NO165201B - Fremgangsmaate for fremstilling av hybrid munamleukocyttinterferoner paa 165-166 aminosyrer omfattende en subsekvens fra human leukocytt-interferon a og en subsekvens fra human leukocytt-interferon b eller d. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en mikrobiell fremstilling ved rekombinant ENA teknologi av hybrid leukocyttinterferoner for bruk ved behandlijTg av virus og neoplastiske sykdommer, hvilken fremgangsmåte omfatter de trekk som er angitt i krav l's ingress. De særpregede trekk ved fremgangsmåten er angitt i krav l's karakteriserende del.

Relativt homogene leukocyttinterferoner er blitt utledet fra normale eller leukemiske giveres leukocytter. Disse interferoner er en familie av proteiner som er karakterisert ved en sterk evne til å gi sine målceller en virusresistent til-stand. Dertil kan interferon virke inhiberende på cellefor-mering og modulere immunreaksjonen. Disse egenskaper har for-årsaket klinisk bruk av interferon som et terapeutisk middel for behandling av virusinfeksjoner og sykdomstilstander.

I det senere har rekombinant DNA-teknologi blitt brukt for

å muliggjøre mikrobiell fremstilling av flere forskjellige leukocyttinterferoner hvis aminosyresekvenser viser størrel-sesorden 7 0% homologi, og er beslektet med hverandre, som beskrevet av David V. Goeddel et al. [Nature 290, 20-26

(1981)]. Gener som koder for aminosyresekvenser av forskjellige

bestemte leukocyttinterferoner, blant annet, LelF A,

B, C, D, F, G og H, oppnås fra cellelinjen KG-1 beskrevet av Koeffler, H.P. og Golde, D.W. [Science 200, 1153-1154

(1978)] av David V. Goeddel og Sidney Pestka. Cellelinjen

KG-1 er deponert hos American type culture collection, ATCC tilgjengelighetsnummer CRL 8031. Slike gener-, riktig anvendt i plasmider "for bakteriell ekspresjon, kan anvendes til å transformere vertsbakterier, fortrinnsvis E. coli K-12 stamme 294, American type culture collection Accession nr. 31446, deponert 28. oktober 1978.

Verktøyet for rekombinant DNA teknologi er plasmidet, en ikke-kromosomal ring av dobbeltkjedet DNA som finnes i bakterier og andre mikrober, ofte i multiple kopier i hver celle. Innebygget i informasjo nen kodet i plasmid DNA er det som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replicon") og normalt,at et eller flere seleksjonskarakteri-stika såsom i tilfellet bakterier, resistens overfor anti-biotika ,hvilket gjorde det mulig for kloner hos vertscellen som inneholder plasmidet av interesse å gjenkjenne og fortrinnsvis vokse i selektive medier. Anvendelsen av plasmider ligger i at de spesifikt kan spaltes av en eller annen restriksjonsendonuklease eller "restriksjonsenzym", som hver gjen-kjenner et forskjellig punkt på det plasmidet. Der-

etter kan heterologe gener eller genfragmenter innsettes i plasmidet ved endekobling på spaltningsstedet eller på rekon-struerte ender nær spaltningsstedet. DNA-rekombinasjon fore-tas utenfor cellen, men det resulterende "rekombinante" plasmid kan innføres i den ved en fremgangsmåte kjent som trans-formasjon, og store mengder av det heterologe genholdige rekombinantplasmid erholdt ved dyrkning av transformanten hvor dertil genet er riktig innsatt i forhold til delene av plasmidet som styrer transkripsjon og translasjon av den kodede DNA informasjonen,kan i den resulterende ekspresjons-vektor brukes til å fremstille polypeptidsekvensen som det innsatte gen koder for, en prosess som kalles ekspresjon.

Ekspresjonen påbegynnes i et område kalt promotoren som gjenkjennes av og bindes av RNA polymerase. I noen tilfeller, som i tryptofan eller "trp" promotoren som foretrekkes ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse, overlappes promotorregi-oner av "operator" regioner under dannelse av en kombinert promotor-operator. Operatorer er DNA sekvenser som gjenkjennes av såkalte repressorproteiner som tjener til å regu-lere frekvensen til transkripsjonspåbegynnelse ved en spesiell promotor. Polymerasen går langs DNAet, transkriberer in-formasjonen som ligger i kodekjeden fra dens 5' til 3' ende til budbringer RNA (m-RNA) som igjen oversettes til et polypeptid med den aminosyresekvens som DNA'et koder for. Hver aminosyre kodes av en nukleotidtriplett eller "kodon" innenfor det som for foreliggende formål kalles det "strukturelle gen", dvs. den del som koder for aminosyresekvensen til det uttrykte produkt. Etter binding til promotoren, transkriberer RNA polymerasen først nukleotider som koder et ribosombindingssted, så en translasjonspåbegynnelse eller "start" signal (normalt ATG, hvilket i det resulterende budbringer RNA blir AUG),

så nukleotidkodonene innenfor selve det strukturelle gen. Såkalte stoppkodoner transkriberes ved enden av det struktu-

reile gen, hvoretter polymerasen kan danne; en ytterligere sekvens av budbringer RNA som, p.g.a. nærværet av stoppsig-nalene vil forbli uoversatt av ribosomene. Ribosomer binder til bindingsstedet som tilveiebringes på budbringer RNA'ot,

i bakterier normalt ettersom mRNAet dannes, og fremstiller selv det kodede polypeptid ved å begynne med translasjonsstartsignalet og ende ved det forut nevnte stoppsignal.

Det ønskede produkt fremstilles hvis sekvensene som koder ribosombindingsstedet anbringes riktig i forhold til AUG initiatorkodon og hvis alle gjenværende kodoner følger ini-tiatorkodonet i fase. Det resulterende produkt kan erholdes ved å lysere vertscellen og gjenvinne produktet ved riktig rensing fra andre bakterielle proteiner.

Nukleotidsekvensstudier av gener som koder for de forskjellige leukocyttinterferoner,har en viss grad av fellesskap blant flere av disse med hensyn til nærvær og plassering av spalt-ningssteder som gjenkjennes av spesielle restriksjonsendo-nukleaser. Ifølge foreliggende oppfinnelse kan man dra nytte av dette fellesskap til gjennom DNA-rekombinering å danne nye hybridgener som er anvendelige i mikrobiell fremstilling av hybridleukocyttinterferoner, hvilke kan forventes å ha i større eller mindre grad antivirus-eller andre egenskaper av interferoner kodet for av moderyenene. I foretrukne utførelses-former av oppfinnelsen kan slike hybridleukocyttinterferoner ha øket aktivitet i forhold til dem som kodes for av modergenene.

Leukocyttinterferon-modergenene koder for familien leukocyttinterferonproteiner omfattende naturlige variasjoner fra individ til individ. Disse variasjoner kan vises ved (en) aminosyreforskjell(er) i den totale proteinsekvens eller ved mangler, substitusjoner, innsatser, inversjoner eller addisjoner av (en) aminosyre(er) i denne sekvens. For hvert moderleutkocyttinterferon herav, merket LelF A, LelFB .... LelF J, etc., inngår slike variasjoner innenfor rammen av merkinger eller navnet som angir slike.

