JP2501549B2 - インタ−フエロンの製造法 - Google Patents
インタ−フエロンの製造法Info
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- JP2501549B2 JP2501549B2 JP57124313A JP12431382A JP2501549B2 JP 2501549 B2 JP2501549 B2 JP 2501549B2 JP 57124313 A JP57124313 A JP 57124313A JP 12431382 A JP12431382 A JP 12431382A JP 2501549 B2 JP2501549 B2 JP 2501549B2
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- interferon
- human
- phage
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はインターフエロン(IFN)の製造法に関す
る。さらに詳細には、本発明はヒト遺伝子DNAの断片を
導入した適当な細菌によつて線維芽細胞(β)型または
白血球(α)型のヒトインターフエロンの大量生産方法
に関する。血球から直接取つたヒトDNAは適当なλ−フ
アージにクローン化される。この組換え体λ−フアージ
によつて感染された細菌中に高インターフエロン生産が
得られ、そのインターフエロンはこの感染によつて生じ
る細菌溶菌液から採取および精製することができる。遺
伝子DNAはまたプラスミド発現ベクターを介して導入さ
れた細菌中で発現される。
る。さらに詳細には、本発明はヒト遺伝子DNAの断片を
導入した適当な細菌によつて線維芽細胞(β)型または
白血球(α)型のヒトインターフエロンの大量生産方法
に関する。血球から直接取つたヒトDNAは適当なλ−フ
アージにクローン化される。この組換え体λ−フアージ
によつて感染された細菌中に高インターフエロン生産が
得られ、そのインターフエロンはこの感染によつて生じ
る細菌溶菌液から採取および精製することができる。遺
伝子DNAはまたプラスミド発現ベクターを介して導入さ
れた細菌中で発現される。
発明の背景 インターフエロン、とくにヒトインターフエロンは多
分野で重要性を増しつつあるが、その生産は困難で、生
産方法の改良が非常に重要になつている。
分野で重要性を増しつつあるが、その生産は困難で、生
産方法の改良が非常に重要になつている。
大腸菌(E.coli)のような細菌における哺乳動物遺
伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配列を中断する介在配
列の存在により妨げられる。しかしながら、イントロン
を持たない遺伝子もかなり存在する。最近、ナガタら
(Nagata et al)(1980)〔Nature 287,401-8〕はヒ
トの白血球インターフエロン−α遺伝子がイントロンを
欠くものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内で
のこれら遺伝子の低レベル発現を見出した。
伝子の発現は、通常遺伝子の暗号配列を中断する介在配
列の存在により妨げられる。しかしながら、イントロン
を持たない遺伝子もかなり存在する。最近、ナガタら
(Nagata et al)(1980)〔Nature 287,401-8〕はヒ
トの白血球インターフエロン−α遺伝子がイントロンを
欠くものの一つであることを示した。彼等は大腸菌内で
のこれら遺伝子の低レベル発現を見出した。
二重鎖RNAによつて誘導されたヒト二倍体線維芽細胞
は少なくともインターフエロンをコードする2つのmRNA
を含んでいる〔ワイゼンバツハら(Weissenbach et a
l.)、1980、(PNAS)77,7152-7156〕。0.9キロベース
(Kb)長(11S)のmRNAはこれら細胞により生産される
主インターフエロン種IFN−β1に相当するが、そのア
ミノ酸配列は部分的に決定されている〔ナイトら(Knig
ht et al.,)1980,Science 207,325-6〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドpBR322を用い、このIFN−β1 mR
NAのcDNAを介するクローニングが達成された〔ゲツデル
ら(Goeddel et al.),1980,Nucleic Acid Res.,8,40
57-4075〕。これらDNAクローンのヌクレオチド配列は決
定された蛋白質配列に相当し、発現プラスミド生成後、
IFN−β1 cDNAは大腸菌内でのヒトインターフエロンの
合成を指令していると証明された。
は少なくともインターフエロンをコードする2つのmRNA
を含んでいる〔ワイゼンバツハら(Weissenbach et a
l.)、1980、(PNAS)77,7152-7156〕。0.9キロベース
(Kb)長(11S)のmRNAはこれら細胞により生産される
主インターフエロン種IFN−β1に相当するが、そのア
ミノ酸配列は部分的に決定されている〔ナイトら(Knig
ht et al.,)1980,Science 207,325-6〕。ベクターと
して大腸菌プラスミドpBR322を用い、このIFN−β1 mR
NAのcDNAを介するクローニングが達成された〔ゲツデル
ら(Goeddel et al.),1980,Nucleic Acid Res.,8,40
57-4075〕。これらDNAクローンのヌクレオチド配列は決
定された蛋白質配列に相当し、発現プラスミド生成後、
IFN−β1 cDNAは大腸菌内でのヒトインターフエロンの
合成を指令していると証明された。
本発明者らは、IFN−β1遺伝子〔モーリイら(Mory
et al.),1981,Eur.J.Biochem.,120,197-202〕ならび
にIFN−αC遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単離した。
これらの遺伝子はイントロンを欠き、従つて大腸菌内で
直接発現させることができる。
et al.),1981,Eur.J.Biochem.,120,197-202〕ならび
にIFN−αC遺伝子を担うヒト遺伝子断片を単離した。
これらの遺伝子はイントロンを欠き、従つて大腸菌内で
直接発現させることができる。
発明の要約 本発明は、ヒト血球から抽出したヒト遺伝子DNAの特
定断片をバクテリオフアージベクターにクローン化しそ
れを直接利用して細菌内でIFNを合成させるようにし、
その細菌を培養してインターフエロンを生産する方法に
関する。従つて、この方法では長い工程は必要なく、mR
NAから全長の相補的DNA(cDNA)をクローニングする必
要がない。本発明に従えば、適当なDNA断片を容易に入
手し得る白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−フ
アージベクターにクローン化する。目的のIFN遺伝子は
イントロンで中断されておらず、細菌内でIFN合成を指
示できる。
定断片をバクテリオフアージベクターにクローン化しそ
れを直接利用して細菌内でIFNを合成させるようにし、
その細菌を培養してインターフエロンを生産する方法に
関する。従つて、この方法では長い工程は必要なく、mR
NAから全長の相補的DNA(cDNA)をクローニングする必
要がない。本発明に従えば、適当なDNA断片を容易に入
手し得る白血球のようなヒト細胞から直接取り、λ−フ
アージベクターにクローン化する。目的のIFN遺伝子は
イントロンで中断されておらず、細菌内でIFN合成を指
示できる。
IFN−β1遺伝子またはIFN−αC遺伝子を挿入したヒ
トDNAを含む組換え体λフアージによつて大腸菌のよう
な適当な細菌を感染させることにより高IFN活性を生産
した。IFNを感染によつて生じる細菌溶解液から採取、
精製した。フアージは細菌にヒトDNA断片を導入するた
めの適当なベクターであることを見出した。とくにλ C
haron 4 Aフアージは優れており、高IFN生産をもたらし
た。さらに本発明は強いプロモーターを備えたプラスミ
ド発現ベクターへのクローン化したヒト遺伝子DNA断片
の導入に関する。この方法はイントロンを欠くものであ
ればIFN−β1同様IFN−αでも実施できる。
トDNAを含む組換え体λフアージによつて大腸菌のよう
な適当な細菌を感染させることにより高IFN活性を生産
した。IFNを感染によつて生じる細菌溶解液から採取、
精製した。フアージは細菌にヒトDNA断片を導入するた
めの適当なベクターであることを見出した。とくにλ C
haron 4 Aフアージは優れており、高IFN生産をもたらし
た。さらに本発明は強いプロモーターを備えたプラスミ
ド発現ベクターへのクローン化したヒト遺伝子DNA断片
の導入に関する。この方法はイントロンを欠くものであ
ればIFN−β1同様IFN−αでも実施できる。
一実施態様において、ヒト成人からのDNAをEcoRI消化
で断片化しλ Charon 4 Aにクローン化した。そのよう
にして得られたクローンをClone C 15と名付けた。その
クローンには約17KbのヒトDNAが挿入されており、ま
た、それは線維芽細胞インターフエロンIFN−β1に対
応する遺伝子を含んでいると同定した。制限地図作成は
1.8KbのEcoRI断片上に位置するこの遺伝子がイントロン
によつて中断されていないことを示した。このヒト遺伝
子DNA断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトIFN−β1の合成を指令することができる。フアー
ジ溶菌液から高IFN活性が回収される。一定条件下で、1
07単位/l程度の活性をフアージ溶菌液から回収した。溶
菌液をクロマトグラフイー、好ましくはシバクロン・ブ
ルー・セフアロース(Cibacron Blue Sepharose)ある
いは同様のカラムにかける。かくして得られたインター
フエロンはヒト線維芽細胞が生産するIFNと同じ免疫学
的性質および種特異性を有している。13Kbのヒト遺伝子
断片を含むクローン18-3中に同定された遺伝子、IFN−
αCで同様の結果を得た。
で断片化しλ Charon 4 Aにクローン化した。そのよう
にして得られたクローンをClone C 15と名付けた。その
クローンには約17KbのヒトDNAが挿入されており、ま
た、それは線維芽細胞インターフエロンIFN−β1に対
応する遺伝子を含んでいると同定した。制限地図作成は
1.8KbのEcoRI断片上に位置するこの遺伝子がイントロン
によつて中断されていないことを示した。このヒト遺伝
子DNA断片は大腸菌や他の適当な細菌内で活性を有する
ヒトIFN−β1の合成を指令することができる。フアー
ジ溶菌液から高IFN活性が回収される。一定条件下で、1
07単位/l程度の活性をフアージ溶菌液から回収した。溶
菌液をクロマトグラフイー、好ましくはシバクロン・ブ
ルー・セフアロース(Cibacron Blue Sepharose)ある
いは同様のカラムにかける。かくして得られたインター
フエロンはヒト線維芽細胞が生産するIFNと同じ免疫学
的性質および種特異性を有している。13Kbのヒト遺伝子
