y, 티로신.

수치는 아미노산 위치를 나타낸다(S는 시그날 펩타이드). 165아미노산 LeIF A 서열중 위치 44에서의 대시는 상기 LeIF A 서열을 기타 LeIF의 166 아미노산 서열과 일렬로 정돈시킨다. 상기 LeIF E서열은 이의 코드화영역에 존재하는 여분 뉴클레오타이드(제 3도의 위치 187)를 무시하여 결정된다. 별표는 등위상 종료 코돈을 나타낸다. 모든 LeIF(슈도진 LeIF E 제외)에 공통적인 아미노산도 표시되어 있다. 밑줄 그은 잔기는 인체의 섬유아세포 인터페론에도 존재하는 아미노산이다.

제 5 도에서 하이브리드 플라스미드는 dC : dG 테일링(tailing)법에 의해서 제조된다(참조 : Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 411 -416(1980)). 따라서 cDNA 삽입은 Pst I을 사용하여 이루어질 수 있다. 각 cDNA 삽입물의 말단에서 라인은 측부 호모폴리머 dC : dG 테일을 타나낸다. Pvu II, EcoRI 및 Bg1 II 제한부위의 위치가 지적되어 있다. 빗금영역은 성숙 LeIF의 코드화서열, 검은점 영역은 시그날 펩타이드 코드화서열 및 공백영역은 3' 및 5'비코드화 서열을 각기 나타낸다.

제 6도에서는 제한 부위 및 잔기가 표시되어 있다("Pst I",등). "b.p."는 염기쌍(base pair)"을 나타낸다.

제 7도에서 두가지 경우에서 지적된 코돈서열은 제한효소 Sau3a로 소화시켜 수득되는 종료 코드화 나선이다.

제 8 도 및 제 9도에서 약어는 제 4도에 나타낸 바와 같다. 제 9도에서 별표는 상응하는 DNA 서열중 종료코돈을 나타낸고, 하이픈은 서열중 삭제 또는 갭(gap)을 나타낸다.

A. 사용 미생물

두 가지 미생물 사용된다 : 이. 콜리 ×1776(참조 ; 미합중국 특허 제4,190,495)및 이. 콜리 K-12균주 294(말단 A,thi^-,hsr^-,hsm k⁺)(참조 : 영국 특허공보 제2055382 A호). 모두 ATCC(American Type Cu1-ture Collection)에 기탁되어 있다.( ATCC 기탁번호는 각기 31537 및 31446). 모든 재조합 DNA법은 국립보건원의 지침에 따라 수행한다.

본 발명의 최선 실시양태에서는 상기 정의된 균주 이. 콜리×1776 및 이. 콜리 K-12균주 294뿐만 아니라 이. 콜리 B와 같은 기타 공지된 이. 콜리 균주를 포함하는 이. 콜리 , 또는 기타의 미생물 균주로 수행하며, 이들중 대부분이 ATCC와 같이 알려져 있는 미생물 기탁 기관에 기탁되어 있고 이로부터 구입할 수 있다. 또한 독일연방공화국 공개공보 제2644432호 참조. 기타의 미생물로는 예를들어 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리 및 기타의 장내균과가 있고 이중에서 예를들어 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)및 세라티아 마르세슨스(Seratia marcescens)이고, 이는 플라스미드를 사용하여 함유된 이종 유전자 서열을 복제 및 발현시킬 수 있다. 또한 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomycescerevisiae)와 같은 효모를 숙주 생물로 사용하여 효보 프로모터의 통제하에 코드화 유전자를 발현시켜 인테레론 단백질을 유리하게 제조할 수 있다.

B. LeIF mRNA의 공급원 및 정제

LeIF mRNA는 인체 백혈구로 부터, 통상 예를들어 독일연방공화국 공개공보 제2947134호에 기술된 바와 같이 센다이 또는 뉴캐슬 질환 바이러스에 의해서 인터페론을 생성시키는 만성 골수백혈병환자의 백혈구로 부터 수득할 수 있다. 특히 바람직한 공급원인, 본 발명의 방법에 사용된 공급원은 급성 골수 백혈병 환자로 부터 유도된 KG -1로 명명되는 셀라인(cell line)이다. 상기 셀라인(cell line)이다. 상기 셀라인(참조 : Koeffler, H.P. and Golde, D.W., Science 200, 1153(1978))을 RMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640+염불활성화된 10%FCS(송아지 태아 혈청), 25mM HEPES 완충제(N-2-하이드로시에틸 -피페라진-N'-2-에탄설폰산) 및 50μg/ml의 겐타마이신으로 이루어진 배지중에서 신속히 성장시키고, 1 내지 3개로 분할하여 주 2회 계대 배양시킨다. 상기 성장배지 + 10% 디메틸설폭사이드중에서 세포를 동결시킬 수 있다.

KG - 1은 ATCC(ATCC 기탁번호 CRL 8031)에 기탁되어 있다.

루빈스타인 등의 방법(참조: Proc. Nat1. Sci. U.S.A. 76, 640 - 644(1979))에 따라서 센다이 또는 뉴캐슬 질환 바이러스로 KG -1세포를 유도하여 백혈구 인터페론 mRNA를 제조한다. 유도한지 5시간후에 세포를 모아 구아디닌 티오시아네이트 - 구아니닌 하이드로클로라이드공정에 의해 RNA를 제조한다(참조 : Chirgwin et al,m Biochemistry 18, 5294-5299(1979)). 동일한 방밥에 의해 비유도 세포로부터 RNA를 분리시킨다. 올리고 데옥시티미딘(dT) -셀룰로즈 크로마토그라피 및 슈크로즈 구배 초원심 분리법을 사용하여 하기 방법에 따라 폴리(A)mRNA의 12S 분획을 수득한다.(참조 : Green et al., Arch. Biochem. Biophys., 172, 74-89 (1976) 및 Okuyuma et al,m Arch. Biochem. Biophys. 188, 98 -104(1978)).

이 mRNA는 크세노푸스 레비스(Xenopus laevis) 난모세포 분석결과 8,000 -10,000 단위/mcg의 인터페론 역가를 지닌다(참조 : Cavalieri et al, Proc. Nat1. Acad. Sci, U.S.A 74, 3287 -3291(1977)).

C. LeIF cDNA 서열을 함유하는 콜로나뱅크의 제조

5μg의 mRNA를 사용하여표준방법에 의해 이중나선 cDNA를 제조한다(참조 : Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 - 2495(1978) 및 Goeddel et al., Nature 281, 544-548(1979)). 이 cDNA를 6% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기 영동하여 크기에 따라 분획을 얻고 이를 전기용출시켜 500 내지 1,500b.p.크기 범위의 물질 230mg을 회수한다. 이 cDNA 100mg에 데옥시시티딘(dC) 잔기를 말단에 붙이고(참조 : Chang et al., Nature 275,617-624(1978)), Pst I 부위에 데옥시구아노신(dG)잔기가 부착된 플라스미드 pBR 322 470ng과 가열 냉각시킨 후(참조 : Bolivar et al,, Gene 2, 95-113(1977)), 이. 콜리 ×1776 형질전환에 사용한다. cDNA ng당 약 130의 테트라사이클린 내성, 암피실린 감수성 형질 전환체가 수득된다.

상기한 바와 같은 두번째의 실험에서는 cDNA ng당 약 1,000의 테트라사이클린 내성, 암피실린 감수성 이. 콜리 K-12균주 294 형질전환제를 수득하였다.

이 경우에 dC말단 부착하고 전기 용출시킴으로써 600 내지 1,300 b.p. 크기범위의 cDNA물질 분획이 회수된다.

D. 합성 올리고뉴클레오타이드의 제조 및 이의 용도

인체 백혈구 인터페론의 여러개의 트립선 분해단편의 아미노산 서열을 알게 되면, LeIF mRNA의 여러 영역에 상보성인 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드의 설계가 가능해진다. 두개의 트립신 분해 펩타이드 T1 및 T13을 선택하는데, 이들은 각기 단지 12개 및 4개의 운데카머 합성에 요구되는 아미노산 서열을 지니고 있어서, 모든 가능한 코드화 서열을 설명할 수 있기 때문이다(제 1도 참조). 데옥시올리고뉴클레오타이드 프로우브 4세트를, 각 서열마다 각기 3개(T-1A,B,C,D)또는 1개(12A,B,C,D)의 올리고뉴클레오타이드를 함유하도록 합성한다. 지적된 상보성 데옥시올리고뉴클레오타이드 11염기길이는 포스포트리에스테르법에 의해 화학적으로 합성한다. (참조 : Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 75,5765-5769(1978)). 4개의 개개 프로우브는 T-13계열에서 제조한다. 12개의 T-1프로우브는 제 1도에 나타낸 바와 같은 프로우브는 3개의 풀(pool)4개로 제조한다.