Måten hvorpå disse og andre mål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse oppnås,vil fremkomme klarere fra den detaljerte beskrivelse som følger og fra de medfølgende tegninger hvori: Figur 1 angir nukleotidsekvenser for koderegionene til 8 leukocyttinterf eron-( "LelF" ) komplementære - DNA ("cDNA") - kloner. Av disse er en tilsvarende kalt LelF E et åpenbart "pseudo-<g>en" som ikke koder for noe aktivt leukocyttinterf eron, mens en annen kalt LelF G,inneholder mindre enn den fulle sekvens for de tilsvarende interferonarter. ATG start-kodonet og avslutningstripletten til hver LelF er understreket. Figur 2 angir restriksjonsendonukleasekart for åtte typer av LelF klonede cDNAer (A til H). Plasmider som inneholder klonene/ble konstruert ved dC:dG halemetoden [Goeddel, D.V. et al. Nature 287, 411-416 (1980)]. Derfor kan cDNA-inn-satsene fjernes ved bruk av Pst I, dvs., hver ende av hver innsats er et Pst I-restriksjonsendonukleasespaltningssted. Linjene ved enden av hver cDNA-innsats representerer de flankerende homopolymere dC:dG haler. Stillingene til Pvu II, Eco RI og Bgl II restriksjonsstedene er angitt. Skyggede områder i figuren representerer kodesekvensene til fullstendige LelFer; de kryss-skraverte områder angir signalpeptid-kodesekvenser, og de åpne områder viser 3' og 5' ikke-kodende sekvenser. Figur 3 er en sammenligning av 8 LelF proteinsekvenser forut-sagt fra nukleotidsekvensene. Enbokstavsforkortningene an-befalt av IUPAC-IUB kommisjonen for biokjemisk nomenklatur er brukt: A, alanin; C, cystein; D, aspartinsyre; E, glutamin-syre; F, fenylalanin; G, glycin; H, histidin; I, isoleucin;

K, lysin; L, leucin; M, metionin; N, asparagin; P/ prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, treonin; V, valin; W, tryptofan; og Y, tyrosin. Tallene referer til aminosyrestilling (S betyr signalpeptid). Streken i den 165. aminosyre LelF A sekvens ved stilling 44 er innsatt for å bringe LelF A sekvensen på linje med de 166 aminosyresekvenser til de andre LelFer. LelF E sekvensen ble bestemt ved å ignorere det ekstra nukleotid (stilling 187 i figur 1) i dets kodeområde. Stjernen angir i-fase avs lu t ni ngskodoner . Aminosyrer som er felles for alle LelFer (bortsett fra pseudogene LelF i-:), er også vist. De understrekede rester er aminosyrer som også er tilstede hos humanfibroblast-interferon.

I figur 1 tilsvarer nukleotider +1 til 69 Sl til S23 aminosyrer i figur 3. Kodon TGT (nukleotider 70 til 72) i figur 1 tilsvarer cystein (C, aminosyre 1) i figur 3. I figur 3 opptrer Pvu II restriksjonsendonuklease-spaltningsstedet mellom kodonene fer aminosyrer 92 og 93 i LelF A,B,D,F og G, dvs. mellom nukleotider 346 og 347 i figur 1. Figur 4 sammenligner aminosyresekvensen til fullstendige leukocyttinterferoner A og D, en mangel av aminosyre 44 i LelF A er angitt ved streker. Bare de LelF D aminosyrer som er forskjellige fra tilsvarende aminosyrer i LelF A er angitt: aminosyresekvensen til LelF D er forøvrig identisk med LelF A. Figur 4 angir også den relative stilling på det tilsvarende gen for Bgl II og Pvu II restriksjonsendonuklease-spaltnings-steder anvendt i dannelse av foretrukne hybridleukocyttgener ifølge oppfinnelsen. Figur 5 og 6 illustrerer resultatene av sammenligningsfor-søk for et foretrukket hybridleukocyttinterferon ifølge oppfinnelsen ("LeIF-A/D") med hensyn til aktivitet mot henholdsvis encefalomyokarditis virus ("EFC") og vesikulært stomati-tis virus ("VSV"), i museceller. Figur 7 og 8 angir resultatene for sammenligningsforsøk av LeIF-A/D og andre interferoner mot EMC virusinfeksjoner i, henholdsvis, mus og hamstere. Dataene i figur 7 resulterer av behandlinger i.p. 3 timer før infeksjon. Doser av LelF-A/D og LeIF-A er som målt på WISH celler. Figur 9 gir DNA sekvensene til fem LelF proteiner herav, inkludert typer I og J.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Anv endte mikroorganismer

Det beskrevne arbeid innebefattet bruk av to mikroorganismer E. coli xl776 som beskrevet i US Patent 419 0 4 9 5,og - E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi , hsr , hsm^) som beskrevet i britisk patent 2055382A. Hver er deponert hos American Type Culture Collection, ATCC tilgjengelighetsnummer

31537 og 31446 deponert henholdsvis 3. juli 1979 og 28. oktober 1978. Alt rekombinant DNA arbeid ble utført ifølge anvendelige retningslinjer fra National Ins ti turtes; of Health.

Oppfinnelsen i sine mest. foretrukne irt f ørelsesffermer er beskrevet for E.. coli, innebefattet ikke bare stammer: E:.. coli x 1776 og E.- coli K-12 stamme 294 som er beskrevet ovenfor, men også andre" kjjente E. coli stammer såsom E. coli B, eller andare- mikrobielle! stammer, som: kan være deponert eller (poten-sielt): tilgjiengeiig f.r.ai anearkj^ente mikroorganismedeponerings-ins ti tusjloner V såsom' American Type Culture Collection, ATCC.

(Se ATCC: kat-a-logliste og også Tysk Of f enlegungsschrif t 2644432). Disse andre mikroorganismer innebefatter f.eks. basiller såsom Bacillus subtilis og andre enterobakteria-ceae blant hvilke kan nevnes som eksempler Salmonella typhi-murium og Serratia marcesans ved bruk av plasmider som kan replikere og uttrykke heterologe gensekvenser deri. Gjær såsom Saccharomyces cerevisiae kan også anvendes med fordel som vertsorganismer i fremstillingen av interferonproteinene ved ekspresjon av gener som koder for disse under kontroll av en gjærpromoter.

LelF hybrider fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved å utnytte restriksjonsendonuklease-spaltningsstedene som normalt befinner seg i de individuelle modergener og hver ende derav i sammenheng med de samme steder i bærer-ekspresjonsplasmidet (vektorer). For eksempel kan det store (~3900 b.p.) fragment fra en Xba I og Pst I behandling av pLelF A trp 25 ekspresjonsplasmidet ligeres med Xba I til Pvu II og Pvu II til Pst I behandlingsfragmenter for de forskjellige LelF modergener og gi ekspresjonsplasmider som er

operable til å fremstillle det tilsvarende hybrid I.elF.

Hvert LelF ekspresjonsplasmid ble konstruert uavhengig av behandlingsfragmenter isolert fra forskjellige LelF plas-

mider, f.eks. pLelF A trp 25, pLelF B trp 7, pLelF C trp 35,

pLelF D trp 11, pLelF F trp 1, pLelF G, pLelF H, og pLelF I,

etc. hvis konstruksjon er beskrevet i Nature 2_8_7 , 411 (1980)

eller fra pBR322 hvis konstruksjon er beskrevet i Gene 2,

95 (1977). I visse av disse plasmider angir "trp" et tryp-

tofan promotor - operatorsystem som er foretrukket for bakteriell ekspresjon som beskrevet i publisert Europa-patentansøkning nr. 3 677 6.

