FR2481316A1 - Technique a adn de recombinant pour la preparation d'une proteine ressemblant a l'interferon humain - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE TECHNIQUE A ADN DE RECOMBINANT. L'INVENTION A PLUS PARTICULIEREMENT POUR OBJET UN GENE POUR L'EXPRESSION D'UNE PROTEINE POSSEDANT DES PROPRIETES QUI RESSEMBLENT A CELLES DE L'INTERFERON HUMAIN. L'INVENTION CONCERNE EGALEMENT LA PRODUCTION ET LA FABRICATION D'UN TEL GENE. DE TELS GENES PEUVENT ETRE INSERES DANS DES VECTEURS DE PLASMIDE ET, PAR CONSEQUENT, DANS DES CELLULES QUE L'ON PEUT CULTIVER POUR EXPRIMER LES PROTEINES VOULUES.

Description

La présente invention concerne une technique à
ADN de recombinant en vue de la préparation dune protéine ressemblant à i'interféron humain.

L'interféron est une molécule naturelle qui est produite par des cellules en réponse à une infection virale et à certains autres stimulis, (voir, par exemple, Isaacs A.

et Lindenmann J., Proc. Roy. SocO B., (1957), 147, 258-257).

Cette molécule, lorsqu'elle est exposée à des cellules, rend ces cellules résistantes à l'infection virale.

Par conséquent, l'interféron constitue un agent antiviral bien connu (voir, par exemple, Isaacs A. et coll., (1957),
Proc. Roy. Soc. B., 147, 268-273).

Depuis l'observation originale de l'activité antivirale, on a attribué un certain nombre d'autres propriétés à l'interféron (voir, par exemple, Stewart W.E., Il,
Interferon I, (1979), Academic Press, I. Gresser (Ed.)), y compris un r81e potentiel d'inhibition de la croissance de cellules cancéreuses in vivo (voir, par exemple, Paucker
K. et coll., (1962), Virology, 7, 324-334; Gresser I. et colle, (1970), Ann. N.Y. Acad. Sci., 173, 694-699; Mellstedt
H. et coll., (1979), Lancet, 1, 245-247; Blomgren H. et col., (1976), Acta. Med. Scand., 199, 527-532; Merigan T.C. et coll., (1978), New Engl. J. Med., 298, 981-987 et Merigan T.C. et coi., (1978), New Engl. J. Med., 299, 1449-1453).

L'interféron manifeste également un degré marqué de spécificité vis-à-vis de I'espèce (cf. atre aubes Tyrell D.A.J., (1959), Nature, 184, 452-453 et Gresser I. et coll., (1974),
Nature, 251, 543-545), ce qui signifie que, pour le traitement d'une maladie humaine, on préfère l'interféron qui provient de cellules humaines.

Pour un rapport détaillé relatif à l'lnterféron, on peut se référer à l'ouvrage Texas Reports on Biology and
Medicine, 35, 1979, publié par la University of Texas Medical
Branch, Galveston, Texas, U.S.A., (S. Baron et F. Diazani,
Editeurs).

Quant aux sources classiques, les cellules de culture de tissu constituent la seule source pratique de matière, Un procédé qui se base sur des cellules de culture de tissu est considéré comme exigeant une quantité importante de travail, pas fiable, coûteux et donnant généralement de faibles rendements.

La présente invention a pour objet des moyens de préparation d'une protéine possédant des propriétés qui ressemblent à celles de l'interféron humain par la mise en oeuvre de techniques à ADN de recombinant dans des bactéries, qui sont meilleur marché et beaucoup plus fiables et qui offrent également la possibilité de produire des formes modifiées de l'interféron. Au surplus, on peut obtenir des rendements élevés en produit.

L'interféron est une glycoprotéiné qui possède un poids moléculaire d'environ 20.000. Les séquences polypeptidiques aminoterminales des interférons humains et de souris sont connues (voir, par exemple, Knight E. Jr. et coll., (1980), Science, 207, 525-526; Zoon K.C. et coll., (1980), Science, 207, 527; et Taira H. et coll., (1980),
Science, 207, 528-529).

Le schéma A qui termine le présent mémoire montre des régions choisies de ces séquences, en meme temps que des possibilités de codons correspondants. Parmi les treize aminoacides connus chez l'interféron de fibroblaste FS-4, trois sont communs (soulignés) aux interférons de souris
A et B que l'on obtient à partir de cellules de tumeur ascitique d'Ehrlich, cependant que seul un aminoacide est commun entre les interférons de lymphoblastoide et de fibroblaste humain. En fait, au niveau de l'ADN, il semble qu'il y ait plus de probabilité de similitude' entre l'interféron de fibroblaste humain et les interférons de souris
A et B (pointillé) qu'entre les deux protéines humaines.

La région correspondant aux cinq restes aminoterminaux de l'interféron de fibroblaste humain présente manifestement un nombre minimal de permutations d'oligonucléotides de codage sur une séquence de longueur suffisante pour être raisonnablement spécifique pour un mARN individuel dans une cellule eucaryote, (voir, par exemple, Nontgomery D.L. et coll., (1978), Cell, 14, 673-680). Les codons pour les restes de sérine et de leucine ont été déduits en choisissant d'abord les triplets les plus susceptibles de montrer une homologie maximale avec les codons de souris analogues.Les ambiguités subsistant alors dans ces triplets et les autres triplets ont ensuite été davantage réduites en agissant sur les fréquences connues d'usage de codons dans des gènes humains, (voir, par exemple, Grantham
R. et coll., (1980), Nucl. Acids Res., 8, r47-r62). Il a par conséquent été possible de réduire le nombre de séquences de codage potentielles à deux, ne différant seulement que par le troisième résidu ou reste du codon de sérine qui ne manifeste pas de discrimination claire dans cette position.Sur cette base, on a déduit les séquences de deux oligodésoxyribonucléotides (IFIA et lB) dont on attendait qu'ils amorcent spécifiquement la synthèse de l'interféron cADN lors de l'incubation avec la transcriptase réverse et le polyA-iiiÂRN (3'-mARN à polyadénylation terminale) provenant de cellules "induites".

Un facteur supplémentaire qui intervient dans la prévision de la structure d'amorceurs spécifiques visez vis du mARN d'interféron était la supposition qu'un reste ou résidu G dans 1'ADN pouvait former une paire de bases modéré- ment stable avec un reste ou résidu U dans l'ARN (ou un reste ou résidu T dans 1'ADN). Par conséquent, si, dans certaines positions, les amorceurs contenaient un résidu G au lien du résidu A correct, on pouvait encore s'attendre à un degré d'amorçage spécifique. (Voir, par exemple, Pokers G.J. et coll., (1975), J.A.C.S., 97,875-884).

Les oligonucléotides (IFIA et IB) ont été synthétisés et radioactivement marqués à l'aide de 32P-phosphate à leurs extrémités 5', hybridés à des préparations de mARN provenant de fibroblastes humains, "faussement induits" ou induits pour produire de l'interféron par amorçage avec de l'interféron et une superinduction subséquente en utilisant du poly(I):poly(C) et du cycloheximide et incubés avec 1' enzyme qu'est la transcriptase réverse avec les substrats de désoxynucléoside triphosphate classiques. Seul l'IFIA a donné un transcrit d'environ 150 nucléotides, spécifique vis-à-vis du mARN de fibroblastes induits. La séquence nucléotidique de ce transcrit à brin négatif a été déterminée par mise en oeuvre de procédés connus et est montrée sur le schéma B qui figure à la fin du présent mémoire.

Le brin supérieur dans le schéma B est la séquence du transcrit d'ADN. Cette séquence d'ADN définit la séquence de ltextrémité 5' du mARN d'interféron de fibroblaste humain, représenté comme le brin inférieur dans le schéma A. La séquence de mARN définit à son tour la séquence protéinique, commençant à partir du premier AUG de la région amino-terminale de la molécule de précurseur d'interféron présumé.

On a synthétisé un second oligodésoxynucléotide (IFII) qui était complémentaire à uneXpartie de la séquence déterminée comme indiqué sur le schéma C qui se trouve à la fin du présent mémoire. On a hybridé le [ 3ZPg IFII comme décrit plus haut à du cADN préparé par mise en oeuvre de procédés connus à partir du mARN total provenant de cellules de fibroblastes induites et faussement induites et d'un transcrit produit de la manière précédemment indiquée.

Lorsque l'on a fractionné les produits de cette réaction sur une base dimensionnelle en faisant appel à une électrophorèse à gel de dénaturation, on a obtenu un transcrit radioactif particulier d'environ 700 nucléotides à partir de cADN provenant de cellules induites mais non faussement induites.

Lorsqu'on l'a soumis à une électrophorèse à travers des gels natifs, le produit spécifique vis-à-vis de l'interféron avait une longueur d'environ 850 paires de bases (bp), correspondant approximativement à la dimension de la molécule de mARN d'interféron complète. Cette contradiction dimensionnelle peut être expliquée en présumant que le cADN d'interféron monocaténaire (à brin unique) tout en agissant commun gabarit pour 1'IFII, s'autoamorce en vertu de l'extrémité 3' se recerclant sur elle-même.Ce transcrit est ensuite allongé jusqu'à la position du transcrit amorcé à l'IFII où il est arrêté, engendrant ainsi un gène dtinter- féron bicaténaire (à double brin) de pleine longueur (C.àede un gène codant pour l'interféron), où l'extrémité 3' du transcrit autoamorcé et l'extrémité 5' du transcrit amorcé à l'IFII ne sont pas attachés par une liaison covalente.

Par conséquent, le calibre ou la dimension du produit spécifique vis-à-vis de l'interféron variera en fonction du type du système de gel.

Le gène d'interféron a été élué de gels natifs et séquencé par mise en oeuvre de procédés connus résultant de l'élucidation de la séquence de gène codant pour l'extrémité amino de l'interféron de fibroblaste mArc On a également réalisé une version allongée de IFII, IFIII (représentG sur le schéma D qui figure en fin du présent mémoire) et on a répété le procédé décrit plus haut On a obtenu les mêmes résultats.

Cette séquence confirme largement les prévisions utilisées dans la synthèse de 1'IFIA. On peut constater, à partir d'une comparaison des schémas A et E qui accompagnent le présent mémoire, que la séquence de mARN réelle spécifiant l'extrémité amino du polypeptide d'interféron mQr est identique à celle sur laquelle la structure de l'IFIA était basée, à l'exception de seulement une différence nucléotidique dans le codon pour le cinquième aminoacide à partir de l'extrémité amino du polypeptide mur. Par consé- quent, hors d'un total de sept positions nucléotidiques ambiguës, six étaient prévues correctement dans le cas de l'IFIA. (Voir, par exemple, Houghton M. et coll., (1980),
Nucl.Acids Res., 8, 1913-1931)
On a ensuite réalisé un amorceur oligodésoxynucléotidique supplémentaire IFIV (représenté sur le schéma
D qui accompagne le présent mémoire) qui correspondait à une région proche de l'extrémité de la séquence nouvellement déterminée. En répétant le mode opératoire susmentionné, on a obtenu une information de séquence supplémentaire à partir de laquelle un autre amorceur IFV (représenté sur le schéma D qui accompagne le présent mémoire) a été déduit et synthétisé. On a ensuite de nouveau répété le procédé.

De cette manière, on a déterminé par étapes successives la séquence de gène entière codant pour le polypeptide d'interféron de fibroblaste mûr (qui figure sur le schéma E qui accompagne le présent mémoire). (Voir, par exemple, Houghton
M. et coll., (1980), Nucl. Acids Res., 8, 2885-2894).

Le schéma F que l'on retrouvera à la fin du présent mémoire représente la séquence de gène bicaténaire qui code pour la séquence de mARN non traduite en 5' et la séquence de MARTE de codage pour protéine.

Un schéma illustratif des procédés de base mis en oeuvre pour cloner le gène d'interféron en plasmides bactériens figure à la fin du présent mémoire et constitue le schéma G.

Les produits finals de ces procédés étaient des recombinants contenant des gènes dtinterféron codant pour le polypeptide d'interféron mûr et la séquence de mARN d'interféron non traduite en 3'. Au surplus, ces recombinants contenaient une molécule d'amorceur IFIII précédant la séquence de gène d'interféron mûr et également une molécule de liant d'Hind III synthétique aux deux entre mités du gène.

Une séquence nucléotidiaue d'ADN partielle d'un de ces recombinants de gène d'interféron est représentée sur le schéma H qui accompagne le présent mémoire, qui montre qu'au cours des procédés de clonage (vraisemblablement en résultat du traitement par la S1 nucléase), le nucléotide terminal 5' de IFIII était perdu. De même, on a observé que le triplet de mARN codant pour le résidu de tyrosine à la position d'aminoacide 30 dans la protéine mûre était UAU, plutôt que le triplet UAC qui avait été antérieurement déterminé par séquentialisation directe de transcrits réverses (voir le schéma E qui accompagne le présent mémoire). Ce changement de nucléotide "silencieux" est vraisemblablement une réflexion du polymorphisme du gène et signifie que les deux types de gène engendrent l'expression d'interférons identiques.

Afin d'exprimer le gène d'interféron dans des bactéries, on l'a transféré à partir de pBR 322 (voir, par exemple, Bolivar F. et coll., (1977), Gene, 2, 95-113) dans le site Hind III des plasmides dits d'expression pWT2x1.

Cette dernière série de plasmides contient la séquence du promoteur responsable de la transcription de l'opéron tryptophane et pourvoit aux besoins des trois phases de traduction possibles (voir, par exemple, la demande de brevet britannique publiée nO 2.052.516). Cependant, si le gène d'interféron est inséré dans ces plasmides dans l'orientation correcte, eu égard à la transcription, seul l'un d'entre eux donnera l'expression fidèle du gène.

A partir de la séquence montrée sur le schéma H qui accompagne le présent mémoire, on a prévu que le pWT 221 assurerait la phase de traduction "ouverte" nécessaire à l'expression fidèle du polypeptide d'interféron mûr, bien que ce dernier fût fusionné à un peptide amino terminal des soixante restes résultant de l'expression de la séquence de gène trp E courte et des molécules de liant d'Hind III présentes dans les plasmides pWT 2x1 et également de l' expression du liant d'Hind III et de l'amorceur IFIII utilisé dans le clonage original du gène d'interféron.En fait, lorsque l'on a transféré le gène d'interféron aux plasmides pWT 221 et déréprimé le promoteur de trp par incubation en l'absence de tryptophane et en présence d'acide 3 ss-indole acrylique, on n'a seulement pu démontrer une activité antivirale que dans le cas du dérive pWT 221, comme prévu.