断片を含むクローン18-3中に同定された遺伝子、IFN−
αCで同様の結果を得た。
他の実施態様では、IFN−β1あるいはIFN−αC遺伝
子を含むヒト遺伝子DNA断片を大腸菌のrec Aプロモータ
ーを含むプラスミドpBR322のようなプラスミドに導入し
た。これらの組換え体プラスミドによつて形質転換され
た大腸菌の培養で、ナリジクス酸(nalidixic acid)に
よりrec Aプロモーターを誘導したとき、著量のIFN−β
あるいはIFN−αが生産された。IFN−β1遺伝子断片を
成熟IFN−β1の最初のメチニオンに対応するコドンの
隣りで切り大腸菌lacプロモーターのリボゾーム結合部
位に連結した。このlacプロモーターをトリプトフアン
プロモーターのRNAポリメラーゼ結合部位を含むように
改良した。この混成tryp-lacプロモーターにより、遺伝
子IFN−β1DNAは大腸菌ミニセル株p679-54内で108単位
/lのIFN−β1を生産することができた。同様にIFN−α
C遺伝子をtryp-lacプロモーターに適切に継ぐことによ
り充分量のIFN−αCを得た。いずれの場合も、IFN活性
はリゾチームと30%プロピレングリコールで溶菌した細
菌細胞から回収し、フアージ溶菌液のときと同様疎水性
クロマトグラフ担体上で精製した。IFN−β1の好適な
担体はシバクロン・ブルー・セフアロース(Cibacron B
lue Sepharose)である。溶出はエチレングリコールや
好ましくはプロピレングリコールで行なうことができ
る。IFN−β1あるいはαCの精製は、さらにモノクロ
ナール抗体カラム上の免疫親和性クロマトグラフイある
いは他の常法によつて行なわれる。
子を含むヒト遺伝子DNA断片を大腸菌のrec Aプロモータ
ーを含むプラスミドpBR322のようなプラスミドに導入し
た。これらの組換え体プラスミドによつて形質転換され
た大腸菌の培養で、ナリジクス酸(nalidixic acid)に
よりrec Aプロモーターを誘導したとき、著量のIFN−β
あるいはIFN−αが生産された。IFN−β1遺伝子断片を
成熟IFN−β1の最初のメチニオンに対応するコドンの
隣りで切り大腸菌lacプロモーターのリボゾーム結合部
位に連結した。このlacプロモーターをトリプトフアン
プロモーターのRNAポリメラーゼ結合部位を含むように
改良した。この混成tryp-lacプロモーターにより、遺伝
子IFN−β1DNAは大腸菌ミニセル株p679-54内で108単位
/lのIFN−β1を生産することができた。同様にIFN−α
C遺伝子をtryp-lacプロモーターに適切に継ぐことによ
り充分量のIFN−αCを得た。いずれの場合も、IFN活性
はリゾチームと30%プロピレングリコールで溶菌した細
菌細胞から回収し、フアージ溶菌液のときと同様疎水性
クロマトグラフ担体上で精製した。IFN−β1の好適な
担体はシバクロン・ブルー・セフアロース(Cibacron B
lue Sepharose)である。溶出はエチレングリコールや
好ましくはプロピレングリコールで行なうことができ
る。IFN−β1あるいはαCの精製は、さらにモノクロ
ナール抗体カラム上の免疫親和性クロマトグラフイある
いは他の常法によつて行なわれる。
上記から、ヒト遺伝子DNA断片が大腸菌および他の適
当な宿主細菌中でヒトIFNを高収率で生産するために使
えることは明らかである。
当な宿主細菌中でヒトIFNを高収率で生産するために使
えることは明らかである。
上述のごとく、本発明の方法は、ヒト遺伝子DNAの断
片をフアージのような適当なベクターに導入し、細菌培
養物を該フアージで感染させることにより溶菌させ、溶
菌物中の生成インターフエロンを採取することからな
る。本発明はヒト遺伝子DNAの導入によつて得られる新
規フアージ、とくにIFN−β2の生成に関与するclone C
15,IFN−αCの生成に関与するクローン18.3のような
λ−型の組換え体フアージに関する。さらに本発明はヒ
ト遺伝子DNAを適当なフアージに導入し、該フアージか
ら適当なDNA断片を採取し、これを適当な細菌の発現プ
ラスミドに導入し、該細菌を培養して目的とするインタ
ーフエロンを採取することからなるインターフエロンの
製造法に関する。本発明の他の目的は下記詳細な記載か
ら明らかになるが、該記載は本発明を制限するものでは
ない。
片をフアージのような適当なベクターに導入し、細菌培
養物を該フアージで感染させることにより溶菌させ、溶
菌物中の生成インターフエロンを採取することからな
る。本発明はヒト遺伝子DNAの導入によつて得られる新
規フアージ、とくにIFN−β2の生成に関与するclone C
15,IFN−αCの生成に関与するクローン18.3のような
λ−型の組換え体フアージに関する。さらに本発明はヒ
ト遺伝子DNAを適当なフアージに導入し、該フアージか
ら適当なDNA断片を採取し、これを適当な細菌の発現プ
ラスミドに導入し、該細菌を培養して目的とするインタ
ーフエロンを採取することからなるインターフエロンの
製造法に関する。本発明の他の目的は下記詳細な記載か
ら明らかになるが、該記載は本発明を制限するものでは
ない。
本発明の重要な利点は健康人あるいは病人から得た遺
伝子のIFN生産性を比較して、IFN生産における遺伝的欠
陥を研究することができることにある。
伝子のIFN生産性を比較して、IFN生産における遺伝的欠
陥を研究することができることにある。
材料および方法 ヒト遺伝子ライブラリー(human gene library)の調
製: 高分子量DNAをβ−地中海貧血(β−thalassemia)の
成人の末梢血球から調製した。DNAの一部(40μg)をE
coRIの100,200,300単位で30分間別個に消化し、65℃で1
0分間加熱し、前述したように一緒に10〜40%蔗糖勾配
にかけた。10〜20Kbの間のDNA断片を、マニアテイスら
(Maniatis et al.)〔1978,セル(Cell)15,687-70
1〕の方法に従つてEcoRI消化により調製したλ Charon
4 A DNAアームに、モリイら(Mory et al.)〔1980,M
ol.Biol.Reports 6,203-208〕の記述に従つてT4DNAリガ
ーゼで連結した。
製: 高分子量DNAをβ−地中海貧血(β−thalassemia)の
成人の末梢血球から調製した。DNAの一部(40μg)をE
coRIの100,200,300単位で30分間別個に消化し、65℃で1
0分間加熱し、前述したように一緒に10〜40%蔗糖勾配
にかけた。10〜20Kbの間のDNA断片を、マニアテイスら
(Maniatis et al.)〔1978,セル(Cell)15,687-70
1〕の方法に従つてEcoRI消化により調製したλ Charon
4 A DNAアームに、モリイら(Mory et al.)〔1980,M
ol.Biol.Reports 6,203-208〕の記述に従つてT4DNAリガ
ーゼで連結した。
試験管内パツケージング(packaging)は、ホーンお
よびマレイ(Hohn and Murray)〔1977,PNAS,.74,3259-
3263〕の記述に従い、連結反応液(0.5μgのベクターD
NAおよび0.125μgのヒトDNA)8μl数部を大腸菌BHB
2688〔N 205 recA-(λ imm 434 cIts b 2 red 3 Eam 4
Sam 7)/λ〕とBHB 2690〔N205 recA-(λ imm 434 c
Its b 2 red 3 Dam 15 Sam 7)/λ〕の抽出物50μlと
混合することにより行なつた。
よびマレイ(Hohn and Murray)〔1977,PNAS,.74,3259-
3263〕の記述に従い、連結反応液(0.5μgのベクターD
NAおよび0.125μgのヒトDNA)8μl数部を大腸菌BHB
2688〔N 205 recA-(λ imm 434 cIts b 2 red 3 Eam 4
Sam 7)/λ〕とBHB 2690〔N205 recA-(λ imm 434 c
Its b 2 red 3 Dam 15 Sam 7)/λ〕の抽出物50μlと
混合することにより行なつた。
組換え体DNA 1μg当り3×105pfuが得られた。一方
手をつけていないλ DNAでは108pfu/μgであつた。総
量で1.8×106の組換え体フアージを10mM Tris-HCl(pH
7.5),10mM MgSO4および0.01%ゼラチンを含む液6mlで
希釈した。0.1mlのクロロホルムを加え、破砕物をミク
ロフユージ(microfuge)遠心にて除き、フアージを大
腸菌DP50〔レーダーら(Leder et al.)1977,Science
196,175-177)に4×103pfu/15cmプレートの割で植え
て105倍に増やした。選別のために2×104pfuを15cmの
プレートに植え、二枚のニトロセルロースフイルター
に、ベントンら(Benton et al.)〔1977,Science 19
6,180-182)〕の記述に従つて、つづけて写した。この
操作はP3の封じ込め条件のもとに行なつた。
手をつけていないλ DNAでは108pfu/μgであつた。総
量で1.8×106の組換え体フアージを10mM Tris-HCl(pH
7.5),10mM MgSO4および0.01%ゼラチンを含む液6mlで
希釈した。0.1mlのクロロホルムを加え、破砕物をミク
ロフユージ(microfuge)遠心にて除き、フアージを大
腸菌DP50〔レーダーら(Leder et al.)1977,Science
196,175-177)に4×103pfu/15cmプレートの割で植え
て105倍に増やした。選別のために2×104pfuを15cmの
プレートに植え、二枚のニトロセルロースフイルター
に、ベントンら(Benton et al.)〔1977,Science 19
6,180-182)〕の記述に従つて、つづけて写した。この
操作はP3の封じ込め条件のもとに行なつた。
IFN−β1 cDNAプローブの調製: 100μg/mlポリ(rI):(rC)と50μg/mlシクロヘキ
シイミド(最後の1時間は2μg/mlアクチノマイシンD
を含む)によつて4時間誘導したヒト包皮線維芽細胞F
S 11からポリA+を調製し、ワイゼンバツハら(Weissenb
ach et al.)〔1980,PNAS 77,7152-7156:1979,(Eur.
J.Biochem.)98,1−8〕によつて詳述された蔗糖勾配遠
心分離によつてインターフエロンmRNAの2つのピークを
分画した。11 SのmRNA(1.5μg)を使いトリ背髄芽球
症ウイルス(Avian myeloblastosis virus)(J.Bear
d)由来逆転写酵素およびオリゴ(dT)とともに先のワ
イゼンバツハら(Weissenbach et al.)〔1980,PNAS
77,7152-7156〕の方法に従つてRNA-cDNAハイブリツドを
調製した。このRNA-cDNAハイブリツドをハイブリツドの
鎖延長のためのdCTPおよびdG−鎖延長しPstI切断したpB
R322ベクター〔チヤンら(Chang et al.),1978,Natu
re 275,617-624〕を用い、ザインら(Zain et al.)
