DE3226319A1 - Verfahren zur herstellung von menschlichem interferon - Google Patents

Description

! Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Interferon (IPN). Die Erfindung betrifft die Herstellung großer Mengen menschlichen Interferons vom Fibroblasten-(ß)- oder Leukozyten- (o<)-Typ durch geeignete Bakterien, in welche ein Fragmenib menschlicher Genom-DNA eingeführt wurde. Menschliche DNA, welche direkt aus Blutzellen gewonnen wird, wird in geeignete -^l-Phagen kloniert. Hohe Interferonproduktion kann erreicht werden mit Bakterien, welche durch diesen rekombinanten λ-Phagen infiziert wurden,und das Interferon kann gewonnen und gereinigt werden aus den bakteriellen Lysaten, welche aus dieser Infektion hervorgehen. Die Genom-DNA wird auch in Bakterien expremiert, in welche sie mittels eines Plasmid-Vektors eingeführt, worden war, welcher zur Ausprägung geeignet ist.

Interferon und insbesondere menschliches Interferon gewinnt zunehmend an Bedeutung in einer Anzahl von Gebieten. Seine Herstellung ist ziemlich mühsam und Verbesserungen in den Verfahren zu seiner Gewinnung sind von großer Bedeutung und

großem Wert.
20

Die Ausprägung von Säugergenen in Bakterien wie E. coli wird gewöhnlich verhindert durch "intervening sequences", welche die codierende Sequenz des Gens unterbrechen. Es gibt jedoch eine gewisse Anzahl von Genen, welche keine Introns haben. Kürzlich zeigten Nagata et al. (I980) (Nature 287, 401-8), daß die Gene für menschliches Leukozyteninterferon <y ebenfalls keine Introns besitzen. Sie konnten ein geringes Maß von Ausprägung dieser Gene in

E. coil entdecken.
30

Menschliche diploide Fibrofalasten, welche durch doppelsträngige RNA induziert wurden, enthalten mindestens zwei mRNAs, welche für Interferon codieren (Weissenbach et al., 1980, PNAS 77, 7152-7156). Eine mRNA mit der Länge 0,9 kb (HS) entspricht der Hauptinterferonspezies IFN-B₁, vrelc'hes von diesen Zellen produziert wird. Dessen Aminosäuresequenz wurde teilweise bestimmt (Knight et al., 1980, Science 207, 325-6). Die Klonierurig dieser IFN-B₁ mRNA

mittels cDNA wurde durchgeführt, wobei das E. coli Plasmid PBR322 als Vektor diente (Goeddel et al., I980, Nucleic Acid Res., 8, 4057-4075)♦ Die Nukleotidsequenz dieser DNA-Klone entspricht derjenigen, welche für das Protein bestimmt wurde, und es konnte nach Konstruktion von Expressionsplasmiden gezeigt werden, daß die IFN-ß, cDNA die Synthese menschlichen Interferons in E. coli steuert.Ferner wurdenmenschliche Genomfragmente isoliert, welche das IFN- B₁ Gen (Mory et al., I98I, Eur. J. Biochem. 120,. 197-202) und das IPN-of -Gen tragen. Diesen Genen fehlen Introns, und sie können daher direkt in E. coli ausgeprägt werden.

Die Erfindung betrifft ein "Verfahren, bei dem ein bestimmtes Fragment menschlicher Genom DNA, welche aus menschliehen Blutzellen gewonnen wurde, in einen Bakteriophagen-Vekfcor geklont wird und direkt dazu benutzt wird, die Synthese von IPN in Bakterien zu bewirken. Diese produzieren im Verlauf ihrer Züchtung das Interferon. Bei dieser Methode bedarf es daher keiner langwierigen Präpara-

tion und Klonierung von DNA, welche über die gesamte Länge zur mRNA komplementär ist (cDNA). Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Stück DNA direkt aus einer leicht verfügbaren menschlichen Zelle, wie z.B. einer weißen Blutzelle, gewonnen und in einem λ-Phagen-

vektor kloniert. Das benötigte IFN-Gen wird nicht durch Introns unterbrochen und ist daher in der Lage, die IFN-Synthese in Bakterien zu steuern. Durch Infektion geeigneter Bakterien, wie E. coli, durch einen rekombinanten ^•-Phagen, welcher eine Insertion von menschlicher DNA

mit dem IFN-B₁-Gen oder dem IFN-tV-Gen enthält, wurde eine

J. C

hohe IFN-Aktivität erreicht. Aus den Bakterienlysaten, welche aus solchen Infektionen hervorgehen, wurde IFN gewonnen und gereinigt. Es zeigte sich, daß Phagen geeignete Vektoren für die Einführung menschlicher DNA-Frag-35

mente in Bakterien darstellen; besonders geeignet war % Charon 4A und führte zu hoher IFN-Produktion. Die Erfindung betrifft ferner die Einführung solcher geklönter

L -I

menschlicher Genom-DNA Fragmente in Expressionsplasmid-Vektoren (= Plasmidvektoren, welche zur Ausprägung genetischer Informationen geeignet sind), welche mit starken Promotoren versehen wurden. Das Verfahren kann mit verschiedenen IPN-(X - sowie IFN-ß,-Genen durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß diese keine Introns besitzen.

In einem Anwendungsbeispiel wurde ■ DNA eines erwachsenen Menschen durch partielle Eco Rl-Verdauung fragmentiert und in Xcharon 4A geklont. Von dem auf diese Weise erhaltenen Klon mit der Bezeichnung Klon.C15, welcher eine Insertion menschlicher DNA von etwa 17 kb Länge trägt, wurde gezeigt, daß er ein Gen für das Fibroblasten-Interferon IFN-B₁ enthält. Die Restriktionskartierung er-

gab, daß dieses Gen, welches auf einem 1,8 kb langen Eco Rl-Fragment liegt, nicht durch Introns unterbrochen wird. Dieses menscMJ.che Genom DNA-Fragment ist in der Lage, die Synthese/aktivem menschlichem IFN-ß, in E. coli und in anderen geeigneten Bakterien zu bewirken. Eine hohe IFN-Aktivität kann von Phagenlysaten gewonnen werden. Unter bestimmten Bedingungen wurden von Phagenlysaten Aktivitäten in der Größenordnung von 10 U/Liter erhalten. Es ist vorteilhaft, die Lysate zu Chromatographieren, vorzugsweise an Cibacron Blue Sepharose oder an ähnlichen Säulen.

Das auf diese Weise erhaltene Interferon hat die gleichen immunologischen Eigenschaften und die Artspezifität wie IFN, welches von menschlichen Fibroblasten hergestellt wird. Ähnliche Ergebnisse wurden mit IFN-OC erzielt, dessen Gen im Klon 18-3 nachgewiesen wurde, welcher ein 1J> kb

Fragment des menschlichen Genoms enthält.