Direkte ekspresjon av et første fullstendig leukocyttinter-

f eron

Fremgangsmåten som ble brukt for å uttrykke LelF A som et fullstendig interferonpolypeptid innebar kombinasjonen av syntetiske (N-terminale) og komplementære DNAer.

Et Sau 3a restriksjonsendonukleasested finnes lett mellom

kodoner 1 og 2 i LelF A. To syntetiske deoksyoligonukleotider ble konstruert som inneholdt et ATG translasjonsfor-bindelseskodon, restaurere kodonet for aminosyre 1 (cystein)

og ga en Eco RI-festende ende. Disse oligomerer ble ligert til et 34 b.p. Sau 3a - Ava II fragment av pL31. Det resulterende 45 b.p. produkt ble ligert til to ytterligere DNA fragmenter for å konstruere et 865 basepar syntetisk natur-

lig hybridgen som koder for LelF A og som er bundet til Eco RI og Pst I restriksjonssteder. Dette genet ble innsatt i

pBR322 mellom EcoRI og Pst I stedene for å gi plasmidet pLelF Al.

Plasmid pGMl bærer E. coli tryptofanoperonet som inneholder sekvensen av ALE1413 [G.F. Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 (1978)] og uttrykker derfor et fusjonspro-

tein bestående av de første seks aminosyrer av trp lederen og omtrent den siste tredjedel av trp E polypeptidet (her-

etter i sammenheng kalt LE'), samt trp D polypeptidet i sin helhet, alt under kontroll av trp promotoroperatorsystemet. 20 ug av <p>lasmidet ble behandlet med restriksjonsenzym Pvu II som spalter plasmidet på fem steder. Genfragmentene ble deretter kombinert med EcoRI linkere (bestående av et selv-komplementerende oligonukleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG) som ga et EcoRI spaltningssted for en senere kloning til et plasmid inneholdende et EcoRI sted. De 20 p. g DNA fragmenter erholdt fra pGML- ble behandlet med 10 enheter T4 DNA ligase i nærvær av 200 pico-mol av 5<1->fosforylerte syntetisk oligonukleotid pCATGAATTCATG og i en 20 ul DNA ligase-buffer (20mM tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol) ved 4°C natten over. Løsningen ble så oppvarmet 10 minutter ved 70°C for å stoppe ligering. Bind-ingene ble spaltet ved EcoRI behandling og fragmentene,

nå med EcoRI ender ble adskilt ved bruk av 5% polyakrylamidgel elektroforese (heretter kalt "PAGE") og de tre største fragmenter isolert fra gelen ved først å farge med eti-diumbromid, lokalisere fragmentene med ultrafiolett lys,

og skjære fra gelen de porsjoner som var av interesse.

Hvert gelfragment ble med 300 mikroliter 0,lxTBE plassert

i en dialysepose og utsatt for elektroforese ved 100 v en time i 0,lxTBE buffer (TBE buffer inneholder: 10,8 g tris base, 5,5 g: borsyre, 0,09 g. Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige løsning ble oppsamlet fra dialyseposen, fenol-ekstrahert, kloroform-ekstrahert og ga 0,2 M natriumklorid og DNAet gjenvunnet i vann etter etanolpresipitering. Det trp promotor-operatorholdige gen med EcoRI bindende ender ble identifisert i den neste beskrevne fremgangsmåte/hvilket medfører innsetning av fragmenter i et tetracyklinsensitivt plasmid som, etter promotor-operatorinnsetning, blir tetracyklinresistent.

Plasmid pBRHl (R.I. Rodriguez, et al., Nucleic Acids Research 6, 3267-3287 [1979)] uttrykker ampicillinresistens og inneholder genet for tetracyklinresistens, men da ingen promoter er tilknyttet, uttrykker det ikke denne resistens. Plasmidet er følgelig tetracyklinsensitivt. Ved å introdusere promoter-operatorsystemet påEcoRI stedet kan plasmidet gjøres tetracyklinresistent.

pBRHl ble behandlet med EcoRI og enzymet fjernet ved fenol-ekstraksjon etterfulgt av kloroformekstraksjon og gjenvunnet i vann etter etanolpresipitering. Det resulterende DNA-molekyl ble i adskilte reaksjonsblandinger kombinert med hver av de tre DNA-fragmenter erholdt ovenfor og ligert med DNA ligase som forut beskrevet. Det foreliggende DNA i reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere kom-petent E. coli K-12 stamme 294 (K. Backman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 73 , 4174-4198 [1976]) ved standardtek-nikker (V. Hershfield et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

71, 3455-3459 [1974]) satt på LB plater inneholdende 20 ug/ ml ampicillin og 5 ug/ml tetracyklin. Flere tetracyklinre-sistente kolonier ble utvalgt, plasmid DNA isolert og nærværet av det ønskede fragment bekreftet ved restriksjons-enzymanalyse. Det resulterende plasmid er kalt pBRHtrp.

Et EcoRI og BamHI behandlingsprodukt fra det virale genom for hepatitis B erholdtes på konvensjonell måte og ble klonet i EcoRI og BamHI stedene til plasmid pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) under dannelse av plasmidet pHS32. Plasmid pHS32 ble spaltet med Xbal, fenol ekstrahert, kloroform ekstrahert og etanol presipitert. Det ble så behandlet med 1 ul E. coli polymerase I, Klenow fragment i 30 ul polymerasebuffer (50

mM kaliumfosfat pH 7,4, 7mM MgCl2f 1 mM (3-merkaptoetanol) inneholdende 0,1 mM dTTP og 0,ImM dCTP i 30 minutter ved 0°C og deretter 2 timer ved 37°C. Denne behandling gjør at to av de fire nukleotider som er komplementære til den 5' fremstikkende ende av Xbal spaltningsstedet fylles i:

De to nukleotider, dC og dT, ble innsatt og ga en ende med to 5' utstikkende nukleotider. Denne lineære rest av plasmid pHS32 (etter fenol og kloroformekstraksjon og gjenvin-ning i vann etter etanolpresipitering) ble spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragmentet ble skilt fra det mindre EcoRI-Xbal fragment ved PAGE og isolert etter elektroeluering. Dette DNA fragment fra pHS32 (0,2 yg) ble ligert under lignende betingelser som de ovenfor beskrevne til EcoRI-Taq I fragmentet av tryptofanoperonet (~0,01 ug) avledet fra pBRHtrp.

I ligeringsprosessen ligeres fragmentet fra pJS32 til Eco RI-Taq I fragmentet som beskrevet ovenfor, den Taq I utstikkende ende ligeres til den Xbal gjenværende fremstikkende ende selv om det ikke er fullstendig Watson-Crick base-paret:

En del av denne ligeringsreaksjonsblanding ble transformert i E. coli 294 celler, varmebehandlet og satt på LB plater inneholdende ampicillin. 24 kolonier ble utvalgt, dyrket i 3 ml LB medier og plasmidet isolert. Seks av disse ble funnet å ha Xbal stedet regenerert gjennom E. coli kataly-sert DNA reparasjon og replikasjon:

Disse plasmider ble også funnet å avspalte både med EcoRI og Hpal og å gi de forventede restriksjonsfragmenter. Et plasmid, kalt pTrp 14, ble brukt for ekspresjon av heterologe polypeptider som omtalt i det følgende.

