SE453512B - Menniskoleukocytinterferon n och forfarande for framstellning derav i bakterieceller - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 453 512 2 För att denna interferon F skall kunna erhållas, fram- ställes summa-informations-RNA från människoblod-leuko- cyter, som inducerats av Newcastle-virus genom guanidin- klorid-guanidintiocyanatmetoden. Poly-A-fraktionen av m-RNA framställes genom dubbelrening på oligo-dT-cellulosa.

C-DNA syntetiseras under användning av en syntetisk oligo- nukleotid, som är komplementär med interferongenen inom terminationsomrádet för translation. Den andra kedjan syn- tetiseras medelst ett s k Klenov-fragment av DNA-polymeras I.

Den så erhållna, av två kedjor bestående DNA, inbygges, efter avslutad rekonstruktion, i vektorplasmid pBR 322 under kontroll av en tryptofanhaltig promotor. Medelst denna rekombinanta plasmid transformeras cellerna av I-Lcoli, Ovannämnda människoleukocytinterferon skiljer sig från varandra såväl med avseende på effektiviteten i under- tryckning av den cytopatiska verkan av ett och samma virus, som med avseende på aktiviteten mot varierande virus.

Uppfinningtanke Det huvudsakliga syftet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma en ny människoleukocytinterferon, som uppvisar specificiteten av antivirusmässig och antiproli- ferativ verkan.

Den enligt föreliggande uppfinning föreslagna människo- leukocytinterferonen N är ny och har icke beskrivits i facklitteraturen.

Detta syfte uppnås enligt föreliggande uppfinning genom att den föreslagna interferonen N utgöres av ett protein med följande aminosyraserie: CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAIS AFHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIA LMNEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD.

Den enligt föreliggande uppfinning föreslagna nya människoleukocytinterferonen N uppvisar specificiteten av antivirusmässig och antiproliferativ verkan. Använd- ningen av denna nya typ av interferon gör det möjligt att öka arsenalen av behandlingsmedel för selektiv inverkan _ på virus och elakartade formationer. 10 15 20 25 30 35 453 512 3 Förfarandet för framställning av den enligt förelig- gande uppfinning föreslagna människoleukocytinterferonen N innefattar isolering av matris-poly(A)-m-RNA fràn inducerade människoleukocyter, dels syntes av en inter- ferongen, inbyggnad i vektorplasmid pBR 322 under kontroll av en tryptofanhaltig promotor dch transformation av den erhållna rekombinanta DNA hos cellerna av E.coli-bakterier, och utmärker sig av att man såsom interferongen använder en gen av interferonen N med följande primärstruktur av DNA: TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA AGG AAG GAT.

Föredragen utföringsform av uppfinningen Nedan beskrives ett exempel på genomförande av för- farandet enligt föreliggande uppfinning för framställning av människoleukocytinterferonen N i bakterieceller.

