JP2501549B2 - インタ−フエロンの製造法 - Google Patents
インタ−フエロンの製造法Info
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- JP2501549B2 JP2501549B2 JP57124313A JP12431382A JP2501549B2 JP 2501549 B2 JP2501549 B2 JP 2501549B2 JP 57124313 A JP57124313 A JP 57124313A JP 12431382 A JP12431382 A JP 12431382A JP 2501549 B2 JP2501549 B2 JP 2501549B2
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- Japan
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- interferon
- human
- phage
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はインターフエロン（IFN）の製造法に関す
る。さらに詳細には、本発明はヒト遺伝子DNAの断片を
導入した適当な細菌によつて線維芽細胞（β）型または
白血球（α）型のヒトインターフエロンの大量生産方法
に関する。血球から直接取つたヒトDNAは適当なλ−フ
アージにクローン化される。この組換え体λ−フアージ
によつて感染された細菌中に高インターフエロン生産が
得られ、そのインターフエロンはこの感染によつて生じ
る細菌溶菌液から採取および精製することができる。遺
伝子DNAはまたプラスミド発現ベクターを介して導入さ
れた細菌中で発現される。
る。さらに詳細には、本発明はヒト遺伝子DNAの断片を
導入した適当な細菌によつて線維芽細胞（β）型または
白血球（α）型のヒトインターフエロンの大量生産方法
に関する。血球から直接取つたヒトDNAは適当なλ−フ
アージにクローン化される。この組換え体λ−フアージ
によつて感染された細菌中に高インターフエロン生産が
得られ、そのインターフエロンはこの感染によつて生じ
る細菌溶菌液から採取および精製することができる。遺
伝子DNAはまたプラスミド発現ベクターを介して導入さ
れた細菌中で発現される。
発明の背景 インターフエロン、とくにヒトインターフエロンは多
分野で重要性を増しつつあるが、その生産は困難で、生
産方法の改良が非常に重要になつている。
分野で重要性を増しつつあるが、その生産は困難で、生
産方法の改良が非常に重要になつている。
大腸菌（E．coli）のような細菌における哺乳動物遺
伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配列を中断する介在配
列の存在により妨げられる。しかしながら、イントロン
を持たない遺伝子もかなり存在する。最近、ナガタら
（Nagata et al）（1980）〔Nature 287,401-8〕はヒ
トの白血球インターフエロン−α遺伝子がイントロンを
欠くものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内で
のこれら遺伝子の低レベル発現を見出した。
伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配列を中断する介在配
列の存在により妨げられる。しかしながら、イントロン
を持たない遺伝子もかなり存在する。最近、ナガタら
（Nagata et al）（1980）〔Nature 287,401-8〕はヒ
トの白血球インターフエロン−α遺伝子がイントロンを
欠くものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内で
のこれら遺伝子の低レベル発現を見出した。
二重鎖RNAによつて誘導されたヒト二倍体線維芽細胞
は少なくともインターフエロンをコードする２つのmRNA
を含んでいる〔ワイゼンバツハら（Weissenbach et a
l．）、1980、（PNAS）77,7152-7156〕。0.9キロベース
（Kb）長（11S）のmRNAはこれら細胞により生産される
主インターフエロン種IFN−β１に相当するが、そのア
ミノ酸配列は部分的に決定されている〔ナイトら（Knig
ht et al.,）1980,Science 207,325-6〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドpBR322を用い、このIFN−β１ mR
NAのcDNAを介するクローニングが達成された〔ゲツデル
ら（Goeddel et al．）,1980,Nucleic Acid Res.,8,40
57-4075〕。これらDNAクローンのヌクレオチド配列は決
定された蛋白質配列に相当し、発現プラスミド生成後、
IFN−β１ cDNAは大腸菌内でのヒトインターフエロンの
合成を指令していると証明された。
は少なくともインターフエロンをコードする２つのmRNA
を含んでいる〔ワイゼンバツハら（Weissenbach et a
l．）、1980、（PNAS）77,7152-7156〕。0.9キロベース
（Kb）長（11S）のmRNAはこれら細胞により生産される
主インターフエロン種IFN−β１に相当するが、そのア
ミノ酸配列は部分的に決定されている〔ナイトら（Knig
ht et al.,）1980,Science 207,325-6〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドpBR322を用い、このIFN−β１ mR
NAのcDNAを介するクローニングが達成された〔ゲツデル
ら（Goeddel et al．）,1980,Nucleic Acid Res.,8,40
57-4075〕。これらDNAクローンのヌクレオチド配列は決
定された蛋白質配列に相当し、発現プラスミド生成後、
IFN−β１ cDNAは大腸菌内でのヒトインターフエロンの
合成を指令していると証明された。
本発明者らは、IFN−β１遺伝子〔モーリイら（Mory
et al．）,1981,Eur.J.Biochem.,120,197-202〕ならび
にIFN−αＣ遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単離した。
これらの遺伝子はイントロンを欠き、従つて大腸菌内で
直接発現させることができる。
et al．）,1981,Eur.J.Biochem.,120,197-202〕ならび
にIFN−αＣ遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単離した。
これらの遺伝子はイントロンを欠き、従つて大腸菌内で
直接発現させることができる。
発明の要約 本発明は、ヒト血球から抽出したヒト遺伝子DNAの特
定断片をバクテリオフアージベクターにクローン化しそ
れを直接利用して細菌内でIFNを合成させるようにし、
その細菌を培養してインターフエロンを生産する方法に
関する。従つて、この方法では長い工程は必要なく、mR
NAから全長の相補的DNA（cDNA）をクローニングする必
要がない。本発明に従えば、適当なDNA断片を容易に入
手し得る白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−フ
アージベクターにクローン化する。目的のIFN遺伝子は
イントロンで中断されておらず、細菌内でIFN合成を指
示できる。
定断片をバクテリオフアージベクターにクローン化しそ
れを直接利用して細菌内でIFNを合成させるようにし、
その細菌を培養してインターフエロンを生産する方法に
関する。従つて、この方法では長い工程は必要なく、mR
NAから全長の相補的DNA（cDNA）をクローニングする必
要がない。本発明に従えば、適当なDNA断片を容易に入
手し得る白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−フ
アージベクターにクローン化する。目的のIFN遺伝子は
イントロンで中断されておらず、細菌内でIFN合成を指
示できる。
IFN−β１遺伝子またはIFN−αＣ遺伝子を挿入したヒ
トDNAを含む組換え体λフアージによつて大腸菌のよう
な適当な細菌を感染させることにより高IFN活性を生産
した。IFNを感染によつて生じる細菌溶解液から採取、
精製した。フアージは細菌にヒトDNA断片を導入するた
めの適当なベクターであることを見出した。とくにλ C
haron 4 Aフアージは優れており、高IFN生産をもたらし
た。さらに本発明は強いプロモーターを備えたプラスミ
ド発現ベクターへのクローン化したヒト遺伝子DNA断片
の導入に関する。この方法はイントロンを欠くものであ
ればIFN−β１同様IFN−αでも実施できる。
トDNAを含む組換え体λフアージによつて大腸菌のよう
な適当な細菌を感染させることにより高IFN活性を生産
した。IFNを感染によつて生じる細菌溶解液から採取、
精製した。フアージは細菌にヒトDNA断片を導入するた
めの適当なベクターであることを見出した。とくにλ C
haron 4 Aフアージは優れており、高IFN生産をもたらし
た。さらに本発明は強いプロモーターを備えたプラスミ
ド発現ベクターへのクローン化したヒト遺伝子DNA断片
の導入に関する。この方法はイントロンを欠くものであ
ればIFN−β１同様IFN−αでも実施できる。
一実施態様において、ヒト成人からのDNAをEcoRI消化
で断片化しλ Charon 4 Aにクローン化した。そのよう
にして得られたクローンをClone C 15と名付けた。その
クローンには約17KbのヒトDNAが挿入されており、ま
た、それは線維芽細胞インターフエロンIFN−β１に対
応する遺伝子を含んでいると同定した。制限地図作成は
1.8KbのEcoRI断片上に位置するこの遺伝子がイントロン
によつて中断されていないことを示した。このヒト遺伝
子DNA断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトIFN−β１の合成を指令することができる。フアー
ジ溶菌液から高IFN活性が回収される。一定条件下で、1
07単位/l程度の活性をフアージ溶菌液から回収した。溶
菌液をクロマトグラフイー、好ましくはシバクロン・ブ
ルー・セフアロース（Cibacron Blue Sepharose）ある
いは同様のカラムにかける。かくして得られたインター
フエロンはヒト線維芽細胞が生産するIFNと同じ免疫学
的性質および種特異性を有している。13Kbのヒト遺伝子
断片を含むクローン18-3中に同定された遺伝子、IFN−
αＣで同様の結果を得た。
で断片化しλ Charon 4 Aにクローン化した。そのよう
にして得られたクローンをClone C 15と名付けた。その
クローンには約17KbのヒトDNAが挿入されており、ま
た、それは線維芽細胞インターフエロンIFN−β１に対
応する遺伝子を含んでいると同定した。制限地図作成は
