JPH02198A - 抗体及びその製造法 - Google Patents
抗体及びその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はヒト インターフェロンの精製、ヒト イン
ターフェロンとその抗体の精製品及びそれらに関する精
製ならびに調製法に関する。
ターフェロンとその抗体の精製品及びそれらに関する精
製ならびに調製法に関する。
ここで使用する用語“蛋白°は″糖蛋白（グリコプロテ
ィン）“を含むものである。
ィン）“を含むものである。
ヒト インターフェロンの精製については多くの試みが
なされてきた。この精製の試みの目的には、標準化を目
的としてインターフェロン種（インターフェロン スピ
シーズ）の特性を完全に決定することが含まれている。
なされてきた。この精製の試みの目的には、標準化を目
的としてインターフェロン種（インターフェロン スピ
シーズ）の特性を完全に決定することが含まれている。
今日まで、ヒトＬｅ型インターフェロンを精製する試み
は完全に成功していない。
は完全に成功していない。
この発明は、不活性な且つさもなくば好ましくない不純
物が実質的に存在しないヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白の全成分を始めて製造しうる精製法を発見したことに
基づくものである。
物が実質的に存在しないヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白の全成分を始めて製造しうる精製法を発見したことに
基づくものである。
インターフェロンのＬｅ型はＥ、Ａ、Ｈａｖｅｌｌ Ｂ
。
。
Ｂｅｒｍａｎ、Ｃ，Ａ、Ｏｇｂｕｒｎ、に、Ｂｅｒｇ、
に、Ｐａｕｃｋｅｒ、ａｎｄ Ｊ。
に、Ｐａｕｃｋｅｒ、ａｎｄ Ｊ。
Ｖｉｌｃｅｋ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ；
ＵＳＡ、 ７２，２１８５〜２１８７（１９７５）で
定義されている。
ＵＳＡ、 ７２，２１８５〜２１８７（１９７５）で
定義されている。
この発明によって、純粋なヒト白血球インターフェロン
蛋白が粗ヒト白血球インターフェロンから一連の特別な
精製工程を経て作られ、且つ純ヒト白血球インターフェ
ロンがＳＯＳ ＰＡＧＥ （ナトリウム ドデシルスル
フアート ポリアクリルアミド傾斜電気泳動）における
染色蛋白バンドで特徴付けられた。
蛋白が粗ヒト白血球インターフェロンから一連の特別な
精製工程を経て作られ、且つ純ヒト白血球インターフェ
ロンがＳＯＳ ＰＡＧＥ （ナトリウム ドデシルスル
フアート ポリアクリルアミド傾斜電気泳動）における
染色蛋白バンドで特徴付けられた。
純ヒト白血球インターフェロン蛋白の製造及び特性決定
に用いられる特定の実験条件は下記の”原料と方法°お
よび“実験の部“の項で記載される。純白血球インター
フェロン蛋白類の製造と特性決定に含まれる製品と手法
のあるものは、それ自体新規であり、インターフェロン
技術に一般的に利用可能であってこの発明の一つをなす
ものであり、広義には蛋白精製技術にも用いられる。
に用いられる特定の実験条件は下記の”原料と方法°お
よび“実験の部“の項で記載される。純白血球インター
フェロン蛋白類の製造と特性決定に含まれる製品と手法
のあるものは、それ自体新規であり、インターフェロン
技術に一般的に利用可能であってこの発明の一つをなす
ものであり、広義には蛋白精製技術にも用いられる。
今この発明により入手可能にされ特性が決定された純ヒ
ト インターフェロン蛋白特に純ヒトＬｅ型インターフ
ェロン蛋白はそれ自体この発明を構成するもので、かつ
この発明の他の１つであってこの明細書で説明され例証
される更に新しい発展の鍵を構成するものである。
ト インターフェロン蛋白特に純ヒトＬｅ型インターフ
ェロン蛋白はそれ自体この発明を構成するもので、かつ
この発明の他の１つであってこの明細書で説明され例証
される更に新しい発展の鍵を構成するものである。
数回のくり返し実験により、“原料と方法”の項で記載
される ＳＤＳ ＰＡＧＥと染色条件下０．９Ｘ １０
’ＩＦυの全インターフェロン負荷で、純ヒト白血球イ
ンターフェロンは、１８，４００±２００ダルトンと２
０．１００±２Ｈダルトンに本質的に２つだけのシャー
プな染色蛋白バンドと２０，３００±２００と２０，４
００±２００ダルトンの間に次位の染色蛋白バンドを示
すことが立証されたのである。下記の蛋白測定法によっ
て測定されたように純ヒト白血球インターフェロンは蛋
白Ｒｇ当り約１０” ＩＦＵの比活性度（ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有し、この比活性度は、使
用する蛋白測定法によっである程度変わるかも知れない
。蛋白重量ベースでのこの比活性度は蛋白１ｇ当り２Ｘ
１Ｇ”〜２ＸＩ０９！ＦＵであると判断される。
される ＳＤＳ ＰＡＧＥと染色条件下０．９Ｘ １０
’ＩＦυの全インターフェロン負荷で、純ヒト白血球イ
ンターフェロンは、１８，４００±２００ダルトンと２
０．１００±２Ｈダルトンに本質的に２つだけのシャー
プな染色蛋白バンドと２０，３００±２００と２０，４
００±２００ダルトンの間に次位の染色蛋白バンドを示
すことが立証されたのである。下記の蛋白測定法によっ
て測定されたように純ヒト白血球インターフェロンは蛋
白Ｒｇ当り約１０” ＩＦＵの比活性度（ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有し、この比活性度は、使
用する蛋白測定法によっである程度変わるかも知れない
。蛋白重量ベースでのこの比活性度は蛋白１ｇ当り２Ｘ
１Ｇ”〜２ＸＩ０９！ＦＵであると判断される。
純インターフェロンが二つの主要な明白なバンドを示す
事実は、粗製または部分精製のインターフェロンｔＪＮ
製品を用いる先行技術の知見によると、ヒト白血球イン
ターフェロンが少なくとも２つの主要な種からなるもの
であることを意味する。例えば、３．ｇｘ １０＠ｆＦ
Ｕの高い全インターフェロン負荷をすると上記のＳＤＳ
ＰＡＧＥ系では６つのインターフェロン蛋白バンドか
らなる更に分化した蛋白パターンを示しうろことが分っ
た。すなわち１８，４１０±２００ダルトンと２０，１
８０±２００ダルトンの２つの強い染色バンド及び上記
次位の染色バンドに対応すル２０．４２０±２００ダル
トンの中位に染色したバンド並びｌ： １９．５００
＋ ２００ダルトン、２１，１３０±２００ダルトン及
び２３，４４０±２００ダルトンのやっと見える程度の
蛋白バンドである。ＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド傾
斜ゲルの上記バンドの個々の成分はそれぞれ、生物学的
インターフェロン活性：すなわち抗ウィルス活性、抗ヒ
ト白血球インターフェロン「抗ヒト線維芽細胞（ａｎｔ
ｉ−ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）インターフェ
ロンではない」だけを中和する能力および抗細胞活性に
種々のいわゆる非ウィルス活性が加わった活性（これら
の活性はナチュラルキラーセルやＭＩＣ−ＣＭＬの増強
、ＨＬＡ抗原の増加等で例証される）を示すということ
を見出した。
事実は、粗製または部分精製のインターフェロンｔＪＮ
製品を用いる先行技術の知見によると、ヒト白血球イン
ターフェロンが少なくとも２つの主要な種からなるもの
であることを意味する。例えば、３．ｇｘ １０＠ｆＦ
Ｕの高い全インターフェロン負荷をすると上記のＳＤＳ
ＰＡＧＥ系では６つのインターフェロン蛋白バンドか
らなる更に分化した蛋白パターンを示しうろことが分っ
た。すなわち１８，４１０±２００ダルトンと２０，１
８０±２００ダルトンの２つの強い染色バンド及び上記
次位の染色バンドに対応すル２０．４２０±２００ダル
トンの中位に染色したバンド並びｌ： １９．５００
＋ ２００ダルトン、２１，１３０±２００ダルトン及
び２３，４４０±２００ダルトンのやっと見える程度の
蛋白バンドである。ＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド傾
斜ゲルの上記バンドの個々の成分はそれぞれ、生物学的
インターフェロン活性：すなわち抗ウィルス活性、抗ヒ
ト白血球インターフェロン「抗ヒト線維芽細胞（ａｎｔ
ｉ−ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）インターフェ
ロンではない」だけを中和する能力および抗細胞活性に
種々のいわゆる非ウィルス活性が加わった活性（これら
の活性はナチュラルキラーセルやＭＩＣ−ＣＭＬの増強
、ＨＬＡ抗原の増加等で例証される）を示すということ
を見出した。
インターフェロン蛋白を完全に精製すれば、単に純イン
ターフェロン調製物またはその一つ以上の成分で動物に
免疫性を与えることにより、活性スピシーズに対し厳に
特異性を有する抗インターフェロンを生産することがは
じめて可能になる。
ターフェロン調製物またはその一つ以上の成分で動物に
免疫性を与えることにより、活性スピシーズに対し厳に
特異性を有する抗インターフェロンを生産することがは
じめて可能になる。
かような単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｒｉｃ）の強
い抗インターフェロンは、簡便かつ経済的に粗製または
部分精製インターフェロンを精製し、多量の純インター
フェロンまたは高度精製のインターフェロン（これら純
又は精製インターフェロンは臨床用、標準化、化学的研
究およびシーケンス研究用として、並びに単一特異性流
インターフェロンを繰返し製造するための免疫抗原とし
て用いられる）を得るために行う抗体アフィニティ り
ロマトグラフィ用に極めて有用である。この発明には、
純ヒト白血球インターフェロンに対して生ずる単一特異
性抗原を用いヒト白血球インターフェロンを精製する方
法だけではなく、その単一特異性抗インターフェロンと
免疫学的に交叉反応する他のタイプのインターフェロン
の精製法も含まれる。この他のタイプのインターフェロ
ンとしては、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）インタ
ーフェロン［ヒト リンホブラストイド インターフェ
ロン（ｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ １ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ） ；そのＬｅ型インターフェロンは
、ヒドリンホブラストイド インターフェロンすなわち
ナマルバ インターフェロンの生物学的活性の約８５％
を占める。 Ｅ、Ａ、Ｈａｖｅｌｌ、Ｙ。
い抗インターフェロンは、簡便かつ経済的に粗製または
部分精製インターフェロンを精製し、多量の純インター
フェロンまたは高度精製のインターフェロン（これら純
又は精製インターフェロンは臨床用、標準化、化学的研
究およびシーケンス研究用として、並びに単一特異性流
インターフェロンを繰返し製造するための免疫抗原とし
て用いられる）を得るために行う抗体アフィニティ り
ロマトグラフィ用に極めて有用である。この発明には、
純ヒト白血球インターフェロンに対して生ずる単一特異
性抗原を用いヒト白血球インターフェロンを精製する方
法だけではなく、その単一特異性抗インターフェロンと
免疫学的に交叉反応する他のタイプのインターフェロン
の精製法も含まれる。この他のタイプのインターフェロ
ンとしては、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）インタ
ーフェロン［ヒト リンホブラストイド インターフェ
ロン（ｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ １ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ） ；そのＬｅ型インターフェロンは
、ヒドリンホブラストイド インターフェロンすなわち
ナマルバ インターフェロンの生物学的活性の約８５％
を占める。 Ｅ、Ａ、Ｈａｖｅｌｌ、Ｙ。
Ｋ、Ｙｉｐ、ＪＪｉｌｃｅｋ、”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎＩｙｍｐｈｏｂｌａｓ
ｔｏｉｄ（Ｎａｍａｌｖａ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、＠
Ｊ、ｇｅｎ。
ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎＩｙｍｐｈｏｂｌａｓ
ｔｏｉｄ（Ｎａｍａｌｖａ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、＠
Ｊ、ｇｅｎ。
Ｖｉｒｏｌ、、３８５ｌ−５９（１９７７）参照］およ
びインターフェロン蛋白（または重要な生物学的インタ
ーフェロン活性決定因子を有する蛋白）を生産するため
のＤＮＡコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）を運ぶ微生物の
培養によって得られるそのＬｅ型を含有するインターフ
ェロンがある。
びインターフェロン蛋白（または重要な生物学的インタ
ーフェロン活性決定因子を有する蛋白）を生産するため
のＤＮＡコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）を運ぶ微生物の
培養によって得られるそのＬｅ型を含有するインターフ
ェロンがある。
またこの単一特異性抗インターフェロンは、それ自体公
知法でインターフェロン蛋白の生産用の遺伝子工学のシ
ステムを確立するために有用である。すなわち、遺伝子
工学に属する知られた方法によれば、その第一段階はイ
ンターフェロン生産細胞から伝令ＲＮＡの単離であり、
そこではインターフェロンの合成がインターフェロン誘
発因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）によって開始され、インター
フェロンの免疫学的な決定因子（またはその一部）を保
持したインターフェロン蛋白の合成を完了し、一方、そ
のときそのインターフェロンはまだリホゾームやメツセ
ンジャーＲＮＡに結合している。インターフェロン産生
細胞としては、通常の方法またはバラフィコ−） （ｂ
ｕｆｆｙ ｃｏａｔｓ） ［またはフイコル技法で単離
されたリンパ球］中で成育させた高度クローン産生ナマ
ルバ細胞懸澗液が好ましいものである。メツセンジャー
ＲＮＡは、かような細胞をそれ自体公知の方法で溶解し
、その溶解物を抗体アフィニティカラム（そこで共有結
合される抗体は単一特異性抗インターフェロンである）
中を通過させることによって単離される。この抗体カラ
ムはインターフェロンを選択的に保持するだけでなく、
付着したメツセンジャーＲＮＡも保持する。塩の溶離の
ごとき公知方法で、メツセンジャーＲＮ＾はカラムから
の溶離液から単離され、また公知方法でリバース トラ
ンスクリプターゼ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）と処理すると対応するＤＮＡを与える。その
代りに、公知の免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉ
ｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）が用いられ、また
この方法は二重免疫沈降法とあわせて用いることもでき
る。遺伝子工学に属する公知方法にしたがって、かかる
インターフェロンまたはその主要部分に関するＤＮＡコ
ーディングは、適当なりローニングベクター好ましくは
ミニプラスミドに組込まれ、微生物に移送される。これ
の培養によりインターフェロンおよび／またはインター
フェロン誘導体が生産され、培養媒体中に放出される。
知法でインターフェロン蛋白の生産用の遺伝子工学のシ
ステムを確立するために有用である。すなわち、遺伝子
工学に属する知られた方法によれば、その第一段階はイ
ンターフェロン生産細胞から伝令ＲＮＡの単離であり、
そこではインターフェロンの合成がインターフェロン誘
発因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）によって開始され、インター
フェロンの免疫学的な決定因子（またはその一部）を保
持したインターフェロン蛋白の合成を完了し、一方、そ
のときそのインターフェロンはまだリホゾームやメツセ
ンジャーＲＮＡに結合している。インターフェロン産生
細胞としては、通常の方法またはバラフィコ−） （ｂ
ｕｆｆｙ ｃｏａｔｓ） ［またはフイコル技法で単離
されたリンパ球］中で成育させた高度クローン産生ナマ
ルバ細胞懸澗液が好ましいものである。メツセンジャー
ＲＮＡは、かような細胞をそれ自体公知の方法で溶解し
、その溶解物を抗体アフィニティカラム（そこで共有結
合される抗体は単一特異性抗インターフェロンである）
中を通過させることによって単離される。この抗体カラ
ムはインターフェロンを選択的に保持するだけでなく、
付着したメツセンジャーＲＮＡも保持する。塩の溶離の
ごとき公知方法で、メツセンジャーＲＮ＾はカラムから
の溶離液から単離され、また公知方法でリバース トラ
ンスクリプターゼ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ）と処理すると対応するＤＮＡを与える。その
代りに、公知の免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｒｅｃｉ
ｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）が用いられ、また
この方法は二重免疫沈降法とあわせて用いることもでき
る。遺伝子工学に属する公知方法にしたがって、かかる
インターフェロンまたはその主要部分に関するＤＮＡコ
ーディングは、適当なりローニングベクター好ましくは
ミニプラスミドに組込まれ、微生物に移送される。これ
の培養によりインターフェロンおよび／またはインター
フェロン誘導体が生産され、培養媒体中に放出される。
微生物の培養で得られるかようなインターフェロンを精
製するには、粗製品を単一特異性抗インターフェロンを
用いた抗体アフィニティ カラムを通過させるという面
記と同一の方法に付すのが適切である。
製するには、粗製品を単一特異性抗インターフェロンを
用いた抗体アフィニティ カラムを通過させるという面
記と同一の方法に付すのが適切である。
放射性標識した単一特異性抗インターフェロンは、微生
物のクローンがＤＮＡを受は取り、インターフェロン、
その一部または誘導体を生産しうるということを評価す
るのに価値のある道具となりうる。
物のクローンがＤＮＡを受は取り、インターフェロン、
その一部または誘導体を生産しうるということを評価す
るのに価値のある道具となりうる。
０．９ｘ １０’ｌＦＵのインターフェロン負荷におい
て、純ヒト白血球インターフェロン蛋白は、５〜６つの
生物学的ピークと共にＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド
傾斜ゲル中に上記３つの別々の蛋白バンドとして現れる
。見出される生物学的バンドの数が５つになるか６つに
なるかは、そのゲルスライスが切り取られる正確な位置
によって左右される。第１図に、後記の“原料と方法”
の項に記載したのと同様にしてこの負荷で作製した染色
ＳＤＳ ＰＡＧＥ傾斜ゲルスラブを示した。この蛋白バ
ンドは各々明確なインターフェロン活性を有することを
示した。
て、純ヒト白血球インターフェロン蛋白は、５〜６つの
生物学的ピークと共にＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド
傾斜ゲル中に上記３つの別々の蛋白バンドとして現れる
。見出される生物学的バンドの数が５つになるか６つに
なるかは、そのゲルスライスが切り取られる正確な位置
によって左右される。第１図に、後記の“原料と方法”
の項に記載したのと同様にしてこの負荷で作製した染色
ＳＤＳ ＰＡＧＥ傾斜ゲルスラブを示した。この蛋白バ
ンドは各々明確なインターフェロン活性を有することを
示した。
第２図に、同一のインターフェロン負荷での他の実験か
ら得たＳＤＳスラブの図と後記“原料と方法”の項で説
明される方法で測定されたバンドに関するインターフェ
ロン活性のプロファイルとを示したが、５個の生物学的
インターフェロンのピークと３個の明確な染色バンドと
が認められる。第２図から、蛋白バンドがインターフェ
ロン活性のピ−クと厳密に一致していることが、明らか
に認められる。このことはその蛋白がインターフェロン
蛋白であるということを証明している。インターフェロ
ン活性プロファイルは、勿論ゲルの個々のスライシング
の正確な位置に左右されるということは注目すべき重要
なことである。第２図において、２０，４１０±２００
ダルトンの位置の次位のバンドの一つのインターフェロ
ン活性はそれ程明白ではないが、同一のインターフェロ
ン負荷の他の実験ではその次位のバンド自体がインター
フェロン活性を有することが示され、より高い負荷での
実験では（以下参照）その次位のバンドが明白なインタ
ーフェロンの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）であること
が見出された。対応するインターフェロン蛋白切片中に
見出されＳＤＳ ＰＡＧＥから得られたインターフェロ
ン活性の量は、蛋白バンドの染色強度から評価される蛋
白の量と直線的に対応する。従って、二つの主体をなす
インターフェロン蛋白と次位のバンドが明確に存在する
ことが、第１図および第２図に示された実験で実証され
た。系内へのインターフェロン負荷がより高い実験では
、第３図［染色と脱色（ｄｅｓＬａｉｎｉｎｇ）を行っ
た後、六つの生物学的ピークと共に六つのインターフェ
ロン蛋白が測定された］に示したごとく、上記したバン
ドのより詳細なバンドパターンが示された。ＳＯＳで処
理されたインターフェロンは、その免疫学的な決定因子
（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を保育し、ＳＤＳで処理さ
れていないインターフェロンに比較してより明白に抗原
性を示す（又は保有する）ということは知られているの
で［ｐａｕｃｋｅｒらの、ヒト白血球インターフェロン
製剤によるマウスの免疫によって示されている。（Ｄａ
ｌｔｏｎ、Ｂ、Ｆ、 、Ｏｇｂｕｒｎ、Ｃ，Ａ、 、Ｐ
ａｕｃｋｅｒ、に、 ；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ １ｎｔｅｒ
−ｆｅｒｏｎｓ ｉｎ ｍ１ｃｅ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ
ｍｕｎ、１９（２）、５７０−５７４（１９７８）、Ｐ
Ｐ４：２５〜３０）］、予備のＳＤＳ ＰＡＧＥによっ
て、各成分を分離された形態で得ることができるだけで
なく、以下に詳述するように分離した成分で免疫にする
こともできる。
ら得たＳＤＳスラブの図と後記“原料と方法”の項で説
明される方法で測定されたバンドに関するインターフェ
ロン活性のプロファイルとを示したが、５個の生物学的
インターフェロンのピークと３個の明確な染色バンドと
が認められる。第２図から、蛋白バンドがインターフェ
ロン活性のピ−クと厳密に一致していることが、明らか
に認められる。このことはその蛋白がインターフェロン
蛋白であるということを証明している。インターフェロ
ン活性プロファイルは、勿論ゲルの個々のスライシング
の正確な位置に左右されるということは注目すべき重要
なことである。第２図において、２０，４１０±２００
ダルトンの位置の次位のバンドの一つのインターフェロ
ン活性はそれ程明白ではないが、同一のインターフェロ
ン負荷の他の実験ではその次位のバンド自体がインター
フェロン活性を有することが示され、より高い負荷での
実験では（以下参照）その次位のバンドが明白なインタ
ーフェロンの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）であること
が見出された。対応するインターフェロン蛋白切片中に
見出されＳＤＳ ＰＡＧＥから得られたインターフェロ
ン活性の量は、蛋白バンドの染色強度から評価される蛋
白の量と直線的に対応する。従って、二つの主体をなす
インターフェロン蛋白と次位のバンドが明確に存在する
ことが、第１図および第２図に示された実験で実証され
た。系内へのインターフェロン負荷がより高い実験では
、第３図［染色と脱色（ｄｅｓＬａｉｎｉｎｇ）を行っ
た後、六つの生物学的ピークと共に六つのインターフェ
ロン蛋白が測定された］に示したごとく、上記したバン
ドのより詳細なバンドパターンが示された。ＳＯＳで処
理されたインターフェロンは、その免疫学的な決定因子
（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を保育し、ＳＤＳで処理さ
れていないインターフェロンに比較してより明白に抗原
性を示す（又は保有する）ということは知られているの
で［ｐａｕｃｋｅｒらの、ヒト白血球インターフェロン
製剤によるマウスの免疫によって示されている。（Ｄａ