In einem weiteren Anwendungsbeispiel wurde das menschliche Genom-DNA-Fragment, welches das IFN-B₁ oder

Gen enthält, in ein Plasmid eingeführt, wie z.B. das 35

Plasmid pBRj522, welches den recA-Promotor von E. coli enthält. Kulturen von E. coli, welche mit diesen rekombinanten

L J

Plasmiden transformiert wurden, erzeugten große Mengen von IFN-ß bzw. IFN-OC wenn der recA-Promotor durch Nalidixinsäure induziert wurde. Das IFN-B₁-Genom-Fragment wurde dann neben dem Codon für das erste Methionin des reifen IFN-B₁ geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle ( ribosomal binding site ) des E. coli Lac-Promotors liiert. Dieser Lac-Promotor war in der Weise verändert, daß er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Tryptophan-Promotors trägt. Mit diesem hybriden Tryp-Lac-Promotor war die IFN-B₁-DNA (aus dem menschlichen Genom) in der Lage, 10 U/ Liter IFN-B₁ 'in dem E. coli Minicell-Stamm P679-54 zu erzeugen. Ähnlich befriedigende Ausbeuten von IFN-ä" xvurden

erreicht, wenn das IFN-c<_c-Gen in geeigneter Weise an den Tryp-Lac-Promotor gekoppelt war. In allen Fällen wurde die IFN-Aktivität aus den bakteriellen Zellen durch Lyse mit Lysozym und 30 % Propylenglykol gewonnen und dann ebenso wie von den Phagenlysaten durch Chromatographie an einem hydrophoben Trägermaterial gereinigt. Für IFN-B₁ ist ein bevorzugtes Trägermaterial Cibacron Blue Sepharose. Die

Elution kann durch Substanzen, wie Ä'thylenglykol oder vorzugsweise Propylenglykol, erreicht werden. Weitere Reinigung von IFN-B₁ oder -(X kann erreicht werden durch Immun-

x C

affinitäts-Chromatographie an Säulen, welche monoklonale

Antikörper enthalten oder durch andere konventionelle 25

Techniken.

Es ist somit klar, daß menschliche Genom-DNA-Fragmente verwendet werden können für die Gewinnung großer Mengen von menschlichem IFN in E. coli oder anderen geeigneten

Wirtsbakterien. Wie oben dargestellt, umfaßt das Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung die Einführung eines Fragmentes menschlicher Genom-DNA in einen geeigneten Vektor, wie z.B. einen Phagen, Infektion einer Bakterienkultur mit diesen Phagen, welche zur Lysis dieser Bakterien führt und die Gewinnung des erzielten Interferongehalts aus diesem Lysat. Die Erfindung bezieht sich

L J

auf die neuartigen Phagen, welche durch die Einführung menschlicher Genom DNA erhalten wurden, und speziell auf rekombinante Phagen des ArTyps, wie z.B. der Klone C15, welcher zur Herstellung von IPN-B₂ führt, und 18-J5, weleher zu IFN-(X. führt. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren für die Herstellung von Interferon durch Einführung menschlicher Genom-DNA in einen geeigneten Phagen, Gewinnung eines geeigneten DNA-Abschnitts aus diesem Phagen, Einführung desselben in ein zur Expression geeignetes Plasmid von geeigneten Bakterien, Züchtung derselben und Gewinnung des erwünschten Interferons.

Ein bedeutender Vorteil dieser Erfindung ist es, daß Gene von kranken oder gesunden Individuen verglichen werden können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, IFN zu produzieren. Dadurch wird die Untersuchung genetischer Defekte der IFN

Produktion ermöglicht.

Material und Methoden Herstellung einer Bank mit menschlichen Genen

DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus peripheren Blutzellen eines Erwachsenen mit ß-Thalassemie gewonnen. DNA Aliquots (¹I-O ug) wurden getrennt 30 Minuten lang mit 100, 200 oder 300 Einheiten Eco Rl verdaut, dann 10 Minuten auf 65°C erhitzt und zusammen auf einen 10- bis ^Oprozentigen Sucrosegradienten aufgetragen, wie beschrieben. DNA Fragmente mit Längen zwischen 10 und 20 kb wurden wie bei Mory et al. (I980, Mol. Biol. Reports 6, 203-208) beschrieben, mit Th-Ligase an λ, Charon ¹IA DNA-A<rme. ligiert, welche durch Eco Rl Verdauung nach Maniatis et al. (I978, Cell 15* 687-7OI) präpariert wurden. In vitro Verpackung wurde, wie von Hohn und Murray (1977, PNAS ¹JK, 3259-3263)

L J

γ- . 3 2 2 6 3 1

beschrieben, durchgeführt, indem mehrere 8 pl-Aliquots des Ligierungsansatzes (0, 5 fS Vektor-DNA und 0,125 pl menschliche DNA) mit 50 jul Extrakten von E. coil BHB2688 /N205 recA"( λ-imm 4^4 cits b2 red 3 Earn¹!· Sam7)/^J "H^ BHB2690 ^N205 rec A~( *.imm 434 cits b2 red 3 Dam 15 Sam 1)/>J gemischt wurden. Pro jag rekombinierter DNA wurden 3 χ 10 pfu erhalten, im Vergleich zu 10 pfu/pg intakter DNA. Insgesamt wurden 1,8 χ Io rekombinante Phagen in 6 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,5* 10 mM Magnesiumsulfat, 0,01 % Gelatine verdünnt. Nach Zugabe von 0,1 ml Chloroform und nach Entfernen der Zellreste durch Microfuge Zentrifugation wurden die Phagen um den Paktor 10^ vermehrt, in-. dem 4x10^ pfu pro I5 cm Platte auf E. coIi DP50 (Leder

et al., 1977* Science I96, 175-177) plattiert wurden. Für . 4

^1b die Durchmusterung wurden 2x10 pfu jeweils auf 15 cm-Platten plattiert und nacheinander je zwei Nitrocellulosefilter-Abdrücke genommen; beschrieben bei Benton et al. (I977 , Science 196, I80-I82). Diese Tätigkeit wurde unter Ρ^,-Bedingungen durchgeführt.
**

Herstellung der IFN-ß-j cDNA-Sonde;

Es wurde Poly A⁺ RNA aus menschlichen Vorhautfibroblastenkulturen des Typs PSlI gewonnen, welche 4 Stunden lang durch 100 pg/ml Poly(rl):(rC), 50 pg/ml Cycloheximid (für

die letzte Stunde mit 2 pg/ml Actinomycin D) induziert worden waren. Die beiden Peaks von Interferon mRNA wurden durch Sucrosegradienten-Zentrifugation fraktioniert wie im einzelnen beschrieben bei Weissenbach et al. (I980 PNAS 77* 7152-7156; Weissenbach et al., 1979* Eur. J. Biochem., 98, 1-8). Die HS mRNA (1,5 ug) wurde verwendet, um RNA-cDNA-Hybride mittels reverser Transcriptase von Avian Myoblastosisvirus (J. Beard) und Oligo(dT) herzustellen wie in der vorher zitierten Arbeit von Weissenbach et al. beschrieben (1980, PNAS 77, 7152-7I56). Die RNA-cDNA-Hybride wurden

direkt geklont entsprechend Zain et al. (1979* Cell 16, 85I-86I), jedoch wurden dCTP für die Verlängerung der Hy-

L J

„ΙΟΙ bride und dG-verlängerte, Pst gespaltene pBR522 DNA als Vektor verwendet (Chang et al», 1978, Nature 275, 617-624). Insgesamt wurden 12 500 tet^r amp^s Transformanten von E. coli MM294 erhalten;vgl.Stenlund et al» (198O_S Gene 10, 47-52).