Plasmid pHGH207 ble Eco RI behandlet og trp promoteren som inneholdt et 300 b.p. Eco RI fragment ble oppnådd ved PAGE etterfulgt av elektroeluering. 300 b.p. Eco RI fragmentet inneholder E. coli trp promotoren, operatoren og trp leaderribosombindingsstedet,men mangler en ATG sekvens for påbegynnel-

se av translasjon. Dette DNA fragment ble klonet i Eco RI stedet til pLelF A.

Det nettopp nevnte trp fragment er en analog av E. coli tryptofanoperonet fra hvilke den såkalte trp attenuåtor er fjernet for kontrollerbart å øke ekspresjonsnivåer. Ekspresjonsplasmidet som inneholder det modifiserte trp regulon,

kan dyrkes til forutbestemte konsentrasjoner i næringsmedier som inneholder tilsatt tryptofan i tilstrekkelige meng-

der til å hemme promoteroperatorsystemet, deretter befris for tryptofan for å oppheve hemningen av systemet og forårsake ekspresjon av det tilsiktede produkt.

Nærmere bestemt ble 250 pg plasmid pL31 behandlet med Pst I

og 1000 b.<p.> innsatsen isolert ved gelelektroforese på en polyakrylamidgel. Ca. 4 0 p. g sats ble elektroeluert fra gelen og oppdelt i 3 alikvoter for videre behandling: a) En 16 ug prøve av dette fragment ble delvis behandlet med 4 0 enheter Bgl II i 45 min. ved 37°C og reaksjonsblandingen renset på

en polyakrylamidgel. Ca. 2 ^ig av det ønskede 67 0 b.p. fragment ble gjenvunnet, b) Fn annen prøve (8 pg) av 1000

b.p. Pst I innsatsen ble spaltet med Ava II og Bgl II.

En pg av det angitte 150 b.p. fragment ble isolert etter gelelektroforese. c) 16 ^ug av 1000 b.p. stykket ble behandlet med Sau 3a og Ava II. Etter elektroforese på en polyakrylamidgel ble ca. 0,25 .ug (~10 pmol) av 34 b.p. fragmentet isolert. De to angitte deoksyoligonukleotider, 5'-dAATTCATGTGT ('fragment 1) og 5'-d GATCACACATG (fragment 2)

ble syntetisert ved fosfortriestermetoden (Maxam og Gilbert, Methods Enzymol. 65, 499-560 [1980]). Fragment 2 ble fos-

32

forylert som følger. 200 pl (~40 pmol) av (y P)

ATP, 5000 Ci/mmol) ble tørket ned og resuspendert i 30 ul

60 mM Tris-HCl (pH8), 10 mM Mgd2, 15 mM &-merkaptoetanol, inneholdende 100 pmol DNA fragment og 2 enheter T4 polynukleo-tidkinase. Etter 15 min. ved 37°C ble 1 pl 10 mM ATP tilsatt ,og reaksjonen fikk fortsette ytterligere 15 min. Blandingen ble deretter oppvarmet ved 70°C i 15 min., kombinert med 100 pmol 5<1->OH fragment 1 og 10 pmol av 34 b.p. Sau 3a -

Ava II fragmentet. Ligering ble utført i 5 timer ved 4°C i

50 pl 20 mM Tris-HCl (pH7,5) lOmM Mg Cl2, lOmM ditiotreitol, 0,5mM ATP og 10 enheter T4 DNA liga se. Blandingen ble underkastet elektroforese på en polyakrylamidgel og 4 5 b.p.-produktet gjenvunnet ved elektroeluer ing .Radioaktivitet på 860 000 Cérenkov cpm ble gjenvunnet (~30 ng, 1 pmol), kombinert med 0,5 pg (5 pmol)

av 150 b.p. Ava II - Bgl II fragment og 1 pg (2 pmol) av 670 b.p. Bgl II - Pst I fragmentet. Ligeringen ble utført ved 20°C i 16 timer ved bruk av 20 enheter T4 DNA ligase.

Ligasen ble inaktivert ved oppvarming til 65°C i 10 min. Blandingen ble så behandlet med Eco RI og Pst I for å eli-

minere polymerer av genet. Blandingen ble renset ved 6% polyakrylamidgel elektroforese. 36000 cpm (~0,04 pmol,

20 ng). av 865 b.p. produkt ble isolert. Halvparten (10 ng)

av dette ble ligert i pBR322 (0,3 pg) mellom Eco RI og Pst I steuer. Transformering av E. coli 294 ga 7 0 tetracyklin-resistente, ampicillinsensitive transformanter. Plasmid-

DNA isolert fra 18 av disse transformanter ble behandlet med

Eco RI og Pst I. 16 av de 18 plasmider hadde et Eco RI-Pst I fragment 865 b.p. i lengde. Et pg av et av disse, pLe-IF Al,

ble behandlet med Eco RI og ligert til et 300 b.p. Eco RI fragment (0,1 pg) inneholdende E. coli trp- promotoren og trp leaderribosombindingsstedet, fremstilt som beskrevet ovenfor. Transformanter inneholdende trp promotoren ble identifisert ved å bruke en 3 2P-trp prøve i sammenheng med Grunstein-Hogness kolonisøkingsmetoden--Grunstein et al.

[Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 72, 3961 (1975)]. I-t a .symmet-risk lokalisert Xba I sted i trp fragmentet muliggjorde bestemmelse av rekombinanter hvori trp promotoren var orientert i retningen til LelF A genet.

Ekstrakter ble fremstilt for IF bestemmelse som følger. En ml kulturer ble dyrket i L medium inneholdende 5 ug/ml tetracyklin til enOD^^ på ca. 1,0, deretter fortynnet i 25 ml 119 medium inneholdende 5 pg/ml tetracyklin. 10 ml prøver ble høstet ved sentrifugerin^ nårOD^rn nådde 1,0 og celle-55 U

klumper ble oppslemmet i 1 ml 15% sukrose, 50 mM Tris-HCl

(pH 8,0), 50mM EDTA. Et mg lysozym ble tilsatt og, etter

5 minutter og 0°C, ble celler lysert ved ultralyd. Prøvene ble sentrifugert 10 minutter ved 15 000 rpm i en Sorvall SM-24 sentrifuge. Interferonaktivitet i supernantantene ble bestemt ved sammenligning med LelF standarder ved den cyto-patiske effekt (CPE) inhiberingsbestemmelse. For å bestemme antallet IF molekyler pr. celle ble en LelF spesifikk aktivitet på 4x10 Q enheter/mg anvendt [Rubinstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 76 , 640 [(1979)].

Klon pLe-IF A trp 25,hvori trp promoteren var innsatt i den ønskede orientering,gir høye aktivitetsnivåer (så høyt som 2,5xl0<8> enheter pr. liter). IFet fremstilt av E. coli K-12 stamme 294/pLe-IF A trp 25 opptrer likt med autentisk human Le-IF; det er stabilt overfor behandling ved pH2 og nøytra-liseres av kanin antl-human leukocyttantistoffer. Interfe-ronet har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 20 000.

