DE3226319C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zum Herstellen von menschlichem Fibroblasten-Interferon (IFN-β ) oder Leukozyten-Interferon (IFN-α ) und gemäß Anspruch 8 einen Vektor, der die genetische Information für die Expression von menschlichem IFN-β₁ oder IFN-α _c enthält. Die Ansprüche 2 bis 7 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens und die Ansprüche 9 bis 11 des Vektors.

Menschliche DNA, welche direkt aus Blutzellen gewonnen wird, wird in geeignete λ-Phagen kloniert. Hohe interferonproduktion kann erreicht werden mit Bakterien, welche durch diesen rekombinanten λ-Phagen infiziert wurden, und das Interferon kann gewonnen und gereinigt werden aus den bakteriellen Lysaten, welche aus dieser Infektion hervorgehen. Die Genom-DNA wird auch in Bakterien exprimiert, in welche sie mittels eines Plasmid-Vektors eingeführt worden war, welcher zur Expression geeignet ist.
Interferon und insbesondere menschliches Interferon gewinnt zunehmend an Bedeutung in einer Anzahl von Gebieten. Seine Herstellung ist ziemlich mühsam und Verbesserungen in den Verfahren zu seiner Gewinnung sind von großer Bedeutung und großem Wert.

Die Expression von Säugergenen in Bakterien wie E. coli wird gewöhnlich verhindert durch "intervening sequences", welche die codierende Sequenz des Gens unterbrechen. Es gibt jedoch eine gewisse Anzahl von Genen, welche keine Introns haben. Kürzlich zeigten Nagata et al (1980, Nature 287, 401-8), daß die Gene für menschliches Leukozyteninterferon α ebenfalls keine Introns besitzen. Sie konnten ein geringes Maß von Expression dieser Gene in E. coli entdecken.

Menschliche diploide Fibroblasten, welche durch doppelsträngige RNA induziert wurden, enthalten mindestens zwei mRNAs, welche für Interferon-β codieren (Weissenbach et al., 1980, PNAS 77, 7152-7156). Eine mRNA mit der Länge 0,9 kb (11S) entspricht der Hauptinterferonspezies IFN-β₁, welches von diesen Zellen produziert wird. Dessen Aminosäuresequenz wurde teilweise bestimmt (Knight et al., 1980, Science 207, 325-6). Die Klonierung dieser IFN-β₁ mRNA mittels cDNA wurde durchgeführt, wobei das E. coli Plasmid pBR322 als Vektor diente (Goeddel et al., 1980, Nucleic Acid Res., 4057-4075). Die Nukleotidsequenz dieser DNA-Klone entspricht derjenigen, welche für das Protein bestimmt wurde, und es konnte nach Konstruktion von Expressionsplasmiden gezeigt werden, daß die IFN-β₁ cDNA die Synthese menschlichen Interferons in E. coli steuert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem eine verbesserte Expression von Interferonen in E. coli möglich wird, ohne daß dabei die Synthese einer cDNA-Kopie erforderlich ist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man menschliche Genom-DNA, welche die genetische Information für Fibroblasten-Interferon-β₁ (IFN-β₁) oder Leukozyten-Interferon-a _c (IFN-α _c ) enthält, in einen λ-Phagen einführt, entweder ein Bakterium mit diesem rekombinanten λ-Phagen infiziert, oder aus dem λ-Phagen ein DNA-Fragment gewinnt und dieses in ein mit einem starken Promotor versehenes Expressionsplasmid eines Bakteriums einführt, das Bakterium züchtet und Interferon gewinnt.

Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde in einer nachveröffentlichten Publikation die Isolierung menschlicher Genomfragmente beschrieben, welche das IFN-β₁ Gen (Mory et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120, 197-202) und das IFN-α _c -Gen tragen. Diesen Genen fehlen Introns, und sie können daher direkt in E. coli exprimiert werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren, bei dem ein bestimmtes Fragment menschlicher Genom-DNA, welche aus menschlichen Blutzellen gewonnen wurde, in einen Bakteriophagen-Vektor kloniert wird und direkt dazu benutzt wird, die Synthese von IFN-β₁ und IFN-a _c in Bakterien zu bewirken. Diese produzieren im Verlauf ihrer Züchtung das Interferon. Bei dieser Methode bedarf es daher keiner langwierigen Präparation und Klonierung von DNA, welche über die gesamte Länge zur mRNA komplementär ist (cDNA). Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Stück DNA direkt aus einer leicht verfügbaren menschlichen Zelle, wie z. B. einer weißen Blutzelle, gewonnen und in einem λ-Phagen-Vektor kloniert. Das benötigte IFN-Gen wird nicht durch Introns unterbrochen und ist daher in der Lage, die IFN-Synthese in Bakterien zu steuern. Durch Infektion geeigneter Bakterien, wie E. coli, durch einen rekombinanten λ-Phagen, welcher eine Insertion von menschlicher DNA mit dem IFN-β₁-Gen oder dem IFN-α _c -Gen enthält, wurde eine hohe IFN-Aktivität erreicht. Aus den Bakterienlysaten, welche aus solchen Infektionen hervorgehen, wurde IFN gewonnen und gereinigt. Es zeigte sich, daß λ-Phagen geeignete Vektoren für die Einführung menschlicher DNA-Fragmente in Bakterien darstellen; besonders geeignet war λ-Charon 4A (Blattner et al., Science 196, 161, 1977), dessen Verwendung zu hoher IFN-Produktion führt. Die Erfindung betrifft ferner die Einführung solcher klonierter menschlicher Genom-DNA Fragmente in Expressionsplasmid- Vektoren (=Plasmidvektoren, welche zur Expression genetischer Informationen geeignet sind), welche mit starken Promotoren versehen wurden. Das Verfahren kann mit verschiedenen IFN-a _c - sowie IFN-β₁-Genen durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß diese keine Introns besitzen.

In einem Anwendungsbeispiel wurde DNA eines erwachsenen Menschen durch partielle Eco R1-Verdauung fragmentiert und in λ-Charon 4A kloniert. Von dem auf diese Weise erhaltenen Klon mit der Bezeichnung Klon C15, welcher eine Insertion menschlicher DNA von etwa 17 kb Länge trägt, wurde gezeigt, daß er ein Gen für das Fibroblasten-Interferon IFN-β₁ enthält. Die Restriktionskartierung ergab, daß dieses Gen, welches auf einem 1,8 kb langen Eco R1-Fragment liegt, nicht durch Introns unterbrochen wird. Dieses menschliche Genom DNA-Fragment ist in der Lage, die Synthese von aktivem menschlichem IFN-β₁ in E. coli und in anderen geeigneten Bakterien zu bewirken. Eine hohe IFN-Aktivität kann von Phagenlysaten gewonnen werden. Unter bestimmten Bedingungen wurden Phagenlysaten Aktivitäten in der Größenordnung von 10⁷ U/Liter erhalten. Es ist vorteilhaft, die Lysate zu chromatographieren, vorzugsweise an Cibacron Blue Sepharose oder an ähnlichen Säulen. Das auf diese Weise erhaltene Interferon hat die gleichen immunologischen Eigenschaften und die Artspezifität wie IFN, welches von menschlichen Fibroblasten hergestellt wird. Ähnliche Ergebnisse wurden mit IFN-α _c erzielt, dessen Gen im Klon 18-3 nachgewiesen wurde, welcher ein 13 kb Fragment des menschlichen Genoms enthält.

