JPS58501543A - ヒトインタ−フエロン蛋白とヒトインタ−フエロン蛋白に対する抗体に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインター７エレン蚤自とヒトインｐ−７エロンｉ白に＊ｆる抗体に関する改 良 国際特許出＠′ＭＰＣＴ／ＤＫ８０１０００２４号は純粋なヒト油製インターフ ェロン蛋白、その蛋白に宵する抗体、および純粋なと）Ｌｏｇインターフェロン 嶽白蛋白る方法【開示している。〔５１１１イ：ＩＩ　７エ’ＥＸン命４法委員 会（Ｉｎｔｅｌ”ｎａｔｉｏｎａｌ工ｎｔｅｒ−ｆｅｒＯｎ　ＮＯｍｅｎｃ工ａ ｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　）によれと、ヒトＬ、ｅ１１インターフェロン に推ａされる命痴は現在ＨｕｌＦＮ−ａ蛋白である。

従ってこの明細書と請求の範囲ではこの命４【用いる。〕この明細書に用いられ ４ｓ蚤白１という用語には１糖飯白（ｇｌｙａｏｐｒｏｔ、ｅｉｎ　）　’が會 オれる。

国際特許＃１願第ＰＣＴ　／　ＤＫｓｏ　／　ｏｏｏｇ＊号において、純粋のＨ ｕｌＦＮ−ａの蛋白は定義されたＳＤＳ　ＰＡＧＥ系における次のような挙動で 特徴づ叶られた。すなわち、約Ｉ　Ｘ　１０＠単位のＨ釦−ＦＮ−ａ蛋白【単一 のスロットに負衝すると、抗つィ〜ヌ性イン！−７エロン活性を有する６つの染 色バンド：すなわチ１８，４１０〆ｐトンと厄μ８０７〜トンの強いバンド、釦 、ｎａｏダ〜トンの中位に！１ｉｉｌいバンド、および１９，５００ダルトンと ａｍ、１３０　／Ａ／　）　：／　（！：部４４０ダμトンとのようやく内服で 見えるバンドとして現われ（このメルトン分子量紘％２００ダ〜トンの実験＃を 度を有する）、抗りイＩス性インター７二ロン活性のピークは染色された蛋白の バンドと正確に一層し、該ＳＤＳ　ＰＡＧＥアタリ〜アミド弧斜法は％に他の染 色蛋白領域【示さなかった。

■ｌＩ籍許出願ｉｌｌ　ＰＣＴ　／ＤＫａｏ　／　ｏｏｏｇｉ号紘上記の染色シ タＳＤＳ　ＰＡＧＥ　Ｏ＆１ＦＮ−＆バンドの各々に宵して免疫化することによ って抗体を得る方法も開示している。

−ｒＩｋ特許出願第ＰＣＴ　／　ＤＫｓｏ　／　ｏｏｏれ号に開示された極めて 単純で便利なひとつ０Ｉｌｌ製系、すなわちゲ１４Ｉ濾過方法と、純粋のＨｕｌ ＦＮ−ａ蛋白に宵して主成した抗体【用いる抗体親和性りｐマトグ２フイとの組 合わせを利用して、個々の純粋なＨｕｌＦＮ−ａｔ白にりいてさらに研究し九結 果、純粋のインターフェレン蛋白製剤は、４１に分離用に適応させ九ひとつのＳ ＤＳ　ＰＡＧＥ法に付したところ、■Ｗｋ畳許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８０１０ＯＯ １ｉ！番号に開示されたパターンよりも一層１ｐｉｉｉなひとりのバンドパター ン（籍にインター７二−ン彊白類だけからなる）が得られることが見出された０ ”１”ある。

この一層１’ｉ　ＩＩ　ｔ　Ａ／−ンＢ、ヒト系（例えばｍｏ−０８１１８４し くはＵ−Ｃｅｌｌｓ　Ｖｔ使用）において航つィ〜ス活性（種々のグレードであ るが）を有する１３の別個の染色蛋白バンドからなっている。さらにヒの岡じ１ ３の種は、クシ系（ＫｂＴｒ−Ｃｅｌｌｓｔ使用）においても種々のグレードの 活性【有することが見出された。ｉｉ＊＊許出願第ＰＣＴ　／ＤＫａｏ　／　ｏ ｏｏｍ４号で開示された種のすべて【含有する溶出液オたは約１８Ｆ４１０　Ｉ Ｎ　）ン０１１に宵して膨或した抗体ｔＭい九Ｗ＃に得られ九同有の複数の種の ひとツ（１６，６００’ダＩＷトン’）が牛革（１ｆｆｉＴｒ−Ｃｅｌｌｓ使用 ）中で著しく高い活性【示し、ヒト系でははとんど無視しうる＆ｉｌＬの活性し か示さない〔すなわち、この種の７２クシ曹ンは牛革で紘５０Ｑ、０００率位【 超えて得られるがヒト系ではわずかに数千単位しか得られない。このように非常 にりないので、ゲ＃Ｐ＊法の不正確なス２イＶング（ｓｌｉｏｉｎｇ）　Ｋ　Ｅ ｔ３米するのではないかとさえ考えられる（実験進行中）〕ということは＃ＩＩ 啄深いことである。結局、分子量が約ｔｏ、ｏ　ｏ　ｏダルトンよシ減少すると 種々の種について牛系活性（ｂｏｙ’−ｎｅａｃｔ１ｖ立ｔｙ　）が増大すると いう一般的傾向があるということが見出された（これと關連して次のことｔ注記 する。すたわち、国際特許出願第ＰＣＴ　／ＤＫ８０　／　０００１８４号に定 義さｔＬティるＳＵＳ　ＰＡＧＥ　法は分子量測定に適切なものであるとＩめら れている傾斜ゲμ法であるが、一方この発明による新しいに発に用いられたＳＤ Ｓ　ＰＡＧＥ法は分離に適応させ九方法である。それ故この新しい方法で測定さ れる１分子量＃紘、同一の種の以前０７Ｆ法による分子量とはある程度興なるこ とがある。このため、新しい方法で測定されたｆμトン分子量の命名社１〆μト ン”のように引用＊１付して記載する）。ゲｐｖＰ’Ａ法と、１へ４１０ダｐト ン種もしくは一際特許出願第ＰＣＴ　／ＤＫｓｏ　／　０００２４号に開示され た全蛋白含有の溶出液に鳶して生成した抗体を用いる抗体親和性クロマトグラフ ィによって上記の如くＩＩ−飯されたインターフェロン蛋白についてこの明細Ｉ Ｋ記載の新規な研究によって、もとＣ）　１ａ４１０　／〜トン０種が新ＳＤＳ 　ＰＡＧＥ法（この明細書の“材料と方法′の項に記載）によって分離しうる夕 なくと′４ｈ３〜４の成分からなることが分かった。

もつとも注目すべきことは、ｍｍされたインター７二四ン灸剤中に見絢され友全 インターフェロン飯臼の約４０％は生糸においては極めて＾い抗ウイルス活性【 示すがヒト系においてはほとんど無視しうる活性しか示さない上記１６，６００ 　’メ〜トン′種の場所に位置しているということである。また１ｉｌＩ４１１ Ｗ！ｆ出願＠　ＰＣＴ　／　ＤＫｓ　ｏ　／　ｏｏｏ　５ｔ４９に記載Ｃ）　ａ Ｑ、４ｊｌＯ１１Ｍ　）　ンによび＾４４０ダμトンの種に対する抗体、並びに ごく一般的に、ｌａ、４１０１１４／　）ン以上のいずれの種に対する抗体もこ の牛のＩＩ（ｂｏｖｉｎｅ　５ｐｅｃｉｅｓ　）　ｔ−中和しない（もしくは極 めて低い１ｉｌＬにこの１１ｔ″中和する）ことも極めてｐ４啄深いことである 。このことは、１６，６００　’ダルトン“以上Ｏいずれか０Ｉ１１０対する抗 体を用いる抗体親和性り胃マトグ２フイにおいて、牛の種は上記溶出液には見出 されないということ【意味する。したがってこの発明によれは、牛の種を、ヒト 系と生爪の両者に活性を有する他の種からＷＳ＊することがで龜る。

このｉ＃１明の１分離に用いられるＳＤＳ　ＰｍＥ法に、合計４百万〜５百万］ ＪＵのインターフェロンを負荷した結果、純粋のＨｕｎＦＮ−＆蛋白が１３０Ｊ ｋ色最白のバンドを示し、すべて抗ウィルスインターフェロン活性【膚し、バン ドは、１６，６００．１６，９８０　。

１フ、３８０　、　１７，５８０　、　１〜４１０．　１８，８４０　、　１９ ，０５ｏ　、　１９．ａｏｏ　、Ｋｒ４Ｂｏ　、鳩８９０．１ｉ１１，３８０、 ｔａｘ、ｓａｏ％＊ヨびｇｊ！、９１ｏ　’ＩＩ＆　）　ン“〔１メμトン′分 子量はこの明細書のひとつの方法（ζ０１ｊ’１ｌｉｌＯ”材料と方法“の項に 記載）に従う〕に現われ、特に他の染色蛋白Ｉｌｌ滅を示していない。

個々のＨｕｌＦＮ　−ａ蛋白の位置ｔ−３１１図に、種々のインター７エ四ン試 験法で各蛋白について測定した抗つイ〜スイン／−７エ胃ン活性【第２図に示し た。

衿表昭５８−５０１５４３（５） ｊｌｌＷＡＫｘｓバンド全部の相対強度【記録した。ｌＳの７ツタＶｗン紘すべ て、３りのヒト細胞系とひとりＯ牛細ｍ系とからなる４つの異なり死細胞系で滴 定された。ヒト細胞は■ｘｏ−ｃｅ　−１ｌｓ％Ｕ−Ｃθ−ｕ８および圓−Ｃｅ ｌｍｓであシ、使用した生細胞はＥｂＴｒ　−Ｃｅ１ｌｓであった。ＶＳＶ　（ ｖｅｓｉｏｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｊ−ｔｉｓｖｉｒｕｓ　：水庖性口炙ウィル ス）が４つの細ｉｉｔ＋系全部に対する誘発ウィμスとして使用され九。６フラ グメントスライス（５ＤＳＰＡＧＥからの）ｔ４′：）の系金郁において滴定さ れた。それぞれのインターフェロン力価【第２図に示した。示されているように 、１３の７２クシ冒ンはすべて、種々のヒト系で測定されたヒトインター７エ胃 ン活性に＃夕とも関連する顕著な牛インＩ−７エロン活性【有する。しかし、　 １６，６００　’ダルトン“の見掛けの分子量（ａｐｐａｒｅｎｔ　ｍｏｌｅｏ ｕｌＬｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　）　（−有する第１ｇ７ツクシ冒ンは、ヒト系ではは とんどインターフェロン活性を有していな匹。特にそのヒト活性を最重量と北咬 したと！にそうである。３３１図において第１号と８号のスライスは互いに近接 していることは明らかである。これらふたつのスライス聞の実際の間隔は約Ｉｍ である。したがって第１＠スライスの／）量のインター７エ胃ン活性は、全く純 粋なスライス【得ることはｔｉｎなので第２号スライスから主じているのか４ｍ れないと考えることもできる。第１号ス２イスＯ牛活性【その景白會有量と比較 すると、牛インターフェロン活性の量と最重量との間には十分一致しているよう である。したがってこのこと唸賂１号フックシ曹ンはヒト白血球系中でＪｌ主さ れた（もしくは退化によって生成し九）牛の種だけで構成されているということ ｔ示唆しているようである。先に記載したゲＡ／＃５過されたヒト白血球インタ ーフェロンは、上記のｌｉｔ、４１０ダμトンの種と相似の２１８８ｏ　＊　／ ルトン“ＯＩＩでラビット【免［：にすることＫよって得られた抗体【用いる抗 体カラム【使用して精製すると、牛の種がなくなっている（もしく紘極めて少量 だけ存在している）ことｔ−除いて、類似の蛋白とインｊ’−７エ鴛ンプロファ イｌｖが得られる。他の稙はナベて存在していることは明らかである。

