KR940010024B1

KR940010024B1 - α-인터페론의 제조 및 정제 방법

Info

Publication number: KR940010024B1
Application number: KR1019860003234A
Authority: KR
Inventors: 보도 게르하르트; 마우러-포기 인그리드; 팔크너 에드가; 주타 린드너 실비아
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터네셔날 게엠베하; 디에터 라우디엔·루돌프 호프만
Priority date: 1985-04-27
Filing date: 1986-04-26
Publication date: 1994-10-20
Also published as: PT82452B; DE3689008D1; CA1340281C; ES554372A0; FI861748A; SU1591814A3; DE3515336C2; DK186486D0; NZ215969A; HUT41073A; GR861093B; EP0203382B1; NO861635L; KR860008270A; IL78604A; ATE94588T1; ZA863108B; ES8707554A1; AU598460B2; EP0203382A2

Abstract

내용 없음.

Description

α-인터페론의 제조 및 정제 방법

제 1 도는 직렬(Tandem) 크로마토그라피후 산 용출물의 역상 HPLC 크로마토그라프 ; 성분 K1-K7을 표기.

제 2 도는 직렬 크로마토그라피후 산 용출물을 겔투과 HPLC 크로마토그라프.

제 3 도는 pH4.5에서의 침전후 역상 HPLC의 크로마토그라프 ; 성분 K1,K2, K 3 및 K6을 표기.

제 4 도는 pH4.5에서의 침전후 겔투과 HPLC의 크로마토그라프.

제 5 도는 0.1-0.5M의 암모늄아세테이트 구배로 pH4.5에서 MONO-S상 FP LC의 크로마토그라프.

제 6 도는 MONO S-피크(peak) "쇼울더 분획"(shoulder fraction)"의 역상 HPLC 크로마토그라프.

제 7 도는 MONO S-피크의 "쇼울더 분획"의 겔투과 HPLC 크로마토그라프.

제 8 도는 MONO S-피크 "주요 분획(main fraction)"의 역상 HPLC 크로마토그라프.

제 9 도는 MONO S-피크 "주요 분획"의 겔투과 HPLC 크로마토그라프.

제 10 도는 MONO S-피크 "주요 분획"의 크로마토포커싱(chromato focussing ) 크로마토그라프.

제 11 도는 직렬 크로마토그라피 후 산 용출물의 겔 전기영동 및 역상 HPLC에 의해 분리된 성분 K1-K7의 사진.

제 12a-12f 도는 안티-IFN-α 항체의 결과 ; 여러가지 증상에 대한 시험.

시험의 형태 : 중화 측정법(10iu/㎖ IFN α/A-599/EMC)

환자의 총수 :75

종양 중상의 환자수 58

자극된 항체가 없는 환자수 58

비루스성 증상의 환자수 17

자극된 항체가 없는 환자수 17

제 13 도는 안티 인터페론-α 항체 검정의 도표.

본 발명은 항비루스 및 면역조절 활성을 갖는, 매우 순수하고, 비-면역원성이며, 균질한 α-인터페론을 제조하는 방법과, 단백질 자체 및 그의 용도에 관한 것이다.

인터페론은 아주 여러 종에서 검출할 수 있는, 신체에서 자연적으로 발생하는 단백질이다. 그들 본래의 항비루스 및 면역조절 특성은 초기 단계에서 광역적 적용에 적합하다. 인터페론에는 여러 종류가 있음이 시험에 의해 밝혀졌다. α,β및 α-인터페론외에, 최근 ω-인터페론이 발견되었고 그의 구조도 명확해졌다.

비루스 질환 및 암에 대한 유효제로서 인터페론에 거는 큰 기대는 천연 물질로부터 수득한 인터페론 제제를 이미 시도하도록 하였으나 심각한 부작용이 발생했다. 이들 시도에 사용된 제제는 철저한 정제후에도 다른 인터페론의 복합 혼합물 및 많은 경우 기타 단백질을 함유하였다. 이 이유는 약간의 인터페론이 다른 인터페론과 크게 또는 작게 상이한 아형(Subtypes)을 갖기 때문이다; 예를들면 α-인터페론은 20개 이상의 상이한 타이프가 공지되어 있다.

유전공학에 의해 인터페론을 생산하는 것만이 순수한 타이프의 인터페론 제제를 시도할 수 있다.

이들은 또한 임상적 시도에서 사용된 재조합 α₂인터페론(αA로도 알려져 있음)을 포함한다. 단백질의 정제는 미생물에 의해 사람 단백질을 생산할 때 매우 중요하다. 숙주 유기체로부터 유래하는 어느 오염이건, 그 생성물을 사람에게 사용할 경우 면역 방어 반응을 일으켜 생명에 위험을 줄 수도 있다. 그러나, 요즘은 이런 종류의 오염을 제거하여 거의 문제를 일으키지 않으며, 현재 가능한 아주 민감한 분석방법이 미세한 농도의 엔도톡신(endotoxins)을 검출할 것이다. 또한 인터페론연구 분야에서 사실상 엔도톡신을 전혀 함유하지 않는 인터페론 제제를 수득할 수 있는 정제방법이 개발되었다. 예를들어 말하자면 문헌[Staehelin et al., J.Biol. Chem. 256, 9750(1981)]의 연구이다.

임상적 시도에 사용된 모든 재조합 α-인터페론은 사실상 엔도톡신이 없다.

그러므로 제거하기 위한 인터페론 처리를 충분히 해주었는데도 부작용이 발생한다는 것은 매우 놀라운 일이다. 몇몇 재조합 α-인터페론은 놀랍게도 면역원성까지 발견된다. 인터페론에 대한 항체를 자극시킨다[Quesada et al., J. Natl. Cancer Inst. 70, No. 6,1041-1046(1983) ; Protzman et al., J. Immunol. Methods 75, 317-323(1984)].

이들 항체는 만약 그들이 인터페론 작용에 영향을 줄 경우 심각한 효과를 유발시킨다. 이 경우에는 재조합 α-인터페론 뿐만 아니라. 재조합 α-인터페론이 신체자신의 인터페론과 동일하므로 신체 자신의 인터페론에도 작용을 하기 때문이다.

이것의 단점은 항체가 인터페론 처리가 끝난 후에도 작용하여, 질병을 악화시키고 비루스 감염에 대한 신체 자신의 방어를 약화시키며, 따라서 유기체에게 다른 감염을 일으킬 수 있다는 것이다.

이 효과는 이미 동물 시험에서 확인된 바 있다. 그러므로 약제 투여의 최대 안정성적인 면으로 보아, 재조합 α₂인터페론이 사실상 엔도톡신이 없고 거의 비-면역원성인, 순수 타이프이어야 함이 필수적이다.

본 발명의 목적은 항비루스 및 면역 조절 활성이 있는 비-면역원성 재조합 α-인터페론의 제조방법을 개발하는 것이다.

상술한 α-인터페론의 면역원성의 원인은 밝혀지지 않고 있다. 제외될 수 있는 유일한 사실은 내독소 오염때문이라는 것이다.

시도용으로 사용한 제제는 기본적으로 그들의 아미노산 서열이 약간씩 다르다.

아미노산 23 아미노산 34

제제 I : 리신(Lysine) 히스티닌(Histidine)

제제 Ⅱ : 아르기닌(Arginine) 히스티딘

제제 Ⅲ : 아르기닌 아르기닌

임상적 시험에 사용한 단백직의 1차 구조의 구조적 차이와는 별개로, 유전 공학에 의해 제조된 α-인터페론은 항상 단량체 형태, 단축된 분자형태, 환원 형태 및 올리고머 형태 인터페론의 혼합물로 이루어져 있음이 공지되어 있다(참조예 : EPA 108 585, 110 302 및 118 808). 이들 형태의 약간은 시험관내에서 동일한 활성을 보이나 다른 것은 감소된 활성을 보이고, 어떤 것은 면역원 특성을 갖는 것으로 생각된다(참조 : EPA 108 585 및 110 302).

