DK173543B1 - Modent humant leukocytinterferon; en bakterie, der kan producere et sådant interferon, og en fremgangsmåde til fremstilling - Google Patents

Description

DK 173543 B1

Den foreliggende opfindelse vedrører rekombinant-DNA-tekno-logiområdet, dvs. fremgangsmåder, der anvendes inden for re-kombinant-DNA-teknologien, samt produkter fremstillet ved disse fremgangsmåder.

5

Mere detaljeret udtrykt angår den foreliggende opfindelse hidtil ukendte modne humane bakterielt fremstillede leuko-cytinterferoner, som er ejendommelige ved, at de består af 165-166 aminosyrer og indeholder Cys-Asp-Leu i stillingerne 10 1, 2 og 3 eller består af 166 aminosyrer og indeholder Cys-Asn-Leu i stillingerne 1, 2 og 3, og sådanne modne leukocyt-interferoner, som ved N-terminalen har en yderligere methio-ninrest, hidtil ukendte humane leukocytinterferoner, som er ejendommelige ved det i krav 5-11's kendetegnende del angiv-15 ne, farmaceutiske præparater indeholdende disse og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at en kultur af en bakterie, der er transformeret med en replicerbar bakteriel udtryksbærer, der er i stand til at udtrykke disse polypeptider, bringes til at gro og 20 udtrykke polypeptiderne. Den foreliggende opfindelse angår også de i denne fremgangsmåde anvendte udtryksbærere og de hidtil ukendte bakterier, som indeholder disse udtryksbærere, og fremgangsmåder til fremstilling deraf, idet disse produkter og fremgangsmåder er ejendommelige ved det i krav 25 18-30 og 44-45's kendetegnende dele angivne. Opfindelsen angår endelig DNA-sekvenser omfattende sekvenser, der koder for det modne humant leukocytinterferons aminosyresekvens samt anvendelser af interferonerne, DNA-sekvenserne, udtryksbærerne samt bakterierne, hvilke anvendelser er ejen-30 dommelige ved det i krav 34-38 angivne.

Humant leukocytinterferon (LeIF) blev først opdaget og fremstillet i form af et meget råt præcipitat af Isaacs og Lin- 2 DK 173543 B1 denmann (Proc. R. Soc. B 147, 258 - 267 (1957), US patentskrift 3.699.222). Forsøg på at rense og karakterisere materialet har stået på lige siden og har ført til fremstilling af relativt homogene leukocytinterferoner afledt fra normale 5 eller leukæmiske donorers leukocyter (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.947.134). Disse interferoner er en familie af proteiner, der vides at have evnen til at bibringe deres målceller en virusresistent tilstand. Interferon kan endvidere virke til inhibering af vækst ved celledeling og modu-10 lere immunrespons. Disse egenskaber har givet anledning til den kliniske anvendelse af leukocytinterferon som et terapeutisk middel til behandling af virusinfektioner og maligne tilstande.

15 Leukocytinterferoner er blevet renset til i det væsentlige homogenitet (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 76, 640 - 644 (1979), Zoon et al., ibid, T6, 5601 -5605 (1979)), og angivne molekylvægte rækker fra ca. 17.500 til ca. 21.000. Den specifikke aktivitet af disse præparater 20 er bemærkelsesværdig høj, fra 2 x 108 til 1 x 109 enheder/mg protein, men udbytter fra cellekulturmetoder har været nedslående lave. Ikke desto mindre har fremskridt i proteinsekvenseringsteknikker gjort det muligt at bestemme partielle aminosyresekvenser {Zoon et al.. Science 207, 527 (1980); 25 Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. TJ_, 5102 - 5104 (1980)). En udredning af glycosyleringen af forskellige leukocytinterferoner er endnu ikke fuldstændig klarlagt, men det står nu klart, at forskelle i glycosylering mellem de forskellige familiemedlemmer ikke alene er årsag til det ob-30 serverede spektrum af molekylvægte. I modsætning hertil afviger leukocytinterferonen markant i aminosyresammensætning og -sekvens, og aminosyrehomologi er i nogle tilfælde mindre end 80%.

DK 173543 B1 3

Medens isolering fra donorleukocyter har givet tilstrækkeligt materiale til partiel karakterisering og begrænsede kliniske studier med homogent leukocytinterferon, er det en 5 absolut utilstrækkelig kilde for de mængder interferon, der kræves til store kliniske forsøg og til en bred profylaktisk og/eller terapeutisk anvendelse derefter. Faktisk har kliniske undersøgelser under anvendelse af humane leukocytafledte interferoner i antitumor- og antivirustestning indtil for 10 nylig hovedsageligt været begrænset til rå (mindre end 1% rene) præparater af dette materiale, og lange ventetider for fremstillingen af tilstrækkelige mængder, selv til urealistiske priser, har alvorligt forsinket undersøgelsen over en bredere front.

15

Med fremkomsten af rekombinant DNA-teknologien er den kontrollerede mikrobielle fremstilling af en enorm varietet af nyttige polypeptider imidlertid blevet mulig. Der eksisterer allerede bakterier modificeret ved denne teknologi, der til-20 lader fremstilling af sådanne polypeptidprodukter såsom somatostatin, A- og B-kæderne fra humant insulin og humant væksthormon (Itakura et al., Science 198, 1056 -1063 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 - 548 (1979)). For nylig er rekombinant-DNA-teknikker blevet anvendt til at fremkalde 25 bakteriel produktion af proinsulin og thymosin al, og adskillige forfattere har beskrevet dannelsen af DNA, som koder for humant leukocytinterferon, og resulterende proteiner med leukocytinterferonaktivitet (Nagata et al., Nature 284, 316 - 320 (1980); Mantei et al., Gene 10, 1 - 10 (1980), Ta-30 niguchi et al., Nature 285, 547 - 549 (1980)).

Artiklerne af Nagata et al., Mantei et al. og Taniguchi et al. omhandler alle fremstillingen af en precursorform af hu- 4 DK 173543 B1 mant leukocytinterferon. I modsætning til det i disse artikler omhandlede angår den foreliggende opfindelse modent humant leukocytinterferon, som ikke indeholder den tilsvarende præ-sekvens eller nogen del af præ-sekvensen.

5

Den bærende kraft i rekombinant-DNA-teknologien er plasmi-det, en ikke-chromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA fundet i bakterier og andre mikrober, ofte i flere kopier pr. celle. Inkluderet i den i plasmid-DNA'et indkodede information 10 er den, der kræves til at reproducere plasmidet i datterceller (dvs. en "replicon"), og sædvanligvis én eller flere udvælgelsesegenskaber såsom for bakterier resistens mod antibiotika, hvilket tillader kloner af værtsceller, som indeholder det plasmid, der har interesse, at blive genkendt og 15 fortrinsvis dyrket på selektive medier. Nytten hos plasmider ligger i det faktum, at de kan spaltes specifikt af én eller anden restriktionsendonuclease eller "restriktionsenzym”, som hver genkender et forskelligt sted på plasmid-DNA'et.

Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes 20 i plasmidet ved sammenknytning fra enden på spaltningsstedet eller ved rekonstruerede ender nær spaltningsstedet. DNA-Rekombinationen udføres uden for cellen, men det resulterende rekombinantplasmid kan indføres i den ved en teknik, der er kendt som transformation, og store mængder af det hetero-25 loge genholdige rekombinantplasmid fås ved at dyrke transformanten. Når genet endvidere er korrekt indsat med hensyn til dele af plasmidet, som leder transkriptionen og translationen af den indkodede DNA-meddelelse, kan den resulterende udtryksbærer anvendes til faktisk at fremstille den polypep-30 tidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en fremgangsmåde, der kaldes udtrykning.

DK 173543 B1 5

Udtrykning startes i en region, som er kendt som promotoren, og som genkendes og bindes af RNA-polymerase. I nogle tilfælde som ved tryptophan eller "trp"-promotoren, som foretrækkes ved udførelse af den foreliggende opfindelse, over-5 lappes promotorregionerne af operatorregioner til dannelse af en kombineret promotor-operator. Operatorer er DNA-se-kvenser, som genkendes af såkaldte repressorproteiner, som tjener til at regulere frekvensen af transkriptionsinitie-ringen ved en bestemt promotor. Polymerasen bevæger sig 10 langs DNA'et og transkriberer den information, der indeholdes i de kodede strenge fra dens 5' til 3'-ende til messen-ger-RNA, som på sin side translateres til et polypeptid med den aminosyresekvens, for hvilket DNA'et kodes. Hver aminosyre kodes ved en nucleotidtriplet eller "codon" inden for 15 det, der til det foreliggende formål kan kaldes det "strukturelle gen", dvs. den del, som koder for aminosyresekvensen i det udtrykte produkt. Efter binding til promotoren transkriberer RNA-polymerasen først nucleotider, der koder for et ribosombindingssted, derefter en translationsinitiering el-20 ler et startsignal (sædvanligvis ATG, som i det resulterende messenger-RNA bliver til AUG), og derefter nucleotidcodoner-ne inden for selve det strukturelle gen. Såkaldte stopcodo-ner transkriberes ved enden af det strukturelle gen, hvorefter polymerasen kan danne en yderligere sekvens af messen-25 ger-RNA, som på grund af tilstedeværelsen af stopsignalet vil forblive utranslateret af ribosomerne. Ribosomerne binder til det bindingssted, der gives på messenger-RNA'et, i bakterier sædvanligvis medens mRNA dannes, og de producerer selv det indkodede polypeptid, begyndende ved translations-30 startsignalet og sluttende ved det ovenfor nævnte stopsignal. Det ønskede produkt fremstilles, hvis de sekvenser, der koder for ribosombindingsstedet, er anbragt rigtigt i forhold til AUG-initieringscodonet, og hvis alle øvrige codoner 6 DK 173543 B1 følger efter initieringscodonet i fase. Det resulterende produkt kan fås ved at lysere værtscellen og udvinde produktet ved hensigtsmæssig rensning fra andet bakterielt protein .

5

Det er konstateret, at anvendelse af rekombinant-DNA-tekno-logi (dvs. indsætning af interferongener i bakterielle udtryksbærere og deres udtrykning under kontrol af bakterielle genreguleringselementer) ville være den mest effektive frem-10 gangsmåde til fremstilling af store mængder af modent leuko-cytinterferon, som, trods fraværelsen i det således fremstillede materiale af glycosyleringsegenskaberne af human-afledt materiale, kan anvendes klinisk i behandlingen af en lang række virale og neoplastiske sygdomme.

15

Fremgangsmåden til fremstilling af et første leukocytgen ifølge den foreliggende opfindelse indebærer følgende trin: 1) Partielle aminosyresekvenser af humant leukocytinterferon 20 renset til homogenitet anvendes til fremstilling af sæt af syntetiske DNA-prøver, hvis codoner i blandingen repræsenterer alle mulige nucleotidkombinationer, som er i stand til at kode for de partielle aminosyresekvenser.

25 2) Bakterielle kolonibanker fremstilles indeholdende komplementært DNA (cDNA) fra induceret messenger-RNA. Andet induceret mRNA, som er radiomærket, hybridiseres til plasmid-cDNA fra denne bank. Hybridiserende mRNA elueres og testes for translation til interferon ved oocyt-test. Plasmid-DNA 30 fra kolonier, der viser sig at inducere interferonaktivitet på denne måde, er testet yderligere for hybridisering til prøver fremstillet som beskrevet i 1) ovenfor.

DK 173543 B1 7 3) Parallelt med fremgangsmåden i afsnit 2) ovenfor anvendes induceret mRNA-afledt cDNA i plasmider til dannelse af uafhængige banker af transformantkolonier. Prøverne fra del 1) anvendes til at forberede syntese af radiomærket enkelt-5 strenget cDNA til anvendelse som hybridiseringsprøver. De syntetiske prøver, der er hybridiseret med induceret mRNA som skabelon, udvides ved omvendt transcription til dannelse af induceret, radiomærket cDNA. Kloner fra kolonibanken, som hybridiserer til radiomærket cDNA fremstillet på denne måde, 10 er undersøgt yderligere til bekræftelse af tilstedeværelsen af et gen, som koder for interferon i fuld længde. En hvilken som helst partiallængde af et formodet genfragment fremstillet i afsnit 1) eller 2) kan selv anvendes som prøve for genet i fuld længde.

15 4} Det ovenfor fremstillede fuldlængdegen tilpasses under anvendelse af syntetisk DNA for at eliminere eventuel ledersekvens, som kunne forhindre bakteriel udtrykning af det modne polypeptid og for at tillade hensigtsmæssig placering 20 i en udtryksbærer i forhold til startsignaler og ribosombindingsstedet hos en bakteriel promotor. Udtrykt interferon renses i en grad, der tillader bekræftelse af dets karakter og bestemmelse af dets aktivitet.