1.8KbのEcoRI断片上に位置するこの遺伝子がイントロン
によつて中断されていないことを示した。このヒト遺伝
子DNA断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトIFN−β１の合成を指令することができる。フアー
ジ溶菌液から高IFN活性が回収される。一定条件下で、1
07単位/l程度の活性をフアージ溶菌液から回収した。溶
菌液をクロマトグラフイー、好ましくはシバクロン・ブ
ルー・セフアロース（Cibacron Blue Sepharose）ある
いは同様のカラムにかける。かくして得られたインター
フエロンはヒト線維芽細胞が生産するIFNと同じ免疫学
的性質および種特異性を有している。13Kbのヒト遺伝子
断片を含むクローン18-3中に同定された遺伝子、IFN−
αＣで同様の結果を得た。
他の実施態様では、IFN−β１あるいはIFN−αＣ遺伝
子を含むヒト遺伝子DNA断片を大腸菌のrec Aプロモータ
ーを含むプラスミドpBR322のようなプラスミドに導入し
た。これらの組換え体プラスミドによつて形質転換され
た大腸菌の培養で、ナリジクス酸（nalidixic acid）に
よりrec Aプロモーターを誘導したとき、著量のIFN−β
あるいはIFN−αが生産された。IFN−β１遺伝子断片を
成熟IFN−β１の最初のメチニオンに対応するコドンの
隣りで切り大腸菌lacプロモーターのリボゾーム結合部
位に連結した。このlacプロモーターをトリプトフアン
プロモーターのRNAポリメラーゼ結合部位を含むように
改良した。この混成tryp-lacプロモーターにより、遺伝
子IFN−β１DNAは大腸菌ミニセル株p679-54内で108単位
/lのIFN−β１を生産することができた。同様にIFN−α
Ｃ遺伝子をtryp-lacプロモーターに適切に継ぐことによ
り充分量のIFN−αＣを得た。いずれの場合も、IFN活性
はリゾチームと30％プロピレングリコールで溶菌した細
菌細胞から回収し、フアージ溶菌液のときと同様疎水性
クロマトグラフ担体上で精製した。IFN−β１の好適な
担体はシバクロン・ブルー・セフアロース（Cibacron B
lue Sepharose）である。溶出はエチレングリコールや
好ましくはプロピレングリコールで行なうことができ
る。IFN−β１あるいはαＣの精製は、さらにモノクロ
ナール抗体カラム上の免疫親和性クロマトグラフイある
いは他の常法によつて行なわれる。
子を含むヒト遺伝子DNA断片を大腸菌のrec Aプロモータ
ーを含むプラスミドpBR322のようなプラスミドに導入し
た。これらの組換え体プラスミドによつて形質転換され
た大腸菌の培養で、ナリジクス酸（nalidixic acid）に
よりrec Aプロモーターを誘導したとき、著量のIFN−β
あるいはIFN−αが生産された。IFN−β１遺伝子断片を
成熟IFN−β１の最初のメチニオンに対応するコドンの
隣りで切り大腸菌lacプロモーターのリボゾーム結合部
位に連結した。このlacプロモーターをトリプトフアン
プロモーターのRNAポリメラーゼ結合部位を含むように
改良した。この混成tryp-lacプロモーターにより、遺伝
子IFN−β１DNAは大腸菌ミニセル株p679-54内で108単位
/lのIFN−β１を生産することができた。同様にIFN−α
Ｃ遺伝子をtryp-lacプロモーターに適切に継ぐことによ
り充分量のIFN−αＣを得た。いずれの場合も、IFN活性
はリゾチームと30％プロピレングリコールで溶菌した細
菌細胞から回収し、フアージ溶菌液のときと同様疎水性
クロマトグラフ担体上で精製した。IFN−β１の好適な
担体はシバクロン・ブルー・セフアロース（Cibacron B
lue Sepharose）である。溶出はエチレングリコールや
好ましくはプロピレングリコールで行なうことができ
る。IFN−β１あるいはαＣの精製は、さらにモノクロ
ナール抗体カラム上の免疫親和性クロマトグラフイある
いは他の常法によつて行なわれる。
上記から、ヒト遺伝子DNA断片が大腸菌および他の適
当な宿主細菌中でヒトIFNを高収率で生産するために使
えることは明らかである。
当な宿主細菌中でヒトIFNを高収率で生産するために使
えることは明らかである。
上述のごとく、本発明の方法は、ヒト遺伝子DNAの断
片をフアージのような適当なベクターに導入し、細菌培
養物を該フアージで感染させることにより溶菌させ、溶
菌物中の生成インターフエロンを採取することからな
る。本発明はヒト遺伝子DNAの導入によつて得られる新
規フアージ、とくにIFN−β２の生成に関与するclone C
15,IFN−αＣの生成に関与するクローン18.3のような
λ−型の組換え体フアージに関する。さらに本発明はヒ
ト遺伝子DNAを適当なフアージに導入し、該フアージか
ら適当なDNA断片を採取し、これを適当な細菌の発現プ
ラスミドに導入し、該細菌を培養して目的とするインタ
ーフエロンを採取することからなるインターフエロンの
製造法に関する。本発明の他の目的は下記詳細な記載か
ら明らかになるが、該記載は本発明を制限するものでは
ない。
片をフアージのような適当なベクターに導入し、細菌培
養物を該フアージで感染させることにより溶菌させ、溶
菌物中の生成インターフエロンを採取することからな
る。本発明はヒト遺伝子DNAの導入によつて得られる新
規フアージ、とくにIFN−β２の生成に関与するclone C
15,IFN−αＣの生成に関与するクローン18.3のような
λ−型の組換え体フアージに関する。さらに本発明はヒ
ト遺伝子DNAを適当なフアージに導入し、該フアージか
ら適当なDNA断片を採取し、これを適当な細菌の発現プ
ラスミドに導入し、該細菌を培養して目的とするインタ
ーフエロンを採取することからなるインターフエロンの
製造法に関する。本発明の他の目的は下記詳細な記載か
ら明らかになるが、該記載は本発明を制限するものでは
ない。
本発明の重要な利点は健康人あるいは病人から得た遺
伝子のIFN生産性を比較して、IFN生産における遺伝的欠
陥を研究することができることにある。
伝子のIFN生産性を比較して、IFN生産における遺伝的欠
陥を研究することができることにある。
材料および方法 ヒト遺伝子ライブラリー（human gene library）の調
製： 高分子量DNAをβ−地中海貧血（β−thalassemia）の
成人の末梢血球から調製した。DNAの一部（40μｇ）をE
coRIの100,200,300単位で30分間別個に消化し、65℃で1
0分間加熱し、前述したように一緒に10〜40％蔗糖勾配
にかけた。10〜20Kbの間のDNA断片を、マニアテイスら
（Maniatis et al．）〔1978,セル（Cell）15,687-70
1〕の方法に従つてEcoRI消化により調製したλ Charon
4 A DNAアームに、モリイら（Mory et al．）〔1980,M
ol.Biol.Reports 6,203-208〕の記述に従つてT4DNAリガ
ーゼで連結した。
製： 高分子量DNAをβ−地中海貧血（β−thalassemia）の
成人の末梢血球から調製した。DNAの一部（40μｇ）をE
coRIの100,200,300単位で30分間別個に消化し、65℃で1
0分間加熱し、前述したように一緒に10〜40％蔗糖勾配
にかけた。10〜20Kbの間のDNA断片を、マニアテイスら
（Maniatis et al．）〔1978,セル（Cell）15,687-70
1〕の方法に従つてEcoRI消化により調製したλ Charon
4 A DNAアームに、モリイら（Mory et al．）〔1980,M
ol.Biol.Reports 6,203-208〕の記述に従つてT4DNAリガ
ーゼで連結した。
試験管内パツケージング（packaging）は、ホーンお
よびマレイ（Hohn and Murray）〔1977,PNAS,.74,3259-
3263〕の記述に従い、連結反応液（0.5μｇのベクターD
NAおよび0.125μｇのヒトDNA）８μｌ数部を大腸菌BHB
2688〔N 205 recA-（λ imm 434 cIts b 2 red 3 Eam 4
Sam 7）／λ〕とBHB 2690〔N205 recA-（λ imm 434 c
Its b 2 red 3 Dam 15 Sam 7）／λ〕の抽出物50μｌと
混合することにより行なつた。
よびマレイ（Hohn and Murray）〔1977,PNAS,.74,3259-
3263〕の記述に従い、連結反応液（0.5μｇのベクターD
NAおよび0.125μｇのヒトDNA）８μｌ数部を大腸菌BHB
2688〔N 205 recA-（λ imm 434 cIts b 2 red 3 Eam 4
Sam 7）／λ〕とBHB 2690〔N205 recA-（λ imm 434 c
Its b 2 red 3 Dam 15 Sam 7）／λ〕の抽出物50μｌと
混合することにより行なつた。
組換え体DNA 1μｇ当り３×105pfuが得られた。一方
手をつけていないλ DNAでは108pfu／μｇであつた。総
量で1.8×106の組換え体フアージを10mM Tris-HCl（pH
7.5）,10mM MgSO4および0.01％ゼラチンを含む液6mlで
希釈した。0.1mlのクロロホルムを加え、破砕物をミク
ロフユージ（microfuge）遠心にて除き、フアージを大
腸菌DP50〔レーダーら（Leder et al．）1977,Science
196,175-177）に４×103pfu/15cmプレートの割で植え
て105倍に増やした。選別のために２×104pfuを15cmの
プレートに植え、二枚のニトロセルロースフイルター
に、ベントンら（Benton et al．）〔1977,Science 19
6,180-182）〕の記述に従つて、つづけて写した。この
操作はP3の封じ込め条件のもとに行なつた。
手をつけていないλ DNAでは108pfu／μｇであつた。総
量で1.8×106の組換え体フアージを10mM Tris-HCl（pH
7.5）,10mM MgSO4および0.01％ゼラチンを含む液6mlで
希釈した。0.1mlのクロロホルムを加え、破砕物をミク
ロフユージ（microfuge）遠心にて除き、フアージを大
腸菌DP50〔レーダーら（Leder et al．）1977,Science
196,175-177）に４×103pfu/15cmプレートの割で植え
て105倍に増やした。選別のために２×104pfuを15cmの
プレートに植え、二枚のニトロセルロースフイルター
に、ベントンら（Benton et al．）〔1977,Science 19
6,180-182）〕の記述に従つて、つづけて写した。この
操作はP3の封じ込め条件のもとに行なつた。
IFN−β１ cDNAプローブの調製： 100μg/mlポリ（rI）：（rC）と50μg/mlシクロヘキ
シイミド（最後の１時間は２μg/mlアクチノマイシンＤ
を含む）によつて４時間誘導したヒト包皮線維芽細胞F
S 11からポリA+を調製し、ワイゼンバツハら（Weissenb
ach et al．）〔1980,PNAS 77,7152-7156:1979,（Eur.
