FI77877C - Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. - Google Patents

Description

— KUULUTU8JULKAISU π π ο π π W£ [β] <11) UTLÄQQNINQSSKRIFT (/Off (51) Kv.lkVlntCI4 C 07 K 15/26, 3/12, A 61 K 1*5/02

SUOMI-FIN LAND

(FI) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 801215 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 16 . Ob . 8 0

Patentti· ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä - Giltighetsdag 16.01». 8 0

Patent* och registerstyrelsen (41) Tullut julkiseksi - Biivit ofientiig 21.10.80 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm - 31.01.89

Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv hakemus - Int ansökan (32)(33)(31) Pwdettv etuoikeus - Begärd pnoritet 20.01*.79 22.02.80, 02.0l*.80 Tanska-Danmark(DK) 161*5/79, 791/80, 1i*8i*/80 (71) Technobiotie Ltd., Toepferstrasse 5, Lucerne, Sveitsi-Schweiz(CH) (72) Kurt Fr imann Berg, Risskov, Tanska-Danmark(DK) (71*) Berggren Oy Ab (51*) Menetelmä Le-muotoa olevien ihmis-interferoniprotei inien valmistamiseksi ja puhdistamiseksi - Förfarande för framstä11 ning och rening av human Le-formig interferonprotein Tämä keksintö koskee ihmis-interferonin puhdistusta ja valmistusmenetelmää .

Keksinnön selityksessä ja patenttivaatimuksissa termi "proteiini" käsittää myös "glykoproteiinin".

Monia yrityksiä on tehty ihmis-interferonin puhdistamiseksi. Näiden puhdistuspyrkimysten tavoitteena on ollut myös inter-feronilajien ominaispiirteiden määrittely standardointitar-koituksia varten. Tähän mennessä eivät kuitenkaan mitkään yritykset puhdistaa Le-muotoa olevaa ihmis-interferonia ole täysin onnistuneet.

Tämä keksintö perustuu sellaisten puhdistusmenetelmien löytämiseen, jotka tekevät ensimmäisen kerran mahdolliseksi Le-muotoa olevan ihmis-interferoniproteiinin kaikkien komponenttien valmistuksen, jotka komponentit ovat olennaisesti vapaat epäaktiivisista ja muuten haitallisista epäpuhtauksista.

2 77877

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit käyvät ilmi patenttivaatimuksista 1 ja 17.

Interferonin Le-muoto on määritelty julkaisussa: E.A. Havell, B. Berman, C.A. Ogburn, K. Berg, K. Paucker ja J. Vilcek,

Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72., 2185-2187 (1975).

Keksinnön mukaisesti on valmistettu puhtaita ihmisen valkoso-luinterferoniproteiineja raa'asta ihmisen valkosoluinterfero-nista useitten erikoisten puhdistusvaiheitten kautta, ja puhtaat ihmisen valkosolu-interferonit on karakterisoitu värjätyillä proteiininauhoilla SDS PAGE -menetelmässä (natriumdo-dekyylisulfaattipolyakryyliamidigradienttielektroforeesi).

Ne erityiset koeolosuhteet, joita on käytetty puhtaiden ihmisen valkosolu-interferoniproteiinien valmistukseen ja karakterisointiin, on esitetty myöhemmin kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" sekä kohdassa "Kokeellinen osa". Eräät puhtaiden s interferoniproteiinien valmistukseen ja karakterisointiin sisältyvistä tuotteista ja menetelmistä ovat sinänsä tähän saakka tuntemattomia ja ne muodostavat keksinnön aspektit yleisen käyttökelpoisuuden suhteen interferoniteknologiassa ja yleensä proteiininpuhdistusteknologiassa. Ne puhtaat ihmis-interferoniproteiinit ja erikoisesti puhtaat Le-muotoa olevat ihmis-interferoniproteiinit, jotka on nyt keksinnön avulla saatettu käytettäviksi ja karakterisoitu, ovat sinänsä keksinnön aspekteja ja lisäksi avaimena uusiin kehityksiin, jotka myös ovat keksinnön aspekteja ja joita selostetaan tässä selityksessä .

Useissa toistetuissa kokeissa on todettu, että niissä SDS

PAGE- ja värjäysolosuhteissa, jotka on selostettu kohdassa "Materiaalit ja menetelmät", ja interferonin kokonaismäärän 6 ollessa 0,9 x 10 IFU puhdas ihmisen valkosolu-interferoni osoittaa omaavansa olennaisesti vain kaksi terävää värillistä proteiininauhaa kohdissa 18400 + 200 ja 20100 + 200 Dalton sekä pienemmän värillisen proteiininauhan välillä i 3 77877 20300 + 200 - 20400 + 200 Dalton. Kuten myöhemmin selostetun proteiininmäärityksen yhteydessä on todettu, ihmisen puhtaan valkosolu-interferonin spesifinen aktiivisuus on g noin 10 IFU/mg proteiinia, mutta saatu spesifinen aktiivisuus voi vaihdella jonkin verran riippuen käytetystä pro- teiininmääritysmenetelmästä, ja niinpä proteiinin spesifi- 8 9 sen aktiivisuuden päätellään olevan välillä 2 x 10 - 2 x 10 IFU/mg proteiinia. Se seikka,että puhtaan interferonin spektrissä esiintyy kaksi voimakasta selvästi erotettavaa nauhaa, on yhdenmukainen aikaisempien havaintojen kanssa käytettäessä puhdistamattomia tai osaksi puhdistettuja interferonipreparaatteja, jotka osoittivat, että ihmisen valkosolu-interferoni käsittää ainakin kaksi päälajia. Interferonin kokonaismäärän ollessa suurempi, esim. 3,8 x 106 IFU, yllämainitun SDS PAGE-systeemin on todettu kykenevän esittämään enemmän eritellyn proteiinikuvion, joka käsittää kuusi interferoniproteiininauhaa, nimittäin kaksi voimakkaasti värjättyä nauhaa kohdissa 18410 + 200 Dalton ja 20180 + 200 Dalton, keskivahvasti värjätyn nauhan kohdassa 20420 + 200 Dalton (joka vastaa yllämainittua vähemmän värjättyä nauhaa) sekä tuskin näkyvät proteiininauhat kohdissa 19500 + 200, 21130 + 200 ja 23440 + 200 Dalton. Kunkin SDS PAGE-akryyligradienttigeelin yllämainituissa nauhoissa esiintyvistä yksityisistä komponenteista on todettu osoittavan biologisia interferoniaktiivisuuksia: virusvastäistä aktiivisuutta, kykyä neutraloida ainoastaan muu kuin ihmisestä peräisin oleva valkosolu-interferoni (mutta ei vastaavaa fibroblast-interferonia) ja solujen-vastaista aktiivisuutta sekä eräitä ns. viruksia koskemattomia aktiivisuuksia, kuten esimerkiksi vahvistamalla "Natural Killer^-soluja, vahvistamalla MLC-CML:ää, lisäämällä HLA-antigeenejä jne.

Interferoniproteiinien täydellinen puhdistus tekee ensimmäisen kerran mahdolliseksi tuottaa anti-interferonia, joka on tarkkaan spesifinen aktiivisten interferonilajien suhteen yksinkertaisesti immunoitaessa eläimiä pelkällä interferonipreparaatilla tai yhdellä tai useammalla sen komponentilla. Tällainen tarkkaan monospesifinen anti- 4 77877 interferoni on erittäin hyödyllinen vasta-aineaffiniteetti-kromatografiässä puhdistamattoman tai osittain puhdistetun interferonin puhdistamiseksi, niin että aikaansaadaan yksinkertaisella ja taloudellisella tavalla suuria määriä puhdasta tai erittäin hyvin puhdistettua interferonia kliinisiä tarkoituksia, standardointia, kemiallisia tutkimuksia ja sarja-tutkimuksia varten, sekä käytettäväksi immunogeenina monospe-sifisen anti-interferonin toistovalmistukseen. Tämän keksinnön puitteisiin ei kuulu ainoastaan ihmisvalkosolu-interfero-nin puhdistus puhdasta ihmisvalkosolu-interferonia vastaan aikaansaadun monospesifisen vasta-aineen avulla, vaan myös sellaisten muiden interferonityyppien puhdistus, jotka risti-reagoivat immunologisesti monospesifisen anti-interferonin, esim. "Namalva"-interferonin kanssa (ihmisen lymfoblastoidi-interferoneja; Le-muotoa oleva interferoni muodostaa noin 85 % ihmisen lymfoblastoidi- eli Namalva-interferonin biologisesta aktiivisuudesta (vertaa julkaisua E.A. Havell, Y.K. Yip ja J. Vilcek, "Characterization of human lymphoblastoid (Namalva) interferon, J. gen. Virol., 38^, 51-59 (1977) ja sellaisen Le-muotoa sisältävän interferonin kanssa, joka on saatu viljelemällä sellaista DNA:ta sisältävää mikro-organismia, joka on koodattu interferoniproteiinien tuottamista varten (tai proteiinien, joilla on huomattavat biologiset interferoniak-tiivisuusdeterminantit).

Interferonisyötön ollessa 0,9 x 10$6£ IFU esiintyvät puhtaat ihmisvalkosolu-interferoniproteiinit yllä mainittuna kolmena erillisenä proteiininauhana SDS PAGE -akryyliamidigra-dienttigeelissä yhdessä viiden tai kuuden biologisen huipun kanssa. Esiintyykö viisi vai kuusi biologista nauhaa, riippuu geeliviipaleen leikkauskohdasta. Kuviossa 1 on esitetty värjätty SDS PAGE -gradienttigeelilevy valmis- 5 77877 tettuna tällä interferonisyötöllä, kuten on selostettu kohdassa "Materiaalit ja menetelmät". On osoittautunut, että kullakin proteiininauhoista on selvä interferoniaktii-visuus. Kuviossa 2 on piirros saman interferonimäärän omaavasta SDS-levystä tehdystä toisesta kokeesta, kuvion 2 esittäessä myös nauhoihin liittyvän interferoniaktiivisuus-profiilin, määritettynä kuten myöhemmin selostetaan kohdassa "Materiaalit ja menetelmät". Nähdään viisi biologista interferonihuippua yhdessä kolmen selvän värillisen proteiinin kanssa. Kuviosta 2 ilmenee selvästi, että proteiininau-hat osuvat tarkkaan interferoniaktiivisuushuippujen kohdalle. Tämä osoittaa, että proteiinit ovat interferoniproteii-neja. On tärkeää ottaa huomioon, että interferoniaktiivi-suusprofiili tulee tietystikin riippumaan yksityisten geeli-viipaleitten täsmällisestä asemasta. Kuviossa 2 kohdalla 20410 + 200 Dalton olevan pienemmän nauhan interferoniaktii-visuus ei ole kovin selvä, mutta samalla interferonisyötöllä suoritetuissa kokeissa on osoittautunut, että tämä pienempi nauha omaa interferoniaktiivisuuden, ja suuremmalla syötöllä suoritetuissa kokeissa (katso selostusta alempana) on pienemmän nauhan todettu olevan selvä interferonin alalaji. SDS PAGE-systeemistä saatu interferoniaktiivisuuden määrä, joka on havaittu vastaavissa interferoniproteiini-viipaleissa, vastaa lineaarisesti sitä proteiinimäärää, joka on määritetty proteiininauhojen värjääntymisen intensiteetistä. Niinpä kahden suuremman interferoninauhan ja pienemmän nauhan selvä olemassaolo on tullut todistetuksi kuvioissa 1 ja 2 kuvatuissa kokeissa. Kokeissa, joissa interferonisyöttö oli suurempi, on yllämainittu yksityiskohtaisempi nauhakuvio tullut osoitetuksi, kuten on esitetty kuviossa 3 (kuusi interferoniproteiinia yhdessä kuuden biologisen huipun kanssa määrättynä värjäyksen ja värittömäksi tekemisen jälkeen). Koska on tunnettua, että SDS-käsitelty interferoni säilyttää immunologiset determinant-tinsa, vieläpä ilmaisee (tai ylläpitää) antigenisyytensä selvemmin kuin SDS-käsittelemätön interferoni (kuten ovat osoittaneet immunoimalla hiiriä ihmisvalkosolu-interfero-nilla Paucker et ai. /Dalton, B.F., Ogburn, C.A., Paucker, K., Production of antibodies to human interferons in mice, 77877

Infect. Immun. 19_(2) , 570-574 (1978), pp 4; 25-30]_7, prepa-ratiivinen SDS PAGE tekee mahdolliseksi ei vain kunkin komponentin saannin eristetyssä muodossa, vaan myös immu-noinnin suorittamisen eristetyillä komponenteilla, kuten on selostettu seuraavassa.

Spesifisen aktiivisuuden suhteen ilmaistuna keksintö koskee ihmis-interferonia tai sen lajeja, joiden spesifinen aktii- 8 9 visuus on noin 2 x 10 - 2 x 10 IFU/mg proteiinia. Koska proteiininmäärityksen metodologia vaihtelee huomattavasti, on spesifisen aktiivisuuden lukuarvo vähemmän merkityksellinen verrattuna siihen, että yksityiset lajit on osoitettu SDS PAGE-systeemiä käyttäen.

