FI82713C - Plasmid, som foermaor expressera humant moget leukocytinterferon, foerfarande foer dess framstaellning samt dess anvaendning vid framstaellning av humant leukocytinterferon. - Google Patents

Description

1 82713

Plasmidi, joka pystyy ekspressoimaan ihmisen kypsän valko-soluinterferonin, menetelmä sen valmistamiseksi sekä sen käyttö interferonin valmistamiseen 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 812067

Keksintö on yhdistelmä-DNA-tekniikan alalta, ts. sen kohteena on plasmidi, joka pystyy ekspressoimaan ihmisen kypsän valkosoluinterferonin mainitulla plasmidilla 10 transformoidussa E. colissa.

Keksinnön mukaiselle plasmidille on tunnusomaista, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia, joka on ihmisen valkosoluinter-feroni (LelF) A, B, C, D, F, H, I tai J, jolla on amino-15 happosekvenssi

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn

Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Vai Leu His Glu Met Ile 20 Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin

Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Vai Ile Gin Gly Vai Gly Vai

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg

Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr 25 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu,

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

Ile Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu 30 Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met

Ile Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala

Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp

Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Vai Leu Cys Asp Gin Glu Vai Gly 35 vai Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys

Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg

Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gin Lys Arg Leu Lys Ser Lys

Glu, 2 82713

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Gly Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg His Asp Phe Arg lie Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly

Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala

Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr

Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val

Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu lie Glu Arg Lys

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg

Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys

Asp,

Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu

Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly

Asn Gin Phe Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala

Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr

Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg

Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val

Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg

Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys

Glu,

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly

Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala

Thr Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn

Gin Gin Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val

Lys Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys

II

3 82713

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Val Arg Ala Givi He Met Arg

Ser Phe Ser Leu Ser Lys He Phe Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys

Glu,

Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu

Met Leu Met Ala Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly

Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala He Ser Val Leu His Glu Met

Met Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala

Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe Tyr He Glu Leu Phe

Gin Gin Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val He Gin Glu Val Gly

Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser He Leu Ala Val

Arg Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg

Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys

Asp,

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

He Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Pro Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly

Asn Gin Phe Gin Lys Thr Gin Ala He Ser Val Leu His Glu Met

He Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala

Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr

Gin Gin Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cys Val He Gin Glu Val Gly

Met Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser He Leu Ala Val

Arg Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys

Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg

Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys He Leu Arg Arg Lys

Asp, tai vastaavasti

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu

He Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly

His Gin Phe Gin Lys Thr Gin Ala He Ser Val Leu His Glu Met

He Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala 4 82713

Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr

Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Vai Ile Gin Glu Vai Gly

Vai Lys Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Vai

Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys 5 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg

Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys Gly Leu Arg Arg Lys

Asp, 10 ja joka DNA-sekvenssi on toiminnallisesti liittynyt promoottori -operaattorialueeseen, joka pystyy aikaansaamaan mainitun interferonin mikrobisen ekspression E. coli-so-luissa.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä plasmidin val-15 Kiistämiseksi sekä sen käyttö ihmisen valkosoluinterferonin valmistamiseen transformoitujen E. coli-solujen avulla.

Plasmidin valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan DNA-sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä ihmisen kypsää valkosoluinterfe-20 ronia, ja liitetään tämä toiminnallisesti promoottori-operaattori -alueeseen, joka pystyy aikaansaamaan mainitun interferonin mikrobisen ekspression E. coli-soluissa.

Ihmisen valkosoluinterferonin (LelF) keksivät ja valmistuvat ensimmäisinä hyvin raakojen sakkojen muodossa 25 Isaacs ja Lindemann [Proc. R. Soc. B 147, ss. 258 - 267 (1957); US-patentti 3 699 222]. Yritykset tämän aineen puhdistamiseksi ja luonnehtimiseksi ovat olleet käynnissä siitä lähtien ja ovat johtaneet suhteellisen homogeenisten valkosoluinterferonien valmistukseen, jotka ovat peräisin 30 normaaleista tai leukemiaa sairastavien luovuttajien valkosoluista (DE-hakemusjulkaisu 2 947 134). Nämä interfe- 5 82713 ronlt kuuluvat proteiinien ryhmään, jonka tiedetään omaavan kyvyn antaa kohdesoluille virusta vastustava tila. Lisäksi interferoni voi toimia solun lisääntymistä estävästi ja immuunivastetta muuttavasti. Nämä ominaisuudet 5 ovat jouduttaneet valkosoluinterferonin kliinistä käyttöä terapeuttisena aineena virusinfektioiden ja pahanlaatuisuuksien hoidossa.

Valkosolulnterferoneja on puhdistettu pääasiallisesti homogeenisiksi [Rubinstein et ai., Proc. Natl. Acad. 10 Sei. USA 76, ss. 640 - 644 (1979); ja Zoon et ai., sama, 76, ss. 5601 - 5605 (1979)], ja ilmoitetut molekyylipainot ovat väliltä n. 17 500 - n. 21 000. Näiden valmisteiden ominaisaktiivisuus on merkittävän suuri, 2 x 10® - 1 x 109 yksikköä/mg proteiinia, mutta saannot soluviljelmistä ovat 15 olleet masentavan pieniä. Siitä huomimatta edistysaskeleet proteiinin sekvessointimenetelmissä ovat tehneet mahdolliseksi osittaisten aminohapposekvenssien määrittämisen [Zoon et ai., Science 207, s. 527 (1980); ja Levy et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, ss. 5102 - 5104 (1980)].

20 Eri valkosoluinterferonien glykosyloinnin tulkinta ei vielä tähän mennessä ole täydellistä, mutta nyt on selvää, että erot glykosyloinnissa ryhmän jäsenten joukossa eivät yksinään ole vastuussa havaittujen molekyylipainojen kir-' ! josta. Sen sijaan valkosoluinterferonit poikkeavat merkit- 25 tävästi aminohappokoostumuksessa ja -sekvenssissä, ja aml-nohappohomologia on joissakin tapauksissa pienempi kuin 80 %.

Samalla kun eristäminen luovuttajien valkosoluista on antanut riittävästi materiaalia homogeenisen valkosolu-30 interferonin osittaista luonnehdintaa ja rajoitettuja kliinisiä tutkimuksia varten, se on täysin riittämätön .I.‘ lähde interferonimääriä varten, joita tarvitaan suurimit- takaavaisiin kliinisiin kokeisiin ja suurimittakaavaista » · 6 82713 ennalta suojaavaa ja/tai terapeuttista käyttöä varten sen jälkeen. Nykyiset kliiniset tutkimukset, joissa käytetään Ihmisen valkosoluista peräisin olevia Interferoneja kasvainten vastaisissa ja virusten vastaisissa kokeissa, ovat 5 pääasiassa rajoittuneet raakoihin (puhtaudeltaan alle 1 %) aineen valmisteisiin, ja pitkät viivytykset riittävien määrien valmistamiseksi jopa epärealistisilla hintatasoilla, ovat ratkaisevasti viivyttäneet tutkimuksia laajalla rintamalla.

10 Yhdistelmä-DNA-teknologian tulon myötä on suunnat toman joukon hyödyllisiä polypeptidejä mikrobinen tuotanto kuitenkin tullut mahdolliseksi. Jo nyt on saatu tällä teknologialla modifioituja bakteereja tekemään mahdolliseksi sellaisten polypeptidituotteiden valmistus kuin somatosta-15 tiini, ihmisen insuliinin A- ja B-ketjut ja ihmisen kasvuhormoni [Itakura et ai., Science 198, ss. 1056 - 1063 (1977); ja Goeddel et ai., Nature 281, ss. 544 - 548 (1979)]. Äskettäin yhdistelmä-DNA-menetelmiä on käytetty saamaan aikaan proinsuliinin ja tymosiini-a-l:n bakteeri-20 tuotanto, ja useat tutkijat ovat ilmoittaneet DNA;n, joka koodaa ihmisen valkosoluinterferonia, sekä syntyneiden proteiinien, joilla on valkosoluinterferoni-aktiivisuus, saannista [Nagata et ai, Nature 284, ss. 316 - 320 (1980); Mantei et ai., Gene 10, ss. 1 - 10 (1980) ja Taniguchiet 25 ai., Nature 285, ss. 547 - 549 (1980)].

Yhdistelmä-DNA-teknologian työhevonen on plasmidi, kaksisäikeisen DNA:n ei-kromosomaalinen rengas, joka löytyy bakteereista ja muista mikrobeista, usein moninkertaisina kopioina solua kohti. Plasmidi-DNA:hän koodattuun in-30 formaatioon on sisällytetty se informaatio, joka tarvitaan jäljentämään plasmidi tytärsoluihin (ts. "repliko-ni"), ja tavallisesti yksi tai useampi valintatunnusmerk-ki, kuten bakteerien tapauksessa resistenssi antibiooteille, jotka sallivat isäntäsolun, joka sisältää kiinnostuk-35 sen kohteena olevan plasmidin, kloonien tunnistamisen ja viljelyn etuoikeutetusti selektiivisillä alustoilla. Plas-

II

7 82713 midien hyödyllisyys on siinä, että ne voidaan spesifisesti pilkkoa yhdellä tai useammalla rekstriktioendonukleaasilla eli "restriktioentsyymillä", joista jokainen tunnistaa eri kohdan plasmidi-DNA:lla. Sen jälkeen heterologisia geenejä 5 tai geeni fragmentteja voidaan kytkeä plasmidiin liittämällä päittäin pilkontakohdassa tai uudelleenrakennetuissa päissä pilkontakohdan vieressä; DNA:n uudelleenyhdistämi-nen suoritetaan solun ulkopuolella, mutta syntynyt "yhdistelmä” (rekombinantti)-plasmidi voidaan tuoda soluun pro-10 sessilla, joka tunnetaan transformaationa, ja suuria määriä heterologista geenejä sisältävää yhdistelmäplasmidia saadaan viljelemällä transformanttia. Lisäksi, kun geeni on oikein kytketty plasmidin osiin nähden, jotka hallitsevat koodatun DNA-viestin transkriptiota ja translaatiota, 15 voidaan syntynyttä ekspressointivektoria käyttää varsinaisesti tuottamaan polypeptidisekvenssiä, jota kytketty geeni koodaa; prosessi, jota nimitetään ekspressioksi.

Ekspressio aloitetaan alueella, joka tunnetaan promoottorina, jonka RNA-polymeraasi tunnistaa ja sitoo.

20 Joissakin tapauksissa, kuten tryptofaani- eli "trp"-pro-moottorissa "operaattori"-alueet limittävät promoottorialueita yhdistetyn promoottori-operaattorin muodostamiseksi. Operaattorit ovat DNA-sekvenssejä, jotka ns., repres-soriproteiinit, joiden tehtävänä on säätää transkription 25 aloitussekvenssiä tietyssä promoottorissa, tunnistavat. Polymeraasi kulkee pitkin DNA:ta transkriboiden informaatiota, joka sisältyy koodaussäikeeseen sen 5'-päästä 3’-päähän, lähetti-RNA:ksi, joka vuorostaan translatoidaan polypeptidiksi, jolla on aminohapposekvenssi, jota DNA 30 koodaa. Jokaista aminohappoa koodaa nukleotidikolmikko eli "kodoni”, joka on ns. "rakennegeenin" (joksi sitä tässä nimitetään) sisällä, ts. sen osan, joka koodaa ekspres-soidun tuotteen aminohapposekvenssiä. Promoottoriin sitomisen jälkeen RNA-polymeraasi transkriboi ensin nukleoti-35 dejä, jotka koodaavat ribosomin sitoutumiskohdan, sitten translaation aloituksen eli "aloitus"-signaalin (tavaili- 8 82713 sesti ATG, josta syntyneessä lähetti-RNA:ssa tulee AUG), sitten nukleotidikodonit itse rakennegeenissä. Ns. lope-tuskodonit transkriboidaan rakennegeenin päässä, minkä jälkeen polymeraasi muodostaa lähetti-RNA:n lisäsekvens-5 sin, joka johtuen lopetussignaalin läsnäolosta, jää ribo-someilta transloimatta. Ribosomit sitoutuvat lähetti-RNA:lie järjestetyyn sitoutumiskohtaan, bakteereissa tavallisesti kun mRNA muodostuu, ja muodostavat itse koodatun polypeptidin, joka alkaa translaation aloitussignaa-10 lista ja päättyy edellä mainittuun lopetussignaaliin. Haluttu tuote syntyy, jos sekvenssit, jotka koodaavat ribo-somin sitoutumiskohtaa, ovat sijoittuneet oikein AUG-aloi-tuskodonin suhteen ja jos kaikki muut kodonit seuraavat aloituskodonia järjestyksessä. Syntyvä tuote saadaan ha-15 jottamalla isäntäsolu ja ottamalla tuote talteen sopivasti puhdistamalla muusta bakteeriproteiinista.

On havaittu, että yhdistelmä-DNA-teknologian käyttö (ts. interferonigeenien kytkeminen mikrobisiin ekspressio-vektoreihin ja niiden ekspressointi mikrobisen geenin sää-20 telyelementtien valvonnassa) olisi tehokkain tapa valmistaa suuria määriä valkosoluinterferonia, jota huolimatta siitä, että näin valmistetusta aineesta puuttuu ihmisestä johdetun aineen glykosylointiominaisuus, voitaisiin käyttää kliinisesti hoidettaessa virus- ja kasvainsairauksia 25 laajalla alueella.

Yritys saada ensimmäinen valkosoluinterferonigeeni tämän keksinnön mukaisesti, käsittää seuraavat vaiheet: 1) Homogeenisyyteen puhdistetun ihmisen valkosolu-interferonin osittaisia aminohapposekvenssejä käytettiin 30 DNA-koetinsarjojen rakenteluun, joiden kodonit aggregaatissa edustivat kaikkia mahdollisia nukleotidiyhdistel-miä, jotka pystyvät koodaamaan näitä osittaisia aminohap-posekvenssej ä.

2) Valmistettiin bakteeripesäkepankkeja, jotka si- 35 sälsivät komplementaarista DNA:ta (cDNA) indusoidusta lä- hetti-RNA:sta. Muita indusoituja mRNA:itä, jotka olivat li 9 82713 radiomerkattuj a, hybridisoitiin tästä pankista peräisin olevan plasmidi-cDNA:n kanssa. Hybridisoitu mRNA eluoi-tiin ja translaatio interferoniksi testattiin varhaismuna-solukokeessa. Pesäkkeestä saatua plasmidi-DNA:ta, jonka 5 osoitettiin aiheuttavan interferoni-aktiivisuutta tällä tavalla, on edelleen testattu hybridisoinnin suhteen koet-timiin, jotka on tehty kuten edellä kohdassa a) kuvattiin.