J.Biochem.）98,1−８〕によつて詳述された蔗糖勾配遠
心分離によつてインターフエロンmRNAの２つのピークを
分画した。11 SのmRNA（1.5μｇ）を使いトリ背髄芽球
症ウイルス（Avian myeloblastosis virus）（J.Bear
d）由来逆転写酵素およびオリゴ（dT）とともに先のワ
イゼンバツハら（Weissenbach et al．）〔1980,PNAS
77,7152-7156〕の方法に従つてRNA-cDNAハイブリツドを
調製した。このRNA-cDNAハイブリツドをハイブリツドの
鎖延長のためのdCTPおよびdG−鎖延長しPstI切断したpB
R322ベクター〔チヤンら（Chang et al．）,1978,Natu
re 275,617-624〕を用い、ザインら（Zain et al．）
〔1979,Cell 16,851-861〕に従つて直接クローン化し
た。ステンランドら（Stenlund et al．）〔1980,Gene
10,47-52〕によつて概説されたようにして総数12,500
のtetrampsの大腸菌M M 294形質転換株を得た。誘導し
たF S 11細胞の11 SmRNA（６μｇ）または非誘導細胞の
総ポリA+‐RNA（3.7μｇ）から転写した32p-cDNAプロー
ブでコロニーハイブリッド化（colony hybridization）
を行なつた。cDNA合成は、合成相補プライマー〔ナラン
グら（Narang et al．）,1979,Methods Enzymol.68,90
-98参照〕であり、IFN−β１配列のBgl II部位を含む
５′ GAGATCTTCAGTTTC 3′で開始した。32P‐５′末端
ラベル〔ヒユートンら（Houghton et al．）,1980,Nuc
l.Ac.Res 8,1913-1931〕したプライマーを用いて、予期
した640ヌクレオチド長のcDNAがみられるのは誘導したR
NAを鋳型として用いたときだけであつた。プローブを調
製するために、20 p molesのプライマーを４μｌの0.4M
KCl中で30℃60分間各RNAとアニール（anneal）し、各20
0μCiの32p−α−dATPとdCTP（両方で400Ci/m mol）、
各0.5mMのdGTPとdTTP、50mM Tris-HCl（pH8.3）、4mM M
gCl2、5mMジチオスレイトール、50μg/mlアクチノマイ
シンＤ、4mMピロ燐酸および30単位の逆転写酵素の混液2
5μｌ中37℃で２時間インキュベートした。25μｇの大
腸菌DNAを加えた後、0.3N NaOHで70℃60分間処理して反
応を中和し、50mM Tris-HCl（pH8）、0.1M NaCl、10mM
EDTA、0.5％ドデシル硫酸中セフアデツクスG-50（Sepha
dex G-50）を通して過した。各RNAから５×106cpm cD
NAを得た。ニトロセルローズフイルター上に生育したコ
ロニーを固定し、DNAをサイヤー（Thayer）〔1979,Ana
l.Biochem.98,60-63〕の記述に従つて変性させた。各フ
イルターを６×SET〔SET＝150mM NaCl、2mM EDTA、30mM
Tris-HCl（pH8）〕、10×デンハルツ溶液（Denhardt′
s solution）〔デンハルト（Denhardt）1966,Biochem.B
iophys.Res.Comm.23,641-646）〕,0.1％ピロリン酸ソー
ダ、0.1％ドデシル硫酸、50μg/ml変性大腸菌DNAの混液
10mlを使い67℃で４時間プレハイブリツド化した。フイ
ルターを各0.5×106cpm／フイルターの二つの32P-cDNA
プローブ、10μg/mlのポリＡおよび2.5μg/mlのポリＣ
を有する同じ溶液中で67℃、14-18時間ハイブリツド化
した。プレハイブリツド化溶液中で67℃、１時間、次に
３×SET、0.1％ピロリン酸、0.1％ドデシル硫酸で67
℃、30分間３回以上、ついで４×SETで25℃、60分間フ
イルターを洗浄した〔マニアテイス（Maniatis）1978、
セルCell 15,687-701参照〕。フイルターを乾燥させ、
増感紙をもつたAgfa Curix X-rayフイルムに−70℃で１
−２日間感光させた。
シイミド（最後の１時間は２μg/mlアクチノマイシンＤ
を含む）によつて４時間誘導したヒト包皮線維芽細胞F
S 11からポリA+を調製し、ワイゼンバツハら（Weissenb
ach et al．）〔1980,PNAS 77,7152-7156:1979,（Eur.
J.Biochem.）98,1−８〕によつて詳述された蔗糖勾配遠
心分離によつてインターフエロンmRNAの２つのピークを
分画した。11 SのmRNA（1.5μｇ）を使いトリ背髄芽球
症ウイルス（Avian myeloblastosis virus）（J.Bear
d）由来逆転写酵素およびオリゴ（dT）とともに先のワ
イゼンバツハら（Weissenbach et al．）〔1980,PNAS
77,7152-7156〕の方法に従つてRNA-cDNAハイブリツドを
調製した。このRNA-cDNAハイブリツドをハイブリツドの
鎖延長のためのdCTPおよびdG−鎖延長しPstI切断したpB
R322ベクター〔チヤンら（Chang et al．）,1978,Natu
re 275,617-624〕を用い、ザインら（Zain et al．）
〔1979,Cell 16,851-861〕に従つて直接クローン化し
た。ステンランドら（Stenlund et al．）〔1980,Gene
10,47-52〕によつて概説されたようにして総数12,500
のtetrampsの大腸菌M M 294形質転換株を得た。誘導し
たF S 11細胞の11 SmRNA（６μｇ）または非誘導細胞の
総ポリA+‐RNA（3.7μｇ）から転写した32p-cDNAプロー
ブでコロニーハイブリッド化（colony hybridization）
を行なつた。cDNA合成は、合成相補プライマー〔ナラン
グら（Narang et al．）,1979,Methods Enzymol.68,90
-98参照〕であり、IFN−β１配列のBgl II部位を含む
５′ GAGATCTTCAGTTTC 3′で開始した。32P‐５′末端
ラベル〔ヒユートンら（Houghton et al．）,1980,Nuc
l.Ac.Res 8,1913-1931〕したプライマーを用いて、予期
した640ヌクレオチド長のcDNAがみられるのは誘導したR
NAを鋳型として用いたときだけであつた。プローブを調
製するために、20 p molesのプライマーを４μｌの0.4M
KCl中で30℃60分間各RNAとアニール（anneal）し、各20
0μCiの32p−α−dATPとdCTP（両方で400Ci/m mol）、
各0.5mMのdGTPとdTTP、50mM Tris-HCl（pH8.3）、4mM M
gCl2、5mMジチオスレイトール、50μg/mlアクチノマイ
シンＤ、4mMピロ燐酸および30単位の逆転写酵素の混液2
5μｌ中37℃で２時間インキュベートした。25μｇの大
腸菌DNAを加えた後、0.3N NaOHで70℃60分間処理して反
応を中和し、50mM Tris-HCl（pH8）、0.1M NaCl、10mM
EDTA、0.5％ドデシル硫酸中セフアデツクスG-50（Sepha
dex G-50）を通して過した。各RNAから５×106cpm cD
NAを得た。ニトロセルローズフイルター上に生育したコ
ロニーを固定し、DNAをサイヤー（Thayer）〔1979,Ana
l.Biochem.98,60-63〕の記述に従つて変性させた。各フ
イルターを６×SET〔SET＝150mM NaCl、2mM EDTA、30mM
Tris-HCl（pH8）〕、10×デンハルツ溶液（Denhardt′
s solution）〔デンハルト（Denhardt）1966,Biochem.B
iophys.Res.Comm.23,641-646）〕,0.1％ピロリン酸ソー
ダ、0.1％ドデシル硫酸、50μg/ml変性大腸菌DNAの混液
10mlを使い67℃で４時間プレハイブリツド化した。フイ
ルターを各0.5×106cpm／フイルターの二つの32P-cDNA
プローブ、10μg/mlのポリＡおよび2.5μg/mlのポリＣ
を有する同じ溶液中で67℃、14-18時間ハイブリツド化
した。プレハイブリツド化溶液中で67℃、１時間、次に
３×SET、0.1％ピロリン酸、0.1％ドデシル硫酸で67
℃、30分間３回以上、ついで４×SETで25℃、60分間フ
イルターを洗浄した〔マニアテイス（Maniatis）1978、
セルCell 15,687-701参照〕。フイルターを乾燥させ、
増感紙をもつたAgfa Curix X-rayフイルムに−70℃で１
−２日間感光させた。
選別にかけた3,500コロニーのうち、14個が誘導したm
RNAから鋳型化したcDNAに優先的にハイブリツド化し、1
30個が非誘導mRNAの鋳型化したcDNAにもハイブリツド化
した。最初の群からのプラスミドのDNA（0.3μｇ）を、
６×SSC、10×デンハルツ溶液中５′−末端32Pラベルし
たプライマー（0.3 p moles,4×106cpm）でフイルター
〔カフアトスら（Kafatos et al．）1979,Nucl.Ac.Re
s.7,1541-1552〕上に35℃で21時間ハイブリツド化し、
ついで35℃で６×SSC（900mM NaCl,90mMクエン酸ソー
ダ）で洗浄した。クローンＩ−６−５は強度の陽性でDN
A配列決定〔マキサムら（Maxam et al．）1980,Method
s Enzymol,65,499-560〕によりそのクローンがIFN−β
１配列の３′−末端から約370ヌクレオチドを含んでい
ることがわかつた。蔗糖勾配精製した誘導mRNA由来dC鎖
延長二重鎖DNA（dC-tailed dS-DNA）をpBR322のPst I部
位に導入することによつて前記のように調製した他の5
0,000のクローンを選別した:IFN−β１クローンの割合
は0.16％（80クローン）であるのに比べてIFN−β２ク
ローンの割合は0.65％であることがわかつた。
RNAから鋳型化したcDNAに優先的にハイブリツド化し、1
30個が非誘導mRNAの鋳型化したcDNAにもハイブリツド化
した。最初の群からのプラスミドのDNA（0.3μｇ）を、
６×SSC、10×デンハルツ溶液中５′−末端32Pラベルし
たプライマー（0.3 p moles,4×106cpm）でフイルター
〔カフアトスら（Kafatos et al．）1979,Nucl.Ac.Re
s.7,1541-1552〕上に35℃で21時間ハイブリツド化し、
ついで35℃で６×SSC（900mM NaCl,90mMクエン酸ソー
ダ）で洗浄した。クローンＩ−６−５は強度の陽性でDN
A配列決定〔マキサムら（Maxam et al．）1980,Method
s Enzymol,65,499-560〕によりそのクローンがIFN−β
１配列の３′−末端から約370ヌクレオチドを含んでい
ることがわかつた。蔗糖勾配精製した誘導mRNA由来dC鎖
延長二重鎖DNA（dC-tailed dS-DNA）をpBR322のPst I部
位に導入することによつて前記のように調製した他の5
0,000のクローンを選別した:IFN−β１クローンの割合
は0.16％（80クローン）であるのに比べてIFN−β２ク
ローンの割合は0.65％であることがわかつた。
上記したFS-11 mRNAから調製されたクローンIFN−β
１ I−６−５はヒトライブラリーを選別するのに使われ
た。
１ I−６−５はヒトライブラリーを選別するのに使われ
た。
遺伝子クローン:IFN−β１クローン15の単離 リグビイら（Rigby et al．）〔1977,J.Mol.Biol.,1
13,237-251〕に従い、IFN−β１ cDNAからのプラスミド
DNAをニツクトランスレーシヨンによつて２×108cpm／
μg DNAに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに106cpm／
フイルターでハイブリツド化した。フイルターの調製、
DNA変性およびハイブリツド化操作は上記のごとく行な
つた。ハイブリツド化陽性のプラークからのフアージを
9cmプレートに１−２×102pfuの濃度で再び植え、再選
別を行なつた。この操作を３回繰返してプレート上のプ
ラークの95％以上をIFN−β１ cDNAにハイブリツド化し
た。フアージクローンC15をそのプラークの一つから単
離した。
13,237-251〕に従い、IFN−β１ cDNAからのプラスミド
DNAをニツクトランスレーシヨンによつて２×108cpm／
μg DNAに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに106cpm／
フイルターでハイブリツド化した。フイルターの調製、
DNA変性およびハイブリツド化操作は上記のごとく行な
つた。ハイブリツド化陽性のプラークからのフアージを
9cmプレートに１−２×102pfuの濃度で再び植え、再選
別を行なつた。この操作を３回繰返してプレート上のプ
ラークの95％以上をIFN−β１ cDNAにハイブリツド化し
た。フアージクローンC15をそのプラークの一つから単
離した。
フアージをブラトナーら（Blattner et al．）〔197
7,Science 196,161-169〕の記述に従い液体培地に増殖
させた。大腸菌DP50を１％トリプトン、0.5％ NaCl、0.