ｌｔｏｎ、Ｂ、Ｆ、 、Ｏｇｂｕｒｎ、Ｃ，Ａ、 、Ｐ
ａｕｃｋｅｒ、に、 ；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ １ｎｔｅｒ
−ｆｅｒｏｎｓ ｉｎ ｍ１ｃｅ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ
ｍｕｎ、１９（２）、５７０−５７４（１９７８）、Ｐ
Ｐ４：２５〜３０）］、予備のＳＤＳ ＰＡＧＥによっ
て、各成分を分離された形態で得ることができるだけで
なく、以下に詳述するように分離した成分で免疫にする
こともできる。
比活性度について述べれば、この発明は、約２ＸＩＯ”
〜２ＸｌＯ’ ＩＦＵ／肩９の蛋白の比活性度を有する
ヒト インターフェロンまたはその種に関する。
〜２ＸｌＯ’ ＩＦＵ／肩９の蛋白の比活性度を有する
ヒト インターフェロンまたはその種に関する。
しかし、蛋白の定量方法にはかなりの種類があるので、
比活性度の実際の数値は個々の種を５ＤＳＰＡＧＥで明
確に示すのに比べて重要ではない。
比活性度の実際の数値は個々の種を５ＤＳＰＡＧＥで明
確に示すのに比べて重要ではない。
そのため、この発明の純インターフェロン蛋白を下記の
ように表わすのがより適切である。すなわち、インター
フェロンの全負荷が０．９ｘ １０’ｌＦＵでかつここ
で定められたＳＤＳ ＰＡＧＥ及び染色条件下にて、１
８，４００及び２０，１００ダルトンにそれぞれ抗ウィ
ルス性インターフェロン活性を有する２つの主要なシャ
ープな染色蛋白バンド、 ２０，３００ダルトンと２０
，４００ダルトンの間に抗ウィルス性インターフェロン
活性を有する次位の染色蛋白バンド並びに１９．５００
．２１，１３０、及び２３，４４０ダルトンに抗ウィル
ス性インターフェロン活性の小さなピークを示しくこの
ダルトン分子量の実験精度は±２００ダルトンである）
、まｋそのＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミドグラジェン
トが特に他の染色蛋白部分を示さないヒトＬｅ型インタ
ーフェロン蛋白か；または、インターフェロンの全負荷
が３．８ｘ ｌＯ”ｌＦＵ、でかつここで定められたＳ
ＤＳ ＰＡＧＥ及び染色条件下にて、抗ウィルス性イン
ターフェロン活性を有する六つの染色蛋白バンド、すな
わち１８，４１０と２０，１８０ダルトンの強いバンド
、２０，４２０ダルトンの中位の強度のバンド及び１９
，５００．２１，１３０と２３，４４０ダルトンに見え
る程度のバンド（このダルトン分子量の実験精度は±２
００ダルトンである）を示し、抗ウィルス性インターフ
ェロン活性のピークが染色蛋白バンドと正確に一致しか
つそのＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド グラジェント
が特に他の染色蛋白部分を示さないヒトＬｅ型インター
フェロン蛋白として表わすのがより適切である。
ように表わすのがより適切である。すなわち、インター
フェロンの全負荷が０．９ｘ １０’ｌＦＵでかつここ
で定められたＳＤＳ ＰＡＧＥ及び染色条件下にて、１
８，４００及び２０，１００ダルトンにそれぞれ抗ウィ
ルス性インターフェロン活性を有する２つの主要なシャ
ープな染色蛋白バンド、 ２０，３００ダルトンと２０
，４００ダルトンの間に抗ウィルス性インターフェロン
活性を有する次位の染色蛋白バンド並びに１９．５００
．２１，１３０、及び２３，４４０ダルトンに抗ウィル
ス性インターフェロン活性の小さなピークを示しくこの
ダルトン分子量の実験精度は±２００ダルトンである）
、まｋそのＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミドグラジェン
トが特に他の染色蛋白部分を示さないヒトＬｅ型インタ
ーフェロン蛋白か；または、インターフェロンの全負荷
が３．８ｘ ｌＯ”ｌＦＵ、でかつここで定められたＳ
ＤＳ ＰＡＧＥ及び染色条件下にて、抗ウィルス性イン
ターフェロン活性を有する六つの染色蛋白バンド、すな
わち１８，４１０と２０，１８０ダルトンの強いバンド
、２０，４２０ダルトンの中位の強度のバンド及び１９
，５００．２１，１３０と２３，４４０ダルトンに見え
る程度のバンド（このダルトン分子量の実験精度は±２
００ダルトンである）を示し、抗ウィルス性インターフ
ェロン活性のピークが染色蛋白バンドと正確に一致しか
つそのＳＤＳ ＰＡＧＥアクリルアミド グラジェント
が特に他の染色蛋白部分を示さないヒトＬｅ型インター
フェロン蛋白として表わすのがより適切である。
ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの上記バンドにおける個々の成分
は、生物学的にインターフェロン活性、抗ヒト白血球イ
ンターフェロンを中和する性能、抗細胞活性等を有する
ことば重要であり注目すべきである。
は、生物学的にインターフェロン活性、抗ヒト白血球イ
ンターフェロンを中和する性能、抗細胞活性等を有する
ことば重要であり注目すべきである。
またこの発明は、上記の３ＳＤＳ ＰＡＧＥバンドで表
わされる各成分、その各成分が有する有意の生物学的イ
ンターフェロン活性決定因子を有する蛋白及びその各成
分が有する有意な免疫学的決定因子を有する蛋白に関す
る。
わされる各成分、その各成分が有する有意の生物学的イ
ンターフェロン活性決定因子を有する蛋白及びその各成
分が有する有意な免疫学的決定因子を有する蛋白に関す
る。
原料に関して、この発明のヒト インターフェロン蛋白
は、前記したように、ヒト細胞を用いて作製されるヒト
白血球インターフェロン、培養されたヒト リンホブラ
ストイド（ナマルバ）細胞又はインターフェロンのＤＮ
Ａコーディングを有する微生物を培養して作製された蛋
白もしくはその主要部から誘導して得られる。しかし、
他の出発物から得られるヒトＬｅ型インターフェロンで
あっても、上記の特徴を有するものであればこの発明の
範囲に含まれる。
は、前記したように、ヒト細胞を用いて作製されるヒト
白血球インターフェロン、培養されたヒト リンホブラ
ストイド（ナマルバ）細胞又はインターフェロンのＤＮ
Ａコーディングを有する微生物を培養して作製された蛋
白もしくはその主要部から誘導して得られる。しかし、
他の出発物から得られるヒトＬｅ型インターフェロンで
あっても、上記の特徴を有するものであればこの発明の
範囲に含まれる。
ヒトＬｅ型インターフェロンは、抗ウィルス活性及び抗
腫瘍活性を含めてヒトに対して多くの重要な治療効果を
示し、かつ純ヒトＬｅ型インターフェロンを投与すれば
これらの有用な性質が一層利用可能になることはよく知
られている。この発明には、ヒトもしくは動物に疾病予
防、治療または免疫効果を与えるため投与するのに適応
させた一種又は複数種のヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白からなる製剤が含まれる。かような製剤は、例えば非
経口、鼻内又は局所投与に応用される。
腫瘍活性を含めてヒトに対して多くの重要な治療効果を
示し、かつ純ヒトＬｅ型インターフェロンを投与すれば
これらの有用な性質が一層利用可能になることはよく知
られている。この発明には、ヒトもしくは動物に疾病予
防、治療または免疫効果を与えるため投与するのに適応
させた一種又は複数種のヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白からなる製剤が含まれる。かような製剤は、例えば非
経口、鼻内又は局所投与に応用される。
この発明の純インターフェロン蛋白のもつとも有用な製
剤は水溶液である。水溶液の純インターフェロン蛋白は
安定化させねばならないが、安定剤はその溶液の用途に
よって選択される。この溶液を、ヒトに例えば非経口投
与して用いる場合、安定剤は生理学的に受容な安定剤で
なければならず、適切な安定剤はヒト血清蛋白及びその
フラクション並びにヒトアルブミンのごときヒトに対し
非毒性かつ非免疫性の一つの蛋白又はその蛋白を組合わ
したものである。典型的な好ましい安定剤は１％のヒト
アルブミンである。ヒトの非経口投与する組成物中の純
インターフェロン蛋白の通常の農度は、１０’〜２ＸＩ
Ｏ’ｌＦＵ／次ｇに相当する範囲であり、通常の一日当
りの投与量は合計３ＸＩＯ＠〜１０’例えば５Ｘ１０＠
〜ｌＯ’ｌＦＵであり、−日当り１〜２回筋肉注射して
投与するのが好ましい。ヒト投与用純インターフェロン
の溶液を作製する際、確実に滅菌しかつ発熱物質を存在
させない予防策のごとき非経口投与用組成物の製造時に
通常行われている通常の製薬上の予防策が行われる。
剤は水溶液である。水溶液の純インターフェロン蛋白は
安定化させねばならないが、安定剤はその溶液の用途に
よって選択される。この溶液を、ヒトに例えば非経口投
与して用いる場合、安定剤は生理学的に受容な安定剤で
なければならず、適切な安定剤はヒト血清蛋白及びその
フラクション並びにヒトアルブミンのごときヒトに対し
非毒性かつ非免疫性の一つの蛋白又はその蛋白を組合わ
したものである。典型的な好ましい安定剤は１％のヒト
アルブミンである。ヒトの非経口投与する組成物中の純
インターフェロン蛋白の通常の農度は、１０’〜２ＸＩ
Ｏ’ｌＦＵ／次ｇに相当する範囲であり、通常の一日当
りの投与量は合計３ＸＩＯ＠〜１０’例えば５Ｘ１０＠
〜ｌＯ’ｌＦＵであり、−日当り１〜２回筋肉注射して
投与するのが好ましい。ヒト投与用純インターフェロン
の溶液を作製する際、確実に滅菌しかつ発熱物質を存在
させない予防策のごとき非経口投与用組成物の製造時に
通常行われている通常の製薬上の予防策が行われる。
この発明の安定化された製剤が、単一特異性抗インター
フェロンを作るため動物類を免疫にするのに用いる純ヒ
トＬｅ型インターフェロン蛋白類の水溶液の場合は、Ｓ
ＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）がインターフェロン
の抗原性及び／又は安定性を増大させるという前記事実
からみて、ＳＤＳでヒトＬｅ型インターフェロン蛋白の
ＳＤＳ錯体を形成させて安定化させるのが好ましい安定
化方法である。次により詳細に説明されるように、純イ
ンターフェロンとＳＤＳとの結合物又はその錯体は、好
ましくはｐＨ７，２で溶液換算にて約０．１重量％濃度
の水性純インターフェロン蛋白に、ＳＤＳを添加するこ
とによって簡単に形成される。一種又は複数種のヒトＬ
ｅ型インターフェロン蛋白のＳＤＳ錯体は、それ自体安
定なことから、この発明の価値ある態様であり、かかる
錯体の形態のものは貯蔵又は輸送（下記のごとく固体で
単離された際は、低温が適切であり、例えば４℃、好ま
しいのは一２０℃である）に好適であり、最も興味深い
ものである。この目的のために、デタージエント型の他
の安定剤を用いることもこの発明に含まれる。
フェロンを作るため動物類を免疫にするのに用いる純ヒ
トＬｅ型インターフェロン蛋白類の水溶液の場合は、Ｓ
ＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）がインターフェロン
の抗原性及び／又は安定性を増大させるという前記事実
からみて、ＳＤＳでヒトＬｅ型インターフェロン蛋白の
ＳＤＳ錯体を形成させて安定化させるのが好ましい安定
化方法である。次により詳細に説明されるように、純イ
ンターフェロンとＳＤＳとの結合物又はその錯体は、好
ましくはｐＨ７，２で溶液換算にて約０．１重量％濃度
の水性純インターフェロン蛋白に、ＳＤＳを添加するこ
とによって簡単に形成される。一種又は複数種のヒトＬ
ｅ型インターフェロン蛋白のＳＤＳ錯体は、それ自体安
定なことから、この発明の価値ある態様であり、かかる
錯体の形態のものは貯蔵又は輸送（下記のごとく固体で
単離された際は、低温が適切であり、例えば４℃、好ま
しいのは一２０℃である）に好適であり、最も興味深い
ものである。この目的のために、デタージエント型の他
の安定剤を用いることもこの発明に含まれる。
純ヒトＬｅ型インターフェロン蛋白のさらに好ましい形
態は、シバクロンブルーＦ３ＧＡと結合した形態か又は
シバクロン ブルーＦ３ＧＡが示す機序に従ってインタ
ーフェロン蛋白と結合しうる他のリガンドと結合した形
態である。これらのことは以下に詳しく説明する。
態は、シバクロンブルーＦ３ＧＡと結合した形態か又は
シバクロン ブルーＦ３ＧＡが示す機序に従ってインタ
ーフェロン蛋白と結合しうる他のリガンドと結合した形
態である。これらのことは以下に詳しく説明する。
単一特異性抗インターフェロンを作るために動物を免疫
にするのに用いる純インターフェロン蛋白溶液のｐＨは
約７．２が好ましく、適切な緩衝液はＰＢＳ （リン酸
塩緩衝食塩水）である。
にするのに用いる純インターフェロン蛋白溶液のｐＨは
約７．２が好ましく、適切な緩衝液はＰＢＳ （リン酸
塩緩衝食塩水）である。
動物の免疫用の安定化された純ヒト インターフェロン
蛋白製剤には、抗原性を一層増大させるためにアジュバ
ントを添加してもよい。一つの適切なアジュバントとし
てはフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ）がある。周知の原理に従って［一種の
°ハプテン°（ｈａｐｔｅｎ）として一種又は複数種の
純インターフェロン蛋白を提供するように］、純Ｌｅ型
インターフェロン蛋白類又はその各蛋白を免疫性担体に
カップリングさせることによってその抗原性を増加及び
／又は安定化させることもこの発明に含まれる。免疫性
担体の例としてはＰＰＤ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）及びＢＣＧ（Ｂａｃｉ
ｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）が挙げられ
る。しかし、かような免疫性担体の使用は現在のところ
好ましくない。
蛋白製剤には、抗原性を一層増大させるためにアジュバ
ントを添加してもよい。一つの適切なアジュバントとし
てはフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａ
ｄｊｕｖａｎｔ）がある。周知の原理に従って［一種の
°ハプテン°（ｈａｐｔｅｎ）として一種又は複数種の
純インターフェロン蛋白を提供するように］、純Ｌｅ型
インターフェロン蛋白類又はその各蛋白を免疫性担体に
カップリングさせることによってその抗原性を増加及び
／又は安定化させることもこの発明に含まれる。免疫性
担体の例としてはＰＰＤ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）及びＢＣＧ（Ｂａｃｉ
ｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）が挙げられ
る。しかし、かような免疫性担体の使用は現在のところ
好ましくない。
免疫処置用には、マウス、うさぎ、山羊及び羊が好まし
い動物であるが、他の動物類を用いることもこの発明に
含まれる。下記のごとく、豚１８Ｇ免疫グロブリンある
種の目的には際立った利点を示す。
い動物であるが、他の動物類を用いることもこの発明に
含まれる。下記のごとく、豚１８Ｇ免疫グロブリンある
種の目的には際立った利点を示す。
原理的には、純インターフェロンに対する動物類の免疫
処置は、例えば、Ａｃｔａ Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。
処置は、例えば、Ａｃｔａ Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ。
５ｃａｎｄ、５ｅｃｔｉｏｎ Ｂ、８３４４３−４６０
（１９７５）に記載のごとき抗インターフェロンの公知
の製造法に従ってなされる。しかし、この発明のインタ
ーフェロン蛋白が純品であるので、免疫原の濃度及び免
疫処置時間やその間隔については若干変動する。免疫処
置計画の例は“実験の部”で明らかにする。
（１９７５）に記載のごとき抗インターフェロンの公知
の製造法に従ってなされる。しかし、この発明のインタ
ーフェロン蛋白が純品であるので、免疫原の濃度及び免
疫処置時間やその間隔については若干変動する。免疫処
置計画の例は“実験の部”で明らかにする。
動物の採血及び抗血清の単離は周知の方法に従って行わ
れる。
れる。
上記のようにして作製された抗体は、免疫処置をされた
動物の生来の特徴を示すという当然の事実とは別に、上
記ＳＤＳ ＰＡＧＥバンドを特徴とするインターフェロ
ン蛋白に対して実質的な特異性を示す。インターフェロ
ン蛋白と共存し、そのＳＯＳ ＰＡＧＥの染色バンドと
して認められないごく少量の不純物は避けることはでき
ない。純インターフェロン蛋白製剤中の全蛋白含量の約
１〜５％に相当する少量のかような蛋白類は、対応する
不純物に対する抗体類を誘発するかも知れない。この可
能性を調べる一つの方法は、純インターフェロン（すな
わち、ＳＤＳ ＰＡＧＨにおいて、全体で１〜４Ｘ１０
’ｌＦＵの負荷で可視のインターフェロン蛋白バンドを
与える上記特徴を有するインターフェロン）でうさぎを
免疫にすることによって得られる関連抗血清の抗インタ
ーフェロンカラムを作製する方法である。そのカラムは
全く吸収剤なしで作製される。
動物の生来の特徴を示すという当然の事実とは別に、上
記ＳＤＳ ＰＡＧＥバンドを特徴とするインターフェロ
ン蛋白に対して実質的な特異性を示す。インターフェロ
ン蛋白と共存し、そのＳＯＳ ＰＡＧＥの染色バンドと
して認められないごく少量の不純物は避けることはでき
ない。純インターフェロン蛋白製剤中の全蛋白含量の約
１〜５％に相当する少量のかような蛋白類は、対応する
不純物に対する抗体類を誘発するかも知れない。この可
能性を調べる一つの方法は、純インターフェロン（すな
わち、ＳＤＳ ＰＡＧＨにおいて、全体で１〜４Ｘ１０
’ｌＦＵの負荷で可視のインターフェロン蛋白バンドを
与える上記特徴を有するインターフェロン）でうさぎを
免疫にすることによって得られる関連抗血清の抗インタ
ーフェロンカラムを作製する方法である。そのカラムは
全く吸収剤なしで作製される。
粗ヒト白血球インターフェロンをこのカラムに充填し、
通常の抗体アフィニテ゛イ クロマトグラフィが行われ
る（後記参照）。溶出液をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析され
（後記参照）、このときインターフェロンのバンドだけ
が認められるべきであるが、１〜４の他の蛋白（不純物
）が認められる場合がある。
通常の抗体アフィニテ゛イ クロマトグラフィが行われ
る（後記参照）。溶出液をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析され
（後記参照）、このときインターフェロンのバンドだけ
が認められるべきであるが、１〜４の他の蛋白（不純物
）が認められる場合がある。
このことは、実際にうさぎの抗血清について認められ（
３つの蛋白）、２〜３ Ｘ １０’１Ｆｔｌの粗ヒト白
血球インターフェロンを負荷した場合に２３１１２カラ
ム中５ Ｘ ｌ０ＪＦＵ −ＮＵｈＱの力価を有してい
た。
３つの蛋白）、２〜３ Ｘ １０’１Ｆｔｌの粗ヒト白
血球インターフェロンを負荷した場合に２３１１２カラ
ム中５ Ｘ ｌ０ＪＦＵ −ＮＵｈＱの力価を有してい
た。
また、その“異質の“蛋白類は、偶然生起する単一の自
然発生交差反応で現われるのかもしれない。
然発生交差反応で現われるのかもしれない。
特定の抗体が単一特異的であるか否かを検査する上記方
法は、それ自体新規であると信するものであり、この発
明のもう一つの態様を構成するものである。この態様は
、特定の抗体製剤（例えば抗血清）がその特定の抗原に
対し単一特異的であるか否かを検査する方法であり、す
なわち検査対象の抗体製剤によって抗体アフィニティ
りロマトグラフィ力ラムを作り、そのカラムに抗体と不
純物を含有する溶液を負荷し、カラムからの溶出液を分
析してその抗体と異なる蛋白が存在するか否か確認する
ことからなる方法である。後者の分析は、当面用いられ
る。抗インターフェロンの単一特異性測定法に関連して
討論されたのと同様の方法でＳＤＳ ＰＡＧＥ傾斜法で
行うのが好ましい。そして溶出液中の不純物蛋白類に対
応して発生するバンドが多くとも４つならば、一般にそ
の抗体製剤を実用に供するには充分な単一特異性を示し
ていると考えられる。
法は、それ自体新規であると信するものであり、この発
明のもう一つの態様を構成するものである。この態様は
、特定の抗体製剤（例えば抗血清）がその特定の抗原に
対し単一特異的であるか否かを検査する方法であり、す
なわち検査対象の抗体製剤によって抗体アフィニティ
りロマトグラフィ力ラムを作り、そのカラムに抗体と不
純物を含有する溶液を負荷し、カラムからの溶出液を分
析してその抗体と異なる蛋白が存在するか否か確認する
ことからなる方法である。後者の分析は、当面用いられ
る。抗インターフェロンの単一特異性測定法に関連して
討論されたのと同様の方法でＳＤＳ ＰＡＧＥ傾斜法で
行うのが好ましい。そして溶出液中の不純物蛋白類に対
応して発生するバンドが多くとも４つならば、一般にそ
の抗体製剤を実用に供するには充分な単一特異性を示し
ていると考えられる。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ中の染色インターフェロン蛋白バンド
が、それらの抗原性を完全又はかなりの程度に保持した
際は、うさぎのような免疫にされうる動物類を免疫にす
るための抗原製剤として、その染色インターフェロン蛋
白類を、ＳＤＳ ＰＡＧＥから直接切り取って使用でき
る。ＳＤＳ ＰＡ（ｉＥから切り取った染色バンドを免
疫（下記製造の後）に用いる時、前に討論した交叉反応
（又はごく少量の不純物による汚染）が、（５つのイン
ターフェロン種を示す全溶出液に比較して）起こる可能
性は少ない。かくして、最適の特異性を有するインター
フェロンの個々の種（主として、約１８，４００ダルト
ンと２０．１００ダルトンの二つの主要な種）に対する
抗体は下記方法にしたがって生産することができる。
が、それらの抗原性を完全又はかなりの程度に保持した
際は、うさぎのような免疫にされうる動物類を免疫にす
るための抗原製剤として、その染色インターフェロン蛋
白類を、ＳＤＳ ＰＡＧＥから直接切り取って使用でき
る。ＳＤＳ ＰＡ（ｉＥから切り取った染色バンドを免
疫（下記製造の後）に用いる時、前に討論した交叉反応
（又はごく少量の不純物による汚染）が、（５つのイン
ターフェロン種を示す全溶出液に比較して）起こる可能
性は少ない。かくして、最適の特異性を有するインター
フェロンの個々の種（主として、約１８，４００ダルト
ンと２０．１００ダルトンの二つの主要な種）に対する
抗体は下記方法にしたがって生産することができる。
１．４〜５Ｘ１０”ｌＦＵのヒト白血球インターフェロ
ン（ＣＩＦとして）が、（下記の“タンデム”アフィニ
ティ りロマトグラフイによって）完全に精製され、次
いで５ＤＳＰＡＧＥに付される。
ン（ＣＩＦとして）が、（下記の“タンデム”アフィニ
ティ りロマトグラフイによって）完全に精製され、次
いで５ＤＳＰＡＧＥに付される。
２、 そのゲルは、室温で１０〜１５分間だけ染色され
、次いで１０分間部分的に脱色され、次いで蒸留水中で
３回、０℃の蒸留水で１〜２分間洗浄される。蛋白のバ
ンドの正確な位置を（例えばポラロイド写真で）記録し
ておき、その二つの主要なインターフェロン蛋白種は、
鋭利なナイフで切取って特別に採取される。各切取片は
、１ｘＣの０．Ｏ１％ＳＤＳ （ＰＢＳ中、 ｐ）（７
，２）中でテフロンのロッドで細切し、その後うさぎに
皮下注射される。この操作を２遇間毎に行い、ヒト白血
球インターフェロン蛋白類に対して低い力価の抗体類を
２〜４ケ月間発育させる。インターフェロンに対する力
価の低いことが検出されたならば直ちに、フロイントの
アジュバントをその免疫性の混合物に対し添加する。そ
してその力価の発育状態によるが４回目毎（４〜６週間
毎）に添加される。この操作は３〜１２ケ月間続行され
、インターフェロン種に対する抗インターフェロンが発
育する（ １０，０００〜１．０００，０００１Ｆｔｌ
−ＮＯ／１１２）。このように、“単一特異性抗インタ
ーフェロン”という用語は、５ＯＳＰＡＧＥから切り取
るステップなしで上記の如き純インターフェロン蛋白に
よって生産される抗インターフェロン、及びＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥから切り取られた染色インターフェロンの一つ又
は複数のバンドに対して産生された抗体類について用い
られる。
、次いで１０分間部分的に脱色され、次いで蒸留水中で
３回、０℃の蒸留水で１〜２分間洗浄される。蛋白のバ
ンドの正確な位置を（例えばポラロイド写真で）記録し
ておき、その二つの主要なインターフェロン蛋白種は、
鋭利なナイフで切取って特別に採取される。各切取片は
、１ｘＣの０．Ｏ１％ＳＤＳ （ＰＢＳ中、 ｐ）（７
，２）中でテフロンのロッドで細切し、その後うさぎに
皮下注射される。この操作を２遇間毎に行い、ヒト白血
球インターフェロン蛋白類に対して低い力価の抗体類を
２〜４ケ月間発育させる。インターフェロンに対する力
価の低いことが検出されたならば直ちに、フロイントの
アジュバントをその免疫性の混合物に対し添加する。そ
してその力価の発育状態によるが４回目毎（４〜６週間
毎）に添加される。この操作は３〜１２ケ月間続行され