La figure 1 des dessins ci-annexés (dans la
Veros = cellules témoin non infectées du virus EMC (virus de l'encéphalomyocardite), Std. A = standard A d'interféron,
Std. B = standard B d'interféron, 221 = extrait de recombinant contenant le gène d'înterféron inséré dans pWT 221 231 = extrait de recombinant contenant le gène d'interféron inséré dans pWT 231, 231 + Std.B = extrait de recombinant contenant le gène d'interféron inséré dans pR < T 231 auquel on avait ajouté le Standard B d'interféron préalablement à l'extraction et EMC = cellules témoin infectées du virus
EMC), montre un résultat typique obtenu lorsque des extraits bactériens sont titrés en ce qui concerne l'actiovité anti- virale dans un système in vitro. Dans ce système, on a dilué les échantillons par étapes de 0,5 1og10 et on les a appliqués à des monocouches de cellules de callitriche d'Afrique (Veros).Après une nuit d'incubation, on a attaqué les cellules par le virus EMC avant la coloration des cellule si bien que l'on a constaté que les échantillons contenant l'activité d'interféron protégeaient les cellules vero contre l'effet cytopathogène (cpe) du virus.En comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus avec des standards d'interféron, on peut établir le niveau d'activité;
On nla pas décele activité dans des extraits des recombinants d'interféron pWT 211 ou pWT 231 (seul le résultat obtenu avec le recombinant pWT 231 est montré sur la figure 1), tandis que l'activité observée à partir des extraits de recombinants pWT 221 est équivalente à un rendement approximatif de 106 à un rendement approximatif de 106 unités de référence internationale d'interféron par litre de bactéries (c.à.d. équivalente à 106 unités d'une préparation d'interféron standard internationale, 1 unité étant définie par la quantité qui entraine une réduction de 50 g0 de la réplication du virus en culture de tissu). I1 est vraisemblable qu'une activité dtinterféron considérable est perdue au cours du procédé d'extraction, étant donné que lorsque l'on ajoute un standard d'interféron de fibroblaste au recombinant pWT 231 préalablement à l'extraction, on n'obtient seulement qu'une récupération d'environ 30 g0.

(I1 faut noter que l'effet toxique observé des extraits de recombinant dans les titrages antiviraux est dA à la présence de Triton X-100 qui fut utilisé pour la mise en oeuvré de ce procédé d'extraction particulier).

Il était à présent nécessaire d'enlever 1'ADN codant pour les aminoacides de non interféron à ltextrémité amino du polypeptide d'interféron fusionné. Ceci peut être commodément effectué en recourant à l'emploi du plasmide pWT 501 (voir, par exemple, la demande de brevet britannique publiée n 80 36080).

Le plasmide pWT 501 possède une longueur moléculaire de 3805 bp (paires de bases) et sa carte de restriction est illustrée par la figure 2 des dessins ci-annexés.

Ce plasmide peut être produit par un procédé qui comprend la restriction du pWT 221 en utilisant Hha I, en isolant le fragment contenant le promoteur de trp, en incubant ce fragment avec de 1'ADN polymérase I, en soudant le fragment à extrémité émoussée à des liants d'Hind III, en restreignant la matière soudée en utilisant Hind III, en isolant le fragment contenant le promoteur de trp, en soudant ce fragment au pAT 153 traité à la phosphatase alcaline bactérienne, coupé à l'Hind III (voir, par exemple, Twigg
A.J. et Sherratt D., (1980), Nature, 283, 216-218), en transformant le K-12 H3101 d'E. coli (génote gal , lac ara ^ pro , arg , strr, rec A , rk , X i voir, par exemple,
Boyer H.W. et Roullard - Dussoix D., J. Mol.Biol., 41, 459-472) > en utilisant le plasmide résultant et en opérant une sélection pour la résistance à l'ampicilline et la résistance à la tétracycline.

Un petit fragment de restriction à 1'Hind III/
Taq I qui contient le promoteur de trp peut être isolé à partir de ce plasmide. Le site de clivage ou scission Taq I en question est situé dans la séquence d'ADN qui correspond au site de liaison de ribosome dans la région de la mARN qui.

code pour le polypeptide conducteur de trp, qui se manifeste juste avant le triplet méthioninique initiateur. Ce fragment peut être uni à un fragment de restriction au Sac I/Hind III du gène d'interféron cloné qui contient la totalité de la séquence de codage de protéine mûre, précédée par seulement six paires de bases comme le représente le schéma I qui accompagne le présent mémoire. Etant donné que le résidu aminoZterminal de l'interféron mûr se trouve être la méthionine, le procédé d'union ou de soudure peut être réalisé de telle manière que leon produise un ADN chimérique qui, lorsqutil est transcrit, contient un site de liaison de ribosome artificiel qui utilise ce codon de méthionine comme codon initiateur pour la traduction.La mqlécule conjointe a ensuite été clonée en K-12 HB101 d'E. coli en utilisant le pAT 153 comme vecteur de plasmide. Ce procédé est illustré sur le schéma I qui accompagne le présent mémoire.

Une autre conséquence importante du procédé ci-dessus réside dans le fait que le plasmide d'expression ainsi obtenu est dépourvu de la région atténuatrice de trp qui joue un r81e important dans la régulation de la trans- cription de l'opéron de trp (voir, par exemple, Miozzari G.F.

et Yanofsky C., (1978), J. Bacteriol., 133, 1457-1466).

Des recombinants contenant la molécule conjointe nécessaire pour chaque orientation ont ensuite été analysés en ce qui concernait leur aptitude à produire de l'interféron. On a constaté qu'ils produisaient des proportions notablement supérieures, grosso modo sextuples (dans les deux orientations), d'activité antivirale extractible, lorsqu'on les comparait aux recombinants contenant le gène d'interféron inséré dans le pWT 221. Comme prévu, le calibre de 1'interféron produit (environ 19.000 daltons) est plus petit que celui obtenu en utilisant le pWT 221 comme plasmide d'expression (environ 24.000 daltons).Ceci est illustré par la figure 3 des dessins ci-annexés et est raisonnablement compatible avec la nature espérée des polypeptides d'interféron produits dans les deux cas (sur la figure 3 : a = recombinant contenant molécule conjointe en orientation dextrorsum (c.à.d. que la transcription se déroule depuis le promoteur de trp vers le gène de résistance à la tétracycline dans le plasmide), b = recombinant contenant molécule conjointe en orientation senestrorsum (c.à.d. que la transcription se déroule depuis le promoteur de trp en s'écartant du gène de résistance à la tétracycline), c = transformant ne contenant seulement que le pAT 153, d = recombinant contenant le gène d'interféron mais dépourvu du promoteur de trp, f = recombinant d'expression constitué du gène d t interféron inséré dans pWT 221 et g = recombinant d'expression constitué du gène d'interféron inséré dans pWT 211). La figure 3 annexée au présent mémoire illustre également l'abondance du polypeptide d'interféron de 19.000 daltons par rapport au produit de 24.000 daltons synthétisé dans le recombinant à pWT 221. Cet accroissement de l'expres- sion du gène d'interféron peut être attribué à l'enlèvement de la région de l'atténuateur de trp.

La séquence de liaison au ribosome artificiel contient six nucléotides entre les restes du site de clivage ou scission Taq I et le codon initiateur ATG. Le plasmide original (pWT 501) ne contient seulement que cinq nucléotides (de séquence différente) dans cette région analogue (voir schéma I). Par conséquent, d'autres changements du calibre et de la séquence de cette région particulière dans le recombinant d'interféron peuvent augmenter l'efficience de la liaison au ribosome et concomitamment améliorer le rendement en polypeptide d'interféron.

I1 faut s'attendre à ce que le rendement en polypeptide analogue à l'interféron puisse encore être davantage amélioré en augmentant le nombre de gènes dtinter- féron et/ou de promoteurs de trp dans chaque plasmide. Ceci peut se faire par mise en oeuvre de procédés connus.

De même, l'utilisation de fermenteurs bactériens dans lesquels de fortes densités cellulaires peuvent être obtenues, accroissent manifestement le rendement en activité d'interféron par litre de bactéries,
Outre son aptitude à protéger les cellules Vero contre le cpe du virus EMC, le polypeptide d1interféron produit dans des bactéries protège également des cellules de callitriche africain V3 contre une infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) in vitre. En outre, comme l'interféron de fibroblaste natif, le polypeptide d'inter- féron bactérien s'est également avéré être capable dtaug- menter 1 t activité léthale naturelle de lymphocytes humains in vitro.

La protéine analogue à 1'interféron génétiquement engendrée est principalement destinée à l'usage pour le traitement de maladies et elle sera utilisée en quantités efficaces, éventuellement en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable Les doses utilisées au cours d'études utilisant des interférons -humains natifs ont consi- dérablement varié, par exemple de 105 à 107 unités de réfé- rence internationales par jour pendant diverses périodes (voir,par exemple, Scott G.M. et Tyrell D.A.J., (1980),
Brit. Med. J., 280, 1558-1562).On prévoit que le régime de traitement préféré sera amené à varier en fonction du type et de la gravité de la maladie Le polypeptide d'inter- féron produit à partir de bactéries peut manifester des activités différentes et des propriétés pharmacocinétiques différentes par rapport à l'interféron de fibroblaste natif dans certaines circonstances.

On a également utilisé l'ADN de recombinant d' interféron pour trier des bancs de gènes humains quant à la présence de clones contenant le gène d'interféron chromo somial. On a obtenu ce dernier en extrayant d'abord le fragment de restriction à 1'Hind III contenant le gène d'inter- féron d'un plasmide de recombinant pWT 221, en radiomarquant et en hybridant ensuite à des plaques produites par la transfection de bactéries avec une collection d'hybrides de phage # /ADN chromosomial humain. Les plaques qui lient spécifiquement le gène d'interféron de sondage ont été purifiées et 1'ADN de recombinant N, en a été préparé.Le gène d' interféron de fibroblaste (ou -3) contenu dans ces molécules a ensuite été séquencé et la séquence est présentée dans le schéma J qui accompagne leprésent mémoire.

On a observé une séquence de gène ininterrompue identique à celle illustrée dans le schéma F qui accompagne le présent mémoire, immédiatement suivie d'une séquence correspondant à la séquence de mARN d'interféron non traduite en 3' qui a été antérieurement déterminée (voir, par exemple, Taniguchi T. et coll., (1980), Gene, 10, 11-15 et
Derynck R. et coll., (1980), Nature, 285, 542-547). Cette observation indique qu'il ntexiste pas de séquences interposées (introns) dans le gène d'interféron de fibroblaste particulier dans le génome.

Au surplus, les courtes séquences de gène en amont et en aval du gène d'interféron ont également été déterminées. La région de flanquement en amont peut constituer une partie de la séquence d'initiation à 1'ARN polymérase/promoteur qui règle la transcription du gène d'interféron dans les fibroblastes humains (voir, par exemple,
Houghton M. et coll., (1981), Nucl. Acids Res., 9, NO 2).

I1 apparait que les bactéries ne peuvent pas fidèlement exprimer des gènes eucaryotes contenant des introns et, de la sorte, une implication de ce qui précède réside dans le fait qu'il serait possible d'induire des bactéries pour produire des interférons humains en les transformant avec des gènes chromosomiaux codant pour 1' interféron. Ces gènes chromosomiaux pourraient être isolés de bancs de gènes humains aisément disponibles et une telle solution offre des avantages par rapport à l'isolement préalable du mAEN d'interféron à partir de cellules eucaryotes induites, la synthèse du gène à cADS in vitro, la transformation de bactéries, etc. Etant donné qu'il apparaît que les gènes d'interféron ne contiennent en général pas d'introns, étant donné qu'un gène d'interféron de leucocyte en est également dépourvu (voir, par exemple,
Nagata S. et coll., (1980), Nature, 287, 401-408), une telle solution pourrait être appliquée à divers gènes d' interféron.

En utilisant le gène d'interféron cloné, c.à.d.

le gène à cADN, comme sonde pour des séquences homologues dans l'ADN génomial total restreint avec toute une variété d'enzymes de restriction, la présence d'un type prédominant de gène d'interféron de fibroblaste pourrait être observée (voir, par exemple, Houghton M et collez loc cit).

Cependant, il n'y avait pas de manifestation de la présence d'autres gènes qui étaient partiellement homologues à la sonde (ibid). La possibilité subsiste par conséquent que d'autres gènes d'interférons pourraient être isolés (à partir de produits de digestion soumis à restriction de l'ADN génomial total ou directement à partir de bancS de gènes chromosomiaux humains) en utilisant le présent gène d'interféron cloné particulier.Au surplus, ayant utilisé avec succès des oligonucléotides spécifiques pour déceler des recombinants bactériens contenant des gènes d'interféron (voir (11) ci-dessous), il est à présent réalisable dguti- liser des oligonucléotides choisis pour déceler et isoler différents gènes d'interféron contenus dans des bancs degènes chromosomiaux humains ou présents dans un produit de digestion sous restriction de 1'ADN génomial total. Par exemple, la présente séquence de gène dtinterféron manifeste certaines similitudes avec des gènes de leucocytes humains (voir, par exemple, Taniguchi T. et coll., (1980), Nature, 285, 547, et Streuli M. et colle, (1980), Science, 209, 1343-1347).Par l'emploi d'une sonde oligonucléotidique qui est commune entre les séquences de gène d'interféron de fibroblastes et de leucocytes, il est possible d'isoler les deux types de gènes à partir d'un banc de gènes humains par exemple. De manière similaire, on pourrait obtenir d'autres gènes d'interféron partiellement homologues par l'emploi d'autres oligonucléotides homologues à différentes régions du présent gène d'interféron cloné. Une telle approche peut être plus efficace que la simple utilisation du gène d'interféron de fibroblaste cloné entier comme sonde pour les gènes partiellement homologues, en raison d'une diminution de "l'arrière-plan" au cours de telles expériences par l'utilisation d'oligonucléotides spécifiques.

Des séquences communes entre différents gènes d'interféron indiquent qu'elles peuvent coder pour une fonction commune manifestée par les divers polypeptides d'interféron. Par conséquent, la séquence de gène codant pour les 50-50 aminoacides approximativement à l'extrémité carboxyle de la molécule, peut être d'une importance particulière et il faut comprendre que le produit d'un recombinant contenant un tel sous-gène ou une partie de celui-ci peut être d'une valeur particulière. De manière similaire, d'autres sous-gènes (outils présentent une certaine homologie avec d'autres séquences de gène d'interféron ou non) peuvent également être d'une valeur particulière.