5％酵母エキス、0.2％マルトース、0.25％ MgSO4、0.0
1％ジアミノピメリン酸、0.004％チミジンで一夜増殖さ
せた。約0.3mlの培養物を前吸着のために10mM MgSO4、1
0mM CaCl2および107フアージの混液0.3mlと37℃で20分
間混合した。その培養物を2lフラスコ中１％ NZアミ
ン、0.5％酵母エキス、0.5％ NaCl、0.1％カザミノ酸、
0.25％ MgSO4、0.01％ジアミノピメリン酸および0.004
％チミジンを含み予備加熱した培地500mlで希釈し、よ
く通気しながら、37℃で15-18時間インキユベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールGSAローター
（Sorvall GSA rotor）中、冷却下7,000rpmで15分間遠
心分離して除いた。この清澄溶菌液からフアージを７％
ポリエチレングリコール6000で沈澱させ、続いて２回塩
化セシウム勾配を行つて精製した。フアージC15 DNAを
フエノール精製し、その構造を、制限酵素消化、および
20mMトリス塩基、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA中、0.
5μg/mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型アガロ
ースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースフイ
ルター〔サザーン（Southern）,1975,J.Mol.Biol.98,50
3-517〕への転写および上記したニツク−トランスレー
シヨン化したIFN−β１ cDNAへのハイブリツド化を行な
つた。C15 DNAのEcoRI断片をプラスミドの正確な制限地
図作成のためにpBR322のEcoRI部位に確立した操作〔ボ
リバー（Bolivar）,1979,Methods Enzymol.68,245-267
参照〕に従つて二次クローン化した。
7,Science 196,161-169〕の記述に従い液体培地に増殖
させた。大腸菌DP50を１％トリプトン、0.5％ NaCl、0.
5％酵母エキス、0.2％マルトース、0.25％ MgSO4、0.0
1％ジアミノピメリン酸、0.004％チミジンで一夜増殖さ
せた。約0.3mlの培養物を前吸着のために10mM MgSO4、1
0mM CaCl2および107フアージの混液0.3mlと37℃で20分
間混合した。その培養物を2lフラスコ中１％ NZアミ
ン、0.5％酵母エキス、0.5％ NaCl、0.1％カザミノ酸、
0.25％ MgSO4、0.01％ジアミノピメリン酸および0.004
％チミジンを含み予備加熱した培地500mlで希釈し、よ
く通気しながら、37℃で15-18時間インキユベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールGSAローター
（Sorvall GSA rotor）中、冷却下7,000rpmで15分間遠
心分離して除いた。この清澄溶菌液からフアージを７％
ポリエチレングリコール6000で沈澱させ、続いて２回塩
化セシウム勾配を行つて精製した。フアージC15 DNAを
フエノール精製し、その構造を、制限酵素消化、および
20mMトリス塩基、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA中、0.
5μg/mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型アガロ
ースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースフイ
ルター〔サザーン（Southern）,1975,J.Mol.Biol.98,50
3-517〕への転写および上記したニツク−トランスレー
シヨン化したIFN−β１ cDNAへのハイブリツド化を行な
つた。C15 DNAのEcoRI断片をプラスミドの正確な制限地
図作成のためにpBR322のEcoRI部位に確立した操作〔ボ
リバー（Bolivar）,1979,Methods Enzymol.68,245-267
参照〕に従つて二次クローン化した。
フアージ溶菌液中のインターフエロン活性分析 上記のごとく調製した清澄フアージIFN−β１ C15溶
菌液をリン酸緩衝化した食塩水（PBS）に７時間透析し
た。透析液10mlをCibacron Blue-Sepharose CL 6 B〔Ph
armacia Fine Chem.〕の0.3mlカラム上に乗せた。カラ
ムを10-15mlの1M NaCl、0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.2）、ついで洗液中50％プロピレン・グリコール1
0mlで洗浄した。画分（0.5ml）を集め４℃で保存した。
場合により0.1％ヒト血清アルブミンを安定化の為に加
えた。ワイゼンバツハら（Weissenbach et al．）〔19
79,Eur.J.Biochem.98,1−８〕の記述に従い、各画分を9
5−ウエル・ミクロプレートに連続的に希釈してインタ
ーフエロン活性を分析した。各ウエルには２−３×104F
S 11ヒト線維芽細胞を含む0.1mlのミニマム・エツセン
シヤル・メデイウム（Minimum Essential Medium,Gibc
o）,5％胎生子牛血清（FCS）,0.5％ゲンタミシンを入れ
た。37℃、18時間後、培地を取り、水胞性口炎ウイルス
（vesicular stomatitis virus,VSV）を２％ FCS含有培
地に1 pfu/細胞で加えた。細胞変性効果（cytopathic e
ffect）の阻害を、IFN−β NIH標準G 023-902-527と比
較して、感染後30〜40時間記録した。また抗ウイルス活
性は、先に記述したごとく〔ワイゼンバツハら（Weisse
nbach et al．）,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕,VSV
感染後の、3H−ウリジン取込みの減少によつて測つた。
IFN−βの抗血清はウサギから得、先のごとく〔Weissen
bach et al.,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕分析し
た。中和試験のために、0.1mlの抗血清（力価104単位/m
l）あるいは非免疫血清をPBS中蛋白Ａ−セフアローズビ
ーズ（protein A-Sepharose beads）（Pharmacia Fine
Chem.）の50％懸濁液0.2mlと37℃で１時間混合した。
菌液をリン酸緩衝化した食塩水（PBS）に７時間透析し
た。透析液10mlをCibacron Blue-Sepharose CL 6 B〔Ph
armacia Fine Chem.〕の0.3mlカラム上に乗せた。カラ
ムを10-15mlの1M NaCl、0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.2）、ついで洗液中50％プロピレン・グリコール1
0mlで洗浄した。画分（0.5ml）を集め４℃で保存した。
場合により0.1％ヒト血清アルブミンを安定化の為に加
えた。ワイゼンバツハら（Weissenbach et al．）〔19
79,Eur.J.Biochem.98,1−８〕の記述に従い、各画分を9
5−ウエル・ミクロプレートに連続的に希釈してインタ
ーフエロン活性を分析した。各ウエルには２−３×104F
S 11ヒト線維芽細胞を含む0.1mlのミニマム・エツセン
シヤル・メデイウム（Minimum Essential Medium,Gibc
o）,5％胎生子牛血清（FCS）,0.5％ゲンタミシンを入れ
た。37℃、18時間後、培地を取り、水胞性口炎ウイルス
（vesicular stomatitis virus,VSV）を２％ FCS含有培
地に1 pfu/細胞で加えた。細胞変性効果（cytopathic e
ffect）の阻害を、IFN−β NIH標準G 023-902-527と比
較して、感染後30〜40時間記録した。また抗ウイルス活
性は、先に記述したごとく〔ワイゼンバツハら（Weisse
nbach et al．）,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕,VSV
感染後の、3H−ウリジン取込みの減少によつて測つた。
IFN−βの抗血清はウサギから得、先のごとく〔Weissen
bach et al.,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕分析し
た。中和試験のために、0.1mlの抗血清（力価104単位/m
l）あるいは非免疫血清をPBS中蛋白Ａ−セフアローズビ
ーズ（protein A-Sepharose beads）（Pharmacia Fine
Chem.）の50％懸濁液0.2mlと37℃で１時間混合した。
ビーズをPBSで２度洗い0.1mlの細菌インターフエロン
（100単位/ml）を加えた。37℃、２時間後、ビーズを遠
心分離し、上清を分析してVSV感染細胞中の3H−ウリジ
ン取り込みの阻害を調べた。
（100単位/ml）を加えた。37℃、２時間後、ビーズを遠
心分離し、上清を分析してVSV感染細胞中の3H−ウリジ
ン取り込みの阻害を調べた。
遺伝子クローン:IFN−αＣクローン18-3の単離 上記のごとく化学合成した２つの短い単鎖オリゴヌク
レオチドを使つて直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはIFN−α遺伝子の共通配列
に相補的で５′CTCTGACAACCTCCC3′および５′CCTTCTGG
AACTG3′の配列を有していた。これらオリゴヌクレオチ
ドは上記のごとく５′標識した後直接、またはセンダイ
ウイルス誘導したヒト白血病細胞からのRNA上cDNA合成
の為の鋳型（プライマー、primer）として使われた。32
P−オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したcDNAを上記
のごとく総数500,000のλ組換え体フアージにハイブリ
ツド化した。9cmニトロセルロースフイルター当り約５
×105cpm使用した。ハイブリツド化はプラスチックの密
封した料理用袋中最少容量の液で行なつた。
レオチドを使つて直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはIFN−α遺伝子の共通配列
に相補的で５′CTCTGACAACCTCCC3′および５′CCTTCTGG
AACTG3′の配列を有していた。これらオリゴヌクレオチ
ドは上記のごとく５′標識した後直接、またはセンダイ
ウイルス誘導したヒト白血病細胞からのRNA上cDNA合成
の為の鋳型（プライマー、primer）として使われた。32
P−オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したcDNAを上記
のごとく総数500,000のλ組換え体フアージにハイブリ
ツド化した。9cmニトロセルロースフイルター当り約５
×105cpm使用した。ハイブリツド化はプラスチックの密
封した料理用袋中最少容量の液で行なつた。
15塩基のプライマーでのハイブリツド化を以下のごと
く行なつた。まず、６×SSC、10×デンハルト溶液（Den
