DE3043981C2

DE3043981C2 -

Info

Publication number: DE3043981C2
Application number: DE3043981A
Authority: DE
Inventors: Michel Rehovot Il Revel; Pierre Paris Fr Tiollais
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1979-11-21
Filing date: 1980-11-21
Publication date: 1989-11-30
Also published as: US5468609A; DE3051086C2; SE8007998L; DE3043981A1; IT8026172A0; SE8603145L; FR2475901B1; SE461223C; JP2555279B2; CH664967A5; SE469660B; JP2548201B2; SE461223B; US5468608A; SE8603145D0; IL58765A0; IT1194820B; US5541312A; GB2063882A; JPS63164896A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung menschlicher Fibroblasten-Interferon-mRNA, mRNA für menschliches Fibroblasten-Interferon und deren Verwendung zur Herstellung von Interferon β 1 bzw. Interferon β 2.

Interferon ist ein wichtiges, vom Körper hergestelltes antivirales Protein, das auch eine Wachstumshemmung von Tumorzellen bewirkt. Aufgrund seiner Artspezifität wird zur Anwendung in der Humanmedizin menschliches Interferon benötigt. Die begrenzten Mengen an Interferon, die in Gewebekulturzellen oder frischen Leukozyten gebildet werden, genügen nicht für die klinische Verwendung in großem Maßstab. Das Einschleusen der genetischen Information für menschliches Interferon in Bakterien könnte die Produktion eines Polypeptids mit Interferon-Aktivität ermöglichen. Es ist bekannt, daß derartige Methoden für das menschliche Wachstumshormon und für Insulin entwickelt wurden.

Die beiden Typen von Interferon, nämlich Leukozyten-Interferon (IFN-α ) und Fibroblasten-Interferon (IFN-β ) werden anscheinend von verschiedenen m-RNAs kodiert; vgl. Cavallieri et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 4415 bis 4419. Die Isolierung dieser mRNAs in reiner Form ist bis jetzt noch nicht gelungen. Dies erscheint auch um so schwieriger, als die Wirtszelle nur dann in der Lage ist, die Interferon-mRNA zu synthetisieren, wenn die Zelle geeigneten exogenen Faktoren ausgesetzt wird, beispielsweise einer viralen Infektion oder speziellen synthetischen Polynucleotiden, wie Poly (rI : rC). Selbst dann produziert die Zelle nur in geringsten Mengen. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, einen mRNA-Extrakt von Wirtszellen zu verwenden, welche vorher zur Bildung von Interferon induziert worden waren, und diese mRNA in vitro in einem zellfreien System mit allen Bestandteilen, insbesondere den natürlichen Aminosäuren, translatieren zu lassen, um auf diese Weise ein Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität zu erhalten. Die Interferon-mRNA stellt jedoch nur einen sehr untergeordneten Anteil der zu translatierenden mRNAs dar, und dementsprechend war das schließlich erhaltene Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität sehr stark durch andere Proteine verunreinigt.

Daher würde die Verwendung solcher mRNA-Präparate als Ausgangsmaterial zur direkten Umwandlung in Doppelstrang-DNA, welche nach Insertion in einen geeigneten Vektor kloniert werden soll, Screening-Schwierigkeiten mit sich bringen, die praktisch unüberwindlich wären.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die erwähnten Schwierigkeiten der Interferon-Herstellung weitestgehend zu überwinden, und insbesondere ein Verfahren zur Anreicherung der mRNA, insbesondere menschlichen Ursprungs, die nach Translation Interferon bildet, sowie der entsprechenden DNAs zu schaffen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren dieser Art zu schaffen, bei dem die Boten-RNA in DNA transkribiert wird, und bei dem die DNA in einem geeigneten Vektor kloniert wird. Plasmide werden als Vektoren bevorzugt. Das bevorzugte Plasmid ist ein Plasmid des pBR322-Typs.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, um die jeweilige unterschiedliche genetische Sequenz festzustellen, die in menschlichen Zellen exprimiert wird, wenn diese zur Bildung von Interferon induziert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht aus einer differentiellen Hybridisierung der bakteriellen Klone zunächst mit DNA von RNA aus induzierten Zellen und sodann mit ebensolcher DNA von RNA aus nicht induzierten Zellen.