このことは１６，６００の牛の種が他の１２のヒＦインターフェロン種と交叉反 応しないととｔ示している。ａりの１２の種はすべて、ヒト系活性（ｈｕｍａｎ 　ａｃｔｉｖｉｔ３ｒ　）とともにある種Ｏ牛系活性（ｂｏｖｊ−ｎｅ　ａｃｔ ｉｖｊ−ｔｙ　）　ｔ−有しティることも注目すべきであろう（Ｊｌｌ！２図参 ｊｌ）。またｊｉ２図は、低分子量の生糸活性の上記一般債向【示している。す なわち生糸活性は、見掛けの分子量が減少するＫつれてヒトインター７エｐン活 性ｔＷ少させて増加することを示している（ｊ１５．４，３、ｊｉ）よび１号ス ライス参Ｉｔ）。

目下のところ、ＨｕｌＬＦＮ　−ａ製剤中に牛の種が存在するということは何を 意味するかということは知られていない。いくつかの可能性が存在する。ひとつ は１６．６００　’ダルトン”ｔｈａｎのＩｇの種の蛋白質加水分解に白米する ということである。しかし、１２０ｆＫのどれもが、分解して分解生成物として ひとつの単一蛋白を生威しそうで絋ないので、上記のＷ陽性はない。現在、この 牛の種がヒトインターフェロン系に先物学的機能ｔ−査するかどうかは知られて いない。ヒト白血球インターフェロンが生糸活性（いわゆる交叉活性）【有する ということはすてに記述されティる（　Ｇｒｅｓｓｅｒ、工、、　ＢａｕＣＩＪ ｌ、　Ｍ、　Ｔ、、　Ｂｒ０ｕｔ、７−；５ｏｙｅ、Ｄ、、　Ｔｏｖｅｙ、Ｍ、 、（１９７４）：　Ｐｒｏｎｏｕｎｏｅｄ　ａｎｔｉｖｉｒａｌａｏｔｉＴｉｔ 、７０ｆ　ｈｕｍａｎ　ｘｎｔｅｒｒｅｒｏｎ　ｏｎ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄ　 ｐｏｒｃｌｎｅｏｅｕｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　ｇ５１．５４５−５４５）ｏ　ｔた Ｂｒａｕｄｅ　、工、Ａ、、Ｌｌｎ。

Ｌ、　Ｓ、、　ｓｔｅｗａｒｔ、　ｗ、　Ｅ、　ｉ奮む他の著者による、（１９ ８１）１８０ｍ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｉｏｌｏｇｉＣＩａ工ｌｙ　ａｃｔｘ ｖｅ　ｆｒａｇｍｆ３ｎｔ　Ｏｆ　ｌｍ１ＦＮ−ＪｂＴ、ｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅ ｄ、　１．１２４５〜２５１にもヒト白血奪インターフェロン紘牛系活性を有す ると記載されている。この発明によるひとつの重要な発見ｄ、１６，６００　’ ｆ〜トン’　０ｌｉｔ−他のヒトの種と全く異なるインターフェロン種として区 分し特徴づけうるということ、すなわち１６，６００　“ダμトン＃Ｏ種は他の ＆ＬＩＦＮ　−ａ種とは免疫学的に別個のものであるという事寮である。１６． ６００１ダ〜トン“のこの＋糸種は先物学的活性ｏ５２定化／発現ＫＭして重要 であろうという見解を支持する寮験結来がある（進行中の実験）。

この発明のひとつのｍ嫌によれば、ｇｌ、ｓａｏ　’／μトン“の種に財する抗 体カラムは顕著なヒト系活性を有する１２のｌ１ｔ−識別するだけであるが、１ Ｂ、４１０ダμトンの種に賞する抗体カラムは１３０種すべてｔｌｌｋ別すると いうことは、伐すの１２の種から例えば次のようにして生糸ｏｓｉｔ単離するの に利用することがで自る。すなわちＦＩ６百万単位Ｏ粗白血球インＰ−７エ藁ン 【ゲ＃Ｐ’ｉｊ４　Ｌ、ＰＢＳに宵して透析し死後、そのインタ−７エｑン社抗 １鶴４１Ｑｌ、Ｉｌ＆／トンカツムを連結した抗ｇｌ、８８０　’ダ〜トン〃カ ラムからなるＩンデムオラム系に負荷される。ナベてのヒトインター７エｐン活 性は抗社、８８０カラムで捕集されるが牛系活性は抗社、８８０カラムを通過す る。抗−１８，４１０力２ムは牛の暑を捕集する。このにつのカラムｔ９：Ｉｎ はなし洗滌し別個に溶離する。ｉｌｌ、８８０のＩ［Ｋ）ｔするカラムからは、 １〜１２のインターフェロン種がナベて回収され、ｌ鈎４１０の力２ムからは１ ６，６０００ダ〜トン“の見掛けの分子量を有する牛の種だ妙が回収される。

１２のヒトの種のそれぞれと牛の種とはいずれも、ＨｕｌＦＮ　−ａもしくはＨ ｕｌＦＮ　−ｂ　ｔたはａもしくはｂの異なる形のものの作用を増大させうるか 否か、を九はこれらの種のいずれもＨ釦２７Ｎ　−ｑのひとつの作用もしくは複 数の作用【増大させるか否かＬ知られていない。

この発明のひとつの態様紘、ｗＡＷＩｋ特許出願第にＴ／ＤＫ８０１０００ｇ４ 号に開示の蛋白と岡じ場合【除いて、上記の条件下、上記パターンの条色バンド 【示すＨｕｌＦＮ　−ａ蛋白に関するものである。

また他の態様としてこの発明社、上記Ｏひとつの分子量【有するひとつの成分で あシ、抗ウイルスインターフェロン活性【有する６単−の蛋白に関する。

国際轡許出ｆｌｉｔ第ＰＯＴ／ＤＫ８０１０ＯＯ５１４号から分かるように、ヒ ドリン＊　プ’）Ｘトイド（ｎｕｍａｎ　ｌｙｍｐｈｏｌ）ｌａ８ｔｏｉ（１） す！〜バ（Ｎａｍａｌｖａ　）　Ｌｅ　ｌ１ｊＥ白紘、その約８６％ｉ）ｚ　Ｈ ｕｌＦＮ　−ａ　蛋白である。ＤＮＡ組換え技術は、Ｈ釦−ＦＮ　−ａ蛋白およ び重要なインター７エａ＞ｆ％黴づける抗原決定因子群【査する蛋白【１産する のに用いることができるということも知られている。それＩｌｒ、にこのｉ＠男 の蛋白【単一しうみインターフェロン製剤に紘、ヒト白血球インターフェロン製 剤だけでなく、この発明のｌ１ａｌＦＮ　−ＩＬ蚤蛋白のひとつ以上の抗原性【 示す蛋白を含有する他のいずれ０＊剤−食まれる。

この発ｖＡＯＩ１１橡は請求の範囲から明らかであるが、一般にこの発明のイン タ−フェレン蛋白は、Ｉｉ際特許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８０１０００８４　ｅに開 示のインターフェロン蛋白と同じ有用な目的に利用できると共に同様の仕方で利 用できる。同様に、この発明の蛋白の庄麿と精製はｍＷｋ特許出願第にＴ／ＤＫ ８０１０ＯＯ５ｉ４号に記載されたのと同様のしかたで行うことができる。

それ紋に、とＯ発明の蛋白の利用と生ＩＩＫついて一層詳細に論する丸めに、ｆ ｆ１１１４１１許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８０１０ＯＣｌａ４号の開示事項を参照と してこの明細書に挙げている。しかし、精製法については、この発明によって、 リガンドクロマトグラフィ（１１−ｇａ已ｏｈｒ（至）ａｔｏｇｒａｐｌｙ　） からなる精製段階は精製に必要ではないということが見出され、そのためゲ〜Ｆ ｊｉして得られたインターフェロン含有７２クシ曹ン【、中間のりガンドクｐ！ トグラフイを抜いて抗体親和性タロマドグラフィに１１振付することが好ましい ということ社注目すべきことである。

この発明０％別な態様によれば、この発明およびｍ際特許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８ ０１０００ｇ４号の各ＨｕｌＦＮ　−ａ種【用い”ｃ各種動物中に産生した単一 ４１異性抗体類は、放射能もしく唸―素活性に基づく免疫学的検定法（例えばＫ Ｌ工ＳＡおよびＲＸＩｔ　）　を確立するのに極めて有用である。これらの抗体 類は、インターフェロン自体Ｋｍする抗体ｌｌｌ５Ｐよび部分的に純粋なインタ ー７エｐン製剤中に存在するインターフェロンに宵する抗体類の検出に用いるこ とができる。またこれらの抗体類はインターフェロン活性を測定する分析法にも 有用である。

２ビツトのとと１動物画乗の抗体類は、ラビットの抗体類の結合性（ａｖｉｄｊ ｔｙ　）がバイブリド−ｗ　（ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ　）が駈支する抗体類の結 合性よりかな〉高いというよく知られていることを考慮すれは、これらの目的に ついてはハイプリドーマ抗体よシも一層有利であろう。

〔この発明の他のａｍによれば、２ビツトのごとき動物中でひとつの４１異的な インター７エｆｌ／ｌｉｌ剤（例えば臨床用のインターフェロン製剤【用いて） Ｋ財して臘止した抗体は、インターフェロン蛋白および間龜のインターフェロン 製剤中の汚染している蛋白に賞する抗体反応の評価を可能にし、かつ例えは、イ ンター７エ關ン製剤で治療中の患者がその製剤に対し抗体【廠主するかどうかを 決定する実験の陽性の対照（ｐｏｓｉ、ｔｉ、ｖｅｏｏｎｔｒＯｌ　）として用 いることができる。下記参照〕さらに、　皿ＦＮ　−ａ　（牛の種ｔ−除く）の １３の種のそれぞれに財して生成したラビット抗体類はＨｕｌＦＮ　−ａの１２ のヒトの撫全部に財して反応する。換言すれは、ヒト系において着しい活性を示 すｌｊａのヒ）　ＨｕｌＦＮ　−ａの種はすべて免疫学的に１００％交叉反応す るが、牛の種（１６，６００＊ダＮトンＮ）は免疫学的に別個の−のである（２ ビツト系において）。一方、牛の１１【會むインター７エ膣ン蛋白類の組合わせ たｔのに財して生成した２ビット抗体秦は、１ｉＷｋ特許出願第ＰＯＴ／ＤＫ８ ０１０００ａ４号に記載の全インターフェロン蛋白の組合わせも含めて、１３の イン／−７エロン蛋白のすべてと反応する。このことａ牛ｃｎｔ含有するか含有 していないかｔ決定する技術を設計できるという利点【与える。この発明の籍に 重要な利用面は、ヒトインターフェロン（白血球インター７二Ｅ＝＞４Ｌ＜ａｔ ｉｌ＆／バインター７エロン）ｔたは上記楓と免疫学的に文叉反応するＤＮＡ　 ｉｌ換え法白米のインターフェロン【投与されている患者を監視するためのふた つのタイプの抗体測定法への利用である（すなわち、一方には純粋なＥｕ１ｌＰ Ｎ　−ａ蛋白に対して生成した抗体【用い、他方にはＰ工Ｆに対して生成した抗 体を用いる）。かような監視は下記のとときＫＬ工ＳＡもしくはＲＩＡ技法にし たがって行われる。このタイプの組会わせた測定法を用いれば、投与されたイン ターフェロンに対する患者の反応を追跡することかで龜る。下記説明参照のこと 。かくして、ｊｋｇＩな分析を行えに１Ｌ者が投与されたインターフェロン蛋白 自体に対して抗体を産生している（　ＨｕｌＦＮ　４　Ｋｉｔ　シて生成した抗 体を用いる測定が陽性の場合）のかまたは汚染された蛋白に対して抗体ｔ−産生 している（　ＨｕｌＦＮ−ａＫ）ｉｌ、て＊ｉする抗体を用いる測定は陽性だが 、Ｐ工Ｆに対して生成した抗体を用いる測定が陽性の場合）のかｔ決定すること が可能であろう。一方、１０６〜１０’の比活性１１：（５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａ ａｔｉｖｉｔｙ　）　ノ抗原製剤（それ自体公知の方法、例えばこの出願および ｍ際特許出ｒＩｊＬ第にＴ／ＤＫ８０１０００２番号に記載の抗体技法によって 作製することができる）も使用することができる。また同様の原理はＨ釦−ＦＮ −ｐａｌ、、（は胆ＩＦＮ　−ｑｔ−含有する製剤を投与されている患者を監視 するのにも使用でき、この利用もこの発明に含まれる。