25 5) Det på den ovenstående måde fremstillede interferongen-fragment anvendes selv til prøvning af andre partielt homologe leukocytinterferoner ved hybridisering.

Ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi som skitseret 30 ovenfor opnås bakteriel produktion i højt udbytte og renhed af familien af homologe leukocytinterferoner (uglycosylere-de) såsom modne polypeptider, dvs. ledsaget af den tilsvarende præ-sekvens eller en hvilken som helst del deraf.

8 DK 173543 B1

Disse interferoner kan udtrykkes direkte, udvindes og renses til niveauer, der gør dem egnede til anvendelse i behandlingen af virale og maligne sygdomme hos dyr og mennesker. Familiemedlemmer, der hidtil er udtrykt, har vist sig effekti-5 ve i in vitro tests og i den første sådanne påvisning af sin art også ved in vivo tests, idet den sidstnævnte involverer det første modne leukocytinterferon, der er fremstillet bakterielt.

10 Ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi som skitseret ovenfor opnås mikrobiel produktion i højt udbytte og renhed af familien af homologe leukocytinterferoner (uglycosylere-de) som modne polypeptider, i det væsentlige uden ledsagelse af den tilsvarende præsekvens eller nogen del deraf. Disse 15 interferoner kan udtrykkes direkte, udvindes og renses til niveauer, der gør dem egnede til anvendelse i behandlingen af viralt og maligne sygdomme hos dyr og mennesker. Familiemedlemmer, der hidtil er udtryt, har vist sig effektive i in vitro tests og i den første sådanne påvisning af sin art og-20 så ved in vivo tests, idet den sidstnævnte involverer det først modne leukocytinterferon, der er fremstillet mikrobielt .

Udtrykket "modent leukocytinterferon" anvendes i nærværende 25 ansøgning til at definere et bakterielt fremstillet interferonmolekyle, som er frit for glycosylgrupper. Modent leukocytinterferon ifølge den foreliggende opfindelse udtrykkes straks fra et translationsstartsignal (ATG) lige før den første aminosyrecodon hos det naturlige produkt. Det "modne" 30 polypeptid kan således som den første aminosyre i sin sekvens indeholde methionin (for hvilken ATG koder), uden at det i det væsentlige ændrer sin karakter. På den anden side kan den bakterielle vært behandle translationsproduktet til DK 173543 B1 9 at udelade det første methionin. Modent leukocytinterferon kan udtrykkes sammen med et konjugeret protein, der er forskelligt fra det konventionelle forprotein, idet konjugatet er specifikt spalteligt i et intra- eller ekstracellulært 5 miljø (jfr. britisk patentpublikation nr. 2.007.676A). Endelig kan det modne interferon fremstilles i forbindelse med et mikrobielt "signal,?-peptid, som transporterer konjugatet til cellevæggen, hvor signalet fjernes, og det modne poly-peptid udskilles. "Udtrykning" af modent leukocytinterferon 10 indebærer bakteriel eller anden mikrobiel produktion af et interferonmolekyle, som ikke indeholder nogen glycosyl-grupper eller en præsekvens, som straks deltager i mRNA-translationen af et humant leukocytinterferongenom.

15 Visse af leukocytinterferonproteinerne er defineret ved hjælp af bestemt DNA gen (fig. 3 og 8) og deduktiv amino-syresekvens (fig. 4 og 9). Det er klart, at for disse specielle interferoner, såvel som hele familien af leukocyt-interferonproteiner omfattet heri, eksisterer der naturlige 20 alleliske variationer og forekommer fra individ til individ, hvorimod de bestemte sekvenser I og J ikke specifikt er genstand for krav. Disse variationer kan påvises ved (en) ami-nosyreforskel/-forskelle i den samlede sekvens eller ved udeladelser, substitutioner, indsætninger, inversioner eller 25 tilsætninger af (en) aminosyre(r) i sekvensen. For hvert modent leukocytinterferonprotein deri mærket fra LeIF A til LeIF J indeholdes sådanne alleliske variationer inden for rammerne af det mærke eller udtryk, der definerer sådant, og således den foreliggende opfindelse.

30

Udtrykket "modent interferon A” betyder i nærværende ansøgning specifikt et mikrobielt (fx bakerielt) fremstillet in- DK 173543 B1 10 terferonmolekyle, som er frit for glycosylgrupper, og som har nedenstående aminosyresekvens:

Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Lys He Ser c Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ale Glu Thr lie Pro Val Leu His Glu Met lie Gin Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val He Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser He Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

10 Det pågældende leukocytinterferon A-protein er defineret ved hjælp af bestemt DNA gen (fig. 3 og 3A) og deduktiv aminosyresekvens (fig. 4 og 4A). Det er klart, at for dette specielle interferon eksisterer der naturlige alleliske variationer og forekommer fra individ til individ. Disse variati-15 oner kan påvises ved (en) aminosyreforskel/-forskelle i den samlede sekvens eller ved udeladelser, substitutioner, indsætninger, inversioner eller tilsætninger af (en) aminosyre (r) i sekvensen. For leukocytinterfon-A-protein deri, mærket LeIF A, er sådanne alleliske variationer inden for 20 rammerne af det mærke eller udryk, der definerer disse, og således inden for opfindelsens omfang.

Opfindelsen belyses nærmere i det nedenstående under henvisning til tegningen, på hvilken 25 fig. 1 viser to aminosyresekvenser, som er fælles for alle interferonarter isoleret fra humane leukocyter og renset til homogenitet betegnet T-l og T-13. Alle potentielle mRNA-se-kvenser, som koder for disse peptider, er vist, ligesom de tilsvarende DNA-sekvenser. Bogstaverne henholdsvis A, T, G, 30 C og U betegner nucleotider, som indeholder baserne henholdsvis adenin, thymin, guanin, cytosin og uracil. Bogstavet N betegner et hvilket som helst af nucleotiderne A, G, C og U. Polynucleotiderne afbildes som gående fra 5’ (venstre) DK 173543 B1 11 til 3' (højre) retningen, og hvor dobbeltstrenget ("d.s.") DNA er afbildet, vice-versa for bundstrengen eller den ikke-kodende streng.

5 Fig. 2 er et autoradiogram, som viser hybridiseringen af po- 32 tentielle LelF-plasmider med -P-mærkede syntetiske deoxyo-ligonucleotider.

Fig. 3 afbilder nucleotidsekvenser (kodende strenge) hos ot-10 te genfragmenter isoleret som emner til anvendelse til ud-trykning af leukocytinterferoner, henholdsvis betegnet "A" til "H". ATG-Translationsinitieringscodonet og terminerings-tripletten for hver LeIF er understreget. Stopcodonerne eller termineringstripletterne efterfølges af 3'-utranslate-15 rede områder. Det viste fuldlængdegen for LeIF A mangler et codon, som findes i de andre afbildede, som vist i tredje A-linje i fig. 3. Utranslaterede 5'-områder ligger foran indledersekvenserne. Som isoleret mangler fragment E indlederens fuldstændige præsekvens, men indeholder hele genet for 20 det putative modne LeIF E. Fragment G som isoleret mangler den fulde kodningssekvens.

Fig. 3A viser nucleotidsekvensen (kodende streng) af det genfragment, der er isoleret som emne til anvendelse til ud-25 trykning af leukocytinterferon-A, uden at vise de andre sekvenser, der er i vist i fig. 3.

Fig. 4 er en sammenligning af de otte LeIF-proteinsekvenser, som forudsiges af nucleotidsekvenserne. Der anvendes de af 30 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature anbefalede enkeltbogstavsforkortelser: A, alanin; C, cystein; D, aspa-raginsyre; E, glutaminsyre; F, phenylalanin; G, glycin; H, DK 173543 B1 12 histidin; I, isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, methionin; N, asparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serin; T, threonin; V, valin; W, tryptophan; og Y, tyrosin. Tallene henviser til aminosyrestillingerne (S betegner signalpep-5 tid). Tankestregen i LeIF A-sekvensen med 165 aminosyrer i position 44 er indført for at bringe LeIF A-sekvensen på linje med de andre LeIF’s aminosyresekvenser på 166. LeIF E-sekvensen bestemmes ved at ignorere det ekstra nucleotid (position 187 i fig. 3) i dets kodende region. Asteriskerne 10 indicerer "in-phase”-termineringscodoner. De understregede rester er aminosyrer, som også er til stede i humant fibroblast interferon .

Fig. 4A viser proteinsekvensen for LeIF-A, som den forudsi-15 ges af nucleotidsekvensen. Fig. 4A er således et uddrag af Fig. 4.

Fig. 5 viser restriktionsendonucleasekort for de otte typer LeIF-klonede cDNA'er (A - H). Hybridplasmiderne fremstilles 20 ved dC:dG-haledannelsesmetoden (Goeddel, D.V, et al., Nature 287, 411 - 416 (1980)). Derfor kan de indsatte cDNA udtages under anvendelse af Pstl. Linjerne ved enden af hver cDNA-indsætning repræsenterer de flankerende homopolymere dCrdG-haler. Positionerne for PvuII, EcoRI og Bglll-restriktions-25 stederne er indiceret. Skyggede områder i figuren repræsenterer de sekvenser, der koder for modne LeIF'er; de skraverede områder indicerer signalpeptidkodende sekvenser; og de lyse områder viser 3T- og 5'-ikke-kodende sekvenser.

30 Fig. 6 viser skematisk konstruktionen af et gen, der koder for den direkte mikrobielle syntese af modent LeIF A. Restriktionssteder og rester er som vist ("Pst I", etc.). Udtrykket "b.p." har betydningen "basepar".

DK 173543 B1 13

Fig. 7 (ikke i samme målestoksforhold) viser skematisk et restriktionskort af to genfragmenter, der anvendes til ud-trykning af det modne leukocytinterferon LeIF B. De angivne 5 codonsekvenser er de kodende strengender, som er resultatet af digestion med restriktionsenzymet Sau3a i de to viste tilfælde.

Fig. 8 og 9 viser DNA- og aminosyresekvenser (jfr. fig. 4 10 ovenfor for tilsvarende enkeltbogstavsforkortelser) for fem LeIF proteiner herfor, herunder type I og J, hvor de pågældende sekvenser I og J ikke specifikt er genstand for krav.

I fig. 9 indicerer asterisken et termineringscodon i den tilsvarende DNA-sekvens, og bindestregen en udeladelse eller 15 et hul i sekvensen.

A. Anvendte mikroorganismer.

Det beskrevne arbejde indebærer anvendelse af to mikroorga-20 nismer: E. coli x 1776 som beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.190.495 og E. coli K-12 stamme 294 (og A, thi", hsr”, hsm+ic) som beskrevet i publiceret britisk patentansøgning nr. 2.055.382 A. Hver af disse er deponeret ved the American Type Culture Collection (ATCC accessionsnumre henholdsvis 25 31.537 og 31.446). Alt rekombinant DNA-arbejde er udført i overensstemmelse med "applicable guidelines" fra the National Institutes of Health.

Opfindelsen beskrives i sine mest foretrukne udførelsesfor-30 mer under henvisning til E. coli, her ikke kun stammer E. coli x 1776 og E. coli K-12 stamme 294 som defineret ovenfor, men også andre kendte E. coli stammer såsom E. coli B

DK 173543 B1 14 eller andre bakterielle stammer, hvoraf mange er deponerede og tilgængelige fra anerkendte mikroorganismedeponeringsinstitutioner såsom the American Type Culture Collection.

Jfr. også tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.644.432. Disse 5 andre mikroorganismer omfatter f.eks. Bacilli såsom Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae, blandt hvilke som eksempler kan nævnes Salminella typhimurium og Serratia mar-cescens, som udnytter plasmider, der kan replicere og udtrykke heterologe gensekvenser deri.

10 B. Kilde for og rensning af LeIF mRNA.

LeIF mRNA kan fås fra humane leukocyter, sædvanligvis fra patienter med kronisk myelogenøs leukæmi, der er induceret 15 til at fremstille interferon med Sendai eller Newcastle disease virus, som beskrevet f.eks. i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.947.134. En særlig foretrukken kilde, faktisk den, der anvendes i det her omhandlede arbejde, er en cellelinje betegnet KG-1 afledt fra en patient med akut myeloge-20 nøs leukæmi. Cellelinjen, der beskrives af Koeffler, H.P. og Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), vokser let i et dyrkningsmedium, som indeholder RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 plus 10% FCS (føtalt kalveserum), der er var-meinaktiveret, 25 mM HEPES-puffer (N-2-hydroxyethyl-pipera-25 zin-N'-2-ethansulfonsyre) og 50 pg/ml gentamicin, og dyrkes som subkultur med 1 til 3 delinger to gange på 1 uge. Celler kan fryses ud fra ovennævnte vækstmedium plus 10% dimethyl-sulfoxid. KG-1 er deponeret ved the American Type Culture Collection (ATCC accessionsnummer CRL 8031).