Weitere Aufgaben der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren zur Anreicherung menschlicher Fibroblasten-Interferon-mRNA, wobei man eine Wirtszellkultur mit einem exogenen Faktor behandelt, um in diesen Wirtszellen die Synthese der induzierbaren mRNA auszulösen, gelöst. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden

a) die mRNAs einschließlich der induzierbaren mRNA, welche in der induzierbaren Zellkultur gebildet wurde, sowie die mRNAs aus einer nicht induzierten Kontrollkultur der gleichen Wirtszellen extrahiert,
b) cDNA-Proben sowohl von den mRNAs aus der induzierten Kultur als auch von den mRNAs aus der nicht-induzierten Kontrollkultur erzeugt, wobei die entsprechenden mRNAs als Matrizen dienen ("induzierte cDNA" und "nicht-induzierte cDNA"),
c) doppelsträngige cDNAs erzeugt, die von der mRNA aus der induzierten Kultur stammen, diese cDNAs in einen Vektor einführt, einen Mikroorganismus mit diesen modifizierten Vektoren transformiert sowie diesen Mikroorganismus unter Bedingungen züchtet, die das selektive Wachstum solcher Mikroorganismenkolonien erlauben, welche die modifizierten Vektoren enthalten (Ausgangskolonien),
d) von diesen Ausgangskolonien Duplikatkolonien herstellt,
e) die DNAs sowohl von den Ausgangs- wie von den Duplikatkolonien in situ freisetzt,
f) die DNAs von den Ausgangskolonien einerseits sowie von den Duplikatkolonien andererseits mit Proben der "induzierten cDNA" bzw. der "nicht-induzierten cDNA" (oder umgekehrt) hybridisiert,
g) die DNAs von Klonen, welche mit den Proben der "induzierten cDNA", nicht dagegen mit den Proben der "nicht-induzierten cDNA" hybridisieren, gewinnt, wobei DNAs erhalten werden, welche mit solcher mRNA hybridisieren, die in das menschliche Fibroblasten-Interferon translatiert werden kann, und die vorher extrahierten, in den Zellen synthetisierten mRNAs mit einem auf einem Träger fixierten DNA-Vektor, der eine DNA, die mit der RNA des menschlichen Fibroblasten-Interferons hybridisieren kann, enthält, unter Bedingungen zusammenbringt, welche Hybridisierung erlauben und danach die gebundene mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von hochgereinigter Interferon-mRNA menschlichen Ursprungs eingesetzt.

Es ist als Vorteil einzuschätzen, daß einige der vorstehend aufgeführten Stufen nicht in genau der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen. Dies trifft insbesondere zu für die Stufe b), welche die Herstellung der cDNA-Proben betrifft. Tatsächlich ist die Stufe b) nicht unbedingt eine Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens. Statt dessen können analoge Proben aus anderen Zellquellen verwendet werden.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Stufen b) und c) lediglich an Fraktionen der mRNAs durchgeführt, die aus den Zellen extrahiert werden, und zwar aus den induzierten oder nicht-induzierten Zellen. In dieser Hinsicht kann die Tatsache ausgenutzt werden, daß mRNAs einen Poly-A-Teil enthalten, der die Abtrennung der mRNA von der Gesamt-RNA durch Bindung an Oligo-T-Cellulose ermöglicht. Die anschließend eluierte mRNA-Fraktion wird vorteilhafterweise danach noch durch eine Sucrose-Gradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die verschiedenen Banden werden sodann gesondert in einem geeigneten zellfreien System, beispielsweise einem Reticulocyten-Lysat, translatiert. Jedes der Translationsprodukte wird dann darauf untersucht, ob es durch ein Anti-Interferonserum ausgefällt wird. Die Banden der mRNA, deren Translationsprodukte eine positive Reaktion bei diesem Immunpräzipitationstest ergeben, werden zur Durchführung der beiden vorstehend beschriebenen Stufen b) und c) zurückbehalten. Ein weiterer Aspekt dieses Verfahrens ist darin zu erblicken, daß zwei verschiedene mRNAs, die für Interferon kodieren, aus menschlichen Fibroblastenzellen isoliert werden können, wenn diese Zellen induziert werden. Die kleinere mRNA sedimentiert bei 11 S und liefert durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 000. Dieses wird durch Antikörper, die gegen eines der Interferone erzeugt werden, welche aus diesen Zellen gewonnen und gereinigt werden können, selektiv ausgefällt. Dieses Protein ist menschliches Interferon (IFN)-β 1. Die größere mRNA sedimentiert bei 14 S und liefert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23 000. Dieses Protein wird durch Antikörper gegen ein weniger gereinigtes Fibroblasten-Interferonpräparat ausgefällt. Dieses Protein wird als menschliches Interferon-β 2 bezeichnet. Fraktionen von mRNA für beide Proteine werden in der Stufe c) eingesetzt. Dies ermöglicht die beliebige Herstellung von IFN β 1 oder IFN β 2 in praktisch reiner Form. Die Hybridisierung (Stufen b, c, d, e, f und g) gestattet eine genaue Identifizierung von einzelnen E. coli-Kolonien, die eine der beiden Interferon-cDNAs für IFN β 1 oder β 2 enthalten.

