DE3490055T1 - Menschliches Leukozyteninterferon N und Verfahren zu dessen Herstellung in Bakterienzellen - Google Patents

Menschliches Leukozyteninterferon N und Verfahren zu dessen Herstellung in Bakterienzellen

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DE3490055T1
DE3490055T1 DE19843490055 DE3490055T DE3490055T1 DE 3490055 T1 DE3490055 T1 DE 3490055T1 DE 19843490055 DE19843490055 DE 19843490055 DE 3490055 T DE3490055 T DE 3490055T DE 3490055 T1 DE3490055 T1 DE 3490055T1
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Institut bioorganičeskoj chimii imeni M.M. Šemjakina Akademii nauk SSSR, Moskau/Moskva
Institut organičeskogo sinteza Akademii Nauk Latvijskoj SSR, Riga
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Description

DEAA-32239.4
MENSCHLICHES LEUKOZYTENINTERFERON N UND VERFAHREN ZU DESSEN HERSTELLUNG IN BAKTERIENZELLEN
Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gentechnik und betrifft insbesondere ein neues menschliches Interferon N und ein Verfahren zu dessen Herstellung in Bakterienzellen.
Vorangehender Stand der Technik
Interferone, darunter auch Leukozyteninterferon, stellen eine Klasse der induziblen Eiweißstoffe der Wirbeltiere dar, die eine virostatische und antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, an der Regulierung der immunologischen Zellreaktionen teilnehmen und eine radioprotektorische und geschwulsthemmende Wirkung ausüben. Die menschlichen Leukozyteninterferone bilden eine multigene Familie mindestens mit 12 Gliedern, was durch die Strukturanalyse der an der m-RNS der Inter-
ferone synthetisierten Chromosomen-DNS und k-DNS sowie durch die Analyse der Aminosäurensequenz der einzelnen Eiweißstoffe aus dem heterogenen Gemisch der menschlichen Leukozyteninterferone bewiesen worden ist.
Es sind verschiedene menschliche Leukozyteninterferone bekannt, die nach den Methoden der Gentechnik erhalten wurden, beispielsweise das durch die Rekombinanten-DNS in den Zellen von E. coli produzierbare Interferon A (Goeddel D. V. et al., Human leukocyte interferon produced by E. coli is biologically active, Nature, 1980, 287, 411-416) oder das menschliche Leukozyteninterferon F/Ovchinnikov Ju0A. et al,. "Direkte Expression des Gens des menschlichen Leukozyteninterferons F in den Zellen von E. coli", Doklady Akademii nauk (Vorträge der Akademie der Wissenschaften), 1982, 265, 238-242/, das einen Eiweißstoff darstellt, der aus 166 Aminosäuren in folgender Reihenfolge besteht:
cdlpqthslgnrralillaqmgrispfsclkdrhdfgfpqeefdgnqfqkaqaisv lhemiqqtfnlfstkdssatweqsllekfstelnqqlndmeacviqevgveetplm nvdsilavkkyfqritlyltekkyspcawewraeimrsfslskifqerlrrke
A - ala; C - cys; D - asp; E - glu; F - phe; G - gly;
H - his; I - ile; K - lys; L - leu; M - met; N - asn;
P - pro; Q - gin; R - arg; S - ser; T - thr; V - val;
W - trp; Y - tyr.
Zur Herstellung des angegebenen Interferons F wird die summarische Informations-RNS aus den durch das Newcastle-Virus induzierten Leukozyten des menschlichen Bluts nach der Guanidinchlorid-Guanidinthiozyanat-Methode erhalten. Die Poly-A-Fraktion der m-RNS wird durch die zweimalige Reinigung auf Oligo-dT-zellulose erhalten. Die Synthese der k-DNS wird unter Ausnutzung des synthetischen Oligonukleotids durchgeführt, das dem Interferongen im Ge-
biet der Translationstermination komplementär ist. Die Synthese der zweiten Kette wird mit Hilfe des Clenovschen Bruchstücks der DNS-Polymerase I verwirklicht. Die dadurch erhaltene zweikettige DNS wird nach der Rekonstruktion in das Vektorplasmid pBR 322 unter Kontrolle des Tryptophanpromotors eingebaut. Mit der genannten Rekombinantenplasmide werden die Zellen von E. coli transformiert.