3) Rinnakkain kohdassa 2) esitetyn yrityksen kanssa, indusoitua mRNA:sta johdettua cDNA:ta plasmidelssa 10 käytettiin muodostamaan transformanttipestäkkeiden itse näinen pankki. Kohdan 1) koettimia käytettiin panemaan alulle radiomerkatun yksisäikeisen cDNA: n synteesi käytettäväksi hybridisointikoettimina. Synteettiset koettimet hybridisoituivat indusoitu mRNA mallina, ja niitä piden-15 nettiin käänteistransktriptiolla muodostamaan indusoitu, radiomerkattu cDNA. Pesäkepankista saatuja klooneja, jotka hybridisoituivat tällä tavalla saatuun radiomerkattuun cDNA:hän, on tutkittu edelleen täysipituisen interferonia koodaavan geenin läsnäolon vahvistamiseksi. Mitä tahansa 20 pituudeltaan osittaista otaksuttua geenifragmenttia, joka on saatu kohdissa 1) tai 2), voidaan sinänsä käyttää koettimena täysipituiselle geenille.

4) Edellä saatu täysipituinen geeni pyöristettiin käyttäen synteettistä DNA:ta jokaisen johtajasekvenssiin 25 poistamiseksi, joka saattaisi estää kypsän polypeptidin mikrobisen ekspression, ja sopivan sijoittumisen sallimiseksi ekspressiovektorissa mikrobipromoottorin aloitussig-naalien ribosomin sitoutumiskohdan suhteen. Ekspressoitu interferoni puhdistettiin pisteeseen, joka teki mahdolli-30 seksi sen luonteen vahvistamisen ja sen aktiivisuuden mää rittämisen.

5) Edellä kuvatulla tavalla valmistettua inter f eroni ^-geenifragmenttia sinänsä käytettiin testattaessa hybri-disoimalla muita osoittain homologisia valkosoluinterfero- 35 nilajeja.

10 8271 3 Käytettäessä edellä hahmoteltuja yhdistelmä-DNA-teknologian menetelmiä, päästiin homologisten valkosoluin-terferonien (glykosyloimattomien) ryhmän mikrobiseen tuotantoon suurella saannolla ja puhtaudella kypsinä poly-5 peptideinä, pääasiallisesti ilman vastaavaa esisekvenssiä tai mitään sen osaa. Näitä interferoneja voidaan suoraan ekspressoida, ottaa talteen ja puhdistaa tasoille, jotka tekevät ne sopiviksi käytettäviksi eläinten ja ihmisten virus- ja pahanlaatuisuussairauksien hoidossa. Tähän men-10 nessä ekspressoidut ryhmän jäsenet ovat osoittautuneet tehokkaiksi in vitro-kokeissa, ja ensimmäisessä sen laa-tuisessa tällaisessa demonstroinnissa myös in vivo-kokeis-sa, jolloin jälkimmäisessä ensimmäisen kypsän valkosoluin-terferonin piti olla mikrobisesti tuotettu.

15 Tämän hakemuksen yhteydessä käytetty ilmaisu "kypsä valkosoluinterferoni" määrittelee mikrobisesti (esim. bak-teerisesti) tuotetun interferonimolekyylin, josta glykos-yyliryhmät puuttuvat. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettu kypsä valkosoluinterferoni ekspressoidaan välittö-20 mästi translaation aloitussignaalista (ATG) juuri ennen luonnon tuotteen ensimmäistä aminohappokodonia. "Kypsä" polypeptidi sisältää siten ensimmäisenä aminohappona sekvenssissään metioniinin (jota ATG koodaa) ilman olennaista muutosta luonteessaan. Toisaalta mikrobi-isäntä saattaa 25 käsitellä translaatiotuotetta jättämään alku-metioniinin pois. Kypsää valkosoluinterferonia voitaisiin ekspressoida yhdessä konjugoidun proteiinin, muun kuin tavanomaisen johtajan kanssa, jolloin konjugaatti on spesifisesti pilkottavissa solun sisä- tai ulkopuolisessa ympäristössä 30 (ks. GB-patenttijulkaisu 2 0076 676 A). Lopuksi kypsä interferoni voitaisiin valmistaa yhdessä mikrobisen "signaali "-peptidin kanssa, joka kuljettaa konjugaatin solusei-nän, jossa signaali käsitellään, pois ja kypsä polypeptidi erittyy. Kypsän valkosoluinterferonin "ekspressointi" mer-35 kitsee interferonimolekyylin, joka ei sisällä glykosyyli-ryhmiä tai esisekvenssiä, joka välittömästi seuraa ihmisen

II

11 8271 3 valkosoluinterferoni-genomin mRNA-translaatiota, bakteerista tai muuta mikrobista tuotantoa.

Tässä esitetyt tietyt valkosoluinterferonl-proteii-nit on määritelty analysoidun DNA-geenin avulla (kuvat 3 5 ja 8) sekä deduktiivisen aminohapposekvenssoinnin avulla (kuvat 4 ja 9). On ymmärrettävä, että näille tietyille interferoneille ja kalkille tähän kuuluvien valkosoluin-terferoni-proteiinien ryhmästä, on olemassa luonnollisia vastingeenimuutoksia ja niitä tapahtuu yksilöstä toiseen. 10 Nämä muutokset voidaan osoittaa aminohappoerolla (-eroilla) kokonaissekvenssissä tai jonkun (joidenkin) aminohapon (aminohappojen) poisjätölllä, substltuoinneilla, inser-tloilla, inversioilla tai lisäyksillä ko. sekvenssissä.

Piirroksista kuva 1 esittää 2 aminohapposekvenssiä, 15 jotka olivat yhteisiä kaikille inter£eronilajeille, jotka on eristetty ihmisen valkosolusta ja puhdistettu homogeenisyyteen ja merkitty T-l:llä ja T-13:lla. Kaikki potentiaaliset mRNA-sekvenssit, jotka koodaavat näitä peptidejä, on esitetty samoin kuin vastaavat DNA-sekvenssit. Kirjal-20 met A, T, 6, C ja U merkitsevät, vastaavasti, nukleotidejä, jotka sisältävät emäkset: adeniinl, tyrniini, guaniini, sytosiini ja urasiili. Kirjain N tarkoittaa jotakin nukleotideistä A, G, C ja U. Polynukleotidit on esitetty luettaviksi suuntaan 5’:sta (vasemmalta) 3':een (oikeal-25 le), ja kun kuvataan kaksisäikeistä ("d.s.") DNA:ta, päinvastoin pohjaa eli ei-koodaavaa säiettä varten.

Kuva 2 on autoradiogrammi, joka esittää potentiaalisten LelF-plasmidien hybridisointia 32p-merkattujen synteettisten deoksioligonukleotldlen kanssa.

30 Kuva 3 esittää nukleotidisekvenssejä (koodaussäi- keltä) 8:sta fragmentista, jotka on eristetty ehdokkaiksi käytettäviksi valkosoluinterferonien ekspressiossa ja jotka on vastaavasti merkattu "A" - "H":11a. ATG-translaatio-aloituskodoni ja terminaatiokolmikko jokaiselle LeIF:lle 35 on alleviivattu. Lopetuskodoneja eli terminaatiokolmikkoja seuraa 3'-translatoimattomat alueet. Mukaan sisällytetystä 12 8271 3 täysipituisesta geenistä LelF A: lie puuttuu yksi kodoni, joka löytyy muista kuvatuista, kuten on osoitettu kuvan 3 kolmannella A-rivillä. 5’-translatoimattomat alueet edeltävät johtosekvenssejä. Eristettynä fragmentista E puuttuu 5 johtajan täysi esisekvenssi, mutta se sisältää koko geenin otaksuttua kypsää LelF Että varten. Fragmentista G, sellaisena kuin se on eristetty, puuttuu täysi koodaussek-venssi.

Kuva 4 on näiden 8 LelF-proteiinisekvenssin, jotka 10 on ennustettu nukleotidisekvensseistä, vertailu. Käytetään yhden kirjaimen lyhennyksiä, joita nimistökomissio IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature suosittelee: A - alaniini; C = kysteiini; D « asparagiinihappo; E -glutamlinihappo; F - fenyylialaniini; G - glysiini; H -15 histidiini; I - isoleusiini; K « lysiini; L » leusiini; M = metioniini; N = asparagiini; P ® proliini; Q glutamii-ni; R arginiini; S seriini; T = treoniini; V ® väliini; W - tryptofaani; ja Y - tyrosiini. Numerot viittaavat aminohappoasemiin; S tarkoittaa signaalipeptidiä. Viiva 20 165 aminohapon LelF A-sekvenssissä asemassa 44 on esitetty

LelF A-sekvenssin asettamiseksi suoraan riviin muiden LelF:ien 166 aminohapposekvenssin kanssa. LelF E-sekvens-si määritettiin jättämällä ottamatta huomioon ylimääräinen nukleotidi (kuvan 3 asema 187) sen koodausalueella. Tähdet 25 osoittavat faasinsisäisiä lopetuskodoneja. Aminohapot, jotka ovat yhteisiä kaikille LelF:lie (lukuunottamatta pseudogeenistä LelF E:tä) on myös esitetty. Alleviivatut tähteet ovat aminohappoja, joita on läsnä myös ihmisen fibroplasti-interferonissa.

30 Kuva 5 esittää LelF-kloonattujen cDNA:iden näiden 8 tyypin (A - H) restriktioendonukleaasikarttoja. Hybridi-plasmidit rakennettiin dC:dG-hännänmuodostusmenetelmällä [Goeddel et ai., Nature 287, ss. 411 - 416 (1980)]. Siten cDNA-insertiojaksot voidaan pilkkoa käyttäen Pstl:tä. Vii-35 vat jokaisen cDNA-insertiojakson päässä edustavat hapsot- 13 8271 3 tavia homopolymeerisiä dC:dC-häntiä. PvuII:n, EcoRI:n ja BglII:n pilkontakohtien asemat on osoitettu.

Kuvan varjostetut alueet edustavat kypsien LeIF:ien koodausseklvenssejä; ristiviivoitetut alueet esittävät 5 signaallpeptIdien koodaussekvenssejä, ja avoimet alueet osoittavat 3'- ja 5’-ei-koodaavia sekvenssejä.

Kuva 6 esittää kaavamaisesti geenin, joka koodaa kypsän LelF A:n suoraa mikrobisynteesiä, rakennetta. Pil-kontakohdat ja tähteet ovat esityksen mukaiset ("PstI", 10 jne.) Termi ”b.p.M merkitsee emäsparia.

Kuva 7 (ei mittakaavassa) esittää kaavamaisesti 2 geenifragmentin, joita käytetään ekspressoitaessa kypsää valkosoluinterferonia LelF B, pilkontakarttaa. Osoitetut kodonisekvenssit ovat koodaussäie-terminaatioita, joita 15 syntyy uutosta restriktioentsyymillä Sau3a näissä 2:ssa esitetyssä tapauksessa.

Kuvat 8 ja 9 esittävät DNA-ja aminohappo- (ks. kuva 4 edellä, vastaavat 1 kirjaimen lyhenteet) sekvenssejä 5:lie LelF-proteiinille, tyypit I ja J mukaan lukien. Ku-20 vassa 9 tähti osoittaa lopetuskodonia vastaavassa DNA-sek-venssissä yhdysviiva poisjääntiä tai aukkoa sekvenssissä.

A. Käytetyt mikro-organismit

Selostetussa työssä käytettiin 2 mikro-organismia: E. coli x 1776, kuten US-patenttijulkaisussa 4 190 495,on 25 kuvattu, ja E. coli K-12-kantaa 294 (pääte A, thi", hsr*. hsm/), kuten on selostettu GB-patenttijulkaisussa 2 066 382 A. Kumpikin on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC talletusnumerot 31537 ja 31446, vastaavasti). Kaikki yhdistelmä-DNA-työ suoritet-30 tiin National Institutes of Health'in käytettäviksi sopivien suuntaviivojen mukaisesti.

Keksintöä selostetaan sen edullisimpien suoritusmuotojen muodossa käyttäen E. colla, joka ei käsitä ainoastaan kantoja E. coli x 1776 ja E. coli K-12-kantaa ____ 35 294, jotka edellä määriteltiin, vaan myös multa tunnettuja E. coli-kantoja, kuten E. coli B, tai muita mikrobikanto- i4 8271 3 ja, joista monia on talletettu ja on saatavissa tunnetuista mikro-organismien talletuslaitoksista, kuten kokoelmasta American Type Culture Collection (ks. myös DE-hakemus-julkalsu 2 644 432).

5 B. LelF-mRNA:n lähde ja puhdistus

LeIF-mRNA:ta saadaan ihmisen valkosoluista, tavallisesti potilaiden, joilla on krooninen ydinsyntyinen leukemia, valkosoluista, joita on indusoitu tuottamaan interferonia Sendai- tai Newcastle'n taudin viruksella, kuten 10 on selostettu esim. DE-hakemusjulkaisussa 2 947 134. Eräs erityisen edullinen lähde ja lähde, jota on käytetty tässä esitetyssä työssä, on KG-l:llä merkitty solulinja, joka on peräisin potilaalta, jolla on akuutti ydinsyntyinen leukemia. Tämä solulinja, jotka ovat kuvanneet H. P. Koeffler 15 ja D. W. Golde [Science 200, s. 1153 (1978)], kasvaa helposti viljelyalustassa, joka sisältää RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 sekä 10 % FCS (vasikkasikiön seerumia), joka on inaktivoitu kuumentamalla, 25 mM HEPES-puskuria (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisul-20 fonihappoa) ja 50 pg/ml gentamisiiniä, ja lohkaistaan 1 -3 jatkoviljelyksi kahdesti viikossa. Soluja voidaan pakastaa edellä esitetystä kasvualustasta ja 10 %:sta dime-tyylisulfoksidia. KG-1 on talletettu kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC talletusnumero CRL 8031), 25 KG-1-solu ja indusoitiin valkosoluinter f eroni-mRNA: n tuottamiseksi Sendai- tai Newcastle'n taudin viruksella seuraten Rubinstein et ai.:n selostamaa menetelmää [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, ss. 640 - 644 (1979)]. Soluja korjattiin talteen 5 tuntia induktion jälkeen ja RNA:ta 30 valmistettiin guanidiinitiosyanaatti-guanidiinihydroklo-ridimenetelmällä [Chirgwin et ai., Biochemistry 18, ss. 5294 - 5299 (1979)]. Indusoimattomista soluista eristettiin RNA:ta samalla tavalla. Käytettiin oligodeoksitymi-dlini (dT)-selluloosakromatografiaa ja sakkaroosigradient-35 ti-ultrasentrifugointia poly-(A)-mRNA:n 12S-jakeen saamiseksi, kuten Green et ai. [Arch. Biochem. Biophys. 172,

II

15 82713 SS. 74 -89 (1976)] ja Okuyoma et ai. [Arch. Biochem. Bio-phys. 188, ss. 98 - 104 (1978)] ovat kuvanneet. Tämän mRNA:n interferoni-tiitteri oli 8 000 - 10 000 yksikköä/-mikrogramma Xenopus laevis-varhaismunasolumäärltyksessä 5 [Cavalieri et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, ss. 3287 - 3291 (1977)].