In einem weiteren Anwendungsbeispiel wurde das menschliche Genom-DNA-Fragment, welches das IFN-β₁ oder IFN-α₃-Gen enthält, in ein Plasmid eingeführt, wie z. B. das Plasmid pBR322, welches den recA-Promotor von E. coli enthält. Kulturen von E. coli, welche mit diesen rekombinanten Plasmiden transformiert wurden, erzeugten große Mengen von IFN-β₁ bzw. IFN-α _c , wenn der recA-Promotor durch Nalidixinsäure induziert wurde. Das IFN-β₁-Genom-Fragment wurde dann neben dem Codon für das erste Methionin des reifen IFN-β₁ geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle (ribosomal binding site) des E. coli Lac-Promotors ligiert. Dieser Lac-Promotor war in der Weise verändert, daß er die RNA-Polymerase-Bindungsstelle des Tryptophan-Promotors trägt. Mit diesem hybriden Trp-Lac-Promotor war die IFN-β₁-DNA (aus dem menschlichen Genom) in der Lage, 10⁸ U/Liter IFN-β₁ in dem E. coli Minicell-Stamm P679-54 (Alder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 57, S. 321, 1967) zu erzeugen. Ähnlich befriedigende Ausbeuten von IFN-α _c wurden erreicht, wenn das IFN-α _c -Gen in geeigneter Weise an den Trp-Lac-Promotor gekoppelt war. In allen Fällen wurde die IFN-Aktivität aus den bakteriellen Zellen durch Lyse mit Lysozym und 30% Propylenglykol gewonnen und dann ebenso wie von den Phagenlysaten durch Chromatographie an einem hydrophoben Trägermaterial gereinigt. Für IFN-β₁ ist ein bevorzugtes Trägermaterial Cibacron Blue Sepharose. Die Elution kann durch Substanzen, wie Äthylenglykol oder vorzugsweise Propylenglykol, erreicht werden. Weitere Reinigung von IFN-β₁ oder -α _c kann erreicht werden durch Immunaffinitäts-Chromatographie an Säulen, welche monoklonale Antikörper enthalten, oder durch andere konventionelle Techniken.

Es ist somit klar, daß menschliche Genom-DNA-Fragmente verwendet werden können für die Gewinnung großer Mengen von menschlichem IFN in E. coli oder anderen geeigneten Wirtsbakterien. Wie oben dargestellt, umfaßt das Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung die Einführung eines Fragmentes menschlicher Genom-DNA, welche die genetische Information für Fibroblasten-Interferon-β₁ (IFN-β₁) oder Leukozyten-Interferon-α _c (IFN-α _c ) enthält, in einem λ-Phagen, wobei man entweder ein Bakterium mit diesem rekombinanten Phagen infiziert, oder aus dem λ-Phagen ein DNA-Fragment gewinnt und dieses in ein mit einem starken Promotor versehenes Expressionsplasmid eines Bakteriums einführt, das Bakterium züchtet und das Interferon gewinnt. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Vektor, der die genetische Information für die Expression von menschlichem IFN-β₁ oder IFN-α _c enthält, und dadurch erhältlich ist, daß man menschliche Genom-DNA entweder in einen λ-Phagen einführt oder aus diesem Phagen ein DNA-Fragment gewinnt und dieses in ein mit einem starken Promotor versehenes Expressionsplasmid einführt. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere die neuartigen Phagen, welche durch die Einführung menschlicher Genom-DNA erhalten wurden, und speziell rekombinante Phagen des λ-Typs, wie z. B. der Klone C15, welcher zur Herstellung von IFN-β₁ führt, und 18-3, welcher zu IFN-α _c führt.

Ein bedeutender Vorteil dieser Erfindung ist es, daß Gene von kranken oder gesunden Individuen verglichen werden können hinsichtlich ihrer Fähigkeit, IFN zu produzieren. Dadurch wird die Untersuchung genetischer Defekte der IFN-Produktion ermöglicht.

Material und Methoden Herstellung einer Bank mit menschlichen Genen

DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus peripheren Blutzellen eines Erwachsenen mit β-Thalassemie gewonnen. DNA Aliquots (40 µg) wurden getrennt 30 Minuten lang mit 100, 200 oder 300 Einheiten Eco R1 verdaut, dann 10 Minuten auf 65°C erhitzt und zusammen auf einen 10- bis 40prozentigen Sucrosegradienten aufgetragen, wie beschrieben. DNA-Fragmente mit Längen zwischen 10 und 20 kb wurden wie bei Mory et al. (1980, Mol. Biol. Reports 6, 203-208) beschrieben, mit T₄-Ligase an Charon 4A DNA-Arme ligiert, welche durch Eco R1 Verdauung nach Maniatis et al. (1978, Cell 15, 687-701) präpariert wurden. In vitro Verpackung wurde, wie von Hohn und Murray (1977, PNAS 74, 3259-3263) beschrieben, durchgeführt, indem mehrere 8 µl-Aliquots des Ligierungsansatzes (0,5 µg Vektor-DNA und 0,25 µl menschliche DNA) mit 50 µl Extrakten von E. coli BHB2688 [N205 recA^- (λimm 434 cIts b2 red 3 Eam4 Sam7)/λ] und BHB2690 [N205 rec A^-(λ imm 434 cIts b2 red 3 Dam 15 Sam 7)/λ] (Hohn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3259, 1977) gemischt wurden. Pro µg rekombinierter DNA wurden 3×10⁵ pfu erhalten, im Vergleich zu 10⁸ pfu/µg intakter DNA. Insgesamt wurden 1,8×10⁶ rekombinante Phagen in 6 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Magnesiumsulfat, 0,01% Gelatine verdünnt. Nach Zugabe von 0,1 ml Chloroform und nach Entfernen der Zellreste durch Microfugen-Zentrifugation wurden die Phagen um den Faktor 10⁵ vermehrt, indem 4×10³ pfu pro 15 cm Platte auf E. coli DP50 (Leder et al., 1977, Science 196, 175-177) plattiert wurden. Für die Durchmusterung wurden 2×10⁴ pfu jeweils auf 15 cm Platten plattiert und nacheinander je zwei Nitrocellulosefilter-Abdrücke genommen; beschrieben bei Benton et al. (1977, Science 196, 180-182). Diese Tätigkeit wurde unter P₃-Bedingungen durchgeführt.