Die genannten menschlichen Leukozyteninterferone unterscheiden sich voneinander sowohl durch die Effektivität der Hemmung der zytopathischen Wirkung eines und desselben Virus als auch durch die Wirksamkeit gegen verschiedene Viren.
Offenbarung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues menschliches Leukozyteninterferon zu entwickeln, das eine spezifische virostatische und antiproliferative Wirkung besitzt.
Das erfindungsgemäße menschliche Leukozyteninterferon N ist neu und wurde in der Literatur nicht beschrieben.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß das vorgeschlagene Interferon N erfindungsgemäß einen Eiweißstoff mit folgender Aminosäurensequenz darstellt: cdlpqthslgnrralillaqmgrishfsclkdrydfgfpqevfdgnqfqkaqaisaf hemiqqtfnlfstkdssaawdetlldkfyielfqqlndleacvtqevgvbsialmne dsilavrkyfqritlylmgkkyspcawewraeimrsfsfstnlqkglrrkd
Das erfindungsgemäße neue menschliche Leukozyteninterferon N besitzt eine spezifische virostatische und antiproliferative Wirkung. Die Verwendung dieser neuen
-X-
Interferonart gestattet, das Angebot an Arzneimitteln
zur selektiven Einwirkung auf Viren und bösartige Neubildungen zu erweitern.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen
menschlichen Leukozyteninterferons N, das die Isolierung der Matrizen-Poly(A)-m-RNS aus den induzierten
menschlichen Leukozyten, die Synthese des Interferongens, das Einbauen in das Vektorplasmid pBR 322 unter
Kontrolle des Tryptophanpromotors und die Transformation der erhaltenen Rekombinanten-DNS der Zellen der
Bakterien E. coli vorsieht, in dem erfindungsgemäß
als Interferongen das Gen des Interferons N mit folgender primärer DNS-Struktur verwendet wird:
TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA AGG AAG GAT
Beste Variante der Offenbarung der Erfindung
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung
wird folgendes Beispiel der Verwirklichung des Verfah-.rens zur Herstellung des menschlichen Leukozyteninterferons N in Bakterienzellen angeführt.
Beispiel
1. Isolierung, Reinigung und Charakterstik der PoIy(A)-m-RNS.
1,4.10 mit dem Senday-Virus induzierte gereinigte Leukozyten des menschlichen Bluts (Cantell K. et al., Meth. Enz., 1981, 78, part A, 29-38) wurden nach 4,5 Stunden Inkubation durch Zentrifugieren gefällt (30 min, 1500 U/min) und in 100 ml 0,85%igem NaCl suspendiert. Die Poly (A)-m-RNS wird aus der Leukozytensuspension nach der beschriebenen Methodik isoliert und gereinigt (Nagata S. et al., Nature, 1980, 284, 316-320), die die affine Chromatographie auf der Oligo-dT-zellulose, die Fraktionierung im linearen Saccharosegradienten (5 bis 20 %) und das Konzentrieren der 12S-Fraktion auf OligodT-zellulose einschließt. Als Kriterium der Qualität der Poly(A)-m-RNS dient deren Matrizenaktivität in Oozyten von Xenopus laevis, die 3.000 Akt.Einh. Interferon pro 1 iig RNS bei der durchschnittlichen Ausbeute von 4 bis 5 ug 12 S Poly(A)-m-RNS beträgt.
2. Synthese von k-DNS auf der PoIy(A)-m-RNS-Matrize.
a) Synthese der einkettigen k-DNS.