Ｈｕｕ’Ｎ　ａ　Ｋｊｔする抗体ｓｉｔ検出するのに次の方法が用いられ、Ｍｅ ｔｈｃｔｓ　Ｏｆ　Ｉｎ２１鶏０工Ｏｇ７．　Ｖｏｌ、　’ＦＯ，ｐ、　４１９ 〜４３９　（ｇｎｚｙｍｅ　ＩｍｍｕｎＯａ８８ａ３’　ＫＬ工ＳＡ　ａｎｃｌ 　ＩＭ工Ｔ、　Ｅ、　ｈ群ａｌｌ　（ｅｄｓ。

：　Ｖａｎ　Ｖｕｎａｊｃｉｓ　ａｎｄ　ＬａｎｇＯｎｅ　）　ｐｃ例が挙げら れている（目標としては他の蛋白が挙げられている）。

ＨｕｌＦＮ　−ａ　（精製された製剤が最も＊ｔＬい、比活性［１〜１００　Ｘ 　１０’単位／雫蛋白）は、ひとつの表面（例えばＮＵＮＣ放射能免疫学的検出 法用グレートのごときプラスチック０＊１ｌｉｉもしくは他の適切なマトリック ス）Ｋ例えは番″Ｃでコートされる。

茂ヤの結合サイトは、４ＮＣで１−５時開０．１％ＢＳＡ　ｌ加えて飽和させる か、またはその表面鉱蛋白かさらに結合するの【抑−」するツイン８０４Ｌ＜ａ トリトン！　−１００のようｔゆるやかな洗剤を含有する緩衝液中で洗浄される 。上記緩衝液中の抗インター７エ四ン試料（例えばインター７エｐンで＃！Ｉｌ ［ｔ″受けている患者の血詩試料）【その表面に例えば４’Ｃで３〜２０時間捩 触させる。該緩衝液で３回洗浄後、放射ｍ標識もしくは酵素標識された異なった ＩＩＯ抗工ｆＧ〔例えば７オス７アターゼ（ｐｈ０８−ｐｈａｔａｓｅ　）もし くはホース２プツシユパーオキシダーゼ（ｈｏｒ−ｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏ ｘｉ、ｄａｓｅ　）　）　０：）予め測定しておいた量を七〇＆衝液に加える。

混合物をさらに５〜２０時間例えば４＃Ｃで培養する。放射能標識された抗体を 用いる場合は、結合した放射能【標準の方法で調定する。酵素標識されたものｔ 用いる場合は、該洗剤含有の趨切な基質緩衝液（その酵素系にとって最適のｐＨ ）【用いて洗浄した表１ｉＫ、最初に関連Ｏ基質が加えられる（培！Ｉ：例えば ｉｉ！鑑で１−１４時間）。色の変化【分光光度計で測定する。色がつよく発生 すれば患者が、問題のインターフェロン、関連の不純物、−シ＜はその両者に対 して抗体【駄圧したナインとされる（上記参ｊｌ）。すべての免疫学的検出法の ように、これらの測定法線、与えられた系にバックグランド【ａ立するために適 切なコントローμ【有していなくてはならない。

使用される２つの興なる抗血清間に好ましくない交叉反応が認められる場合が非 常に＃い。これは、９％真性のパックグランドを生じさせる抗原の適切な溶液【 単に添加することによって避ゆることができる（例えは、羊の免疫グロブリンを 除いた血ａｔラビット抗インターフェロン血貴などに添加してもよいし、または 免疫グロブリン【除いたヒト血ａｔラビット航インターフェロン血貴等に添加し てもよい）。

該表面【抗原（すなわち比活性度が１〜１００　Ｘ　１０’率位／キ蛋白の精製 インターフェロン）で；−ティングする代シに、１２重層“技法【用いてもよい 。すなわち、オず第一に該表面【約１１９　／　ｄ　Ｏ適切な工、Ｇ　％液【用 いて、抗Ｈｕ工ｙＮ−ａ４Ｌ＜は抗Ｐ工Ｆ（ｓ分的に精製されたインターフェロ ンに対して生成した抗血清、下記１材料および方法“参照）でコートされる（あ る場合には抗血清が適切なときがある）。この抗体で；−卜された表面は関連の インターフェロン製剤と反応させ、洗浄畿、抗イン／−７エｐン會有試料【抗体 が結合された抗原（インターフェロンを奮む）と反応さぜ、さらに上記の操作【 行う。

ｍ１ＦＮ　−ｂ−もしくはＨｕｌＦＮ−ｑ−抗原決定因子群（ａｎｔｉｇｅ−ｎ ｉｃαｅｔθｒｍｉｎａｎｔ　）　ｔ−含有する製剤の免疫学的反応を査定する 測定は極めてＪｌ似した仕方で行われる。

この発明の特別のａ様によれは、抗体親和性クロマトグラフイカ２ムに宵するイ ンＩ−７エｐン含有溶液の負荷は、標準のｐＨ７、ｇ［′Ｍ此してｂ−グのｌ） ＭＥで行われる。この低いｐＨにおいて娘、抗体親和性タロマトダ２フィカッム Ｋｊｌするインター７二酊ンの納会がわずかにゆるいので、その結果１物学的イ ンターフェロン活性の高い回収率が期待される。

この発明の他のｆｌｉｍ（所菫によｐ１上記の低ｐＨでの負荷と組会わすことが できる）Ｋよれは、マトリックスへの抗体のカップリングは、結台容１（ｂｉｎ ｄｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ　）　ヘｆ４１を与よりことなしにわずかに可逆的 に変性する条件下、例えば４〜８ＭのＲ素中、特に４〜６Ｍの尿素中、好ましく は４〜５Ｍの尿素中で行われる。免疫グロブリン【かように可逆的に変性すると 、その結果その後の抗体親和性クロマトグラフィにおいて問題の抗１［（例えに インターフェロン）の結合がゆるくなル、抗原が高い回収率で得られる（例えば より高いインターフェロン活性の回収）ということがみとめられる。この明細書 で１変性＃　（αｅｎａｔｕｒａｔ１ｏｎ　）という用語線、自然状態では小球 状蛋白として存在する免疫グロブリンが実質的にｔ重どかれる（　ｕｎｃｏｉｌ ｅｄ　）現象ｔ−を味する。この発明のひとつＯｗＡ様としてこの変性は可逆的 変性として行われる。これははどかれた蛋白が変性剤【除くとその自然の形態に 実質的に灰ることができること【意味する。可逆的変性用に有用な変性銅線、４ 〜ＢＪＥ＊０所定の範囲Ｏ尿素、４〜８％〜の複酸グアニジンのような尿素誘導 体、ＫＳＣＮなどである。免疫グロブリン【可逆的に変性する方法線知られてい るが、抗体親和性クロマトグラフィカラムに免疫グログリン【結合させる閲にそ の免疫グロブリンを可逆的に変性し、その後変性剤を除いてからカラム七使用す ることは新規であると信するものである。

部分的もしくは可逆的な変性の子息される有利な効果は、はどかれたすなわち変 性された免疫グロブリンは実質的にはどかれたすなわち線状の形態でマトリック スに結合するということである。そしてこの形態によって、変性しなければかく されていたいくつかの結合サイトが！トリックスＫｉｔしてさらされ、その結果 免疫グロブリンを、マトリックスに一層！！ｉ！［ＩＫＭ会畜せるとともに問題 の抗原に宵しいくぶんゆるやかだが充分しっか夛と結合させ〔免役グロブリンＫ ｍ有の変性廖ｍ沃定子（ａｅｎａｔｕｒｅｃＬ　ｏｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　 ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　）　Ｋよる〕、免疫グロブリンのほどかれ九籍性によ って非特異性結合をする蛋白の量は一層少ない（そのためマトリックスの疎水性 が低くなる）。

一般に、抗体力う五ＫＪＩ異的に結合され九少量の蛋白【溶離するということは 重要な１Ｉｌｉｌａ点である。ごく少量の蛋白が存在して一１吸収もしくは非特 異的不活性化が再々起こることがある。これ【Ｍけるひとつの方法Ｌ１下記爽教 条件（問題の抗体３ＩＫ対してその蛋白の抗原性ｔ−変化させることなくそ０蚤 白を安定化する物質の存在下でのクロマトグラフィ）からなるものである。

ヒト白血球インターフェロン【Ｑ、１％）！Ｊ）：／Ｘ−１００（Ｄｌｌｉ？在 下で通常の仕方でゲＡ／濾過した。ゲμ濾過し九物質【０．１％トリトン！　− １００含有のＰＢＳと０．１モ〜の塊化ナトリウム含有のＰＢＳとに財してｐＨ ’／Ｊ！で透析した。こＯ溶液【、０．１％トリトンＸ　−１００會有Ｏ適切な 緩衝液で平衡にした平衡抗体ｔＪラムに供給した。次いで通常の抗体親和性り四 マドグラフィの操作【０．１％トリトン！　−１００の存在下で行った。かよう な抗体親和性りｐマドグラフィの回収率はトリトン！　−：ＬＯＯｌ含有しない クロマトグラフィに比較してかなり増大させうることが分かった。またＳＤＳ　 （安定化上目的とする）は、トリトンＸ　−１００が上記のプロセスに含まれて いるならは、インターフェロン精製時には削除することができることが見出され た。このことは、ＳＤＳ　ｔ−溶出液中に安定剤として用いることなしに抗体カ ラムによって少量のインターフェロン【完全Ｋ１１ｌ製することは以前には不可 能であったのでＣＳＤＳ　ｔｌＪ＃するとインター７二ロンの収率が着しく減分 した（ｓｏ９６から１１１０％へ）〕有利であると考えられる。

材料と方法 インター７二ロンの分析は公知の標準法〔■ｍｏ　ｃｅｌｌｓ　（ｍｏｎｋｅ３ ｙ　ｋｉ山１８３’　ｏｅｌｌｓ　）　、　Ｕ　−Ｏｅ工１６　（ｈｕｍａｎ　 ａｍｎｉｏｎａｓ工１１ｉｎｅ　）　、　ＧＭ　−ｏｅｌｌｓ　（ｔｒｉｓＯｍ ｅｒ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２１　）　、　ＤｂＴｒ　−ｃｅｌｌｓ　 （ｂｏｖｌｎｅ　ｏｅＬｌｓ　）　＄ＰよびチャレンジウィルスとしてＶｅａｉ 、ｏｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔ、１ｔｉｓ　ｎｒｕｓ　（ＶＳＶ）　（用いるＢｅ ｒｇ”Ｋ、　、　５ｅｑｕｅｎｔ″１：ａｌ　Ａｎｔ、１ｂｏｄｙ　Ａｆｆｉｎ ｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ−ｐｈｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｏｙ ｔｅ工ｎｔｅｒｒｅｒｏｎ、　５ｏａｎｄ、　Ｊ、工ｍｍｕ−ｎＯ１，６，７７ −８６（１９’？？）　）で行った。インターフェロン単位（ＩＦＵ）はすベテ 国際標早単位（１，ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｕｎｉｔ、 　６９／１９　Ｂ単位）で示した（　６９／１９　Ｂの１１ＨＰはＭＢＣ。

