JP2759320B2 - 抗血液凝固作用を有するポリペプチド - Google Patents
抗血液凝固作用を有するポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト胎盤を始めと
するヒト組織より得られる抗血液凝固物質（以下、ＰＣ
Ｉと称する）と同様の抗血液凝固活性を有するポリペプ
チドをコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベ
クター及び該組換えベクターを保持する形質転換体細胞
に関する。 【０００２】 【従来の技術】従来、抗血液凝固物質としてはヘパリ
ン、ヘパリンコファクター−II、アンチトロンビン−II
I、α2−マクログロブリン、α1−トリプシンインヒビ
ター、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、プロテインＣ
等が知られているが、実用に供されているのはヘパリン
のみである。しかしヘパリンには出血傾向を招く副作用
があるため、その使用方法及び使用量が極めて限定され
ており、抗血液凝固剤としては安全性の面から満足すべ
きものではなかった。 【０００３】斯かる状況の下で本出願人は、先にヒト胎
盤からＰＣＩを分離精製することに成功し、特許出願し
た（特願昭６０−２１７５１２号）。 【０００４】ＰＣＩは、下記の性質を有する医薬として
有用な物質である。 （ｉ）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法、還元状態） ３４，０００±２，０００ （ii）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （iii）安定性 イ．５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ．pH４〜１０で安定 ハ．血漿中３７℃、３０分で安定 （iv）作用 イ．カルシウム再加凝固時間を延長 ロ．プロトロンビン時間を延長 ハ．活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （ｖ）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。 さらに本出願人は、ＰＣＩに特異的なモノクローナル抗
体を作成し、特許出願した（特願昭６１−２６９５８８
号）。このモノクローナル抗体を利用することにより、
ＰＣＩの高感度検出、精製等を行うことができる。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら現在ＰＣ
Ｉを得るためにはヒト胎盤を始めとしたヒト組織を原材
料とする必要があることから、いくつかの問題があっ
た。すなわちヒト組織中より得られるＰＣＩの量には限
りがあること、原材料であるヒト組織の入手には困難が
伴い、安定して供給することは難しいこと、ヒト組織中
に存在し得る病原ウィルスの危険性が無視できないこと
等である。従って、より安価に、より大量に、より安定
して、かつ、より安全にＰＣＩを供給する方法又はこれ
と同様な作用を有する物質の開発が望まれていた。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト胎盤ｃ
ＤＮＡライブラリーよりＰＣＩ特異的抗体をプローブと
して利用することによりＰＣＩポリペプチドをコードす
るＤＮＡ断片が得られること、さらにこのＤＮＡ断片を
組み込んだ組換えベクターを用いて微生物細胞を形質転
換し、ＰＣＩ遺伝子を発現させることによりＰＣＩ様ポ
リペプチドが製造できることを見い出し、本発明を完成
した。 【０００７】すなわち、本発明は下記のアミノ酸配列 【０００８】 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp 【０００９】を有するポリペプチドをコードする新規Ｄ
ＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター及び該組換えベク
ターを保持する形質転換体細胞を提供するものである。 【００１０】 【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体細胞は、例えば
次の如くして製造される。すなわち、（１）ヒト胎盤ｃ
ＤＮＡライブラリーよりＰＣＩ特異的抗体を用いて抗体
陽性クローンをスクリーニングし、（２）単離された抗
体陽性クローンより組換えＤＮＡを調製し、この組換え
ＤＮＡよりｃＤＮＡ断片を制限酵素処理によって切出
し、プラスミドベクターに組込む。（３）得られたｃＤ
ＮＡ組換えベクターにより宿主細胞を形質転換し、本発
明の形質転換体細胞を得る。得られた本発明形質転換体
細胞を培養し、菌体中より本発明ＤＮＡ断片を含む本発
明の組換えベクターを得る。さらに得られた組換えベク
ターを適当な制限酵素で切断し、本発明のＤＮＡ断片を
得る。 【００１１】次に上記各工程について説明する。 （１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより抗体陽性クロ
ーンのスクリーニング ｃＤＮＡライブラリーはヒト胎盤よりｍＲＮＡを調製
し、逆転写酵素と適当なベクターを用いて作成すること
ができるが、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばクロ
ンテック社製ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１
１）を利用することができる。λｇｔ１１をベクターと
して作成されたｃＤＮＡライブラリーは特異抗体をプロ
ーブとしてヤングとデイウィスの方法（Huynh, T. V.,
Young, R. A. and Davis, R. W. (1985) In：DNA Cloni
ng：A Practical Approach, vol. 1,(D. M. Glover, e
d.), pp49-78. IRL Press, Oxford.）を応用してスクリ
ーニングに付し、特異抗体陽性クローンを単離すること
ができる。 【００１２】プローブとして用いる一次抗体としては、
ＰＣＩ特異抗体、例えば、抗ＰＣＩウサギポリクローナ
ル抗体、抗ＰＣＩマウスポリクローナル抗体、抗ＰＣＩ
モノクローナル抗体を用いることができるが、就中抗Ｐ
ＣＩモノクローナル抗体、特に抗ＰＣＩマウスモノクロ
ーナル抗体が好ましい。抗体は、血清、腹水、ハイブリ
ドーマ培養液、精製イムノグロブリン、いずれの状態で
も使用できる。 【００１３】抗原と結合した一次抗体の検出には、放射
性ヨード（125Ｉ）ラベルしたプロテインＡ、放射性ヨ
ード（125Ｉ）ラベルした抗イムノグロブリン抗体を用
いてオートラジオグラフィーにより行う方法、パーオキ
シダーゼラベルした抗イムノグロブリン抗体、又はアル
カリ性フォスファターゼラベルした抗イムノグロブリン
抗体を用いて酵素抗体法により行う方法を利用すること
ができる。 【００１４】なお、抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、例
えば前記特願昭６１−２６９５８８号に記載の方法によ
って製造することができる。すなわち、ヒト胎盤より抽
出、精製したＰＣＩでマウスを免疫し、該マウスより脾
細胞を採取し、これとマウス骨髄腫細胞を細胞融合させ
る。融合処理を施した細胞をＨＡＴ選択培地を用いて培
養し、ハイブリドーマのみを増殖させる。ハイブリドー
マが増殖した培養液に対してＰＣＩを抗原として酵素抗
体法によりスクリーニングを行い、ＰＣＩに特異的なモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを得た。得
られたハイブリドーマを培養した培養液又は接種したマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体が得られる。 【００１５】（２）ＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターの
作成 単離された抗体陽性クローンよりヤングとデイヴィスの
方法（Huynh, T. V.,Young, R. A. and Davis, R. W.
(1985) In：DNA Cloning：A Practical Approach, vol.
1, (D. M. Glover, ed.), pp49-78. IRL Press, Oxfor
d.）により組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡを抽出精製
する。精製された組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化することによりｃＤＮＡをベク
ターＤＮＡより分離することができる。得られたｃＤＮ
Ａを同じくＥｃｏＲＩ消化した種々のクローニング用プ
ラスミドベクターと再結合し、組換えプラスミドベクタ
ーを作成する。利用できるプラスミドベクターとして
は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１１８、ｐＴＺ１８Ｒなどが挙げられる。 【００１６】（３）ＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターに
よる宿主細胞の形質転換、本発明組換えベクター及び本
発明ＤＮＡの調製 得られたＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターをその組換え
ベクターの持つ遺伝子マーカーを最大限に利用できる種
々の宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換せしめ
る。宿主細胞としては、大腸菌が好ましく、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２株の種々の変異株、例えばＨＢ１０１、Ｃ６
００Ｋ、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、χ１７７６、ＭＶ１
３０４などが利用でき、組換えベクターの導入にはカル
シウム処理によるコンピテント細胞法などが用いられ
る。 【００１７】形質転換細胞をベクターの遺伝子マーカー
に応じた選択培地中で培養し、菌体中から本発明の組換
えベクターが採取される。また、ｐＵＣ１１８、ｐＴＺ
１８Ｒをベクターとして用いた場合、得られた組換えベ
クターを保持する形質転換体大腸菌にヘルパーファージ
Ｍ１３Ｋ０７を感染させることにより一本鎖ＤＮＡを調
製することができる。得られた一本鎖ＤＮＡは、ジデオ
キシシークェンス法（Sanger, F., Nicklen, S. and Co
ulson, A.R. DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5
467, 1977）によりＤＮＡ塩基配列を決定することがで
きる。 【００１８】その塩基配列のうち、本発明で目的とする
ポリペプチドをコードする部分の塩基配列は例えば次の
如くである。 【００１９】 GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA AGATGAC 【００２０】本発明のＤＮＡ断片は、前記アミノ酸配列
をコードする能力を有すれば、上記の塩基配列には限定
されるものではない。また本発明の組換えベクターも、
前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ複
製可能であれば、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等
いずれのベクターとの組換えでもよい。 【００２１】本発明ポリペプチドは、前記本発明組換え
ベクターを保持する形質転換細胞を培養し、その培養物
から採取することにより製造することができる。しか
し、本発明ポリペプチドを効率よく生産するためには、
転写の下流方向へ順に次の（ｉ）〜（vi）、 （ｉ）プロモーター （ii）リボソーム結合部位 （iii）開始コドン （iv）本発明ポリペプチドのアミノ酸配列をコードし得
る塩基配列を有するＤＮＡ （ｖ）終止コドン （vi）転写ターミネーター を含む発現用組換えベクターを構築し、これを用いて宿
主細胞を形質転換する必要がある。 【００２２】このような発現用組換えベクターを得るた
めのベクターの宿主としては、細菌のごとき単細胞微生
物、特に大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、
ストレプトミセス（Streptomyces）が好ましい。大腸菌
を宿主とした場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の種々
の変異株、例えばＨＢ１０１、Ｃ６００Ｋ、ＪＭ１０
１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、χ１７７６、ＭＶ１３０
４などが利用できる。 【００２３】ベクターとして利用するＤＮＡは、プラス
ミドが好ましい。例えば、大腸菌を宿主とした場合、プ
ラスミドＤＮＡは、大腸菌細胞中にプラスミドが増殖す
る為に必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏｌＥ１系のプラス
ミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、さらにプロモータ
ー、転写ターミネーターとして働くＤＮＡ配列を有し、
さらに好ましくは形質転換大腸菌の選択マーカーとなる
遺伝子を含む。プロモーターとしては、例えばλＰＬ、
ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐなどのプロモ
ーターが、転写ターミネーターとしては、例えばｒｒｎ
ＢリボゾーマルＲＮＡ転写ターミネーターなどが挙げら
れる。選択マーカー遺伝子としてはアンピシリン耐性遺
伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性
遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げら
れ、これらの遺伝子の１種又は２種以上が用いられる。 【００２４】上記ベクターに、本発明ポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ、す
なわち本発明ＤＮＡ断片を組み込むには、これを含むＤ
ＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリ
ンカーを付加した後、適当な制限酵素で切断したベクタ
ーと結合させることにより行われる。例えば図２の塩基
配列を有するＤＮＡの場合には、用いられる制限酵素と
しては、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩ；ＮｃｏＩ及びＳｐｈ
Ｉ；又はＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII等が挙げられる。 【００２５】得られた発現用組換えベクターをコンピテ
ント細胞法、プロトプラスト法、カルシウム共沈法、電
気パルス法などを用いて宿主細胞に導入すれば、本発明
ポリペプチドを効率的に生産する能力を有する形質転換
体細胞が得られる。 【００２６】本発明ポリペプチドは、得られた形質転換
体細胞を培養し、該培養細胞及び／又は培養液から抽
出、分離することにより製造される。 【００２７】形質転換体細胞の培養に際しては、種々の
天然培地、合成培地が用いられる。培地は、糖類、アル
コール類、有機酸塩などの炭素源；蛋白質混合物、アミ
ノ酸類、アンモニウム塩などの窒素源；無機塩類を含ん
でいることが望ましい。さらに、ビタミン類、選択マー
カー遺伝子に対応した抗生物質類を添加することが望ま
れる。発現の制御が可能なベクターであれば、培養途中
で遺伝子発現を誘導する操作を加える必要がある。培養
後、遠心処理を行い培養液と培養細胞とに分別する。本
発明ポリペプチドが培養細胞中に蓄積する様な場合は、
例えば凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、酵素処
理、ホモジナイザーなどを用いて細胞を破壊した後に、
例えばＥＤＴＡ、界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンな
どを用いて本発明ポリペプチドを可溶化する必要があ
る。 【００２８】得られた本発明ポリペプチドを含む培養液
又は培養細胞抽出液を種々のカラムクロマトグラフィー
に付すことにより、精製された本発明ポリペプチドを得
ることができる。カラムクロマトグラフィーとしては、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲルクロマトグラフィーを単独又は組合
せて用いることができる。 【００２９】かくして得られた本発明ポリペプチドは、
次の性質を有する。 （ｉ）アミノ酸配列 Ｎ末端のアミノ酸配列をＪＥＯＬ ＪＡＳ−５７０Ｋ
シークェンスアナライザーを用い、ＰＴＨアミノ酸に誘
導化して分析した。その結果、本発明ポリペプチドのＮ
末端から１０個のアミノ酸配列は次の如く決定された。
Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp 【００３０】この結果、本発明ＤＮＡ断片の塩基配列か
ら本発明ポリペプチドのアミノ酸配列は次の如く推定さ
れる。 【００３１】 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp 【００３２】（ii）分子量 ３５，８０５（アミノ酸配列より推定） ３４，０００±１，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法、還元状態） 【００３３】（iii）等電点（アンフォライトを用いる
等電点電気泳動法） ５．０±０．１ 【００３４】（iv）安定性 血漿中３７℃、３０分で安定 【００３５】（ｖ）作用 イ．カルシウム再加凝固時間を延長 ロ．プロトロンビン時間を延長 ハ．活性化部分プロトロンボプラスチン時間を延長 【００３６】上記の如く本発明ポリペプチドは優れた抗
血液凝固活性を有し、抗血液凝固剤として有用である。 【００３７】本発明ポリペプチドを抗血液凝固剤の有効
成分として使用する場合の剤型としては、注射剤が挙げ
られる。注射剤としては、凍結乾燥粉末を用時、注射用
蒸留水、生理食塩水等に溶解して投与する形態が好まし
い。投与部位としては、静脈内が適当である。 【００３８】投与量は疾患の重症度、患者の体重等によ
り異なるが、通常１０μｇ〜１０mg／kg・day であるこ
とが好ましい。なお、本発明ポリペプチドは、上記投与
量の範囲内においては全く異常が認められず、安全であ
る。 【００３９】 【発明の効果】本発明ポリペプチドは、強力な抗血液凝
固活性を示すことから、これを有効成分として含有する
抗血液凝固剤は、血液凝固活性亢進に起因する種々の疾
患、例えば脳梗塞、心筋梗塞等の脳、心臓、末梢血管に
おける血栓症あるいはＤＩＣ（播種性血管内凝固）等の
予防及び治療に有用である。 【００４０】また、本発明ポリペプチドは、ヒト胎盤由
来の抗血液凝固物質（ＰＣＩ）と同様の性質を有するこ
とから、ヒトに対し抗原性を有さない安全な物質であ
る。さらに、ＰＣＩは抗血液凝固剤として有用であるに
もかかわらず、ヒト胎盤の入手の困難性等から大量に生
産することができないという欠点があったが、本発明ポ
リペプチドは大量かつ安価に製造できるものである。 【００４１】 【実施例】次に参考例及び実施例を挙げて本発明を説明
する。 【００４２】参考例：抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調
製 （１）抗原（ＰＣＩ）の精製 （ａ）ヒト胎盤５個（約２，５００ｇ）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワー
リングブレンダーを用いて破砕し、これにさらに、５０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）２Ｌを加え、ポリト
ロン（Polytron）で磨砕する。得られたホモジネートを
７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣を分取した。
得られた沈渣に再度５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）２Ｌを加え、ポリトロンでホモジナイズし、７，０
００rpm １５分間遠心分離して洗浄沈渣を得た。この操
作を数回繰り返し、血液成分を除去して、洗浄沈渣９３
０ｇを得た。 【００４３】（ｂ）（ａ）で得た沈渣９００ｇに、５０
mM ＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）を約２Ｌ加え、ワーリングブレンダーでホモジナイ
ズする。このホモジネートを４℃にて、一夜攪拌後７，
０００rpm １５分間遠心分離して、抽出液２Ｌを得た。 【００４４】（ｃ）（ｂ）で得た抽出液に固形硫安を加
え、３５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、
７，０００rpm １５分間遠心分離し上清を分取した。こ
の上清にさらに硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２
時間放置した後７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈
渣を分取した。得られた沈渣を２０mMトリス−塩酸緩衝
液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜、充分
に透析した。透析中に生じた沈殿は、７，０００rpm １
５分間遠心分離して除き、透析液３９０mlを得た。 【００４５】（ｄ）得られた透析液を、２０mMトリス−
塩酸緩衝液（pH７．４）で平行化したＤＥＡＥ−トヨパ
ール（φ５．５×１９cm）に吸着させ、同緩衝液にて充
分洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩
衝液４Ｌを用い、直線濃度勾配により１分画２０mlとな
る様に溶出させた。活性画分は、ほぼ０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム濃度付近にて溶出され、３８０mlの活性画分を
得た。 【００４６】（ｅ）得られた活性画分を、０．１Ｍリン
酸緩衝液（pH７．０）に対し、４℃で一夜充分に透析
し、同緩衝液にて平衡化したブルーセファロース（φ
２．５×１２cm）カラムを通過させた。Ａ280 の吸収を
示す通過画分（４８０ml）を集め、これをダイアフロー
メンブランフィルターＹＭ−１０を用いて濃縮した。 【００４７】（ｆ）（ｅ）で得た濃縮液をセファデック
スＧ−１００を用いるゲル濾過（φ４．５×７５cm）に
付し、生理食塩水で１分画８mlになるように溶出させ、
活性画分８８〜１０４を集め、これを限外濾過により濃
縮して、ＰＣＩ１４．５ml（蛋白重量１３６．１mg，Lo
wry 法）を得た。なお、各精製段階において得た蛋白の
収量を下に示す。 【００４８】 工程 蛋白重量（mg） （ｂ）工程（ＤＥＴＡ抽出） ７２２６ （ｃ）工程（硫安分画、透析） ３１８４ （ｄ）工程（ＤＥＡＥ−トヨパール吸着） ５３１ （ｅ）工程（ブルー−セファロース吸着） １６３ （ｆ）工程（セファデックスＧ−１００吸着） １３６ 【００４９】（２）免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したＰＣＩ １００μｇをフロイント・
コンプリート・アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／
ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で
５０μｇのＰＣＩとアジュバンド乳濁液を２回投与し、
最後にＰＣＩ ５０μｇのみを投与し免疫を完了した。
３日後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後１００
メッシュのナイロン網で濾過し、脾臓の単離細胞を得
た。 【００５０】（３）ハイブリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（１５５mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏ
ｄｅｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を３回洗い、マウス骨髄腫細胞ＰＡ
ＩはＩＭＤＭで３回洗った。両細胞数を計測し、脾細胞
とＰＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣を十分解きほぐした後ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４，０００を培地で希釈した４５％液を
０．５ml滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置
した後、ＩＭＤＭ １mlを１分間かけて静かに添加し
た。続いて１０mlを５分間かけて加え、最終４０mlにし
た遠心管を１，０００rpm 、８分間遠心した。 【００５１】沈渣を１０％ Ｆｅｓ添加ＩＭＤＭで浮遊
し再度遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０
-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及びチミジン１．６
×１０-5Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０％ ＦＣＳ添加Ｉ
ＭＤＭを用い沈渣を再浮遊し、９６ウェルマイクロプレ
ートに１００μｌずつ分注した。３〜４日ごとに培地５
０μｌ追加し、細胞の増殖を見た。 【００５２】ＨＡＴ選択により、ハイブリドーマのみ増
殖することを確認した。 【００５３】（４）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し酵素
免疫法により、ＰＣＩに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、９６ウェルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にＰＣＩを０．１μｇ／１０
０μｌ／ウェル分注し、２５℃で１８時間静置し吸着さ
せる。次いで検体である培養液を１００μｌ／ウェル注
入し、２５℃で２時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（PBS-Tween）で３回洗
浄後、ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（カペル社製）を１００μｌ／ウェル加え、２時間後Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。これに、０．００１
％過酸化水素、０．４mg／mlオルトフェニレンジアミン
（シグマ社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH４．０）を加え、波長４９２nmの吸光度を測
定した。 【００５４】検体中、ＰＣＩに対する抗体が存在したウ
ェルにのみ発色が観察されるので、発色したウェルの細
胞を採取した。 【００５５】（５）ＰＣＩに対するモノクローナル抗体
産生細胞のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。１０％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１０5 個／ml）を９６ウ
ェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。翌
日、抗体産生ハイブリドーマを５個／mlに調製し、各ウ
ェルに１００μｌずつ分注した。３日ごとに培地を交換
し適当な量まで細胞が増殖したウェルから順に培養上清
を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を確認し
た。陽性のウェルは再度クローニングし、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハ
イブリドーマは、６種類得られ、それぞれ産生する抗Ｐ
ＣＩモノクローナル抗体の種類により、ＰＣＩ−Ｈ３
９、ＰＣＩ−Ｈ４６、ＰＣＩ−Ｈ１６７、ＰＣＩ−Ｈ１
６９、ＰＣＩ−Ｈ１７６、ＰＣＩ−Ｈ１８０と命名し
た。 【００５６】（６）抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調製 ７週令以上のＢＡＬＢ／ｃ系マウスにプリスタン（アル
ドリッチ社製）０．５mlを腹腔内投与し、約１週間後、
上記で得たハイブリドーマ１×１０6 個／マウス腹腔内
接種した。約１０日後、マウス腹腔より腹水を採取し
た。これを３，０００rpm、１０分間遠心分離し、上清
を分取しその５mlに硫酸アンモニウムを終濃度が５０％
飽和濃度になるように加え、４℃で一夜放置する。次い
で、３，０００rpm、１５分間遠心分離し、沈渣を０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８）に溶かし同緩衝液に対
して透析した。これを同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅ
ｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに付した。 【００５７】モノクローナル抗体の溶出は、０．１Ｍグ
リシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（pH２．７）
で行い、抗ＰＣＩモノクローナル抗体を得た。ＰＣＩ−
Ｈ３９を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ３９ １４．２mg、
ＰＣＩ−Ｈ４６を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ４６ ２
０．２mg、ＰＣＩ−Ｈ１６７を用いた場合は、ＰＣＩ−
Ａ１６７ ２２．９mg、ＰＣＩ−Ｈ１６９を用いた場合
は、ＰＣＩ−Ａ１６９２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１７６を
用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１７６ ２５．０mg、ＰＣＩ
−Ｈ１８０を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１８０ ８．６
mgをそれぞれ得た。 【００５８】実施例１ ＰＣＩ ｃＤＮＡのクローニン
グ （１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ： （ａ）ｃＤＮＡライブラリー ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーは、クロンテック社製
（Clontech Laboratories, Inc.）でλｇｔ１１ファー
ジのＥｃｏＲＩ部位に平均１．８kbのヒト胎盤ｍＲＮＡ
より逆転写酵素を用いて作製されたｃＤＮＡがＥｃｏＲ
Ｉリンカーを介して結合されている。ライブラリーは、
１．０×１０6 個の独立クローンより成る組換えλｇｔ
１１ファージである。 【００５９】（ｂ）宿主大腸菌Ｙ１０９０（ATCC3719
7）を使用し、アンピシリン（１００μｇ／ml）とマル
トースを含むＬＢ寒天平板（バクトトリプトン１０ｇ、
バクトイーストエキストラクト５ｇ、食塩５ｇ、マルト
ース２ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ、pH７．５）にスト
リークし、３７℃、一夜培養した、生じた単コロニーを
アンピシリン（１００μｇ／ml）とマルトースを含むＬ
Ｂ培地（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキ
ストラクト５ｇ、食塩５ｇ、マルトース５ｇ、蒸留水１
Ｌ、pH７．５）に移植し、３７℃、一夜振盪培養した。 【００６０】（ｃ）ファージライブラリーの感染 ０．２mlの宿主大腸菌Ｙ１０９０の一夜培養液とλ稀釈
液（１０mMトリス−塩酸緩衝液、１０mM塩化マグネシウ
ム、pH７．５）で３．７〜５．５×１０5 pfu／mlとな
るように調製したライブラリー０．１mlを混ぜ、室温で
２０分間放置してファージを宿主菌に吸着させた。４５
℃に保温しておいたマルトースを含むＬＢ上層寒天培地
（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキストラ
クト５ｇ、食塩５ｇ、マルトース２ｇ、寒天７．２ｇ、
蒸留水１Ｌ、pH７．５）２．５mlを加え混合した後、マ
ルトースを含む直径９cmのＬＢ寒天平板上に撤き４２
℃、３時間半培養した。 【００６１】（ｄ）ニトロセルロースフィルターへの転
写 １０mMイソプロピルβ−Ｄガラクトピラノシド（IPTG）
で飽和後、乾燥した滅菌ニトロセルロースフィルターを
４２℃で３時間半培養したλｇｔ１１ファージプラーク
の生じたＬＢ寒天平板に被せた。さらに３７℃、３時間
半培養した後、フィルターを剥がし、ファージプラーク
の生じた平板は４℃に保存した。フィルターをＴＢＳＴ
（１０mMトリス−塩酸緩衝液、１５０mM食塩、０．０５
％Tween２０、pH８．０）で洗浄後、１％ブタ血清アル
ブミン／ＴＢＳＴで室温、３０分間ブロッキングを行っ
た。 【００６２】（ｅ）一次抗体の結合 フィルターを一次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温で３０分間反応させた。一次抗体としては、Ｔ
ＢＳＴに溶かした抗ＰＣＩマウスモノクローナル抗体
（参考例で得られた）混合液を室温で３０分間放置し、
不純抗体の吸収を行ってから用いた。抗ＰＣＩマウスモ
ノクローナル抗体混合液は、ＰＣＩ−Ａ３９＋ＰＣＩ−
Ａ４６＋ＰＣＩ−Ａ１８０（１：１：０．５）、１mg／
mlウシ血清アルブミン、０．２５μｇ／ml〜０．０４μ
ｇ／mlの大腸菌エキストラクト（Promega Corporation
製）を含むものを用いた。一次抗体反応後、ＴＢＳＴで