〔1979,Cell 16,851-861〕に従つて直接クローン化し
た。ステンランドら(Stenlund et al.)〔1980,Gene
10,47-52〕によつて概説されたようにして総数12,500
のtetrampsの大腸菌M M 294形質転換株を得た。誘導し
たF S 11細胞の11 SmRNA(6μg)または非誘導細胞の
総ポリA+‐RNA(3.7μg)から転写した32p-cDNAプロー
ブでコロニーハイブリッド化(colony hybridization)
を行なつた。cDNA合成は、合成相補プライマー〔ナラン
グら(Narang et al.),1979,Methods Enzymol.68,90
-98参照〕であり、IFN−β1配列のBgl II部位を含む
5′ GAGATCTTCAGTTTC 3′で開始した。32P‐5′末端
ラベル〔ヒユートンら(Houghton et al.),1980,Nuc
l.Ac.Res 8,1913-1931〕したプライマーを用いて、予期
した640ヌクレオチド長のcDNAがみられるのは誘導したR
NAを鋳型として用いたときだけであつた。プローブを調
製するために、20 p molesのプライマーを4μlの0.4M
KCl中で30℃60分間各RNAとアニール(anneal)し、各20
0μCiの32p−α−dATPとdCTP(両方で400Ci/m mol)、
各0.5mMのdGTPとdTTP、50mM Tris-HCl(pH8.3)、4mM M
gCl2、5mMジチオスレイトール、50μg/mlアクチノマイ
シンD、4mMピロ燐酸および30単位の逆転写酵素の混液2
5μl中37℃で2時間インキュベートした。25μgの大
腸菌DNAを加えた後、0.3N NaOHで70℃60分間処理して反
応を中和し、50mM Tris-HCl(pH8)、0.1M NaCl、10mM
EDTA、0.5%ドデシル硫酸中セフアデツクスG-50(Sepha
dex G-50)を通して過した。各RNAから5×106cpm cD
NAを得た。ニトロセルローズフイルター上に生育したコ
ロニーを固定し、DNAをサイヤー(Thayer)〔1979,Ana
l.Biochem.98,60-63〕の記述に従つて変性させた。各フ
イルターを6×SET〔SET=150mM NaCl、2mM EDTA、30mM
Tris-HCl(pH8)〕、10×デンハルツ溶液(Denhardt′
s solution)〔デンハルト(Denhardt)1966,Biochem.B
iophys.Res.Comm.23,641-646)〕,0.1%ピロリン酸ソー
ダ、0.1%ドデシル硫酸、50μg/ml変性大腸菌DNAの混液
10mlを使い67℃で4時間プレハイブリツド化した。フイ
ルターを各0.5×106cpm/フイルターの二つの32P-cDNA
プローブ、10μg/mlのポリAおよび2.5μg/mlのポリC
を有する同じ溶液中で67℃、14-18時間ハイブリツド化
した。プレハイブリツド化溶液中で67℃、1時間、次に
3×SET、0.1%ピロリン酸、0.1%ドデシル硫酸で67
℃、30分間3回以上、ついで4×SETで25℃、60分間フ
イルターを洗浄した〔マニアテイス(Maniatis)1978、
セルCell 15,687-701参照〕。フイルターを乾燥させ、
増感紙をもつたAgfa Curix X-rayフイルムに−70℃で1
−2日間感光させた。
シイミド(最後の1時間は2μg/mlアクチノマイシンD
を含む)によつて4時間誘導したヒト包皮線維芽細胞F
S 11からポリA+を調製し、ワイゼンバツハら(Weissenb
ach et al.)〔1980,PNAS 77,7152-7156:1979,(Eur.
J.Biochem.)98,1−8〕によつて詳述された蔗糖勾配遠
心分離によつてインターフエロンmRNAの2つのピークを
分画した。11 SのmRNA(1.5μg)を使いトリ背髄芽球
症ウイルス(Avian myeloblastosis virus)(J.Bear
d)由来逆転写酵素およびオリゴ(dT)とともに先のワ
イゼンバツハら(Weissenbach et al.)〔1980,PNAS
77,7152-7156〕の方法に従つてRNA-cDNAハイブリツドを
調製した。このRNA-cDNAハイブリツドをハイブリツドの
鎖延長のためのdCTPおよびdG−鎖延長しPstI切断したpB
R322ベクター〔チヤンら(Chang et al.),1978,Natu
re 275,617-624〕を用い、ザインら(Zain et al.)
〔1979,Cell 16,851-861〕に従つて直接クローン化し
た。ステンランドら(Stenlund et al.)〔1980,Gene
10,47-52〕によつて概説されたようにして総数12,500
のtetrampsの大腸菌M M 294形質転換株を得た。誘導し
たF S 11細胞の11 SmRNA(6μg)または非誘導細胞の
総ポリA+‐RNA(3.7μg)から転写した32p-cDNAプロー
ブでコロニーハイブリッド化(colony hybridization)
を行なつた。cDNA合成は、合成相補プライマー〔ナラン
グら(Narang et al.),1979,Methods Enzymol.68,90
-98参照〕であり、IFN−β1配列のBgl II部位を含む
5′ GAGATCTTCAGTTTC 3′で開始した。32P‐5′末端
ラベル〔ヒユートンら(Houghton et al.),1980,Nuc
l.Ac.Res 8,1913-1931〕したプライマーを用いて、予期
した640ヌクレオチド長のcDNAがみられるのは誘導したR
NAを鋳型として用いたときだけであつた。プローブを調
製するために、20 p molesのプライマーを4μlの0.4M
KCl中で30℃60分間各RNAとアニール(anneal)し、各20
0μCiの32p−α−dATPとdCTP(両方で400Ci/m mol)、
各0.5mMのdGTPとdTTP、50mM Tris-HCl(pH8.3)、4mM M
gCl2、5mMジチオスレイトール、50μg/mlアクチノマイ
シンD、4mMピロ燐酸および30単位の逆転写酵素の混液2
5μl中37℃で2時間インキュベートした。25μgの大
腸菌DNAを加えた後、0.3N NaOHで70℃60分間処理して反
応を中和し、50mM Tris-HCl(pH8)、0.1M NaCl、10mM
EDTA、0.5%ドデシル硫酸中セフアデツクスG-50(Sepha
dex G-50)を通して過した。各RNAから5×106cpm cD
NAを得た。ニトロセルローズフイルター上に生育したコ
ロニーを固定し、DNAをサイヤー(Thayer)〔1979,Ana
l.Biochem.98,60-63〕の記述に従つて変性させた。各フ
イルターを6×SET〔SET=150mM NaCl、2mM EDTA、30mM
Tris-HCl(pH8)〕、10×デンハルツ溶液(Denhardt′
s solution)〔デンハルト(Denhardt)1966,Biochem.B
iophys.Res.Comm.23,641-646)〕,0.1%ピロリン酸ソー
ダ、0.1%ドデシル硫酸、50μg/ml変性大腸菌DNAの混液
10mlを使い67℃で4時間プレハイブリツド化した。フイ
ルターを各0.5×106cpm/フイルターの二つの32P-cDNA
プローブ、10μg/mlのポリAおよび2.5μg/mlのポリC
を有する同じ溶液中で67℃、14-18時間ハイブリツド化
した。プレハイブリツド化溶液中で67℃、1時間、次に
3×SET、0.1%ピロリン酸、0.1%ドデシル硫酸で67
℃、30分間3回以上、ついで4×SETで25℃、60分間フ
イルターを洗浄した〔マニアテイス(Maniatis)1978、
セルCell 15,687-701参照〕。フイルターを乾燥させ、
増感紙をもつたAgfa Curix X-rayフイルムに−70℃で1
−2日間感光させた。
選別にかけた3,500コロニーのうち、14個が誘導したm
RNAから鋳型化したcDNAに優先的にハイブリツド化し、1
30個が非誘導mRNAの鋳型化したcDNAにもハイブリツド化
した。最初の群からのプラスミドのDNA(0.3μg)を、
6×SSC、10×デンハルツ溶液中5′−末端32Pラベルし
たプライマー(0.3 p moles,4×106cpm)でフイルター
〔カフアトスら(Kafatos et al.)1979,Nucl.Ac.Re
s.7,1541-1552〕上に35℃で21時間ハイブリツド化し、
ついで35℃で6×SSC(900mM NaCl,90mMクエン酸ソー
ダ)で洗浄した。クローンI−6−5は強度の陽性でDN
A配列決定〔マキサムら(Maxam et al.)1980,Method
s Enzymol,65,499-560〕によりそのクローンがIFN−β
1配列の3′−末端から約370ヌクレオチドを含んでい
ることがわかつた。蔗糖勾配精製した誘導mRNA由来dC鎖
延長二重鎖DNA(dC-tailed dS-DNA)をpBR322のPst I部
位に導入することによつて前記のように調製した他の5
0,000のクローンを選別した:IFN−β1クローンの割合
は0.16%(80クローン)であるのに比べてIFN−β2ク
ローンの割合は0.65%であることがわかつた。
RNAから鋳型化したcDNAに優先的にハイブリツド化し、1
30個が非誘導mRNAの鋳型化したcDNAにもハイブリツド化
した。最初の群からのプラスミドのDNA(0.3μg)を、
6×SSC、10×デンハルツ溶液中5′−末端32Pラベルし
たプライマー(0.3 p moles,4×106cpm)でフイルター
〔カフアトスら(Kafatos et al.)1979,Nucl.Ac.Re
s.7,1541-1552〕上に35℃で21時間ハイブリツド化し、
ついで35℃で6×SSC(900mM NaCl,90mMクエン酸ソー
ダ)で洗浄した。クローンI−6−5は強度の陽性でDN
A配列決定〔マキサムら(Maxam et al.)1980,Method
s Enzymol,65,499-560〕によりそのクローンがIFN−β
1配列の3′−末端から約370ヌクレオチドを含んでい
ることがわかつた。蔗糖勾配精製した誘導mRNA由来dC鎖
延長二重鎖DNA(dC-tailed dS-DNA)をpBR322のPst I部
位に導入することによつて前記のように調製した他の5
0,000のクローンを選別した:IFN−β1クローンの割合
は0.16%(80クローン)であるのに比べてIFN−β2ク
ローンの割合は0.65%であることがわかつた。
上記したFS-11 mRNAから調製されたクローンIFN−β
1 I−6−5はヒトライブラリーを選別するのに使われ
た。
1 I−6−5はヒトライブラリーを選別するのに使われ
た。
遺伝子クローン:IFN−β1クローン15の単離 リグビイら(Rigby et al.)〔1977,J.Mol.Biol.,1
13,237-251〕に従い、IFN−β1 cDNAからのプラスミド
DNAをニツクトランスレーシヨンによつて2×108cpm/
μg DNAに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに106cpm/
フイルターでハイブリツド化した。フイルターの調製、
DNA変性およびハイブリツド化操作は上記のごとく行な
つた。ハイブリツド化陽性のプラークからのフアージを
9cmプレートに1−2×102pfuの濃度で再び植え、再選
別を行なつた。この操作を3回繰返してプレート上のプ
ラークの95%以上をIFN−β1 cDNAにハイブリツド化し
た。フアージクローンC15をそのプラークの一つから単
離した。
13,237-251〕に従い、IFN−β1 cDNAからのプラスミド
DNAをニツクトランスレーシヨンによつて2×108cpm/
μg DNAに標識し、ヒト遺伝子ライブラリーに106cpm/
フイルターでハイブリツド化した。フイルターの調製、
DNA変性およびハイブリツド化操作は上記のごとく行な
つた。ハイブリツド化陽性のプラークからのフアージを
9cmプレートに1−2×102pfuの濃度で再び植え、再選
別を行なつた。この操作を3回繰返してプレート上のプ
ラークの95%以上をIFN−β1 cDNAにハイブリツド化し
た。フアージクローンC15をそのプラークの一つから単
離した。
フアージをブラトナーら(Blattner et al.)〔197
7,Science 196,161-169〕の記述に従い液体培地に増殖
させた。大腸菌DP50を1%トリプトン、0.5% NaCl、0.