Ｍ１工Ｉ　Ｈｌｌｌ、　ＵＫから得た）。

インターフェロン　粗ヒト白血球インター７エ四ンはカンテμ記述の方法（０ａ ｎｔｅｌｌ　、　Ｋ、　、　Ｈ：ＬｒＶＯｎｅｎ　、　Ｓ、　、　ｍｏｇｅｎａ ｅｎ　、　Ｋ、Ｅ、　ａｎＩｉｐｙｈａｘｉｉ　１＋、、　Ｈｕｍａｎ　１ｓｍ ｏａｙｔｅ　ｘｎｔｅｒｒｅｒｏｎ　：　Ｐｒｏ−ｃＬｕｏｔｉｏｎ、　ｐｕｒ ｉｆｉｏａｔｊ−ｏｎ、　５ｔａｂｉｌ：Ｌｔｙ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌ　ｅｘ ｐｅｒｉ−ｍｅｎｔｓ　、工ｎ　：　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ：１ｏｒｘ　ａｎ ｄ　ｕｓｅ　ｏｆ工ｎｔｅｒｆｅ＋ｒｏｎｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 　ａｎ（Ｌｐｒｅｖｅｎｔｔｏｎ　ｏｆ　Ｈ’１ＭｎＢ、ｎ　Ｖｉｒｕｓ工ｎ− ｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｐｐ、　５ｂ−３ｓ、　Ｗａｙｍｏｕｔｈ、　Ｃ，（ｅｄ、 ）　；　１９７ｓ生Ｌａ−ｋｅ　Ｐ］−ａｏｉｄで開催されｆｔ−Ｔｉ５ｓｕｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ａｓｓｏｏｉａｔｉｏｎｗｏｒｈｓｈｏｐの会報（皮体外の 部、第３４１）、イン／−７ＸＯ：フインデイエーナー（１ｎｄｕｏｅｒ　）と してセンダイウィルス【使用するＴｉ５ｓｕｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ａｓ５ｏｃｉ 、ａｔｉｏｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｍｆｌ、　）　）で行った。５　Ｘ　１０ ”工ＦＵ／＃振白Ｏ比活性度を有する部分的に精製したインｌ−７ｘａ：ｙ　（ Ｐ工Ｆ）は、（ａｎｔｅｌｌ　、　Ｋ、　、　Ｈｌｒｖｏｎｅｎ　。

Ｓ、、　Ｍｏｇｅｎｓｅｎ、　Ｋ、　Ｅ、およびＰｙｈｉｌ栓り、が上記引用文 献中に記載したエタノ−μによる沈澱法で粗濃縮ヒト白血奪インターフェロン（ Ｃ工Ｆ）から得た。

〕当シ鋳、０００のｖ臣Ｏ細胞ｉ　１００−の培地に接種し、湿らしたキャビネ ット内に５％ＣＯ意の雰囲気で保持した。２８目に培地【細胞から取や出し各ウ ニ〜に６〜８工ＦＵ／−の濃度のインターフェロン【含有する抗血清の希釈物（ １＠地中）　ｔ−１００１１７添加した（血清とインターフェロンとは３７”Ｃ で１時間予め培襞した）。３日月に培地ｔ−取出し、すべてのウニ〜にＶＳＶ　 （培地中−３．５ １０　に希釈）ｌｏｏｍ’ｉ加えた。４日月にＣＰＫ　（細胞変性効果）ｔ−測 定した。そして抗インターフェロンの力価測定の終点とし１５０％分解法（５０ ％ｄｅｓｔｒｕｏｔｉ、ｏｎ　）　ｆ用いた。これらの力価は、インターフェロ ン中和単位（工”　ＭＵ）／ＨｄＴ９＠れる。

化学薬品　ＣＮＢｒ　ｉｉ、　Ｆｌｕｋａ社から得た（　−２０”ＣＴ保存）。

電４ＪＣ激動法用の特に純粋なドデシＩｖＷＬ酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＥｒｉ 、ｔｉｓｎ　ＤｒｕｇＨｏｕｓｅ社（ＢＤＬ（）ｉ通じて購入した。ツヤビーン 　トリプシン　インヒビ、＃−（ＳＴ工〕とＬ−リシンはＳ１ｇ；ｒｍ社から得 た。−ｔ　７７１：ｌ−／（４ｂ　（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　）とＣ！ＮＢ ｒで活性化されたセファロースは７ア一マシア社（デン！−り）から供給された 。

結合操作　免疫グロブリンのセファロース４ＢへのＭＳ結合的結合は、Ｋ、　Ｂ ｅｒｇによって５ｏａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ、　、　６　、７７− ８６、１９７７にすでに記載されたのと同様にしてなされた。免疫グロブリンの ８０〜８５％だけｔ注意深く結合させた。４〜８Ｍの尿素中で結合させると、純 度が同じかもしくはわずかに高いインターフェロンを高い回収率で得られるので 、有利であることが分かった。かくして、この目的の結合緩衝液の一例は、ＯＳ Ｍ樵化塊化リクムと４〜８Ｍの尿素例えば４〜６Ｍの尿素好ましくＦ！４〜５Ｍ の尿素とを含有する、ｐＨ８〜９．５例えば８．５のαＩＭ＃ｉ！！酸水嵩ナト リウムである。

蛋白分析法は、ＬＯＷＩ７　ノ方法（Ｂｅｒｋ　Ｋ、　、　５ｅｑｕｅｎｔｉａ ｌ　Ａｎ−ｔｌｂｏａｙ　Ａｆｆｉｎｉｔ３’　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＩＡｕ）ＫＯＱ７ｔｅ工ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　５ｃａｎ ｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ工、、　６．７７〜８６　（１９７７）　）の資形法 〔検出可能な蛋白の最低濃度として１−　ｇ１１９／ｆｌｉｔ）検出ができる（ 　ＬＫＢ　Ｃａｏｕｌａｔｉｏｎ　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｅｒ　ｔＩｌｔｒａｌ ａｂＳ３’８ｔｅｍ　を用いて）〕でなされた。結晶牛血憫アμプ建ンｔＳ＊＊ 白として使用した。精製インターフエロンの蛋白濃ｊｉ！（会計量１〜５岬）の 測定には下記の方法ｔ−採用した。ＳＤＳ　ｆ最終濃ｆがｏ、１％になるまで添 加した。その凍結乾燥された蛋白試料ｔＸ１１１水に透析した後、５ＤＳ−ポリ アクリルアきトゲルミ気泳動法（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　＠記参照）で試験した。染 色した蛋白バンドの強度′ｋｌＩｌ々の愈の公知の標準品と比較しく後記参照、 ５ＤＳＰＡＧＩＣの項）、蛋白の総量【評価した。偏差は５〜１０％で、蛋白の 最低検出可能濃度は０．１■（合計ｔ）であった。このｊ５決の測定結果は、真 の値の測定法というよｐもむしろう７な評価法として有用である。

親和性クロマトグラフィは番“Ｃで行った。ゲルｉ！蜀液ｔカラムに充填する前 に脱ガスした。充填は蝙動ポンプを用いカラ五ベッド客量の３〜４倍客積の負荷 緩衝液で洗浄することによって行った。インターフェロン滴定用の試料（ｌｏｏ ｍ）はブー〜もしくは個々のフラクションから採取し、同じ日に滴定するかもし くはプラスチック管に入れて凍結しその後に滴定した。希釈は媒体（１１０％小 牛血小金血清含有で行った。

抗体親和性クロマトグラフィは、　：ｓｅｒｇが記載したのと同様にして行Ｑｆ ｌ　（５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ＡＪｌｔｉｂＯ（１３’　Ａｆｆｉｎｉｔ７　Ｃ ｈｒｏｍａｔ、ｏｇｒａ−ｐｈｙＯｆ　Ｈｕｍａｎ　ＬｅｕｋＯ０３’ｔｅ　Ｉ ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、　５Ｏａｎｄ、　Ｊ　、　Ｉｍｍｕ−ｎｃ工、、　６．７ ７〜８６　（１９７？）　）。負荷緩衝液としては、ｐＨ７，２ｃＤ　Ｏ，Ｉ　 Ｍ　Ｎａ０Ａ　／　０．３　Ｍ　ＮａＣ１（流ｉ４ｏｍ／ｈ）ｋ用いた。段階的 な溶離が、少量のクエン酸（ｐＨｌ　Ｌ４にｉｌＩ爽に保持するのに足る）を含 有する０、Ｉ　Ｍ　ＥＩＯＡＣ／Ｑ、３　Ｍ　ＮａＣ１テ行った。使用していな い時カラムはペニシリン、ストレプト！イシン、ゲンＩマイシンシよびりＩ２ラ ム７エエ：ｘ　−ｐｙ　（各１９６）含有のＰＢＳ上ＮａＣ１中４＃Ｃで保存し た。力２ム【精製に用いる前にまず負荷緩衝液１００　ＷＪでｒｆｃ降し次いで 溶離緩衝液１０１１ＪＩ入れ、最終的に負荷緩衝液２０〜３０−で平衡にし九。

この洗浄ナイフ〜は、特Ｉｃ、１０’　ＩＦＵ　／ｌｌ！ｌｌ上白比活性度のイ ンターフェロンについて繰作すると龜は１天然の“蛋白【Ｍけるために必要であ った。インターフェレン濤出液を収集するのに用いるグラスチック管ｄｌｏｏｍ の１％ＳＤＳ液で予め濡らしておいた。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　Ｑ製濃縮されたインター７エ四ン製剤について紘、２ｏａＩ 長の分離ゲル、Ｏ１’１５ｍ、厚（Ｂｉｏ　ｋ　ｍｏｄｅｌ　ａｓａｌ：　Ｄｕ ａｌｖｅｒｔｉｏａｌ　５ｌａｂ　ｇｅｌ　ｅｌｅｏｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　 ｏｅ工１）および７〜ｌＯ−畏のスタツキングゲ＃　（８ｔＥＬＯｋｉＪ１ｇ　 ｇｅｌ　）　ｌ用いゐ５ＤＳＰＡＧ１ｉス２プグ〜（８工ａ’ｔ）　ｇｅｌ　） 上でポリペプチド成分の分析を行りた。はじめＯＩＯｃｍは１２〜２２％のアク リルアミドのグラジェントからな）、喪シの１０側は２２％のアクリルアミドか ら１ｋｂｏ　ｐｌｐｖｏ作製は、（Ｋｎｉｇｈｔ　、　Ｅ、　、工ｎｔｅｒｒｅ ｒｏｎ　：　Ｐｕ−ｒｊ−ｆｉｏａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｎｊ−ｔｉａｌ　ｏｈ ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕ−ｍａｎ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｏ ｅｌｌｓ、　Ｐｒｏｃ、　ｎａｔｎ、　Ａｏａｄ、　５ｃｊ−、ＵＳＡ　？ｓ。

ａｇｏ　−５１２３（１９７６）　）に記載の方法で行り九。ＩＡｅｎｎＯＩｎ ｌｉ記載の断続的緩衝Ｍ　（ＬＡｅｎＯｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、、　Ｃｌｅａｖａ ｇｅ　Ｏｆ　５ｔｒｕｃ−ｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＤｕｒｉｎｇＡｓｓ ｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｄ　ｏｆ　Ｂａ−ｃｔｅｒｌｏｐｈａｇｅ　 Ｔ４．　Ｎａｔｕｒｅ、　ｇｌａ？、　６８０〜６８Ｂ　（１９７０）　）　ｌ 用いた。このゲ／Ｌ／線寮際に電気泳動分析【始める前に２時間（ｌｏ’ｃ）予 め冷却した後、電気泳動分析ｆ　ｌｏｍＡ　（および約２゜ｖ）で開始し、一定 工７エクト（ｏｏｎｓｔａｎｔ　ｅｆｆｅｏｔ　）　（ＬＫＢ供給電源）で−夜 （ｌｏ’ｃ　）行った。分析すべき試料ｉ、Ｏ，１Ｍトリス檻酸毅衡液（ｐＨ６ ，８）と２Ｌ５９６ＳＤＳとｂ％グμ；−スとからなｊｌ）ラッキング染料を含 有する液（試料緩衝液に溶解（もしくは希釈）した。このゲＡ／【、コマシープ ルー（ｃｏｍａｓｓ：ｔｅＢｌｕｅ　）　（５０％メタノール、４０％水および １０％酢酸混合液中１．２５ダ／−）で予めフイクツスせずに１６分間、室温下 、絶えず揺動させながら染色した。ついで７％酢酸（５９６メＩノー〜）中で脱 色した。このゲμ【、良質の紙〔例えばワットマン社のクロマトグラフィ用紙（ １７ｍ））上で、ゲｙ乾燥４Ｉ（Ｂ：ＬＯＲａｄ。