Exempel 1. Isolering, rening och egenskaper hos poly(A)-m-RNA 1,4 x 1010 renade, av Sendai-virus inducerade leuko- cyter frán människoblod (jämför exempelvis Cantell K. et al., Meth.Enz., 1981, 78, part A, 29-38) utfälles, efter en inkubationstid av 4,5 timmar, genom centrifu- gering under en tid av 30 min (1500 varv/min) och suspen- deras i 100 ml av en 0,85%-ig lösning av NaCl. Poly(A)- -m-RNA isoleras från leukocytsuspensionen och renas genom den beskrivna metoden (jämför exempelvis Nagata S. et al., 10 15 20 25 30 35 455 512 4 "Nature", 1980, 284, 316-320), som är baserad pà affinitets- kromatografi på oligo-dT-cellulosa, fraktionering i en linjär sackarosgradient (5-20%) och koncentrering av l2s- fraktionen pà oligo-dT-cellulosa. Kvalitetskriteriumet för poly(A)-m-RNA är dennas matrisaktivitet i cocyter Xenopus laevis, som utgör 3000 interferonaktivitetsenheter per pg RNA vid ett medelutbyte av 12 S poly(A)-m-RNA av 4-5 pg. 2. Syntes av C-DNA på matrisen av poly(A)-m-RNA a) Syntes av C-DNA med en kedja Reaktionsblandningen (600 ul) innehåller 50 mM tris- HCl (med ett pH av 8,1), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreit, 150 mM KC1, en 3H-blandning av dCTP, dATP, dTTP, dGTP (0,5 mM av varje beståndsdel), 7 ug poly(A)-m-RNA per ml, 20 ug o1igo(dT)12_18 per ml och 200 aktivitetsenheter av omvänd transkriptas AMV per ml. Reaktionen genomföres under en tid av 1 timme vid en temperatur av 42°C. Efter avslutad syntes försättes blandningen med EDTA letylen- diamintetraacetat) till en koncentration av 10 mM, varefter blandningen avproteiniseras med en enda volym av en bland- ning av fenol och CHC13 (i ett inbördes blandningsför- hållande av 1:1) och det vattenhaltiga mediet får strömma genom en kolonn (0,4 x 15 cm) fylld med Sephadex G 50 i l0 mM tris-CHl (pH 7,6) och 0,25 M NaCl. Komplexet av C-DNA med po1y(A)-m-RNA från fraktionerna utfälles med etylakohol och fällningen löses i 50 ul vatten. Lösningen försättes med 5,1 ul SN lösning av NaOH och neutraliseras, efter en inkubationstid av 40 min vid 20°C, med 8,5 ul 3 M natriumacetat (pH 4,5), varefter 30 ul vatten till- sättes och C-DNA med en kedja utfälles med etylakohol. b) Syntes av C-DNA med tvâ kedjor Fällninger av C-DNA med en kedja löses i 100 ul av en reaktionsblandning (jämför exempelvis Kurtz D.T. et al., Gene, 1981, 13, 145-152), som innehåller en 50 mM buffertlösning av kaliumfosfat (pH 7,4), 5 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, en G - [ 32P]-blandning av dTTP, dATP, dCTP, dGTP (50 uM av varje komponent) och 100 aktivitets- enheter av DNA-polymeras 1 (Klenov-fragment) per ml, f 10 15 20 25 30 35 453 512 5 och inkuberas under en tid av 30 min vid en temperatur av 37°C. Sedan reaktionen fullbordats, isoleras syntes- produkten på samma sätt som beskrives i 2a. Efter kromato- grafi på Sephadex G 50 överföres den högmolekylära frak- tionen till en lösning (850 ul), som innehåller 30 mM natriumacetat (pH 4,5), 0,3 M NaC1, 3 mM ZnSO4, 2 pg t-RNA hos E.coli per ml och 115 aktivitetsenheter av nukleas S1 per ml. Blandningen inkuberas under en tid av 30 min vid en temperatur av 37°C, varefter C-DNA med två kedjor isoleras på samma sätt som beskrives i 2a. 3. Kloning, i celler av E.coli K-12 RR 1, av vektor- plasmider pBR 322, som vid PstI-läget bär genom metoden för oligo(dC)-oligo(dG)-Connectors inbyggda interferon- gener. a) Anslutning av s k connectors Oligo(dC)-connectors anslutes till C-DNA med två kedjor på följande sätt. 20 ul reaktionsblandning innehåller 140 mM kalium- kakodylat (pH 6,9), 4 uM ZnSO4, 0,8 mM 2-merkaptoetanol, 0,4 mM CoCl2, 0,1 mM[ 3H]-dCTP, 100 mg C-DNA med tvâ kedjor och 50 aktivitetsenheter av terminal desoxinukleotidyl- transferas. Efter en inkubationstid av 5 min vid en tempe- ratur av 37°C isoleras reaktionsprodukten genom den i 2a beskrivna metoden.