C. Pesäkepankkien, jotka sisältävät LelF-cDNA-sekvenssejä, valmistus 10 Käytettiin 5 pg mRNA:ta kakslsälkelsen cDNA:n val mistamiseksi standardimenetelmin [Wlckens et ai., J. Blol. Chem. 253, ss. 2483 - 2495 (1978), ja Goeddel et ai., Nature 281, ss. 544 - 548 (1979)]. cDNA fraktioitiin koon mukaan elektroforeesilla 6-%:isella polyakryyliamidigee-15 Iillä, ja 230 ng ainetta, jonka koko oli välillä 500 - 1 500 emäsparia (b.p.), korjattiin talteen sähköeluutiol-la. 100 ng:n erälle tätä cDNA:ta muodostettiin hännät de-okslsytidiini(dC)-tähteillä kuten Chang et ai. [Nature 275, ss. 617 - 624 (1978)] on kuvannut, lämpökäsiteltiin 20 470 ng:n kanssa plasmidia pBR322, johon oli muodostettu hännät deoksiguanosiini(dG)-tähteillä Pstl-kohdassa [Bolivar et ai., Gene 2, ss. 95 - 113 (1977)], ja käytettiin transformoimaan E. coll x 1776. Saatiin n. 130 tetrasyk-liinille resistenttiä ampisilliiniherkkää transformanttia 25 ng:aa kohti cDNA:ta.

Toisessa samanlaisessa kokeessa saatiin n. 1 000 tetrasykliinille resistenttiä ampisilliiniherkkää E. coli K-12-kannan 294 transformanttia ng:aa kohti cDNA:ta. Tässä tapauksessa koon mukaan fraktioitua cDNA-ainesta, Joka oli 30 kooltaan välillä 600 - 1 300 emäsparia, otettiin talteen sähköeluutiolla cD-hännänmuodostusta varten.

D. Synteettisten oligonukleotidien valmistus ja niiden käyttö

Ihmisen valkosoluinterferonin useiden tryptisten 35 fragmenttien aminohapposekvenssien tuntemus teki mahdolli-• seksi rakentaa synteettisiä deoksioliginukleotidejä, jotka 16 8271 3 ovat komplementaarisia LelF-mRNA:n eri alueilla. Valittiin 2 tryptistä peptidiä, Tl ja T13, koska niiden aminohappo-sekvenssit vaativat ainoastaan 12 ja 4 undekameerin synteesin, vastaavasti, vastaamaan kaikista mahdollisista 5 koodaussekvensseistä (kuva 1). Syntetisoitiin 4 sarjaa deoksioligonukleotidi-koettimia jokaista sekvenssiä varten, joka sisälsi joko 3 (T-1A, B, C, D) tai yhden T-13A, B, C, D) oligonukleotidin kukin. Osoitetut komplementaariset 11 emäksen pituiset deoksioligonukleotidit syntetisoi-10 tiin kemiallisesti fosfotriesterimenetelmällä [Crea et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, ss. 5765 - 5769 (1978)]. 4 yksittäistä koetinta valmistettiin T-13-sarjas-sa. 12 T-l-koetinta valmistettiin 4:ssä kolmen koettimen erässä, kuten kuvassa 1 on esitetty.

15 T-13-sarjan 4 yksittäistä koetinta ja 12 T-l-koe tinta, jotka oli valmistettu 4:ssä kolmen alukkeen erässä, käytettiin kutakin aloittamaan radiomerkatun yksisäikeisen cDNA:n synteesi käytettäväksi hybridisointikoettimina. Malli-mRNA oli joko 12S-RNA Sendai'11a indusoiduista KG-20 1-soluista (8 000 yksikköä IF-aktiivisuutta/pg) tai koko-nais-poly-(A)-mRNa indusoimattomista valkosoluista (< 10 yksikköä/pg). 32p-merkattua cDNA:ta valmistettiin näistä alukkeista käyttäen tunnettuja reaktio-olosuhteita [Noyes et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, ss. 1770 - 1774,

25 (1979)]. 60 μ1:η reaktiot saatettiin tapahtumaan 20 mM

Tris-HCl:ssa (pH 8,3), 20 mM KCl:ssa, 8 mM MgCl2:ssa ja 20 mM S-merkaptoetanolissa. Reaktiot sisälsivät 1 pg:n kutakin aluketta (ts. 20 pg yhteensä T-l-sarjoille ja 4 pg yhteensä T-13-sarjoille), 2 pg "indusoitua" 12S-fraktion 30 mRNA:ta (tai 10 pg indusoimatonta poly-(A)-mRNA:ta), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 pCi (a32 p)dCTP (Amersham, 2 - 3 000 Ci/mmooli) sekä 60 yksikköä käänteistransskriptaasia (Bethesda Research Laboratories). Tuote erotettiin yhdis-tymättömästä merkkiaineesta geelisuodatuksella 10 ml: n 35 Sephade^ G-50-kolonnissa, käsiteltiin 0,3 N NaOHrlla 30 min 70 °C:ssa RNA:n hävittämiseksi ja neutraloitiin

II

I? 8271 3 HCl:lla. Hybridisoinnit suoritettiin kuten Kafatos et ai. [Nucleic Acids Res. 7, ss. 1541 - 1552 (1979)] on kuvannut.

E. Kloonien pLl - pL30 tunnistaminen 5 Käytettiin Birnboim et al.:n [Nucleic Acids 7, ss.

1513 - 1523 (1973)] nopeaa plasmidin eristämismenetelmää 1 yg:n plasmidi-DNA:ta valmistamiseksi kustakin 500:sta yksittäisestä E. coli K-12-kannan 294 transformantista (ks. C). Jokainen DNA-näyte denaturoitiin ja levitettiin nitro-10 selluloosasuodattimille kolminkertaisesti seuraten Kafatos et ai.:n (ks. edellä) menetelmää.

Nämä 3 nitroselluloosasuodatinsarjaa, jotka sisälsivät 500 plasmidinäytettä, hybridisoitiin: a) indusoidulla cDNA:11a, joka oli aloitettu aluk- 15 keiden T-l-sarjalla, b) T-13:lla aloitetulla Indusoidulla cDNA:lla, ja c) indusoimattomalla cDNA:lla, joka oli valmistettu käyttämällä alukkeiden kumpaakin sarjaa.

Klooneja pidettiin positiivisina, jos ne hybridi-20 soituivat voimakkaammin toiseen tai kumpaankin indusoiduista cDNA-koettimista kuin koko indusoimattomaan koet- timeen. 500:sta valittiin 30 "positiivista" kloonia (pLl -pL30) lisäanalysointia varten.

F, Kloonien pL31 - pL39 tunnistaminen; plasmidin 25 (n:o 104), joka sisältää LelF-geenifragmentin, eristäminen E. coli x 1776:n transformantteja seulottiin Grun-stein'in ja Hogness'in pesäke-hybridisointimenetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, ss. 3961 - 3965 (1975)] 30 käyttäen koettimena 32p-merkattua indusoitua mRNA:ta [Lillenhaug et ai., Biochemistry 15, ss. 1858 - 1865 (1976)]. Merkkaamatonta mRNA:ta indusoimattomista soluista sekoitettiin koettimen kanssa suhteessa 200:1 kilpailemaan lndusoimattoman mRNA:n kanssa, jota on läsnä 32p-merkatussa 35 valmisteessa. Merkatun mRNA:n hybridisoitumisen tulisi tapahtua etuoikeutetusti pesäkkeisiin, jotka sisältävät ie 8271 3 indusoituja sekvenssejä. Saatiin 3 luokkaa transformaat-teja: 1) 2 - 3 % pesäkkeistä hybridisoitui 32p-mRNA:han hyvin voimakkaasti; 5 2) 10 % hybridisoitui merkittävästi vähemmän kuin luokka 1), ja 3) loppuosa ei antanut havaittavaa hybridisoimis-merkkiä.

Positiiviset pesäkkeet [luokat 1) ja 2)] tutkittiin 10 interferoni-spesifisten sekvenssien läsnäolon suhteen määrityksellä, joka riippuu interferoni-mRNA:n hybridisoitu-misesta spesifisesti plasmidi-DNA:han.

Aluksi viljeltiin 60 voimakkaasti positiivista pesäkettä [luokka 1)] yksittäin 100 mlrssa M9-alustaa, jota 15 oli täydennetty tetrasykliinillä (20 pg/ml), diaminopime-liinihapolla (100 pg/ml), tymidiinillä (20 pg/ml) ja d-biotiinilla (1 pg/ml). M9-alusta sisältää litraa kohti: 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl ja 1 g NH4C1. Autoklaa-vikäsittelyn jälkeen lisättiin 1 ml steriiliä 1 M MgS04:a 20 ja 10 ml steriiliä 0,01 M CaCl2:a. 10 viljelyä yhdistettiin ja plasmidi-DNA eristettiin näistä 6:sta yhdistetystä erästä kuten Clewell et ai. [Biochemistry 9, ss. 4428 -4440 (1970)] on selostanut. 10 pg jokaisesta plasmidi-DNA-erästä pilkottiin HindIII:lla, denaturoitiin ja sidottiin 25 kovalenttisesti DBM (diatsobentsyylioksimetyyli)-paperiin.

1 pg puhdistettua mRNA:ta indusoiduista soluista hybridi-soitiin jokaisella suodattimelle. Hybridisoitumaton mRNA poistettiin pesemällä. Spesifisesti hybridisoitu mRNA elu-oitiin ja translatoitiin Xenopus laevis-varhaismunasolui-30 hin. Tällä analyysillä kaikki 6 erää olivat negatiivisia.

5 erää, joissa kussakin oli 10 pesäkettä, tehtiin 59:stä heikosta pesäkkeestä [luokka 2)] ja näistä eristä valmistettiin plasmideja ja tutkittiin kuten edellä.

6:sta testatusta erästä yksi (K10) hybridisoitui 35 interferoni-mRNA:han määrissä, jotka olivat merkittävästi tausta-arvoja suurempia, joka kerta kun sitä testattiin.

11 is 8271 3

Spesifisen interferoni-cDNA-kloonin tunnistamiseksi valmistettiin plasmidi-DNA:ita erän K10 9:stä pesäkkeestä ja tutkittiin yksittäin. Kaksi 9:stä plasmidista (n:ot 101 ja 104) sitovat interferoni-mRNA:ta selvästi yli tausta- ar-5 vojen. Plasmidista n: o 104 eristettiin ainutlaatuinen Bglll-pllkontafragmentti, joka sisälsi 260 emäsparia, se merkattiin 32p:llä käyttäen Taylor et ai.:n [Biochem. Bio-phys. Acta 442, ss. 324 - 330 (1976)] selostamaa menetelmää ja käytettiin koettimena 400:n E. coli K-12-kannan 294 10 transformantln seulomiseksi itsenäisesti in situ-pesäke-seulontamenetelmällä [Grunstein ja Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, ss. 3961 - 3965 (1975)]. Tunnistettiin 9 pesäkettä (pL31 - pL39), jotka hybridisoituivat eri määriin tällä koettimella.

15 Lisäksi merkattua 260 emäsparin fragmenttia käytet tiin 4 000:n E. coli K-12-kannan 294 transformantln seulomiseksi itsenäisesti samalla tavalla. Tunnistettiin 50 pesäkettä, jotka hybridisoituivat eri määriin tällä koettimella. Yksi sisälsi LelF G-fragmentin, yksi LelF H-frag-20 mentln ja yksi sisälsi fragmentin, joka merkittiin LelF Hl:ksi (LelF H:n ilmeinen vastingeeni). Saadut hybridi-plasmldit merkitään "pLelF H:ksi", jne.

G. Ensimmäisen täysipituisen LelF-geenin eristäminen ja sekvenssointi 25 Plasmidl-DNA:ta valmistettiin kaikista 39:stä po tentiaalisesta LelF-cDNA-kloonista ja seulottiin uudelleen saman 260 emäsparin DNA-koettimen kanssa käyttäen Kafatos et ai.:n hybridisointimenetelmää (ks. edellä). 3 plasmidia (pL4, pL31 ja pL34) antoi hyvin voimakkaan hyb-30 ridisoitumissignaalin, 4 (pL13, pL30, pL32 ja pL36) hybri-disoitui kohtuullisesti ja 3 (pL6, pL8 ja pL14) hybridi-soi tui heikosti tämän koettimen kanssa.