ゲルスラブ乾燥器、モデμａｓ４）を用い減圧下加熱して乾燥した。５つの異な る分子量の！−カー：ａ）クトア〜プオン（１４，４００ダルトン）、ツヤビー ン・トリプシン・インヒビＩ　−（釦、１００ダμトン）、縦酸脱水酵素（３０ ，０００／〜トン）、オバ〜グミン（４３，０００ダμトン）、牛血黄ア〜プミ ン（６）、ＯＱＯダ〜トン）、およびホスホリラー−ｋ”　（９４，０００ダ〜 トン）（電気泳動法キャリプレーシ誓ン・キット、７ア一マシア社、デンマータ ）それぞれの０．１〜１０　ｍｌ　／　ｇｏ−浮液（ＳＤＳ　ＰＡＧＥに付して 染色し九。この方法で決定される分子量は約％１００１ダ〜トンＩｌｏ爽験精度 であるということに留意すべきである。その染色され九振白バンドｋｍ製された インターフェロン製剤について平行して行ったＳＤＳ　ＰＡＧＥから得た対応す るバンドと比較してインターフェロン蚤白の全濃度【測定した。ひとつのＳＤＳ 　ＰＡＧＥから先物学的グ０７アイ／＆／【得るために、インター７エ胃ン測定 用のゲルの一部を跣シのゲルからｆｌｐ取シ、４“Ｃで（湿らせた箱中）左５） 厚板上に保持した。このゲ〜の主な部分【１５分間乗色した。

ｒｓ〜６分間脱色した後に、弱いバンドがブルーのバックグランドに明硼に認め られ、これによって１４，０００　”ダルトン′と３０．０００５０〆μトン“ とに対応する蛋白のバンドの正確な位置ｔ−ａｍすることができた。そのグμの 染まっていない部分ｔ′ｖｌ′Ｊシ取ったかそれは１４，０００　／ｌＷ　）ン “と３０，０００　’ダルトン“との間Ｏｆｃ白だけ【含有していた。さらにそ のゲμ【鋭利なナイフでｌｓＩのピースに再分した。これらＯＸツイｘｔテフ胃 ン棒で完全に砕いた後、０．５−のαＩＭｓＤｓでこれらスライスのインター７ エ冒ン１＊離した。室温で６時間後（揺動）、上澄液のインターフェロン活性【 測定した。個々の７２タシ璽ン【、添加物を加えることなしに−ｇｏ’ｃで凍結 した。

７　ｘ　ｒｘ　ン１３　Ｊ　Ｋ　ＫＳＣＮ　ｔｌｌｌ＃０．５　ＭＫ＆　２＞　 ｔ　テｐＨ’７．２　”Ｃ１１ｌｘ加した。ｌＮ４Ｄ樵酸【加えることによって ｐＨＣ４−５１で低下畜せて（マグネチック・ス！ラーで揖＃）、インターフェ ロン（ｔｒよび不純物の一部）含有の蛋白の沈澱を得た。この沈澱を、ＩＭＮａ Ｃｌと２５審量％のエチレングリ；−〜とｔ含有のＰＢＳ（＊酸緩衝液ｐＨ７， ２）の１５ｏｄＫＪＩ解し、岡じ緩衝液の２１づつに対５ ７　工ａ　ン（ＨｕｌｅＣ工Ｆ）ｏ比活性度は５〜１ＯＸＩＯ”工ｙｕ／ｓｗｌ 白であ′）た。回収率は約９８％であり九。

／１００　）のなかに、ｌ　Ｍ　ＮａＣ工と１ａｌｊｉ％Ｃ）ＬｆＶ：／グリ； −〜とを含有のＰＢＳ　（番’Ｃ，ｐＨ７）中に入れたウルトｐゲ〜（Ｕｌｔｒ ｏｇｅｌ　）　ＡＱＡ　５　／　４　（ＬＪ四デンマ−り）を充填した。カラム を３ベツド答愈の緩衝液で洗浄して安定化させた。１０〜１ｂ１１７　ＯＨｕＬ ｅ　ｃ工Ｆ（２６審量％ノエチＬ／ングリＯ−／Ｉ／　ｌ　Ｍ　ＮａＣ工含有の ＰＢＳ、　ｐＨマ、４中に上記のようＫして作製された）ｔカラムに注入し、カ ラム【負荷緩衝液で’＄１１！’　Ｌ％　＋７’）クシ璽ンのインター７エｐン 活性【測定した。インターフェロン含有７ラクシ曹ン【ためた。元のインターフ ニシン活ｔ０８５〜９６％１ｂＸｇ収された。ゲＡ／Ｐｊｉされたインターフェ レン食有溶出液の比活性度は１，０００，０００工Ｆ′Ｕ／ｑ蛋白に近い一部で 、精製係１ｋ（ｐｕｒｉｆｉｏａｔｉｏｎ　ｆａｏｔｏｒ　）　Ｂｏｏに相当す る。分子量マーカーによって測定されたように、そのインタ−７エ胃ンＯ分子量 は１０，０００〜ｇＯρ００ダ〜トンの範囲に対応する。個々の７２クシ曹ンを 貴兄したところ、ｌａ、０００ダＡ／）ンの最大のところにひとつだけの１０− ドなビーク【示した。

ＨｕｌＦＮ　−ＥＬの上記ゲル濾過についてのゲルｒ過蘭線は、国際特許出願＠ 　ＰＯＴ／ＤＫｓｏ　１０ｏｏｇ４＠の第５図に示されている。そのイン／−７ エ簡ン活姓は全蛋白Ｏ主要部から効果的に分離されていることが明らかＫｌｉめ られる。

抗体親和性タロマドグラフィ　ゲ／＆／濾過し九インター７エ四ン負荷緩衝液（ ０，３８ａＣ工、　＄１０ｍＭ　ＰＢ　ｐＨ７，２に＊して〕に負荷した。負荷 緩衝液で充分洗浄した後（ａａｏｎｍ６ｃシける０Ｄｌｌｌｌｉがベースツイン Ｋｍ少するまで）、インター７エ藁ンｌ、ＱＪＭＮａｉｌ含有ＯＯ，ｌｉｉ　Ｍ 酢酸からする溶離用緩衝液（ＰＨ１−１１５１ＥＫＬ４に保持するため少量のク エン酸【含有する）で溶離した。純粋のインターフェロン蛋白を安定化するため に、抗体カラムからの溶出液を収集する管（７２クシヨン・サイズ２１１／）は 各々、Ｉ　Ｐ６ＳＤＳ溶液の１００−で予め濡らしておいた。インターフェロン 含有溶出液【ためた後に追加のＳＤＳ　’ｉ全濃ｔがｏ、１重量％になるまで添 加する。

０・１％ＳＤＳで安定化して丸めたインターフェロン含有溶出液ｔ＊浴中で０＃ Ｃに予め冷１１１ｔｋれたｇｏｗ４審量のメチンレス鋼管にうりす。１６分後沈 ｔが生成する。この沈澱ｔｅＣでａＯ分聞就ψｏｏ　ｒｐｍで遠心分離して単離 する。上置液ｔ−廃秦しくインター７エ腐ン活性がない）、沈１１ｔ−ａＭの尿 素４−に再溶解し、ｆリボ７（Ｍ卸ユｊ−ｐｏｒｅ　）濃＠＊＊（ｓ＊？イズ） に移し分子量ＩＱ、０００カットｔツイＡ／１−Ｌ次いでｉ１＠で約１００１に 濃縮する。

その後ζＯＩＩ縮物に追加の４Ｍｇ素（Ｐ、ａ、）會添加し、その溶液を室温で 釣１００−まで濃縮した。最後にｌ〜δ―の蒸留水【添加した。その溶液１２ｏ −壕で濃細し、２０−のＳＤＳ試料電気泳動緩＊ｍと混合した。得られた溶液の ２０−（全体でｌ〜ｌＯ×ｌＯ＠単位）を下記ＳＤＳ　ＰＮＥの項に記載の方法 で分析するのに使用した。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　ＳＤＳ　ＰＡＧＥ電気泳動法は、前記１材料と方法“の項に 記載のようにして行った。純粋なヒト白直球インターツエｐン振白（５−７Ｘ　 １０“単位）の電気泳動法の染色され九スラグ（５ｌａｂ　）　１第１図に示し た。第１図はＨｕｌＦＮ　−ａの１５０異なる亀か分離され特徴づ轢られている のを示している。かくして１ＩＷｊｋ４ｔｔＦｌｆｊｉｉｆ第ＰＯＴ　／ＤＫａ ｏ　／　０００１４号Ｏ第１図に示されてｉるもとの１８，４１０ダμトンのバ ンドは、さらに４つの別個のインターフェロン・ピーク（第１図のＸ２イア１〜 ４）に分離することができたのであｐｌその主要表白（染色の［からやｊ断して １３の楓すべてを合計した蛋白の４０％を含有している）が１６．６００１ダμ トン′すなわち＄１＠ｉ中のスライス１の位置にあることを示している。ｊＩＩ １図に示したインターフェロン活性のデータは国際特許出願第にＴ／ＤＫ８０１ ０００ｇ４号に記載したのと同じしかた（　ＶＥＩ？Ｏｏｅｌｌｓ使用）で得た 。すべてのバンドかヒト系（および生糸）でインターフェロン活性を有する第１ ＷＡＫ示した蛋白バンドＯほかに紘（下記ｓｚ図についての論畠参照）、団凋Ｐ ＡＧＥ　Ｋ他Ｏ内服で見える蛋白バンドは存在していなかったの紘注目すべきこ とである。またその生物学的ピータか蛋白類の位置と正＊に一致すること４注目 すべきことである。

純インター７エ冒ン飯白ｏ生産 ｄ”　−ａは一際籍許出駅第ＰＣＴ　／　ＤＫｓｏ　／　ｏｏｏｇ４す０５１Ｅ 験の項に従って精製される。かくして−千万単位Ｏ粗ＨｕｌＦＮ　−ａから約５ 　Ｘ　１０＠単位が、安定化を目的としてＱ、１％ＳＤＳ　ｌ添加する最後のｌ Ｒ階で得られた。Ｉｉ際轡許出願第ＰＯＴ／ＤＫａｏ　／　０００５１４号に記 載の電気泳動法【行つ九執、染色と脱色ＩＮ　Ｋ　＄１ぽ６〜グのバンドかみと められ丸。１岬口０／Ａ’トンのバンド、８０，１８０ダ〜トンのバンドおよび Ｂ：！、、４４０〆〜トンのバンド【グｐから切り取シ、０．５　ｍ　００．０ １％ＳＤＳ綴衝液中にテフロン棒でグ〜−ミンｘ　（ｇｅｌ−ｍｉｎｏｉｎｇ　 ）　した後、１５ｃで５１〜８時間０．０１　％　ＳＤＳによって濤離し、次い でイン／−７エレン活性を滴定した。下記第１表から明らかなように、各７２ク シ璽ンについて下記単位の活性が得られた。