5%酵母エキス、0.2%マルトース、0.25% MgSO4、0.0
1%ジアミノピメリン酸、0.004%チミジンで一夜増殖さ
せた。約0.3mlの培養物を前吸着のために10mM MgSO4、1
0mM CaCl2および107フアージの混液0.3mlと37℃で20分
間混合した。その培養物を2lフラスコ中1% NZアミ
ン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl、0.1%カザミノ酸、
0.25% MgSO4、0.01%ジアミノピメリン酸および0.004
%チミジンを含み予備加熱した培地500mlで希釈し、よ
く通気しながら、37℃で15-18時間インキユベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールGSAローター
(Sorvall GSA rotor)中、冷却下7,000rpmで15分間遠
心分離して除いた。この清澄溶菌液からフアージを7%
ポリエチレングリコール6000で沈澱させ、続いて2回塩
化セシウム勾配を行つて精製した。フアージC15 DNAを
フエノール精製し、その構造を、制限酵素消化、および
20mMトリス塩基、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA中、0.
5μg/mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型アガロ
ースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースフイ
ルター〔サザーン(Southern),1975,J.Mol.Biol.98,50
3-517〕への転写および上記したニツク−トランスレー
シヨン化したIFN−β1 cDNAへのハイブリツド化を行な
つた。C15 DNAのEcoRI断片をプラスミドの正確な制限地
図作成のためにpBR322のEcoRI部位に確立した操作〔ボ
リバー(Bolivar),1979,Methods Enzymol.68,245-267
参照〕に従つて二次クローン化した。
7,Science 196,161-169〕の記述に従い液体培地に増殖
させた。大腸菌DP50を1%トリプトン、0.5% NaCl、0.
5%酵母エキス、0.2%マルトース、0.25% MgSO4、0.0
1%ジアミノピメリン酸、0.004%チミジンで一夜増殖さ
せた。約0.3mlの培養物を前吸着のために10mM MgSO4、1
0mM CaCl2および107フアージの混液0.3mlと37℃で20分
間混合した。その培養物を2lフラスコ中1% NZアミ
ン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl、0.1%カザミノ酸、
0.25% MgSO4、0.01%ジアミノピメリン酸および0.004
%チミジンを含み予備加熱した培地500mlで希釈し、よ
く通気しながら、37℃で15-18時間インキユベートし
た。溶菌完了後、細胞破砕物をソルバールGSAローター
(Sorvall GSA rotor)中、冷却下7,000rpmで15分間遠
心分離して除いた。この清澄溶菌液からフアージを7%
ポリエチレングリコール6000で沈澱させ、続いて2回塩
化セシウム勾配を行つて精製した。フアージC15 DNAを
フエノール精製し、その構造を、制限酵素消化、および
20mMトリス塩基、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA中、0.
5μg/mlエチジウム・ブロマイドを用いる水平型アガロ
ースゲル電気泳動により分析し、ニトロセルロースフイ
ルター〔サザーン(Southern),1975,J.Mol.Biol.98,50
3-517〕への転写および上記したニツク−トランスレー
シヨン化したIFN−β1 cDNAへのハイブリツド化を行な
つた。C15 DNAのEcoRI断片をプラスミドの正確な制限地
図作成のためにpBR322のEcoRI部位に確立した操作〔ボ
リバー(Bolivar),1979,Methods Enzymol.68,245-267
参照〕に従つて二次クローン化した。
フアージ溶菌液中のインターフエロン活性分析 上記のごとく調製した清澄フアージIFN−β1 C15溶
菌液をリン酸緩衝化した食塩水(PBS)に7時間透析し
た。透析液10mlをCibacron Blue-Sepharose CL 6 B〔Ph
armacia Fine Chem.〕の0.3mlカラム上に乗せた。カラ
ムを10-15mlの1M NaCl、0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.2)、ついで洗液中50%プロピレン・グリコール1
0mlで洗浄した。画分(0.5ml)を集め4℃で保存した。
場合により0.1%ヒト血清アルブミンを安定化の為に加
えた。ワイゼンバツハら(Weissenbach et al.)〔19
79,Eur.J.Biochem.98,1−8〕の記述に従い、各画分を9
5−ウエル・ミクロプレートに連続的に希釈してインタ
ーフエロン活性を分析した。各ウエルには2−3×104F
S 11ヒト線維芽細胞を含む0.1mlのミニマム・エツセン
シヤル・メデイウム(Minimum Essential Medium,Gibc
o),5%胎生子牛血清(FCS),0.5%ゲンタミシンを入れ
た。37℃、18時間後、培地を取り、水胞性口炎ウイルス
(vesicular stomatitis virus,VSV)を2% FCS含有培
地に1 pfu/細胞で加えた。細胞変性効果(cytopathic e
ffect)の阻害を、IFN−β NIH標準G 023-902-527と比
較して、感染後30〜40時間記録した。また抗ウイルス活
性は、先に記述したごとく〔ワイゼンバツハら(Weisse
nbach et al.),1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕,VSV
感染後の、3H−ウリジン取込みの減少によつて測つた。
IFN−βの抗血清はウサギから得、先のごとく〔Weissen
bach et al.,1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕分析し
た。中和試験のために、0.1mlの抗血清(力価104単位/m
l)あるいは非免疫血清をPBS中蛋白A−セフアローズビ
ーズ(protein A-Sepharose beads)(Pharmacia Fine
Chem.)の50%懸濁液0.2mlと37℃で1時間混合した。
菌液をリン酸緩衝化した食塩水(PBS)に7時間透析し
た。透析液10mlをCibacron Blue-Sepharose CL 6 B〔Ph
armacia Fine Chem.〕の0.3mlカラム上に乗せた。カラ
ムを10-15mlの1M NaCl、0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.2)、ついで洗液中50%プロピレン・グリコール1
0mlで洗浄した。画分(0.5ml)を集め4℃で保存した。
場合により0.1%ヒト血清アルブミンを安定化の為に加
えた。ワイゼンバツハら(Weissenbach et al.)〔19
79,Eur.J.Biochem.98,1−8〕の記述に従い、各画分を9
5−ウエル・ミクロプレートに連続的に希釈してインタ
ーフエロン活性を分析した。各ウエルには2−3×104F
S 11ヒト線維芽細胞を含む0.1mlのミニマム・エツセン
シヤル・メデイウム(Minimum Essential Medium,Gibc
o),5%胎生子牛血清(FCS),0.5%ゲンタミシンを入れ
た。37℃、18時間後、培地を取り、水胞性口炎ウイルス
(vesicular stomatitis virus,VSV)を2% FCS含有培
地に1 pfu/細胞で加えた。細胞変性効果(cytopathic e
ffect)の阻害を、IFN−β NIH標準G 023-902-527と比
較して、感染後30〜40時間記録した。また抗ウイルス活
性は、先に記述したごとく〔ワイゼンバツハら(Weisse
nbach et al.),1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕,VSV
感染後の、3H−ウリジン取込みの減少によつて測つた。
IFN−βの抗血清はウサギから得、先のごとく〔Weissen
bach et al.,1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕分析し
た。中和試験のために、0.1mlの抗血清(力価104単位/m
l)あるいは非免疫血清をPBS中蛋白A−セフアローズビ
ーズ(protein A-Sepharose beads)(Pharmacia Fine
Chem.)の50%懸濁液0.2mlと37℃で1時間混合した。
ビーズをPBSで2度洗い0.1mlの細菌インターフエロン
(100単位/ml)を加えた。37℃、2時間後、ビーズを遠
心分離し、上清を分析してVSV感染細胞中の3H−ウリジ
ン取り込みの阻害を調べた。
(100単位/ml)を加えた。37℃、2時間後、ビーズを遠
心分離し、上清を分析してVSV感染細胞中の3H−ウリジ
ン取り込みの阻害を調べた。
遺伝子クローン:IFN−αCクローン18-3の単離 上記のごとく化学合成した2つの短い単鎖オリゴヌク
レオチドを使つて直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはIFN−α遺伝子の共通配列
に相補的で5′CTCTGACAACCTCCC3′および5′CCTTCTGG
AACTG3′の配列を有していた。これらオリゴヌクレオチ
ドは上記のごとく5′標識した後直接、またはセンダイ
ウイルス誘導したヒト白血病細胞からのRNA上cDNA合成
の為の鋳型(プライマー、primer)として使われた。32
P−オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したcDNAを上記
のごとく総数500,000のλ組換え体フアージにハイブリ
ツド化した。9cmニトロセルロースフイルター当り約5
×105cpm使用した。ハイブリツド化はプラスチックの密
封した料理用袋中最少容量の液で行なつた。
レオチドを使つて直接ヒト遺伝子ライブラリーを選別し
た。該オリゴヌクレオチドはIFN−α遺伝子の共通配列
に相補的で5′CTCTGACAACCTCCC3′および5′CCTTCTGG
AACTG3′の配列を有していた。これらオリゴヌクレオチ
ドは上記のごとく5′標識した後直接、またはセンダイ
ウイルス誘導したヒト白血病細胞からのRNA上cDNA合成
の為の鋳型(プライマー、primer)として使われた。32
P−オリゴヌクレオチドあるいは鋳型化したcDNAを上記
のごとく総数500,000のλ組換え体フアージにハイブリ
ツド化した。9cmニトロセルロースフイルター当り約5
×105cpm使用した。ハイブリツド化はプラスチックの密
封した料理用袋中最少容量の液で行なつた。
15塩基のプライマーでのハイブリツド化を以下のごと
く行なつた。まず、6×SSC、10×デンハルト溶液(Den