Herstellung der IFN-β₁ cDNA-Sonde

Es wurde Poly A⁺ RNA aus menschlichen Vorhautfibroblastenkulturen des Typs FS11 gewonnen, welche 4 Stunden lang durch 100 µg/ml Poly(rI) : (rC), 50 µg/ml Cycloheximid (für die letzte Stunde mit 2 µg/ml Actinomycin D) induziert worden waren. Die beiden Peaks von Interferon mRNA wurden durch Sucrosegradienten-Zentrifugation fraktioniert wie im einzelnen beschrieben bei Weissenbach et al. (1980 PNAS 77, 7152-7156; Weissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem., 98, 1-8). Die 11S mRNA (1,5 µg) wurde verwendet, um RNA-cDNA-Hybride mittels reverser Transcriptase von Avian Myoblastosisvirus (J. Beard) und Oligo (dT) herzustellen wie in der vorher zitierten Arbeit von Weissenbach et al. beschrieben (1980, PNAS 77, 7152-7156). Die RNA-cDNA-Hybride wurden direkt kloniert entsprechend Zain et al. (1979, Cell 16, 851-861), jedoch wurden dCTP für die Verlängerung der Hybride und dG-verlängerte, Pst gespaltene pBR322 DNA als Vektor verwendet (Chang et al., 1978, Nature 275, 617-624). Insgesamt wurden 12 500 tet^r amp^s Transformanten von E. coli MM294 erhalten; vgl. Stenlund et al. (1980, Gene 10, 47-52). Koloniehybridisierung wurde mit ³²p-cDNA-Sonden durchgeführt, welche entweder von 11S mRNA (6 µg) aus induzierten FS11 Zellen oder von Gesamt-Poly A⁺-RNA (3,7 µg) aus nichtindizierten Zellen transcribiert worden waren. Die cDNA Synthese wurde gestartet mit einem synthetischen komplementären Primer (siehe Narang et al., 1979, Methods Enzymol. 68, 90-98), 5′GAGATCTTCAGTTTC 3′, welcher die Bgl II Erkennungsstelle der IFN-β₁ Sequenz enthält. Mit einer Startersequenz (Primer), welche am 5′-Ende mit ³²P markiert war (Houghton et al., 1980, Nucl. Ac. Res. 8, 1913-1931), konnte eine erwartete cDNA von 640 Nukleotidenlänge nur dann beobachtet werden, wenn induzierte RNA als Matrize (Template) verwendet wurde. Um die Sonden herzustellen, wurden jeweils 20 pMol Primer mit jeder RNA in 4 µl 0,4 M KCl bei 30°C für 60 Minuten hybridisiert, dann 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und zwar in einem Volumen von 25 µl, mit jeweils 200 µCi von ³²P-α-dATP und dCTP (beide 400 Ci/mMol), 0,5 mM jeweils von dGTP und TTP, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 4 mM Magnesiumchlorid, 5 mMol Dithiothreitol, 50 µg/ml Actinomycin D, 4 mM Pyrophosphat und 30 Einheiten reverse Transcriptase. Nach Zugabe von 25 µg E. coli DNA wurde der Ansatz 60 Minuten bei 70°C mit 0,3 N NaOH behandelt, neutralisiert und filtriert durch Sephadex G-50 in 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% Dodecylsulfat. Von jeder RNA wurden 5×10⁶ cpm cDNA erhalten. Kolonien, die auf Nitrocellulosefiltern gewachsen waren, wurden fixiert und die DNA denaturiert, wie bei Thayer beschrieben )(1979 Anal. Biochem. 98, 60-63). Jedes Filter wurde 4 Stunden bei 67°C vorhybridisiert mit 10 ml 6×SET (SET=150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl pH8), 10×Denhardt-Lösung (Denhardt 1966, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641-646), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 µg/ml denaturierter E. coli DNA. Die Filter wurden bei 67°C 14 bis 18 Stunden lang hybridisiert in der gleichen Lösung mit 0,5×10⁶ cpm/Filter von jeder der beiden ³²P-cDNA-Sonden, 10 µg/ml Poly A und 2,5 µg/ml Poly C. Die Filter wurden 1 Stunde lang bei 67°C in der Vorhybridisierungslösung gewaschen und dann noch dreimal für jeweils 30 Minuten bei 67°C mit 3×SET, 0,1% Pyrophosphat, 0,1% Dodecylsulfat, und dann 60 Minuten bei 25°C mit 4×SET, siehe Maniatis, (1978, Cell 15, 687-701). Die Filter wurden getrocknet und mit Agfa Curix Roentgenfilmen mit Verstärkerfolien 1 bis 2 Tage lang bei -70°C exponiert.

Von 3500 geprüften Kolonien hybridisierten 14 vorzugsweise mit cDNA von induzierter mRNA, während 130 auch mit cDNA von nichtinduzierter mRNA hybridisierten. DNA (0,3 µg) der Plasmide der ersten Gruppe wurde auf Filtern hybridisiert (Kafatos et al., 1979, Nucl. Ac. Res. 7, 1541-1552) mit dem Primer selbst, der am 5′-Ende ³²P markiert war (0,3 pMol, 4×10⁶ cpm), und zwar in 6×SSC, 10×Denhardt-Lösung für 21 Stunden bei 35°C; anschließend wurde mit 6×SSC (900 mM NaCl, 90 mM Natriumcitrat) bei 35°C gewaschen. Ein Klon I-6-5 war stark positiv und die DNA Sequenzierung (siehe Maxam et al., 1980, Methods Enzymol. 65, 499-560) zeigte, daß er etwa 370 Nukleotide vom 3′-Ende der IFN-β₁ Sequenz enthielt. Es wurden weitere 50 000 Klone geprüft, welche wie beschrieben hergestellt wurden durch Einspleißen von dC-verlängerter doppelsträngiger cDNA von Sucrosegradienten- gereinigter, induzierter mRNA in die Pst I Schnittstelle von pBR322: Es zeigte sich, daß der Anteil von IFN-b₁ Klonen 0,16% (80 Klone) betrug im Vergleich zu 0,65% IFN-β₂ Klonen.

Der oben beschriebene und von FS-11 mRNA hergestellte Klon IFN-β₁ I-6-5 wurde verwendet, um die menschliche Genbank durchzuprüfen.

Isolierung des Genom-Klons: IFN-β₁ Klon 15

Plasmid DNA der IFN-β₁-cDNA-Klone wurde durch Nicktranslation nach Rigby et al. (1977, J. Mol Biol. 113, 237-251) mit 2×10⁸ cpm/µg DNA markiert und 10⁶ cpm/Filter an die menschliche Genbank hybridisiert. Die Vorbereitung der Filter, die DNA-Denaturierung sowie die Hybridisierungsverfahren waren wie vorstehend beschrieben. Phagen von solchen Plaques, welche positive Hybridisierung ergaben, wurden erneut mit einer Dichte von 1-2×10² pfu auf 9 cm-Platten plattiert und erneut geprüft. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, bis mehr als 95% der Plaques auf der Platte mit IFN-β₁ cDNA hybridisierten. Der Phagenklon C15 wurde von einem solchen Plaque isoliert.