第１表 ＨｕｌＦＮ−ａ＠　ｔ　ＶｆＪ収インｌ−７ＷＯン０＃）かようなＳＤＳ　ＰＡ ＧＥ寮験から得られるインターフェロン活性の全回収率は通常合計１５〜４０％ （はとんどが約３０％）に達する。これらの電気泳動はすべてメμカプトエＩノ ーμなしで行った（さもないと生物学的活性の９Ｂ％以上を破壊することになる ）。

（ＳＤＳとメ／Ｌ’★ブトエタノ−μとの存在下でのヒト白血球インターフェロ ンの破壊はすでに文献に記載されている。この発明の発明者はこのことｔ多く　 ０ＪＩＩ＊−にりいて確認した。ＳＤＳ　ＰＡＧＥ中の蛋白のパターンは、その 緩衝液中にメμカグトエタノーＮが會すれていると、メμカプトエタノー／＆／ ″ｆｉ電気泳動緩衝液もしくは試料緩衝液中に含まれていないと亀に見られるの と岡−の蛋白パターンを与えるということか分かった。）ＨｕｌＦＮ　−ａ蛋白 に対して主成する抗体上記の繰作ｔｇＳに一回行り九。そしてそのＳＤＳ　ＰＡ ＧＥ　ｆ室温で１５分間染色し、７％酢酸、５９６メＩノー〃で脱色し、５分間 蒸留水で洗浄し丸。そＯ談１８，０００％ｇ＆へ０００および四、００Ｑのイン ／−７エロン蛋白バンドｔ−ｔ７１７！：Ｊ取った。各ゲルスライスをテフロン 棒で砕＠　０．５−の０．０１％ＳＤＳ中に懸濁させ、ラビットに注射する前に 、ａＳ検の７レイントの先金アシ臭パン）（Ｆｒｅ−１ｗＬｔシリンジに入れる ことができなければならない。そしてこのことは同じＷＡＩｌｌ液ｔ−数回式れ たシ出したりして儀かめられる）。各ラビットにはそれぞれのインターフェロン 含有ゲ＊ｉ［液ｔＷ中に８運に一回皮下注射した。この操作は３漏に一回づつ６ ケ月間続けた。この６ケ月の治療の飯、使用された３匹のラビットはすべて第２ 表に示したように抗体を生成した。

第２表 免疫化のｂヶ月関の後、５０〜６Ｑ−の血液を各２ビツトから採取した（　１８ ，４１０および−４０，第２表参蕉）。工、Ｇ免疫グープリン【、セファレース ４ＢＫ共有結合的に大ツグμされた蛋白Ａ１２）使用を含む公知の方法で、その 血清から単離した。抗血清の１ＯｘｌｆＪＦ衡にし九カラム〔通常の抗体親和性 緩衝液（前記ゝ材料と方法＃参ｊｌｔ）もこの場合に用いられ九〕に負荷し九。

蛋白Ａ−セファロースカラムの大き１！紘５ｗＪであった。そ０力２ムＫｌＯ＠ ｌの血ａｔ負荷した後、カラムは溶離されその畿充分に洗浄した。ためた溶出液 を前記１材料と方法“の項に記載０中和分析法で滴定した。そＯ結果９０％の中 和活性が回収されたことが分かった。洗浄水中に中和活性は認められなかった。

０．１Ｍ跋酸水素ナトリウム、ｐＨ８〜９に賞して透析した後、■２Ｇが、ＩＦ （乾燥重量）の活性化セファレースを用い、ファーｉシア製のＣＮＢｒ活性化セ ファロース４ＢＫ共有結合的に結合され、２〜３ｗＪの抗体カラムが得られる（ 前記１材料と方法“参ｆｌ）。

そＯｔ１９　ム（１ａＦ４１りに６百方率位ｔ）ｊｌ’ｌｋ／ｆ＠粗ＨｕｌＦＮ 　−ａ　（約Ｉ　Ｘ　１０＠率位／ｗｅ景白の比活性１）を負荷してチェツタし た。

インター７エ田ン活性の９８％以上がその力２ムによって除去され、洗浄液中に インター７エレンははとんど蕗められなかり九。

溶離はｐＨｔ通常２−４１で下げて行つ九〔収集管はＯ，１％ＳＤＳで予め濡ら した。（回収率５０％〜８０％）〕。インター７エ胃ン奮有のため九Ｗ／Ｉ＃ｋ ｉ液【、ゝ材料と方法′の項に記載の分離５ＤＳＰＡＧＥで検査した。その結果 第１図に関連して下記の蛋白パターンが観察された。比活性度は合計ｌｏ１〜１ ０＠単位／ダ蛋白に達した。染色し脱色され九ゲ〜中にみられるすべてｏｌ白は インターフェロン活性を有する。回収率は中＠度であった（３０〜４０％）Ｏ 同じ実験【廊へ４４０ラビツトカ２ムで行り九。この抗体カラムも少なくともｇ ｘｌｏ＠単位のゲＩｖ濾過され九ＨｕｌＦＮ　−ａと結合することができる。そ してこのことは１０−の血ａｔ用いて７〜１０　Ｘ　１ｏｉｌｘ　ａｏの中和単 位／１１４　ｅ　５０００インｐ　−７エＥｌ　ン単位の結合性【示す血清の中 和力価（５０中和率位／―）と比べて驚くべき知見である。この中和試験線、与 えられ九抗インターフェロン血清の結合能【検査するのに紘重要な方法ではない 。免疫抗＠　（ＩＷｎｕｎｏｇｅｎ　）　（Ｄ純度が増大すると、産主される抗 体紘、通常の中和試験では全く検出されない（ｔたはごくわずか検出される）種 類のものであろう。回収率ははぼ中ｉｔで２０−３０％であった。

載４４０力２ムからＯ溶出液【濃縮して、上記と同様の５ＤＳＰＡＧＥで試験し た。再び岡じ蛋白パターンが、蛋白の主Ｉ！部分が欠けているようにみえる１ａ 、ｏｏｏ　ゝメμトン′のレンジ【１１；いて、牛の種によって示される４０％ に対応して先に見られたのとｒ１４様に観察された。（盪８０ラビットで作った 小カラムも同様に同じ結果七文持した）従って、ヒトの種はすべて、ｍ際特許出 願第ＰＯＴ／ｌＸ８０１０００ａ４すにおける先Ｏ知見を直接支持するヒト系（ ９ビット抗体【使用〕中で抗原的に同一であると結論ずけることができる。

国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８０１０００ｇ４号において用いられたＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥ　ＪＴノ１８，４１０力２ムの溶出液と部、４４０　＊うＡＯＪＩＩ出液 【比較した際に１８０００の位置に異なった強度の蛋白染色が慕められたことか ら、個々のインターフェロンｉｔｔさらに良好に分離することがで！る系を開発 するためにＳＤＳ　ＰＡＧＥ系の再設計がうながされたのである。

１材料と方法“の項から明らかなように、新しい修正されたＳＤＳ　ＰＡＧＥ系 は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ８０　／　ｏｏｏｇａ号に記載ｏスｐｙ＊ング ・ゲｌｖ（ｓｔａａｋｉｎｇ　ｇｅｌ　）と岡−Ｃ）５％ＪＩツキング・ゲルで 構成されている。次いて１０１１＋灸の１８〜２２％グラジェントのポリアタリ ルアミドゲル、最後に一定の７クリμアξトゲル濃度（ｇｇ％）でｌｏａｍ長の ゲμが続いている。操作全体の詳細、緩衝液および材料は０材料と方法“の項に 記載されている。上記のように、　ＩＩＴＳＤＳ　ＰＡＧＥ系で測定される分子 量は、−際特許出願第Ｐ（：！Ｔ　／ＤＫｓｏ　／　０００２４号で用いられた Ｓ英ＰＡＧＥ系によって測定された分子量と直接に開運はない。というのは、こ の新しい系ではゲル濃ｍがあＺレンジ（１０，、）にわたって一定であるという ことによる。

かくして次の実験がなされた。

一千万単位のインターフェロンｔ％材料と方法“に記載の方法でゲｌ′Ｖｆｉ過 した。α１モ〜の樵化す）　Ｉ）りム含有で％　７．２のＰＢＳ　（標準条件） に屑して透析した後、そのインタ−７エμン１１ａ４１０抗体カラムに負荷した 。このカラムを充分に洗浄し、通常の溶離緩衝液で溶離し九。０．Ｉ　Ｃ）６Ｓ ＤＳ含有の溶出液【国際峙許出願第ＰＣＴ　／ＤＫ８０　／　０００＄１４号に 記載のＳＤＳ沈澱法によって濃縮し、染色、脱色および溶離【含む新ＳＤＳ　Ｐ ＡＧＥ系で試験した。第１図に示したように、１３の別個の蛋白バンドが観察さ れた。

こｔＬう１３の蛋白バンド社各々インターフェロン活性【モっていた。この第１ 図における約１６，０００〜１Ｂ、０００　”ダルトン“のレン５ｅｔｓ　ａｉ ｌｌ特許出願第ＰＣＴ　／ＤＫｓｏ　／　ｏｏｏｇａ　号（Ｄ第１図に示ｔ［れ たＳＤＳ　ＰＡＧＩ！：パターンと比較すると、ｍ際特許出願第ＰＣ！Ｔ／ＤＫ ｓｏ　／　ｏｏｏａ４号に記載のｌ昭ＩＱメμトンＯ種はさらに３〜４の別個の 種に分離されたことが分かる。前記のように、第１図に見られる１１３，６００ 　ゝダルトン１の種は、純インターフェロン蛋白だけで構成されている精製ヒト インターフェロン蛋白製剤中に存在する全蛋白の＃ｔは４０％を含有している。

さらに、この１６．６００　’ダＡ／）ン“の種はヒト系中では驚ぐほど低い活 性を有してｉることが示されている。しかし牛の細胞系中で１３の種全部を滴定 すると、１６，６００　’〆〜ダルトン種は顕著な高い活性を有する。従って１ ６，６００　’ダルトン“の種はたんなる不純物ではない。むしろ、この種はヒ ト系ではほとんど活性を有しないかもしくは極めて低い活性【有するが、牛の系 では極めて高い活性【有するインＩ−７エ虞ン蛋白である。

さらに同様の実験ｔ＆５Ｆ４４０カラム【用いて行った。−千万隼位の粗ヒト白 血朦インター７エ四ンを前記したのと同様のしかたで６場した。帖４４０抗体力 ２ムから溶離した精製溶出液【新しい修正ＳＤＳ　ＰＡＧＥ系で試験したところ 、１６．６００　’〆Ｎダルトン位置の異なった蛋白が完全く欠けていた（もし く酸ごく少量存在していた）。この２つの実験を比較すると次のことが推論でき る。即ち１６，６００　”ダルトン“の種は伐ｐのヒトインターフェロン種と抗 原的に交叉反応しない。

牛のｌｌｔ含めて全ヒトの種に対して主成したラビット中の抗体ａ、−際特許出 願第ＰＯＴ／ＤＫ８０１０００２４号に記載の最後の抗体親和性クロマドグａ） フイからの全溶出液ｔ−ラビットに接種することによって主意できる。０．１％ ＳＤＳで安定化された１、０００，０００〜為００μｓ００単位のインターフェ ロンからなるがような溶出液【さらＫ　ＳＤＳ　ＰＡＧＥで分離することなく、 ７０インドの完全アジュバントとと−ＫｇｊｌＫ１Ｂ！１３〜４ケ月間、ラビッ トに皮下注射し丸。イン１−７エロンに対する抗体はこのａｍ中の５〜４ケ月後 に主成した。その力価唸約３００，０００−５００，０００中和単位／−であっ た。抗体力りムを前記手順で作製し、ゲ１Ｉ４Ｐｆｉｋシたヒト白血球インター フェロン【負荷した。溶出液ｆ　ＳＤＳ　ＰＡＧＥで試験した結果通常のルのバ ンドがみとめられた。２つの蛋白バンドが１０，０００　ゝダルトン“の近傍Ｋ ｍわれるのが時々みとめられた。これらの蛋白バンドがこのカラムに＃ｌ：４Ｉ 異的に結合され九少量の不純物を示すのかまたはすでに観察された１６，６００ 　’ダルトン“よりも低い分子量を有するインターフェロン蛋白【示すのかは、 現在分かってい１にい。