hardts）中37℃で４時間プレハイブリツド化、次いで６
×SSC、10×デンハルト溶液（Denhardts）中37℃で18時
間ハイブリツド化し、６×SSC中37℃で各30分間３〜４
回、洗液に放射能が検出されなくなるまで洗浄した。13
塩基のプライマーでのハイブリツド化では、ハイブリツ
ド化および洗浄の温度を30℃に下げた。ハイブリツド化
陽性を示した総数16のフアージをさらに制限地図作成お
よびDNA配列化により分析した。クローン18-3は３個のI
FN−α遺伝子を担い、そのうちの１個は、ゲツデルら
（Goeddel et al．）〔1981,Nature,290,20-25〕のcDN
AクローンαＣと同じ配列を持つていることが証明され
た。クローン18-3は上記クローンC15と同様に精製し
た。クローン18-3のλバクテリオフアージ中での発現お
よび発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記
「結果」で説明する。
く行なつた。まず、６×SSC、10×デンハルト溶液（Den
hardts）中37℃で４時間プレハイブリツド化、次いで６
×SSC、10×デンハルト溶液（Denhardts）中37℃で18時
間ハイブリツド化し、６×SSC中37℃で各30分間３〜４
回、洗液に放射能が検出されなくなるまで洗浄した。13
塩基のプライマーでのハイブリツド化では、ハイブリツ
ド化および洗浄の温度を30℃に下げた。ハイブリツド化
陽性を示した総数16のフアージをさらに制限地図作成お
よびDNA配列化により分析した。クローン18-3は３個のI
FN−α遺伝子を担い、そのうちの１個は、ゲツデルら
（Goeddel et al．）〔1981,Nature,290,20-25〕のcDN
AクローンαＣと同じ配列を持つていることが証明され
た。クローン18-3は上記クローンC15と同様に精製し
た。クローン18-3のλバクテリオフアージ中での発現お
よび発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記
「結果」で説明する。
結果 1.遺伝子IFN−β１ C15クローンの構造： フアージクローンをEcoRIで部分消化しλ Charon 4A
のアームにクローン化したヒトDNAのライブラリーから
分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株のmRNA画
分から別々に調製した二つの異なるIFN−β１ cDNAプロ
ーブに強くハイブリツド化した。EcoRIによる該フアー
ジDNAの消化は、２つのλアームに加えて、12,2.6,1.84
および0.6キロベース（第1A図）の４断片を示した。サ
ザーン（Southern）〔1975,J.Mol.Biol.98,503-517〕の
方法によるニトロセルロースへの転写およびIFN−β１
I−６−5 cDNAクローンからニック−トランスレーシヨ
ン化したDNAとのハイブリツド化により1.84Kb断片がIFN
−β１遺伝子を含むことがわかつた。このEcoRI断片をp
BR322のEcoRI部位に再クローン化した。この1.84Kb亜ク
ローンのBgl II Pvu II,Pst I,Hinc IIおよびTaq Iによ
る制限酵素分析および部分ないし完全長IFN−β１ cDNA
プローブとのハイブリツド化によりIFN−β１プレ蛋白
のコード配列（Hinc II部位）はEcoRI部位から約350ヌ
クレオチドで始まると結論した（第1A図）。遺伝子DNA
中の種々の制限酵素部位の間の距離は実験誤差の範囲で
cDNA配列のそれと同じである（第１表）。
のアームにクローン化したヒトDNAのライブラリーから
分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株のmRNA画
分から別々に調製した二つの異なるIFN−β１ cDNAプロ
ーブに強くハイブリツド化した。EcoRIによる該フアー
ジDNAの消化は、２つのλアームに加えて、12,2.6,1.84
および0.6キロベース（第1A図）の４断片を示した。サ
ザーン（Southern）〔1975,J.Mol.Biol.98,503-517〕の
方法によるニトロセルロースへの転写およびIFN−β１
I−６−5 cDNAクローンからニック−トランスレーシヨ
ン化したDNAとのハイブリツド化により1.84Kb断片がIFN
−β１遺伝子を含むことがわかつた。このEcoRI断片をp
BR322のEcoRI部位に再クローン化した。この1.84Kb亜ク
ローンのBgl II Pvu II,Pst I,Hinc IIおよびTaq Iによ
る制限酵素分析および部分ないし完全長IFN−β１ cDNA
プローブとのハイブリツド化によりIFN−β１プレ蛋白
のコード配列（Hinc II部位）はEcoRI部位から約350ヌ
クレオチドで始まると結論した（第1A図）。遺伝子DNA
中の種々の制限酵素部位の間の距離は実験誤差の範囲で
cDNA配列のそれと同じである（第１表）。
予期しない制限酵素部位はIFN−β１コード領域のど
こにも見出せなかつた。これは検出できる介在配列（in
tervening sequence）が存在しないことを示している。
こにも見出せなかつた。これは検出できる介在配列（in
tervening sequence）が存在しないことを示している。
C15 DNAのEcoRI部分消化は、0.6Kb EcoRI断片が1.84
と2.6Kb EcoRI断片の間に位置することを示した。BamHI
部位が2.6Kb中に１箇所見出されたが挿入したヒトDNAの
他のEcoRI断片には見出されなかつた。IFN−β１ cDNA
にハイブリツド化する1.84KbのEcoRI断片はC15 DNAの9.
6Kb BamHI断片上に見出された。第１図に示したとお
り、この断片はλ右アーム（EcoRIから5.1Kb）のBamHI
部位からのみ由来し、挿入したヒトDNAのEcoRI-BamHI断
片に当る4.5Kbを遊離しているが、このことは1.84Kb Ec
oRI断片がλ右アームに隣接しているにちがいないこと
を示している。遺伝子方向づけ（第1A図）は以下のごと
く決定した。C15 DNAをPvu IIで切断してIFN−β１ cDN
Aの完全長または３′側半分にハイブリツド化したと
き、IFN−β１の５′末端にのみハイブリツド化してい
る0.66Kb断片が見出された。しかし、1.84Kb EcoRI断片
をPvu IIで切断したときは、IFN−β１の５′末端が、
より小さい0.54Kb断片に見られた。挿入したヒトDNAの
0.6Kb EcoRI断片にはPvu II部位は見出されないので、
0.66Kb Pvu II断片はλ右アームで終るはずであり、従
つてIFN−β１の５′末端はλ右アームに最も接近して
いる。第1A図に示される構造は、Hind III、Sma Iおよ
びBgl II消化を用いる数種の他の制限地図作製実験から
も確認される。クローンC15中のIFN−β１遺伝子のコー
ド配列は、従つて、左方向転写を調節する強力なλPLプ
ロモーター〔ウイリアムスら（Williams et al．）,19
80,Genetic Engineering Vol II,pp 201-281,プレナム
社（Plenum Corp）〕から約1,775ヌクレオチド離れて、
適切な左方向性に挿入されていた。このことが検出可能
なイントロンの不在とともにC 15組換え体フアージ感染
大腸菌でインターフエロンを生産する可能性の検討を促
した。
と2.6Kb EcoRI断片の間に位置することを示した。BamHI
部位が2.6Kb中に１箇所見出されたが挿入したヒトDNAの
他のEcoRI断片には見出されなかつた。IFN−β１ cDNA
にハイブリツド化する1.84KbのEcoRI断片はC15 DNAの9.
6Kb BamHI断片上に見出された。第１図に示したとお
り、この断片はλ右アーム（EcoRIから5.1Kb）のBamHI
部位からのみ由来し、挿入したヒトDNAのEcoRI-BamHI断
片に当る4.5Kbを遊離しているが、このことは1.84Kb Ec
oRI断片がλ右アームに隣接しているにちがいないこと
を示している。遺伝子方向づけ（第1A図）は以下のごと
く決定した。C15 DNAをPvu IIで切断してIFN−β１ cDN
Aの完全長または３′側半分にハイブリツド化したと
き、IFN−β１の５′末端にのみハイブリツド化してい
る0.66Kb断片が見出された。しかし、1.84Kb EcoRI断片
をPvu IIで切断したときは、IFN−β１の５′末端が、
より小さい0.54Kb断片に見られた。挿入したヒトDNAの
0.6Kb EcoRI断片にはPvu II部位は見出されないので、
0.66Kb Pvu II断片はλ右アームで終るはずであり、従
つてIFN−β１の５′末端はλ右アームに最も接近して
いる。第1A図に示される構造は、Hind III、Sma Iおよ
びBgl II消化を用いる数種の他の制限地図作製実験から
も確認される。クローンC15中のIFN−β１遺伝子のコー
ド配列は、従つて、左方向転写を調節する強力なλPLプ
ロモーター〔ウイリアムスら（Williams et al．）,19
80,Genetic Engineering Vol II,pp 201-281,プレナム
社（Plenum Corp）〕から約1,775ヌクレオチド離れて、
適切な左方向性に挿入されていた。このことが検出可能
なイントロンの不在とともにC 15組換え体フアージ感染
大腸菌でインターフエロンを生産する可能性の検討を促
した。
2.IFN−β１ C 15フアージ感染大腸菌溶菌液からのイン
ターフエロン生物活性の回収 クローンC15からのフアージをメソツズ（Methods）に
記載のとおり大腸菌DP 50の培養液500mlで増殖させた。
清澄溶菌液10mlを透析し、Cibacron Blue-Sepharose小
カラム（0.3ml）にのせ、画分を水胞性口内炎ウイルス
（VSV）細胞変性効果の阻害について、標準IFN−βを対
照として用いて、分析した。溶菌液中のフアージ濃度1.
3×1010フアージ/mlで行なつた一実験例におけるインタ
ーフエロン活性パターンを第２図に示した。カラムから
50％プロピレングリコール1M NaClで溶出した画分中に
総量7,500単位のIFN活性を回収した。これは溶菌液１
当り0.75×106単位に相当する。しかし粗溶菌液中では
測定可能な活性が非常に低く、そのことは溶菌液中の物
質がIFN活性の正確な分析を妨げていることを示唆して
いる。再造成実験で、標準ヒトIFN−βを野性型λ Char
on 4A溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの10分
の１であつた。この混合物をBlue-Sepharoseカラムに通
すと、投入活性の75％が回収された。対照としてIFN添
加しない野性型λ Charon 4 Aフアージからの溶菌液を
分析したが、IFN活性は見出せなかつた（第２図）。
ターフエロン生物活性の回収 クローンC15からのフアージをメソツズ（Methods）に
記載のとおり大腸菌DP 50の培養液500mlで増殖させた。
清澄溶菌液10mlを透析し、Cibacron Blue-Sepharose小
カラム（0.3ml）にのせ、画分を水胞性口内炎ウイルス
（VSV）細胞変性効果の阻害について、標準IFN−βを対
照として用いて、分析した。溶菌液中のフアージ濃度1.