32

Koloniehybridisierung wurde mit ^ p~eDNA-Sonden durchgeführt, welche entweder von IIS mRNA (6 jug) aus induzierten FSH Zellen oder von Gesamt-Poly A⁺-RNA (5,7 jug) aus nichtinduzierten Zellen transcribiert worden waren. Die cDNA Synthese wurde gestartet mit einem synthetischen komplementären Primer (siehe Narang et al», 1979* Methods Enzymol. 68, 90-98), 5^!GAGATCTTCAGTTTC 3', welcher die BgI II Erkennungsstelle der IFN-B₁ Sequenz enthält. Mit einer Startersequenz (Primer), welche am 5^!-Ende mit ^J P markiert war (Houghton et al., 1980, Nucl« Ac. Res. 8, 1913-1951), konnte eine erwartete cDNA von 640 Nukleotidenlänge nur dann beobachtet werden,, wenn induzierte RNA als Matrize (Template) verwendet wurde» Um die Sonden herzustellen, wurden jeweils 20 pMol Primer mit jeder RNA in 4 pl 0,4m KCl bei 30°C für 60 Minuten hybridisiert, dann 2 Stunden lang bei 57°C inkubiert, und zwar in einem Volumen von 25 ul, mit jeweils 200 pCi von ^²P~öC-dATP und dCTP (beide 400 Ci/mMol), 0,5 mM jeweils von dGTP und TTP, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 4 mM Magnesiumchlorid, 5'mMol Dithiothreitol,50 ug/ml Actinomycin D, 4 mM Pyrophosphat und 50 Einheiten reverse Transeriptase» Nach Zugabe von 25 jug E. coli DNA wurde der Ansatz 60 Minuten bei 70°C mit 0,3N NaOH behandelt, neutralisiert und filtriert durch Sephadex G-50 in 50 mM Tris-HCl pH 8, O₅IM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 % Dodecylsulfatc Von jeder RNA wurden 5x10 cpm cDNA erhalten. Kolonien, die auf Nitrocellulosifiltern gewachsen waren, wurden fixiert und die DNA denaturiert,wie bei Thayer beschrieben (1979 Anal. Biοehem. 98, 60-65)» Jedes Filter wurde 4 Stunden bei 67⁰C vorhybridisiert mit 10 ml 6xSET (SET=150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl pH8), lOxDenhardt-Lösung (Denhardt I966, Biochern* Biophys» Res. Comm. 25, 641-646), 0,1 $ Natriumpyrophosphat, 50 ug/ml denaturier-

L J

^ter E. coli DNA. Die Filter wurden bei 67⁰C l4 bis 18 Stunden lang hybridisiert in der gleichen Lösung mit 0,5x10

32
cpm/Filter von jeder der beiden P-cDNA-Sonden, 10 ug/ml Poly A und 2,5 ug/ml Poly C. Die Filter wurden 1 Stunde lang bei 67⁰C in der Vorhybridisierungslösung gewaschen und dann noch dreimal für jeweils 30 Minuten bei 67⁰C mit JJxSET, 0,1 <fo Pyrophosphat, 0,1 fo Dodecylsulfat, und dann 60 Minuten bei 25°C mit 4xSKT, siehe Maniatis (I978, Cell 15, 687-70I). Die Filter wurden getrocknet und mit Agfa Curix Roentgenfilmen mit Verstarkerfolien 1 bis 2 Tage lang bei -70⁰C exponiert.

Von 5500 geprüften Kolonien hybridisierten 14 vorzugsweise mit cDNA von induzierter mRNA, während I30 auch mit cDNA von nichtinduzierter mRNA hybridisierten. DNA (0,3 MS) der Plasmide der ersten Gruppe wurde auf Filtern hybridisiert (Kafatos et al., 1979, Nucl. Ac. Res. 7, 1541-1552) mit dem Primer selbst, der am 5'-Ende ^ P markiert war (0,3 pMol, 4x10 cpm), und zwar in 6xSSC, lOxDenhardt-Lösung für 21 Stunden bei 35°C; anschließend wurde mit 6xSSC (900 mM NaCl, 90 mM Natriumeitrat) bei 35 C gewaschen. Ein Klon 1-6-5 war stark positiv und die DNA Sequenzierung (siehe Maxam et al., 1980, Methods Enzymol. 65, 499~56o) zeigte, daß er etwa 370 Nukleotide vom 3'-Ende der IFN-B₁ Sequenz

enthielt. Es wurden weitere 50 000 Klone geprüft, welche wie besehrieben hergestellt wurden durch Einspleißen von dC-verlängerter doppelsträngiger cDNA von Suerosegradienten-gereinigter, induzierter mRNA in die Pst I Schnittstelle von pBR322: Es zeigte sich, daß der Anteil von IFN- Q₁ Klonen 0,16 % (80 Klone) betrug im Vergleich zu 0,65$ ßg Klonen.

Der oben beschriebene und von FS-Il mRNA hergestellte Klon IFN-ß., 1-6-5 wurde verwendet, um die menschliehe Genbank

durchzuprüf en.

L j

_ 12 _

Isolierung des Genom-Klons: IFN-ß, Klon 15 Plasmid DNA der IPN-B₁-CDNA-Klone wurde durch Nicktranslation nach Rigby et al. (1977, J. Mol Biol. 113, 237-251) mit 2x10 cpra/pg DNA markiert und 10 cpm/Filter an die

menschliche Genbank hybridisiert. Die Vorbereitung der Filter, die DNA-Denaturierung sowie die Hybridisierungsverfahren waren wie vorstehend beschrieben. Phagen von solchen Plaques, welche positive Hybridisierung ergaben, wurden er-

2
neut mit einer Dichte von 1-2x10 pfu auf 9 cm-Platten plattiert und erneut geprüft. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, bis mehr als 95 % der Plaques auf der Platte mit IFN-ß, cDNA hybridisierten.Der Phagenklon C15 wurde von einem solchen Plaque isoliert.

Phagen wurden in Flüssigkulturen vermehrt gemäß Blattner et al. (1977, Science I96, I6I-I69). E. coli

DP50 wurde.über Nacht vermehrt in 1 % Trypton, 0,5 % NaCL, 0,5 % Hefeextrakt, 0,2 fo Maltose, 0,25 % Magnesiumsulfat,

0,01 % Diaminopimelinsäure, 0,004 % Thymidin. Etwa 0,3 ml 20

der Kultur wurden zur Präadsorption mit 0,3 ml 10 niM Ma-

7 gnesiumsulfat, 10 mM Calciumchlorid und 10 Phagen für 20

Minuten bei 37 C gemischt. Die Kulturen wurden dann verdünnt in eine 2 Liter Flasche mit 500 ml vorgewärmtem Medium, welches 1 % NZ Amin, 0,5 $ Hefeextrakt, 0,5 % Natrium-25

chlorid, 0,1 % Casaminosäuren,0,25 % Magnesiumsulfat, 0,01 % Diaminopimelinsäure und 0,004 Thymidin enthielt. Diese Verdünnung wurde bei guter Belüftung I5 bis 18 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Nach erfolgte Lyse wurden die Zellreste durch Zentrifugation in der Kälte für 15 Minuten bei 7OOO rpm in einem Sorvall GSA Rotor entfernt. Aus diesem geklärten Lysat wurden die Phagen mit 7 % Polyäthylenglykol 6000 ausgefällt und durch zwei aufeinanderfolgende Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Die DNA des Phagen CI5 wurde phenolgereinigt und ihre Struktur analysiert durch Restriktionsenzymverdauung, horizontale Agarose-Gelelektrophorese in 20 mM Tris-Base, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA

L J

r _ ₁₅ _■ 32263Ί9π

mit 0,5 jug/ml Ethidiumbromid, anschließenden Transfer auf Nitrocellulosefilter (Southern, 1975, J. Mol.Biol. 98, 502-517) und Hybridisierurig mit Nick-translatierter IPN-B₁ cDNA wie vorstehend beschrieben. Eco Rl Fragmente von"C15 DNA wurden in die Eco Rl Schnittstelle von pBR322 subkloniert, um eine genaue Restriktionskartierung der Plasmid DNA nach der üblichen Methode durchzuführen (siehe Bolivar 1979, Methods Enzymol. 68, 245-2β7).