Es liegt auf der Hand, daß diejenigen Kolonien, die nur mit "induzierten" cDNA-Proben und nicht mit den "nicht-induzierten" cDNA-Proben hybridisieren, nur solche Kolonien darstellen, die einen modifizierten Vektor mit der cDNA enthalten, die der Interferon-mRNA entspricht, weil

a) die DNA, die mit der "nicht-induzierten" cDNA-Probe nicht hybridisierbar ist, dementsprechend keiner der mRNAs entspricht, die normalerweise von einer nicht-induzierten Zelle gebildet werden und
b) der einzige Unterschied zwischen den beiden Proben darin besteht, daß die "induzierte" cDNA-Probe eine cDNA aus einer der Interferon-mRNAs enthält, die andere Probe dagegen nicht.

Diese sogenannte differentielle Hybridisierung ist beispielsweise in Cell 16, S. 443 ff., 1979 und J. Mol. Biol. 129, S. 19 ff., 1979 beschrieben.

Die Herstellung dieser cDNA-Proben kann nach üblichen Methoden (s. beispielsweise Genetic Engineering, Band 1, S. 15 ff., 1979) erfolgen, insbesondere durch Transkription mit einer reversen Transkriptase. Vorzugsweise wird ein bakterieller Vektor mit hoher Kopienzahl, wie das pBR322-Plasmid, verwendet. Um die spätere Expression der durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektoren in einem Mikroorganismus zu erhalten, kann man einen Satz von Vektoren verwenden, wie sie von Patrick Charney, et al., in dem Aufsatz "Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases", Nucleic Acids Res., Bd. 5 (12), 1978, S. 4479 bis 4494, beschrieben wurden.

Gemäß einem weiteren wichtigen Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der vorstehend modifizierte Vektor, wie immer sein (Translations-)Leseraster auch vorliegen mag, zur Extraktion von Interferon-mRNA aus dem RNA-Gemisch verwendet werden, das durch die induzierten Zellen gebildet wird. Bei diesem Verfahren werden diese RNAs mit einem derartigen durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektor zusammengebracht, welcher vorher auf einem Träger fixiert worden ist. Die Vereinigung (von mRNAs und modifiziertem Vektor) erfolgt unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung erlauben. Danach wird die hängengebliebene (gebundene) mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert. Auf diese Weise kann mRNA von menschlichem Interferon (entweder IFN β 1 oder IFN β 2) in hochgereinigter Form erhalten werden.

Der hohe Reinigungsgrad ergibt sich aus der Tatsache, daß das Translationsprodukt in einem geeigneten in vitro-System in jedem Fall im wesentlichen aus einem einzigen Polypeptid mit Interferon-Aktivität besteht, das durch die Antikörper gegen menschliches Interferon ausgefällt wird.

Die Erfindung betrifft somit auch die gereinigten mRNAs, die normalerweise bis zu 900 bis 1000 Nucleotide für IFN β 1 und 1250 bis 1350 Nucleotide für IFN β 2 enthalten. In gleicher Weise betrifft die Erfindung die entsprechenden cDNAs, die durch Transkription der mRNAs erhalten werden. Die Erfindung betrifft ferner die beiden unterschiedlichen Interferon-mRNAs und somit die Proteinkomponenten, die auch unterschiedliche biologische Bedeutung haben können. Es liegt auf der Hand, daß jedem der Hybridisierungsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, sofern erforderlich, eine Denaturierung der möglichen doppelsträngigen Nucleinsäuren vorangeht, um sicherzustellen, daß keine doppelsträngigen Nucleinsäuren (die eine Interferon-Aktivität in Zellen induzieren könnten) in den gereinigten mRNAs verbleibt, wenn diese zur in vitro-Produktion durch Translation von praktisch reinem Protein mit Interferon-Aktivität verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und Tabellen weiter erläutert.

Fig. 1 zeigt die Fraktionierung von mRNA an einem Sucrosegradienten sowie die Translation dieser aus induzierten Zellen stammenden mRNA-Fraktionen in Xenopus laevis-Oocyten zur Herstellung von menschlichem Interferon und ihre Translation in Reticulocyten-Lysaten zur Produktion spezifisch immunpräzipitierbarer Proteine. Dieses Verfahren gestattet die Trennung der mRNAs für IFN β 1 und IFN β 2.