Das Reaktionsgemisch (600 ill) enthält: 50 mMol tris-HCl (pH 8,1), 6 mMol MgCl-, 5 mMol Dithiotreit, 150 mMol KCl, ein Gemisch von / H/d CTP, dATP, dTTP, dGTP zu je 0*5 mMol, 7 ug/ml Poly(A)-m-RNS, 20 ug/ml Oligo(dT)12-i8 und 200 Akt.Einh./ml Reverse-Transkriptase AMV. Die Reaktion wird innerhalb von 1 Stunde bei einer Temperatur von 42 C durchgeführt. Nach der Beendigung der Synthese wird dem Gemisch EDTA (Ethylendiamintetraacetat) bis zu einer Konzentration von 10 mMol zugesetzt, das Gemisch wird mit einem Volumen von Phenol-CHCl, (1:1)
deproteinisiert, und das wäßrige Medium wird durch eine Säule (0,4.15 cm) mit Sephadex G 50 in 10 mMol tris-HCl (pH 7,5), 0,25 Mol NaCl geschickt. Der Komplex k-DNS mit PoIy(A)-m-RNS wird aus den Fraktionen mit Ethylalkohol gefällt und der Niederschlag wird in 50 ul H^O gelöst. Der Lösung werden 5,1 ul 5n-Lösung NaOH zugegeben und nach der Inkubation innerhalb von 40 Minuten bei einer Temperatur von 20 C wird die Lösung mit 8,5 ul 3 Mol Natriumacetat (pH 4,5) neutralisiert, es werden 30 ul H„0 zugesetzt und die einkettige k-DNS wird mit Ethylalkohol gefällt.
b) Synthese der zweikettigen k-DNS.
Der Niederschlag der einkettigen k-DNS wird in 100 IaI Reaktionsgemisch gelöst (Kurtz D.T. et al., Gene, 1981, 13, 145-152), das 50 mMol Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,4), 5 mMol MgCl-, 1 mMol 2-Mercaptoethanol, ein Gemisch aus Ot-(32P) dTTP, dATP, dCTP, dGTP zu je 50 iiMol, 100 Akt. Einh. /ml DNS-Polymerase I (Clenovsches Bruchstück) enthält und innerhalb von 30 Minuten bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Syntheseprodukt nach der im Abschnitt 2a beschriebenen Methode isoliert. Nach der Chromatographie auf Sephadex G 50 wird die hochmolekulare Fraktion in eine Lösung (850 ul) überführt, die 30 mMol Natriumacetat (pH 4,5), 0,3 Mol NaCl, 3 mMol ZnSO3, 2 ug/ml t-RNS von E. coli und 115 Akt. Einh./ml Nuklease S enthält. Das Gemisch wird innerhalb von 30 Minuten bei einer Temperatur von 37 C inkubiert und die zweikettige k-DNS wird nach der im Abschnitt 2a beschriebenen Methodik isoliert.
3. Klonierung in den Zellen von E. coli K-12RRI des Vektorplasmids pBR 322, die im Pst-I-Abschnitt die nach der Methode der Oligo(dC)-oligo(dG)-Konnektoren einge-
bauten Interferongene tragen.
a) Angliederung der Konnektoren.
Oligo(dC)-Konnektoren werden an die zweikettige k-DNS folgendermaßen angegliedert.
20 ul Reaktionsgemisch enthalten 140 mMol Kaliumkakodylat (pH 6,9), 4 uMol ZnSO., 0,8 mMol 2-Mercaptoethanol, 0,4 mMol CoCl», 0,1 mMol / H/ dCTP, 100 mg zweikettige k-DNS und 50 Akt.Einh/ml terminale Desoxynukleotidyltransferase. Nach der Inkubation innerhalb von 5 min bei einer Temperatur von 37 C wird das Reaktionsprodukt nach der im Abschnitt 2a beschriebenen Methodik isoliert.
Die Oligo(dG)-Konnektoren werden an das durch die mit ■ der Restriktase Pst I zerspaltene .Plasmid pBR 322 folgendermaßen angegliedert.
125 ul Reaktionsgemisch enthalten 200 mMol Kaliumkakodylat (pH 6,9), 10 JiMoI ZnSO4, 2 mMol 2-Mercaptoethanol, 4 mMol MgCl2, 1 mMol CoCl2, 0,2 mMol QC (32P) dCTP, 10 Ug der mit Restriktase Pst I zerspaitenen Plasmide pBR 322 und 400 Akt.Einh./ml terminale Desoxynukleotidyltransferase. Das Gemisch wird innerhalb von 5 min bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, und das Syntheseprodukt wird nach der im Abschnitt 2a beschriebenen Methodik isoliert.