フィルターを１０分間ずつ３回洗浄した。 【００６３】（ｆ）二次抗体の結合 フィルターを二次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温３０分間反応させた。二次抗体としては、アル
カリ製フォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（Promega Corporation製）をＴＢＳＴで１／７，５０
０倍に稀釈したものを用いた。ＴＢＳＴでフィルターを
１０分間ずつ３回洗浄、ＡＰ緩衝液（１００mMトリス−
塩酸緩衝液、１００mM食塩、５mM塩化マグネシウム、pH
９．５）で一回洗浄した。 【００６４】（ｇ）発色 ５mlのＡＰ緩衝液に３３μｌのニトロブルーテトラゾリ
ウム溶液（５０mg／ml）と６６μｌの５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルフォスフェート溶液（５０mg／
ml）を混ぜた発色基質溶液にフィルターを浸した。室
温、１時間発色後、反応停止液（２０mMトリス−塩酸緩
衝液、５mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、pH８．
０）に移し、発色を停止した。 【００６５】（ｈ）陽性プラークの調製、純化 発色の認められた陽性スポットに対応するプラークを寒
天培地ごと取り、０．１mlのＴＭＧ緩衝液（１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液、１０mM塩化マグネシウム、１００μｇ
／mlゼラチン、pH７．４）に移し、クロロホルムを２滴
加え、４℃で４，０００rpm、１５分間遠心し、上清に
クロロホルムを１滴加えて４℃に保存した。約３×１０
6 個のプラークについて上記のスクリーニングを行った
ところ、２６株の陽性プラークを得た。発色の強かった
５株についてファージ液を適当に稀釈し、さらに２回ス
クリーニング操作を繰り返しファージの純化を行った。 【００６６】（２）組換えファージＤＮＡの調製 得られた５株の組換えファージを宿主大腸菌Ｙ１００８
（ATCC337195）に感染させ、４２℃でファージを誘発さ
せ、λファージの調製法（Bernard Perbal、PREPARATIO
N OF λ PHAGE DNA. in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECUL
AR CLONING、pp175-184、A Wiley-Interscience Public
ation, 1984, New York, U. S. A.）に準じて、プレー
ト法による少量調製、大量調製、液体培養による大量調
製を経て、１０9 pfu／mlの組換えファージを得た。 【００６７】λＤＮＡ調製法（Bernard Perbal、PURIFI
CATION OFλ DNA. in A PRACTICALGUIDE TO MOLECULAR
CLONING 、pp184-187、A Wiley-Interscience Publicat
ion, 1984, New York, U. S. A.）に従い、ポリエチレ
ングリコール沈殿法により１０11 pfu／mlに濃縮したフ
ァージ液をグリセリンのステップワイズ遠心（Bernard
Perbal著、小林成保監訳、遺伝子操作実験実用ハンドブ
ック、pp175, 1985、ジャテック出版）により精製し
た。 【００６８】精製組換えファージを用いて、同じくλＤ
ＮＡの調製法に従って、組換えファージＤＮＡの調製を
行い、３００mlの培養液から約３０〜１６０μｇのＤＮ
Ａが得られた。 【００６９】（３）ｃＤＮＡのサブクローニング ベクターとしてｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）を用
いた。ｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩで切断し、同じくＥｃ
ｏＲＩで切断した５株の組換えλｇｔ１１ファージＤＮ
ＡとＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。 【００７０】宿主大腸菌ＭＶ１３０４（宝酒造株式会社
製）に得られた組換えベクターを導入したところ、得ら
れた形質転換体ＭＶ１３０４より５株の組換えλｇｔ１
１ファージに対応する５種の組換えベクターｐＭＫＴ
１、ｐＭＫＴ３、ｐＭＫＴ５、ｐＭＫＴ７、ｐＭＫＴ９
が得られた。 【００７１】種々の制限酵素を用いて制限酵素地図を作
製したところ、いずれの組換えベクターも共通してＰｓ
ｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄIII の切断部位を
有していた。いずれの挿入断片も１．５kb前後の長さを
持ち、最も長い挿入断片を持つｐＭＫＴ７の制限酵素地
図を第１図に示した。ｐＭＫＴ７の大きさは、約４．８
kbであった。 【００７２】（４）ＰＣＩ ｃＤＮＡ塩基配列の確認 得られたＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターを様々な制限
酵素、エキソヌクレアーゼIII、ムングビーンヌクレア
ーゼを用いて処理し、ｃＤＮＡの短鎖化を行い、ｐＵＣ
１１８をベクターとして短鎖化プラスミドを再構築し
た。得られた短鎖化プラスミドを用いて宿主大腸菌ＭＶ
１３０４を形質転換した。得られた形質転換体細胞培養
液にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（宝酒造株式会社
製）を感染させ増殖したファージ粒子より一本鎖ＤＮＡ
を調製し、ジデオキシシークェンス法（SANGER, F., NI
CKLEN、S and COULSON, A. R. Proc. Nat. Acad. Sci.
U. S.A., 74, 5463 〜5467, 1977）によるＤＮＡ塩基配
列を決定した。 【００７３】図２に塩基配列を示したが、１５６６bpに
わたるほぼ完全長のｃＤＮＡを得ることができた。４塩
基目のＧから始まり、９６０塩基目で終わるＣまでの９
５７bpの塩基配列が本発明ポリペプチドの３１９個より
成るアミノ酸配列をコードしていることが明らかになっ
た。 【００７４】本発明ポリペプチドをコードしている全オ
ープンリーディングフレームを含む組換えベクターｐＭ
ＫＴ７を保持するＥ．ｃｏｌｉ ＭＶ１３０４／ｐＭＫ
Ｔ７は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第１２６２号として寄託した。 【００７５】実施例２ 発現用組換えベクターの構築及
び該組換えベクターによる宿主細胞の形質転換 （１）発現ベクターの選択 図２に示した様にＰＣＩ ｃＤＮＡの翻訳開始部位ＡＴ
Ｇは制限酵素ＮｃｏＩの認識部位の中にあり、強力なプ
ロモーターの下流にＮｃｏＩ部位を持つ発現ベクターに
連結することにより容易に発現し得る。 【００７６】そこで大腸菌の強力なプロモーターである
ｔｒｃプロモーターとＬａｃＺのリボソーム結合部位を
持ち、リボソーム結合部位の８塩基下流に翻訳開始部位
ＡＴＧを持つ発現ベクターｐＫＫ２３３−２（Amann,
E. and Brosius, J., Gene, 40, 183-190, 1985）を用
いることにした。ｐＫＫ２３３−２の翻訳開始部位ＡＴ
Ｇは制限酵素ＮｃｏＩ認識部位中に存在している。 【００７７】（２）発現用組換えベクターの構築 実施例１で作製されたＰＣＩ ｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＭＫＴ７を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄIII で切断
し、低融点アガロース・ゲル電気泳動（Bernard Perbal
著、小林茂保監訳、遺伝子操作実験実用ハンドブック、
pp211-212、19851,ジャテック出版）により本発明ポリ
ペプチドをコードする領域を含んだ１，３０９bpのＤＮ
Ａ断片を分離した。次にあらかじめ制限酵素ＮｃｏＩと
ＨｉｎｄIII で切断しておいたベクターｐＫＫ２３３−
２と本ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造株式会社製）を用いて連結し発現用組換えベクターｐ
ＭＫＴＸ１を構築した（図３）。 【００７８】（３）発現用組換えベクターによる宿主細
胞の形質転換（２）で構築された発現用組換えベクター
ｐＭＫＴＸ１をヴィースタース・シマニスの方法（Hana
han, D. (1985) In：DNA Cloning：A Practical Approa
ch, vol. 1,(D.M. Glover, ed.), pp121, IRL Press, O
xford.）により調製した宿主大腸菌ＪＭ１０５（C. Yan
isch-Perron, J. Vieira and J. Messing. Impoved M13
phage cloning vectorsand host strains：nucleotide
sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene
33, 103-119, 1985）コンピテント細胞に導入した。形
質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴＸ１
は、アンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒天平板
（バクトトリプトン １％、バクトイーストエクストラ
クト０．５％、食塩１％、寒天１．５％）上で選択を行
った。 【００７９】得られた形質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０５／ｐＭＫＴＸ１は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄１４０７号として寄託し
た。 【００８０】実施例３ ウエスタンブロッティング法に
よる本発明ポリペプチドの発現の確認 実施例２にて作製されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐ
ＭＫＴＸ１をアンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒
天平板上にて３７℃、一夜培養し、生じたコロニーを５
００ml三角フラスコに分注した５０mlのＳＯＣ培地（バ
クトトリプトン２０ｇ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ、食塩１０mM、塩化カリウム２．５mM、塩化マグネ
シウム１０mM、硫酸マグネシウム１０mM、グルコース２
０mM、アンピシリン５０μｇ／ml、蒸留水１Ｌ、pH７．
０）に接種し、３７℃、２時間振盪培養した。イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１mM
となる様に加えて、さらに２時間振盪培養を続けた。集
菌後、０．２mlのＴＢＳ（１０mMトリス−塩酸緩衝液、
１５０mM食塩、pH８．０）に懸濁し、それぞれ１００μ
ｇ／mlのリゾチーム、リボヌクレアーゼ、デオキシリボ
ヌクレアーゼを加えた。懸濁液をドライアイス／エタノ
ール中で凍結し、続けて解凍した。凍結融解を再度繰り
返した後、室温で１５分間放置し、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウムを最終濃度２０mMとなるように加え菌体
破砕液を得た。菌体破砕液の遠心上清をミリポアフィル
ターを通過させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴ
Ｘ１抽出液を得た。 【００８１】得られた抽出液１５μｌをβ−メルカプト
エタノールにて還元後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動（１０％ゲル）に付し、抗ヒト胎盤由来ＰＣＩモノ
クローナル抗体ＰＣＩ−Ａ４６とプロトブロットイムノ
ブロッティングシステム（Promega Biotec製）を用いて
ウエスタンブロッティングを行ったところ、ほぼヒト胎
盤由来ＰＣＩに相当する分子量を持った本発明ポリペプ
チドの発現を確認できた（図４）。 【００８２】実施例４ 本発明ポリペプチドの生産 （１）培養 形質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴＸ
１をアンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒天平板上
にて３７℃、一夜培養し、生じたコロニーを４本のＬ字
管に分注した各５mlのアンピシリン５０μｇ／mlを含む
ＬＢ培地（ＬＢ寒天より寒天を除いたもの）に接種し
た。３７℃、一夜振盪培養後０．５mlを５００ml三角フ
ラスコ（４０本）に分注した５０mlのＭＭＣＡ培地（リ
ン酸２カリ１０．５ｇ、リン酸１カリ４．５ｇ、硫安
１．０ｇ、クエン酸ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシ
ウム０．２ｇ、グルコース２．０ｇ、チアミン塩酸５．
０μｌ、カザミノ酸５．０ｇ、アンピシリン５０μｇ／
ml、蒸留水１Ｌ、pH７．０）に接種した。これを３７
℃、４時間振盪培養した後イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドを最終濃度１mMとなる様に加えてさ
らに２．５時間振盪培養を続けた。 【００８３】（２）抽出・精製 （ａ）集菌後、５０mlの２５mM ＥＤＴＡを含む２５mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）に懸濁し、遠心して洗
浄菌体を得た。洗浄菌体を同緩衝液７５mlに懸濁し、凍
結／融解後遠心上清を得た。残渣を再度同緩衝液７５ml
に懸濁し、凍結／融解後遠心し上清を得た。遠心上清を
併せ３０％飽和硫安にて不純物を除いた後、２５mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．４）に透析し大腸菌抽出液２４
４mlを得た。 【００８４】（ｂ）（ａ）で得た大腸菌抽出液を５０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＤＥＡＥ
トヨパールカラム（φ１．６×１０cm）に吸着させ同緩
衝液にて充分洗浄した後、０〜０．３Ｍ食塩を含有する
同緩衝液２４０mlを用い直線濃度勾配により１分画３ml
となる様に溶出させ本発明ポリペプチド含有画分３９ml
を得た（図５）。なお、各画分の本発明ポリペプチド量
はＥＬＩＳＡ法によって測定した。 【００８５】（ｃ）（ｂ）で得られた本発明ポリペプチ
ド含有画分を抗体カラム（φ３×４cm、モノクローナル
抗体ＰＣＩ−Ａ４６をブロムシアン活性化セファロース
４Ｂに固定化させたもの）に付し、０．５Ｍ食塩を含む
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）にて充分洗浄
した後、５０mlの０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（pH５．０）により１分画２mlとなる様に
溶出させ本発明ポリペプチド含有画分２０mlを得た（図
６）。これをイマーシブルＣＸ−１０（MILLIPORE製）
により濃縮し、０．１５Ｍ食塩を含む２５mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．４）に透析し、精製した本発明ポリペ
プチド標品３．７５ml（蛋白質重量４．７mg、BIO-RAD
PROTEIN ASSAY）を得た。得られた本発明ポリペプチド
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一バ
ンドを示したことから、不純物を含まない単一成分から
なると考えられる。 【００８６】なお、各精製段階において得た蛋白質の収
量を下に示す。 【００８７】 工程 蛋白質重量（mg） （ａ）工程（大腸菌抽出液） ９５．２ （ｂ）工程（DEAE−トヨパール吸着） ２１．５ （ｃ）工程（抗体カラム吸着） ４．７ 【００８８】実施例５ 本発明ポリペプチドの物性 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 本発明ポリペプチド２mgを蒸留水に対して透析後、凍結
乾燥しＪＥＯＬ ＪＡＳ−５７０Ｋシークェンスアナラ
イザーを用いてＰＴＨアミノ酸に誘導化して分析を行っ
た。分析結果を表１に示す。 【００８９】 【表１】 【００９０】以上の結果より本発明ポリペプチドのＮ末
端のアミノ酸配列は Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp と決定された。 【００９１】（２）分子量の測定 本発明ポリペプチドの分子量は２−メルカプトエタノー
ルにより還元した後、ウェーバーとオズボーンの方法
（Weber, K. & Osborn, J. H. (1969) J. Biol.Chem. 2
44, 4406-4412）に従って、１２．５％ゲルを用いたＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た。分子量マーカーとしてはホスホリラーゼｂ（M. W.