T-13계열의 4개의 개개 프로우브 및 프라이머 3개의 풀 4개로 제조된 12개의 T-1프로우브를 사용하여 하이브리드화 프로우브로 사용되는 방사선 - 표지된 단일나선 cDNA를 합성한다. 템플레이트 mRNA는 센다이 질환 -유도 KG -1세포로부터 제조된 12S RNA(μg당 8,000단위의 IF 활성도)이거나, 비유도 백혈구로부터 제조된 총 폴리(A) mRNAμg당<10단위)이다.³²p -표지된 cDNA는 이들 프라이머로부터 공지의 반응조건을 사용하여 제조한다(참조 : Noyes et al., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A.76, 1770-1774(1979)). 60μl 의 반응물이 20mM트리스 - HCI(pH8.3), 20mM KCI, 8mM MgCI₂및 30mM β - 머캅토에탄올중에서 생성된다. 반응물에 각 프라이머(즉 T-1계열 총 12μg, T-13계열 4μg)1μg, "유도된" 12S분획 mRNA 2μg(또는 비유도된 폴리(A)mRNA10μg), 0.5mM dATP, dCTP, d┬P, 200μCi (α³²p)dCTP(에머샴,2-3,000Ci/밀리몰) 및 60단위의 역트란스크립타제(Bethesda Research Laboratories)를 함유시킨다. 생성물은 10ml 세파텍스

G-50 컬럼상에서 켈여과시켜 혼입안된 표지로부터 분리한후, 0.3N NaOH로 70℃에서 30분간 처리하여 RNA를 파괴하고 HC1로 중화시킨다. 하기한 방법에 따라 하이브리드화를 수행한다(참조 : Kafatos et al., Nucleic acids Res. 7, 1541-1522(1979)).

E. 클론 PL1-PL30의 동정

하기한 바의 신속한 프라스미드 분리 방법을 사용하여 각기 500의 이. 콜리 K-12 294형질전환체(C참조)로부터 플라스미드 DNA1μg을 제조한다(참조 : Birnboin et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513- 1523(1979)). 각 DNA시료를 변질시키고 상기한 카파토스 등의 방법에 따라서 3회 니트로셀룰로즈 여과시킨다.

500프라스미드 시료를 함유하는 니트로셀룰로즈 여과물 3세트를 하기 a,b 및 c와 하이브리드화시킨다 :

a) 프라이머의 T-1세트로 개시된 유도 cDNA

b)T-13 개시된 유도 cDNA 및

c) 프라이머 양세트를 사용하여 제조한 비유도 cDNA.

클론은 비유도 총 프로우브보다 하나 또는 두개의 유도 cDNA프로우브와 더 강하게 하이브리드화시킬 경우 양성화되는 것으로 생각된다. 또 다른 분석용으로 500클론중 30개의 "양성"클론(PL1-PL30)을 선택한다.

F. 클론 PL31-PL39의 동정

LeIF 유전자 단편을 함유하는 플라스미드(No. 104)의 분리

이. 콜리 ×1776의 형질 전환체를³²P-표지된 유도 mRNA를 프로우브로 사용하여(참조 : Lillenhaug et al., Biochemistry, 15, 1858-1865(1976)) 그룬스타인 및 호그네스의 콜로니 하이브리드화 공정에 의해 선별한다(참조 : Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72, 3961-3965(1975)). 비유도세포에서 얻은 표지안된 mRNA를 상기 프로우브와 200:1의 비율로 혼합하여³²P-표지된 제제중에서 비유도 mRNA가 경쟁적으로 작용되도록 한다. 표지된 mRNA의 하이브리드화는 유도서열을 함유하는 콜로니에서 바람직하게 일어나야 한다.

3종의 형질전환체가 수득된다 :

(1) 콜로니중 2 내지 3%는³²P-mRNA에 매우 강하게 하이브리드화됨

(2) 콜로니중 10%는 (1)에 비해 약하게 하이브리드화됨

(3) 나머지는 검출할만한 하이브리드화 시그날을 제공안함.

양성콜로니(1) 및 (2)에 대하여 인터페론 mRNA의 특히 플라스미드 DNA에의 하이브리드화에 따른 시험에 의해 인터페론-고유서열이 존재하는가를 조사한다. 우선 60의 강양성 콜로니(1)를 테트라사이클린(20μg/ml), 디아미노피멜산(100μg/ml), 티미딘(20μg/ml)및 d-비오틴 (1μg/ml)을 보충시킨 M9배지 100ml에 각기 성장시킨다. M9배지는 l당 Na₂HPO₄(6g), KH₂PO₄(3g), NaC1(0.5g) 및 NH₄C1(1g)을 함유한다. 멸균된 1M MgSO₄1ml를 고압멸균시킨 후 멸균된 0.01M CaC1₂10ml를 가한다. 10개의 배양물을 합하고 클레웰 등의 방법에 따라 6개 풀로부터 플라스미드 DNA를 분리시킨다(참조 : Biochemistry 9, 4428-440(1970)). 각 플라스미드 DNA풀 10μg을 Hind III으로 분해하고 변질시킨 후 DBM(디아조벤질옥시메틸)지에공유결합시킨다. 유도세포로부터 제조된 정제 mRNA 1μg을 각 여과물과 하이브리드화시킨다. 비하이브리드화 mRNA를 세척하여 제거시킨다. 특이적 하이브리드화 mRNA를 용출시키고 크세노푸스 레비스 난모세포중에서 번역시킨다. 상기 시험에 의해, 6개 출 모두가 음성이었다. 59의 약한 양성 콜로니(2)로부터 10콜로니의 5폴과 9콜로니의 1풀을 제조한 후, 상기 풀로부터 플라스미드를 제조하여 상기한 바와 같이 시험한다. 시험한 6풀중 매회 상기 수준보다 특이적으로 강하게 인터페론 mRNA와 하이브리드화 되는 것 1개(K 10)를 시험하였다. 특정인터페론을 동정하기 위해, 풀 K 10의 9콜로니로부터 cDNA 클론 플라스미드 DNA를 제조하여 각기 시험하였다. 9플라스미드중 둘(No. 101 및 No. 104)은 상기 수준보다 강하게 인터페론 mRNA에 결합하였다. 플라스미드 No. 104로부터 260b.p.를 함유하는 유일한 Bg1 II 제한단편을 분리시키고 테일러의 방법을 사용하여³²P로 표지시킨 후(참조 : Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta 442, 324-330(1976)), 동일 반응계내 콜로니 선별법(참조: Grunstein and Hogness, Proc.Nat1. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965(1975))에 의해 400 이.콜리 294 형질전환체를 각기 선별하는데 프로우브로 사용한다. 9개의 콜로니(PL31-PL 39)를 이 프로우브와의 하이브리드화 상이도에 따라 동정한다.

또한 표지된 260b.p 단편을 사용하여 상기한 바와 동일한 방법에 의해 4,000 이. 콜리 294형질전횐체를 각기 선별한다. 50콜로니를 이 프로우브와의 하이브리드화 상이도에 따라 동정한다. 1개는 LeIF G 단편을 함유하고 1개는 LeIF H 단편을 함유하며, 1개는 LeIF H의 대립형질인 LeIF H1로 표시되는 단편을 함유한다. 수득되는 하이브리드화 "플라스미드는 PLeIF H"등으로 표시된다.

G. 첫째 전장 LeIF 유전자의 분리 및 서열화

모든 39의 잠재적 LeIF cDNA 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고 카파토스 등의 하이브리드화 공정(상기 참조)을 사용하여 동일한 260b.p. DNA 프로우브로 재선별한다. 3개의 플라스미드(PL4,PL31,PL34)는 매우 강한 하이브리드화 시그날을 나타내며, 4개(PL13,PL30,PL32,PL36)는 중간정도로 하이브리드화되고 3개(PL6,PL8,PL14)는 프로우브와 약하게 하이브리드화된다.

또한 하이브리드화 프로우브로서³²P-표지된 합성 운데카머(개개 T-1 프라이머 풀 또는 개개 T-13프라이머)를 직접 사용하여 39의 잠재적 LeIF cDNA 재조합 플라스미드를 선별한다. 하이브리드화 시그날 검출에 염기쌍이 완전히 이용되도록 하이브리드화 조건을 선택한다(참조 : Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557(1979)). 따라서 39 클론으로부터 표준 세정용해물 공정(참조 : Clewell et al.,상기 참조)에 의해 플라스미드 DNA를 재조한후, 비오라드 아가로즈(Biorad Agarose) A-50컬럼 크로마토그라피로 정제한다. 각 제제 시료(3μg)를 EcoRI로 처리하여 선형화시키고 알칼리중엣 변질시킨 후 2개의 니트로셀룰로즈 필터사에서 스포팅하며, 스포트당 1.5μg이다(카파토스 등, 상기참조). 개개 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프라이머 풀을 다음과 같이(γ³²p)ATP로 포스포릴화시킨다 :

올리고뉴클레오타이드 50pmole 및 (γ³²p)ATP 100pmole(New England Nuclear, 2,500Ci/mmole)을 50mM 트리스 - HCl, 10mM MgCl₂및 15mM β-머캅토에탄올 30μl 중에서 혼합한다. T₄폴리-뉴클레오타이드 키나제 2단위를 가하고 37℃에서 30분후에³²P-표지된 프라이머를 세파덱스

G-50컬럼 10m 상에서 크로마토그라피로 정제한다. 프라이머 T-13C 10⁶cpm 또는 프라이머 풀 T-1C 3×10⁶cpm 을 사용하여 하이브리드화를 수행한다. 하이브리드화는 6×SSC[1×SSC=0.15M NaCl, 0.015M 나트륨시트레이트, pH7.2], 10×덴하르트 용액 [0.2% 소혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 피콜(Ficoll)]중에서 월라스 등의 방법(상기 참조)에 의해 15℃에서 14시간동안 수행한다. 여과물을 0℃에서 6xSSC 중에서 5분간 세척하고(3회), 건조시키고 X-선 필름에 노출시킨다.³²P-프라이머 풀 T-13C 및 프라이머T-1C에 대한 결과는 제 2 도에 나타냈다.