3×1010フアージ/mlで行なつた一実験例におけるインタ
ーフエロン活性パターンを第２図に示した。カラムから
50％プロピレングリコール1M NaClで溶出した画分中に
総量7,500単位のIFN活性を回収した。これは溶菌液１
当り0.75×106単位に相当する。しかし粗溶菌液中では
測定可能な活性が非常に低く、そのことは溶菌液中の物
質がIFN活性の正確な分析を妨げていることを示唆して
いる。再造成実験で、標準ヒトIFN−βを野性型λ Char
on 4A溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの10分
の１であつた。この混合物をBlue-Sepharoseカラムに通
すと、投入活性の75％が回収された。対照としてIFN添
加しない野性型λ Charon 4 Aフアージからの溶菌液を
分析したが、IFN活性は見出せなかつた（第２図）。
クローンC15の溶菌液からのIFNのクロマトグラフ挙動
は一定でない。フアージ濃度が３×1011pfu/mlの実験で
は、IFN活性は高いが、Blue-Sepharoseカラムには保持
されなかつた。この実験で、カラムから回収された総活
性は10mlの溶菌液（７−８×106単位/l）の投入に対し7
0-80,000単位のIFNであつた。溶出画分を第２のBlue-Se
pharoseカラムに再吸着させた。このときは活性がカラ
ムに保持されたが、PBSでカラムを洗うと再び溶出され
た。ヒトIFN−β１は通常疎水性溶媒によつてのみBlue-
Sepharoseから溶出されるはずである〔ナイトら（Knigh
t et al．）,1980.Science 207,525-526〕，従つて標
準ヒトIFN−βを同じフアージ溶菌液と混合しカラムに
かけた。活性の30％が保持されず、活性の回収は25％に
すぎなかつた。このことは、この溶菌液の成分がIFN−
β、特に細菌によつて生産されるIFN−βとBlue-Sephar
oseの相互作用を不安定化したことを示唆している。
は一定でない。フアージ濃度が３×1011pfu/mlの実験で
は、IFN活性は高いが、Blue-Sepharoseカラムには保持
されなかつた。この実験で、カラムから回収された総活
性は10mlの溶菌液（７−８×106単位/l）の投入に対し7
0-80,000単位のIFNであつた。溶出画分を第２のBlue-Se
pharoseカラムに再吸着させた。このときは活性がカラ
ムに保持されたが、PBSでカラムを洗うと再び溶出され
た。ヒトIFN−β１は通常疎水性溶媒によつてのみBlue-
Sepharoseから溶出されるはずである〔ナイトら（Knigh
t et al．）,1980.Science 207,525-526〕，従つて標
準ヒトIFN−βを同じフアージ溶菌液と混合しカラムに
かけた。活性の30％が保持されず、活性の回収は25％に
すぎなかつた。このことは、この溶菌液の成分がIFN−
β、特に細菌によつて生産されるIFN−βとBlue-Sephar
oseの相互作用を不安定化したことを示唆している。
インターフエロンはカラムに保持されなかつたが、溶
菌液の蛋白質の90％以上が比活性４−５×105単位/mg蛋
白質を有する活性画分から取除かれた。この部分精製は
粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除くために
欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカルボキシメ
チル−セフアロース クロマトグラフイーにかけてクロ
ーンC15 IFN活性を回収した（図には示さない）。
菌液の蛋白質の90％以上が比活性４−５×105単位/mg蛋
白質を有する活性画分から取除かれた。この部分精製は
粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除くために
欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカルボキシメ
チル−セフアロース クロマトグラフイーにかけてクロ
ーンC15 IFN活性を回収した（図には示さない）。
3.クローンC15感染大腸菌産生インターフエロンの性質 クロマトグラフ処理で回収したインターフエロン活性
はアクチノマイシンＤで処理したVSV−感染ヒト細胞中
の3H−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバツ
ハ（Weissenbach）,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕。
細菌IFN−βで得られた力価曲線は標準ヒトIFN−βで得
られたものと同じであつた（第３図）。細菌IFNの免疫
学的性質を調べるために、部分精製物をウサギ抗IFN−
β血清（IFN−αには不活性）または蛋白質Ａ−セフア
ロース（protein A-Sepharose）に予備結合したウサギ
非免疫血清と混合した。遠心分離後、上清のIFN活性を
分析した。抗IFN−β血清はインターフエロン活性を全
て取除いたが非免疫血清を用いたときは活性が残つた
（第３図）。
はアクチノマイシンＤで処理したVSV−感染ヒト細胞中
の3H−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバツ
ハ（Weissenbach）,1979,Eur.J.Biochem.98,1−８〕。
細菌IFN−βで得られた力価曲線は標準ヒトIFN−βで得
られたものと同じであつた（第３図）。細菌IFNの免疫
学的性質を調べるために、部分精製物をウサギ抗IFN−
β血清（IFN−αには不活性）または蛋白質Ａ−セフア
ロース（protein A-Sepharose）に予備結合したウサギ
非免疫血清と混合した。遠心分離後、上清のIFN活性を
分析した。抗IFN−β血清はインターフエロン活性を全
て取除いたが非免疫血清を用いたときは活性が残つた
（第３図）。
細菌IFN（20単位/ml）は細胞培養物上で抗IFN−β（2
0単位/ml）と混合するだけで同様に中和され、VSV細胞
変性効果の阻害によつて分析された。
0単位/ml）と混合するだけで同様に中和され、VSV細胞
変性効果の阻害によつて分析された。
細菌インターフエロンの種特異性を種々の細胞型の比
較により分析した。
較により分析した。
ヒトIFN−βとしてのクローンC15感染大腸菌生産物の
活性はサル腎細胞BSC-1およびウシMDBK細胞ではヒト細
胞の場合の10％以下であつた。マウスＬあるいはA9細胞
については検出可能な抗ウイルス活性はなかつた。クロ
ーンC15によつて生産される細菌IFN6,000単位/mlでも同
じ効果が得られた。
活性はサル腎細胞BSC-1およびウシMDBK細胞ではヒト細
胞の場合の10％以下であつた。マウスＬあるいはA9細胞
については検出可能な抗ウイルス活性はなかつた。クロ
ーンC15によつて生産される細菌IFN6,000単位/mlでも同
じ効果が得られた。
本発明は、従つてヒト遺伝子DNAのEcoRI部分消化断片
からλ Charon 4A中へのクローニングによつて直接単離
されたIFN−β１遺伝子が発現可能で培養物の溶菌液中
に著量のIFN活性を蓄積させることができることを示し
た。生産された活性は免疫学的性質ならびに種特異性か
ら明らかに線維芽細胞インターフエロン（β）である。
活性はIFN−β１ C15フアージクローンによる感染細菌
を培養したときだけ生産される。大腸菌中のクローンC1
5によつて生産されるIFN活性はCibacron Blue Sepharos
e上のクロマトグラフにおける性質がヒトIFN−βとよく
似ている。細菌溶菌液から高活性（７×106単位/l）を
回収するためにはクロマトグラフ処理が必須である。イ
ンターフエロンは、従つて一個体の遺伝子から直接採取
したヒトDNA断片の指示のもとに細菌により生産される
生物学的活性蛋白質の最初の例となる。
からλ Charon 4A中へのクローニングによつて直接単離
されたIFN−β１遺伝子が発現可能で培養物の溶菌液中
に著量のIFN活性を蓄積させることができることを示し
た。生産された活性は免疫学的性質ならびに種特異性か
ら明らかに線維芽細胞インターフエロン（β）である。
活性はIFN−β１ C15フアージクローンによる感染細菌
を培養したときだけ生産される。大腸菌中のクローンC1
5によつて生産されるIFN活性はCibacron Blue Sepharos
e上のクロマトグラフにおける性質がヒトIFN−βとよく
似ている。細菌溶菌液から高活性（７×106単位/l）を
回収するためにはクロマトグラフ処理が必須である。イ
ンターフエロンは、従つて一個体の遺伝子から直接採取
したヒトDNA断片の指示のもとに細菌により生産される
生物学的活性蛋白質の最初の例となる。
4.遺伝子IFN−αＣ18-3クローン クローンを、化学合成された短いオリゴヌクレオチド
の直接ハイブリツド化によつて、IFN−αの配列に相補
的であると同定した。総数0.5×106の遺伝子中16のクロ
ーンがハイブリツド化陽性であつた。オリゴヌクレオチ
ドにハイブリツド化するEcoRI断片の配列を調べた結
果、クローン18-3は、第1B図に示したように、IFN−α
Ｃの遺伝子が位置する2Kb EcoRI断片18-33（第1B図の挿
入部分）を含んでいることがわかつた。この遺伝子は、
明らかにゲツデルら（Goeddel et al．）〔1981,Natur
e 290,20-25〕によつて報告されたIFN−αＣクローンを
生じるmRNAの起源である。クローン５−１は重複するDN
A断片を表わす。クローン５−１およびクローン18-3は
ともに、IFN−αＣに加えて、α−C2およびα−C4と名
付けた二つの他のIFN−α遺伝子を担つている（第1B
図）。
の直接ハイブリツド化によつて、IFN−αの配列に相補
的であると同定した。総数0.5×106の遺伝子中16のクロ
ーンがハイブリツド化陽性であつた。オリゴヌクレオチ
ドにハイブリツド化するEcoRI断片の配列を調べた結
果、クローン18-3は、第1B図に示したように、IFN−α
Ｃの遺伝子が位置する2Kb EcoRI断片18-33（第1B図の挿
入部分）を含んでいることがわかつた。この遺伝子は、
明らかにゲツデルら（Goeddel et al．）〔1981,Natur
e 290,20-25〕によつて報告されたIFN−αＣクローンを
生じるmRNAの起源である。クローン５−１は重複するDN
A断片を表わす。クローン５−１およびクローン18-3は
ともに、IFN−αＣに加えて、α−C2およびα−C4と名
付けた二つの他のIFN−α遺伝子を担つている（第1B
図）。
5.recAプロモーター調節下のヒトIFN遺伝子断片の発現 recAプロモーターは最強の大腸菌プロモーターのひと
つと考えられている。通常、pBR322のような多数コピー
プラスミド上に存在するときでも、lex遺伝子の生産物
によつて強く抑制されている。recAプロモーターは損傷
を受けたDNAの存在下にそれ自身の抑制体を切断して誘
導され、誘導は非常に高い程度まで行なわれる。
つと考えられている。通常、pBR322のような多数コピー
プラスミド上に存在するときでも、lex遺伝子の生産物
によつて強く抑制されている。recAプロモーターは損傷
を受けたDNAの存在下にそれ自身の抑制体を切断して誘
導され、誘導は非常に高い程度まで行なわれる。
〔サンカーおよびラツプ（Sancar and Rupp）,1979,PNA
S 76,3144-3148〕。recAの標準誘導物質はDNA合成を妨
げるナリジクス酸あるいはDNAを交叉連結するマイトマ
イシンＣである。
S 76,3144-3148〕。recAの標準誘導物質はDNA合成を妨
げるナリジクス酸あるいはDNAを交叉連結するマイトマ
イシンＣである。
約１キロベースのTaq I-BamHI断片上のプロモーター
を分離するためにクローン化したrecAを含むプラスミド
pDR1453を使つた。これをCla IおよびBam Iで開裂したp
BR 322に連結しプラスミドRAP-1を造成した。この場合T
aq I-Cla I結合はCla I部位を回復し、その結果プラス
ミドはrecA遺伝子の第３番目のコドン中で唯一開裂され
ることを可能にした。RAP-2はRAP-1をEcoRIおよびCla I
で切断し、粘着末端を埋め込み（filling in）、RI部位
を回復する再連結を行なつて造成した。RAP-2をRI部位
で開裂し、外来DNAをrecA蛋白の第３番目のコドンに挿
入することができる。
を分離するためにクローン化したrecAを含むプラスミド
pDR1453を使つた。これをCla IおよびBam Iで開裂したp
BR 322に連結しプラスミドRAP-1を造成した。この場合T
aq I-Cla I結合はCla I部位を回復し、その結果プラス
ミドはrecA遺伝子の第３番目のコドン中で唯一開裂され
ることを可能にした。RAP-2はRAP-1をEcoRIおよびCla I
で切断し、粘着末端を埋め込み（filling in）、RI部位
を回復する再連結を行なつて造成した。RAP-2をRI部位
で開裂し、外来DNAをrecA蛋白の第３番目のコドンに挿
入することができる。
RAP-1ベクターをヒト遺伝子ライブラリーからの遺伝
子断片によるインターフエロン活性の間接発現に使つ
た。IFN−β１遺伝子および数個の単離したαＣ亜種のI
FN−α遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗
ウイルス分析によると強いインターフエロン活性を生産
することが認められた。これらの遺伝子が存在するDNA
のRI断片（第1AおよびＢ図）をRAP-1プラスミドのRI部
位に二次クローン化した。該プラスミドをrecA+宿主菌
株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で誘導し、細
胞を採集し、リゾチームおよび30％プロピレングリコー
ルで溶菌し、抽出物の抗ウイルス活性を分析した。活性
の程度は明らかにナリジクス酸による誘導に依存し、最
高50μg/mlであつた（第３表）。