94,000）、ウシ血清アルブミン（M. W. 67,000）、卵白
アルブミン（M. W. 43,000）、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（M. W. 30,000）、大豆トリプシンインヒビター
（M. W. 20,100）、α−ラクトアルブミン（M. W. 14,4
00）を用いた。 【００９２】本発明ポリペプチドの分子量は、３４，０
００±１，０００と計算された。 【００９３】（３）等電点の測定 等電点はリグレイの方法（Wrigley, C. W. (1971) Meth
ods Enzymol. 22, 559-564）に従って、アンホラインPA
GPLATE, pH３．５−９．５（LKB製）を用いてポリアク
リルアミドゲルイソエレクトリックフォーカシングによ
り測定した。本発明ポリペプチドの等電点は５．０±
０．１と計算された。 【００９４】（４）安定性の測定 本発明ポリペプチドの血漿中での安定性を測定した。本
発明ポリペプチド（６０μｇ／ml）５μＬとヒト血漿１
００μＬを混合し３７℃にて０〜３０分間インキュベー
ト放置後０．０１２５Ｍの塩化カルシウムを２００μＬ
加えカルシウム再加法により凝固時間の延長を測定し
た。本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時間を１０
０％としたときの凝固時間延長率によって測定結果を表
２に示す。 【００９５】 【表２】 【００９６】本発明ポリペプチドは、血漿中３７℃、３
０分で安定であった。 【００９７】（５）抗血液凝固活性の測定 （ｉ）カルシウム再加血液凝固時間の測定 シリコーン処理した小ガラス試験管に本発明ポリペプチ
ドを含む溶液１００μｌとヒト標準血漿１００μｌを混
和し３７℃にて３分間放置した後、０．０２５Ｍ塩化カ
ルシウム１００μｌを加え良く混和し、血液が凝固する
までの時間を測定した。本発明ポリペプチド無添加時の
血液凝固時間を１００％としたときの凝固時間延長率に
よって測定結果を表３に示す。 【００９８】 【表３】 【００９９】（ii）プロトロンビン時間の測定 ガラスキュベットに本発明ポリペプチドを含む溶液５０
μｌと０．１５Ｍ食塩と０．５％ヒト血清アルブミンを
含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）５０μｌと
２０mM塩化カルシウムで０．１mg／mlとなる様に稀釈し
たトロンボプラスチン（リオプラスチン、持田製薬製）
１００μｌを混和し３７℃にて３分間放置後、０．１５
Ｍ食塩で１／２に稀釈したヒト標準血漿２００μｌを加
え、コアグテックＴＥ−６００（エルマー社製）を用い
て血液凝固時間を測定した。 【０１００】本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時
間を１００％としたときの凝固時間延長率によって測定
結果を表４に示す。 【０１０１】 【表４】 【０１０２】（iii）活性化部分プロトロンボプラスチ
ン時間の測定 ガラスキュベットに本発明ポリペプチドを含む溶液５０
μｌと活性化トロンボファックス（オルソ社製）５０μ
ｌを混和し３７℃にて２分間放置後ヒト血漿１００μｌ
を加え、さらに４分間放置する。０．０１２５Ｍ塩化カ
ルシウム２００μｌを加え、コアグテックＴＥ−６００
（エルマー社製）を用いて血液凝固時間を測定した。 【０１０３】本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時
間を１００％としたときの凝固時間延長率によって測定
結果を表５に示す。 【０１０４】 【表５】 【０１０５】実施例６ 本発明ポリペプチドとＰＣＩと
の抗血液凝固活性の比較 本発明ポリペプチドとヒト胎盤由来ＰＣＩの抗血液凝固
苛性を比較した。すなわち、０．５mg／mlのＰＴ試薬
（リオプラスチン・持田製薬製）１００μｌ及び各種濃
度の試料１００μｌを混和し、３分後に生理食塩水で２
倍に稀釈した標準血液２００μｌを添加し血液凝固時間
を測定した。 【０１０６】表６に示した様に本発明ポリペプチドとヒ
ト胎盤由来ＰＣＩとは、ほぼ同じ血液凝固時間（ＰＴ）
の延長効果を示した。 【０１０７】 【表６】【０１０８】実施例７ 製剤 【表７】 本発明ポリペプチド １mg アルブミン ５mg マンニトール ２５mg 塩化ナトリウム １．９５mg リン酸ナトリウム ３．８５mg 【０１０９】上記成分を注射用蒸留水２mlに溶解し、無
菌バイアルに入れ、−３０℃〜−４０℃で２時間予備凍
結し、−３０℃〜＋２０℃、真空度０．０５〜０．１To
rrで３５時間、一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．
０１〜０．０５Torrで５時間、二次乾燥して、注射用バ
イアルを製造した。
するヒト組織より得られる抗血液凝固物質（以下、ＰＣ
Ｉと称する）と同様の抗血液凝固活性を有するポリペプ
チドをコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベ
クター及び該組換えベクターを保持する形質転換体細胞
に関する。 【０００２】 【従来の技術】従来、抗血液凝固物質としてはヘパリ
ン、ヘパリンコファクター−II、アンチトロンビン−II
I、α2−マクログロブリン、α1−トリプシンインヒビ
ター、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、プロテインＣ
等が知られているが、実用に供されているのはヘパリン
のみである。しかしヘパリンには出血傾向を招く副作用
があるため、その使用方法及び使用量が極めて限定され
ており、抗血液凝固剤としては安全性の面から満足すべ
きものではなかった。 【０００３】斯かる状況の下で本出願人は、先にヒト胎
盤からＰＣＩを分離精製することに成功し、特許出願し
た（特願昭６０−２１７５１２号）。 【０００４】ＰＣＩは、下記の性質を有する医薬として
有用な物質である。 （ｉ）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法、還元状態） ３４，０００±２，０００ （ii）等電点（アンフォライトを用いる等電点カラム電
気泳動法） ４．７±０．１ （iii）安定性 イ．５０℃、３０分加熱処理で失活 ロ．pH４〜１０で安定 ハ．血漿中３７℃、３０分で安定 （iv）作用 イ．カルシウム再加凝固時間を延長 ロ．プロトロンビン時間を延長 ハ．活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 （ｖ）アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、１
／２シスチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リ
ジン及びアルギニンの存在が認められる。 さらに本出願人は、ＰＣＩに特異的なモノクローナル抗
体を作成し、特許出願した（特願昭６１−２６９５８８
号）。このモノクローナル抗体を利用することにより、
ＰＣＩの高感度検出、精製等を行うことができる。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら現在ＰＣ
Ｉを得るためにはヒト胎盤を始めとしたヒト組織を原材
料とする必要があることから、いくつかの問題があっ
た。すなわちヒト組織中より得られるＰＣＩの量には限
りがあること、原材料であるヒト組織の入手には困難が
伴い、安定して供給することは難しいこと、ヒト組織中
に存在し得る病原ウィルスの危険性が無視できないこと
等である。従って、より安価に、より大量に、より安定
して、かつ、より安全にＰＣＩを供給する方法又はこれ
と同様な作用を有する物質の開発が望まれていた。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト胎盤ｃ
ＤＮＡライブラリーよりＰＣＩ特異的抗体をプローブと
して利用することによりＰＣＩポリペプチドをコードす
るＤＮＡ断片が得られること、さらにこのＤＮＡ断片を
組み込んだ組換えベクターを用いて微生物細胞を形質転
換し、ＰＣＩ遺伝子を発現させることによりＰＣＩ様ポ
リペプチドが製造できることを見い出し、本発明を完成
した。 【０００７】すなわち、本発明は下記のアミノ酸配列 【０００８】 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp 【０００９】を有するポリペプチドをコードする新規Ｄ
ＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター及び該組換えベク
ターを保持する形質転換体細胞を提供するものである。 【００１０】 【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体細胞は、例えば
次の如くして製造される。すなわち、（１）ヒト胎盤ｃ
ＤＮＡライブラリーよりＰＣＩ特異的抗体を用いて抗体
陽性クローンをスクリーニングし、（２）単離された抗
体陽性クローンより組換えＤＮＡを調製し、この組換え
ＤＮＡよりｃＤＮＡ断片を制限酵素処理によって切出
し、プラスミドベクターに組込む。（３）得られたｃＤ
ＮＡ組換えベクターにより宿主細胞を形質転換し、本発
明の形質転換体細胞を得る。得られた本発明形質転換体
細胞を培養し、菌体中より本発明ＤＮＡ断片を含む本発
明の組換えベクターを得る。さらに得られた組換えベク
ターを適当な制限酵素で切断し、本発明のＤＮＡ断片を
得る。 【００１１】次に上記各工程について説明する。 （１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより抗体陽性クロ
ーンのスクリーニング ｃＤＮＡライブラリーはヒト胎盤よりｍＲＮＡを調製
し、逆転写酵素と適当なベクターを用いて作成すること
ができるが、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばクロ
ンテック社製ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１
１）を利用することができる。λｇｔ１１をベクターと
して作成されたｃＤＮＡライブラリーは特異抗体をプロ
ーブとしてヤングとデイウィスの方法（Huynh, T. V.,
Young, R. A. and Davis, R. W. (1985) In：DNA Cloni
ng：A Practical Approach, vol. 1,(D. M. Glover, e
d.), pp49-78. IRL Press, Oxford.）を応用してスクリ
ーニングに付し、特異抗体陽性クローンを単離すること
ができる。 【００１２】プローブとして用いる一次抗体としては、
ＰＣＩ特異抗体、例えば、抗ＰＣＩウサギポリクローナ
ル抗体、抗ＰＣＩマウスポリクローナル抗体、抗ＰＣＩ
モノクローナル抗体を用いることができるが、就中抗Ｐ
ＣＩモノクローナル抗体、特に抗ＰＣＩマウスモノクロ
ーナル抗体が好ましい。抗体は、血清、腹水、ハイブリ
ドーマ培養液、精製イムノグロブリン、いずれの状態で
も使用できる。 【００１３】抗原と結合した一次抗体の検出には、放射
性ヨード（125Ｉ）ラベルしたプロテインＡ、放射性ヨ
ード（125Ｉ）ラベルした抗イムノグロブリン抗体を用
いてオートラジオグラフィーにより行う方法、パーオキ
シダーゼラベルした抗イムノグロブリン抗体、又はアル
カリ性フォスファターゼラベルした抗イムノグロブリン
抗体を用いて酵素抗体法により行う方法を利用すること
ができる。 【００１４】なお、抗ＰＣＩモノクローナル抗体は、例
えば前記特願昭６１−２６９５８８号に記載の方法によ
って製造することができる。すなわち、ヒト胎盤より抽
出、精製したＰＣＩでマウスを免疫し、該マウスより脾
細胞を採取し、これとマウス骨髄腫細胞を細胞融合させ
る。融合処理を施した細胞をＨＡＴ選択培地を用いて培
養し、ハイブリドーマのみを増殖させる。ハイブリドー
マが増殖した培養液に対してＰＣＩを抗原として酵素抗
体法によりスクリーニングを行い、ＰＣＩに特異的なモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを得た。得
られたハイブリドーマを培養した培養液又は接種したマ
ウスの腹水からモノクローナル抗体が得られる。 【００１５】（２）ＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターの
作成 単離された抗体陽性クローンよりヤングとデイヴィスの
方法（Huynh, T. V.,Young, R. A. and Davis, R. W.