Phagen wurden in Flüssigkulturen vermehrt gemäß Blattner et al. (1977, Science 196, 161-169). E. coli DP50 wurde über Nacht vermehrt in 1% Trypton, 0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Maltose, 0,25% Magnesiumsulfat, 0,01% Diaminopimelinsäure, 0,004% Thymidin. Etwa 0,3 ml der Kultur wurden zur Präadsorption mit 0,3 ml 10 mM Magnesiumsulfat, 10 mM Calciumchlorid und 10⁷ Phagen für 20 Minuten bei 37°C gemischt. Die Kulturen wurden dann verdünnt in eine 2 Liter Flasche mit 500 ml vorgewärmtem Medium, welches 1% NZ Amin, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,1% Casaminosäuren, 0,25% Magnesiumsulfat, 0,01% Diaminopimelinsäure und 0,004 Thymidin enthielt. Diese Verdünnung wurde bei guter Belüftung 15 bis 18 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Nach erfolgter Lyse wurden die Zellreste durch Zentrifugation in der Kälte für 15 Minuten bei 7000 rpm in einem Sorvall GSA Rotor entfernt. Aus diesem geklärten Lysat wurden die Phagen mit 7% Polyäthylenglykol 6000 ausgefällt und durch zwei aufeinanderfolgende Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Die DNA des Phagen C15 wurde phenolgereinigt und ihre Struktur analysiert durch Restriktionsenzymverdauung, horizontale Agarose-Gelelektrophorese in 20 mM Tris-Base, 10 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid, anschließenden Transfer auf Nitrocellulosefilter (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98, 503-517) und Hybridisierung mit Nick-translatierter IFN-β₁ cDNA wie vorstehend beschrieben. Eco R₁ Fragmente von C15 DNA wurden in die Eco R1 Schnittstelle von pBR322 subkloniert, um eine genaue Restriktionskartierung der Plasmid DNA nach der üblichen Methode durchzuführen (siehe Bolivar 1979, Methods Enzymol. 68, 245-267).

Messung der Interferon-Aktivität in Phagenlysaten

Geklärte Lysate des Phagen IFN-β₁ C15 wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt und gegen Phosphat-gepufferte Saline (PBS) 7 Stunden lang dialysiert. Eine 10 ml Probe davon wurde auf eine 0,3 ml Säule von Cibacron Blue-Sepharose CL6B aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen mit 10 bis 15 ml 1M NaCl, 0,02 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2 und anschließend mit 10 ml 50% Propylenglykol in der Waschlösung. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und bei 4°C aufbewahrt; in einigen Fällen wurde 0,1% menschliches Serumalbumin zur Stabilisierung zugefügt. Die Interferon-Aktivität wurde gemessen, wie bei Weissenbach et al. (1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8) beschrieben. Hierzu wurde jede Fraktion serienweise in eine Mikrotiterplatte (95 Vertiefungen) verdünnt. Jede Vertiefung enthielt 2-3×10⁴ menschliche FS11-Fibroblasten in 0,1 ml Minimum Essential Medium, 5% fötales Kalbsserum (FCS), 0,5% Gentamycin. Nach 18 Stunden bei 37°C wurde das Medium entfernt und Vesicular Stomatitis Virus (VSV) in Medium mit 2% FCS hinzugefügt (1 pfu/Zelle). Eine Hemmung des cytopathischen Effekts wurde 30 bis 40 Stunden nach Infektion im Vergleich mit IFN-β NIH Standard GO23-902-527 festgestellt. Die antivirale Aktivität wurde ebenfalls gemessen durch die Abnahme des ³H-Uridin-Einbaus nach VSV-Infektion, wie früher beschrieben (Weissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). Antiserum gegen IFN-β wurde von Kaninchen hergestellt und geprüft, wie vorstehend beschrieben (Weissenbach et al., 1979, Eur. J. Biochem. 98, 1-8). Für den Neutralisationstest wurden 0,1 ml Antiserum (Titer 10⁴ U/ml) oder Nichtimmunserum mit 0,2 ml einer 50prozentigen Suspension von Protein A-Sepharoseperlen in PBS für 1 Stunde bei 37°C gemischt. Die Perlen wurden zweimal mit PBS gewaschen, und 0,1 ml bakterielles Interferon (100 U/ml) wurden hinzugefügt. Nach 2 Stunden bei 37°C wurden die Perlen zentrifugiert und der Überstand geprüft auf die Hemmung von ³H-Uridin-Einbau in VSV-infizierte Zellen.

Isolierung des Genom Klons: IFN-α _c Klon 18-3

Zwei kurze einzelsträngige Oligonukleotide, sie wie vorstehend beschrieben chemisch synthetisiert worden waren, wurden benutzt, um die menschliche Genbank direkt durchzuprüfen. Die Oligonukleotide sind komplementär zur gemeinsamen Sequenz von IFN-α Genen und haben die Sequenz 5′CTCTGACAACCTCCC 3′ und 5′CCTTCTGGAACTG 3′. Die Oligonukleotide wurden nach 5′-Markierung, wie vorstehend beschrieben, entweder direkt benutzt oder als Primer für cDNA Synthese an der RNA von Sendai-Virus induzierten menschlichen Leukämie-Zellen. Die ³²P-Oligonukleotide oder die cDNA's wurden gegen die DNA von insgesamt 500 000 rekombinanten λ-Phagen hybridisiert wie vorstehend dargestellt. Etwa 5×10⁵ cpm wurden pro 9 cm-Nitrocellulosefilter eingesetzt. Die Hybridisierungen wurden durchgeführt in versiegelten Plastikkochbeuteln mit einem möglichst geringen Flüssigkeitsvolumen. Die Hybridisierung mit den 15 Basen langen Primern wurde folgendermaßen durchgeführt: Zunächst Vorhybridisierung in 6×SSC, 10×Denhardt Lösung bei 37°C für 4 Stunden; dann Hybridisierung in 6×SSC, 10× Denhardt Lösung bei 37°C für 18 Stunden; anschließend 3- bis 4maliges Waschen für 30 Minuten jeweils in 6×SSC bei 37°C oder solange, bis keine Radioaktivität mehr in der Waschflüssigkeit gefunden wurde. Für die Hybridisierung mit dem 13 Basen-Primer wurde die Temperatur für Hybridisierung und Waschen auf 30°C erniedrigt. Insgesamt 16 Phagen zeigten eine positive Hybridisierung und wurden weiter analysiert durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung. Von Klon 18-3 wurde gezeigt, daß er 3 IFN-α Gene enthielt, von denen eines die gleiche Sequenz hatte wie der cDNA Klon α _c von Goeddel et al. (1981, Nature 290, 20-25). Der Klon 18-3 wurde gereinigt wie für den Klon C15 vorstehend beschrieben. Die Expression des Klons 18-3 in Bakteriophagen und nach einer Insertion in einen Expressions-Plasmid-Vektor wird im Ergebnisteil beschrieben.

Ergebnisse 1. Struktur des Genom-Klons IFN-β₁ C15

Dieser Phagenklon wurde aus einer menschlichen DNA-Bank isoliert, welche durch partielle Verdauung mit Eco R1 und Klonierung in die Arme von λ-Charon 4A erhalten worden war. Der Klon hybridisierte stark an zwei unterschiedliche IFN-β₁ cDNA-Sonden, welche unabhängig voneinander von mRNA Fraktionen zweier Stämme von menschlichen Fibroblasten hergestellt worden waren. Die Verdauung der Phagen-DNA durch Eco R1 zeigt neben den zwei λ-Armen noch 4 Fragmente von 12, 2,6, 1,84 und 0,6 Kilobasen Länge (Fig. 1A). Transfer auf Nitrocellulose nach Southern (1975, J. Mol. Biol. 98, 503-517) und Hybridisierung mit Nick-translatierter DNA des IFN-β₁ I-6-5 cDNA-Klons zeigte, daß er das 1,84 kb Fragment das IFN-β₁ Gen enthielt. Dieses Eco R1 Fragment wurde erneut in die Eco R1 Schnittstelle von pBR322 kloniert; die Restriktionsanalyse dieses 1,84 kb Subklons mit Bgl II, Pvu II, Pst I, Hinc II und Taq I sowie Hybridisierung mit partiellen sowie Gesamt-IFN-b₁ cDNA-Sonden erlaubten den Schluß, daß die für das IFN-β₁ Präprotein codierende Sequenz (Hinc II Erkennungsstelle) etwa 350 Nukleotide von der Eco R1 Schnittstelle entfernt beginnt (Fig. 1A). Die Entfernungen zwischen den verschiedenen Restriktionsstellen in der Genom DNA sind im Rahmen des experimentellen Fehlers die gleichen wie die in der cDNA-Sequenz (Tabelle I). Keine unerwarteten Restriktionsstellen wurden im Bereich der für IFN-β₁ codierenden Region gefunden, was bedeutet, daß keinerlei meßbare intervening sequences vorliegen.

