JP2642291B2

JP2642291B2 - ハイブリド型ヒト白血球インタフェロンをコードするｄｎａ

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Publication number: JP2642291B2
Application number: JP4349148A
Authority: JP
Inventors: バンノーマンゴエデルデビツド
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Priority date: 1980-11-10
Filing date: 1992-12-28
Publication date: 1997-08-20
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Also published as: IL64243A; LU83745A1; AU7730481A; EP0051873B1; DE3144469A1; FR2493867A1; ES8304200A1; ES506955A0; EP0051873A2; IE812622L; ES8302778A1; FI79550B; NL189092C; DK173590B1; CA1212915A; GB2090258B; EP0051873A3; DOP1981004064A; AU555293B2; SE460539B

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウィルス性および腫瘍
性疾患治療に用いられる、ハイブリド型白血球インタフ
ェロンの、組換えＤＮＡ技術による微生物生産のための
手段に関するものである。さらに特に、本発明は、およ
そ１６５〜１６６個のアミノ酸よりなるポリペプチドで
あって、ヒト白血球インタフェロンＡおよびヒト白血球
インタフェロンＢまたはＤの別々のアミノ酸副配列から
なり、ヒト白血球インタフェロンＡの副配列は前記ポリ
ペプチドのＮ末端に位置しており、そしてこのポリペプ
チドの全アミノ酸配列が天然白血球インタフェロンのア
ミノ酸配列とは異なるポリペプチドをコードする鎖から
なる二重鎖ＤＮＡ、このようなＤＮＡを含有する複製可
能な発現ベクターおよびこのような複製可能な発現ベク
ターで形質転換した細菌に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】本発明の背景についてまず説明する。比
較的均質な白血球インタフェロンは正常な献血者または
白血病給血者の白血球を原料としている。これらのイン
タフェロンはその標的細胞中にウィルス耐性状態を与え
る強い活性により特徴づけられるたん白質の一群であ
る。さらに、インタフェロンは細胞増殖を阻害し、免疫
応答を調整することが出来る。これらの特性により、イ
ンタフェロンがウィルス感染および腫瘍の治療のため治
療剤として、臨床に用いられるようになった。

【０００３】さらに近年では、組換えＤＮＡ技術を用い
て、数多くの異なる白血球インタフェロンの微生物生産
が可能となり、それらインタフェロンのアミノ酸配列
は、ＤａｖｉｄＶ．Ｇｏｅｄｄｅｌら［Ｎａｔｕｒｅ
２９０，２０〜２６（１９８１）］により発表されて
いるように、お互いに７０％程度の相同性を有すること
を示している。それぞれ、ＬｅＩＦＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，
Ｆ，ＧおよびＨと命名された種々の白血球インタフェロ
ンのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、Ｈ．Ｐ．Ｋｏ
ｅｆｆｌｅｒおよびＤ．Ｗ．Ｇｏｌｄｅにより記述され
たＫＧ−１細胞［Ｓｃｉｅｎｃｅ２００，１１５３〜
１１５４（１９７８）］から、ＤａｖｉｄＶ．Ｇｏｅｄ
ｄｅｌおよびＳｉｄｎｅｙＰｅｓｔｋａにより得られ
ている。ＫＧ−１細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ番
号ＣＲＬ８０３１として寄託されている。それらの遺伝
子は、細菌発現のためのプラスミド性ベクターに適当に
挿入され、宿主、好ましくは、Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２
２９４株、ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６（１９７８年
１０月２８日寄託）、を形質転換するのに用いられてい
る。

【０００４】組換えＤＮＡ技術における働き手は、細菌
および他の微生物に存在し、しばしば、一細胞当たり多
数のコピーで存在する非染色体性の環状二重鎖ＤＮＡで
あるプラスミドである。プラスミドＤＮＡ中にコードさ
れる情報には、娘細胞中でプラスミドを複製するのに必
要な情報（即ち、「レプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏ
ｎ）」）および、通常、一種またはそれ以上の選択特
性、たとえば、細菌の場合に、抗生物質に対する抵抗性
のような情報がある。この選択特性の情報により、対象
プラスミドを含有する宿主細胞のクローンを認識し、選
択培地中で優先的に生育させることができる。

【０００５】プラスミドの有用性は、プラスミドＤＮＡ
の異なる部位をそれぞれ認識する一つの、又はいくつか
の制限エンドヌクレアーゼ、すなわち「制限酵素」によ
り特異的に切断されるという点にある。従って、切断部
位または、切断部位に接して再構成した末端に結合する
ことにより、異種遺伝子または遺伝子断片をプラスミド
中に挿入することができる。ＤＮＡの組換えは細胞外で
実施しうるが、出来た“組換え”プラスミドは、形質転
換として知られる方法により細胞内に導入され、その転
換細胞を生育させることにより、異種遺伝子を含む組換
えプラスミドを大量に得ることができる。更に、その異
種遺伝子がプラスミド内の、コードされるＤＮＡ情報の
転写および翻訳を支配する部位に対して正しく挿入され
る場合には、出来た発現ベクターは、挿入された遺伝子
がコードするポリペプチド配列を実際に生産すること、
即ち、発現と称されるプロセスに使用される。

【０００６】発現は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識さ
れ、結合を受けるプロモーターとして知られる領域で始
まる。例えば、本発明の実施において選択されているト
リプトファンまたは「ｔｒｐ」プロモーターのように、
ある場合には、プロモーター領域は「オペレーター」領
域と重なり、両者が結合したプロモーター−オペレータ
ーを形成している。オペレーターは、特定のプロモータ
ーにおける転写開始の頻度を調節する役割を果す、いわ
ゆるレプレッサーたん白により認識されるＤＮＡ配列で
ある。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡに沿って移動し、コ
ード鎖に含まれる情報を、その５′末端から３′末端へ
とｍＲＮＡに転写し、代わって、ｍＲＮＡがＤＮＡのコ
ードするアミノ酸配列を有するポリペプチドに翻訳され
る。

【０００７】個々のアミノ酸はヌクレオチドトリプレッ
トまたは「コドン」によりコードされ、それらは、本発
明において、「構造遺伝子」、即ち発現される生成物の
アミノ酸配列をコードする部分、と呼ばれる部分に存在
する。ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターに結合後に、
先ずリボゾーム結合部位をコードするヌクレオチドを転
写し、次いで、翻訳開始すなわち「開始」シグナル（通
常はＡＴＧで、ｍＲＮＡではＡＵＧとなる）を、続い
て、構造遺伝子自体のヌクレオチド、コドンを転写す
る。

【０００８】構造遺伝子の末端で、いわゆる停止コドン
が転写され、その後、ポリメラーゼはｍＲＮＡの追加配
列を形成することがあるが、停止シグナルが存在するた
めその配列はリボゾームで翻訳されない。リボゾームは
ｍＲＮＡ上にある結合部位に結合し、細菌においては通
常、ｍＲＮＡが形成されながら結合する。そして、翻訳
開始シグナルから始まり、前記の停止シグナルで終了す
る、コードされたポリペプチドを生成する。リボゾーム
結合部位をコードする配列がＡＵＧ開始コドンに対して
適切に位置し、かつ、残る全てのコドンが開始コドンに
続くなら、目的の生成物が生産される。この生成物は、
宿主細胞を溶解し、適当な精製により他の細菌たん白質
から採取することにより得ることができる。

【０００９】

【発明の開示】本発明の概略を以下に説明する。種々の
白血球インタフェロンをコードする遺伝子の塩基配列を
調べてみると、それらの多くが、ある制限エンドヌクレ
アーゼにより認識される切断部位の存在とその位置の点
で、共通性が高いことがわかる。本発明はこの共通性を
利用して、組換えＤＮＡ技術により、ハイブリッド型白
血球インタフェロンの微生物生産に有用な新規ハイブリ
ッド遺伝子を作製するものであり、これらのハイブリッ
ド型白血球インタフェロンは、親遺伝子がコードするイ
ンタフェロンが有する抗ウィルス性および他の性質を、
より以上の程度で或いはより低い程度で示す。本発明の
有利な具体例においては、ハイブリッド型白血球インタ
フェロンは、親遺伝子によりコードされるインタフェロ
ンに比較し、高い活性を示す。

【００１０】本発明が企図する白血球インタフェロンた
ん白群をコードする親白血球インタフェロン遺伝子は、
個々に天然配列変化を示している。これらの変化は、全
たん白配列中でのアミノ酸の差、或いはこの配列中にお
けるアミノ酸の欠失、置換、挿入、転換、或いは追加な
どにより起っている。ＬｅＩＦＡ，ＬｅＩＦＢ，・
・・ＬｅＩＦＪ等の略号で示されるこの親白血球イン
タフェロンの個々に対する配列変化は、本発明で定義さ
れる略号又は語の範囲内に含まれる。

【００１１】本発明の目的物およびその利点は以下に記
載される詳細な説明および添付図面により明確となる。
図および表について説明する。第１表は、８種の白血球
インタフェロン（「ＬｅＩＦ」）の相補ＤＮＡ（「ｃＤ
ＮＡ」）クローンのコード領域の塩基配列を示す。これ
らの中で、ＬｅＩＦＥと命名されるものは「偽遺伝子」
であり、活性白血球インタフェロンをコードしていない
し、又ＬｅＩＦＧと命名されているものは、対応する
インタフェロン種の全長より短い配列しか含んでいな
い。翻訳開始コドンＡＴＧおよび停止トリプレットは各
ＬｅＩＦ中で下線で示す。