30 KG-l-Celler induceres til at producere leukocytinterferon-mRNA med Sendai eller Newcastle disease virus efterfulgt af den af Rubinstein et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, DK 173543 B1 15 640 - 644 (1979) beskrevne fremgangsmåde. Celler høstes 5 timer efter induktionen, og RNA fremstilles ved guanidin-thiocyanat-guanidinhydrochlorid-fremgangsmåden (Chirgwin et al., Biochemistry 1J3, 5294 - 5299 (1979)). RNA fra ikke-5 inducerede celler isoleres på samme måde. Oligodeoxythymidin (dT)-cellulosechromatografi og saccharosegradientultracen-trifugering anvendes til fremstilling af 12S-fraktionen af poly(A)-mRNA som beskrevet af Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74 - 89 (1976)) og Okuyuma et al., (Arch. Bio-10 chem. Biophys. 188, 98 - 104 (1978)). Dette mRNA har en in-terferontiter på 8000 - 10.000 enheder pr. mikrogram i Xeno-pus laevis oocytassay (Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 74, 3287 - 3291 (1977)).

15 C. Fremstilling af kolonibanker indeholdende LeIF cDNA-se-kvenser.

5 μς mRNA anvendes til fremstilling af dobbeltstrenget cDNA ved standardprocedurer (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 20 2483 -2495 (1978) og Goeddel et al., Nature 281, 544 - 548 (1979)). cDNA’et størrelsefraktioneres ved elektroforese på en 6%'s polyacrylamidgel og 230 ng materiale med en størrelse i området fra 500 til 1500 b.p. udvindes ved elektroelue-ring. En portion på 100 ng af dette cDNA forsynes med haler 25 af deoxycytidin (dC)-rester som beskrevet af Chang et al..

Nature 275, 617 - 624 (1978), sammenføjes med 470 ng plasmid pBR322, som er forsynet med haler af deoxyguanosin (dG)-rester ved Pstl-stedet (Bolivar et al., Gene 2, 95 - 113 (1977)), og anvendes til transformation af E. coli x 1776.

30 Der fås ca. 130 tetracyclinresistente, ampicillinfølsomme transformanter pr. ng cDNA.

DK 173543 B1 16

Ved et andet lignende forsøg fås ca. 1000 tetracyclinresi-stente, ampicillinfølsomme E. coli K-12 stamme 294-trans-formanter pr. ng cDNA. I dette tilfælde udvindes ved elek-troeluering størrelsesfraktioneret cDNA-materiale med en 5 størrelse i området fra 600 til 1300 b.p. til dC-haledan-nelse.

D. Fremstilling af syntetiske oligonucleotider og deres anvendelse .

10

Kendskabet til aminosyresekvensen hos adskillige tryptiske fragmenter af humant leukocytinterferon tillader udformning af syntetiske deoxyoligonucleotider, som er komplementære til forskellige regioner af LeIF mRNA. De to tryptiske pep-15 tider TI og T13 udvælges, da de har aminosyresekvenser, der kun kræver syntesen af henholdsvis 12 og 4 undecamerer for at tage hensyn til alle mulige kodende sekvenser (fig. 1).

Fire sæt deoxyoligonucleotidprøver syntetiseres for hver sekvens, hver indeholdende enten tre (T-lA, B, C, D) eller et 20 (T-13A, B, C, D) oligonucleotid. De indicerede komplementære deoxyoligonucleotider, som har en længde på 11 baser, syntetiseres kemisk ved phosphortriestermetoden (Crea et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7jj, 5765 - 5769 (1978)). Der fremstilles fire individuelle prøver i T-13-serien. De tolv 25 T-l-prøver fremstilles i fire puljer å tre prøver som vist i fig. 1.

De fire individuelle prøver fra T-13-serien og de tolv T-l-prøver fremstillet i fire puljer med tre primere hver anven-30 des til at prime syntesen af radiomærket enkeltstrenget cDNA til anvendelse som hybridiseringsprøver. Skabelonen mRNA er enten 12S RNA fra Sendai-inducerede KG-l-celler (8000 enheder IF-aktivitet pr. μg) eller totalt poly(A)-mRNA fra uin- DK 173543 B1 17 32 ducerede leukocyter (<10 enheder pr. μς). P-mærket cDNA fremstilles ud fra disse primere under anvendelse af kendte reaktionsbetingelser {Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 76, 1770 - 1774 (1979)). 60 μ1^θΓ-οιη3®ίηΐη9βΓηβ ud-5 føres i 20 mM tris-HCl med pH-værdi 8,3, 20 mM KC1, 8 mM MgCl2, 30 mM β-mercaptoethanol. Reaktionerne inkluderer 1 μg af hver primer {dvs. 12 μς i alt for T-l-serierne, 4 μς i alt for T-13-serier), 2 pg "induceret" 12S-fraktion mRNA {eller 10 μg uinduceret poly(A)-mRNA), 0,5 mM dATP, dCTP, 10 dTTP, 200 pCi {a32 P)dCTP (Amersham, 2 - 3000 Ci/mmol), og 60 enheder omvendt transcriptase (Bethesda Research Laboratories) . Produktet skilles fra ikke-inkorporeret mærke ved gelfiltrering på en 10 ml "Sephadex"® G-50-søjle behandlet med 0,3N NaOH i 30 minutter ved 70°C til destruktion af RNA 15 og neutraliseret med HC1. Hybridiseringerne udføres som beskrevet af Kafatos et al.. Nucleic Acids Res. T_, 1541 - 1552 (1979).

E. Identifikation af klonerne pLl-pL30.

20

Den hurtige plasmidisolationsprocedure ifølge Birnboim et al., Nucleic Acids Res. l_r 1513 - 1523 (1979) anvendes til fremstilling af 1 μg plasmid-DNA fra hver af 500 individuelle E. coli K-12-stammer 294-transformanter (jfr. punkt C).

25 Hver DNA-prøve denatureres og anbringes på nitrocellulosefiltre in triplo efterfulgt af proceduren ifølge Kafatos et al., (se ovenfor).

De tre sæt nitrocellulosefiltre, som indeholder de 500 plas-30 midprøver, hybridiseres med DK 173543 B1 18 a) induceret cDNA primet med T-l-sættet af primere, b) T-13 primet, induceret cDNA, og 5 c) ikke-induceret cDNA fremstillet ved anvendelse af begge sæt primere. Klonerne betragtes som positive, hvis de hybri-diserer stærkere til en af eller begge de inducerede cDNA-prøver end til den helt ikke-inducerede prøve. 30 "positive" kloner (pLl-pL30) udvælges blandt de 500 til yderligere ana-10 lyse.

F) Identificering af klonerne pL31-pL39.

Isolering af et plasmid (nr. 104), som indeholder et LelF-15 genfragment.

Transformanter af E. coli x 1776 screenes ved kolonihybri-diseringsfremgangsmåden ifølge Grunstein og Hogness (Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 - 3965) (1975)) under an-32 20 vendelse af P-mærket induceret mRNA som prøve (Lillenhaug et al., Biochemistry, _15, 1858 - 1865 (1976)). Umærket mRNA fra ikke-inducerede celler blandes med prøven i et forhold på 200 til 1 for at konkurrere med ikke-induceret mRNA til 32 stede i det P-mærkede præparat. Hybridisenng af mærket 25 mRNA bør fortrinsvis ske i kolonier, som indeholder inducerede sekvenser. Der fås tre klasser af transformanter: 32 1) 2-3% af kolonierne hydridiserer meget kraftigt til P-mRNA.

30 2) 10% hybridiserer signifikant mindre end klasse 1, og DK 173543 B1 19 3) de resterende giver intet detekterbart hybridiserings-signal.

De positive kolonier (klasse 1) og 2) undersøges for til-5 stedeværelsen af interferonspecifikke sekvenser ved et assay, der afhænger af hybridisering af interferon mRNA specifikt for plasmid-DNA. Først dyrkes 60 stærkt positive kolonier (klasse 1) individuelt i 100 ml M9-medium suppleret med 20 μg/ml tetracyclin, 100 pg/ml diaminopimelinsyre, 20 μg/ml 10 thymidin og 1 μg/ml d~biotin. M9-mediet indeholder pr. liter 6 g NajHPOi, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl og 1 g NH4CI. Efter autoklavering tilsættes 1 ml steril 1M MgSO-» og 10 ml steril 0,01M CaCl2. Ti kulturer kombineres, og plasmid-DNA isoleres fra seks puljer som beskrevet af Clewell et al., Biochemi-15 stry 9, 4428 - 440 (1970). Ti μg af hver plasmid-DNA-pulje spaltes med Hindlll, denatureres og bindes kovalent til DBM (diazobenzyloxymethyl)-papir. 1 μg renset mRNA fra inducerede celler hybridiseres til hvert filter. Ikke-hybridiseret mRNA fjernes ved vask. Det specifikt hybridiserede mRNA elu-20 eres og translateres i Xenopus laevis oocyter. Ved dette assay er alle seks puljer negative. Fem puljer å ti kolonier og en pulje af ni kolonier fremstilles ud fra 59 svagt positive kolonier (klasse 2), og plasmider fremstilles fra puljerne og undersøges som ovenfor. Blandt de seks testede pul-25 jer hybridiserer én (K10) til interferon-mRNA i niveauer, der ligger signifikant over baggrundsniveauerne, hver gang det testes. Til identifikation af den specifikke interferon-cDNA-klon fremstilles plasmid-DNA'er fra de ni kolonier i pulje K10 og undersøges individuelt. To af de ni plasmider 30 (nr. 101 og nr. 104) binder interferon-mRNA langt over baggrundsniveauerne. Fra plasmid nr. 104 isoleres et unikt Bglll-restriktionsfragment, der indeholder 260 b.p., mærkes 32 DK 173543 B1 20 med P under anvendelse af den af Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324 - 330 (1976) beskrevne fremgangsmåde og anvendes som prøve til uafhængig screening af 400 E. coli 294-transformanter via en in situ koloniscreeningsprocedure 5 (Grunstein og Hogness, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 72, 3961 -3965 (1975)). Ni kolonier (pL31-pL39) identificeres, som hy-bridiserer i forskellig udstrækning med denne prøve.

Endvidere anvendes det mærkede 260 b.p. fragment til uafhæn-10 gig screening af 4000 E. coli 294-transformanter på samme måde. 50 kolonier identificeres, hvilke kolonier er hybridi-seret i forskellig udstrækning med denne prøve. Én indeholder LeIF G-fragmentet, én indeholder LeIF H-fragmentet, og én indeholder et fragment betegnet LeIF Hl, en tilsyneladen-15 de allel til LeIF H. Hybridpiasmiderne, der fås, betegnes "pLeIF H", etc.

G. Isolering og sekventering af et første fuldlængde LelF-gen.

20

Plasmid-DNA fremstilles fra alle 39 potentielle LelF-cDNA-kloner og genscreenes med samme 260 b.p.-DNA-prøve under anvendelse af hybridiseringsproceduren ifølge Kafatos et al., (se ovenfor).

25

Tre plasmider (pL4, pL31, pL34) giver særdeles kraftige hy-bridiseringssignaler, fire (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridi-serer moderat og tre {pL6, pL8, pL14) hybridiserer svagt med prøven.

30

De 39 potentielle LeIF-cDNA-rekombinantplasmider screenes 32 også under anvendelse af P-mærkede syntetiske undecamerer DK 173543 B1 21 (individuelle T-l-primerpuljer eller individuelle T-13-pri-mere) direkte som hybridiseringsprøver. Hybridiseringsbetin-gelserne udvælges, så at perfekt baseparring kræves for de-tekterbare hybridiseringssignaler (Wallace et al., Nucleic 5 Acids Res. j6, 3543 - 3557 (1979)). Således fremstilles plas-mid-DNA fra 39 kloner ved en sædvanlig klaret lysatprocedure (Clewell et al., se ovenfor) og renses ved Biorad Agarose A-50 søjlechromatografi. Prøver (3 μg) af hvert præparat line-ariseres ved behandling med Eco RI, denatureret i alkali og 10 anbragt som pletter på 2 separate nitrocellulosefiltre, 1,5 μg pr. plet (Kafatos et al., se ovenfor). Individuelle syntetiske deoxyoligonucleotidprimere og primerpuljer phospho-32 ryleres med (γ P)ATP som følger: 50 picomol oligonucleotid og 100 picomol (γ"^Ρ)ΑΤΡ (New England Nuclear, 2500 Ci/mmol) 15 kombineres i 30 μΙΐίβΓ tris-HCl, 10 mM MgCl2, 15 mM β-mercap-toethanol. 2 Enheder T4-polynucleotidkinase tilsættes, og 32 efter 30 minutter ved 37°C renses P-mærkede primere ved chromatografi på 10 ml "Sephadex"® G-50-søjler. Hybridiserin-ger udføres under anvendelse af 106 cpm af primer T-13C eller 20 3 x 106 cpm primerpulje T-1C. Hybridiseringerne udføres ved 15°C i 14 timer i 6 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat, pH-værdi 7,2). 10 x Denhardt's (0,2% bovint serumalbumin, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll) opløsning, som beskrevet af Wallace et al., (se ovenfor). Filtre 25 vaskes i 5 minutter (tre gange) ved 0°C i 6 x SSC, tørres og eksponeres på røntgenfilm. Resultaterne er vist i fig. 2 for 32 P-primerpulje T-13C og primer T-1C.