Keksinnön mukaiset puhtaat interferoniproteiinit voidaan sen vuoksi sopivimmin ilmaista Le-muotoa olevina ihmis-interferoniproteiineina, jotka niissä SDS PAGE- ja värjäys-olosuhteissa, jotka on määritelty tässä selityksessä, inter- g feronin kokonaissyötön ollessa 0,9 x 10 IFU tuovat esiin kaksi suurta terävää värillistä, virusvastaisen interferoni-aktiivisuuden omaavaa proteiininauhaa kohdissa 18400 ja 20100 Dalton sekä pienemmän värillisen, virusvastaisen in-terferoniaktiivisuuden omaavan nauhan välillä 20300-20400 : Dalton yhdessä virusvastaisen interferoniaktiivisuuden omaa- vien pienempien huippujen kanssa kohdissa 19500, 21130 ja 23440 Dalton (näiden Dalton-molekyylipainojen koetarkkuu-; den ollessa + 200 Dalton), SDS PAGE-akryyliamidigradientin osoittamatta olennaisesti mitään muita värillisiä proteiini-alueita; tai Le-muotoa olevina ihmis-interferoniproteiinei-na, jotka niissä SDS PAGE- ja värjäysolosuhteissa, jotka on määritelty tässä selityksessä, interferonin kokonaissyötön ollessa 3,8 x 10^ IFU tuovat esiin kuusi virusvastaisen interferoniaktiivisuuden omaavaa värillistä proteiininauhaa, nimittäin voimakkaat nauhat kohdissa 18410 ja 20180 Dalton, keskivoimakkaan nauhan kohdassa 20420 Dalton sekä tuskin näkyvät nauhat kohdissa 19500, 21130 ja 23440 Dalton (näiden Dalton-molekyylipainojen koetarkkuuden ollessa + 200 Dalton), näiden virusvastaisen interferoniaktiivisuuden huippujen osuessa tarkkaan värillisten proteiini- i 7 77877 nauhojen kohdalle, SDS PAGE-akryyliamidigradientin osoittamatta olennaisesti mitään muita värillisiä proteiinialueita.

On tärkeää ottaa huomioon, että yksityiset komponentit yllämainituissa SDS PAGE-geelin nauhoissa osoittavat biologista interferoniaktiivisuutta, kykyä neutraloida muuta kuin ihmisvalkosolu-interferonia ja solujenvastaista aktiivisuutta jne. Keksintö koskee myös jokaista kunkin yllämainitun SDS PAGE-nauhan edustamaa yksityistä komponenttia sekä mitä tahansa proteiinia, jolla on merkittävä biologinen interferoniaktiivisuusdeterminantti tai -determinantteja, jonka tai jotka yksityiset komponentit omaavat, ja mitä tahansa proteiinia, jolla on merkittävä immunologinen determinantti tai determinantteja, jonka tai jotka yksityiset komponentit omaavat.

Alkuperänsä suhteen voivat ihmis-interferoniproteiinit olla lähtöisin ihmisvalkosolu-interferonista, joka on valmistettu ihmissoluja käyttäen, tai viljellyistä ihmisen lymfoblastoi-disoluista (Namalva-soluista) tai proteiineista, jotka on valmistettu viljelemällä sellaista DNA:ta sisältävää mikro-organismia, joka on koodattu interferonia tai sen tärkeää osaa varten, kuten edellä on selostettu, mutta myös Le-muotoa olevat ihmis-interferonit, jotka ovat muuta alkuperää mutta jotka ovat yhtäpitäviä yllämainittujen ominaispiirteiden suhteen, sisältyvät tämän keksinnön puitteisiin.

On tunnettua, että Le-muotoa olevilla ihmis-interferoneil-la on useita tärkeitä terapeuttisia aspekteja ihmisessä, mm. virusvastainen ja kasvainvastainen aktiivisuus, ja puhtaan Le-muotoa olevan ihmis-interferonin aikaansaaminen tekee mahdolliseksi käyttää yhä enemmän hyväksi näitä edullisia ominaisuuksia. Tämän keksinnön eräs aspekti koskee Le-muotoa olevaa puhdasta ihmis-interferoniproteiinia tai tällaisia proteiineja sisältävää preparaattia, joka soveltuu annettavaksi ihmisille tai eläimille profylaktisten tai terapeuttisten vaikutusten aikaansaamista tai immunointia 8 77877 varten. Tällainen preparaatti voi olla sovitettu esim. parenteraalisesti eli ruoansulatuskanavan ulkopuolitse, nenänsisäisesti tai paikallisesti tapahtuvaa antoa varten.

Erikoisen hyödyllinen keksinnön mukaisten puhtaiden inter-feroniproteiinien preparaatti on vesiliuos. Puhtaat inter-feroniproteiinit on vesiliuoksessa stabiloitava, ja stabilointiaineen valinta riippuu liuoksen käytöstä. Kun liuos on tarkoitettu annettavaksi ihmisille, esim. parenteraalisesti, pitää stabilointiaineen olla fysiologisesti hyväksyttävä, ja sopiva stabilointiaine on tällöin proteiini tai proteiinien yhdistelmä, joka ei ole myrkyllinen eikä immuno-geeninen ihmisille, esimerkiksi ihmisseerumiproteiinit tai niiden fraktiot sekä ihmisalbumiini. Tyypillinen edullinen stabilointiaine on 1 % ihmisalbumiini. Normaali puhtaiden interferoniproteiinien pitoisuus preparaateissa parenteraa-lista ihmisille antoa varten tulee olemaan alueella, joka vastaa 1-20 miljoonaa IFU/ml, ja normaalin päivittäisen annoksen ollessa kaikkiaan välillä 3-10 miljoonaa, esim.

5-10 miljoonaa IFU, sopivimmin annettuna 1 tai 2 kertaa päivässä lihaksensisäistä ruiskutusta käyttäen. Valmistettaessa puhtaan interferonin liuoksia ihmisille annettavaksi on otettava huomioon normaalit farmaseuttiset varotoimenpiteet, joita yleensä noudatetaan parenteraalisten preparaattien valmistuksen yhteydessä, kuten varotoimenpiteet, jotka varmistavat, että liuos on steriiliä ja kuumetta aiheuttamatonta. Kun stabiloituna preparaattina on Le-muotoa olevan puhtaan ihmis-interferoniproteiinin tai tällaisten proteiinien vesiliuos käytettäväksi eläimien immunointiin monospe-sifisen anti-interferonin valmistusta varten, on stabilointi yhdisteellä SDS (natriumdodekyylisulfaatti) Le-muotoa olevan puhtaan ihmis-interferoniproteiinin tai tällaisten proteiinien SDS-kompleksin muodostamiseksi edullista, ottaen huomioon sen yllämainitun seikan, että SDS lisää interferonin antigenisiteettiä ja/tai stabiliteettiä. Kuten yksityiskohtaisemmin selostetaan seuraavassa, voidaan puhdas interferoni-SDS-yhdistelmä eli -kompleksi muodostaa yksinkertaisesti lisäämällä yhdistettä SDS puhtaiden interferoni-proteiinien vesiliuokseen, sopivimmin pitoisuuteen noin 0,1 % 77877 9 liuoksen painosta, pH-arvon ollessa 7,2. Le-muotoa olevan puhtaan ihmis-interferoniproteiinin tai tällaisten proteiinien SDS-kompleksi muodostaa sinänsä stabiliteettinsä johdosta tämän keksinnön erään arvokkaan aspektin, ja eräs tämän kompleksin erittäin tärkeä muoto, joka soveltuu säilytykseen ja kuljetukseen (varsinkin alhaisessa lämpötilassa, esim. lämpö- o o tilassa, joka on enintään 4 C tai sopivimmin -20 C), on kiinteässä muodossa eristetty kompleksi, kuten myöhemmin selostetaan. Tämän keksinnön puitteisiin sisältyy myös muiden, detergent ti tyyppiä olevien stabilointiaineiden käyttö tähän tarkoitukseen. Edelleen eräs Le-muotoa olevien puhtaiden ih-mis-interferoniproteiinien edullinen muoto on sellainen muoto, jossa ne on sidottu valmisteeseen Cibracron Blue F3GA^ tai johonkin muuhun ligandiin, joka kykenee sitomaan interfero-niproteiineja valmisteen Cibracron Blue F3GA''-'* osoittaman mekanismin mukaisesti, kuten yksityiskohtaisemmin seuraavassa selostetaan.

Eläinten immunointiin monospesifisen anti-interferonin valmistusta varten tarkoitetun puhtaan interferoniproteiinin liuoksen pH-arvo on sopivimmin noin 7,2, sopivan puskurin ollessa PBS (fosfaattipuskuroitu suolaliuos).

Eläinten immunointiin tarkoitettu puhtaan interferoniproteiinin stabiloitu preparaatti voi lisäksi sisältää adjuvantin sen antigenisiteetin edelleen lisäämiseksi, sopivan adjuvantin ollessa Freund'in adjuvantti.

Keksinnön puitteisiin sisältyy myös Le-muotoa olevien puhtaiden interferoniproteiinien tai kunkin yksityisen proteiinin antigenisiteetin lisääminen ja/tai stabilointi liittämällä immunogeeniseen kantoaineeseen (niin että puhdas interfero-niproteiini tai tällaiset proteiinit tulevat esiintymään eräänlaisena "hapteenina") tunnettujen periaatteiden mukaisesti. Esimerkkeinä immunogeenisistä kantoaineista voidaan mainita PPD (Purified Protein Derivative) ja BCG (Bacille Calmette Guerin). Tällaisten immunogeenisten kantoaineiden käyttöä ei kuitenkaan nykyisin pidetä suotavana.

10 r-ι f—I

77877

Koska värilliset interferoniproteiininauhat SDS PAGE -systeemissä ovat täysin tai olennaisessa määrässä säilyttäneet an-tigeniteettinsä, on myös mahdollista käyttää värillisiä inter-feroniproteiineja välittömästi poistettuina SDS PAGE -systeemistä antigeenipreparaatteina immunoitavissa olevien eläinten, kuten kaniinien, immunointiin.

On havaittu, että yhtä keksinnön mukaista puhdistettua inter-feroniproteiinia vastaan tuotetut vasta-aineet kykenevät neutraloimaan myös muita keksinnön mukaisia puhdistettuja proteiineja. Niinpä on ilmeistä, että monospesifiset vasta-aineet, riippumatta siitä, ovatko ne tuotetut yhtä keksinnön mukaista interferoniproteiinia vai keksinnön mukaisten puhdistettujen interferoniproteiinien yhdistelmää vastaan, ovat yhtä tehokkaita puhdistamaan Le-muotoa olevaa ihmis-interfero-nia sisältäviä liuoksia.

Tunnettujen periaatteiden mukaisesti voidaan monospesifistä anti-interferonia käyttää vastaavan interferonin tai interfe-ronikomponentin määritykseen biologisissa nesteissä, kuten radioimmunomäärityksessä tai sentapaisissa menetelmissä. Mo-nospesifisiä vasta-aineita voidaan käyttää interferonipitois-ten liuosten puhdistuksessa vasta-aineaffiniteettikromatogra-fiassa tämän keksinnön mukaisten Le-muotoa olevien interferonien tuottamiseksi. Tätä tarkoitusta varten vasta-aineet im-mobilisoidaan matriksissa tunnetulla tavalla, parhaiten sidottuna kovalenttisesti sopivaan vasta-aineaffiniteettikroma- tografiamatriksiin, kuten ristisidottuun agaroosiin, esim.

TM

farmasia-aineeseen Sepharose 4B . Interferonia sisältävien liuosten puhdistus vasta-aineaffiniteettikromatografialla voidaan suorittaa minkä tahansa tunnetun menetelmän mukaisesti, joko erittäin tai sopivimmin käyttämällä kolonniin vietyä matriksi-immobilisoitua vasta-ainetta.

Vasta-aineaffiniteettikolonnien valmistus monospesifistä anti-interferonia käyttäen sekä operaatio näissä kolonneissa 11 „ „ 77877 suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla. Näihin kolonneihin viety interferonia sisältävä liuos voi olla puhdistamaton vä-kevöimätön interferonipreparaatti tai se voi olla väkevöity tai osittain puhdistettu interferonipreparaatti. Kolonniin vietynä interferonipreparaattina voi olla mikä tahansa interferonipreparaatti, joka sisältää Le-muotoa olevaa ihmis-interferonia, ts. ihmisvalkosolu-interferoneja, ihmisen lym-foblastoidi-interferoneja (Namalva-interferoneja) tai sellaista interferonia (tai sen tärkeitä osia), joka on tuotettu viljelemällä mikro-organismia, joka sisältää interferonia varten koodattua DNA:ta, kuten edellä on selostettu. Vasta-aineiden käyttö osittain puhdistettua ihmisvalkosolu-interfe-ronia vastaan vasta-aineaffiniteettikromatografiassa Namalva-interferonin ja valkosolu-interferonin puhdistamiseksi on jo aikaisemmin selostettu /vertaa esim. julkaisua Scand. J. Immunol., 8, 429-436 (1978//. Tärkeä parannus on kuitenkin se, että monospesifinen anti-interferoni pidättää olennaisesti ainoastaan Le-muotoa olevan ihmis-interferonipro-teiinin, muiden preparaatin proteiinien läpäistessä kolonnin. Spontaanista ristireagoinnista johtuvia hyvin pieniä epäpuh-tausmääriä ei voida eliminoida, eikä silloinkaan, kun käytetyt vasta-aineet ovat hydridomimenetelmällä tuotettuja vasta-aineita, joiden tätä lukuunottamatta pitäisi olla odotettavissa "tuottavan" pelkästään puhtaita interferoniproteiineja (tai reagoivan niiden kanssa).