【００１２】図１は、８種のＬｅＩＦｃＤＮＡクロー
ン（ＡからＨ）の制限エンドヌクレアーゼ切断地図を示
す。クローンを含むプラスミドはｄＣ：ｄＧ法〔Ｄ．
Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８７，４１１
〜４１６（１９８０）〕により作製された。従って挿入
ｃＤＮＡはＰｓｔＩにより切除され得る。即ち、挿入部
の各末端はＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位で
ある。各ｃＤＮＡ挿入物の端の線はｄＣ：ｄＧ末端のホ
モポリマーを示す。ＰｖｕII，ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ
IIの制限部位の位置を示してある。点々部分は、成熟Ｌ
ｅＩＦのコード配列を表わす。又、斜線部分は、シグナ
ルペプチドをコードする配列を、又白い部分は、３′お
よび５′の非コード配列を示す。

【００１３】第２表は、塩基配列から推定される８種の
ＬｅＩＦのたん白配列の比較を示す。ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
ＢＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅが推奨する一文字略号を
用いている。Ａ，アラニン；Ｃ，システイン；Ｄ，アス
パラギン酸；Ｅ，グルタミン酸；Ｆ，フェニルアラニ
ン；Ｇ，グリシン；Ｈ，ヒスチジン；Ｉ，イソロイシ
ン；Ｋ，リジン；Ｌ，ロイシン；Ｍ，メチオニン；Ｎ，
アスパラギン；Ｐ，プロリン；Ｑ，グルタミン、Ｒ，ア
ルギニン；Ｓ，セリン；Ｔ，スレオニン；Ｖ，バリン；
Ｗ，トリプトファン；およびＹ，チロシンである。

【００１４】数字はアミノ酸の位置を示す（Ｓはシグナ
ルペプチドを指す）。１６５個のアミノ酸より成るＬｅ
ＩＦＡの４４番目の位置に横線があるのは、他のＬｅ
ＩＦの１６６個のアミノ酸配列と合わせるためである。
ＬｅＩＦＥの配列は、コード領域の余分の塩基（第１
表の１８７番目）を無視して決定した。星印は停止コド
ンを示す。全てのＬｅＩＦ（偽遺伝子のＬｅＩＦＥは
除く）に共通なアミノ酸も示してある。下線を施したも
のはヒト線維芽細胞インタフェロンにも存在するアミノ
酸である。

【００１５】第１表の＋１から６９までの塩基は第２表
のＳ１からＳ２３のアミノ酸に対応する。第１表のＴＧ
Ｔコドン（７０から７２の塩基）は第２表のシステイン
（Ｃ，アミノ酸１）に対応する。第２表で、ＰｖｕII制
限エンドヌクレアーゼ切断部位は、ＬｅＩＦＡ，Ｂ，
Ｄ，ＦおよびＧで９２と９３のアミノ酸のコドンの間、
即ち、第１表の３４６と３４７の塩基の間に存在する。

【００１６】第３表は、成熟白血球インタフェロンＡお
よびＤのアミノ酸配列の比較を示す。ＬｅＩＦＡの４
４番目のアミノ酸の欠失は横線で表わしている。ＬｅＩ
ＦＤのアミノ酸の中で、対応するＬｅＩＦＡのアミノ
酸と異なるもののみ記してあり、他の部分は、ＬｅＩＦ
Ｄのアミノ酸配列はＬｅＩＦＡと同一である。第３
表はさらに、本発明で選択されるハイブリッド型白血球
遺伝子を作製するのに採用されるＢｇｌIIおよびＰｖｕ
II制限酵素切断部位の遺伝子に対応する位置も示してい
る。

【００１７】図２および図３は、本発明で選択されるハ
イブリッド型白血球インタフェロン（「ＬｅＩＦ−Ａ／
Ｄ」）マウス細胞における脳心筋炎ウィルス（「ＥＭ
Ｃ」）および水疱性口内炎ウィルス（「ＶＳＶ」）に対
する活性の比較試験の結果を示すグラフである。

【００１８】図４および図５は、それぞれマウスおよび
ハムスターでのＥＭＣウィルス感染に対するＬｅＩＦ−
Ａ／Ｄおよび他のインタフェロンの活性の比較試験の結
果を示すグラフである。図４のデータは、感染３時間前
にｉ．ｐ．投与した結果である。ＬｅＩＦ−Ａ／Ｄおよ
びＬｅＩＦ−Ａの投与量は、ＷＩＳＨ細胞で測定したも
のである。第４表は、タイプＩおよびＪを含む５種のＬ
ｅＩＦたん白のＤＮＡ配列を示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】

【表２】

【００２１】

【表３】

【００２２】

【表４】

【００２３】

【表５】

【００２４】

【表６】

【００２５】

【表７】

【００２６】

【表８】

【００２７】

【実施例】次に、本発明を実施するための有利な具体例
を示す。Ａ．使用微生物記載した実施において２種の微生物を用いている。米国
特許４１９０４９５に記載のＥ．ＣｏｌｉＸ１７７６
および、英国特許公報No. ２０５５３８２記載のＥ．Ｃ
ｏｌｉＫ−１２２９４株（ｅｎｄＡ，ｔｈｉ^-，
ｈｓｒ^-，ｈｓｍ⁺ｋ）である。それぞれ、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに１９７９年７月３日、および１９７８年１０月２
８日寄託のＡＴＣＣ番号３１５３７および３１４４６と
して寄託されている。全ての組換えＤＮＡ実験はＮａｔ
ｉｏｎａｌＪｕｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ
のガイドラインに従って行なった。

【００２８】本発明の最も有利な具体例としては、上述
のＥ．ＣｏｌｉＸ１７７６およびＥ．ＣｏｌｉＫ−
１２２９４株に関して記載するが、本発明は、他の公
知のＥ．Ｃｏｌｉ株、例えばＥ．ＣｏｌｉＢ或いは他
の微生物菌株を含むもので、それらの多くは、公認の微
生物寄託機関、たとえば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ，
に寄託され、入手可能である。（ＡＴＣＣカタログリス
トおよびドイツ特許２６４４４３２を参照のこと。）他
の微生物としては、たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓのようなＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳｅｒｒａ
ｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓを例として挙げられる腸
内細菌があり、これらは、複製可能で異種遺伝子配列を
発現することのできるプラスミドを利用する。Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵
母も、酵母のプロモータ制御下にインタフェロンたん白
をコードする遺伝子を発現することにより、インタフェ
ロンたん白生産のための宿主菌として有利に用いられ
る。

【００２９】本発明によると、ＬｅＩＦのハイブリドは
個々の親遺伝子に共通に存在する制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位とその各末端を発現プラスミド担体（ベクタ
ー）の同じ部位と共に利用することにより作製される。
例えば、ＬｅＩＦＡｔｒｐ２５発現プラスミドのＸ
ｂａＩからＰｓｔＩまでの大きい断片（約３９００ｂ
ｐ）を種々のＬｅＩＦ親遺伝子のＸｂａＩからＰｖｕII
およびＰｖｕからＰｓｔＩ切断断片と結合することによ
り、対応するハイブリッドＬｅＩＦを得るのに使用でき
る発現プラスミドを供給することが出来る。

【００３０】各ＬｅＩＦ発現プラスミドは、各種ＬｅＩ
Ｆプラスミド、ｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５，ｐＬｅ
ＩＦＢｔｒｐ７，ｐＬｅＩＦＣｔｒｐ３
５，ｐＬｅＩＦＤｔｒｐ１１，ｐＬｅＩＦ
Ｆｔｒｐ１，ｐＬｅＩＦＧ，ｐＬｅＩＦＨ
およびｐＬｅＩＦＩ等、或いはＰＢＲ３２２より分
離される消化断片から個別に作製された。上記各種Ｌｅ
ＩＦプラスミドの作製はＮａｔｕｒｅ２８７，４１１
（１９８０）に、又ｐＢＲ３２２の作製はＧｅｎｅ２，
９５（１９７７）に記載されている。これらのプラスミ
ドのあるものでの、“ｔｒｐ”というのは、バクテリア
の発現に最も有利なトリプトファンのプロモーターオペ
レータ系を示し、それは、ヨーロッパ特許出願No. ３６
７７６に記載されている。

【００３１】Ｂ．第一の成熟白血球インタフェロンの直
接発現ＬｅＩＦＡを直接成熟インタフェロンポリペプチドと
して発現するため、合成（Ｎ−末端）および相補ＤＮＡ
の組み合せを用いた。

【００３２】Ｓａｕ３ａ制限エンドヌクレアーゼ部位が
ＬｅＩＦＡの第一番目と第二番目のコドンの間に幸い
存在している。ＡＴＧ翻訳開始コドンを含み、第一番目
のアミノ酸（システイン）のコドンを保持し、かつＥｃ
ｏＲＩの接着末端を構成するような２つの合成デオキシ
オリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴマをｐ
Ｌ３１のＳａｕ３ａ−ＡｖａIIの３４ｂ．ｐ．断片と結
合した。出来た４５ｂ．ｐ．の産物に２つのＤＮＡ断片
を結合して８６５塩基対を有するＬｅ−ＩＦＡをコード
し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで結合され合成−天然ハ
イブリド遺伝子を構成した。この遺伝子をｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位の間に挿入してプラス
ミドｐＬＥ−ＩＦＡ１を得た。