この抗体親和性タロマトダａ）フイの回収率は、免疫グロブリンのカップリング が４〜６Ｍの尿素のようなゆるやかな可逆的変性条件下で行われ九ＩＩＫＩ［著 に増大した。これらＯＲ境のもとでの回収亭鉱、カップリング緩衝液中に尿素ｔ いれなかった際の回収率５０〜１００％（−貫していない）に北べて一貫して８ ０〜８５％であった。

図面の浄書（内容に変更なし） 、ＪＤ’５；；；　５１　９　寓　０　０ＰＣＴ　′ＤＫ８２　′０００７　ｔ ２　発明の名称 ヒ］・インターフェロン蛋白ととトインターフェロン蛋白に対する抗体に関する 改良 ３、補１をする壱 事件との関係　特許出願人 付　所　テンマーク、ティケイ−１７００コペンハーゲン　ウイハルム１−ルベ ツＩ・２９ ぐ、利　エイ　ニス　アルフレツＩ・　ｌ＼ン゛ンオン代表名　ニールセン２エ イチ・ウメ ４イ友埋人　Ｎ　５３（，１ イ１　戸）１　犬阪市北区西大山５丁目１−３クォーター・〔ノンヒノ［７袖１ 〕０〕内着 別紹σＩ２ａす 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ζＯ男細書に定義畜れたＳＤＳ　ＰＡＧＥとｌＩ！６条件下で、インター７ 　：Ｌ　Ｈンｆ舎計ａ　Ｘ　１０’　ＩＩＦＵ負荷した１ｌｌｃ１６，６００． １６，９８０゜ｌ〒、！＄８０．　ｌグー８０％１８，４１０、ｌＢ、８４０． １９，０５０．１９，５００　、　ｇｏ４ｓｉｏ　。 １ａ０，８９０．　！１１，２１８０、ｊＬｌ、８８０、および縞９１０　’ｆ 〜トン′〔えだし１ダルトン１分子量は％１００　’ダＡ／）ンＩｏ１４験精Ｉ Ｌを有する〕の位置に抗りイ〜スインター７エｐン活性を有する１３のシャープ ＆＆色景自バンドを示し、その１９Ｄｓ　ＰＡＧＩＣが他Ｏ染色景白頷ｓｒ本質 的に示富１ｋ　％ＡＨｕｌＦＭ　−ａ蛋白。 ２、請求ｏ’ｘｉｙｓｓ　ｚ項記載（Ｄ　ＨｕＬＦＮ　−ａインｐ−ｙｚｖｘン 量白の蛋白つＯ成分である、抗りイ〜スインターフエ讐ン活性を有する４１蛋白 。 ３、ｌｊ、６００％１００　’〆＊）：／’０位置Ｗ−現れる請求の範囲第１１ 項記載の抗りイＪｖスインＩ−７エ冒ンｍ＊會有す為蛋白。 ４、跣〕の１０種と別個の免疫学的性質を有する請求の範囲ｊ１ｇ３項記載の蛋 白。 ５、純粋のＥＩｕｌＦＮ　−＆蛋白の約４０％を構成し、ヒト系では無視ナベ龜 活蝋しか有せず生糸で紘非常に高い＃Ｉｉ性を有し、かクヒト系では相当の＃！ 性を有する地上ＦＮ　−ａ蛋白とは免匿学的に別個のものである蛋白。 １！、１８，９８０％１００１〆ｐ）ン“Ｋ現れる請求の範−第舅礪記載の航り イμスインターフエーン活性を有する蛋白。 ７．１フ、３８０％１００１ダμトンＩｖｃ現れる請求ｏ１ＮｉｍＭ廊項記載Ｏ Ｎ？イ〜スインター７エ四ンｆＩＩＩ性を有する蛋白。 ８、　１？、Ｊｓ８０％１００　’７＊　）　ン’に鳳れる請求の範■第８項記 載〇抗りイμスインＩ−７エ■ンｆｒ！ｋｔ−有する蛋白。 ９、　１〜［０％１００　ゝダルトン１に属れる請求０範Ｂ第３項記軌〇抗ウイ Ａ／スインＩ−７エ四ン＃ｌ性を書する蛋白。 １０、１Ｂ、８４０％１００１ダｐｔトンＩに現れる請求ｏｉ＊ａｔｇ、ｉ項記 載〇抗ウイ〜スインタつ７エレン活性を有する蛋白。 １１、１９．ｏ５ｏ％１００　’ダミｖ　）　ン’　Ｋｌ！レル請求ｏ１１１１ ｊｌ　３１　’ｌ記軟０抗ウィμスインター７エロンｒａｒ性を有する蛋白。 ＩＬ　１９ｔ５００％１００１ダ〜トン１に現れる請求の範ＩＩｊＩｊＩ項記載 の抗りイＵＸイン１−７エ■ンＩＩ性を有する蛋白。 １３、　ｓｉｏ、４ｇｏ　ｐ６１００　’ｒｓｔ　）　ン’　ＫＩＬし請求０１ １１１Ａ第ｇ項記載。 抗つイＡ／：Ｘインｊｌ−７エ曹ン活性を有する蛋白。 １４、釦−９０％１００１ダμトン１に現れる請求の範囲第３項記載〇抗りイ〜 スインターツェ誼ン活性を書する蛋白。 ｉｓ、社、３８０％１００　’ダルトン１に属れる請求０範■第１礪記執〇抗ウ イ１４／スインター７エ四ン＃１性を有する蛋白。 １６、２１，８８０％１００１ダｐトンＩＩＫ現れる請求ｏ１１１！ｊｌｊｉｊ ｊ［１ｅｌｌｌ。 抗りイμスインター７エ々ン活性を有する蛋白。 １７、　ｇｘｅｌｏ％Ｚｏｏ　’／Ａ／　）　ン’　Ｋｌｌれる請求０１１１！ ｌ第８項記載ＯＭクイμスインＩ−７エ諏ン盾性を有すゐ蛋白。 ＩＬ　１６，６００％１００１ダμトン１に現れる蛋白で、牛革では明確な［ｒ ｖｋ％ｋ）系で紘頗机すべ自活性を有するインター７エ誼ン最白。 １９、比較ＳＤＳ　ＰＡＧＥ染色鹸によりて査定畜れた夕なくと４１ｏ’〜ｌｏ ｅ工ＦＵ／ＭＩ蚤白の比活蝋度を有する請求０範囲第１項記載の蛋白。 ２０．比ｌ　ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　５１２色法によって査定された１０”　〜ｇ　 Ｘ　１０”工ＦＵ／ｑ蛋白の比活性度【有する請求の範囲１ｇ１９項記載の蛋白 。 ２１、抗細胞活性【示し、ナチ瓢うμ・キラー・セル系を増強するとと【付加的 に特徴とする請求の範ＩＰ８第１〜８０項の何れかに記載の蛋白。 ２２、　ｌａ、ａｏｏ　ゝゝダ〜トン”のＩ［ｔ−除いて、請求の範ｉ！１ＪＩ ６〜１７項の伺れかに記載の蛋白に大して生成した抗体または請求の範囲第１項 に記載の蛋白に対して生成した抗体を中和するとと【付加的に特徴とする請求の 範８第６〜１７項の絢れかに記載の蛋白。 ム、請求の範囲第１〜８２項の何れかに記載のヒト白血球インター７エｐン飯白 。 ム、予防、治療または免疫法の効果をめてヒ）１九は動物に投与するのに適応さ せた請求の範囲第１〜２３項の何れかに記載のひとつの蛋白または複数の蛋白か らなる製剤。 怒、細胞増殖抑制的に活性な薬剤【加えるか加えずに、非経口、鼻内、または局 所投与に適応させた請求の範囲第２４項記載の製剤。 局８局所投与用のクリームまたは軟膏である請求の範囲１ｇ１９項記載の製剤。 釘４一定化した水溶液の彫態である請求の範囲第８番項記載の製剤。 錫、安定剤が、ヒトに宵して熱棒で非免疫原性のひとつの蛋白または蛋白類の組 会せである請求の範囲第ｇ７項記載の製剤。 器、安定剤がヒト血清蛋白とその分画、たとえばヒト７μグζン、また線ヒトに 財して非免疫原性の他の蛋白からなる鮮から迦ばれたｔのである請求の範囲第８ ８項記載の製剤。 別、純粋なインターフェロンＯ濃度が１−４０ＸＩＯ’工ＦＵ／ｍｌ（相当する 範囲にある請求の範囲ＪＩＩれ〜８９項の匈れかに記載の製剤。 ３１、１Ｒ定剤がＳＤＳである動物を免疫化するための請求の範囲第２７項記載 の製剤。 鵠、　ＰＢＳでｐＨが約７．２に緩衝されている請求の範囲第３１項記載の製剤 。 ３３、さらにアジ瓢パン）１−含有する請求の範囲３１３１項または３３３２項 記載の製剤。 Ｕ、アνエバントが７ａインドの７ジ龜バントである請求の範匹第３３項記載の 製剤。 ３５、請求の範囲第１〜２５項の舛れかに記載のひとつの蛋白もしくは複数の蛋 白のＳＤＳ複合体。 ！、　ｇｉ１体で単離される請求の範囲１ｇ１９項記載のＳＤＳ複合体。 ３７．請求の範囲第１〜２３項の何れかに記載のヒ）Ｌｅｆｆｉインターフェロ ン蛋白の免疫学的決定因子群に財して生成するか、または実質的に該決定因子に 対してのみ生成する抗体。 銘、請求の範囲第１項記載の蛋白の、１６，６００．１６，９８０．１フ、３８ ０　。 １フー５８０　、ｌＢ、４１０　、　１８Ｊ４０　、　１９，０５０．　１９， ５００．　＄Ｋｌ、４ＳａＯ、１，８９０。 ｊａｌ、３８０、社、８８０、ｇ’ａ、９１０　’〆ＩＷ　）　ン’　ノＨｕｌ ＦＮ　−ａ　Ｃ＋酸成分いずれか、もしくはこれらの組合せで免疫化しうみ動物 【免疫化させて得られるか、またはバイブリド−Ｖ技法もしく唸形質転換技法に よって同じ成分から得られる請求の範１８＠：ｓ７項記載の抗体。 鰺、請求の範囲第１項記載の蛋白０１６，９８０．１ツ、３８０．１フ、５８０ ゜ｌｆｉ、４１０．１８，８４０，１９，０５０．１９，５００、ｇｏ、４ｇｏ 、釦−９０、Ｋｌ、３８０゜ｌａｌ、８８０．３１２，９１０．１〆〜トン“の ＨｕｌＦＮ　−ａ成分ノ舛れかもしくはこれらの組合せで免疫化しうる動物【免 疫化して得られる請求の範１１５Ｊ１３７項記載の抗体。 ４０、１６，６００％１００　’ダルトン“ｔＤ　ＨｕｌＦＮ　−ａ成分で免疫 化しうる動物を免疫化することによって得られる請求の範囲＄３７ＸＪ記載の抗 体。 ４１、　ＳＤＳ　ＰＡＧＩＣゲ〜から切ｐ取った各バンドもしくは複数のバンド から得られるひとつのＨｕｌＦＮ　−ａ成分または複数の成分で免疫化しうる動 物【免疫化して得られる請求の範！８ｐｇ　３７〜４０項の何れかに記載の抗体 。 ４２、バンドが、ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲ／＆／を染色し蒸留水で短時間洗浄した袂 に切夛とられ九請求０１１１ｔｌｊ１４１Ｘ１記載の抗体。 ４３、請求の１１１８５１１８−８３項の匈れかに記載の１つまたは複数のヒ） 　Ｌｅ　ｌｌ！白に對して免疫化しうる動物を免疫化し、この動物から抗血ｌ１ ｉｔ−得ることからなる、請求の範Ｉ！ＩＪ１ｇ３７項記載の抗体の、製造法。 たは複数の蛋白で行われる請求の範Ｓ第４３項記載の方法。 