JPH04505614A - タンパク質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分子、細胞外液から得られるその高分子を精製することによる調整法、その高分 子を含んでなる製剤、およびその高分子に特異的な抗原決定基に対する抗体に関 する。 背景技術 従来、優れた運動能および比較的直線性の継続的運動能を有する精子だけが、受 精にあずかる可能性があること、ならびに最良の形態を有する精子だけが子宮頚 粘液に侵入することが知られている（Ｆｒｅｄｅｉｃａｓｓｏｎ　Ｂ、およびＢ Ｊｏｒｋ　Ｇ、　（１９７７）　：　ｒ子宮頚の分泌における性交後の精子の形 態とその臨床的意義（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆｐｏｓｔｃｏｉｔａｌ　ｓｐ ｅｒｍａｔｏｚｏａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎａ ｎｄ　ｉｔｓ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｃｅ　）　Ｊ　Ｆｅｒ ｔｌ、　５ｔｅｒｉｌ。 ２８　：　８４１−８４５）。また、血精が精子の運動能を補強することＣＡｕ ５ｔｉｎ　Ｒ，（１９８５）　ｒ男女の生殖管での精子の成熟（Ｓｐｅｒｍ　ｍ ａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｌｅ　ａｎｄｆｅｍａｌｅ　ｇｅｎｉ ｔａｌ　ｔｒａｃｔｓ　）　、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉ 、ｏｎ。 Ｖｏｌ、２、ＣＭｅｔｚおよびＡ　Ｍｏｎｒｏｙ編集、ｐｐ、１２１−１４７、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、したかって、血精が 生体外受精のための精子の分離と関連して使用されることも知られている。 しかし、極めて多くの成分を含む体液を使用することにかかわる数々の問題があ り、より特異的な活性成分があれば、体液よりも、さらに安全かつ予想可能な効 果が得られるであろう。活性因子は、危険な付随作用、例えば、各種の免疫学的 因子またはさまざまな感染症と無縁の効果も得られるてあろう。 発明の開示 受精に関する研究の途上で、例えば、精子の運動能試験のだめの生体外での標準 化されたモデル系が開発され、運動能および生存力のある精子のさらに均一な集 団を得たり、精液のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）含有量およびその特異的継続 的運動能（ＳＰ、Ｍ）が解析されるよう（二なった〔入ｋｅｒｌｏｆ　ＩＥ、、 　Ｆｒｅｄｒｉｃｓｓｏｎ　Ｂ、、　ＧｕｓｔａｆｓｏｎＯ，、Ｌｕｎｄｉｒｉ 　Ａ、、Ｌｕｎｅｌｌ　Ｎ−０，、Ｎｙｌｕｎｄ　Ｌ、、ＲｏｓｅｎｂｏｒｇＬ 、およびＰＯＵＳｅｔｔｅ＾、（１９８７）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ａｎｄｒｏｌ。 ｔｏ、６６３−６６９．ならびにＰｏｕｓｅｔｔｅ人、、　ＡｋｅｒｌＯｆＥ、 、　Ｌｕｎｄｉｎ　Ａ、、　Ｒｏｓｅｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＦｒｅｄｉｃｓｓ ｏｎ　Ｂ。 （１９８６）ｉｎｔ、Ａｎｄｒｏｌ、９，３３１−３４０）。 上記の標準化モデル系は、受精が起こるに必要な精液に運動能を与える１種また は数種の因子を見い出すため２００．０００ダルトンの高分子によって活性化さ れることを見いだした。 子量は、この発明の好ましい実施態様によれば、約１８０．０００ダルトンであ る。 この発明の更に好ましい実施態様では、等ｔｐ、が約５．１の、アルブミンを含 むタンノくり坤高分子が開示されている。；／ｌ島＋＋坪わ傷９７７７　＋ｔｌ すｔ子すこ〈Ｈ系６λ呻、ρり′ルハｄ・うλこの発明の高分子は、実質的に均 質であって、細胞外液、特には動物またはヒトの血精から得られる。 このタンパク性高分子は、動物またはヒトの細胞外液から精製されるものの、好 ましい実施態様によればヒトの血精から精製されることが好ましい。 他の好ましい実施態様では、約５．１の等電点を持ちアポリポプロティンＡＩ、 免疫グロブリンおよびアルブミンを含むタンパク性高分子は、イオン交換クロマ トグラフィー、クロマトフオーカシング、タンノ（り質用高速液体クロマトグラ フィーおよびアフィニティークロマトアポリボプロティンＡ１．免疫グロブリン およびア／Ｌ）゛ミンを含むタンパク性高分子は、イオン交換クロマトグラフィ ー、クロマトフオーカシング、タンノくり質用高速液体クロマトグラフィーおよ びアフィニティークロマトグラフィーからなる４工程の精製法によって調製され る。 