이들 특허원은 이들 형태의 인터페론을 분리하는 방법에 대해 기술하고 있다.

유럽 특허원 제108 505호는 인터페론 탐침(probe)을 pH 3 내지 5에서 수시간 동안 28 내지 40℃의 온도로 배양해서 "미등 모노머(Slow moving monomer)" 및 올리고머를 분리하는 방법을 기술하고 있다.

유럽 특허원 제110 302호는 산화환원 시스템으로 환원시켜서 올리고머로부터 모노머를 형성시키는 방법에 대해 기술하고 있다.

끝으로 유럽 특허원 제118 808호에는, 재조합 α-인터페론이 금속 킬레이트 수지(metal chelate resins)를 사용하여 올리고머 형태로부터 정제되고 있다.

이들 방법으로 수득한 인터페론은 사실상 정량적 형태로 모노머 인터페론을 함유하는 것으로 예상된다 ; 하지만 면역원성에 대한 시험은 나타나지 않았다.

우리들의 세밀한 분석적 연구는 재조합 방법으로 제조한 α-인터페론이 노도에 변동이 있는 상이한 형태의 인터페론 혼합물임을 밝혀냈다.

이들은 인터페론의 올리고머, 테트라머, 트리머 및 다이머(dimers), 메티오닌 인터페론, 인터페론의 환원된 형태 및 단편 및, 놀랍게도 여러가지 모노머 형태를 함유한다.

올리고머는 분자량이 70,000보다 큰 α-인터페론이고, 환원된 α-인터페론은 유리 SH 그룹이 있는 단백질이며, 메티오닌 인터페론은 N-종결 말단에 추가의 메티오닌을 수반하는 α-인터페론이다(α-인터페론의 미생물학적 제조방법에 의해 야기됨).

여러가지 모노머 형태의 α-인터페론의 상이한 S-S 이성체임이 분석으로 밝혀졌다.

이들 이성체를 언어적으로 구별하기 위해, 용어 비-천연 모노머(non-native monomer)를 하기에, 우세하게 발생하는 α-인터페론 모노머의 이성체에 대해 사용하고, 후자는 천연 모노머 α-인터페론에 대해 사용할 것이다. 그러나 이것은 비-천연 모노머가 "천연(natural)"물질로도 존재할 수 있다는 가능성을 배제하지 않아야 한다.

예를 들면, α₂인터페론을 제조하기 위한, 이.콜라이(E. coli) 발효 혼합물에서 7개의 상이한 인터페론 성분이 검추될 수 있다(K1-K7).

분석에 의해 이들은 올리고머, 다이머 및 트리머, 메티오닌 인터페론, 환원된 인터페론 및 위치 1과 98 및 29와 138의 아미노산 간에 이황와 결합을 가지고 있는 천연 모노머 α₂인터페론의 S-S 이성체임이 밝혀졌다[참조 : Wetzel et al., J. Interferon Res., Vol. 1, No. 3, 381-391(1981)].

이미 설명한 바와 같이, 재조합 α-인터페론의 면역원성의 원인은 알려지지 않았다. 그러나 신체 자신의 인터페론과 상이한 모든 형태의 α-인터페론이 면역원 활성이 있음은 또한 명백하다. 이들 형태는 단축된 분자, 다이머 및 모노머, 그리고 또한 상이하게 연결된 이황화 결합을 갖는 비-천연 모노머를 포함한다.

면역원성의 원인이 명백하지 않는한, 미지의 효능을 갖는 이들 형태의 형성을 촉진시킬 어떠한 조건도 재조합 α-인터페론을 제조하는 방법에 사용하지 못한다. 이것은 인터페론의 정제라도 천연성에 위협을 주지 않는 온화한 조건하에서 수행해야 된다는 것을 의미한다. 상승 온도 및 환원제는 이들 조건에 속하지 않는다.

확실히, 모든 정제 단계에서 예를 들면 금속 킬레이트 수지 또는 유사한 문제의 시약의 사용으로 인해 외래 물질이 유입되지 않도록 노력을 기울려야 한다.

본 발명의 주요 특허청구의 범위에서 재언급되는 특성을 갖는 재조합 α-인터페론의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은 예를들면 사람 또는 동물 α-인터페론과 같이 상이한 종으로부터 α-인터페론을 제조 및 정제하는데 적합하다. 제조시 사용되는 숙주 유기체는 원핵생물 또는 진핵생물, 예를들면 이. 콜라이 또는 사카로마이세스 세리비지애(saccharomyces cerevisiae), 바람직하게는 이. 콜라이이다. 여러가지 숙주 유기체의 배양 조건은 당 분야 숙련가에게 숙지되어 있다.

놀랍게도, 성장시간이 α-인터페론의 수율에 영향을 줄 뿐만 아니라 인터페론 혼합물의 조성을 결정하는 결정적 인자임이 발견되었다. 따라서, 이. 콜라이를 사용하는 경우, 인터페론 혼합물의 조성은 성장 지속기에 의존하는 메티오닌 인터페론의 양에 따라 변한다.

따라서, 발효 혼합물을, 최적 성장 시간의 척도로서, 숙주 유기체에 의해 생산된 α-인터페론 유도체의 형성에 대해 짧은 간격을 두고 측정하는 것이 유리하다. 메티오닌 인터페론은 이런 종류의 지시물로 사용할 수 있다. 따라서, 적당한 시간에 예를들면 메티오닌 인터페론이 20% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 특히 1% 이하가 형성된 후 반응을 중지시킴으로써, 본 발명에 따른 연속적 정제 방법을 위한 이상적인 필요물로 특히 순수한 인터페론이 수득된다.

본 방법은 산-안정성 α-인터페론 제조시 특히 적합하다. 예를 들면 DE 34 32 196.9에 따라 pH 2로 세포를 균질기에서 파괴하는 방법을 사용할 수 있다.

직렬 크로마토그라피(tandem chromatography)를 사용하여, 즉 적당한 세척 및 용출 용액과 함께 상이한 흡착제를 사용하는 연속적인 크로마토그라피 단계로 놀랍게도 대부분의 불순물을 제고할 수 있다. 바람직하게는 친화성 컬럼에 직접 연결된 셀룰로오스 예비 컬럼의 배합물을 사용한다. 예를들면 DE-OS 33 06 060에 기술된, 세파로스와 같은 담체와 결합된 EBI 1 항체와 같은 모노클로날 안티-인터페론 IgG-항체(monoclonal anti-interferon IgG-antibody)와 함께 DE-52 셀룰로오스를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

pH 7.5인 트리스/ NaCl 완충액이 세척용액으로 적합함이 증명되었으나, 항체에 대한 인터페론의 결합에 영향을 주지 않고 오염물을 세척해내며, 예비 컬럼에 결합된 항체 컬럼의 특성에 음성적 영향을 갖는 성분을 남겨두는 세척 용액을 사용할 수도 있다.

인터페론용으로 적당한 용출제는 예를 들면 25% 에틸렌글리콜중의 0.1M 시트르산을 함유하는 완충용액이나, 유사한 특성을 갖는 그 밖의 용출제도 적당하다. 일반적으로 용출제는 정제시킬 특정 α-인터페론에 적합해야 한다.

"직렬 용출물(tandem eluate)" 중의 몇몇 불순물은 놀랍게도 pH 4.0 내지 4.8 바람직하게는 pH 4.5로 완충시켜 제거할 수 있다. pH 값은 침전물에 모노머 α-인터페론이 가능한한 거의 존재하지 않도록 선택하여야 한다.