Messung der Interferon-Aktivität in Phagenlysaten; Geklärte Lysate des Phagen IPN-B₁ CI5 wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und gegen Phosphat-gepufferte Saline (PBS) 7 Stunden lang dialysiert« Eine 10 ml Probe davon wurde auf eine 0,5 ml Säule von Cibaeron Blue-Sepharose CLÖB (Pharmacia Pine Chem.) aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen mit 10 bis I5 ml IM NaCl, 0,02M Natriumphosphatpuffer pH 7,2 und anschließend mit 10 ml 50 % Propylenglykol in der Waschlösung. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und bei 4° C aufbewahrt; in einigen Fällen wurde 0,1 fo menschliches Serumalbumin zur Stabilisierung zugefügt. Die Interferon-Aktivität wurde gemessen, wie bei Weissenbach et al. (1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8) beschrieben. Hierzu wurde jede Fraktion serienweise in eine Mikrotiterplatte (95 Vertiefungen) verdünnt. Jede Vertiefung enthielt 2-5x10 menschliche FSll-Pibroblasten in 0,1 ml Minimum Essential Medium (Gibco), 5 % fötales Kalbsserum (PCS), 0,5 % Gentamycin. 'Nach 18 Stunden bei 37°C wurde das Medium entfernt und Vesicular stomatitis Virus (VSV) in Medium mit 2 % PCS hinzugefügt (1 pfu/Zel-Ie). Eine Hemmung des cytopathischen Effekts wurde 30 bis 4o Stunden nach Infektion im Vergleich mit IPN-ß NIH Standard G025-902-527 festgestellt. Die antivirale Aktivität

■5 wurde ebenfalls gemessen durch die Abnahme des ^H-Uridin-Einbaus nach VSV-Infektion, wie früher beschrieben (Weissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). Antiserum gegen IPN-ß wurde von Kaninchen hergestellt und geprüft,

L J

wie vorstehend beschrieben (Weissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). Für den Neutralisationstest wurden 0,1 ml Antiserum (Titer 10 U/ml) oder Nichtimmunserum mit 0,2 ml einer 50prozentigen Suspension von Protein A-Sepharoseperlen (Pharmacia Pine Chem.) in PBS für 1 Stunde bei 57°C gemischt. Die Perlen wurden zweimal mit PBS gewaschen, und 0,1 ml bakterielles Interferon (100 U/ml) wurden hinzugefügt. Nach 2 Stunden bei Jf⁰C .wurden die. Perlen zentrifugiert und der Überstand geprüft auf die Hemmung von H-Uridin-Einbau in VSV-infizierte Zellen.

Isolierung des Genom Klons: IFN-QL Klon 18-3 Zwei kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die wie vorstehend beschrieben chemisch synthetisiert worden waren, wurden benutzt, um die menschliche Genbank direkt durchzuprüfen. Die Oligonukleodide sind komplementär zur ge-.meinsamen Sequenz von IFN-CX Genen und haben die Sequenz 5'CTCTGACAACCTCCC y und 5'CCTTCTGGAACTG 3'. Die Oligonukleotide wurden nach 5'-Markierung, wie vorstehend be-

schrieben, entweder direkt benutzt oder als Primer für cDNA Synthese an der RNA von Sendai-Virus induzierten

"52

menschlichen Leukämie-Zellen. Die ^ P-Oligonukleotide oder die cDNA's wurden gegen die DNA von insgesamt 500 000 re~ kombinanten X-Phagen hybridisiert wie vorstehend dargestellt. Etwa 5x10 cpm wurden pro 9 cm-Nitrocellulosefilter eingesetzt. Die Hybridisierungen wurden durchgeführt in versiegelten Plastikkochbeuteln mit einem möglichst geringen Flüssigkeitsvolumen. Die Hybridisierung mit den

15 Basen langen Primern' wurde folgendermaßen durchgeführt: 30

Zunächst Vorhybridisierung in oxSSC, lOxDenhardt Lösung bei 37⁰C für k Stunden; dann Hybridisierung in 6xSSC, 1Ox Denhardt Lösung bei 37 C für l8 Stunden; anschließend 3- bis 4maliges Waschen für 30 Minuten jeweils in 6xSSC bei 37 C oder solange, bis keine Radioaktivität mehr in der Waschflüssigkeit gefunden wurde. Für die Hybridisierung mit dem 13 Basen-Primer wurde die Temperatur für Hybridi-

L j

sierung und Waschen auf 30⁰C erniedrigt. Insgesamt 16 Phagen zeigten eine positive Hybridisierung und wurden weiter analysiert durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung.' Von Klon 18-3 wurde gezeigt, daß er 3 IFN-(X Gene enthielt, von denen eines die gleiche Sequenz hatte wie der cDNA Klon OC_n von Goeddel et al. (I98I, Nature 290, 20-25). Der Klon 18-3 wurde gereinigt wie für den Klon CI5 vorstehend beschrieben. Die Ausprägung des Klons 18-3 in ^.Bakteriophagen und nach seiner Insertion in einen Expressions-Plasmid-.10 Vektor wird im Ergebnisteil beschrieben.

Ergebnisse

1. Struktur des Genom-Klons

Dieser Phagenklon wurde isoliert von einer menschlichen DNA-Bank, welche durch partielle Verdauung mit Eco Rl und Klonierung in die Arme von 3. Charon 4a erhalten worden war. Der Klon hybridisierte stark an zwei unterschiedliche IFN-S₁ cDNA-Sonden, welche unabhängig voneinander von mRNA Fraktionen zweier Stämme von menschlichen Fibroblasten hergestellt worden waren. Die Verdauung der Phagen-DNA durch Eco Rl zeigt neben den zwei A-Armen noch 4 Fragmente von 12, 2,6, 1,84 und 0,6 Kilobasen Länge (Fig. IA). Transfer auf Nitrocellulose nach Southern (1975* J· Mol.

Biol. 98, 503-517) und Hybridisierung mit Nick-translatler ter DNA des IFN-B₁ 1-6-5 cDNA-Klons zeigte, daß das 1,84 kb Fragment das IFN-B₁ Gen enthielt. Dieses Eco Rl Fragment wurde erneut geklont in die Eco Rl Schnittstelle von pBR322; die Restriktionsanalyse dieses 1,84 kb Subklons mit BgI II, Pvu II, Pst I, Hinc II und Taq I sowie Hybridisierung mit partiellen sowie Gesamt-IFN-ß., cDNA-Sonden erlaubten den Schluß, daß die für das IFN-B₁ Präprotein codierende Sequenz (Hinc II Erkennungsstelle) etwa 350 Nukleotide von der Eco Rl Schnittstelle entfernt beginnt

(Fig. IA). Die Entfernungen zwischen den verschiedenen Restriktionsstellen in der Genom DNA sind im Rahmen des ex-

L J

r "' * ₁₆ 32263Ί 9~ι

perimentellen Fehlers die gleichen wie die in der cDNA-Sequenz (Tabelle I). Keine unerwarteten Restriktionsstellen wurden im Bereich der für IFN-ß., codierenden Region gefunden, was bedeutet, daß keinerlei meßbare intervening sequence vorliegen.