【００３３】プラスミドＰＧＭ１は、ΔＬＥ１４１３を
欠失するＥ．ｃｏｌｉトリプトファンオペロンを有し
〔Ｇ．Ｆ．ＭｉｏｚｚａｒｉらＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ１３３，１４５７−１４６６（１９７８）〕、従
って、ｔｒｐリーダーの最初の６コのアミノ酸とｔｒｐ
Ｅポリペプチドの後の約３分の１の融合たん白（以
後ＬＥ′と呼ぶ）とさらにｔｒｐＤポリペプチドの全
長とをｔｒｐプロモーターオペレータ系の制御の下に発
現する。このプラスミド２０μｇを制限酵素ＰｖｕIIで
消化すると、プラスミドは５ケ所で切断される。

【００３４】次に、遺伝子断片にＥｃｏＲＩリンカー
（自己相補オリゴヌクレオチド：ｐＣＡＴＧＡＡＴＴＣ
ＡＴＧより成る）を結合し、後に、ＥｃｏＲＩ部位を
有するプラスミドにクローン化する際のＥｃｏＲＩ部位
を供与する。ｐＧＭ１より得られたＤＮＡ断片２０μｇ
を、２００ｐｍｏｌｅの５′−りん酸化合成オリゴヌク
レオチドｐＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧ存在下、２０μｌ
のＴ４リガーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス、pH７．６，
０．５ｍＭＡＴＰ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭジ
チオスライトール）中、４℃で一晩、１０ユニットのＴ
４リガーゼと反応させる。反応液を７０℃、１０分間加
熱して反応を停止する。リンカーはＥｃｏＲＩ消化で切
断し、ＥｃｏＲＩ末端を有する断片を５％ポリアクリル
アミド電気泳動（以後“ＰＡＧＥ”という）で分離す
る。

【００３５】ゲルを先ずエチジウムブロマイドで染色
し、紫外線で位置を確認し、必要な部分をゲルから切り
とることにより、大きな３つの断片を単離する。各ゲル
断片を、３００μｌの０．１×ＴＢＥと透析袋に入れ、
１００Ｖで１時間、０．１×ＴＢＥ緩衝液中で電気泳動
にかける。ＴＢＥ緩衝液は、１Ｌ中１０．８ｇトリス塩
基、５．５ｇホウ酸、０．０９ｇＮａ₂ＥＤＴＡを含
む。透析袋中の水溶液を集め、フェノールで抽出し、ク
ロロホルム抽出し０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液とし、エ
タノールによる沈でん後に、水中にＤＮＡが回収され
る。ｔｒｐプロモーターオペーレータを含み、ＥｃｏＲ
Ｉ接着末端を有する遺伝子は、以下に述べるように、断
片をテトラサイクリン感受性プラスミドに挿入し、それ
にプロモーターオペレータを挿入することによりテトラ
サイクリン耐性となるような方法で確認される。

【００３６】プラスミドｐＢＲＨ１（Ｒ．Ｉ．Ｒｏｄｒ
ｉｇｕｅｚら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ６，３２６７〜３２８７〔１９７９〕）は、
アンピシリン耐性を発現し、テトラサイクリン耐性遺伝
子を含むが、付随したプロモータがないため、その耐性
を発現しない。従って、このプラスミドはテトラサイク
リン感受性である。ＥｃｏＲＩ部位にプロモーターオペ
レータ系を入れることにより、このプラスミドはテトラ
サイクリン耐性となる。

【００３７】ｐＢＲＨ１をＥｃｏＲＩで消化し、酵素を
フェノール抽出およびクロロホルム抽出により除去し、
エタノールによる沈でん後に、水中に回収できる。得ら
れるＤＮＡ分子を、それぞれ別の反応液中で、上述の３
つのＤＮＡ断片のそれぞれと組み合せ、既に記載したと
おり、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合する。反応液中に存在
するＤＮＡを用い、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２２９４株
（Ｋ．Ｂａｃｋｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｅｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，４１７４−４１９８
〔１９７６〕）を標準の方法（Ｖ．Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌ
ｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７１，３４５５−３４５９〔１９７４〕）により形
質転換し、バクテリアを２０μｇ／mlのアンピシリンお
よび５μｇ／mlのテトラサイクリン含有のＬＢプレート
にまく。いくつかのテトラサイクリン−耐性コロニーを
選択し、プラスミドＤＮＡを単離して、制限酵素による
分析で目的の断片を確認する。このようにして得られた
プラスミドをｐＢＲＨｔｒｐと命名する。

【００３８】肝炎ウィルスの遺伝子のＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨＩ消化産物を従来の方法でとり、プラスミドｐ
ＧＨ６（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ
２８１，５４４〔１９７９〕）のＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩ部位にクローンして、プラスミドｐＨＳ３２を得
た。プラスミドｐＨＳ３２をＸｂａＩで切断し、フェノ
ール抽出、クロロホルム抽出およびエタノール沈でんを
行なう。次に、０．１ｍＭｄＴＴＰおよび０．１mM
ｄＣＴＰを含む３０μｌのポリメラーゼ緩衝液（５０mM
りん酸カリ、pH７．４，７mM ＭｇＣｌ₂，１mMβ−メ
ルカプトエタノール）中にて、Ｅ．Ｃｏｌｉポリメラー
ゼＫｌｅｎｏｗ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）１μｌで処理する。この処理により、Ｘｂｅ
Ｉの切断部位の突出５′−末端の４塩基の中の２個に相
補塩基をうめる。

【００３９】ｄＣおよびｄＴの二つの塩基がとり込ま
れ、５′末端に２個の塩基が突き出た形になる。このプ
ラスミドｐＨＳ３２の直線鎖（フェノールおよびクロロ
ホルム抽出後、エタノール沈でんの後、水に回収）をＥ
ｃｏＲＩで切断する。小さい、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断
片から大きいプラスミド断片をＰＡＧＥにより分離し、
電気溶出により単離する。このｐＨＳ３２からのＤＮＡ
断片（０．２μｇ）を、上述の方法と同じような条件下
で、ｐＢＲＨｔｒｐに由来するトリプトファンオペロ
ンのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ断片（約０．０１μｇ）と結
合する。上記のようにｐＨＳ３２からの断片と、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＴａｑＩ断片とを結合する際、ＴａｑＩの突出末
端は、ワトソン−クリックの塩基対で相補性がないが、
ＸｂａＩの残突出末端と結合する。

【００４０】この結合反応液の一部でＥ．Ｃｏｌｉ２９
４細胞を形質転換し、加熱処理後アンピシリン含有のＬ
Ｂプレートにまく。２４個のコロニーを選択し、３mlの
ＬＢ培地で生育させ、プラスミドを単離する。この中の
６個は、ＸｂａＩ部位がＥ．ＣｏｌｉのＤＮＡ複修およ
び複製により再生されていた。 ───ＴＣＴＡＧＡ─── ────ＴＣＴＡＧＡ──── ───ＡＧＣＴＣＴ─── ────ＡＧＡＴＣＴ──── これらのプラスミドはＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩで切断
されることがわかり、制限断片も予想されるものが得ら
れた。ｐｔｒｐ１４と命名されたプラスミドを、以
下に述べる異種ポリペプチドの発現に用いた。

【００４１】プラスミドｐＨＧＨ１０７（Ｄ．Ｖ．Ｇｏ
ｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１，５４４〔１９７
９〕）は、合成ＤＮＡ断片より作られた２３コのアミノ
酸コドンと、ヒト生長ホルモンのｍＲＮＡの逆転写によ
り作製した相補ＤＮＡから得られた１６３個のアミノ酸
コドンとから作られたヒト生長ホルモンの遺伝子を含ん
でいる。この遺伝子はヒト生長ホルモンの“プレ”配列
のコドンを欠失しているが、ＡＴＧ翻訳開始コドンは有
している。遺伝子は１０μｇのｐＨＧＨ１０７から、Ｅ
ｃｏＲＩ処理、Ｅ．ＣｏｌｉポリメラーゼＩＫｌｅｎ
ｏｗ断片およびｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ処理により、上述の
とおり単離された。プラスミドは、フェノールおよびク
ロロホルム抽出、エタノール沈でんの後、ＢａｍＨＩで
処理した。

【００４２】ヒト成長ホルモン（「ＨＧＨ」）含有遺伝
子断片は、ＰＡＧＥおよび電気溶出により単離した。こ
のようにして得られるＤＮＡ断片は、テトラサイクリン
耐性構造遺伝子の最初の３５０塩基を含有するが、テト
ラサイクリンのプロモーターオペレータ系を欠如してい
るため、発現プラスミドにクローン化する際、挿入ＤＮ
Ａを含むプラスミドをテトラサイクリン耐性の回復で確
認することが出来る。又、断片のＥｃｏＲＩ末端はＫｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼＩ法により修復されているので、
この断片は一つの平滑末端と一つの接着末端を有し、従
って後に発現プラスミドに挿入される時、正しい方向に
結合され得る。

【００４３】次に、上記のとおり得られたＨＧＨ遺伝子
含有断片を入れるための発現プラスミドｐｔｐｒ１４
を作製した。ｐｔｒｐ１４をＸｂａＩで消化し、接着
末端をｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを
用いたＫｌｅｎｏｗポリメラーゼＩ法により修復する。
フェノールおよびクロロホルム抽出、エタノール沈でん
の後、得られるＤＮＡをＢａｍＨＩで処理し、ＰＡＧＥ
および電気溶出によりプラスミドの大断片を単離する。
このｐｔｒｐ１４由来の断片は一つの平滑末端と、一
つの接着末端を有するため、前述のＨＧＨ遺伝子含有断
片との組み換えを正しい方向性で行なうことが出来る。