I1 faut également comprendre que la séquence de gène d'interféron de fibroblaste peut être limitée quant à l'expression dans des bactéries en raison de l'emploi de codons qui peuvent être peu fréquemment utilisés dans des molécules de mARN bactérien. Par conséquent, il est clair qu'en changeant certains codons de gène d'interféron, en manière telle qu'ils continueront encore d'encoder le même aminoacide, mais qu'ils seront plus-efficacement traduits par l'appareil de traduction bactérien, on peut améliorer le rendement global en interféron. La logique mise en oeuvre pour décider quels sont les codons, s'il y en a, qui tireraient bénéfice de l'ajustement, peut être basée sur l'usage de codon observé dans des molécules de mAREJ procaryotes (voir, par exemple, Grantham R. et coll., loc cit).

De même, il faut bien comprendre que le clonage du gène d'interféron contenant additionnellement 1'ADN pour la séquence de signal prépeptidique peut entrarner un certain avantage. Par exemple, l'interféron produit peut être séoues- tré dans ltespace périplasmique, éventuellement après clivage ou scission de la séquence de signal. Au surplus, la conformation de l'interféron polypeptidique peut tre plus similaire à l'état naturel, en comparaison de celui obtenu par l'ex- pression directe de la séquence de gène ne codant seulement que pour l'interféron mûr. Par conséquent, l'activité de l'interféron produit peut être supérieure.

D'autres techniques de production de l'interféron par fabrication génétique comprennent l'introduction du gène d'interféron nécessaire dans des cellules eucaryotes, par exemple des cellules L de souris ou des cellules de levure.

On peut transformer des cellules L de souris avec de l'ADN exogène et ceci peut s'effectuer avec des gènes d'interféron humain selon un certain nombre de manières différentes. Par exemple, un gène d1interféron chromosomial contenant la totalité de la séquence à ADN nécessaire à l'initiation correcte par l'ARN polymérase pourrait être cloné dans les cellules de souris, de manière à permettre ainsi ia transcription et l'expression subséquente
En alternative, un gène dtinterSéron dépourvu de cette séquence de promoteur pourrait être soudé à un autre morceau d'ADN eucaryote contenant un promoteur, par exemple le gène de thymidine kinase que l'on utilise comme base pour la sélection du transformant (voir, par exemple, Wigler M.

et coll., (1979), Cell, 16, 777-785). De cette manière, la transcription du gène d'interféron se déroulerait par l'intermédiaire de la séquence de gène soudée ou liée,
il est également possible que la transformation de cellules L aveo un gène d'interféron dépourvu d'une séquence de promoteur puisse encore entraîner l'expression de l'ADN, en raison de l'insertion fortuite dans des régions partioulières du génome.

Certains plasmides habitent aussi des cellules de levure et des gènes d'interféron pourraient être introduits dans de tels plasmides ou des versions convenablement modifiées de ces plasmides, de façon à obtenir l'expression de 1'ADN hétérologue et le rendement en polypeptide diinter- féron.

Il est possible que l'interféron produit par mise en oeuvre de tels procédés puisse être d'une efficacité et d'une activité biologique supérieures à celles de ltinter- féron produit dans des procaryotes où certaines modifications importantes ne peuvent pas être apportées à la protéine eucaryote. Le rendement en interféron peut également être supérieur dans ces systèmes eucaryotes.

Par conséquent, selon une première de ses formes de réalisation, la présente invention a pour objet un gène pour l'expression d'une protéine possédant des propriétés ressemblant à celles de l'interféron humain, caractérisé en ce qu'il comprend un brin codeur et un brin complémentaire, le brin codeur comprenant la séquence
5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.CCT*- ,TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.GTA,GTA.GGC.GAC.ACT.-
GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.-
GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.-
TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.-
TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.-
TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.-
AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.-
ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.-
GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.
CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.-
GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG;;AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.-
AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.
ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.-
TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.-
ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.-
CCT.AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.-
ATT.CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.-
TAA.TGT.ACT.GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.
ATT.TTT.ATT.AAA.TTA.TGA.GTT.ATT.TTT.ATT.TAT.TTA.AAT.-
TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TCA.-
ACA.TGG.CA 3'
ou-une sous-unité ou un équivalent de ce gène.

(Il faut comprendre que ce que lton appelle
"brin codeur11 a le mme sens que le m-ARN).

Ce qui figure ci-dessus correspond à la
séquence codant l'mARN entière, plus les séquences de gène en amont et en aval, obtenues en isolant le gène d'un banc de gènes chromosomiaux et en procédant à une séquentialisation.

Selon une autre de ses formes de réalisation, la présente invention a pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.CCT.
TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.CTA.CTA.GGC.GAC.ACT.
GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.
GCT.CTC.CTC.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.-
TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.ACC.AGc.AAT.TTT.cAG.-
TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.CGC.AGG.cTT.GAA.TAC.-
TGC.CTC.AAG.GAC.AGC.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.
AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.
ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.
GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.
CTC.CTG.CCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.
GTC.CTG.CAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTc.ACC.AGGGGA.-
AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.
ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.
TGG.ACC.ATA.GTC.ACA.GTG.GAA.ATc.cTA.ACG.AAc.TTT.TAC.TTC.-
ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.
AGC. CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGc.ATT.-
CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.TAA.TGT.-
ACT.GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.
AAA.TTA.TGA.GTT.ATT.TTT.ATT,TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.-
AAT.AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TCA.ACA.TGG.CAG.TTT.TAA.
TTT.CGA.TTT.GAT.TTA.TAT.AAC.CA..3' ou une sous-unité ou un équivalent de ce gène.

Ceci correspond à la séquence qui a été décrite plus haut avec une certaine séquence aval supplémentaire
La présente invention a également pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.
CCT.TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.GTA.GTA.GGC.

GAC.ACT.GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.GTC.-
CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.
CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA. AGC.GC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.-
AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAT.TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.

TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC-.-
CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.ATC.TAT.GAG.ATG. CTC.-
CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.CAT.TCA.TCT.AGC ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.-
AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.
GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.
CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG. ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC .AAG.GAG.TAC.AGT'.CAC.TGT.-
GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.
TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.
AGA.TCT.CCT.AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT. TCA.AGC.ATT.CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.-
GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.
TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.TTA.TGA.GTT.ATT.TTT.ATT.TAT.
TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA. AAG.TCA.ACA.TGG.CAG.TTT.TAA.TTT.CGA.TTT.GAT.TTA.TAT.- AAC.CA.. 3' ou une sous-unité de ce gène.

Ceci constitue une forme polymorphe de la séquence décrite plus haut.

Certaines parties particulières de tels gènes constituent également des formes de réalisation de la
présente invention.

Par conséquent, selon lgune de ses formes de
réalisation particulières, la présente invention a pour
objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence
qui suit :
5' TTC.TAA.CTG.CAA.CCT.TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.
CAA.CAG.CTA.GTA.GGC.GAC.ACT.GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG
ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.
TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.
GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.
CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.CTC.
AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.
CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.
ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.
CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.
GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.
CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.
TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.
AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.
GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.
ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.
TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.
GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.ATT.CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.
GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.GCA.TAT.GAA.
AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.TTA.TGA.
GTT.ATT.TTT.ATT.TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.AAA.
TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TC 3'
ou un équivalent de ce gène
Avec 1 t addition éventuelle dgun ou deux restes
ou résidus A à extrémité 3', ceci constitue la séquence
de gène correspondant à la séquence de mARN entière
Selon une autre de ses formes de réalisation particulières, la présente invention a pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit
5' ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG,TTG.-
TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG,-
CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.-
AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.-
CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.-
AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.-
ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.-
AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.-
GTT.GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.
CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.-
GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.-
AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.-
AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.-
GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.
GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA. 3'
ou un équivalent de ce gène.

Ceci correspond à la séquence de gène codant
pour le prépeptide et la protéine mûre.

La présente invention a également pour objet
un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui
suit
5' ATG.AGC.TAC.AAC,TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.- AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.-
GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT. GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.-
AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG. AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.-
GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT. GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.-
GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GT.TTC.ACC.AGG.GCA.AAA.CTC. -
ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.
CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC. TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.-
TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA. 3'
ou un équivalent de ce gène.

Ceci correspond à la séquence de gène codant
pour la protéine mûre.

Les sous-unités de ces gènes constituent égal en
ment des formes de réalisation de la présente invention.

L'invention concerne également un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une
sous-unité de ce gene, conforme à l'une quelconque des trois
premières formes de réalisation susmentionnées de l'inven
tion, caractérisé en ce que l'on utilise, comme sonde, une
molécule possédant une séquence dtun gène ou d'un équivalent
de ce gène ou d'une sous-unité de ce gène conforme à llune
quelconque des autres formes de réalisation susmentionnées
de l'invention, afin d'isoler de l'ADN chromosomial humain
un gène d'interféron chromosomial humain.

I1 faut comprendre que bien que l'on puisse ini
tialement utiliser de l'ADN monocaténaire ou bicaténaire
comme sonde, un brin monocaténaire sera présent à l'étape
d'hybridation.

La présente invention a également pour objet un
procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce
gène ou d'une sous-unité de celui-ci, confirme à l'une
quelconque des formes de réalisation susmentionnées de
l'invention, autres que les trois premières, caractérisé
en ce que l'on isole le polyA-mARN de cellules de fibro
blastes induites, on synthétise du cADN monocaténaire en
utilisant un oligo dT amorceur et on en synthétise de
1'ADN bicaténaire en utilisant de la transcriptase réverse
ou de 1'ADN polymérase I de E. coli et éventuellement un
amorceur.

I1 est préférable d'utiliser un amorceur au cours de la troisième étape de ce procédé. De manière générale, on fractionne le mélange réactionnel après la-seconde étape et/ou après la troisième étape. On inhibe de préférence l'autoamorçage après la seconde étape. On peut identifier le produit, après clonage, en utilisant un amorceur pour trier les colonies.

La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de celui-ci, conforme à l'une quelconque des formes de réalisation susmentionnées de l'invention, autre que les trois premières, caractérisé en ce que l'on isole le mARN de cellules de fibroblastes induites, on synthétise du cADN monocaténaire en utilisant un amorceur spécifique et de la transcriptase réverse et on en synthétise de 1'ADN bicaténaire en utilisant de la transcriptase réverse ou de 1'ADN polymérase I de E. coli et éventuellement un amorceur.

On peut considérer que ceci constitue une variante du procédé susmentionné.

La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de gène ou d'une sous-unité de celui-ci qui possède une partie commune à ou apparentée à une partie d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de celui-ci, conforme à l'une quelconque des trois premières formes de réalisation susmentionnées de l'invention, caractérisé en ce que l'on utilise, comme sonde, une molécule possédant une séquence correspondant à au moins une partie d'une fraction commune ou apparentée, afin d'isoler un gène chromosomial humain à partir de 1'ADN chromosomial humain.

La présente invention concerne également un recombinant de plasmide, caractérisé en ce qutil comprend un vecteur de plasmide dans lequel est inséré, à un site d'insertion, un gène ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de celui-ci, le recombinant de plasmide permettant la traduction dans la phase correcte pour le mARN correspondant au gène ou à la sous-unité de ce gène ou à l'équivalent de ce gène inséré et possédant un promoteur bactérien en amont de et adjacent au site d'insertion, de telle façon que le gène ou la sous-unité de ce gène ou 1' équivalent de ce gène inséré se trouve sous contre d'un promoteur bactérien. Il peut être considéré comme avantageux d'insérer une multiplicité de fragments d'ADN. De manière similaire, on peut trouver souhaitable d'utiliser une multiplicité de promoteurs bactériens.Il est particulièrement avantageux d'utiliser un recombinant de plasmide qui est dépourvu d'au moins une partie de la séquence d'ADN responsable de l'atténuation de la transcriptions Un exemple particulier d'un recombinant de plasmide préféré comprend un dérivé modifié de pWT 501. Dans certaines circonstances, on peut tirer bénéfice du fait que L'ADN inséré code également pour un codon d'initiation et/ou au moins une partie d'un site de liaison ou soudure de ribosome.

La production d'un tel recombinant de plasmide par mise en oeuvre d'un procédé caractérisé en ce que l'on insère 1'ADN au site dsinsertion d'un vecteur de plasmide approprié constitue également une forme de réalisation de la présente invention.

Dans un cas particulier, un tel procédé peut comprendre l'isolement d'un fragment d'Hind III d'environ 150 bp contenant un promoteur de trp à partir du pWT 5Q1 l'autosoudure, la digestion partielle avec du Taq I, le traitement par de la S1 nuclease, le traitement par de l'ADN polymérase I de E. coli, la restriction avec Hind III, l'isolement d'un fragment d'environ 100 bp contenant le promoteur de trp, la soudure à un fragment d'environ 700 bp obtenu en traitant un plasmide recombinant de pWT 231 contenant le gène ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de ce gène par du Sac I, de la S1 nucléase, de 1'ADN polymérase I de E. coli et de l'Hind III, la restriction avec l'Hind III et la soudure au pAT 153 traité par une phos- phatase alcaline bactérienne, ayant subi une restriction à l'Hind III.

La présente invention a également pour objet une cellule caractérisée en ce qu'elle comporte à ltétat inséré, un gène tel que décrit plus haut ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de celui-ci, ou un recombinant de plasmide tel que décrit plus haut.

Dans le cas préféré, la cellule est une cellule
K-12 HB 101 d'E. coli.

La production d'une telle cellule par mise en oeuvre d'un procédé caractérisé en ce que lton insère 1'ADN ou le recombinant de plasmide dans une cellule constitue également une forme de réalisation de la présente invention.

Selon une autre de ses formes de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé de production d' une protéine possédant des propriétés qui ressemblent à celle de l'interféron humain, caractérisé en ce que lton cultive une cellule-du genre susmentionné et on récupère la protéine exprimée.

On donne ci-dessous des formes de réalisation illustratives et non limitatives de la présente invention.