Partiell rait Eco Rl gespaltene C15 DNA zeigte, daß das 0,6 kb Eco Rl Fragment zwischen dem 1,84 und dem 2,6 kb Eco Rl Fragment liegt. Eine Bam Hl Spaltstelle wurde in dem 2,6 kb Fragment gefunden, nicht jedoch in den anderen Eco Rl Fragmenten des menschlichen DNA-Abschnitts. Das 1,84 kb Eco Rl Fragment, welches an IFN-B₁ cDNA hybridisiert, wurde auf einem 9,6 kb Bam Hl Fragment der C15 DNA gefunden. Wie in Fig. 1 dargestellt, kann dieses Fragment nur von einer Bam Hl Schnittstelle des rechten X Arms (5,1 kb von Eco Rl) stammen, wobei 4,5 kb für das Eco Rl- · Bam Hl Segment des menschlichen DNA Inserts übrig bleiben. Dies bedeutet, daß das 1,84 kb Eco Rl Fragment unmittelbar neben dem rechten StArm liegen muß. Die Gen-

orientierung (Fig. IA) wurde auf folgende Weise festgestellt: Wenn C15 DNA mit Pvu II geschnitten und an die gesamte IFN-B₁ cDNA oder deren 5'-Hälfte hybridisiert wurde, so wurde ein 0,66 kb Fragment gefunden, welches nur an das 5'-Ende von IFN-B₁ hybridisiert. Wenn jedoch

. das 1,84 kb Eco Rl Stück mit Pvu II geschnitten wurde, so befand sich das 5'-Ende von IFN-ß·, auf einem kleineren 0,5^· kb Fragment. Da keine Pvu II Schnittstelle auf dem 0,6 kb Eco Rl Stück des menschlichen Inserts gefunden wurde, muß das 0,66 kb Pvu II Fragment im rechten Λ Arm

enden und somit ist das 5'-Ende von IFN-B₁ unmittelbar

dem rechten XArm benachbart. Die in Fig. IA gezeigte Anordnung wird bestätigt durch mehrere weitere Restriktionskartierungsexperimente mit Hind III, Sma I und BgI II Verdauung. Die codierende Sequenz des IFN-B₁ Gens in Klon 35

CI5 war daher etxva 1775 Nukleotide von dem starken Λ.Ρ_Τ

Promotor entfernt inseriert worden, welcher die linksge-L j

richtete Transkription kontrolliert (Williams et al., 1980, Genetic Engineering VoI II, pp201-28l, Plenum Corp.), und befindet sich in der passenden linksgerichteten Orientierung. Dies zusammen mit dem Fehlen von nachweisbaren Introns veranlaßte die Untersuchung, ob Interferon von E. coli produziert werden konnte, welche mit den rekombinanten Phagen CI5 infiziert waren.

2. Gewinnung von biologisch aktivem Interferon von Lysaten von E. coli, infiziert mit dem IFN-ß^ CI5 Phagen:

Phagen des Klons CI5 wurden„in 500 ml Kulturen von E. coli

in "Methoden" ^:—

DP50 vermehrt, wie vorstehend/beschrieben. 10 ml des geklärten Lysates wurden dialysiert und auf eine kleine Cibacron Blue-Sepharose-Säule (0,5 ml) aufgetragen. Die Praktionen wurden auf ihre Hemmung des cytopathischen Effekts von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) untersucht, wobei ein IFN-ß Standard als Referenz benutzt wurde. In einem Experiment, bei dem der Phagentiter im Lysat 1,5x10 ° Phagen/ml betrug, wurde das Interferon-Aktivitätsmuster gefunden, welches in Fig. 2 dargestellt ist. Insgesamt wurden 7500 Einheiten von IFN Aktivität in Fraktionen gefunden, welche durch 50 % Propylenglykol-IM NaCl von der Säule eluiert wurden. Dies würde 0,75x10 Einheiten/Liter Lysat entsprechen. Im Rohlysat war die nachweisbare Aktivität jedoch wesentlich geringer. Dies läßt vermuten, daß gewisse Stoffe im Lysat den korrekten Nachweis der IFN Aktivität verhinderten. In einem Rekonstruktionsexperiment wurde menschliches Standard IFN-ß zu einem Wildtyp XCharon 4A Lysat gefügt,und tatsächlich betrug die gemessene Aktivität nur 1/10 der Zugabe. Wenn dieses Gemisch über die Blue-Sepharose-Säule gegeben wurde, wurden 75 # der Input-Aktivität wiedergefunden. In einem Kontrolllauf wurde das Lysat vom Wildtyp ^ Charon 4A Phagen (ohne IFN-Zugabe) untersucht,und keine IFN Aktivität wurde gefunden (Fig. 2).

Id

Das chromatographische Verhalten von IPN von Lysaten des Klons CI5 kann unterschiedlich sein. In einem Experiment, bei dem der Phagentiter 3x10 pfu/ml war, war die IPN Aktivität hoch, wurde jedoch auf der Blue-Sepharose-Säule nicht zurückgehalten. In diesem Lysat belief sich die gesamte Aktivität, welche von der Säule zurückgewonnen wurde, auf 70 bis 80 000 Einheiten IPN bei einem Einsatz von 10 ml Lysat (7-8x10 Einheiten/Liter). Die eluierten Fraktionen wurden "erneut adsorbiert an einer zweiten Blue-Sepharose-Säule. Diesmal wurde die Aktivität von der Säule zurückgehalten, jedoch wieder eluiert beim Waschen der Säule nur mit PBS. Menschliches IPN-ß, sollte normalerweise von Blue-Sepharose nur durch hydrophobe Lösungsmittel eluiert werden (Knight et al., I980, Science 207, 525-526). Daher wurde menschliches Standard IPN-ß mit dem gleichen Phagen-Iysat gemischt und auf die Säule aufgetragen: 30 % der Aktivität wurden nicht zurückgehalten,und die Rückgewinnung der Aktivität betrug nur 25 %. Dies läßt vermuten, daß Komponenten dieses Lysats wahrscheinlich die Wechselwir-

kung des IPN-ß, insbesondere des bakteriell produzierten, mit Blue-Sepharose destabilisierten. Obwohl Interferon nicht von der Säule zurückgehalten wurde, wurden mehr als 90 % des Proteins des Lysats aus den aktiven Fraktionen entfernt, welche eine spezifische Aktivität von 4-5x10 .

Einheiten/mg Protein hatten. Diese partielle Reinigung

war wichtig für die Entfernung der Chemikalien, welche . die Aktivität in den Rohlysaten maskierten. In einem Versuch wurde IPN Aktivität des Klons CI5 auch rückgewonnen

nach Chromatographie des Lysats an Carboxymethyl-Sepharose 30

(nicht gezeigt).

J>. Eigenschaften von Interferon, welches in E. coli Zellen

produziert wurde, die durch Klon CI5 infiziert waren Die Interferon-Aktivität, welche nach dem Chromatographie-

GO "Z.

schritt erhalten wurde, erniedrigte den H-Uridin-Einbau in VSV-infizierte menschliche Zellen nach Actinomycin D

L ■ J

Behandlung (Weissenbach, 1979* Eur. J. Biochem., 98, 1-8). Die Titratidnskurve, welche für bakterielles IFN-J3 erhalten wurde, war ähnlich derjenigen für menschliches Standard IFN- ^ ß (Fig. 3)· Um die immunologischen Eigenschaften des bakteriellen IFN zu prüfen, wurde das partiell gereinigte Produkt mit Kanlnchenanti-IFN-ß-Serum (inaktiv gegen IFN-o< ) gemischt oder mit Kaninchen-Nichtirnmün-Serum, welches vorher an Protein A-Sepharose gebunden war. Der Überstand wurde nach Zentrifugation auf IFN Aktivität geprüft: Anti-IFN-ß-Serum beseitigte die gesamte Interferon Aktivität, wohingegen die Aktivität erhalten blieb, wenn Nichtimmun-Serum verwendet wurde (Fig. 3). Das bakterielle IFN (20 U/ml) wurde in ähnlicher Weise neutralisiert, wenn es nur mit Anti-IFN-ß (20 U/ml) auf der Zellkultur gemischt und auf Hemmung des "cytopathischen Effekts von VSV untersucht wurde.