【００４４】ＨＧＨ遺伝子断片と、ｐｔｒｐ１４ΔＸ
ｂａ−ＢａｍＨＩ断片を組み合せ、前述の条件と同じよ
うな条件で結合する。修復ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ末
端を平滑末端結合により結合し、ＸｂａＩおよびＥｃｏ
ＲＩ部位を再構成する。

【００４５】この構成によりテトラサイクリン耐性遺伝
子も再生される。それは、プラスミドｐＨＧＨ１０７は
テトラサイクリン耐性をＨＧＨ遺伝子より上流に存在す
るプロモータ（Ｌｅｃプロモータ）にて発現するため、
この構成（ｐＨＣＨ２０７と命名）によりテトラサイク
リン耐性の遺伝子の発現がトリプトファンプロモーター
オペレータの調節下に行なわれるからである。そこで、
結合混合液でＥ．Ｃｏｌｉ２９４株を形質転換し、コロ
ニーを５μｇ／mlテトラサイクリン含有のＬＢプレート
上で選択する。

【００４６】プラスミドｐＨＧＨ２０７をＥｃｏＲＩで
消化し、３００ｂ．ｐ．のＥｃｏＲＩ断片を含むｔｒｐ
プロモーターを、ＰＡＧＥおよび電気溶出により回収し
た。この３００ｂ．ｐ．のＥｃｏＲＩ断片はＥ．Ｃｏｌ
ｉのｔｒｐプロモータ、オペレータおよびｔｒｐリーダ
ーリボゾーム結合部位を含有するが、翻訳開始のＡＴＧ
配列を欠失している。このＤＮＡ断片をｐＬｅ−ＩＦＡ
のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。

【００４７】ここで、言及したｔｒｐ断片は、調節可能
に発現程度が高められるよう、いわゆるｔｒｐアテニュ
エーターを欠失させたＥ．Ｃｏｌｉトリプトファンオペ
ロンの類似体である。修復ｔｒｐ制御遺伝子含有の発現
プラスミドを、そのプロモーターオペレータ系を抑制す
るのに十分量のトリプトファンを添加した栄養培地で、
予め決めておいた程度まで発育させ、次に系の抑制を解
除するためトリプトファンを除去すると、目的産物が発
現され得る。

【００４８】さらに具体的に言うと、２５０μｇのプラ
スミドｐＬ３１をＰｓｔＩで消化し、１０００ｂ．ｐ．
の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
て単離する。およそ４０μｇの挿入物をゲルから電気溶
出し、３つに分けてさらに消化した。a)この１６μｇを
４０ｕｎｉｔｓのＢｇｌIIにより３７℃で４５分間部分
消化し、反応液を６％ポリアクリルアミドゲルで精製す
る。約２μｇの目的の６７０ｂ．ｐ．断片を得た。b)次
の８μｇの１０００ｂ．ｐ．ＰｓｔＩ挿入物をＡｖａII
およびＢｇｌIIで制限切断する。電気泳動の後、１５０
ｂ．ｐ．の断片１μｇを得た。

【００４９】c) １６μｇの１０００ｂ．ｐ．断片をＳ
ａｕ３ａおよびＡｕａIIで処理する。１０％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動後、約０．２５μｇ（〜１０ｐ
ｍｏｌｅ）の３４ｂ．ｐ．断片を得た。二つのデオキシ
オリゴヌクレオチド、５′−ｄＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴ
（断片１）および５′−ｄＧＡＴＣＡＣＡＣＡＴＧ（断
片２）をりん酸トリエステル法（ｍａｘａｍおよびＧｉ
ｌｂｅｒｔ，ｍｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６５，
４９９−５６０〔１９８０〕）により合成した。

【００５０】断片２を以下のとおりりん酸化した。２０
０ml（〜４０ｐｍｏｌｅ）の（ｒ³²ｐ）ＡＴＰ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ，５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を乾燥し、再
び１００ｐｍｏｌｅのＤＮＡ断片および２ユニットのＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０μｌの６０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（pH８）、１０mM ＭｇＣｌ₂，１５mM
β−メルカプトエタノールにけん濁した。３７℃、１５
分後、１μｌの１０mMＡＴＰを加え、さらに１５分間反
応を続けた。次に、反応液を７０℃、１５分加熱し、１
００ｐｍｏｌｅの５′−ＯＨ断片１および１０ｐｍｏｌ
ｅの３４ｂ．ｐ．Ｓａｕ３ａ−ＡｖａII断片と合わせ
た。

【００５１】結合は、５０μｌの２０mMトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）、１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mMジチオスラ
イトール、０．５mM ＡＴＰおよび１０ユニットのＴ４
ＤＮＡリガーゼ中で４℃において５時間行なった。反
応液を６％ポリアクリルアミド上電気泳動し、４５ｂ．
ｐ．の産物を電気溶出にて回収した。８６０，０００Ｃ
ｅｒｅｎｋｏｖｃｐｍを回収し、（〜３０ｎｇ，１ｐ
ｍｏｌｅ）、０．５μｇ（５ｐｍｏｌｅ）の１５０ｂ．
ｐ．ＡｖａII−ＢｇｌII断片および１μｇ（２ｐｍｏｌ
ｅ）の６７０ｂ．ｐ．ＢｇｌII−ｐｓｔＩ断片と合わせ
た。

【００５２】結合反応は、２０ユニットのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用い、２０℃で１６時間行なった。リガーゼは
６５℃で１０分の加熱により不活化した。次に反応液を
ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化して遺伝子ポリマーを
除去した。反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製した。３６，０００ｃｐｍ（〜０．０４ｐ
ｍｏｌｅ，２０ｎｇ）の８６５ｂ．ｐ．産物を単離し
た。この半分（１０ｎｇ）をｐＢＲ３２２（０．３μ
ｇ）のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ部位の間に結合した。Ｅ．
Ｃｏｌｉ２９４株を形質転換し、７０コのテトラサイク
リン耐性、アンピシリン感受性形質転換株が得られた。

【００５３】これらの形質転換株の１８株からプラスミ
ドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し
た。１８個の中の１６個のプラスミドが８６５ｂ．ｐ．
の長さのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を持っていた。これ
らの一つ（ｐＬｅＩＦＡ１）の１μｇをＥｃｏＲＩで
切断し、前述のように調製した、Ｅ．Ｃｏｌｉｔｒｐ
プロモータおよびｔｒｐリーダーリボゾーム結合部位含
有の３００ｂ．ｐ．ＥｃｏＲＩ断片（０．１μｇ）と結
合した。ｔｒｐプロモータを含む形質転換株は、３２Ｐ
−ｔｒｐプローブと、Ｇｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｕｅｓ
ｓコロニー選択法〔Ｇｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）７２，３９６１
（１９７５）〕との組み合せて用いて確認された。ｔｒ
ｐ断片中にＸｂａＩ部位が非対称的に存在することか
ら、ｔｒｐプロモーターがＬｅＩＦＡ遺伝子の方向に正
しく位置する組み換え体を決めることができる。

【００５４】ＩＦ分析用の抽出物は、以下のように調製
した。１mlの培養物を、５μｇ／mlのテトラサイクリン
含有Ｌ−ブロス中でＡ５５０が約１．０となるまで培養
し、次に、５μｇ／mlのテトラサイクリン含有のＭ９培
地２５mlに希釈した。Ａ５５０が１．０になった時１０
mlを遠心分離により採収し、細胞を１mlの１５％蔗糖、
５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．０）５０mM ＥＤＴＡに
けん濁する。１mgのリゾチームを添加し、０℃で５分後
に、細胞を超音波処理により破砕した。これをＳｏｒｖ
ａｌｌＳＭ−２４ローター中１５，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離する。上澄液のインタフェロン活性を細
胞病理効果（ＣＰＥ）阻害分析によりＬｅ−ＩＦ標準と
比較して測定した。細胞当りのインタフェロン分子の数
を決定するには、Ｌｅ−ＩＦの比活性４×１０⁸ｕｎｉ
ｔ／mgを使用した〔Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６，６
４０（１９７９）〕。

【００５５】ｔｒｐプロモーターが望む方向に挿入され
ているクローンｐＬｅ−ＩＦＡｔｒｐ２５は高い程度
の活性（リットル当たり２．５×１０⁸ユニット）を示
した。Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２２９４株／ｐＬｅ−Ｉ
ＦＡｔｒｐＡの生産するＩＦは、標準のヒトＬｅ
−ＩＦと同じような挙動を示した。これは、pH２の処理
に対して安定であり、ウサギの抗ヒト白血球抗体により
中和された。このインタフェロンは、およそ２０，００
０の分子量を有する。

【００５６】Ｃ．他の白血球のインタフェロンのｃＤＮ
Ａの分離完全に分析されているＬｅ−ＩＦＡ含有プラスミドか
らのＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、電気泳動で単離し、既
報の方法〔Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ．４４２，３２４（１９７６）〕によ
り³²Ｐでラベルした。得られた放射活性標識ＤＮＡをプ
ローブとして用いて、上記Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎらのコロ
ニー選択法により、他のＥ．Ｃｏｌｉ２９４形質転換株
をスクリーニングした。プローブと種々の量でハイブリ
ダイズするコロニーを単離した。これらのコロニーから
のプラスミドＤＮＡおよび上記に言及した１０個のハイ
ブリド形成コロニーからのプラスミドをＰｓｔ切断で単
離し、３つの異なる方法で解析した。