인터페론의 최종 정제는 양이온 교환기, 바람직하게는 MONO-S, 타이프 HR 10/10 양이온 교환기를 사용하여 크로마토그라피 함으로써 수행한다.

pH가 일정하게 유지되고 농도가 변하는 (농도 구배), 암모늄 아세테이트 완충액과 같은 휘발성 완충액을 사용한 편평 눈금 구배(flat graduated gradient)를 사용하여 고도로 정제된 α-인터페론을 용출시킨다. 농도를 일정하게 하고 pH를 변화시키는 (pH 구배)것도 마찬가지로 가능하다. 중요한 점은 용출제가 어떠한 인터페론 오염물, 특히 생성되는 주요 모노머의 S-S 이성체를 제거할 수 있어야 한다. pH 4.0 내지 5.0 바람직하게는 pH 4.5의 0.1 내지 1.0M, 바람직하게는 0.1 내지 0.5M 암모늄 아세테이트로부터 제조한 암모늄 아세테이트 완충액의 선형 농도 구배(linear concentration gradient) 가 이 목적을 위해 특히 적합하다. 이 완충액은 또한 고도로 정제된 α-인터페론이 완충염 및 침전제가 없는 고체 형태로 최초로 수득될 수 있도록 동결건조에 의해 제거될 수도 있다.

본 발명의 따른 방법은 특히 상응하는 종에 투여할 경우 어느 항체도 자극하지 않는 여러가지 종의 α-인터페론을 제조하는데 적합하다.

본 발명에 따른 방법은 환원된 형태의 인터페론 단면이 없는, 재조합의 균질하고 순수하며, 고체이고 비-면역원성인 α-인터페론의 제조시 특히 유리함이 입증되었으며, 이것은 0.2% 이하 올리고머 및 2% 이하 다이머/트리머/테트라머 및 5% 이하 메티오닌 인터페론을 함유하고 있고, 여기에서 모노머 함량의 90% 이상이 천연 모노머 α-인터페론으로 구성되어 있다.

본 발명에 따른 방법은 상기에 기술한 바와 같이, 숙주 유기체가 하기 아미노산 서열에 따라 사람 α-인터페론을 암호화(code)하는 유전자를 함유하고, 천연 모노머 α-인터페론이 위치 1 및 98과 29 및 138의 시스테인 사이에 이황화 결합을 함유하는 천연 모노머 α-인터페론의 제조시 아주 유리하게 사용할 수 있다.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제조할 수 있는 재조합 α-인터페론, 바람직하게는 메티오닌 인터페론을 20% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 특히 1%이하 함유하는 균질한 순수 형태의 재조합 α-인터페론에 관한 것이다.

숙주 유기체의 선택 및 발효 조건의 성질에 따라, 재조합 방법에 의해 제조한 α-인터페론은 메티오닌 인터페론외에 , 디-,트리-, 테트라- 및 올리고머, 환원된 형태 및 단편과 우세하게 생성되는, 변동량의 모노머 α-인터페론 S-S 이성체를 함유할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 처음으로 억압 또는 제거할 수 있다.

그러므로 본 발명은 또한 메티오닌 인터페론을 20% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 특히 1% 이하 함유하고, α-인터페론의 환원 형태 및 단편이 없으며, 올리고머 0.2% 이하 및 다이머/트리머/테트라머 2% 이하, 바람직하게는 올리고머, 테트라머, 트리머 또는 다이머가 전혀 없고, 바람직하게는 천연 모노머가 90% 이상이며, 천연 모노머α-인터페론의 S-S 이성체가 완전히 비함유된 균질한 순수 형태의 재조합 α-인터페론에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특정한 종에 투여했을때, 어느 항체도 자극하지 않는 기술한 여러가지 종의 재조합 α-인터페론 및 고체 인터페론에 관한 것이다.

상술한 특성의 재조합 사람 α-인터페론, 바람직하게는 하기 아미노산 서열에 따른 재조합 사람 α-인터페론이 바람직하다.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

하기 아미노산 서열에 상응하고, 5% 이하의 메티오닌 인터페론을 함유하는 순수한 균질 형태로 존재하며, 인터페론의 환원 형태 및 단편이 없고, 올리고머가 0.2% 이하 및 다이머/트리머/테트라머가 2% 이하이며, 모노머 함량의 95% 이상이 위치 1과 98 및 29와 138 시스테인 사이에 이황화 결합이 있는 천연 모노머 α-인터페론으로 구성된 재조합의 비-면역원성이고 고체인 사람 α-인터페론이 특히 바람직하다.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

본 발명에 따른 방법은 매우 온화한 조건하에 불순물 및 인터페론 오염물을 제거할 수 있다. 이 방법은 하기 아미노산 서열에 따른 α₂Arg 인터페론의 실례를 사용하여 좀더 구체적으로 설명하겠으나, 기타 α-인터페론도 본 발명에 따른 방법, 경우에 따라 약간 비-발명적인 변형과 함께 사용하여 제조 및 정제할 수 있다.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

산-침전된 심부 냉동 바이오매스(biomass)를 1% 아세트산에서 교반하여 해동시킨다. 이것과 모든 후속적 조작은 약 5℃에서 수행한다.

특허원 DE 34 32 196.9에 기술된 바와 같이, 균질기에서 세균 세포를 파괴하고, 폴리에틸렌 이민 PEI-600과 같은 침전 보조제를 0.1 내지 0.25% 범위의 농도를 가하며, NaOH 첨가에 의해 pH를 7.5 내지 10.0으로 조정하고, 현탁액을 수시간 동안 교반함으로써 세포로부터 단백질을 추출한다. 이어서 pH를 7.5로 조정하고, 조추출물(crude extract)을 온화한 조건하에서 정화하며, 단백질의 측정 및 인터페론 시험을 위해 샘플을 채취한다.

기계적 작용하에 발생하는 전단력(Shearing forces)에 대해 공지된 인터페론과 같은 폴리펩타이드의 이손성(易損性 : vulnera-bility)에도 불구하고 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 146, 249-253(1974)], 놀랍게도 고수율의 조인터페론은 상기 pH 조건하에 이 방법을 사용하여 달성할 수 있다.

상이한 발효 뱃치의 시험은 혼합물의 조성이 발효조건의 함수로서 변화함을 보여준다. 특히 성분 1, 즉 제거하기가 매우 어려운 성분인 메티오닌 α-인터페론의 비율은 발효과정 중에 다양하였다 : 발효 8 내지 9시간 후에는 메티오닌 α-인터페론만이 형성되었다.

그러므로 적정한 시간에 발효를 중단시킴으로서, 메티오닌 인터페론을 함유하지 않는 인터페론 제제를 수득할 수 있다.

고체 황산암모늄을 정화시킨 조용액에 65% 포화될 때까지 가한다. 모든 황산 암모늄이 용해된 후, 혼합물을 밤새 냉장하고, 형성된 침전물을 분리하여 필요시까지 -20℃에 보관한다.

인터페론의 침전을 측정하기 위해 맑은 상등액으로부터 인터페론 시험용 샘플을 다시 취한다. 5% 이하의 인터페론이 상등액에 남아 있어야 한다.

황산암모늄 펠릿(pellet)을 0.01M NaCl에 용해시키고, NaOH로 pH를 7.5로 조정하여 용액을 2시간 동안 교반한다. 불용성 분획을 제거하고 가능하면 0.01M NaCl로 한번 더 추출한다.