Fig. 2 veranschaulicht das Ergebnis einer differentiellen Hybridisierung der DNAs der gleichen bakteriellen Kolonien mit den beiden vorstehend erwähnten cDNA-Proben aus induzierten und nicht-induzierten Zellen.

Fig. 3 erläutert eine Reinigung von Interferon IFN β 2-mRNA durch Hybridisierung mit immobilisierter DNA aus dem bakteriellen Klon A341, nachgewiesen durch Translation in einem Reticulocyten-Lysat.

Fig. 4 zeigt, das DNA aus dem bakteriellen Klon A341 komplementär ist zu einer mRNA mit 1250 bis 1350 Nucleotiden, die in menschlichen Zellen nur nach Induktion der Interferonsynthese auftritt.

Tabelle I zeigt, daß diese mRNA nach Translation in den Oocyten von Xenopus laevis biologisch aktives Interferon liefert, welches das Wachstum eines Virus in menschlichen Zellen hemmt.

Beispiel a) Reinigung der beiden Interferon-mRNAs aus menschlichen diploiden Fibroblasten

RNA wird aus Monolayerkulturen der menschlichen Fibroblastenlinie FS11 (isoliert am Weizmann Institute of Science) extrahiert. Diese diploiden Zellen aus der Vorhaut eines normalen, 8 Tage alten Knaben werden von 15 gesonderten Isolaten ausgewählt im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bildung hoher Interferon-Titer. Alternativ werden Kulturen eines Klones von menschlichen SV 80 Zellen verwendet. Die Kulturen in Eagles Minimalmedium mit 10% fötalem Kälberserum werden in 2,2 Liter fassenden Rollerflaschen aus Glas oder 22×22 cm Tabletts aus Kunststoff in einer Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37°C inkubiert. 3 Tage nach dem Zusammenfließen der Zellen werden die Kulturen zur Produktion von Interferon induziert, indem sie 3½ Stunden lang mit 100 µg/ml Poly (rI : rC) und 50 µg/ml Cycloheximid (dies blockiert die Synthese von Proteinen durch den Wirt), behandelt werden. Actinomycin D (das die Synthese von zellulärer RNA blockiert) wird in einer Menge von 1 µg/ml zugesetzt. 1 Stunde später werden die Zellen mit gepuffertem Nonidet-P40 Detergens (Netzmittel) lysiert und die cytoplasmatische RNA wird mit einem Phenol-Kresol-Gemisch nach Kirby (1965) extrahiert. Die mRNAs werden aus der Gesamt-RNA dadurch isoliert, daß man sie an Oligo-dT-Cellulose bindet, da sie selbst Poly-A enthalten. der mRNS-Anteil wird anschließend durch Sucrosegradientenzentrifugation fraktioniert. Die Fraktionen, die Interferon-mRNA enthalten, werden durch Mikroinjektion in Oocyten von Xenopus laevis gemäß N. K. B. Raj und P. M. Pitha (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 1483 bis 1487) identifiziert. 24 bis 40 Stunden später wird die antivirale Aktivität des in das Oocyten-Inkubationsmedium freigesetzten Interferons bestimmt. Die antivirale Aktivität wird dadurch bestimmt, daß man FS11-Zellen mit Verdünnungen des Oocytenmediums behandelt. Die Zellen werden mit dem Virus der vesiculären Stomatitis (VSV) infiziert. Es wird die Hemmung des cytopathischen Effekts des Virus beobachtet. Die Interferontiter werden durch Vergleich mit einer bekannten Lösung entsprechend der letzten wirksamen Verdünnung berechnet. Die Interferon-mRNA enthaltenden Fraktionen werden außerdem durch Translation in einem Reticulocyten-Lysat und anschließende Immunpräzipitation des Produkts nach der Methode von Weissenbach et al., (Eur. J. Biochemistry, Bd. 98 (1979), S. 1 bis 8) identifiziert.

Fig. 1a zeigt die beiden Peaks der Interferon-mRNA-Aktivität, ermittelt durch Injektion in Oocyten. Fig. 1b zeigt die Linien, die durch Immunpräzipitation der Translationsprodukte mit dem Anti-Interferon-Serum erhalten wurden. Die beiden Pfeile zeigen die beiden Polypeptide vom Molekulargewicht 23 000 (23 K) und 20 000 (20 K). Die Sucrose-Gradientenfraktionen, die für die 23 K und 20 K immunpräzipitierten Polypeptide kodieren, sind in Fig. 1a gezeigt. Es ist ersichtlich, daß sie den beiden Peaks der Interferon-mRNA-Aktivität entsprechen.