(1) Synthèse des oligodésoxynucléotides
Les six oligonucléotides, CpApGpGpTpTpGpTpApGpCp
TpCpApT (IFIA), CpApGpGpTpTpGpTpApApCpTpCpApT (IFIB),
CpTpCpTpTpTpCpCpApTpG (1FII), CpApGpCpTpCpTpTpTpCpCpApTpG (IFIII), GpApGpGpApGpApTpTpApApG (IFIV) et CpCpTpGpGpApAp
GpApApA (IFV) ont été synthétisés par une méthodologie au triester classique (voir, par exemple, Hsiung H.M. et coll., (1979), Nucl. Acids Res., 6, 1371-1385) et confor mément au schéma réactionnel représenté sur la figure 4 des dessins ci-annexés où N représente Gisobu, T, Cbz ou Abz e
On a débloqué les oligonucléotides totalement protégés avec de l'acide benzènesulfonique à 2 % (p/v), du fluorure de tétraéthylammonium 0,1 M dans un mélange de tétrahydrofuranne (THF)/pyridine/H2O (8/1/1 en volume), cette opération étant suivie du traitement par de l'ammoniac.On a purifié les oligonucléotides débloqués par une chromatographie en phase liquide sous pression élevée (HPLC) sur de la silice microparticulaire "Partisil 10 SAX" que l'on a soumise à une dérivation avec des groupes ammonium quaternaire (Whatman).

(2) Phoseholation des oligonucléotides
On a incubo chaque oligonucléotide synthétique (120 pmoles)avec 200 pmoles de 5'-(&gamma;-32P) ATP (Radiochemical Centre, Xmersham, Buckinghamshire, Angleterre; activité spécifique > 5000 Ci/mmole) et 3 unités de polynucléotide kinase (EC 2.7.1.78), (1 unité est la quantité qui catalyse la production de 1 nmole de 32P insoluble dans l'acide après incubation pendant 30 minutes à 370C selon Richardson C.C., (1972), Progress in Nucleic Acids Research, 2, 815), dans un volume total de 20 1 contenant 50 mM de Tris-HCl (chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane) pH 9,0 10 m de Mg C12, 0,1 mM d'EDTA (sel disodique de l'acide éthylène-diaminetétra-acétique), 0,1 mM de spermidine et 1 mM de dithiothréitol (DTT)q Après 60 minutes à 370C, lorsque la plupart des molécules de l'amorceur furent marquées, on a soit dilué le melange jusqu'à 200 l et on l'a ajusté à 1 O/o (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et à 10 mI d'EDTA et, étant donné que peu d'oligonucléotide était présent, à 5 ug/ml de tARN de levure, secoué avec un égal volume de phénol saturé d'eau et secoue de nouveau après l'addition du même volume de chloroforme, centrifugé (10.000 x g; 2 minutes) et extrait la phase aqueuse résultante comme décrit ci-dessus, que l'on a ensuite extraite à deux reprises avec un égal volume de chloroforme et ensuite concentrée par précipitation à l'éthanol (ce qui a impliqué l'ajustement de la concentration en NaCl à 200 mM, l'addition de 2,5 volumes d'éthanol absolu et le repos jusqu'au lendemain à -200C), (IFIA et IB), soit simplement chauffé à 1000C pendant 5 minutes (IFII, III, IV et V).

(3) Isolement de poly A - mARN
Des bouteilles montées sur des rouleaux 20 1 de fibroblastes humains (FS-4)(provenant de cellules de prépuce humain) ou17/1 (provenant de cellules de poumons d'embryons humains) ont été amorces jusqu'au lendemain à l'aide d'interféron homologue (60 unités de référence internationales/ml) avant d'être superinduites pendant 5 heures avec du poly(I):poly(C), (30 Rg/ml) et du cycloheximide, (2 g/ml). Des cellules faussement induites n'ont pas reçu de poly(I):poly(C).On a enlevé les cellules de la surface de verre par un bref traitement à l'aide d' une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1,25 mg/ml de trypsine (EC 3.4.4.4), 0,5 mg/ml d'EDTA, 2 Itg/sl de cycloheximide et on les a récoltées dans un milieu R.P.M.I. 1640 (modification de Searle, Flow Laboratories) glacé contenant 2 ug/ml de cycloheximide et 10 O/o (v/v) de sérum de veau.Après avoir rapidement lavé les culots (1.000 x g, 5 minutes) avec du R.P.M.I. 1640 contenant 2 ug/ml de cycloheximide, on a lysé les cellules par homogénéisation dans du Tris-HCl 0,2 M, pH 9, du NaCl 50 mM, de l'EDTA 10 mM, du SDS 0,5 O/o (p/v), 1 mg/ml d'héparine et on les a ensuite déprotéinisées à l'aide d'un égal volume de phénol équilibré dans le tampon susmentionné (sans héparine), cette opération étant suivie de trois extractions avec un égal volume d'un mélange de CHCl3 et de phénol tamponné (1:1 v/v). Après la précipitation à l'éthanol et la dissolution, on a sélectivement précipité 1'ARN avec du NaCl 3M et on a isolé le mARN polyadénylé par chromatographie à l'oligo (dT) - cellulose (voir, par exemple,
Aviv H. et Leder P., (1972), Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 69, 1408-1412).

(4) Transcription réverse du mARN de fibroblaste en utilisant
IFIA et IB
On a incubé 75 pmoles de 5'-oligonucléotide (IFIA ou IB) marqué au (32p) avec 22,5 g de mARN de fibroblaste contenant du poly(A) à 25 C pendant 1 heure dans 36 1 de KC1 0,4 M, de manière à permettre à l'amorceur de s'hybrider à la séquence complémentaire dans le mARN.

On a ensuite dilué le produit ainsi obtenu avec un mélange de transcription de façon à obtenir une solution finale contenant 0,5 mM de chacun de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 4 mM de MgC12, 60 mM de KCl, 5 mM de DTT, 0,01 /0 (v/v) de Triton X-100 (détergent non ionique, isooctylphénoxypolyéthoxyéthanol), 0,22 RM de
IFIA ou IB, 50 g/ml d'actinomycine D, 67 Fg/ml de polyAmARN, 20 unités/ml d'inhibiteur de ribonucléase de foie de rat (1 unité est la quantité qui donne une inhibition de 50 /0 de 5 ng de ribonucléase pancréatique selon Shortman K., (1961), Biochim. Biophys. Acta, 51, 37), (voir, par exemple,
Gribnau A.A.M. et coll., (1969), Arch. Biochem.Biophys., 130, 48-52) et 100 unités/ml d'AMV (virus de la myéloblastose aviaire) de transcriptase réverse (1 unité est la quantité qui incorpore 1 n mole de dTMP dans le produit précipitable à l'acide après incubation pendant 10 minutes à 37 C selon
Houts G.E. et coll., (1979), J. Virol., 29, 517). On a poursuivi l'incubation pendant 60 minutes à 370C et on a ensuite extrait le mélange par du phénol et du -chloroforme et on lta concentré par précipitation à l'éthanol (voir (2) ci-dessus).

(5) Analyse des produits de la transcription réverse obtenus
avec IFIA et 13
On a dissous les produits précipités à l'éthanol dans de l'eau et on les a incubés en présence de NaOH 0,1 M et d'EDTA 1 mM à 370C pendant 30 minutes. On a ensuite ajouté un égal volume d'urée 10 M, de saccharose 25 O/o (p/v), de xylène cyanol et de bleu de bromophénol, chacun 0,05 % (p/v) et on a ensuite chauffé le mélange à 90 C pendant 90 secondes avant de l'appliquer à de l'urée 7M contenant du gel de polyacrylamide (12,5 O/o p/v) (voir, par exemple,
Maxam A. et Gilbert W., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 560-564). Après 1'électrophorèse, ona autographié le gel afin de localiser la position des molécules marquées.

Le produit marqué d'environ 150 nucléotides et produit uniquement par du mARN à partir de cellules induites a ensuite été élué de la tranche de gel et on a déterminé sa séquence (voir, par exemple, Maxam et Gilbert, loc oit). La séquence est illustrée par le schéma B qui accompagne le présent mémoire.

(6) Préparation du cADN à tartir de polyA-mARN de fibro
blastes
On a préparé le cADN en incubant le mélange suivant à 370C pendant 2 heures : 0,5 mM de dCTP, de dGTP, de dTTP, 0,15 mM de (3H) dATP (167 mCi/mmole), 5 mM de DTT, 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 10 mM de MgCl2, 0,01 / (v/v) de
Triton X-100, 50 g/ml d'actinomycine D, 20 unités/ml d' inhibiteur de ribonucléase de foie de rat, 50 mM de KCl, 20 Rg/ml d'oligo-(dT)12-18' 60 g/ml de polyA-mARN et 100 unités/ml d'AMV de transcriptase réverse. Après l'incuba- tion, on a extrait le mélange à l'aide de phénol et de chloroforme et on l'a précipité à l'éthanol (voir (2) ci-dessus).

On a récupéré 1'ADN par centrifugation, on 11a séché et dissous dans 200 ul de NaOH 0,3 N. Après incubation pendant 1 heure à 500C, on l'a neutralisé et élué sous forme du pic exclu d'une colonne de G50 (M) Sephadex, polymère de dextrane modifié, réticulé, particulaire (Pharmacia) (25 x 0,5 cm), équilibrée dans du NaCl 50 mM/SDS 0,1 O/o (p/v). On a rassemblé les fractions du pic et on les a concentrées par précipitation à l'éthanol.

(7) Transcription de cADN avec des oligonucléotides IFII,
III, IV et V
On a préincubé le 5'-oligonucléotide marqué au (32P) (3 uM) avec du cADN monocaténaire total (440 ug/ml), dérivé de polyA-mARN total pendant 2 heures à 250C, en présence de KC1 0,4 M. On a ensuite incubé le produit obtenu à 370C pendant 3 heures dans une solution finale contenant alors 0,01 % (v/v) de Triton X-100, 50 mM de Tris-RCl, pH 8, 20 mM de DTT, 10 mM d'acétate de magnésium, 0,5 mM de chacun de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 80 mM de KC1, 1.000 unités/ml de transcriptase réverse d'AMV du 5'-oligo- nucléotide marqué au (32P) (0,12 uM) et du cADN monocaté- naire (17,6 Rg/ml). Après l'extraction par du phénol et du chloroforme, on a fait passer la phase aqueuse à travers une colonne de G50 (M) Sephadex dans du NaCI 50 mM, du SDS 0,1 % (p/v) et on a précipité la fraction exclue à l'aide d'éthanol, on l'a dissoute et on l'a soumise à une électrophorèse.

(8) Analyse de transcrits Produits par IFII, III, IV et V
On a traité les transcrits de la manière décrite plus haut, c.à.d. pour des transcrits produits par IFIA et IB à 11 exception de l'emploi d'un gel de polyacrylamide à 5 O/o (p/v) dans de l'urée 7M, ou bien on les a préparés et soumis à une électrophorèse à travers des gels d'agarose (1,4 % p/v) natifs (voir, par exemple, Sharp P.A. et coll., (1973),
Biochemistry, 12, 3055-3053), que lton a ensuite autoradiographiés. On a ensuite élué les gènes d'interféron à partir de tranches de gel d'agarose choisies abord par passage à travers une aiguille de seringue 19G, puis une aiguille de seringue 21G (Gillette) et agitation des fragments de gel pendant 3 heures à 25 C dans de l'Hépés 10 ni, de l'acide
N-2-hydroxy-éthylpipérazine-M'-2-éthanesulfonique (Ultrol), pH 7, de 1'EDTA 0,1 mM et du Triton X-100 (0,02 O/o - v/v).

Après centrifugation (700 x g, 5 minutes) à travers un tampon de laine de verre posé sur un papier filtre GF/C et GF/B (Whatman), on a extrait le filtrat au phénol et au chloroforme et on l'a ensuite précipité à l?éthanol,
On a ensuite séquencé 1'ADN comme mentionne plus haut.

(9) Préparation de gènes d'interbéron pour le clonage
(a) Production de cADN monocaténaire à partir de
polyA-mARN total isolé de fibroblastes induits
On a synthétisé le cADN dans un milieu d'inouba- tion de 20 ml contenant les constituants décrits plus haut (6). Après ltextraction à l'aide de phénol et de chloroforme, on a chromatographié la phase aqueuse sur une colonne de Sephadex G50 (M) (28 x 4 cm) à partir de laquelle on a élué le cADN dans la fraction exclue dans du NaCl 50 mM,
SDS 0,1 O/o (p/v). On a précipité le cADN avec de l'éthanol et on lta ensuite récupéré, dissous dans 0,4 mi de NaOH 0,2 N et on l'a incubé à 500C pendant 30 minutes avant d' être centrifugé à travers un gradient de saccharose alcalin comme décrit ci-dessous.

(b) Purification du cADN monocaténaire d'interféron
On a divisé le cADN ci-dessus en deux parties égales et on a centrifugé chaque partie à 36.000 tpm à 2 C pendant 24 heures dans un rotor SW 41 de Beckmann, à travers un gradient de saccharose isocinétique (5-20 O/o p/p) (11 ml) contenant du NaOH 0,2 N, du NaCl 100 mM et de 1'EDTA 10 mMe
On a recueilli des fractions de 0,5 ml par déplacement ascendant en utilisant du saccharose (50 /0, p/v) et on a rassemblé les fractions correspondantes des deux gradients, on les a neutralisées et précipitées à l'aide d'6thanol absolu.On a recueilli les précipités par centrifugation, on les a lavés dans de 1 'éthanol absolu et on les a ensuite dissous dans 100 1 d'H20. On a identifié les fractions contenant des transcrits de cADN d'înterféron par analyse des produits obtenus après l'amorçage de petites parties aliquotes de chaque fraction à l'aide de (32p) 1FIII et de transcriptase réverse, de la manière décrite plus haut (7) et (8).

On a rassemblé les fractions principales qui avaient donné lieu à la synthèse dune molécule d'ADN d'interféron d'une longueur d'environ 700 nucléotides dans une préparation pour une synthèse à grande échelle de gènes dtinterféron à double brin.

(c) Inhibition de l'activité autoamorçante du cADN
monocaténaire d'interféron purifié
Avant de procéder à une préparation à grande échelle de gènes d'interféron à double brin, on a réduit l'activité autoamorçante du cADN monocaténaire d'interféron purifié (lorsqu'il était subséquemment incubé avec de la transcriptase réverse) en incubant le cADN à 370C pendant 3 heures dans 1,5 ml d'un milieu contenant du cacodylate de sodium 150 mM, pH 7,2 , du 2-mercaptoéthanol 1 mM, du CoC12 1 mM, 100 g/ml de gélatine, 20 ug/ml de cADN, du rATP 1,2 mM et 600 unités/ml de transférase terminale (EC 2.7.7.31) (1 unité est la quantité oui incorpore 1 n mole de dATP dans le produit précipitable à l'acide en l'espace d'une heure à 370C en utilisant du d(pA)50 comme amorceur, selon
Bollum R.J. et coll., (1974), Methods in Enzymology, 29, 70).