hardts)中37℃で4時間プレハイブリツド化、次いで6
×SSC、10×デンハルト溶液(Denhardts)中37℃で18時
間ハイブリツド化し、6×SSC中37℃で各30分間3〜4
回、洗液に放射能が検出されなくなるまで洗浄した。13
塩基のプライマーでのハイブリツド化では、ハイブリツ
ド化および洗浄の温度を30℃に下げた。ハイブリツド化
陽性を示した総数16のフアージをさらに制限地図作成お
よびDNA配列化により分析した。クローン18-3は3個のI
FN−α遺伝子を担い、そのうちの1個は、ゲツデルら
(Goeddel et al.)〔1981,Nature,290,20-25〕のcDN
AクローンαCと同じ配列を持つていることが証明され
た。クローン18-3は上記クローンC15と同様に精製し
た。クローン18-3のλバクテリオフアージ中での発現お
よび発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記
「結果」で説明する。
く行なつた。まず、6×SSC、10×デンハルト溶液(Den
hardts)中37℃で4時間プレハイブリツド化、次いで6
×SSC、10×デンハルト溶液(Denhardts)中37℃で18時
間ハイブリツド化し、6×SSC中37℃で各30分間3〜4
回、洗液に放射能が検出されなくなるまで洗浄した。13
塩基のプライマーでのハイブリツド化では、ハイブリツ
ド化および洗浄の温度を30℃に下げた。ハイブリツド化
陽性を示した総数16のフアージをさらに制限地図作成お
よびDNA配列化により分析した。クローン18-3は3個のI
FN−α遺伝子を担い、そのうちの1個は、ゲツデルら
(Goeddel et al.)〔1981,Nature,290,20-25〕のcDN
AクローンαCと同じ配列を持つていることが証明され
た。クローン18-3は上記クローンC15と同様に精製し
た。クローン18-3のλバクテリオフアージ中での発現お
よび発現プラスミドベクター中に挿入後の発現を下記
「結果」で説明する。
結果 1.遺伝子IFN−β1 C15クローンの構造: フアージクローンをEcoRIで部分消化しλ Charon 4A
のアームにクローン化したヒトDNAのライブラリーから
分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株のmRNA画
分から別々に調製した二つの異なるIFN−β1 cDNAプロ
ーブに強くハイブリツド化した。EcoRIによる該フアー
ジDNAの消化は、2つのλアームに加えて、12,2.6,1.84
および0.6キロベース(第1A図)の4断片を示した。サ
ザーン(Southern)〔1975,J.Mol.Biol.98,503-517〕の
方法によるニトロセルロースへの転写およびIFN−β1
I−6−5 cDNAクローンからニック−トランスレーシヨ
ン化したDNAとのハイブリツド化により1.84Kb断片がIFN
−β1遺伝子を含むことがわかつた。このEcoRI断片をp
BR322のEcoRI部位に再クローン化した。この1.84Kb亜ク
ローンのBgl II Pvu II,Pst I,Hinc IIおよびTaq Iによ
る制限酵素分析および部分ないし完全長IFN−β1 cDNA
プローブとのハイブリツド化によりIFN−β1プレ蛋白
のコード配列(Hinc II部位)はEcoRI部位から約350ヌ
クレオチドで始まると結論した(第1A図)。遺伝子DNA
中の種々の制限酵素部位の間の距離は実験誤差の範囲で
cDNA配列のそれと同じである(第1表)。
のアームにクローン化したヒトDNAのライブラリーから
分離した。該クローンはヒト線維芽細胞の二株のmRNA画
分から別々に調製した二つの異なるIFN−β1 cDNAプロ
ーブに強くハイブリツド化した。EcoRIによる該フアー
ジDNAの消化は、2つのλアームに加えて、12,2.6,1.84
および0.6キロベース(第1A図)の4断片を示した。サ
ザーン(Southern)〔1975,J.Mol.Biol.98,503-517〕の
方法によるニトロセルロースへの転写およびIFN−β1
I−6−5 cDNAクローンからニック−トランスレーシヨ
ン化したDNAとのハイブリツド化により1.84Kb断片がIFN
−β1遺伝子を含むことがわかつた。このEcoRI断片をp
BR322のEcoRI部位に再クローン化した。この1.84Kb亜ク
ローンのBgl II Pvu II,Pst I,Hinc IIおよびTaq Iによ
る制限酵素分析および部分ないし完全長IFN−β1 cDNA
プローブとのハイブリツド化によりIFN−β1プレ蛋白
のコード配列(Hinc II部位)はEcoRI部位から約350ヌ
クレオチドで始まると結論した(第1A図)。遺伝子DNA
中の種々の制限酵素部位の間の距離は実験誤差の範囲で
cDNA配列のそれと同じである(第1表)。
予期しない制限酵素部位はIFN−β1コード領域のど
こにも見出せなかつた。これは検出できる介在配列(in
tervening sequence)が存在しないことを示している。
こにも見出せなかつた。これは検出できる介在配列(in
tervening sequence)が存在しないことを示している。
C15 DNAのEcoRI部分消化は、0.6Kb EcoRI断片が1.84
と2.6Kb EcoRI断片の間に位置することを示した。BamHI
部位が2.6Kb中に1箇所見出されたが挿入したヒトDNAの
他のEcoRI断片には見出されなかつた。IFN−β1 cDNA
にハイブリツド化する1.84KbのEcoRI断片はC15 DNAの9.
6Kb BamHI断片上に見出された。第1図に示したとお
り、この断片はλ右アーム(EcoRIから5.1Kb)のBamHI
部位からのみ由来し、挿入したヒトDNAのEcoRI-BamHI断
片に当る4.5Kbを遊離しているが、このことは1.84Kb Ec
oRI断片がλ右アームに隣接しているにちがいないこと
を示している。遺伝子方向づけ(第1A図)は以下のごと
く決定した。C15 DNAをPvu IIで切断してIFN−β1 cDN
Aの完全長または3′側半分にハイブリツド化したと
き、IFN−β1の5′末端にのみハイブリツド化してい
る0.66Kb断片が見出された。しかし、1.84Kb EcoRI断片
をPvu IIで切断したときは、IFN−β1の5′末端が、
より小さい0.54Kb断片に見られた。挿入したヒトDNAの
0.6Kb EcoRI断片にはPvu II部位は見出されないので、
0.66Kb Pvu II断片はλ右アームで終るはずであり、従
つてIFN−β1の5′末端はλ右アームに最も接近して
いる。第1A図に示される構造は、Hind III、Sma Iおよ
びBgl II消化を用いる数種の他の制限地図作製実験から
も確認される。クローンC15中のIFN−β1遺伝子のコー
ド配列は、従つて、左方向転写を調節する強力なλPLプ
ロモーター〔ウイリアムスら(Williams et al.),19
80,Genetic Engineering Vol II,pp 201-281,プレナム
社(Plenum Corp)〕から約1,775ヌクレオチド離れて、
適切な左方向性に挿入されていた。このことが検出可能
なイントロンの不在とともにC 15組換え体フアージ感染
大腸菌でインターフエロンを生産する可能性の検討を促
した。
と2.6Kb EcoRI断片の間に位置することを示した。BamHI
部位が2.6Kb中に1箇所見出されたが挿入したヒトDNAの
他のEcoRI断片には見出されなかつた。IFN−β1 cDNA
にハイブリツド化する1.84KbのEcoRI断片はC15 DNAの9.
6Kb BamHI断片上に見出された。第1図に示したとお
り、この断片はλ右アーム(EcoRIから5.1Kb)のBamHI
部位からのみ由来し、挿入したヒトDNAのEcoRI-BamHI断
片に当る4.5Kbを遊離しているが、このことは1.84Kb Ec
oRI断片がλ右アームに隣接しているにちがいないこと
を示している。遺伝子方向づけ(第1A図)は以下のごと
く決定した。C15 DNAをPvu IIで切断してIFN−β1 cDN
Aの完全長または3′側半分にハイブリツド化したと
き、IFN−β1の5′末端にのみハイブリツド化してい
る0.66Kb断片が見出された。しかし、1.84Kb EcoRI断片
をPvu IIで切断したときは、IFN−β1の5′末端が、
より小さい0.54Kb断片に見られた。挿入したヒトDNAの
0.6Kb EcoRI断片にはPvu II部位は見出されないので、
0.66Kb Pvu II断片はλ右アームで終るはずであり、従
つてIFN−β1の5′末端はλ右アームに最も接近して
いる。第1A図に示される構造は、Hind III、Sma Iおよ
びBgl II消化を用いる数種の他の制限地図作製実験から
も確認される。クローンC15中のIFN−β1遺伝子のコー
ド配列は、従つて、左方向転写を調節する強力なλPLプ
ロモーター〔ウイリアムスら(Williams et al.),19
80,Genetic Engineering Vol II,pp 201-281,プレナム
社(Plenum Corp)〕から約1,775ヌクレオチド離れて、
適切な左方向性に挿入されていた。このことが検出可能
なイントロンの不在とともにC 15組換え体フアージ感染
大腸菌でインターフエロンを生産する可能性の検討を促
した。
2.IFN−β1 C 15フアージ感染大腸菌溶菌液からのイン
ターフエロン生物活性の回収 クローンC15からのフアージをメソツズ(Methods)に
記載のとおり大腸菌DP 50の培養液500mlで増殖させた。
清澄溶菌液10mlを透析し、Cibacron Blue-Sepharose小
カラム(0.3ml)にのせ、画分を水胞性口内炎ウイルス
(VSV)細胞変性効果の阻害について、標準IFN−βを対
照として用いて、分析した。溶菌液中のフアージ濃度1.
3×1010フアージ/mlで行なつた一実験例におけるインタ
ーフエロン活性パターンを第2図に示した。カラムから
50%プロピレングリコール1M NaClで溶出した画分中に
総量7,500単位のIFN活性を回収した。これは溶菌液1
当り0.75×106単位に相当する。しかし粗溶菌液中では
測定可能な活性が非常に低く、そのことは溶菌液中の物
質がIFN活性の正確な分析を妨げていることを示唆して
いる。再造成実験で、標準ヒトIFN−βを野性型λ Char
on 4A溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの10分
の1であつた。この混合物をBlue-Sepharoseカラムに通
すと、投入活性の75%が回収された。対照としてIFN添
加しない野性型λ Charon 4 Aフアージからの溶菌液を
分析したが、IFN活性は見出せなかつた(第2図)。
ターフエロン生物活性の回収 クローンC15からのフアージをメソツズ(Methods)に
記載のとおり大腸菌DP 50の培養液500mlで増殖させた。
清澄溶菌液10mlを透析し、Cibacron Blue-Sepharose小
カラム(0.3ml)にのせ、画分を水胞性口内炎ウイルス
(VSV)細胞変性効果の阻害について、標準IFN−βを対
照として用いて、分析した。溶菌液中のフアージ濃度1.