Partiell mit Eco R1 gespaltene C15 DNA zeigte, daß das 0,6 kb Eco R1 Fragment zwischen dem 1,84 und dem 2,6 kb Eco R1 Fragment liegt. Eine Bam H1 Spaltstelle wurde in dem 2,6 kb Fragment gefunden, nicht jedoch in den anderen Eco R1 Fragmenten des menschlichen DNA-Abschnitts. Das 1,84 kb Eco R1 Fragment, welches an IFN-β₁ cDNA hybridisiert, wurde auf einem 9,6 kb Bam H1 Fragment der C15 DNA gefunden. Wie in Fig. 1 dargestellt, kann dieses Fragment nur von einer Bam H1 Schnittstelle des rechten g-Arms (5,1 kb von Eco R1) stammen, wobei 4,5 kb für das Eco R1-Bam H1 Segment des menschlichen DNA Inserts übrig bleiben. Dies bedeutet, daß das 1,84 kb Eco R1 Fragment unmittelbar neben dem rechten λ-Arm liegen muß. Die Genorientierung (Fig. 1A) wurde auf folgende Weise festgestellt: Wenn C15 DNA mit Pvu II geschnitten und an die gesamte IFN-β₁ cDNA oder deren 3′-Hälfte hybridisiert wurde, so wurde ein 0,66 kb Fragment gefunden, welches nur an das 5′-Ende von IFN-β₁ hybridisiert. Wenn jedoch das 1,84 kb Eco R1 Stück mit Pvu II geschnitten wurde, so befand sich das 5′-Ende von IFN-β₁ auf einem kleineren 0,54 kb Fragment. Da keine Pvu II Schnittstelle auf dem 0,6 kb Eco R1 Stück des menschlichen Inserts gefunden wurde, muß das 0,66 kb Pvu II Fragment im rechten λ-Arm enden und somit ist das 5′-Ende von IFN-β₁ unmittelbar dem rechten λ-Arm benachbart. Die in Fig. 1A gezeigte Anordnung wird bestätigt durch mehrere weitere Restriktionskartierungsexperimente mit Hind III, Sma I und Bgl II Verdauung. Die codierende Sequenz des IFN-β₁ Gens in Klon C15 war daher etwa 1775 Nukleotide von dem starken λ P_L Promotor entfernt inseriert worden, welcher die linksgerichtete Transkription kontrolliert (Williams et al., 1980, Genetic Engineering Vol II, pp. 201-281, Plenum Corp.), und befindet sich in der linksgerichteten Orientierung. Dies zusammen mit dem Fehlen von nachweisbaren Introns veranlaßte die Untersuchung, ob Interferon von E. coli produziert werden konnte, welche mit den rekombinanten Phagen C15 infiziert waren.

2. Gewinnung von biologisch aktivem Interferon von Lysaten von E. coli, infiziert mit dem IFN-β₁ C15 Phagen

Phagen des Klons C15 wurden in 500 ml Kulturen von E. coli DP50 vermehrt, wie vorstehend in "Methoden" beschrieben. 10 ml des geklärten Lysates wurden dialysiert und auf eine kleine Cibacron Blue-Sepharose-Säule (0,3 ml) aufgetragen. Die Fraktionen wurden auf ihre Hemmung des cytopathischen Effekts von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) untersucht, wobei ein IFN-β Standard als Referenz benutzt wurde. In einem Experiment, bei dem der Phagentiter im Lysat 1,3×10¹⁰ Phagen/ml betrug, wurde das Interferon-Aktivitätsmuster gefunden, welches in Fig. 2 dargestellt ist. Insgesamt wurden 7500 Einheiten von IFN Aktivität in Fraktionen gefunden, welche durch 50% Propylenglykol-1M NaCl von der Säule eluiert wurden. Dies würde 0,75×10⁶ Einheiten/Liter Lysat entsprechen. Im Rohlysat war die nachweisbare Aktivität jedoch wesentlich geringer. Dies läßt vermuten, daß gewisse Stoffe im Lysat den korrekten Nachweis der IFN Aktivität verhinderten. In einem Rekonstruktionsexperiment wurde menschliches Standard IFN-β zu einem Wildtyp λ-Charon 4A Lysat gefügt, und tatsächlich betrug die gemessene Aktivität nur 1/10 der Zugabe. Wenn dieses Gemisch über die Blue-Sepharose-Säule gegeben wurde, wurden 75% der Input-Aktivität wiedergefunden. In einem Kontrollauf wurde das Lysat vom Wildtyp λ-Charon 4A Phagen (ohne IFN-Zugabe) untersucht, und keine IFN Aktivität wurde gefunden (Fig. 2).

Das chromatographische Verhalten von IFN von Lysaten des Klons C15 kann unterschiedlich sein. In einem Experiment, bei dem der Phagentiter 3×10¹¹ pfu/ml war, war die IFN Aktivität hoch, wurde jedoch auf der Blue-Sepharose-Säule nicht zurückgehalten. In diesem Lysat belief sich die gesamte Aktivität, welche von der Säule zurückgewonnen wurde, auf 70 bis 80 000 Einheiten IFN bei einem Einsatz von 10 ml Lysat (7-8×10⁶ Einheiten/Liter). Die eluierten Fraktionen wurden erneut adsorbiert an einer zweiten Blue-Sepharose-Säule. Diesmal wurde die Aktivität von der Säule zurückgehalten, jedoch wieder eluiert beim Waschen der Säule nur mit PBS. Menschliches IFN-β₁ sollte normalerweise von Blue-Sepharose nur durch hydrophobe Lösungsmittel eluiert werden (Knight et al., 1980, Science 207, 525-526). Daher wurde menschliches Standard IFN-β mit dem gleichen Phagenlysat gemischt und auf die Säule aufgetragen: 30% der Aktivität wurden nicht zurückgehalten, und die Rückgewinnung der Aktivität betrug nur 25%. Dies läßt vermuten, daß Komponenten dieses Lysats wahrscheinlich die Wechselwirkung des IFN-β, insbesondere des bakteriell produzierten, mit Blue-Sepharose destabilisierten. Obwohl Interferon nicht von der Säule zurückgehalten wurde, wurden mehr als 90% des Proteins des Lysats aus den aktiven Fraktionen entfernt, welche eine spezifische Aktivität von 4-5×10⁵ Einheiten/mg Protein hatten. Diese partielle Reinigung war wichtig für die Entfernung der Chemikalien, welche die Aktivität in den Rohlysaten maskierten. In einem Versuch wurde IFN Aktivität des Klons C15 auch rückgewonnen nach Chromatographie des Lysats an Carboxymethyl-Sepharose (nicht gezeigt).