さらに別の好ましい実施態様では、精液の運動能は、各車−の精製工程ごとに調 べられる。 また、この発明は、実質的に精製され、約２００．０００ダルトンの分子量を持 ち、精液の運動能を活性化するタンパク性高分子と、適切な医薬品添加物とから なる製剤に関する。 適切な医薬品添加物の例としては、培地または他の塩類溶液が挙げられる。 この製剤は、それ自体既知の方法に従って調製される。 この発明の製剤は、不妊症の治療、好ましくは生体外で使用される。 既知の標準試料に対して比較する方法に関する。 また、この発明は、この発明の高分子に対して特異的な抗原決定基に対する抗体 、好ましくは、それ自体既知の方法で免疫処理することによって得られるポリク ロ−することによって授精を防止する手段としても使用される。 ５ＰＡＰは、男性の血液ドナーから得られた血清から精製され、５６℃で３０分 間インキュベーションされてから、使用時まで一２０℃で保存されたものである 。 この発明の一つの実施態様では、精製法は、３工程で行われ、はぼ等モル量のア ポリボプロティンＡＩ、免疫グロブリンおよびアルブミンを含み、約２００，０ ００ダルトン以上、正確には約２５０．０００の分子量および約５．１の等電点 を持つ高分子であることが判明した。 上記の工程は以下のとおりである。 １、ＤＥＡＥ−セファ０−ス■上てのイオン交換クロマトグラフィー、およびＮ ａＣ１の直線濃度勾配（θ〜０、　２５ｍｏｌ　／　１） ２、　開始緩衝液としてヒスチジン−ＭＣＩを使ってＰＢＥＴＭ上でのクロマト フオーカシング。その際のｐＨ間隔は、６．０〜４．０であった。 ３、　分子量に応じた分離をともなう、２本のセファロース０１２ＨＲ１０／３ ０カラム（直列）タンパク質用高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ■、ファ ルマシア）。 この発明のさらに好ましい実施態様によれば、ブルーセファロース０上でのアフ ィニティークロマトグラフィる　５ＰＡＰが得られる。 各精製ステップ毎に精液分画中の精液運動能の産生を追跡するために、その調製 物を特異的継続的運動能（ＳＰＭ）試験およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。 アポリボプロティンＡ１および免疫グロブリンを含む高分子の調製には、イオン 交換（ＤＥＡＥ−セファロース■）クロマトグラフィー、クロマトフオーカシン グ、排除ＦＰＬＣｏ（約２５０ｋＤの分子量に相当する溶トコールが使用された 。濃度２０〜７０　ｎｍｏｌ／　Ｉの純粋なタンパクは、血精と同じ程度まで、 その運動能を活性化した。 非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動では、分子量約１８０ ｋＤに相当するバンドか示された。メルカプトエタノールの存在下、ブルーセフ ァロースの工程にかけた後の分画では、５０ｋＤおよび２５ｋＤに相当する２つ のバンドが得られた。ブルーセファロース■の工程を行わない場合、より大きな 成分として非還元複合体が溶出し、次の工程におけるＳＤＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動の後、さらに約６７ｋＤのところにバンドが現れた。これによって 、この分子がアルブミンと複合している状態にあり、このアルブミンはブルーセ ファロース■の工程で除去されることが示唆された。このブルーセファロース■ での溶出物をアミノ酸配列分析にかけると、３種類のタンパク質鎖、すなわち、 アポリボプロティンＡＩ鎖、免疫グロブリンの長鎖および短鎖が同定された。こ れによって、調製物が、アポリポプロティンＡＩ−免疫グロブリン複合体である ことが示唆された。ウサギで作成した抗血清は、これを直接精子に添加した場合 、精液の運動能を抑制した。ヒト血清をウサギの抗血清で前処理したところ、ヒ ト血清の加熱で不活化されるが、これは、その活性が完全なタンパク質の立体配 座に依存することを示唆している。アルブミン、アポリボプロティンＡＩおよび 免疫グロブリンは、それら自体、精液の運動能に少しの影響しか与えなかった。 アポリボプロティンＡ１−免疫グロブリン複合体が精液運動能の活性化を媒介す ると考えられる。 本明細書では以下の略称を使用する。 ＡｐｏＡｌ　アポリボプロティンＡＩ ＡＴＰ　アデノシン三リン酸 Ｄ　ダルトン ＦＰＬＣ■　タンパクの高速液体クロマトグラフィーＨＥＰＥＳ　Ｎ−２−ヒド ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸 １ｇ　免疫グロブリン ＩＶＦ　生体外受精 ＭＷ　分子量 ’ＳＰＭ　特異的継続的運動能 Ｖ／Ｖ　容量／容量 図面の説明 第１Ａ図は、イオン交換（ＤＥＡＥ− セファ０−ス■）クロマトグラフィーを示す。