、インターフェロン種に対する抗インターフェロンが発
育する（ １０，０００〜１．０００，０００１Ｆｔｌ
−ＮＯ／１１２）。このように、“単一特異性抗インタ
ーフェロン”という用語は、５ＯＳＰＡＧＥから切り取
るステップなしで上記の如き純インターフェロン蛋白に
よって生産される抗インターフェロン、及びＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥから切り取られた染色インターフェロンの一つ又
は複数のバンドに対して産生された抗体類について用い
られる。
インターフェロン類に対して単一特異性の抗体類を生産
するもう一つの方法としていわゆるハイブリドマ（ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ）手法がある。このハイブリドマ手法は
抗体の公知の製造法であり、単一分枝基（ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ）の抗体産生リンパ細胞／骨髄腫雑種（例えば
、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１ｏｇｙ、Ｖｏ
ｌ、８１．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ｓ。
するもう一つの方法としていわゆるハイブリドマ（ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ）手法がある。このハイブリドマ手法は
抗体の公知の製造法であり、単一分枝基（ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ）の抗体産生リンパ細胞／骨髄腫雑種（例えば
、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１ｏｇｙ、Ｖｏ
ｌ、８１．Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
ｓ。
Ｅｄｓ、Ｆ、Ｍｅｌｃｈｏｒｓ、Ｍ、Ｐｏｔｔｅｒ、ａ
ｎｄ Ｎ、Ｌ、Ｗａｒｎｅｒ。
ｎｄ Ｎ、Ｌ、Ｗａｒｎｅｒ。
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９７８参照）を確
立したことからなるものである。しかし、この発明がな
されるまでは、抗インターフェロン産生ハイブリドマ細
胞クローンを得ることが可能であるか知られておらずま
た自明なことではなかった。ハイブリドマ手法において
、例えば免疫にされた動物としてヒトＬｅ型インターフ
ェロンで免疫にされたマウスを用い、この免疫にされた
マウスから得た膵臓の細胞を骨髄腫細胞に融合させた後
、この融合させたハイブリドマを無性生殖させ、抗体産
生クローンを選別して培養し、抗体はその培養媒体から
得られる。
立したことからなるものである。しかし、この発明がな
されるまでは、抗インターフェロン産生ハイブリドマ細
胞クローンを得ることが可能であるか知られておらずま
た自明なことではなかった。ハイブリドマ手法において
、例えば免疫にされた動物としてヒトＬｅ型インターフ
ェロンで免疫にされたマウスを用い、この免疫にされた
マウスから得た膵臓の細胞を骨髄腫細胞に融合させた後
、この融合させたハイブリドマを無性生殖させ、抗体産
生クローンを選別して培養し、抗体はその培養媒体から
得られる。
マウス系でハイブリドマ手法で作られた抗体は、厳密に
単一特異性であり、それ故に、放射線免疫検定法（ｒａ
ｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又は他の類似の試験法
に特に有利である。
単一特異性であり、それ故に、放射線免疫検定法（ｒａ
ｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）又は他の類似の試験法
に特に有利である。
ハイブリドマ手法において、その抗体を得る一つの特別
な方法は、膵臓細胞が取り出された動物種の生体内で、
選別したクローンを培養し、その動物の腹水液から抗体
を得る方法である。そしてかような態様はこの発明の範
囲内に含まれる。
な方法は、膵臓細胞が取り出された動物種の生体内で、
選別したクローンを培養し、その動物の腹水液から抗体
を得る方法である。そしてかような態様はこの発明の範
囲内に含まれる。
陽性のハイブリドマ クローンの選別は、通常のインタ
ーフェロン中和試験によって行ってもよい。しかし、通
常のインターフェロン中和試験は、一つの必須要件とし
て、そのインターフェロンの抗原決定子が生物学的活性
中心に極めて近接した位置（約１１ｇＧ分子長の距離以
内）にあることを要するので、一つ又は複数の生物学的
活性中心からはるかに離れて位置する抗原決定子はこの
試験法では検出されないであろうし、またこのことから
“陽性”のハイブリドマ クローン（生物学的中心から
ｌＩｇＧ分子長以上の距離ではなれて位置するインター
フェロン蛋白上で抗原決定子に対する抗体を産生する）
は、この試験では検出されないであろう。それ故に、陽
性ハイブリドマクローンを試験するのにより有利な手法
はこの発明の放射性標識純ヒトＬｅインターフェロンを
用いて放射性免疫分析を行なう方法である。放射性標識
線ヒトＬｅインターフェロン蛋白は、ヒトＬｅインター
フェロンに放射性標識を行なうことによって作られる。
ーフェロン中和試験によって行ってもよい。しかし、通
常のインターフェロン中和試験は、一つの必須要件とし
て、そのインターフェロンの抗原決定子が生物学的活性
中心に極めて近接した位置（約１１ｇＧ分子長の距離以
内）にあることを要するので、一つ又は複数の生物学的
活性中心からはるかに離れて位置する抗原決定子はこの
試験法では検出されないであろうし、またこのことから
“陽性”のハイブリドマ クローン（生物学的中心から
ｌＩｇＧ分子長以上の距離ではなれて位置するインター
フェロン蛋白上で抗原決定子に対する抗体を産生する）
は、この試験では検出されないであろう。それ故に、陽
性ハイブリドマクローンを試験するのにより有利な手法
はこの発明の放射性標識純ヒトＬｅインターフェロンを
用いて放射性免疫分析を行なう方法である。放射性標識
線ヒトＬｅインターフェロン蛋白は、ヒトＬｅインター
フェロンに放射性標識を行なうことによって作られる。
例えば下記のゲル濾過手法でゲル濾液を作製し、ラクト
パーオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒ−ｏｘｉｄａｓｅ
）とヨー素１３５とを用いるというような標準方法で放
射性標識を行ない、次いでそのインターフェロン蛋白を
本願記載の方法で精製し、その精製インターフェロン蛋
白をＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、そのＳＤＳ ＰＡＧＥゲ
ルから放射性標識された純インターフェロン蛋白を溶離
する。通常のインターフェロン中和試験では、検出され
ないようなりローンを検出する陽性ハイブリドマ クロ
ーンを選別するもう一つの方法は次のとおりである。す
なわち各クローンの培養物の上澄液の例えば５００μＱ
をマトリックス上に固定化し、例えば“原料及び方法”
の項に記載の方法に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロー
ス（ＣＮＢｒ −ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）上に固定する；得られた処理マトリックスにヒト
Ｌｅ型インターフェロン例えば、粗ヒト白血球インター
フェロンを加え、例えば各クローンに対応する得られた
マトリックスゲル懸濁液をそのインターフェロンと混合
し；その混合物を例えば１時間３７℃で放置し；次いで
例えば遠心分離しＰＢＳで洗浄して未結合のインターフ
ェロンをマトリックス物質から有効に分離し：次いで各
マトリックスゲルを溶離し、例えば溶離緩衝液（ｐＨ２
，４）と混合し遠心分離して結合インターフェロンを脱
離させ：この溶離によってインターフェロンが得られる
ということは陽性のクローンの指標なので、そのマトリ
ックスゲルから得られた溶ＭｔｉＩｉ衝液（特に最後の
溶Ｍ緩衝液）がインターフェロンを含有している該マト
リックスゲルに対応するクローンを選別する方法である
。陽性ハイブリドマクローンを検出する上記二つの有利
な方法は、抗インターフェロン産生ハイブリドマクロー
ンに適用されるだけでなく、明確な修正を行い、他の蛋
白に対して１向される陽性ハイブリドマクローン産生抗
体の検出にも用いられる。
パーオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒ−ｏｘｉｄａｓｅ
）とヨー素１３５とを用いるというような標準方法で放
射性標識を行ない、次いでそのインターフェロン蛋白を
本願記載の方法で精製し、その精製インターフェロン蛋
白をＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、そのＳＤＳ ＰＡＧＥゲ
ルから放射性標識された純インターフェロン蛋白を溶離
する。通常のインターフェロン中和試験では、検出され
ないようなりローンを検出する陽性ハイブリドマ クロ
ーンを選別するもう一つの方法は次のとおりである。す
なわち各クローンの培養物の上澄液の例えば５００μＱ
をマトリックス上に固定化し、例えば“原料及び方法”
の項に記載の方法に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロー
ス（ＣＮＢｒ −ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）上に固定する；得られた処理マトリックスにヒト
Ｌｅ型インターフェロン例えば、粗ヒト白血球インター
フェロンを加え、例えば各クローンに対応する得られた
マトリックスゲル懸濁液をそのインターフェロンと混合
し；その混合物を例えば１時間３７℃で放置し；次いで
例えば遠心分離しＰＢＳで洗浄して未結合のインターフ
ェロンをマトリックス物質から有効に分離し：次いで各
マトリックスゲルを溶離し、例えば溶離緩衝液（ｐＨ２
，４）と混合し遠心分離して結合インターフェロンを脱
離させ：この溶離によってインターフェロンが得られる
ということは陽性のクローンの指標なので、そのマトリ
ックスゲルから得られた溶ＭｔｉＩｉ衝液（特に最後の
溶Ｍ緩衝液）がインターフェロンを含有している該マト
リックスゲルに対応するクローンを選別する方法である
。陽性ハイブリドマクローンを検出する上記二つの有利
な方法は、抗インターフェロン産生ハイブリドマクロー
ンに適用されるだけでなく、明確な修正を行い、他の蛋
白に対して１向される陽性ハイブリドマクローン産生抗
体の検出にも用いられる。
この発明の精製されたインターフェロン蛋白類の一つに
対して生じた抗体類は、この発明の他の精製された蛋白
類を中和しうるということが見出されたのは興味深いこ
とである。かくして、この発明の単一特異性抗体類は、
この発明の単一の精製インターフェロン蛋白に対して生
成したものまたはこの発明の精製されたインターフェロ
ン蛋白類を組合わせたものに対して生成したもののいず
れもヒトＬｅ型インターフェロン含有溶液の精製に等し
く有効であることが明らかになったのである。
対して生じた抗体類は、この発明の他の精製された蛋白
類を中和しうるということが見出されたのは興味深いこ
とである。かくして、この発明の単一特異性抗体類は、
この発明の単一の精製インターフェロン蛋白に対して生
成したものまたはこの発明の精製されたインターフェロ
ン蛋白類を組合わせたものに対して生成したもののいず
れもヒトＬｅ型インターフェロン含有溶液の精製に等し
く有効であることが明らかになったのである。
公知の原理に従って、この発明の単一特異性抗インター
フェロンは、放射性免疫検定法又はその関連手法によっ
て生物学的流体中の対応するインターフェロン又はイン
ターフェロン成分の測定に用いることができる。しかし
上記したように、単一特異性抗体類の興味ある重要な効
用は、インターフェロン含有溶液の抗体アフィニテイ
りロマトグラフィ精製法に有用なことである。この目的
のために、抗体はそれ自体公知の方法でマトリックスに
固定される。すなわち、ファーマシア社製セファロース
４Ｂのごとき架橋アガロースのような適切な抗体アフィ
ニティ クロマトグラフィマトリックスに共有結合的に
適切に結合される。インターフェロン含有溶液の抗体ア
フィニティ クロマトグラフィ精製は、公知の方法で行
ってもよいが、バッチ式か好ましくはカラム中に配置さ
れたマトリックスに固定化された抗体を用いて行われる
。
フェロンは、放射性免疫検定法又はその関連手法によっ
て生物学的流体中の対応するインターフェロン又はイン
ターフェロン成分の測定に用いることができる。しかし
上記したように、単一特異性抗体類の興味ある重要な効
用は、インターフェロン含有溶液の抗体アフィニテイ
りロマトグラフィ精製法に有用なことである。この目的
のために、抗体はそれ自体公知の方法でマトリックスに
固定される。すなわち、ファーマシア社製セファロース
４Ｂのごとき架橋アガロースのような適切な抗体アフィ
ニティ クロマトグラフィマトリックスに共有結合的に
適切に結合される。インターフェロン含有溶液の抗体ア
フィニティ クロマトグラフィ精製は、公知の方法で行
ってもよいが、バッチ式か好ましくはカラム中に配置さ
れたマトリックスに固定化された抗体を用いて行われる
。
単一特異性抗インターフェロンを用いる抗体アフィニテ
ィ カラムの作製及びかようなカラムの操作は、本来公
知の方法で行われる。かかるカラムに用いられるインタ
ーフェロン含有溶液は未濃縮の粗インターフェロン製剤
でもよく、又は濃縮インターフェロン製剤もしくは一部
精製されたインターフェロン製剤でもよい。カラムに用
いられるインターフェロン製剤は、ヒトＬｅ型インター
フェロン含有のいずれのインターフェロン製剤でもよい
。すなわち、ヒト白血球インターフェロン、ヒト リン
ホブラストイド インターフェロン（ナマルバ インタ
ーフェロン： Ｎａｍａｌｖａ １ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
ｓ）又は上記のごときインターフェロンのＤＮＡコーデ
ィングを含有する微生物の培養によって産生されるイン
ターフェロン（もしくはその主要部分）が挙げられる。
ィ カラムの作製及びかようなカラムの操作は、本来公
知の方法で行われる。かかるカラムに用いられるインタ
ーフェロン含有溶液は未濃縮の粗インターフェロン製剤
でもよく、又は濃縮インターフェロン製剤もしくは一部
精製されたインターフェロン製剤でもよい。カラムに用
いられるインターフェロン製剤は、ヒトＬｅ型インター
フェロン含有のいずれのインターフェロン製剤でもよい
。すなわち、ヒト白血球インターフェロン、ヒト リン
ホブラストイド インターフェロン（ナマルバ インタ
ーフェロン： Ｎａｍａｌｖａ １ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
ｓ）又は上記のごときインターフェロンのＤＮＡコーデ
ィングを含有する微生物の培養によって産生されるイン
ターフェロン（もしくはその主要部分）が挙げられる。
ナマルバ インターフェロンや白血球インターフェロン
を精製するため、抗体アフィニティ クロマトグラフィ
に一部精製されたヒト白血球インターフェロンに対する
抗体を用いることはすでに記載されている［例えば、５
ｃａｎｄ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．．８，４２９−４３６
（１９７ｇ）参照］。しかし、重要な改良点は、単一特
異性抗インターフェロンが実質的にヒトＬｅ型インター
フェロン蛋白だけを残し、製剤の残りの蛋白類はカラム
を通過するということである。自然に起る交差反応によ
るごく少量の不純物は避けることができない。またこの
交差反応は別として、用いられる抗体がたとえ純インタ
ーフェロン蛋白だけを“産生ずる。
を精製するため、抗体アフィニティ クロマトグラフィ
に一部精製されたヒト白血球インターフェロンに対する
抗体を用いることはすでに記載されている［例えば、５
ｃａｎｄ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．．８，４２９−４３６
（１９７ｇ）参照］。しかし、重要な改良点は、単一特
異性抗インターフェロンが実質的にヒトＬｅ型インター
フェロン蛋白だけを残し、製剤の残りの蛋白類はカラム
を通過するということである。自然に起る交差反応によ
るごく少量の不純物は避けることができない。またこの
交差反応は別として、用いられる抗体がたとえ純インタ
ーフェロン蛋白だけを“産生ずる。
（と反応する）と期待されているハイブリドマ手法で生
産された抗体であっても避けることはできない。
産された抗体であっても避けることはできない。
適切な寸法のかような抗体カラムは（抗体アフィニティ
りロマトグラフィカラムの公知の原理に従って設計し
うる力り、このカラムは、粗インターフェロン製剤から
インターフェロンの大規模な工業的精製を行い、カラム
溶出液中に純粋な（又は高度に精製された）インターフ
ェロン蛋白を得るのに用いられる。この方法で製造され
る純（又は高度に精製された）インターフェロン蛋白は
、上記のごとく、その意図する用途によって適切な安定
剤で安定化される。
りロマトグラフィカラムの公知の原理に従って設計し
うる力り、このカラムは、粗インターフェロン製剤から
インターフェロンの大規模な工業的精製を行い、カラム
溶出液中に純粋な（又は高度に精製された）インターフ
ェロン蛋白を得るのに用いられる。この方法で製造され
る純（又は高度に精製された）インターフェロン蛋白は
、上記のごとく、その意図する用途によって適切な安定
剤で安定化される。
単一特異性抗インターフェロンカラムに用いられるイン
ターフェロン製剤のインターフェロンは、重潰基準で通
常非常に低濃度で存在し、かつ高価なインターフェロン
はできるだけ大量に単離すべきであるから、インターフ
ェロンが接触する生物学的物質中に蛋白分解活性が存在
することから起るインターフェロン蛋白の劣化を最小に
することが大切である。そして精製されるべきインター
フェロンか接触するいずれの生物学的物質からも蛋白分
解活性を除去することはこの発明の一つの態様である。
ターフェロン製剤のインターフェロンは、重潰基準で通
常非常に低濃度で存在し、かつ高価なインターフェロン
はできるだけ大量に単離すべきであるから、インターフ
ェロンが接触する生物学的物質中に蛋白分解活性が存在
することから起るインターフェロン蛋白の劣化を最小に
することが大切である。そして精製されるべきインター
フェロンか接触するいずれの生物学的物質からも蛋白分
解活性を除去することはこの発明の一つの態様である。
この態様の重要な一つの効用は、この発明の抗インター
フェロン抗体（免疫グロブリン）から蛋白分解活性を除
去することである。この発明の除去法は、抗体をマトリ
ックスに結合させる前に、免疫グロブリン（又はその重
要なフラグメント）に対して有害でないマトリックス固
定化酵素阻害剤又は要素分解で処理することによって適
切に行われる。例えば、抗体は、マトリックス固定化ポ
リ −Ｌ−リジン及び／又はマトリックス固定化ツヤビ
ーン トリプシン阻害剤及び／又はマトリックス固定化
カリクライン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）不活性剤のカラ
ムを通過させることができる。抗体の適切な処理の例と
しては、セファロース４Ｂのごとき架橋アガロースに共
有結合的に結合したポリーＬ−リジンのカラムを通過さ
せ次いで同じマトリックスに共有結合的に結合したツヤ
ビーン トリプシン阻害剤のカラムを通過さ什る方法が
挙げられる。このように蛋白分解活性を除去するとイン
ターフェロン含有溶液の抗体アフィニティ りロマトグ
ラフィ精製時のインターフェロン活性の回収率を増大さ
せることが見出されたのである。
フェロン抗体（免疫グロブリン）から蛋白分解活性を除
去することである。この発明の除去法は、抗体をマトリ
ックスに結合させる前に、免疫グロブリン（又はその重
要なフラグメント）に対して有害でないマトリックス固
定化酵素阻害剤又は要素分解で処理することによって適
切に行われる。例えば、抗体は、マトリックス固定化ポ
リ −Ｌ−リジン及び／又はマトリックス固定化ツヤビ
ーン トリプシン阻害剤及び／又はマトリックス固定化
カリクライン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）不活性剤のカラ
ムを通過させることができる。抗体の適切な処理の例と
しては、セファロース４Ｂのごとき架橋アガロースに共
有結合的に結合したポリーＬ−リジンのカラムを通過さ
せ次いで同じマトリックスに共有結合的に結合したツヤ
ビーン トリプシン阻害剤のカラムを通過さ什る方法が
挙げられる。このように蛋白分解活性を除去するとイン
ターフェロン含有溶液の抗体アフィニティ りロマトグ
ラフィ精製時のインターフェロン活性の回収率を増大さ
せることが見出されたのである。
単一特異性抗インターフェロンが架橋アガロースのごと
きマトリックスに共有結合的に結合している際は、マト
リックス１ご共有結合的に結合した抗体の全量は、この
発明の発明者が５ｃａｎｄＪ。
きマトリックスに共有結合的に結合している際は、マト
リックス１ご共有結合的に結合した抗体の全量は、この
発明の発明者が５ｃａｎｄＪ。
１ｍａ＋ｕｎｏ１ｏｇ、、６．７７−８６（１９７７）
に記載したごとく、その共有結合段階で用いられる免疫
グロブリンのせいぜい８５％に相当するような程度に結
合させるのが好ましい。その結果、このカラムからは、
最高の回収率でインターフェロンが得られる。
に記載したごとく、その共有結合段階で用いられる免疫
グロブリンのせいぜい８５％に相当するような程度に結
合させるのが好ましい。その結果、このカラムからは、
最高の回収率でインターフェロンが得られる。
単一特異性抗インターフェロン アフィニティクロマト
グラフィからの溶Ｍ液をヒトに投与する際は、その溶離
液がヒトに免疫を起こさせるいずれの成分も含有しない
ことが重要である。抗体アフィニティ りロマトグラフ
ィに随伴するかもしれない一つのリスクは、免疫グロブ
リン フラグメントがカラムから遊離し、所望の単一又
は複数の蛋白と共に溶出されるようになることである。
グラフィからの溶Ｍ液をヒトに投与する際は、その溶離
液がヒトに免疫を起こさせるいずれの成分も含有しない
ことが重要である。抗体アフィニティ りロマトグラフ
ィに随伴するかもしれない一つのリスクは、免疫グロブ
リン フラグメントがカラムから遊離し、所望の単一又
は複数の蛋白と共に溶出されるようになることである。
この発明によれば、ヒトに免疫を起こさせるような免疫
グロブリン又はそのフラグメントは、その溶離液を、そ
の抗体が抗インターフェロン免疫グロブリンに対して指
向されており、かつヒトに非経口投与しても免疫を起こ
させない種類のものである抗体アフィニティ カラムを
通過させることによって除かれる（溶離液は、該カラム
を通過させる前にｐＨを中性、例えば、ＰＢＳに対して
透析しｐＨ７，２に調整しなければならない）。
グロブリン又はそのフラグメントは、その溶離液を、そ
の抗体が抗インターフェロン免疫グロブリンに対して指
向されており、かつヒトに非経口投与しても免疫を起こ
させない種類のものである抗体アフィニティ カラムを
通過させることによって除かれる（溶離液は、該カラム
を通過させる前にｐＨを中性、例えば、ＰＢＳに対して
透析しｐＨ７，２に調整しなければならない）。
（以下余白）
ヒトへ非経口投与した際、免疫を起こさせない免疫グロ
ブリンは霊長類の免疫グロブリンであるが、単一特異性
抗インターフェロンの製造に用いられる動物の免疫グロ
ブリンに対して指向される霊長類の免疫グロブリンへの
門戸は、法律的倫理的理由から制限されるか完全に閉ざ
されている。
ブリンは霊長類の免疫グロブリンであるが、単一特異性
抗インターフェロンの製造に用いられる動物の免疫グロ
ブリンに対して指向される霊長類の免疫グロブリンへの
門戸は、法律的倫理的理由から制限されるか完全に閉ざ
されている。
それ故に、豚ＮＦＧ免疫グロブリンが、米国特許第４．
１３２，７６９号に記載のようにヒトに免疫を起こさせ
ないことが見出されたことは注目すべき重要なことであ
る。ヒト ハイブリドマ系で生産される抗体が得られれ
ば興味深い代替物となるであろう。
１３２，７６９号に記載のようにヒトに免疫を起こさせ
ないことが見出されたことは注目すべき重要なことであ
る。ヒト ハイブリドマ系で生産される抗体が得られれ
ば興味深い代替物となるであろう。
かくして、この発明に従って、抗インターフェロン ア
フィニティ りロマトグラフィの溶離液からの抗インタ
ーフェロン免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラクン
ヨンの除去は、溶離液を（ｐＨを中性に調整後）、抗イ
ンターフェロン免疫グロブリンに対して指向されるマト
リックス固定化豚Ｉ９Ｇのカラムを通過させて行うのが
好ましい。
フィニティ りロマトグラフィの溶離液からの抗インタ
ーフェロン免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラクン
ヨンの除去は、溶離液を（ｐＨを中性に調整後）、抗イ
ンターフェロン免疫グロブリンに対して指向されるマト
リックス固定化豚Ｉ９Ｇのカラムを通過させて行うのが
好ましい。
抗インターフェロン免疫グロブリンに対して指向される
豚１９Ｇ免疫グロブリンは、本来公知の方法、すなわち
、豚を、抗インターフェロン免疫グロブリン産生動物種
からの免疫グロブリンで免疫にしておいて、上記米国特
許第４，１３２，７６９号に開示の方法に従って豚から
得られる抗血清からＩｇＧ免疫グロブリンフラクション
を単離する方法で製造される。
豚１９Ｇ免疫グロブリンは、本来公知の方法、すなわち
、豚を、抗インターフェロン免疫グロブリン産生動物種
からの免疫グロブリンで免疫にしておいて、上記米国特
許第４，１３２，７６９号に開示の方法に従って豚から
得られる抗血清からＩｇＧ免疫グロブリンフラクション
を単離する方法で製造される。
一般的に、この発明の寄与するところを示せば、この発
明はヒトに投与される蛋白溶液からヒトに免疫を起こさ
せる蛋白を除去する方法であるといえる。すなわち、そ
の蛋白溶液を、抗体が免疫を起こさせる蛋白に対して指
向する免疫グロブリンであり、該免疫グロブリンがヒト
に非経口投与しても免疫を起こさせない種類のものであ
る抗体アフィニティ りロマトグラフィ処理に付すこと
からなる方法である。上記説明から明らかなごとく、免
疫を起こさせない好ましい免疫グロブリンは霊長類の免
疫グロブリン又は豚のＩｇＧ免疫グロブリンである。
明はヒトに投与される蛋白溶液からヒトに免疫を起こさ
せる蛋白を除去する方法であるといえる。すなわち、そ
の蛋白溶液を、抗体が免疫を起こさせる蛋白に対して指
向する免疫グロブリンであり、該免疫グロブリンがヒト
に非経口投与しても免疫を起こさせない種類のものであ
る抗体アフィニティ りロマトグラフィ処理に付すこと
からなる方法である。上記説明から明らかなごとく、免
疫を起こさせない好ましい免疫グロブリンは霊長類の免
疫グロブリン又は豚のＩｇＧ免疫グロブリンである。
この発明の上記の寄与に関連した別の態様としては、マ
トリックス固定化抗体を用いる抗体アフィニティ りロ
マトグラフィで免疫グロブリンとして豚１９Ｇ免疫グロ
ブリンを用いる方法；抗体アフィニティ りロマトグラ
フィにマド１ノツクス固定化豚ＮＡＧ免疫グロブリンを
用いる方法；及びマトリックス固定化豚Ｉ９Ｇ免疫グロ
ブリンを用いる抗体アフィニティ りロマトグラフィに
よりて、ヒトに非経口投与する蛋白含有溶液を精製する
方法が挙げられる。これらの−船釣な態様、効用及び実
施態様は上記説明から明らかである。
トリックス固定化抗体を用いる抗体アフィニティ りロ
マトグラフィで免疫グロブリンとして豚１９Ｇ免疫グロ
ブリンを用いる方法；抗体アフィニティ りロマトグラ
フィにマド１ノツクス固定化豚ＮＡＧ免疫グロブリンを
用いる方法；及びマトリックス固定化豚Ｉ９Ｇ免疫グロ
ブリンを用いる抗体アフィニティ りロマトグラフィに
よりて、ヒトに非経口投与する蛋白含有溶液を精製する
方法が挙げられる。これらの−船釣な態様、効用及び実
施態様は上記説明から明らかである。
徂ヒト白血球インターフェロンから純ヒト白血球インタ
ーフェロン蛋白（ヒトＬｅ型インターフェロン蛋白）を
製造するためにこの発明にしたがって行われる精製工程
は、ＫＳＣＮでの蛋白の沈澱による濃縮、ゲル濾過、リ
ガンド アフィニティクロマトグラフィ及び抗体アフィ
ニティ りロマトグラフィからなるものである。かよう
な工程はインターフェロン技術分野では本来公知である
が、その特定の組合わせ及びいくつかの操作に適用され
る特定の条件は新規な特徴であり、その中のいくつかの
ものはそれ自体この発明に含まれる。この工程を実施す
るときの特定の仕方や操作の特定の組合わせによって、
インターフェロンに最適の精製法や濃縮法が得られ、か
つ工程中でのインターフェロンの損失が最小になったの
である。
ーフェロン蛋白（ヒトＬｅ型インターフェロン蛋白）を
製造するためにこの発明にしたがって行われる精製工程
は、ＫＳＣＮでの蛋白の沈澱による濃縮、ゲル濾過、リ
ガンド アフィニティクロマトグラフィ及び抗体アフィ
ニティ りロマトグラフィからなるものである。かよう
な工程はインターフェロン技術分野では本来公知である
が、その特定の組合わせ及びいくつかの操作に適用され
る特定の条件は新規な特徴であり、その中のいくつかの
ものはそれ自体この発明に含まれる。この工程を実施す
るときの特定の仕方や操作の特定の組合わせによって、
インターフェロンに最適の精製法や濃縮法が得られ、か
つ工程中でのインターフェロンの損失が最小になったの
である。
ＫＳＣＮ沈澱法は、０．５Ｍ濃度のＫＳＣＮ含有粗イン
ターフェロンのｐＨを、通常の３．５に低下させる代り
に４．５に低下させて行うのが好ましい。かようにする
と、沈澱中の蛋白の量はごく少量になり、その後の精製
工程が容易になる。
ターフェロンのｐＨを、通常の３．５に低下させる代り
に４．５に低下させて行うのが好ましい。かようにする
と、沈澱中の蛋白の量はごく少量になり、その後の精製
工程が容易になる。
ゲル濾過法は、２５容量％のエチレングリコール、１モ
ル濃度のＮａＣＮ及びＰ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）を含
有する緩衝溶液で行われる。その結果ＰＢＳを用いて低
いｐＨ（２，４）にするだけか又は尿素を用いかつＰＢ
ＳでｐＨ７，２とした場合よりも良好に溶解することが
できた。特に１０，０００〜２０．０００ダルトンの範
囲の蛋白だけを含有する溶離液フラクションが集められ
る。
ル濃度のＮａＣＮ及びＰ Ｂ Ｓ （ｐＨ７，２）を含
有する緩衝溶液で行われる。その結果ＰＢＳを用いて低
いｐＨ（２，４）にするだけか又は尿素を用いかつＰＢ
ＳでｐＨ７，２とした場合よりも良好に溶解することが
できた。特に１０，０００〜２０．０００ダルトンの範
囲の蛋白だけを含有する溶離液フラクションが集められ
る。
リガンド アフィニティ りロマトグラフィは新規で極
めて有利な方法で行われ、この発明の一つの重要な態様
を構成するものである。
めて有利な方法で行われ、この発明の一つの重要な態様
を構成するものである。
該リガンド アフィニティ りロマトグラフィは、リガ
ンドとして固定化シバクロン ブルーＦ３ＧＡを用い、
少なくとも５０，０００〜１００，０ＯＯＩＦＵ／ｕ蛋
白の特異性活性を有するインターフェロンについて、特
定の条件下で行われる。インターフェロンのアフィニテ
ィ クロマトグラフィ用のリガンドとしてシバクロン
ブルー Ｆ２Ｏ八を用いることは当然技術分野では公知
であったが、この発明によって、条件の特定の組合わせ
を用いるとこのリガンドの選択度が著しく増大すること
が見出されたのである。すなわち用いられるインターフ
ェロンは、このタイプのリガンドを用いる場合（このと
き約３〜５ｘ １０３Ｉ Ｆ Ｕ ７ｍｇ蛋白の比活性
度の徂ヒト白血球インターフェロンが用いられる）より
もはるかに高い比活性度すなわち少なくとも５０．００
０〜１００．０００１ＦＵ／ｘ９蛋白の比活性度を有し
ていなければならない。そしてインターフェロンをカラ
ムに入れるときの溶液は、ｐＨが６．５〜８の範囲にな
ければならずイオン強度は特にｌＯ〜１００の範囲を超
えてはならず、特にｐ）ｌが７．２の２０１Ｍリン酸塩
緩衝液が用いられる。このような比較的高い比活性度の
インターフェロンが用いられる際は、リガン下の特異性
が変化し、インターフェロン蛋白かりガントと選択的に
結合する度合がより高くなる。シバクロン Ｆ３Ｇ＾は
、インターフェロン蛋白と“ジヌクレオチド ホウルド
（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｆｏｌｄ）”の存在を示す
インターフェロン蛋白とある程度相互作用するものと信
じられ、この相互作用において、ポリリボヌクレオチド
と同じ結合部位を有するようである。上記で討論された
ごとき特別の臨界条件下でシバクロン Ｆ３ＧＡが示し
た特別の有利な性質は、このリガンドが属する部類の他
のリガンドも示すものと信じられる。それ故に、この発
明の一つの態様として、少なくとも５０，０００〜１０
０，０ＯＯＩＦＵ／ｕ蛋白の比活性度を有するヒトＬｅ
型インターフェロン蛋白含有水溶液、すなわちｐＨが６
．５〜８に緩衝されたイオン強度は実質的にｌＯ〜１０
０を超えずに特に２ｈ＋λ１のリン酸塩緩衝液が用いら
れｐＨ１，２の溶液に任意に５〜８０％のエタノールの
ごとき水混和性有機溶媒を加えた溶液を、シバクロン
Ｆ３ＧＡによって与えられる機作にしたがってインター
フェロンと結合しうるマトリックス固定化リガンド上に
注入し、その後結合されたインターフェロンを溶離する
ことからなるヒトインターフェロンの精製法が含まれる
。
ンドとして固定化シバクロン ブルーＦ３ＧＡを用い、
少なくとも５０，０００〜１００，０ＯＯＩＦＵ／ｕ蛋
白の特異性活性を有するインターフェロンについて、特
定の条件下で行われる。インターフェロンのアフィニテ
ィ クロマトグラフィ用のリガンドとしてシバクロン
ブルー Ｆ２Ｏ八を用いることは当然技術分野では公知
であったが、この発明によって、条件の特定の組合わせ
を用いるとこのリガンドの選択度が著しく増大すること
が見出されたのである。すなわち用いられるインターフ
ェロンは、このタイプのリガンドを用いる場合（このと
き約３〜５ｘ １０３Ｉ Ｆ Ｕ ７ｍｇ蛋白の比活性
度の徂ヒト白血球インターフェロンが用いられる）より
もはるかに高い比活性度すなわち少なくとも５０．００
０〜１００．０００１ＦＵ／ｘ９蛋白の比活性度を有し
ていなければならない。そしてインターフェロンをカラ
ムに入れるときの溶液は、ｐＨが６．５〜８の範囲にな
ければならずイオン強度は特にｌＯ〜１００の範囲を超
えてはならず、特にｐ）ｌが７．２の２０１Ｍリン酸塩
緩衝液が用いられる。このような比較的高い比活性度の
インターフェロンが用いられる際は、リガン下の特異性
が変化し、インターフェロン蛋白かりガントと選択的に
結合する度合がより高くなる。シバクロン Ｆ３Ｇ＾は
、インターフェロン蛋白と“ジヌクレオチド ホウルド
（ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｆｏｌｄ）”の存在を示す
インターフェロン蛋白とある程度相互作用するものと信
じられ、この相互作用において、ポリリボヌクレオチド
と同じ結合部位を有するようである。上記で討論された
ごとき特別の臨界条件下でシバクロン Ｆ３ＧＡが示し
た特別の有利な性質は、このリガンドが属する部類の他
のリガンドも示すものと信じられる。それ故に、この発
明の一つの態様として、少なくとも５０，０００〜１０
０，０ＯＯＩＦＵ／ｕ蛋白の比活性度を有するヒトＬｅ
型インターフェロン蛋白含有水溶液、すなわちｐＨが６
．５〜８に緩衝されたイオン強度は実質的にｌＯ〜１０
０を超えずに特に２ｈ＋λ１のリン酸塩緩衝液が用いら
れｐＨ１，２の溶液に任意に５〜８０％のエタノールの
ごとき水混和性有機溶媒を加えた溶液を、シバクロン
Ｆ３ＧＡによって与えられる機作にしたがってインター
フェロンと結合しうるマトリックス固定化リガンド上に
注入し、その後結合されたインターフェロンを溶離する
ことからなるヒトインターフェロンの精製法が含まれる
。
マトリックス固定化シバクロン Ｆ３ＧＡの材料の例と
しては、“ブルー デキストラン ２０００（Ｂｌｕｅ
Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００） ” （？トリックス
：分子量２００万のデキストラン）及びブルー セファ
ロース ＣＬ−６Ｂ （Ｂｌｕｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂ）か挙げられる。これらの材料と他の材料
及び通常のインターフェロン精製にこれらのものを用い
る場合のさらに詳細な事項は、Ｂｏｌｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ、、 ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉ
ｓｔｒｙ、８（４）、２５９〜２７４（１９７８）に示
されている。
しては、“ブルー デキストラン ２０００（Ｂｌｕｅ
Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００） ” （？トリックス
：分子量２００万のデキストラン）及びブルー セファ
ロース ＣＬ−６Ｂ （Ｂｌｕｅ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂ）か挙げられる。これらの材料と他の材料
及び通常のインターフェロン精製にこれらのものを用い
る場合のさらに詳細な事項は、Ｂｏｌｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ、、 ＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉ
ｓｔｒｙ、８（４）、２５９〜２７４（１９７８）に示
されている。
この発明では、固定化シバクロン Ｆ３ＧＡ組成物とし
て、（ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂによって）セ
ファロース４Ｂにカップリングさせたブル−デキストラ
ン２０００を用いるのが好ましい。
て、（ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂによって）セ
ファロース４Ｂにカップリングさせたブル−デキストラ
ン２０００を用いるのが好ましい。
この発明によって、インターフェロンをこのタイプの固
定化リガンドから溶離する際、ｐＨ７，２に緩衝された
０、６Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いると、極めて選択的
に溶離されることが見出されたのである。またこのｐＨ
７，２は用いられるインターフェロン含有溶液について
も好ましいｐＨである。
定化リガンドから溶離する際、ｐＨ７，２に緩衝された
０、６Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いると、極めて選択的
に溶離されることが見出されたのである。またこのｐＨ
７，２は用いられるインターフェロン含有溶液について
も好ましいｐＨである。
第４図には、ｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液（Ｐ
Ｂ）に対して透析し、部分的に精製したヒト白血球イン
’；ｔ−フｚロン（ＩｎＩ３．比活性度５００，０ＯＯ
ＩＦＵ／ＭＳ！蛋白）を、ブルーデキストラン セファ
ロース４Ｂのカラムに負荷したときの溶離パターンを示
した。フラクションの大きさは５ＩＩ１１２、流速は３
５〜４０ｉＣ／ｈであった。カラムは２０ｍＭ ＰＢ
で２時間洗浄した後、０．２．０．４．０．６．０．８
および１．０Ｍの塩化ナトリウムのＰＢ （ＰＨ７，４
）溶液で段階的に溶離した。はじめに負荷した液の定歪
結果は７５０．０００１ＦＵであったが、全溶出液（１
＋ＩＩ＋Ｉ［ｒ）には７５４，０ＯＯＩＦＵ （３０ｘ
Ｑ中）含有されていた。従って回収率は１００％であっ
た。溶出液の比活性度は２．１ｘ ｌＯ’ｌＦＵ／ｍｇ
蛋白であり、精製係数は４２であった。溶出液をＳＤＳ
ＰＡＧＥで検査すると、殆んどの溶出蛋白（〉９８％
）は５０，０００ダルトン以上のところに現われる（不
純物）（第４図の供給液、洗浄液および溶出液のＳＤＳ
ＰＡＧＥを示す第４ａ図参照）。上記のことから明ら
かなように、ｐＨ７，２に緩衝された０、６Ｍ塩化ナト
リウム溶液がアフィニティ カラムに対してもつとも好
ましい溶離液であるけれどもさらに広い範囲の濃度を選
択することができることにも留意すべきである。そして
この発明には、０．５〜０，７モル特に０．５〜０．６
５モル濃度でｐＨが６．５〜８に緩衝された塩化ナトリ
ウム水溶液又はｐＨが６．５〜８に緩衝されかつかよう
な塩化ナトリウム溶液に相当するイオン強度を有する他
の水溶液による溶離法が含まれる。他の溶離液を用いる
こともこの発明の範囲に含まれる。例として、アミノ酸
類、人工アミノ酸類、アンホリン類、蛋白類、蛋白混合
物の濃度を５０％まで段階的及び／又は傾斜的に増大さ
せた塩類及び／又はエチレングライコールを挙げること
ができる。上記のごとく、インターフェロン溶液はアル
コール特にエタノールのごとき水混和性有機溶媒と共に
用いてもよい。
Ｂ）に対して透析し、部分的に精製したヒト白血球イン
’；ｔ−フｚロン（ＩｎＩ３．比活性度５００，０ＯＯ
ＩＦＵ／ＭＳ！蛋白）を、ブルーデキストラン セファ
ロース４Ｂのカラムに負荷したときの溶離パターンを示
した。フラクションの大きさは５ＩＩ１１２、流速は３
５〜４０ｉＣ／ｈであった。カラムは２０ｍＭ ＰＢ
で２時間洗浄した後、０．２．０．４．０．６．０．８
および１．０Ｍの塩化ナトリウムのＰＢ （ＰＨ７，４
）溶液で段階的に溶離した。はじめに負荷した液の定歪
結果は７５０．０００１ＦＵであったが、全溶出液（１
＋ＩＩ＋Ｉ［ｒ）には７５４，０ＯＯＩＦＵ （３０ｘ
Ｑ中）含有されていた。従って回収率は１００％であっ
た。溶出液の比活性度は２．１ｘ ｌＯ’ｌＦＵ／ｍｇ
蛋白であり、精製係数は４２であった。溶出液をＳＤＳ
ＰＡＧＥで検査すると、殆んどの溶出蛋白（〉９８％
）は５０，０００ダルトン以上のところに現われる（不
純物）（第４図の供給液、洗浄液および溶出液のＳＤＳ
ＰＡＧＥを示す第４ａ図参照）。上記のことから明ら
かなように、ｐＨ７，２に緩衝された０、６Ｍ塩化ナト
リウム溶液がアフィニティ カラムに対してもつとも好
ましい溶離液であるけれどもさらに広い範囲の濃度を選
択することができることにも留意すべきである。そして
この発明には、０．５〜０，７モル特に０．５〜０．６
５モル濃度でｐＨが６．５〜８に緩衝された塩化ナトリ
ウム水溶液又はｐＨが６．５〜８に緩衝されかつかよう
な塩化ナトリウム溶液に相当するイオン強度を有する他
の水溶液による溶離法が含まれる。他の溶離液を用いる
こともこの発明の範囲に含まれる。例として、アミノ酸
類、人工アミノ酸類、アンホリン類、蛋白類、蛋白混合
物の濃度を５０％まで段階的及び／又は傾斜的に増大さ
せた塩類及び／又はエチレングライコールを挙げること
ができる。上記のごとく、インターフェロン溶液はアル
コール特にエタノールのごとき水混和性有機溶媒と共に
用いてもよい。
この発明の一態様によってアフイニテイ クロマトグラ
フィで精製されるインターフェロンの代表的なものは、
ヒトインターフェロン類（ヒト線維芽細胞インターフェ
ロン類は別として）：すなわち例えばヒト白血球インタ
ーフェロン類、ヒドリンホブラストイド インターフェ
ロン類；及びヒトＬｅ型インターフェロン蛋白類もしく
はこのインターフェロン蛋白生産のためのＤＮＡコーデ
ィングを有する微生物クローンの培養によって得られる
その主要部分；のごときヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白類を含有するインターフェロンである。［ヒト リン
ホブラストイド インターフェロン（ナマルバ）が小比
率の線維芽細胞特性のインターフェロン（Ｆ型−その生
物学的活性の１５％に相当する）を含有するという事実
は、ヒドリンホブラストイ、ド インターフェロンが、
その大部分のインターフェロン活性に関してこの発明に
よって示されたごとく、ヒト白血球インターフェロン蛋
白類の決定因子と同一の決定因子を有するヒトＬｅ型イ
ンターフェロン蛋白類（その生物学的活性の８５％に相
当する）を含有する一つのヒトＬｅ型インターフェロン
であるという事実を損うものではない。］ アフィニティカラムに注入されるインターフェロン製剤
の比活性度として好ましいのは１０５〜１０８ＩＦＵ／
ａ９蛋白であり、例えば２ｘｌＯ’〜１０”、約５×１
０’、５ｘｔｏ５〜１０’ｌＦＵ／＋ｙｇ蛋白である。
フィで精製されるインターフェロンの代表的なものは、
ヒトインターフェロン類（ヒト線維芽細胞インターフェ
ロン類は別として）：すなわち例えばヒト白血球インタ
ーフェロン類、ヒドリンホブラストイド インターフェ
ロン類；及びヒトＬｅ型インターフェロン蛋白類もしく
はこのインターフェロン蛋白生産のためのＤＮＡコーデ
ィングを有する微生物クローンの培養によって得られる
その主要部分；のごときヒトＬｅ型インターフェロン蛋
白類を含有するインターフェロンである。［ヒト リン
ホブラストイド インターフェロン（ナマルバ）が小比
率の線維芽細胞特性のインターフェロン（Ｆ型−その生
物学的活性の１５％に相当する）を含有するという事実
は、ヒドリンホブラストイ、ド インターフェロンが、
その大部分のインターフェロン活性に関してこの発明に
よって示されたごとく、ヒト白血球インターフェロン蛋
白類の決定因子と同一の決定因子を有するヒトＬｅ型イ
ンターフェロン蛋白類（その生物学的活性の８５％に相
当する）を含有する一つのヒトＬｅ型インターフェロン
であるという事実を損うものではない。］ アフィニティカラムに注入されるインターフェロン製剤
の比活性度として好ましいのは１０５〜１０８ＩＦＵ／
ａ９蛋白であり、例えば２ｘｌＯ’〜１０”、約５×１
０’、５ｘｔｏ５〜１０’ｌＦＵ／＋ｙｇ蛋白である。
この発明の態様に従って操作されたアフイニティ クロ
マトグラフィカラムからの溶出液も治療用に興味ある生
成物である。この生成物は、純ヒトアルブミン血清を標
準に用いるロウソイ法（Ｌｏｗｒｙｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
）基準で、３０ｘ １０’ 〜１０’、例えば３０Ｘ１
０８〜７０ ｘ １０’ ＩＦＵ／ ｍ９蛋白のごとき
少なくとも３０Ｘ １０’ｌＦＵ／π９蛋白の比活性度
を有する場合が多い。
マトグラフィカラムからの溶出液も治療用に興味ある生
成物である。この生成物は、純ヒトアルブミン血清を標
準に用いるロウソイ法（Ｌｏｗｒｙｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
）基準で、３０ｘ １０’ 〜１０’、例えば３０Ｘ１
０８〜７０ ｘ １０’ ＩＦＵ／ ｍ９蛋白のごとき
少なくとも３０Ｘ １０’ｌＦＵ／π９蛋白の比活性度
を有する場合が多い。
ヒトに投与するため、この製剤には、滅菌と発熱物質が
存在しないことを保証するための予防策のごとき通常の
製薬上の予防策がなされる。この製剤の投与量は、全活
性度基準で、純インターフェロンについて上記した投与
量に相当するものである。
存在しないことを保証するための予防策のごとき通常の
製薬上の予防策がなされる。この製剤の投与量は、全活
性度基準で、純インターフェロンについて上記した投与
量に相当するものである。
“実験”の項で説明されるように、アフィニティ りロ
マトグラフィカラムからの溶出液は、純インターフェロ
ンに至る当初の実験では、抗体が部分的に精製されたヒ
ト白血球インターフェロンに対して生じた免疫グロブリ
ンである吸収抗体アフィニティカラムを通過させること
によって最終の精製がなされ、次いでマトリックス固定
化粗ヒト白血球インターフェロンのカラムを何回か通過
することによって混入した蛋白に対する抗体が除去され
る。下記の詳細な説明で明らかなように、阻インターフ
ェロンとマトリックス（例えばセファロース４Ｂのごと
き）との共有結合的結合は、インターフェロン自体の免
疫学的決定因子を破壊するが（９８％以上）、大半の不
純物の決定因子を破壊しないことは明らかである。この
ことは、部分的に精製された白血球インターフェロンに
対して生じた免疫グロブリンをカラムを通過（通常数回
）させると、その抗不純物がカラムに残留し、一方抗イ
ンターフェロンはカラムを通過することを意味する。か
ような吸収された抗インターフェロン（数回吸収された
）はそのアフィニティ りロマトグラフィの後の抗体ア
フィニティ りロマトグラフィに用いられる。
マトグラフィカラムからの溶出液は、純インターフェロ
ンに至る当初の実験では、抗体が部分的に精製されたヒ
ト白血球インターフェロンに対して生じた免疫グロブリ
ンである吸収抗体アフィニティカラムを通過させること
によって最終の精製がなされ、次いでマトリックス固定
化粗ヒト白血球インターフェロンのカラムを何回か通過
することによって混入した蛋白に対する抗体が除去され
る。下記の詳細な説明で明らかなように、阻インターフ
ェロンとマトリックス（例えばセファロース４Ｂのごと
き）との共有結合的結合は、インターフェロン自体の免
疫学的決定因子を破壊するが（９８％以上）、大半の不
純物の決定因子を破壊しないことは明らかである。この
ことは、部分的に精製された白血球インターフェロンに
対して生じた免疫グロブリンをカラムを通過（通常数回
）させると、その抗不純物がカラムに残留し、一方抗イ
ンターフェロンはカラムを通過することを意味する。か
ような吸収された抗インターフェロン（数回吸収された
）はそのアフィニティ りロマトグラフィの後の抗体ア
フィニティ りロマトグラフィに用いられる。
粗ヒト白血球インターフェロンの代りに、“インターフ
ェロン抗体アフィニティ りロマトグラフィ”特にこの
発明の単一特異性抗体を用いて行われるインターフェロ
ン抗体アフィニティ りロマトグラフィから得られる“