Après l'extraction à l'aide de phénol et de chloroforme, réalisée de la manière décrite plus haut, on a rendu la phase aqueuse 0,3 normale en NaOH et on l'a incubée pendant 1 heure à 500C. On a-ensuite neutralisé le mélange et on l'a chromatographié sur une colonne
Sephadex G50 (moyen) (20 x 2 cm) et on a élué le cADN dans la fraction exclue dans-du NaCl 50 mM, SDS (0,1 O/o - p/v).

On l'a ensuite précipité à l'aide d'éthanol et redissous dans de 1'H20.

Le résultat de la mise en oeuvre de ce procédé réside dans l'addition d'un reste d'AMP simple à l'extrémité 3'-hydroxyle du cADN. Le traitement à l'alcali engendre également un mélange de restes 2' et 3' phosphate à cette extrémité qui ne peut plus prendre part à une réaction d' autoamorçage avec de la transcriptase réverse. Par conséquent, lorsque des gènes bicaténaires sont subséquemment préparés en utilisant un oligonucléotide pour amorcer la transcription spécifique sur le cADN monocaténaire, la proportion de produits autoamorcés contaminants est réduite et le cADN monocaténaire résiduel peut subséquemment être dégradé par la S1 nucléase (EC 3.1.4.21).

On peut également très fortement inhiber ltacti- vité autoamorçante par la préincubation du cADN dans des mélanges tampons appropriés avec de la transcriptase réverse ou de la transcriptase terminale, en présence des quatre didésoxynucléosides triphosphstes. On peut aussi incuber le cADN avec la transférase terminale et le désoxyadénosine triphosphate, de maniere à produire une queue de poly(dA) à ltextrémité 3'-hydroxyle, ce qui inhibe également efficacement l'activité autoamorçante.

(d) Synthèse de gènes d'interféron bicaténaires en
utilisant du IFIII comme amorceur
On a purifié le cADN monocaténaire d'interféron par centrifugation à travers un gradient de saccharose alcalin et on a réduit son activité autoamorçante de la manière décrite plus haut. On a ensuite préincubé 20 g de cette matière à 250C pendant 2 heures dans 0,36-ml contenant du KC1 0,4 M et 575 pmoles de IFIII que l'on avait préalablement incubé avec de la polynucléotide kinase (EC 2.7.1.78) et du (&gamma;-32P) ATP, également de la manière décrite plus haut.On a ensuite produit des gènes bicaténaires par incubation plus poussée à 370C pendant 3 heures dans 1,8 ml de milieu contenant alors du Triton X-100 (0,01 % - v/v), du Tris-HCl (50 mM), pH 8, du DTT (20 mM), de l'acétate de magnésium (10 mM), du dATP, du dCTP, du dGTP et du dTTP (0,5 mM), de la transcriptase réverse (1.000 unités/ml), du KC1 (80 mM), du cADN (11,1 Rg/ml) et du (32p) IFIII (0,32 ssM). Après concentration à l'aide de phénol et de chloroforme, on a élué les gènes à partir d'une colonne de Sephadex G50 (moyen) (20 x 2 cm) dans du NaCl 50 mM, SDS (0,1 O/o p/v). On a ajouté du tARN de levure comme véhicule (3 ug/ml) et on a ajusté la concentration du NaCl à 0,2 M avant de procéder à la précipitation avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après repos à -7O0C pendant 30 minutes, on a recueilli le précipité par filtration et on a redissous le oulot séchédans 100 l d'H2O.

(e) Purification de gènes d'interféron à double brin
On a sédimenté 1'ADN à travers un-gradient de saccharose linéaire (5-20 O/o p/p) contenant du Tris-HCl (10 4), pH 7,5 , du NaCl (0,8 M) et de 1'EDTA (8 mM).

On a centrifugé un gradient de 5,2 ml dans un rotor 5W 65 de Beckmann à 42.000 tpm pendant 18 heures à 20C, puis on a recueilli des fractions de 0,2 ml du produit et on les a précipitées à l'éthanol. On a recueilli 1'ADN par centrifugation, on l'a redissous et on en a ensuite soumis de petites parties aliquotes à une électrophorèse à travers de 1' urée 7M contenant du gel de polyacrylamide (5 % p/v) et on a ensuite passéà l'autoradiographie du produit.

On a rassemblé les fractions présentant la molécule d'ADN d'interféron de 700 nucléotides.

(f) Préparation de gènes d'interféron contenant des
liants d'Hind III à leurs extrémités
On a d'abord traité les fractions de gradients rassemblées susmentionnées par de la S1 nucléase par incubation à 370C pendant 30 minutes dans 50 1 d'un milieu contenant du ZnSO4 0,1 mM, du NaCl 150 mM, de l'acétate de sodium 25 mM, pH 4,6 et 120 unités/ml de S1 nucléase (1 unité est-la quantité qui solubilise 10 g d'acide nucléique en 10 minutes à 450C selon Vogt V.M., (1973), Eur. J.

Biochem., 33, 192)..

Après l'addition de 0,5 l de SDS à 10 O/o (pfV), de 1 l d'EDTA 0,5 M et de 1 til de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,3 on a extrait le mélange avec du phénol et du chloroforme et on a précipité la phase aqueuse à l'aide d'éthanol. A ce stade, on a obtenu un total de 0,24 ug d'ADN bicaténaire.

Afin de garantir la présence d'extrémités "émoussées" pour la soudure subséquente avec des molécules de liant d'Hind III, on a récupéré 1'ADN à partir d'éthanol et on l'a incubé pendant 20 minutes à 140C dans 50 l d'un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2, 10 mM, du 2-mercaptoéthaol 1 mM, du dATT 0,2 mM, du dCTP 0,2 mM, du dGTP 0,2 mM et du dTTP 0,2 rnM et 40 unités/ml d'ADN polymérase I d'E. coli (EC 2.7.7.7) (1 unité est la quantité qui incorpore 10 n moles de nucléotides totaux dans une fraction précipitable à l'acide, en l'espace de 30 minutes, à 37 C, en utilisant du poly-d(A-T) comme amorceur, selon
Richardson C.C. et coll., (1964), J. Biol. Chem., 239, 222).

On a ensuite extrait l'ADN de la manière habituelle, on l'a précipité à l'éthanol et on a ensuite séché le culot obtenu par centrifugation,
On a phosphorylé 2,5 g de liant d'Hind III (Collaborative Research) d'abord par incubation à 370C pendant 30 minutes dans 50 l d'un milieu contenant 50 mM de
Tris-HCl, pH 7,8 , 10 mM de MgCl2, 10 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,25 mM de (Y-32P) ATP (20 mCi/gmole), 50 Rg/ml de
BSA (albumine de sérum bovin) et 100 unités/ml de polynucléotide kinase.Pour garantir une phosphorylation complète, on a incubé le mélange pendant 30 minutes supplémentaires à 37 C après l'addition de 10 1 d'un milieu contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,8 , 10 mM de MgCl2, 3,75 mM de rATP et 500 unités/ml de polynucléotide kinase. On a ensuite extrait le mélange avec du phénol et du chloroforme et on l'a précipité avec de 1'éthanol après l'addition de tARN de levure jusqu'à 10 g/ml.

La soudure des liants d'Hind III phosphorylés aux gènes d'interféron a été réalisée en dissolvant le culot de gène d'interféron dans 40 til d'un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2 10 mM, du rATP 1 mM, du DTT 20 mM, 20 Fg/ml de liant phosphorylé et ~ 480 unités/ ml de T4 ADN ligase (EC 6.5.1.1) (1 unité est la quantité qui catalyse la conversion de 1 n mole de 32PP1 en 32P)-ATP en 20 minutes à 370C selon Weiss B. et coll., (1968), J. Biol. Chem., 243, 4543). On a ensuite incubé ce produit à 250C pendant 16 heures.

Ces conditions ont engendré un excès environ centuple de liant par rapport à l'ADN.

Après le chauffage du mélange à 650C pendant 5 minutes, on a restreint 1'ADN à l'aide d'Hind III par l'addition de 60 til d'un mélange contenant 400 unités/ml d'Hind III (EC 3.1.23.21), (1 unité est la quantité qui digère 1 g de N, -ADN en 15 minutes à 370C dans 50 l), 3 mM de DTT, 167 ssg/ml de gélatine, 83 mM de Tris-HCl,- pH 7,5 , 83 mN de NaCl, 17 mM de MgCl2 et 8 mN de 2-mercaptoéthanol.Après l'incubation à 37 C pendant 2 heures, on a amené le mélange à une concentration de SDS de 0,2 O/o (p/v) et à une concentration d'EDTA de 20 mM et on a extrait 1'
ADN avec du phénol et du chloroforme et on a ajouté du tARN de levure à la phase aqueuse finale de façon à obtenir une concentration ao 5 /n. On a ensuite chromotographié ce produit sur une colonne de Sephadex G150 superfin (50 x 0,7 cm) d'où on a élué les gènes bicaténaires dans la fraction exclue en utilisant du NaCl 50 mM, SDS 0,1 O/o (p/v) et 5 ug/ml de tARN de levure.On a ensuite précipité ce dernier produit avec de l'éthanol après avoir amené les concentrations en tAZN à 10 ug/ml. On a estimé que 1'ADN récupéré contenait environ 0,125 ug de gènes bicaténaires.

(g) Fractionnement final des gènes d'interféron
On a ensuite dissous 1'ADN dans 50 1 d'H20 et on en a soumis 20 l à une électrophorèse à travers un gel d'agarose à 1,4 O/o (p/v) (20 x 14 x 0,5 cm) pendant 2 heures à 120 volts. On a ensuite élué 1-'ADN correspondant à une longueur de 600 à 1000 bp du gel, de la manière suivante on a excisé la tranche appropriée et on l'a fait passer à travers une aiguille 21G (Gillette).On a lavé cette dernière avec 4 ml de 10 mM de Hépés, pH 7,5 , de 0,1 mN d'
EDTA, de 0,02 % (v/v) de Triton X-100, de5 Rg/ml de tARN de levure et on a congelé la tranche à -700C. On l'a ensuite dégelée et on l'a agitée sur un mélangeur rotatif jusqu'au lendemain à la température ambiante (environ 250C) avant de la filtrer à travers un papier Whatman n 52e On a ajusté le filtrat à une concentration en acétate d'ammonium de 0,1 M, d'acétate de magnésium de 2 mM, de SDS de 0,02 O/o (p/v) et on l'a lié à une colonne de 1 ml de diéthylaminoéthyl (DEAE) 52 cellulose. On a ensuite procédé à un triple lavage avec des parties aliquotes de 1,5 ml du tampon susmentionné avant de procéder à l'élution de 1'ADN avec des fractions aliquotes de 0,5 ml de NaCl 1,1 M, d'acétate d' ammonium 0,1 M, d'acétate de magnésium 2 mM, de SDS 0,02 O/o (p/v) et d'EDTA 0,02 mN. On a ensuite complété 1'ADN élué avec les seconde et troisième fractions aliquotes qui furent alors réunies, de 5 ug de tARN de levure et on a précipité le produit à l'éthanol. On a récupéré le précipité par centrifugation, on l'a lavé à l'éthanol absolu, on l'a séché et on l'a dissous dans 20 ul d'eau. On a prélevé 4 til pour un comptage à scintillation liquide et on a séché le résidu (environ 8 ng) par dessiccation sous vide.

(10) Clonage des gènes d'interféron en x1776 en utilisant
du nBR 322 comme vecteur de plasmide
On a préparé les vecteurs de la manière suivante: on a restreint 10 g du plasmide pBT 322 avec de l'Hind III, on l'a extrait à l'aide de phénol et de chloroforme et on l'a précipité à l'éthanol. On a ensuite incubé le plasmide linéaire récupéré à 650C pendant 30 minutes dans 25 1 d'un milieu contenant 20 mM-de Tris-HCl, pH 7,5 , 0,1 % (p/v) de SDS et 0,7 mg/ml de phosphatase alcaline bactérienne (EC 3.1.3.1), avant de procéder à une triple extraction avec du chloroforme et du phénol, à une double extraction avec de l'éther et à une nouvelle précipitation à l'éthanol.On a ensuite dissous le précipité récupéré dans 100 til d1H20.

On a ensuite dissous le culot de gène séché (voir (9 - g) ci-dessus) dans 10 ul d'un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgC12 10 mN, du rATP 1 mN, du DTT 20 mN, 10 ug/ml d'ADN de vecteur traité et environ 16 unités/ml d'ADN ligase de T4. On a ensuite incubé ce mélange à 150C jusqu'au lendemain avant de le diluer jusqu'à 100 til avec du Tris-HCl 10 mN, pH 7,5 , de l'EDTA 1 mN, du
NaCL 0,1 M et on 1ta ainsi utilisé pour transformer E. coli
K-12 X 1776 selon des procédés connus (voir, par exemple,
Curtiss R., III, et coîl., (1976), Recombinant Molecules
Impact on Science and Society (R.F. Berrs, Jr. et E.G.

Bassett (Eds.), 45-56). De cette manière, on a obtenu un total de 370 transformants résistant à l'ampicilline (100 g/ml) que lton a ensuite testé quant à leur sensibi- lité à 10 g/ml de tétracycline On a constaté que 62 O/o étaient sensibles à la tétracycline et on les a par consé- quent identifiés comme étant des recombinantsq On a ensuite fait croître 160 de ces derniers sur des filtres millipores posés par dessus des plaques de culture afin d'identifier les recombinants de gène d'interféron par hybridation de colonie avec (&gamma;-32P) IFIA et (&gamma;-32P) IFIV.