精液を、ＤＥＡＥ−セファロース ■カラムにかけ、０〜０．２５Ｍ　ＮａＣｌ直線勾配で溶出させた。分画を集め 、吸光度を２８０ｎｍてモニターした。すへての分画のＳＰＭを測定した。精液 活性化能は、約０．２ＭＮａＣｌのところに溶出した。 第１Ｂ図は、ＰＢＥＴＭ９４上てのクロマトフオーカシングを示す。開始緩衝液 に対して透析した後、プールした分画をＰＢＥ”クロマトフオーカシングのカラ ムにかけ、ポリバッファー＠７４９Ｈ４，０を流した。分画を集め、ｐＨおよび ＳＰＭをモニターした。精液活性化能は、ｐＨ５，１のところに溶出した。 第１Ｃ図は、ＦＰＬＣ■を示す。プールした分画を透析し、凍結乾燥（水に溶解 ）し、２本のセファロース［Ｆ］１２８Ｒ１０／３０カラム（直列）上で分画し た。カラムに対して、既製の標準試料（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社 、ウプサラ、スウェーデン）を用いて検量線を作成した。各分画の一部に対して 、ＳＰＭの試験を行った。精液活性化能は、分子量約２５０ｋＤに相当するとこ ろに溶出した。 第２図は、２−メルカプトエタノールの存在下および非存在下でのＦデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示し、この泳動は、既 製のゲルおよび検量線標準物を用いて実施された。 １列目：ホスホリラーゼｂ　（９４，０００，）、アルブミン（６７，０００） 、オボアルブミン（３４，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（３０，００ ０）、トリプシンインヒビター（２０，１００）、ラクトアルブミン（１４，４ ００）のハンドを示す。 ２列目・タンパクの分画をともなってＦＰＬＣｏ溶出物（２−メルカプトエタノ ール存在下）を示す。 ３列目−チログロフ゛リン（３３０，０００）、フェリチン（２２０，０００） 、アルブミン（６７，０００）、カタラーゼ（６０，０００）、乳酸デヒロゲナ ーゼ（３６，０００）およびフェリチン（１８，５００）を示す。 ４列目　２−メルカプトエタノール非存在下、タンパクの分画をともなったＦＰ ＬＣ■溶出物を示す。 非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ては、分子量約１８０ ｋＤに相当する１本のバンドか示された。メルカプトエタノール存在下では、こ の分画は、５０ｋＤ（後に、免疫グロブリンの長鎖と同定）と２５ｋＤ（後に、 アポリボプロティンＡ１および免疫グロブリン短鎖と同定）の２本のバンドを示 した。ブルーセファロース■工程を行わないと、大きな成分として非還元複合体 か溶出し、還元後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、約６７ｋ Ｄのところにもう１つ別のバンドが認められた。これは、その際、分子がアルブ ミンと複合状態にあって、このアルブミンはブルーセファロース［Ｆ］工程によ って除去されることを示唆する。 第３図は、２−メルカプトエタノール存在下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル 電気泳動を示す。 １列目　第２図の１列目と同じ。 ２列目　正常血清。 ３列目　タンパク分画をともなったプル−セファロース■溶出物。 ４列目、第２図の３列目と同し。 ５列目：アルブミン分画をともなったＦＰＬＣ＠溶出物。 ６列目：タンパク分画をともなったＦＰＬＣ■溶出物。 第４図は、ＳＰＭ（Ａ）およびＡＴＰ含有量（Ｂ）に関して、精製５ＰＡＰの効 果を示す。精液は、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ　）　Ｑ法を用いて分離し、緩 衝液Ｂに移した。 精製５ＰＡＰは、濃度を増加させながら、少量の精液溶液に添加し、精子は、２ ．５および５時間後にその運動能を測定し、５ＰＡＰ添加の２および３時間後に そのＡＴＰ含有量を測定した。 発明を実施するための最良の形態 精液運動能試験モデルを以下に説明する。 精液試料：精液および血清を６人の提供者から集め、２時間以内に分析した。　 （Ｆｒｅｄｒｉｃｓｓｏｎ　Ｂ、　（１９７９）Ａｎｄｒｏｌｏｇｉ　Ｉ　１． 　５７−６１　）　ｏ活発な精子の分離は、浮上法またはパーコール■勾配法を 用いた精子自体の移動性、次いて、規定培地への精子の移行性によって行った。 　〔Ａｋｅｒｌｏｆ　Ｅ、、Ｆｒｅｄｒｉｃｓｓｏｎ　Ｂ、、Ｇｕｓｔａｆｓｏ ｎ　Ｏ，。 