Tällaisten vasta-ainekolonnien (jotka voidaan konstruoida vasta-aineaffiniteettikromatografiakolonnien yleisesti tunnettujen periaatteiden mukaisesti) mitoituksen ollessa sopiva niitä voidaan käyttää interferonin suurimittaiseen teolliseen puhdistukseen puhdistamattomasta interferonipreparaatista puhtaiden (tai erittäin hyvin puhdistettujen) interferonipro-teiinien aikaansaamiseen kolonnieluaatissa. Tällä tavalla valmistetut puhtaat (tai erittäin hyvin puhdistetut) interfe-roniproteiinit stabiloidaan tähän käyttöön soveltuvilla stabilointiaineilla, kuten edellä on selostettu.

12 77877

Koska niissä interferonipreparaateissa, jotka viedään mono-spesifisiin anti-interferonikolonneihin, interferoni on tavallisesti läsnä hyvin pieninä pitoisuuksina painosuhteissa ja koska on eristettävä niin suuria määriä kuin mahdollista arvokasta interferonia, on tärkeää minimoida interferoniproteii-nien mahdollinen hajoaminen, joka voi johtua jossakin biologisessa aineessa esiintyvästä proteolyyttisestä aktiivisuudesta, jonka aineen kanssa interferoni joutuu kosketuksiin.

Täten proteolyyttisen aktiivisuuden poistaminen anti-interfe-ronivasta-aineista (immunoglobuliineista) suoritetaan sopi-vimmin siten, että vasta-aineet ennen matriksiin sitomista käsitellään matriksi-immobilisoidulla entsyymininhibiitillä tai entsyyminhajottimella, joka ei vahingoita immunoglobulii-neja (tai niiden tärkeitä fragmentteja). Niinpä vasta-aineet voidaan kuljettaa sellaisen kolonnin läpi, joka sisältää mat-riksi-immobilisoitua poly-Lrlysiiniä ja/tai matriksi-immobi-loisoitua Soyabean Trypsin'^' -inhibiittiä ja/tai matriksi-immobilisoitua kallikreiini-inaktivaattoria. Erimerkki sopivasta vasta-aineiden käsittelystä on kuljetus sellaisen kolonnin läpi, joka sisältää-ristikytkettyyn agaroosiin, kuten valmisteeseen Sepharose 4Er-^ kovalenssisidottua poly-L-lysiiniä, ja sen jälkeen kuljetus samaan matriksiin kovalens-- sisidottua Soyanbean-Trypsin^ -inhibiittiä sisältävän kolon- ; nin läpi. On todettu, että tällainen proteolyyttisen aktiivi suuden poisto lisää interferoniaktiivisuuden saantoa puhdistettaessa interferonia sisältäviä liuoksia vasta-aineaffini-teettikromatografiän avulla.

Kun monospesifistä anti-interferonia kovalenssisidotaan matriksiin kuten ristikytkettyyn agaroosiin, sidotaan sitä sopi-vimmin sellaisessa määrässä, että matriksiin kovalenssisido-tun vasta-aineen kokonaismäärä tulee vastaamaan enintään 85 % kovalenssisidontavaiheessa käytettyjen immunoglobuliinien määrästä, kuten on selostettu tämän patentin hakijan julkaisussa Scand. J. Immunolog., 6, 77-86 (1977). Tämä aikaansaa suurimman mahdollisen interferonin saannon kolonnista.

13 7 7877

Kun eluaattia monospesifistä anti-interferonia sisältävästä affiniteettikromatografiakolonnista on käytettävä antoon ihmisille, on tärkeää, ettei eluaatti sisällä mitään komponenttia, joka voisi olla immunogeeninen ihmisessä. Vasta-aineaf-finiteettikromatografiaan liittyvänä vaarana voisi olla, että immunoglobuliinejä tai niiden fragmentteja vapautuu kolonnista ja tulee eluoiduksi yhdessä halutun proteiinin tai haluttujen proteiinien kanssa.

Tällaiset immunoglobuliinit tai niiden fragmentit, jotka ovat immunogeenisiä ihmisessä, poistetaan johtamalla eluaatti sellaisen vasta-aineaffiniteettikolonnin läpi, jossa vasta-aineet on suunnattu anti-interferoni-immunoglobuliineja vastaan ja ovat sellaista lajia, joka ei ole immunogeeninen pa-renteraalisesti ihmiselle annettaessa. (Ennen eluaatin kuljetusta kolonnin läpi pitää sen olla säädetty neutraaliin pH-arvoon, esim. dialysoimalla PBS-liuosta vastaan, pH 7,2).

Keksinnön mukaisesti suoritettavat puhdistusvaiheet puhtaiden ihmisvalkosolu-interferoniproteiinien (Le-muotoa olevien ih-mis-interferoniproteiinien) valmistamiseksi puhdistamattomas-ta ihmisvalkosolu-interferonista käsittävät väkevöimisen seostamalla proteiineja yhdisteellä KSCN, geelisuodatuksen, li-gandiaffiniteettikromatografian ja vasta-aineaffiniteettikro-matografian. Vaikka nämä vaiheet ovatkin tunnettuja interfe-ronitekniikassa, niiden erikoislaatuinen yhdistely ja ne erikoisolosuhteet, joita käytetään tietyissä operaatioissa, ovat uusia piirteitä, joista jotkin sinänsä muodostavat tämän keksinnön aspekteja. Vaiheiden erikoislaatuinen suoritustapa ja operaatioiden tietty yhdistely ovat aikaansaaneet interferonin optimaalisen puhdistuksen ja väkevöinnin, interferoniproteii-nien häviön ollessa mahdollisimman pieni vaihesarjan aikana.

KSCN-saostus suoritetaan parhaiten alentamalla KSCN-pitoisuu-den 0,5 M omaavan interferonin pH arvoon 4,5 tavanmukaiseen arvoon 3,5 alentamisen sijasta. Tämä on omiaan vähentämään huomattavasti proteiinin määrää saostumassa, helpottaen siten myöhempien puhdistusvaiheiden suoritusta.

14 77877

Geelisuodatus suoritetaan puskuriliuoksella, joka sisältää 25 tilavuusprosenttia etyleeniglykolia ja joka on 1-molaarinen natriumkloridin suhteen sisältäen yhdistettä PBS (pH 7,2). Tämä aikaansaa paljon paremman erottelukyvyn kuin pelkästään yhdisteen PBS tai pienen pH-arvon (2,4) käyttö tai käytettäessä virtsa-ainetta, PBS pH-arvolla 7,2. Eluaattifraktiot, jotka sisältävät proteiineja olennaisesti ainoastaan alueella 10000-20000 Dalton, kerätään.

Ligandiaffiniteettikromatografia suoritetaan tähän saakka tuntemattomalla ja erittäin edullisella tavalla, ja se muodostaa tämän keksinnön erään tärkeän aspektin:

Ligandiaffiniteettikromatografia suoritetaan määrätyissä olosuhteissa interferonilla, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään 50000-100000 iFU/mg proteiinia, käyttäen ligandina immobi li soitua valmistetta Cibacron Blue F3GA'>-^. Valmisteen Cibacron Blue F3GA'^--' käyttö ligandina interferonin affini-teettikromatografiässä on ollut tunnettua, mutta tämän keksinnön mukaan on havaittu, että tämän ligandin selektiivisyys lisääntyy voimakkaasti, kun käytetään tiettyjä olosuhteiden yhdistelmiä: Viedyllä interferonilla pitää olla paljon suurempi spesifinen aktiivisuus, esim. vähintään 50000-100000 IFU/mg proteiinia, kuin tätä ligandityyppiä tavanmukaisesti käytettäessä (jolloin viedään puhdistamatonta ihmisvalkosolu-interferonia, jonka spesifinen aktiivisuus on noin 3-5 x 10 IFU/mg proteiinia) ja liuoksen, jossa interferoni viedään kolonniin, pH-arvon pitää olla alueella 6,5-8 ja omata ionipi-toisuus, joka ei olennaisesti ylitä 10-100 mM, erikoisesti 20 mM fosfaattipuskurin (pH 7,2) ionipitoisuutta. Kun näin suhteellisen suuri interferonin spesifinen aktiivisuus viedään, muuttuu ligandin spesifiteetti, ja interferoniproteiinien voimakkaampi-vsitoutuminen ligandiin esiintyy. Valmisteen Cibacron F3GAV^' oletetaan vaikuttavan yhdessä interferoniproteiinien kanssa tavalla, joka osoittaa "dinucleotid-fold"-il-miön olemassaolon, ja tässä keskinäisessä vaikutuksessa valmisteella näyttää olevan sama sitoutumiasijainti kuin polyri-bonukleotideillä.

15 77877

Arvellaan, että ne erittäin edulliset ominaisuudet, joita Ci-bacron F3GAv-^ osoittaa omaavansa edellä selostetuissa kriittisissä olosuhteissa, esiintyvät myös tämän ligandin luokkaan kuuluvissa muissa jäsenissä, ja niinpä keksinnön tänä aspektina on menetelmä ihmis-interferonin puhdistamiseksi, joka menetelmä käsittää sellaisen vesiliuoksen, joka sisältää Le-muotoa olevaa ihmis-interferonia muodossa, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään 50000-100000 IFU/mg proteiinia, liuoksen ollessa puskuroitu pH-arvoon 6,5-8 ja omatessa ioni-pitoisuuden, joka ei olennaisesti ylitä 10-100 mM, erikoisesti 20 mM fosfaattipuskuriliuoksen (pH 7,2) ionipitoisuutta, viemisen mahdollisesti yhdessä veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen kuten etanolin (määrässä 5-80 %) kanssa matriksi- immobilisoituun ligandiip- joka kykenee sitomaan interferonia ΓΓΜ valmisteen Cibacron F3GAV-/ aikaansaaman mekanismin mukaisesti, sekä näin sidotun interferonin eluoimisen sen jälkeen.

Esimerkkejä aineista, jotka ovat matriksi-immobili^pitua val- (TM (TM) mistetta Cibacron F3GAV*-', ovat "Blue Dextran 2000>^’ (matrik-si: molekyylipainon 2 miljoonaa omaava dekstraani) ja Blue Sepharose CL-6B^-A Näitä ja muita aineita sekä niiden käyttöä tavanmukaisessa interferonin puhdistuksessa koskevia yksityiskohtaisia tietoja esiintyy julkaisussa Bollin et ai., Preparative Biochemistry, 8(4), 259-274 (1978).

6m)

Keksinnön mukaan on edullista immobilisoituna Cibacron F3GA^^ (m -valmisteena käyttää seosta, jossa Blue Dextran 2000^-^ on liitetty valmisteeseen Sepharose 4b^ (CNBr-aktivoidun valmisteen Sepharose 46^-^ avulla) .

Interferonin eluointi tämäntyyppisestä immobilisoidusta li-gandista on keksinnön mukaan osoittautunut erittäin selektiiviseksi käytettäessä pH-arvoon 7,2 puskuroitua 0,6 M NaCl-liuosta, ja 7,2 on myös kolonniin viedyn interferonipitoisen liuoksen sopivin pH-arvo.