(1985) In：DNA Cloning：A Practical Approach, vol.
1, (D. M. Glover, ed.), pp49-78. IRL Press, Oxfor
d.）により組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡを抽出精製
する。精製された組換えλｇｔ１１ファージＤＮＡを制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化することによりｃＤＮＡをベク
ターＤＮＡより分離することができる。得られたｃＤＮ
Ａを同じくＥｃｏＲＩ消化した種々のクローニング用プ
ラスミドベクターと再結合し、組換えプラスミドベクタ
ーを作成する。利用できるプラスミドベクターとして
は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１１８、ｐＴＺ１８Ｒなどが挙げられる。 【００１６】（３）ＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターに
よる宿主細胞の形質転換、本発明組換えベクター及び本
発明ＤＮＡの調製 得られたＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターをその組換え
ベクターの持つ遺伝子マーカーを最大限に利用できる種
々の宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換せしめ
る。宿主細胞としては、大腸菌が好ましく、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２株の種々の変異株、例えばＨＢ１０１、Ｃ６
００Ｋ、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、χ１７７６、ＭＶ１
３０４などが利用でき、組換えベクターの導入にはカル
シウム処理によるコンピテント細胞法などが用いられ
る。 【００１７】形質転換細胞をベクターの遺伝子マーカー
に応じた選択培地中で培養し、菌体中から本発明の組換
えベクターが採取される。また、ｐＵＣ１１８、ｐＴＺ
１８Ｒをベクターとして用いた場合、得られた組換えベ
クターを保持する形質転換体大腸菌にヘルパーファージ
Ｍ１３Ｋ０７を感染させることにより一本鎖ＤＮＡを調
製することができる。得られた一本鎖ＤＮＡは、ジデオ
キシシークェンス法（Sanger, F., Nicklen, S. and Co
ulson, A.R. DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5
467, 1977）によりＤＮＡ塩基配列を決定することがで
きる。 【００１８】その塩基配列のうち、本発明で目的とする
ポリペプチドをコードする部分の塩基配列は例えば次の
如くである。 【００１９】 GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA AGATGAC 【００２０】本発明のＤＮＡ断片は、前記アミノ酸配列
をコードする能力を有すれば、上記の塩基配列には限定
されるものではない。また本発明の組換えベクターも、
前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ複
製可能であれば、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等
いずれのベクターとの組換えでもよい。 【００２１】本発明ポリペプチドは、前記本発明組換え
ベクターを保持する形質転換細胞を培養し、その培養物
から採取することにより製造することができる。しか
し、本発明ポリペプチドを効率よく生産するためには、
転写の下流方向へ順に次の（ｉ）〜（vi）、 （ｉ）プロモーター （ii）リボソーム結合部位 （iii）開始コドン （iv）本発明ポリペプチドのアミノ酸配列をコードし得
る塩基配列を有するＤＮＡ （ｖ）終止コドン （vi）転写ターミネーター を含む発現用組換えベクターを構築し、これを用いて宿
主細胞を形質転換する必要がある。 【００２２】このような発現用組換えベクターを得るた
めのベクターの宿主としては、細菌のごとき単細胞微生
物、特に大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、
ストレプトミセス（Streptomyces）が好ましい。大腸菌
を宿主とした場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の種々
の変異株、例えばＨＢ１０１、Ｃ６００Ｋ、ＪＭ１０
１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、χ１７７６、ＭＶ１３０
４などが利用できる。 【００２３】ベクターとして利用するＤＮＡは、プラス
ミドが好ましい。例えば、大腸菌を宿主とした場合、プ
ラスミドＤＮＡは、大腸菌細胞中にプラスミドが増殖す
る為に必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏｌＥ１系のプラス
ミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、さらにプロモータ
ー、転写ターミネーターとして働くＤＮＡ配列を有し、
さらに好ましくは形質転換大腸菌の選択マーカーとなる
遺伝子を含む。プロモーターとしては、例えばλＰＬ、
ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐなどのプロモ
ーターが、転写ターミネーターとしては、例えばｒｒｎ
ＢリボゾーマルＲＮＡ転写ターミネーターなどが挙げら
れる。選択マーカー遺伝子としてはアンピシリン耐性遺
伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性
遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げら
れ、これらの遺伝子の１種又は２種以上が用いられる。 【００２４】上記ベクターに、本発明ポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ、す
なわち本発明ＤＮＡ断片を組み込むには、これを含むＤ
ＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリ
ンカーを付加した後、適当な制限酵素で切断したベクタ
ーと結合させることにより行われる。例えば図２の塩基
配列を有するＤＮＡの場合には、用いられる制限酵素と
しては、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩ；ＮｃｏＩ及びＳｐｈ
Ｉ；又はＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIII等が挙げられる。 【００２５】得られた発現用組換えベクターをコンピテ
ント細胞法、プロトプラスト法、カルシウム共沈法、電
気パルス法などを用いて宿主細胞に導入すれば、本発明
ポリペプチドを効率的に生産する能力を有する形質転換
体細胞が得られる。 【００２６】本発明ポリペプチドは、得られた形質転換
体細胞を培養し、該培養細胞及び／又は培養液から抽
出、分離することにより製造される。 【００２７】形質転換体細胞の培養に際しては、種々の
天然培地、合成培地が用いられる。培地は、糖類、アル
コール類、有機酸塩などの炭素源；蛋白質混合物、アミ
ノ酸類、アンモニウム塩などの窒素源；無機塩類を含ん
でいることが望ましい。さらに、ビタミン類、選択マー
カー遺伝子に対応した抗生物質類を添加することが望ま
れる。発現の制御が可能なベクターであれば、培養途中
で遺伝子発現を誘導する操作を加える必要がある。培養
後、遠心処理を行い培養液と培養細胞とに分別する。本
発明ポリペプチドが培養細胞中に蓄積する様な場合は、
例えば凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、酵素処
理、ホモジナイザーなどを用いて細胞を破壊した後に、
例えばＥＤＴＡ、界面活性剤、尿素、塩酸グアニジンな
どを用いて本発明ポリペプチドを可溶化する必要があ
る。 【００２８】得られた本発明ポリペプチドを含む培養液
又は培養細胞抽出液を種々のカラムクロマトグラフィー
に付すことにより、精製された本発明ポリペプチドを得
ることができる。カラムクロマトグラフィーとしては、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ゲルクロマトグラフィーを単独又は組合
せて用いることができる。 【００２９】かくして得られた本発明ポリペプチドは、
次の性質を有する。 （ｉ）アミノ酸配列 Ｎ末端のアミノ酸配列をＪＥＯＬ ＪＡＳ−５７０Ｋ
シークェンスアナライザーを用い、ＰＴＨアミノ酸に誘
導化して分析した。その結果、本発明ポリペプチドのＮ
末端から１０個のアミノ酸配列は次の如く決定された。
Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp 【００３０】この結果、本発明ＤＮＡ断片の塩基配列か
ら本発明ポリペプチドのアミノ酸配列は次の如く推定さ
れる。 【００３１】 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp 【００３２】（ii）分子量 ３５，８０５（アミノ酸配列より推定） ３４，０００±１，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法、還元状態） 【００３３】（iii）等電点（アンフォライトを用いる
等電点電気泳動法） ５．０±０．１ 【００３４】（iv）安定性 血漿中３７℃、３０分で安定 【００３５】（ｖ）作用 イ．カルシウム再加凝固時間を延長 ロ．プロトロンビン時間を延長 ハ．活性化部分プロトロンボプラスチン時間を延長 【００３６】上記の如く本発明ポリペプチドは優れた抗
血液凝固活性を有し、抗血液凝固剤として有用である。 【００３７】本発明ポリペプチドを抗血液凝固剤の有効
成分として使用する場合の剤型としては、注射剤が挙げ
られる。注射剤としては、凍結乾燥粉末を用時、注射用
蒸留水、生理食塩水等に溶解して投与する形態が好まし
い。投与部位としては、静脈内が適当である。 【００３８】投与量は疾患の重症度、患者の体重等によ
り異なるが、通常１０μｇ〜１０mg／kg・day であるこ
とが好ましい。なお、本発明ポリペプチドは、上記投与
量の範囲内においては全く異常が認められず、安全であ
る。 【００３９】 【発明の効果】本発明ポリペプチドは、強力な抗血液凝
固活性を示すことから、これを有効成分として含有する
抗血液凝固剤は、血液凝固活性亢進に起因する種々の疾
患、例えば脳梗塞、心筋梗塞等の脳、心臓、末梢血管に
おける血栓症あるいはＤＩＣ（播種性血管内凝固）等の
予防及び治療に有用である。 【００４０】また、本発明ポリペプチドは、ヒト胎盤由
来の抗血液凝固物質（ＰＣＩ）と同様の性質を有するこ
とから、ヒトに対し抗原性を有さない安全な物質であ
る。さらに、ＰＣＩは抗血液凝固剤として有用であるに
もかかわらず、ヒト胎盤の入手の困難性等から大量に生
産することができないという欠点があったが、本発明ポ
リペプチドは大量かつ安価に製造できるものである。 【００４１】 【実施例】次に参考例及び実施例を挙げて本発明を説明
する。 【００４２】参考例：抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調
製 （１）抗原（ＰＣＩ）の精製 （ａ）ヒト胎盤５個（約２，５００ｇ）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。次いでワー
リングブレンダーを用いて破砕し、これにさらに、５０
mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）２Ｌを加え、ポリト
ロン（Polytron）で磨砕する。得られたホモジネートを
７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈渣を分取した。
得られた沈渣に再度５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）２Ｌを加え、ポリトロンでホモジナイズし、７，０
００rpm １５分間遠心分離して洗浄沈渣を得た。この操
作を数回繰り返し、血液成分を除去して、洗浄沈渣９３
０ｇを得た。 【００４３】（ｂ）（ａ）で得た沈渣９００ｇに、５０
mM ＥＤＴＡを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．
４）を約２Ｌ加え、ワーリングブレンダーでホモジナイ
ズする。このホモジネートを４℃にて、一夜攪拌後７，
０００rpm １５分間遠心分離して、抽出液２Ｌを得た。 【００４４】（ｃ）（ｂ）で得た抽出液に固形硫安を加
え、３５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、
７，０００rpm １５分間遠心分離し上清を分取した。こ
の上清にさらに硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２
時間放置した後７，０００rpm １５分間遠心分離し、沈
渣を分取した。得られた沈渣を２０mMトリス−塩酸緩衝
液の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜、充分
に透析した。透析中に生じた沈殿は、７，０００rpm １
５分間遠心分離して除き、透析液３９０mlを得た。 【００４５】（ｄ）得られた透析液を、２０mMトリス−
塩酸緩衝液（pH７．４）で平行化したＤＥＡＥ−トヨパ
ール（φ５．５×１９cm）に吸着させ、同緩衝液にて充
分洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩
衝液４Ｌを用い、直線濃度勾配により１分画２０mlとな
る様に溶出させた。活性画分は、ほぼ０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム濃度付近にて溶出され、３８０mlの活性画分を
得た。 【００４６】（ｅ）得られた活性画分を、０．１Ｍリン
酸緩衝液（pH７．０）に対し、４℃で一夜充分に透析
し、同緩衝液にて平衡化したブルーセファロース（φ
２．５×１２cm）カラムを通過させた。Ａ280 の吸収を
示す通過画分（４８０ml）を集め、これをダイアフロー
メンブランフィルターＹＭ−１０を用いて濃縮した。 【００４７】（ｆ）（ｅ）で得た濃縮液をセファデック
スＧ−１００を用いるゲル濾過（φ４．５×７５cm）に
付し、生理食塩水で１分画８mlになるように溶出させ、
活性画分８８〜１０４を集め、これを限外濾過により濃
縮して、ＰＣＩ１４．５ml（蛋白重量１３６．１mg，Lo
wry 法）を得た。なお、各精製段階において得た蛋白の
収量を下に示す。 【００４８】 工程 蛋白重量（mg） （ｂ）工程（ＤＥＴＡ抽出） ７２２６ （ｃ）工程（硫安分画、透析） ３１８４ （ｄ）工程（ＤＥＡＥ−トヨパール吸着） ５３１ （ｅ）工程（ブルー−セファロース吸着） １６３ （ｆ）工程（セファデックスＧ−１００吸着） １３６ 【００４９】（２）免疫脾細胞の調製 上述の如く精製したＰＣＩ １００μｇをフロイント・
コンプリート・アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／
ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で
５０μｇのＰＣＩとアジュバンド乳濁液を２回投与し、
最後にＰＣＩ ５０μｇのみを投与し免疫を完了した。
３日後にマウスを殺し、脾臓を摘出、細断した後１００
メッシュのナイロン網で濾過し、脾臓の単離細胞を得
た。 【００５０】（３）ハイブリドーマの調製 得られた免疫脾細胞に低張液（１５５mM塩化アンモニウ
ム）を加え赤血球を溶血した後Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏ
ｄｅｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を３回洗い、マウス骨髄腫細胞ＰＡ
ＩはＩＭＤＭで３回洗った。両細胞数を計測し、脾細胞
とＰＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨
て、細胞沈渣を十分解きほぐした後ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）４，０００を培地で希釈した４５％液を
０．５ml滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置
した後、ＩＭＤＭ １mlを１分間かけて静かに添加し
た。続いて１０mlを５分間かけて加え、最終４０mlにし
た遠心管を１，０００rpm 、８分間遠心した。 【００５１】沈渣を１０％ Ｆｅｓ添加ＩＭＤＭで浮遊
し再度遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０
-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及びチミジン１．６
×１０-5Ｍを加えた（ＨＡＴ−）１０％ ＦＣＳ添加Ｉ
ＭＤＭを用い沈渣を再浮遊し、９６ウェルマイクロプレ
ートに１００μｌずつ分注した。３〜４日ごとに培地５
０μｌ追加し、細胞の増殖を見た。 【００５２】ＨＡＴ選択により、ハイブリドーマのみ増
殖することを確認した。 【００５３】（４）抗体産生ハイブリドーマの検索 ハイブリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し酵素
免疫法により、ＰＣＩに対する抗体産生ハイブリドーマ
を調べた。まず、９６ウェルマイクロプレート（イムノ
プレートＩ、ヌンク社製）にＰＣＩを０．１μｇ／１０
０μｌ／ウェル分注し、２５℃で１８時間静置し吸着さ
せる。次いで検体である培養液を１００μｌ／ウェル注
入し、２５℃で２時間反応させる。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（PBS-Tween）で３回洗
浄後、ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（カペル社製）を１００μｌ／ウェル加え、２時間後Ｐ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。これに、０．００１
％過酸化水素、０．４mg／mlオルトフェニレンジアミン
（シグマ社製）の０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH４．０）を加え、波長４９２nmの吸光度を測
定した。 【００５４】検体中、ＰＣＩに対する抗体が存在したウ
ェルにのみ発色が観察されるので、発色したウェルの細
胞を採取した。 【００５５】（５）ＰＣＩに対するモノクローナル抗体
産生細胞のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細胞を
フィーダー細胞として使用した。１０％ＦＣＳ添加ＩＭ
ＤＭに浮遊した腹腔細胞（１×１０5 個／ml）を９６ウ
ェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。翌
日、抗体産生ハイブリドーマを５個／mlに調製し、各ウ
ェルに１００μｌずつ分注した。３日ごとに培地を交換
し適当な量まで細胞が増殖したウェルから順に培養上清
を採取し、上記と同一の方法により、抗体産生を確認し
た。陽性のウェルは再度クローニングし、抗ＰＣＩモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。これらのハ
イブリドーマは、６種類得られ、それぞれ産生する抗Ｐ
ＣＩモノクローナル抗体の種類により、ＰＣＩ−Ｈ３
９、ＰＣＩ−Ｈ４６、ＰＣＩ−Ｈ１６７、ＰＣＩ−Ｈ１
６９、ＰＣＩ−Ｈ１７６、ＰＣＩ−Ｈ１８０と命名し
た。 【００５６】（６）抗ＰＣＩモノクローナル抗体の調製 ７週令以上のＢＡＬＢ／ｃ系マウスにプリスタン（アル
ドリッチ社製）０．５mlを腹腔内投与し、約１週間後、
上記で得たハイブリドーマ１×１０6 個／マウス腹腔内
接種した。約１０日後、マウス腹腔より腹水を採取し
た。これを３，０００rpm、１０分間遠心分離し、上清
を分取しその５mlに硫酸アンモニウムを終濃度が５０％
飽和濃度になるように加え、４℃で一夜放置する。次い
で、３，０００rpm、１５分間遠心分離し、沈渣を０．
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８）に溶かし同緩衝液に対
して透析した。これを同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅ
ｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに付した。 【００５７】モノクローナル抗体の溶出は、０．１Ｍグ
リシン−０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（pH２．７）
で行い、抗ＰＣＩモノクローナル抗体を得た。ＰＣＩ−
Ｈ３９を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ３９ １４．２mg、
ＰＣＩ−Ｈ４６を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ４６ ２
０．２mg、ＰＣＩ−Ｈ１６７を用いた場合は、ＰＣＩ−
Ａ１６７ ２２．９mg、ＰＣＩ−Ｈ１６９を用いた場合
は、ＰＣＩ−Ａ１６９２５．０mg、ＰＣＩ−Ｈ１７６を
用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１７６ ２５．０mg、ＰＣＩ
−Ｈ１８０を用いた場合は、ＰＣＩ−Ａ１８０ ８．６
mgをそれぞれ得た。 【００５８】実施例１ ＰＣＩ ｃＤＮＡのクローニン
グ （１）ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ： （ａ）ｃＤＮＡライブラリー ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーは、クロンテック社製
（Clontech Laboratories, Inc.）でλｇｔ１１ファー
ジのＥｃｏＲＩ部位に平均１．８kbのヒト胎盤ｍＲＮＡ
より逆転写酵素を用いて作製されたｃＤＮＡがＥｃｏＲ
Ｉリンカーを介して結合されている。ライブラリーは、
１．０×１０6 個の独立クローンより成る組換えλｇｔ
１１ファージである。 【００５９】（ｂ）宿主大腸菌Ｙ１０９０（ATCC3719
7）を使用し、アンピシリン（１００μｇ／ml）とマル
トースを含むＬＢ寒天平板（バクトトリプトン１０ｇ、
バクトイーストエキストラクト５ｇ、食塩５ｇ、マルト
ース２ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ、pH７．５）にスト
リークし、３７℃、一夜培養した、生じた単コロニーを
アンピシリン（１００μｇ／ml）とマルトースを含むＬ
Ｂ培地（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキ
ストラクト５ｇ、食塩５ｇ、マルトース５ｇ、蒸留水１
Ｌ、pH７．５）に移植し、３７℃、一夜振盪培養した。 【００６０】（ｃ）ファージライブラリーの感染 ０．２mlの宿主大腸菌Ｙ１０９０の一夜培養液とλ稀釈
液（１０mMトリス−塩酸緩衝液、１０mM塩化マグネシウ
ム、pH７．５）で３．７〜５．５×１０5 pfu／mlとな
るように調製したライブラリー０．１mlを混ぜ、室温で
２０分間放置してファージを宿主菌に吸着させた。４５
℃に保温しておいたマルトースを含むＬＢ上層寒天培地
（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイーストエキストラ
クト５ｇ、食塩５ｇ、マルトース２ｇ、寒天７．２ｇ、
蒸留水１Ｌ、pH７．５）２．５mlを加え混合した後、マ
ルトースを含む直径９cmのＬＢ寒天平板上に撤き４２
℃、３時間半培養した。 【００６１】（ｄ）ニトロセルロースフィルターへの転
写 １０mMイソプロピルβ−Ｄガラクトピラノシド（IPTG）
で飽和後、乾燥した滅菌ニトロセルロースフィルターを
４２℃で３時間半培養したλｇｔ１１ファージプラーク
の生じたＬＢ寒天平板に被せた。さらに３７℃、３時間
半培養した後、フィルターを剥がし、ファージプラーク
の生じた平板は４℃に保存した。フィルターをＴＢＳＴ
（１０mMトリス−塩酸緩衝液、１５０mM食塩、０．０５
％Tween２０、pH８．０）で洗浄後、１％ブタ血清アル
ブミン／ＴＢＳＴで室温、３０分間ブロッキングを行っ
た。 【００６２】（ｅ）一次抗体の結合 フィルターを一次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温で３０分間反応させた。一次抗体としては、Ｔ
ＢＳＴに溶かした抗ＰＣＩマウスモノクローナル抗体
（参考例で得られた）混合液を室温で３０分間放置し、
不純抗体の吸収を行ってから用いた。抗ＰＣＩマウスモ
ノクローナル抗体混合液は、ＰＣＩ−Ａ３９＋ＰＣＩ−
Ａ４６＋ＰＣＩ−Ａ１８０（１：１：０．５）、１mg／
mlウシ血清アルブミン、０．２５μｇ／ml〜０．０４μ
ｇ／mlの大腸菌エキストラクト（Promega Corporation
製）を含むものを用いた。一次抗体反応後、ＴＢＳＴで
フィルターを１０分間ずつ３回洗浄した。 【００６３】（ｆ）二次抗体の結合 フィルターを二次抗体溶液に移し、ゆっくりと振盪しな
がら室温３０分間反応させた。二次抗体としては、アル
カリ製フォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（Promega Corporation製）をＴＢＳＴで１／７，５０
０倍に稀釈したものを用いた。ＴＢＳＴでフィルターを
１０分間ずつ３回洗浄、ＡＰ緩衝液（１００mMトリス−
塩酸緩衝液、１００mM食塩、５mM塩化マグネシウム、pH
９．５）で一回洗浄した。 【００６４】（ｇ）発色 ５mlのＡＰ緩衝液に３３μｌのニトロブルーテトラゾリ
ウム溶液（５０mg／ml）と６６μｌの５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルフォスフェート溶液（５０mg／
ml）を混ぜた発色基質溶液にフィルターを浸した。室
温、１時間発色後、反応停止液（２０mMトリス−塩酸緩
衝液、５mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、pH８．
０）に移し、発色を停止した。 【００６５】（ｈ）陽性プラークの調製、純化 発色の認められた陽性スポットに対応するプラークを寒
天培地ごと取り、０．１mlのＴＭＧ緩衝液（１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液、１０mM塩化マグネシウム、１００μｇ
／mlゼラチン、pH７．４）に移し、クロロホルムを２滴
加え、４℃で４，０００rpm、１５分間遠心し、上清に
クロロホルムを１滴加えて４℃に保存した。約３×１０
6 個のプラークについて上記のスクリーニングを行った
ところ、２６株の陽性プラークを得た。発色の強かった
５株についてファージ液を適当に稀釈し、さらに２回ス
クリーニング操作を繰り返しファージの純化を行った。 【００６６】（２）組換えファージＤＮＡの調製 得られた５株の組換えファージを宿主大腸菌Ｙ１００８
（ATCC337195）に感染させ、４２℃でファージを誘発さ
せ、λファージの調製法（Bernard Perbal、PREPARATIO
N OF λ PHAGE DNA. in A PRACTICAL GUIDE TO MOLECUL
AR CLONING、pp175-184、A Wiley-Interscience Public
ation, 1984, New York, U. S. A.）に準じて、プレー
ト法による少量調製、大量調製、液体培養による大量調
製を経て、１０9 pfu／mlの組換えファージを得た。 【００６７】λＤＮＡ調製法（Bernard Perbal、PURIFI
CATION OFλ DNA. in A PRACTICALGUIDE TO MOLECULAR
CLONING 、pp184-187、A Wiley-Interscience Publicat
ion, 1984, New York, U. S. A.）に従い、ポリエチレ
ングリコール沈殿法により１０11 pfu／mlに濃縮したフ
ァージ液をグリセリンのステップワイズ遠心（Bernard
Perbal著、小林成保監訳、遺伝子操作実験実用ハンドブ
ック、pp175, 1985、ジャテック出版）により精製し
た。 【００６８】精製組換えファージを用いて、同じくλＤ
ＮＡの調製法に従って、組換えファージＤＮＡの調製を
行い、３００mlの培養液から約３０〜１６０μｇのＤＮ
Ａが得られた。 【００６９】（３）ｃＤＮＡのサブクローニング ベクターとしてｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）を用
いた。ｐＵＣ１１８をＥｃｏＲＩで切断し、同じくＥｃ
ｏＲＩで切断した５株の組換えλｇｔ１１ファージＤＮ
ＡとＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。 【００７０】宿主大腸菌ＭＶ１３０４（宝酒造株式会社
製）に得られた組換えベクターを導入したところ、得ら
れた形質転換体ＭＶ１３０４より５株の組換えλｇｔ１
１ファージに対応する５種の組換えベクターｐＭＫＴ
１、ｐＭＫＴ３、ｐＭＫＴ５、ｐＭＫＴ７、ｐＭＫＴ９
が得られた。 【００７１】種々の制限酵素を用いて制限酵素地図を作
製したところ、いずれの組換えベクターも共通してＰｓ
ｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄIII の切断部位を
有していた。いずれの挿入断片も１．５kb前後の長さを
持ち、最も長い挿入断片を持つｐＭＫＴ７の制限酵素地
図を第１図に示した。ｐＭＫＴ７の大きさは、約４．８
kbであった。 【００７２】（４）ＰＣＩ ｃＤＮＡ塩基配列の確認 得られたＰＣＩ ｃＤＮＡ組換えベクターを様々な制限
酵素、エキソヌクレアーゼIII、ムングビーンヌクレア
ーゼを用いて処理し、ｃＤＮＡの短鎖化を行い、ｐＵＣ
１１８をベクターとして短鎖化プラスミドを再構築し
た。得られた短鎖化プラスミドを用いて宿主大腸菌ＭＶ
１３０４を形質転換した。得られた形質転換体細胞培養
液にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（宝酒造株式会社
製）を感染させ増殖したファージ粒子より一本鎖ＤＮＡ
を調製し、ジデオキシシークェンス法（SANGER, F., NI
CKLEN、S and COULSON, A. R. Proc. Nat. Acad. Sci.