Die Spezies-Spezifität des bakteriellen Interferons wurde durch Vergleich der verschiedenen Zelltypen untersucht.

Ebenso wie menschliches IFN-ß zeigte das Produkt von Klon Cl5-infizierten E. coli weniger als 10 % Aktivität auf Affennierenzellen BSC-I und Rinder-MDBK-Zellen im Vergleich zu menschlichen Zellen. Keine antivirale Aktivität konnte gefunden werden bei Maus-L- oder A9~Zellen (Tabelle II). Die gleichen Ergebnisse wurden erzielt mit 6000 U/ml von bakteriellem IFN, welches von Klon CI5 produziert wurde.

Die vorliegende Erfindung beweist somit, daß das IFN-B₁ Gen, welches direkt aus Fragmenten einer partiellen Eco Rl Verdauung der menschlichen Genom DNA isoliert wurde durch Klonierung in λ. Charon 4a, ausgeprägt werden kann und zu Anhäufung signifikanter Mengen von IFN Aktivität in den Kulturlysaten führt. Die erzeugte Aktivität ist ganz klar Fibroblasteninterferon (ß), was durch seine immunologischen Eigenschaften und "seine Spezies-Spezifität gezeigt

wurde. Die Aktivität wird von der Bakterienkultur nur produziert als Reaktion auf die Infektion durch den IFN-B-, CI5 Phagenklon. Die IFN Aktivität, welche in E. coli durch den Klon CI5 hervorgerufen wird, entspricht dem menschlichen IFN-ß in seinen chromatographischen Eigenschaften auf Cibacron Blue Sepharose. Der .chromatographische Schritt ist wichtig für die Gewinnung hoher Aktivität (bis zu 7x10 Einheiten/Liter) aus dem bakteriellen Lysat. Interferone stellen somit die ersten Beispiele von biologisch aktiven Proteinen dar, welche von Bakterien unter der Kontrolle eines Stücks menschlicher DNA hergestellt werden, welches direkt aus dem menschlichen Genom eines Individuums gewonnen wurde.

4. Genom-IFN-DL-Klon 18-3

¹¹ C»

Dieser Klon wurde identifiziert durch direkte Hybridisierung von kurzen Oligonukleotiden, welche komplementär zu Sequenzen in IFN-of chemisch synthetisiert wurden. Von insgesamt 0,5x10 Genom-Klonen

waren 16 Klone positiv in der Hybridisierung. Die Eco Rl Fragmente, welche mit den Oligonukleotiden hybridisierten, wurden sequenziert,und von Klon I8-3 wurde,wie in Fig. IB gezeigt, nachgewiesen, daß er ein 2 kb Eco Rl Fragment 18-33 enthielt (Einschub in Fig. IB), auf welchem das Gen für IFN-K liegt." Dieses Gen ist einwandfrei die Quelle der mRNA, welche zu dem IFN-Of Klon führte, von dem Goeddel et al. berichten (I98I, Nature 290, 20-25). Klon 5-1 stellt ein überlappendes DNA-Fragment dar. Zusammen tragen Klon 5-1 und Klon I8-3 zusätzlich zu dem IFN-G: Gen zwei weitere IFN-Oi Gene, welche Of- 2 und cv-ij. bezeichnet werden (Fig. IB).

L J

5« Ausprägung menschlicher IPN Genom-Fragmente unter der Kontrolle des recA-Promotors ■

Der recA Promotor gilt als einer der stärksten E. coli Promotoren. Normalerweise ist er stark repremiert durch das Produkt des lex-Genes, sogar wenn ein Multicopy-Plasmid, wie pBRj522,vorhanden ist. In Gegenwart geschädigter DNA wird es dazu induziert, seinen eigenen Repressor zu spalten und wird in sehr starkem Maße induziert (Sancar und Rupp, 1979, PNAS 76, 3144-3148). Die Standardinduktoren für recA sind Nalidixinsäure (welche die DNA Synthese blockiert) oder Mitomycin C (welchesQuervernetzungen der DNA bewirkt).

Ein Plasmid, pDRl45]5, welches das geklonte recA-Gen enthält, wurde verwendet, um den Promotor auf einem Taql-BamHI Fragment von etwa 1 Kilobase zu isolieren. Dieses wurde in pBRJ22 ligiert, welcher geöffnet wurde mit CIaI und Baml, wobei das Plasmid RAP-I entstand. Die Taql-Clal Ligierung stellt die CIaI Schnittstelle in diesem Fall wieder her, was ermöglicht, daß das Plasmid nur noch im dritten Codon des recA-Gens geöffnet werden kann. RAP-2 wurde konstruiert durch Spaltung von RAP-I mit Eeo Rl und Clal, Auffüllen der sticky ends und erneuter Ligierung, welche die Eco Rl Schnittstelle wieder herstellte. Wenn RAP-2 an der Eco Rl Stelle geöffnet wird, kann Fremd-DNA am dritten Codon des recA-Proteins inseriert werden.

Der RAP-I Vektor wurde benutzt für die indirekte Ausprägung der Interferon-Aktivität durch Genom-Fragmente der menschlichen Genom-Bank. Das IFN-ß^ Gen sowie mehrere isolierte IFN-Oi Gene der C* Unterklasse produzierten

starke Interferon-Aktivität (bestimmt durch den Standard Antivirus Test), wenn sie in dieses Plasmid inseriert

wurden. Diejenigen Rl Fragmente der DNA, auf welchen diese Gene liegen (Fig. IA und B), wurden in Rl Schnittstelle

L _T

des Plasraids RAP-I subkloniert. Das Plasmid wurde in einen

+ wurden

recA Wirt gebracht, die Bakterien/Kultiviert und mit

Sodann wurden die Nalidixinsäure induziert./Zellen geerntet, mit Lysozym plus 3>0 $ Propylenglykol lysiert und der Extrakt auf antivirale Aktivität geprüft. Die Höhe der Aktivität hängt deutlich ab von der Reduktion durch Nalidixinsäure, wobei das Optimum 50 Ug/ml beträgt (Tabelle III). In einigen Fällen erzeugt das Genom-Fragment interessanterweise Aktivität in beiden möglichen Orientierungen in Bezug zum recA Promotor. Die IFN-B₁ und IFN-Of Gene, welche Aktivität zeigten, lagen alle auf DNA Eco Rl Fragmenten von 1,8-2 Kilobasen Länge, so daß die Entfernung vom Promotor zum ATG Startcodon des Interferon-Gens in der Größenordnung von Hunderten von Nukleotiden ist.