클론 104에서 얻은 플라스미드 DNA는 프라이머 풀 T-1C 및 프라이머 풀 T-13C 와 상당히 하이브리드화되나, 기타 나타낸 운데카머와의 하이브리드화는 검출되지 않았다. 제 2도에 기타낸 바와 같이, 39의 잠재적 LeIF 플라스미드중 몇명(PL2,4,13,17,20,30,31,34)은 상기 프로우브와 하이브리드화된다. 그러나 제한 분석결과, 상기 플라스미드중 단지 1개(PL31)만이 260b.p. 내부 Bgl II 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. PL31을 Pst I 소화시킨 결과, cDNA 삽입물 크기는 대략 1000b.p.로 나타났다.

M13벡터에 Sau 3a 단편을 서브클로닝시킨후, PL31의 전체 Pst I 삽입물을 맥샴-길버트의 화학적 방법(참조: Methods Enzymol. 65, 499-560(1980)) 및 디데옥시쇄 말단화공정(참조 : Smith, Methods Enzymol. 65, 560-580(1980)에 의해 서열화시킨다. DNA 서열은 제 3도에 표시되어 있다("A").

적절한 번역판독 프레임은 단백질 서열정보, 기지의 LeIF 분자량 범위 및 3개의 가능판독 프레임중 정지 트리플렛의 상대 출현으로부터 예측할 수 있으며, 또한 프리(pre)-또는 시그날 펩타이드를 포함하는 전체 LeIF 아미노산 서열도 예측할 수 있다. 첫째 ATG 번역개시 코돈이 서열의 5'말단에서부터 60번째 뉴클레오타이드에 나타나고 이로부터 188번째후의 코돈에서 TGA 종료 트리플렛이 나타나며 ; 3'말단에는 342개의 번역안된 뉴클레오타이드가 존재하고 이에 이어서 폴리(A) 서열이 위치한다. 추정되는 시그날 펩타이드(아마도 백혈구로부터의 성숙 LeIF 분비시 포함되는)는 아미노산 23개의 길이를 갖는다. 성숙 LeIF를 구성하는 165개의 아미노산은 19,390의 계산치 분자량을 갖는다. PL31로 코드화된 LeIF는 "LeIF A"라 명명한다. 제 4도의 서열데이타("A")로부터, LeIF B의 트립신 분해 펩타이드 T1및 T13이 각기 LeIF A의 아미노산 145 내지 149 및 51내지 61에 상응하는 것으로 알 수 있다.

상기 두개의 영역에서 발견된 실제 DNA 코드화 서열은 프라이머 풀 T1-C 및 프라이머 T13-C로 표시된다(제 8도 참조).

H. 성숙 백혈구 인터페론 A(LeIF A)의 직접 발현

1.개 요

LeIF A를 성숙 인터페론 폴리펩타이드로서 직접 발현시키는 하기 방법은 인체 성장 호르몬에 일찌기 사용된 방법(참조 : Goeddel et al., Nature 281, 544-548(1979))의 변형법으로, 여기에는 합성(N-말단) 및 상보성 DNA의 조합이 포함된다.

제 6도에서 밝혀진 바와 같이, Sau 3a 제한 엔도뉴클레아제 부위는 통상 LeIF A의 코돈 1과 3 사이에 위치한다. 두개의 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드를 설계하여, 여기에 ATG 번역개시 코돈을 편입시키고 아미노산 1(시스테인)의 코돈을 넣고 EcoRl 점착성 말단을 만든다. 이들 올리고머를 PL31의 34b.p. Sau 3a AVa II 단편과 연결시킨다. 수득되는 45b.p. 생성물을 2개의 추가 DNA 단편과 연결시켜 865b.p.합성-천연 하이브리드 유전자를 구성하고 이는 LeIF A를 코드화하고 EcoRl 및 Pst I 제한부위와 결합된다. 이 유전자를 EcoRI과 Pst I 부위 사이의322에 삽입시켜 플라스미드 pLeIF A1을 수득한다.

2. 트립토판 조절 원소의 작제(이. 콜리 trp프로모터, 오퍼레이터 및 trp 리더 리보솜 결합부위를 함유하나 번역을 개시하는 ATG 서열을 결여)

플라스미드 pGMI은 삭제 ΔLE 1413을 함유하는 이. 콜리 트립토판 오퍼론을 수반하고(참조 : Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466(1978)),따라서 trp 프로모터-오퍼레이터 시스템 통제하에 trp 리더의 첫째 6 아미노산 및 trp E 폴리펩타이드(이하 LE'로 지칭)의 최후 3번째 아미노산)은 물론 trp D 폴리펩타이드 전부로 구성되는 융합 단백질을 발현시킨다. 플라스미드20μg을 제한 효소로 Pvu II 로 소화시켜 플라스미드의 5부위를 분해시킨다. 이어서 상기 유전자 단편을 EcoRI 링커(pCATGAATTCATG 서열의 자기상보성 올리고뉴클레오타이드로 구성된)와 결합하여, EcoRI 부위를 함유하는 플라스미드내에 이후의 클론화 EcoRI 분해 부위를 제공한다. pGM 1에서 수득된 DNA 단편 20μg을 5'-포스포릴화 합성 올리고뉴클레오타이드로 pCATGAATTCATG 200pmole 존재하에 20μl의 T₄DNA 리가제 완충제(20mM 트리스, pH7.6, 0.5mM ATP, 10Mm MgCl₂, 5mM 디티오트레이톨)중에서 10단위의 T₄DNA 리가제로 4℃에서 밤새 처리한다.

이어서 용액을70℃에서 10분간 가열한후 리게이션을 중지시킨다. 링커를 EcoRI 소화에 의해 분해시키고 EcoRI 말단이 부착된 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(이하 PAGE라 함)으로 분리시키고, 3개의 가장 큰 단편을 에티디움 브로마이드로 일차 염색시키고 자외선을 조사시킨 후 겔로부터 목적하는 부분을 절단시킴으로써 겔에서 분리시킨다. 300마이크로리터 0.1×TBE와 함께 각 겔 단편을 투석백에 넣고, 0.1×TBE 완충제(TBE 완충제는 10.8g의 트리스 염기, 5.5g의 붕산, 1l의 H₂O 중 0.09g의 Na₂EDTA를 함유)중에서 100V하에 1시간동안 전기영동시킨다. 투석백으로부터 수용액을 모아 페놀추출 및 클로로포름 추출후에 0.2M 염화나트륨 용액으로 만들고 에탄올 첨전후에 물중에서 DNA를 회수한다. EcoRI 점착성 말단을 지닌 trp 프로모터-오퍼레이터-함유 유전자를 하기 방법에 의해 동정하고, 이 유전자에는 프로모터-오퍼 레이터 삽입시 페트라이클린 내성으로 되는 테트라사이클린 감수성 플라스미드에 단편이 삽입되어 있다.

플라스미드 pBRHI(참조 ; Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287(1979))는 암피실린 내성을 나타내고 테트라사이클린 내성인 유전자를 함유하나, 프로모터와 무관할 경우에는 내성을 나타내지 않는다. 따라서 플라스미드는 테트라사이클린 감수성이다. EcoRI 부위에 프로모터-오퍼레이터 시스템을 도입시키면 플라스미드가 테트라사이클린 내성으로 될 수 있다.

pBRH1은 EcoRI로 소화시키고 페놀 추출 및 클로로포름 추출로 효소를제거시킨후 에탄올 침전시켜 물중에서 회수한다. 수득되는 DNA 분자는 각 반응환합물중에서 상기 수득된 3개의 DNA 단편과 각기 결합시키고 상기한 바와 같이 T₄DNA 리가제로 리게이션시킨다. 반응 혼합물에 존재하는 DNA는 표준 기술에 의해 경쟁적 이. 콜리 K-12균주 294를 형질 전환시키는데 사용하고(참조 : Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 3455-3459(1974)), 이 박테리아는 20μg/ml의 암피실린 및 5μg/ml의 테트라이클린을 함유하는 LB(Luria-Bertani)판상에 둔다. 여러개의 테트라사이클린- 내성 콜로니를 선택하여 플라스미드 DNA를 분리시키고, 제한 효소 분석법에 의해 목적한 단편의 존재여부를 확인한다. 수득되는 플라스미드는 pBRHtrp로 명명된다.