Interferon-Aktivität wird auch in den Translationsprodukten der Reticulocyten-Lysate durch Bestimmung der Induktion der (2′-5′)-Oligo-isoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen festgestellt. Aufgrund der beiden Methoden kann festgestellt werden, daß der größere Interferon-mRNA-Peak für das 23 K-Polypeptid kodiert, während der kleinere Interferon-mRNA-Peak für das 20 K-Polypeptid kodiert. Beide Interferon-mRNAs werden auf diese Weise isoliert und zur Klonierung in E. coli verwendet.

b) Klonierung von Interferon-β 2-cDNA in E. coli

Die gereinigte mRNA aus induzierten Zellen enthält etwa 1 bis 3% der mRNA für das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Sie dient als Matrize zur Synthese von cDNA durch reverse Transkriptase von Vogelmyeloblastosis-Virus (AMV). Als Starter wird Oligo-dT verwendet. Nach Eliminierung der RNA durch Alkalibehandlung kann der zweite Strang der DNA mit reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase I synthetisiert werden. Einsträngige DNA wird mit Nuclease S1 weghydrolysiert, und die 3′-Enden der DNA werden mit Nucleotid-terminaler Transferase unter Verwendung von dGTP als Substrat verlängert. Die Plasmid-DNA, welche in entsprechender Weise mit terminaler Transferase und dCTP verlängert wurde, wird mit dieser dG-verlängerten menschlichen cDNA hybridisiert und in E. coli DP 50 eingeschleust. Transformierte Bakterienkolonien werden durch Auftragen auf Agarplatten identifiziert (selektioniert), die Luria Nährbrühe, Diaminopimelinsäure, Thymidin und Tetracyclin enthalten. Die Kolonien werden weiterhin auf ähnlichen Agarplatten geprüft, die Ampicillin als einziges Antibiotikum enthalten. Auf einem Nitrocellulosefilter auf einer Agarplatte der vorstehend beschriebenen Art mit 10 µg/ml Tetracyclin läßt man die ampicillinempfindlichen, tetracyclinresistenten Bakterienkolonien heranwachsen. Über 2000 der erhaltenen transformierten Kolonien werden auf andere Nitrocellulosefilter übertragen, die ebenfalls auf Agarplatten der vorstehend beschriebenen Art aufgelegt sind. Jede der Duplikatkolonien wird ihrer jeweiligen Ursprungs- oder Ausgangskolonie zugeordnet, gewöhnlich durch gemeinsame Numerierung. Sobald die Kolonien einen Durchmesser von 3 bis 5 mm erreicht haben, werden die Filter (Ausgangskolonien und Duplikate) auf einen Stapel aus Filterpapieren übertragen, die zunächst mit 0,5 N Natronlauge, sodann mit 0,15 M Kochsalzlösung und 0,1 N Natronlauge imprägniert worden sind, um in situ die entsprechenden DNAs freizusetzen. Die Filterpapiere werden neutralisiert und getrocknet. Zum Nachweis der Bakterienkolonien, die die Interferon-DNA-Sequenzen enthalten, werden die Filterpapiere mit zwei verschiedenen [³²P]-cDNA-Proben hybridisiert. Eine cDNA-Probe wird durch reverse Transkriptase der mRNA aus der Sucrose-Gradientenfraktion von induzierten Zellen (Pfeil 23 K der Fig. 1) hergestellt. Die zweite Probe wird in gleicher Weise aus der entsprechenden Fraktion des nicht-induzierten Zellenpräparats hergestellt. Beide cDNA-Proben werden mit den vier stark radioaktiven [³²P]-Desoxynucleosidtriphosphaten als Substraten und fragmentierter Kälberthymus-DNA als Starter synthetisiert. Auf diese Weise wird eine statistische Wiedergabe der mRNA-Sequenzen in den cDNA-Proben erreicht. Die Hybridisierung wird während 18 Stunden bei 62 bis 64°C in einem 0,9 M NaCl-0,09 M Natriumcitrat-Puffer vom pH-Wert 7,0 durchgeführt. Die Ausgangskolonien werden mit den cDNA-Proben der induzierten Zellen und die Duplikatkolonien mit den cDNA-Proben der nicht-induzierten Zellen (oder umgekehrt) hybridisiert. Nach gründlichem Waschen werden die Filter auf Röntgenfilm gelegt, und es werden die Bakterienkolonien festgestellt, die nur mit der "induzierten" cDNA, nicht jedoch mit der "nicht-induzierten" cDNA hybridisieren. Auf diese Weise wurden 20 verschiedene Bakterienkolonien aus insgesamt mehr als 2000 untersuchten transformierten Kolonien isoliert. Diese 20 Bakterienkolonien enthalten Mehrfachkopien eines Plasmids, in welches DNA-Sequenzen inseriert sind, welche sich vom menschlichen mRNA ableiten, die nur dann exprimiert wird, nachdem die Zellen durch Poly-(rI : rC) zur Interferonproduktion induziert worden sind.