洗浄水“もこの目的に使用できるし、又はかような洗浄
水は粗ヒト白血球インターフェロンと共に用いることも
できる。
ェロン抗体アフィニティ りロマトグラフィ”特にこの
発明の単一特異性抗体を用いて行われるインターフェロ
ン抗体アフィニティ りロマトグラフィから得られる“
洗浄水“もこの目的に使用できるし、又はかような洗浄
水は粗ヒト白血球インターフェロンと共に用いることも
できる。
またいくつかのインターフェロン抗体アフィニティ り
ロマトグラフィから得られるすべての不純物が集められ
、これらの不純物は粗ヒト白血球インターフェロンの代
りかもしくは該インターフェロンと合して用いることが
できる。
ロマトグラフィから得られるすべての不純物が集められ
、これらの不純物は粗ヒト白血球インターフェロンの代
りかもしくは該インターフェロンと合して用いることが
できる。
“実験”の項から明らかなように、アフィニティ力うム
類すなわちブルー デキストラン セファロース カラ
ム及び抗体アフィニティ カラムの好ましい操作法は、
これら２つのカラムを連結し、ブルー デキストラン
カラムからの溶出液を同時に抗体アフィニティ カラム
に負荷する方法である。この方法はブルー デキストラ
ン カラムからの溶出液を別個に扱ったならば起こりう
る損失を防止する。
類すなわちブルー デキストラン セファロース カラ
ム及び抗体アフィニティ カラムの好ましい操作法は、
これら２つのカラムを連結し、ブルー デキストラン
カラムからの溶出液を同時に抗体アフィニティ カラム
に負荷する方法である。この方法はブルー デキストラ
ン カラムからの溶出液を別個に扱ったならば起こりう
る損失を防止する。
ヒトＬｅ型インターフェロン蛋白の最後の濃縮工程には
、ＳＤＳで沈澱させることによって蛋白をａ縮する独特
の方法が用いられる。この方法は、この発明のもう一つ
の態様を構成するものであり、好ましくは０．１〜４重
量％、特に約０．１重量％のＳＤＳを含有する蛋白溶液
からＳＤＳ又はその塩を沈澱させ、ＳＤＳ又はその塩と
該蛋白との一種又は複数の錯体からなる沈澱を得、その
沈澱を溶液から分離し、好ましくは０〜４℃で遠心分離
し、次いでその沈澱を小容積の液体に再溶解することか
らなるものである。このＳＤＳを沈澱させるには、ａ）
約１５分間、温度を０℃に低下させるか又はｂ）ＳＤＳ
又は５ＤＳ−蛋白錯体て沈澱を形成する例えばカリウム
塩のごとき塩を加えて行うのが適切である。この方法は
純粋又は精製されたインターフェロンの水溶液を濃縮す
る価値ある方法であり、上記のごとく、ヒトＬｅ型イン
ターフェロン蛋白を濃縮する優れた方法であることが見
出されたのである。
、ＳＤＳで沈澱させることによって蛋白をａ縮する独特
の方法が用いられる。この方法は、この発明のもう一つ
の態様を構成するものであり、好ましくは０．１〜４重
量％、特に約０．１重量％のＳＤＳを含有する蛋白溶液
からＳＤＳ又はその塩を沈澱させ、ＳＤＳ又はその塩と
該蛋白との一種又は複数の錯体からなる沈澱を得、その
沈澱を溶液から分離し、好ましくは０〜４℃で遠心分離
し、次いでその沈澱を小容積の液体に再溶解することか
らなるものである。このＳＤＳを沈澱させるには、ａ）
約１５分間、温度を０℃に低下させるか又はｂ）ＳＤＳ
又は５ＤＳ−蛋白錯体て沈澱を形成する例えばカリウム
塩のごとき塩を加えて行うのが適切である。この方法は
純粋又は精製されたインターフェロンの水溶液を濃縮す
る価値ある方法であり、上記のごとく、ヒトＬｅ型イン
ターフェロン蛋白を濃縮する優れた方法であることが見
出されたのである。
（以下余白）
この発明に従って行われる全精製系列は著しく活性度を
保持することが見出された。すなわち出発量が７ｘｌＯ
’ガンマの蛋白から単離された純インターフェロンは１
ガンマ以下か１ガンマに等しいものであった（ＳＤＳ
ＰＡＧＥの蛋白のバンドを比較して測定）。しかし粗イ
ンターフェロンの出発バッチから純インターフェロンに
至るまでの全インターフェロン活性度は４ＸＩＯ’ｌＦ
Ｕから１．８５Ｘ １０’ｌＦＵに減少したに過ぎなか
った（約５０％）。このことはその精製系列及び上記系
列の重要な段階の独特な特性を強調している。
保持することが見出された。すなわち出発量が７ｘｌＯ
’ガンマの蛋白から単離された純インターフェロンは１
ガンマ以下か１ガンマに等しいものであった（ＳＤＳ
ＰＡＧＥの蛋白のバンドを比較して測定）。しかし粗イ
ンターフェロンの出発バッチから純インターフェロンに
至るまでの全インターフェロン活性度は４ＸＩＯ’ｌＦ
Ｕから１．８５Ｘ １０’ｌＦＵに減少したに過ぎなか
った（約５０％）。このことはその精製系列及び上記系
列の重要な段階の独特な特性を強調している。
材料及び方法
インターフェロンの分析は、公知の標準法［Ｂｅｒｇ
Ｋ、、５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｉ
ＴｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｈ
ｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
。
Ｋ、、５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｉ
ＴｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｈ
ｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ
。
５ｃａｎｄ、 Ｊ、 １ｍｍｕｎｏ１．６．７７〜８６
（１９７７）、 ＶＥＲＯ細胞（猿の腎臓の細胞）及
び攻撃性ウィルス（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｖｉｒｕｓ）
として水胞性口内炎ウィルス（ｖＳＶ）を使用］に従っ
て行われた。全インターフェロンの単位（ＩＦＵ）は国
際参照単位（６９／１９Ｂ単位： ＭＲＣ，ｍ１ｌｌ
Ｈｉｌｌ、 Ｕ、に、から得た。）で表わされる。
（１９７７）、 ＶＥＲＯ細胞（猿の腎臓の細胞）及
び攻撃性ウィルス（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｖｉｒｕｓ）
として水胞性口内炎ウィルス（ｖＳＶ）を使用］に従っ
て行われた。全インターフェロンの単位（ＩＦＵ）は国
際参照単位（６９／１９Ｂ単位： ＭＲＣ，ｍ１ｌｌ
Ｈｉｌｌ、 Ｕ、に、から得た。）で表わされる。
インターフェロン：粗ヒト白血球インターフェロンはＣ
ａｎｔｅｌｌが記載のインターフェロン誘発因子として
センダイウィルスを用いる方法（Ｃａｎｔｅｌｌ、 Ｋ
、、 Ｈｉｒｖｏｎｅｎ、 Ｓ、、 Ｍｏｇｅｎｓｅｎ
、 Ｋ、 Ｅ。
ａｎｔｅｌｌが記載のインターフェロン誘発因子として
センダイウィルスを用いる方法（Ｃａｎｔｅｌｌ、 Ｋ
、、 Ｈｉｒｖｏｎｅｎ、 Ｓ、、 Ｍｏｇｅｎｓｅｎ
、 Ｋ、 Ｅ。
ａｎｄ ＰｙｈｉｉｌＭ、 Ｌ、、 Ｈｕｍａｎ Ｌｅ
ｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ：ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ、 ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 ５ｔａｂ
ｉｌｉｔｙ ａｎｄａｎｉｌＩｌａｌ ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ； ＷａｙｍｏｕＬｈ、 Ｃ，、ＴｈｅＰｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｒ Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎ
ｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒ
ｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、 ＰＰ３５〜３８ ； １
９７３年レイク プラシッドで開催されたＴｉ５ｓｕｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎＷｏｒｋｓ
ｈｏｐの会報（生体外の部第３巻）及びメリーランド州
ロックビルのＴｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ＾５ｓｏｃ
ｉａｔ ｉｏｎの会報）で生産された。５ＸｌＯＳ！
ＦＵ１０蛋白の比活性度を有する一部分精製されたイン
ターフェロン（ＲＩＦ）が、Ｃａｎｔｅｌｌ、 Ｋ。
ｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ：ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ、 ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、 ５ｔａｂ
ｉｌｉｔｙ ａｎｄａｎｉｌＩｌａｌ ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ； ＷａｙｍｏｕＬｈ、 Ｃ，、ＴｈｅＰｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｒ Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅＴｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎ
ｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒ
ｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、 ＰＰ３５〜３８ ； １
９７３年レイク プラシッドで開催されたＴｉ５ｓｕｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎＷｏｒｋｓ
ｈｏｐの会報（生体外の部第３巻）及びメリーランド州
ロックビルのＴｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ＾５ｓｏｃ
ｉａｔ ｉｏｎの会報）で生産された。５ＸｌＯＳ！
ＦＵ１０蛋白の比活性度を有する一部分精製されたイン
ターフェロン（ＲＩＦ）が、Ｃａｎｔｅｌｌ、 Ｋ。
Ｈｉｒｖｏｎｅｎ、 Ｓ、、 Ｍｏｇｅｎｓｅｎ、 Ｋ
、 Ｅ、 ａｎｄ Ｐｙｈ旧Ｍ、 Ｌ。
、 Ｅ、 ａｎｄ Ｐｙｈ旧Ｍ、 Ｌ。
らが上記文献中に記載のエタノールによる沈殿法で粗濃
縮ヒト白血球インターフェロン（ＣＩＦ）から得られた
。
縮ヒト白血球インターフェロン（ＣＩＦ）から得られた
。
粗ナマルバ インターフェロンは、実質的に５ｔｒａｎ
ｄｅｒらが記載のインターフェロン誘発因子としてセン
ダイウィルスを用いる方法（Ｐｒｏｄｕｃｔ １ｏｎｏ
ｒ ｈｕｍａｎ Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ １ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
ｄｅｒらが記載のインターフェロン誘発因子としてセン
ダイウィルスを用いる方法（Ｐｒｏｄｕｃｔ １ｏｎｏ
ｒ ｈｕｍａｎ Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ １ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 １１１６〜１２４９ （１９７
５）コで製造された。
５）コで製造された。
インターフェロン中和法：抗インターフェロンを測定す
るこの方法は、次の仕方でマイクロ−分析系で行った。
るこの方法は、次の仕方でマイクロ−分析系で行った。
：２万ＶＥＲＯ細胞／ウエルを１００μＱの媒体中に接
種し湿らしたキャビネット中５％ＣＯｔで保持した。２
日目媒体を該細胞から除去し、各ウェルに６〜８１ＦＵ
／ｄの濃度のインターフェロンを含有する抗血清の希釈
液（媒体での）の１００μｇを加えた（該血清とインタ
ーフェロンは１時間、３７℃で予め培養した）。３日目
に媒体を除去し、全つエルニ１００μ１２ｖＳｖ（媒体
テ１０−３５マチ希釈）を加えた。４日目に、ＣＰＥ
（細胞変性効果）が測定された。そして抗インターフェ
ロン力価の測定のため終点として５０％破壊試験が行わ
れた。
種し湿らしたキャビネット中５％ＣＯｔで保持した。２
日目媒体を該細胞から除去し、各ウェルに６〜８１ＦＵ
／ｄの濃度のインターフェロンを含有する抗血清の希釈
液（媒体での）の１００μｇを加えた（該血清とインタ
ーフェロンは１時間、３７℃で予め培養した）。３日目
に媒体を除去し、全つエルニ１００μ１２ｖＳｖ（媒体
テ１０−３５マチ希釈）を加えた。４日目に、ＣＰＥ
（細胞変性効果）が測定された。そして抗インターフェ
ロン力価の測定のため終点として５０％破壊試験が行わ
れた。
その力価は国際中和単位（ＩＦＵ−ＮＵ） ／ｆｆ１２
で表わされる。
で表わされる。
ＰＩＦに対する非単一特異性抗インターフェロンが一部
羊又は一部うさぎを使ってＭｏｇｅｎｓｅｎ、 Ｋ。
羊又は一部うさぎを使ってＭｏｇｅｎｓｅｎ、 Ｋ。
Ｅ、、 Ｐｙｈｉｉｌｊｉ、 Ｌｉ５ａ ａｎｄ Ｃａ
ｎｔｅｌｌ、 Ｋ、、 Ａｃｔａ ｐａｔｈ。
ｎｔｅｌｌ、 Ｋ、、 Ａｃｔａ ｐａｔｈ。
ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、 ５ｅｃｔ、 Ｂ、
８３４４３−４５０ （１９７５）に従って製造され
た。竿尻インターフェロンの力価はｉｏｏ〜２５万ＩＦ
Ｕ−ＮＯ／ｘｃであった。うさぎ抗インターフェロン製
造のために、ＰＩＦ （２Ｘ１０ＳＩＦＵ）を２年間以
上１週間毎にうさぎに対し皮下注射した。
８３４４３−４５０ （１９７５）に従って製造され
た。竿尻インターフェロンの力価はｉｏｏ〜２５万ＩＦ
Ｕ−ＮＯ／ｘｃであった。うさぎ抗インターフェロン製
造のために、ＰＩＦ （２Ｘ１０ＳＩＦＵ）を２年間以
上１週間毎にうさぎに対し皮下注射した。
うさぎ抗インターフェロンの力価は、１５，０００〜３
０．０ＯＯＩＦＵ−ＮＯ／＋ｇであった。全免疫グロブ
リンは、５０％硫酸アンモニウムで沈殿させ次いで、ｐ
Ｈ１，２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対し透析し
て単離された。
０．０ＯＯＩＦＵ−ＮＯ／＋ｇであった。全免疫グロブ
リンは、５０％硫酸アンモニウムで沈殿させ次いで、ｐ
Ｈ１，２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対し透析し
て単離された。
化学試薬類 ＣＮＢｒはフル力源（−２０℃で貯蔵）を
用いた。電気泳動法用の特に純粋なドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）はＢｒ１ｔｉｓｈ Ｄｒｕｇ Ｈｏｕｓ
ｅ （ＢＤＨ）を通じて購入した。ツヤビーン トリプ
シン阻害剤（ＳＴＩ）とし−リジンはシグマ社から得た
。セフｙ Ｏ−ス４ Ｂ、 ＣＮＢｒ−活性化セファロ
ース４Ｂ。
用いた。電気泳動法用の特に純粋なドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）はＢｒ１ｔｉｓｈ Ｄｒｕｇ Ｈｏｕｓ
ｅ （ＢＤＨ）を通じて購入した。ツヤビーン トリプ
シン阻害剤（ＳＴＩ）とし−リジンはシグマ社から得た
。セフｙ Ｏ−ス４ Ｂ、 ＣＮＢｒ−活性化セファロ
ース４Ｂ。
ＣＨ−活性化セファロース４Ｂ及びエポキシ活性化セフ
ァロース６Ｂは、すべてファーマシア社（デンマーク）
から購入した。
ァロース６Ｂは、すべてファーマシア社（デンマーク）
から購入した。
結合方法 免疫グロブリンとセファロース４Ｂとの共有
結合的な結合は、Ｋ、 Ｂｅｒｇが先に５ｃｎａｄ 。
結合的な結合は、Ｋ、 Ｂｅｒｇが先に５ｃｎａｄ 。
Ｊ、 Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇ、、 ６．７７−８６ （
１９７７）に記載したのと同じ方法でなされた。免疫グ
ロブリンの８０〜８５％のみかむらなく結合された。
１９７７）に記載したのと同じ方法でなされた。免疫グ
ロブリンの８０〜８５％のみかむらなく結合された。
蛋白の分析は、ロウソイ法の変形法［ＢｅｒｇＫ、。
５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆ Ｈｕｍａ
ｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒ４ｅｒｏｎ、 ５
ｃａｎｄ、 Ｊ。
ｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆ Ｈｕｍａ
ｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒ４ｅｒｏｎ、 ５
ｃａｎｄ、 Ｊ。
ｌｎｍｕｎｏｌ、、 ６．７７〜８６ （１９７７）
］でなされ、（ＬＫＢＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ａｂｓ
ｏｒｐｔｉｏｎｅｒ Ｕｌｔｒａｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ
を用い、）検出可能な最少量の蛋白が１〜２μ９／ｖｔ
Ｉ２であった。結晶性の牛血清アルブミンを標準蛋白と
して用いた。精製インターフェロンの蛋白濃度（全体で
１〜５μ９）を測定するのに次の手法が採用された。す
なわち、ＳＤＳを最終的に０．１％の濃度まで添加し、
これを蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した蛋白の試
料をさらに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ、後記参照）で試験した。染色した
蛋白のバンドの強度を種々の量の既知の標準と比較しく
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる；後記参照）、蛋白の全量を算
出したかその偏差は５〜１０％であり、蛋白の検出可能
な最少量は０．１μ９（全体で）であった。この方法で
得られる結果は、実測値というよりもラフな計算値とし
て役立つものである。
］でなされ、（ＬＫＢＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ａｂｓ
ｏｒｐｔｉｏｎｅｒ Ｕｌｔｒａｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ
を用い、）検出可能な最少量の蛋白が１〜２μ９／ｖｔ
Ｉ２であった。結晶性の牛血清アルブミンを標準蛋白と
して用いた。精製インターフェロンの蛋白濃度（全体で
１〜５μ９）を測定するのに次の手法が採用された。す
なわち、ＳＤＳを最終的に０．１％の濃度まで添加し、
これを蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した蛋白の試
料をさらに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（ＳＤＳ ＰＡＧＥ、後記参照）で試験した。染色した
蛋白のバンドの強度を種々の量の既知の標準と比較しく
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる；後記参照）、蛋白の全量を算
出したかその偏差は５〜１０％であり、蛋白の検出可能
な最少量は０．１μ９（全体で）であった。この方法で
得られる結果は、実測値というよりもラフな計算値とし
て役立つものである。
アフィニティ りロマトグラフィは４℃で行われた。そ
のゲル懸濁液は、カラムに充填する前に脱ガスされた。
のゲル懸濁液は、カラムに充填する前に脱ガスされた。
充填は嬬動ポンプを用い、充填用緩衝液のカラム容積の
３〜５倍儀で洗浄して行われた。ターフエロン滴定用の
試料（１００μｇ）は、プール又は個々のフラクション
から採取されその日に滴定するか又はプラスチック管に
入れて凍結（−２０℃）しその後滴定した。希釈は媒体
（１０％小牛血清含有）でなされた。
３〜５倍儀で洗浄して行われた。ターフエロン滴定用の
試料（１００μｇ）は、プール又は個々のフラクション
から採取されその日に滴定するか又はプラスチック管に
入れて凍結（−２０℃）しその後滴定した。希釈は媒体
（１０％小牛血清含有）でなされた。
抗体アフィニティ りロマトグラフィは、特にＢｅｒｇ
か記載した方法で行われた［５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ｏｒ ｈｍａｎ Ｌｅｕｋ。
か記載した方法で行われた［５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ｏｒ ｈｍａｎ Ｌｅｕｋ。
ｃｙｔｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、 ５ｃａｎｄ、
Ｊ、 ｌｎｍｕｎｏｌ、、 ６． ７７−８６
（１９７７） ］ 、充填緩衝液として０．ＩＭ Ｎ
ａ０Ａ１０．３ＭＮａＣ（２，ｐＨ７，２（流速４０ｆ
ｆ１２／ｈ）が用いられた。段階的溶離は、少量のクエ
ン酸（ｐＨを額実に２．４に保持するに足る）含有のＯ
，１Ｍ ＨＯＡｃｌｏ、３Ｍ ＮａＣｌ２で行われた。
Ｊ、 ｌｎｍｕｎｏｌ、、 ６． ７７−８６
（１９７７） ］ 、充填緩衝液として０．ＩＭ Ｎ
ａ０Ａ１０．３ＭＮａＣ（２，ｐＨ７，２（流速４０ｆ
ｆ１２／ｈ）が用いられた。段階的溶離は、少量のクエ
ン酸（ｐＨを額実に２．４に保持するに足る）含有のＯ
，１Ｍ ＨＯＡｃｌｏ、３Ｍ ＮａＣｌ２で行われた。
カラムを使用しない際は、ペニシリン、ストレプトマイ
シン、ゲンタマイシン及びクロラムフェニコール（各１
％）含有のＰＢＳ ＩＭ ＮａＣＱ中４℃で保管した。
シン、ゲンタマイシン及びクロラムフェニコール（各１
％）含有のＰＢＳ ＩＭ ＮａＣＱ中４℃で保管した。
カラムを精製を目的として使用する前は、最初に１００
ｊＩＱの充填用緩衝液で次いで溶離緩衝液で洗浄し、最
後に２０〜３０１Ｑの充填用緩衝液で平衡にさせた。こ
の洗浄サイクルは、特にｌＯ’ｌＦＵ／ｉ９蛋白以上の
比活性度のインターフェロンを処理するとき、“天然”
の蛋白を避けるのに必要であった。インターフェロン溶
出液を集めるのに用いたプラスチック管は１％ＳＤＳの
１００μＣで予め濡らしておいた。
ｊＩＱの充填用緩衝液で次いで溶離緩衝液で洗浄し、最
後に２０〜３０１Ｑの充填用緩衝液で平衡にさせた。こ
の洗浄サイクルは、特にｌＯ’ｌＦＵ／ｉ９蛋白以上の
比活性度のインターフェロンを処理するとき、“天然”
の蛋白を避けるのに必要であった。インターフェロン溶
出液を集めるのに用いたプラスチック管は１％ＳＤＳの
１００μＣで予め濡らしておいた。
ＳＤＳ ＰＡＧＥ 精製、濃縮されたインターフェロ
ン製剤は、そのポリペプチド成分を、２０ｃｍ長の分離
ゲル、０．７５Ｊ！Ｊ！厚（ビオラッド２２１型ｓ２重
垂直平板ゲル電気泳動セル）及び７〜ｌ０ｃｍ長のスタ
ッキング ゲル（ＳｔＢｃｋｉｎｇ ｇｏｌ）を用いる
ＳＯＳ ＰＡＧＥ平板ゲルで分析された。約９〜２２％
ポリアクリルアミドの指数勾配のゲルは、Ｋｎｉｇｈｔ
、 Ｅ、。
ン製剤は、そのポリペプチド成分を、２０ｃｍ長の分離
ゲル、０．７５Ｊ！Ｊ！厚（ビオラッド２２１型ｓ２重
垂直平板ゲル電気泳動セル）及び７〜ｌ０ｃｍ長のスタ
ッキング ゲル（ＳｔＢｃｋｉｎｇ ｇｏｌ）を用いる
ＳＯＳ ＰＡＧＥ平板ゲルで分析された。約９〜２２％
ポリアクリルアミドの指数勾配のゲルは、Ｋｎｉｇｈｔ
、 Ｅ、。
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ： Ｐｕｒｉｒｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ １ｎｉｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｌｏｉｄ ｃｅ
ｌｌｓ。
ａｎｄ １ｎｉｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｌｏｉｄ ｃｅ
ｌｌｓ。
Ｐｒｏｃ、 ｎａｔｎ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ
Ａ ７３５２０〜５２３ （１９７６）に記載のごとく
、ｌＤ＋ｆ２の２２％アクリルアミド溶液と約３２ＲＱ
の９％溶液とを簡単な水冷勾配型中で混合して作製され
た。Ｌａｅｎｏｍｌｉ記載の非連続緩衝液系［Ｌａｅｎ
ｏｍｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、 Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ５
ｔｒｕｃｔｕｒａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ
Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆｔｈｅ Ｈｅａｄ ｏｒＢａｃ
ｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ ２２７