간염 B의 바이러스 제놈의 EcoRI 및 BamHI 소화 생성물은 통상적 방법에 의해 수득하고 플라스미드 pGH 6의 EcoRI 및 BamHl 부위에 클론화시켜(참조:Goeddel et al, Nature 281,544(1979)) 플라스미드 pHS 32를 형성시킨다. 플라스미드 pHS32를 XbaI로 분해시키고 페놀추출 및 클로로포름 추출후에 에탄올로 침전시킨다. 이어서 0.1mM dTTP및 0.1mM dCTP를 함유하는 30μl의 폴리머라제 완충제(50mM인산 칼륨 pH7.4, 7mM MgCl₂, 1mMβ-머캅토에탄올)중에서 1μl의 이. 콜리 DNA폴리머라제 I, 클레나우(klenow)단편(Boehringer-Mannheim)으로 0℃에서 30분간 처리한 후 37℃에서 2시간동안 처리한다. 상기 처리에 의해서 XbaI 분해부위의 5'돌출말단에 상보성인 4개의 뉴클레오타이드중 2개가 다음과 같이 채워진다:

두개의 뉴클레오타이드, dC 및 dT는 결합되어 두개의 5'돌출 뉴클레오타이드 말단을 갖게된다. 이러한 선형 플라스미드 pHS 32잔기(페놀 및 클로로포름 추출하고 에탄올 침전후에 물중에서 회수)는 EcoRI로 분해 시킨다. 대형 플라스미드 단편을 PAGE에 의해 소영 EcoRI-XbaI 단편으로부터 분리하고 전기용출시킨 후 분리시킨다. pHS32(0.2μg)로부터 수득된 DNA 단편은 상기한 바와 동일한 조건하에 리게이션시켜, pBRHtrp로부터 유도된, 트립토판 오퍼론(~0.01μg)의 EcoRI- TaqI단편을 수득한다.

pHS 32에서 얻은 단편을 리게이션시켜 EcoRI-TaqI 단편을 얻는 방법은, 상기한 바와 같이, 비록 완전한 와트슨-크리크(Watson-Crick) 염기쌍을 지니지는 않았어도 TaqI 돌출 말단을 XbaI 잔류 돌출말단과 리게이션시키는 것이다.

이러한 리게이션 반응 혼합물의 일부를 이. 콜리 294세포로 형질전환시키고 가열 처리한후 암피실린을 함유하는 LB 판상에 둔다. 24개의 콜로니를 선택하여 3ml LB(Luria-Bertani) 매질중에서 성장시켜 플라스미드를 분리한다. 이들중 6개는 이. 콜리 촉매화된 DNA회복 및 복제로 재생된 AbaI 부위를 갖는 것으로 밝혀졌다 :

이들 플라스미드는 또한 EcoRI 및 HpaI 모두에 의해 분해되어 목적한 제한 단편을 생성시키는 것으로 밝혀졌다.

pTrp 14로 명명된 1개의 플라스미드는 이하에 논의되는 바와 같이 이종 폴리펩타이드의 발현에 사용된다.

플라스미드 pHGH 107(참조 : Goeddel et al.m Nature 281, 544(1979))은 합성 DNA 단편에 수득된 23개의 아미노산 코돈과, 인체 성장 호르몬 mRNA를 역전사시켜 제조된 상보성 DNA로부터 수득된 163개의 아미노산 코돈으로 이루어진 인체 성장 흐르몬 유전자를 함유한다. 이 유전자는, 인체성장 호르몬의 "전(pre)"서열 코돈을 결여하지만, ATG 번역 개시 코돈을 함유한다. 이 유전자는 상기한 바와 같이 10μg의 pHGH 107을 EcoRI로 처리한 후 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I 클레나우 단편과dTTP 및 dATP로 처리하여 분리시킨다. 이어서 페놀 및 클로로포름추출 및 에탄올 침전후에 상기 플라스미드를 BamHI로 처리한다.

인체성장 호르몬(HGH)유전자-함유 단편은 PAGE후에 전기 용출시켜 분리시킨다. 또한 수득되는 DNA단편도 테트라사이클린 내성 구조 유전자의 첫째 350뉴클레오타이드를 함유하나 테트라사이클린 프로모터-오퍼레이터 시스템을 결여하므로, 발현 플라스미드에 후속 클론화시킬 경우 이 삽입물을 함유하는 플라스미드가 테트라사이클린 내성을 회복할 수 있다. 상기 단편의 EcoRI 말단은 클레나우 폴리머라제 I공정에 의해 채워지므로, 이 단편은 발현 플라스미드에 삽입시 적절한 방향으로 1개의 평활말단 및 1개의 점착성 말단을 갖게 된다.

이어서 발현 플라스미드 pTrp 14를 상기 제조된 HGH유전자-함유 단편이 함유되도록 제조한다. 즉, pTrp 14를 XbaI 소화시키고 수득되는 점착성 말단을 클레나우 폴리머라제 공정에 의해 dATP, dCTP, dTTP,및 dGT를 사용하여 채운다. 페놀 및 클로로포름 추출과 에탄올 침전후에 수득되는 DNA 를 BamHI로 처리하고, 수득되는 대형 플라스미드 단편을 PAGE 및 전기 용출로 분리시킨다. pTrp 14-유도 단편의 1개의 평활말단 및 1개의 점착성 말단을 함유하므로, 상기한 HGH유전자-함유 단편을 적절한 방향으로 재조합시킬 수 있다.

HGH유전자단편과 pTrp14 ΔXba-BamHI 단편을 상기한 바와 동일한 조건하에 결합 및 리게이션시킨다. XbaI 및 EcoRI 으로 채워진 말단을 평활말단 리게이션으로 결합시켜 XbaI 및 EcoRI부위를 재생시킨다 :

상기 구조는 또한 테트라시이클린 내성 유전자를 재생시킨다. 플라스미드 pHGH 107은 HGH유전자의 상류에 위치하는 프로모터(lac 프로모터)로부터 테트라사이클린 내성을 나타내므로, pHGH207로 명명된 이 구조는 트립토판 프로모터-오퍼레이터 통제하에 테트라사이클린 내성 유전자를 발현시킬 수 있다. 따라서 리게이션 혼합물을 이. 콜리 294로 형질전환시키고 선택된 콜로니를 5μg/ml의 테트라사이클린을 함유하는 LB판상에 둔다.

플라스미드 pHGH 207을 EcoRI소화시키고, trp프로모터, 오퍼레이터 및 trp리더 리보솜 결합부위는 함유하나 번역개시 ATG 서열은 결여하는 300 b.p. 단편을 pAGE 후에 전기용출시켜 회수한다. 이 DNA 단편을 pLeIf A의 EcoRI 부위에 클론화한다. 상기 변형된 trp 레굴론(발현도를 제어가능하게 높이기 위해 감퇴 서열을 삭제한 이. 콜리 trp 오퍼론)을 함유하는 발현 플라스미드는, 프로모터-오퍼레이터 시스템을 충분히 억제시킬 수 있는 양의 트립토판을 추가로 함유하는 영양 배지중에서 예정한 정도까지 성장시킨후 시스템 및 목적 생성물의 발현을 억제하지 않도록 트립토판을 제거한다.

더욱 특히, 제 6도에서는 플라스미드 pL31 250μg을 Pst I로 소화시키고 1000 b.p. 삽입물을 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 겔 전기영동시켜 분리한다. 약 40μg의 삽입물을 겔로부터 전기용출시킨 후 3개의 분취량으로 나누어 더욱 소화시킨다:

a) 상기 단편시료 16㎍을 Bgl II 40단위로 37℃에서 45분간 부분적 소화시키고 반응 혼합물을 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한다. 목적한 670 b.p. 단편 약 2μg이 회수된다. b)1000b.p. Pst I 삽입물의 다른시료(8μg)를 Ava II와 Bgl II로 제한시킨다. 지시된 150b.p. 단편 1μg을 겔 전기 영동후에 회수한다. c)1000b.p. 16μg 을 sau 3a 및 Ava II 로 처리한다. 10%폴리아크릴아미드겔상에서 전기 영동안 후에, 약 0.25μg(10 pmole)의 34 b.p.단편을 회수한다. 포스포트리에스테르 공정에 의해 두개의 지시된 데옥시올리고뉴클레오타이드, 5'-dAATTCATGTGT(단편 1) 및 5'-dGATCACACATG(단편 2)를 합성한다. 단편 2를 다음과 같이 포스포릴화시킨다.(r³²p)ATP(Amersham, 5,000Ci/mmole) 200μl (~40pmole)을 건조시키고, DNA 단편 100pmole 및 T₄폴리뉴클레오타이드 키나제 2단위를 함유하는, 60mM 트리스-HCl(pH 8), 10mM MgCl₂, 15mMβ- 머갑토에탄올 30μl중에 재현탁시킨다. 37℃에서 15분후에 10mM ATP 1μl를 가하고 반응을 15분간 더 진행시킨다.

혼합물을 70℃에서 15분간 가열한 후, 5'-OH 단편 1100pmole 및 34 b.p. Sau 3a-Ava II 단편 10pmole과 결합시킨다. 20mM트리스-HCl 50μl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 0.5mM ATP 및 10 단위의 T₄DNA리가제 50μl 중에서 4℃에서 5시간 동안 리게이션시킨다. 혼합물을 6% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동한 후에 전기용출시켜 45 b.p. 생성물을 회수한다. 45 b.p.생성물 약 30ng(1pmole)150b.p. Ava II-Bgl II 단편 0.5μg(5pmole)및 670b.p Bgl II-Pst I 단편 1μg(2pmole)과 결합시킨다. T₄DNA 리가제 20단위를 사용하여 20℃에서 16시간동안 리게이션시킨다. 리가제는 65℃에서 10분간 가열하면 불활성화된다. 이어서 혼합물을 EcoRl 및 Pst I 로 소화시켜 유전자 폴리머를 제거시킨다. 혼합물을 6% 로 PAGE로 정제한다. 865b.p.생성물 약 20ng(0.04pmole)을 분리시킨다. 이중 1/2(10ng)을 EcoRl 과 Pst I 부위사이의 pBR(0.3μg)에 리게이션시킨다. 이. 콜리 294의 형질전환으로 70 테트라사이클린 내성, 암피실린 감수성 형질 전환체가 수득된다. 이들 형질존환체 18개로부터 분리된 플라스미드 DNA를 EcoRl 및 Pst I 로 소화시킨다. 18개의 플라스미드중 16개는 865b.p. 길이에 EcoRl-Pst I 단편을 갖는다. 이중 하나, pLeIF Al 1μg을 EcoRl로 소화시킨 후, 상기한 바와 같이 제조된, 이. 콜리 trp프로모터 및 trp 리더 리보솜 결합부위를 함유하는300b.p. EcoRl 단편(0.1μg)에 리게이션시킨다. trp프로모터를 함유하는 형질전환체는³²p-trp프로우브를 사용하여 그룬스타인-호그네스 콜로니 선별공정에 의해 동정한다. trp 단편내에 비대칭적으로 위치하는 Xba I 부위로부터, trp 프로모터가 LeIF A 유전자 방향에 위치하는 재조합을 결정할 수 있다.