Diese Experimente beweisen, daß der Promotor erwartungsgemäß funktionsfähig ist und sie erlauben die schnelle Be-. Stimmung, welche der interferonähnlichen Gene aus der Gen-Bank aktiv sein können.
20

6., Starke Expression des IFN-B ₁ Gens unter der Kontrolle

des Tryp-Lac-Hybrid-Promotors
Das Plasmid PLJ3 (Johnsrud, PNAS, 1978, 75, 5314-531S) enthält zwei Lac-Promotoren, von denen jeder 95 Basenpaare _oc Sie sind
^^b lang ist ./durch 95 Nukleotide voneinander getrennt, die nichts damit zu tun haben. Dieses Fragment von 285 Nukleotiden Länge ist inseriert in die Eco Rl Schnittstelle des Plasmids PMB9. Die 95 Basenpaare langen Lac-Sequenzen enthalten den Operator und die Promotor-Sequenz und enden unmittelbar vor dem ATG Codon der ß-Galactosidase. Eine codierende DNA-Sequenz mit einem ATG Initiator-Codon, die in geeigneter Entfernung von der ribosomalen Bindungsstelle des ß-Galactosidase-Gens inseriert ist, sollte korrekt in E. coli Zellen exprimiert werden. Das Eco Rl Fragment mit den 285 Basenpaaren wurde subkloniert an der Eco Rl Schnittstelle von pBR322; die Rekombinanten wurden gesucht, indem

L J

-· 23 -

Zellen auf Platten gezüchtet wurden, welche 4o pg/ml X-gal und 15 ug/ml Tetracyclin enthielten. Nur positive blaue Kolonien wurden zusammengefaßt und die DNA durch Cäsiumchloriddichte-Gradientenzentrifugation gereinigt. 5

Zwei Orientierungen der Lao-Promotoren können erwartet werden; entweder gegen das Ämpicillin-Gen gerichtet oder gegen das Tetracyelin-Gen von pBR322. Da nur an der Eco Rl Schnittstelle Interesse bestand , welche zwi-

sehen der ribosomalen Bindungsstelle von Lac und der pBRJ22 Sequenz liegt, wurde diese Stelle durch Bindung mit RNA Polymerase an die Plasmid DNA geschützt, während die distale Stelle durch Eco Rl Restriktion geöffnet wurdest dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt und erneut Iigiert wurde. Nach Transformation von Zellen des E. coli Stammes MM294 wurden die Plasmide isoliert und die Entfernung zwischen der Eco Rl--und dem Barn HI-Schnittstelle von pBR322 gemessen. Die Plasmide, welche ein 375 Basenpaar-Fragment enthielten, waren diejenigen, in denen die Lac Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen ausgerichtet waren, während diejenigen mit einem 670 Basenpaar-Fragment (375+ 295 Basenpaare) die Lac-Promotoren gegen das Ampicillin-Gen gerichtet hatten.

Von dem 1,84 kb Eco Rl Subklon des IFN-B₁ Genom-Fragments wurde ein Hindi-BgIII Fragment herausgeschnitten, welches die Präinterferonsequenz enthielt. Das reife IFN-B₁ Protein enthält an seinem aminoterminalen Ende ein Methionin, welches in E. coli als Initiatorcodon benutzt werden kann. Es gibt zwei AIuI Erkennungsstellen dicht bei diesem ATG Codon, welche durch I3 Nukleotide getrennt sind, eine AIuI Stelle ist 8 Nukleotide vor dem ATG, während die andere 2 Nukleotiden nach dem ATG liegen. Das HincII-Bglll Fragment wurde partiell mit AIuI gespalten und Fragmente von etwa 510

Basenpaaren von Agarosegelen isoliert. Der Vektor, welcher die Lac Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen gerichtet ent-

hielt, wurde mit Eco Rl gespalten, die Spaltstelle mit DNA-Polymerase aufgefüllt und mit BamHI erneut geschnitten. Nach Ligierung der Alul-Bglll Fragmente an den aufgefüllten Eco Rl-BamHI Vektor wurde die Eco Rl Schnittstelle wieder hergestellt. Um die Klone mit dem ATG Codon (I5 Nukleotide langer) erkennen zu können, wurden die erhaltenen Klone mit Eco Rl und Pstl gespalten; die Klone, welche die erwarteten Fragmente von I5I Basenpaaren Länge enthielten, wurden sequenziert. Die Eco Rl Spaltstelle wurde erneut geöffnet und die Entfernung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem ATG durch BaI 1 Verdauung verkürzt und erneut ligiert. E. coli Zellen, welche bei diesen Plasmiden transformiert worden waren, wurden auf IFN-B₁ Produktion untersucht.

Ein Klon, L-Il, produzierte ungefähr 3x10 U/Liter von IFN-ß. Die Lac-Promotor-Region in diesem Klon wurde gespalten mit HpaJI, d.h. 17 Nukleotide vor dem Start der mRNA. Um das IFN-B₁ Gen herauszuschneiden, wurde das Enzym SaujJa benutzt, welche die DNA genau J Nukleotide jenseits des Stop-Codons von IFN-B₁ spaltet.

Dieses Hpall-SaujJa LaC-IFN-B₁ Fragment wurde eingespleißt zwisehen die CIaI und Hindlll Erkennungsstellen eines Tryp-Promotorplasmids, welches wie folgt hergestellt wurde. Ein 180 Nukleotide langes Taql-Taql Fragment von -21 bis -201 vor dem Start der Tryp mRNA wurde aus dem Tryp-Plasmid pEPl21-221 herausgeschnitten und in die CIaI Sennittstelle von pBRJ22 kloniert. Es wurde die Orientierung gewählt, bei der Tryp-Promotor Fragment im Uhrzeigersinn vorliegt. Bei diesem Vorgang wird die CIaI Stelle an der Position -21 des Tryp-Promotors wieder hergestellt. Durch Ligierung an das LaC-IFN-B₁ Fragment entsteht ein Hybrid-Promotor Tryp-Lac vor dem IFN-ß·, Gen. Mit diesem Plasmid TL-Il wurden E. coli MM29A oder der E* coli Minizell-

L J

stamm 0079-5¹J- transformiert. Diese Bakterien produzieren

10 U/Liter IPN-B₁ unter jFermenterkulturbedingungen bei einer ODg,-_o von 10, was beweist, daß das IPN-B₁ Genom DNA Fragment sehr aktiv ist (Fig. 4).

L J

	- 26 _ Tabelle I	Nukleotide
Restriktionsstellen	in IFN-B1 cDNA und Gen	250 210 570 360 3βθ
Restriktions stellen
Tag I-Pvu II Hinc II-Pvu II Hinc H-BgJL II Pvu II -BgI II Pst I -BgI. II
Entfernungen zwischen den Schnitt stellen Errechnet aus der Gemessen an der B1 cDNA-Sequenz "** ß- -Genom-DNA ++
Nukleotide
255 204 570 366 363

⁺ Taniguchi et al., I980 Gene 10 (II.-I5).

⁺⁺ Gemessen am 1,84 kb Ecο RI Fragment Die angesprochenen Hinc II und Tag !-Schnittstellen sind diejenigen, welche dem 5^!-Ende des Gens, zunächst liegen.

Tabelle II

Artspezifität von bakteriellem Interferon, das vom Genom-IFN-ß·, C15 Klon produziert wurde.

Interferon-Quelle

Interferon-Titer, ü/ml Menschl. Affen- Rinder- Maus- Maus-FSIl BSC-I MDBK L A9 Zellen Zellen Zellen Zellen Zellen

<4

1. Menschliche FSlI-

Zellen 1500 32 32

²· E. coli, infiziert

mit dem Cl5-Klon 1000 32 32-

Das bakterielle IFN wurde nach Chromatographie des C15-Lysates an Cibacron Blue-Sepharose benutzt, wie in Fig. 2 gezeigt.