Kuvio 4 esittää Blue Dextran Sepharose 4Bv^-kolonmn eluoin-tikuviota, johon kolonniin on syötetty osittain puhdistettua 16 77877 ihmisvalkosolu-interferonia (1 ml), spesifinen aktiivisuus 500000 IFU/mg proteiinia, 20 mM fosfaattipuskuria (PB, pH-arvo 7,4) vastaan suoritetun perusteellisen dialysoinnin jälkeen. Fraktioiden suuruus oli 5 ml ja virtausnopeus 35-40 ml/h. Kolonnia huuhdeltiin 20 mM PB-puskurilla 2 tuntia ennen kuin sitä eluoitiin vaiheittain 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ja 1,0 M NaCl-liuoksella PB-puskurissa (pH 7,4). Koko eluaatti (I + II + III) sisälsi 754000 IFU (30 ml:ssa), ja alkuaan viedyksi määräksi oli määritetty 750000 IFU. Niinpä saanto oli 100 %. Eluaatin spesifinen aktiivisuus oli 2,1 x 10 IFU/mg proteiinia. Puhdistuskerroin oli 42. Kontrolloitaessa eluaatteja SDS PAGE-systeemissä useimmat eluoidut proteiinit (< 98 %) esiintyivät arvon 50000 Dalton yläpuolella (epäpuhtauksia). Vertaa kuviota 4a, joka esittää viedyn aineen, huuhteluosuuden ja eluaatin (kuviosta 4) SDS PAGE-kuvaa. Vaikka pH-arvoon 7,2 puskuroitu 0,6 NaCl-liuos on erittäin edullinen eluaatti af-finiteettikolonnia varten, kuten ylläolevasta ilmenee, on huomattava, että myös laajempi pitoisuusalue on täysin selektiivinen, ja niinpä keksintö käsittää eluoinnin NaCl-vesiliuok-sella, jonka pitoisuus on 0,5-0,7 M, erikoisesti 0,5-0,65 M ja joka on puskuroitu pH-arvoon 6,5-8, tai jonkin muun vesiliuoksen, joka on puskuroitu pH-arvoon 6,5-8 ja jonka ionipitoisuus vastaa tällaisen NaCl-liuoksen ionipitoisuutta. Myös muiden eluanttien käyttö sisältyy keksinnön puitteisiin. Esimerkkeinä voidaan mainita suolat ja/tai etyleeniglykoli lisäten pitoisuutta porrastetusti tai gradienttisesti aina 50 %:iin saakka, aminohapot, keinotekoiset aminohapot, amfoliinit ja proteiinit sekä proteiiniseokset. Kuten edellä on mainittu, voidaan in-terferoniliuos viedä kolonniin yhdessä veteensekoittuvan orgaanisen liuottimen kuten alkoholin, erikoisesti etanolin kanssa.

Keksinnön mukaisesti affiniteettikromatografiällä puhdistettava interferoni on tyypillisesti interferoni, joka sisältää Le-muotoa olevia ihmis-interferoniproteiineja kuten ihmisinterferoneja (paitsi ihmisen fibroblasti- 77877 17 interferoneja), ts. esim. ihmisen valkosolu-interferoneja, ihmisen lymfoblastoidi-interferoneja ja Le-muotoa olevia ihmis-interferoniproteiineja tai näiden tärkeitä osia, kun ne on valmistettu viljelemällä mikro-organismikloonia, joka sisältää DNA-koodauksen tällaisen interferoniproteii-nin tuottamista varten. (Se seikka, että ihmisen lymfoblas-toidi-interferoni (Namalva) sisältää pienen osuuden fibroblastiluonteista interferonia (F-muoto - vastaten 15 % biologisesta aktiivisuudesta), ei huononna sitä tosiasiaa, että ihmisen lymfoblastoidi huomattavan interferoniaktiivi-suutensa suhteen on Le-muotoa oleva ihmis-interferoni siten, että se sisältää Le-muotoa olevia ihmis-interferoniproteii-neja (vastaten 85 % biologisesta aktiivisuudesta) omaten determinantteja, jotka ovat identtisiä ihmisvalkosolu-inter-feroniproteiinien determinanttien kanssa, kuten on osoitettu tämän keksinnön mukaan).

On edullista, että affiniteettikolonniin viedyn interferoni-preparaatin spesifinen aktiivisuus on 100000-1000000, kuten 200000-1000000, esim. noin 500000, esim. 500000-1000000 IFU/mg proteiinia.

Keksinnön tämän aspektin mukaisesti operoidusta affiniteet-tikromatografiakolonnista saatu eluaatti voi olla edullinen tuote myös terapeuttista käyttöä varten. Sillä tulee usein olemaan spesifinen aktiivisuus, joka on vähintään 30 x 106 IFU/mg proteiinia, perustuen Lowry-menetelmään käytettäessä puhdasta ihmisen albumiiniseerumia standardina, kuten 30 x 10® - 10®, esim. 30 x 10® - 70 x 10® IFU/mg proteiinia. Ihmisille antoa varten tämä preparaatti on saatettava tavallisten varotoimenpiteiden alaiseksi, jotta varmistetaan, että se on steriiliä ja kuumetta aiheuttamatonta. Tämän preparaatin annostus tulee vastaamaan yllämainittua puhtaan interferonin annostusta kokonaisaktiivisuuteen perustuen.

Kuten on selostettu tämän selityksen kokeellisessa osassa, affiniteettikromatografiakolonnista saatu eluaatti saatettiin puhtaaseen interferoniin johtavissa alkuperäisissä kokeissa lopullisen puhdistuksen alaiseksi kuljettamalla se ie 77877 absorboidun vasta-aineaffiniteettikolonnin läpi, jossa kolonnissa vasta-aineet ovat immunoglobuliineja, jotka on tuotettu osittain puhdistettua ihmisvalkosolu-interferonia vastaan ja josta sen jälkeen on poistettu vasta-aineet saastuttavia proteiineja vastaan johtamalla useita kertoja matriksi-immobili-soitua puhdistamatonta ihmisvalkosoluinterferonia sisältävien kolonnien läpi. Kuten yksityiskohtaisemmasta selityksestä alempana ilmenee, puhdistamattoman interferonin kovalensaisidonta matriksiin (kuten esim. valmisteeseen Sepharose 4eS»') hävittää itse interferonin immunologiset determinantit (> 98 %), mutta ilmeisesti ei epäpuhtauksien suurimman osan determinantteja, ja tämä merkitsee sitä, että kun osittain puhdistettua valkosolu-interferonia vastaan tuotetut immuno-globuliinit kuljetetaan (normaalisti useita kertoja) kolonnin läpi, niissä olevat antiepäpuhtaudet tulevat pidätetyiksi kolonniin, anti-interferonin läpäistessä kolonnin. Tätä useita kertoja absorboitua anti-interferonia käytettiin affiniteet-tikromatografiaa seuraavassa vasta-aineaffiniteettikromato-grafiavaiheessa.

Kuten kokeellisesta osasta käy ilmi, edullinen menetelmä af-finiteettikolonneja, ts. Blue Dextran-Sepharose'*-'' -kolonnia ja vasta-aineaffiniteettikolonnia käytettäessä on yhdistää nämä kaksi kolonnia siten, että Blue Dextran^ -kolonnista poistuva eluaatti samanaikaisesti syötetään vasta-aineaffiniteettiko-lonniin. Täten vältetään kaikki häviöt, joita muuten voisi esiintyä, jos Blue Dextran''-'7 -kolonnista saatuja eluaattifrak-tioita käsiteltäisiin erillisinä.

Le-muotoa olevien ihmis-interferoniproteiinien lopullisessa väkevöinnissä käytettiin ainutlaatuista proteiinienväkevöin-timenetelmää suorittamalla saostus yhdisteellä SDS. Tämä menetelmä muodostaa edelleen tämän keksinnön erään aspektin, ja se käsittää yhdisteen SDS tai sen suolan saostamisen proteii-niliuoksesta, joka sisältää yhdistettä SDS, pitoisuuden ol- - lessa sopivimmin 0,1-4 painoprosenttia, erikoisesti noin 0,1 painoprosenttia, sellaisen sakan muodostamiseksi, joka käsittää yhdisteen SDS tai sen suolan kompleksin tai komplekseja proteiinin kanssa, sakan erottami- 77877 19 sen liuoksesta, sopivimmin linkoamalla lämpötilassa 0-4°C sekä sakan liuottamisen pienempään nestetilavuuteen. Yhdisteen SDS saostuminen voidaan sopivasti aikaansaada a) alentamalla lämpötila arvoon OOC 15 minuutiksi tai b) lisäämällä suolaa, esim. K+-suolaa, joka muodostaa saostuman yhdisteen SDS tai SDS-proteiini-kompleksien kanssa. Tämä menetelmä on edullinen menetelmä puhtaiden tai puhdistettujen interferonien vesiliuosten väkevöimiseksi, ja on osoittautunut erinomaiseksi tavaksi väkevöidä Le-muotoa olevia ihmis-interferoniproteiineja, kuten edellä on mainittu.

Koko se puhdistusmenetelmäsarja, joka suoritetaan tämän keksinnön mukaisesti, on osoittautunut erittäin hyvin aktiivisuutta säilyttäväksi: Lähtien proteiinimäärästä 7 x 10^ gamma eristetyn puhtaan interferonin määrä oli 1 gamma tai pienempi (määritettynä vertaamalla SDS PAGE-systeemin proteiininauhoja). Interferonin kokonaisaktiivisuuden väheneminen puhdistamatonta interferonia olevasta lähtöerästä puhtaaseen interferoniin oli kaikkiaan ainoastaan arvosta 4 x 106 IFU arvoon 1,85 x 106 IFU (n. 50 %). Tämä tähdentää puhdistusprosessin ja sen yllämainittujen kriittisten vaiheitten ainutlaatuista luonnetta.

Materiaalit ja menetelmät

Interferonimääritykset suoritettiin tunnetun standardimenetelmän mukaisesti /Berg K., Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human Leukocyte Interferon, Scand. J. Immunol. 6, 77-86 (1977)7 käyttämällä VERO-soluja (apinan-munuaissoluja) sekä Vesicular Stomatitis-virusta (VSV) challenge-viruksena. Kaikki interferoniyksiköt (IFU) on ilmoitettu kansainvälisinä normiyksikköinä (69/19 B-yksik-köinä) (69/19 B-normi saatiin lähteestä MRC, Mill Hill, Englanti).

Interferoni. Puhdistamatonta ihmisvalkosolu-interferonia • · valmistettiin Cantell'in esittämän menetelmän mukaan (Cantell, K., Hirvonen, S., Mogensen, K.E. ja Pyhälä, L., Human leukocyte interferon: production, purification, stability and animal experiments. In: The Production and 20 77877

Use of Interferon for the Treatment and Prevention of Human Virus Infections, pp. 35-38, Waymouth, C. (ed.), Proceedings of a Tissue Culture Association Workshop held at Lake Placid, 1973 (In Vitro Monograph, volume 3), Tissue Culture Association, Rockville Md.) käyttäen Sendai-virusta interferonintuottajana. Osittain puhdistettua interferonia (PIF), jonka spesifinen aktiivisuus oli 5 x 10^ IFU/mg proteiinia valmistettiin puhdistamattomasta väkevöidystä ihmisvalkosolu-interferonista (CIF) etanolilla saostamalla, kuten on selostettu mainitussa julkaisussa: Cantell, K., Hirvonen, S., Mogensen, K.E. ja Pyhälä, L., loc. cit.

Puhdistamatonta Namalva-interferonia valmistettiin olennaisesti siten, kuin on selostettu julkaisussa: Strader et ai.,

Production of human lymphoblastoid interferon, J. Clin. Microbiol. _1, 116-124 (1975), käyttämällä Sendai-virusta interferonintuottajina.

Interferonin neutralointi anti-interferonin määrittämiseksi suoritettiin mikromäärityssysteemissä seuraavalla tavalla: 20000 VERO-solua syvennystä kohti istutettiin 100 yUl:aan väliainetta ja pidettiin kostutuskammiossa kaasukehän sisältäessä 5 % CO2. Toisena päivänä väliaine poistettiin soluista, ja kuhunkin syvennykseen vietiin 100 ^ul (väliaineella) laimennettua antiseerumia, jonka sisältämä interferonipitoi-suus oli 6-8 IFU/ml (seerumin ja interferonin ollessa esihau-dottuja lämpötilassa 37°C 1 tunnin ajan). Kolmantena päivänä väliaine poistettiin ja kaikkiin syvennyksiin vietiin -3 5 100 yul virusta VSV (laimennettuna arvoon 10 ' väliainees sa) . Neljäntenä päivänä määritettiin CPE (sytopatogeeninen vaikutus), ja 50-prosenttista hajoamista pidettiin anti-inter-feronitiitterin määrityksen päätepisteenä. Tiitterit ilmoitetaan interferonin neutralointiyksikköinä (IFU-NU) milli-litraa kohti.

Epämonospesifistä anti-interferonia ainetta PIF vastaan valmistettiin julkaisun Mogensen, K.E., Pyhälä, Liisa ja Cantell, K., Acta path, microbiol. scand. Sect. B, 83, 443-450 (1975) mukaisesti, osaksi lampaissa ja osaksi kanii- 21 77877 neissa. Lammas-anti-interferonin tiitteri oli 100-250000 IFU-NU/ml. Kaniini-anti-interferonin valmistamiseksi kaniiniin 5 ruiskutettiin viikoittain ihonalaisesti ainetta PIF (2 x 10 IFU) yli 2 vuoden ajan. Kaniini-anti-interferonin tiitteri oli 15000-30000 IFU-NU/ml. Kaikki immunoglobuliinit eristettiin seostamalla 50 % ammoniumsulfaattiliuoksella ja sen jälkeen suorittamalla dialyysi fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS) vastaan (pH 7,2).

Kemikaalit. CNBr oli Fluka'lta (säilytetty lämpötilassa ö -20 C). Natriumdodekyylisulfaatti (SDS), erikoispuhdasta elektroforeesia varten, hankittiin British Drug House'n (BDH) kautta. Soyabean Trypsin'^'-inhibiitti (STI) ja L-lysiini hankittiin Sigma'lta. Sepharose 4B><, CNBr-aktivoitu Sepharose 4b'^, J2H-aktivoitu Sepharose 4Bx^-'ja epoksi-aktivoitu Sepharose βΒ'^-' olivat kaikki Pharmacia' lta (Tanska).