O1igo(dG)-connectors anslutes till medelst restriktas PstI spjälkad plasmid pBR 322 på följande sätt. 125 ul reaktionsblandning innehåller 200 mM kalium- kakodylat (pH 6,9), 10 pm ZnSO4, 2 mM 2-merkaptoetanol, 4 mm mgclz, 1 mm coclz, 0,2 mm a-[32P]-dc¶~1>, 10 pg medelst restriktas PstI spjälkad plasmid pBR 322 och 400 aktivitetsenheter av terminal desoxinukleotidyltranferas per ml. Blandningen inkuberas under en tid av 5 min vid en temperatur av 37°C och syntesprodukten isoleras på samma sätt som beskrives i 2a.

Under ovannämnda reaktionsbetingelser anslutes 15-20 monomerenheter av dCMP och dCMP till molekylen av C-DNA med två kedjor respektive till molekylen av den spjälkade plasmiden pBR 322. 10 15 20 25 30 35 453 512 gÄ 6 b) Kloning av rekombinanta DNA i celler av E.co1i K-12 RRI 20 ul av en lösning av 6 ng C-DNA och 40 hg av vektorn, som erhållits såsom beskrivits i 3a, i l0 mM tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl och 1 mM EDTA, uppvärmes under en tid av 10 min vid en temperatur av 65°C och under en tid av 2 timmar vid en temperatur av 42°C, kyles därefter under en tid av 3 timmar till 22°C och användes för trans- formering, genom en känd metod (jämförßexempelvis Dagert M et al., Gene, 1979, 6, 23-28) av celler av E.coli K-12 RRI (F_, pro, leu, thi, lacyl, strr, rk_, mk-, endo I_).

På detta sätt framställes 1200 tetracyklin-(5 pg/ml)-stabila transformat, av vilka 98% uppvisar ampicillin-(150 ug/ml)- känslighet och användes för screening av rekombinanterna. 4. Uttagning av rekombinanta DNA, som bär gener av människoleukocytinterferonen. e) De rekombinanta DNA, som bär gener av människo- 32P]~markerade leukocytinterferonen, uttages medelsti syntetiska 16-ledade oligonukleotidsonder med ordningsfölj- den ÖTCTCATCATTTCTCCT (A) och CCTCTCATCTCCCTCA (B), Søm är komplementära med för flertalet kända gener av människo- leukocytinterferonen typiska (jämför exempelvis Goeddel D.V. et al., "Nature", 1981, 290, 20-26) avsnitt av nukleo- tider 504-5l9 i kodningskedjan respektive nukleotider 68-83 i den icke-kodande kedjan. För införande av en 5'-ändmarkör inkuberas 30 mmoler oligonukleotid under en tid av 30 min vid en temperatur av 37°C i 20 ul av en reaktionsblandning, som innehåller 50 mM tris-HCl (pH 8,0), 5 mM ditiotreit, 7 mm Mgclz, 3 um Xfpzpl-ATP och 20 aktivitetsenheter av polynukleotidkinas av T4-fag.

Den 5'-[32P]-markerade oligonukleotiden renas genom kromato- grafi på Sephadex G 50 (0,4 x 22 cm) i vatten. b) Hybridisering av kolonier på nitrocellulosafilter med 5'-[32P]-markerade oligonukleotidsonder.