I. LeIF A의 시험관내 및 생체내 활성도

IF분석용 추출물을 다음과 같이 제조한다 ;

1ml의 배양물을 5μg/ml의 테트라사이클린을 함유하는 L육즙에서 A₅₅₀치가 약 1.0이 될 때까지 성장시킨후, 5μg/ml의 테트라사이클린을 함유하는 M9 배지 25ml에 희석시킨다. A₅₅₀이 1.0이 되면 원심분리시켜시료 10ml를 모으고 세포펠렛을 15% 슈크로즈, 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 50mM EDTA 1ml 중에 현탁시킨다. 리소자임 1mg을 가하고 0℃에서 5분후에 세포를 초음파 처리하여 분쇄한다. 시료를 10분간 원심분리시키고(15,000rpm), 상등액의 인터페론 활성을 세포변성 효과(CPE)억제 분석법에 의해 LeIF 표준물과 비교하여 측정한다. 세포당 IF 분자수를 측정하기 위해서, 4×10⁸단위/mg의 LeIF 비활성도를 사용 한다.

표 1에 밝혀진 바와 같이, trp 프로모터가 목적한 방향으로 삽입된 클론pLeIF A trp 25는 고활성도(2.5×10⁸단위/ι)를 나타낸다. 표 2에 밝혀진 바와 같이, 이. 콜리 K-12 균주 294/ pLeIF A trp 25에 의해 제조된 IF는실제의 인체 LeIF처럼 작용하고 ; 이는 pH2에서 처리시 안정하고 토끼의 항-인체백혈구 항체로 중화시킨다. 인터페론은 약 20,000의 겉보기 분자량을 갖는다.

인터페론이 생체내에서 활성화되기 위해서는 거대세포와 천연식(natural killer: NK)세포가 존재해야 하고 생체내 작용 기전이 이들 세포를 자극시키도록 나타야 한다. 따라서 이. 콜리 294/pLeIF A 25에 의해 생성된 인터페론이 세포 배양 분석법에서는 항바이러스 활성을 지니나 감염 동물에서는 활성을 나타내지 않을 수 있다. 또한 박테리아에 의해 제조된 비-글리코실화 LeIF A의 생체내 항바이러스 활성은 인체"연막(buffy coat)" 백혈구에서 유도된 글리코실화 LeIF 와는 상이할 수 있다. 따라서 박테리아에 의해 합성된 LeIF A(2%순도)의 생물학적 활성은 스퀴럴(squirrel)원숭이의 치명적 뇌심근염(EMC) 바이러스 감염증에서 연막 LeIF(8%순도)와 비교 측정하였다(표 3).

[표 1]

이. 콜리 추출물의 인터페론 활성도

[표 2]

이. 콜리 294/pLeIF A 25에서의 추출물과 표준 LeIF*의 비교 활성도

*표 1에 기술된 이. 콜리 294/pLeIF A trp 25의 추출물 250,000 단위/ml 를, 500 단위/ml의 비활성도를 제공하는 최소 필수 배지로 500배 희석시킨다. NIH 백혈구 인터페론 표준물에 대해 미리 적정시킨 백혈구 인터페론 표준물(Wadley Institute)을 희석시켜 최종 농도를 500U/ml로 만든다. 1ml 분취량을 1N HCl pH 2로 조정하고 4℃에서 52시간 동안 배양하고 NaOH를 가하여 중화시킨후 표준 CPE 억제 분석법에 의해 IF활성도를 측정한다. 500 단위/ml 시료(비처리된)의 25μl 분취량을 토끼의 항-인체 백혈구 인터페론 25μl의 37℃에서 60분간 배양하고 12,000×g 속도로 5분간 원심분리시킨 후 상등액을 분석한다.

[표 3]

스퀴럴 원숭이의 EMC바이러스 감염증에 대한 여러 LeIF 제제의 항 바이러스효과

모든 원숭이는 수컷(평균체중 713g)이고 감염전에 EMC 바이러스 항체를 갖지 않은 것이다. 원숭이를 100×LD₅₀바이러스(마우스에서 측정된)로 근육내 감염시킨다. 대조군 원숭이는 감염후 134, 158 및 164시간에 사망하였다. 16⁶단위의 인터페론 처리는 감염시키기 4시간전 및 감염시키기 2,23,29,48,72,168 및 240시간에 정맥내 투여로 수행한다. 박테리아 백혈구 인터페론은 7.4×10⁶단위/ml 단백질의 비활성도에서 이. 콜리 294/pLeIF A 25 용해물로부터의 컬럼크로마토그라피 분획물이다. 대조군 박테리아 단백질은 2배의 총단백질 농도에서 이. 몰리 294/pBR 322 용해물로부터의 컬럼 분획물이다. 백혈구 인터페론 표준물은 정상 인체 "연막" 세포로부터의 센다이 바이러스 유도 인터페론으로 32 ×10⁶단위/mg 단백질의 비활성도를 갖도록 크로마토그라피롤 정제시킨다.

대조군 원숭이는 사망전 8시간 경에 점차적으로 기면, 평형감각상실, 뒷다리의 이완성 마비 및 안루등을 나타낸다. 인터페론 처리된 원숭이는 이들 비정상적 증상을 나타내지 않고, 이들 원숭이는 계속 활동적이며 바이러스 혈증을 일으키지 않는다. 그러나 죽은지 4일(감염후 164시간)까지 바이러스 혈중을 나타내지 않은 대조군중의 1마리 원숭이는 사망후 심장 및 뇌에서 고역가의 바이러스를 나타냈다. 인터페론 처리된 원숭이에서는 감염후 14 및 21일에 측정시 EMC 바이러스에 대한 향체가 생성되지 않았다. 이러한 결과로부터 감염 단백질은 박테리아 및 연막제제와는 매우 상이하기 때문에 감염 동물에서의 LeIF 제제의 항바리러스 효과는 오로지 인터레론에 기인된 것임을 알 수 있다. 또한 이러한 결과는 LeIF A의 생체내 항바리어스 활성에 글리코실화가 요구되지 않음을 나타낸다.

J. 추가의 백혈구 인터페론 제조용 cDNA의 분리

완전히 특정지워진 LeIF A cDNA-함유 플라스미드로 부터 얻어진 DNA를 Pst I 로 절단하고 전기영동으로 분리시킨후³²p로 표지시킨다. 수득되는 방사선-표지된 DNA를 프로우브로 사용하여, 상기 C에서와 같이 제조된 추가의 이. 콜리 294 형질전환체를 그룬스타인 및 호그네스의 동일 반응계내 콜로니 선별공정(상기 참조)에 의해 선별한다. 프로우브와 여러 변화량으로 하이브리드화된 콜로니를 분리시킨다. 이들 콜로니로부터 수득한 플라스미드 DNA와 상기 G에서 명명된 10개의 하이브리드화된 콜로니를 Pst I 절단으로 분리시키고 3가지의 상이한 방법에 의해 특징지운다. 첫째, 이들 Pst I 단편을 Bgl II, Pvu II 및EcoRI 효소에 의한 제한 엔도뉴클레아제 소화 패턴으로 특징지운다. 상기 분석법으로, 제 5도에 나타낸 적어도 8개의 상이한 타입(LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF G,및 LeIF H)으로 분류되며, 이는LeIF A 의 공지된 전서열(presequence)및 코드화 서열에 대한 여러 제한 절단 위치에 근접한다. 이들중 하나인 LeIF D는 하기 문헌에 보고된 바와 일치하는 것으로 간주된다.(참조 : Nagata et al., Nature 284, 316-320(1980)).

둘째, 하기 문헌에 기술된 하이브리드화 선별 분석법에 의해 특정의 DNA가 폴리-A 함유 KG-1 세포DNA로부터 LeIF mRNA를 선택적으로 제거시킬 수 있는가를 시험한다.(참조 : Cleveland et al., Cell 20,95-105(1980)). LeIF A,B,C 및 F는 상기 시험결과 양성이었다. 셋째, Pst 단편을 발현 플라스미드내에 삽입시키고, 이. 콜리 294를 플라스미드로 형질전횐시킨후 상기 단편들을 발현시킨다. 프리(pre)-인터페론으로 여겨지는 발현 생성물은 인터페론 활성에 대한 CPE 분석결과 모두 양서으로 나타냈으나, LeIF F 단편의 경우에는 활성이 제한적이었다. 상기한 바 이외에, 기술된 LeIf 타입 모두를 서열화했다.