Plasmid-DNA fra klon 104 findes at give signifikant hybridi-30 sering ved primerpulje T-1C og primer T-13C, men ikke detek-terbar hybridisering med de andre undecamerer. Som vist i DK 173543 B1 22 fig. 2 hybridiserer adskillige af de 39 potentielle LelF-plasmider (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) også med begge disse prøver. Imidlertid viser restriktionsanalyser, at kun ét af disse plasmider (pL31), også indeholder et 260 b.p.

5 internt BglIl-fragment. Pstl-nedbrydning af pL31 viser, at størrelsen af det indsatte cDNA er ca. 1000 b.p.

Hele PstI indsætningen i pL31 sekventeres både ved den kemiske metode ifølge Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65, 4 99 -10 560 (1980)) og ved dideoxykædetermineringsmetoden (Smith,

Methods Enzymol. _65, 560 - 580 (1980)) efter subkloning af Sau3a-fragmenter i en M13 vector. DNA sekvensen vises ("A") i fig. 3. Den tilsvarende translationelle aflæsningssystem kan forudsiges ud fra den forhåndenværende proteinse-15 kvensinformation, det kendte område for LeIF-molekylvægte og den relative gyldighed af stoptripletter i de tre mulige læ-sesystemer, og dette tillader igen forudsigelse af hele LeIF-aminosyresekvensen, herunder et præ- eller signalpeptid. Det første ATG-translationelle initieringscodon findes 20 60 nucleotider fra 5’-enden af sekvensen og efterfølges, 188 codoner senere, af en TGA-terminationtriplet; der er 342 uoversatte nucleotider ved 3'-enden, efterfulgt af en poly (A) -sekvens. Det formodede signalpeptid (formodentlig involveret i udskillelsen af modent LeIF fra leukocyter) har 25 en længde på 23 aminosyrer. De 165 aminosyrer, der udgør det modne LeIF, har en beregnet molekylvægt på 19.390. Her benævnes det LeIF, der kodes af pL31, "LeIF A". Det fremgår af sekvensdata ("A") i fig. 4, at de tryptiske peptider TI og T13 i LeIF B svarer til henholdsvis aminosyrer nr. 145 - 149 30 og 57 - 61 i LeIF A. De aktuelle DNA-kodende sekvenser, der findes i disse to regioner, er dem, som repræsenteres ved primerpulje Tl-C og primer T13-C (jfr. fig. 8).

DK 173543 B1 23 H. Direkte udtrykning af modent leukocyt interferon A (LeIF A).

I. Generelt.

5

Den følgende procedure til udtrykning af LeIF A direkte som et modent interferonpolypeptid er en variant af den til humane væksthormoner tidligere anvendte (Goeddel et al., Nature 281, 544 - 548 (1979)), for så vidt den indebærer kom-10 bination af syntetiske (N-terminale) og komplementære DNA'er.

Som vist i fig. 6 er et Sau3a restriktionsendonucleasested hensigtsmæssigt anbragt mellem codonerne 1 og 3 i LeIF A.

15 Der udformes to syntetiske deoxyoligonucleotider, som ind-korporer et ATG-translationelt initieringscodon, genindsætter codonet for aminosyre 1 (cystein) og danner en EcoRI "sticky end". Disse oligomerer ligateres til et 34 b.p. Sau3a-AvaII-fragment af pL31. Det resulterende 45 b.p. pro-20 dukt ligateres til to yderligere DNA-fragmenter til dannelse af et 865 b.p. syntetisk-naturligt hybridgen som koder for LeIF A, og som er bundet ved EcoRI og Pstl-restriktionsste-der. Dette gen indsættes i pBR322 mellem EcoRI og Pstl-ste-derne til dannelse af plasmid pLeIF Al.

25 2. Konstruktion af tryptophankontrolelement (indeholder E. coli trp promotor, operator og trp-lederribosombindingssted, men mangler ATG-sekvens til intiering af translation).

30 Plasmid pGMI bærer E. coli-tryptophan-operonet, der indeholder udeladelsen ÅLE413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457 - 1466 (1978)) og udtrykker derfor et fusionsprotein, som indeholder de første seks aminosyrer fra trp- DK 173543 B1 24 lederen og ca. den sidste tredjedel af trp-E. polypeptidet (i det efterfølgende benævnt det samme som LE') samt trp-D-polypeptidet i sin helhed, alle under kontrol af trp promo-tor-operatorsystemet. Plasmidet, 20 pg, digesteres med re-5 striktionsenzym PvuII, som spalter plasmidet på fem steder. Genfragmenterne kombineres derefter med EcoRI-bindere (består af et selvkomplementært oligonucleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG), hvorved der fås et EcoRI-spaltningssted for en senere kloning til et plasmid, som indeholder et EcoRI-10 sted. 20 pg af de fra pGMl vundne DNA-fragmenter behandles med 10 enheder T4-DNA-ligase i nærværelse af 200 picomol 5'-phosphoryleret syntetisk oligonucleotid pCATGAATTCATG og i 20 pliter T4-DNA-ligasepuffer (20 mM Tris, pH-værdi 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol) ved 4°C natten 15 over. Opløsningen opvarmes derefter i 10 minutter ved 70°C for at standse ligateringen. Binderne spaltes ved EcoRI-digestetion, fragmenterne, der nu har EcoRI-ender, fraskilles under anvendelse af 5% polyacrylamidgelelektroforese (i det nedenstående PAGE), og de tre største fragmenter isole-20 res fra gelen ved først at farve med ethidiumbromid, lokalisere fragmenterne med ultraviolet lys og udskære de interessante dele af gelen. Hvert gelfragment anbringes sammen med 300 pliter 0,1 x TBE i en dialysebeholder og underkastes elektroforese ved 100 Vil time i 0,1 x TBE-puffer (TBE-25 puffer indeholder 10,8 g Tris-base, 5,5 g borsyre og 0,09 g Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige opløsning opsamles fra dialysebeholderen, phenolekstraheres, chloroformekstraheres og indstilles til 0,2M natriumchlorid, og DNA’et udvindes i vand efter ethanoludfældning. det trp-promotor-operator-30 holdige gen med EcoRI-”sticky ends" identificeres ved den nedenfor beskrevne fremgangsmåde, som medfører indsætning af DK 173543 B1 25 fragmenter i et tetracyclinfølsomt plasmid, som, efter pro-motor-operatorindsætningen, bliver tetracyclinresistent.

Plasmid pBRHI {Rodriquez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267 5 -3287 (1979)) udtrykker ampicillinresistens og indeholder genet for tetracyclinresistens, men da der ikke er nogen tilknyttet promotor, udtrykker det ikke denne resistens.

Plasmidet er derfor tetracyclinfølsomt. Ved indføring af et promotor-operatorsystem i EcoRI-stedet kan plasmidet gøres 10 tetracyclinresistent.

pBRHI digesteres med EcoRI, og enzymet fjernes ved phenolek-straktion efterfulgt af chloroformekstraktion og udvindes i vand efter ethanoludfældning. Det resulterende DNA-molekyle 15 kombineres i separate reaktionsblandinger med hver af de tre DNA-fragmenter, som fås ovenfor, og bindes med T4-DNA-ligase som beskrevet ovenfor. Det DNA, der er til stede i reaktionsblandingen, anvendes til at transformere kompetent E. co-li K-12 stamme 294 ved standardteknik (Hershfield et al., 20 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71/ 3455 - 3459 (1974)) og bakterierne udplades på LB (Luria-Bertani) plader indeholdende 20 pg/ml ampicillin og 5 μg/ml tetracyclin. Der udvælges adskillige tetracyclin-resistente kolonier, plasmid-DNA isoleres, og tilstedeværelsen af det ønskede fragment be-25 kræftes ved restriktionsenzymanalyse. Det resulterende plasmid betegnes pBRHtrp.

Et EcoRI og BamHI-digestionsprodukt er det virale genom fra hepatitis B fås ved konventionelle midler og dones på EcoRI 30 og BamHI-steder af plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) til dannelse af plasmidet pHS32. Plasmid pHS32 spaltes med XBal, phenolekstraheres, chloroformekstraheres og ethanoludfældes. Det behandles derefter med 1 μϋίβΓ E.

DK 173543 B1 26 coli-DNA-polymerase I, Klenow fragment (Boehringer-Mannheim) i 30 pliter polymerasepuffer (50 mM kaliumphosphat, pH-værdi 7,4, 7 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol) indeholdende 0,1 mM dTTP og 0,1 mM dCTP i 30 minutter ved 0°C og derefter i 2 ti-5 mer ved 37°C. Denne behandling bevirker, at 2 af de 4 nucleo-tider, der er komplementære til den udragende 5'-ende ved Xbal-spaltningsstedet, udfyldes: 5’ CTAGA - 5' CTAGA- 10 3' T- ,3' TCT -

To nucleotider, dC og dT, inkorporeres, hvorved fås en ende med 5'-udragende nucleotider. Denne lineære rest af plasmid 15 pHS32 (efter phenol- og chloroformekstraktion og udvinding af vand efter ethanoludfældning) spaltes med EcoRI. Det store plasmidfragment separeres fra det mindre EcoRI-Xbal-fragment ved PAGE og isoleres efter elektroeluering. Dette DNA-fragment fra pHS32 (0,2 pg) ligateres under betingelser, der 20 ligner dem, der er beskrevet ovenfor, til EcoRI-Taql-frag-mentet i tryptophanoperon (ca. 0,01 pg) afledt af pBRHtrp.

I processen til ligatering af fragmentet fra pHS32 til EcoRI -Taql- fragmentet som beskrevet ovenfor, ligateres den ud-25 ragende TaqI-ende til den XbaI-tilbageværende udragende ende, selv om den ikke er fuldstændig Watson-Crick-baseparret: — T CTAGA- - TCTAGA — 30 ^

AGC TCT — ' AGCTCT

DK 173543 B1 27

En del af denne ligationsreaktionsblanding transformeres til E. coli 294-celler, varmebehandles og udplades på LB-plader indeholdende ampicillin. Der udvælges 24 kolonier, dyrkes i 3 ml LB (Luria-Bertani)-medier, og plasmidisoleres. Seks af 5 disse viser sig at have regenereret Xbal-stedet via E. coli-katalyseret DNA-reparation og -replikation: - TCTAGA — - TCTAGA — —^ 10 - AGCTCT- - AGATCT-

Disse plasmider viser sig også at spalte både med EcoRI og HpAI og give de forventede restriktionsfragmenter. Et plasmid betegnet pTRpl4 anvendes til udtrykning af heterologe 15 polypeptider som beskrevet nedenfor.

Plasmidet pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) indeholder et gen for humant væksthormon fremstillet af 23 aminosyrecodoner fremstillet ud fra syntetiske DNA-fragmen-20 ter og 163 aminosyrecodoner fremstillet fra komplementært DNA fremstillet via omvendt transkription af humant væksthormon mRNA. Dette gen indeholder, selv om det mangler codo-nerne for humant væksthormons "præ”-sekvens, et ATG-transla-tionsinitieringscodon. Dette gen isoleres fra 10 μg pHGH 107 25 efter behandling med EcoRI efterfulgt af E. coli-DNA-poly-merase I, Klenow fragment og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Efter phenol- og chloroformekstraktion og ethanol-udfældning behandles plasmidet med BamHI.