3. Eigenschaften von Interferon, welches in E. coli Zellen produziert wurde, die durch Klon C15 infiziert waren

Die Interferon-Aktivität, welche nach dem Chromatographieschritt erhalten wurde, erniedrigte den ³H-Uridin-Einbau in VSV-infizierte menschliche Zellen nach Actinomycin D Behandlung (Weissenbach, 1979, Eur. J. Biochem., 98, 1-8). Die Titrationskurve, welche für bakterielles IFN-β erhalten wurde, war ähnlich derjenigen für menschliches Standard IFN-β (Fig. 3). Um die immunologischen Eigenschaften des bakteriellen IFN zu prüfen, wurde das partiell gereinigte Produkt mit Kaninchenanti-IFN-β-Serum (inaktiv gegen IFN-α) gemischt oder mit Kaninchen-Nichtimmun-Serum, welches vorher an Protein A-Sepharose gebunden war. Der Überstand wurde nach Zentrifugation auf IFN Aktivität geprüft: Anti-IFN-β-Serum beseitigte die gesamte Interferon Aktivität, wohingegen die Aktivität erhalten blieb, wenn Nichtimmun-Serum verwendet wurde (Fig. 3). Das bakterielle IFN (20 U/ml) wurde in ähnlicher Weise neutralisiert, wenn es nur mit Anti-IFN-β (20 U/ml) auf der Zellkultur gemischt und auf Hemmung des cytopathischen Effekts von VSV untersucht wurde.

Die Spezies-Spezifität des bakteriellen Interferons wurde durch Vergleich der verschiedenen Zelltypen untersucht. Ebenso wie menschliches IFN-β zeigte das Produkt von Klon C15-infizierten E. coli weniger als 10% Aktivität auf Affennierenzellen BSC-1 und Rinder-MDBK-Zellen im Vergleich zu menschlichen Zellen. Keine antivirale Aktivität konnte gefunden werden bei Maus-L- oder A9-Zellen (Tabelle II). Die gleichen Ergebnisse wurden erzielt mit 6000 U/ml von bakteriellem IFN, welches von Klon C15 produziert wurde.

Die vorliegende Erfindung beweist somit, daß das IFN-β₁ Gen, welches direkt aus Fragmenten einer partiellen Eco R1 Verdauung der menschlichen Genom DNA isoliert wurde, durch Klonierung in λ-Charon 4A exprimiert werden kann und zu Anhäufung signifikanter Mengen von IFN Aktivität in den Kulturlysaten führt. Die erzeugte Aktivität ist ganz klar Fibroblasteninterferon ( β ), was durch seine immunologischen Eigenschaften und seine Spezies-Spezifität gezeigt wurde. Die Aktivität wird von der Bakterienkultur nur produziert als Reaktion auf die Infektion durch den IFN-β₁ C15 Phagenklon. Die IFN Aktivität, welche in E. coli durch den Klon C15 hervorgerufen wird, entspricht dem menschlichen IFN-β in seinen chromatographischen Eigenschaften auf Cibacron Blue Sepharose. Der chromatographische Schritt ist wichtig für die Gewinnung hoher Aktivität (bis zu 7×10⁶ Einheiten/Liter) aus dem bakteriellen Lysat. Interferone stellen somit die ersten Beispiele von biologisch aktiven Proteinen dar, welche von Bakterien unter der Kontrolle eines Stücks menschlicher DNA hergestellt werden, welches direkt aus dem menschlichen Genom eines Individuums gewonnen wurde.

4. Genom-IFN-α _c -Klon 18-3

Dieser Klon wurde identifiziert durch direkte Hybridisierung von kurzen Oligonukleotiden, welche komplementär zu Sequenzen in IFN-α chemisch synthetisiert wurden. Von insgesamt 0,5×10⁶ Genom-Klonen waren 16 Klone positiv in der Hybridisierung. Die Eco R1 Fragmente, welche mit den Oligonukleotiden hybridisierten, wurden sequenziert, und von Klon 18-3 wurde, wie in Fig. 1B gezeigt, nachgewiesen, daß er ein 2 kb Eco R1 Fragment 18-33 enthielt (Einschub in Fig. 1B), auf welchem das Gen für IFN-α _c liegt. Dieses Gen ist einwandfrei die Quelle der mRNA, welche zu dem IFN-α _c Klon führte, von dem Goeddel et al. berichten (1981, Nature 290, 20-25). Klon 5-1 stellt ein überlappendes DNA-Fragment dar. Zusammen tragen Klon 5-1 und Klon 18-3 zusätzlich zu dem IFN-α _c Gen zwei weitere IFN-α Gene, welche α- _c² und α _c⁴ bezeichnet werden (Fig. 1B).

5. Expression menschlicher IFN Genom-Fragmente unter der Kontrolle des recA-Promotors

Der recA Promotor gilt als einer der stärksten E. coli Promotoren. Normalerweise ist er stark reprimiert durch das Produkt des lex-Genes, sogar wenn ein Multicopy-Plasmid, wie pBR322, vorhanden ist. In Gegenwart geschädigter DNA wird es dazu induziert, seinen eigenen Repressor zu spalten und wird in sehr starkem Maße induziert (Sancar und Rupp, 1979, PNAS 76, 3144-3148). Die Standardinduktoren für recA sind Nalidixinsäure (welche die DNA Synthese blockiert) oder Mitomycin C (welches Quervernetzungen der DNA bewirkt).

Ein Plasmid pDR1453, welches das geklonte recA-Gen enthält, wurde verwendet, um den Promotor auf einem TaqI-BamHI Fragment von etwa 1 Kilobase zu isolieren. Dieses wurde in pBR322 ligiert, welcher geöffnet wurde mit ClaI und BamI, wobei das Plasmid RAP-1 entstand. Die TaqI-ClaI Ligierung stellt die ClaI Schnittstelle in diesem Fall wieder her, was ermöglicht, daß das Plasmid nur noch im dritten Codon des recA-Gens geöffnet werden kann. RAP-2 wurde konstruiert durch Spaltung von RAP-1 mit Eco R1 und Cla1, Auffüllen der sticky ends und erneuter Ligierung, welche die Eco R1 Schnittstelle wieder herstellte. Wenn RAP-2 an der Eco R1 Stelle geöffnet wird, kann Fremd-DNA am dritten Codon des recA-Proteins inseriert werden.