(11) Triage des recombînants
On a fait croitre des recombinants sur des filtres de nitrocellulose (diamètre : 9 cm) jusqu'à ce que les colonies eussent atteint un diamètre de 2 ou 3 mm. Après avoir soulevé les filtres des plaques, on les a placés pendant 7 minutes sur un tampon de papiers filtres TMatman n 1 trempés dans du NaOd 0,5 N, puis pendant 2 minutes sur un tampon trempé dans du Tris-HCl 1 M, pH 7,5 , et ensuite pendant 7 minutes sur un tampon trempé dans du Tris-HCî 0,5 N, pH 7,5 et du NaCl 1,5 M.On a ensuite séché les filtres en les plaçant sur une tubulure d'aspiration de vide pendant environ 5 minutes et on les a finalement lavés avec 100 ml d'éthanol absolu avant de les chauffer pendant 2 heures à une température de 80 à 850C. 0
On a préincubé les filtres à 250C pendant 2 heures dans 3 x SSC (1 x SSC est constitué de NaCl 0,15 M, de citrate de sodium 0,015 M, pH 7,6) contenant du BSA (0,02 O/o p/v), du Ficoll (0,02 /0 p/v) (copolymère de saccharose et d'épichlorhydrine) et de la polyvinylpyrrolidone (0,02 /0 p/v) avant d'être égouttés et placés sur un filtre de papier pour sécher à l'air pendant quelques minutes.On a marqué les oligonucléotides IFIA et IFIV radioactivement en utilisant du (Y-32p) ATP et de polynucléotide kinase, de la manière décrite plus haut et on les a ensuite mis en suspension dans 3 x SSC. On a uniformément appliqué 300 til (contenant 0,85 pmole de chaque (Y-32P) oligonucléotide (environ 1 FCi/pmole)) sur chaque filtre (reposant alors sur une surface non absorbante) et on a laissé la substance pénétrer dans les filtres pendant environ 5 minutes. On a submergé les filtres de paraffine légère et on les a incubés pendant 2 ou 3 jours à 250C.On en a ensuite égoutté lthuile, on a rincé les filtres dans du chloroforme, on les a séchés à l'air et on les a lavés à quatre reprises dans 3 x SSC à 250C (chaque lavage durant 20 minutes), avant de les laver à deux reprises dans 2 x SSC à la même température. Après les avoir modérément séchés au buvard, on a hermétiquement enfermé les filtres dans un sac en polythène et on les a autoradiographiés à -700C dans une cassette d'intensification Kodak regular. -
L'autoradiographie a indiqué la présence de cinq colonies qui étaient manifestement plus sombres que le reste.On a préparé 1'ADbJ de plasmide à partir de ces colonies selon des procédés connus (voir, par exemple,
Birnboim H.C. et Doly J., (1979), Nucl. Acids Res., 7, 1513-1523) et la restriction subséquente et l'enalyse de la séquence nucléotidique ont confirmé que chacun de ces recombinants contenait un gène d'interféron de fibroblaste codant pour le polypeptîde d'interféron mûr et la séquence de mARN non traduite en 3'.

(12) Transfert du gène d'interféron dans des plesmides
d'exuression pWT 2xl
On a préparé l'ADN de plasmide à partir de l'un des recombinants d'interféron susmentionnés en centrifugeant un lysat clarifie à travers des gradients de densité conte- nant du bromure d'éthidium (vour, par exemple, Katz L. et coll., (1973), J. Bacteriol., 114, 577-591 et Wensink POC.

et coîl., (1974), Ceîl, 3, 315-325). On en a ensuite restreint 3 g avec de l'Hind III et on a soumis l'ADN extrait à une électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide (5 % p/v).

On a visualisé le gène d'interféron (environ 730 bp) par coloration avec 1 g/ml de bromure d'éthidium et en regar- dant sous de la lumière UV (254 nm), de façon à permettre l'excision d'une petite tranche de gel contenant le gène,
On a dispersé cette tranche en la faisant passer à travers l'orifice d'une seringue en plastique de l/ml, cette dernière ayant été lavée avec quatre volumes, par rapport à la tranche de gel, dVAGEB (acétate d'ammonium 0,5 M, acétate de magnésium 10 mM, SDS 0,1 % (p/V) et EDTA 0,1 mN) que l'on avait mélangé à la suspension de gel en secouant modérément pendant 1.6 heures à 37 C. On a ajouté du tARN de levure de façon à obtenir une concentration finale de 25 Rg/ml avant de concentrer le mélange à. travers un papier Whstman n 52 dans une seringue de 2 ml et de laver le papier à l'AGEB. On a ensuite dilué le filtrat total cinq fois avec de l'eau avant de procéder à une chromatographie sur une colonne de 1 ml de DEAE 52-celldlose), comme décrit plus haut (9 g). On a extrait l'éluat (1 ml au total) à deux reprises avec 1 ml d'alcool isoamylique saturé de 1/5 x
AGEB contenant du NaCl 1,1 M (afin d'éliminer le bromure d'éthidium) avant de procéder à une précipitation avec de l'éthanol après l'addition de 5 g de tARN de levure0 On a récupéré 1'ADN et on l'a dissous dans 50 l d'H20 (environ 0,2 g d'ADN).

On a ensuite soudé 4 ul du produit (dans un volume final de 10 ll) à 80 ng de psrT 211, de pWT 221 ou de pWT 231, que l'on avait préalablement restreint à 1'
Hind III et ensuite traité par de la phosphatase alcaline afin de minimiser la soudure du plasmide apparenté (voir (10) ci-dessus). On a ensuite utilisé chaque soudure pour transformer E. coli K 12 UB-101 en utilisant des procédés connus (voir, par exemple, Emtage J.S. et coll., (1980),
Nature, 283, 171-174).

On a fait croftre des transformants sur des plaques de L-gélose contenant 100 Rg/ml d'ampicilline (en fait on a utilisé de la carbénicilline sodique (Beecham) qui est un dérivé qui peut otre considéré comme lui étant équivalent; la carbénicilline est 1' -carboxybenzylpénicil- line) et on a préparé 1'ADN de plasmide à partir de six à douze colonies dans chaque cas. En procédant à des restrictions avec Pst I (EC 3.1.23.31) et en analysant les produits par électrophorèse en gel, on a pu identifier les recombinants tout comme ltorientation du gène d'interféron par rapport à la séquence de promoteur de tryptophane.Pour chacun des trois plasmides pWT 2x1, on a sélectionné un recombinant possédant le gène d'interféron dans l'orienta- tion requise pour l'expression et on 11a examiné quant à son aptitude à produire un interféron biologiquement actif.

(13) Induction de plasmides d'exoroseion contenant le gène
d'interféron
On a fait croître des cultures de 150 ml de chacun des trois clones de pWT 2xl/gène d'interféron dans du bouillon L (bouillon de luria : bacto tryptone 1 % (p/v), extrait de bactolevure 0,5 O/o (p/v), NaCl 0,5 O/o (p/v), glucose 0,2 O/o (p/v), thymine 0,004 % (p/v) pW7) contenant de l'ampicilline jusqu'à un 0.De600 nm d'environ 0,3.

On a pastillé les bactéries par centrifugation, on les a lavées et on les a remises ensuite en suspension dans un milieu inducteur (42 mM de Na2HPO4, 22 mM de KH2P04, 8,6 mM de NaCî, 18,7 mM de NH4Cl, 0,1 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgS04, 1 ssg/ml vitamine B1, 0,2 O/o (p/v) de glucose, 0,5 % (p/v) de casamino acides manquant de tryptophane (Difco), 20 Ug/ml d'acide 3 ss-indole acrylique et 100 ug/ml d'ampioilline).

Après l'incubation à 37 C pendant 4 heures (moment au bout duquel le O.D.600 nm était d'environ 1,0), on a centrifugé les cellules et on les a extraites de la manière décrite ci-dessous.

(14) Extraction d'interféron à tartir de bactéries
On a effectué les opérations suivantes à 2 C
On a remis les culots bactériens en suspension dans 1,2 mi de PBs contenant 2 % (p/v) d'HSA (albumine do sérum humein).

On a ensuite ajouté un égal volume de saccharose à 50 % (p/v) contenant du Tris-HCl 0,1 M, pH 8 et 1 O/o (p/v) de
HSA, cette addition étant suivie de l'addition de 0,8 ml d'une solution de lysozyme franche (10 mg/ml dans PBS)
Après 15 minutes, on a ajouté 0,8 mi d'EDTA 0,5 H de pH 8,5 et on a laissé reposer les cellules pendant 10 minutes supplémentaires.On a ensuite ajouté 4 mi de Triton X-100 à 0,6 O/o (v/v) et, après mélange pendant 10 minutes, on a soumis l'extrait à une sonication de façon à réduire la viscosité et à garantir une lyse complète, puis on a procédé à l'$l'ultra-dentrifugation (10,000 du produit à 500000 tpm dans un rotor T1 50 de Beckmann, pendant 2 heures On a dialysé la couche surnageante vis-à-vis de PBS, on l'a clarifiée par centrifugation d'interféron tpm, 10 minutes), avant de la titrer quant à son activité Dahi en surveillant la protection conférée à des cellules Vero contre le cpe du virus
EMC dans un système de titrage à microplaque in vitro (voir, par exemple, Path. N. et Degre M., (1972), Acta. Scan., Microbiol. sonication 1380, 863).

Un autre procédé d'extraction implique la simple mM, des bactéries induites dans du Tris-HCl 10 8,0 pH 15.000 , suivie d'une centrifugation pendant 30 minutes à d'exeression x g et le prélèvement de la couche surnageanteO (15) Construction de recombinants pWT modifiés
Le plasmide partir 501 contient un fragment d'Hind
III de 150 bp qui contient le promoteur de trp et la partie de la séquence de gène codant pour le polypeptide conducteur de trp.On a récupéré ce fragment à d'un gel de polyacrylamide (5 O/o - p/v) natif et on l'a autosoudé en utilisant de la T4 ADN ligase (10) Les enchafnements ont ensuite été partiellement digérés avec du Taq I avant de subir un traitement préalable par la S1 nucléase, puis par 1'ADN polymérase I d'E. coli et finalement par l'Hind III (9 f).

De cette manière, la scission ou clivage au Taq I requis dans la séquence correspondant au site de liaison de ribosome dans la région du mARN codant pour le polypeptide conducteur de trp, a engendré un fragment d'environ 100 bp suivant la restriction à l'Hind III. On a isolé ce fragment à partir d'un gel de polyacrylamide natif (8 /0 - p/v) (12) en préparation pour une soudure au fragment Sac I/Hind III du gène d'interféron. On a obtenu ce dernier fragment en procédant d'abord à la digestion du gène d'interféron cloné dans pWT 231 par le Sac I.Après le traitement par la SI nucléase, puis par 1'ADN polymérase I d'E. c-oli, on a soumis 1'ADN à une restriction par l'Hind III et on a récuperé le fragment résultant d'environ 700 bp à partir d'un gel de polyacrylamide natif (5 /0 - p/v).

On a ensuite mutuellement soudé les deux fragments par incubation à 250C pendant 16 heures dans un volume final de 20 1 contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2 10 mN, de 1'ATP 1 mN, du DTT 20 mM, environ 480 unités/ ml de T4 ADN ligase, 0,5 Rg/ml du fragment d'Hind III/Taq I trp et 5 Fg/ml du fragment Sac I/Hind III du gène d'interféron. Après la restriction à 1'Hind III, on a transformé la molécule conjointe en K-12 HBl0l d'E. coli en utilisant du pAT 153 comme vecteur.Ce dernier avait été préalablement restreint avec l'Hind III avant de subir un traitement par la phosphatase alcaline bactérienne (EC 3.1.3.1) en vue de réduire la proportion de transformants non recombinants (10). On a préparé 1'ADN de plasmide à partir de transformants selon des procédés connus (voir, par exemple, Katz et colt, et Wensink et coll., loc cit) et on l'a ensuite analysé par établissement de la carte à l'enzyme de restriction et également par séquencialisation nucléotidique. De cette manière, on a identifié plusieurs recombinants contenant la molécule conjointe requise.

Ces recombinants ont ensuite été induits de façon à produire de l'interféron de la manière décrite plus haut (13), à l'exception que la concentration en acide 3 3.-indole acrylique avait été ajustée à 2,5 ug/ml.

Afin de préparer l'interféron radioactif, on a induit des bactéries de la manière précédemment décrite, à l'exception que l'on a travaillé en l'absence de casamino acides et en présence de 5 Mg/ml d'acide 3 ss-indole acrylique. Au bout de la période d'induction, on a incubé des parties aliquotes de 1 ml pendant 15 minutes supplémentaires avec 5 FCi d'un mélange de (14C) amino acides On a ensuite centrifugé les bactéries et on a lysé le culot par l'addition de 50 1 d'un mélange de glycérol (10 %, v/v), de 2-mercaptoéthanol (5 %, p/v), de SDS (3 /0, p/v), de
Tria-HCl (62,5 mM), pH 6,8 , de bleu de bromophénol (0,01 % p/v) et par le chauffage à 900C pendant 2 minutes.On a ensuite soumis les échantillons à une électrophorèse à travers des gels de polyacrylamide (12,5 /0, p/v) par mise en oeuvre de procédés connus (voir, par exemple, Laemmli, U.K., (1970), Nature, 227, 680-685). On a ensuite séché le gel et on l'a autoradiographie afin de visualiser le polypeptide d'interféron (voir figure 4 des dessins annexés).

SCHEMA A
A A A
UCN UU UU UU CGN UCN UCN
G G G
PIBROBLASTE H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser
HUMAIN FS-4 U U U U A A U U
AUG AG UA AA CUN CUN CGN UU CUN CA AG AG AG
C C C C G G C C
.. . .. .. . . .. . . . . .

A A
UU UU CGN
G G
SOURIS H-Ile-Asn-Tyr-Lys-Gln-Leu-Gln-Leu-Gln-glu-Arg-Thr-Asn
A et B U U U A A A A A A U
AUC AA UA AA CA CUN CA CUN CA GA AG ACN AA
A C C G G G G G G C
.. . .. .. . . . . . . .. .