Unter den genannten Reaktionsbedingungen haben sich an das Molekül der zweikettigen k-DNS und der zerspaitenen Plasmide pBR 322 15 bis 20 Monomereneinheiten dCMR angegliedert.
b) Klonierung der Rekombinanten-DNS in den Zellen von E. coli K-12 RRI.
20 ml Lösung von 6 ng k-DNS und 40 ng Vektor, die nach der im Abschnitt 3a beschriebenen Methode erhalten wurden, in 10 mMol tris-HCl (pH 7,5), 0,1 Mol NaCl und 1 mMol EDTA werden innerhalb von 10 Minuten bei einer Temperatur von 65 C und innerhalb von 2 Stunden bei einer Temperatur von 42 C erwärmt, innerhalb von 3 Stunden auf 22°C abgekühlt und für die Transformation der Zellen von E. coli K-12 RRI (F , pro, leu, thi, Iac ,yl, str , r, ; m, , endo I ) nach der Methode von Dagert M. et al, Gene, 1979, 6, 23-28, benutzt. Auf diese Weise werden 1200 tetrazyklin-(5 ug/ml)-resistente Transformanten erhalten, von denen 98 % Ampizillin-(150 ug/ml)-Empfindlichkeit aufweisen und für das Screening der Rekombinanten Verwendung finden.
4. Auswahl der Rekombinanten-DNS, die die Gene des menschlichen Leukozyteninterferons tragen.
a) Die Auswahl der Rekombinanten-DNS f .· die die Gene des menschlichen Leukozyteninterferons tragen, wird mit
32
Hilfe der / P/-markierten synthetischen 16-gliedrigen
. Oligonukleotidsonden mit der Sequenz dTCTCATCATTTCTCCT (A) und dCCTCTCATCTCCCTCA (B) durchgeführt, die den für die meisten bekannten Gene des menschlichen Leukozyteninterferons kennzeichnenden konservativen Abschnitten der Nukleotide 504 bis 519 der kodierenden Kette bzw. der Nukleotide 68 bis 83 der nichtkodierenden Kette komplementär sind (Goeddel D.V. et al.. Nature, 1981, 290, 20-26). Für die Einführung der 5 -End-
markierung werden 30 mMol Oligonukleotid innerhalb von 30 Minuten bei einer Temperatur von 37°C in 20 ul Re-
aktionsgemisch inkubiert, das 50 mMol tris-HCl (pH 8,0), 5 mMol Dithiotreit, 7 mMol MgCl^, 3 uMol J/1/ P/-ATP und 20 Akt. Einh. Polynukleotidkinase des Phagen T. ent-
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hält. 5 -/ P/-markiertes Oligonukleotid wird durch Chromatographie an Sephadex G 50 (0,4.22 cm) in H~O gereinigt.
b) Hybridisierung der Kolonien auf Nitrozellulosefil-
1 32
tern mit 5 -/ P)-markierten Oligonukleotidsonden.
T A -Transformanten werden auf Nitrozellulosefiltern c ρ
(Durchmesser 90 nun) bis zur Kolonienbildung gezüchtet, nachher werden die Filter auf Agar übertragen, der Chloramphenikol (500 ug/ml) enthält, und die Inkubation wird innerhalb von 18 Stunden fortgesetzt. Nachher werden die Filter mit 0,5 n-NaOH mit darauffolgender Neutralisation in 1 Mol tris-HCl (pH = 8,0) und Vakuumtrocknung (2 bis 4 Stunden bei einer Temperatur von 80 C) behandelt, und die Filter werden innerhalb von 2 Stunden bei einer Temperatur von 37°C in einem Gemisch prähybridisiert, das 0,15 Mol tris-HCl (pH 8,0), 0,75 Mol NaCl, 5 mMol EDTA, 1 mMol Na3HPO4, 250 Jig/ml t-RNS und jeweils 0,1 % Natriumdodecylsulfat, Rinderserumalbumin, Phikol und Polyvinylpyrrolidon enthält. Nach der Trocknung auf dem Filterpapier werden die Filter mit dem obengenannten Gemisch (300 ul/Filter) angefeuchtet, das 1.106 Imp/min/ml S^/^P/HDligonukleotid enthält, in ein Polyäthylenpaket eingeschmolzen und innerhalb von 20 Stunden bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach der Hybridisierung werden die Filter bei einer Temperatur von 22°C dreimal mit der Lösung von 0,1 Mol tris-HCl (pH 8,0), 0,5 Mol NaCl, 0,1 % Natriumdodecylsulf at ausgewaschen, getrocknet und am Röntgenfilm innerhalb von 20 bis 70 Stunden autographiert.