합한 맑은 용액을 멸균된, 발열물질(pyrogen)이 없는 투석 카트리지(cartridge)를 사용하여 0.01M NaCl로 투석한다. 인터페론 용액의 삼투성은 2 내지 3회 실시후 약 390 내지 430mOsmol/ℓ 이어야 한다. 인터페론 시험용 분취량을 정확한 용액으로부터 취한다.

"직렬 크로마토그라피"를 추가의 정제를 위해 사용한다 : 셀롤로오스 예비컬럼과 고도의 특이한 모노클로날 항체가 있는 후속적 친화 크로마토그라피의 조합, 난용성 샘플 성분을 항체 컬럼으로부터 멀리 유지하는데 예비 컬럼, 이온 교환컬럼을 사용한다. 예비 컬럼용으로는 DE-52 셀룰로오스(Messrs, Whatman)를 pH 7.5인 TRIS /NaCl 완충액으로 완전히 교반하여 크로마토그라피 컬럼에 도입시킨다. 흡착제를 용출물이 pH 및 삼투성에서 더 이상 변화를 보이지 않을 때까지 완충액으로 세척한다. 예비 컬럼을 위해서, 0.025M TRIS/HCl+0.2M NaCl 중의 DE 셀룰로오스 0.5 내지 1.0g을 바이오매스 그람당 사용한다 : 각각 정제시 새로 제조한다. 항체 컬럼을 위해서는, 마우스 복주중(ascites)으로부터 수득한 정제된 모노클로날 안티-인터페론-IgG를 담체로서 BrCN 활성화된 세파로스 4B(Messrs, Pharmacia)에 결합시킨다.

완성한 컬럼 물질은 포스페이트-완충된 식염수(PBS)에 아지드화나트륨과 함께 냉장 보관한다. 최초로 또는 장기간 보관후 사용하기 전에, 항체 컬럼을 25% 에틸렌글리콜중 0.1M 시트르산으로 세척하여 기타 가용성 성분을 제거하고 PBS로 세척하여 중성으로 한다. 0.2 내지 1.0㎖의 컬럼 용적이 항체 컬럼중 바이오매스 매 그람당 요구된다 ; 이 컬럼은 수회 사용할 수 있다. 투석된 인터페론 용액을 우선 두개의 컬럼(예비컬럼 및 항체 컬럼)을 통해 펌핑시키고, 용출액을 280nm에서의 흡광을 측정함으로써 모니터한다. 인터페론 용액을 적용한 후, 용출물 중 단백질의 양이 플라토 값(Plateau value)의 1/20로 떨어질 때까지 TRIS/NaCl 완충액, pH 7.5으로 세척한다. 인터페론이 항체 컬럼에 결합된 것을 점검하기 위해 용출물에 대해 그의 인터페론 함량을 시험한다. 항체 컬럼을 예비 컬럼으로부터 분리하고 용출물에서 단백질이 더 이상 검출되지 않을때까지 TRIS/NaCl 완충액으로 그 자체를 세척한다.

항체에 결합된 인터페론의 용출은 25% 에틸렌 글리콜중 0.1M 시트르산을 사용하여 수행하고, 용출액의 흡광도는 280nm에서 측정한다. 인터페론을 함유하는 단백질 피크(peak)를 수거한다. 인터페론 풀(pool)을 최종 정제시가지 -20℃에서 보관한다. 인터페론 시험, 단백질 측정 및 역상 HPLC 분석은 60-90% 순수한 IFN-α가 이 정제이후 수득됨을 나타낸다. 올리고머 형태외에 이 인터페론 풀은 유리 SH 그룹을 갖는 환원형, 다이머, 트리머, 테트라머 및 비-천연 모노머를 함유한다. 이들 성분들이 모두 생물학적 및 면역학적으로 IFN으로서의 특성을 가질 수 있다. 놀랍게도, 이들 성분의 약간은 pH 4.5(암모니아로)에서 침전시켜 제거할 수 있다. 특히 환원된 황 결합을 가진, 즉 유리 SH 그룹이 있는 형태의 성분분획(성분 5 및 6)이 환원된다. 침전물을 분석해보면 단지 소량의 모노머 인터페론이 침전되었음을 알 수 있다.

최종 정제는 60㎎ 이하의 단백질로 충전될 수 있는 MONO-S 컬럼, 타이프 HR 10/10(양이온 교환기)을 갖는 FPLC 장치(Messrs. Pharmacia에 의해 제조)를 사용하여 수행한다. 이 컬럼 물질은 예외적인 분리 작용을 갖는 고성능 이온교환기를 구성하고, 정제할 단백질의 양이 아주 많음에도 불구하고 최종 정제는 단지 몇시간에 걸쳐 이루어지고, 완충용액은 여과 멸균후 사용할 수 있으며, 주위 온도에서 작업할 수 있다는 커다란 장점을 갖는다.

침전후 수득한 맑은 상등액을 컬럼에 적용한다. FPLC 분리에 사용하는 완충액은 특히 중요하다. 인터페론 성분을 용출시켜서 명확히 식별할 수 있어야 하고 완전히 제거할 수 있어야 한다. 인터페론을 일련의 구배로 용출시키는 암모늄 아세테이트 완충액은 이러한 특성을 가지고 있다. 인터페론을 완만한 쇼율더(shoulder)를 갖는 명확한 피크로서 용출시킨다. 쇼울더 분획(K3) 및 후속적으로 용출된 분획(K5-K7)을 순수한 인터페론의 주요 피크로부터 분리한다. 순수한 인터페론의 피크를 수거하고, 그로부터 HPLC 분석, SDS 겔 전기 영동, 단백질 측정, 인터페론 시험 및 엔도톡신 측정을 위한 분취량을 취한다.

이 크로마토그라피에 의해, 사실상 모든 성분을 주요 피크로부터 분리하고 겔투과 HPLC에서 99% 이상의 모노머 함량을 나타내는 균질한 인터페론을 수득한다. 역상 HPLC는 비천연의 모노머가 단지 약 1%임을 밝혔고 크로마토포커싱(chromatofocussing)은 비-천연 모노머가 2.5%의 비율임을 보여주었다.

MONO-S 컬럼은 재사용하기 전에 pH 8.0인 0.5M NaCl+0.1MNa-포스페이트로 세척하여 흡착된 불순물을 제거한다 ; 25% 에탄올에 보관한다.

휘발성 완충액은 동결건조로 모두 제거할 수 있다. 이를 위해서, IFN 풀을 2㎖ 이하의 뱃치 중에 고압 멸균시킨 동결건조용-앰플(lyo-ampoules ; 용량 8㎖)에 전이한다 ; 이것은 앰플당 순수한 인터페론 1내지 8㎎에 해당한다. 앰플을 미리 세척한 고압 멸균된 동결건조용-마개로 밀봉하고 적어도 -20℃까지 냉각한다. 동결건조는 1토르(torr) 이하의 진공하에 -10℃에서 수행한다. 완충용액의 제거후 온도를 25℃로 올리고 동결건조를 1시간 이상 계속한다. 진공을 완화하고 마개를 측시 압입시킨다. 알루미늄 봉합지로 밀봉하고 이어서 앰플을 냉장고 또는 -20℃에서 보관한다.

설명한 바와 같이 본 발명에 따른 방법과 발효를 조심스럽게 유도(비교적 조기 수거)하여 처음으로 그의 인터페론 함량에 비해 98% 이상의 순도를 가지고 있을뿐만 아니라, 여러가지 인터페론 성분을 기본으로 한 그의 균일성에도 95% 이상 천연 모노머 α-인터페론을 함유하는 α-인터페론의 제조가 가능케 되었다.