K. 2차 성숙 백혈구 인터페론(LeIF B)의 직접 발현

성숙 LeIF B 유전자를 함유하는 분리 단편의 서열은 타입 A와 B의 전반 14의 뉴클레오타이드가 동일함을 나타냈다. 따라서 trp-프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합부위 및 LeIF A(=B)개시 유전자를 함유하는 LeIF A 25로부터 수득된 단편을 분리시키고 발현된 플라스미드이 B서열중 잔류 부분과 결합시킨다.pL4(제 5 도에 표시된 LeIF B Pst-말단 유전자를 함유하는 플라스미드) 및 PLeIF A 25의 단편에 대한 돌출 제한지도를 각기 제 7 a및 7b도에 표시하였다.

제 7a조에 표시된 서열로부터 약 950b.p.의 Sau 3a 내지 Pst I 단편을 얻기 위해서는, 1개이상의 인터비닝(intervening)Sau 3a 제한 부위가 존재하므로 하기한 여러단계가 필요하다 :

1. 하기 단편을 분리시킨다 :

a)Sau 3에서 EcoRI까지의 110b.p.

b) EcoRI에서 Xba까지의 132b.p.

c) Xba에서 Pst까지의 >700b.p.

2. 단편(1a)와 (1b)를 리게이션시키고 Xba 및 Bgl II 로 절단하여 Sau 3 및 Xba 말단을 통한 자기 중합을 배제시킨다(관련 Sau 3 부위는 Bgl II 부위내에 존재하고; Bgl II 를 절단하여 Sau 3a 점착성 말단을 남긴다). 242 b.p.단편을 분리시킨다.

3. (2) 및 (1c)의 생성물을 리게이션시키고 재차 자기중합을 방지하기 위해서 Pst I 및 Bgl II 로 절단한다. 제 7a도에서의 Sau 3a에서 Pst I 까지의 약 950b.p를 분리시킨다. 이 단편은 LeIF A 과 공통되지 않는 LeIF B 유전자 부분으로 구성된다.

4. LeIF A의 trp 프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합부위, ATG 출발 시그날 및 시스테인 코돈으로 구성되는 약 300b.p 단편(Hind III에서 Sau 3a까지)을 pLeIF 25로부터 분리시킨다.

5. Pst I 에서 Hind III까지의 약 3,600b.p 단편을 pBR322로부터 분리시킨다. 이는 레플리콘 및 코드화테트라사이클린으로 구성되나 암피실린 내성은 아니다.

6. 단계 3,4 및 5에서 수득된 단편을 3중 리게이션시키고 수득되는 플라스마드를 이. 콜리K-12균주 294로 형질 전환시킨다.

형질 전환체를 최소 선별하고(참조 : Birnboim et al.m Nucleic Acids Res.7, 1513-1512(1979)), 플라스미드 시료를 EcoRI로 소화시킨다. 소화물로부터 하기한 3개의 단편이 수득된다 :1)EcoRI-EcoRI trp 프로모터 단편 ; 2)pL4의 내부 EcoRI에서 EcoRI까지의 단편 ; 및 3) pL4의 단백질 번역 출발 시그날에서 EcoRI까지의 단편.

CPE 분석법에 따르면, 클론으로부터의 박테리아 추출물은 상기 대표적 분석법으로 A₅₅₀=1에서ι당 약 10×10⁶단위의 인터페론 활성을 기타냈다. 상기 방법에 의해 제조된 1개의 대표적 클론은 이. 콜리 294/pLeIF B trp 7이다.

L. 또 다른 성숙 백혈구 인터페론(LeIF C, D, F, H, I 및 J )의 직접 발현

기타의 LeIF 타입으로 구성되는 추가의 전장 유전자단편을 LeIF A의 경우에서와 같이 테일링시키고 발현 비히클중에 둘 수 있다. 통상적 방법에 의한 완전서열화로부터, 상기 H에서 사용된 방법에 의해 성숙 LeIF A를 발현할 수 있도록 제한부위가 성숙 인터페론의 첫째 아미노산 코돈에 충분히 가까이 있는지를 알 수 있고, 이는 즉, 제한 절단으로 전서열을 제거시키고 합성DNA 단편을 리게이션시켜 소실된 N-말단 아미노산 코돈으로 대치하는 것이다. 이와 달리 다음 방법을 사용할 수 있다. 즉, 성숙 폴리펩타이드의 첫째 아미노산 코돈이 시작하는 지점 직전에서 진서열-함유 단편을 다음과 같이 분해시킨다 :

1. 상기 지점 주위의 영역에서 이중 나선 DNA를 단일 나선DNA로 전환시키고 ;

2. 단계(a)에서 형성된 단일 나선영영에 단일나선 DNA의 상보성 프라이머를 하이브리드화시키고, 이때 프라이머의 5'말단을 반적한 분해 부위에 인접한 뉴클레오타이드와 반대편에 위치시키며 ;

3. 아데닌, 티민, 구아닌 및 사이토신-함유 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 존재하에 DNA 폴리머라제와 목응시켜 프라이머로부터 3'방향에 위치하는 단계 1에서 제거된 2번째 나선부분을 회복시키고 ;

4. 목적한 분해 지점 뒤쪽에 뻗어있는 잔류의 단일 나선 DNA를 소화시킨다.

코드화 나선의 3'말단에서 종료되는 단선의 합성 DNA는 번역 출발 시그날 ATG와, 예를들어 성숙 인터페론에 대하여 수득되는 테일링된 유전자에 평활 말단 리게이션시킴으로써 리게이션시킬 수 있고, 상기 유전자를 발현 플라스미드내에 삽입시키고 프로모터 및 관련 리보솜 결합부위 통제하에 둔다.

상기 K에서 사용된 방법과 유사한 방법에 따라, LeIF C 및 LeIF D를 코드화하는 유전자단편을 적절히 배열시켜 직접 박테리아 발현이 일어나도록 한다. 이들 추가의 백혈구 인터페론의 발현방법은 각 경우에 pLeIF A 25로부터 LeIF A trp 프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합부위. ATG 출발 시그날 및 시스테인 코돈으로 구성되는 약 300b.p. 단편(Hind III에서 Sau 3a까지)으로 재분류시키는 것이다. 여기에 모든 인터페론에 공통되는 개시 시스테인 뒤의 각 아미노산 서열을 코드화하는 추가의 인터페론 유전자로부터 수득된 유전자단편을 결합시킨다. 각기 수득되는 플라스미드를 사용하여 이. 콜리 K-12 균주 294를 형질전환시킨다.

각 유전자를 형성시키는 리게이션은 다음과 같이 수행된다.

LeIF C

pLeIF C로부터 하기 단편을 분리시킨다 ;

(a) Sau 3a에서 Sau 96까지의 35b.p.

(b) Sau 96에서 Pst I 까지의 >900b.p.

(c) 상기 K(4)에서와 같이 pLeIF A-25로부터 약 300b.p. 단편(Hind III-Sau 3a) 분리.

(d) 상기 K(S)의 약 3,600b.p 단편 분리.

제 조 :

(1)(a)와(c)를 리게이션시키다. Bg1 II, Hind III으로 분해하고 약 335b.p. 생성물을 분리시킨다.

(2) (1)+(b)+(d)로 3중 리게이션시키고 수득되는 플라스미드로 이. 콜리를 형질전환시킨다.

상기 방법으로 제조된 대표적 클론은 이. 콜리 K-12 균주 294/pLeIF C trp 35이다.

LeIF D

pLeIF D로부터의 분리물 :

(a) Sau 3a에서 Ava II 까지의 35b.p.

(b)Ava II 에서 Bgl II 까지의 150b.p.

(c)Bgl II 에서 Pst I 까지의 약 700b.p.

LeIF A 25로부터의 분리물 :

(d) Hind III 에서 Sau 3a까지의 300b.p.

pBR 322로부터의 분리물 :

(e)Hind III 에서 Pst I 까지의 약 3600b.p.

제 조 :

(1) (a)+(b)로 리게이션시키고, Bgl II로 절단시킨 후 185b.p.생성물(1)을 정제한다.

(2) (1)+(d)로 리게이션시키고 Hind III, Bgl II 로 절단하여 약 500b.p.생성물(2)를 정제한다.

(3) (2)+(c)+(e)로 리게이션시키고 수득되는 플라스미드로 이. 콜리를 형질전환시킨다.

상기 방법으로 제조된 대표적 클론은 이. 콜리 K-12 균주 294/ pLeIF D trp 11이다.

LeIF F

LeIF F-함유 단편은 직접 발현하도록 LeIF B 및 LeIF F의 아미노산 1 내지 13의 완전 상동으로 쉽게 이루어진 제조합을 통해서 테일링시킬 수 있다. 적절히 배열된 말단을 갖는 trp 프로모터-함유 단편(a)는, 상기한 pHGH 207로부터 Pst I 및 XbaI 소화시킨 후 약 1,050b.p. 단편을 분리시킴으로써 수득된다. 두 번째 단편(b)는 플라스미드 pHKY 10의 pst I및Bgl II 소화로 부터 수득되는 더 큰 단편으로서 수득한다. 단편(a)는 암피실린 내성을 코드화하는 유전자 약 반을 함유하고 ; 단편(b)는 상기 유전자의 나머지 및 관련 프로모터가 결여된 테트라시이클린 내성의 전체 유전자를 함유한다. 단편(a)및 (b)는T₄리가제로 결합시키고 생성물은 XbaI 및 BgI II로 처리하여 이합체화를 방지시켜, trp 프로모터- 오퍼레이터 및 테트라사이클린 및 암피실린 내성 유전자로 구성되는 단편(c)를 형성시킨다.