【００５７】先ず、これらのＰｓｔ断片を、ＢｇｌII、
ＰｖｕIIおよびＥｃｏＲＩの制限エンドヌクレアーゼ消
化パターンにより解析した。この分析により、少なくと
も８つの異なるタイプに分類できた。Ｌｅ−ＩＦＡ，
Ｌｅ−ＩＦＢ，Ｌｅ−ＩＦＣ，Ｌｅ−ＩＦＤ，Ｌｅ
−ＩＦＥ，Ｌｅ−ＩＦＦ，Ｌｅ−ＩＦＧおよびＬ
ｅ−ＩＦＨであり、これにより、種々の制限酵素切断
の位置をＬｅ−ＩＦＡのこれまでに明かなプレ配列及び
コード配列に対応しておよそ決められる。これらの中の
一つ、Ｌｅ−ＩＦＤ，はＮａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ２８４，３１６（１９８０）に報告されているものと
同一と考えられる。

【００５８】第二に、ＤＮＡのいくつかは、既報のハイ
ブリド化選択分析（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら、Ｃｅｌｌ２
０，９５〔１９８０〕）により、ポリ−Ａ含有ＫＧ−１
細胞ＲＮＡからＬｅ−ＩＦｍＲＮＡを選択的に除去す
る能力を試験した。Ｌｅ−ＩＦＡ，Ｂ，ＣおよびＦは
この分析で陽性であった。第三に、後のＰｓｔ断片を発
現プラスミドに挿入し、そのプラスミドでＥ．Ｃｏｌｉ
２９４株を形質転換して、その断片を発現させた。発現
産物はプレインタフェロンと考えられ、ＣＰＥ分析のイ
ンタフェロン活性が陽性であった。但し、Ｌｅ−ＩＦ
Ｆ断片の場合は、わずかな活性であった。上記に加え、
全てのＬｅＩＦタイプに関してＤＮＡ配列決定をした。

【００５９】Ｄ．第二の成熟白血球インタフェロン成熟Ｌｅ−ＩＦＢを含む断片の配列から、タイプＡとタ
イプＢの最初の１４個の塩基が同一であることがわか
る。そこで、ｔｒｐ−プロモーターオペレータ、リボゾ
ーム結合部位およびＬｅ−ＩＦ（Ａ＝Ｂ）遺伝子を有す
るｐＬｅ−ＩＦＡ２５からの断片を単離し、これと残り
部分のＢ配列とを発現プラスミド中で結合することを考
えた。

【００６０】約９５０ｂ．ｐ．のＳａｕ３ａ−ＰｓｔＩ
断片を得るために、いくつかの段階が必要であった。そ
れは、Ｓａｕ３ａ制限部位が一つ以上邪魔して存在して
いるからである。1. 次の断片を単離した。 a) Ｓａｕ３ａからＥｃｏＲＩまでの１１０ｂ．ｐ． b) ＥｃｏＲＩからＸｂａまでの１３２ｂ．ｐ． c) ＸｂａからＰｓｔまでの７００ｂ．ｐ．以上 2. 断片（１ａ）と（１ｂ）を結合し、ＸｂａとＢｇｌ
IIで切断してＳａｕ３ａとＸｂａ末端を介しての自己ポ
リマー化を妨げた（Ｓａｕ３ａ部位はＢｇｌII部位内に
存在；ＢｇｌII切断によりＳａｕ３ａの接着末端が保存
される）２４２ｂ．ｐ．の断片を単離した。

【００６１】3. (2) の産物と（１ｃ）を結合し、自己
ポリマー化を防ぐためＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断する。
Ｓａｕ３ａからＰｓｔＩまでのおよそ９５０ｂ．ｐ．の
断片を単離した。この断片は、Ｌｅ−ＩＦＢ遺伝子の
Ｌｅ−ＩＦＡと共通でない部分より成っている。 4. ｐＬｅ−ＩＦＡ２５より、ｔｒｐプロモーターオ
ペレータ、リボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始シグナルお
よびＬｅ−ＩＦＡのシステインコドンを含む、およそ
３００ｂ．ｐ．の断片（ＨｉｎｄIII からＳａｕ３ａ）
を単離した。 5. ｐＢＲ３２２より、およそ３６００ｂ．ｐ．のＰｓ
ｔＩからＨｉｎｄIII の断片を単離した。この断片はレ
プリコンを含み、テトラサイクリンをコードするが、ア
ンピシリン耐性は有しない。 6. ステップ３，４および５で得られた断片を結合し、
得られたプラスミドでＥ．Ｃｏｌｉ２９４株を形質転換
した。

【００６２】形質転換株をミニスクリーンし、〔Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａ
ｒｃｈ７，１５１３（１９７９）〕、プラスミド標品を
ＥｃｏＲＩで消化した。その結果、次の三つの断片を得
た。 1) ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩｔｒｐプロモータ断片、
2) ｐＬ４のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片、および、3)
ｐＬ４のたん白翻訳開始シグナルからＥｃｏＲＩ断
片。ＣＰＥ分析で先きのようにして作製したクローンか
らの細菌抽出物は、典型的にＡ₅₅₀＝１の１リットル当
たりのインタフェロン活性として、約１０×１０⁶ユニ
ットであった。このようにして調製したクローンの一例
として２９４／ｐＬＩＦＢｔｒｐ７がある。

【００６３】Ｅ．他の成熟白血球インタフェロン他のＬｅ−ＩＦタイプを含む全長遺伝子断片はＬｅ−Ｉ
ＦＡの場合と同じように仕立て、発現のために発現用
ベクターに入れた。常法により完全配列決定することに
より、上記に記載のような、プレ配列を制限切断により
除去し、その際失なわれたＮ末端アミノ酸コドンの代わ
りに合成ＤＮＡ断片を置くというアプローチへの手段を
とることが出来るよう、制限部位が成熟インタフェロン
の第一番目のアミノ酸コドンに十分近いかどうかわか
る。もしそれに失敗したら、Ｋｌｅｉｄらの記載の方法
を採用できる。

【００６４】要約すると、プレ配列含有断片を成熟ポリ
ペプチドの第一番目のアミノ酸のコドンが始まる点のす
ぐ前で切断するもので、次のようにして行なう： 1. その部位のまわりの領域の二重鎖ＤＮＡを一重鎖Ｄ
ＮＡにする。 2. 上記(1) で出来た一重鎖部分に相補プライマ長の一
重鎖ＤＮＡを、５′末端が目的の切断部位に隣接する塩
基と反対に位置するようにハイブリダイズする。 3. プライマーから３′の方向に存在し、ステップ１で
除去した第二鎖の、プライマーから３′方向に存在する
部分を、アデニン、グアニンおよびシトシン含有デオキ
シヌクレオチド三りん酸存在下でＤＮＡポリメラーゼと
反応させることにより修復する。そして、 4. 目的の切断部位より突出している残りの一重鎖ＤＮ
Ａを消化する。

【００６５】短い長さの合成ＤＮＡで、翻訳開始シグナ
ルＡＴＧで終っているものをコード鎖の３′末端に結合
する。この結合は、成熟インタフェロンの仕立てた遺伝
子と、発現プラスミドに挿入され、プロモーターと付属
のリボゾーム結合部位の制御下に置かれた挿入遺伝子に
対し、平滑末端結合により行なわれる。

【００６６】上記に用いられた方法と同様に、Ｌｅ−Ｉ
Ｆ−ＣおよびＬｅ−ＩＦ−Ｄをコードする遺伝子断片も
細菌による直接発現のため適当に配列された。これらの
他のインタフェロン発現の戦術として、それぞれ、ｐＬ
ｅ−ＩＦＡ２５のｔｒｐプロモーターオペレータ、リ
ボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始シグナルおよびＬｅ−Ｉ
ＦＡのシステインコドンを含む、およそ３００ｂ．ｐ．
の断片（ＨｉｎｄIIIからＳａｕ３ａ）の利用がある。
この断片に、全てに共通の最初のシステイン以後それぞ
れのアミノ酸をコードする各インタフェロン遺伝子から
の断片を組み合わせる。得られた各プラスミドを用いて
Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２２９４株を形質転換した。そ
れぞれの遺伝子を作製する結合は以下のとおりである。

【００６７】ＬｅＩＦ−ＣｐＬｅ−ＩＦＣより以下の断片を単離する。 (a) Ｓａｕ３ａからＳａｕ９６までの３５ｂ．ｐ． (b) Ｓａｕ９６からＰｓｔＩまでの９００以上のｂ．
ｐ． (c) 本明細書第４３頁４項のように、およそ３００ｂ．
ｐ．の断片（ＨｉｎｄIII −Ｓａｕ３ａ）をｐＬｅＩＦ
Ａ２５より単離する。 (d) 本明細書第４３頁５項の約３６００ｂ．ｐ．の断片
を単離する。

【００６８】構成 (1) (a) と(c) を結合する。ＢｇｌIIとＨｉｎｄIII
で切断し、約３３５ｂ．ｐ．の産物を単離する。 (2) (1) と(b) と(c) を結合し、生成するプラスミド
でＥ．Ｃｏｌｉを形質転換する。このようにして作製したクローンの一例としてＥ．Ｃｏ
ｌｉＫ−１２２９４／ｐＬｅＩＦＣｔｒｐ３５株
がある。

【００６９】Ｌｅ−ＩＦＤｐＬｅＩＦ−Ｄより以下を単離する。 (a) Ｓａｕ３ａからＡｖａIIの３５ｂ．ｐ． (b) ＡｖａIIからＢｇｌIIの１５０ｂ．ｐ． (c) ＢｇｌIIからＰｓｔＩの約７００ｂ．ｐ．ｐＬｅ
ＩＦＡ２５より以下を単離する。 (d) ＨｉｎｄIII からＳａｕ３ａの３００ｂ．ｐ．ｐ
ＢＲ３２２より単離する。 (e) ＨｉｎｄIII からＰｓｔＩの約３６００ｂ．ｐ．