Der RAP-1 Vektor wurde benutzt für die indirekte Expression der Interferon-Aktivität durch Genom-Fragmente der menschlichen Genom-Bank. Das IFN-β₁ Gen sowie mehrere isolierte IFN-α Gene der α _c Unterklasse produzierten starke Interferon-Aktivität (bestimmt durch den Standard Antivirus Test), wenn sie in dieses Plasmid inseriert wurden. Diejenigen R1 Fragmente der DNA, auf welchen diese Gene liegen, (Fig. 1A und B), wurden in die R1 Schnittstelle des Plasmids RAP-1 subkloniert. Das Plasmid wurde in einen recA⁺ Wirt gebracht, die Bakterien wurden kultiviert und mit Nalidixinsäure induziert. Sodann wurden die Zellen geerntet, mit Lysozym plus 30% Propylenglykol lysiert und der Extrakt auf antivirale Aktivität geprüft. Die Höhe der Aktivität hängt deutlich ab von der Reduktion durch Nalidixinsäure, wobei das Optimum 50 µg/ml beträgt (Tabelle III). In einigen Fällen erzeugt das Genom-Fragment interessanterweise Aktivität in beiden möglichen Orientierungen in Bezug zum recA Promotor. Die IFN-β₁ und IFN-α Gene, welche Aktivität zeigten, lagen alle auf DNA Eco R1 Fragmenten von 1,8-2 Kilobasen Länge, so daß die Entfernung vom Promotor zum ATG Startcodon des Interferon-Gens in der Größenordnung von Hunderten von Nukleotiden ist.

Diese Experimente beweisen, daß der Promotor erwartungsgemäß funktionsfähig ist und sie erlauben die schnelle Bestimmung, welche der interferonähnlichen Gene aus der Gen-Bank aktiv sein können.

6. Starke Expression des IFN-β₁ Gens unter der Kontrolle des Trp-Lac-Hybrid-Promotors

Das Plasmid PLJ3 (Johnsrud, PNAS, 1978, 75, 5314-5318) enthält zwei Lac-Promotoren, von denen jeder 95 Basenpaare lang ist. Sie sind 95 Nukleotide voneinander getrennt, die nichts damit zu tun haben. Dieses Fragment von 285 Nukleotiden Länge ist inseriert in die Eco R1 Schnittstelle des Plasmids pMB9. Die 95 Basenpaare langen Lac-Sequenzen enthalten den Operator und die Promotor-Sequenz und enden unmittelbar vor dem ATG Codon der β-Galactosidase. Eine codierende DNA-Sequenz mit einem ATG Initiator-Codon, die in geeigneter Entfernung von der ribosomalen Bindungsstelle des β-Galactosidase-Gens inseriert ist, sollte korrekt in E. coli Zellen exprimiert werden. Das Eco R1 Fragment mit den 285 Basenpaaren wurde subkloniert an der Eco R1 Schnittstelle von pBR322; die Rekombinanten wurden gesucht, indem Zellen auf Platten gezüchtet wurden, welche 40 µg/ml X-gal und 15 µg/ml Tetracyclin enthielten. Nur positive blaue Kolonien wurden zusammengefaßt und die DNA durch Cäsiumchloriddichte- Gradientenzentrifugation gereinigt.

Zwei Orientierungen der Lac-Promotoren können erwartet werden; entweder gegen das Ampicillin-Gen gerichtet oder gegen das Tetracyclin-Gen von pBR322. Da nur an der Eco R1 Schnittstelle Interesse bestand, welche zwischen der ribosomalen Bindungsstelle von Lac und der pBR322 Sequenz liegt, wurde diese Stelle durch Bindung mit RNA Polymerase an die Plasmid DNA geschützt, während die distale Stelle durch Eco R1 Restriktion geöffnet wurde, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt und erneut ligiert wurde. Nach Transformation von Zellen des E. coli Stammes MM294 wurden die Plasmide iosliert und die Entfernung zwischen der Eco R1- und dem Bam HI-Schnittstelle von pBR322 gemessen. Die Plasmide, welche ein 375 Basenpaar-Fragment enthielten, waren diejenigen, in denen die Lac Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen ausgerichtet waren, während diejenigen mit einem 670 Basenpaar-Fragment (375+295 Basenpaare) die Lac-Promotoren gegen das Ampicillin-Gen gerichtet hatten.

Von dem 1,84 kb Eco R1 Subklon des IFN-β₁ Genom-Fragments wurde ein HincII-BglII Fragment herausgeschnitten, welches die Präinterferonsequenz enthielt. Das reife IFN-β₁ Protein enthält an seinem aminoterminalen Ende ein Methionin, welches in E. coli als Initiatorcodon benutzt werden kann. Es gibt zwei AluI Erkennungsstellen dicht bei diesem ATG Codon, welche durch 13 Nukleotide getrennt sind, eine AluI Stelle ist 8 Nukleotide vor dem ATG, während die andere 2 Nukleotide nach dem ATG liegt. Das HincII-BglII Fragment wurde partiell mit AluI gespalten und Fragmente von etwa 510 Basenpaaren aus Agarosegelen isoliert. Der Vektor, welcher die Lac Promotoren gegen das Tetracyclin-Gen gerichtet enthielt, wurde mit Eco R1 gespalten, die Spaltstelle mit DNA-Polymerase aufgefüllt und mit BamHI erneut geschnitten. Nach Ligierung der AluI-BglII Fragmente an den aufgefüllten Eco R1-BamHI Vektor wurde die Eco R1 Schnittstelle wieder hergestellt. Um die Klone mit dem ATG Codon (13 Nukleotide länger) erkennen zu können, wurden die erhaltenen Klone mit Eco R1 und Pst1 gespalten; die Klone, welche die erwarteten Fragmente von 151 Basenpaaren Länge enthielten, wurden sequenziert. Die Eco R1 Spaltstelle wurde erneut geöffnet und die Entfernung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem ATG durch Bal 1 Verdauung verkürzt und erneut ligiert. E. coli Zellen, welche bei diesen Plasmiden transformiert worden waren, wurden auf IFN-β₁ Produktion untersucht.

Ein Klon, L-11, produzierte ungefähr 3×10⁶ U/Liter von IFN-β. Die Lac-Promotor-Region in diesem Klon wurde gespalten mit HpaII, d. h. 17 Nukleotide vor dem Start der mRNA. Um das IFN-β₁ Gen herauszuschneiden, wurde das Enzym Sau3a benutzt, welche die DNA genau 3 Nukleotide jenseits des Stop-Codons von IFN-β₁ spaltet.

Dieses HpaII-Sau3a Lac-IFN-β₁ Fragment wurde eingespleißt zwischen die ClaI und HindIII Erkennungsstellen eines Trp-Promotorplasmids, welches wie folgt hergestellt wurde. Ein 180 Nukelotide langes TaqI-TaqI Fragment von -21 bis -201 vor dem Start der Trp mRNA wurde aus dem Trp-Plasmid pEP121-221 herausgeschnitten und in die ClaI Schnittstelle von pBR322 kloniert. Es wurde die Orientierung gewählt, bei der Trp-Promotor Fragment im Uhrzeigersinn vorliegt. Bei diesem Vorgang wird die ClaI Stelle an der Position -21 des Trp-Promotors wieder hergestellt. Durch Ligierung an das Lac-IFN-β₁ Fragment entsteht ein Hybrid-Promotor Trp-Lac vor dem IFN-β₁ Gen. Mit diesem Plasmid TL-11 wurden E. coli MM294 oder der E. coli Minizellstamm p679-54 transformiert. Diese Bakterien produzieren 10⁸ U/Liter IFN-β₁ unter Fermenterkulturbedingungen bei einer OD₆₅₀ von 10, was beweist, daß das IFN-β₁ Genom DNA Fragment sehr aktiv ist (Fig. 4).