Ｌｕｎｄｉｎ　Ａ、、Ｌｕｎｅｌｌ　Ｎ−０，、Ｎｙｌｕｎｄ　Ｌ、、Ｒｏｓｅ ｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＰｏｕｓｅｔｔｅ　Ａ、（１９８７）　［ｎｔ、　Ｊ、 　Ａｎｄｒｏｌ、Ｉ　Ｏ。 ６６３−６ｆ３９）。 浮上調製物ては、０３ｍｌの精液に、１ｍｌの組織培養用培地、すなわち、１３ ％（Ｖ　／　Ｖ　）ヒトの血清、２４ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（シグマ社、米国）、５ ０１Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０Ｒｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギフコ社、 スコツトランド）〔緩衝液Ｂ〕を添加したＲＰＭｌ−１６４０（フロー社）を重 層した。３７°Ｃで４５分間インキュベーションした後、活発な精液を含む最上 層０．５ｍｌを回収した。パーコールＯ勾配法では、１ｍｌの精液をパーコール ■勾配液の上部に静かに重層した。３７°Ｃで３時間後（遠心せず）、上層部を 吸引して捨て、下層部の３ｍｌを懸濁させた。（Ｐｏｕｓｅｔｔｅ　Ａ、、　Ａ ｋｅｒｌＯｆＥ、、　Ｌｕｎｄｉｎ　Ａ、。Ｒｏｓｅｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＦ ｒｅｄｉｃｓｓｏｎ　Ｂ。 （１９８６）　Ｉｎｔ、Ａｎｄｒｏｌ、９．　３　３　ｉ−３４０）活発な精子 を緩衝液Ａ（血清無添加の緩衝液Ｂ）へ移行させるために、５〜１０管の分画（ 浮上法またはパーコール■によって分離）をプールし、これらをボンブーフィル ター系（Ａｋｅｒｌｏｆ　Ｅ、、　Ｆｒｅｄｒｉｃｓｓｏｎ　Ｂ、。 Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ　Ｏ，、Ｌｕｎｄｉｎ　Ａ、、Ｌｕｎｅｌｌ　Ｎ−０，、Ｎ ｙｌｕｎｄ　Ｌ、。 Ｒｏｓｅｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＰｏｒｓｅｔｔｅ　’Ａ、（１９８７）　Ｉｎ ｔ、　Ｊ、Ａｎｄｒｏｌ、１０．　６６３−６６９）に添加した。 精子を約３百万個／ｍｌに希釈した後、各０．５ｍｌを移し取り、これらに０． 、］ｍｌの緩衝液Ａ（対照）、血清（対照）、さまざまな添加物または精製工程 からの溶出物を添加した。タンパク質複合体の精製のためのプロトコールか確立 される間、精子の継続的運動能をさまざまな時間間隔をおいて測定した。ルーチ ンの調製物では、運動能を試験溶液の添加後４〜６時間で測定した。非特異的な アルブミンの効果がこの時間で最小になるからで緩衝液Ｂ中での添加物として使 用される）を５６°Ｃ３０分間インキユヘーションし、−２０°Ｃで使用時まで 保存した。免疫沈降させた血清と同様に、正常なウサギの血清およびウサギの抗 タンパク質複合体血清を、直接またはさまざまな組合わせで添加して、精液運動 化試験を行った。 精製されたヒトのアポリボプロティンＡＩ（Ａ−９２８４、シグマ社、ミズリー 州、米国）を緩衝液入に添加したところ、試験管中の最終濃度は０．０４〜０． ３ｇ／Ｉとなった。ガンモネイティブ（Ｇａｍｏｎａｔｉｖｅ）　Ｏ（カビ社、 ストックホルム、スエーデン）をブルーセファロース０クロマトグラフイーに添 加して、アルブミンを除去した。免疫グロブリンを凍結乾燥し、水に溶解して、 精液運動化試験試料に添加した。 運動能：継続的運動能は上記のとおりに解析した（Ｐｏｕｓｅｔｔｅ　八、、八 ｋｅｒｌｏｆ　Ｅ、、　Ｒｏｓｅｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＦｒｅｄｉｃｓｓｏｎ 　Ｂ、（１９８６）　Ｉｎｔ、　Ａｎｄｒｏｌ、９．　Ｉ　−１３）。単位時間 あたり、ブユルカー（Ｂｕｒｋｅｒ）チャンバー中の長さ既知の特定のラインを 通過する精子の数を計測した。濃度を判定するには、結果を１ｍｌ中で１分間あ たり通過する何百万個単位の精子の値として表した。この値を、特異的継続的運 動能（ＳＰＭ）と称する。精液の運動能は、各溶出分画をそれぞれ少量づつ使っ て測定した。その運動能は、通常、例えば、アルブミンの添加後に観察されるこ とかある精液運動能の初期の上昇をさけるために精液添加の４〜６時間後に測定 した。 ＡＴＰ含有量を“Ｐｏｕｓｅｔｔｅ　Ａ、、　Ａｋｅｒｌｏｆ　ＩＥ、、　Ｌｕ ｎｄｉｎＡ、、　Ｒｏｓｅｎｂｏｒｇ　Ｌ、およびＦｒｅｄｉｃｓｓｏｎ　Ｂ、 （１９８６）Ｉｎｔ、　Ａｎｄｒｏｌ、９．　