약 580b.p.의 단편(d)는pLeIF F의Ava II 및 Bgl II 소화로 수득한다. 이는 LeIF F의 아미노산 14내지 166의 코돈으로구성된다.

단편(e) (49b.p.)는 pLeIF B의 Xba I 및 Ava II 소화로 수득한다. 단편(e)는 LeIF F의 아미노산 1 내지 13을 코드화한다.

단편(c),(d)및 (e)를 T₄리가게 존재하에 3중 리게이션시킨다. 각 단편의 점성 말단은, 복합 플라스미드가 정확히 회전하여 trp 프로모터-오퍼레이터 조절하에 테트라시이클린 내성유전자를 성숙 LeIF F 유전자와 함께 도입되도록 하고 목적한 플라스미드로 형질 전환된 박테리아가 테트라시이클린 -함유 판상에서 선택될 수 있도록 한다. 상기 방법으로 제조된 대표적 클론은 이. 콜리 K-12 균주 294/pLeIF F trp 1이다.

LeIF H

성숙 백혈구 인터페론으로 발현시키기 위해서 완전 LeIF H 유전자를 다음과 같이 배열할 수 있다 :

1. 플라스미드 pLeIF H를 Hae II 및 Rsa I 소화시키고 시그날 펩타이드 아미노산 10에서 3'비코드화 영역까지의 816b.p. 단편을 분리시킨다.

2. 상기 단편을 변질시키고, 합성 데옥시리보올리고 뉴클레오타이드 프라이머 5'-dATG TGT AAT CTG TCT를 사용하여, DNA 폴리머라제 I의 클레나우단편으로 회복 합성한다.(참조 : Klenow et al.m Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 65, 168(1970)).

3. 수득되는 생성물을 Sau 3a로 분해시키고 아미노산 1 내지 150의 452b.p.단편을 분리시킨다.

4. pLeIF H의 Sau 3a 및 Pst I 소화와 수득되는500b.p. 단편의 분리로 코드화 서열의 말단을 통해서 아미노산 150을 코드화하는 유전자가 수득된다.

5. 단계(3)과 (4)에서 분리된 단편을 리게이션시켜 LeIF H의 166 아미노산을 코드화하는 하기 단편을 형성시킨다.

6. pLeIFA trp 25를 Xba I로 소화시키고 DNA 폴리머라제 I로 평활말단시킨 후 생성물을Pst I로 소화시킨다. 수득되는 큰 단편을 분리시키고 단계(5)의 생성물과 리게이션시켜, 이. 콜리 K-12균주 294 또는 기타의 숙주 박테리아의 형질전환시 성숙 LeIF H를 발현시킬 수 있는 발현 플라스미드를 형성시킬 수 있다.

LeIF I

하기 문헌에 의해서 구성된 인체 제놈의 파아지 λ샤론(Charon) 4A재조합군에서(참조Lawn et al., Cell 15, 1157(1978)) 하기 문헌에 기술된 방법에 의해서 백혈구 인터페론 유전자를 선별한다.(참조 : Lawn et al.,(상기 참조)및 Maniatis et al., Cell 15, 687(1978)). cDNA클론 LeIF A로부터 유도된 방사성 LeIF 프로우브를 사용하여 약 500,000 반점을 선별한다. 상기 선별로부터 6개의 LeIF 제놈 클론이 수득된다. 재선별 및 반점 정제를 수행하고 이들 클론중 한개인λHLeIF 2를 취해 이후 분석에 사용한다.

상기한 방법을 사용하여, 다른 프로우브를 인체 제놈으로부터 추가의 LeIF 클론을 분리시키는데 유리하게 사용할 수 있다. 이들도 또한 본 발명에 따른 추가의 백혈구 인터페론 단백질 제조에 이용될 수 있다.

1. 클론λLeIF 2의 2,000b.p EcoRI 단편을 pBR 325의 EcoRI부위에 서브클로닝시킨다. 수득되는 플라스미드 LeIF I을 EcoRI 로 분해시키고 2,000b.p 단편을 분리한다. 데옥시올리고뉴클레오타이드 dAATTC-TGCAG(EcoRI-Pst I 전환체)를 2,000 b.p. EcoR 단편에 리게이션시키고 수득되는 생성물을 Pst I로 분해하여 Pst I 말단을 함유하는2,000b.p.단편을 수득한다. 이를 Sau 96으로 분해하여 1개의 Pst I말단 및 1개의 Sau 96말단을 지닌 1,100b.p.단편을 분리시킨다.

2. 클라스미드 pLeIF C trp 35를 Pst I 및 XbaI 로 소화시킨다. 큰 단편을 분리시킨다.

3.pLeIF C trp 35에서 수득한 작은 XbaI-Pst I 단편을 Xba I및Sau 96으로 소화시킨다. 40b.p. Xba I-Sau 96 단편을 분리시킨다.

4. 단계(1),(2)및 (3)에서 분리시킨 단편을 리게이션시켜 발현 플라스미드 pLeIF I trp 1을 형성시킨다.

LEIF J

1. 플라스미드 pLeIF J는 LeIF J 유전자 서열을 포함하는 인체 제놈 DNA의 3.8 킬로베이스(kilobase)Hind III 단편을 함유한다. 이 플라스미드로부터 760b.p. Dde I-Psa I 단편을 분리시킨다.

2. 플라스미드 pLeIF B trp 7을 Hind III 및Dde I 로분해시키고 340b.p. Hind III-Dde I 단편을 분리시킨다.

3. 플라스미드 pBR 322 Pst I로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I(클레나우 단편)과 배양시켜 평활말단화 시킨후,Hind III으로 소화시킨다. 큰(~3,600b.p.) 단편을 분리시킨다.

4. 단계 (1),(2)및 (3)에서 분리된 단편들을 리게이션시켜 발현 플라스미드pLeIF Jtrp 1를 형성시킨다.

M. 정 제

박테리아 추출물중 백혈구 인터페론 함량은 다음과 같은 과정을 연속적으로 수행하여 보강할 수 있다 :

1. 폴리에틸렌-이민 침전, 이때 인터페론을 포함하는 세포상 단백질 대부분이 상등액에 남는다.

2. 황산 암모늄 분획화, 이때 인터페론은 55% 황산 함모늄 포활 용액에서 분획화된다.

3. 0.06M 인산칼륨, 10mM트리스-HCl, pH7.2중 상기 황산 암모늄 펠렛의 현탁액을 25mM 트리스-HCl, pH7.9에 투석시킨다.(인터페론 활성은 용액에 남는다).

4. 상기 상등액을 pH8.5로조절하고 DEAE-셀룰로즈 컬럼상에서 크로마토그라피한다(선형구배의 25mM트리스- HCl 중 0내지 0.2M NaCl(pH 8.5)로 용출).

5. 시바크롬 블루 -아가로즈(Cibachrome Blue-Agarose) 또는 하이드록실- 아파타이트상에 흡수시키고 각기 1.5M KCl 또는0.2M 포스포이트용액으로 용출시킨다.(임의로).

6. 세파덱스

G-75 칼럼상에서 분자크기에 따라 분류한다.

7.25mM 초산 암모늄(pH 5.0)중CM-셀룰로즈상에서 양이온 교환 크로마토그라피하고 초산 암모늄 구배(0.2M 까지의 초산 암모늄)로 전개시킨다.

상기 과정으로부터 순도95% 이상의 물질을 수득한다.

이 물질은 또한 크기 선별(Size exclusion) 크로마토그라피, 역상(RP-8) 고압 액체크로마토그라피 또는 고정화 항인터페론 항체상의 친화성 크로마토그라피로 정제할 수도 있다.

이와 달리, 상기 단계 4의 물질을 하기 문허에 기술된 방법으로 제조된 모노클로날 항체칼럼상에 넣고, 0.2M 아세트산, 0.1% 트리톤 및 0.15M NaCl로 용출시킬 수 있다(참조 : Milstein, Scientific American 243, 66(1980 )).

또한 바람직하게는 상기 과정에 의해 제조된 백혈구 인터페론을 다음 단계에 의해 정제한다 :

1. 상기 발현된 백혈구 인터페론을 함유하는 동결된 세포 펠렛을 손이나 적절한 분쇄장치로 분쇄한다. 부분적으로 녹은 세포를 pH7.5내지 8.0의 0.1M 트리스,10%(A/V) 슈크로즈, 0.2M NaCl, 5mM EDTA, 0.1mM PMSF 및 10 내지 100mM MgCl₂를 함유하는 4용량의 완충액 A에 현탁시킨다.

이 현탁액을 약 6,000psi에서 균질화기를 통과시킨 후, 1,000psi 미만에서 이차통과시킨다. 2회 통과에 의해 균질화기로부터의 유출물을 빙욕중에서 냉각시킨다.