Isolering av cDNAer for ytterligere leukocyttinterferoner. DNA fra det fullstendig karakteriserte Le-IF A cDNA-inneholdende plasmid ble spaltet med Pst I, isolert elektrofore-tisk og merket ved en publisert metode [Taylor et al., Biochem, Biophys. Acta. 442, 324 (1976)] med 3 2P. Det resulterende radioaktivt merkert DNA ble brukt som en prøve for å undersøke ytterligereE. coli 294 transformanter ved en in situ koloniundersøkelsesmetode, Grunstein et al., supra. Kolonier ble isolert som hybridiserte i forskjellige grader med prøven. Plasmid DNA fra disse kolonier og de to hybri-diserende kolonier nevnt ovenfor ble isolert ved Pst-spalt-ing og karakterisert ved tre forskjellige metoder. Først ble disse Pst fragmenter karakterisert ved deres restriksjons-endonukleasebehandlingsmønstre med enzymene Bgl II, Pvu II

og Eco RI. Denne analysen muliggjorde klassifisering av minst 8 forskjellige typer (Le-IF A, Le-IF B, Le-IF C, Le-IF D, Le-IF E, Le-IF F, Le-IF G og Le-IF H) som omtrent gir loka-liseringen av forskjellige restriksjons seter i for-

hold til den nå kjente forsekvens og kodesekvens for Le-IF A. En av disse, Le-IF D, antas å være identisk med det som er angitt av Nagata et al., Nature 284, 316 (1980).

For det andre ble visse av DNAene prøvet ved en publisert hybridiseringsutvalgsbestemmelse, Cleveland et al., Cell 20, 95 (1980), på evne til selektivt å fjerne Le-IF mRNA fra poly-A holdig KG-1 celle RNA. Le-IF A, B, C og F var positive ved denne bestemmelse. For det tredje ble de siste Pst fragmenter innsatt i et ekspresjonsplasmid, E. coli 294 transformert med plasmidet og fragmentene uttrykt. Ekspresjonsproduktene som antas å ha vært preinterferoner, var alle positive ved CPE bestemmelse på interferonaktivitet,

om enn marginalt aktive i tilfellet Le-IF-F fragmentet. I tillegg til det foregående har alle de beskrevne Le-IF typer blitt sekvensbestemt.

Andre fullstendige leukocyttinterferoner.

Sekvensen til det isolerende fragment bestående av genet for fullstendig Le-IF-B viser de første fjorten nukleotider av typer A og B identiske. Det ble følgelig foreslått å isolere et fragment fra pLe-IF A25 som bærer trp-promoteroperatoren, ribosombindingsstedet og starten av Le-IF (A=B) genet, og kombinere dette med den gjenværende del av B sekvensen i et ekspresj onsplasmid.

For å oppnå det ca. 950 b.p. Sau 3a til Pst I fragment fra sekvensen vist i figur 1, var flere trinn nødvendige p.g.a. nærværet av en eller flere intervenerende Sau 3a restriksjonssteder, dvs.:

1. De følgende fragmenter ble isolert:

a) 110b b.p. fra Sau 3a til Eco RI; b) 132 b.p. fra Eco RI til Xba;

c) >700 b.p. fra Xba til Pst.

2. Fragmentene (la) og (lb) ble ligert og kuttet med Xba og

Bgl II for å utelukke selv-polymerisasjon gjennom Sau 3a og Xba slutt-terminaler (det relevante Sau 3a stedet var innenfor et Bgl II sted; Bgl II deler og gir en Sau 3a bindende ende). Et 242 b.p. fragment ble isolert. 3. Produktet fra (2 ) og (lc) ble ligert og spaltet med Pst I og Bgl II, igjen for å forhindre selv-polymerisasjon. Et ca. 950 b.p. fragment, Sau 3a til Pst I i figur 7a, ble isolert. Dette fragment bestod av den del av Le-IF B genet som ikke var felles med Le-IF A. 4. Et ca. 300 b.p. fragment (Hind III til Sau 3a) bestående av trp promotor-operator, ribosombindingssted, ATG startsig-nal og cysteinkodon for Le-IF A ble isolert fra pLe-IF A25. 5. Et ca. 3600 b.p. fragment Pst I til Hind III ble isolert fra pBR 322. Dette bestod av replikonet og var innkodet tetracyklirr,men ikke ampicillinresistens. 6. Fragmentene erholdt i trinnene 3,4 og 5 ble trippel-ligert og det resulterende plasmid transformet i E. coli K-12 stamme 294.

Transformantene ble miniprøvet, Birnboim et al., Nucleic Acid Research 7, 1513 (1979) og plasmidprøver ble behandlet med Eco RI. Behandlingene ga tre fragmenter karakteristiske for: 1) Eco RI-Eco RI trp promotorfragmentet; 2) Det interne Eco RI fragment for pL4; og 3) proteintranslasjonssignal til Eco RI fragment for pL 4.

I CPE bestemmelsen viser bakterielle ekstrakter fra kloner fremstilt på den foregående måte gjerne ca. 10 x 10^ enheter interferonaktivitet pr. liter ved OCj-^g = 1. Et representativt klon fremstilt på denne måten er 294/pLIF B trp 7.

Videre fullstendige leukocyttinterferoner.

Ytterligere full-lengde genfragmenter som består av andre Le-IF typer, kan settes sammen og plasseres i ekspresjonsbærere for ekspresjon som i tilfellet av Le-IF A. Fullstendig sekvensbestemmelse på vanlig måte vil vise om et restrik-sjonssted ligger tilstrekkelig nær det første aminosyrekodon for den fullstendige interferontype til å muliggjøre lett tilgang til den metode som anvender eliminering av forsek-vensen ved restriksjonsspaltning og erstatning av kodoner for de endeterminale aminosyrer tapt i forsekvenselimineringen ved ligering av et syntetisk DNA-fragment som beskrevet ovenfor. Hvis så ikke er tilfelle,kan fremgangsmåten som er beskrevet

i Kleid et al., ovenfor anvendes. Kort betyr dette spaltning av det forsekvensholdige fragment rett før det punkt ved hvilket kodonet for den første aminosyre av det fulltendige polypeptid begynner ved:

1. å overføre det dobbeltkjedede DNA til enkeltkjedet DNA

i et området rundt det punktet; 2. å hybridisere til det enkeltkjedede området dannet i trinn (a) en komplementær primerlengde av enkeltkjedet DNA, idet 5' enden til primeren ligger motsatt av nukleo-tidet tilsluttet "det tilsiktede snaltningssted; 3. å restaurere den del av den andre kjede som er eliminert i trinn 1 som ligger i 3' retningen fra primeren ved om-setning med DNA polymerase i nærvær av adenin, tymin,

guanin og cytosinholdige deoksynukleotidtrifosfater; og

4. å behandle den gjenværende enkeltkjedede lengde av DNA som stikker frem forbi det tilsiktede spaltningspunkt.

En kort lengde av syntetisk DNA som slutter ved 3' ende til kodekjeden med translasjonsstartsignalet og ATG kan så ligeres ved, f.eks., stump endeligering til det resulterende sammensatte gen for" de fullstendige interf eroner, og genet innsettes i et ekspresjonsplasmid og bringes under kontroll

av en promotor og dets tilknyttede r ibosomhi nd .i n<g>ss ted .

På lignende måte som anvendt ovenfor/ ble genfragrncnter som koder forLe-IF-C og Le-IF-D konstruert riktig for direkte bakteriell ekspresjon. Ekspresjonsstrategien for disse ytterligere leukocyttinterferoner inneholdt i hvert tilfelle mulighet til ca. 300 b.p. fragmentet (Hind III til Sau 3a) bestående av trp promotor-operator, ribosombindingssted, ATG start-signal og cysteinkodon for Le-IF A fra pLe-IF A25. Til dette ble det kombinert genfragmenter fra de ytterligere interferon-gener som koder sine respektive aminosyresekvenser forbi det opprinnelige cystein felles for alle. Hvert resulterende plasmid ble brukt til å transformere F. coli K-12 stamme 294. Ligeringer for å danne de respektive gener var som følger:

Le IF- C

Isolere de følgende fragmenter fra pLe IF-C:

(a) 35 b.p. fra Sau 3a til Sau 96

(b) > 900 b.p. Sau 96 til Pst I

(c) Isolere et ca. 300 b.p. fragment (Hind III - Sau 3a)

fra pLe IF A-25 som i del N (4) ovenfor.