Ein Beispiel zur Erläuterung dieser Methode ist in Fig. 2 an Hand von 15 Paaren von alkalibehandelten Kolonien (Ausgangs-Kolonien und Duplikatkolonien) auf ihren Nitrocellulosefiltern wiedergegeben, deren DNAs mit [³²P]-cDNA hybridisiert worden sind, die von den mRNA-Fraktionen 23 K von Fig. 1 hergestellt wurden, welche entweder aus mit Poly (rI : rC) zur Interferonproduktion induzierten (i) Zellen oder aus nicht-induzierten (n. i.) Zellen stammen. Die Pfeile zeigen (zwei) Kolonien, insbesondere die Kolonien 5 und 13, welche die induzierten Sequenzen enthalten.

Die Kolonie Nr. 13 wird als E. coli DP50/A341 bezeichnet.

c) Isolierung von Interferon-mRNA aus menschlichen Fibroblasten

Interferon-mRNA (und der Nachweis der Gegenwart von Interferon-cDNA-Sequenzen in der Plasmid-DNA des Klones A341) wird folgendermaßen erhalten:
Eine 500 ml Kultur dieses Bakterienklones wird zur Herstellung von 50 µg Plasmid-DNA verwendet. Diese DNA wird nach vorheriger Denaturierung kovalent an Diazobenzyloxymethyl-Cellulosepulver nach der Methode von Aldwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5350, gebunden. In ähnlicher Weise wird Plasmid pBR322-DNA (die keine humanen DNA-Sequenzen enthält), an Cellulose gebunden. Poly-A enthaltende mRNA aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferonbildung induziert worden sind, wird mit den beiden DNA-Cellulosepräparaten in 56prozentigem Formamid bei 52°C hybridisiert. Sodann wird mit reinem Formamid bei 70°C eluiert. Die nach dem Eluieren wiedergewonnene RNA wird in dem zellfreien Reticulocyten-System (Fig. 3) translatiert. Das entstandene Translationsprodukt der an der A341-DNA-Cellulose selektierten mRNA ist im wesentlichen das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Von der pBR322-DNA-Cellulose hingegen wird keine menschliche Interferon-mRNA isoliert. Im Vergleich zu den Translationsprodukten der menschlichen mRNA vor der Hybridisierung an A341-DNA-Cellulose konnte festgestellt werden, daß die klonierte A341-DNA nur zu einem geringen Teil komplementär ist zu der mRNA des Gemisches. Das Produkt der an A341-DNA-Cellulose gebundenen mRNA wird durch das menschliche Fibroblasten-Interferon-Antiserum immunpräzipitiert.

Die Interferon-mRNA kann auch nach einem ähnlichen Verfahren isoliert werden, wie dies vorstehend beschrieben ist, bei dem die Plasmid-A341-DNA jedoch an Nitrocellulosefilter gebunden ist, dann mRNA daran hybridisiert und schließlich durch 1minütiges Kochen in Wasser eluiert wird.

Die Aktivität dieser gereinigten mRNA zur Kodierung für biologisch aktives menschliches Interferon konnte durch Injektion in Oocyten von Xenopus laevis und anschließende Bestimmung der Hemmung der Virusvermehrung in menschlichen Zellen festgestellt werden, die dem Oocyten-Inkubationsmedium ausgesetzt wurden; vgl. Tabelle I. Die Interferon-Aktivität der gereinigten β 2-mRNA kann auch durch Induktion der (2′-5′)-Oligoisoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen durch die Oocyten-Translationsprodukte gezeigt werden; vgl. Tabelle I.