３３１−３４０’に記載された「 標準化モデル系」て分析し、特異的ＡＴＰを、１匹の精子あたりのＡＴＰ含有量 と定義した。 ５ＰＡＰの精製では、男性の血液提供者から得られた血清を５６°Ｃで３０分間 インキュベーションした後、精製の際に使用するまで一２０°Ｃて保存した。分 画を透析および／または凍結乾燥してから、「標準化モデル系」て精液の活性化 能を測定した。 イオン交換クロマトグラフィー二血清（１００ｍｌ）を０．０１Ｍリン酸緩衝液 （ｐｉ（７，４）で平衡化された１００ｍ１のＤＥＡＥセファロース０カラム（ ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社、ウプサラ、スウェーデン）上で分画し た。この血清を０．ＯＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で２倍に希釈し、その カラムに添加した。 洗浄後、０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中の０〜０．２５Ｍ　ＮａＣｌ 溶液（２Ｘ３００ｍｌ）の直線勾配をかけた。分画く約５　ｍｌ）を集め、２８ ０ｎｍでの吸光度をモニターした。次いて、すへての分画から少量を取り、これ を０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析し、ＳＰＭの活性化能 を測定した。精液の運動能を促進し得る分画をプールした。通常、勾配て約０． ２ＭＮａＣｌのところて回収した約ＩＯ分画（５０ｍｌ）をそ６．０）に対して 透析した、３７ｍ１のＰＢＥ”９４クロ酸緩衝液に対して透析し、凍結乾燥して 、２５０μｌの０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解してから、精液 運動化試験にかけた。精液活性化能を示す分画をプールした。通常、はぼ３つの 分画（１５ｍｌ）が得られたが、これらはｐＨ約５．１のところに溶出した。 タンパク質の高速液体クロマトグラフィー■（ＦＰＬＣ■）　プールされた分− を、０．００１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析し、凍結乾燥し、２ ００μ！の蒸留水（ミリボア■）に溶解して、０．１２５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）で平衡化した２本のセファロース■１２ＨＲ１０／３０カラム（直列 ）上で平衡化した。検量線は、既製の標準試料（ファルマシア・ファイン・ケミ カルズ社、ウプサラ、スウェーデン）を使って作成した。各分画（６００μｍ） の一部（１０μｍ）の精液活性化能を試験した。通常その活性は、分子量約２５ ０ｋＤに相当する２つの分画（１，２ｍ１）に見い出された。 ブルーセファロース０クロマトグラフイー：ＦＰＬＣ＠の後プールされた分画を 、０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化されたブルーセファロース ■のカラム（１０ｘ２０ｍｍ）にかけた。精液活性化能は、ゲルに吸着されず、 排除体積に相当する分画に回収された。 そして、洗浄は、０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４、全量３０ｍ１）で行 った。この物質を凍結乾燥し、１．０ｍｌの水で溶解した。そのうちの１０８ｍ をルーチンの精在下、分析用ディスク電気泳動を行ったが、そこでは、検量線用 標準試料（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社、ウプサラ、スウェーデン） が付属している既製のゲルカセットキット（Ｇｅｌ　Ｃａ５ｅｔｔｅ　Ｋｉｔｓ ）　（８０ｘ　８０ｆｆＩｆｆＩ）とともにＧＥ２／４垂直系（Ｖｅｒｔｉｃａ ｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　）（ファルマシア社、スウェーデン）を使用した。タンパク をクマンブルーで染色した。アミノ酸分析用の試料を、オンラインのフェニルチ オヒダントインのアナライザー１２０が装備されたアプライドバイオシステムズ （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　４７０　Ａ気相シークエンサ−（ アプライド・バイオシステムズ社、フォースター市、カリフォルニア州）て分析 した。 総タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いたバイオラド 社のタンパク検定（バイオラドラボラトリーズ社、ミュンヘン、ドイツ連邦共Ｓ 国）で行った。