．６８０〜６８５（１９７０） ］が用いられた。この
ゲルは予め２時間冷却（１０°Ｃ）しておいてから電気
泳動分析法に付されるが、ｉｏ＋ｎＡ （約２０■）で
開始され、一定条件下（ＬＫＢ’Ｉ源）−夜（１０℃）
行われた。分析試料は、トラッキング染料を含有しＳＤ
Ｓが２．５％、グルコースが５％の０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ６，！ｌ）に溶解（又は希釈）された（
試料緩衝液）。そのゲルは、コマソイ ブルー（Ｃｏｍ
ａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ、 ５０％メタノール、４０％水
及びｌＯ％酢酸混合物中１．２５Ｍ９ｈ（１）にて、予
め固定処理することなしに、１５分間、室温下、一定揺
動下で染色し、次いで７％酢酸（５％メタノール）中で
脱色した。ゲルは良質の紙［例えば、ワットマン りロ
マトグラフィ紙（ｔ７ｉｇ）］上で、加熱減圧下、ゲル
乾燥機（ビオ ラッド、ゲル平板乾燥機２２４型）を用
いて乾燥された。５種の異ったモレキュラーマーカーの
０．１μ２〜】０μｇ７２０μ？溶液［ラクトアルブミ
ン（１４，４００ダルトン）；ツヤビーン トリプシン
阻害剤（２０，１００ダルトン）：炭酸脱水酵素（３０
，０００ダルトン）；オバルブミン（４３，０００ダル
トン）；牛血清アルブミン（６７，０００ダルトン）；
ホスホリラーゼ（９４，０００ダルトン）（デンマーク
、ファーマシャ社の電気泳動法用校正キットとして入手
）〕をＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、染色した。この方法で
決定された分子量は約±２００ダルトンの実験精度であ
ることに留意すべきである。
Ａ ７３５２０〜５２３ （１９７６）に記載のごとく
、ｌＤ＋ｆ２の２２％アクリルアミド溶液と約３２ＲＱ
の９％溶液とを簡単な水冷勾配型中で混合して作製され
た。Ｌａｅｎｏｍｌｉ記載の非連続緩衝液系［Ｌａｅｎ
ｏｍｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、 Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ５
ｔｒｕｃｔｕｒａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｕｒｉｎｇ
Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆｔｈｅ Ｈｅａｄ ｏｒＢａｃ
ｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ ２２７
．６８０〜６８５（１９７０） ］が用いられた。この
ゲルは予め２時間冷却（１０°Ｃ）しておいてから電気
泳動分析法に付されるが、ｉｏ＋ｎＡ （約２０■）で
開始され、一定条件下（ＬＫＢ’Ｉ源）−夜（１０℃）
行われた。分析試料は、トラッキング染料を含有しＳＤ
Ｓが２．５％、グルコースが５％の０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ６，！ｌ）に溶解（又は希釈）された（
試料緩衝液）。そのゲルは、コマソイ ブルー（Ｃｏｍ
ａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ、 ５０％メタノール、４０％水
及びｌＯ％酢酸混合物中１．２５Ｍ９ｈ（１）にて、予
め固定処理することなしに、１５分間、室温下、一定揺
動下で染色し、次いで７％酢酸（５％メタノール）中で
脱色した。ゲルは良質の紙［例えば、ワットマン りロ
マトグラフィ紙（ｔ７ｉｇ）］上で、加熱減圧下、ゲル
乾燥機（ビオ ラッド、ゲル平板乾燥機２２４型）を用
いて乾燥された。５種の異ったモレキュラーマーカーの
０．１μ２〜】０μｇ７２０μ？溶液［ラクトアルブミ
ン（１４，４００ダルトン）；ツヤビーン トリプシン
阻害剤（２０，１００ダルトン）：炭酸脱水酵素（３０
，０００ダルトン）；オバルブミン（４３，０００ダル
トン）；牛血清アルブミン（６７，０００ダルトン）；
ホスホリラーゼ（９４，０００ダルトン）（デンマーク
、ファーマシャ社の電気泳動法用校正キットとして入手
）〕をＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、染色した。この方法で
決定された分子量は約±２００ダルトンの実験精度であ
ることに留意すべきである。
染色蛋白のバンドが精製インターフェロン製剤の平行し
たＳＤＳ ＰＡＧＥから得られた対応するバンドと比較
され、インターフェロン蛋白の全濃度が評価された。Ｓ
ＤＳ ＰＡＧＥから生物学的プロフィルを得るため、イ
ンターフェロン測定用のゲルの一部を残りのゲルから切
り取り、ガラス板上４℃で（しめらせた箱内）に保管し
た。そのゲルの主要部は１５分間染色し、３〜５分間脱
色すると、弱いバンドがブルー色をバックグランドとし
て明確に見えるようになり、１４，０００ダルトンと３
０，０００ダルトンに対応する蛋白のバンドの正確な位
置を決定することかできた。そのゲルの染色しなかった
部分、すなわち１４．０００ダルトンとａｏ、ｏｏｏダ
ルトンとの間の蛋白だけを含有している部分を切り取り
、鋭利なナイフで１ｍｍ片に細切した。これらの切片を
テフロンロッドで完全に細かくくだいた後０．１Ｍ Ｓ
ＯＳの０．５ｕ２で溶離してこれらの切片のインターフ
ェロンが得られた。室温で５時間振動させた後、上澄液
のインターフェロン活性を測定した。個々のフラクショ
は添加物を加えずに一２０℃で凍結した。
たＳＤＳ ＰＡＧＥから得られた対応するバンドと比較
され、インターフェロン蛋白の全濃度が評価された。Ｓ
ＤＳ ＰＡＧＥから生物学的プロフィルを得るため、イ
ンターフェロン測定用のゲルの一部を残りのゲルから切
り取り、ガラス板上４℃で（しめらせた箱内）に保管し
た。そのゲルの主要部は１５分間染色し、３〜５分間脱
色すると、弱いバンドがブルー色をバックグランドとし
て明確に見えるようになり、１４，０００ダルトンと３
０，０００ダルトンに対応する蛋白のバンドの正確な位
置を決定することかできた。そのゲルの染色しなかった
部分、すなわち１４．０００ダルトンとａｏ、ｏｏｏダ
ルトンとの間の蛋白だけを含有している部分を切り取り
、鋭利なナイフで１ｍｍ片に細切した。これらの切片を
テフロンロッドで完全に細かくくだいた後０．１Ｍ Ｓ
ＯＳの０．５ｕ２で溶離してこれらの切片のインターフ
ェロンが得られた。室温で５時間振動させた後、上澄液
のインターフェロン活性を測定した。個々のフラクショ
は添加物を加えずに一２０℃で凍結した。
実験
３Ｑの粗ヒト白血球インターフェロンに、Ｉ）Ｈ７，２
でＫＳＣＮを０．５Ｍ濃度まで加えた。マグネチックス
タラーで撹拌しなから１規定の塩酸を加えてりＨ４，５
まで下げてインターフェロン（と不純物）を含有する蛋
白の沈殿を得た。この沈殿を、ＩＭＮａＣＱと２５容量
％のエチレングリコール含有のＰＢＳ（リン酸塩溶液で
緩衝された塩水、 ｐＨ７，２） １５０ｊＩａ中に溶
解し、４℃で２１２の同じ緩衝液に対して３回充分透析
を行った。この濃縮された粗ヒト白血球インターフェロ
ン（ＨｕＬｅＣＩＦ）の比活性度は５〜１０ Ｘ １０
’ ＩＦＵ／ｉｇ蛋白であり、回収率は約９８％であっ
た。
でＫＳＣＮを０．５Ｍ濃度まで加えた。マグネチックス
タラーで撹拌しなから１規定の塩酸を加えてりＨ４，５
まで下げてインターフェロン（と不純物）を含有する蛋
白の沈殿を得た。この沈殿を、ＩＭＮａＣＱと２５容量
％のエチレングリコール含有のＰＢＳ（リン酸塩溶液で
緩衝された塩水、 ｐＨ７，２） １５０ｊＩａ中に溶
解し、４℃で２１２の同じ緩衝液に対して３回充分透析
を行った。この濃縮された粗ヒト白血球インターフェロ
ン（ＨｕＬｅＣＩＦ）の比活性度は５〜１０ Ｘ １０
’ ＩＦＵ／ｉｇ蛋白であり、回収率は約９８％であっ
た。
粗ナマルバインターフェロンの濃縮
的８，０００１ＦＵ＃＋（の力価を有するＩＱのナマル
バインターフエロンニ、ｐＨ７，２”ｉｌ？ＫｓｃＮを
０．５Ｍ１１度まで加えた。マグ不チックスタラーで撹
拌しながらｌ規定の塩酸を加えてｐＨを４．５に下げ、
インターフェロン（と不順物）を含有する蛋白の沈殿を
得た。その沈殿を１ＭＮａＣＩ２と２５容量％のエチレ
ングリコール含有のＰＢＳ （ｐＨ７，２） ５０ｘ１
２中に溶解し、４℃で２Ｑの同じ緩衝液に対し３回充分
に透析を行った。この濃縮された粗ナマルバインターフ
ェロン（ＮａＣＩＦ）の比活性度はｔＯ〜１２ ｘ １
０’ ＩＦＵ１０蛋白であり、回収率は約９８％であっ
た。
バインターフエロンニ、ｐＨ７，２”ｉｌ？ＫｓｃＮを
０．５Ｍ１１度まで加えた。マグ不チックスタラーで撹
拌しながらｌ規定の塩酸を加えてｐＨを４．５に下げ、
インターフェロン（と不順物）を含有する蛋白の沈殿を
得た。その沈殿を１ＭＮａＣＩ２と２５容量％のエチレ
ングリコール含有のＰＢＳ （ｐＨ７，２） ５０ｘ１
２中に溶解し、４℃で２Ｑの同じ緩衝液に対し３回充分
に透析を行った。この濃縮された粗ナマルバインターフ
ェロン（ＮａＣＩＦ）の比活性度はｔＯ〜１２ ｘ １
０’ ＩＦＵ１０蛋白であり、回収率は約９８％であっ
た。
ゲル濾過
１００ｃｍ長のカラム（直径２．６ｃｍ、ファーマシャ
に２．６Ｘ １００）に、４℃でＩ Ｍ ＮａＣＱと２
５容量％のエチレングリコール含有のＰＢＳ （ｐＨ７
，２）中にウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ） ＡｃＡ
５／４ （ＬＫＢ、デンマーク）を充填した。そのカ
ラムをその３倍容量の緩衝液で洗い、カラムを安定化さ
せた。１０〜１５ｘ（ｌのＨｕＬｅＣＩＦ （エチレン
グリコール濃度が２５容量％で１ＭＮａＣ１２のｐＨ７
，４のＰＢＳ中で前記のごとく調製したもの）をカラム
に充填し、次いでそのカラムを上記の充填用緩衝液で“
溶離“し、各フラクションのインターフェロン活性を分
析した。そのインターフエロン含有フラクションを合し
、原インターフェロン活性度の約９５％を回収した。ゲ
ル濾過したヒト白血球インターフェロン含有溶出液の比
活性度はほぼ１Ｇ＠ｌＦＵ／ｘ９蛋白であった。これは
２００の精製係数に相当する。モレキュラーマーカーで
測定すると、そのインターフェロンの分子量はｉｏ、ｏ
ｏ。
に２．６Ｘ １００）に、４℃でＩ Ｍ ＮａＣＱと２
５容量％のエチレングリコール含有のＰＢＳ （ｐＨ７
，２）中にウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ） ＡｃＡ
５／４ （ＬＫＢ、デンマーク）を充填した。そのカ
ラムをその３倍容量の緩衝液で洗い、カラムを安定化さ
せた。１０〜１５ｘ（ｌのＨｕＬｅＣＩＦ （エチレン
グリコール濃度が２５容量％で１ＭＮａＣ１２のｐＨ７
，４のＰＢＳ中で前記のごとく調製したもの）をカラム
に充填し、次いでそのカラムを上記の充填用緩衝液で“
溶離“し、各フラクションのインターフェロン活性を分
析した。そのインターフエロン含有フラクションを合し
、原インターフェロン活性度の約９５％を回収した。ゲ
ル濾過したヒト白血球インターフェロン含有溶出液の比
活性度はほぼ１Ｇ＠ｌＦＵ／ｘ９蛋白であった。これは
２００の精製係数に相当する。モレキュラーマーカーで
測定すると、そのインターフェロンの分子量はｉｏ、ｏ
ｏ。
〜２０．０００ダルトンの範囲にある。個々のフラクシ
ョンを測定すると１８，０００ダルトンの位置に極大値
を示すブロードなどピークを一つだけを示した。
ョンを測定すると１８，０００ダルトンの位置に極大値
を示すブロードなどピークを一つだけを示した。
上記同じ仕方で、１０１１＋１２のＮａＣＩＦ （エチ
レングリコール濃度が２５容量％でＮａＣ（２８度がＩ
ＭでありｐＨ７，４のＰＢＳ中で前記のごとく調製され
たもの）をカラムに充填し、次いで前記と同じ仕方で“
溶離”を行った。回収率は約９０％であった。このゲル
濾過されたナマルバインターフェロン含有溶出液の比活
性度は、はぼ１０＠１ＦＬＩ／１９蛋白で、これは精製
係数１００に相当する。モレキュラーマーカーで測定す
るとこのインターフェロンの分子量は１０．０００〜２
０．Ｇｏｏダルトンの範囲にある。個々のフラクション
を滴定すると１８，０００グルトンの位置に極大値を示
す一つのブロードなピークを示した。
レングリコール濃度が２５容量％でＮａＣ（２８度がＩ
ＭでありｐＨ７，４のＰＢＳ中で前記のごとく調製され
たもの）をカラムに充填し、次いで前記と同じ仕方で“
溶離”を行った。回収率は約９０％であった。このゲル
濾過されたナマルバインターフェロン含有溶出液の比活
性度は、はぼ１０＠１ＦＬＩ／１９蛋白で、これは精製
係数１００に相当する。モレキュラーマーカーで測定す
るとこのインターフェロンの分子量は１０．０００〜２
０．Ｇｏｏダルトンの範囲にある。個々のフラクション
を滴定すると１８，０００グルトンの位置に極大値を示
す一つのブロードなピークを示した。
）１ｕＬｅＣＩＦとＮａＣＩＦの上記ゲル濾過操作につ
いてのそれぞれのゲル濾過曲線を第５図及び第６図に示
した。そして“ＨＵＬＥＩＦ”はヒト白血球インターフ
ェロンを示し、一方”ＮＡＬＹＩＦ”はナマルバ（リン
ホブラストイド）インターフェロンを示す。そのインタ
ーフェロン活性は蛋白の主要部分から有効に分離されて
いることが明確に認められる。
いてのそれぞれのゲル濾過曲線を第５図及び第６図に示
した。そして“ＨＵＬＥＩＦ”はヒト白血球インターフ
ェロンを示し、一方”ＮＡＬＹＩＦ”はナマルバ（リン
ホブラストイド）インターフェロンを示す。そのインタ
ーフェロン活性は蛋白の主要部分から有効に分離されて
いることが明確に認められる。
ブルーデキストラン りロマトグラフィ上記のようにし
て得られた、ゲル濾過されたヒト白血球インターフェロ
ン溶液を、４℃、ｐＨ１，２の２０ｍＭＰＢの２００倍
容量に対して徹底的に透析を行った。この透析を２回行
い、全透析時間は約２４時間であった。この透析された
溶液（２５３１１２，１，８Ｘ１０”１Ｆｔｌ）をブル
ーデキストラン−セファ０−ス４Ｂのカラムに充填した
。そのカラムの直径は１ｃｍで長さは１０ｃｍであった
。このカラムは、ｐＨ７，４の２０ｍＭＰＢ （’Ｊ
ン酸塩緩衝液） （１） ２００〜３０Ｑｔｘ（ｌ テ
予め洗浄した。透析されたインターフェロン調製試料を
その平衡化されたカラムに入れ、次いでカラムを７５ｍ
１２のＰＢで洗浄した。その洗浄液には４．５００１Ｐ
Ｕの活性度が認められた。そのカラムを０，６Ｍ Ｎａ
ＣＱ。
て得られた、ゲル濾過されたヒト白血球インターフェロ
ン溶液を、４℃、ｐＨ１，２の２０ｍＭＰＢの２００倍
容量に対して徹底的に透析を行った。この透析を２回行
い、全透析時間は約２４時間であった。この透析された
溶液（２５３１１２，１，８Ｘ１０”１Ｆｔｌ）をブル
ーデキストラン−セファ０−ス４Ｂのカラムに充填した
。そのカラムの直径は１ｃｍで長さは１０ｃｍであった
。このカラムは、ｐＨ７，４の２０ｍＭＰＢ （’Ｊ
ン酸塩緩衝液） （１） ２００〜３０Ｑｔｘ（ｌ テ
予め洗浄した。透析されたインターフェロン調製試料を
その平衡化されたカラムに入れ、次いでカラムを７５ｍ
１２のＰＢで洗浄した。その洗浄液には４．５００１Ｐ
Ｕの活性度が認められた。そのカラムを０，６Ｍ Ｎａ
ＣＱ。
２０ｍＭ ＰＢ （ｐＨ７，２）で溶離し、インターフ
ェロン活性の９５％以上を６１１２の溶出液中に回収し
た（インターフェロン滴定により測定）。
ェロン活性の９５％以上を６１１２の溶出液中に回収し
た（インターフェロン滴定により測定）。
正確に同じ方法で、上記ゲル濾過ナマルバインターフェ
ロン溶液を徹底的に透析に付した後、ブルーデキストラ
ン りロマトグラフイに付した。
ロン溶液を徹底的に透析に付した後、ブルーデキストラ
ン りロマトグラフイに付した。
ブルーデキストラン りロマトグラフイに供給したもの
の力価は１６．０００１ＦＵであり、その洗浄液５０ｍ
Ｑ（Ｄ力価ハフ０，０ＯＯＩＰＵテあった。溶出液は０
．６ＭＮａＣＱ ｐＨ７，２のＰＢによる溶離によって
得られた。
の力価は１６．０００１ＦＵであり、その洗浄液５０ｍ
Ｑ（Ｄ力価ハフ０，０ＯＯＩＰＵテあった。溶出液は０
．６ＭＮａＣＱ ｐＨ７，２のＰＢによる溶離によって
得られた。
ナマルバインターフェロンのブルーデキストランクロマ
トグラフィを第７図に示した。ナマルバインターフェロ
ンの線維芽細胞部は、上記条件下このカラムは溶離され
なかった。しかしエチレングリコール濃度が２５％、Ｉ
Ｍ ＮａＣ（ｌのｐＨ７，２のＰＢを用いれば溶離さ
れるであろう。
トグラフィを第７図に示した。ナマルバインターフェロ
ンの線維芽細胞部は、上記条件下このカラムは溶離され
なかった。しかしエチレングリコール濃度が２５％、Ｉ
Ｍ ＮａＣ（ｌのｐＨ７，２のＰＢを用いれば溶離さ
れるであろう。
上記ブルーデキストランカラムは、臭化シアンで活性化
されたアガロース（セファロース４日）にカップリング
されたブルーデキストラン（分子１１２００万のデキス
トラン２，０００に固定化されたシバクロンブルーＦ３
ＧＡ）のカラムであった。従って、そのカラムのより完
全な名称はブルーデキストラン−セファロース４Ｂであ
る。この種のカラムはＢｏｌｌｉｎらの前記文献に記載
されている。溶離した後、そのカラムを、エチレングリ
コール濃度が２５％、ＮａＣ（２濃度が１．５Ｍ及びリ
ン酸塩濃度が２０ｍＭのＰＢの２５〜３０＊Ｑで溶離す
ることによって洗浄した。
されたアガロース（セファロース４日）にカップリング
されたブルーデキストラン（分子１１２００万のデキス
トラン２，０００に固定化されたシバクロンブルーＦ３
ＧＡ）のカラムであった。従って、そのカラムのより完
全な名称はブルーデキストラン−セファロース４Ｂであ
る。この種のカラムはＢｏｌｌｉｎらの前記文献に記載
されている。溶離した後、そのカラムを、エチレングリ
コール濃度が２５％、ＮａＣ（２濃度が１．５Ｍ及びリ
ン酸塩濃度が２０ｍＭのＰＢの２５〜３０＊Ｑで溶離す
ることによって洗浄した。
このカラムを使用しない際は、４℃でこの緩衝液中に保
存された。上記のごとく、カラムへの負荷条件には種々
な潰（０〜５０％）のアルコール類のごとき疎水性試薬
を使用することら含まれる。
存された。上記のごとく、カラムへの負荷条件には種々
な潰（０〜５０％）のアルコール類のごとき疎水性試薬
を使用することら含まれる。
ブルーデキストラン りロマトグラフィから０．６Ｍ
ＮａＣｌ２で溶離されたものは、ヒト白血球インターフ
ェロン及びナマルバインターフェロンの両者ニツイテ、
７０Ｘ １０’ｌＦＵ／Ｉｆ！蛋白の比活性度を示す。
ＮａＣｌ２で溶離されたものは、ヒト白血球インターフ
ェロン及びナマルバインターフェロンの両者ニツイテ、
７０Ｘ １０’ｌＦＵ／Ｉｆ！蛋白の比活性度を示す。
従ってこれらのインターフェロンは治療を目的としてヒ
トに非経口投与しうるものであり、この点については通
常用いられるＰＩＦ製剤よりもはるかに高純度の製剤で
ある。この用途に用いるため、この溶出液は上記のごと
き生理学的に受容な安定剤、例えば１％のヒトアルブミ
ンで安定化される。
トに非経口投与しうるものであり、この点については通
常用いられるＰＩＦ製剤よりもはるかに高純度の製剤で
ある。この用途に用いるため、この溶出液は上記のごと
き生理学的に受容な安定剤、例えば１％のヒトアルブミ
ンで安定化される。
さらに精製し純インターフェロンを製造するため、ブル
ーデキストランカラムから得られた溶出液は、抗体アフ
ィニティ りロマトグラフィ カラムに直接移される。
ーデキストランカラムから得られた溶出液は、抗体アフ
ィニティ りロマトグラフィ カラムに直接移される。
最も有利なのは、抗体アフィニティ りロマトグラフィ
カラムを、下記のように“タンデムシステム”でブル
ーデキストラン カラムと連結することである。
カラムを、下記のように“タンデムシステム”でブル
ーデキストラン カラムと連結することである。
タンデム アフィニティ クロマトグラフィ上記のよう
にしてブルーデキストラン カラムを溶離するのに代っ
て、溶離を行う前にブルーデキストラン カラムの出口
と抗体カラムの入口とを結合することによってブルーデ
キストラン カラムと平衡化された抗体カラムとが連結
される。
にしてブルーデキストラン カラムを溶離するのに代っ
て、溶離を行う前にブルーデキストラン カラムの出口
と抗体カラムの入口とを結合することによってブルーデ
キストラン カラムと平衡化された抗体カラムとが連結
される。
この方法ではブルーデキストラン カラムからの溶出液
は直ちに抗体カラムによって“キャッチ”される。この
組合わせは、０．６Ｍ ＮａＣ０，２０ｍＭ ＰＢ。
は直ちに抗体カラムによって“キャッチ”される。この
組合わせは、０．６Ｍ ＮａＣ０，２０ｍＭ ＰＢ。
ｐＨ７，２の溶離条件が抗体カラムの負荷条件として用
いうるという事実を利用するものである。２０ＩＩＱの
溶出液／″負荷緩衝液” （この“負荷緩衝液“は、も
ちろん同時にブルーデキストラン カラムから溶離され
たインターフェロンを含有している）を用いて溶離／負
荷を行った後、この２つのカラムをはずし、次いで抗体
カラムを上記のごとく溶離する前にさらに洗浄する。抗
体カラムからのヒト白血球インターフェロン溶出液１０
”ｌＦＵ／ｍｙ蛋白以上の比活性度（上記測定法による
）を示す純インターフェロン蛋白を含有する。純インタ
ーフェロン蛋白を安定化するには、抗体カラムからの溶
出液を集める管（フラクションサイズ２ｍυを各々ＩＯ
μｇの１％ ＳＤＳで予め濡らしておいた。インターフ
ェロン含有溶出液をプールした後、追加のＳＤＳを全農
度を０．１重量％まで加えた。
いうるという事実を利用するものである。２０ＩＩＱの
溶出液／″負荷緩衝液” （この“負荷緩衝液“は、も
ちろん同時にブルーデキストラン カラムから溶離され
たインターフェロンを含有している）を用いて溶離／負
荷を行った後、この２つのカラムをはずし、次いで抗体
カラムを上記のごとく溶離する前にさらに洗浄する。抗
体カラムからのヒト白血球インターフェロン溶出液１０
”ｌＦＵ／ｍｙ蛋白以上の比活性度（上記測定法による
）を示す純インターフェロン蛋白を含有する。純インタ
ーフェロン蛋白を安定化するには、抗体カラムからの溶
出液を集める管（フラクションサイズ２ｍυを各々ＩＯ
μｇの１％ ＳＤＳで予め濡らしておいた。インターフ
ェロン含有溶出液をプールした後、追加のＳＤＳを全農
度を０．１重量％まで加えた。
プールされ、０．１％ＳＤＳで安定化されたインターフ
ェロン含有溶出液は、水浴中で０℃に予め冷却された２
０ｚ（７のステンレス鋼製管に移される。１５分後、沈
殿が生成する。この沈殿を４℃で２０分間２０．００Ｏ
ｒｐｍの遠心分離法で分離される。上澄液（インターフ
ェロン活性なし）を排棄し、沈殿を４ｘＱの８Ｍ尿素溶
液に再溶解し、Ｂｙ（ｌ容量、１０，０００分子量カッ
トのミリポア濃縮セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）に移され、室温で約１０
ｈ１２まで濃縮される。その後この濃縮物に４ｉ２の４
Ｍ尿素溶液（ｐ、ａ、）を加え、その溶液を室温で約１
００μｅまで濃縮した。１〜３！Ｑの蒸留水を加え、そ
の溶液を再度２０μＱ容量まで濃縮し、次いで２０μｇ
のＳＤＳ試料電気泳動緩衝液と混合した。得られた溶液
の２０μｅを下記の“ＳＤＳ ＰＡＧＥ”の項に記載の
特性決定に用いた。
ェロン含有溶出液は、水浴中で０℃に予め冷却された２
０ｚ（７のステンレス鋼製管に移される。１５分後、沈
殿が生成する。この沈殿を４℃で２０分間２０．００Ｏ
ｒｐｍの遠心分離法で分離される。上澄液（インターフ
ェロン活性なし）を排棄し、沈殿を４ｘＱの８Ｍ尿素溶
液に再溶解し、Ｂｙ（ｌ容量、１０，０００分子量カッ
トのミリポア濃縮セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）に移され、室温で約１０
ｈ１２まで濃縮される。その後この濃縮物に４ｉ２の４
Ｍ尿素溶液（ｐ、ａ、）を加え、その溶液を室温で約１
００μｅまで濃縮した。１〜３！Ｑの蒸留水を加え、そ
の溶液を再度２０μＱ容量まで濃縮し、次いで２０μｇ
のＳＤＳ試料電気泳動緩衝液と混合した。得られた溶液
の２０μｅを下記の“ＳＤＳ ＰＡＧＥ”の項に記載の
特性決定に用いた。
上記の抗体アフィニティ りロマトグラフィカラムは、
次のようにして吸収された非単一特異性抗−ＰＩＦを用
いる“結合手法“にしたがって作製された。すなわち全
量で１０”１ＦＵ−ＮＯの抗インターフェロン免疫グロ
ブリン（４μｍの竿尻インターフェロン血清に相当）を
ヒト血清が結合されたセファロース４Ｂの１５０ｉｌＱ
カラムに３回吸収させ、次いでＣＩＦ−エポキシセファ
ロースカラムに４回吸収させ次いで下記“抗インターフ
ェロンの吸収。
次のようにして吸収された非単一特異性抗−ＰＩＦを用
いる“結合手法“にしたがって作製された。すなわち全
量で１０”１ＦＵ−ＮＯの抗インターフェロン免疫グロ
ブリン（４μｍの竿尻インターフェロン血清に相当）を
ヒト血清が結合されたセファロース４Ｂの１５０ｉｌＱ
カラムに３回吸収させ、次いでＣＩＦ−エポキシセファ
ロースカラムに４回吸収させ次いで下記“抗インターフ
ェロンの吸収。
の項と５ｃａｎｄ、 １ｍｍｕｎｏ１．８．４２９−４
３６ （１９７８）とに記載のＣＩＦ ＣＨで活性化さ
れたセファロース４Ｂに２回吸収させた。免疫グロブリ