이 고도의 순소 및 균일성은 또한 처음으로 염 및 완충액 성분이 없는 고체 형태로 인터페론을 수득할 수 있게 한다. 그러므로 안정제의 사용없이 α-인터페론을 수개월 동안 저장할 수 있다 ; 이것은 지금까지 항상 알부민으로 안정화 시켰던 인터페론보다 보관, 신속처리 및 생약 개발면에서 커다란 장점이 있다. 4℃에서 11달 저장후에도 함량의 상실이 검출되지 않았다.

유럽 특허원 제82 734호에 기술된 결정상 사람 백혈구 인터페론은 인터페론과의 침저제로서 폴리에틸렌글리콜의 결정으로 구성되어 있어서, 표제가 의미하는 것처럼 순수하고 균질한 결정상 인터페론이 아니다.

이미 공지되어 있는 바와 같이 본 발명에 따라 제조한 α-인터페론은 사람 혈청 알부민을 첨가해 용해시키고, 무균 상태까지 여과하여, 특정 적용에 따라 적당한 농도로 무균 조건하에 바이알(Vials)속으로 이전시킨다.

임상적 시험에서, 본 발명에 따라 제조한 α-인터페론은 비-면역원성이고 예외적으로 널리 허용적임이 입증되었다.

1985년 1월까지 전부 75명의 환자에게 비-면역원성 α-인터페론을 처리하였다 : 종양 증상 58명 및 비루스성 중상 17명.

치료를 통해 한 사람에게서도 항체가 자극받지 않았고, 몇몇 경우 치료 기간은 15주 이상 내지 35주 까지 였다.

본 발명에 따른 방법은 천연 모노머 인터페론의 측면에서 균질하고 고체이며, 염과 완충액 성분이 없고 비-면역원성인 고도로 순수한 α₂-인터페론을 최초로 제조할 수 있게 하였다.

공지 방법에 의한 아미노산 서열 분석은 하기 아미노산 서열과 같다 :

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

하기 실시예는 어떤 방법으로든 본 발명을 제한하지 않고 본 발명을 설명하고자 의도된 것이다.

특히 발효 혼합물에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 제한없이 광역적으로 사용할 수 있다. 따라서 기계적 분해후 상당한 IFN을 수득케하는 다른 숙주 유기체 및 EBI-1 모노클로날 항체, 예를 들면 IFN-α, 과 유사한 특수 방법으로 반응하는 인터페론을 사용할 수도 있다. 인터페론 α와 좀덜 상동적인 기타 인터페론도, 만약 상응하는 고도의 특이성 모노클로날 항체를 사용할 경우 본 발명에 따른 방법을 사용하여 정제할 수 있다.

본 발명은 특히 인터페론 유전자를 함유하는 숙주 유기체를 통상적인 조건하에 배양하고, 통상적인 성장후에 세포를 죽여 수거하며, 발현 인터페론을 통상적 방법으로 수거하고, 세포 부스러기를 약알칼리성 배지에서 제거하며, 인터페론을 농축하고 직렬 크로마토그라피에 의해 예비 정제를 실시하며, 용출물을 pH 4.0-4.8로 조정하여 기타 불순물을 제거하고, 인터페론을 용출제로서 휘발성 완충액을 사용한 양이온 교환 컬럼상에 크로마토그라피한 후 동결건조시킴을 특징으로 하고 ; 여기에서, 숙주 유기체가 이.콜라이임을 특징으로 하며 ; 메티오닌 인터페론이 20% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 특별하게는 1% 이하로 형성되는 성장 기간 후에 세포를 사멸시킴을 특징으로 하고 ; 세포를 균질기에서 pH 2로 파괴하여 인터페론을 수거함을 특징으로 하며 ; 직렬 크로마토그라피가 예비 셀룰로오스 컬럼 및 친화성 크로마토그라피로 구성되고, 정제할 물질을 적당한 세척 용액으로 두개의 컬럼을 통해 세척하며, 후속적으로 α-인터페론을 적당한 용출제로 친화성 컬럼으로부터 용출시킴을 특징으로 하고 ; 예비 컬럼은 DE-52 셀룰로오스로 충진하고, 친화성 컬럼은 담체와 결합된 모노클로날 안티-인터페론 IgG 항체로 충진하며, 정제할 물질을 두컬럼을 통해 pH 7.5인 TRIS-NaCl 완충액으로 세척하고, 후속적으로 α-인터페론을 친화성 컬럼으로부터 25% 에틸렌글리콜중의 0.1M 시트르산으로 용출시킴을 특징으로 하며 ; 모노클로날 항체 EBI 1을 사용함을 특징으로 하고 ; 직렬 크로마토그라피로부터의 용출물을 pH 4.5로 조정하여 기타 불순물을 제거함을 특징으로 하며 ; MONO-S, 타이프 HR 10/10 양이온 교환기를 최종 정제시 사용함을 특징으로 하고 ; pH 값 4.0-5.0, 바람직하게는 pH 4.5에서 0.1-1.0M, 바람직하게는 0.1-0.5M 암모늄 아세테이트 완충액으로부터 제조한 성형 농도 구배를 용출시 사용함을 특징으로 하여 재조합 α-인터페론을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 다음 등에 관하여 기술하고 있다.

고체 α-인터페론의 제조방법.

비-면역원성 α-인터페론의 제조방법.

5% 이하의 메티오닌을 함유하고, 인터페론의 환원 형태 및 단편이 없으며, 0.2%이하의 올리고머 및 2% 이하의 다이머/트리머/테트라머를 함유하고, 이때 모노머 함량의 90% 이상이 천연 모노머 인터페론으로 구성된 재조합의 균질하고도 순수한 α-인터페론의 제조방법.

숙주 유기체가 하기 아미노산 서열을 갖는 사람 α-인터페론을 암호화하는 유전자를 함유함을 특징으로 하는 방법.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

5% 이하의 메티오닌-인터페론을 함유하고, α-인터페론의 환원 형태 및 단편이 없으며, 0.2% 이하의 올리고머 및 2% 이하의 다이머/트리머/테트라머를 함유하고, 천연 모노머 α-인터페론이 위치 1과 98및 29와 138의 시스테인 간에 이황화 결합이 있는, 하기 아미노산 서열의 재조합의 균질하고도 순수한 사람 α-인터페론을 제조하는 방법.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

본 발명은 추가로 20% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 특정하게는 1% 이하의 메티오닌-인터페론을 갖는 재조합-α-인터페론이 균질한 순수 형태로 수득됨을 특징으로 하고 ; 균질하고도 순수한 형태로 존재하며, 환원 형태 및 단편이 없고, 0.2% 이하의 올릴고머 및 2% 이하의 다이머/트리머/테트라머를 함유하며, 올리고머 및 다이머/트리머/테트라머가 없고, 모노머 함량의 90% 이상이 천연 모노머-인터페론이며, 비-천연 모노머 인터페론이 없음을 특징으로 하고 ; 어떠한 항체도 자극시키지 않음을 특징으로 하고 ; 고체 형태로 생성됨을 특징으로 하는, 본 발명에 따라 제조되어질 수 있는 재조합 α-인터페론을 기술하고 있다.

본 발명에 따른 사람 α-인터페론, 하기 아미노산 서열

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

에 상응함을 특징으로 하는 α-인터페론, 5% 이하의 메티오닌 인터페론, 0.2% 이하의 올리고머 및 2% 이하의 다이머/트리머/테트라머를 갖는 균질하고도 순수한 형태로 존재하며, α-인터페론의 환원 형태와 단편이 없고, 모노머 함량의 90% 이상이 위치 1과 98및 29와 138의 시스테인 간에 이황화 결합을 갖는 천연 모노머 α-인터페론으로 이루어진, 하기 아미노산 서열

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Ara Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.