3×1010フアージ/mlで行なつた一実験例におけるインタ
ーフエロン活性パターンを第2図に示した。カラムから
50%プロピレングリコール1M NaClで溶出した画分中に
総量7,500単位のIFN活性を回収した。これは溶菌液1
当り0.75×106単位に相当する。しかし粗溶菌液中では
測定可能な活性が非常に低く、そのことは溶菌液中の物
質がIFN活性の正確な分析を妨げていることを示唆して
いる。再造成実験で、標準ヒトIFN−βを野性型λ Char
on 4A溶菌液に加えたとき、活性は投入したものの10分
の1であつた。この混合物をBlue-Sepharoseカラムに通
すと、投入活性の75%が回収された。対照としてIFN添
加しない野性型λ Charon 4 Aフアージからの溶菌液を
分析したが、IFN活性は見出せなかつた(第2図)。
クローンC15の溶菌液からのIFNのクロマトグラフ挙動
は一定でない。フアージ濃度が3×1011pfu/mlの実験で
は、IFN活性は高いが、Blue-Sepharoseカラムには保持
されなかつた。この実験で、カラムから回収された総活
性は10mlの溶菌液(7−8×106単位/l)の投入に対し7
0-80,000単位のIFNであつた。溶出画分を第2のBlue-Se
pharoseカラムに再吸着させた。このときは活性がカラ
ムに保持されたが、PBSでカラムを洗うと再び溶出され
た。ヒトIFN−β1は通常疎水性溶媒によつてのみBlue-
Sepharoseから溶出されるはずである〔ナイトら(Knigh
t et al.),1980.Science 207,525-526〕,従つて標
準ヒトIFN−βを同じフアージ溶菌液と混合しカラムに
かけた。活性の30%が保持されず、活性の回収は25%に
すぎなかつた。このことは、この溶菌液の成分がIFN−
β、特に細菌によつて生産されるIFN−βとBlue-Sephar
oseの相互作用を不安定化したことを示唆している。
は一定でない。フアージ濃度が3×1011pfu/mlの実験で
は、IFN活性は高いが、Blue-Sepharoseカラムには保持
されなかつた。この実験で、カラムから回収された総活
性は10mlの溶菌液(7−8×106単位/l)の投入に対し7
0-80,000単位のIFNであつた。溶出画分を第2のBlue-Se
pharoseカラムに再吸着させた。このときは活性がカラ
ムに保持されたが、PBSでカラムを洗うと再び溶出され
た。ヒトIFN−β1は通常疎水性溶媒によつてのみBlue-
Sepharoseから溶出されるはずである〔ナイトら(Knigh
t et al.),1980.Science 207,525-526〕,従つて標
準ヒトIFN−βを同じフアージ溶菌液と混合しカラムに
かけた。活性の30%が保持されず、活性の回収は25%に
すぎなかつた。このことは、この溶菌液の成分がIFN−
β、特に細菌によつて生産されるIFN−βとBlue-Sephar
oseの相互作用を不安定化したことを示唆している。
インターフエロンはカラムに保持されなかつたが、溶
菌液の蛋白質の90%以上が比活性4−5×105単位/mg蛋
白質を有する活性画分から取除かれた。この部分精製は
粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除くために
欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカルボキシメ
チル−セフアロース クロマトグラフイーにかけてクロ
ーンC15 IFN活性を回収した(図には示さない)。
菌液の蛋白質の90%以上が比活性4−5×105単位/mg蛋
白質を有する活性画分から取除かれた。この部分精製は
粗溶菌液中の活性を隠蔽した化学物質を取り除くために
欠かせない。別の実験では、また溶菌液をカルボキシメ
チル−セフアロース クロマトグラフイーにかけてクロ
ーンC15 IFN活性を回収した(図には示さない)。
3.クローンC15感染大腸菌産生インターフエロンの性質 クロマトグラフ処理で回収したインターフエロン活性
はアクチノマイシンDで処理したVSV−感染ヒト細胞中
の3H−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバツ
ハ(Weissenbach),1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕。
細菌IFN−βで得られた力価曲線は標準ヒトIFN−βで得
られたものと同じであつた(第3図)。細菌IFNの免疫
学的性質を調べるために、部分精製物をウサギ抗IFN−
β血清(IFN−αには不活性)または蛋白質A−セフア
ロース(protein A-Sepharose)に予備結合したウサギ
非免疫血清と混合した。遠心分離後、上清のIFN活性を
分析した。抗IFN−β血清はインターフエロン活性を全
て取除いたが非免疫血清を用いたときは活性が残つた
(第3図)。
はアクチノマイシンDで処理したVSV−感染ヒト細胞中
の3H−ウリジンの取り込みを減少させた〔ワイゼンバツ
ハ(Weissenbach),1979,Eur.J.Biochem.98,1−8〕。
細菌IFN−βで得られた力価曲線は標準ヒトIFN−βで得
られたものと同じであつた(第3図)。細菌IFNの免疫
学的性質を調べるために、部分精製物をウサギ抗IFN−
β血清(IFN−αには不活性)または蛋白質A−セフア
ロース(protein A-Sepharose)に予備結合したウサギ
非免疫血清と混合した。遠心分離後、上清のIFN活性を
分析した。抗IFN−β血清はインターフエロン活性を全
て取除いたが非免疫血清を用いたときは活性が残つた
(第3図)。
細菌IFN(20単位/ml)は細胞培養物上で抗IFN−β(2
0単位/ml)と混合するだけで同様に中和され、VSV細胞
変性効果の阻害によつて分析された。
0単位/ml)と混合するだけで同様に中和され、VSV細胞
変性効果の阻害によつて分析された。
細菌インターフエロンの種特異性を種々の細胞型の比
較により分析した。
較により分析した。
ヒトIFN−βとしてのクローンC15感染大腸菌生産物の
活性はサル腎細胞BSC-1およびウシMDBK細胞ではヒト細
胞の場合の10%以下であつた。マウスLあるいはA9細胞
については検出可能な抗ウイルス活性はなかつた。クロ
ーンC15によつて生産される細菌IFN6,000単位/mlでも同
じ効果が得られた。
活性はサル腎細胞BSC-1およびウシMDBK細胞ではヒト細
胞の場合の10%以下であつた。マウスLあるいはA9細胞
については検出可能な抗ウイルス活性はなかつた。クロ
ーンC15によつて生産される細菌IFN6,000単位/mlでも同
じ効果が得られた。
本発明は、従つてヒト遺伝子DNAのEcoRI部分消化断片
からλ Charon 4A中へのクローニングによつて直接単離
されたIFN−β1遺伝子が発現可能で培養物の溶菌液中
に著量のIFN活性を蓄積させることができることを示し
た。生産された活性は免疫学的性質ならびに種特異性か
ら明らかに線維芽細胞インターフエロン(β)である。
活性はIFN−β1 C15フアージクローンによる感染細菌
を培養したときだけ生産される。大腸菌中のクローンC1
5によつて生産されるIFN活性はCibacron Blue Sepharos
e上のクロマトグラフにおける性質がヒトIFN−βとよく
似ている。細菌溶菌液から高活性(7×106単位/l)を
回収するためにはクロマトグラフ処理が必須である。イ
ンターフエロンは、従つて一個体の遺伝子から直接採取
したヒトDNA断片の指示のもとに細菌により生産される
生物学的活性蛋白質の最初の例となる。
からλ Charon 4A中へのクローニングによつて直接単離
されたIFN−β1遺伝子が発現可能で培養物の溶菌液中
に著量のIFN活性を蓄積させることができることを示し
た。生産された活性は免疫学的性質ならびに種特異性か
ら明らかに線維芽細胞インターフエロン(β)である。
活性はIFN−β1 C15フアージクローンによる感染細菌
を培養したときだけ生産される。大腸菌中のクローンC1
5によつて生産されるIFN活性はCibacron Blue Sepharos
e上のクロマトグラフにおける性質がヒトIFN−βとよく
似ている。細菌溶菌液から高活性(7×106単位/l)を
回収するためにはクロマトグラフ処理が必須である。イ
ンターフエロンは、従つて一個体の遺伝子から直接採取
したヒトDNA断片の指示のもとに細菌により生産される
生物学的活性蛋白質の最初の例となる。
4.遺伝子IFN−αC18-3クローン クローンを、化学合成された短いオリゴヌクレオチド
の直接ハイブリツド化によつて、IFN−αの配列に相補
的であると同定した。総数0.5×106の遺伝子中16のクロ
ーンがハイブリツド化陽性であつた。オリゴヌクレオチ
ドにハイブリツド化するEcoRI断片の配列を調べた結
果、クローン18-3は、第1B図に示したように、IFN−α
Cの遺伝子が位置する2Kb EcoRI断片18-33(第1B図の挿
入部分)を含んでいることがわかつた。この遺伝子は、
明らかにゲツデルら(Goeddel et al.)〔1981,Natur
e 290,20-25〕によつて報告されたIFN−αCクローンを
生じるmRNAの起源である。クローン5−1は重複するDN
A断片を表わす。クローン5−1およびクローン18-3は
ともに、IFN−αCに加えて、α−C2およびα−C4と名
付けた二つの他のIFN−α遺伝子を担つている(第1B
図)。
の直接ハイブリツド化によつて、IFN−αの配列に相補
的であると同定した。総数0.5×106の遺伝子中16のクロ
ーンがハイブリツド化陽性であつた。オリゴヌクレオチ
ドにハイブリツド化するEcoRI断片の配列を調べた結
果、クローン18-3は、第1B図に示したように、IFN−α
Cの遺伝子が位置する2Kb EcoRI断片18-33(第1B図の挿
入部分)を含んでいることがわかつた。この遺伝子は、
明らかにゲツデルら(Goeddel et al.)〔1981,Natur
e 290,20-25〕によつて報告されたIFN−αCクローンを
生じるmRNAの起源である。クローン5−1は重複するDN
A断片を表わす。クローン5−1およびクローン18-3は
ともに、IFN−αCに加えて、α−C2およびα−C4と名
付けた二つの他のIFN−α遺伝子を担つている(第1B
図)。
5.recAプロモーター調節下のヒトIFN遺伝子断片の発現 recAプロモーターは最強の大腸菌プロモーターのひと
つと考えられている。通常、pBR322のような多数コピー
プラスミド上に存在するときでも、lex遺伝子の生産物
によつて強く抑制されている。recAプロモーターは損傷
を受けたDNAの存在下にそれ自身の抑制体を切断して誘
導され、誘導は非常に高い程度まで行なわれる。
つと考えられている。通常、pBR322のような多数コピー
プラスミド上に存在するときでも、lex遺伝子の生産物
によつて強く抑制されている。recAプロモーターは損傷
を受けたDNAの存在下にそれ自身の抑制体を切断して誘
導され、誘導は非常に高い程度まで行なわれる。
〔サンカーおよびラツプ(Sancar and Rupp),1979,PNA
S 76,3144-3148〕。recAの標準誘導物質はDNA合成を妨
げるナリジクス酸あるいはDNAを交叉連結するマイトマ
イシンCである。
S 76,3144-3148〕。recAの標準誘導物質はDNA合成を妨
げるナリジクス酸あるいはDNAを交叉連結するマイトマ
イシンCである。
約1キロベースのTaq I-BamHI断片上のプロモーター
を分離するためにクローン化したrecAを含むプラスミド
pDR1453を使つた。これをCla IおよびBam Iで開裂したp
BR 322に連結しプラスミドRAP-1を造成した。この場合T
aq I-Cla I結合はCla I部位を回復し、その結果プラス
ミドはrecA遺伝子の第3番目のコドン中で唯一開裂され
ることを可能にした。RAP-2はRAP-1をEcoRIおよびCla I
で切断し、粘着末端を埋め込み(filling in)、RI部位
を回復する再連結を行なつて造成した。RAP-2をRI部位
で開裂し、外来DNAをrecA蛋白の第3番目のコドンに挿
入することができる。
を分離するためにクローン化したrecAを含むプラスミド
pDR1453を使つた。これをCla IおよびBam Iで開裂したp
BR 322に連結しプラスミドRAP-1を造成した。この場合T
aq I-Cla I結合はCla I部位を回復し、その結果プラス
ミドはrecA遺伝子の第3番目のコドン中で唯一開裂され
ることを可能にした。RAP-2はRAP-1をEcoRIおよびCla I
で切断し、粘着末端を埋め込み(filling in)、RI部位
を回復する再連結を行なつて造成した。RAP-2をRI部位
で開裂し、外来DNAをrecA蛋白の第3番目のコドンに挿
入することができる。