アポリボプロティンＡＩは、ベーリンガー社（マールブルグ、ド イツ連邦共和国）からの試薬を用いた比濁法で行った。 免疫化および免疫沈降は、上記のように、ｍＨ９ンパク質複合体を用いて１才の オスのニューシーラントホワイトラビット２匹で実施した（Ｖａｉｔｕｋａｉｔ ｉｓ　ｌ　ＲｏｂｂｉｎｓＪ　Ｂ、Ｎｉｅｓｃｈｌａｇ　Ｅ　およびＲｏｓｓ　 Ｇ　Ｔ、（１９７１）、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、３　３ ．　９　８　８−９　９　１）　Ｑ　このウサギ１匹にはタンパク質２０μｇを 水１ｍｌに溶かし、もう１匹のウサギにはタンパク質８０μｇを水１ｍｌに溶か して、それらの溶液をフロイント完全アジュバントと混合し、この混合物を各ラ ビットの背中に皮下注射した。 正常な不活性化血清とウサギの抗５ＰＡＰ血清を、１：１９ないしＩ　９　：　 ｌ　（Ｖ／Ｖ）の比率で混合した。 混合物を２５°Ｃて２０時間インキュベーションしてから、それの入った試験管 を１４００Ｘｇて２５分間遠心した。 吸引によって上清を除去して、形成されたペレットを使用時まで一２０°Ｃて保 存した。これらの上清の精液運動能を試験し、それらのアポリボプロティンＡＩ を分析した。 アミノ酸配列の分析を２つの異なったプールで行い、ブルーセファロース■工程 からの５ＰＡＰ０３つの調製物のそれぞれを、アミノ酸配列のための分解によっ て分析した。得られた結果は非常に類似しており、調製物の再現性が確立され、 ３つの主要なＮ末端配列の存在が明らかとなった。しかし、アミノ酸分析を約２ ５サイクル行った後は、かなりバックグラウンドが高くアミノ酸の種類を確認す るのがすへてにおいて困難となった（第１表参照）。 第１表 ５ＰＡＰのアミノ酸配列。２つの調製物を分解したところ、３種類の主要Ｎ末端 配列が、平均比的１．４ｚ中の残基の一致が確実な順序を阻害しないうちに、そ れぞれ２６．２０および１５サイクルを行って解釈されたものである。各サイク ルで確認されたトリブレットでは、配列■、■および■それぞれの配列のような 順序が、回収率たけては不確実になることがしばしばあったが、■、■および■ に属するものとしての記載は、さまざまな組み合わせが３つの既知の構造にいっ たん合致することが分かれば、容易であった。■は、アポリボプロティンＡｌ、 ■は、免疫グロブリンの短鎖（に）、および■は、グロブリン長鎖（ｇ、ｍおよ びａ）に相当する。各サイクルで同定された残基をその順番に示す。数個の位置 （１，７，１１）では、２つだけの主要残基が同定され、これは、２つの構造が 同一の残基をもつと思われる位置が複数あることを反映している。したがって、 表にあげた回収率は異なる。主にバックグラウンドかかなり高いために、仮定さ れた配列を（）の中に示す。２つの調製物からは、個々の残基の回収率が仮定の 配列および確実な配列の長さにおいて少々のばらつきはあるもののほぼ同一の結 果が得られた。 サイクル　■　■　■ ｌ　アスパラギン酸　２５０（アスパラギン酸　２００）　グルタミン酸　２０ ０２　グルタミン酸　２４０　イソロイシン　１９０　バリン　１８０３　プロ リン　２００　バリン　１７０　グルタミン　２００４　プロリン　２１０　メ チオニン　１７０　ロイシン　２００５　グルタミン　１９０　スレオニン　１ ５０　バリン　１４０６　セリン　１５０　グルタミン　１３０　グルタミン酸 　１３０７　プロリン　１６０　セリン　１１０　セリン　１１０８　トリプト ファン　５０　プロリン　１４０　グリシン　１３０９　アスパラギン酸　１５ ０　バリン　１４０　グリシン　１２０１０　アルギニン　１００　スレオニン 　１１０（グルタミン酸　１００）１１　バリン　２１０　ロイシン　■、ロイ シン　９゜１２　リ’／＞　１７０　（ｒリン１００　バリン１１０１３　アス パラギン酸　１４０（バリン　１００）　グルタミン　８゜１４　ロイシン　１ ７０　セリン　８０　プロリン　１００１５　アラニン　１５０（プロリン　９ ０）　グリシン　（資）１６　スレオニン　１０（）　（グリシン　８０）１７ 　バリン　１４０　グルタミン酸　６０１８　ヂロシン　１３０　アルギニン　 凹１９　バリン　１３０　アラニン　７０２０　アスパラギン酸　１００　スレ オニン　６０２１　バリン　１３０ ２２　ロイシン　１１０ ２３　リシン　８０ ２４　アスパラギン酸　匍 ２５　セリン　７０ ２６　グリシン　８０ 各位置のトリブレットを、既知の構造に対してスクリーニングし、３つのタンパ ク構造が既知のものであることか分がった。したかって、１つは、ヒトのアポリ ボプロティ：／Ａ　ｌ　（Ｂａｌｅｒ　Ｈ，Ｎ、、Ｇｏｔｔｏ　Ａ、Ｍ、ＪＲ， およびＪａｃｋｓｏｎＲ，Ｌ、（１９７５）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、７． 　