에 상응하는 재조합 사람 α-인터페론, 비루성 질환 및 종양에 대한 치료를 위한 본 발명에 따른 α-인터페론의 용도, 본 발명에 따른 α-인터페론 및 불활성 약제학적 부형제 및/또는 담체를 하나 이상 함유함을 특징으로 하는 치료용 약제학적 조성물에 대해 기술하고 있다.

[실시예 1]

(혼합물 이. 콜라이 ; IFN - α₂Arg ; 28℃)

a) -20℃에 보관했던 산-침전된 바이오매스 251g을 1% 아세트산 2500㎖ 중에 용해시키고, 빙욕에서 30분 동안 교반하며, 울트라투락스 타이프 45/6(Ultraturax Type 45/6)을 사용하여 1분 동안 균질화한다. 폴리민 P(Polymin P)를 가하여 최종 농도를 0.25%로 하고, 5N NaOH를 사용하여 pH를 10.0으로 조정하며, 혼합물을 빙욕에서 2시간 동안 교반하고, 최종적으로 5N HCl을 사용하여 pH를 7.50으로 조정한다. 크리스트 크리포퓨지 6-6S(Christ Cryofuge 6-6S)에서 4℃ 및 3000rpm 으로 1시간 동안 원심 분리하면, 인터페론 함량 17.1×10⁹I.U.(100%)인 2540㎖의 맑은 조추출물 및 5330㎎ 함량의 단백질이 수득되는데, 이로부터 3.21×10⁶I.U./단백질(㎎)의 특이 활성을 계산할 수 있다.

b) 황산암모늄을 65% 포화에 달할 때까지 가한다(430g/추출물 ℓ). 혼합물을 4 내지 8℃에서 밤새 보관하고, 생성된 침전물을 베크만(Beckmann) J-2-21 고속 원심분리기, 로토(Rotor) JA 10에서 4℃, 10,000rpm으로 1시간 이내에 원심분리시켜 제거한다. 맑은 상등액 3120㎖는 조추출물에 함유되어 있는 0.7% 인터페론을 함유한다(120×10⁶I.U.).

펠릿을 0.01M NaCl에 용해시키고, 4-8℃에서 2시간 동안 교반한다. 5N-NaOH를 사용하여 pH를 7.50으로 조정하고 용액을 상술한 바와 같이 원심분리시켜 정화시킨다. 맑은 요액을 투석 카트리지(Nephross Allegro, Messrs. Organon Technika)를 사용, 0.01M NaCl로 투석하여 390mOsmol/ℓ 를 수득한다. 인터페론 함량은 13.3×10⁹I.U.(

77.6%)이다.

c) 이어서 투석된 물질을 크로마토그라프한다(직렬 크로마토그라피). 예비 컬럼을 위해서는 Messrs. Whatman이 제조한 DE 52 셀룰로오스 분말 125g을 pH 7.5인 TRIS/NaCl 완충액 (0.025M TRIS/HCl+0.2M NaCl) 중에 사용한다 ; 이것은 바이오매스 g당 컬럼 물질 0.5g에 상응한다. 친화성 컬럼을 위해서는 Br-CN-활성화된 세파로스 4B(Messrs. Pharmacia)에 결합된 모노클로날 안티-인터페론 IgG(EBI1)을 사용한다.

완성된 칼럼 물질은 포스페이트-완충된 식염수(PBS)에 아지드화 나트륨과 함께 4-8℃로 보관한다. 사용전에 항체 컬럼을 25% 에틸렌 글리콜 중의 0.1M 시트르산으로 세척하고 이어서 중화될 때까지 PBS로 세정한다. 0.2 내지 1.0㎖의 컬럼 용적이 항체 컬럼에서 바이오매스의 매 그람에 요구된다. 투석한 인터페론 용액을 먼저 두 컬럼(예비 컬럼 및 항체 컬럼)을 통해 펌핑시키고, 용출액을 280nm에서 흡광도를 측정함으로써 검사한다. 인터페론 용액을 적용한 후, 용출물의 단백질 양이 플라토 값의 1/20로 떨어질 때까지 pH 7.5인 TRIS/NaCl 완충액으로 세척한다. 이어서 항체 컬럼을 예비 컬럼으로부터 분리하고, 단백질이 용출물에서 더이상 검출되지 않을 때까지 pH 7.5인 TRIS/NaCl 완충액으로 그 자체를 세척한다.

항체에 결합된 인터페론의 용출은 25% 에틸렌 글리콜 중의 0.1M 시트르산을 사용하여 수행하고, 다시 280nm에서 용출물의 흡광도를 검사한다. 인터페론을 함유하는 단백질 피크를 수거한다. 용출물 16.8㎖가 인터페론 함량 12.3×10⁹I.U.(

71.9%)으로 수득된다. 단백질의 총량이 54.4㎎이므로 226×10⁶I.U./단백질(㎎)의 특이 활성을 계산할 수 있다.

d) 추가의 정제를 위해서, 용출물을 암모니아로 pH 4.5에 조정하여 형성된 침전물을 제거한다. 맑은 상등액 (18.3㎖)은 단백질 46.3㎎을 함유하며 조 단백질 기본으로 11.8×10⁹I.U.의 인터페론 함량을 갖고 있다. 이것은 69%(255×10⁶I.U./단백질(㎎))의 수율에 상당한다.

e) 최종 정제는 메즈로스. 파머시아가 제조한 FPLC로 MONO-S 컬럼, 타이프 HR 10/10(양이온 교환기)을 사용하여 수행한다.

침전후 수득한 맑은 상등액을, pH 4.5-5.0인 0.1M 암모늄 아세테이트 완충액으로 미리 세척해 놓은 컬럼에 적용하고, 이어서 이 컬럼을 280nm에서의 흡광도가 본래의 값으로 환원될 때까지 세척한다. 흡착된 인터페론의 용출은 혼합한 pH 4.5 내지 5.0인 0.5M 암모늄 아세테이트 완충액을 혼합하여 평면의 염 구배(planar salt gradient)로 수행한다. 인터페론이 명확한 피크로서 용출된다. "쇼울더"분획(K3) 및 후에 용출된 분획(K5-K7)을 순수한 인터페론의 주요 피크로부터 분리한다. 순수한 인터페론의 피크를 수거하고, 그로부터 HPLC 분석, SDS겔 전기영동, 단백질 측정, 인터페론 시험 및 엔도톡신 측정을 위한 본취량을 취한다. 단백질 총 4.1㎎이 "쇼울더"분획 (9.1㎖)에서 발견된다 ; 인터페론 함량은 1.33×10⁹I.U.(7.7%)이다. 이것은 324×10⁶I.U./단백질(㎎)을 산출한다.

9.8㎖의 주요 풀(pool)은 매우 순수한 인터페론 5.18×10⁹I.U.(30.3%) 및 단백질 총 16.1㎖을 함유한다 ; 이것은 특이 활성 322×10⁶I.U./단백질(mg)을 산출한다.

f) α) IFN 풀을 앰풀당 순수한 인터페론 1 내지 약 8㎎의 양에 상당하는, 최고 2㎖까지의 뱃치 중의 고압멸균한 동결건조용-앰풀(용량 8㎖)에 이전한다. 이어서 앰풀을 예비 세척하고 고압멸균시킨 동결건조용-마개로 밀봉하고 적어도 -20℃로 냉각한다. 동결건조는 -10℃로 1토르 이하의 진공하에 수행한다. 완충용액을 제거한 후, 온도를 25℃로 올리고 적어도 1시간 동결건조를 계속한다. 진공을 완화하고 즉시 마개를 견고하게 압입시킨다. 알루미늄 씰로 캡핑(capped)후 앰풀을 냉장고 또는 -20℃에서 보관한다.