RAP-1ベクターをヒト遺伝子ライブラリーからの遺伝
子断片によるインターフエロン活性の間接発現に使つ
た。IFN−β1遺伝子および数個の単離したαC亜種のI
FN−α遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗
ウイルス分析によると強いインターフエロン活性を生産
することが認められた。これらの遺伝子が存在するDNA
のRI断片(第1AおよびB図)をRAP-1プラスミドのRI部
位に二次クローン化した。該プラスミドをrecA+宿主菌
株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で誘導し、細
胞を採集し、リゾチームおよび30%プロピレングリコー
ルで溶菌し、抽出物の抗ウイルス活性を分析した。活性
の程度は明らかにナリジクス酸による誘導に依存し、最
高50μg/mlであつた(第3表)。
子断片によるインターフエロン活性の間接発現に使つ
た。IFN−β1遺伝子および数個の単離したαC亜種のI
FN−α遺伝子はこのプラスミドに挿入したとき、標準抗
ウイルス分析によると強いインターフエロン活性を生産
することが認められた。これらの遺伝子が存在するDNA
のRI断片(第1AおよびB図)をRAP-1プラスミドのRI部
位に二次クローン化した。該プラスミドをrecA+宿主菌
株に入れ、該細菌を培養し、ナリジクス酸で誘導し、細
胞を採集し、リゾチームおよび30%プロピレングリコー
ルで溶菌し、抽出物の抗ウイルス活性を分析した。活性
の程度は明らかにナリジクス酸による誘導に依存し、最
高50μg/mlであつた(第3表)。
興味深いことには、遺伝子断片はrecAプロモーターに
関連する二つの可能な配向で活性を生産することもあ
る。活性を示すIFN−β1およびIFN−α遺伝子はすべて
1.8-2キロベースのDNA EcoRI断片上に位置していたの
で、プロモーターからインターフエロン遺伝子のATG開
始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチドである。
関連する二つの可能な配向で活性を生産することもあ
る。活性を示すIFN−β1およびIFN−α遺伝子はすべて
1.8-2キロベースのDNA EcoRI断片上に位置していたの
で、プロモーターからインターフエロン遺伝子のATG開
始コドンまでの距離はおよそ数百ヌクレオチドである。
これらの実験からプロモーターが予期したとおり機能
することは明らかであり、遺伝子ライブラリーからのイ
ンターフエロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決定する
ことが可能である。
することは明らかであり、遺伝子ライブラリーからのイ
ンターフエロン様遺伝子の活性の有無を迅速に決定する
ことが可能である。
6.tryp-lac混成プロモーター調節下のIFN−β1遺伝子
の高発現 プラスミドPLJ 3〔ジヨンスラド(Johnsrud),PNAS,1
978,75,5314-5318〕は関連のない95ヌクレオチドで隔て
られた各95塩基対長の2つのlacプロモーターを含んで
いる。この285ヌクレオチド断片をプラスミドPMB 9のEc
oRI部位に挿入する。95塩基対長のlac配列はオペレータ
ーおよびプロモーター配列を含み、β−ガラクトシダー
ゼのATGの直前で停止する。β−ガラクトシダーゼのリ
ボゾーム結合部位から適当な距離に挿入した、ATG開始
コドンを有するコード化DNA配列は大腸菌細胞中で正確
に発現されるはずである。285塩基対のEcoRI断片をpBR
322のEcoRI部位に再クローン化した。組換え体を40μg/
ml X-galおよび15μg/mlテトラサイクリン含有プレート
で細胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけ
を集めDNAを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
の高発現 プラスミドPLJ 3〔ジヨンスラド(Johnsrud),PNAS,1
978,75,5314-5318〕は関連のない95ヌクレオチドで隔て
られた各95塩基対長の2つのlacプロモーターを含んで
いる。この285ヌクレオチド断片をプラスミドPMB 9のEc
oRI部位に挿入する。95塩基対長のlac配列はオペレータ
ーおよびプロモーター配列を含み、β−ガラクトシダー
ゼのATGの直前で停止する。β−ガラクトシダーゼのリ
ボゾーム結合部位から適当な距離に挿入した、ATG開始
コドンを有するコード化DNA配列は大腸菌細胞中で正確
に発現されるはずである。285塩基対のEcoRI断片をpBR
322のEcoRI部位に再クローン化した。組換え体を40μg/
ml X-galおよび15μg/mlテトラサイクリン含有プレート
で細胞を増殖させて選別した。陽性の青色コロニーだけ
を集めDNAを塩化セシウム勾配遠心で精製した。
lacプロモーターにはpBR 322のアンピシリン遺伝子方
向とテトラサイクリン遺伝子方向の二方向が予期でき
る。本発明者らの興味はlacリボゾーム結合部位とpBR 3
22配列の間に位置するEcoRI部位のみを得ることにある
ので、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼを結合すること
によつてこの部位を保護し、一方末梢部位をEcoRI制限
で開裂し、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント(K
lenow fragment)で埋め込みを行ない、再結合した。MM
294大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを分離し、pBR
322のEcoRI部位とBamHI部位の間の距離を測つた。375
塩基対断片を含むプラスミドはlacプロモーターがテト
ラサイクリン遺伝子方向で、670塩基対断片(375±295
b.p.)を含むプラスミドはlacプロモーターがアンピシ
リン遺伝子方向であつた。
向とテトラサイクリン遺伝子方向の二方向が予期でき
る。本発明者らの興味はlacリボゾーム結合部位とpBR 3
22配列の間に位置するEcoRI部位のみを得ることにある
ので、プラスミドDNAにRNAポリメラーゼを結合すること
によつてこの部位を保護し、一方末梢部位をEcoRI制限
で開裂し、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメント(K
lenow fragment)で埋め込みを行ない、再結合した。MM
294大腸菌細胞を形質転換後、プラスミドを分離し、pBR
322のEcoRI部位とBamHI部位の間の距離を測つた。375
塩基対断片を含むプラスミドはlacプロモーターがテト
ラサイクリン遺伝子方向で、670塩基対断片(375±295
b.p.)を含むプラスミドはlacプロモーターがアンピシ
リン遺伝子方向であつた。
IFN−β1遺伝子断片のEcoRI 1.84Kb二次クローンか
ら、本発明者らはプレインターフエロン配列を含むHinc
II-BglII断片を切出した。成熟IFN−β1蛋白はそのア
ミノ基末端に大腸菌内で開始コドンとして用いることが
できるメチオニンを含んでいる。このATGコドンに接し
て13ヌクレオチド隔てられた2つのAluI部位がある。1
つはATGの前8ヌクレオチド、他はATGの後2ヌクレオチ
ドである。部分的AluI消化をHincII-BglII断片で行な
い、約510塩基対の断片をアガロースゲルで単離した。
テトラサイクリン遺伝子方向のlacプロモーターを含む
ベクターをEcoRIで制限し、制限部位をDNAポリメラーゼ
で埋め込みを行ないBamHIで再切断した。AluI-BglII断
片と埋め込みを行なつたEcoRI-BamHIベクターの連続でE
coRI部位が回復した。ATGコドンを含むクローン(13ヌ
クレオチド長)の間の区別を可能にするために得られた
クローンをEcoRIとPstIで制限し、予期した151塩基対の
断片を含むクローンの配列を決めた。次いでEcoRI部位
を再開裂し、リボゾーム結合部位とATGの間の距離をBal
31消化と再結合で短くした。これらのプラスミドで形
質転換した大腸菌はIFN−β1生産により選別した。
ら、本発明者らはプレインターフエロン配列を含むHinc
II-BglII断片を切出した。成熟IFN−β1蛋白はそのア
ミノ基末端に大腸菌内で開始コドンとして用いることが
できるメチオニンを含んでいる。このATGコドンに接し
て13ヌクレオチド隔てられた2つのAluI部位がある。1
つはATGの前8ヌクレオチド、他はATGの後2ヌクレオチ
ドである。部分的AluI消化をHincII-BglII断片で行な
い、約510塩基対の断片をアガロースゲルで単離した。
テトラサイクリン遺伝子方向のlacプロモーターを含む
ベクターをEcoRIで制限し、制限部位をDNAポリメラーゼ
で埋め込みを行ないBamHIで再切断した。AluI-BglII断
片と埋め込みを行なつたEcoRI-BamHIベクターの連続でE
coRI部位が回復した。ATGコドンを含むクローン(13ヌ
クレオチド長)の間の区別を可能にするために得られた
クローンをEcoRIとPstIで制限し、予期した151塩基対の
断片を含むクローンの配列を決めた。次いでEcoRI部位
を再開裂し、リボゾーム結合部位とATGの間の距離をBal
31消化と再結合で短くした。これらのプラスミドで形
質転換した大腸菌はIFN−β1生産により選別した。
クローン、L-11は約3×106単位/lのIFN−βを生産し
た。このクローン中のlacプロモーター領域をHpaHIで、
すなわちmRNA開始前17ヌクレオチドで切断した。IFN−
β1遺伝子を切出すため、酵素Sau 3aを用いそのDNAをI
FN−β1の停止コドンを越えて3ヌクレオチドで切断し
た。このHpaII-Sau 3a lac-IFN−β1断片を下記のごと
くに調製したtrypプロモータープラスミドのClaI部位と
Hind III部位の間に導入した。tryp mRNAの開始前−21
〜−201の180ヌクレオチド長のTaqI-TaqI断片をtrypプ
ラスミドpEP 121-221から切出し、pBR 322のClaI部位に
クローン化した。本発明者らは、trypプロモーター断片
が時計方向に向いた配向のものを選んだ。この操作によ
りtrypプロモーターの−21の位置にClaI部位が回復す
る。lac-IFN−β1断片に連結後、混成プロモーターtry
p-lacがIFN−β1遺伝子の前に形成される。このプラス
ミドTL-11を大腸菌MM294あるいは大腸菌ミニセル株p679
-54の形質転換に使つた。これらの細菌はO D65010の発
酵槽培養で108単位/lのIFN−β1を生産する。このこと
はこのIFN−β1遺伝子DNA断片が高い活性を有すること
を示している(第4図)。
た。このクローン中のlacプロモーター領域をHpaHIで、
すなわちmRNA開始前17ヌクレオチドで切断した。IFN−
β1遺伝子を切出すため、酵素Sau 3aを用いそのDNAをI
FN−β1の停止コドンを越えて3ヌクレオチドで切断し
た。このHpaII-Sau 3a lac-IFN−β1断片を下記のごと
くに調製したtrypプロモータープラスミドのClaI部位と
Hind III部位の間に導入した。tryp mRNAの開始前−21
〜−201の180ヌクレオチド長のTaqI-TaqI断片をtrypプ
ラスミドpEP 121-221から切出し、pBR 322のClaI部位に
クローン化した。本発明者らは、trypプロモーター断片
が時計方向に向いた配向のものを選んだ。この操作によ
りtrypプロモーターの−21の位置にClaI部位が回復す
る。lac-IFN−β1断片に連結後、混成プロモーターtry
p-lacがIFN−β1遺伝子の前に形成される。このプラス
ミドTL-11を大腸菌MM294あるいは大腸菌ミニセル株p679
-54の形質転換に使つた。これらの細菌はO D65010の発
酵槽培養で108単位/lのIFN−β1を生産する。このこと
はこのIFN−β1遺伝子DNA断片が高い活性を有すること
を示している(第4図)。
第1A図:IFN−β1クローンC15 DNAの模式構造 (a)λ Charon 4Aの模式図。2つのアームは実線で示
す。 (b)クローンC15に挿入したヒトDNAの構造、黒塗部分
はIFN−β1 cDNAにハイブリツド化するEcoRI断片を示
す。 (c)bからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。PLはλ左方向プロモータ
ーである。 (d)IFN−β1 mRNAの位置。上方の目盛りは(a)と
(b)に対応する。下方の目盛りは(c)と(d)に対
応する。詳細は本文参照。 第1B図:IFN−αCクローン18-3の模式構造 2つのλ Charon 4Aクローン挿入部分の制限地図を示