Tcr-Ap3-transformanter odlas på nitrocellulosafilter (med en diameter av 90 mm) tills kolonier uppkommer, var- efter filtren överföres till agar, som innehåller klor- amfenikol (500 ug/ml), och inkuberingen fortsättes under 10 15 20 25 30 35 453 512 7 en tid av 18 timmar. Filtren behandlas därefter med en 0,5 N lösning av NaOH med efterföljande neutralisering i l M tris-HCl (pH 8,0) och vakuumtorkning (under en tid av 2-4 timmar vid en temperatur av 80°C). Därefter pre- hybridiseras filtren under en tid av 2 timmar vid 37°C i en blandning, som innehåller 0,15 M tris-HCl (pH 8,0), 0,75 M NaCl, 5 mM EDTA, l mM Na2HPO4, 250 pg t-RNA per ml, samt natriumdodecylsulfat, bovinserumalbumin, fykol och polyvinylpyrrolidon (0,l% av varje komponent). Efter torkning på filterpapper vätes filtren av ovannämnda bland- ning (300 ul per filter), som innehåller 106 imp/min/ml av 5'-i32P]-oligonukleotid, och svetsas in i en påse av polyetylen, varefter de inkuberas under en tid av 20 timmar vid en temperatur av 37°C. Efter avslutad hybridisering tvättas filtren tre gånger vid 22°C med en lösning av 0,1 M tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, 0,l% natriumdodecyl- sulfat, varefter de torkas och autograferas på röntgenfilm under en tid av 20-70 timmar. Genom autoradiografi har man kunnat upptäcka några få kolonier, som är positiva i hybridisering med de båda 5'-[32fl -markerade oligonukleo- tidsonerna A och B. Restriktionsanalys av plasmid-DNA från dessa kolonier samt analys av nukleotidserien i den inbyggda C-DNA har visat, att en enda rekombinant DNA pIFN 105 innehåller en kort följd av 5'-icke-translerbart avsnitt, en kodningsföljd av den fulla genen av människo- leukocytinterferon av den nya typen av leukocytinterferon N och 370 nukleotider av 3-icke-translerbar del av genen. 5. Konstruering av rekombinanta DNA, som säkerställer syntes av interferonen N i celler av E.coli. a) En plasmid plFN 105-1, som bär genen av preinterferon N under kontroll av trp-promotor, DNA i den rekombinanta plasmiden plFN 105, som innehåller ovannämnda gen av inter- feron N, isoleras från ett lysat av transformerade celler av E.co1i och renas pà hydroxiapatit genom en känd metod (jämför exempelvis Colman A. et al., J.Biochem. 1978, 91, 303-310). 50 pg DNA behandlas med restriktas PstI och spjälkningsprodukterna separeras genom elektrofores i en 0,8%-ig agarosgel. Ett DNA-fragment (ungefär 960 10 15 20 25 30 35 4-53 512 8 baspar), som innehåller interferongenen, isoleras genom elektroeluering och renas såsom beskrives i Analyt. Biochem. 1981, 112, 295-298. 10 pg DNA-fragment spjälkas medelst restriktas BamHI och blandningen behandlas med nukleas S1 (0,5 aktivitetsenheter per pg DNK, 30 min vid 22°C).

Ett stort BamHI-Pstl-fragment (947 baspar) isoleras efter elektrofores i en 1,5%-ig agarosgel analogt med isoleringen av Pstl-fragmentct. 5 pg vektorplasmid pBR 322-trp (jämför exempelvis Ovchinnikov Ju.A. m fl., Sovjetunionens Vetenskapsakademi, 1982, 265, 238-242), som innehåller ett promotionsavsnitt av tryptofanoperon av E.coli, spjälkas medelst restriktas EcoRI, varvid DNA's klibbiga ändar fylles med polymeras I (Klenov-fragment) genom den beskrivna metoden (jämför exempelvis Backman K et.al., Proc. Nat1.Acad.Sci, USA, 1976, 73 4171-4178). 1,5 pg vektor ligeras under en tid av 18 timmar vid 10°C i 10 pl av en buffertlösning av 50 mM tris-CHl (pH 7,6). 10 mM MgCl2 och 10 mM ditiotreit, som innehåller 0,27 pg DNA-fragment med interferongen och 20 aktivitetsenheter T4-DNA-ligas. Blandningen ut- spädes med 150 pl buffertlösning av 10 mM tris-HC1 (pH 7,5), 50 mM NaCl, l mM EDTA och cellerna av E.coli K-12 RR I transformeras. De interferongenen innehållande trans- formanterna uttages genom hybridisering av kolonier, såsom beskrives i 4b. Genom restriktionsanalys har man identi- fierat en plasmid plFN 105-1, som innehåller genen av preinterferonen N under kontroll av den tryptofanhaltiga promotorn.