Die Restriktionskartierung der A341-Plasmid-DNA (die Analyse der A321-Plasmid-DNA durch Restriktionsenzyme) zeigt, daß sie ein Insert aus menschlicher DNA von etwa 900 Nucleotiden in der Pst-Schnittstelle enthält. Die A341-DNA hybridisiert auch mit drei Fragmenten des menschlichen Genoms, das durch Eco R1-Nuclease geschnitten wurde. Diese Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese voneinander getrennt. Die Hybridisierung an Agarose-Gelelektropherogramme von mRNA aus menschlichen Fibroblasten zeigt ferner, daß A341-DNA komplementär ist zu RNA-Sequenzen, die nur in Zellen exprimiert werden, die dem Interferon-Induktor Poly (rI : rC) ausgesetzt wurden; vgl. Fig. 4a. Selbst eine einstündige Behandlung der Zellen mit Poly (rI : rC) führt zur Anhäufung einer 1250 bis 1350 Nucleotide langen RNA, die mit A341-DNA hybridisiert. Diese stellt die IFN β 2-mRNA dar.

Die vorstehenden Werte zeigen, daß der bakterielle Klon E. coli DP50/A341 in der Pst-Schnittstelle seines pBR322-Plasmids ein Insert von etwa 900 Nucleotiden aus menschlichen cDNA-Sequenzen enthält, die komplementär zu einer menschlichen Interferon-mRNA sind. Es wurden mehrere, auf ähnliche Weise hergestellte Klone erhalten. Fig. 4b zeigt, daß Klone für IFN β 2 mit der größeren, 1250 bis 1350 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren, während Klone für IFN β 1 mit der kleineren, 900 bis 1000 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren.

Das Verfahren kann zur Herstellung von Klonen von Interferon-DNA unterschiedlicher Typen ( α, β, γ ) aus menschlichen Zellen verwendet werden.

Beschreibung der Figuren Fig. 1

Sucrose-Gradient von Poly A-RNA aus menschlichen Zellen, die zur Herstellung von Interferon induziert worden waren (a). Sedimentation erfolgte von rechts nach links. In 10 Xenopus Oocyten werden 0,4 µg RNA aus jeder Fraktion injiziert. Nach 40 Stunden wird das Medium um die Oocyten mit FS11-Zellen auf Interferon untersucht (linke Skala). Jede RNA-Fraktion (0,24 µg) wird auch in Reticulocyten-Lysaten translatiert, und die ³⁵S-Methionin-markierten Produkte werden mit Anti-Interferon-Serum ausgefällt. Die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysierten Produkte sind in der Reihe i von (b) gezeigt. Die Reihe n in (b) stellt die immunpräzipitierten Produkte von nicht-fraktionierter mRNA aus nicht-induzierten Zellen dar. Am rechten Ende von (b) sind die Molekulargewichtsmarker angegeben (von oben nach unten 68, 46, 30, 18 und 14 Dalton × 10^-3). Die Position und die Intensität des 23 K- und 20 K-Proteins (Pfeile) wird aufgezeichnet und ist graphisch in a (rechte Skala) wiedergegeben. Die schwerere der beiden Interferon-mRNAs wird in das 23 K-Protein translatiert, während die kleinere Interferon-mRNA in das 20 K-Protein translatiert wird.

Fig. 2 Erkennung von transformierten bakteriellen Klonen, die Interferon-DNA enthalten

Die Nukleinsäuren von 15 alkalibehandelten, auf Nitrocellulosefiltern gewachsenen Kolonien werden in situ mit [³²P]-cDNA hybridisiert. Diese wurde an der 23 K-mRNA synthetisiert, welche entweder aus Zellen stammt, die durch Poly (rI : rC) zur Interferonproduktion induziert waren (i), oder aus nicht-induzierten Zellen (Ni). Die Pfeile zeigen zwei Kolonien, die induzierte Sequenzen enthalten. Die Kolonie Nr. 13 ist E. coli DP50/A341.

Fig. 3 Nachweis von Interferon-DNA im Klon E. coli DP50/A341

Poly A-mRNA aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferon-Produktion induziert worden sind, wird mit DNA aus dem A341-Plasmid hybridisiert, die an Cellulose kovalent gebunden ist. Nach Translation der mRNA erfolgt die Gelelektrophorese der Translationsprodukte, welche zeigt, daß nur mRNA, die für das Interferon-(IF) Polypeptid kodiert, aus dem Gemisch der gesamten mRNAs selektioniert wurde. pBR322-DNA ist nicht in der Lage, diese mRNA zu binden. Die Position des IF-Polypeptids zeigt sich nach Immunpräzipitation mit Anti-Interferon-Serum (ipt).