Sidontamenetelmät. Immunoglobuliinien kovalenssisidonta valmisteeseen Sepharose 4B'*-? suoritettiin kuten aikaisemmin on selostettu julkaisussa K. Berg, Scand. J. Immunolog., 6, 77-86 (1977). Tarkoituksellisesti sidottiin vain 80-85 % im-munoglobuliineista.

Proteiinin määritykset suoritettiin käyttäen Lowry-menetel-män muunnosta ^Berg, K., Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human Leukocyte Interferon, Scand. J. Immunolog., <5, 77-86 (1977)^, jolla on mahdollista todeta 1-2 yug/ml todettavissa olevien proteiinien alimpana tasona (käyttämällä systeemiä "LKB Calculation Absorptioner Ultralab System"). Kiteistä härän seerumialbumiinia käytettiin standardiproteii-nina. Puhdistetun interferonin proteiinipitoisuuden (kaikkiaan 1-5 ^ug) määritykseen käytettiin seuraavaa menettelyä: yhdistettä SDS lisättiin pitoisuuteen 0,1 % saakka. Lyofili-soitua proteiinikoetetta tutkittiin edelleen SDS-polyakryy-. . liamidielektroforeesilla (SDS PAGE, katso alempana) tislattua vettä vastaan suoritetun dialyysin jälkeen. Värjättyjen pro-teiininauhojen intensiteettiä verrattiin tunnettuihin standardeihin erilaisissa määrissä 77877 22 (vertaa alempana kohtaa SDS PAGE), ja proteiinien kokonaismäärät arvioitiin. Poikkeamat olivat välillä 5-10 % ja alin havaittava proteiinitaso oli 0,1 yug (kaikkiaan). Tämän menetelmän tulokset ovat likimääräisiä arvioita eikä tarkasta mittauksesta saatuja.

Affiniteettikromatografiat suoritettiin lämpötilassa 4°C. Geelisuspensioista poistettiin kaasu ennen kuin ne pakattiin kolonneihin. Pakkaus suoritettiin huuhtelemalla 3-5-kertaisella kerrostilavuudella täyttöpuskuria peristaltista pumppua käyttäen. Koetteet (100 ^ul) interferonititrauksia varten otettiin joko koko eristä tai yksityisistä fraktioista ja titrattiin samana päivänä tai pakastettiin muoviputkiin (-20°C) ja titrattiin myöhemmin. Laimennukset suoritettiin väliaineella (joka sisälsi 10 % vasikkaseerumia.

Vasta-aineafflniteettikromatografla suoritettiin olennaisesti siten kuin on selostettu julkaisussa Berg, K., Sequential Antibody Affinity Chromatography of Human Leukocyte Interferon, Scand. J. Immunol., j5, 77-86 (1977). Syöttöpuskurina käytettiin 0,1 M Na0A/0,3 M NaCl, pH-arvon ollessa 7,2 (virtausnopeus 40 ml/h). Vaiheittainen eluointi suoritettiin liuoksella 0,1 M H0Ac/0,3 M NaCl lisäämällä pieni määrä sitruuna-happoa (kylliksi pH-arvon pitämiseksi varmasti arvossa 2,4).

Kun kolonni ei ollut käytössä, sitä säilytettiin lämpötilassa 4°C liuoksessa PBS 1 M NaCl, joka sisälsi penisilliiniä, streptomysiiniä, gentamysiiniä ja klooriamfenikolia (1 % kutakin). Ennen kolonnin käyttöä puhdistustarkoituksiin se huuhdeltiin ensin 100 ml:11a syöttöpuskuria ja sen jälkeen 10 ml:lla eluointipuskuria sekä lopuksi tasapainotettiin 2-30 ml:lla syöttöpuskuria. Tämä huuhteluvaihe oli tarpeen "spon-taanisten" proteiinien välttämiseksi, erikoisesti kun kyseessä olivat interferonit, joiden spesifiset aktiivisuudet 7 ovat yli 10 IFU/mg proteiinia. Ne muoviputket, joita käytettiin interferonieluaatin keräämiseen, esikostutettiin liuoksella 100 ^.ul 1 % yhdistettä SDS.

i 77877 23 SDS PAGE. Puhdistetut väkevöidyt interferonipreparaatit analysoitiin polypeptidikomponenttien suhteen SDS PAGE -levy-geeleissä käyttämällä 20 cm Ditkiä ja 0,75 mm paksuja erotus-geelejä (Bio Rad-tyyppi 221^-^: kaksinkertainen pystysuora le-vygeelielektroforeesikenno) sekä 7-10 cm pitkää kerrosgeeliä. Eksponentiaaligradienttigeelejä, jotka sisälsivät noin 9-22 % polyakryyliamidia, valmistettiin sekoittamalla 11 ml 22-pro-senttista akryyliamidiliuosta ja noin 32 ml 9-prosenttista liuosta keskenään yksinkertaisessa jäällä jäähdytetyssä gra-dienttilaitteessa, kuten on selostettu julkaisussa Knight, E., Interferon: Purification and initial characterization from human diploid cells, Proc. natn. Acad. Sci. USA 73^, 520-523 (1976). Käytettiin epäjatkuvaa puskurisysteemiä, joka on selostettu julkaisussa Laenomli, U.K., Cleavage of Structural Proteins During Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227, 680-685 (1970). Geeliä esijäähdytettiin 2 tuntia o (10 C) ennen varsinaisen elektroforeesin aloittamista. Elekt- o roforeesia jatkettiin yön yli (10 C) vakioteholla (LKB-tehon-syöttö) virran ollessa aluksi 10 mA (ja jännitteen n. 20 V). Analysoitavat koetteet liuotettiin (tai laimennettiin) liuokseen 0,1 M Tris, HC1 (pH 6,8), joka sisälsi 2,5 % yhdistettä SDS ja 5 % glukoosia sekä jäijitysväriainetta (koetepuskuri). Geeliä värjättiin Comassie Blue''-'' -aineella (1,25 mg/ml seosta, joka sisälsi 50 % metanolia, 40 S vettä ja 10 % etikka-happoa) ilman edeltävää kiinnitystä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa jatkuvasti heiluttaen, ja väri poistettiin 7-pro-senttisessa etikkahapossa (5 % metanolia). Geelit kuivattiin hyvälaatuisen paperin £esim. Whatman Chromatographic paper''-'' (17 mm)/ päällä länmittäen tyhjössä käyttämällä geelinkuivain-ta (Bio RacN-', gel slab dryer, model 224). Viiden eri molekyy-linmerkittimen liuokset, jotka sisälsivät 0,1-10 ^ug kutakin merkitintä 20 ^ulsaa kohti^- merkittöminä laktalbumiini (14400 Dalton), Soyabean Trypsin'*-'-inhibiitti (20100 Dalton), hiili-happoanhydraasi (30000 Dalton), ovalbumiini (43000 Dalton), häränseerumialbumiini (67000 Dalton) ja fosforylaasi /hankittu elektroforeesikalibrointivälineenä (Pharmacia, Tanska)/ -saatettiin SDS PAGE-systeemin alaisiksi ja värjättiin. On huo- 77877 24 mättävä, että tällä tavalla määritettyjen molekyylipai-nojen koetarkkuus on noin + 200 Dalton. Värjättyjä proteiininauhoja verrattiin vastaaviin nauhoihin, jotka oli saatu rinnakkaisesta SDS PAGE-kokeesta suoritettuna puhdistetulla interferonipreparaatilla, ja interferoni-proteiinien kokonaispitoisuus arvosteltiin. Biologisen profiilin SDS PAGE-kokeesta aikaansaamiseksi se osa geeliä, jota käytettiin interferoninmääritykseen, leikattiin erilleen muusta geelistä, ja sitä pidettiin lasilevyllä lämpötilassa 4°C (kosteuskammiossa). Pääosaa geelistä värjättiin 15 minuutin ajan, ja 3-5 minuutin aikana suoritetun värinpoiston jälkeen nähtiin selvästi heikkoja nauhoja sinisellä taustalla, jolloin arvoja 14000 ja 30000 vastaavien proteiininauhojen tarkka sijainti voitiin määrittää. Geelin värjäämätön osa leikattiin irti siten, että se sisälsi proteiineja ainoastaan väliltä 14000-30000 Dalton, ja se jaettiin edelleen 1 mm paksuiksi viipaleiksi terävillä veitsillä. Interferoni eluoitiin näistä viipaleista 0,5 ml :11a 0,1 M SDS-liuosta, kun ne oli täysin pienennetty teflonpuikon avulla. Kun koetetta oli pidetty 5 tuntia huoneen lämpötilassa (heiluttaen), nesteen interferoniaktii-visuus määritettiin. Yksityiset fraktiot pakastettiin lämpötilassa -20°C ilman lisäaineita.

Kokeellinen osa

Puhtaiden ihmisvalkosolu- ja -lymfoblastoidi-interferoni-proteiinien valmistus

Puhdistamattoman ihmisvalkosolu-interferonin väkevöinti.

3 litraan puhdistamatonta ihmisvalkosolu-interferonia lisättiin yhdistettä KSCN pitoisuuteen 0,5 M saakka pH-arvolla 7,2. pH alennettiin arvoon 4,5 lisäämällä 1 N HCl-liuosta (magneettinen hämmennys), jolloin saatiin interferonin (ja osan epäpuhtauksista) sisältävä proteiinisakka. Sakka liuotettiin 150 ml:aan liuosta PBS (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, pH 7,2), joka sisälsi 1 M NaCl-liuosta ja 25 . . tilavuusprosenttia etyleeniglykolia, ja suoritettiin perus teellinen dialyysi 3 kertaa saman puskurin 2 litran erää vastaan lämpötilassa 4°C. Puhdistamattoman väkevöidyn ihmisvalkosolu-interferonin (HuLeCIF) spesifinen aktiivisuus i 3 77877 25 oli 5-10 x 10 IFU/mg proteiinia. Saanto oli noin 98 %.

Puhdistamattoman Namalva-interferonin väkevöinti. 1 litraan puhdistamatonta Namalva-interferonia, jonka tiitteri oli n. 8000 IFU/ml, lisättiin yhdistettä KSCN pitoisuuteen 0,5 M saakka pH-arvolla 7,2. pH alennettiin arvoon 4,5 lisäämällä 1 N HCl-liuosta (magneettinen hämmennys), jolloin saatiin interferonin (ja osan epäpuhtauksista) sisältävä proteiini-sakka. Sakka liuotettiin 50 mlraan PBS-liuosta (pH 7,2), joka sisälsi 1 M NaCl-liuosta ja 25 tilavuusprosenttia ety-leeniglykolia, ja suoritettiin perusteellinen dialyysi 3 kertaa saman puskurin 2 litran erää vastaan lämpötilassa 4°C. Puhdistamattoman väkevöidyn Namalva-interferonin 3 (NaCIF) spesifinen aktiivisuus oli 10-12 x 10 IFU/mg proteiinia. Saanto oli noin 98 %.

Geelisuodatus. 100 cm pitkään kolonniin (läpimitta 2,6 cm,

Pharmacia K 2,6/100) pakattiin valmistetta Ultrogel AcA 5/4 (LKB Tanska) PBS-liuoksessa, joka sisälsi 1 M NaCl-liuosta ja 25 tilavuusprosenttia etyleeniglykolia lämpötilassa 4°C (pH 7,2). Kun kolonni oli huuhdeltu 3:11a kerros-tilavuudella puskuria, kolonni stabiloitiin. Kolonniin syötettiin 10-15 ml ainetta HuLeCIF (valmistettuna kuten edellä 25 tilavuusprosentissa etyleeniglykolia, 1 M NaCl PBS-liuoksessa, pH 7,4), ja kolonni "eluoitiin" syöttö-puskurilla, minkä jälkeen suoritettiin fraktioiden interfe-roniaktiivisuuden määritys. Interferonipitoiset fraktiot yhdistettiin, ja saatiin talteen noin 95 % alkuperäisestä interferoniaktiivisuudesta. Geelisuodatettujen ihmisvalko-solu-interferonia sisältävien eluaattien spesifinen aktiivisuus oli lähes 1000000 IFU/mg proteiinia, mikä vastaa puh-distuskerrointa 200. Molekyylinmerkittimillä määritettynä interferonin molekyylipaino vastaa aluetta 10000-20000 Dalton. Yksityisten fraktioiden titraus toi esiin vain yhden leveän huipun, maksimin ollessa kohdalla 18000 Dalton.

77877 26

Samalla tavalla kuin edellä on selostettu kolonniin syötettiin 10 ml ainetta NaCIF (valmistettuna kuten edellä 25 tilavuusprosentissa etyleeniglykolia, 1 M NaCl PBS-liuoksessa, pH 7,4), ja "eluointi" suoritettiin samoin kuin edellä. Saanto oli noin 90 %. Geelisuodatetun NamaIva-interferonia sisältävän eluaatin spesifinen aktiivisuus oli lähes 1000000 IFU/mg proteiinia, mikä vastaa puhdistuskerrointa 100. Molekyylimerkit-timillä määritettynä interferonin molekyylipaino vastaa aluetta 10000-20000 Dalton. Yksityisten fraktioiden titraus toi esiin vain yhden leveän huipun, maksimin ollessa kohdassa 18000 Dalton.