30 Det humane væksthormon(HGH)-genholdige fragment isoleres ved PAGE efterfulgt af elektroeluering. Det resulterende DNA-fragment indeholder også de første 350 nucleotider fra det tetracyclinresistente strukturelle gen, men mangler tetracy- DK 173543 B1 28 clinpromotor-operatorsystemet, så at når det derefter klones i et udtryksplasmid, kan plasmider, der indeholder indsætningen, lokaliseres ved genvindingen af tetracyclinresisten-sen. EcoRI-enden af fragmentet er udfyldt ved Klenow polyme-5 rase I-proceduren, har fragmentet én "blunt end" og én "sticky end", som sikrer korrekt orientering, når det senere indsættes i et udtryksplasmid.

Udtryksplasmidet pTrpl4 forberedes derefter til at modtage 10 det HGH genholdige fragment fremstillet ovenfor. Således

Xbal-digesteres pTrpl4, og de resulterende "sticky ends" udfyldt ved Klenow polymerase I-proceduren under anvendelse af dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Efter phenol- og chloroformeks-traktion og ethanoludfældning behandles det resulterende DNA 15 med BamHI, og det resulterende store plasmidfragment isoleres ved PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-afledte fragment har én "blunt end" og én "sticky end”, der tillader rekombination i den korrekte orientering med det HGH-genholdige fragment beskrevet ovenfor.

20 HGH-Genfragmentet og pTrpl4 AXba-BamHI-fragmentet kombineres og ligateres under betingelser, som ligner de ovenfor beskrevne. De udfyldte Xbal og EcoRI-ender ligateres ved "blunt end"-ligatering til dannelse af både Xbal- og EcoRI-25 stedet:

Xbal udfyldt EcoRI udfyldt HGH geninitiering - TCTAG AATTCTATG -TCTAGAATTCTATG- 30 + -> -AGATC TTAAGATAC- -AGATCTTAAGATAC-

Xbal EcorI

DK 173543 B1 29

Denne konstruktion gendanner også tetracyclinresistensgen.

Da plasmidet pHGH 107 udtrykker tetracyclinresistensen fra en promotor, som ligger ovenfor HGH-genet (lacpromotoren) tillader denne konstruktion betegnet pHGH 207 udtrykning af 5 genet for tetracyclinresistens under kontrol af tryptophan-promotor-operatoren. Således transformeres ligationsblandingen til E. coli 294, og kolonier udvælges på LB-plader indeholdende 5 μg/ml tetracyclin.

10 Plasmid pHGH 207 EcoRI-digesteres, og et 300 b.p. fragment indeholdende trp-promotor og operator og trp hovedribosom-bindingssted, men uden ATG-sekvensen til initiering af translationen, udvindes ved PAGE efterfulgt af elektroelu-ering. Dette DNA fragment klones til EcoRI-stedet på pLeIF 15 A. Udtryksplasmider indeholdende det ovenfor nævnte modificerede trp regulon (E. coli-trp-operon, fra hvilket svækkelsessekvensen er udeladt for på kontrolleret måde at forøge udtryksniveauer) kan dyrkes til i forvejen bestemte niveauer i et næringsmedium, som indeholder tilsat tryptophan 20 i mængder, der er tilstrækkelige til at undertrykke promo-tor-operatorsystemet, derefter unddrages tryptophan for at genundertrykke systemet og foranledige udtryk af det tilsigtede produkt.

25 Nærmere angivet og med henvisning til fig. 6 digesteres 250 pg plasmid pL31 med PstI, og 1000 b.p.-indsætningen isoleres ved gelelektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Ca. 40 pg af indsætningen elektroelueres fra gelen og deles i 3 alikvoter til yderligere digstetion: a) en 16 μg prøve af dette frag-30 ment digesteres delvis med 40 enheder Bglll i 45 minutter ved 37°C, og reaktionsblandingen renses på en 6%'s polyacrylamidgel. Ca. 2 μg af det ønskede 670 b.p.-fragment udvindes.

DK 173543 B1 30 b) En anden prøve (8 pg) af 1000 b.p. Pstl-indsætningen udsættes for restriktion med Avail og Bglll. 1 pg af det indicerede 150 b.p.-fragment udvindes efter gelelektroforese. c) 16 pg 1000 b.p.-stykket behandles med Sau3a og Avail. Efter 5 elektroforese på en 10%'s polyacrylamidgel udvindes ca. 0,25 μg (10 picomol) af 34 b.p.-fragmentet. De to indicerede de-oxyoligonucleotider, 51-dAATTCATGTGT (fragment 1) og 5'-dGATCACACATG (fragment 2) syntetiseres ved phosphotriester-proceduren. Fragment 2 phosphoryleres som følger. 200 pliter 10 (ca. 40 picomol) (γ^Ρ)ΑΤΡ (Amersham, 5000 Ci/millimol) tørres og resuspenderes i 30 pliter 60 mM tris-HCl (pH-værdi 8), 10 mM MgCl2, 15 mM β-mercaptoethanol, indeholdende 100 picomol DNA-fragment og 2 enheder T4-polynucleotidkinase.

Efter 15 minutter ved 37°C tilsættes 1 pliter 10 mM ATP, og 15 reaktionen lades forløbe i yderligere 15 minutter. Blandingen opvarmes derefter til 70°C i 15 minutter, kombineres med 100 picomol 5'-OH-fragment 1 og 10 picomol af 34 b.p. Sau3a-Avall-fragmentet. Ligation udføres i 5 timer ved 4°C i 50 pliter 20 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM 20 dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 10 enheder T4 DNA-ligase.

Blandingen underkastes elektroforese på en 65%'s polyacrylamidgel, og produktet med 45 b.p. udvindes ved elektroelue-ring. Ca. 30 ng (1 picomol) af 45 b.p-produktet kombineres med 0,5 pg (5 picomol) af 150 b.p. Avail - Bglll-fragmentet 25 og 1 pg (2 picomol) af 670 b.p. Bglll - Pstl-fragmentet. Ligationen udføres ved 20°C i 16 timer under anvendelse af 20 enheder T4-DNA-ligase. Ligasen inaktiveres ved opvarmning til 65°C i 10 minutter. Blandingen digesteres derefter med EcoRI og PstI til eliminering af polymerer af genet. Blan-30 dingen renses med 6%'s PAGE. Ca. 20 ng (0,04 picomol) af 865 b.p.-produktet isoleres. Halvdelen (10 ng) af dette ligate- DK 173543 B1 31 res til pBR322 (0,3 μ9) mellem EcoRI- og Pstl-stederne. Transformation af E. coli 294 giver 70 tetracyclinreistente ampicillinfølsomme transformanter. Plasmid-DNA isoleres fra 18 af disse transformanter digesteres med EcoRI og Pstl. 16 5 af de 18 plasmider har et EcoRI - Pstl-fragment 865 b.p. i længden. 1 μg af et af disse, pLeIF Al, digesteres med EcoRI og ligateres til 300 b.p. EcoRI-fragmentet (0,1 μg), som indeholder E. coli trp-promotor og trp-hovedribosombindings-stedet, fremstillet som beskrevet ovenfor. Transformanter, 10 som indeholder trp-promotoren, identificeres under anvendel-32 se af P-trp-prøve i kombination med Grundstexn-Hogness-koloniscreeningsproceduren. Et asymmetrisk lokaliseret Xbal-sted i trp-fragmentet tillader bestemmelse af rekombinanter, i hvilke trp-promotoren er orienteret i retning af LeIF A-15 genet.

I. In vitro og in vivo aktivitet for LeIF A.

Der fremstilles ekstrakter til IF-assay som følger: 1 ml's 20 kulturer dyrkes i L-medium indeholdende 5 pg/ml tetracyclin til en A^g-værdi ca· 1*0 og fortyndes derefter i 25 ml M9-medier indeholdende 5 pg/ml tetracyclin. 10 ml's prøver høstes ved centrifugering, når A^g-værdien når 1,0, og cellepellets suspenderes i 1 ml 15%’s saccharose, 50 mM tris-25 HC1 (pH-værdi 8,0), 50 mM EDTA. 1 mg lysozym tilsættes og efter 5 minutter ved 0°C ødelægges celler ved lydbehandling. Prøverne centrifugeres i 10 minutter (15.000 rpm), og interferonaktivitet i supernatanterne bestemmes ved sammenligning med LeIF-standarder ved cytopatisk effekt(CPE)inhiberings-30 assayet. Til bestemmelse af antallet af IF-molekyler pr.

DK 173543 B1 32 celle anvendes en LeIF specifik aktivitet på 4 x 108 enhe-der/mg.

Som vist i tabel I, giver klon pLeIF A trp 25, i hvilken 5 trp-promotoren er indsat i den ønskede orientering, høje niveauer for aktivitet (så høje som 2,5 x 108 enheder/liter) .

Som vist i tabel II opfører IF produceret af E. coli K-12 stamme 294/pLeIF A trp 25 sig som autentisk humant LeIF; det er stabilt for behandling ved pH-værdi 2 og neutraliseres af 10 kanin-antihumant leukocytantistof. Interferonet har en tilsyneladende molekylvægt på ca. 20.000.

In vivo kraften af interferon kræver tilstedeværelse af ma-crofager og naturlige "killer cells" (NK), og in vivo virk-15 ningsmåden synes at indebære stimulering af disse celler.

Det forbliver således muligt, at interferonet fremstillet af E. coli 294/pLeIF A 25, selv om det har en antiviral aktivitet i cellekulturassay, ikke vil være aktivt i inficerede dyr. Endvidere kan in vivo antiviralaktiviteten hos den bak-20 terielt fremstillede ikke-glycosylerede LeIF A være forskellig fra det glycosylerede LeIF afledt fra humane "buffy coat" leukocyter. Derfor sammenlignes den biologiske aktivitet af bakterielt syntetiseret LeIF A (2% rent) med "buffy coat" LeIF (8% rent) i letal encephalomyocarditis (EMC)-25 virusinfektion hos dødningehovedaber (tabel III).

Tabel I

DK 173543 B1 33

Interferonaktivitet i ekstrakter af E. coli 5 E. coli K-12 Celledensitet IF-Aktivitet LeIF molekyler stamme 294 trans- (celler/ml) enheder/ml pr. celle formeret ved kultur pLeIF A trp 25 3,5 x 108 36.000 9.000 10 pLeIF A trp 25 1,8 x 109 250.000 12.000

Tabel II

DK 173543 B1 34

Sammenligning af aktiviteter af ekstrakter fra E. coli 294/pLeIF A 25 med standard LeIF1.

5

Interferonaktivitet (enheder/ml)

Ubehandlet pH-værdi 2 Kaninantihuman- leukocytantistof- fer 10 ---:- 294/pLeIF A trp 25 500 500 <10 ekstrakt

LeIF standard 500 500 <10 15

De i tabel I beskrevne 250.000 enheder/ml ekstrakt af E.

20 coli 294/pLeIF A trp 25 fortyndes 500 gange med minimalt essentielt medium, hvorved fås en specifik aktivitet på 500 enheder/ml. En leukocytinterferonstandard (Wadley Institute), der i forvejen er titreret mod NIH-leukocytinterferon-standard, fortyndes også til en slutkoncentration på 500 en-25 heder/ml. 1 ml1s alikvoter indstilles til pH-værdi 2 med IN saltsyre, inkuberes ved 4°C i 52 timer, neutraliseres ved tilsætning af NaOH, og IF aktivitet bestemmes ved standard CPE-inhiberingsassay. 25 μΐ^βτ alikvoter af 500 enheder/ml-prøverne (ubehandlede) inkuberes sammen med 25 pliter kanin-30 anti-human leukocytinterferon i 60 minutter ved 37°C, centrifugeres ved 12.000 x g i 5 minutter, og supernatanten bruges til assay.

Tabel III

DK 173543 B1 35

Antiviral effekt på forskellige LeIF-præparater mod EMC virusinfektion på dødningehovedaber.

5 Serum

Behandling Overlevende plaquedannende enheder/ml dag 2 dag 3 dag 4 1 o

Kontrol 0/3 1θΛ 3x10^ 105Ί

(bakterielle protei- l II

ner) 0[3 0 jlO4 1.200 i >3,4xl04 oj 0 J oj

Bakterielt LeIF A 3/3 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0

LeIF standard 3/3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 25 Alle aber er hanner (middelvaegt 713 g) og har ingen EMC- virusantistof før infektion. Aberne inficeres intramuskulært med 100 x LD5Q EMC virus (bestemt i mus). Kontrolbehandlede

aber dør 134, 158 og 164 timer efter infektionen. Interferonbehandlinger med 106 enheder er ad intravenøs vej på tids-30 punkterne -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 og 240 timer i forhold til infektion. Det bakterielle leukocytinterferon er en søj-lechromatografifraktion fra et lysat af E. coli 294/pLeIF A

DK 173543 B1 36 25 med en specifik aktivitet på 7,4 x 106 enheder/mg protein.