仙、免疫化が、請求の範囲第１項記載の蛋白の１６，６００．１６，９８０゜１ フ、３８０　、　１’／、５Ｂ０．　ｌＢ、４１０．　ｌａ、８４０　、　１９ ，０５０．　１９，５００．　ＳＩＱ、４１ａＯ、ｓａｏ、ａ　９０．２１，３ ５０、ｓｕ、ａａｏ、Ｓａｇ、９１０　’ダルトン“ｏ　ＨｕｌＦＮ　−ａ成分 のいずれかまたはこれらの組合せのいずれかで行われる請求の範１２１１１４４ 項記載の方法。 槌、免疫化が、請求の範囲第１項記載の蛋白の１６，９８０、ｌ’Ｆ、３８０、 ｌ〒＊５８０．　ｌａ、４１０．１８，８４０．１９ｔ０５０．１９，５００． ８０，４２０．１ＱＪ９０、Ｕ、３８０．　社、８８０．５！、Ｌ９１０　’ｆ μダルトンＨｕｌＦＮ　−ａ成分ノイずれかｔた紘これらの組会せで行われる請 求の範囲１４δ項記載の方法。 ４７、免疫化が１６，６００　％　１００　’ダ、Ａ／　）　ン″のＨｕｌＦＮ 　−ａ成分で行われる請求の範囲１１ｇ４５項記載の方法。 槌、免疫化が、２１，８８０％１００１ダμトン′の成分で行われる請求の範囲 ｊ１４６項に記載の方法。 ４９、免疫化が、請求の範囲ＭＢ２項および＠　３１−　Ｉ　Ｊｉｊ［Ｃ）勾れ かに記載の製剤で行われる請求の範囲１８４３〜４８項の侑れかに記載の方法。 関、請求の範Ｗｉ第１項に記載のＥｕ１ＦＮ　−ａ成分の免疫学的決定因子群に 財する抗体類【産生するバイブリド！・セル、り簡−ンを培費し、培ＩＩ謀体か ら抗体を回収することからなる請求の範１１ｉｆｓ３’７項に記載の抗体生産方 法。 ５１、請求の範囲第４３〜５０項のいずれかに記載の方法でＮ造される抗体。 ５２、　ｆｆ　）　リツクスに同定化された請求の範囲第３７〜４Ｑ項及び第５ １項Ｏ備れかに記載の抗体（又紘必須の抗インターフエｐン医定因子【保有する ７ツグメントもしくはその誘導体）。 詔、マトリックスと共有結合的に結合する請求の範囲第２４項記載の抗体。 ６４、Ｗ）リツクスがセファロース４Ｂのごとき架橋アガロースである請求の範 囲Ｊ１１５３項記載の抗体。 邸、実質的に蛋白分解性酵素活性を有しない請求の範囲第５１〜６４項の何れか に記載のマトリックスＫｌｉ定化された抗体。 胚、＃素阻害剤又は−素破壊剤で地場することによりて実質的に蛋白分解性＃素 活性を有しないようにされた請求Ｏ範囲第７６項記載のマトリックスに固定化さ れた抗体。 ５７、酵素阻害剤又は酵素破壊剤による処理がマトリックスＫｍ！ｉｆ定化され 九＃素阻害剤又は＃素破壊剤で行われた請求の範囲第５７項記載のマトリックス に同定化された抗体。 詔、′ｖマトリックス共有結合させる前に、！トリックス同定化ポリーＬ−リシ ン及び／又は！トリックス固定化ツヤビーントリプシン狙害剤及び／又紘マトリ ックス同定化カリクレイン不活性化剤のカラ＾を通過させた請求の範囲第５？Ｘ ］記載のマトリツタスＫｌｉ定化された抗体。 ５９、ヒ）Ｌｅ１Ｍインターフェロン會有の溶液を特徴する請求の範８第３７〜 ４１ｉ項及び１１５１〜５８項の何れかに記載の抗体の用途。 ω、請求の範＠］＊ｌ〜、２３項の舛れかに記載の蛋白が保有しかつ顕著にイン ター７エ四ン［４？黴付ける決定因子を有する蛋白。 ６１、請求の範囲３１１〜２３項の膏れかに記載の蛋白が保有しかつ顕著な免疫 学的決定因子【有する蛋白。 ６２、ヒトＩ、６製インター７エｐン蛋白含有溶液ｔ％該振白【選択的に保持し 次いで保持された該蛋白ｔＳ離するような親和性りｐマトグンフイに付すことか らなる請求の範１１ｉ第１項及び第３〜６項のいずれかに記載のヒ）Ｌθ蓋イン ターフェロン蛋白の製造法。 ６３、親和性クロマトグラフィが、その抗体が請求の範ｉ！ｉｊＩ　５２〜ｂ８ 項の餌れかに記載のマトリックス同定化抗体である抗体親和性／μマトグツフイ からなる請求の範１１１１１４に項記載０方決。 ６４、固定化段階でマトリックスに財して用いられる抗体の中限は８６％が共有 結合的に結合した請求の範Ｗｉ第６３項記載Ｏ方沫。 ６５、抗体ｔマトリックスに結合させる前に、１１素阻害剤及び／又は酵素破壊 剤で処理することによって蛋白分解性ｌＩ素活性【実質的に有しないようにされ た請求の範囲３Ｉ６３項又は第６４項記載の方法。 ６、蛋白分解性活性の除去會マトリックス同定化＊＊！１１害剤及び／又は酵素 破壊剤で行なった請求の範ｍ１ｌｌ　６５項記載の方法。 ６７、抗体親和性マトリックスに対して用いられる溶液が粗製の濃縮されていな いインターフェロン製剤である請求の範＠＠　６２〜６６項の匈れかに記載の方 法。 銘、抗体親和性マトリックスに用いられる溶液が、濃ＩＩＡされているか又は部 分的Ｋ１１Ｍ！されたインターフェロン製剤である請求の範囲８６２〜６６項の 餌れかに記載の方法。 ６９、インターフェロン含有溶液が、粗製で濃縮されていないインターフェロン 製剤に蛋白を沈澱させるｌ＆ｔｍｔ−なすことによって得られるインタ−７エｐ ン食有振白画分からなる請求の範Ｉ！第６２〜６６項Ｏ匈れかに記載の方法。 ７０、蛋白【沈澱させる処理がＫＳＯＮの添加及びその溶液のＩ）Ｈｔ−４・６ に調整することからなる請求の範１１ｉｊｌａ９項記載の方法。 ７１、抗体親和性！）　ＩＪラックス対して用いられる溶液が１０，０００〜恥 、Ｑ００ダ〜トンの範ｌ！０蓋白だ仕【特に含有するインターフェロン溶液であ る請求の範Ｓ第６２〜７ｏ項の伺れかに記載の方法。 ７２、溶液が、エチレングリコ−〜のごと自グリーー〜Ｉｇｉｇ審量％含有しか ：）ｐａが約７．２でＩＭＱ直のｈａａ６に和尚するイオン強度【有する緩衝溶 液で行うゲ１４／濾過法で得た１０．ＱＱ　Ｏ〜ｇｏ、ｏｏ。 ｆ〜トンの溶出液である請求の範囲第７１項記載の方法。 ７３、抗体親和性マトリックスに用いられる溶液の比ＬＬＦＮ　−ａインターフ ェロンが、ヒト白血球インターフェロン、ヒトリンホブラストイド　インターフ ェロン及び請求の範囲１ｇ６０項又は第６１項記載の蛋白、並びにその蛋白１産 用ＤＮＡコーディング【運ぶ歓庄物を培養することによって主意されるこれらの 蛋白からなる鮮から選択される請求の範囲第６３〜７２項の何れかに記載の方法 。 ７４、インターフェロン含有溶液が、粗製で未濃縮のインター７エ胃ン製剤ｔ− 蛋白沈澱処理に付して得られるインターフェロン含有振自画分からなる請求の範 囲第７３項に記載の方法。 ７５、蛋白沈澱処塩沫が、ＫＳＣＮの添加及び溶液のｐＨｔ駄６に調整すること を含む請求の範＠＠Ｕ項記載の方法。 ７６、抗体親和性マトリックスに用いられる溶液が、１０，０００〜ｓｏ、ｏｏ ｏダ〜トンの範囲の蛋白だけｔ必須に含有するインターフェロン溶液である請求 の範囲第７３〜７５ＸＪのいずれかに記載の方法。 ７７、　溶液が、エチレングリコ−〜のどと龜グリコ−μの約２５賽量５）６ｔ −含有しかつｌ　Ｍ　Ｎａ０−＆に和尚するイオン強直を有し、ｐＨが約７．２ の敏衝幡液で行うゲμＦ［法で得たＩＱ、ＯＯＯ〜ｓａｐ　ｏ　。 ダμトンの浸出液である請求の範囲第７６項記載の方法。 ７８、ゲｔｖｆｉ過緩衝液中の溶出液【抗体親和性マトリックスに１＃＆負荷す る請求０範囲第７４〜？７項の伺れかＩ’Ｃ１ｅ戦の方法。 １、請求の範囲第５３！〜６Ｂ項Ｏ餌れかに記載のマトリックス同定化抗体を用 いて作製するか又は請求の範１１１ｊ１６ａ〜７８項の何れかに記載の方法で作 製されるＨｕｌＦＮ　−ａインターフェロン。 釦、少なくとも３０　Ｘ　１０’工ＦＵ／１９蛋白の比活性ａｔ有し、その蛋白 測定が純ヒトアμプミン血ｉ＋ｎ標準として用いるロウサイ法に基づいてなされ る請求の範囲３ＩＩ７９項記載のＨｕｌＦＮ　−ａインタ−７エロン。 ８１、３０　Ｘ　１０＠〜１０”工ＦＵ／智振白の範囲の比活性ａｔ有する請求 ｃｏｍｓ第８０項記載）ＨｕｌＦＮ　−ａインタ−；ｙｃｏン。 ８２、３０　Ｘ　１０’　−７０Ｘ　１０＠工ＦＵ／１ｌＦｊｔ白の比活性ｔ【 有す、６ｔｌＤＲ（Ｄ範Ｈ１ｒｒ　８１項記載のＨｖｌＦＮ　−ａインターフェ ロン。 お、請求の範ｍｓ１〜Ｓａ項及び第６０項の匈れかに記載のＨｕｌＦＮ−ａイン ター７エ■ン飯白主産用のＤＮＡ　：ｙ−ディング【這ぶ微生物【培養し、その 培ＩＩＩ謀体から該蛋白を回収することからなる、インターフェロン蛋白又はそ ０Ｉｉｉ著な庄物学的インターフェロン活性決定因子を有するに≠膏：）蛋白の Ｉｌ！造法。 机、インター７二はン飯白生産用ＤＮＡコーディングが、プ２スζド上に存在す る請求の範ＷＡ３１８３項記載の方法。 δ、インターフェロン蛋白生産用ＤＮＡコーディングが、公知の方法でインター フェロン産生細胞から単離されたメツセンジャーＲＮＡ　ｉリバース　トランス クリプターゼで匙場して作Ｉｌ！されたものであル、かつ細胞の溶解産物【抗体 親和性クロマトグラフィ及び／又は免疫沈降法に付し、その抗体親和性クロマト グラフイ又は免疫沈降法に用いられる抗体が請求のＩｉ！■第３７〜４２項及び 第５１項の輯れかに記載０抗体であることからなる、請求の範囲第８３項又は＠ ８４項記載の方法。 恥、微生物のインター７エ曜ン産生クローンが、請求の範８Ｍ３７〜４２項及び ＄５１項の伺れかに記載の放射性標識した本−％異性抗体によって選択されたも のである請求の範囲第８３〜８５項の伺れかに記載の方法。