Aineiden HuLeCIF ja NaCIF edellä selostetussa geelisuodatuk-sessa saadut geelisuodatuskäyrät on esitetty vastaavasti kuvioissa 5 ja 6, joissa "HULEIF" merkitsee ihmisvalkosoluin-terferonia ja "NALYIF" Namalva-(lymfoblastoidi)-interferonia. Nähdään selvästi, että interferoniaktiivisuus erottuu tehokkaasti proteiinien pääosasta.

(Ti)

Blue Dextrans-X -kromatografia. Geelisuodatettu ihmisvalkoso-luinterferoniliuos, valmistettuna kuten edellä on selostettu, dialysoitiin perusteellisesti liuoksen 20 mM PB (pH 7,2) 200 tilavuutta vastaan. Dialyysi suoritettiin kahdesti, koko dia-lysointiajan ollessa n. 24 tuntia. Dialysoitu liuos (25 ml, sisältäen 1,8 x 10 IFU) syötettiin Blue Dextran^-Sepharose 4B'^' -kolonniin. Kolonnin läpimitta oli 1 cm ja sen pituus 10 cm. Kolonni esihuuhdeltiin 200-300 ml:11a liuosta 20 mM PB (fosfaattipuskuri, pH 7,4). Dialysoitu interferonipreparaatti syötettiin tasapainotettuun kolonniin, ja kolonni huuhdeltiin 75 ml:lla PB-liuosta. Huuhtelunesteessä todettiin 4500 IFU. Kolonni eluoitiin liuoksella 0,6 M NaCl, 20 mM PB (pH 7,2), jolloin enemmän kuin 95 % interferoniaktiivisuudesta saatiin talteen 6 ml:aan eluaattia, määritettynä interferonititrauksella.

Tarkkaan samalla tavalla dialysoitiin yllämainittu geelisuodatettu Namalva-interferoniliuos perusteellisesti ja saatettiin sen jälkeen Blue Dextran'''7 -kromatografian alaiseksi. Syöttö Blue Dextran^-·' -kromatografiaan oli 1600000 IFU. 50 ml i 77877 27 huuhtelunestettä käsitti 70000 IFU. Eluaatti muodostettiin lisäämällä 0,6 M NaCl PB-liuokseen (pH 7,2). Namalva-interferonin Blue Dextran^-·' -kromatografia on esitetty kuviossa 7. Namalva-interferonin fibroblasti-osa ei eluoitunut kolonnista näissä olosuhteissa, mutta on odotettavissa sen eluoituvan käytettäessä esim. 25 % etyleeniglykolia 1 M NaCl-liuoksessa (pH 7,2).

©

Yllämainittuna Blue Dextran^ ^kolonnina °ϋ kolonni *_joka sisälsi valmistetta Blue Dextran^ /cibacron Blue F3GA'-' immo-bilisoituna aineeseen Dextran 2000 (molekyylipaino 2 miljoo-naa)^ liitettynä syanogeenibromidi-aktivoituun agaroosiin (Sepharose 4b^) . Niinpä kolonnin täydellisempi nimitys on Blue Dextran-Sepharose 4b's-''. Tällaista tyyppiä oleva kolonni on selostettu julkaisussa Bollin et ai., loc. cit. Eluoinnin jälkeen kolonni puhdistettiin eluoimalla liuoksella, joka sisälsi 20-30 ml 25 %:sta etyleeniglykolia ja 1,5 M NaCl 20 mM

PB-liuoksessa. Kolonnia säilytettiin tässä puskurissa lämpö-o tilassa 4 C, kun sitä ei käytetty. Kuten edellä on mainittu, syöttöolosuhteet voivat käsittää myös hydrofobisten reagens-sien kuten alkoholien käytön vaihtelevissa määrissä (0-50 %).

(τή

Blue Dextran^-kromatografiasta saadut 0,6 M NaCl-eluaatit osoittavat omaavansa spesifisen aktiivisuuden 70 x 10 IFU/mg proteiinia sekä ihmisvalkosolu-interferonin että Namalva-interferonin ollessa kyseessä. Niinpä ne molemmat soveltuvat annettavaksi parenteraalisesti ihmisille terapeuttisia tarkoituksia varten, ja ne ovat tässä suhteessa paljon puhtaampia preparaatteja kuin yleisesti käytetyt PIF-preparaatit. Tällaista käyttöä varten eluaatit stabiloidaan, kuten edellä on selostettu, esim. 1-prosenttisella ihmis-albumiinilla.

@

Blue Dextran -kolonnista saadut eluaatit siirretään välittömästi vasta-aineaffiniteettikromatografiakolonniin niiden ' edelleen puhdistamiseksi ja puhtaan interferonin valmistami seksi. Edullisimmassa sovellutusmuodossa vasta-aineaffiniteet-tikromatografiakolonni yhdistetään Blue Dextran'^-' -kolonnin kanssa "tandemsysteemiksi", kuten seuraavassa selostetaan: 28 77877

Tandem-jjLffiniteettikromatografia. Edellä selostetun Blue Dextranw*-kolonnin eluoinnin sijasta yhdistetään Blue Dex-tran^-kolonni tasapainotetun vasta-ainekolonnin kanssa ennen eluointia liittämällä Blue Dextran'^-' -kolonnin poistopu-tki vasta-ainekolonnin tuloputkeen. Tällä tavalla Blue Dextran^ -kolonnista poistuva eluaatti tulee johdetuksi välittömästi vasta-ainekolonniin. Tässä yhdistelmässä käytetään hyväksi sitä seikkaa, että eluointiolosuhteita (0,6 M NaCl, 20 mM PB, pH 7,2) voidaan käyttää myös vasta-ainekolonnin syöttöolosuh-teina. Eluoinnin/syötön jälkeen käytettäessä 20 ml eluaat-tia/”syöttöpuskuria" (tämärl·. "syöttöpuskurin" sisältäessä tietysti samalla Blue Dextran^ -kolonnista eluoidun interferonin) kolonnit erotetaan toisistaan, ja vasta-ainekolonnia huuhdellaan edelleen ennen eluointia, kuten edellä on selostettu. Vasta-ainekolonnista saatu ihmisvalkosolu-interferonieluaatti sisältää puhtaita interferoniproteiineja, joiden spesifinen 9 aktiivisuus on suurempi kuin 10 IFU/mg proteiinia (määritettynä edellä selostetulla menetelmällä). Puhtaiden interfero-niproteiinien stabiloimiseksi putket, joihin eluaatti vasta-ainekolonnista kerätään (fraktion suuruus 2 ml), on kukin esikostutettu 100 ^ultlla 1-prosenttista SDS-liuosta. Inter-feronipitoisten eluaattien yhdistämisen jälkeen yhdistettä SDS lisätään kokonaispitoisuuteen 0,1 painoprosenttia saakka.

Yhdistetyt ionipitoiset eluaatit, jotka on stabiloitu 0,1-prosenttisella SDS-liuoksella, siirretään ruostumatonta terästä olevaan 20 ml:n putkeen, joka on esijäähdytetty läm-o potilaan 0 C jäähauteessa. 15 minuutin kuluttua muodostuu sakka. Sakka eristetään linkoamalla nopeudella 20000 rpm läm-o pötilassa 4 C 20 minuutin ajan. Erottunut neste hylätään (ei interferoniaktiivisuutta), ja sakka liuotetaan 4 M virtsa-aineliuokseen ja siirretään Millipore^^-väkevöintikennoon, tilavuus 8 ml, suodattimen leikkauksen ollessa molekyylipai-non 10000 kohdalla, sekä väkevöidään noin 100 ui taan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen lisättiin väkevöitteeseen 4 ml analysoitua 4 M virtsa-aineliuosta, ja liuos väkevöitiin noin 77877 29 100 ^ulrksi huoneen lämpötilassa. 1-3 ml tislattua vettä lisättiin, ja liuos väkevöitiin jälleen tilavuuteen 20 ui ja sekoitettiin 20 ^ul:aan SDS-elektroforeesipuskuria. 20 ^ul saatua liuosta käytettiin karakterisointiin, kuten on selostettu alempana kohdassa "SDS PAGE".

Yllämainittu vasta-aineaffiniteettikromatografiakolonni oli valmistettu "sidontamenettelyjen" mukaisesti käyttämällä epä-monospesifistä anti-PIP-preparaattia, joka oli absorboitu seuraavasti: anti-interferoni-immunoglobuliinien kokonaismäärä 10 IFU-NU (vastaten 4 ml:aa lampaan anti-interferonisee-rumia) absorboitiin 3 kertaa 150 ml:n_ihmisseerumikolonniin sidottuna valmisteeseen Sepharose minkä jälkeen suori tettiin 4 absorbointia CIF-epoksi-Sepharose^*rkolonniin ja 2 ΓΓΜ absorbointia CIF-CH-aktivoituun Sepharose 43^-^ -kolonniin, kuten on selostettu julkaisussa Scand. J. Immunol, 8, 429-436 (1978). Lopuksi immunoglobuliinit absorboitiin poly^L-lysiini-Sepharose>-^-kolonnissa (kerran) ja Soyabean Trypsin'—' -inhi-biitti-Sepharose'—'-kolonnissa (2 kertaa).

@

Namalva-interferonin Blue Dextran^-' -kromatografiästä saatu eluaatti jaettiin kahten osaan. Yhtä osaa käytettiin SDS PAGE-elektroforeesiin, kuten alempana on selostettu. 250000 IFU syötettiin absorboituun vasta-ainekolonniin, kuten on esitetty kuviossa 8. Lainkaan interferonia ei todettu huuhtelunesteessä. Interferoni eluoitiin tavanmukaisesta alentamalla pH arvoon 2,4, ja 235000 IFU (kerättynä 0,1-prosenttisen SDS-liuoksen läsnäollessa) saatiin talteen. Tämä eluaatti väkevöitiin, kuten on edellä selostettu, ja sitä tutkittiin edelleen SDS PAGE-systeemissä.

SDS PAGE. SDS PAGE-elektroforeesi suoritettiin siten kuin edellä on selostettu kohdassa "materiaalit ja menetelmät". Puhtaista ihmisvalkosolu-interferoniproteiineista saatu kuvioissa 1 ja 2 kuvattu värjätty levy esittää kaaviomaisesti värjättyä levyä toisesta kokeesta yhdessä vastaavan interfero-niaktiivisuuden kanssa eluoituna värjäämättömästä rinnakkai- 77877 30 sesta geelisuikaleesta. Huomattava toistettavuus ilmenee näistä kuvioista, eron arvojen 20100 ja 20180 välillä ollessa koe-tarkkuuden rajojen sisäpuolella. Kuten edellä on mainittu, biologiset huiput osuvat tarkkaan yhteen proteiinihuippujen kanssa.

Kuviosta 1 ilmenee, että interferonipreparaatti on täysin puhdas SDS PAGE-systeemillä määritettynä. Mitään muita pro-teiininauhoja ei ole näkyvissä.

Kuvio 9 esittää uouhtaiden Namalva-interferoniproteiinien (A) ja Blue Dextran'^-// -kolonnista saadun eluaatin (B) värjättyjä 6 SDS PAGE-levyjä (syöttö 0,9 x 10 ). Verrattaessa kuvioon 1 havaitaan, että puhtaan Namalva-interferonin nauhat ovat olennaisesti identtiset samassa määrässä viedyn puhtaan ih-misvalkosolu-interferonin nauhojen kanssa.

Sellaisten hydridoomasolujen aikaansaaminen, joilla on interferonin vastaista aktiivisuutta 3 Balb/c-naarashiirtä, 2 kuukauden ikäisiä, immunoitiin ih-misvalkosolu-interferonilla seuraavasti:

Ensimmäinen ruiskutus (40000 IFU) suoritettiin ihonalaisesti kunkin hiiren selkään. Immunointia jatkettiin viikoittain ihonalaisella ruiskutuksella (70000 IFU). Viimeinen ruiskutus annettiin laskimonsisäisesti 9. viikkona (hiiri 1) ja 10. viikkona (hiiret 2 ja 3).

Anti-interferonin kehittyminen määritettiin hiiristä otetuista seerumikoetteista interferonin neutralointikoetta käyt-täen. Lisäksi käytettiin tavanmukaisesta anti-interferoni-: IgG-preparaattia (tuotettu ruiskuttamalla kaniineja osittain puhdistetuilla ihmisvalkosolu-interferonipreparaateilla) interferonin neutralointikoesysteemin laboratoriokont-rolliin. Hiiristä otetut seerumikoetteet eivät osoittaneet lainkaan anti-interferoniaktiivisuutta ensimmäisenä kuutena viikkona. Sen jälkeen todettiin selvä anti- 77877 31 interferoniaktiivisuus:

Taulukko I. IFU-NU/ml 7. viikko 8. viikko 9. viikko 10. viikko Hiiri 1 160 160 120

Hiiri 2 200 1280 2500 1200-2500

Hiiri 3 80 40 40 5-10

Hiiret tapettiin taittamalla niiden niska 2-4 päivää viimeisen ruiskutuksen jälkeen, ja niiden pernat poistettiin steriileissä olosuhteissa. Kun kukin perna oli homogenoitu PBS-liuoksessa, homogenoitu solususpensio siirrettiin lin-kousputkiin, ja näitä lingottiin arvolla 170 g lämpötilassa 4°C. Solut suspendoitiin PBS-liuokseen, ja toisen linkoa-misen jälkeen ne suspendoitiin seerumista vapaaseen DMEM-liuokseen (noin 0,5 ml pernaa kohti). Solujen kokonaismäärä oli 10® (hiili 1), 0,8 x 10® (hiiri 2) ja 0,8 x 10® (hiiri 3). Elinkykyisyys oli noin 85-90 %.