ンは、最終的にはポリーＬ−リジンーセツァロース カ
ラムに１回吸収させ、次いでツヤビーン トリプシン阻
害剤−セファロース カラムに２回吸収させた。
３６ （１９７８）とに記載のＣＩＦ ＣＨで活性化さ
れたセファロース４Ｂに２回吸収させた。免疫グロブリ
ンは、最終的にはポリーＬ−リジンーセツァロース カ
ラムに１回吸収させ、次いでツヤビーン トリプシン阻
害剤−セファロース カラムに２回吸収させた。
ナマルバ インターフェロンのブルーデキストラン り
ロマトグラフィからの溶出液を２分した。
ロマトグラフィからの溶出液を２分した。
その一方を下記のＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動法に用いた
。
。
２５０．０ＯＯＩＦＵのものを、前記の吸収させた抗体
カラムに負荷して結果を第８図に示した。洗浄水中には
インターフェロンは全く認められなかった。インターフ
ェロンは、通常どおりＩ）Ｈを２．４に下げて溶離され
、２３５，０ＯＯＩＦＵ （０，１％ＳＤＳの存在下で
収集）が回収された。この溶出液を上記のようにして濃
縮しさらにＳＤＳ ＰＡＧＥで試験しｎ０ＳＤＳ ＰＡ
ＧＥ ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動法は前記“原料及び方法”の
項に記載したのと同様にして行った。純ヒト白血球イン
ターフェロン蛋白の電気泳動法による染色スラブを第１
図に示した。第２図は、他の実験で得た染色スラブと染
色していない平行したゲルストリップから溶離した対応
するインターフェロン活性とを図式的に示したものであ
る。この２つの図から、この２つの実験間のすぐれた再
現性は明らかであり、２０，１００と２０．１８０との
差は実験精度の範囲内である。前記のごとく、その生物
学的ピークは正確にそれら蛋白類と一致している。第１
図から、そのインターフェロン製剤が完全に純品である
ことはＳＤＳ ＰＡＧＥによつて明らかである。他の蛋
白のバンドは全く認められない。
カラムに負荷して結果を第８図に示した。洗浄水中には
インターフェロンは全く認められなかった。インターフ
ェロンは、通常どおりＩ）Ｈを２．４に下げて溶離され
、２３５，０ＯＯＩＦＵ （０，１％ＳＤＳの存在下で
収集）が回収された。この溶出液を上記のようにして濃
縮しさらにＳＤＳ ＰＡＧＥで試験しｎ０ＳＤＳ ＰＡ
ＧＥ ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動法は前記“原料及び方法”の
項に記載したのと同様にして行った。純ヒト白血球イン
ターフェロン蛋白の電気泳動法による染色スラブを第１
図に示した。第２図は、他の実験で得た染色スラブと染
色していない平行したゲルストリップから溶離した対応
するインターフェロン活性とを図式的に示したものであ
る。この２つの図から、この２つの実験間のすぐれた再
現性は明らかであり、２０，１００と２０．１８０との
差は実験精度の範囲内である。前記のごとく、その生物
学的ピークは正確にそれら蛋白類と一致している。第１
図から、そのインターフェロン製剤が完全に純品である
ことはＳＤＳ ＰＡＧＥによつて明らかである。他の蛋
白のバンドは全く認められない。
第９図に、純ナマルバインターフェロン蛋白類（Ａ）と
ブルーデキストランカラムから得た溶出液（Ｂ）のそれ
ぞれのＳＤＳ ＰＡＧＥ （０，９Ｘ ｌｏ’ｌＦＵ負
荷）から得た染色スラブを示す。第１図と比較すると、
純ナマルバインターフェロンのバンドは、同量用いた純
ヒト白血球インターフェロンのバンドと本質的に一致し
ていることが分かるであろう。
ブルーデキストランカラムから得た溶出液（Ｂ）のそれ
ぞれのＳＤＳ ＰＡＧＥ （０，９Ｘ ｌｏ’ｌＦＵ負
荷）から得た染色スラブを示す。第１図と比較すると、
純ナマルバインターフェロンのバンドは、同量用いた純
ヒト白血球インターフェロンのバンドと本質的に一致し
ていることが分かるであろう。
インターフェロンに し された活性を するハイブ
リドマ細胞の決定 ２月令の３匹のバルブ／ Ｃ（Ｂａ１ｂ／Ｃ）マウスを
次のような方法でヒト白血球インターフェロンで免疫に
された。
リドマ細胞の決定 ２月令の３匹のバルブ／ Ｃ（Ｂａ１ｂ／Ｃ）マウスを
次のような方法でヒト白血球インターフェロンで免疫に
された。
第１回の注射（４０，０ＯＩＦＵ）は各マウスの背中の
皮下に行った。毎週７０，０ＯＯＩＦＵを皮下注射して
免疫化を続けた。最終の注射は静脈注射がなされ、Ｎｏ
、Ｉのマウスには９週目に、Ｎｏ、２及び３のマウスに
はｌＯ０回目それぞれ行われた。
皮下に行った。毎週７０，０ＯＯＩＦＵを皮下注射して
免疫化を続けた。最終の注射は静脈注射がなされ、Ｎｏ
、Ｉのマウスには９週目に、Ｎｏ、２及び３のマウスに
はｌＯ０回目それぞれ行われた。
抗インターフェロンの生成は、マウスから得た血清試料
について、インターフェロン中和試験法を用いて測定し
た。インターフェロン中和試験を実験室的にチエツクす
るため、内部抗インターフェロンＩｇＧ製剤（部分的に
精製されたヒト白血球インターフェロン製剤をうさぎに
注射することによって生ずる）が通常含まれていた。マ
ウスから得た血清試料は、はじめの６週間、抗インター
フェロン活性を全く示さなかったがその後に顕著なイン
ターフェロン活性が見出された。
について、インターフェロン中和試験法を用いて測定し
た。インターフェロン中和試験を実験室的にチエツクす
るため、内部抗インターフェロンＩｇＧ製剤（部分的に
精製されたヒト白血球インターフェロン製剤をうさぎに
注射することによって生ずる）が通常含まれていた。マ
ウスから得た血清試料は、はじめの６週間、抗インター
フェロン活性を全く示さなかったがその後に顕著なイン
ターフェロン活性が見出された。
第１表 ＩＦＵ−ＮＵ／ｍｃ
マウス番号 ７週目 ８週目 ９週目
１０週目
１２Ｏ０〜２５００
５〜１０
最後の注射をしてから２〜４日後に、マウスの背中を切
開して殺し、その牌臓を殺菌条件下に取出した。各膵臓
をＰＢＳ中で均質化した後、その均質化された細胞の懸
濁液を遠心分離管に移し、４℃で５分間、１７０Ｇで遠
心分離した。その細胞をＰＢＳ中に再び懸濁させ２回目
の遠心分離を行った後、血清を含まなイＤＭＥＭ （約
０．５＋＋＋ｆ）／ｌ−？！臓）中に再び懸濁させた。
開して殺し、その牌臓を殺菌条件下に取出した。各膵臓
をＰＢＳ中で均質化した後、その均質化された細胞の懸
濁液を遠心分離管に移し、４℃で５分間、１７０Ｇで遠
心分離した。その細胞をＰＢＳ中に再び懸濁させ２回目
の遠心分離を行った後、血清を含まなイＤＭＥＭ （約
０．５＋＋＋ｆ）／ｌ−？！臓）中に再び懸濁させた。
細胞の全量は、Ｎｏ、ｌマウスでは１０ｓ、 Ｎｏ、２
トＮｏ、３マウスｔ：にイずれもＱ、３ｘ ｌｏ’テあ
った。その生育性（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）−は約８５〜
９０％であった。
トＮｏ、３マウスｔ：にイずれもＱ、３ｘ ｌｏ’テあ
った。その生育性（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）−は約８５〜
９０％であった。
下記の方法でポリエチレングリコールで処理することに
よって、各マウスから得た膵臓細胞懸濁液を、次ノヨう
ナシかｔ：、 テ１０７ノＸ６３Ａｇ８ （ＨＰＲＴ−
）骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ）と融合させ
た。すなわち１０８のマウス膵臓細胞と１０７８−アザ
グアニン−耐性骨髄腫細胞（Ｘ６３Ａｇ８ ： ＮＳＩ
／１Ａｇ４−１ ；ＳＰ２１０−Ａｇ１４）とを、５Ｏ
ｘ（ｌのコニカル プラスチック遠心分離管（フアシヨ
ン２０７０）に入れて混合した。この分離管を血清を含
まないＤＭＥλ１で満たし、４℃で１０分間、１７０〜
２００Ｇで遠心分離した。上澄液を注意深く除去し、次
いで３７℃において、温度が３７℃の５０％ポリエチレ
ンゲルコール溶液の０．７ｍＱを、ゆるやかに回転しな
がら１分間かけて滴下して加えた。３７℃で９０秒間保
温した後、温かい血清を含まぬＤＭＥＭの１５ｍＱをき
わめてゆっくり添加した（１〜２分間で）。その後、そ
の混合物を１０分間２００Ｇで遠心分離し、その細胞ペ
レットをコスタ−トレイ（Ｃｏｓｔａｒ ｔｒａｙ）
（こ接種するため５０ｍＱの完全ＤｈｌＥＭ −Ｆｅ２
中に懸濁させた。
よって、各マウスから得た膵臓細胞懸濁液を、次ノヨう
ナシかｔ：、 テ１０７ノＸ６３Ａｇ８ （ＨＰＲＴ−
）骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ）と融合させ
た。すなわち１０８のマウス膵臓細胞と１０７８−アザ
グアニン−耐性骨髄腫細胞（Ｘ６３Ａｇ８ ： ＮＳＩ
／１Ａｇ４−１ ；ＳＰ２１０−Ａｇ１４）とを、５Ｏ
ｘ（ｌのコニカル プラスチック遠心分離管（フアシヨ
ン２０７０）に入れて混合した。この分離管を血清を含
まないＤＭＥλ１で満たし、４℃で１０分間、１７０〜
２００Ｇで遠心分離した。上澄液を注意深く除去し、次
いで３７℃において、温度が３７℃の５０％ポリエチレ
ンゲルコール溶液の０．７ｍＱを、ゆるやかに回転しな
がら１分間かけて滴下して加えた。３７℃で９０秒間保
温した後、温かい血清を含まぬＤＭＥＭの１５ｍＱをき
わめてゆっくり添加した（１〜２分間で）。その後、そ
の混合物を１０分間２００Ｇで遠心分離し、その細胞ペ
レットをコスタ−トレイ（Ｃｏｓｔａｒ ｔｒａｙ）
（こ接種するため５０ｍＱの完全ＤｈｌＥＭ −Ｆｅ２
中に懸濁させた。
各融合物から得た、１ｍＱづつの４８個の培養物をコス
タ−トレイに接種した（２つのトレイ×２４孔／禅臓＝
４８培養物／マウス）。１０〜１５日後、Ｎ００１マウ
スの２１個の培養物に生育か認められ、Ｎｏ、２マウス
の培養物については生育が認められず、Ｎｏ、３マウス
については（さらに接種した後）１５０培養物に生育が
認められた。
タ−トレイに接種した（２つのトレイ×２４孔／禅臓＝
４８培養物／マウス）。１０〜１５日後、Ｎ００１マウ
スの２１個の培養物に生育か認められ、Ｎｏ、２マウス
の培養物については生育が認められず、Ｎｏ、３マウス
については（さらに接種した後）１５０培養物に生育が
認められた。
細胞を、コスタ−トレイのようにマクロファージの“フ
ィーダー層”を有する２ＳｕＱ ＮＵＮＣ瓶中の５ｍ
ｆ２の培養物中に移した。培地の取替え時、上澄液が得
られ、これら濃厚な培養物から得た細胞を液体窒素中で
凍結した。
ィーダー層”を有する２ＳｕＱ ＮＵＮＣ瓶中の５ｍ
ｆ２の培養物中に移した。培地の取替え時、上澄液が得
られ、これら濃厚な培養物から得た細胞を液体窒素中で
凍結した。
Ｎｏ、１マウスから得た個々の培養物の上澄液について
、インターフェロン中和試験法を用いて陽性クローンの
検出を行った。この方法によって、一つの陽性クローン
が、非常に低い力価（約２〜３１ＦＵ−Ｎｕｔ／ｆｆ１
２）であるのが見出された。
、インターフェロン中和試験法を用いて陽性クローンの
検出を行った。この方法によって、一つの陽性クローン
が、非常に低い力価（約２〜３１ＦＵ−Ｎｕｔ／ｆｆ１
２）であるのが見出された。
約１０６１ＦＩＪ単位のものを約５ｙｔＱに濃縮し、Ｉ
’ＢＳに対し１０℃で一夜透析した。２匹のうさぎに、
それぞれ、この方法で作製したｌ０１ｌｌＦＵのものを
皮下注射した。
’ＢＳに対し１０℃で一夜透析した。２匹のうさぎに、
それぞれ、この方法で作製したｌ０１ｌｌＦＵのものを
皮下注射した。
この注射を２週間毎に繰返し、抗体の生成は下記第２表
から明らかである。
から明らかである。
第２表 ［中和単位（ＩＦＵ−ＮＯ） ］産
ＳＤＳ ＰＡＧＥによって特徴づけられる、前記タンデ
ム アフィニティ クロマトグラフィから得られた溶出
液を次に示すように、うさぎの免疫に使用した。
ム アフィニティ クロマトグラフィから得られた溶出
液を次に示すように、うさぎの免疫に使用した。
注
表中の数値は抗インターフェロンの力価（ｌ ＦＲ−Ｎ
Ｕ／Ｍ（１）を示す。
Ｕ／Ｍ（１）を示す。
ＳＤＳ ＰＡＧＥから切り取った純染色インターフェロ
ン免疫化は、本願明細書第１４頁記載の方法にしたがい
、直接、免疫抗原性の製剤として、細切されたインター
フェロンを含有しく及び部分的に洗浄され脱色された）
ゲル懸濁液を用いて行った。
ン免疫化は、本願明細書第１４頁記載の方法にしたがい
、直接、免疫抗原性の製剤として、細切されたインター
フェロンを含有しく及び部分的に洗浄され脱色された）
ゲル懸濁液を用いて行った。
Ｎｏ、３のうさぎを１８，４００±２００ダルトン種で
免疫にし、他のＮｏ、４のうさぎは２０，１００±２０
０ダルトン種で免疫にした（１５週後に死亡）。第３表
に示すごとくよい結果が得られた。
免疫にし、他のＮｏ、４のうさぎは２０，１００±２０
０ダルトン種で免疫にした（１５週後に死亡）。第３表
に示すごとくよい結果が得られた。
第３表 （中和単位）
注：表中の数値の単位はＩＦＵ−ＮＵ／ｍｃ上記二つの
種の抗原決定因子が同一であることを示すために、下記
の交差中和実験を行った。
種の抗原決定因子が同一であることを示すために、下記
の交差中和実験を行った。
インターフェロン蛋白を、前記方法によって、１８．４
００±２００ダルトン種のＳＤＳ ＰＡＧＥバンドと２
０．１００±２００ダルトン種のＳＤＳ ＰＡＧＥとか
ら溶離し、次いでこの２つの種の５〜ｌ０ＩＦＵを含有
する溶液を作製した。この２つの種からの抗インターフ
ェロン溶液は前記のようにしてうさぎ中で作製され、合
計２０１ＦＵ／ＮＯ／ｘＩ２含有するように希釈した。
００±２００ダルトン種のＳＤＳ ＰＡＧＥバンドと２
０．１００±２００ダルトン種のＳＤＳ ＰＡＧＥとか
ら溶離し、次いでこの２つの種の５〜ｌ０ＩＦＵを含有
する溶液を作製した。この２つの種からの抗インターフ
ェロン溶液は前記のようにしてうさぎ中で作製され、合
計２０１ＦＵ／ＮＯ／ｘＩ２含有するように希釈した。
ｌ０ＩＦＵのＩｇ、４００ダルトンのインターフェロン
種とｌ０ＩＦＵの２０，１００ダルトンのインターフェ
ロン種をそれぞれ含有する純インターフェロン種のｌｘ
（！づつに、１８．４００ダルトン種の抗インターフェ
ロンの溶液１ＩＩ１１２と２０，１００ダルトン種の抗
インターフェロンの容器１ｍＱを可能なすべての組合わ
せでそれぞれ混合した。すなわち各々の種の抗インター
フェロンは別々に、両者の種のインターフェロンと混合
した。
種とｌ０ＩＦＵの２０，１００ダルトンのインターフェ
ロン種をそれぞれ含有する純インターフェロン種のｌｘ
（！づつに、１８．４００ダルトン種の抗インターフェ
ロンの溶液１ＩＩ１１２と２０，１００ダルトン種の抗
インターフェロンの容器１ｍＱを可能なすべての組合わ
せでそれぞれ混合した。すなわち各々の種の抗インター
フェロンは別々に、両者の種のインターフェロンと混合
した。
３７℃で１時間後、残っているインターフェロン活性を
通常のインターフェロン滴定法で測定した（前記“原料
と方法”の項参照）。いずイ１もインターフェロン活性
は見出されなかった。すなわち１８，４００±２００ダ
ルトン種と２０．１００±２００ダルトン種のそれぞれ
に、抗−Ｈ！、４００±２００ダルトン種と抗−２０，
１００±２００ダルトン種をそれぞれ別個に混合するか
またこれとは逆に該抗インターフェロンを混合するとイ
ンターフェロンは検出されなかった。
通常のインターフェロン滴定法で測定した（前記“原料
と方法”の項参照）。いずイ１もインターフェロン活性
は見出されなかった。すなわち１８，４００±２００ダ
ルトン種と２０．１００±２００ダルトン種のそれぞれ
に、抗−Ｈ！、４００±２００ダルトン種と抗−２０，
１００±２００ダルトン種をそれぞれ別個に混合するか
またこれとは逆に該抗インターフェロンを混合するとイ
ンターフェロンは検出されなかった。
換言すれば完全中和が起ったのである。それ故に、この
２つのインターフェロン種は同一の抗原決定因子を示し
ていると結論することができる。このことは、抗１８．
４００±２００ダルトン種が両インターフェロン種を精
製用の単一特異性抗体として使用しうろこと、また抗−
２０，１００±２００ダルトン種及びこの２つの種の混
合物についても同様であることを意味する。同じ仕方で
行った他の実験は、６つの生物学的ピークの各々が、２
つの主要な種に対して生じた各抗血清によって完全に中
和されるということを示した。
２つのインターフェロン種は同一の抗原決定因子を示し
ていると結論することができる。このことは、抗１８．
４００±２００ダルトン種が両インターフェロン種を精
製用の単一特異性抗体として使用しうろこと、また抗−
２０，１００±２００ダルトン種及びこの２つの種の混
合物についても同様であることを意味する。同じ仕方で
行った他の実験は、６つの生物学的ピークの各々が、２
つの主要な種に対して生じた各抗血清によって完全に中
和されるということを示した。
ナマシ／＜ ＳＤＳ ＰＡＧＥから単離され乙２つの
主要な稲が同様の結果を与えるだろうということ、換言
すればこの２つの主要な種も交差反応を行い、抗原性に
ついてはＨｕＬｅｌＦと同一であることを示すであろう
ということか分かる（抗原性及び分子量については、Ｈ
ｕＬｅｌＦ １８，４００±２００とナマルバ１８．４
００±２００並びにＨｕＬｅｌＦ ２０，１００±２０
０とナマルバ２００．１００±２００はそれぞれ同一で
ある）。
主要な稲が同様の結果を与えるだろうということ、換言
すればこの２つの主要な種も交差反応を行い、抗原性に
ついてはＨｕＬｅｌＦと同一であることを示すであろう
ということか分かる（抗原性及び分子量については、Ｈ
ｕＬｅｌＦ １８，４００±２００とナマルバ１８．４
００±２００並びにＨｕＬｅｌＦ ２０，１００±２０
０とナマルバ２００．１００±２００はそれぞれ同一で
ある）。
第３図に示した６つの染色された蛋白のバンドの各々に
ついて抗ウィルス活性を測定した。ゲルを２つのスロッ
トに充填し両者とも染色した。１つのスロットの染色さ
れたバンドを第３図のＡに示した。他方のスロットは短
時間脱色しく５０％メタノール、４５％Ｈｔ Ｏ＊、５
％酢酸中で）、湿潤ゲル中のインターフェロン蛋白の正
確な位置を記録し、そのゲルを水で洗い、その後第３図
Ｂに示したごとくスライスしｒこ。ゲルスライスの番号
を第３図のＣに示した。また、各インターフェロン蛋白
バンドを、隣接するものと混合することなく、ゲルから
正確に切り取った。各スライスを“原料及び方法”の項
に記載したのと同じ方法で溶離し、“原料及び方法”の
項に記載の通常のインターフェロン滴定法を用いその生
物学的プロファイルを第３図に示した。ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅから切り取って溶離された６つの種の各々の中和活性
を抗白血球インターフェロンに対して調べたがすべての
種が同じ抗血清によって完全に中和されることが見出さ
れた。
ついて抗ウィルス活性を測定した。ゲルを２つのスロッ
トに充填し両者とも染色した。１つのスロットの染色さ
れたバンドを第３図のＡに示した。他方のスロットは短
時間脱色しく５０％メタノール、４５％Ｈｔ Ｏ＊、５
％酢酸中で）、湿潤ゲル中のインターフェロン蛋白の正
確な位置を記録し、そのゲルを水で洗い、その後第３図
Ｂに示したごとくスライスしｒこ。ゲルスライスの番号
を第３図のＣに示した。また、各インターフェロン蛋白
バンドを、隣接するものと混合することなく、ゲルから
正確に切り取った。各スライスを“原料及び方法”の項
に記載したのと同じ方法で溶離し、“原料及び方法”の
項に記載の通常のインターフェロン滴定法を用いその生
物学的プロファイルを第３図に示した。ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅから切り取って溶離された６つの種の各々の中和活性
を抗白血球インターフェロンに対して調べたがすべての
種が同じ抗血清によって完全に中和されることが見出さ
れた。
第３図のインターフェロンの回収率が、予め染色せずに
行う通常の“ＳＤＳ ＰＡＧＥ溶離” （１８，４０
０±２００ダルトン種を除く）と比べてむしろ低かった
（２０％）ということは、はとんどのインターフェロン
種の生物学的活性は、抗原性と比べて選択的に破壊され
たということを示している。抗白血球インターフェロン
に対する中和試験において、“第３図から溶離された”
インターフェロン蛋白は、天然の（粗）ヒト白血球イン
ターフェロンよりも、インターフェロン活性基準で計算
して３〜５倍も有効に抗白血球インターフェロンを中和
することができた。このことは生物学的活性に応答しう
る決定因子が選択的に破壊されることを示している。
行う通常の“ＳＤＳ ＰＡＧＥ溶離” （１８，４０
０±２００ダルトン種を除く）と比べてむしろ低かった
（２０％）ということは、はとんどのインターフェロン
種の生物学的活性は、抗原性と比べて選択的に破壊され
たということを示している。抗白血球インターフェロン
に対する中和試験において、“第３図から溶離された”
インターフェロン蛋白は、天然の（粗）ヒト白血球イン
ターフェロンよりも、インターフェロン活性基準で計算
して３〜５倍も有効に抗白血球インターフェロンを中和
することができた。このことは生物学的活性に応答しう
る決定因子が選択的に破壊されることを示している。
非−抗ウィルス効力
純ヒト白血球インターフェロン種の非−抗ウィルス効力
を３つの系で調べた。
を３つの系で調べた。
ｌ）抗細胞活性
純インターフェロン蛋白の抗細胞活性は、第２図に示し
たＳＤＳ ＰＡＧＥ溶離フラクションから得られた純イ
ンターフェロン蛋白の１：１０００希釈物（媒体中）と
共にダウデイ細胞（Ｄａｕｄｉ ｃｅｌｌｓ）を培養し
、インターフェロンなしの対照と比べながらトリチウム
放射性標識チミジン［１，Ｈｅｒｏｎ ａｎｄ Ｋ。
たＳＤＳ ＰＡＧＥ溶離フラクションから得られた純イ
ンターフェロン蛋白の１：１０００希釈物（媒体中）と
共にダウデイ細胞（Ｄａｕｄｉ ｃｅｌｌｓ）を培養し
、インターフェロンなしの対照と比べながらトリチウム
放射性標識チミジン［１，Ｈｅｒｏｎ ａｎｄ Ｋ。
Ｂｅｒｇ、 Ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ ａｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ ａｔ
ｅｌｅｖａｔｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、 Ｎａｔ
ｕｒｅ。
ｒｆｅｒｏｎ ａｒｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ ａｔ
ｅｌｅｖａｔｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、 Ｎａｔ
ｕｒｅ。
ｍ５０８〜５１０ （１９７８） ］が相対的に低下す
るのを確認することによって研究された（第２図上部の
“％Ｇ−ビは発育阻止％を示す）。明らかなように、そ
の“抗細胞曲線゛は抗ウィルス曲線に顕著に追随してい
る。このとことは、純粋の天然のヒト白血球インターフ
ェロンの５つの種がすべて抗ウィルス活性と抗細胞活性
との両方を有することを立証したのである。それぞれの
“抗細胞性のピ−り“は“インターフェロンピーク”の
対応する大きさと直線的には変化しない。このことは多
分ダウデイ細胞系の感受性を反映している［Ｊ。
るのを確認することによって研究された（第２図上部の
“％Ｇ−ビは発育阻止％を示す）。明らかなように、そ
の“抗細胞曲線゛は抗ウィルス曲線に顕著に追随してい
る。このとことは、純粋の天然のヒト白血球インターフ
ェロンの５つの種がすべて抗ウィルス活性と抗細胞活性
との両方を有することを立証したのである。それぞれの
“抗細胞性のピ−り“は“インターフェロンピーク”の
対応する大きさと直線的には変化しない。このことは多
分ダウデイ細胞系の感受性を反映している［Ｊ。
Ｈｉｌｆｅｎｈａｕｓ、 Ｈ，Ｄａｍｍ、 Ｈ，Ｅ、
Ｋａｒｇｅｓ ａｎｄ Ｋ、 Ｅ。
Ｋａｒｇｅｓ ａｎｄ Ｋ、 Ｅ。
Ｍａｎｔｈｅｙ、 Ｇｒｏｗｔｈ １ｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ ｏｆｈｕｍａｎｌｙｏ＋ｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ
Ｄａｕｄｉ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、 Ａｒ
ｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５１．８７−９７ （１９７６
）コ。１９，５００ダルトンにおける小さなインターフ
ェロンピークはその抗細胞曲線に対応するピークを生じ
なかった。しかし、希釈度がｌ。
ｎ ｏｆｈｕｍａｎｌｙｏ＋ｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ
Ｄａｕｄｉ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、 Ａｒ
ｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５１．８７−９７ （１９７６
）コ。１９，５００ダルトンにおける小さなインターフ
ェロンピークはその抗細胞曲線に対応するピークを生じ
なかった。しかし、希釈度がｌ。
倍低い場合（１：１ＯＯ） 、抗細胞性活性の小さいが