Die Autoradiographie der Filter legte einige in der
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Hybridisierung mit beiden 5 -/ P/-markierten Oligonukleotidsonden A und B positive Kolonien an den Tag. Die Restriktionsanalyse der Plasmiden-DNS aus diesen Kolonien und die Analyse der Nukleotidensequenz der eingebauten k-DNS zeigte, daß eine Rekombinanten-DNS pIFN 105 eine kurze Sequenz des 5 -nichttranslierbaren Abschnittes enthält, die die Sequenz des vollständigen Gens des menschlichen Leukozyteninterferons der neuen Art des Leukozyteninterferons N und der 370 Nukleotide des - 3-nichttranslierbaren Teils des Gens kodiert.
5. Erstellung der Rekombinanten-DNS, die die Synthese des Interferons N in den Zellen von E. coli bewirken.
a) Das Plasmid pIFN 105-1, das das Gen des Interferons N unter der Kontrolle des t -Promotors trägt.
Die DNS des Rekombinantenplasmids pIFN 105, das das oben erwähnte Gen des Interferons N enthält, wird aus dem Lysat der transformierten Zellen von E. coli isoliert und auf Hydroxyapatit nach der bekannten Methodik (CoI-man A. et al, J. Biochem., 1978, 91, 303-310) gereinigt. 50 ug DNS werden mit Restriktase Pst I behandelt und die Spaltprodukte werden in 0,8 % Agargel elektrophoretisch getrennt. Das DNS-Bruchstück (ca. 960 Basenpaare), das das Interferongen enthält, wird durch die Elektroelution isoliert und nach der in Analyt. Biochem. 1981, 112, 295-298, beschriebenen Methode gereinigt. 10 pk DNS-Bruchstück werden mit Restriktase BamH I zerspalten, das Gemisch wird mit Nuklease S, (0,5 Akt.Einh./ug DNS, 30 min bei 22°C) behandelt und das große BamH I-Pst I-Bruchstück (947 Basenpaare) wird nach der Elektrophorese in 1,5 % Agargel analog dem Pst I-Bruchstück isoliert.
5 ug Vektorplasmid pBR 322-trp /Ovchinnikov Ju.A. et al., DAN (= Vorträge der Akademie der Wissenschaften) 1982, 265, 238-242/, das einen Promotorabschnitt des Tryptophanoperons von E. coli enthält, werden mit Restriktase E. co RI zerspalten, die klebrigen DNS-Enden werden mit Polymerase I (Clenovsches Bruchstück) nach der beschriebenen Methodik (Backman K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1976, 73, 4171-4178) gefüllt. 1,5 ug Vektor werden innerhalb von 18 Stunden bei einer Temperatur
von 10°C in 10 ul Puffer aus 50 mMol tris-HCl (pH 7,6), 10 mMol MgCl_, 10 mMpl Dithiotreit ligiert, der 0,27 ug DNS-Bruchstück mit dem Interferongen und 20 Akt. Einh. T. DNS-Ligase enthält. Das Gemisch wird mit 150 ul Puffer aus 10 mMol tris-HCl (pH 7,5), 50 mMol NaCl, 1 mMol EDTA verdünnt, wonach die Zellen von E. coli K-12RRI transformiert werden. Die Transformanten, die das Interferongen enthalten, werden durch die Hybridisierung der Kolonien ausgewählt, wie im Abschnitt 4b beschrieben worden ist. Mit Hilfe der Restriktionsanalyse wurde das Plasmid pIFN 105-1 identifiziert, das das Gen des Präinterferons Ji unter Kontrollejdes Tryptophanpromotors enthält.