２７２５−２７３８）であって、他の２つは免疫グロブリンの短鎖および長鎖 として知られる主要なタンパクであると同定された。短鎖は典型的なに鎖に相当 し、長鎖は、その構造の報告と一致していることから判断して、ｇ、ｍおよびａ 鎖と最も一致していることを示し、典型的なｇ鎖である可能性が高い。しかし、 免疫グロブリン鎖の性質が、混合物中ての配列分析から得られた最終的なものと みられてはならない。それでも結果から、５ＰＡＰは、多様性の徴候か全くなく ３つの型のタンパク鎖（アポリボプロティンＡＩ、ならびに免疫グロブリン長鎖 および短鎖）から構成されているタンパクであると明らかに同定される。化学量 論的に判定することは困難である。Ｅ記の分解における初期の収率が鎖ごとに少 々異なっているためてもあるか、免疫グロブリン分子とアポリボプロティンＡ１ 分子との複合体が等モルの鎖を産生する可能性もみられるからである。 ５ＰＡＰの精液活性化能を以下のように測定した。 異なった精製工程から得られた溶出液は、１６．７％（Ｖ／Ｖ）の血精と同程度 まで精子を活性化する。精製された５ＰＡＰの精液活性化能は、５ＰＡＦ’の濃 度に依存することか分かった。この活性化は、ＡＴＰと同様にＳ　Ｐ　Ｍを用い て検出され得る（第４図）。精子２百５０万個／ｍｌを使った「標準化モデル系 」で、最大の効果は、濃度か２Ｑ　〜７’　Ｏｎｍｏｌ／　１のときに得られた 。１００°Ｃて５分間加熱した精製５ＰＡＰは、精液運動能を活性化　゛しなか った。精製されたアルブミン、アポリポプロティンＡ１および免疫グロブリンに は、精液運動能に対する効果が小さくかつ短期間（数時間）゛だけてあった。 抗５ＰＡＰ血清の免疫化および特性決定は、フロイント完全アジュバント中に溶 かした精製５ＰＡＰをウサギに免疫処置することによって実施した。免疫化の１ ０週後、充分な力価の抗血清が１匹のウサギに検出された。 この抗血清を正常な男性の血清と約９　：　１　（ｖ／ｖ）の比率でインキュベ ーションしたとき、沈澱が形成された。 アポリポプロティンＡＩの上清の分析では、アポリボプロティンＡＩ含有量が、 未処置の血清の値に比較して低いことが分かったが、これは、大部分のアポリポ プロティンＡＩがウサギ抗血清によって沈澱することを示唆する。未処置のヒト 血清と比較した際、沈澱したヒト血清は、精液運動能を促進する力価が低い（約 ２５％）であることが分かった。「標準化モデル系」でウサギの抗５ＰＡＰ血清 を精子に直接添加した際、その運動能は、前免疫処置血清の添加てみられた値に 比較して減少していた。 精子に添加された５ＰＡＰ抗血清は、精液運動能を阻害することが分かった。こ れに対する可能性の高い説明は、５ＰＡＰか初期のうちに精子に結合し、次いて 、抗体によって認識されるというものである。 ＦＰＬＣ■クロマトグラフィーによってゲル濾過を行った後、分画の分子量は約 ２５０ｋＤであると計算され、ブルーセファロース■にかけた後で、２−メルカ プトエタノールの非存在下のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで観察される主バン ドは、約１８０ｋＤに相当していた。 その差は約７０ｋＤてあって、アルブミンの分子量に相当している。２−メルカ プトエタノール存在下てのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動ては、複数の 成分（５０ｋＤおよび２５ｋＤ）が確認された。精液活性化タンパクを化学量論 的に判断することは難しいか、当モル量の鎖を産生する免疫グロブリンとアポリ ボプロティンＡ１との間の複合は可能であると思われる。アポリボプロティンＡ ＋、免疫グロブリンおよびアルブミンは、単独では、精液運動能に対する効果が 少ない。アポリボプロティンＡｔ−免疫グロブリン複合体が精子の活性化を仲介 するものと考えられる。 上記の結果は、精液中の主要な精液活性化能は、分子この分画は現在、アルブミ ン、アポリボプロティンＡＩ、ならびに免疫グロブリンの長鎖および短鎖を含む 複合体から構成されていることが示されている。煮沸すると活性化能が破壊され るので、小さなリガンドによってではなく、その高分子自体によって仲介される ものと考えられる。２−メルカプトエタノール存在下でのＳＤＳポリアクリルア ミドケル電気泳動は１５’ＯｋＤ以下のバンドを示さないが、２−メルカプＩ・ エタノール存在下で成分が観察されるので、上記の複合体は完全なタンパクの　 ゛ジスルフィド結合に依存することが考えられる。その複合体の分子量は、ＦＰ ＬＣ■クロマトグラフィー上て約２５０ｋＤであると計算された。