【００７０】構成 (1) (a) と(b) を結合した後、ＢｇｌIIで切断し、１８
５ｂ．ｐ．の産物(1) を精製する。 (2) (1) と(d) を結合し、ＨｉｎｄIII とＢｇｌIIで切
断し、約５００ｂ．ｐ．産物(2) を精製する。 (3) (2) と(c) と(e) を結合し、生成するプラスミドで
Ｅ．Ｃｏｌｉを形質転換する。このようにして得られたクローンの一例として、Ｅ．Ｃ
ｏｌｉＫ−１２２９４／ｐＬｅＩＦＤｔｒｐ１１
株がある。

【００７１】Ｌｅ−ＩＦＦＬｅ−ＩＦＦ含有断片は、Ｌｅ−ＩＦＢとＬｅ−Ｉ
ＦＦの１〜１３番目のアミノ酸の完全同一性を利用し
た再集合により、直接発現のため仕立てられる。適当な
配列末端を有する、ｔｒｐプロモーター含有断片を、ｐ
ＨＧＨ２０７より、上記記載のようにＰｓｔＩおよびＸ
ｂａＩ消化と１０５０ｂ．ｐ．断片単離により得る。

【００７２】テトラサイクリン耐性プロモーターと構造
遺伝子の間にＢｇｌII部位を有するｐＢＲ３２２の誘導
体のプラスミドｐＨＫＹ１０をＰｓｔＩとＢｇｌII消化
し、大きい断片として、第二の断片(b) が得られる。断
片(a) はアンピシリン耐性をコードする遺伝子のおよそ
半分を含み、断片(b) は残りの半分と、プロモーターを
除く全てのテトラサイクリン耐性遺伝子を有している。
断片(a) と(b) をＴ４リガーゼを用いて結合し、その産
物をポリメリ化を防ぐためＸｂａＩとＢｇｌIIで処理す
る。その結果、ｔｒｐプロモーターオペレーターとテト
ラサイクリンとアンピシリン耐性を含む断片(c) を得
る。

【００７３】ｐＬｅ−ＩＦＦをＡｖａIIおよびＢｇｌ
IIで消化して、およそ５８０ｂ．ｐ．の断片(d) を得
る。これはＬｅ−ＩＦＦの１４〜１６６のアミノ酸コ
ドンを含有している。ｐＬｅ−ＩＦＢをＸｂａＩとＡｖａIIで消化して４９
ｂ．ｐ．の断片(e) を得る。断片(e) はＬｅ−ＩＦＦ
の１〜１３のアミノ酸をコードしている。

【００７４】断片(c) 、(d) および(e) をＴ４リガーゼ
存在下で結合する。それぞれの断片の結合末端は、合成
プラスミドが正しく閉環するようになっていて、テトラ
サイクリン耐性遺伝子が成熟Ｌｅ−ＩＦＦの遺伝子に
沿ってｔｒｐプロモーターオペレーターの制御下に位置
し、目的のプラスミドで形質転換した細菌がテトラサイ
クリン含有平板上で選択され得る。このようにして調製
されたクローンの一例としてＥ．ＣｏｌｉＫ−１２
２９４／ｐＬｅＩＦＦｔｒｐ１がある：

【００７５】Ｌｅ−ＩＦＨ成熟白血球インタフェロンとしての発現のための完全Ｌ
ｅ−ＩＦＨ遺伝子は以下のようにして調製される。 1. プラスミドｐＬｅ−ＩＦＨをＨａｅIIとＲｓａＩ
で消化し、シグナルペプチドのアミノ酸１０から３′非
コード領域への８１６ｂ．ｐ．断片を単離する。 2. この断片を変性し、合成デオキシリボヌクレオチド
プライマ−５′−ｄＡＴＧＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴ
ＣＴを利用し、Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｋｌｅｎｏｗら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ６５，
１６８〔１９７０〕）による修復合成を行う。この一般
法については、１９８０年９月２５日出願のＵＳＳｅ
ｒｉａｌ No. １９０７９９に、Ｇｏｅｄｄｅｌらによ
り記載されている。

【００７６】3. 生成物をＳａｕ３ａで切断し、アミノ
酸１から１５０に対応する４５２ｂ．ｐ．の断片を単離
する。 4. ｐＬｅ−ＩＦＨのＳａｕ３ａからＰｓｔＩ消化
と、生成する５００ｂ．ｐ．断片の単離により、アミノ
酸１５０からコード配列の最後までをコードする遺伝子
を得る。 5. (3) および(4) で得られた断片を結合して次の断片
を生成する。これはＬｅ−ＩＦＨの１６６のアミノ酸をコードして
いる。

【００７７】６．ｐＬｅ−ＩＦＡｔｒｐ２５をＸ
ｂａＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩにて平滑末端と
し、生成物をＰｓｔＩで消化する。生成する大きい断片
を単離し、ステップ(5) の断片と結合し、発現プラスミ
ドを得る。これでＥ．ＣｏｌｉＫ−１２２９４株、
或いは他の宿主菌を形質転換すると成熟Ｌｅ−ＩＦＨ
を発現することが出来る。

【００７８】ＬＥ−ＩＦＩＬａｗｎら、Ｃｅｌｌ１５，１１５７（１９７８）に
より構成されたヒトゲノムのファージλ Ｃｈａｒｏｎ
４Ａ組み換え体ライブラリーを、Ｌａｗｎら（上記）
およびＭａｎｉａｔｉｓら、Ｃｅｌｌ１５，６８７
（１９７８）に記載される方法を用いて白血球インタフ
ェロン遺伝子に対して選択した。ＬｅＩＦＡｃＤＮＡク
ローンからの放射性ＬｅＩＦプローブ〔Ｇｏｅｄｄｅｌ
ら，Ｎａｔｕｒｅ２８７，４１１（１９８０）〕を用い
て約５００，０００プラークを選択した。再スクリーニ
ングとプラーク精製により、これらのクローンの一つ、
λＨＬｅＩＦ２を以後の分析に選択した。

【００７９】上記の方法を用い、他のプローブを利用し
てヒトゲノムより、その他のＬｅＩＦクローンを単離す
る。次に又、これらを利用してその他の白血球インタフ
ェロンたん白を本発明に従って生産することができる。 1. ゲノムクローン（λＨＬｅＩＦ２）の２０００ｂ．
ｐ．のＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位
にサブクローンする。生成するプラスミドＬｅＩＦＩを
ＥｃｏＲＩで切断し、２０００ｂ．ｐ．断片を単離す
る。デオキシオリゴヌクレオチドｄＡＡＴＴＣＴＧＣＡ
Ｇ（ＥｃｏＲＩ＞ＰｓｔＩ変換体）をこの２０００ｂ．
ｐ．のＥｃｏＲＩ断片に結合し、生成物をＰｓｔＩで切
断してＰｓｔＩ末端を含む２０００ｂ．ｐ．の断片を得
る。これをさらに、Ｓａｕ９６で切断し、ＰｓｔＩ末端
とＳａｕ９６末端を有する１１００ｂ．ｐ．断片を単
離する。

【００８０】2. プラスミドｐＬｅＩＦＣｔｒｐ３
５をＰｓｔＩとＸｂａＩで消化する。大きい断片を単離
する。 3. ｐＬｅＩＦＣｔｒｐ３５からの小さいＸｂａＩ
−ＰｓｔＩ断片をＸｂａＩおよびＳａｕ９６で消化す
る。４０ｂ．ｐ．のＸｂａＩ−Ｓａｕ９６断片を単離す
る。4. 上記1)、2)および3)で単離した断片を結合し、
発現プラスミドｐＬｅＩＦＩｔｒｐ１を形成する。

【００８１】ＬｅＩＦ−Ｊ 1. プラスミドｐＬｅＩＦＪは、ＬｅＩＦＪの遺伝
子配列を含むヒトゲノムＤＮＡの３．８キロベースのＨ
ｉｎｄIII 断片を含有している。このプラスミドより７
６０ｂ．ｐ．のＤｄｅＩ−ＲｓａＩ断片を単離した。 2. プラスミドｐＬｅＩＦＢｔｒｐ７をＨｉｎｄII
I およびＤｄｅＩで切断し、３４０ｂ．ｐ．のＨｉｎｄ
III −ＤｄｅＩ断片を単離した。 3. プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断し、ＤＮ
ＡｐｏｌＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で処理して平滑末端
とし、ＨｉｎｄIII で消化した。大きい断片（〜３６０
０ｂ．ｐ．）を単離した。 4. 上記1)、2)および3)で単離した断片を結合し、発現
プラスミドｐＬｅＩＦＪｔｒｐ１を形成した。

【００８２】以下の構成に用いられる方法と材料は上記
記載と同じものである。次の第５表は、特にハイブリド
ＬｅＩＦプラスミドの構成の詳細を示すものである。さ
らに、第５表に言及すると、最初に記載の４つのハイブ
リドＬｅＩＦは２つのＬｅＩＦ発現プラスミドから生産
されたものである。

【００８３】

【表９】

【００８４】

【表１０】

【００８５】

【表１１】

【００８６】

【表１２】

【００８７】★ Ｎ−末端のメチオニンを除くａｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５のＸｂａＩからＰｓｔ
Ｉ消化の大きい（〜３９００ｂｐ）断片ｂｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII 〜ＰｓｔＩ消化物の大
きい（〜３６００ｂｐ）断片