Käsittelemällä polyetyleeniglykolilla edellä selostetulla tavalla kustakin hiirestä saatu pernasolususpensio sulautettiin yhteen 10^ X63Ag8 (HPRT-) myelomasolun kanssa 8 7 seuraavalla tavalla: 10 hiirenpernasolua ja 10 8-atsa- guaniinia kestävää myelomasolua (X63Ag8# NSI/lAg 4-1; SP 2/0-Ag 14) sekoitettiin keskenään 50 ml:n kartiomaises-sa muovisessa linkousputkessa (Falcon 2070). Putki täytettiin seerumittomalla DMEM-aineella, ja putkea lingottiin 10 minuuttia arvolla 170-200 g lämpötilassa 4°C. Erottunut neste poistettiin tarkkaan, ja lämpötilassa 37°C lisättiin 0,7 ml 50-prosenttista polyetyleeniglykoliliuosta, jonka lämpötila oli 37°C, tipoittain 1 minuutin aikana kevyesti hämmentäen. 90 sekunnin aikana lämpötilassa 37°C suoritetun haudonnan jälkeen lisättiin 15 ml lämmintä seerumi tonta DMEM-liuosta hyvin hitaasti (1-2 minuutin aikana). Sen jälkeen seosta lingottiin 10 minuutin ajan arvolla 200 g, ja solukasautuma suspendoitiin 50 ml:aan DMEM-FCS-liuos-ta Costar-lautasilla suoritettavaa kylvöä varten.

32 77877

Kustakin sulautumasta kylvettiin 48 viljelmää, kukin 1 ml, Costar-lautasille (2 lautasta, kummassakin 24 reikää pernaa kohti eli 48 viljelmää hiirtä kohti). 10-15 päivän kulut tua kasvu huomioitiin 21 viljelmässä (hiiri 1), O viljelmässä (hiiri 2) ja (edelleen suoritetun kylvön jälkeen) 150 viljelmässä (hiiri 3).

Solut siirrettiin 5 ml:n viljelmiksi 25 ml:n NUNC-pulloihin, jotka Costar-lautasten tapaan sisälsivät makrofagien muodostaman "ravintokerroksen". Väliainetta vaihtamalla saatiin pinnalle nousevia nesteitä, ja näistä tiivistetyistä viljelmistä saadut solut pakastettiin nesteytetyssä typessä.

Hiirestä 1 saatujen yksityisten viljelmien nesteitä tutkittiin positiivisten kloonien toteamiseksi interferonin neutralointikoetta käyttäen. Tällöin todettiin yksi positiivinen klooni, jolla kuitenkin hyvin pieni tiitteriarvo (noin 2-3 IFU-NU/ml).

Anti-interferonin valmistus puhtaiden interferoniproteiinien avulla (puhtaita SDS PAGE-systeemin mukaan)

Edellä selostetusta tandem-affiniteettikromatografiasta saatua eluaattia, karakterisoituna SDS PAGE-systeemin avulla, käytettiin kaniinien immunointiin seuraavalla tavalla:

Noin 1000000 IFU-yksikköä väkevöitiin n. 1 ml:ksi, ja väke-vöitettä dialysoitiin PBS-liuosta vastaan lämpötilassa 10°C yön yli. Kahteen kaniiniin ruiskutettiin ihonalaisesti kumpaankin 1000000 IFU-määrä tällä tavalla valmistettua väkevöitettä. Ruiskutus toistettiin joka toinen viikko. Vasta-aineiden kehittyminen ilmenee taulukosta II: 77877 33

Taulukko II

Neutralointiyksiköissä (IFU-NU)

Freundin adjuvantti

Kaniini I xx) 1 3 5 7 \7 9 11 13 15 xxx) 0 0 2 100 2000 NDX)20000 20000

Freundin adjuvantti

Kaniini I xx) 17 ψ 19 21 23 25 27 xxx) 20000 800000 600000 500000 600000 600000

Freundin adjuvantti

Kaniini II xx) 135 7 V 9 11 13 15 xxx) 0 0 0 20 500 NDX)20000 10000

Freundin adjuvantti

Kaniini II xx) 17 ^ 19 21 23 25 27 xxx) 8000 100000 150000 200000 180000 185000 x) ei määritetty xx) viikkoa xxx) anti-interferonitiitterit (IFU-NU/ml)

Anti-interferonien valmistus SDS PAGE-systeemistä irtileikattujen puhtaiden värjättyjen interferoniproteiinien avulla Immunointi suoritettiin tässä selityksessä aikaisemmin selostetun menettelyn mukaisesti käyttämällä hienonnettua interfe-ronipitoista (osittain huuhdeltua ja värittömäksi tehtyä) geelisuspensiota suoraan immunogeenisenä preparaattina. Yksi kaniini (III) immunoitiin 18400 + 200 Dalton-lajilla ja toinen kaniini (IV) 20100 + 200 Dalton-lajilla (kuolivat 15 viikon kuluttua). Saatiin hyvät tulokset, kuten näkyy taulukosta Ills 77877 34

Taulukko III

Neutralointiyksiköissä

Freundin adjuvantti

Kaniini III viikkoa 1 3 5 7 9 11 15 (18400 Dal- ton-laj i) IFU-NU/ml 0 0 0 1-2 2 2 200

Kaniini IV viikkoa 1 3 5 7 9 11 v 15 (20100 Dal- ton-laj i) IFU-NU/ml 0 0 0 0 1 2 200 18400 Dalton-lajin antigenisiteetti 20100 Dalton-lajia vastaan ja kääntäen

Sen osoittamiseksi/ että yllämainitut kaksi lajia ovat identtiset, suoritettiin seuraavat ristineutralointikokeet:

Interferoniproteiini eluoitiin 18400 + 200 Dalton-lajin SDS PAGE-nauhasta ja 20100 + 200 Dalton-lajin SDS PAGE-nau-hasta edellä selostetulla tavalla, ja valmistettiin liuokset, jotka sisälsivät 5-10 IFU näitä kahta lajia. Anti-inter-feroniliuokset näistä kahdesta lajista, valmistettuna kaniineissa, kuten edellä on selostettu, laimennettiin sisältämään kaikkiaan 20 IFU-NU/ml. Puhtaiden interferonilajien tasaosia (1 ml), jotka sisälsivät 10 IFU 18400 Dalton-inter-feronilajia ja vastaavasti 10 IFU 20100 Dalton-interferonila-jia, sekoitettiin 1 ml:aan 18400 Dalton-lajin anti-interfero-niliuosta ja vastaavasti 1 mlraan 20100 Dalton-lajin anti-interferoniliuosta käyttäen kaikkia mahdollisia vaihteluja, ts. että kummankin lajin anti-interferoni sekoitettiin erik-seen kummankin lajin interferonin kanssa. Kun seoksia oli pidetty lämpötilassa 37°C 1 tunnin ajan, kaikki mahdollisesti jäljelle jäänyt interferoniaktiivisuus määritettiin tavanmukaisella interferonititrauksella (vertaa kohtaa "Materiaalit ja menetelmät" edellä). Mitään interferoniaktiivisuutta ei todettu. Niinpä sekoitettaessa 18400 + 200 Dalton-lajia ja 20100 + 200 Dalton-lajia erikseen vastaavasti kummankin anti-18400 + 200 Dalton-lajin ja anti-20100 + 200 Dalton-lajin kanssa ja kääntäen, mitään interferonia ei havaittu, 77877 35 toisin sanoen täydellinen neutralointi oli tapahtunut. Niinpä voidaan tehdä se johtopäätös, että nämä kaksi interfero-nilajia tuovat esiin samoja antigeenisiä determinantteja.

Tämä merkitsee sitä, että anti-18400 + 200 Dalton-lajia voidaan käyttää monospesifisenä vasta-aineena molempien inter-feronilajien puhdistukseen, ja että sama pätee anti-20100 + 200 Dalton-lajin sekä näiden lajien seoksen suhteen. Samalla tavalla suoritetut lisäkokeet osoittivat, että kukin näitä kahta päälajia vastaan tuotettu antiseerumi neutraloi täysin mainitut kuusi biologista huippua.

On erittäin todennäköistä, että nämä kaksi päälajia eristettynä Namalva-SDS PAGE-systeemistä antavat saman tuloksen, toisin sanoen että ne myös ristireagoivat ja osoittavat identisyy-den HuLelF-aineen kanssa antigenisiteetin suhteen, (niin että HuLelF 18400 + 200 on identtinen Namalva 18400 + 200 kanssa sekä antigeniöiteetin ja molekyylipainon suhteen, ja että HuLelF 20100 + 200 on samoin identtinen Namalva 20100 + 200 kanssa).

Puhtaiden interferoniproteiinien biologiset vaikutukset Virusvastainen aktiivisuus

Kunkin kuviossa 3 esitetyn kuuden värjätyn proteiininauhan virusvastainen aktiivisuus määritettiin. Geeli syötettiin kahteen rakoon, joista kumpikin oli värjätty. Yhdessä raoista olevat värjätyt nauhat on esitetty kuvion 3 kohdassa A.

Toinen rako tehtiin nopeasti värittömäksi (seoksessa, joka käsitti 50 % metanolia, 45 % vettä ja 5 % etikkahappoa), interferoniproteiinien tarkka sijainti kosteassa geelissä re-kisterötiin ja geeli huuhdeltiin vedellä sekä leikattiin viipaleiksi, kuten on esitetty kuvion 3 kohdassa B. Geelivii-paleitten lukumäärä on osoitettu kuvion 3 kohdassa C. Tällä tavoin kukin interferoniproteiininauha tuli leikatuksi täsmällisesti irti geelistä sekoittumatta viereisen nauhan kanssa. Kunkin viipale eluoitiin siten kuin on selostettu kohdassa "Materiaalit ja menetelmät", ja kuviossa 3 esitetty biologinen profiili konstruoitiin käyttäen kohdassa "Materiaalit ja menetelmät" selostettua tavanmukaista inter-feronin-titrausta. Kukin SDS PAGE-systeemistä leikatun ja 77877 36 eluoidun kuuden lajin neutralointiaktiivisuus kontrolloitiin anti-valkosolu-interferonia vastaan, ja osoittautui, että kaikki lajit olivat täysin saman antiseerumin neutraloi-mia. Kuviossa 3 esitetyn interferonin saanto oli melko pieni (20 %) verrattuna normaalilla "SDS PAGE-eluoinnilla" ilman esivärjäystä saatuun (paitsi 18400 + 200 Dalton-lajin suhteen), mikä osoittaa, että useimpien interferonilajien biologinen aktiivisuus oli selektiivisesti tuhoutunut verrattuna antigenisiteettiin. Anti-valkosolu-interferonia vastaan suoritetuissa neutralointikokeissa "kuviosta 3 eluoidut" inter-feroniproteiinit kykenivät neutraloimaan anti-valkosolu-interferonia 3-5 kertaa tehokkaammin kuin luontainen (puhdis-tamaton) ihmisvalkosolu-interferoni, interferoniaktiivisuu-den perusteella laskettuna, mikä osoittaa biologisesta aktiivisuudesta vastaavien determinanttien selektiivisesti tuhoutuneen.

Epä-virusvastaiset vaikutukset

Puhtaan ihmisvalkosolu-interferonilajin epä-virusvastaiset vaikutukset kontrolloitiin 3 systeemissä: 1) Soluvastainen aktiivisuus

Puhtaiden interferoniproteiinien soluvastaista aktiivisuutta tutkittiin inkuboimalla Daudi-soluja puhtaiden interferoniproteiinien 1ϊΙΟΟΟ-laimennuksissa (väliaineessa), jotka proteiinit oli saatu eluoiduista SDS PAGE-fraktioista, kuten on esitetty kuviossa 2, ja varmistamalla tritiumilla merkityn tymidiinin suhteellinen väheneminen /1. Heron ja K. Berg,

The actions of interferon are potentiated at elevated temperature, Nature, 274, 508-510 (1978J_/ verrattuna kontrolleihin ilman interferonia (kuvion 2 yläosa, jossa "% G-I" merkitsee kasvun ehkäisyä prosenteissa). Nähdään selvästi, että "soluvastainen käyrä" hyvin tarkkaan seuraa virusvastaista käyrää. Tämä todistaa, että puhtaan luontaisen ihmisvalko-solu-interferonin kaikki 5 lajia sisältävät sekä virusvastaista aktiivisuutta että soluvastaista aktiivisuutta. Eri "soluvastaisten huippujen" koko ei vaihtele lineaarisesti "interferoni-huippujen" koon kanssa, mikä todennäköisesti kuvastaa Daudi-solusysteemin herkkyyttä £3. Hilfenhaus, 37 77877 H. Damm, H.E. Karges ja K.E. Manthey, Growth inhibition of human lymphoblastoid Daudi cells in vitro by interferon preparations, Arc. Virol. _51, 87-97 (1976J_/. Pieni interferoni-huippu kohdalla 19500 Dalton ei aiheuttanut vastaavaa huippua soluvastaisessa käyrässä. 10 kertaa pienemmällä laimennuksella havaittiin kuitenkin pieni mutta selvä soluvastai-sen aktiivisuuden huippu (ei näkyvissä kuviossa).