Nämä 39 potentiaalista LelF-cDNA-yhdistelmä-plas-midla seulottiin myös käyttäen 32p-merkattuja synteettisiä 35 undekameerejä (yksittäisiä T-l-aluke-eriä tai yksittäisiä T-13-alukkeita) suoraan hybridisoimiskoettimina. Hybridi- 20 8271 3 soimisolosuhteet valittiin sellaisiksi, että vaadittaisiin oikea emäspariutuminen havaittavia hybridisoitumissignaa-leja varten [Wallace et ai., Nucleic Acids Res. 6, ss. 3543 - 3557 (1979)]. Siten plasmidi-DNA:ta 39:stä kloonis-5 ta valmistettiin standardimenetelmällä, jossa käytettiin kirkastettua lysaattia (Clewell et ai., ks. edellä) ja puhdistettiin Biorad Agarose A-50 pyiväskromatografiällä. Jokaisen preparaatin näytteitä (3 pg) linearisoitiin käsittelemällä EcoRX:lla, denaturoitiin alkalissa ja täpli-10 tettiin kahdelle erilliselle nitroselluloosasuodattimelle, 1,5 pg/täplä (Kafatos et ai., ks. edellä). Yksittäisiä synteettisiä deoksioligonukleotidi-alukkeita ja yhdistettyjä alukkeita fosforyloitiin (32p)ATP (New England Nuclear, 2 500 Ci/mmoolia), yhdistettiin 30 pl:ssa 50 mM 15 Tris-HCl:a, 10 mM MgCl2:a ja 15 mM β-merkaptoetanolia. Lisättiin 2 yksikköä T4-polynukleotidi-kinaasia ja 30 minuutin kuluttua 37 °C:ssa 32p-merkattuja alukkeita puhdistettiin kromatografisesti 10 ml:n Sephade^ G-50-pylväissä. Hybridisoinnit suoritettiin käyttäen 106 cpm aluketta 20 T-13C tai3 x 10® cpm yhdistettyjä alukkeita T-1C. Hybridi- soinnit saatettiin tapahtumaan 15 eC:ssa 14 tunnin aikana 6 x SSCissa [1 x SSC - 0,15 M NaCl:a ja 0,015 M natrium-sitraattia; pH 7,2], 10 x Denhardt’in liuosta [0,2 % naudan seerumialbumiinia, 0,2 % polyvinyylipyrrolidonia ja 25 0,2 % Ficoll'ia], kuten Wallace et ai. (ks. edellä) on selostanut. Suodattimia pestiin 5 minuuttia (3 x) 0 °C:ssa ja 6 x SSC:ssa, kuivattiin ja asetettiin röntgenfilmilie. Tulokset on esitetty kuvassa 2 32p-yhdistetyille alukkeille T-13C ja alukkeille T-1C.

30 Kloonin 104 plasmidi-DNA:n havaittiin antavan mer kittävän hybridisoitumisen yhdistetyillä alukkeilla T-1C ja alukkeella T-13C, mutta ei havaittavaa hybridisoitumis-ta muiden undekameerien kanssa. Kuten kuvassa 2 on esitetty, hybridisoituvat monet 39:stä potentiaalisesta LelF-35 plasmidista (pL2, 4, 13, 17, 20, 31 ja 34) myös näiden kummankin koettimen kanssa. Restriktioanalyysi osoitti

II

21 8271 3 kuitenkin, että ainoastaan yksi näistä plasmideista, pL31, sisälsi myös 260 emäsparin sisäisen Bglll-fragmentin; pL31:n Pstl-uutto osoitti cDNA-insertiojakson koon olevan n. 1 000 emäsparia.

5 pL31:n koko Pstl-insertiojakso sekvenssoitiin sekä

Maxam-Gilbert'in kemiallisella menetelmällä [Methods En-zymol. 65, ss. 499 - 560 (1980)] että dideoksi-ketjuter-minaatiomenetelmällä [Smith, Methods Enzymol. 65, ss. 560 - 580 (1980)] Sau3a-fragmenttien subkloonaamisen jälkeen 10 M13-vektoriin. DNA-sekvenssi ("A") on esitetty kuvassa 3. Sopiva translaatio-koodikaava voitiin ennustaa käytettävissä olevasta proteiinisekvenssi-informaatiosta, LelF-molekyylipainojen tunnetusta alueesta ja lopetuskolmikoi-den suhteellisesta sattumisesta kolmeen mahdolliseen koo-15 dikaavaan, ja tämä puolestaan teki mahdolliseksi koko LelF-aminohapposekvenssln, joka sisältää esi- eli signaa-lipeptidln, ennustamisen. Ensimmäinen ATG-translaation aloltuskodoni löytyy 60 nukleotidin päässä sekvenssin 5'-päästä ja sitä seuraa 188 kodonin päässä TGA-lopetuskol-20 mikko; 3'-päässä on 342 translatoimatonta nukleotidiä, Joita seuraa poly-(A)-sekvenssi. Otaksuttu signaalipeptidi (oletettavasti osallisena kypsän LeIF:n erittymisessä valkosoluista) on 23 aminohapon pituinen. Muiden 165 aminohapon, jotka muodostavat kypsän LeIF:n, laskettu molekyyli-25 paino on 19 390. Tässä LelF, jota pL31 koodaa, on nimetty "LelF A:ksi”. Sekvenssitiedoista ("A”) kuvassa 4 voidaan nähdä, että LelF B:n tryptiset peptidit T-l ja T-13 vastaavat LelF A:n aminohappoja 145 - 149 ja 57 - 61, vastaavasti. Todelliset DNA-koodaussekvenssit, jotka löytyvät 30 näiltä kahdelta alueelta, ovat niitä, joita edustavat yhdistetyt alukkeet T-1C ja T-13C (ks. kuva 8).

H. Kypsän valkosoluinterferonin A (LelF A) suora ekspressointi I. Yleistä 35 Menetelmä, jota seurataan LelF A:n ekspressoimisek- sl suoraan kypsäksi interferoni-polypeptidiksi, on muunnos 22 8271 3 menetelmästä, jota aikaisemmin käytettiin ihmisen kasvuhormonille [Goeddel et ai., Nature 281, ss. 544 - 548 (1979)], sikäli kun se käsitti synteettisen (N-terminaa-tio) ja komplementaarisen DNA:n yhdistelmän.

5 Kuten kuvassa 6 on esitetty, sijaitsee Sau3a-rest- riktioendonukleaasikohta sopivasti LelF A:n kodonien 1 ja 3 välissä. Rakennettiin 2 synteettistä deoksioligonukleo-tidiä, jotka yhdistävät ATG-translaation aloituskodonin, rekonstruoivat kodonin aminohappoa 1 (kysteiiniä) varten 10 ja muodostavat yksisäikeisen EcoRI-pään. Nämä oligomeerit liitettiin pL31:n emäsparin Sau3a-AvaII-fragmenttiin. Syn-tynyt 45 emäsparin tuote liitettiin kahteen lisä-DNA-frag-menttiin 865 emäsparin synteettis-luonnollisen hybridigee-nin rakentamiseksi, joka koodaa LeiF A:ta ja jota rajoit-15 tavat EcoRI- ja Pstl-pilkontakohdat. Tämä geeni kytkettiin pBR322:een EcoRI- ja Pstl-kohtien väliin antamaan plasmidi pLelF AI.

2. Tryptofaani-kontrollielementin (joka sisältää E. coli-trp-promoottorin, operaattorin ja trp-johtori-20 bosomin sitomiskohdan, mutta josta puuttuu ATG-sek- venssi, translaation alullepanemiseksi) rakentaminen

Plasmidi pGMI sisältää E. coli-tryptofaanioperonin, joka sisältää deleetion ALE1413 [Miozzari et ai., Bacte-25 riology 133, ss. 1457 - 1466 (1978)] ja ekspressoi siten yhdistyneen proteiinin, joka sisältää trp-johtajan ensimmäiset 6 aminohappoa ja trp E-polypeptidin (jota tässä tämän jälkeen nimitetään "LE:ksi") likimääräisesti 3 viimeistä aminohappoa, sekä trp D-polypeptidin kokonaisuudes-30 saan; kaikki trp-promoottori-operaattorisysteemin kontrollin alaisina. Plasmidia (20 pg) uutettiin restriktioent-syymin PvuII kanssa, joka pilkkoo plasmidin viidestä kohdasta. Geenifragmentit yhdistettiin ensin EcoRI-kytkentä-fragmenteilla (jotka koostuvat itse-komplementaarisesta 35 oligonukleotidistä, jolla on sekvenssi pCATGAATTCATG) ai-

II

23 8 2 7 1 3 kaansaaden EcoRI-pilkontakohdan myöhempää kloonausta varten plasmidiin, joka sisältää EcoRI-kohdan.

pGMl:stä saatua 20 pg:aa DNA-fragmentteja käsiteltiin 10 yksiköllä T4-DNA-ligaasia 20 pmoolin 5'-fosfory-5 loitua synteettistä oligonukleotidiä pCATGAATTCATG läsnäollessa ja 20 pl:ssa T4-DNA-ligaasipuskuria [20 mM Tris (pH 7,6), 0,5 mM ATP, 10 mM MgClj ja 5 mM ditiotreitolia) 4 °C:ssa yön yli. Liuosta kuumennettiin sitten 10 minuuttia 70 °C:ssa liitännän pysäyttämiseksi. Kytkentäfragmentit 10 pilkottiin EcoRI-uutolla ja fragmentit, joissa nyt oli EcoRI-päät, erotettiin käyttäen 5-%:ista polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesia (tästä eteenpäin "PAGE") ja 3 suurinta fragmenttia eristettiin geelistä värjäämällä ensin etidldiumbromidilla, paikallistamalla fragmentit ultravio-15 lettivalolla ja leikkaamalla geenistä kiinnostavat osat. Jokainen geenifragmentti pantiin 300 mikrolitran kanssa 0,1 x TBE dialyysipussiin ja saatettiin 100 voltin elektroforeesiin tunnin ajaksi 0,1 x TBE-puskurissa (TBE-pus-kuri sisältää 10,8 g Tris-emästä, 5,5 g boorihappoa ja 20 0,09 g Na3-EDTA:a 1 litrassa vettä). Vesipitoinen liuos kerättiin dialyysipussista, uutettiin fenolilla, uutettiin kloroformilla ja tehtiin 0,2 M:ksi natriumkloridin suhteen ja DNA otettiin etanolisaostuksen jälkeen talteen veteen. Trp-promoottori-operaattorin sisältävä geeni, jossa oli 25 yksisäikeiset EcoRI-päät, tunnistettiin seuraavassa kuvatulla menetelmällä, mitä seuraa fragmenttien insertio tet-rasykliinille herkkään plasmidiin, josta promoottori-ope-raattori-insertion jälkeen tulee tetrasykliinille resistentti .

30 Plasmidi pBRHl [Rodriques et ai.. Nucleic Acids

Res. 6, ss. 3267 - 3287 (1979)] ekspressoi ampisilliinire-sistenssin ja sisältää geenin tetrasykliiniresistenssiä varten, mutta koska tähän liittyvää promoottoria ei ole läsnä, se ei ekspressoi tätä resistenssiä. Plasmidi on si-„·· 35 ten herkkä tetrasykliinille. Tuomalla promoottori-operaat- 24 8271 3 torisysteemi EcoRI-kohtaan, plasmidi voidaan tehdä resistentiksi tetrasykliinille.

pBRHl uutettiin EcoRI:11a ja entsyymi poistettiin £enoliuutolla, jota seurasi kloroformiuutto, ja otettiin 5 talteen veteen etanolisaostuksen jälkeen. Syntynyt DNA-molekyyli yhdistettiin erillisissä reaktioseoksissa jokaisen edellä saadusta kolmesta DNA-fragment!sta kanssa ja liitettiin T4-DNA-ligaasilla kuten edellä kuvattiin. Reak-tioseoksessa läsnäoleva DNA käytettiin transformoimaan 10 pätevä E. coli K-12-kanta 294 standardimenetelmin [Hersh-field et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71, ss. 3455 -3459 (1974)] ja bakteerit levitettiin LB (Luria-Bertani)-levyille, jotka sisälsivät 20 pg/ml ampisilliiniä ja 5 pg/ml tetrasykliiniä. Valittiin useita tetrasykliinille 15 resistenttejä pesäkkeitä, plasmidi-DNA eristettiin ja halutun fragmentin läsnäolo vahvistettiin resktriktioentsyy-mianalyysillä. Saatu plasmidi on merkitty pBRHtrpiksi.

Hepatitis B:n virusgenomin EcoRI- ja BamHI-uutto-tuote saatiin tavanomaisin menetelmin ja kloonattiin plas-20 midin EcoRI- ja BamHI-kohtiin [Goeddel et ai, Nature 281, s. 544 (1979)] muodostamaan plasmidi pHS32. Plasmidi pHS32 pilkottiin Xbal:llä, uutettiin fenolilla sekä kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Sitä käsiteltiin sitten 1 litralla E. coli DNA-polymeraasi I:tä, Klenow-fragmentilla 25 (Boehringer-Mannheim) 30 pl:ssa polymeraasipuskuria [50 mM

kalimufosfaattia (pH 7,4), 7 mM MgCl2:a ja 1 mM B-merkapto-etanolia), joka sisälsi 0,1 mM dTTP ja 0,1 mM cCTP, 30 minuuttia 0 °C:ssa ja sitten 2 tuntia 37 °C:ssa. Tämä käsittely saattaa kaksi 4:stä nukleotidistä komplementaarises-30 ti Xbal-pilkontakohdan esiintyöntyvään 5' -päähän täytettäväksi seuraaviin: 5’ CT AGA- 5' CT AGA- 3 ’ T- 3' TCT-

II

25 8271 3 2 nukleotidia, dC ja dT, yhdistettiin antamaan pää, jossa oli 2 esiintyöntyvää 5'-nukleotidiä. Tämä plasmidin pHS32 lineaarinen tähde (fenoli- ja kloroformiuuton ja talteenoton jälkeen vedessä etanolisaostuksen jälkeen) 5 pilkottiin EcoRI:lla. Suuri plasmidifragmentti erotettiin pienemmästä EcoRI-Xbal-fragmentista PAGE:11a ja eristettiin sähköeluution jälkeen. Tämä DNA-fragmentti pHS32:sta (0,2 pg) liitettiin samanlaisissa olosuhteissa kuin edellä kuvatut, tryptofaanioperonln (n. 0,01 pg), joka oli peräi-10 sin pBRHtrprsta, EcoRI-TaqI-fragmenttiin.

Prosessissa, jossa fragmentti PHS32:sta liitetään EcoRI-TaqI-fragmenttiin kuten edellä selostettiin, Taql:n esiintyöntyvä pää liitetään Xbal:n jäljellä olevaan esiin-työntyvään päähän, vaikka se ei olisikaan täydellisesti 15 Watson-Crick'in mukaisesti emäspariutunut: - T CTAGA- TCTAGA- -» -AGC + TCT- AGCTCT- 20

Osa tästä liitäntäreaktioseoksesta transformoitiin E. coli K-12-kannan 294 soluihin, lämpökäsiteltiin ja levitettiin LB-maljoille, jotka sisälsivät ampisilliiniä.