Tabelle III

IPN-Of und ß - Aktivitäten» die von Genom-Fragmenten in dem recA-Plasmid RAP-I hergestellt wurden

~l

Versuch Klon	Bedingungen	IFN-Aktivität E/ml
1. RAP-I (1833)-IPN-Of0 RAP-I (1833)-IFN-K0 2. RAP-I (1833)-IPN-Ocn RAP-I ( 63I)-IPN-B1 RAP-I ( 63I)-IPN-B1	+ NalidJxinsäure - NalidJxinsäure rechte Orientie rung rechte Orientie rung entgegengesetzte Orientierung	500 <32 1000 3000 750

Klon RAP-I (I833) enthält das Ecο RI Fragment mit dem ₀ Gen (Pig. IB).

Klon RAP-I ( 63I) enthält das Eco RI Fragment mit dem IPN-B₁ Gen (Fig. IA).

Die Fragmente sind am Anfang des recA-Gens eingebaut. Die Orientierung ist in Bezug zur recA-Promotor-Orientierung angegeben.

28

Legenden zu den Abbildungen:

Pig. IA: Schematische Darstellung der DNA des IFN-ß-j Klons

£15 ~

(a): Schematische Karte von XCharon 4A. Die izLwe.i Arme sind als durchgezogene Linien gezeichnet, (b): Struktur der menschlichen DNA-Einfügung in den Klon C15, die geschwärzte Zone zeigt das Eco Rl Fragment, welches mit IFN-B₁ cDNA hybridisiert. (c): Vergrößerung des geschwärzten Fragments von b, dargestellt als Doppellinie. Die einfache Linie ist Teil des rechten Λ Arms. P_ ist

Ju

der linksseitige X Promotor, (d): Lage der IFN-B₁ mRNA. Die oberen Skalen gelten für a und b; die untere Skala für c und d (Details siehe im Text).

Fig. IB: Schematische Darstellung des IFN-⁰ C Klons 18-3

Es ist die Restriktionskarte der Einfügungen von zwei ^Charon Kk Klonen dargestellt. Das

Gen ist durch den Pfeil alpha-c gekennzeichnet. Zwei weitere IFN-Or Gene liegen in der Nähe von IFN-OC . Die Einfügung zeigt das Eco Rl 2kb Fragment 18-33, welches die IFN-QL. Gene enthält und welches in das recA-Plasmid subkloniert wurde, wie im Text erklärt. Die Symbole für Restriktionsenzymschnittstellen sind, dargestellt.

Fig. 2: Nachweis von Interferon auf Blue-Sepharose, welches von dem Genom-Klon IFN-ß·. C15 hergestellt

I '.

wurde

Ein Rohlysat von E. coli DP5O Zellen, welche mit dem Phagen C15 infiziert waren, wurde wie in Methoden und Material beschrieben fraktioniert und

die IFN-Aktivität für Jede Fraktion bestimmt

(a———Φ). Die Proteinkonzentration wurde in denselben Fraktionen gemessen ($«-—<|. Eine parallele Chromatographie und der Nachweis vom Lysat des

L_ Charon 4a Phagen ist dargestellt (D Q) ·

Fig. 3ϊ Titration des Interferons vom Genom-Klon IFN-B ₁ C15 Eine Fraktion des IFN vom Phagen C15 von der Säule in Fig. 2 (ungefähr ICr U/ml) wurde 1 : 40 verdünnt und dann serienweise verdünnt in Mikrotiterplatten zum Nachweis von IFN durch die Verdünnung der VSV RNA-Synthese (o——-o). 25 U/ml Standardinterferon von menschlichen Fibroblasten wurde parallel dazu

geprüft (· ·). Kontrollen ohne VSV (CZ3 ) und

mit VSV ohne IFN (Wl) sind dargestellt. Die beiden Säulen rechts zeigen die Restaktivität des IFN vom Phagen C15 (Sndverdünnung 1 : 4o) nach Adsorption an immobilisiertes Anti-IFN-ß oder Nichtimmun-IgG, wie in Methoden beschrieben.

Fig. 4: Wachstum und IFN-Produktion in E. coli Zellen, welche das Plasmid TLH enthalten
Das Plasmid TLIl enthält einen hybriden Typ-Lac Promotor und die codierende Sequenz für reifes menschliches IFN-ß·,, welche von dem menschlichen Genom-Fragment stammt, wie im Text beschrieben. Bakterienkulturen wurden in einem 1 Liter New Brunswick-Fermentor gezüchtet, und zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen durch Lysozym-propylenglykol lysiert und die IFN-Aktivität auf menschliehen Zellen geprüft, welche mit VSV infiziert waren. Die IFN-Aktivität ist pro ml Bakterienkultur berechnet.

L J

Leerseite

Claims (14)

VOSSlUS -VOSSIUS-TAUCHNER · HEUNEMANN · RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4'8000 MÜNCHEN 86 > PHON£:(089) 474O75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-29 4-53 VOPAT D u.Z.: R 978 (RaAo) U' Juli 1982 Case: Τ/48θ YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY, LTD. Rehovot, Israel 10 11 Verfahren zur Herstellung von menschlichem Interferon " Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Interferon des Fibroblastentyps (ß) und des Leukozytentyps (of), dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Genom-DNA in einen geeigneten Phagen einführt, entweder geeignete Bakterien mit solchen rekombinanten Phagen infiziert, oder aus solchen Phagen ein geeignetes DNA Segment gewinnt und dieses in ein Expressionsplasmid eines geeigneten Bakteriums einführt, diese Bakterien züchtet und das Interferon gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Interferon vom ß-Typ ist und der Phage vom % Typ.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei der Phage ein 3-Charon 4A ist, woraus ein Klon hervorgeht mit der Bezeichnung Klon C15·

L J

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hergestellte Interferon vomcY-Typ und der benutzte Phage vom λ-Typ ist.

5· Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Phage ein λ Charon ²I-A ist, woraus ein Klon 18-5 hervorgeht.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei der zur Infektion benutzte Phage vom X-Typ und das damit infizierte Bakterium E. coli ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Phage A-Charon 4A und das Bakterium E. coli DP-5O ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine menschliche Genom-DNA-Fraktion von solchen Phagen gewonnen und in ein Expresstionsvektorplasmid eines geeigneten Bakteriums eingeführt wird und die Bakterien zur Interferonherstellung gezüchtet werden.

9· Verfahren nach Anspruch 8, wobei die DNA in ein Plasmid eingeführt wird, welches mit einem starken Promotor versehen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das benutzte Plasmld pBRj522 und das eingefügte Gen das IFN-B₁ oder IFN-Of Gen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Plasmid pBRj522 mit dem recA-Promotor von E. coli ist.

12. Verfahren nach Anspruch 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das menschliche Genom-DNA-Fragment mit dem iFN-ot- oder IFN-ß Gen aus dem Phagen oder dem Plasmid entfernt, neben dem Codon für das erste Methionin des reifen IFN geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle des Lac-Pro-

motors von E. coli ligiert wird, der so modifiziert ist, daß er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Tryptophan-Promotors enthält, was zu einem hybriden Tryp-Lac-Promotor

L J

führt, das Plasmid in das Bakterium wieder eingeführt wird und die Bakterien zur Interferonherstellung gezüchtet werden.

13. Klon CI5» hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis J.

14. Klon I8-3, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1, 4 und 10

15· Mikroorganismus* infiziert mit einem Klon gemäß Anspruch I^ oder

l6. Mikroorganismus nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, daß er E. coli ist.

L -J