β) 안정성을 검증하기 위해서, 4개의 상이한 발효 혼합물을 각각 그러나 유사하게 실시예 1a-f와 같이 정제한 후 동결건조시킨다 ;

동결건조한 혼합물을 IRMA 희석 완충액에 용해하고, 사람 IFN 알파(Messrs. Celltech U.K.)용 NK 2-IRMA의 도움으로 분석한다.

따라서 동결건조는 어떤 손실도 유발하지 않는다. 동결건조한 물질을 약 4℃(냉장고)에 11개월 보관한 후, 0.1M 암모늄 아세테이트에 용해하고 순도(겔투과 HPLC에 의해) 및 함량(NK 2-IRMA 시험에 의해)에 대해 검정한다.

[실시예 2]

인터페론 성분의 조성에 대한 발효시간의 효과를 시험하기 위해, 샘플을 발효 혼합물(이. 콜라이 HB 101 ; 28℃)로 부터 8, 9, 10 또는 11시간 후 채취하고, 통상의 방법으로 pH 2에서 산으로 침전시키며, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 후처리 및 분석한다. 하기 표는 샘플 중의 K1, K2 및 K3(K1 : Met-IFN, K2 : 천연 IFN, K3 : 비-천연 IFN) 함량을 나타낸다. 값은 크로마토포커싱으로 측정하였다.

* n.d. = 검출되지 않음.

[실시예 3]

EBI 1항체의 CNBr-활성화된 세파로스 4B(참조 : DE-OS 33 06 060)에 대한 결합

EBI-1 항체를 우선 pH 8.4인 0.5M NaCl/0.2M NaHCO₃(가능한한 적은 완충액에)로 용해하고, 황산염 이온이 염화바륨으로 외부 용액에서 더이상 검출되지 않을 때까지 완충액으로 투석한다. 황산암모늄의 조심스런 제거는 암모늄 이온이 후속적인 담체에의 결합을 방해하기 때문에 절대적으로 필수적이다. 이어서 단백질 농도를 완충액으로 5㎎/㎖로 조정한다. 결합시 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia)를 담체로서 사용한다. 그것을 우선 제조회사의 지시(포장에 포함된 소책자)에 따라 예비 세척을 한다. 활성화된 세파로스 1g을 EBI-1 항체 매 25㎎에 대해 사용한다. 주위온도에서 pH 8.4인 상기 완충액에서 2시간 동안 결합을 수행한다. 이어서 EBI-1 세파로스를 흡입여과에 의해 제거하고 지시 소책자에 따라 세척한다. 사용한 EBI-1항체의 5% 이상이 여과물에 남아 있어서는 안된다. 처리가 끝난 EBI-1 세파로스는 냉장보관소 PBS/아지드 중에 보관한다.

PBS/아지드 :

PBS : 7.30g 염화나트륨 p.A.(Merck 6404) 3.00g NaH₂PO₄×2H₂O p.A(Merck 6580) 1.15g NaH₂PO₄×H₂O p.A.(Merck 6346)을 용해하여 1000㎖로 함 ; pH 7.0

아지드 : 아주 순수한 아지드화나트륨(Merck 6688) 1.0g/ℓ를 PBS에 가함.

완성한 용액은 무균 여과(0.2마이크론 공극 크기) 하여 냉장 보관소에 보관한다.

인터페론 항체 검정(중화 검정)

물질

세포

사람 폐 암종 세포 "A-549" ATCC CCL 185.

비루스

뇌심근염 비루스(EMC), ATCC VR 129.

인터페론 표준

HS-11(1앰풀 "HS-11" = 1.2㎖ H₂O에 용해시킨 동결건조된 Hu IFN γα-A, 12,000iu/㎖ 수득)

[조직배양평판]

덮개가 있는 96웰(wells), 편평한 바닥, 뉴욕 25860 코닝시(Corning), 웰의 직경 6.4㎜, 처리된 조직 배양물.

[배지]

DMEM=들베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium), 글루타민이 있고 중탄산나트륨이 없음, 플루오 캘. 번호(flow cat.no.)10-331-24(1F-017D).

헤페스(HEPES : Sigma No. H-3375).

트리신(TRICINE : Calbiochem No. 33468, A등급).

FCS=태아 송아지 혈청(Boehringer Mannheim).

사람혈청-알부민(HUMANSERUM-ALBUMIN : Behring Inst., 20%, 주입용).

항생물질, 티아물린 수소 푸마레이트(tiamulin hydrogen fumarate : Biochemie).

쿤들/티롤(Kundl/Tirol : 오스트리아, Sandez C.).

성장배지 : DMEM+10% FCS/불활성화 30분/56℃.

+13mM 헤페스

+6mM 트리신

+1.6g/ℓ NaHCO₃

항생물질 없이

pH 7.2-7.4

검정배치 : 성장배지와 동일하나 FCS 10% 대신에 5%로 하고 티아물린 5㎍/㎖을 가함.

희석배치 : 혈청은 없고 5㎍/㎖ 티아물린이 있는 성장배지.

비루스배지 : 혈청은 없고 티아물리이 5㎍/㎖ 및 사람 혈청 알부민이 3.5㎎/㎖있는 성장배지.

메틸 바이올릿 보관용액(Methyl Violet Storage Solution) :

메틸 바이올릿 메르크 번호 1402…………………………………………………6g

에탄올 ……………………………………………………………………………100㎖

용해하고 약 50℃에서 여과함.

사용을 위한 메틸 바이올릿 용액

보관용액 …………………………………………………………………………50㎖

물(pH 중성) ……………………………………………………………………950㎖

세포를 영구 세포주(cell line)로서 취급한다. 그들을 성장 배지에서 항 트립신성을 파괴하고(trypsinisation)희석하여 생장시킨다. 검정시, 세포를 혈구계로 카운트하고 검정 배지에 현탁하여 웰딩 ㎖당 4-5×10⁴세포의 접종 용액을 수득한다. 이들을 디쉬(dishes)상에 산포한다. 5% CO₂및 상대습도 80%인 대기에서 37℃로 배양한다. 8-24시간 후 통상 단일층(mono-layer)이 완성된다. 이때 인터페론 및 혈청 희석액을 분리 시험관에 준비한다.

대조용 디쉬로서, 1:1000, 1:2000 식으로 1:32,000까지의 HS-111희석액을 1시간 동안 37℃로 배양한다.

시험용 디쉬로서, 충분한 HS-11을 함유하는 희석 배지로 혈청 샘플을 1:2, 1:4, 1:8 등으로 1:64까지 희석하여, 각각의 글래스(glass)가 10iu HS-11/㎖의 최종농도가 되게 한후 이어서 37℃로 1시간 동안 배양한다.

디쉬를 붓고 각각의 웰을 희석 배지(일련번호 2,3,10 및 11) 100㎖ 또는 희석액(일련번호 4-9) 100㎕로 채운다. 디쉬를 상기와 같이 37℃로 4시간 동안 배양한다. 이어서 디쉬를 매 웰에 대해 비루스 배지(비루스없이)100㎕ 및 비루스 희석액(일련번호 3,11,4-9) 50㎕로 피복하여 36시간 안에 거의 90%의 세포 병리적 효과를 달성하고, 이어서 다시 배양한다. 24시간 및 현미경적 검증후 세포를 메틸 바이올릿으로 염색한다.

결과가 표 12a-12f에 나타나 있다. 도표는 첨부물에 있다(표1은 정제의 개관이고 표2는 HPLC에 의한 순도 평가이다).

[방법]

하기 방법들이 분석시 사용된다 :

[단백질 측정]

바이오래드 단백질 검정(BIORAD PROTEIN ASSAY) :

이 검정법은 염료 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)를 사용하여 595nm 에서 단백질/염료 복합체를 측정한다. 사용되는 표준은 소의 혈청 알부민이다.