De transformerade p1FN 105-1 cellerna av E.coli K-12 RR I i ett medium, som i g/liter innehåller 10 g bakto- trypton, 5 g jästextrakt, 10 g NaCl och 0,02 g ampicillin, odlas till en optisk densitet A650 av 1,0, utfälles och sönderdelas genom behandling med lysosym och frysning- upptining, såsom beskrives i tidskriften "Nature“, 1980, 284, 316-320.

Interferonens aktivitet utgör 0,5 x 106 till 106 aktivitetsenheter per liter av bakteriesuspension. 10 15 20 25 30 35 453 512 9 b) Plasmid av expressionen av mogen interferon N 5 ug av det stora BamHI-fragmentet (DNA plFN 105) utsättes för partiell hydrolys medelst restriktas Sau3A (2 aktivitetsenheter per ug DNA), under en tid av 5 min vid en temperatur av 37°C, varefter fragmentblandningen separeras genom elektrofores i en l,5%-ig agarosgel, och man isolerar ett fragment med en längd av 869 nukleotider, vilket innehåller genen av mogen interferon utan första kodon. Med detta fragment förenas en syntetisk oligonuk- leotid (jämför exempelvis Föredrag från Sovjetunionens Vetenskapsakademi, 1982, 265, 238-212) med EcoRI och Sau3A medelst klibbiga ändar, varefter man ligerar vid Pstl- och EcoRI-lägen i vektorplasmiden pBR 322. Medelst rekom- binant DNA transformeras cellerna av E.coli. Efter hybri- disering med sonderna och restriktionsanalys av DNA uttager man från transformaterna en plasmid plFN l8, som bär en modifierad gen av den mogna interferonen N. Ett kort EcoRI- -Pstl-fragment av plasmiden plFN l8 med den modifierade in0erferongenen ligeras med ett PvuII-EcoRI-fragment (340 baspar) av DNA i plasmiden pBR 322-trp, vilket fragment bär en tryptofanhaltig promotor. 0,4 ug av produkten in- bygges vid Pstl och det fyllda EcoRI-läget i vektorplas- miden pBR 322. Efter avslutad transformation av cellerna av E.coli RRl uttages 1000 TcrAp3-kloner, av vilka man efter hybridiserings- och restriktionsanalys av rekombi- nanta-DNA uttager en plasmid plFN 18-36, som under kontroll av den tryptofanhaltiga promotorn innehåller genen av mogen interferon N.

Uëfiytet av leukocytinterferonen N utgör 4 x 10 6 x 10 8 till aktivitetsenheter per liter bakteriesuspension.

Industriell användbarhet Den enligt föreliggande uppfinning föreslagna människo- leukocytinterferonen N uppvisar anti-virusaktivitet och kan finna användning inom medicinen såsom antivirus-, antimikrob- och anti-tumörpreparat.

Claims (2)

1. 453 512 10 PATBNTKRAV l. Människoleukocytinterferon N, som utgöres av ett protein med följande aminosyraserie: CDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRISHFSCLKDRYDFGFPQEVFDGNQFQKAQAIS AFHEMIQQTFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYIELFQQLNDLEACVTQEVGVEEIA 5 LMEDSILAVRKYFQRITLYLMGKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSFSTNLQKGLRRKD.
2. 2. Förfarande för framställning av människoleukocyt- interferonen N enligt patentkravet 1 i bakterieceller, vilket förfarande innefattar isolering av en matris-poly(A)- -m-RNA från inducerade människoleukocyter, syntes av en 10 interferongen, inbyggnad i en vektorplasmid pBR 322 under kontroll av en tryptofanhaltig promotor och transformation av den erhållna rekombinanta DNA hos celler av E.coli- bakterier, k ä n n e t e c k n a t av att man såsom inteferongen använder en gen av interferonen N med följande 15 primärstruktur av DNA: TGT GAT CTG CCT CAG ACT CAC AGC CTG GGT AAT AGG AGG GCC TTG ATA CTC CTG GCA CAA ATG GGA AGA ATC TCT CAT TTC TCC TGC CTG AAG GAC AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC 20 TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA 25 ATC ACT CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA GGA TTA AGA AGG AAG GAT.