Fig. 4

a) Plasmid-DNA aus dem bakteriellen Klon A341 (1) hybridisiert mit einer 14 S (1300 Nucleotide langen) mRNA, die in Zellen gefunden wird, welche zur Interferonproduktion induziert wurden (i). Diese RNA wird jedoch nicht in nicht-induzierten Zellen (n) gefunden. Die Plasmid-pBR322-DNA (2) hybridisiert nicht, während nichtklonierte Gesamt-cDNA (tot) (3) mit zahlreichen mRNAs hybridisiert, die auch in nicht-induzierten Zellen gefunden werden. Es wird eine Agarose-Gelelektrophorese der RNAs und anschließende Hybridisierung mit den drei ³²P-DNAs gezeigt.

b) Plasmid-DNA aus verschiedenen Klonen von Interferon-DNA wird für ein ähnliches Hybridisierungsexperiment an mRNA-Elektropherogrammen verwendet. Klone mit IFN β 2-DNA hybridisieren mit der 1300 Nucleotide langen mRNA, während Klone wie IFN β 1-DNA an der kleineren, 900 Nucleotide langen Interferon-mRNA hybridisieren.

Tabelle I

Hybridisierung und Translation von β 2-Interferon-mRNA

Claims

1. Verfahren zur Anreicherung menschlicher Fibroblasten-Interferon-mRNA, wobei man eine Wirtszellkultur mit einem exogenen Faktor behandelt, um in diesen Wirtszellen die Synthese der induzierbaren mRNA auszulösen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die mRNAs einschließlich der induzierbaren mRNA, welche in der induzierten Zellkultur gebildet wurde, sowie die mRNAs aus einer nicht-induzierten Kontrollkultur der gleichen Wirtszellen extrahiert,
b) cDNA-Proben sowohl von den mRNAs aus der induzierten Kultur als auch von den mRNAs aus der nicht-induzierten Kontrollkultur erzeugt, wobei die entsprechenden mRNAs als Matrizen dienen ("induzierte cDNA" und "nicht-induzierte cDNA"),
c) doppelsträngige cDNAs erzeugt, die von der mRNA aus der induzierten Kultur stammen, diese cDNAs in einen Vektor einführt, einen Mikroorganismus mit diesen modifizierten Vektoren transformiert sowie diesen Mikroorganismus unter Bedingungen züchtet, die das selektive Wachstum solcher Mikroorganismenkolonien erlauben, welche die modifizierten Vektoren enthalten (Ausgangskolonien),
d) von diesen Ausgangskolonien Duplikatkolonien herstellt,
e) die DNAs sowohl von den Ausgangs- wie von den Duplikatkolonien in situ freisetzt,
f) die DNAs von den Ausgangskolonien einerseits sowie von den Duplikatkolonien andererseits mit Proben der "induzierten cDNA" bzw. der "nicht-induzierten cDNA" (oder umgekehrt) hybridisiert,
g) die DNAs von Klonen, welche mit den Proben der "induzierten cDNA", nicht hingegen mit den Proben der "nicht-induzierten cDNA" hybridisieren, gewinnt, wobei DNAs erhalten werden, welche mit solcher mRNA hybridisieren, die in das menschliche Fibroblasten-Interferon translatiert werden kann, und die vorher extrahierten, in den Zellen synthetisierten mRNAs mit einem auf einem Träger fixierten DNA-Vektor, der eine DNA, die mit der RNA des menschlichen Fibroblasten-Interferons hybridisieren kann, enthält, unter Bedingungen zusammenbringt, welche Hybridisierung erlauben und danach die gebundene mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich der auf einem Träger fixierte DNA-Vektor vom Plasmid pBR322 ableitet und ein DNA-Insert enthält, das mit menschlicher mRNA hybridisieren kann und bis zu 900 bis 1000 Nukleotide oder 1250 bis 1350 Nukleotide umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei man die RNA durch Sucrosegradientenzentrifugation reinigt und danach die mRNA in vitro in menschliches Fibroblasten-Interferon translatiert, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus den induzierten Zellen isolierte RNA in RNA-Fraktionen auftrennt, welche letztlich die Herstellung von menschlichem Interferon IFN β 1 mit 900 bis 1000 Nukleotiden und IFN β 2 mit 1250 bis 1350 Nukleotiden ermöglichen.

4. mRNA für menschliches Fibroblasten-Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß sie 900 bis 1000 Nukleotide lang ist und bei 11 S sedimentiert, wenn sie für IFN β 1 kodiert und 1250 bis 1350 Nukleotide lang ist und bei 14 S sedimentiert, wenn sie für IFN β 2 kodiert, und daß die bei 11 S sedimentierende mRNA durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 000 und die bei 14 S sedimentierende mRNA durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23 000 liefert.

5. Verwendung einer mRNA für menschliches Fibroblasten-Interferon nach Anspruch 4 zur Herstellung von Interferon β 1 bzw. Interferon β 2.