2) Tärkeimmän histokompatibiliteettiantigeenin (MHC) ilmaiseminen lymfosyyteillä ja monosyyteillä

Selektiivinen lisäys 82“assosi°idussa MHC-ilmaisussa havaittiin käytettäessä osittain puhdistettua ihmisvalkosolu-in-terferonia, kuten esimerkiksi on selostettu julkaisussa I. Heron, M. Hokland ja K. Berg, "Enhanced expression of $2 microglobulin and HLA on human lymphoid cells by interferon", Proc. Natl. Acad. Sei., J75, 6215-6222 (1978) (josta seuraavassa käytetään viitettä PNAS 75). Kummallakin kahdella tärkeimmällä ihmisvalkosolu-interferonilajilia (18400 ja 20100 Dalton, vertaa kuviota 1) suoritettiin koe annosten ollessa n. 100 IFU/ml viljelyväliainetta. Yllämainittu vaikutus todettiin käytettäessä näitä puhtaita molekyylilajeja, kun sen sijaan sellaisista geeliviipaleista saaduilla eluaa-teilla, jotka olivat niiden alueiden ulkopuolelta, joissa virusvastaista aktiviteettia oli havaittu, ei ollut mitään vaikutusta. On siis tullut todistetuksi, että MHC-antigeeni-ilmaisun selektiivisen lisäyksen vaikutus lymfoidisoluihin on interferonimolekyyleille luonnostaan kuuluva ominaisuus.

3) Natural Killer-solusysteemin (NK-systeemin) potensointi

Kuvio 10 esittää virusvastaista profiilia (määritettynä SDS PAGE-systeemillä samalla tavoin kuin on selostettu kuvion 2 yhteydessä). Kukin geelin lajeista tutkittiin NK-arvoa lisäävän aktiivisuuden suhteen käyttäen menetelmää, joka on selostettu artikkelissa PNAS 75. Virusvastaisen aktiivisuuden omaavat fraktiot, kuten on esitetty alemmassa käyrässä, antoivat ylemmässä käyrässä kuvatun lisätyn NK-arvon, kun sen sijaan "perusviiva"-fraktiot eivät lisänneet NK-arvoa. Yksi nuoli osoittaa tapausta, jossa pelkästään suolaliuosta 77877 38 on lisätty negatiiviseksi kontrolliksi, ja kaksi nuolta osoittaa tapausta, jossa osittain puhdistettua ihmisvalkosolu-interferonia (PIF) on käytetty positiivisena kontrollina.

Noin 100 IFU virusvastaista yksikköä kutakin interferoni-preparaattia lisättiin ml:aa kohti.

Claims (20)

1. 77877 39
2. 1. Menetelmä Le-muotoa olevien ihmis-interferoniproteii-nien valmistamiseksi, jotka SDS PAGEsssa käytettäessä ekspo-nentiaaligradienttigeeliä interferonin kokonaissyötön ollessa 0,9 x 10 IFU tuovat esiin kaksi suurta terävää värillistä proteiininauhaa, joiden virusvastainen interferoniaktiivisuus on vastaavasti kohdissa 18400 ja 20100 Dalton sekä pienen värillisen proteiininauhan, jonka virusvastainen interferoniaktiivisuus on välillä 20300-20400 Dalton, yhdessä pienempien huippujen kanssa, joiden huippujen virusvastainen interferoniaktiivisuus on kohdissa 19500, 21130 ja 23440 Dalton (näiden Dalton-molekyylipainojen koetarkkuuden ollessa + 200 Dalton), mainitun SDS PAGE -akryyliamidigradientin osoittamatta olennaisesti mitään muita värillisiä proteiinialueita ja jotka SDS PAGEsssa käytettäessä eksponentiaaligradienttigeeliä in- 6 terferonin kokonaissyötön ollessa 3,8 x 10 IFU tuovat esiin kuusi värillistä virusvastaisen interferoniaktiivisuuden omaavaa proteiininauhaa, nimittäin voimakkaat nauhat kohdissa 18410 ja 20180 Dalton, keskivoimakkaan nauhan kohdassa 20420 Dalton ja tuskin näkyvät nauhat kohdissa 19500, 21130 ja 23440 Dalton (näiden Daltonmolekyylipainojen koetarkkuuden ollessa + 200 Dalton), virusvastaisen interferoniaktiivisuuden huippujen osuessa tarkkaan yhteen värillisten proteiininauho-jen kanssa ja mainitun SDS PAGE -akryyliamidigradientin ollessa osoittamatta olennaisesti mitään muita värillisiä proteiinialueita, tunnettu siitä, että Le-muotoa olevia ihmis-interferoniproteiineja sisältävä liuos saatetaan affiniteet-tikromatografian alaiseksi siten, että Le-muotoa olevat ihmis-interferoniproteiinit tulevat selektiivisesti pidätetyiksi, ja nämä pidätetyt interferoniproteiinit eluoidaan.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että affiniteettikromatografia käsittää ligandiaffini-teettikromatografian yhdessä vasta-aineaffiniteettikromato-grafian kanssa, jossa vasta-aineet ovat matriksi-immobilisoi-tuja vasta-aineita, jotka on tuotettu tai olennaisesti vain 77877 40 kohdistettu patenttivaatimuksessa 1 esitettyjä interferoni-proteiineja vastaan tai tuotettu yhtä niistä yksittäisistä proteiineista vastaan, jotka ovat patenttivaatimuksessa 1 esitettyjen interferoniproteiinien aineosia.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että enintään 85 % vasta-aineista, jotka on viety mat-riksiin immobilisointivaiheessa, on kovalenssisidottu.
5. 4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineista ennen matriksiin sitomista on poistettu olennaisesti kaikki proteolyyttinen entsymaatti-nen aktiivisuus käsittelemällä entsyymininhibiiteillä ja/tai entsyyminhajottimilla, erikoisesti matriksi-immobolisoiduilla entsyymininhibiiteillä ja/tai entsyyminhajottimilla.
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineaffiniteettimatriksiin viety liuos on puhdistamaton väkevöimätön interferonipreparaatti.
7. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineaffiniteettimatriksiin viety liuos on väkevöity tai osittain puhdistettu interferonipreparaatti.
8. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että interferonipitoinen liuos käsittää inter feronipitoisen proteiinifraktion, joka on proteiinisaos-tuskäsittelyllä saatu puhdistamattomasta väkevöimättömästä in-terferonipreparaatista, kuten esim. lisäämällä yhdistettä *- KSCN ja säätämällä liuoksen pH arvoon 4,5.
9. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineaffiniteettimatriksiin viety liuos on interferoniliuos, joka sisältää proteiineja olennaisesti ainoastaan alueelta 10 000 - 20 000 Dalton. 77877 41
10. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos on 10 000 - 20 000 Dalton-eluaatti geeli-suodatuksesta, joka on suoritettu puskuriliuoksella, joka sisältää noin 25 tilavuus-% glykolia, kuten etyleeniglykolia, ja jonka ionipitoisuus vastaa 1 M NaCl-liuoksen ionipitoisuutta, pH-arvon ollessa noin 7,2.
11. 10. Jonkin patenttivaatimuksista 2-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Le-muotoa oleva ihmis-interferoni vas-ta-aineaffiniteettimatriksiin viedyssä liuoksessa on valittu ryhmästä, jonka muodostavat ihmisen valkosoluinterferonit, ihmisen lymfoblastoidi-interferonit ja proteiinit, joilla on ne olennaiset interferonia karakterisoivat determinantit, joita patenttivaatimuksessa 1 esitetyt proteiinit omaavat, tai ne olennaiset immunologiset determinantit, joita patenttivaatimuksessa 1 esitetyt proteiinit omaavat, mm. sellaiset proteiinit, jotka on tuotettu DNA:ta sisältävää mikro-organismia viljelemällä, joka DNA koodaa tällaisia proteiineja.
12. 11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 2-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä^että ligandina ligandikromatogra- fiässä on Cibacron F3GA'*-' tai muu sellainen ligandi, joka kykenee sitomaan Le-muotoa-olevia ihmis-interferoniproteiineja valmisteen Cibacron F3GA'^ käyttämän mekanismin mukaisesti, jollaisia ovat erikoisesti Blue Dextran 2 QQCr» Blue Sepha-rose C1-6b'<-'' ja valmisteeseen Sepharose liitetty Blue Dextran, tai sellainen ligandi, joka on immobilisoitu mole-kyylipainon noin 2 miljoonaa Dalton omaavaan dekstraaniin liitettynä ristikytkettyyn agaroosiin, kuten Blue Dextran^-' liitettynä kovalenttisesti valmisteeseen Sepharose 4B^-^. 1 2 3 4 Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu 2 siitä, että syötetty liuos on vesiliuos, joka sisältää Le- 3 muotoa olevaa interferonia muodossa, jonka spesifinen aktiivi 4 suus on vähintään 50 000 - 100 000 IFU/mg proteiinia, liuok- 77877 42 sen ollessa puskuroitu pH-arvoon 6,5-8 ja omatessa ionipitoi-suuden, joka ei olennaisesti ylitä 10-100 mM, erikoisesti 20 mM, fosfaattipuskuriliuoksella (pH 7,2).
13. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointi suoritetaan vesiliuoksella, joka on puskuroitu pH-arvoon 6,5-8 ja jonka ionipitoisuus vastaa 0,5-0,7, erikoisesti 0,5-0,65 molaarisen NaCl-liuoksen ionipitoisuut-ta, parhaiten vesiliuoksella, jonka ionipitoisuus vastaa 0,6 molaarisen NaCl-liuoksen ionipitoisuutta ja joka on puskuroitu pH-arvoon 7,2.
14. 14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo syötetyssä liuoksessa ja eluaatissa on noin 7,2.
15. 15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandiaffiniteettikromatografiamat-riksiin syötetyn interferonin spesifinen aktiivisuus on noin 50 000 - 1 000 000, kuten 100 000 - 1 000 000, esim. 200 000 -1 000 000, erikoisesti noin 500 000 - 1 000 000 IFU/mg proteiinia.
16. 16. Jonkin patenttivaatimuksista 12-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineaffiniteettimatriksiin syötetty liuos on interferoniliuos, joka sisältää proteiineja olennaisesti ainoastaan alueelta 10 000 - 20 000 Dalton, kuten sellaisesta geelisuodatuksesta saatu eluaatti, joka on suoritettu puskuriliuoksella (pH noin 7,2), joka sisältää noin 25 tilavuus-% glykolia, kuten etyleeniglykolia, ja jonka ionipitoisuus vastaa 1 M NaCl-liuoksen ionipitoisuutta, jolloin ligandiaffiniteettikromatografiästä saatu eluaatti sopivimmin syötetään suoraan vasta-aineaffiniteettimatriksiin. 1 2 Menetelmä ihmis-interferonin puhdistamiseksi, tun 2 nettu siitä, että vesiliuos, joka sisältää Le-muotoa olevaa 77877 43 ihmis-interferoniproteiinia muodossa, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään 50 000 - 100 000 IFU/mg proteiinia, liuoksen ollessa puskuroituna pH-arvoon 6,5-8 ja omatessa io-nipitoisuuden, joka ei olennaisesti ylitä 10-100 mM, erikoisesti 20 mM, fosfaattipuskuriliuoksella (pH 7,2), syötetään matriksi-immobilisoituun ligandiin, joka Jcykenee sitomaan interferonia valmisteen Cibacron Blue F3GA'^-' käyttämän mekanismin mukaisesti, minkä jälkeen näin sidottu interferoni eluoi-daan.
17. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan niissä olosuhteissa, jotka on määritelty jossakin patenttivaatimuksista 11 ja 13-16.
18. 19. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadun interferonipro-teiinin molekyylipaino määritettynä SDS PAGE:11a on 18400 + 200 Daltonia.
19. 20. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadun interferonipro-teiinin molekyylipaino määritettynä SDS PAGE:11a on 20100 + 200 Daltonia.
20. 21. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadun interferonipro-teiinin molekyylipaino määritettynä SDS PAGE:11a on välillä 20300 ja 20400, 19500, 21130 tai 23440 Daltonia. 1 Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu interferonipro-teiini on puhdasta ihmisen lymfoblastoidi (Namalva)-interferonin Le-muodon proteiinia. 77877 44