U. S.A., 74, 5463 〜5467, 1977）によるＤＮＡ塩基配
列を決定した。 【００７３】図２に塩基配列を示したが、１５６６bpに
わたるほぼ完全長のｃＤＮＡを得ることができた。４塩
基目のＧから始まり、９６０塩基目で終わるＣまでの９
５７bpの塩基配列が本発明ポリペプチドの３１９個より
成るアミノ酸配列をコードしていることが明らかになっ
た。 【００７４】本発明ポリペプチドをコードしている全オ
ープンリーディングフレームを含む組換えベクターｐＭ
ＫＴ７を保持するＥ．ｃｏｌｉ ＭＶ１３０４／ｐＭＫ
Ｔ７は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第１２６２号として寄託した。 【００７５】実施例２ 発現用組換えベクターの構築及
び該組換えベクターによる宿主細胞の形質転換 （１）発現ベクターの選択 図２に示した様にＰＣＩ ｃＤＮＡの翻訳開始部位ＡＴ
Ｇは制限酵素ＮｃｏＩの認識部位の中にあり、強力なプ
ロモーターの下流にＮｃｏＩ部位を持つ発現ベクターに
連結することにより容易に発現し得る。 【００７６】そこで大腸菌の強力なプロモーターである
ｔｒｃプロモーターとＬａｃＺのリボソーム結合部位を
持ち、リボソーム結合部位の８塩基下流に翻訳開始部位
ＡＴＧを持つ発現ベクターｐＫＫ２３３−２（Amann,
E. and Brosius, J., Gene, 40, 183-190, 1985）を用
いることにした。ｐＫＫ２３３−２の翻訳開始部位ＡＴ
Ｇは制限酵素ＮｃｏＩ認識部位中に存在している。 【００７７】（２）発現用組換えベクターの構築 実施例１で作製されたＰＣＩ ｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＭＫＴ７を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄIII で切断
し、低融点アガロース・ゲル電気泳動（Bernard Perbal
著、小林茂保監訳、遺伝子操作実験実用ハンドブック、
pp211-212、19851,ジャテック出版）により本発明ポリ
ペプチドをコードする領域を含んだ１，３０９bpのＤＮ
Ａ断片を分離した。次にあらかじめ制限酵素ＮｃｏＩと
ＨｉｎｄIII で切断しておいたベクターｐＫＫ２３３−
２と本ＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造株式会社製）を用いて連結し発現用組換えベクターｐ
ＭＫＴＸ１を構築した（図３）。 【００７８】（３）発現用組換えベクターによる宿主細
胞の形質転換（２）で構築された発現用組換えベクター
ｐＭＫＴＸ１をヴィースタース・シマニスの方法（Hana
han, D. (1985) In：DNA Cloning：A Practical Approa
ch, vol. 1,(D.M. Glover, ed.), pp121, IRL Press, O
xford.）により調製した宿主大腸菌ＪＭ１０５（C. Yan
isch-Perron, J. Vieira and J. Messing. Impoved M13
phage cloning vectorsand host strains：nucleotide
sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene
33, 103-119, 1985）コンピテント細胞に導入した。形
質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴＸ１
は、アンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒天平板
（バクトトリプトン １％、バクトイーストエクストラ
クト０．５％、食塩１％、寒天１．５％）上で選択を行
った。 【００７９】得られた形質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０５／ｐＭＫＴＸ１は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄１４０７号として寄託し
た。 【００８０】実施例３ ウエスタンブロッティング法に
よる本発明ポリペプチドの発現の確認 実施例２にて作製されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐ
ＭＫＴＸ１をアンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒
天平板上にて３７℃、一夜培養し、生じたコロニーを５
００ml三角フラスコに分注した５０mlのＳＯＣ培地（バ
クトトリプトン２０ｇ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ、食塩１０mM、塩化カリウム２．５mM、塩化マグネ
シウム１０mM、硫酸マグネシウム１０mM、グルコース２
０mM、アンピシリン５０μｇ／ml、蒸留水１Ｌ、pH７．
０）に接種し、３７℃、２時間振盪培養した。イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１mM
となる様に加えて、さらに２時間振盪培養を続けた。集
菌後、０．２mlのＴＢＳ（１０mMトリス−塩酸緩衝液、
１５０mM食塩、pH８．０）に懸濁し、それぞれ１００μ
ｇ／mlのリゾチーム、リボヌクレアーゼ、デオキシリボ
ヌクレアーゼを加えた。懸濁液をドライアイス／エタノ
ール中で凍結し、続けて解凍した。凍結融解を再度繰り
返した後、室温で１５分間放置し、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウムを最終濃度２０mMとなるように加え菌体
破砕液を得た。菌体破砕液の遠心上清をミリポアフィル
ターを通過させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴ
Ｘ１抽出液を得た。 【００８１】得られた抽出液１５μｌをβ−メルカプト
エタノールにて還元後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動（１０％ゲル）に付し、抗ヒト胎盤由来ＰＣＩモノ
クローナル抗体ＰＣＩ−Ａ４６とプロトブロットイムノ
ブロッティングシステム（Promega Biotec製）を用いて
ウエスタンブロッティングを行ったところ、ほぼヒト胎
盤由来ＰＣＩに相当する分子量を持った本発明ポリペプ
チドの発現を確認できた（図４）。 【００８２】実施例４ 本発明ポリペプチドの生産 （１）培養 形質転換体細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＭＫＴＸ
１をアンピシリン１００μｇ／mlを含むＬＢ寒天平板上
にて３７℃、一夜培養し、生じたコロニーを４本のＬ字
管に分注した各５mlのアンピシリン５０μｇ／mlを含む
ＬＢ培地（ＬＢ寒天より寒天を除いたもの）に接種し
た。３７℃、一夜振盪培養後０．５mlを５００ml三角フ
ラスコ（４０本）に分注した５０mlのＭＭＣＡ培地（リ
ン酸２カリ１０．５ｇ、リン酸１カリ４．５ｇ、硫安
１．０ｇ、クエン酸ナトリウム０．５ｇ、硫酸マグネシ
ウム０．２ｇ、グルコース２．０ｇ、チアミン塩酸５．
０μｌ、カザミノ酸５．０ｇ、アンピシリン５０μｇ／
ml、蒸留水１Ｌ、pH７．０）に接種した。これを３７
℃、４時間振盪培養した後イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドを最終濃度１mMとなる様に加えてさ
らに２．５時間振盪培養を続けた。 【００８３】（２）抽出・精製 （ａ）集菌後、５０mlの２５mM ＥＤＴＡを含む２５mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）に懸濁し、遠心して洗
浄菌体を得た。洗浄菌体を同緩衝液７５mlに懸濁し、凍
結／融解後遠心上清を得た。残渣を再度同緩衝液７５ml
に懸濁し、凍結／融解後遠心し上清を得た。遠心上清を
併せ３０％飽和硫安にて不純物を除いた後、２５mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．４）に透析し大腸菌抽出液２４
４mlを得た。 【００８４】（ｂ）（ａ）で得た大腸菌抽出液を５０mM
トリス−塩酸緩衝液（pH７．４）で平衡化したＤＥＡＥ
トヨパールカラム（φ１．６×１０cm）に吸着させ同緩
衝液にて充分洗浄した後、０〜０．３Ｍ食塩を含有する
同緩衝液２４０mlを用い直線濃度勾配により１分画３ml
となる様に溶出させ本発明ポリペプチド含有画分３９ml
を得た（図５）。なお、各画分の本発明ポリペプチド量
はＥＬＩＳＡ法によって測定した。 【００８５】（ｃ）（ｂ）で得られた本発明ポリペプチ
ド含有画分を抗体カラム（φ３×４cm、モノクローナル
抗体ＰＣＩ−Ａ４６をブロムシアン活性化セファロース
４Ｂに固定化させたもの）に付し、０．５Ｍ食塩を含む
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）にて充分洗浄
した後、５０mlの０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（pH５．０）により１分画２mlとなる様に
溶出させ本発明ポリペプチド含有画分２０mlを得た（図
６）。これをイマーシブルＣＸ−１０（MILLIPORE製）
により濃縮し、０．１５Ｍ食塩を含む２５mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．４）に透析し、精製した本発明ポリペ
プチド標品３．７５ml（蛋白質重量４．７mg、BIO-RAD
PROTEIN ASSAY）を得た。得られた本発明ポリペプチド
はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて単一バ
ンドを示したことから、不純物を含まない単一成分から
なると考えられる。 【００８６】なお、各精製段階において得た蛋白質の収
量を下に示す。 【００８７】 工程 蛋白質重量（mg） （ａ）工程（大腸菌抽出液） ９５．２ （ｂ）工程（DEAE−トヨパール吸着） ２１．５ （ｃ）工程（抗体カラム吸着） ４．７ 【００８８】実施例５ 本発明ポリペプチドの物性 （１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 本発明ポリペプチド２mgを蒸留水に対して透析後、凍結
乾燥しＪＥＯＬ ＪＡＳ−５７０Ｋシークェンスアナラ
イザーを用いてＰＴＨアミノ酸に誘導化して分析を行っ
た。分析結果を表１に示す。 【００８９】 【表１】 【００９０】以上の結果より本発明ポリペプチドのＮ末
端のアミノ酸配列は Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp と決定された。 【００９１】（２）分子量の測定 本発明ポリペプチドの分子量は２−メルカプトエタノー
ルにより還元した後、ウェーバーとオズボーンの方法
（Weber, K. & Osborn, J. H. (1969) J. Biol.Chem. 2
44, 4406-4412）に従って、１２．５％ゲルを用いたＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た。分子量マーカーとしてはホスホリラーゼｂ（M. W.