De bakterielle kontrolproteiner er en ækvivalent søjlefraktion fra et lysat af E. coli 294/pBR322 med en dobbelt så stor totalproteinkoncentration. Leukocytinterferonstandarden 5 er Sendai virus-induceret interferon fra normale humane "buffy-coat"-celler, renset chromatografisk til en specifik aktivitet på 32 x 105 enheder/mg protein.

Kontrolaberne viser progressiv lethargi, balancetab, slap 10 paralyse af baglemmerne, og øjnene løber i vand, hvilket begynder ca. 8 timer før døden. De interferonbehandlede aber viser ingen af disse abnormaliteter; de forbliver aktive til alle tidspunkter og udvikler ingen viræmi. Den ene abe i kontrolgruppen, som ikke udviklede viræmi efter 4 dage, døde 15 sidst (164 timer efter infektion) men viste høje titere af virus i hjertet og hjernen post mortern. De interferonbehandlede aber udvikler ikke antistoffer mod EMC-virus, hvilket bestemmes 14 og 21 dage efter infektionen. Disse resultater påviser, at LeIF-præparaters antivirale virkning i de infi-20 cerede dyr alene kan tilskrives interferon, da de forurenende proteiner er meget forskellige i de bakterielle præparater og "buffy coat"-præparaterne. Endvidere indicerer disse resultater, at glycosylering ikke er nødvendig for in vivo anti-viralaktivitet hos LeIF A.

25 J. Isolering af cDNA'er for yderligere modne leukocytinter-feroner.

DNA fra det fuldstændigt karakteriserede LeIF A cDNA-holdige 30 plasmid overskæres med PstI, isoleres elektroforetisk og 32 mærkes med P. Det resulterende radioaktivt mærkede DNA anvendes som prøve til screening af yderligere E. coli 294- DK 173543 B1 37 transformanter, som er opnået på samme måde som dem i del C ved in situ koloniscreeningsproceduren ifølge Grunstein og Hogness (se ovenfor). Der isoleres kolonier, som hybridise-rer i forskellig udstrækning for prøven. Plasmid-DNA fra 5 disse kolonier og de ti hybridiserende kolonier, der henvises til i del G ovenfor, isoleres ved Pstl-klipning og karakteriseres ved tre forskellige metoder. Først karakteriseres Pst-fragmenterne ved deres restriktionsendonucleasedige-stionsmønstre med enzymerne Bglll, PvuII og EcoRI. Denne 10 analyse tillader klassifikation af mindst otte forskellige typer (LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G og LeIF H), vist i fig. 5, som omtrentlig viser lokaliseringen af forskellige restriktionsklipninger i forhold til den nu kendte præsekvens og kodningssekvensen for LeIF A. Et 15 af disse, LeIF D, formodes at være identisk med det, der beskrives af Nagata et al., Nature 284, 316 - 320 (1980).

For det andet testes visse af DNA'erne ved det af Cleveland et al., Cell 20, 95 - 105 (1980) beskrevne hybridiserings-20 selektionsassay, for deres evne til selektivt at fjerne LeIF mRNA fra poly-A-holdigt KG-l-celle-RNA. LeIF A, B, C og F er positive ved dette assay. For det tredje indsættes det sidstnævnte Pst-fragment i et udtryksplasmid, E. coli 294 transformeres med plasmidet, og fragmenterne udtrykkes. Ud-25 tryksprodukterne, der formodes at have været præ-interferoner, var alle positive ved CPE-assay for interferonaktivitet, omend det er marginalt aktivt for LeIF F-fragmentets vedkommende. Ud over det ovenstående er alle LeIF-typerne beskrevet og sekventeret.

DK 173543 B1 38 K. Direkte udtrykning af et andet modent leukocytinterferon (LeIF B).

5 Sekvensen af det isolerede fragment, som indeholder genet for modent LeIF B, viser, at de første 14 nucleotider af type A og B er identiske. Følgelig isoleres et fragment fra pLeIF A25, som bærer trp-promotor-operatoren, ribosombindingssted og starten for LeIF A (=B)-genet kombineres med 10 den tilbageværende andel af B.-sekvensen i et udtryksplas-mid. Hovedrestriktionskortet for Pst-fragmentet af pL4 (et plasmid, som indeholder LeIF B Pst-afsluttet gen vist i fig.

5) og pLeIF A25 er vist i henholdsvis fig. 7a og 7b.

15 Til fremstilling af de ca. 950 b.p. Sau3a-PstI-fragment fra den i fig. 7a viste sekvens er adskillige trin nødvendige på grund af tilstedeværelsen af ét eller flere mellemliggende Sau3a restriktionssteder, dvs.: 20 1. Følgende fragmenter isoleres: a) 110b b.p. fra Sau3a til EcoRI; b) 132 b.p. fra EcoRI til Xba; c) >700 b.p. fra Xba til Pst.

25 2. Fragmenter (la) og (lb) ligateres og klippes med Xba og Bglll for at udelukke selvpolymerisation gennem Sau 3a- og Xba-endeterminalerne (det relevante Sau3a-sted ligger inden for et Bglll-sted; Bglll klipper, så der efterlades en Sau3a 30 "sticky end"). Der isoleres et 242 b.p. fragment.

3. Produkterne fra (2) og (lc) ligateres og klippes med PstI og Bglll, igen for at forhindre selvpolymerisation. Der iso- DK 173543 B1 39 leres et ca. 950 b.p. fragment, Sau 3a til PstI på fig. 7a.

Dette fragment indeholder den del af LeIF B-genet, som ikke er fælles med LeIF A.

5 4. Et ca. 300 b.p. fragment (Hind Illtil Sau3a) indeholdende trp-promotor-operatoren, ribosombindingssted, ATG-startsig-nal og cysteincodon af LeIF A isoleres fra pLeIF A25.

5. Et ca. 3600 b.p. fragment fra PstI til Hindlll isoleres 10 fra pBR322. Dette indeholder replicon og koder for tetracy- clin- men ikke ampicillinresistens.

6. De fragmenter, som fås i trin 3, 4 og 5 tripelligateres, og det resulterende plasmid transformeres i E. coli K12 15 stamme 294.

Transformanter miniscreenes (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 1_, 1513 - 1523 (1979)) og plasmidprøver digesteres med EcoRI. Digestering giver tre fragmenter karakteristiske for: 20 1) EcoRI-EcoRI trp-promotorfragmentet; 2) det interne EcoRI - EcoRI-fragment fra pL4; og 3) proteintranslationelt startsignal til EcoRI-fragment fra pL4.

I CPE-assay giver bakterielle ekstrakter fra kloner frem-25 stillet på den ovenfor beskrevne måde et assay på ca. 10 x 106 enheder interferonaktivet pr. liter ved A^g = 1. En repræsentativ klon fremstillet på denne måde er E. coli 294/pLeIF B trp 7.

DK 173543 B1 40 L. Direkte udtrykning af yderligere modne leukocytinter-feroner (LeIF C, D, F, Η, I og J).

Andre fuldlængdegenfragmenter, som omfatter andre LelF-5 typer, kan skræddersys og anbringes i udtryksbærere til udtrykning som i tilfældet med LeIF A. Fuldstændig sekvente-ring med konventionelle midler afslører, om der ligger et restriktionssted tilstrækkelig nær ved det første amino-syrecodon af den modne interferontype til at tillade hen-10 sigtsmæssig brug af den tilnærmelse, der anvendes i afsnit H ovenfor til udtrykning af modent LeIF A, dvs. elimination af præsekvensen ved restriktionsklipning og erstatning af co-doner for tabte N-terminale aminosyrer tabt ved præsekvens-elimination ved ligation af et syntetisk DNA-fragment. Hvis 15 dette mislykkes, kan nedenstående fremgangsmåde anvendes.

Kort indebærer denne spaltning af det præsekvensholdige fragment lige før det sted, ved hvilket codonet for første aminosyre i det modne polypeptid begynder, ved: 20 1. Omdannelse af dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget DNA i et område, der omgiver dette punkt; 2. Hybridisering til den enkeltstrengede region dannet i trin a) af en komplementær primerlængde af enkeltstrenget 25 DNA, idet 5'-enden af primeren ligger over for det nucleo-tid, som ligger op til det ønskede spaltningssted; 3. Gendannelse af den del af den anden streng, der er elimineret i trin 1, som ligger i 3'-retningen fra primeren, ved 30 omsætning med DNA-polymerase i nærværelse af adenin, thymin, guanin og cytosin-holdige deoxynucleotidtriphosphater; og DK 173543 B1 41 4. Digestering af tilbageværende enkeltstrengede længder af DNA, som strækker sig ud over det tilsigtede spaltningssted.

En kort længde syntetisk DNA, som ender ved 3'-enden af den 5 kodende streng med translationsstartsignalet ATG, kan derefter ligateres ved f.eks. "blunt end"-ligatering til det resulterende skræddersyede gen for modne interferoner, og indsættes i et udtryksplasmid og bringes under kontrol af en promotor og dens tilknyttede ribosombindingssted.

10 På en lignende måde som den, der anvendes i afsnit K ovenfor, konfigureres genfragmenter, der koder for LeIF C og LeIF D hensigtsmæssigt til direkte bakteriel udtrykning. Ud-trykningsstrategien for disse yderligere leukocytinterfero-15 ner omfatter i hvert tilfælde, at der gribes til det ca. 300 b.p. fragment (Hindlll til Sau3a) indeholdende trp promotoroperatoren, ribosombindingsstedet, ATG-startsignalet og cy-steincodonet for LeIF A fra pLeIF A25. Til dette kombineres genfragmenter fra yderligere interferongener, som koder for 20 deres respektive aminosyresekvenser efter det initielle cy-stein, som er fælles for alle. Hvert resulterende plasmid anvendes til at transformere E. coli K-12 stamme 294. Ligationen til dannelse af de respektive gener er som følger: DK 173543 B1 42

LeIF C

Isoler nedenstående fragmenter fra pLeIF C:

a) 35 b.p. fra Sau3a til Sau96 5 b) >900 b.p. Sau96 til PstI

c) isoler et ca. 300 b.p. fragment {Hind III - Sau3a) fra pLeIF A-25 som i afsnit K 4) ovenfor, d) isoler det ca. 3600 b.p. fragment fra afsnit K 5) ovenfor.

10

Konstruktion: 1) Ligater a) og c). Spalt med Bglll, Hindlll og isoler det ca. 335 b.p. produkt.

15 2) Trippelligater 1) + b) + d) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

En repræsentativ klon fremstillet på denne måde er E. coli 20 K-12 stamme 294/pLeIF C trp 35.

LeIF D

Isoler fra pLeIF D: 25 a) 35 b.p. fra Sau3a til Avail b) 150 b.p. fra Avail til Bgll c) ca. 700 b.p. fra Bglll til PstI.

Isoler fra pLeIF A25: 30 d) 300 b.p. fra Hindlll til Sau3a.

Isoler fra pBR322: e) ca. 3600 b.p. fra Hind III til PstI.

DK 173543 B1 43

Konstruktion: 1) ligater a) + b), klip med Bglll og rens et 185 b.p. pro-5 dukt (1).

2) ligater 1) + d), klip med Hindlll, Bglll og rens det ca.

500 b.p. produkt (2).

10 3) ligater 2) + c) + e) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

En repræsentativ klon fremstillet på denne måde er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF D trp 11.

15

LeIF F

Det LeIF F-holdige fragment kan skræddersys til direkte ud-trykning gennem gensamling udført hensigtsmæssigt ved at 20 fuldende homologien af aminosyre 1-13 fra LeIF B og LeIF

F. Et trp-promotorholdigt fragment a) med hensigtsmæssigt konfigurerede ender fås fra pHGH207 som beskrevet ovenfor, via PstI og Xbal digestering efterfulgt af isolering af det ca. 1050 b.p. fragment. Et andet fragment b) fås som det 25 største af de fragmenter, der resulterer af PstI og Bglll digestering af plasmidet pHKY 10. Fragment a) indeholder ca. halvdelen af det gen, der koder for ampicillinresistens; fragment b) indeholder den resterende del af det gen og hele genet for tetracyclinresistens bortset fra den tilknyttede 30 promotor. Fragmenter a) og b) kombineres via T4-ligase, og produktet behandles med Xbal og Bglll til eliminering af di-merisering til dannelse af et fragment c), der indeholder DK 173543 B1 44 trp-promotor-operator og gener for tetracyclin- og ampicil-linresistens.

Et fragment d) med omtrent 580 b.p. fås ved Avail- og Bglll-5 digerering af pLeIF F. Dette omfatter codoner for aminosyrer 14 - 166 i LeIF F.