顕著なピークが観察された（記載せず）。
顕著なピークが観察された（記載せず）。
２）リンパ球及び単核細胞上の主要組織適合性抗原（Ｍ
ＢＣ）の圧出（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。
ＢＣ）の圧出（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。
β−系ＭＨＣ（主要組織適合性抗原）の圧出が選択的に
増加することは、［１，Ｈｅｒｏｎ、 Ｍ、 Ｈｏｋｌ
ａｎｄ＆ Ｋ、 Ｂｅｒｇ （１９７ｇ）、 ”Ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒβ２ｍｉｃ
ｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ＨＬＡ ｏｎ ｈｕｍ
ａｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌｓ ｂｙ １ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
増加することは、［１，Ｈｅｒｏｎ、 Ｍ、 Ｈｏｋｌ
ａｎｄ＆ Ｋ、 Ｂｅｒｇ （１９７ｇ）、 ”Ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒβ２ｍｉｃ
ｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ＨＬＡ ｏｎ ｈｕｍ
ａｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌｓ ｂｙ １ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
ひ−： ６２１５−６２２２ （ＰＮＡＳ胆として下記
に引用）］に記載のごとく部分的精製ヒト白血球インタ
ーフェロンを用いて観察された。２つの主要なヒト白血
球インターフェロン種（１８，４００及び２０．１００
ダルトン、第１図参照）は各々、約１００１ＦＵ／＊１
２培地の量で測定した。上記の効力は、これらの純粋な
分子種を用いて見出されたが、一方抗ウィルス活性が記
録された領域以外のゲルスライスの溶出液は何ら効力を
示さなかった。かくして、リンパ球細胞へのＭＨＣ抗原
の圧出を選択的に増大させる効力はこのインターフェロ
ン分子固有の特性であることが立証されたのである。
に引用）］に記載のごとく部分的精製ヒト白血球インタ
ーフェロンを用いて観察された。２つの主要なヒト白血
球インターフェロン種（１８，４００及び２０．１００
ダルトン、第１図参照）は各々、約１００１ＦＵ／＊１
２培地の量で測定した。上記の効力は、これらの純粋な
分子種を用いて見出されたが、一方抗ウィルス活性が記
録された領域以外のゲルスライスの溶出液は何ら効力を
示さなかった。かくして、リンパ球細胞へのＭＨＣ抗原
の圧出を選択的に増大させる効力はこのインターフェロ
ン分子固有の特性であることが立証されたのである。
３）ナチュラルキラー細胞系（ＮＫ系）の強化作用
第１０図は抗ウィルス性プロファイルを示す（第２図に
関連して記載したのと同じ仕方でＳＤＳ ＰＡＧＥで測
定）。そのゲルから得た種の各々について、そのＮＫ強
化活性はＰＮＡＳ ７５に記載の方法を用いて測定した
。下方の曲線に示された抗ウィルス活性を有するフラク
ションは、上方の曲線に示されたような増大したＮＫを
示した。一方“ベースライン“のフラクションは増大し
たＮＫを与えなかった。１本の矢印は食塩水だけの消極
的な対照例を示し、２本の矢印は、積極的な対照例とし
て用いた部分精製ヒト白血球インターフェロン（ＰＩＦ
）を示している。約１００１ＦＵの抗ウィルス単位の各
インターフェロン製剤をｘＱ当り添加した。
関連して記載したのと同じ仕方でＳＤＳ ＰＡＧＥで測
定）。そのゲルから得た種の各々について、そのＮＫ強
化活性はＰＮＡＳ ７５に記載の方法を用いて測定した
。下方の曲線に示された抗ウィルス活性を有するフラク
ションは、上方の曲線に示されたような増大したＮＫを
示した。一方“ベースライン“のフラクションは増大し
たＮＫを与えなかった。１本の矢印は食塩水だけの消極
的な対照例を示し、２本の矢印は、積極的な対照例とし
て用いた部分精製ヒト白血球インターフェロン（ＰＩＦ
）を示している。約１００１ＦＵの抗ウィルス単位の各
インターフェロン製剤をｘＱ当り添加した。
第１図は、実施例で得られたインターフェロン蛋白の電
気泳動法による染色スラブを示す平面図、第２図は同じ
く、染色スラブと染色していない平行したゲルストリッ
プから溶離した対応するインターフェロン活性を示すグ
ラフ図、第３図は、同じく染色された蛋白のバンドを示
すグラフ図、第４図は、ヒト白血球インターフェロンの
溶離パターンを例示するグラフ図、第４ａ図は同じく溶
出液のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す平面図、第５図及び第６
図は、実施例のインターフェロンのゲル濾過曲線を示す
グラフ図、第７図は、ナマルバインターフェロンのプル
ープキストラ・ンクロマトグラムを例示するグラフ図、
第８図は、同じくブルーデキストランクロマトグラムの
画分の電気泳動による分離グラフ図、第９図は、純ナマ
ルバインターフェロン蛋白類（Ａ）とその溶出液（Ｂ）
から得た染色スラブを示す平面図、第１Ｏ図は、抗ウィ
ルス性のプロファイルを示すグラフ図である。
気泳動法による染色スラブを示す平面図、第２図は同じ
く、染色スラブと染色していない平行したゲルストリッ
プから溶離した対応するインターフェロン活性を示すグ
ラフ図、第３図は、同じく染色された蛋白のバンドを示
すグラフ図、第４図は、ヒト白血球インターフェロンの
溶離パターンを例示するグラフ図、第４ａ図は同じく溶
出液のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す平面図、第５図及び第６
図は、実施例のインターフェロンのゲル濾過曲線を示す
グラフ図、第７図は、ナマルバインターフェロンのプル
ープキストラ・ンクロマトグラムを例示するグラフ図、
第８図は、同じくブルーデキストランクロマトグラムの
画分の電気泳動による分離グラフ図、第９図は、純ナマ
ルバインターフェロン蛋白類（Ａ）とその溶出液（Ｂ）
から得た染色スラブを示す平面図、第１Ｏ図は、抗ウィ
ルス性のプロファイルを示すグラフ図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ナトリウムドデシルスルファートポリアクリルアミ
ド傾斜電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）染色条件下０．９×
１０＾６ＩＦＵの全インターフェロン負荷で、１８，４
００と２０，１００ダルトンに抗ウィルス性インターフ
ェロン活性を有する２つの主要なシャープな染色蛋白バ
ンド、２０，３００と２０，４００ダルトンの間に、抗
ウィルス性インターフェロン活性を有する次位の染色蛋
白バンド並びに、１９，５００、２１，１３０及び２３
，４４０ダルトンに抗ウィルス性の小さなピークを示し
（但し、上記ダルトン分子量の実験精度は±２００ダル
トンである）、該ＳＤＳＰＡＧＥアクリルアミドグラジ
エントが本質的に他の染色蛋白バンドを示さないもので
あるヒトＬｅ型インターフェロン蛋白の免疫学的決定子
に対してのみ実質的に生ずるか又は指向した抗体。 ２、ナトリウムドデシルスルファートポリアクリルアミ
ド傾斜電気泳動染色条件下３．８×１０＾６ＩＦＵの全
インターフェロン負荷で、抗ウィルス性インターフェロ
ン活性を有する６つの染色蛋白バンド、すなわち１８，
４１０と２０，１８０ダルトンに強いバンド、２０，４
２０ダルトンに中程度の強いバンド、及び１９，５００
、２１，１３０と２３，４４０ダルトンに見える程度の
バンド（ダルトン分子量の実験精度は±２００ダルトン
）を示し、抗ウィルス性インターフェロン活性のピーク
は正確に染色蛋白バンドに一致し、かつ該ＳＤＳＰＡＧ
Ｅアクリルアミドグラジエントが本質的に他の染色蛋白
バンドを示さないヒトＬｅ型インターフェロン蛋白の免
疫学的決定子に対してのみ実質的に生ずるか又は指向し
たものであることを更に特徴とする請求の範囲１記載の
抗体。 ３、ヒトＬｅ型インターフェロン蛋白が請求の範囲１又
は２記載の蛋白の成分である抗ウィルス性インターフェ
ロン活性を有する蛋白の何れか１つ又は混合物である請
求の範囲１又は２記載の抗体。 ４、免疫しうる動物を、１８，４００±２００ダルトン
もしくは２０，１００±２００ダルトン又はこれらの組
合せである請求の範囲１または２記載の蛋白のヒトＬｅ
型インターフェロン蛋白成分で免疫にして得られる請求
の範囲３記載の抗体。 ５、免疫しうる動物に請求の範囲１〜４の何れかに記載
のヒトＬｅ型インターフェロン蛋白を免疫させ、その動
物から抗血清を得ることからなる請求の範囲１〜４の何
れかに記載の抗体の製造法。 ６、免疫に使用されるヒトＬｅ型インターフェロン蛋白
が、ナトリウムドデシルスルファートポリアクリルアミ
ド傾斜電気泳動から切り取った１つのバンド又は複数の
バンドから得たものである請求の範囲５記載の方法。 ７、該バンドが、ナトリウムドデシルスルファートポリ
アクリルアミド傾斜電気泳動のゲルを染色し、次いで蒸
留水で短時間洗浄した後切り取られる請求の範囲６記載
の方法。 ８、免疫が該インターフェロン蛋白の安定化水溶液で行
われ、安定化水溶液中の安定剤がドデシル硫酸ナトリウ
ムである請求の範囲５〜７の何れかに記載の方法。 ９、該インターフェロン蛋白の安定化水溶液がリン酸塩
緩衝液でｐＨ約７．２に緩衝化されている請求の範囲８
記載の方法。 １０、該安定化水溶液が、アジュバントを含む請求の範
囲８又は９記載の方法。 １１、アジュバントがフロイントのアジュバントである
請求の範囲１０記載の方法。 １２、ハイブリドマセルクローン［骨髄腫細胞系（×６
３Ａｇ８；ＮＳＩ／１Ａｇ４−１；ＳＰ２／０−Ａｇ１
４）から誘導］を培養し、請求の範囲１〜４の何れかに
記載のヒトＬｅ型インターフェロンの免疫学的決定子に
指向した抗体を産生し、培養液から前記抗体を回収する
ことからなる請求の範囲１〜４の何れかに記載の抗体の
製法。 １３、請求の範囲５〜１２の何れかに記載の方法で作ら
れた抗体。 １４、マトリックスに固定化されている請求の範囲１〜
４又は１３の何れかに記載の抗体。 １５、マトリックスに共有結合された請求の範囲１４記
載の抗体。 １６、マトリックスがセファロース４Ｂのような架橋ア
ガロースである請求の範囲１５記載の抗体。 １７、蛋白分解性酵素活性を減少すべく処理された請求
の範囲１４〜１６の何れかに記載のマトリックスに固定
化された抗体。 １８、酵素阻害剤又は酵素破壊剤で処理されてなる請求
の範囲１７記載の抗体。 １９、酵素阻害剤又は酵素破壊剤での処理が、マトリッ
クスに固定化された酵素阻害剤又は酵素破壊剤で行われ
た請求の範囲１８記載の抗体。 ２０、マトリックスに共有結合させる前に、マトリック
ス固定化されたポリＬ−リジン及び／又は大豆トリプシ
ン阻害剤及び／又はカリクレイン不活性化剤のカラムを
通過された請求の範囲１９記載の抗体。 ２１、ヒトＬｅ型インターフェロン含有溶液の精製への
請求の範囲１〜４又は１３〜２０の何れかに記載の抗体
の使用。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK1645/79 | 1979-04-20 | ||
| DK164579 | 1979-04-20 | ||
| DK791/80 | 1980-02-22 | ||
| DK79180 | 1980-02-22 | ||
| DK1484/80 | 1980-04-02 | ||
| DK148480 | 1980-04-02 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55500974A Division JPH0742317B2 (ja) | 1979-04-20 | 1980-04-18 | インタ−フエロン蛋白とその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02198A true JPH02198A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0794480B2 JPH0794480B2 (ja) | 1995-10-11 |
Family
ID=27220922
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55500974A Expired - Lifetime JPH0742317B2 (ja) | 1979-04-20 | 1980-04-18 | インタ−フエロン蛋白とその製造法 |
| JP63227360A Expired - Lifetime JPH0794480B2 (ja) | 1979-04-20 | 1988-09-08 | 抗体及びその製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55500974A Expired - Lifetime JPH0742317B2 (ja) | 1979-04-20 | 1980-04-18 | インタ−フエロン蛋白とその製造法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0091543B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0742317B2 (ja) |
| AU (1) | AU539494B2 (ja) |
| CA (1) | CA1168151A (ja) |
| DE (2) | DE91543T1 (ja) |
| ES (1) | ES490697A0 (ja) |
| FI (1) | FI77877C (ja) |
| HK (1) | HK22792A (ja) |
| IE (1) | IE55791B1 (ja) |
| IL (1) | IL59880A (ja) |
| NO (1) | NO165961C (ja) |
| NZ (1) | NZ193487A (ja) |
| PT (1) | PT71111A (ja) |
| SG (1) | SG92591G (ja) |
| WO (1) | WO1980002229A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002104978A (ja) * | 2000-09-25 | 2002-04-10 | Fujirebio Inc | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| DE3005843A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| DE3177213D1 (de) | 1980-04-03 | 1990-10-18 | Biogen Inc | Dns-sequenzen, rekombinante dns-molekuele und verfahren zur herstellung von dem menschlichen fibroblast-interferon. |
| JPH0611235B2 (ja) * | 1980-04-11 | 1994-02-16 | セルテック・リミテッド | モノクロ−ナル抗体 |
| CH657141A5 (de) * | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
| FR2492842A1 (fr) * | 1980-10-24 | 1982-04-30 | Centre Nat Rech Scient | Hybride cellulaire produisant un anticorps specifique de l'interferon leucocytaire humain et procede de formation d'hybrides cellulaires producteurs d'anticorps specifiques de l'interferon humain |
| US4514507A (en) * | 1980-11-07 | 1985-04-30 | Secher David S | Assay for interferon |
| JPS58500037A (ja) * | 1980-11-07 | 1983-01-06 | セルテク リミテツド | インタ−フェロンの検定法 |
| AU561649B2 (en) * | 1981-02-27 | 1987-05-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies to proteins |
| EP0062971B1 (en) * | 1981-03-27 | 1990-03-07 | Imperial Chemical Industries Plc | Genetically modified microorganisms |
| IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
| WO1983000693A1 (en) * | 1981-08-14 | 1983-03-03 | Berg, Kurt, Frimann | SUBJECTS RELATING TO HUMAN INTEFERON-'alpha' SUBTYPE PROTEINS AND CORRESPONDING ANTIBODIES |
| US6432677B1 (en) | 1982-03-08 | 2002-08-13 | Genentech, Inc. | Non-human animal interferons |
| US5827694A (en) * | 1982-03-08 | 1998-10-27 | Genentech, Inc. | DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| JPS58201794A (ja) * | 1982-05-17 | 1983-11-24 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US5702699A (en) * | 1982-09-23 | 1997-12-30 | Cetus Corporation | Process for the recovery of lipophilic proteins |
| US4534906A (en) * | 1982-11-01 | 1985-08-13 | Genentech, Inc. | Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations |
| US5831023A (en) * | 1982-11-01 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant animal interferon polypeptides |
| DE3306060A1 (de) * | 1983-02-22 | 1984-08-23 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Neue immunglobulin-produzierende hybridzellinien, deren verwendung und verfahren zu deren herstellung |
| US5196323A (en) * | 1985-04-27 | 1993-03-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Process for preparing and purifying alpha-interferon |
| DE3515336C2 (de) * | 1985-04-27 | 1994-01-20 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| DE3607835A1 (de) * | 1986-03-10 | 1987-09-24 | Boehringer Ingelheim Int | Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung |
| EP0490233A1 (de) * | 1986-03-10 | 1992-06-17 | BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH | Monoclonale Antikörper gegen BgIII-Hybridinterferone, deren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE3633323A1 (de) * | 1986-10-01 | 1988-04-07 | Boehringer Ingelheim Int | Neue monoklonale antikoerper gegen ifn-omega, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung zur reinigung sowie zum nachweis von ifn-omega |
| US5391713A (en) * | 1989-06-20 | 1995-02-21 | Bionative Ab | Interferon purification process |
| SE468251B (sv) | 1989-06-20 | 1992-11-30 | Bionative Ab | Reningsprocess foer interferon |
| ATE179330T1 (de) * | 1992-02-10 | 1999-05-15 | Interferon Sciences Inc | Verbesserte alpha-interferon-zusammensetzung und verfahren zu ihrer herstellung aus leukocyten des menschlichen peripheren blute |
| US5676942A (en) * | 1992-02-10 | 1997-10-14 | Interferon Sciences, Inc. | Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof |
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2351665A1 (fr) * | 1976-05-21 | 1977-12-16 | Elf Aquitaine | Procede de purification de preparations possedant notamment une activite interferon, preparations purifiees ainsi obtenues et leur application en tant que medicament |
| NL7703281A (nl) * | 1977-03-25 | 1978-09-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het bereiden van interferon. |
| FR2389380B1 (ja) * | 1977-05-02 | 1980-02-29 | Anvar | |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| EP0032134B2 (en) * | 1980-01-08 | 1993-10-13 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human interferon-alpha like polypeptides |
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
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-
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002104978A (ja) * | 2000-09-25 | 2002-04-10 | Fujirebio Inc | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
| JP4706093B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-06-22 | 富士レビオ株式会社 | パルボウイルスの除去方法及び精製方法 |
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