(d) Isolere ca. 3600 b.p. fragment fra del N (5) ovenfor.

Konstruksjon:

(1) Ligere (a) og (c). Spalte med Bgl II, Hind III og isolere det ca. 335 tr.p. produktet.

(2) Trippelligere (1) + (b) + (d) og transformere E. coli

med det resulterende plasmid.

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli

K-12 stamme 294/pLe IF C trp 35.

Le- IF D

Isolere fra pLe IF-D:

a) 35 b.p. fra Sau 3a til Ava II

b) 150 b.p. fra Ava II til Bgl II

c) ca. 700 b.p. fra Bgl II til Pstl

Isolertt fra pLe IF A25:

d) 300 b.p. fra Hind III til Sau 3a

Isolert fra PBr 322:

e) ca. 3600 b.p. fra Hind III til Pst I

Konstruksjon:

(1) ligere (a) + (b), dele med Bgl II og rense et 185 b.p. produkt (1). (2) ligere (1) + (d), dele med Hind III, Bgl II og rense det ca. 500 b.p. produktet (2). (3) ligere (2) + (c) + (e) og transformere F,. coli med det resulterende plasmid.

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF D trp 11.

Le- IF F

Det Le-IF F holdige fragment kan settes sammen for direkte ekspresjon gjennom en genspleisin<g> som er gjort enkel ved denne fullstendige^ homclogi av aminosyrene 1-13 av Le-IF B og Le-IF F. Et trp promotorholdig fragment (a) med riktig konstruerte ender erholdes fra pHGH 207, beskrevet ovenfor, via Pst I-og Xba I-behandling etterfulgt av isolering av ca. 1050 b.p. fragmentet. Et andre fragment (b) oppnås som det større av fragmentene som resulterer av Pst I og Bgl II behandling av plasmidet pHKY 10, et derivat av pBR322 som inneholder et Bgl II sted mellom tetracyklinresistenspromo-teren og det strukturelle gen. Fragment (a) inneholder ca. halve genet som koder for ampicillinresistens,fragment (b) inneholder resten av dette genet og hele genet for tetracyklinresistens bortsett fra den assosierte promoter. Fragmentene (a) og (b) kombineres gjennom T4 ligase,og produktet behandles med Xba I og Bgl II for å eliminere dimerisering, under dannelse av et fragment (c) bestående av trp promoter-operator og gener for tetracyklin og ampicillinresistens.

Et fragment (d) på ca. 580 b.p. erholdes ved Ava II og Bgl II behandling av pLe IF-F. Dette består av kodoner for aminosyrer 14-166 av Le-IF F.

Et fragment (e) (49 b.p.) oppnås ved Xba I og Ava II behandling av pLe-IF B. Fragment (e) koder aminosyrer 1-1.3 i Lc-IF F.

Fragmenter (c), (d) og (e) trippel-ligeres i nærvær av T4 ligase. De festende ender av de respektive fragmenter er slik at det sammensatte plasmid ringslutter riktig og brin-ger tetracyklinresistensgenet under kontrollen av trp promotor-operatoren sammen med genet for fullstendig Le-IF F, slik at bakterier transformert med det ønskede plasmid kan utvelges på tetracyklinholdige plater. Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 294/ pLelF F trp 1.

Le- IF H

Det fullstendige Le-IF H gen kan konstrueres for ekspresjon som et fullstendig leukocyttinterferon som følger: 1. Plasmid pLe-IF H behandles med Hae II og Rsa I under isolering av 816 baseparfragmentet som går fra signalpeptid-aminosyre 10 til det 3' ikke-kodende området. 2. Fragmentet denatureres og underkastes reparasjonssyn-tese med Klenow fragment, Klenow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 65, 168 (1970) ved å anvende den syntetiske deoksy-ribooligonukleotidprimer 5'-dATG TGT AAT CTG TCT. Denne generelle metode er også beskrevet av Goeddel et al., U.S. ans. nr. 190799, innlevert 25. september, 1980. 3. Det resulterende produkt spaltes med Sau 3a og et 452 basepar ("bp") fragment som inneholder aminosyrer 1 til 150 isoleres. 4. Sau 3a og Pst I behandling av pLelF H og isolering av det resulterende 500 b.p. fragment gir et gen som koder for aminosyrer 150 gjennom enden av kodesekvensen. 5. Fragmenter isolert i trinnene (3) og (4) ligeres under dannelse av et fragment:

som koder de 166 aminosyrer av Le-IF H.

6. pLelF A trp 25 behandles med Xba I, for avvisende ende med DNA polymerase I og produktet behandles med Pst I. Det store resulterende fragment kan isoleres og ligeres med produktet fra trinn (5) under dannelse av et ekspresjonsplasmid som etter transformering av E. Coli K-12 stamme 294 eller andre vertsbakterier/ blir i stand til å uttrykke fullstendig Le-IF H.

LeIF- I

Fag K Charon 4A rekombinant samling for det humane genom som er konstruert av Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978), ble gjennomsøkt etter leukocyttinterferongener ved fremgangs-måter som er beskrevet av Lawn et al., supra, og Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978). Fn radioaktiv LelF prøve avledet fra cDNA klonet LelF A (Goeddel et al., Nature 287, 411

(1980), ble brukt til å undersøke ca. 500 000 plater. Seks LelF genomkloner erholdtes i denne undersøkelsen. Etter gjentatt undersøkelse og platerensing ble enav disse kloner, XHLeIF2 utvalgt for videre analyse.

Ved å bruke den ovenfor beskrevne metode,kan andre prøver med fordel brukes til å isolere ytterligere LelF kloner fra det humane genom. Disse kan igjen anvendes til å fremstille ytterligere leukocyttinterferonproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse.

1. 2000 basepar Eco RI fragment fra det genomiske klon ( AHLeIF2) ble subklonet i pBR325 på Eco RI stedet. Det resulterende plasmid LelF I ble spaltet med- Eco RI og 2000 basepar-fragmentet isolert. Deoksyoligonukleotidet dAATTCT GCAG (en Eco RI >Pst I konvertor) ble ligert til 2000 basepar -Eco RI-fragmentet,og det resulterende produkt spaltet med Pst I ,hvilket ga et 2000 baseparfragment inneholdende Pst I ender. Dette ble spaltet, med Sau 96, og et .11.00 basopar-fraament ble isolert som hadde en Pst I ende og en Sau 9G ende. \ ,;

2. Plasmidet pLelF C trp 35 ble behandlet med Pst I og Xba

I. Det store fragment ble isolert. 3. Det lille Xba I - Pst I fragment fra pLelF C trp 35 ble behandlet med Xba I og Sau 96. Et 40 basepar Xba I - Sau

96 fragment ble isolert.