Et fragment e) (49 b.p.) fås ved Xbal og Avall-digestering af pLeIF B. Fragment e) koder for aminosyrer 1 - 13 i LeIF 10 F.

Fragmenter c), d) og e) tripellelligateres i nærværelse af T4-ligase. De sammenhængende ender af de respektive fragmenter er sådanne, at det sammensatte plasmid ringslutter 15 korrekt og bringer tetracyclinresistensgenet under kontrol af trp promotor-operatoren sammen med genet for modent LeIF F, så at bakterier transformeret med det ønskede plasmid kan vælges på tetracyclinholdige plader. En repræsentativ klon fremstillet på denne måde er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF F 20 trp 1.

LeiF H

Det fuldstændige LeiF H gen kan konfigureres til udtrykning 25 som et modent leukocytinterferon som følger: 1). Plasmid-pLeIF H underkastes Haell- og Rsal-digerering med isolering af 816 b.p. fragmentet, som strækker sig fra signalpeptidaminosyre 10 til den ikke-kodende 3'-region.

2. Fragmentet denatureres og underkastes reparationssyntese med Klenow fragment af DNA-polymerase I (Klenow et al., 30 DK 173543 B1 45

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 6^, 168 (1970)) syntetisk de-oxyribooligonucleotidprimer 5'-dATGTGTAATCTGTCT.

3. Det resulterende produkt spaltes med Sau3a, og et 452 5 b.p. fragment repræsenterende aminosyrer 1 til 150 isoleres.

4. Sau3a- og Pstl-digestering af pLeIF H og isolering af det resulterende 500 b.p. fragment giver et gen, der koder fra aminosyrer 150 til enden af den kodende sekvens.

10 5. Fragmenter isoleret i trin 3) og 4) ligateres til dannelse af et fragment: 1 166 met cys asp stop

ATC TGT .. j - ... GAT TGA - ... - Pst I

Sau3a 20 der koder for de 166 aminosyrer i LeIF H. 1 pLeIF A trp 25 digereres med Xbal, og "blunt-endes" med DNA-polymerase I, og produktet digereres med Pstl. Det store 25 resulterende fragment kan isoleres og ligateres med produktet fra trin 5) til dannelse af et udtryksplasmid, der efter transformation i E. coli K-12 stamme 294 eller andre værtsbakterier er i stand til at udtrykke modent LeIF H.

30 LeIF I

Den særlige sekvens af LeIF I er ikke genstand for patentkrav.

DK 173543 B1 46

Fag-λ Charon 4A-rekombinantbiblioteket for det humane genom konstrueret af Lawn et al., Cell _15, 1157 (1978), screenes for leukocytinterferongener ved den af Lawn et al., (supra) 5 og Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978), beskrevne fremgangsmåde. En radioaktiv LeIF-prøve afledt af cDNA-klon LeIF A anvendes til at screene ca. 500.000 plaques. Seks LeIF genomkloner fås ved denne screening. Efter genscreening og plaquerensning af disse kloner udvælges λΗ1βΐΓ2 til yderli-10 gere analyse.

Under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan andre prøver med fordel anvendes til isolering af yderligere LeIF-kloner fra humant genom. Dette kan på sin side anvendes 15 til fremstilling af yderligere leukocytinterferonproteiner i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.

1. 2000 b.p. EcoRI fragmentet fra klon XHLeIF2 subklones på pBR325 ved EcoRI-stedet. Det resulterende plasmid LeIF I

20 spaltes med EcoRI, og 2000 b.p. fragmentet isoleres. Deoxy-oligonucleotidet dAATTCTGCAG (en EcoRI-Pstl-omdanner) liga-teres til 2000 b.p. EcoRI-fragmentet, og det resulterende produkt spaltes med PstI, hvorved fås et 2000 b.p.-fragment, som indeholder Pstl-ender. Dette spaltes med Sau96, og et 25 1100 b.p. fragment isoleres, som har en PstI- og en Sau96-ende.

2. Plasmidet pLeIF C trp 35 digesteres med PstI og Xbal. Det store fragment isoleres.

30 DK 173543 B1 47 3. Det lille Xbal - PstI-fragment fra pLeIF C trp 35 dige-steres med Xbal og Sau96. Et 40 b.p. Xbal - Sau96-fragment isoleres.

5 4. Fragmenterne isoleret i trin 1), 2) og 3) ligateres til dannelse af et udtryksplasmid pLeIF I trp 1.

LeIF J

10 Den særlige sekvens af LeIF J er ikke genstand for patentkrav.

1. Plasmidet pLeIF J indeholder et 3,8 kilobase Hindlll-fragment af humant genom-DNA, som indeholder LeIF J-gense- 15 kvensen. Et 760 b.p. Ddel - RsaI-fragment isoleres fra dette plasmid.

2. Plasmidet pLeIF B trp 7 spaltes med Hindlll og Ddel og et 340 b.p. Hind III - Ddel-fragment isoleres.

20 3. Plasmidet pBR322 spaltes med PstI, ’’blunt endes" ved in-kubering med DNA-polymerase I (Klenow fragment), og digeste-res derefter med Hindlll. Det store (ca. 3600 b.p.)fragment isoleres.

25 4. Fragmenter isoleret i trin 1), 2) og 3) ligateres til dannelse af udtryksplasmidet pLeIF J trp 1.

M. Rensning.

Indholdet af leukocytinterferon i bakterielle ekstrakter kan forøges ved successiv 30 DK 173543 B1 48 1. Polyethyleniminudfældning, ved hvilken det meste af det cellulære protein, herunder interferonet, forbliver i super-natanten.

5 2. Ammoniumsulfatfraktionering, ved hvilken interferon kommer ud af opløsning i 55%'s mættet ammoniumsulfat.

3. Suspension af ammoniumsulfatpelleten i Ο,ΟβΜ kaliumphos-phat, 10 mM tris-HCl, pH-værdi 7,2 og dialyse mod 25 mM

10 tris-HCl, pH-værdi 7,9 (interferonaktiviteten forbliver i opløsningen).

4. Chromatografi af den ovenstående supernatant, pH-værdien indstillet til 8,5, på en DEAE-cellulosesøjle (eluering med 15 en lineær gradient fra 0 til 0,2M NaCl i 25 mM tris-HCl, pH-værdi 8,5).

5. Adsorption på Cibachrome Blue-agarose eller hydroxylapa-tit og eluering med henholdsvis 1,5M KC1 eller 0,2M phos- 20 phatopløsning (fakultativ).

6. Molekylstørrelsesfordeling på "Sephadex"® G-75-søjle.

7. Kationbytterchromatografi på CM-cellulose i 25 mM amrao-25 niumacetat ved pH-værdi 5,0, udviklet med en ammoniumace- tatgradient (til 0,2M ammoniumacetat).

Ved ovenstående fremgangsmåde fås et materiale med >95%’s renhed.

Materialet kan også renses ved størrelseseksklusionschroma-tografi, omvendt fase(RP-8)højtryksvæskechromatografi eller 30 DK 173543 B1 49 affinitetschromatografi på immobiliserede antiinterferon-antistoffer.

Materialet for trin 4 ovenfor kan alternativt anbringes på 5 en monoklonal antistofkolonne fremstillet som beskrevet af Milstein, Scientific American 243, 66 (1980) og elueres med 0. 2. eddikesyre og 0,1¾ "Triton” og 0,15M NaCl.

Ved en alternativ, foretrukken udførelsesform, kan det ved 10 den ovenfor beskrevne fremgangsmåde fremstillede interferon renses ved følgende trin: 1. Frosne cellepellets, som indeholder det udtrykte leuko-cytinterferon, opbrydes manuelt eller med et hensigtsmæssigt 15 størrelsesreduktionsudstyr. De delvist optøede celler suspenderes i 4 volumener puffer A, som indeholder 0,1M tris indstillet til pH-værdi 7,5 - 8,0, 10 vægt/volumenprocent saccharose, 0,2M NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 mM PMSF og 10 - 100 mM MgCl2. Suspensionen holdes ved ca. 4°C.

20

Suspensionen føres gennem en homogenisator ved ca. 41 mPa efterfulgt af en anden passage ved mindre end ca. 7 mPa. Ef-fluenten fra homogenisatoren fra begge passager afkølet i et isbad.

25 2. Polyethylenimin sættes langsomt til homogenisatet til en koncentration på ca. 0,35% og lades henstå i ca. 30 minutter. Det faste stof fjernes ved centrifugering eller filtrering. Dette trin temperaturreguleres eller foretages til- 30 strækkeligt hurtigt til, at supernatanten (filtratet) holdes ved under 10°C. Supernatanten (filtratet) koncentreres ved ultrafiltrering til ca. 1/10 af det oprindelige volumen.

DK 173543 B1 50

Partikelformet stof eller uklarhed i retentatet kan fjernes ved et hensigtsmæssigt filter såsom en mikroporøs membran.

3. Den klarede opløsning anbringes direkte på en monoklonal 5 antistofsøj le ved en strøm på 5 - 8 cm/h (f.eks. 25 - 40 ml/h på en søjle med diameter 2,6 cm). Efter anbringelse vaskes søjlen med ca. 10 søjlevolumener 25 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5 - 8,5, indeholdende 0,5M NaCl og overfladeaktivt middel såsom "Triton" X-100 (0,2%) eller ækvivalent. Efter 10 vasken skylles kolonnen med ca. 10 søjlevolumener opløsning indeholdende 0,15 M natriumchlorid og overfladeaktivt middel såsom 0,1% "Triton" X-100 eller ækvivalent. Søjlen elueres med 0,2M eddikesyre indeholdende overfladeaktivt middel såsom "Triton" X-100 (0,1%) eller ækvivalent. Proteintoppen 15 fra den monoklonale antistofsøjle (bestemt ved UV-absorbans eller andet hensigtsmæssigt assay) kombineres, og pH-værdien indstilles til ca. 4,5 med IN NaOH eller 1,0M trisbase.

4. Den kombinerede interferontop anbringes på en kation- 20 bytter såsom "Whatman CM52" cellulose eller ækvivalent, der er ækvilibreret med en puffer såsom 50 mM ammoniumacetat (pH-værdi 4,5). Efter anbringelsen vaskes søjlen med ækvi-libreringspufferen, til effluentens UV-absorbans har nået et plateau, så at kun lidt yderligere protein elueres fra søj-25 len. Søjlen elueres derefter med 25 mM ammoniumacetat/0,12M natriumchlorid eller en kombination, som optimerer udvindeisen af interferon og giver lyofiliseret kage, som har tilfredsstillende udseende og opløsningsegenskaber.

30 De monoklonale antistoffer, der anvendes ved den foretrukne udførelsesform beskrevet ovenfor, kan fremstilles ved de fremgangsmåder, der beskrives af Staehelin et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7j), 1848 - 52 (1981). Monoklonale DK 173543 B1 51 antistoffer renses og bindes covalent til "Affigel-10" som beskrevet nedenfor:

Fremstilling og rensning af monoklonale antistoffer fra 5 ascitesvaeske.

Fem Balb/c-hunmus inokuleres hver med 5 - 10 x 106 hybridom-celler fra den midtlogaritmiske vækstfase. Ca. 5 x 106 levende celler fra musen, der fremstiller væske, inokuleres in-10 traperitonealt i hver af 10 eller flere mus. Ascitesvæsken opsamles gentagne gange (2-4 gange) fra hver mus. Op til tre overførsler og opsamlinger kan udføres fra en gruppe mus til den næste. Ascitesvæsker fra mus ved hver overførsel kombineres.

15

Celler og nedbrudt materiale fjernes fra ascitesvæsken ved lavhastighedscentrifugering (500 - 1000 x g) i 15 minutter. Derefter udføres centrifugering i 90 minutter ved 18.000 rpm. Supernatanten fryses og opbevares ved -10°C. Efter optø-20 ning fjernes yderligere fibrin og partikelformet materiale ved centrifugering ved 35.000 rpm i 90 minutter. Portioner af ascitesvæske fra hver overførsel testes for specifik antistofaktivitet ved et fastfaseantistof-bindingsassay (Staehelin et al., supra) og kombineres, hvis de findes til-25 fredsstillende.

Koncentrationen af protein i de kombinerede opløsninger estimeres ved den tilnærmelse, at 1 mg protein giver en ab-sorbans på 1,2 ved 280 nm i en cuvette, ved en vejlængde på 30 1,0 cm. Ascitesvæsker med høje antistofniveauer indeholder 30 - 35 mg protein/ml. Dette er ækvivalent med ca. 4 - 7 mg specifikt antistof/ml. Væsken fortyndes med PBS (0,01M na- DK 173543 B1 52 triumphosphat, pH-værdi 7,3, 0,15M NaCl) med en proteinkoncentration på 10 - 12 mg/ml.