2. 균질화물에 폴릴에틸렌-이민을 약 0.35% 농도로 서서히 첨가하고 약 30분간 방치한다. 원심분리 또는 여과에 의해 고체를 제거한다. 이 단계는 온도를 조절하여 수행하거나, 상등액(여액)의 온도가 10℃미만으로 유지될 수 있도록 충분히 신속하게 수행한다. 상등액(여액)은 한회여과하여 원래 용량의 약 1/10로 농축시킨다. 잔류액내의 입상물질이나 운무상 물질은 미세다공성 막과 같은 적절한 여과기로 제거한다.

3. 상기 정화된 용액을 모노클로날 항체 칼럼상에 5 내지 8cm/시간의 유속으로(즉, 2.6cm직경 칼럼에 25내지 40ml/시간)직접 넣는다. 이어서 이 컬럼을 NaCl(0.5M), 및 트리톤(Triton) X-100(0.2%)또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는 약 10 칼럼용량의 25mM 트리스- HCl(pH7.5 내지 8.5)로 세척한 후, 0.15M NaCl, 및 트리톤 X-100(0.1%)또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는 약 10칼럼 용량의 용액으로 세정한다. 이 칼럼을 트리톤X-100(0.1%)또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는0.2M 아세트산으로 용출시킨다. 모노클로날 항체 칼럼에서 수득된 단백질 피크(UV 흡광기 또기 기타 편리한 분석법으로 측정) 분획을 모으고 1N NaOH 또는 1.0M 트리스염기를 사용하여 pH를 약 4.5로 조정한다.

4. 합한 인터페론 피크분획을pH4.5 초산 암모늄(50mM)과 같은 적절한 완충액으로 평형화한, 와트만(Whatman)CM 52셀룰로즈 또는 등가물과 같은 양이온 교환기에 넣는다. 이어서 칼럼을 평형화 완충액으로, 유출물의 UV 흡광도가 더 피크를 나타내지 않을 때까지 세척하여 칼럼으로부터 소량의 나머지 단백질을 모두 용출시킨다. 이어서 이 칼럼을 25mM 초산 암모늄/0.12M 염화나트륨 또는 인터페론의 회수에 가장적합한 조성물로 용출시켜, 만족스러운 외양과 용해특성을 갖는 동결 건조된 케익을 수득한다.

상기 바람직한 실시양태에서 사용된 모노클로날 항체는 하기 문헌에 기술된 방법으로 제조할 수 있다(참조 : Staehelin et al., Proc. Natl. acad. Sci. U.S.A. 78, 1848-52(1981)). 모노클로날 항체는 다음과 같이 정제하고 에피겔(Affigel)-10에 공유결합시킨다:

복수(腹水)로부터의 모노클로날 항체 제조 및 정제

5마리의 암컷 밸브(Balb)/C 마우스에서 각기 5 내지 10×10⁶개의 중간 대수기 하이브리도마 세포를 접종한다. 복수증이 있는 마우스로부터 수득한 생육성 세포 5×10⁶를 10마리 이상의 마우스에게 복강내 접종한다. 각 마우스로부터 복수를 반복(2 내지 4회) 채취한다. 이러한 전이 및 채취과정을 마우스 한 군에서 다른 군으로 연속적으로 3회 수행할 수 있다 각 전이시에 채취한 복수를 모은다.

이 복수를 15분간 저속 원심분리시켜(500내지 1000×g) 세포 및 오물을 제거한다. 이어서 18,000rpm으로 90분간 원심분리시킨다. 상등액은 동결시켜-20℃에서 보관한다. 이것을 녹인 후, 35,000rpm으로 90분간 원심분리시켜 기타 섬유소 및 입상물질를 제거한다. 각 전이시에 채취한 복수의 배치를 고체상 항체-결합분석법(참조 : Staehelin et al., 상기 참조)에 의해 특이적 항체 활성도를 측정하고 결과가 만족스러우면 이를 모은다.

모은 용액중의 단백질 농도는 근사치로서, 1mg의 단백질이 통과 길이 1.0cm의 흡수관(cuvette)에서, 280nm에서 1.2의 흡수도를 나타내는 것으로 평가된다. 고농도의 항체를 함유한 복수는 ml당 30내지 85mg의 단백질을 함유한다. 이것은 ml 당 4 내지 7mg의 특이적 항체를 함유하는 것과 같다. 이 복수를 PBS(0.01M인산나트륨, pH7.3, 0.15M NaCl)로 희석시켜 단백질농도를 10 재지 12 mg/ml로 만든다.

희석용액 각 100ml에 90ml의 실온 황산암모뉴 포화용액을 -0℃에서 진탕시키면서 서서히 첨가한다. 이 현탁핵을 얼음중에서 40 내지 60분간 보관한 후, 10,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리시킨다. 상등액을 경사시키고 잘 배수 시킨다. 이 단백질 펠렛을 0.02M의 트리스. HCl(pH7.9)/0.04M의 NaCl(완충액 I)에 용해시킨다. 이 단백질 용액을 실온에서 100용량의 완충액 I 에 대하여 16내지 18시간동안, 완충액을 적어도 1회 교환하여 투석시킨다. 이 투석된 용액을 15,000rpm에서 10분간 원심분리시켜 미용해물질을 제거한다. 복수중의 원래 총 단백질 분량의 30 내지 35%를 회수하고 이는 280nm에서 흡수를 나타낸다.

1ml 당 30 내지 40mg의 단백질을 함유하는 용액을 , 완충액 I로 평형화시킨 DEAE-셀룰로즈 칼럼에 넣는다. 이 단백직 g당 적어도100ml의 칼럼상(bed)용량을 사용한다. 0.02M 트리스 HCl(pH7.9)및 0.04M 내지 0.5M NaCl을 함유하는 선형 NaCl구배를 사용하여 컬럼으로부터 항체를 용출시킨다. 0.06M 내지 0.1M NaCl로 용출시켜 모은 피크 분획을 동용량의 실온 포화 황산암모늄으로 침전시켜 농축시키고 원심분리한다. 이 단백질 펠렛을 0.2M NaHCO₃(pH 약8.0)/0.3M NaCl(완충액 II)에 용해시킨 후, 실온에서 동일한 완충액을 3회 교환하며 투석한다. 투석된 용액을 15분간 20,000×g으로 원심분리하여 불용성 물질을 제거한다. 완충액 II로 단백질 농도를 20 내지 251mg/ml로 조절한다.

면역흡착제의 제조

에피겔-10(BioRad Laboratories, Richmond California)를 소결 유리 필터상에서 빙냉 이소프로판올로 3회 세척한 후 빙쟁 증류수로 3회 세척한다. 이 겔상슬러리(냉수중 약 50%)를 플라스틱 튜브에 옮기고 잠시 원심분리시켜 침전시킨다. 상등액을 흡인시킨다. 충진 겔을 동용량의 정제된항체 용액과 혼합시키고 4℃에서 5시간동안 회전시킨다. 반응시킨 후에 겔을 원심분리하고 완충액 III(0.1M NaCO₃/0.15M NaCl)으로 2회세척하여 커플링되지 않은 항체를 제거한다. 합한 세척물을 단백질 측정하면 90% 이상의 항체가 겔에 커플링되었음을 알 수 있다.

미반응부위를 차단하기 위해서, 상기 겔을 동용량의 0.1M 에탄올아민 HCl(pH8)과 혼합시키고 실온에서 60분간 회전신킨다. 이 겔 슬러리를 PBS로 세척하여 반응물을 제거하고 0.02%(W/V)의 나트륨아지드 존재하에 4℃에서 PBS중에서 보관한다.

N. 비경구 투여

LeIF는 항종양 또는6항바이러스 치료가 요구되는 환자 및 면역억제 상태를 나타내는 환자에게 비경구투여할 수 있다. 투여용량 및 속도는 인체유도물질의 임상연구에서 통상 사용하는 용량, 예를 들어 1일 약(1 내지 10)×10⁶단위이고, 순도가 1% 이상인 물질의 경우 1일 약5×10⁷단위까지이다.

거의 균질한 박테리아 LeIF의 비경구투여 형태로서 적절한 투여형태의 한 예로서, 특이적 활성도의 3mg LeIF,즉2×10⁸단위/mg을 25ml의 5N 인체 혈청 알부민에 용해시키고 이 용액을 박테리아 여과기를 통과시키고 여과된 용액을 무균상태에서 100개의 바이알에 나누어 담아, 각 바이알에 비경구투여에 적절한 6×10⁶단위의 순수 인터페론이 함유되도록 한 것이다. 이 바이알은 사용전에 냉소(-20℃)에 보관하는 것이 좋다.

본 발명은 화합물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지 방법에 의해, 상기 폴리펩타이드를 약제학적으로 무독한 담체 비히클과 혼합하여 제형화할 수 있다. 적절한 비히클 및 그 제제는 본문에 참조로 들어있는 하기 문헌에 기술되어 왔다(참조 :Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin). 상기 조성물은, 숙주에의 효과적 투여에 적절한 약제학적으로 무독한 조성물을 제조하기 위해서, 본 발명의 인터페론 단백질 유효량과 적절한 분량의 비히클을 함유할 것이다. 바람직한 투여경로는 비경구투여이다.

Claims

어떤 전서열도 수반하지 않는 성숙 인체 백혈구 인터페론의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 복제성 대장균 발현비히클에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 성장시켜 상기 폴리펩타이드를 발현시킨 후, 상기 폴리펩타이드를 회수함을 특징으로 하여, 어떤 전서열도 수반하기 않는 성숙 인체 백혈구 인터페론의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.