Valittiin 24 pesäkettä, jotka oli viljelty 3 mlrssa 25 LB (Luria-Bertani)-alustaa ja plasmidi eristettiin. 6:11a näistä havaittiin olevan Xbal-kohta, joka oli uudistettu E. colilla katalysoidulla DNA-korjauksella, ja seuraava jäljentyminen: -TCTAGA - TCTAGA- 30 -> -AGCTCT - AGATCT- Näiden plasmidien havaittiin myös pilkkoutuvan sekä EcoRI:llä että Hpal:llä ja antavan odotetut pilkontafrag-35 mentit. Yhtä plasmidia, joka nimettiin pTrpl4:ksi, käytet- 26 8271 3 tiin heterologisten polypeptidien ekspressointiin kuten seuraavaksi esitetään.

Plasmidi pHGH 107 [Goeddel et ai., Nature 281, s. 544 (1979)] sisältää ihmisen kasvuhormonia varten geenin, 5 joka rakentuu 23 aminohappokodonista, jotka on tuotettu synteettisistä DNA-fragmenteista ja 163 aminohappokodonista, jotka on saatu komplementaarisesta DNA:sta, joka on tuotettu ihmisen kasvuhormonin lähetti-RNA:n käänteis-transkriptiolla. Tämä geeni, vaikka siitä puuttuu ihmisen 10 kasvuhormonin "esi"-sekvenssin kodonit, sisältää translaation aloituskodonin ATG. Tämä geeni eristettiin 10 pg:sta pHGH 107:ää käsittelyn jälkeen EcoRI:lla, mitä seurasi käsittely E. colin DNA-polymeraasi I-Klenow-fragmentilla ja dTTP:lla ja dATP:lla kuten edellä selostettiin. 15 Fenoli- ja kloroformiuuton ja etanolilla saostamisen jälkeen plasmidia käsiteltiin BamHl:lla.

Ihmisen kasvuhormoni (HGH)-geenin sisältävä fragmentti eristettiin PAGE:11a, mitä seurasi sähköeluutio. Saatu DNA-fragmentti sisältää myös tetrasykliiniresistens-20 si-rakennegeenin ensimmäiset 350 nukleotidiä, mutta siitä puuttuu tetrasykliini-promoottori-operaattorisysteemi, niin että kun se myöhemmin kloonataan ekspressointiplasmi-diin, voidaan plasmidit, jotka sisältävät insertiojakson, paikantaa palauttamalla tetrasykliiniresistenssi. Koska 25 fragmentin EcoRI-pää on täytetty Klenow-polymeraasi I-me-netelmällä, on fragmentilla yksi tylppä pää ja yksi yksl-säikeinen pää, mikä takaa oikean suuntautumisen myöhemmin ekspressolntiplasmidiin liitettäessä.

Seuraavaksi valmistettiin ekspressointiplasmidi 30 pTrpl4 vastaanottamaan edellä valmistettu HGH-geenin sisältävä fragmentti. Siten pTrpl4 uutettiin Xbal:llä ja syntyvät yksisäikeiset päät täytettiin Klenow-polymeraasi I-menetelmällä käyttäen dATP, dTTP, dGTP ja dCTP. Ferioli-ja kloroformiuuton ja etanolilla saostamisen jälkeen saa-35 tua DNA:ta käsiteltiin BamHI:lla ja syntynyt suuri plasmi-difragmentti eristettiin PAGE:11a ja sähköeluutiolla.

li 27 8271 3 pTrpl4:sta johdetulla fragmentilla oli yksi tylppä ja yksi yksisäikeinen pää, mikä teki mahdolliseksi yhdistämisen oikeassa suunnassa edellä kuvatun HGH-geenin sisältävän fragmentin kanssa.

5 HGH-geenifragmentti ja pTrpl4:m Xba-BamHI-fragment- ti yhdistettiin ja liitettiin yhteen samanlaisissa olosuhteissa kuin edellä kuvatut. Täytetyt Xbal- ja EcoRI-päät liitettiin yhteen tylppäliitännällä sekä Xbal- että EcoRI-kohdan uudelleen muodostamiseksi: 10 Täytetty Xbal Täytetty EcoRI HGH-geenin initiaatio -TCTAG AATTCTATG- -TCTAGAATTCTAG- -> -AGATC + TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC-

15 Xbal EcoRI

Tämä rakentelu muodostaa uudelleen myös tetrasyk-liiniresistenssigeenin. Koska plasmidi pHGH 107 ekspressoi tetrasykliiniresistenssin promoottorilta, joka sijaitsee 20 ylävirtaan HGH-geenistä (lac-promoottorista), tämä rakenne, joka on nimetty pHGH 207:ksi, sallii geenin ekspres-soinnin tetrasykliiniresistenssiä varten tryptofaani-pro-moottori-operaattorin säätelyn alaisena. Siten liitäntä-seos transformoitiin E. coli K-12-kantaan 294 ja valittiin 25 pesäkkeitä LB-maljoille, jotka sisälsivät 5 pg/ml tetrasykliiniä.

Plasmidia pHGH 207 uutettiin EcoRI:11a ja otettiin talteen 300 emäsparin fragmentti, joka sisälsi trp-pro-moottorin, operaattorin ja trp-johtoribosomin sitomiskoh-30 dan, mutta josta puuttui ATG-sekvenssi translaation aloittamiseksi PAGE:11a, mitä seurasi sähköeluutio. Tämä DNA-fragmentti kloonattiin pLelF A:n EcoRI-kohtaan. Ekspres-sointiplasmideja, jotka sisältävät edellä modifioidun trp-regulonin (E. coli-trp-operoni, josta vaimenninsekvenssi 35 on jätetty pois ekspressointitasojen säädettäväksi korottamiseksi), voidaan viljellä ennalta määrätyille tasoille 28 8271 3 ravintoalustoissa, jotka sisältävät lisä-tryptofaania määrissä, jotka ovat riittäviä vaimentamaan promoottori-ope-raattorisysteemin, ja sitten poistaa tryptofaani niistä systeemin vaimennuksen siten poistamiseksi ja aiotun tuot-5 teen ekspressoinnin aikaansaamiseksi.

Erityisesti ja viitaten kuvaan 6, uutettiin 250 pg plasmidia pL31 Pstl:llä ja 1 000 emäsparin insertiojakso eristettiin geelielektroforeesilla 6-%:isella polyakryyli-amidigeelillä. Noin 40 pg insertiojaksosta sähköuutettiin 10 geelistä ja jaettiin kolmeen tasaosaan jatkouuttoa varten: a) 16 pg:n näytettä tästä fragmentista uutettiin osittain 40 yksiköllä BglII:a 45 minuuttia 37 °C:ssa ja reak-tioseos puhdistettiin 6-%:isella polyakryyliamidigeelillä. Noin 2 pg halutusta 670 emäsparin fragmentista otettiin 15 talteen; b) toinen näyte (8 pg) 1 000 emäsparin Pstl-insertiojak-sosta pilkottiin Avail:11a ja BglII:lla. 1 pg osoitetusta 150 emäsparin pätkästä otettiin talteen geelielektroforee-sin jälkeen; 20 c) 16 pg 1 000 emäsparin fragmentista käsiteltiin

Sau3a:lla ja Avail:11a. Elektroforeesin jälkeen 10-%:isel-la polyakryyliamidigeelillä, otettiin n. 25 pg (10 pmoo-lia) talteen 34 emäsparin fragmentista.

2 osoitettua deoksioligonukleotidia, 25 5'-dAATTCATGTGT (fragmentti 1) ja 5'-dGATCACACATG (frag mentti 2) syntetisoitiin fosfotriesterimenetelmällä. Fragmentti 2 fosforyloitiin seuraavasti: 200 pl (n. 400 pmoo-lia) (^32p) ATP (Amersham; 5 000 Ci/mmooli) kuivattiin perusteellisesti ja suspendoitiin uudelleen 300 pl:aan 60 mM 30 Tris-HCl:a (pH 8), 10 mM MgCl2:a ja 15 mM β-merkaptoetano-lia, joka sisälsi 100 pmoolia DNA-pätkää ja 2 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. 15 minuutin kuluttua 37 °C:ssa lisättiin 1 pl 10 mM ATP:a ja reaktion annettiin jatkua vielä 15 minuuttia. Seosta kuumennettiin sitten 70 °C:ssa 15 35 minuuttia, yhdistettiin 100 pmoolin kanssa 5*-0H-frag-menttia 1 ja 10 pmoolin kanssa 34 emäsparin Sau3a-AvaII- il 29 8271 3 fragmenttia. Liitäntä tapahtui 5 tunnin aikana 4 °C:ssa 50 pl:ssa 20 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 10 mM MgCl2:a, 10 mM di-tiotreitolia, 0,5 mM ATP:a ja 10 yksikössä T4-DNA-ligaasia. Seos saatettiin elektroforeesiin 6-%:isella polyakryyli-5 amidigeelillä ja 45 emäsparin tuote otettiin talteen säh-köuutolla. Noin 30 ng (1 pmooli) 45 emäsparin tuotetta yhdistettiin 0,5 pg:n (5 pmoolin) kanssa 150 emäsparin Avall-Bglll-fragmenttia ja 1 pg:n (2 pmoolin) kanssa 670 emäsparin Bglll-Pstl-fragmenttia. Liitäntä tapahtui 20 10 °C:ssa 16 tunnin aikana käyttäen 21 yksikköä T4-DNA-ligaa-sia. Ligaasi inaktivoitiin kuumentamalla 65 °C:ssa 10 minuuttia. Seosta uutettiin sitten EcoRI:llä ja Pstlillä geenin polymeerien poistamiseksi. Seos puhdistettiin 6-%:isella PAGE:lla. Noin 20 ng (0,04 pmoolia) 865 emäspa-15 rin tuotetta eristettiin. Puolet tästä (10 ng) liitettiin pBR322:een (0,3 pg) EcoRI- ja Pstl-kohtien väliin. E. coli K-12-kannan 294 transformointi antoi 70 tetrasykliinire-sistenttiä, ampisilliiniherkää transformanttia. Plasmidi-DNA:ta, joka oli eristetty 18:sta näistä transformanteis-20 ta, uutettiin EcoRI:llä ja Pstlillä. 16:ssa näistä 18 pla-smidista oli EcoRI-Pstl-fragmentti, joka oli 865 emäsparin pituinen, 1 pg yhdestä näistä (pLelF AI) uutettiin EcoRI:llä ja liitettiin 300 emäsparin EcoRI-fragmenttiin (0,1 pg), joka sisälsi E. coli-trp-promoottorin ja trp-25 johtoribosomin sitorniskohdan, joka oli valmistettu kuten edellä kuvattiin. Transformantit, jotka sisälsivät trp-promoottorin, identifioitiin käyttäen 32p-trp-koetinta yhdessä Grunstein - Hogness'in pesäkkeenseulontamenetelmän kanssa. Asymmetrisesti sijaitseva Xbal-kohta trp-fragmen-30 tissa teki mahdolliseksi rekombinanttien määrittämisen, joissa trp-promoottori oli suuntautunut LelF A-geenin suuntaan.

I. LelF A:n in vitro- ja in vivo-aktiivisuus Uutteita IF-määritystä varten valmistettiin seuraa-35 vasti: 1 ml:n viljelyjä kasvatettiin L-liemessä, joka si-. . sälsi 5 pg/ml tetrasykliiniä, A550-arvoon n. 1,0 ja laimen- 30 8271 3 nettiin sitten 25 ml:aan M9-alustaa, joka sisälsi 5 pg/ml tetrasykliiniä. 10 ml:n näytteitä otettiin talteen linkoamalla, kun A550 saavutti arvon 1,0 ja solupelletit suspen-doitiin 1 ml:aan 15-%:ista sakkaroosia, 50 mM Tris-HCl:a 5 (pH 8,0) ja 50 mM EDTA:a. Lisättiin 1 mg lysotsyymiä ja 5 minuutin kuluttua solut rikottiin 0 °C:ssa äänikäsittelyl-lä. Näytteitä lingottiin 10 minuuttia 15 000 rpm ja päällä olevien nesteiden interferoni-aktiivisuus määritettiin vertaamalla LelF-standardeihin solusairausvastuksen (CPE) 10 estomäärityksellä. IF-molekyylien lukumäärän solua kohti määrittämiseksi käytettiin LeIF:n ominaisaktiivisuutta 4 x 108 yksikköä/mg.

Kuten taulukossa 1 on esitetty, antaa klooni pLelF A trp 25, johon trp-promoottori on liitetty halutun suun-15 täisenä, suuria aktiivisuusmääriä (niinkin suuria kuin 2,5 x 108 yksikköä/litra).

Kuten taulukossa 2 on esitetty, käyttäytyy IF, joka on tuotettu E. coli K-12-kannan 294/pLeIF A trp 25:11a, kuten autenttinen ihmisen LelF; se on käsittelyn kestävä 20 pH-arvossa 2 ja neutraloituu kaniinin anti-ihmis-valkoso-lu-vasta-aineilla. Interferonin näennäismolekyylipaino on n. 20 000.

Interferonin in vivo-tehokkuus vaatii makrofagien ja luonnollisten tappaja (NK)-solujen läsnäolon ja toimin-25 tatapa in vivo näyttää saavan aikaan näiden solujen stimu-loitumlsen. Siten säilyi mahdollisuus, että interferoni, joka on tuotettu E. coli K-12-kannan 294/pLeIF A trp 25:llä, samalla kun sillä on virusten vastainen vaikutus soluviljelyanalyysissä, ei olisi aktiivinen infektoisuissa 30 eläimissä. Lisäksi bakteerisesti tuotetun, ei-glykosyloi-dun LelF A:n in vivo-virusten vastainen vaikutus saattaisi olla erilainen kuin glykosyloidulla LelF:11a, joka on peräisin ihmisen koaguloituneen verinesteen valkosoluista punasolujen laskeutumisen jälkeen. Siksi bakteerisesti 35 syntetisoidun LelF A:n (2 %:n puhtaus) biologista aktiivisuutta verrattiin LelF:n (puhtaus 8 %) kanssa, joka oli ii 31 8271 3 peräisin koaguloituneesta vesinesteestä punasolujen laskeutumisen jälkeen, orava-apinoiden kuolettavassa aivo-sydänlihastulehdus (EMC)-virusinfektiossa (taulukko 3).