【００８８】ＬｅＩＦＡおよびＤのｃＤＮＡに共通の
ＢｇｌII部位を用いて、ＬｅＩＦＡの６３個のアミノ末
端アミノ酸およびＬｅＩＦＤのカルボキシ末端の１０
２個のアミノ酸をコードする発現プラスミドｐＬｅＩＦ
ｔｒｐＡＤ（ＢｇｌII）を構成した。同じ部位を利
用して、ＬｅＩＦＤの６４個のアミノ末端のアミノ酸
と、ＬｅＩＦＡのカルボキ末端の１０２個のアミノ酸
をコードする発現プラスミドｐＬｅＩＦｔｒｐＤＡ
（ＢｇｌII）を構成した。他の二つのハイブリドインタ
フェロン発現プラスミドの構成には、ＰｖｕII部位を利
用した。Ａのアミノ末端の９１個のアミノ酸と、Ｄのカ
ルボキシ末端７４個のアミノ酸（ｐＬｅＩＦｔｒｐ
ＡＤ（ＰｖｕII））およびＬｅＩＦＤの９２個のアミ
ノ末端アミノ酸とＬｅＩＦＡのカルボキシ末端７４
個のアミノ酸（ｐＬｅＩＦｔｒｐＤＡ（ＰｖｕI
I））である。

【００８９】要約すると、ｐＬｅＩＦＡＤｔｒｐ（ＰｖｕII）：ｐＬｅＩＦ
Ａｔｒｐ２５のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ消化の大きい
断片（〜３９００ｂｐ）をｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５
のＸｂａＩ−ＰｖｕIIの２８５ｂｐ断片と、ｐＬｅＩＦ
Ｄｔｒｐ１１のＰｖｕII−ＰｓｔＩの約５５０ｂｐ
断片とを結合する。ｐＬｅＩＦＤＡｔｒｐ（ＰｖｕII）：ｐＬｅＩＦ
Ａｔｒｐ２５のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ消化の大きい
断片（〜３９００ｂｐ）をｐＬｅＩＦＤｔｒｐ１１
からの２８８ｂｐＸｂａＩ−ＰｖｕII断片とＬｅＩＦ
Ａｔｒｐ２５の約５５０ｂｐのＰｖｕII−ＰｓｔＩ
断片とを結合する。

【００９０】ｐＬｅＩＦＡＤｔｒｐ（ＢｇｌII）：
ｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５のＢｇｌII、Ｐｓｔ消化の
大きい断片とｐＬｅＩＦＤｔｒｐ１１からの約６０
０ｂｐのＢｇｌII−ＰｓｔＩ断片とを結合する。ｐＬｅＩＦＤＡｔｒｐ（ＢｇｌII）：ｐＬｅＩＦ
Ｄｔｒｐ１１のＢｇｌII、ＰｓｔＩ消化の大きい断片
と、ｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５のＰｓｔＩ切断で得ら
れる約７００ｂ．ｐ．の断片とを結合し、ＢｇｌIIによ
り部分消化する。

【００９１】第５番目に記載のハイブリドは、ｐＬｅＩＦＡＢｔｒｐ（ＰｖｕII）：ｐＬｅＩＦ
Ａｔｒｐ２５のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ消化の大きい
断片（〜３９００ｂｐ）をｐＬｅＩＦＡｔｒｐ２５
の２８５ｂｐのＸｂａＩ−ＰｖｕII断片と、ｐＬｅＩＦ
Ｂｔｒｐ７のＰｖｕII（部分）−Ｐｓｔの約７５０
ｂｐ断片とを結合する。同様の方法で、第５表に記載の構成が定義される。さら
に例として、ＬｅＩＦＣおよび／又はＬｅＩＦＨの一
部を含むハイブリドの構成においては、遺伝子配列の約
２９４番目の塩基（即ち、ＧＣＴＧＣ）に存在する共通
のＢｂｖＩ部位の利点を利用することができる。

【００９２】同じようにして、天然存在の白血球インタ
フェロンのアミノ酸配列の全て、或いは一部をコードす
る二重鎖ＤＮＡを適当に操作することにより、白血球イ
ンタフェロンの新規なハイブリドを微生物発現するのに
適したプラスミドを作製することができる。従って、一
番目の二重鎖ＤＮＡ断片として、一番目の天然存在白血
球インタフェロンのアミノ末端のアミノ酸配列を、３′
方向に進んで、そのアミノ酸配列のかなりの部分をコー
ドするものを選ぶ。断片は第一の白血球インタフェロン
のアミノ酸“ｎ”のコドンに隣接した位置に制限エンド
ヌクレアーゼ切断部位を含有し、ｎ−アミノ酸は第一の
インタフェロンのアミノ酸配列のかなりの部分より成っ
ている。その制限エンドヌクレアーゼで切断すると、第
一のインタフェロンのアミノ末端と、およそｎ−アミノ
酸のコドンとを含んでいる。

【００９３】二番目の異なる白血球インタフェロンのア
ミノ酸に対するコドンの全て、或いは一部を含んでいる
二つ目の断片を選び該断片は、アミノ酸数がおよそ１６
６−ｎ個の、第二のインタフェロンのアミノ末端から進
んでそのアミノ酸に対するコドンに隣接して、同じ制限
エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。二つ目の断片を
その制限エンドヌクレアーゼで切断すると、第一の断片
の消化産物の“ｎ”末端部分に相補的な産物を得る。従
って、二番目の消化産物を第一の産物と結合して再び制
限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成し、最初の消化で
失なった第一のインタフェロンのアミノ酸ｎのコドンを
再構成する。二番目の断片の制限エンドヌクレアーゼ消
化産物は切断部位から３′の方向に、第二の白血球イン
タフェロンのカルボキシ末端をコードする塩基を経て進
むのが好ましい。

【００９４】選択的には、天然存在の二つ以上の白血球
インタフェロンのアミノ酸配列のかなりの部分を含むハ
イブリドも作成し得る。そのような場合、例えば、上記
に言及した第二の断片が二つ目の制限エンドヌクレアー
ゼ部位を一つ目のより下流に有するよう選択し、二つ目
の部位は、第三の白血球インタフェロンのカルボキシ末
端部をコードする断片内に同じように存在するものと同
一であるようにする。引用した例において、連続した制
限エンドヌクレアーゼ操作の生成物を三つ合わせて結合
し、第一のインタフェロンのアミノ末端部分、第二のも
のの中間のアミノ酸配列、および第三のもののカルボキ
シ末端（或いは、第一と第三のインタフェロンは同じ
で、第一のインタフェロンの他の組み合せ）をコードす
るハイブリド遺伝子を形成できる。

【００９５】好ましくは、上述の第一の断片は発現プラ
スミドに由来し、即ち、第一のインタフェロンのアミノ
末端のコドンの前にＡＴＧ或いは他の翻訳開始コドンと
プロモーター又はプロモーターオペレーター系を有する
ものである。その結果、上記記載の操作による最終生成
物はハイブリド遺伝子のコードするポリペプチドをその
プラスミドで形質転換したバクテリア或いは他の微生物
中で発現できるプラスミドとなる。ハイブリド遺伝子を
微生物発現させるための他の方法は技術として明白であ
る。

【００９６】本発明の好ましい具体例として、ハイブリ
ド遺伝子がおよそ１６５〜１６６個のアミノ酸より成る
新規の白血球インタフェロンアミノ酸配列をコードし、
そのアミノ酸は、第２表に示すＬｅＩＦＡ、ＬｅＩＦ
Ｂ、ＬｅＩＦＣ、ＬｅＩＦＤ、ＬｅＩＦＥ、Ｌ
ｅＩＦＦ、ＬｅＩＦＧおよびＬｅＩＦＨより成る
グループから選ばれる二つ又はそれ以上の異なる白血球
インタフェロンのアミノ酸配列の接合より成っている。
最も好ましくは、ハイブリド遺伝子によりコードされる
新規白血球インタフェロンは、第２表の“Ａ１１”配列
に示すアミノ酸とその位置を含むものである。本発明に
より作成されるプラスミドの発現産物は、以下に生物活
性測定として記載するように、常法により抗ウィルス活
性を試験でき得る。

【００９７】Ｆ．抗ウィルス活性Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２２９４株を、それぞれ別個
に、プラスミドｐＬｅＩＦｔｒｐＡ２５，ｐＬｅＩＦ
ｔｒｐＤ，ｐＬｅＩＦｔｒｐＡ／Ｄ（ＢｇｌI
I）、およびｐＬｅＩＦｔｒｐＤ／Ａ（ＢｇｌII）
を用いて形質転換した。形質転換株をそれぞれ、テトラ
サイクリン５μｇ／ml含有のＬ−培地５mlでＡ₅₅₀がお
よそ１．０となるまで培養し、次に５μｇ／mlのテトラ
サイクリン含有のＭ９培地１リットルに希釈する。Ａ
₅₅₀が１．０に達した時、集菌し、菌体を１０ml １５
％蔗糖、５０mMトリス−塩酸（pH８．０）、５mM ＥＤ
ＴＡにけん濁する。１０mgのリゾチーム添加、０℃５分
後、細胞を超音波処理により破砕する。サンプルをＳｏ
ｒｖａｌｌＳＭ−２４ローター中で１５，０００rpm
、１０分間遠心する。上澄液のインタフェロン活性を
抗ウィルス活性でテストする。