Tabelle I

Restriktionsstellen in IFN-β₁ cDNA und Gen

Tabelle II

Artspezifität von bakteriellem Interferon, das vom Genom-IFN-β₁ C15 Klon produziert wurde

Das bakterielle IFN wurde nach Chromatographie des C15-Lysates an Cibacron Blue-Sepharose benutzt, wie in Fig. 2 gezeigt.

Tabelle III

IFN-α und β-Aktivitäten, die von Genom-Fragmenten in dem recA-Plasmid RAP-1 hergestellt wurden

Klon RAP-1 (1833) enthält das Eco RI Fragment mit dem IFN-α _c Gen (Fig. 1B).
Klon RAP-1 (631) enthält das Eco RI Fragment mit dem IFN-β₁ Gen (Fig. 1A).
Die Fragmente sind am Anfang des recA-Gens eingebaut. Die Orientierung ist in Bezug zur recA-Promotor-Orientierung angegeben.

Legenden zu den Abbildungen

Fig. 1A: Schematische Darstellung der DNA des IFN-b₁ Klons C15
(a): Schematische Karte von λ-Charon 4A. Die zwei Arme sind als durchgezogene Linien gezeichnet. (b): Struktur der menschlichen DNA-Einfügung in den Klon C15, die geschwärzte Zone zeigt das Eco R1 Fragment, welches mit IFN-β₁ cDNA hybridisiert. (c): Vergrößerung des geschwärzten Fragments von b, dargestellt als Doppellinie. Die einfache Linie ist Teil des rechten λ-Arms. P _L ist der linksseitige λ-Promotor. (d): Lage der IFN-β₁ mRNA. Die oberen Skalen gelten für a und b; die untere Skala für c und d (Details siehe im Text).

Fig. 1B: Schematische Darstellung des IFN-α _c Klons 18-3
Es ist die Restriktionskarte der Einfügungen von zwei λ-Charon 4A Klonen dargestellt. Das IFN-α _c Gen ist durch den Pfeil alpha-c⁺ gekennzeichnet. Zwei weitere IFN-α Gene liegen in der Nähe von IFN-α _c . Die Einfügung zeigt das Eco R1 2kb Fragment 18-33, welches die IFN-α _c Gene enthält und welches in das recA-Plasmid subkloniert wurde, wie im Text erklärt. Die Symbole für Restriktionsenzymschnittstellen sind dargestellt.

Fig. 2: Nachweis von Interferon auf Blue-Sepharose, welches von dem Genom-Klon IFN-β₁ C15 hergestellt wurde
Ein Rohlysat von E. coli DP50 Zellen, welche mit dem Phagen C15 infiziert waren, wurde wie in Methoden und Material beschrieben fraktioniert und die IFN-Aktivität für jede Fraktion bestimmt (      ). Die Proteinkonzentration wurde in denselben Fraktionen gemessen (      ). Eine parallele Chromatographie und der Nachweis vom Lysat des λ-Charon 4A Phagen ist dargestellt (      ).

Fig. 3: Titration des Interferons vom Genom-Klon IFN-β₁ C15
Eine Fraktion des IFN vom Phagen C15 von der Säule in Fig. 2 (ungefähr 10³ U/ml) wurde 1 : 40 verdünnt und dann serienweise verdünnt in Mikrotiterplatten zum Nachweis von IFN durch die Verdünnung der VSV RNA-Synthese (      ). 25 U/ml Standardinterferon von menschlichen Fibroblasten wurde parallel dazu geprüft (      ). Kontrollen ohne VSV (      ) und mit VSV ohne IFN (      ) sind dargestellt. Die beiden Säulen rechts zeigen die Restaktivität des IFN vom Phagen C15 (Endverdünnung 1 : 40) nach Adsorption an immobilisiertes Anti-IFN-β oder Nichtimmun-IgG, wie in Methoden beschrieben.

Fig. 4: Wachstum und IFN-Produktion in E. coli Zellen, welche das Plasmid TL11 enthalten
Das Plasmid TL11 enthält einen hybriden Trp-Lac Promotor und die codierende Sequenz für reifes menschliches IFN-β₁, welche von dem menschlichen Genom-Fragment stammt, wie im Text beschrieben. Bakterienkulturen wurden in einem 1 Liter New Brunswick-Fermentor gezüchtet, und zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen durch Lysozym-Propylenglykol lysiert und die IFN-Aktivität auf menschlichen Zellen geprüft, welche mit VSV infiziert waren. Die IFN-Aktivität ist pro ml Bakterienkultur berechnet.

Claims (11)

1. Verfahren zum Herstellen von menschlichem Fibroplasten-Interferon (IFN-β ) oder Leukozyten-Interferon (IFN-α ), dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Genom-DNA, welche die genetische Information für Fibroblasten-Interfereon-β 1 (IFN-β 1) oder Leukozyten-Interferon-α _c (IFN-α _c ) enthält, in einen λ-Phagen einführt, entweder ein Bakterium mit diesem rekombinanten Phagen infiziert, oder aus dem g-Phagen ein DNA-Fragment gewinnt und dieses in ein mit einem starken Promotor versehenes Expressionsplasmid eines Bakteriums einführt, das Bakterium züchtet und das Interferon gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Phage λ-Charon 4A ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Klon C15 oder Klon 18-3 durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das infizierte bzw. transformierte Bakterium Escherichia coli ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das infizierte bzw. transformierte Bakterium Escherichia coli DP-50 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid pBR322 ist, welches den recA-Promotor von E. coli enthält.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Genom-DNA mit dem IFN-β₁- oder IFN-α _c -Gen aus dem λ-Phagen oder dem Plasmid entfernt wird, neben dem Codon für das erste Methionin des reifen Interferon geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle des Lac-Promotors von E. coli ligiert wird, der so modifiziert ist, daß er die RNA-Polymerase- Bindungsstelle des Tryptophan-Promotors enthält, was zu einem hybriden Trp-Lac-Promotor führt, das Plasmid in das Bakterium wieder eingeführt wird und die Bakterien zur Interferonherstellung gezüchtet werden.

8. Vektor, der die genetische Information für die Expression von menschlichem IFN-β₁ oder IFN-α _c enthält, dadurch erhältlich, daß man menschliche Genom-DNA entweder in einen λ-Phagen einführt oder aus diesem Phagen ein DNA-Fragment gewinnt und dieses in ein mit einem starken Promotor versehenes Expressionsplasmid einführt.

9. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Phage λ-Charon 4A ist.

10. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Expressionsplasmid das Plasmid pBR322 ist, welches den recA-Promotor von E. coli enthält.

11. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Genom-DNA, enthaltend das Gen für IFN-β₁ oder IFN-α _c , aus dem λ-Phagen oder dem Expressionsplasmid entfernt, neben dem Codon für das erste Methionin des reifen Interferons geschnitten und an die ribosomale Bindungsstelle des Lac-Promotors von E. coli ligiert wurde, der so modifiziert ist, daß er die RNA-Polymerase-Bundungsstelle des Tryptophan-Promotors enthält, wodurch ein hybrider Trp-Lac-Promotor in dem so modifizierten Phagen oder Expressionsplasmid vorliegt.