子断片によるインターフエロン活性の間接発現に使つ
た。IFN−β１遺伝子および数個の単離したαＣ亜種のI
FN−α遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗
ウイルス分析によると強いインターフエロン活性を生産
することが認められた。これらの遺伝子が存在するDNA
のRI断片（第1AおよびＢ図）をRAP-1プラスミドのRI部
位に二次クローン化した。該プラスミドをrecA+宿主菌
株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で誘導し、細
胞を採集し、リゾチームおよび30％プロピレングリコー
ルで溶菌し、抽出物の抗ウイルス活性を分析した。活性
の程度は明らかにナリジクス酸による誘導に依存し、最
高50μg/mlであつた（第３表）。
興味深いことには、遺伝子断片はrecAプロモーターに
関連する二つの可能な配向で活性を生産することもあ
る。活性を示すIFN−β１およびIFN−α遺伝子はすべて
1.8-2キロベースのDNA EcoRI断片上に位置していたの
で、プロモーターからインターフエロン遺伝子のATG開
始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチドである。
関連する二つの可能な配向で活性を生産することもあ
る。活性を示すIFN−β１およびIFN−α遺伝子はすべて
1.8-2キロベースのDNA EcoRI断片上に位置していたの
で、プロモーターからインターフエロン遺伝子のATG開
始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチドである。
これらの実験からプロモーターが予期したとおり機能
することは明らかであり、遺伝子ライブラリーからのイ
ンターフエロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決定する
ことが可能である。
することは明らかであり、遺伝子ライブラリーからのイ
ンターフエロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決定する
ことが可能である。
6.tryp-lac混成プロモーター調節下のIFN−β１遺伝子
の高発現 プラスミドPLJ 3〔ジヨンスラド（Johnsrud）,PNAS,1
978,75,5314-5318〕は関連のない95ヌクレオチドで隔て
られた各95塩基対長の２つのlacプロモーターを含んで
いる。この285ヌクレオチド断片をプラスミドPMB 9のEc
oRI部位に挿入する。95塩基対長のlac配列はオペレータ
ーおよびプロモーター配列を含み、β−ガラクトシダー
ゼのATGの直前で停止する。β−ガラクトシダーゼのリ
ボゾーム結合部位から適当な距離に挿入した、ATG開始
コドンを有するコード化DNA配列は大腸菌細胞中で正確
に発現されるはずである。285塩基対のEcoRI断片をpBR
322のEcoRI部位に再クローン化した。組換え体を40μg/
ml X-galおよび15μg/mlテトラサイクリン含有プレート
で細胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけ
を集めDNAを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
の高発現 プラスミドPLJ 3〔ジヨンスラド（Johnsrud）,PNAS,1
978,75,5314-5318〕は関連のない95ヌクレオチドで隔て
られた各95塩基対長の２つのlacプロモーターを含んで
いる。この285ヌクレオチド断片をプラスミドPMB 9のEc
oRI部位に挿入する。95塩基対長のlac配列はオペレータ
ーおよびプロモーター配列を含み、β−ガラクトシダー
ゼのATGの直前で停止する。β−ガラクトシダーゼのリ
ボゾーム結合部位から適当な距離に挿入した、ATG開始
コドンを有するコード化DNA配列は大腸菌細胞中で正確
に発現されるはずである。285塩基対のEcoRI断片をpBR
322のEcoRI部位に再クローン化した。組換え体を40μg/
ml X-galおよび15μg/mlテトラサイクリン含有プレート
で細胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけ
を集めDNAを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
lacプロモーターにはpBR 322のアンピシリン遺伝子方
向とテトラサイクリン遺伝子方向の二方向が予期でき
る。本発明者らの興味はlacリボゾーム結合部位とpBR 3
22配列の間に位置するEcoRI部位のみを得ることにある
ので、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼを結合すること
によつてこの部位を保護し、一方末梢部位をEcoRI制限
で開裂し、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント（K
lenow fragment）で埋め込みを行ない、再結合した。MM
294大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを分離し、pBR
322のEcoRI部位とBamHI部位の間の距離を測つた。375
塩基対断片を含むプラスミドはlacプロモーターがテト
ラサイクリン遺伝子方向で、670塩基対断片（375±295
b.p.）を含むプラスミドはlacプロモーターがアンピシ
リン遺伝子方向であつた。
向とテトラサイクリン遺伝子方向の二方向が予期でき
る。本発明者らの興味はlacリボゾーム結合部位とpBR 3
22配列の間に位置するEcoRI部位のみを得ることにある
ので、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼを結合すること
によつてこの部位を保護し、一方末梢部位をEcoRI制限
で開裂し、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント（K
lenow fragment）で埋め込みを行ない、再結合した。MM
294大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを分離し、pBR
322のEcoRI部位とBamHI部位の間の距離を測つた。375
塩基対断片を含むプラスミドはlacプロモーターがテト
ラサイクリン遺伝子方向で、670塩基対断片（375±295
b.p.）を含むプラスミドはlacプロモーターがアンピシ
リン遺伝子方向であつた。
IFN−β１遺伝子断片のEcoRI 1.84Kb二次クローンか
ら、本発明者らはプレインターフエロン配列を含むHinc
II-BglII断片を切出した。成熟IFN−β１蛋白はそのア
ミノ基末端に大腸菌内で開始コドンとして用いることが
できるメチオニンを含んでいる。このATGコドンに接し
て13ヌクレオチド隔てられた２つのAluI部位がある。１
つはATGの前８ヌクレオチド、他はATGの後２ヌクレオチ
ドである。部分的AluI消化をHincII-BglII断片で行な
い、約510塩基対の断片をアガロースゲルで単離した。
テトラサイクリン遺伝子方向のlacプロモーターを含む
ベクターをEcoRIで制限し、制限部位をDNAポリメラーゼ
で埋め込みを行ないBamHIで再切断した。AluI-BglII断
片と埋め込みを行なつたEcoRI-BamHIベクターの連続でE
coRI部位が回復した。ATGコドンを含むクローン（13ヌ
クレオチド長）の間の区別を可能にするために得られた
クローンをEcoRIとPstIで制限し、予期した151塩基対の
断片を含むクローンの配列を決めた。次いでEcoRI部位
を再開裂し、リボゾーム結合部位とATGの間の距離をBal
31消化と再結合で短くした。これらのプラスミドで形
質転換した大腸菌はIFN−β１生産により選別した。
ら、本発明者らはプレインターフエロン配列を含むHinc
II-BglII断片を切出した。成熟IFN−β１蛋白はそのア
ミノ基末端に大腸菌内で開始コドンとして用いることが
できるメチオニンを含んでいる。このATGコドンに接し
て13ヌクレオチド隔てられた２つのAluI部位がある。１
つはATGの前８ヌクレオチド、他はATGの後２ヌクレオチ
ドである。部分的AluI消化をHincII-BglII断片で行な
い、約510塩基対の断片をアガロースゲルで単離した。
テトラサイクリン遺伝子方向のlacプロモーターを含む
ベクターをEcoRIで制限し、制限部位をDNAポリメラーゼ
で埋め込みを行ないBamHIで再切断した。AluI-BglII断
片と埋め込みを行なつたEcoRI-BamHIベクターの連続でE
coRI部位が回復した。ATGコドンを含むクローン（13ヌ
クレオチド長）の間の区別を可能にするために得られた
クローンをEcoRIとPstIで制限し、予期した151塩基対の
断片を含むクローンの配列を決めた。次いでEcoRI部位
を再開裂し、リボゾーム結合部位とATGの間の距離をBal
31消化と再結合で短くした。これらのプラスミドで形
質転換した大腸菌はIFN−β１生産により選別した。
クローン、L-11は約３×106単位/lのIFN−βを生産し
た。このクローン中のlacプロモーター領域をHpaHIで、
すなわちmRNA開始前17ヌクレオチドで切断した。IFN−
β１遺伝子を切出すため、酵素Sau 3aを用いそのDNAをI
FN−β１の停止コドンを越えて３ヌクレオチドで切断し
た。このHpaII-Sau 3a lac-IFN−β１断片を下記のごと
くに調製したtrypプロモータープラスミドのClaI部位と
Hind III部位の間に導入した。tryp mRNAの開始前−21
〜−201の180ヌクレオチド長のTaqI-TaqI断片をtrypプ
ラスミドpEP 121-221から切出し、pBR 322のClaI部位に
クローン化した。本発明者らは、trypプロモーター断片
が時計方向に向いた配向のものを選んだ。この操作によ
りtrypプロモーターの−21の位置にClaI部位が回復す
る。lac-IFN−β１断片に連結後、混成プロモーターtry
p-lacがIFN−β１遺伝子の前に形成される。このプラス
ミドTL-11を大腸菌MM294あるいは大腸菌ミニセル株p679
-54の形質転換に使つた。これらの細菌はO D65010の発
酵槽培養で108単位/lのIFN−β１を生産する。このこと
はこのIFN−β１遺伝子DNA断片が高い活性を有すること
を示している（第４図）。
た。このクローン中のlacプロモーター領域をHpaHIで、
すなわちmRNA開始前17ヌクレオチドで切断した。IFN−
β１遺伝子を切出すため、酵素Sau 3aを用いそのDNAをI
FN−β１の停止コドンを越えて３ヌクレオチドで切断し
た。このHpaII-Sau 3a lac-IFN−β１断片を下記のごと
くに調製したtrypプロモータープラスミドのClaI部位と
Hind III部位の間に導入した。tryp mRNAの開始前−21
〜−201の180ヌクレオチド長のTaqI-TaqI断片をtrypプ
ラスミドpEP 121-221から切出し、pBR 322のClaI部位に
クローン化した。本発明者らは、trypプロモーター断片
が時計方向に向いた配向のものを選んだ。この操作によ
りtrypプロモーターの−21の位置にClaI部位が回復す
る。lac-IFN−β１断片に連結後、混成プロモーターtry
p-lacがIFN−β１遺伝子の前に形成される。このプラス
ミドTL-11を大腸菌MM294あるいは大腸菌ミニセル株p679
-54の形質転換に使つた。これらの細菌はO D65010の発
酵槽培養で108単位/lのIFN−β１を生産する。このこと
はこのIFN−β１遺伝子DNA断片が高い活性を有すること
を示している（第４図）。
第1A図:IFN−β１クローンC15 DNAの模式構造 （ａ）λ Charon 4Aの模式図。２つのアームは実線で示
す。 （ｂ）クローンC15に挿入したヒトDNAの構造、黒塗部分
はIFN−β１ cDNAにハイブリツド化するEcoRI断片を示
す。 （ｃ）ｂからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。PLはλ左方向プロモータ
ーである。 （ｄ）IFN−β１ mRNAの位置。上方の目盛りは（ａ）と
（ｂ）に対応する。下方の目盛りは（ｃ）と（ｄ）に対
応する。詳細は本文参照。 第1B図:IFN−αＣクローン18-3の模式構造 ２つのλ Charon 4Aクローン挿入部分の制限地図を示
す。IFN−αＣ遺伝子は矢印アルフアーC*で示される。
他の２つのIFN−α遺伝子がIFN−αＣの近くに存在す
る。挿入部分はIFN−αＣ遺伝子を含み、本文に説明し
たようにrecAプラスミド中にクローン化したEcoRI 2Kb
フラグメント18-33を示す。制限酵素部位に対応する記
号を示す。 第２図：遺伝子クローンIFN−β１ C15により生産され
たインターフエロンのBlue-Sepharoseでの分析 フアージC15感染大腸菌DP50の粗溶菌液を“材料および
方法”に記載のごとく分画し、IFN活性を各画分につい
て分析した 蛋白濃度を同じ画分について測つた λ Charon 4Aフアージからの溶菌液の並行クロマトグラ
フイと分析を示す 第３図：遺伝子クローンIFN−β１ C15インターフエロ
ンの力価 第２図のカラムからのフアージC15 IFNの画分（約103単
位/ml）を1:40に希釈し、ついでVSV RNA合成の希釈によ
るIFNの分析の為にミクロプレート上で連続的に希釈し
た 標準ヒト線維芽細胞インターフエロン25単位/mlを平行
して分析した VSVなしの対照（□）およびVSVありIFNなしの対照
（■）を示す。右の２つのカラムは“方法”で示したよ
うに、固定化した抗IFN−βまたは非免疫IgGに吸着後の
フアージC15 IFNの残在活性（最終希釈1:40）を示す。 第４図：プラスミドTL11含有大腸菌の増殖とIFN生産 TL11プラスミドは本文に示したごとく混成tryp-lacプロ
モーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒトIFN−β１
をコードする配列を含んでいる。細菌を１のニユー・
ブルンスウイツク発酵槽（New Brunswick fermentor）
中で増殖し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロ
ピレングリコールで溶菌し、VSVにヒト細胞を攻撃させ
てIFN活性を測定した。IFN活性は細菌培養物1ml当りで
計算する。
す。 （ｂ）クローンC15に挿入したヒトDNAの構造、黒塗部分
はIFN−β１ cDNAにハイブリツド化するEcoRI断片を示
す。 （ｃ）ｂからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。PLはλ左方向プロモータ
ーである。 （ｄ）IFN−β１ mRNAの位置。上方の目盛りは（ａ）と
（ｂ）に対応する。下方の目盛りは（ｃ）と（ｄ）に対
応する。詳細は本文参照。 第1B図:IFN−αＣクローン18-3の模式構造 ２つのλ Charon 4Aクローン挿入部分の制限地図を示
す。IFN−αＣ遺伝子は矢印アルフアーC*で示される。
他の２つのIFN−α遺伝子がIFN−αＣの近くに存在す
る。挿入部分はIFN−αＣ遺伝子を含み、本文に説明し
たようにrecAプラスミド中にクローン化したEcoRI 2Kb
フラグメント18-33を示す。制限酵素部位に対応する記
号を示す。 第２図：遺伝子クローンIFN−β１ C15により生産され
たインターフエロンのBlue-Sepharoseでの分析 フアージC15感染大腸菌DP50の粗溶菌液を“材料および
方法”に記載のごとく分画し、IFN活性を各画分につい
て分析した 蛋白濃度を同じ画分について測つた λ Charon 4Aフアージからの溶菌液の並行クロマトグラ
フイと分析を示す 第３図：遺伝子クローンIFN−β１ C15インターフエロ
ンの力価 第２図のカラムからのフアージC15 IFNの画分（約103単
位/ml）を1:40に希釈し、ついでVSV RNA合成の希釈によ
るIFNの分析の為にミクロプレート上で連続的に希釈し
た 標準ヒト線維芽細胞インターフエロン25単位/mlを平行
して分析した VSVなしの対照（□）およびVSVありIFNなしの対照
（■）を示す。右の２つのカラムは“方法”で示したよ
うに、固定化した抗IFN−βまたは非免疫IgGに吸着後の
フアージC15 IFNの残在活性（最終希釈1:40）を示す。 第４図：プラスミドTL11含有大腸菌の増殖とIFN生産 TL11プラスミドは本文に示したごとく混成tryp-lacプロ
モーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒトIFN−β１
をコードする配列を含んでいる。細菌を１のニユー・
ブルンスウイツク発酵槽（New Brunswick fermentor）
中で増殖し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロ
ピレングリコールで溶菌し、VSVにヒト細胞を攻撃させ
てIFN活性を測定した。IFN活性は細菌培養物1ml当りで
計算する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ルイセ・チエン イスラエル国ラマツト・アビブ・タゴ− ル・ストリ−ト52 (72)発明者 シエルドン・イスラエル・フエインステ イン アメリカ合衆国コネチカツト州ニユ−・ ヘブン・フア−ンハム・アベニユ−33 (56)参考文献 特開 昭56−154499（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−77654（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−140793（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，Ｖｏ ｌ．９，ｎｏ．３（1981）ｐ．461−471 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．14（1981）ｐ. 137−143 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．287（1980) ｐ．193−197 Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．77，ｎｏ．９ （1980）ｐ．5230−5233
Claims (6)
- 【請求項１】ヒト線維芽細胞型インターフェロンβ１を
コードする配列を含むヒト染色体由来のイントロンを有
しないヒト遺伝子DNA断片をファージに導入し、得られ
るそのファージ組換え体で大腸菌を感染させ、そのよう
な感染大腸菌を培養し、次いでインターフェロンを採取
することを特徴とする、ヒト線維芽細胞型インターフェ
ロンβ１の製造法。 - 【請求項２】ヒト線維芽細胞型インターフェロンβ１を
コードする配列を含むヒト染色体由来のイントロンを有
しないヒト遺伝子DNA断片をファージに導入し、そのフ
ァージからヒト線維芽細胞型インターフェロンβ１をコ
ードする配列を含むDNA断片を採取し、これをヒト線維
芽細胞型インターフェロンβ１の合成を誘導し得るプラ
スミドに導入し、得られるプラスミドを大腸菌に感染
し、そのような感染大腸菌を培養し、次いでインターフ
ェロンを採取することを特徴とする、ヒト線維芽細胞型
インターフェロンβ１の製造法。 - 【請求項３】ファージが以下に示した遺伝子地図を有す
るClone C15を得ることのできるλ−Charon 4Aである、
特許請求の範囲第２項記載の方法： - 【請求項４】ヒト遺伝子DNA断片をファージから採取
し、大腸菌においてヒト線維芽細胞型インターフェロン
β１の合成を誘導することができる強力なプロモーター
を備えたプラスミド発現ベクターに導入する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】プラスミドが大腸菌のrecAプロモーターを
含むPBR322である、特許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】インターフェロンβ１遺伝子を含むヒト遺
伝子DNA断片をファージから取り、対応する成熟型イン
ターフェロンβ１の最初のメチオニンをコードするコド
ンの隣を切断し、トリプトファンプロモーターのRNAポ
リメラーゼ結合部位を含むように改良された大腸菌lac
プロモーターのリボゾーム結合部位に連結し、かくして
混成tryp-lacプロモーターのコントロール下にインター
フェロンβ１遺伝子を含むプラスミドを得、該プラスミ
ドを大腸菌に導入し、該大腸菌を培養してインターフェ
ロンを生産する、特許請求の範囲第２項記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL63327A IL63327A (en) | 1981-07-16 | 1981-07-16 | Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria |
| IL63327 | 1981-07-16 |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4113784A Division JP2500174B2 (ja) | 1981-07-16 | 1992-05-06 | インタ―フェロンの製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5860998A JPS5860998A (ja) | 1983-04-11 |
| JP2501549B2 true JP2501549B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=11052769
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|---|---|---|---|
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| JP4113784A Expired - Lifetime JP2500174B2 (ja) | 1981-07-16 | 1992-05-06 | インタ―フェロンの製造法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4113784A Expired - Lifetime JP2500174B2 (ja) | 1981-07-16 | 1992-05-06 | インタ―フェロンの製造法 |
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| CH (1) | CH664761A5 (ja) |
| DE (1) | DE3226319A1 (ja) |
| FR (1) | FR2509614B1 (ja) |
| GB (1) | GB2103222B (ja) |
| IL (1) | IL63327A (ja) |
| IT (1) | IT1195940B (ja) |
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| JPS5965099A (ja) * | 1982-10-05 | 1984-04-13 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現用プロモ−タ−およびその用途 |
| JPS6054685A (ja) * | 1983-09-02 | 1985-03-29 | Suntory Ltd | 改良発現ベクタ−およびその利用 |
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| US4707445A (en) * | 1984-07-31 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Intact gene and method of excising and cloning same |
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|---|---|---|---|---|
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-
1981
- 1981-07-16 IL IL63327A patent/IL63327A/xx not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-06-23 SE SE8203890A patent/SE464088B/sv not_active Application Discontinuation
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- 1982-07-13 CH CH4268/82A patent/CH664761A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-07-14 DE DE19823226319 patent/DE3226319A1/de active Granted
- 1982-07-15 IT IT22411/82A patent/IT1195940B/it active
- 1982-07-15 CA CA000407391A patent/CA1339829C/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-16 JP JP57124313A patent/JP2501549B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-16 FR FR8212437A patent/FR2509614B1/fr not_active Expired
-
1992
- 1992-05-06 JP JP4113784A patent/JP2500174B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１４（１９８１）ｐ．１３７−１４３ |
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８７（１９８０）ｐ．１９３−１９７ |
| Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．，Ｖｏｌ．９，ｎｏ．３（１９８１）ｐ．４６１−４７１ |
| Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｎｏ．９（１９８０）ｐ．５２３０−５２３３ |
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| IT8222411A1 (it) | 1984-01-15 |
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| GB2103222B (en) | 1985-05-15 |
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| IL63327A (en) | 1985-11-29 |
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| IT1195940B (it) | 1988-11-03 |
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| DE3226319A1 (de) | 1983-02-03 |
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