プル−セファ ロース■上でのクロマトグラフィーの後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上ての 主要バンドは、約１８０ｋＤに相当していた。その差は約７０ｋＤであって、こ れは、アルブミンの分子量に相当し得た。化学量論を判断することは難しいが、 当モル量の鎖を産生ずる免疫グロブリンとアポリボプロティン間の複合体の形成 は可能であると思われる。この複合体の分子量は約１８０“ｋＤのはずであって 、この値はゲル電気泳動上で見い出されたものと類似している。アルブミンを含 まない高分子が精子を活性化し得るとしても、その生物学的活性型が１分子のア ルブミンを含み、分子量が約２５０ｋＤであって、Ｆ　Ｐ　Ｌ、　Ｃ■の結果と 一致する。 われわれの研究では、作成された抗血清が上記の高分子および免疫グロブリンと 相互作用することが示される。 上記の高分子か精液の活性化を誘導する機構はまだ未解明である。活性化に対す る所要量が少ないことから判断すると、レセプタ仲介型または酵素結合型の機構 が考えられる。本明細書では、アポリポプロティンＡ１がレシチン・コレステロ ールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）を活性化するが、われわれには、こ の酵素またはいずれか他の酵素が精液の活性化に関与しているということは明ら かではない。 この新規の高分子複合体が、恐らく別の細胞外液にも存在していよう。したがっ て、精液の受精能を判断するための単一の最も重要な変量であること、そして、 異なった血清および濾胞液が、精液を非特異的に活性化することが知られている ので、上記の高分子か診断および治療の両面で有効に使用される可能性がある。 ＾　２８０　ｎｆｆ１ ＾　２ａＯｎ− 特異的継続的運動能 ＾　２１１０　ｎｆｗ 特巽的継続的運動能 Ｆｉｇ、２ 噸−１− −一 １−−　＆− ミー― Ｆｉｇ−３ ｎｍｏｌ／Ｉ Ａ。 ｎｍｏｌ／Ｉ Ｂ。 Ｆｉｇ　４゜ 国際調査報告 国際調査報告 、ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００２１３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）実質的に純粋、ｂ）その分子量が約２００，０００ダルトン、ｃ）精液 の運動能を活性化することを特徴とする、タンパク性高分子。 ２．少なくともアポリポプロテインＡ１および免疫グロブリンを含むことを特徴 とする、請求項１記載の高分子。 ３．アルブミンを含むことを特徴とする、請求項２記載の高分子。 ４．アルブミン、アポリポプロテインＡ１および免疫グロブリンがほぼ等モル状 態にあることを特徴とする、請求項３記載の高分子。 ５．等電点が約５．１であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１ 項に記載の高分子。 ６．細胞外液、例えば、ヒト血清から得られたことを特徴とする、上記請求項の いずれか１項に記載の高分子。 ７．実質的に純粋であって、約２００，０００ダルトンの分子量をもち、精液の 運動能を活性化するタンパク性高分子の調製法であって、該タンパク性高分子が 、細胞外液、例えば、ヒト血清から精製されることを特徴とする調製法。 ８．上記精製工程が、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング およびタンパクの高速液体クロマトグラフィーを含む３つの工程であることを特 徴とする、請求項７記載の方法。 １０．ＦＰＬＣの後、アブアニティークロマトグラフィーをさらに含むことを特 徴とする、請求項８記載の方法。 １１．精液運動能を各精製ステップ毎に調べることを特徴とする、請求項１ない し７のいずれか１項に記載の方法。 １２．適切な医薬品添加物とともに、実質的に純粋であって、約２００，０００ ダルトンの分子量をもち、精液の運動能を活性化するタンパク性高分子を含む製 剤。 １３．不妊の治療に使用するための、請求項１１記載の製剤。 １４．生体外で不妊の治療に使用するための、請求項１２記載の製剤。 １５．測定用試料を請求項１ないし６項に記載の高分子で処理し、該試料の運動 能を既知の標準試料に対して比較することを特徴とする、精液の受精能を測定す る方法。 １６．実質的に純粋であって、約２００，０００ダルトンの分子量をもち、精液 の運動能を活性化するタンパク性高分子に特異的な抗原決定基に対する抗体。 １７．上記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５記載 の抗体。 １８．請求項１ないし６記載の高分子の精液運動能活性化特性を阻害する、請求 項１５および１６記載の抗体の使用。