5 Taulukko 1

Interferoni-aktiivisuus E. colin uutteissa E. coli K-12- Solutiheys IF-aktiivisuus LelF-mole- kanta 294; (solua/ml) yksikköä/ml kyylejä 10 transformoitu_viljelyä_/solu__

pLelF A

trp 25: llä 3,5 x 10® 36 000 9 000

pLelF A

trp 25: llä_1,8 x 109 250 000_12 000 15

Taulukko 2 E. coli K-12-kannan 294/pLeIF A 25:n uutteiden aktiivisuuksien vertaaminen standardi-LelF: iin(* 20 _

Interferoni-aktiivisuus (yksikköä/ml) Käsittele- pH 2 Kaniinin anti-ih mätön mis-valkosolu- - . _vasta-aineet_ 25 E. coli 294/ pLelF A trp 25- uute 500 500 < 10

LelF-standardi_500_500_< 10_

Taulukossa 1 esitetty E. coli K-12-kanta 294/-30 pLelF A trp 25: n 250 000 yksikköä/ml uute laimennettiin 500-kertaiseksi minimimäärällä välttämätöntä alustaa, joka antaa ominaisaktiivisuuden 500 yksikköä/ml. Eräs valkoso-luinterferoni-standardi (Wadley Institute), joka oli sitä ennen titrattu NIH-valkosoluinterferoni-standardia vas-35 taan, laimennettiin myös loppupitoisuuteen 500 yksikköä/- ml. 1 ml:n tasaosia asetettiin pH-arvoon 2 IN HCl:lla, 32 8271 3 inkuboitiin 4 °C:ssa 52 tuntia, neutraloitiin lisäämällä NaOH:a, ja IF-aktiivisuus määritettiin standardi-SPE-esto-määrityksellä. 25 μ1:η tasaosia 500 yksikköä/ml:n näytteistä (käsittelemättömiä) inkuboitiin 25 μ1:η kanssa ka-5 niinin anti-ihmis-valkosoluinter£eronia 60 minuuttia 37 °C:ssa, lingottiin 12 000 x G:ssä 5 minuttia ja sakan päällä oleva neste analysoitiin.

Taulukko 3 10

Erilaisten LelF-preparaattien virusten vastainen vaikutus orava-apinoiden EMC-virusinfektiota vastaan

Eloon- Seerumi 15 jääneitä Plakkeja muodostavia yksiköitä/ml Käsittely_Päivä 2 Päivä 3 Päivä 4

Vertailu 0/3 ίο') 3 x 104 10 (bakteeri- 0 Γ3 0 1,200 f>3,4xl04 proteiineja) Oj 0 0) 20 Bakteeri LelF A 3/3 0 00 0 0 0 0 0 0

LelF-standardl 3/3 0 00 0 0 0^ 25 _o_o_g_

Kaikki apinat olivat urospuolisia (keskimääräinen paino 713 g) ja niissä ei ollut EMC-virus-vasta-aineita ennen infektiota. Apinat infektoitiin lihaksensisäisesti 30 100 x LD50 EMC-virusmäärällä (määritetty hiirillä). Vertai lussa käsitellyt apinat kuolivat 134, 158 ja 164 tuntia infektion jälkeen. Interferonikäsittelyt 10® yksiköllä tapahtuivat laskimonsisäistä tietä -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 ja 240 tuntia infektioon nähden. Bakteeri-valkosoluin-35 terferoni oli pylväskromatografiajae E. coli K-12-kanta 294/pLeIF A 25:n lysaatista ominaisaktiivisuuden ollessa

II

33 8271 3 7,4 x 106 yksikköä/mg proteiinia. Vertailubakteeriproteii-nit olivat samanarvoinen pylväsjae E. coli K-12-kanta 294-/pBR322:n lysaatista kaksinkertaisella kokonaisproteiini-pitoisuudella. Valkosoluinterferoni-standardi oli Sendai-5 viruksella Indusoitu interferoni normaaleista Ihmisen "koaguloituneen verinesteen, punasolujen laskeutumisen jälkeen," soluista, jotka oli kromatografisesti puhdistettu ominaisaktiivisuuteen 32 x 106 yksikköä/mg proteiinia.

Vertailuapinoilla ilmeni jatkuvaa horrosta, tasa-10 painon menetystä, takaraajojen hervotonta halvaantumista ja silmien vesittymistä, joka alkoi noin 8 tuntia ennen kuolemaa. Interferonilla käsitellyillä apinoilla ei ilmennyt mitään näistä poikkeavuuksista; ne pysyivät aktiivisina koko ajan eivätkä kehittäneet viremiaa. Yksi vertailu-15 ryhmän apina, joka ei kehittänyt viremiaa 4 päivässä, kuoli viimeisenä (164 tuntia infektion jälkeen), mutta sillä oli suuret virustiitterit sydämessä ja aivoissa kuoleman jälkeen. Interferonilla käsitellyt apinat eivät kehittäneet vasta-aineita EMC-virukselle, kuten määritettiin 14 20 ja 21 päivää infektion jälkeen. Nämä tulokset osoittavat, että LelF-preparaattien virusten vastaiset vaikutukset tartutetuissa eläimissä voidaan laskea pelkästään interferonin ansioksi, koska saastuttavat proteiinit ovat täysin erilaisia bakteerisessa ja kaoguloituneesta verines-25 teestä tehdyissä valmisteissa. Lisäksi nämä tulokset osoittavat, että glykosylointia ei tarvita Lei F A: n in vivo-virusten vastaista vaikutusta varten.

J. cDNAriden eristäminen lis*ä-valkosoluinterfero-neja varten 30 DNa täysin luonnehditusta LelF A-cDNA:ta sisältä västä plasmidista leikattiin Pstl:llä, eristettiin elekt-roforeettisesti ja merkattiin 32p:llä. Syntynyttä radioak-tiivisesti merkattua DNA:ta käytettiin koettimena E. coli K-12-kannan 294 lisätransformanttien seulomiseksi, jotka 35 oli saatu samalla tavalla kuin osassa C, Grunstein'in ja Hogness'in (ks. edellä) in situ-pesäkkeenseulontamenetel- 3* 82713 mällä. Pesäkkeet, jotka hybridisoitulvat valhtelevlssa määrissä koettlmeen, eristettiin. Plasmldl-DNA näistä pesäkkeistä ja 10 hybridisoitua pesäkettä, joihin viitattiin osassa 6 edellä, eristettiin leikkaamalla Pstl:llä ja 5 luonnehdittiin 3:11a eri menetelmällä.

Ensiksi näitä Pst-fragmentteja luonnehdittiin niiden restriktioendonukleaasi-uuttomalllen mukaan entsyymeillä Bglll, PvuII ja EcoRI. Tämä analyysi teki mahdolliseksi ainakin 8 eri tyypin luokittelun (LelF A, B, C, D, 10 E, F, G ja H), jotka on esitetty kuvassa 5, jossa on likimääräisesti esitetty eri pilkontaleikkausten sijainti suhteessa tähän mennessä tunnettuun esisekvenssiin ja LelF A:n koodaussekvenssiin nähden. Yhden näistä, LelF D:n, uskotaan olevan sama kuin se, jonka Nagata et ai. [Nature 15 284, ss. 316 - 320 (1980)] on esittänyt.

Toiseksi testattiin tiettyjä DNA:itä Gleveland et al.:n [Cell 20, ss. 95 - 105 (1980)] kuvaamalla hybridi-soimisvalikointimäärityksellä kyvyn suhteen selektiivisesti poistaa LelF-mRNA poly-A:ta sisältävästä KG-l-solu-20 RNA:sta. LelF A, B, C ja F olivat tällä määrityksellä positiivisia.

Kolmanneksi jälkimmäiset Pst-fragmentit liitettiin ekspressointiplasmidiin, E. coli K-12-kanta 294 transformoitiin tällä plasmidilla ja fragmentit ekspressoitiin. 25 Ekspressointituotteet, joiden uskottiin olleen esi-inter-feroneja, olivat kaikki positiivisia CPE-analyysillä interferoni-aktiivisuuden suhteen, vaikkakin aktiivisuus oli aivan rajatapaus LelF F-fragmentin kohdalla. Edellä esitetyn lisäksi kaikki selostetut LelF-tyypit on sekvenssoitu. 30 K. Toisen kypsän valkosoluinterferonin (LelF B) suora ekspressointi

Eristetyn fragmentin, joka sisältää geenin kypsää LelF B:tä varten, sekvenssi osoittaa A-tyypin ja B-tyypin 14 ensimmäisen nukleotidin olevan identtisiä. Sitten ero-35 tettiin pLelF A 25:stä fragmentti, jossa oli trp-promoot-

II

35 8271 3 tori-operaattori, ribosomin sitomiskohta ja LelF A (- B) geenin aloitus ja yhdistettiin B-sekvenssin loppuosan kanssa ekspressointiplasmidissa. Haarautuvat pilkontakar-tat pL4:n Pst-fragmentille (plasmidille, joka sisältää 5 kuvassa 5 esitetyn LeIF B-Pst-päisen geenin) ja pLelF A 25:lie on esitetty, vastaavasti, kuvissa 7a ja 7b.

Likimääräisesti 950 emäsparin Sau3a-PstI-fragmentin saamiseksi kuvassa 7a esitetystä sekvenssistä, tarvittiin useita vaiheita, mikä johtui yhden tai useamman välissä 10 olevan Sau3a-pilkontakohdan läsnäolosta, ts.: 1) Eristettiin seuraavat fragmentit: a) 110 emäsparia Sau3a:sta EcoRIreen; b) 132 emäsparia EcoRI:stä Xbarhan; ja c) > 700 emäsparia Xba:sta Pst:hen.

15 2) Fragmentit la) ja Ib) liitettiin ja leikattiin

Xba:lla ja BglII:lla itsepolymerisoitumisen estämiseksi Sau3a- ja Xba-pääterminaalien kautta (sopiva Sau3a-kohta oli Bglll-kohdan sisällä; Bglll leikkaa jättäen Sau3a-yk-sisäikeisen pään). Eristettiin 242 emäsparin fragmentti. 20 3) 2):n ja lc):n tuote liitettiin ja leikattiin

Pstl:llä ja BglII:lla, jälleen itsepolymerisoitumisen estämiseksi. Noin 950 emäsparin fragmentti, Sau3a:sta Pstl:een (kuvassa 7a) eristettiin. Tämä fragmentti sisälsi LelF B-geenin sen osan, joka ei ole yhteinen LelF A:n 25 kanssa.

4) Noin 300 emäsparin fragmentti (HindIII:sta

Sau3a:han), joka sisälsi trp-promoottori-operaattorin, ri bosomin sitomiskohdan, ATG-aloitussignaalin ja LelF A:n kysteiinikodonin, eristettiin pLelF A 25:stä.

30 5) Noin 3 600 emäsparin fragmentti PstI:stä

HindIII:een eristettiin pBR322:sta. Tämä sisälsi repliko-nin ja koodasi tetrasykliini- mutta ei ampisilliiniresis-tenssiä.

6) Vaiheissa 3), 4) ja 5) saadut fragmentit kol-35 moisliitettiin ja syntynyt plasmidi transformoitiin E.

coli K-12-kantaan 294.

36 8 2 7 1 3

Transformantit miniseulottiin [Birnboim et al., Nucleid Acids Res. 7, ss. 1513 - 1523 (1979)] ja plasmidi-näytteitä uutettiin EcoRIrllä. Uutot antoivat 3 fragmenttia, joille oli ominaista: 5 1) EcoRI-EcoRI-trp-promoottorifragmentti; 2) pL4:n sisäinen EcoRI-fragmentti; ja 3) proteiinin translaation aloitussignaali pL4:n EcoRI-fragmenttiin.

CPE-analyysissä bakteeriuutteet, jotka on saatu 10 klooneista, jotka on tehty edellä esitetyllä tavalla, antavat tyypillisesti n. 10 x 10® yksikköä interferoni-aktii-visuutta/litra A550 = l:ssä. Edustava tällä tavalla valmistettu klooni on E. coli K-12-kanta 294/pLeIF B trp 7.

L. Muiden kypsien valkosoluinterferonien (LelF C, 15 D, E, F, H, I ja J) suora ekspressointi

Muita täysipituisia geeni-fragmentteja, jotka sisältävät muita LeIF-tyyppejä, voidaan erityisesti valmistaa ja sijoittaa ekspressointivektoriin ekspressiota varten, kuten LelF A:n tapauksessa. Täydellinen sekvenssointi 20 tavanomaisin menetelmin ilmaisee, sijaitseeko pilkontakoh-ta riittävän lähellä kypsän interferonityypin ensimmäistä aminohappokodonia salliakseen sopivan turvautumisen osassa H edellä käytettyyn menetelmään kypsän LelF A:n ekspres-soimiseksi, ts. esi-sekvenssin poistoon pilkontaleikkauk-25 sella ja korvaamalla kodonit N-terminaatio-aminohappoja varten, jotka menetettiin esi-sekvenssin poistossa, kytkemällä synteettinen DNA-fragmentti. Toteuttamatta tätä voidaan käyttää seuraavaa menetelmää, joka lyhyesti käsittää esi-sekvenssin sisältävän fragmentin pilkkomisen juuri 30 ennen pistettä, jossa kodoni kypsän polypeptidin ensimmäistä aminohappoa varten alkaa, siten että: 1) muutetaan kaksisäikeinen DNA yksisäikeiseksi DNA:ksi tätä pistettä ympäröivällä alueella; 2) hybridisoidaan vaiheessa 1) muodostetulle yksi-35 säikeiselle alueelle komplementaarinen aluke, joka on yk- sisäikeisen DNA:n pituinen, niin että alukkeen 5'-pää on 37 8 2 7 1 3 vastapäätä nukleotidiä, joka liittyy aiottuun pilkon-takohtaan; 3) rekonstruoidaan toisen säikeen se osa, joka poistettiin vaiheessa 1) ja joka sijaitsee 3'-suuntaan 5 alukkeesta, saattamalla reagoimaan DNA-polymeraasin kanssa adeniinia sisältävien deoksinukleotidi-trifosfaattien läsnäollessa; ja 4) uutetaan DNA:n jäljellä oleva yksisäikeinen pituus, joka työntyy yli aiotun pilkontapisteen.

10 Lyhyt pätkä synteettistä DNA:ta, joka päättyy koo- daussäikeen 3'-päässä ja jossa on translaation aloitussig-naali ATG, voidaan sitten liittää esim. tylppäliitännällä syntyneeseen erikoisesti tehtyyn geeniin kypsiä interferoneja varten ja geeni voidaan kytkeä ekspressointiplasmi-15 diin ja saattaa promoottorin ja siihen liittyvän ribosomin sitomiskohdan säätelyn alaiseksi.