4. Fragmentene isolert i trinn 1), 2] og 3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmidet pLelF I trp 1.

LeIF- J

1. Plasmidet pLelF J inneholder et 3,8 kilobase Hind III fragment for humant genomisk DNA som inneholder LelF J gen-sekvensen. Et 760 basepar Dde I - Rsa I fragment ble isolert fra dette plasmidet. 2. Plasmidet pLelF B trp 7 ble spaltet med Hind III og Dde I og et 340 bp Hind III - Dde I fragment isolert. 3. Plasmidet pBR322 ble spaltet med Pst I, fikk avvisende ende ved inkubering med DNA Pol I (Klenow fragment), deretter behandlet med Hind III. Det store (~3600 bp) frag-

ment ble isolert.

4. Fragmenter isolert i trinn 1), 2) og 3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmidet pLelF J trp 1.

Metodene og materialene som anvendes i de følgende konstruksjoner var som i den foregående beskrivelse. Den følgende tabell 1 gir detaljer for spesielle konstruksjoner av hybrid LelF plasmider herav: I tabell I er de første fire beskrevne hybrid l.olFer fremstilt fra to LelF ekspresjonsplasmider. Ft Bql IT sted fei-les for LelF A og D cDNAer er brukt for å konstruere et ek-spres jonsplasmid pLelF trp AD (Bgl II) som koder for de 6 3 aminoterminale aminosyrer av LelF A og de 102 karboksyterminale aminosyrer av LelF D. Det samme sted ble brukt i konstruksjonen av et ekspresjonsplasmid pLelF trp DA (Bql II) som koder for 64 aminoterminale aminosyrer av LelF D og 102 karboksyterminale aminosyrer av LelF A. Pvu Il-setet er blitt brukt i konstruksjonen av to andre hybridinterferonek-spresjonsplasmider: 91 aminoterminale aminosyrer av A med 74 karboksyterminale aminosyrer av D (pLelF trp AD (Pvu II)) og 92 aminoterminale aminosyrer av LelF D med 74 karboksyterminale aminosyrer av LelF A (pLelF trp DA (Pvu II)). Sammen-fattet: pLelF AD trp ( Pvu II): Det store (~3900 bp) fragment av et Xba I og Pst I behandlingsprodukt av pLelF A trp 25 ble ligert med et 285 bp Xba I-Pvu II fragment av pLelF A trp 25 og et ca. 550 bp Pvu II-Pst I fragment av <p>LelF D trp 11;

pLelF DA trp ( Pvu II): Det store (~3900 bp) fragment av et Xba I og Pst I behandlingsprodukt av pLelF A trp 25 ble ligert med et 288 bp Xba I-Pvu II fragment av pLelF D trp 11 og et ca. 550 bp Pvu II-Pst I fragment av pLelF A trp 25;

pLelF AD trp ( Bgl II): Det store fragment fra et Bgl II,

Pst I behandlingsprodukt av pLelF A trp 25 ble ligert med

et ~600 bp Bgl II-Pst I fragment fra pLelF D trp 11; og

pLelF DA trp ( Bgl II): Det store fragment fra et Bgl II og Pst I behandlingsprodukt av pLelF D trp 11 ble ligert til et ca. 700 bp fragment erholdt ved Pst I spaltning av pLelF A trp 25 etterfulgt av partiell Bgl II behandling.

I det femte angitte hybrid:

pLelF AB trp ( Pvu II): Det store (~3900 bp) fragment av et Xba I og Pst I behandlingsprodukt av pLelF A trp 25 ble lig-

etrt med et 235 bp Xba I - Pvu II fragment av pLelF A trp 25

og et ca. 750 bp Pvu II (partiell) - Pst I fragment av pLelF

B trp 7.

På lignende måte er de andre konstruksjoner angitt i tabell

I således definert. Som et videre eksempel kan man i konstruksjonen av et LelF C og/eller LelF H-del holdig hybrid dra fordel av de felles Bbv I steder som opptrer rundt nukleotid 294 (dvs. GCTGC) av gensekvensene.

På lignende måte kan egnede plasmider for den mikrobielle ekspresjon av andre nye hybridleukocyttinterferoner dannes ved riktig manipulering av dobbeltkjedet DNA som koder eller deler av aminosyresekvensene av naturlig forekommende leukocyttinterferoner. Først utvelges et første dobbeltkjedet DNA-fragment som koder for aminoterminalen av en første naturlig forekommende leukocyttinterferon-aminosyresekvens og, fortsatt derfra i 3' retningen, en betydelig del av aminosyresekvensen derav. Fragmentet består av et restriksjonsendonuklease-spaltningssted plassert nær kodoner for aminosyre "n" av det første leukocyttinerferon, idet n aminosyrer utgjør en hovedsakelig del av aminosyresekvensen til det første interferon. Spaltning med restriksjonsendonuklease gir et fragment bestående av aminoterminalen til det første interferon og kodoner for ca. n aminosyrer. Et andre fragment bestående av hele eller en del av kodonene for aminosyresekvensen til et andre, forskjellig leukocyttinterferon utvelges, og fragmentet omfattende et spaltningssted for en identisk restriksjonsendonuklease plassert nær kodoner for den aminosyre av det andre interferon hvis aminosyre-antall (utfra aminoterminalen til det andre interferon) er ca. 166-n. Spaltning av det andre fragment med denne restriksjonsendonuklease gir et produkt komplementært til den "n"-terminale del av behandlingsproduktet fra det første fragment, slik at behandlingsproduktet til det andre kan ligeres til det fra det første under gjendannelse av restriksjons-ehdonukleasegjenkjennelsesstedet og rekonstituere kodonet for aminosyre n i det første interf eron,hvor dette er tapt i begyn-nelsesbehandlingen. Produktet fra restriksjonsendonuklease-behandlingen av det andre fragment fortsetter fortrinnsvis fra den ende som kommer av spaltning i 3' retningen gjennom nukleotider som koder karboksyterminalen til det andre leukocyttinterf eron .

Alternativt kan hybrider inneholdende hovedsakelige deler

av aminosyresekvensene til mer enn to naturlig forekommende leukocyttinterferoner dannes, i hvilket tilfelle f.eks. det andre ovenfor nevnte fragment i tillegg velges å inneholde et andre restriksjonsendonukleasested nedstrøms fra det første, idet det andre sted er identisk med et lignende plassert sted i et fragment som koder den karboksyterminale del av et tredje leukocyttinterferon osv.

I det nevnte eksempel kan produktene av påfølgende restrik-sjonsendonukleaseoperasjoner trippellegeres under dannelse av et hybridgen som koder den aminoterminale del av et første interferon, midtområdeaminosyresekvensen til den andre og den karboksyterminale del av den tredje, (eller i en annen variasjon av den første, hvor det første og tredje interferon er det samme)..

Fortrinnsvis utledes det første ovenfor nevnte fragment

fra et ekspresjonsplasmid, dvs. en hvori kodoner for den aminoterminale del av det første leukocyttinterferon forut-, gåes av et ATG eller annet translasjonsinitieringskodon og et promoter eller promoter-operator-system. Som et resultat vil sluttproduktet av manipuleringsoperasjonene beskrevet ovenfor være et plasmid som kan uttrykke polypeptidet kodet for av hybridgenet i bakterier eller andre mikrobielle organis-mer transformert med plasmidet. Andre midler for konstruksjon av det hybride gen for mikrobiell ekspresjon vil være velkjent for en fagmann.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen koder hybridgenene en ny leukocyttinterferonaminosyresekvens på 165-166 aminosyrer som utgjør et konjugat av hovedsakelige aminosyresekvenser tatt fra to eller flere forskjellige leukocyttinterferoner valgt fra LelF A, LelF :B,

Leif D, som angitt i fiq. 3. Fortrinnsvis omfatter de nye leukocyttinterferoner kodet for av hybridgenene av aminosyrene som er spesifisert og anbragt som angitt i sekvensen "All" i figur 3. Ekspresjonsproduktene av plasmidene anvendt ifølge oppfinnelsen kan undersøkes med hensyn til antivirusaktivitet på vanlig måte som i det følgende er beskrevet i biologiske aktivitets-bestemmelser.