SCHEMA A (suite)
AUG AGC UAC AAC CUG (possibilités de séquence de
codage déduites)
AUG AGU UAC AAC CUG
OH 3'-TAC TCG ATG TTG GAC-5' IFIA
OH 3'-TAC TCA ATG TTG GAC-5' IFIB (amorceurs potentiels déduits) SCHEMA B 3' AAG.AAT.GAC.GTT.GGA.AAG.CTT.CGG.AAA.CGA.GAC.CGT.GTT.GTC.CAT.5' UUC.UAA.CUG.CAA.CCU.UUC.GAA.GCC.UUU.GCU.CUG.GCA.CAA.CAG.GUA.
CAT.CCG.CTG.TCA.CAA.GCA.CAA.CAG.TTG.TAC.TGG.TTG.TTC.ACA.GAG.
GUA.GGC.GAC.ACU.GUU.CGU.GUU.GUC.AAC.AUG.ACC.AAC.AAG.UGU.CUC.
met thr asn lys cys leu
GAG.GTT.TAA.CGA.GAG.GAC.AAC.ACG.AAG.AGG.TGA.TGT.CGA.GAA.AGG.
CUC.CAA.AUU.GCU.CUC.CUG.UUG.UGC.UUC.UCC.ACU.ACA.GCU.CUU.UCC.leu gln ile sla leu leu leu oys phe ser thr thr ala leu ser
Amorceur IFIA
TAC.TCG.ATG.TTG.GAC. 5'
SCHEMA C

CTCTTTCCATG
IFII
SCHEMA D
IFIII
5' CAGCTCTTTCCATG 3'
IFIV
5' GAGGAGATTAAG 3
IFV
5' CCTGCAAGAAA 3'
SCHEMA E amorceur IFII

mARN 5'... CU.CUU.UCC.AUG.AGC.UAC.AAC.UUG.CUU.protéine N... leu

ser tyr asn leu leu polypeptide mêr
GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGG.AGC.
GGA.UUC0CUA.CAA.AGA.AGC.AGC.-
10 gly phe leu gln atg ser ser AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.-
AAU.UUU.CAG.UGU.CAG.
asn phe gln cys. gln
AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.
AAG.CUC.CUG.UGG.CAA.UUG.
10
lys leu leu trp gln leu -
AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC. AAU.GGG.AGG.CUU.GAA.UAC.-
30
asn gly arg leu glu tyr
TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG. UGC.CUC.AAG.GAC.AGG.AUG.-
cys leu lys asp atg met

mARN 5' AAC.UUU.GAC.AUC.CCU.GAG.
40 protéine N asn phe asp ile pro glu.

GAG.AUU.AAG.CAG.CUG.CAG.CAG.UUC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.glu ile lys gln leu gln gln phe gln lys glu asp ala ala
TTG.ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.
UUG.ACC.AUC.UAU.GAG.AUG.CUC.CAG.AAC.AUC.UUU.GCU.AUU.UUC.
10 leu thr ile tyr glu met meu gln asn ile phe ala ile phe
AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.
AGA.CAA.GAU.UCA.UCU.AGC.ACU.GGC.UGG.AAU.GAG.ACU.AUU.GUU.
80 arg gln asp ser ser ser thr gly trp asn glu thr ile val
GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.
GAG.AAC.CUC.CUG.GCU.AAU.GUC.UAU.CAU.CAG.AUA.AAC.CAU.CUG.glu asn leu leu ala asn val tyr his gln ile asn his leu.

AAG.ACA.GUC.CUG.GAA.GAA.AAA.CUG.GAG.AAA.GAA.GAu.UUC.Aoe.-
100 110 lys thr val leu glu glu lys leu glu lys glu asp phe thr
AGG.GGA.AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.
AGG.GGA.AAA.CUC.AUG.AGC.AUG.CUG.CAC.CUG.AAA.AGA.UAU.UAU.
120 arg gly lys leu met ser ser leu his leu lys arg tyr tyr
GGG.AGG.ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.
GGG.AGG.AUU.CUG.CAU.UAC.CUG.AAG.GCC.AAG.GAG.UAC.AGU.CAC.
130 140 gly arg ile leu his tyr leu lys ala lys glu tyr ser his
TGT.GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.
UGU.GCC.UGG.ACC.AUA.GUC.AGA.GUG.GAA.AUC.CUA.AGG.AAC.UUU.
150 cys ala trp thr ile val arg val glu ile leu arg asn phe
TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.CGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.

UAC.UUC.AUU.AAC.AGA.CUU.ACA.GGU.UAC.CUC.CGA.AAC.UGA.AGA.UCU.

160 166 tyr phe ile asn arg leu thr gly tyr leu arg asn
SCHEMA F
Brin codeur : 5' TTC.TAA.CTG.CAA.CCT.TTC.GAA.
Brin complémentarie : 3' AAG.ATT.GAC.GTT.GGA.AAG.CTT.
GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.GTA.GTA.GGC.GAC.
CGG.AAA.CGA.GAC.CGT.GTT.GTC.CAT.CAT.CCG.CTG.
ACT.GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATC.ACC.AAC.AAG.TGT.
TGA.CAA.GCA.CAA.CAG.TTG.TAC.TGG.TTG.TTC.ACA.
CTC.CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.
GAG.GAG.GTT.TAA.GCA.GAG.GAC.AAC.AGG.AAG.AGG.TGA.
ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.
TGT.CGA.GAA.AGG.TAC.TCG.ATG.TTG.ACC.GAA.CCT.AAG.
CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.
GAT.GTT.TCT.TCG.TCG.TTA.AAA.GTC.ACA.GTC.TTC.GAG.GAC.ACC.
CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.CTC.AAG.GAC.
GTT.AAC.TTA.CCC.TCC.GAA.CTT.ATG.ACG.GAG.TTC.CTG.
AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.CAG.
TCC.TAC.TTG.AAA.CTG.TAG.GGA.CTC.CTC.TAA.TTC.GTC.
CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG..
GAC.GTC.GTC.AAG.GTC.TTC.CTC.CTG.CGG.CGT.AAC.
ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.
TGC.TAG.ATA.CTC.TAC.GAG.GTC.TTG.TAG.AAA.CGA.TAA.AAG.TCT.
CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.CGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.
GTT.CTA.AGT.AGA.TCG.TGA.CCG.ACC.TTA.CTC.TGA.TAA.CAA.CTC.
AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.
TTG.GAG.GAC.CGA.TTA.CAG.ATA.GTA.GTC.TAT.TTG.GTA.GAC.TTC.
ACA.GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.
TGT.CAG.GAC.CTT.CTT.TTT.GAC.CTC.TTT.CTT.CTA.AAG.TGG.TCC.
GGA.AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.
CCT.TTT.GAG.TAC.TCG.TCA.GAC.GTG.GAC.TTT.TCT.ATA.ATA.CCC.TCC.
ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.TGG.
TAA.GAC.GTA.ATG.GAC.TTC.CGG.TTC.CTC.ATG.TCA.GTC.ACA.CGG.ACC.
ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.ATT.AAC.
TGG.TAT.CAG.TCT.CAC.CTT.TAG.GAT.TCC.TTG.AAA.ATG.AAG.TAA.TTG.
AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.A AAC.TGA.AGA.TCT....

TCT.GAA.TGT.CCA.ATG.GAG.GCT.TTG.ACT.TCT.AGA....

SCHEMA G

<tb> <SEP> Poly <SEP> A <SEP> - <SEP> mARN
<tb> <SEP> Oligo(dT)1218, <SEP> 100 <SEP> unités/ml <SEP> de
<tb> <SEP> transcriptase <SEP> réverse,-.
<tb> <SEP> Actinomycine <SEP> D, <SEP> 370C
<tb> cADN <SEP> mono <SEP> caténaire
<tb> <SEP> | <SEP> centrifugation <SEP> avec <SEP> gradient <SEP> de
<tb> <SEP> saccharose <SEP> alcalin
<tb> Grand <SEP> cADN <SEP> d'interféron
<tb> <SEP> &verbar;<SEP> transférase <SEP> terminale, <SEP> ATP, <SEP> 37 C;
<tb> <SEP> i <SEP> traitement <SEP> à <SEP> l'alcali <SEP> ATP, <SEP> 370C;
<tb> cADN <SEP> avec <SEP> faible <SEP> activité <SEP> d'auto-amorçage
<tb> <SEP> | <SEP> /-32p <SEP> 7,CAGCTCTTTCCATGOH-31 <SEP> (IFIII),
<tb> <SEP> 1.000 <SEP> unités/ml <SEP> de <SEP> transcriptase <SEP> réverse,
<tb> <SEP> > <SEP> z37"C
<tb> <SEP> Gènes <SEP> bicaténaires
<tb> <SEP> centrifugation <SEP> avec <SEP> gradient <SEP> saccharose
<tb> Grands <SEP> gènes <SEP> d'interféron
<tb> <SEP> a) <SEP> Sl <SEP> nucléase, <SEP> 370C
<tb> <SEP> b)- <SEP> ADN <SEP> polymérase <SEP> I <SEP> d'E.<SEP> coli, <SEP> 140C
<tb> <SEP> c) <SEP> liants <SEP> d'Hind <SEP> III, <SEP> ADN <SEP> ligase, <SEP> 250C
<tb> <SEP> d) <SEP> d) <SEP> Hind <SEP> III, <SEP> 370C
<tb> <SEP> Gènes <SEP> avec <SEP> extrémités <SEP> "collantes" <SEP> à <SEP> Hind <SEP> III
<tb> <SEP> 4 <SEP> électrophorèse <SEP> avec <SEP> gel <SEP> d'agarose
<tb> <SEP> Gènes <SEP> de <SEP> haut <SEP> poids <SEP> moléculaire <SEP> avec <SEP> extrémités
<tb> <SEP> "collantes" <SEP> à <SEP> Hind <SEP> III
<tb> <SEP> a) <SEP> souder <SEP> à <SEP> 150C <SEP> avec <SEP> pBR322 <SEP> prétraité
<tb> <SEP> par <SEP> Hind <SEP> III <SEP> et <SEP> phosphatase <SEP> alcaline
<tb> <SEP> b) <SEP> b) <SEP> transformer <SEP> en <SEP> X <SEP> 1776
<tb> <SEP> TransSormants
<tb> <SEP> a) <SEP> Colonie <SEP> sthybride <SEP> avec <SEP> /-32p <SEP> 7 <SEP> IFIA
<tb> <SEP> et <SEP> g32P <SEP> 7 <SEP> IFIV
<tb> <SEP> b) <SEP> Mise <SEP> en <SEP> carte <SEP> à <SEP> l'enzyme <SEP> de <SEP> restriction
<tb> <SEP> et <SEP> séauentialisation <SEP> nucléotidique
<tb> Recombinants <SEP> de <SEP> gènes <SEP> d'interféron
<tb>
SCHEMA H

TAC AAC TTG CTT GGA TTC CTA CAA AGA tyr asn leu leu gly phe leu gln arg
10
AGC AGC AAT TTT CAG TGT CAG AAG ser ser asn phe gln cys gin lys
CTC CTG TGG CAA TTG AAT GGG AGG leu leu trp gln leu asn gly arg
20
CTT GAA TAT TGG leu glu tyr cys
30 SCHEMA I

<SEP> (fragment <SEP> d'Hind <SEP> III
<tb> <SEP> de <SEP> pWT <SEP> 501)
<tb> ind <SEP> III
<tb> <SEP> Taq <SEP> I <SEP> Taq <SEP> I <SEP> wet <SEP> bys <SEP> Aln <SEP> ile <SEP> ruo <SEP> val <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Cly <SEP> Trp <SEP> Trp <SEP> Pro <SEP> Hind <SEP> III <SEP> Structure <SEP> de
<tb> COTT <SEP> AAAAAOCQTATCOACA <SEP> ATG <SEP> AAA <SEP> GCA <SEP> ATT <SEP> TTC <SEP> Gra <SEP> CTG <SEP> AAA <SEP> CGT <SEP> TGG <SEP> TGG <SEP> CCA <SEP> A <SEP> recombinant <SEP> voule
<tb> <SEP> TTTTTCCATACA <SEP> TGT <SEP> TAG <SEP> TTT <SEP> COT <SEP> TAA <SEP> AAG <SEP> Chr <SEP> GAC <SEP> TTT <SEP> CCA <SEP> ACC <SEP> ACC <SEP> CCT <SEP> TCGA <SEP> mARN <SEP> d'interféron
<tb> <SEP> protection <SEP> de <SEP> ribosome <SEP> non <SEP> traduit <SEP> 3'
<tb> <SEP> 1) <SEP> auto-soudure <SEP> (basse <SEP> concentration <SEP> en <SEP> ligase) <SEP> Hind <SEP> III
<tb> <SEP> 2) <SEP> restriction <SEP> partielle <SEP> Taq <SEP> I
<tb> <SEP> 3) <SEP> Sl <SEP> nucléase
<tb> <SEP> 4) <SEP> ADN <SEP> polymérase <SEP> I <SEP> d'E.<SEP> Coli
<tb> <SEP> 5) <SEP> restriction <SEP> à <SEP> l'Hind <SEP> III <SEP> (a) <SEP> Hind <SEP> III
<tb> 5' <SEP> -ACCTT <SEP> - <SEP> ----- <SEP> AAAAACGCTAT <SEP> (b) <SEP> PAT <SEP> 193 <SEP> --------- <SEP> AAAAAGGGTATCTTTCC <SEP> ATG <SEP> AGC <SEP> TAC
<tb> <SEP> A <SEP> ------- <SEP> TTTTTGCATA <SEP> (c) <SEP> --------- <SEP> TTTTTCCCATAGAAAGG <SEP> TAC <SEP> TCG <SEP> ATG
<tb> <SEP> CTTTCC <SEP> ATG <SEP> AGC <SEP> TAC--------A <SEP> (d) <SEP> Hot <SEP> fier <SEP> Tyr
<tb> <SEP> CAAACG <SEP> TAC <SEP> TCC <SEP> ATG--------TTCGA <SEP> - <SEP> 5' <SEP> séquence <SEP> de <SEP> gène <SEP> d'interf'4
<tb> <SEP> 1) <SEP> restriction <SEP> au <SEP> Sac <SEP> I <SEP> mûr
<tb> <SEP> 2) <SEP> Sl <SEP> nucléase
<tb> <SEP> 3) <SEP> ADN <SEP> polymérase <SEP> d'E.<SEP> Coli
<tb> <SEP> 4) <SEP> restriction <SEP> à <SEP> l'Hind <SEP> III
<tb> <SEP> séquence <SEP> codeuse <SEP> séquence <SEP> de <SEP> mARN
<tb> liant <SEP> d' <SEP> d'interféron <SEP> mûr <SEP> non <SEP> traduit <SEP> 3'
<tb> Hind <SEP> III <SEP> 1F <SEP> III <SEP> liant <SEP> d'Hind <SEP> III
<tb> Phr <SEP> 23) <SEP> CCA <SEP> AGCTTCACCTTTTCC <SEP> ATC <SEP> ACC <SEP> TAC----------- <SEP> CCAAGCTTCG
<tb> <SEP> CCT <SEP> TCCAACOTCGAAAGG <SEP> TAC <SEP> TCG <SEP> ATG----------- <SEP> CGTTGGAATC <SEP> ptry <SEP> 231
<tb> <SEP> Met <SEP> Ser <SEP> Tyr
<tb> <SEP> (gène <SEP> d'interféron <SEP> cloné <SEP> dans <SEP> pWT <SEP> 231)
<tb> (a) 1. souder (forte concentration en ligase) (b) 2. restreindre à l'Hind III (c) 3.cloner dans pAT 153 (d) 4. choisir recombinats contenant
molécule conjointe requise
SCHEMA J 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.CCT.
TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CGA.GTA.GTA.GGC.GAC.ACT.
GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.
GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.
TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.
TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.
TCC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.
AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.
ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.ACA.CAA.
GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.
CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.
GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.
AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.
ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.
TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG G.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.
ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.
AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.ATT.CTT.
CAA.CCA.GCA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.
TTA.TGA.GTT.ATT.TTT.ATT.TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.
AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TCA.ACA.TGG.CAG.TTT.TAA.TTT.
CGA.TTT.GAT.TTA.TAT.AAC.CA.. 3'

Claims (34)

1. ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.

   AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.-

   TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.-

   TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.-

   TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTTCAG.-

   GCT.CTCCTG.TTG.TGC.TTC.TCC .ACT.ACA.CCT.CTT.TCC.ATG.AGC.-

   GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.-

   TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.GTA.GTA.GGC.GAC.ACT.

   1. Gène pour l'expression d'une protéine possédant des propriétés ressemblant à celles de l'interféron humain, caractérisé en ce qu'il est constitué par un brin codeur et un brin complémentaire, le brin codeur comprenant la séquence suivante 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.CCT.-

   R E V E N D I C A T I O N S

   TTA.TGA.GTT.ATT.TTT. TT.TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.

   GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.

   CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.

   AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.ATT.CTT.-

   ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.

   TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.-

   ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.-

   AAA.CTC.ATG.ACC.AGT.CTC.CAC.CTG.AAA.ACA.TAT.TAT.GGG.AGG.-

   GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.-

   CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.-

   GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.--

   AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TCA.ACA.TGG.CA 3' ou une sous-unité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci.
2. 2. Gène suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le brin codeur comprend la séquence suivante 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA.CCT. TTC.GAA.GCC.TTT..CCT.CTG.GCA.CAA.CAC.GTA.GTA.GGC.GAC.ACT. -

   GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.

   GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.CTT.TCC.ATG.AGC.

   TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.

   TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.

   TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.

   AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.

   ATC.TAT e GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.~

   GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.~

   CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATAAAC.CAT.CTG.AAG.ACA.~

   GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.

   AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.

   ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC*AGT.CAC.TGT.GCC.-

   TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.~

   ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.

   AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.ATT.CTT.

   CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.~

   GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.~

   TTA.TGA.GTT. ATT.TTT.ATT.TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.CAA.AAT. -

   AAA.TTA.TTT.TTG.CTG.CAA.AAG.TCA.ACA.TGG.CAG.TTT.TAA.TTT. CGA.TTT.GAT.TTA.TAT.A.AC.CA. .3' ou une sous-unité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci.
3. 3. Gène suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le brin codeur comprend la séquence qui suit 5' GGC.CAT.ACC.CAT.GGA.GAA.AGG.ACA.TTC.TAA.CTG.CAA. CCT.TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.CAA.CAG.GTA.GTA.GGC.-

   GAC.ACT.GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.

   CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.TTC.TCC.ACT.ACA.GCT.-

   CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.-

   AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.-

   AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAT.TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.-

   TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.-

   CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.-

   CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.-

   ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.-

   AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.-

   GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.-

   CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.-

   ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.-

   GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.-

   TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.

   AGA.TCT.CCT.AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.GAC.TGc.ACA.ATT.GCT.-

   TCA.AGC.ATT.CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.-

   GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.GCA.TAT.GAA.AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.-

   TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.TTA.TGA.GTT.ATT.TTT.ATT.TAT,-

   TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.AAA.TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.

   AAG.TCA.ACA.TGG.CAG.TTT.TAA.TTT.CGA.TTT.GAT.TTA.TAT.

   AAC.CA..3' ou une sous-unité de celui-ci.
4. 4. Gène suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le brin codeur comprend la séquence suivante 5 TTC. TAA.CTG.CAA.CCT.TTC.GAA.GCC.TTT.GCT.CTG.GCA.-

   CAA.CAG.GTA.GTA.GGC.GAC.ACT.GTT.CGT.GTT.GTC.AAC.ATG.

   AOC.AAC.AAG.TCT.GTC.CTC.CAA.ATT.GCT.CTC.CTG.TTG.TGC.

   TTC.TCC.ACT.ACA.CCT.CTT.TCC.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.

   GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.

   CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.CTC.

   AAG.-GAC.AGG.ATG.AAG.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.-

   CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.-

   ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.-

   CAA.GAT.TCA.TCT.AGC .ACT.GGC .TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT. -

   GAC.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.CAT. CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.-

   TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.CTC.ATC.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.

   AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.AAG.

   GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.

   ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.

   TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.AGA.TCT.CCT.AGC.CTG.TGC.CTC.TGG.

   GAC.TGG.ACA.ATT.GCT.TCA.AGC.ATT.CTT.CAA.CCA.GCA.GAT.

   GCT.GTT.TAA.GTG.ACT.GAT.GGC.TAA.TGT.ACT.GCA.TAT.GAA.

   AGG.ACA.CTA.GAA.GAT.TTT.GAA.ATT.TTT.ATT.AAA.TTA.TGA.

   GTT.ATT.TTT.ATT.TAT.TTA.AAT.TTT.ATT.TTG.GAA.AAT.AAA.

   TTA.TTT.TTG.GTG.CAA.AAG.TC..3' OU un équivalent de celui-ci'.

   ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.

   CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT. AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.AAG.GAG.GAC.GCC.GCA.TTG.-

   AAC.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.

   CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.
5. 5. Gène suivant ltunè quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le brin codeur comprend la séauence qui suit 5' ATG.ACC.AAC.AAG.TGT.CTC.CTC.CAA.ATT.CCT.CTC.CTC.TTG. TGc TTC. TCC.ACT,ACA.GCT.CTT.TCG.ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.-

   CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.

   GTS.GAG.AAC.CTC.CTG.GCT.AAT.GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC.-

   AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.-

   GAA.ATC.CTA.AGG.AAC.TTT.TAC.TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.- GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA.. 3' ou un équivalent de celui-ci.

   AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC.TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.-

   AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.CTG.CAT.TAC.CTG.AAG.GCC.-

   GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.CTC.ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.-
6. 6. Gène suivant lune quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le brin codeur comprend la séquence qui suit 5' ATG.AGC.TAC.AAC.TTG.CTT.GGA.TTC.CTA.CAA.AGA.AGC.

   AGC.AAT.TTT.CAG.TGT.CAG.AAG.CTC.CTG.TGG.CAA.TTG.AAT.-

   GGG.AGG.CTT.GAA.TAC.TGC.CTC.AAG.GAC.AGG.ATG.AAC.TTT.-

   GAC.ATC.CCT.GAG.GAG.ATT.AAG.CAG.CTG.CAG.CAG.TTC.CAG.-

   AAG,GAG,GAC.GCC.GCA.TTG.ACC.ATC.TAT.GAG.ATG.CTC.CAG.

   AAC.ATC.TTT.GCT.ATT.TTC.AGA.CAA.GAT.TCA.TCT.AGC.ACT.-

   GGC.TGG.AAT.GAG.ACT.ATT.GTT.GAG.AAC.CTC.CTG,GCT.AAT.-

   GTC.TAT.CAT.CAG.ATA.AAC. CAT.CTG.AAG.ACA.GTC.CTG.GAA.-

   GAA.AAA.CTG.GAG.AAA.GAA.GAT.TTC.ACC.AGG.GGA.AAA.CTC.-

   ATG.AGC.AGT.CTG.CAC.CTG.AAA.AGA.TAT.TAT.GGG.AGG.ATT.-

   CTG.CAT.TAC,.CTG.AAG.GCC.AAG.GAG.TAC.AGT.CAC.TGT.GCC. TGG.ACC.ATA.GTC.AGA.GTG.GAA.ATC.CTA.AGG.ARC.TTT.TAC.-

   TTC.ATT.AAC.AGA.CTT.ACA.GGT.TAC.CTC.CGA.AAC.TGA. 3' ou un équivalent de celui-ci.
7. 7. Sous-unité dlun gène suivant l'une quelcon- que des revendications 1 à 6.
8. 8. Procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'on isole le polyA mARN de celleu- les de fibroblastes induites, on synthétise le cADN monocaténaire en utilisant l'oligo dT amorceur et la trans- criptase réverse et on en synthétise 1ZADN bicaténaire en utilisant la transcriptase réverse ou 1'ADN polymérase

   I d'E. coli et éventuellement un amorceur.
9. 9. Procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que l'on isole le mARN de cellules de fibroblastes induites, on synthétise le cADN en utilisant un amorceur spécifique et la transcriptase réverse et on en synthétise l'ADN bicaténaire en utilisant la transcriptase réverse ou 1'ADN polymérase I dtE. coli et éventuellement un amorceur.
10. 10. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on utilise un amorceur au cours de la troisième étape.
11. 11. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'on frac tionne le mélange réactionnel après la seconde étape et/ou la troisième étape e
12. 12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'on inhibe l'autoamorçage après la seconde étape.
13. 13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que l'on identifie le produit, après clonage, en utilisant un amorceur pour trier les colonies.
14. 14. Gène ou un équivalent de celui-ci ou une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 4 à 7, lorsqu'il est obtenu par mise en oeuvre d'un procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 à 13.
15. 15. Procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise, à titre de sonde, une molécule possédant une séquence d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 14, de façon à isoler un gène d'interféron chromosomial à partir de 1'ADN chromosomial humain.
16. 16. Gène ou un équivalent de celui-ci ou une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, lorsqu'il est obtenu par mises en oeuvre d'un procédé suivant la revend-cation 15.
17. 17. Procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci, qui possède une portion commune à ou apparentée à une portion d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on utilise, à titre de sonde, une molécule possédant une séquence correspondant à au moins une partie de la portion commune ou apparentée de façon à isoler un gène chromosomial humain à partir de 1'ADN chromosomial humain.
18. 18. Gène ou un équivalent de celui-ci ou une sous-unité de celui-ci qui possède une portion commune à ou apparentée à une portion d'un gène ou d'un équivalent de celui-ci ou d'une sous-unité de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3, lorsqu'il est produit par un procédé suivant la revendication 17.
19. 19. Recombinant de plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend un vecteur de plasmide auquel est inséré, à un site d'insertion, un gène ou une sousunité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, le recombinant de plasmide permettant la traduction dans la phase correcte pour le mARN correspondant au gène ou à la sous-unité de célui-ci ou à l'équivalent de celuici, inséré et possédant un promoteur bactérien en amont du et adjacent au site dtinsertion, de telle manière que le gène inséré ou la sous-unité de celui-ci ou l'équi- valent de celui-ci soit sous le contrôle d'un promoteur bactérien.
20. 20. Recombinant de plasmide suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend, à l'état inséré, une multiplicité de gènes ou de sous-unités de celui-ci ou d'équivalents de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16.
21. 21. Recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 et 20, caractérisé en ce qu'il comprend une multiplicité de promoteurs bact6- riens.
22. 22. Recombinant de plasmide suivant 1tune quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qutil comprend au moins un promoteur de trp.
23. 23. Recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 22, qui est dépourvu d'au moins une partie de la séquence d'ADN responsable de l'atténuation de la transcription.
24. 24. Recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend un dérivé modifié de pWT 501
25. 25. Recombinant de plasmide suivant l'une

    quelconque des revendications 19 à 24, caractérisé en

    ce qu'il comprend un vecteur de plasmide possédant,

    à 1'état inséré, un gène ou une sous-unité de celui-ci

    ou d'un équivalent de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, qui code également pour un codon d'initiation et/ou au moins une partie d'un

    site de liaison de ribosome
26. 26.Procédé de production d'un recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que l'on insère un gène ou une sous-unité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, dans un site d'insertion d'un vecteur de plasmide approprié.
27. 27. Procédé suivant la revendication 26 caractérisé en ce qutil comprend : l'isolement d'un fragment d'Hind III d'environ 150 bp contenant du promoteur de trp à partir de pT;1T 501, l'autosoudure ou autoliaison, la digestion partielle par le Taq I, le traitement par la S1 nucléase, le traitement par 1'ADN polymérase I d'E. coli, la restriction par l'Hind III, l'isolement d'un fragment d'environ 100 bp contenant du promoteur de trp, 7a soudure ou liaison à un fragment d'environ 700 bp obtenu en traitant un plasmide de re- combinant de pWT 321 contenant un gène ou une sous-unité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, par du Sac- I, la S1 nucléase, l'ADN polymérase I d'E. coli et l'Hind III, la restriction par l'Hind III et la soudure ou liaison au pAT 153 traité par la phosphatase alcaline bactérienne, restreint à l'Hind III.
28. 28. Recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 25, obtenu par mise en oeuvre du procédé suivant l'une quelconque des revendications 26 et 27.
29. 29.Cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend, à l'état inséré, un gène ou une sous-unité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci suivant ltune quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, ou un recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 25 et 28.
30. 30. Cellule suivant la revendication 29, caractérisée en ce qu'elle est une cellule K-ï2 HB101 d'E. coli.
31. 31 Procédé de production d'une cellule suivant l'une quelconque des revendications 29 et 30, caractérisé en ce que l'on insère un gène ou une sousunité de celui-ci ou un équivalent de celui-ci, suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7, 14 et 16, ou un recombinant de plasmide suivant l'une quelconque des revendications 19 à 25 et 28 dans une cellule.
32. 32. Cellule suivant l'une quelconque des revendications 29 et 30, produite par mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 51
33. 33. Procédé de production dune protéine possédant des propriétés ressemblant à celles de l'inter- féron humain, caractérisé en ce que l'on cultive une cellule suivant l'une quelconque des revendications 29 et 30 ou 32 et on récupère la protéine exprimée.
34. 34. Protéine possédant des propriétés qui ressemblent à celles de itinterféron humain, lorsqu'elle est produite par mise en oeuvre du procédé suivant la revendication 33.