Til hver 100 ml fortyndet opløsning sættes 90 ml ved stue-5 temperatur mættet ammoniumsulfatopløsning langsomt under kraftig omrøring ved 0°C. Suspensionen holdes i is i 40 - 60 minutter, centrifugeres derefter i 15 minutter ved 10.000 rpm ved 4°C. Supernatanten fradekanteres og drænes godt. Proteinpellets opløses i 0,02M tris-HCl (pH-værdi 7,9)/0,04M 10 natriumchlorid (puffer I). Proteinopløsningen dialyseres i 16 - 18 timer ved stuetemperatur mod 100 volumener puffer I med mindst én udskiftning af pufferen. Den dialyserede opløsning centrifugeres ved 15.000 rpm i 10 minutter til fjernelse af uopløst materiale. Ca. 30 - 35% af den oprindelige 15 totalmængde protein i ascitesvæsken udvindes som estimeret ved absorption ved 280 nm.

Opløsningen, som indeholder 30 - 40 mg protein pr. ml, føres derefter til en søjle af DEAE-cellulose ækvilibreret med 20 puffer I. Et kolonneleje på mindst 100 ml anvendes for hvert g påført protein. Antistoffet elueres fra søjlen med lineær NaCl-gradient indeholdende 0,02M tris-HCl, pH-værdi 7,9, fra 0,04M til 0,5M NaCl. Kombinerede spidsfraktioner elueret med 0,06 og 0,1M NaCl koncentreres ved udfældning med et lige så 25 stort volumen ved stuetemperatur mættet natriumsulfat og centrifugeres. Proteinpellets opløses i 0,2M NaHCCh (pH-værdi ca. 8,0)/0,3M NaCl (puffer II) efterfulgt af dialyse mod tre udskiftninger af samme puffer ved stuetemperatur. De dialyserede opløsninger centrifugeres ved 20.000 x g i 15 minut-30 ter til fjernelse af uopløseligt materiale. Proteinkoncentrationen indstilles til 20 - 25 mg/ml med puffer II.

DK 173543 B1 53

Fremstilling af immunoadsorbanter.

"Affigel-10" (BioRad Laboratories, Richmond, California) vaskes på et sintret glasfilter tre gange med iskoldt isopro-5 panol efterfulgt af tre gange vask med iskoldt destilleret vand. Gelopslæmningen (ca. 50% i koldt vand) overføres til plastrør og sedimenteres ved en kort centrifugering. Super-natanten opsuges. Den mærkede gel blandes med et lige så stort volumen renset antistofopløsning og roteres over en-10 derne ved 4°C i 5 timer. Efter omsætning centrifugeres gelen, vaskes to gange med puffer III (0,1M NaHCO3/0,15M NaCl) til fjernelse af ukoblet antistof. Proteinbestemmelse af de forenede vaskevæsker afslører, at mere end 90% af antistoffet er koblet til gelen.

15

For at blokere uomsatte steder, blandes gelen med et lige så stort volumen 0,1M ethanolamin-HCl (pH-værdi 8) og roteres over enderne ved stuetemperatur i 60 minutter. Gelopslæmningen vaskes fri for reaktanter med PBS og lagres i PBS i nær-20 værelse af 0,02 vægt/volumenprocent natriumazid ved 4°C.

N. Parenteral administration.

LeIF kan administreres parenteralt til personer, som kræver 25 antitumor- eller antiviral behandling og til sådanne, som udviser immunosupressive tilstande. Dosis og dosishastighed kan være parallelle til dem, der for øjeblikket anvendes ved kliniske undersøgelser af humant afledte materialer, f.eks. ca. 1 - 10 x 106 enheder daglig og for materialer med en ren-30 hed større end 1%, sandsynligvis op til 5 x 107 enheder daglig.

Claims (46)

1. Modent humant bakterielt fremstillet leukocytinterferon, kendetegnet ved, at det består af 165-166 amino-30 syrer og indeholder Cys-Asp-Leu i stillingerne 1, 2 og 3 eller består af 166 aminosyrer og indeholder Cys-Asn-Leu i stillingerne 1, 2 og 3, og et sådant modent leukocytinterferon med en yderligere methioninrest ved N-terminalen. DK 173543 B1 55

2. Interferon ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af 165 aminosyrer med Cys-Asp-Leu i stillingerne 1, 2 og 3 og Asp i stilling 5 144 eller af 166 aminosyrer med Cys-Asn-Leu i stillingerne 1, 2 og 3 og Glu eller Val i stilling 114 eller Cys-Asn-Leu i stillingerne 1, 2 og 3 og Glu i stilling 114.

3. Interferon ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at det består af 166 aminosyrer med Met i stilling 1, Cys-Asp-Leu i stillingerne 2, 3 og 4 og Asp i stilling 115 eller af 167 aminosyrer med Met i stilling 1, Cys-Asn-Leu i stillingerne 2, 3 og 4 og Glu eller Val i stilling 115 eller Cys-Asn-Leu i stillin- 15 gerne 2, 3 og 4 og Glu i stilling 115.

4. Interferon ifølge krav 1-3 indeholdende den partielle aminosyresekvens

5. Modent humant leukocytinterferon A (LeIF A), kendetegnet ved aminosyresekvensen Cys Asp Leu Pro Gin Thr Hfs Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Mel Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys 25 Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ata Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu tie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu. som vist i Fig. 4A. DK 173543 B1 56

6. Modent humant leukocytinterferon B (LeIF B) kendetegnet ved aminosyresekvensen 5 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Asp Lys Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr Phe 10 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Asp Glu Thr Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Val Leu Cys Asp Gin Glu Val Gly Val Ile Glu Ser Pro Leu Met Tyr Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin ^ Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Ser Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Ile Asn Leu Gin Lys Arg Leu Lys Ser Lys Glu^ som vist i fig. 4. 20

7. Modent humant leukocytinterferon C (LeJF C) kendetegnet ved aminosyresekvensen Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Gly Gin

8. Modent humant leukocytinterferon D (LeIF D) kendetegnet ved aminosyresekvensen 5 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gl.n Phe Gin Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gin Gin He Phe

9. Modent humant leukocytinterferon F (LeIF F) kendetegnet ved aminosyresekvensen Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu. Gly Asn Arg Arg Ala Leu lie Leu Leu Ala Gin «I

10 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gin Gin Met Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser 15 Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp. som vist i fig. 4.

10. Modent humant leukocytinterferon H (LeIF H) kendetegnet ved aminosyresekvensen 5 Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu Asn Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Met Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Met Gin Gin Thr Phe

10 Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gin Glu Glu Arg Vai Gly Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg lie Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu^ . som vist i fig. 4. 20

11. Humant leukocytinterferon, 20 kendetegnet ved en aminosyresekvens ifølge et hvilket et hvilket som helst af kravene 5-10 med en yderligere methioninrest ved aminoterminalen.

12. Humant leukocytinterferon ifølge et hvilket som helst af 25 kravene 1-11 fremstillet bakterielt.

13. Humant leukocytinterferon ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 fremstillet af E. coli.

14. DNA-Sekvens, der koder for et humant leukocytinterferon ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11. DK 173543 B1 59

15. DNA-Sekvens ifølge krav 14, valgt fra gruppen bestående af sekvenser B, C, D, F og H i fig. 3 og sekvens A i fig. 3A.

16. DNA-Sekvens ifølge krav 14 eller 15 operabelt bundet med en DNA-sekvens, der er i stand til at fremkalde udtrykning af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 i en bakterie.

17. DNA-Sekvens ifølge krav 14 eller 15, operabelt bundet til en DNA-sekvens, der er i stand til at bevirke udtrykning af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 i E. coli.

18. Replicerbar udtrykningsbærer, der i en transformeret bakterie kan udtrykke et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

19. Replicerbar udtryksbærer ifølge krav 18, der i en trans-20 formeret E. coli kan udtrykke et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

20. Replicerbar udtrykningsbærer ifølge krav 18 eller 19, hvilken bærer er et plasmid. 25

20 Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser.

21. Plasmidet PLeIF A trp 25 omfattende E. coli-trp-promoto-ren og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder for LeIF A.

22. Plasmid PLeIF B trp 7 omfattende E. coli trp-promotoren og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder for LeIF B. DK 173543 B1 60

23. Plasmid pLeIF F trp 1 omfattende E. coli-trp-promotoren og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder for LeIF F.

24. Plasmid pLeIF C trp 35 omfattende E. coli-trp-promotoren og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder for LeIF C.

25. Plasmid pLeIF D trp 11 omfattende E. coli trp-promotoren 10 og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder for LeIF D.

25 Met Gly Arg He Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala He Ser Val Leu His Glu Met He Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gin Gin Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val He Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro 30 Leu Met Asn Val Asp Ser He Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu He Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Lys lie Phe Gin Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu. som vist i fig. 4. 58 DK 173543 B1

25 Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Arg Ile Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Gin Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro 30 Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val-Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp^ som vist i fig. 4. 57 DK 173543 B1

26. Plasmid pLeIF H omfattende E. coli-trp-promotoren og under kontrol af denne promotor nucleotidsekvensen, der koder 15 for LeIF H.

27. Bakterie, der er transformeret med en bærer ifølge et hvilket som helst af kravene 18-26.

28. Stamme af E. coli transformeret med en udtryksbærer ifølge et hvilket som helst af kravene 18-26.

29. E. coli K-12-stamme 294 transformeret med en udtryksbærer ifølge et hvilket som helst af kravene 18-26. 25

30. E. coli K-12-stamme 294 ifølge krav 29 transformeret med pLeIF A trp 25.

31. Farmaceutisk præparat indeholdende en terapeutisk effek-30 tiv mængde af et modent humant leukocytinterferon ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 og en bærer, der er egnet til farmaceutisk administration. DK 173543 B1 61

32. Farmaceutisk præparat ifølge krav 31 indeholdende en terapeutisk effektiv mængde af et modent humant leukocytinter-feron-A ifølge krav 5 eller 11 og en bærer, der er egnet til farmaceutisk administration. 5

33. Farmaceutisk præparat ifølge krav 31 eller 32 til parenteral administration.

34. Anvendelse af forbindelserne ifølge et hvilket som helst 10 af kravene 1-11 til fremstilling af farmaceutiske præparater.

35. Anvendelse ifølge krav 34 af det modne humane leukocyt-interferon-A ifølge krav 5 eller 11 til fremstilling af far- 15 maceutiske præparater.

36. Anvendelse af DNA-sekvenserne ifølge et hvilket som helst af kravene 14-17 i den mikrobielle fremstilling af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11. 20

37. Anvendelse af en udtryksbærer ifølge et hvilket som helst af kravene 18-26 i den bakterielle fremstilling af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

38. Anvendelse af en bakterie ifølge et hvilket som helst af kravene 27-30 til fremstilling af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

39. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 30 anvendt til behandling af tumorer og virale infektioner eller til fremstilling af farmaceutiske præparater, der kan anvendes til en sådan behandling. DK 173543 B1 62

40. DNA-sekvenser ifølge et hvilket som helst af kravene 14-17 anvendt til den mikrobielle fremstilling af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

41. Udtryksbærer ifølge et hvilket som helst af kravene 18-26 anvendt i den bakterielle fremstilling af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

42. Bakterie ifølge et hvilket som helst af kravene 27-30 10 anvendt i fremstillingen af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

43. Fremgangsmåde til fremstilling af et humant leukocytin-terferon ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, hvil- 15 ken fremgangsmåde omfatter, at en kultur af en bakterie, der er transformeret med en replicerbar udtryksbærer, der kan udtrykke polypeptidet, bringes til at gro og udtrykke poly-peptidet, og dette polypeptid udvindes.

44. Fremgangsmåde til fremstilling af bakterier, der er i stand til at udtrykke et humant leukocytinterferon ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at en bakterie transformeres med en replicerbar udtryksbærer, der kan udtrykke polypeptidet, 25 og den transformerede bakterie dyrkes.

45. Fremgangsmåde til fremstilling af en replicerbar udtryksbærer, der i en transformeret bakterie er i stand til at udtrykke et humant leukocytinterferon ifølge et hvilket 30 som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at der konstrueres en første DNA-sekvens, der koder for dette polypeptid, og det første DNA-fragment bindes operativt til en anden DNA-sekvens, der er i DK 173543 B1 63 stand til at bevirke bakteriel udtrykning af dette poly-peptid.

46. Fremgangsmåde ifølge krav 43 til fremstilling af et mo-5 dent humant leukocytinterferon-A ifølge krav 5 eller 11/ kendetegnet ved, at en kultur af E. coli, der er transformeret med pLeIF A trp 25 ifølge krav 21, bringes til at gro og udtrykke dette polypeptid, og polypeptidet udvindes .