PÅVISNING AV ANTIVIRUSAKTIVITET

E. coli K-12 stamme 294 ble normalt transformert med plasmidene pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) og pLelF trp D/A (Bgl II). Transformantene ble dyrket separat i 5 ml kulturer i L medium inneholdende 5 mg pr. ml tetracyklin til en OD55Q ^ ca' 1'°' deretter fortynnet til 1 liter avM9 me-diet inneholdende 5jug/ml tetracyklin. Celler ble høstet når ODj^0 nådde 1,0 og celleaggregater oppslemmet i 10 ml 15% sukrose, 50 mM tris-HCl (pH 8,0), '50 mM EDTA. 10 mg lysozym ble tilsatt og, etter 5 minutter ved 0°C ble cellene destruert med uliralyd. Prøvene ble sentrifugert 10 minutter ved 15000 rpm i en Sorvall SM-24 sentrifuge. Interferonaktivitet i supernatan-tene ble undersøkt med hensyn til antivirusaktivitet.

Utbyttene pr. liter kultur av disse interferoner, titrert på en humancellelinje (WTSH), er vist i tabell 2, fra hvilken det er tydelig at LeIF-A/D aktivitet fremstilles i større mengde enn de andre interferoner. Denne forskjell kunne skyldes større iboende aktivitet av LeIF-A/D eller større utbytte uttrykt som mg protein av dette interferon. Fordi den gene-tiske oppbygning var identisk for alle disse interferoner synes det mest sannsynlig atLeIF-A/D hovedsakelig har større aktivitet enn de andre interferoner.

Styrken til de forskjellige interferoner i et område av pattedyrcellelinjer ble bestemt, (human, WISH; Afrikansk grønn ape, VERO; hamsterfibroblast, BHK; kaninnyreceller, RK-13; mus L-929; og storfenyre, MDBK celler). For å sammen-ligne den relative aktivitet av interferonene, ble deres aktivitet beregnet på forskjellige celler i forhold til deres aktivitet på WISH celler regnet som 100. Resultatene i tabell 3 viser at LeIF-A/D har meget høy aktivitet i VERO og L-929 celler mens LeIF-D/A har lav aktivitet i disse . cellelinjer. Disse resultater indikerer at kombinasjonen av den N-terminale del av LeIF-A og den C-terminale del av LelF-D i et molekyl (LeIF-A/D) gir hybridproteinet spesiell styrke som er fastslått i flere <p>attedyrsarter. Videre er disse egenskaper ikke ganske enkelt summeringen av egen-skapenen til moderinterferonene. Dette sees klart i tilfellet aktivitet på L-929 celler (tabell 3) i hvilket tilfelle verken en blanding av LeIF-A og LeIF-D eller det andre hybrid, LeIF-D/A har signifikant aktivitet.

Aktiviteten til LeIF-A/D mot andre virus ble også undersøkt. Dataene i figur 5 viser antivirusvirkninger mot EMC virusinfeksjon i L-celler og dataene i figur 6 viser virkninger mot VSV infeksjon i L-celler. Fra disse data er det klart at den større aktiviteten til Le.IF-A/D ikke er begrenset til en virus (VSV) og dens sterkere aktivitet er sannsynlig en generell egenskap mot mange virus. Naturlig humane brun-gule belegginterferonpreparater har ingen virkning mot museceller (se tabell 2). Aktiviteten til LeIF-A/D mot EMC virusinfeksjon i CD-1 mus ble derfor undersøkt. Resultatene i figur 7 viser at LeIF-A/D er ekstremt sterk mot dødelig EMC virusinfeksjon og LeIF-A også har antivirusaktivitet som er å forvente fra aktiviteten i cellelinjer (tabell 2). Dataene i figur 7 følger av behandlinger i.p. 3 timer før infeksjon. Doseringer av LeIF-A/D og LeIF-A er som titrert på WISH.

Letal EMC virusinfeksjon på hamstere påvirkes også av LelF-A/D og LeIF-A (figur 8), idet førstnevnte er mest effektiv, og brungult belegginterferon viser bare en liten og statis-tisk insignifikant virkning. I tilfellet i figur 8 ble alle interferoner gitt i.p. 3 timer før infeksjon i en dose på 5xl0<5> pg/ kg, titrert på WISH celler.

Disse resultater angir at de utpregede antivirusvirkningene til LeIF-A/D i et område av pattedyrarter ikke er begrenset til cellekulturer men også observeres i letale virusinfeksjoner .

EMC virus kan betraktes som et modellsystem, mot hvilke en påvisning av antivirus effekt kan være forutsigbar for antivirus effekt mot den representerte familievirus, f.eks. pikor-navirusfamilien hvorav munn- og klovsyke og polio er medlem-mer. VSV virus kan ansees som et modellsystem, mot hvilke en påvisning av antivirus kan være forutsigbar for anti-viruseffekt mot den representerte familie av virus, f.eks. rhabdovirusfamilien hvorav rabies er et viktig medlem.

Tabell 4 viser tabullarisk aktivitetene til forskjellige av LelF hybridene herav på WISH og MDBK celler og aktivitets-forholdene derav:

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av hybrid humanleukocyttinterferon på 165-166 aminosyrer og omfattende en diskré aminosyre subsekvens av humanleukocyttinterferon A og en diskré aminosyre subsekvens fra humanleukocyttinterferon B eller D, hvor den totale aminosyresekvens av nevnte hybride humanleukocyttinterferon er forskjellig fra sekvensen til naturlig forekommende leukocyttinterferoner, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å dyrke en mikroorganisme transformert med et plasmid som koder for og er i stand til å indusere ekspresjon av det hybride humanleukocyttinterferon i mikroor-ganismen og å isolere det hybride humanleukocyttinterferon fra kulturen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at N-terminaldelen av det antivirale polypeptid som uttrykkes omfatter aminosyrene 1-92 av LeIF-D dvs samt at den karboksyterminale del derav omfatter aminosyrene 92-165 av LeIF-A dvs

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den N-terminale del av det antivirale polypeptid som uttrykkes omfatter aminosyrene 1-91 av LeIF-A dvs samt at den karboksyterminale del derav omfatter aminosyrene

93-166 av LeIF-D dvs

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den N-terminale del av det antivirale polypeptid som uttrykkes omfatter aminosyrene 1-63 av LeIF-D dvs. samt at den karboksyterminale del derav omfatter aminosyrene 63-165 av LeIF-A dvs.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den N-terminale del av det antivirale polypeptid som uttrykkes omfatter aminosyrene 1-62 av LeIF-A dvs. samt at den karboksyterminale del derav omfatter aminosyrene

64-166 av LeIF-D dvs

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den N-terminale del av det antivirale polypeptid som uttrykkes omfatter aminosyrene 1-91 av LeIF-A dvs samt at den karboksyterminale del derav omfatter aminosyrene 93-166 av LeIF-B dvs.