【００９８】培養液１リットル当りのインタフェロンの
生産量をヒト細胞（ＷＩＳＨ）で測定した結果を第６表
に示す。表から明かなように、他のインタフェロンに比
較してＬｅＩＦ−Ａ／Ｄ活性が多量に生産している。こ
の差はＬｅＩＦ−Ａ／Ｄの活性が本質的に高いことに由
来するのか、或いは、このインタフェロンたん白が量と
して多く生産されていることに由来するのかであろう。
これら全てのインタフェロンが遺伝子的に全く同一に結
合しているものであるから、ＬｅＩＦ−Ａ／Ｄが他のイ
ンタフェロンより本質的に活性が強いという可能性が最
も高いと思われる。

【００９９】

【表１３】

【０１００】各種インタフェロンの哺乳動物細胞内での
効果を測定した（ヒト、ＷＩＳＨ；アフリカミドリサ
ル、ＶＥＲＯ；ハムスター線維芽細胞、ＢＨＫ；ウサギ
腎細胞、ＲＫ−１３；マウス、Ｌ−９２９；およびウシ
腎、ＭＤＢＫ細胞）。各種インタフェロンの相対活性を
比較するため、各細胞における活性を、ＷＩＳＨ細胞上
の活性を１００として計算した。第７表に示す結果よ
り、ＬｅＩＦ−Ａ／ＤがＶＥＲＯおよびＬ−９２９細胞
で非常に高い活性を示すのに対し、ＬｅＩＦ−Ｄ／Ａは
これらの細胞で低い活性しか示さない。

【０１０１】この結果から、ＬｅＩＦ−ＡのＮ−末端部
分とＬｅＩＦ−ＤのＣ−末端部分を一つの分子内（Ｌｅ
ＩＦ−Ａ／Ｄ）に組み合せることにより、何種かの哺乳
動物に現われるような特別の効力がそのハイブリドたん
白に備わることがわかる。さらに、これらの性質は、単
に、親インタフェロンの性質の和ではない。このことは
特にＬ−９２９細胞での活性で明確である。即ち、Ｌｅ
ＩＦ−ＡおよびＬｅＩＦ−Ｄの混合物やもう一つのハイ
ブリド（ＬｅＩＦ−Ｄ／Ａ）では有意な活性を有してい
ない。

【０１０２】ＬｅＩＦ−Ａ／Ｄの他のウィルスに対する
活性も調べた。図２に示すデータはＬ−細胞に感染した
ＥＭＣウィルスに対する抗ウィルス活性を、又図３は、
Ｌ−細胞に感染したＶＳＶに対する効果を示している。
これらのデータから明かなとおり、ＬｅＩＦ−Ａ／Ｄの
強い活性は一つのウィルス（ＶＳＶ）に限られるもので
なく、多くのウィルスに対する一般的性質のようであ
る。天然のヒト白血球層インタフェロン標品はマウス細
胞で活性を示さない（第７表）。図４のデータは、感染
前３時間にｉ．ｐ．投与した結果である。ＬｅＩＦ−Ａ
／ＤおよびＬｅＩＦ−Ａの投与量はＷＩＳＨで測定した
ものである。

【０１０３】

【表１４】

【０１０４】ＥＭＣウィルスのハムスターへの致死感染
もＬｅＩＦ−Ａ／ＤおよびＬｅＩＦ−Ａにより影響を受
ける（図５）。前者が最も効果があり、ヒト白血球層イ
ンタフェロンは統計的には有意でないぐらいの低い活性
のみ示す。図５の場合、どのインタフェロンもＷＩＳＨ
細胞での測定での５×１０⁵μｇ／kgの量を感染３時間
前にｉ．ｐ．投与した。これらの結果は、ＬｅＩＦ−Ａ
／Ｄの哺乳動物における強い抗ウィルス効果は、培養細
胞に限定されるのでなく、ウィルス致死感染においても
観察されることを示している。

【０１０５】ＥＭＣウィルスに対する抗ウィルス活性
は、鵞口瘡ウィルスやポリオウィルスなどのピコナウィ
ルス群のウィルスに対する抗ウィルス活性を示唆するモ
デル系と考えられている。ＶＳＶウィルスに対する抗ウ
ィルス活性は、狂犬病ウィルスがその重要な一員である
ｒｈａｂｄｏウィルス群のウィルスに対する抗ウィルス
活性を示唆するモデル系と考えられている。第８表は、
各種ＬｅＩＦハイブリッドのＷＩＳＨおよびＭＤＢＫ細
胞での活性とそれらの活性比を表にしたものである。

【０１０６】

【表１５】

【０１０７】

【表１６】

【０１０８】Ｇ．非経口投与以上のハイブリド白血球インタフェロンは、抗腫瘍或い
は抗ウィルス治療を必要とする人、および免疫抑制状態
を示す人に対して非経口投与され得る。投与量および投
与の割合は、現在ヒト由来のもので臨床に用いられてい
る量、毎日約（１〜１０）×１０⁶ユニットと同じ位で
よく、純度が１パーセント以上の場合には、例えば毎日
５×１０⁷ユニットにもなろう。上述のサルにおける予
備試験でも、バクテリアから得られるＬｅＩＦの場合に
は、ＬｅＩＦ以外のヒトたん白が本質的に存在しないた
め、投与量も高く、より高い効果が得られることを示唆
している。白血球由来のものでは、ＬｅＩＦ以外のヒト
たん白が発熱物質となり、倦怠感、発熱などの副作用を
示す。

【０１０９】本質的に均質なバクテリア由来のＬｅＩＦ
の非経口投与のための適当な投与形態の一例として、比
活性が例えば２×１０⁸Ｕ／mgのＬｅＩＦ３mgを２５ml
の５％ヒト血清アルブミンに溶解し、溶液を除菌フィル
ターを通した後、濾液を無菌的に１００本のバイアルに
分ける。それぞれ、６×１０⁶ユニットの純インタフェ
ロンを含有し、非経口投与に適している。バイアルは使
用前は低温（−２０℃）に保存する。

【０１１０】本発明の化合物は、有用な医薬組成物を調
製する既知の方法に従って処方されうる。その際、ポリ
ペプチドは、医薬として許容されうる担体基礎剤と混ぜ
合わせる。適当な基礎剤およびその処方は、Ｅ．Ｗ．Ｍ
ａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されてお
り、これを参考文献として引用する。これらの組成物
は、インタフェロンたん白の有効量と、適量の基礎剤を
含み、宿主に対して有効で投与に適した医薬的に許容し
得る組成物とする。

【図面の簡単な説明】

【図１】８種の白血球インタフェロンのｃＤＮＡクロー
ン（ＡからＨ）の制限エンドヌクレアーゼ切断地図。

【図２】ハイブリド型白血球インタフェロン（ＬｅＩＦ
−Ａ／Ｄ）のマウス細胞におけるＥＭＣウィルスに対す
る活性を示すグラフ。

【図３】ＬｅＩＦ−Ａ／Ｄのマウス細胞におけるＶＳＶ
に対する活性を示すグラフ。

【図４】マウスにＥＭＣウィルスを感染させた時の、Ｌ
ｅＩＦ−Ａ／Ｄの活性を示すグラフ。

【図５】ハムスターにおけるＥＭＣウィルス感染に対す
るＬｅＩＦ−Ａ／Ｄの活性を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹＦ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】およそ１６５〜１６６個のアミノ酸より
なり、ヒト白血球インタフェロン活性を有するポリペプ
チドであって、ヒト白血球インタフェロンＡおよびヒト
白血球インタフェロンＢまたはＤの別々のアミノ酸副配
列からなり、ヒト白血球インタフェロンＡの副配列は前
記ポリペプチドのＮ末端に位置しており、そしてこのポ
リペプチドの全アミノ酸配列が天然白血球インタフェロ
ンのアミノ酸配列とは異なるポリペプチドをコードする
鎖からなる二重鎖ＤＮＡ。
【請求項２】およそ１６５〜１６６個のアミノ酸より
なり、ヒト白血球インタフェロン活性を有するポリペプ
チドであって、ヒト白血球インタフェロンＡおよびヒト
白血球インタフェロンＢまたはＤの別々のアミノ酸副配
列からなり、ヒト白血球インタフェロンＡの副配列は前
記ポリペプチドのＮ末端に位置しており、そしてこのポ
リペプチドの全アミノ酸配列が天然白血球インタフェロ
ンのアミノ酸配列とは異なるポリペプチドをコードする
配列からなるＤＮＡ配列を含有する複製可能な発現ベク
ター。
【請求項３】ｐＬｅＩＦＡＤｔｒｐ（Ｂｇｌ
ＩＩ）、ｐＬｅＩＦＡＤｔｒｐ（ＰｖｕＩＩ）、
ｐＬｅＩＦＤＡｔｒｐ（ＢｇｌＩＩ）およびｐ
ＬｅＩＦＤＡｔｒｐ（ＰｖｕＩＩ）よりなる群
から選択されるプラスミドである、特許請求の範囲２項
のベクター。
【請求項４】ｐＬｅＩＦＡＢ（ＰｖｕＩＩ）プ
ラスミドである特許請求の範囲２項のベクター。
【請求項５】およそ１６５〜１６６個のアミノ酸より
なり、ヒト白血球インタフェロン活性を有するポリペプ
チドであって、ヒト白血球インタフェロンＡおよびヒト
白血球インタフェロンＢまたはＤの別々のアミノ酸副配
列からなり、ヒト白血球インタフェロンＡの副配列は前
記ポリペプチドのＮ末端に位置しており、そしてこのポ
リペプチドの全アミノ酸配列が天然白血球インタフェロ
ンのアミノ酸配列とは異なるポリペプチドをコードする
配列からなるＤＮＡ配列を含有する複製可能な発現ベク
ターで形質転換した細菌。