Die transformierten pIFN 105-I-Zellen von E. coli K-12RRI werden in einem Medium, das folgende Komponenten (g/l) enthält: Baktotrypton-, 10,0».Hefeextrakt - 5,0, NaCl-IO,0, Ampizillin -0,02, bis zur optischen Dichte A650 von 1,0 gezüchtet, gefällt und durch die Behandlung mit Lysozym und durch das Einfrieren und Auftauen zerstört, wie in Nature, 1980, 284, 316-320 beschrieben worden ist.
Die Aktivität des Interferons beträgt 0,5 bis 1,0.1O6 Akt. Einh. pro Liter Bakteriensuspension.
b) Das Plasmid der Expression des reifen Interferons N.
5 ug eines großen BamH I-Pst I-Bruchstücks (DNS pIFN 105) werden der teilweisen Hydrolyse mit Restriktase Sau 3A (2 Akt. Einh.Aig DNS, 5 min bei einer Temperatur von 37°C) unterzogen, das Gemisch der Bruchstücke wird durch Elektrophorese in 1,5 % Agargel aufgetrennt und es wird ein Bruchstück von einer Länge von 869 Nukleotiden isoliert, das das Gen des reifen Interferons ohne erstes Kodon enthält. Diesem Bruchstück wird das synthetische Oligonukleotid (DAN, 1982,, 265, 238-212) mit Eco RI und Sau 3A mit klebrigen Enden angegliedert und an den Pst I- und Eco RI-Abschnitten des Vektorplasmids pBR 322 ligiert. Mit der Rekombinanten-DNS werden die Zellen von E. coli transformiert und nach der Hybridisierung mit Sonden und der Restriktionsanalyse der DNS wird aus den Transformanten das Plasmid pIFNl8 ausgewählt, das das modifizierte Gen des reifen Interferons N trägt. Das kurze Eco RI-Pst I-Bruchstück des Plasmids pIFNl8 mit dem modifizierten Interferongen wird mit PvU II τ- Eco RI-Bruchstück (340 Basenpaare) der DNS des Plasmids pBR 322-trp ligiert, das den trp-Promotor trägt, und 0,4 ug Produkt werden an Pst I und dem gefüllten Eco R I-Abschnitt des Vektorplasmids pBR 322 eingebaut. Nach der Transformation der Zellen von E.coli RRI werden 1000 TcrApS-Klone ausgewählt, woraus nach der Hybridisations- und Restriktionsanalyse der Rekombinanten-DNS das Plasmid pIFN 18-36 ausgewählt wird, das unter Kontrolle des Tryptophanpromotors das Gen des reifen Interferons N enthält.
Die Ausbeute an Leukozyteninterferon N beträgt 4 bis
6.10 Akt.Einh. pro Liter Bakteriensuspension.
Industrielle Verwendbarkeit
Das erfindungsgemäße menschliche Leukozyteninterferon N besitzt eine virostatische Wirksamkeit und kann in der Medizin als ein virostatisches, antibakterielles und geschwulsthemmendes Arzneimittel Verwendung finden.

Claims (2)

  1. Patentansprüche
    Menschliches Leukozyteninterferon N, das einen Eiweißstoff mit folgender Aminosäurensequenz darstellt:
    CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAISA FHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIALM NEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEWRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD:
  2. 2. Verfahren zur Herstellung des menschlichen Leukozyteninterferons N nach Anspruch 1 in Bakterienzellen,
    das die Isolierung der Matrizen-Poly(A)-m-RNS aus induzierten menschlichen Leukozyten, die Synthese des Interferongens, den Einbau in das Vektorplasmid pBR 322 unter Kontrolle des Tryptophanpromotors und die Transformation der erhaltenen Rekombinanten-DNS der Zellen der Bakterien E. coli vorsieht, dadurch gekennzeichnet , daß als Interferongen das Gen des
    Interferons N mit folgender primärer DNS-Struktur verwendet wird:
    TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA AGG AAG GAT.
DE19843490055 1983-02-24 1984-02-23 Menschliches Leukozyteninterferon N und Verfahren zu dessen Herstellung in Bakterienzellen Withdrawn DE3490055T1 (de)

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