94,000）、ウシ血清アルブミン（M. W. 67,000）、卵白
アルブミン（M. W. 43,000）、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（M. W. 30,000）、大豆トリプシンインヒビター
（M. W. 20,100）、α−ラクトアルブミン（M. W. 14,4
00）を用いた。 【００９２】本発明ポリペプチドの分子量は、３４，０
００±１，０００と計算された。 【００９３】（３）等電点の測定 等電点はリグレイの方法（Wrigley, C. W. (1971) Meth
ods Enzymol. 22, 559-564）に従って、アンホラインPA
GPLATE, pH３．５−９．５（LKB製）を用いてポリアク
リルアミドゲルイソエレクトリックフォーカシングによ
り測定した。本発明ポリペプチドの等電点は５．０±
０．１と計算された。 【００９４】（４）安定性の測定 本発明ポリペプチドの血漿中での安定性を測定した。本
発明ポリペプチド（６０μｇ／ml）５μＬとヒト血漿１
００μＬを混合し３７℃にて０〜３０分間インキュベー
ト放置後０．０１２５Ｍの塩化カルシウムを２００μＬ
加えカルシウム再加法により凝固時間の延長を測定し
た。本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時間を１０
０％としたときの凝固時間延長率によって測定結果を表
２に示す。 【００９５】 【表２】 【００９６】本発明ポリペプチドは、血漿中３７℃、３
０分で安定であった。 【００９７】（５）抗血液凝固活性の測定 （ｉ）カルシウム再加血液凝固時間の測定 シリコーン処理した小ガラス試験管に本発明ポリペプチ
ドを含む溶液１００μｌとヒト標準血漿１００μｌを混
和し３７℃にて３分間放置した後、０．０２５Ｍ塩化カ
ルシウム１００μｌを加え良く混和し、血液が凝固する
までの時間を測定した。本発明ポリペプチド無添加時の
血液凝固時間を１００％としたときの凝固時間延長率に
よって測定結果を表３に示す。 【００９８】 【表３】 【００９９】（ii）プロトロンビン時間の測定 ガラスキュベットに本発明ポリペプチドを含む溶液５０
μｌと０．１５Ｍ食塩と０．５％ヒト血清アルブミンを
含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）５０μｌと
２０mM塩化カルシウムで０．１mg／mlとなる様に稀釈し
たトロンボプラスチン（リオプラスチン、持田製薬製）
１００μｌを混和し３７℃にて３分間放置後、０．１５
Ｍ食塩で１／２に稀釈したヒト標準血漿２００μｌを加
え、コアグテックＴＥ−６００（エルマー社製）を用い
て血液凝固時間を測定した。 【０１００】本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時
間を１００％としたときの凝固時間延長率によって測定
結果を表４に示す。 【０１０１】 【表４】 【０１０２】（iii）活性化部分プロトロンボプラスチ
ン時間の測定 ガラスキュベットに本発明ポリペプチドを含む溶液５０
μｌと活性化トロンボファックス（オルソ社製）５０μ
ｌを混和し３７℃にて２分間放置後ヒト血漿１００μｌ
を加え、さらに４分間放置する。０．０１２５Ｍ塩化カ
ルシウム２００μｌを加え、コアグテックＴＥ−６００
（エルマー社製）を用いて血液凝固時間を測定した。 【０１０３】本発明ポリペプチド無添加時の血液凝固時
間を１００％としたときの凝固時間延長率によって測定
結果を表５に示す。 【０１０４】 【表５】 【０１０５】実施例６ 本発明ポリペプチドとＰＣＩと
の抗血液凝固活性の比較 本発明ポリペプチドとヒト胎盤由来ＰＣＩの抗血液凝固
苛性を比較した。すなわち、０．５mg／mlのＰＴ試薬
（リオプラスチン・持田製薬製）１００μｌ及び各種濃
度の試料１００μｌを混和し、３分後に生理食塩水で２
倍に稀釈した標準血液２００μｌを添加し血液凝固時間
を測定した。 【０１０６】表６に示した様に本発明ポリペプチドとヒ
ト胎盤由来ＰＣＩとは、ほぼ同じ血液凝固時間（ＰＴ）
の延長効果を示した。 【０１０７】 【表６】【０１０８】実施例７ 製剤 【表７】 本発明ポリペプチド １mg アルブミン ５mg マンニトール ２５mg 塩化ナトリウム １．９５mg リン酸ナトリウム ３．８５mg 【０１０９】上記成分を注射用蒸留水２mlに溶解し、無
菌バイアルに入れ、−３０℃〜−４０℃で２時間予備凍
結し、−３０℃〜＋２０℃、真空度０．０５〜０．１To
rrで３５時間、一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．
０１〜０．０５Torrで５時間、二次乾燥して、注射用バ
イアルを製造した。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明組換えベクターｐＭＫＴ７の制限酵素地
図を示す模式図である。 【図２】本発明のＰＣＩ ｃＤＮＡの全塩基配列を示す
説明図である。翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１番目とし
て番号を付した。 【図３】本発明ポリペプチド発現用組換えベクターｐＭ
ＫＴＸ１の制限酵素地図を示す模式図である。 【図４】本発明ポリペプチドのＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル（１０％ゲル）電気泳動上におけるウェスタンブ
ロッティングの結果を示す図面である。レーン１はＩＰ
ＴＧを添加して培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐ
ＭＫＴＸ１の菌体抽出液を泳動したものである。レーン
２はＩＰＴＧを添加せず培養したＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
５／ｐＭＫＴＸ１の菌体抽出液を泳動したものである。
レーン３はＩＰＴＧを添加して培養したＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５／ｐＫＫ２３３−２の菌体抽出液を泳動した
ものである。レーン４はＩＰＴＧを添加せず培養した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＫＫ２３３−２の菌体抽
出液を泳動したものである。レーン５はＰＣＩを泳動し
たものである。 【図５】実施例４における大腸菌抽出液の食塩濃度勾配
によるＤＥＡＥトヨパールカラムからの溶出を示す図面
である。影を施した画分を集めた。 【図６】実施例４における抗体カラムからの本発明ペプ
チドの溶出を示す図面である。影を施した画分を集め
た。
図を示す模式図である。 【図２】本発明のＰＣＩ ｃＤＮＡの全塩基配列を示す
説明図である。翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１番目とし
て番号を付した。 【図３】本発明ポリペプチド発現用組換えベクターｐＭ
ＫＴＸ１の制限酵素地図を示す模式図である。 【図４】本発明ポリペプチドのＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル（１０％ゲル）電気泳動上におけるウェスタンブ
ロッティングの結果を示す図面である。レーン１はＩＰ
ＴＧを添加して培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐ
ＭＫＴＸ１の菌体抽出液を泳動したものである。レーン
２はＩＰＴＧを添加せず培養したＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
５／ｐＭＫＴＸ１の菌体抽出液を泳動したものである。
レーン３はＩＰＴＧを添加して培養したＥ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５／ｐＫＫ２３３−２の菌体抽出液を泳動した
ものである。レーン４はＩＰＴＧを添加せず培養した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＫＫ２３３−２の菌体抽
出液を泳動したものである。レーン５はＰＣＩを泳動し
たものである。 【図５】実施例４における大腸菌抽出液の食塩濃度勾配
によるＤＥＡＥトヨパールカラムからの溶出を示す図面
である。影を施した画分を集めた。 【図６】実施例４における抗体カラムからの本発明ペプ
チドの溶出を示す図面である。影を施した画分を集め
た。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
// Ｃ０７Ｋ 14/745 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 ＥＵＲ．Ｊ．ＯＢＳ．ＧＹＮ．ＲＥ
Ｐ．ＢＩＯＬ．17 （1984） Ｐ．149
−154
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記のアミノ酸配列 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ断片、及びこれ
に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片。 ２．塩基配列が下記 GCACAGGTTC TCAGAGGCAC TGTGACTGAC TTCCCTGGAT TTGATGAGCG GGCTGATGCA GAAACTCTTC GGAAGGCTAT GAAAGGCTTG GGCACAGATG AGGAGAGCAT CCTGACTCTG TTGACATCCC GAAGTAATGC TCAGCGCCAG GAAATCTCTG CAGCTTTTAA GACTCTGTTT GGCAGGGATC TTCTGGATGA CCTGAAATCA GAACTAACTG GAAAATTTGA AAAATTAATT GTGGCTCTGA TGAAACCCTC TCGGCTTTAT GATGCTTATG AACTGAAACA TGCCTTGAAG GGAGCTGGAA CAAATGAAAA AGTACTGACA GAAATTATTG CTTCAAGGAC ACCTGAAGAA CTGAGAGCCA TCAAACAAGT TTATGAAGAA GAATATGGCT CAAGCCTGGA AGATGACGTG GTGGGGGACA CTTCAGGGTA CTACCAGCGG ATGTTGGTGG TTCTCCTTCA GGCTAACAGA GACCCTGATG CTGGAATTGA TGAAGCTCAA GTTGAACAAG ATGCTCAGGC TTTATTTCAG GCTGGAGAAC TTAAATGGGG GACAGATGAA GAAAAGTTTA TCACCATCTT TGGAACACGA AGTGTGTCTC ATTTGAGAAA GGTGTTTGAC AAGTACATGA CTATATCAGG ATTTCAAATT GAGGAAACCA TTGACCGCGA GACTTCTGGC AATTTAGAGC AACTACTCCT TGCTGTTGTG AAATCTATTC GAAGTATACC TGCCTACCTT GCAGAGACCC TCTATTATGC TATGAAGGGA GCTGGGACAG ATGATCATAC CCTCATCAGA GTCATGGTTT CCAGGAGTGA GATTGATCTG TTTAACATCA GGAAGGAGTT TAGGAAGAAT TTTGCCACCT CTCTTTATTC CATGATTAAG GGAGATACAT CTGGGGACTA TAAGAAAGCT CTTCTGCTGC TCTGTGGAGA AGATGAC 又は本配列に相補的なものである特許請求の範囲第１項
記載のＤＮＡ断片。 ３．下記のアミノ酸配列 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ断片及び／又は
これに相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片と複製可能
なベクターからなる組換えベクター。 ４．転写の下流方向へ順に次の（ｉ）〜（vi）、 （ｉ）プロモーター （ii）リボソーム結合部位 （iii）開始コドン （iv）下記のアミノ酸配列 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ （ｖ）終止コドン （vi）転写ターミネーター を含有するものである特許請求の範囲第３項記載の組換
えベクター。 ５．下記のアミノ酸配列 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ断片及び／又は
これに相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片と複製可能
なベクターからなる組換えベクターを保持する形質転換
体細胞。 ６．組換えベクターが、転写の下流方向に順に次の
（ｉ）〜（vi）、 （ｉ）プロモーター （ii）リボソーム結合部位 （iii）開始コドン （iv）下記のアミノ酸配列 Ala-Gln-Val-Leu-Arg-Gly-Thr-Val-Thr-Asp-Phe-Pro-Gly-Phe-Asp- Glu-Arg-Ala-Asp-Ala-Glu-Thr-Leu-Arg-Lys-Ala-Met-Lys-Gly-Leu- Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Leu-Thr-Leu-Leu-Thr-Ser-Arg-Ser- Asn-Ala-Gln-Arg-Gln-Glu-Ile-Ser-Ala-Ala-Phe-Lys-Thr-Leu-Phe- Gly-Arg-Asp-Leu-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Ser-Glu-Leu-Thr-Gly-Lys- Phe-Glu-Lys-Leu-Ile-Val-Ala-Leu-Met-Lys-Pro-Ser-Arg-Leu-Tyr- Asp-Ala-Tyr-Glu-Leu-Lys-His-Ala-Leu-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asn- Glu-Lys-Val-Leu-Thr-Glu-Ile-Ile-Ala-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Glu- Leu-Arg-Ala-Ile-Lys-Gln-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Tyr-Gly-Ser-Ser- Leu-Glu-Asp-Asp-Val-Val-Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Gln-Arg- Met-Leu-Val-Val-Leu-Leu-Gln-Ala-Asn-Arg-Asp-Pro-Asp-Ala-Gly- Ile-Asp-Glu-Ala-Gln-Val-Glu-Gln-Asp-Ala-Gln-Ala-Leu-Phe-Gln- Ala-Gly-Glu-Leu-Lys-Trp-Gly-Thr-Asp-Glu-Glu-Lys-Phe-Ile-Thr- Ile-Phe-Gly-Thr-Arg-Ser-Val-Ser-His-Leu-Arg-Lys-Val-Phe-Asp- Lys-Tyr-Met-Thr-Ile-Ser-Gly-Phe-Gln-Ile-Glu-Glu-Thr-Ile-Asp- Arg-Glu-Thr-Ser-Gly-Asn-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Leu-Ala-Val-Val- Lys-Ser-Ile-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Glu-Thr-Leu-Tyr- Tyr-Ala-Met-Lys-Gly-Ala-Gly-Thr-Asp-Asp-His-Thr-Leu-Ile-Arg- Val-Met-Val-Ser-Arg-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Phe-Asn-Ile-Arg-Lys- Glu-Phe-Arg-Lys-Asn-Phe-Ala-Thr-Ser-Leu-Tyr-Ser-Met-Ile-Lys- Gly-Asp-Thr-Ser-Gly-Asp-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-Cys- Gly-Glu-Asp-Asp をコードし得る塩基配列を有するＤＮＡ （ｖ）終止コドン （vi）転写ターミネーター を含有するものである特許請求の範囲第５項記載の形質
転換体細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9009094A JP2759320B2 (ja) | 1987-02-20 | 1997-01-22 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-37227 | 1987-02-20 | ||
| JP3722787 | 1987-02-20 | ||
| JP9009094A JP2759320B2 (ja) | 1987-02-20 | 1997-01-22 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH09308491A JPH09308491A (ja) | 1997-12-02 |
| JP2759320B2 true JP2759320B2 (ja) | 1998-05-28 |
Family
ID=26343747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9009094A Expired - Lifetime JP2759320B2 (ja) | 1987-02-20 | 1997-01-22 | 抗血液凝固作用を有するポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2759320B2 (ja) |
-
1997
- 1997-01-22 JP JP9009094A patent/JP2759320B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＥＵＲ．Ｊ．ＯＢＳ．ＧＹＮ．ＲＥＰ．ＢＩＯＬ．１７ （１９８４） Ｐ．１４９−１５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09308491A (ja) | 1997-12-02 |
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