Samalla tavalla, jota käytettiin edellä osassa K, muotoiltiin sopivasti geenifragmentteja, jotka koodaavat LelF C:tä ja LelF D:tä suoraa bakteeriekspressointia var-20 ten. Ekspressointistrategia näitä ylimääräisiä valkosolu-interferoneja varten käsitti jokaisessa tapauksessa turvautumisen n. 300 emäsparin fragmenttiin (HindIII:sta Sau3a:han), joka sisälsi trp-promoottori-operaattorin, ribosomin sitomiskohdan, ATG-aloitussignaalin ja LelF A:n 25 kysteiinikodonin pLelF A 25:stä. Tähän yhdistettiin geeni-fragmentteja muista interferonigeeneistä, jotka koodaavat vastaavia aminohapposekvenssejään yli alkukysteiinin, joka on yhteinen kaikille. Jokainen saatu plasmidi käytettiin transformoimaan E. coli K-12-kanta 294. Liitännät vastaa-30 vien geenien muodostamiseksi olivat seuraavat:

LelF C

Eristetään seuraavat fragmentit pLelF C:stä: a) 35 emäsparia Sau3a:sta Sau96:een; b) > 900 emäsparia Sau96:sta Pstl:een; 35 c) eristetään n. 300 emäsparin fragmentti (HindiII-

Sau3a) pLelF A 25:stä, kuten osassa K 4) edellä; ja 38 8 2 7 1 3 d) eristetään n. 3 600 emäsparin fragmentti osasta K 5) edellä;

Rakentelu 1) a) ja c) liitetään. Pilkotaan BglII:lla ja 5 Hindlllrlla ja eristetään n. 335 emäsparin tuote.

2) Kolmoisliitetään 1) + b) +d) ja transformoidaan E. coli saadulla plasmidilla.

Tällä tavalla tehty edustava klooni on E. coli K-12-kanta 294/pLeIF C trp 35.

10 LelF D

pLelF D:stä eristetään: a) 35 emäsparia Sau3a:sta Avail reen; b) 150 emäsparia AvaII:sta Bglllreen; ja c) noin 700 emäsparia BglII:sta Pstlreen.

15 pLelF A 25:stä eristetään: d) 300 emäsparia HindIII:sta Sau3a:han; pBR322:sta eristetään: e) noin 3 600 emäsparia HindIII:sta Pstlreen.

Rakentelu: 20 1) a) + b) liitetään, leikataan BglII:lla ja puh distetaan 185 emäsparin tuote 1).

2) 1) + d) liitetään, leikataan Hindlllrlla ja Bglllrlla ja puhdistetaan n. 500 emäsparin tuote 2).

3) 2)+c)+e) liitetään ja transformoidaan E.

25 coli saadulla plasmidilla.

Tällä tavalla tehty edustava klooni on E. coli K-12-kanta 294/pLeIF D trp 11.

Le IF F

LelF F:n sisältävää fragmenttia voidaan erikoisesti 30 käsitellä suoraa ekspressointia varten kokoamalla uudel leen, mikä tehdään sopivasti LelF B:n ja LelF F:n aminohappojen 1-13 täydellisen homologian avulla. Trp-pro-moottorin sisältävä fragmentti a), jolla on sopivasti muotoillut päät, saadaan edellä kuvatusta pHGH 207:stä Pstl-35 ja Xbal-uuton kautta, joita seuraa n. 1 050 emäsparin 39 8271 3 fragmentin eristäminen. Toinen fragmentti b) saadaan suurempana kahdesta fragmentista, jotka saadaan plasmidin pHKY 10 uutosta Pstl:llä ja Bgl:llä. Fragmentti a) sisältää suurinpiirtein puolet geenistä, joka koodaa empisi1-5 lliniresistenssiä; fragmentti b) sisältää loput geenistä ja koko geenin tetrasykliiniresistenssiä varten, paitsi tähän liittyvää promoottoria. Fragmentit a) ja b) yhdistetään T4-ligaasilla ja tuotetta käsitellään Xbal:llä ja BglII:lla dimeroinnin poistamiseksi, muodostaen fragmentti 10 c), joka sisältää trp-promoottori-operaattorin ja geenit tetrasykliini- ja ampisilliiniresistenssiä varten.

Likimääräisesti 580 emäsparin fragmentti d) saadaan uuttamalla pLelF F Avail:11a ja Bglllrlla. Tämä sisältää kodonit LelF F:n aminohappoja 114 - 166 varten.

15 Fragmentti e) (49 emäsparia) saadaan uuttamalla pLelF B:tä Xbal:llä ja Avail:11a. Fragmentti e) koodaa LeiF F:n aminohappoja 1-13.

Fragmentit c), d) ja e) kolmoisliitetään T4-ligaasin läsnäollessa. Vastaavien fragmenttien koossapysyvät päät 20 ovat sellaisia, että yhdistelmäplasmidi muodostuu renkaaksi oikein, saattaen tetrasykliiniresistenssigeenin trp-promoottori-operaattorin säätelyn alaiseksi yhdessä geenin kanssa kypsää LelF F:ää varten, niin että bakteerit, jotka on transformoitu halutulla plasmidilla, voidaan valita 25 tetrasykliiniä sisältäviltä maljoilta. Eräs edustava tällä tavalla valmistettu klooni on E. coli K-12-kanta 294/pLeIF F trp 1.

LelF H

Täydellinen LelF H-geeni voidaan muotoilla ekspres-30 siota varten kypsäksi valkosoluinterferoniksi seuraavasti: 1) Plasmidia pLelF H uutetaan HaeII:lla ja Rsal:llä ja eristetään 816 emäsparin fragmentti, joka ulottuu sig-naalipeptidin aminohaposta 10 3'-ei-koodaavalle alueelle.

2) Fragmentti denaturoidaan ja saatetaan korjaus-35 synteesiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentin kanssa [Klenow et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 65, s. 168 40 8271 3 (1970)] käyttäen synteettistä deoksiribo-oligonukleotidi-aluketta 5'-dATG TGT AAT CTC TCT.

3) Syntynyt tuote pilkotaan Sau3A:lla ja eristetään 452 emäsparin fragmentti, joka edustaa aminohappoja 1 - 5 150.

4) pLelF H:n Sau3a- ja Pstl-uutto ja syntyneen 500 emäsparin fragmentin eristäminen antaa geenin, joka koodaa aminohappoja 150:stä koodaussekvenssin päähän asti.

5) Vaiheissa 3) ja 4) eristetyt fragmentit liite- 10 tään muodostamaan fragmentti: 1 166 met cys asp stop

ATG TGT.. -1- ...GAT TAG---PstI

15 Sau3a joka koodaa LeiF H:n 166 aminohappoa.

6) pLelF A trp 25 uutetaan Xbal:llä, tehdään tylppäpäiseksi DNA-polymeraasi I:llä ja tuotetta uutetaan 20 Pstl:llä. Saatu suuri fragmentti voidaan eristää ja liit tää vaiheen 5) tuotteen kanssa muodostamaan ekspressointi-plasmidi, joka pystyy E. coli K-12-kannan 294 tai muiden isäntäbakteerien transformoinnin jälkeen ekspressoimaan kypsää LelF H:ta.

25 LeiF I

Ihmis-genomin faagi Charon 4A-rekombinanttikir-jasto, jonka on rakentanut Lawn et ai. [Cell 15, s. 1157 (1978)], seulottiin valkosoluinterferonigeenien suhteen menetelmin, joita ovat selostaneet Lawn et ai. (supra) ja 30 Maniatis et ai. [Cell 15, s. 687 (1978)]. Radioaktiivista LelF-koetinta, joka oli peräisin cDNA-kloonista LelF A, käytettiin seulomaan n. 500 000 plakkia. Tässä seulonnassa saatiin 6 LelF-genomikloonia. Uudelleenseulonnan ja plakkien puhdistamisen jälkeen yksi näistä klooneista, X.HLeIF2 35 valittiin jatkoanalyysiä varten.

li 41 8271 3 Käyttäen edellä kuvattua menetelmää, voidaan käyttää multa koettlmia edistämään muiden LelF-kloonlen eristämistä Ihmls-genomlsta. Näitä voidaan vuorostaan käyttää tuottamaan lisää valkosoluinterferonl-proteilneja tämän 5 keksinnön mukaisesti.

1) λJLeIF2-kloonin 2 000 emäsparin EcoRI-fragmentti subkloonattiin pBR325:ksi EcoRI-kohdassa. Syntynyt plasmldi, LelF I, pilkottiin EcoRI:llä ja 2 000 emäsparin fragmentti eristettiin. Deoksioligonukleotidl dATTCTGCAG

10 (eräs EcoRI-Pstl-konventtori) liitettiin tähän 2 000 emäs- parin EcoRI-fragmenttiin ja syntynyt tuote pilkottiin Pstl:llä antamaan 2 000 emäsparin fragmentti, joka sisälsi PstI—päät· Tämä pilkottiin Sau96:lla ja eristettiin 1 100 emäsparin fragmentti, jolla oli yksi PstI- ja yksi Sau96- 15 pää.

2) Plasmidia pLelF C trp 35 uutettiin Pstlrllä ja Xbal:llä. Suuri fragmentti eristettiin.

3) Pientä Xbal-Pstl-fragmenttia pLelF C trp 35:stä uutettiin Xbal:llä ja Sau96:lla. Eristettiin 40 emäsparin 20 XbaI-Sau96-fragmentti.

4) Vaiheissa 1), 2) ja 3) eristetyt fragmentit lii tettiin muodostamaan ekspressointiplasmidi pLelF I trp 1.

LelF J

1) Plasmidi pLelF J sisältää 3,8 kiloemäksen 25 Hindlll-fragmentin ihmisen genomi-DNA:ta, joka sisältää

LeiF J:n geenisekvenssin. Tästä plasmidista eristettiin 760 emäsparin Ddel-Rsal-fragmentti.

2) Plasmidi pLelF trp 7 pilkottiin HindIII:lla ja Ddei:llä ja eristettiin 340 emäsparin Hindlll-Ddel-frag- 30 mentti.

3) Plasmidi pBR322 pilkottiin Pstl:llä, tehtiin tylppäpäiseksi inkuboimalla DNA-polymeraasi I:n kanssa (Klenow-fragmentin kanssa) ja uutettiin sitten HindIII:lla. Suuri (n. 3 600 emäsparin) fragmentti eris- 35 tettiin.

42 8271 3 4) Vaiheissa 1), 2) ja 3) eristetyt fragmentit liitettiin muodostamaan ekspressointiplasmidi pLelF J trp 1.

M. Puhdistus

Valkosoluinterferonin pitoisuutta bakteeriuutteissa 5 voidaan suurentaa peräkkäisillä: 1) polyetyleeni-imiinisaostuksella, jossa suurin osa soluproteiinista interferoni mukaan lukien, jää sakan päällä olevaan nesteeseen; 2) ammoniumsulfaattifraktioinnilla, jossa interfe- 10 roni tulee pois liuoksesta 55-%:isesti kyllästettyyn ammo- niumsulfaattiin; 3) anunoniumsulfaattipelletin suspendoinnilla 0,06 M kaliumfosfaattiin ja 10 mM Tris-HCl:ään (pH 7,2) ja dialyysillä 25 mM Tris-HCl:a (pH 7,9) vastaan (interferoni- 15 aktiivisuus jää liuokseen); 4) edellä saadun päällä olevan nesteen kromatogra- fiällä, jolloin pH on asetettu arvoon 8,5, DEAE-selluloo- sapylväässä (eluoiden NaCltn suoralla gradientilla 0:sta 0,2 mM Tris-HCl:ssä; pH 8,5); 20 5) adsorptiolla Cibachrome Blue Agarose’11a tai hydroksyyliapatiitilla ja eluoimalla 1,5 M KCl:lla tai 0,2 M fosfaattiliuoksella vastaavasti (valinnainen); 6) molekyylien koon mukaisella lajittelulla Sepha-de^® G -75-kolonnilla; ja 25 7) kationinvaihtokromatografiällä CM-selluloosalla 25 mM ammoniumasetaatissa pH-arvossa 5,0, joka on kehitetty ammoniumasetaattigradientilla (0,2 M:ään ammoniumase-taattia).

Edellä esitetty prosessi antaa aineen, jonka puh- 30 taus on yli 95 %.

Aine voidaan puhdistaa myös kokoja poissulkevalla kromatografiällä, käänteisfaasi (RP-8)-suurpainenestekro-matografialla tai affiniteettikromatografialla liikkumattomaksi tehdyillä anti-interferoni-vasta-aineilla.

35 Vaihtoehtoisesti aine edellä vaiheesta 4) voidaan kuormata monoklonaaliseen vasta-ainepylvääseen, joka on 43 8271 3 valmistettu kuten Milstein [Scientific American 243, s. 66 (1989)] on esittänyt, ja eluoida 0,2 M etikkahapolla, 0,l-%:isella Triton*: 11a ja 0,15 NaCl:lla.

Eräässä vaihtoehtoisessa edullisessa suoritusmuo-5 dossa edellä kuvatulla menetelmällä valmistettu valkosolu-interferoni voidaan puhdistaa seuraavin vaihein: 1) Pakastettuja solupellettejä, jotka sisältävät ekspressoidun valkosoluinterferonin, rikotaan käsin tai sopivalla kokoa pienentävällä laitteella. Osittain sula- 10 neet solut suspendoidaan 4 tilavuusosaan puskuria A, joka sisältää 0,1 M Tris:ä, joka on asetettu pH-arvoon 7,5 - 8,0, 10 % (paino/tilav.) sakkaroosia, 0,2 M NaCl:a, 5 mM EDTA:a, 0,1 mM PMSF:a ja 10 - 100 mM MgCl2:a. Suspensiota pidetään n. 4 °C:ssa. Suspensio viedään homogenoijän läpi 15 n. 6 000 psi:ssä, mitä seuraa toinen läpivienti alle 1 000 psi:ssä. Poistovirta homogenoijasta kummastakin ajosta j äähdytetään j äähauteella.