す。IFN−αC遺伝子は矢印アルフアーC*で示される。
他の2つのIFN−α遺伝子がIFN−αCの近くに存在す
る。挿入部分はIFN−αC遺伝子を含み、本文に説明し
たようにrecAプラスミド中にクローン化したEcoRI 2Kb
フラグメント18-33を示す。制限酵素部位に対応する記
号を示す。 第2図:遺伝子クローンIFN−β1 C15により生産され
たインターフエロンのBlue-Sepharoseでの分析 フアージC15感染大腸菌DP50の粗溶菌液を“材料および
方法”に記載のごとく分画し、IFN活性を各画分につい
て分析した 蛋白濃度を同じ画分について測つた λ Charon 4Aフアージからの溶菌液の並行クロマトグラ
フイと分析を示す 第3図:遺伝子クローンIFN−β1 C15インターフエロ
ンの力価 第2図のカラムからのフアージC15 IFNの画分(約103単
位/ml)を1:40に希釈し、ついでVSV RNA合成の希釈によ
るIFNの分析の為にミクロプレート上で連続的に希釈し
た 標準ヒト線維芽細胞インターフエロン25単位/mlを平行
して分析した VSVなしの対照(□)およびVSVありIFNなしの対照
(■)を示す。右の2つのカラムは“方法”で示したよ
うに、固定化した抗IFN−βまたは非免疫IgGに吸着後の
フアージC15 IFNの残在活性(最終希釈1:40)を示す。 第4図:プラスミドTL11含有大腸菌の増殖とIFN生産 TL11プラスミドは本文に示したごとく混成tryp-lacプロ
モーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒトIFN−β1
をコードする配列を含んでいる。細菌を1のニユー・
ブルンスウイツク発酵槽(New Brunswick fermentor)
中で増殖し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロ
ピレングリコールで溶菌し、VSVにヒト細胞を攻撃させ
てIFN活性を測定した。IFN活性は細菌培養物1ml当りで
計算する。
す。 (b)クローンC15に挿入したヒトDNAの構造、黒塗部分
はIFN−β1 cDNAにハイブリツド化するEcoRI断片を示
す。 (c)bからの黒塗断片の拡大は二重線として示す。単
線はλ右アームの部分である。PLはλ左方向プロモータ
ーである。 (d)IFN−β1 mRNAの位置。上方の目盛りは(a)と
(b)に対応する。下方の目盛りは(c)と(d)に対
応する。詳細は本文参照。 第1B図:IFN−αCクローン18-3の模式構造 2つのλ Charon 4Aクローン挿入部分の制限地図を示
す。IFN−αC遺伝子は矢印アルフアーC*で示される。
他の2つのIFN−α遺伝子がIFN−αCの近くに存在す
る。挿入部分はIFN−αC遺伝子を含み、本文に説明し
たようにrecAプラスミド中にクローン化したEcoRI 2Kb
フラグメント18-33を示す。制限酵素部位に対応する記
号を示す。 第2図:遺伝子クローンIFN−β1 C15により生産され
たインターフエロンのBlue-Sepharoseでの分析 フアージC15感染大腸菌DP50の粗溶菌液を“材料および
方法”に記載のごとく分画し、IFN活性を各画分につい
て分析した 蛋白濃度を同じ画分について測つた λ Charon 4Aフアージからの溶菌液の並行クロマトグラ
フイと分析を示す 第3図:遺伝子クローンIFN−β1 C15インターフエロ
ンの力価 第2図のカラムからのフアージC15 IFNの画分(約103単
位/ml)を1:40に希釈し、ついでVSV RNA合成の希釈によ
るIFNの分析の為にミクロプレート上で連続的に希釈し
た 標準ヒト線維芽細胞インターフエロン25単位/mlを平行
して分析した VSVなしの対照(□)およびVSVありIFNなしの対照
(■)を示す。右の2つのカラムは“方法”で示したよ
うに、固定化した抗IFN−βまたは非免疫IgGに吸着後の
フアージC15 IFNの残在活性(最終希釈1:40)を示す。 第4図:プラスミドTL11含有大腸菌の増殖とIFN生産 TL11プラスミドは本文に示したごとく混成tryp-lacプロ
モーターおよびヒト遺伝子断片由来成熟ヒトIFN−β1
をコードする配列を含んでいる。細菌を1のニユー・
ブルンスウイツク発酵槽(New Brunswick fermentor)
中で増殖し、指示した時間に、細菌をリゾチーム−プロ
ピレングリコールで溶菌し、VSVにヒト細胞を攻撃させ
てIFN活性を測定した。IFN活性は細菌培養物1ml当りで
計算する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:19) (C12N 1/21 (C12N 1/21 C12R 1:19) C12R 1:19) 9281−4B C12N 15/00 A (72)発明者 ルイセ・チエン イスラエル国ラマツト・アビブ・タゴ− ル・ストリ−ト52 (72)発明者 シエルドン・イスラエル・フエインステ イン アメリカ合衆国コネチカツト州ニユ−・ ヘブン・フア−ンハム・アベニユ−33 (56)参考文献 特開 昭56−154499(JP,A) 特開 昭57−77654(JP,A) 特開 昭57−140793(JP,A) Nucl.Acid Res.,Vo l.9,no.3(1981)p.461−471 Gene,Vol.14(1981)p. 137−143 Nature,Vol.287(1980) p.193−197 Pro.Natl.Acad.Sc i,USA,Vol.77,no.9 (1980)p.5230−5233
Claims (6)
- 【請求項1】ヒト線維芽細胞型インターフェロンβ1を
コードする配列を含むヒト染色体由来のイントロンを有
しないヒト遺伝子DNA断片をファージに導入し、得られ
るそのファージ組換え体で大腸菌を感染させ、そのよう
な感染大腸菌を培養し、次いでインターフェロンを採取
することを特徴とする、ヒト線維芽細胞型インターフェ
ロンβ1の製造法。 - 【請求項2】ヒト線維芽細胞型インターフェロンβ1を
コードする配列を含むヒト染色体由来のイントロンを有
しないヒト遺伝子DNA断片をファージに導入し、そのフ
ァージからヒト線維芽細胞型インターフェロンβ1をコ
ードする配列を含むDNA断片を採取し、これをヒト線維
芽細胞型インターフェロンβ1の合成を誘導し得るプラ
スミドに導入し、得られるプラスミドを大腸菌に感染
し、そのような感染大腸菌を培養し、次いでインターフ
ェロンを採取することを特徴とする、ヒト線維芽細胞型
インターフェロンβ1の製造法。 - 【請求項3】ファージが以下に示した遺伝子地図を有す
るClone C15を得ることのできるλ−Charon 4Aである、
特許請求の範囲第2項記載の方法: - 【請求項4】ヒト遺伝子DNA断片をファージから採取
し、大腸菌においてヒト線維芽細胞型インターフェロン
β1の合成を誘導することができる強力なプロモーター
を備えたプラスミド発現ベクターに導入する、特許請求
の範囲第2項記載の方法。 - 【請求項5】プラスミドが大腸菌のrecAプロモーターを
含むPBR322である、特許請求の範囲第4項記載の方法。 - 【請求項6】インターフェロンβ1遺伝子を含むヒト遺
伝子DNA断片をファージから取り、対応する成熟型イン
ターフェロンβ1の最初のメチオニンをコードするコド
ンの隣を切断し、トリプトファンプロモーターのRNAポ
リメラーゼ結合部位を含むように改良された大腸菌lac
プロモーターのリボゾーム結合部位に連結し、かくして
混成tryp-lacプロモーターのコントロール下にインター
フェロンβ1遺伝子を含むプラスミドを得、該プラスミ
ドを大腸菌に導入し、該大腸菌を培養してインターフェ
ロンを生産する、特許請求の範囲第2項記載の方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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---|---|
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JPS5965099A (ja) * | 1982-10-05 | 1984-04-13 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現用プロモ−タ−およびその用途 |
JPS6054685A (ja) * | 1983-09-02 | 1985-03-29 | Suntory Ltd | 改良発現ベクタ−およびその利用 |
ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
US4707445A (en) * | 1984-07-31 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Intact gene and method of excising and cloning same |
MY153357A (en) | 2007-08-07 | 2015-01-29 | Panasonic Corp | Ceiling fan |
NZ601790A (en) | 2010-02-24 | 2014-03-28 | Zymenex As | Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase |
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DE3176011D1 (en) * | 1980-06-12 | 1987-04-23 | Japan Found Cancer | Plasmid |
ZA816621B (en) * | 1980-09-25 | 1982-09-29 | Genentech Inc | Microbial production of human fibroblast interferon |
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-
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- 1982-07-06 GB GB08219499A patent/GB2103222B/en not_active Expired
- 1982-07-13 CH CH4268/82A patent/CH664761A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-07-14 DE DE19823226319 patent/DE3226319A1/de active Granted
- 1982-07-15 IT IT22411/82A patent/IT1195940B/it active
- 1982-07-15 CA CA000407391A patent/CA1339829C/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-16 JP JP57124313A patent/JP2501549B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-07-16 FR FR8212437A patent/FR2509614B1/fr not_active Expired
-
1992
- 1992-05-06 JP JP4113784A patent/JP2500174B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Title |
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Gene,Vol.14(1981)p.137−143 |
Nature,Vol.287(1980)p.193−197 |
Nucl.AcidRes.,Vol.9,no.3(1981)p.461−471 |
Pro.Natl.Acad.Sci,USA,Vol.77,no.9(1980)p.5230−5233 |
Also Published As
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GB2103222A (en) | 1983-02-16 |
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SE8203890L (sv) | 1983-01-17 |
SE8203890D0 (sv) | 1982-06-23 |
IL63327A0 (en) | 1981-10-30 |
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