[면적 측정(Planimetric determination)]

피크 표면의 면적 측정은 겔투과 HPLC에 의해 기록되어 214nm에서 측정된다. 결과를 물질 소 혈청 알부민, 오발부민(ovalbumin), 트립시노겐 및 라이소자임(lysozyme)을 측정한 값을 사용하여 전환시킨다. 이 측정은 특히 부가적으로 또는 배타적으로 직렬 크로마토그라피 정제 단계, pH 4.5, 침전 및 MONO-S상 FPLC 후 제제상에서 수행한다.

[인터페론 측정]

사람 알파 인터페론을 위해 상업적으로 업체(Messrs, CELLTECH : 영국)로부터 입수가능한 "NH₂-IRMA"를 사용한다.

사용한 표준은 생물학적 검정[플라크(plaque)환원 시험, WISH 세포 및 수포성 구내염 비루스]에 의해 국제 표준 B 69/19에 맞춘 실험실 표준 "HS11" 이다.

[SDS-겔 전기영동]

래플리[LAEMMLI ; Nature 227, 680, (1980)]방법이 사용된다. 단백질 염색에 사용된 염료는 쿠마시브릴리언트 블루이다. 인터페론 제제의 20㎍을 순도 점검에 사용하였다.

[크로마투포커싱(Chromatofocussing)]

보도 및 아돌프의 방법(Bodo 및 Adolf ; 사람 IFN-알파 서브타입의 분리 및 특성화, In The Biology of the Interferon System, pages 113-118, Elsevier 1983, Edts, E. DeMaeyer and H. Schellekns)을 pH 범위 4-7에서 MONO-P크로마토포커싱 컬럼 HR 5/20 (Pharmacia)와 함께 사용한다. 완충액은 유동율을 증가시키기 위해 특이화한 25% 1,2-프로판디올 대신에 25% 아세토니트릴을 함유한다. 단백질 농도는 280nm에서 기록되고 pH는 자동적으로 기록된다. 분석할 샘플을 동결건조하고, 물에 1㎎/㎖의 양으로 용해시키며, 완충액 A(pH 7.1)의 5배 용적으로 희석한다. 인터페론 0.2-1.0㎎을 매 분석시 사용한다.

겔투과 HPLC(고압 액체 크로마토그라피)

정지상(Statiomary phase) :

WATERS I-125 ; 2×(300mm×7.8mm), 10㎛ 입자직경

이동상(Mobile phase) :

0.5M Na₂SO₄

0.02M NaH₂PO₄, NaOH로 pH 7.0에 조정

0.04% 트윈 20(Tween 20)

25% 프로필렌글리콜

유동속도 :

0.5㎖/분

검출 :

214nm에서 UV 흡수

분자량 측정 :

소의 혈청 알부민 M66,000

오발 부민 M45,000

트립시노겐 M24,000

라이소자임 M14,300

역상 HPLC(고압 액체 크로마토그라피)

정지상 :

베이커본드(Bakerbond) WP C 18 ; 250mm×4.6mm ; ㎛ 입자 직경 : 30nm 공극 직경

이동상 :

A : 물중의 0.1% 트리플루오로아세트산, pH 2.2

B : 아세토니트릴중의 0.1% 트리플루오로아세트산

구배 프로그램 :

0-2분 : 45% B

2-32분 : 45% B

32-40분 : 53% B

40-50분 : 45% B

유동속도 :

1㎖/분

검출 :

214nm에서 UV 흡수

[표 1]

n.d. = 측정되지 않음

I.U. = 국제단위

[표 2]

* = 측정되지 않음

** = 상대적인 프크 높이 (214nm), K2+1=100%

Claims

인터페론 유전자를 함유한 숙주 유기체를 통상적인 조건하에서 배양하고, 통상의 성장기간 후, 세포를 사멸시켜 수거하며, 발현된 인터페론을 통상적인 방법으로 수거하고, 세포 부스러기를 약알칼리성 배지에서 제거하며, 인터페론을 농축하여 직렬 크로마토프라피(tandem chromatography)로 예비 정제하고, 용출물을 pH 4.0 내지 4.8로 조정하여 불순물을 제거하며, 인터페론을 최종적으로 양이온 교환컬럼에서 용출제로서 휘발성 완충액을 사용하여 크로마토그라피시켜 정제한 후 동결건조시킴을 특징으로 하여, 재조합 α-인터페론을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 직렬 크로마토그라피가 예비 셀룰로오스 컬럼 및 친화성 크로마토그라피로 구성되고, 정제시킬 물질을 세척 용액으로 두 컬럼을 통해 세척하고, 계속해서 α-인터페론을 용출제를 사용하여 친화성 컬럼으로부터 용출시킴을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 직렬 크로마토그라피의 용출물을 pH 4.5로 조정하여 불순물을 제거함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 메티오닌 인터페론을 5%미만으로 함유하고, 인터페론의 환원 형태 및 단편이 없으며, 0.2% 미만의 올리고머 및 2% 미만의 다이머(dimer) 트리머(trimer)/테트리머(tetramer)를 함유하고, 여기에서 모노머(monomer) 함량의 90% 이상이 천연 모노머 인터페론으로 이루어진 제조합성인 균질하고도 순수한 α-인터페론을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 메티오닌 인터페론을 5% 미만으로 함유하고, α-인터페론의 환원 형태 및 단편이 없으며, 0.2% 미만의 올리고머 및 2% 미만의 다이머/ 트리머/테트리머를 함유하고, 여기에서 천연 모노머 α-인터페론이 위치 1과 98 및 29와 138에 있는 시스테인 사이에서 이황화 결합을 함유하는, 하기 아미노산 서열을 갖는 재조합성인 균질하고도 순수한 α-인터페론을 제조하는 방법.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.
제 1 항에 있어서, 고체 α-인터페론을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 비-면역원성 α-인터페론을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 숙주 유기체가 이.콜라이(E.coli)임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 인터페론 유전자가 하기의 아미노산 서열을 갖는 사람 α-인터페론을 암호화하는 유전자임을 특징으로 하는 방법.

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Gly Asn

Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile

Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala

Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln

Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val

Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg

Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr

Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser

Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu.
제 1 항에 있어서, 성장기간에 메티오닌 인터페론이 20% 이하로 형성되는 성장기간 임을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 성장기간이 메티오닌 인터페론이 5% 이하로 형성되는 성장기간 임을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 성장기간이 메티오닌 인터페론이 1% 이하로 형성되는 성장기간 임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세포를 pH 2의 균질기(homogeniser)내에서 파괴시킴으로써 사멸시킴을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 인터페론을 크로마토그라피시켜 정제하는데 사용되는 양이온 교환컬럼이 MONO-S, 타이프 HR 10/10 양이온 교환기임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 용출을 pH 4.0 내지 5.0인 0.1 내지 1.0M의 암모늄 아세테이트 완충액으로부터 제조된 선형 농도 구배를 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 용출을 pH 4.0 내지 5.0인 0.1 내지 1.0M의 암모늄 아세테이트 완충액으로부터 제조된 선형 농도 구배를 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 완충액의 pH가 4.5임을 특징을로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 예비 셀룰로오스 컬럼이 DE-52셀룰로오스 컬럼임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 친화성 크로마토그라피가 담체와 결합된 모노클로날 안티-인터페론 IgG 항체 (monoclonal anti-interferon IgG antibody)를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 모노클로날 항체가 모노클로닐 항체 EBI 1임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 세척 용액이 pH 7.5인 TRIS-NaCl 완충액임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 용출제가 25% 에틸렌글리콜 중의 0.1M 시트르산임을 특징으로 하는 방법.