2) Homogenoituun tuotteeseen lisätään hitaasti po-lyetyleeni-imiiniä n. 0,35 %:n pitoisuuteen ja annetaan 20 seistä n. 30 minuuttia. Kiintoaine poistetaan linkoamalla tai suodattamalla. Tämän vaiheen lämpötilaa valvotaan tai se suoritetaan riittävän nopeasti, niin että sakan päällä olevan nesteen (suodoksen) lämpötila pysyy 10 °C:n alapuolella. Sakan päällä oleva neste (suodos) väkevöidään ult-25 rasuodatuksella n. 1/10 osaan alkuperäisestä tilavuudesta. Hiukkasmainen aines tai sumuisuus pidätteessä poistetaan sopivalla suodattimena, kuten mikrohuokoisella membräänillä.

3) Kirkastettu liuos pannaan suoraan monoklonaali-30 seen vasta-ainekolonniin, jonka virtaus on n. 5-8 cm/h (esim. 25 - 40 ml/h 2,6 cm:n läpimittaisessa pylväässä). Kuormittamisen jälkeen pylväs pestään n. 10 pylvään tilavuudella 25 mM Tris-HCl:a (pH 7,5 - 8,5), joka sisältää NaCl:a (0,5 M) ja pinta-aktiivista ainetta, kuten ΤγΙϊοιΦ 35 X-100:aa (0,2-%:ista) tai muuta samanarvoista. Pesun jäl keen pylväs huuhdotaan n. 10 pylvään tilavuudella liuos- 44 8271 3 ta, joka sisältää 0,15 M NaCl:a ja pinta-aktiivista ainetta, kuten Tritori® X-100:aa (0,l-%:ista) tai muuta samanarvoista. Pylväs eluoidaan 0,2 M etikkahapolla, joka sisältää pinta-aktiivista ainetta, kuten Tritori® X-100:aa 5 (0,1-%lista) tai muuta samanarvoista. Proteiinihuippu mo- noklonaalisesta vasta-ainepylväästä (määritettynä UV-ab-sorboituvuudella tai muulla sopivalla määrityksellä) yhdistetään ja pH asetetaan arvoon n. 4,5 IN NaOH:lla tai 0,1 M Tris-emäksellä.

10 4) Yhdistetty interferonihuippu kuormataan katio- ninvaihtajalle, kuten Whatman CM52-selluloosalle tai samanarvoiselle, joka on tasapainotettu sopivalla puskurilla, kuten ammoniumasetaatilla (pH 4,5) (50 mM). Kuormittamisen jälkeen pylvästä pestään tasapainottavalla puskuril-15 la kunnes poistovirtauksen UV-absorboituvuus on saavuttanut tason, jolla vähän lisä-proteiinia eluoituu pylväästä. Pylväs eluoidaan sitten 25 mM ammoniumasetaatti/0,12 M natriumkloridilla tai yhdistelmällä, joka optimoi interferonin talteenoton ja antaa lyofilisoidun kakun, jolla on 20 tyydyttävä ulkonäkö ja tyydyttävät liukoisuusominaisuudet.

Edellä kuvatussa edullisessa suoritusmuodossa käytettyjä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa menetelmin, joita on kuvannut Staehelin et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, ss. 1848 - 1852 (1981)]. Monoklo-25 naaliset vasta-aineet puhdistetaan ja sidotaan kovalentti-sesti Affigel-10:een, kuten seuraavassa selostetaan.

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus ja puhdistus vesivatsanesteestä 5 naaraspuoliseen Balb/c-hiireen istutettiin jokai-30 seen 5 - 10 x 106 hybridoma-solua keskilogaritmisesta kasvuvaiheesta. Noin 5 x 106 elinvoimaista solua, jotka oli saatu hiirten tuottamasta nesteestä, istutettiin vatsaontelon sisäisesti jokaiseen 10:stä tai useammasta hiirestä. Vesivatsanestettä kerättiin toistuvasti (2-4 kertaa) jo-35 kaisesta hiirestä. Siirtoja ja keräämisiä 3:een asti voi- n 45 8271 3 daan suorittaa yhdestä hiiriryhmästä toiseen. Vesivatsa-neste hiiristä yhdistettiin jokaisesta siirrosta.

Solut ja orgaanisten aineiden jätteet poistettiin vesivatsanesteestä linkoamalla pienellä nopeudella (500 -5 1 000 x G) 15 minuuttia. Linkoaminen suoritettiin 90 mi nuutissa kierrosluvulla 18 000 rpm. Sakan päällä oleva neste pakastettiin ja varastoitiin -20 °C:ssa. Sulamisen jälkeen ylimääräinen fibriini ja osasmainen aine poistettiin linkoamalla kierrosluvulla 35 000 rpm 90 minuuttia. 10 Vesivatsanesteen eriä jokaisesta siirrosta testattiin spesifisen vasta-aineaktiivisuuden suhteen kiintofaasi-vasta-aineen sitomismäärityksellä (Staehelin et ai., supra) ja yhdistettiin, jos ne havaittiin tyydyttäviksi.

Proteiinin pitoisuus yhdistetyissä liuoksissa ar-15 vioitiin likiarvioimalla, että 1 mg proteiinia antaa ab-sorboivuuden 1,2 280 nm:ssä kyvetissä, jossa kulkumatka on 1,0 cm. Vesivatsanesteet, joissa on suuret vasta-ainemäärät, sisältävät 30 - 35 mg proteiinia/ml. Tämä vastaa 4 -7 mg spesifistä vasta-ainetta/ml. Neste laimennettiin 20 PBSrllä [0,01 M natriumfosfaattia (pH 7,3) ja 0,15 M NaClra] proteiinipitoisuuteen 10 - 12 mg/ml.

Jokaiseen 100 ml:aan lisättiin hitaasti ja voimakkaasti sekoittaen 0°C:ssa 90 ml huoneen lämpötilassa olevaa kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta. Suspensiota pidet-25 tiin jäissä 40 - 60 minuuttia, lingottiln sitten 15 minuuttia kierrosluvulla 10 000 rpm 4 °C:ssa. Sakan päällä oleva neste dekantoitiin ja valutettiin hyvin. Proteiini-pelletit liuotettiin 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9)/0,04 M NaClriin (puskuri I). Proteiiniliuosta dialysoitiin 16 -30 18 tuntia huoneen lämpötilassa 100 tilavuusosaa vastaan puskuria I ainakin kerran puskuria vaihtaen. Dialysoitua liuosta lingottiln kierrosluvulla 15 000 rpm 10 minuuttia liukenemattoman aineen poistamiseksi. Noin 30 - 35 % alkuperäisestä kokonaisproteiinimäärästä vesivatsanesteessä 35 otettiin talteen, kuten absorptiolla 280 nm:ssä arvioitiin.

«« 82713

Liuos, joka sisälsi 30 - 40 mg proteiinla/ml, pantiin sitten pylvääseen, jossa oli DEAE-selluloosaa, joka oli tasapainotettu puskurilla I. Kutakin lisättyä grammaa kohti proteiinia käytettiin ainakin 100 ml pylväspatjan 5 tilavuutta. Vasta-aine eluoitiin pylväästä suoraviivaisella NaCl-gradientilia, joka sisälsi 0,02 M Tris-HCl:a (pH

7,9) ja 0,04 - 0,5 M NaCl:a. Yhdistetyt huippujakeet, jotka eluoituivat välillä 0,06 - 0,1 M NaCl:a, väkevöitiin seostamalla yhtä suurella tilavuusmäärällä huoneen lämpö-10 tilassa olevaa kyllästettyä ammoniumsulfaattia ja linkoamalla. Proteiinipelletit liuotettiin 0,2 M NaHC03:a (pH n.

8,0)/0,3 M NaCl:a (puskuri II), mitä seurasi dialyysi huoneen lämpötilassa samaa puskuria vastaan, joka vaihdettiin kolmesti. Dialysoituja liuoksia lingottiin 20 000 x G:ssä 15 15 minuuttia kaiken liukenemattoman aineen poistamiseksi.

Proteiinipitoisuus asetettiin välille 20 - 25 mg/ml puskurilla II.

Immunoadsorbenttlen valmistus

Affigel-10:ntä (BioRad Laboratories, Richmond, Ka-20 lifornia) pestiin sintratulla lasisuodattimella kolmesti jääkylmällä tislatulla vedellä. Geeliliete (n. 50-%:inen kylmässä vedessä) siirrettiin muoviputkiin ja sedimentoi-tiin lyhyesti linkoamalla. Sakan päällä oleva neste imettiin pois. Pakkautunut geeli sekoitettiin yhtä suuren ^i-25 lavuusmäärän kanssa puhdistettua vasta-aineliuosta ja pyöritettiin päittäin 4 °C:ssa 5 tuntia. Reaktion jälkeen geeli lingottiin, pestiin sitten kahdesti puskurilla III (0,1 M NaHC03/0,15 M NaCl) kytkemättömän vasta-aineen poistamiseksi. Yhdistettyjen pesunesteiden proteiinimääritys il-30 maisi, että yli 90 % vasta-aineista oli kytkeytynyt geeliin.

Reagoimattomien kohtien tukkimiseksi geeli sekoitettiin yhtä suuren tilavuusmäärän kanssa 0,1 M etanoli-amiini-HCl:a (pH 8) ja pyöritettiin päittäin huoneen läm-35 pötilassa 60 minuuttia. Geeliliete pestiin vapaaksi rea-

II

47 8 2 7 1 3 goivista aineista PBS:llä ja varastoitiin PBS:ään 0,02 %:n (paino/tilav.) natriumatsidia läsnäollessa 4 °C:ssa.

N. Antaminen ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti

LeIF:a voidaan antaa ruoansulatuskanavan ulkopuoli-5 sesti kohteille, jotka ovat kasvaimen vastaisen tai viruksen vastaisen hoidon tarpeessa, ja niille, joilla esiintyy immunosupressiivisia tiloja. Annos ja annostusmäärät voivat olla samankaltaisia, joita tavallisesti käytetään kliinisissä ihmisestä peräisin olevien aineiden tutkimuk-10 sissa, esim. n. 1 - 10 x 106 yksikköä päivittäin, ja kun kysymyksessä ovat aineet, joiden puhtaus on suurempi kuin 1 %, sopivasti esim. 5 x 107 yksikköön asti päivittäin.

Eräänä esimerkkinä sopivasta annosmuodosta pääasiallisesti homogeeniselle bakteeri-LelF:lie ruoansula-15 tuskanavan ulkopuolisesti annettavassa muodossa, liuotetaan 3 mg LeIF:a, jonka ominaisaktiivisuus on esim. 2 x 10® yksikköä/mg 25 ml:aan 5 N ihmisen seerumialbumiinia, liuos viedään bakteriologisen suodattimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisesti 100 ampulliin, joista kukin si-20 sältää 6 x 106 yksikköä puhdasta interferonia, joka on sopiva annettavaksi ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti. Ampulleja varastoidaan edullisesti kylmässä (-20 °C) ennen käyttöä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdisteitä 25 voidaan käsitellä tunnettujen menetelmien mukaisesti farmaseuttisesti hyödyllisten yhdisteiden valmistamiseksi, jolloin tämä polypeptidi yhdistetään seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Sopivia kantajia ja niiden muodostusta on kuvannut E. W. Martin julkaisussa 30 Remington's Pharmaceutical Sciences. Tällaiset yhdistelmät sisältävät tehokkaan määrän tämän keksinnön mukaisesti valmistettua interferoni-proteiinia yhdessä sopivan määrän kanssa kantajaa farmaseuttisesti hyväksyttävien yhdistelmien valmistamiseksi, jotka ovat sopivia tehokkaasti an-35 nettaviksi hoidettavalle kohteelle. Edullinen antotapa on ruoansulatuskanavan ulkopuolinen antaminen.

Claims (15)

48 8271 3

1. Plasmidi, joka pystyy ekspressoimaan ihmisen kypsän valkosoluinterferonin mainitulla plasmidilla trans-5 formoidussa E. colissa, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa ihmisen kypsää valko-soluinterferonia, joka on ihmisen valkosoluinterferoni (LelF) A, B, C, D, F, H, I tai J, jolla on aminohapposekvenssi 10 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Vai Leu His Glu Met Ile

15 Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Vai Ile Gin Gly Vai Gly Vai Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

20 Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu, Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu

25 Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Vai Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Vai Leu Cys Asp Gin Glu Vai Gly

30 Vai Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gin Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu, II 49 8 27 1 3 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Gly Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Arg lie Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu lie Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp, Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg lie Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Pro Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu lie Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu, Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys 50 8271 3 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala G1U lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys lie Phe Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu, Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Met Ala Gin Met Arg Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe Tyr lie Glu Leu Phe Gin Gin Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp, Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Ala Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Pro Asp Phe Gly Leu Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Thr Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cys Val lie Gin Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser lie Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys lie Leu Arg Arg Lys Asp, tai vastaavasti Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Arg Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leii Ala Gin Met Gly Arg lie Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Glu Phe Arg Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gin Phe Gin Lys Thr Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Met lie Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala I! si 8271 3 Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Vai Ile Gin Glu Vai Gly Vai Lys Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Vai Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen 15 kypsää valkosoluinterferonia A (LelF A).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia B (LelF B).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, 20 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia C (LelF C).

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia D (LelF D).

5 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Lys Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp, ja joka DNA-sekvenssi on toiminnallisesti liittynyt pro- 10 moottori-operaattori-alueeseen, joka pystyy aikaansaamaan mainitun interferonin mikrobisen ekspression E. coli-so-luissa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia F (LelF F).

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen 30 kypsää valkosoluinterferonia H (LelF H).

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia I (LelF I).

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, 35 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi koodaa ihmisen kypsää valkosoluinterferonia J (LelF J). 52 8271 3

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pLelF A trp 25, pLelF B trp 7 tai pLelF F trp 1.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, 5 tunnettu siitä, että se on pLelF C trp 35 tai pLelF D trp 11.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on pLelF G tai pLelF H.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, 10 tunnettu siitä, että se on pLelF I trp 1 tai pLelF J trp 1.

14. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen plasmidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että muodostetaan DNA-sekvenssi, joka koodaa patentti- 15 vaatimuksessa 1 määriteltyä ihmisen kypsää valkosoluinter-feronia, ja liitetään tämä toiminnallisesti promoottori-operaattori-alueeseen, joka pystyy aikaansaamaan mainitun interferonin mikrobisen ekspression E. coli-soluissa.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen 20 plasmidin käyttö ihmisen kypsän valkosoluinterferonin valmistukseen transformoitujen E. coli-solujen avulla. li 53 8271 3