JPH03178999A - 脳由来の膜蛋白質に対する抗体 - Google Patents

脳由来の膜蛋白質に対する抗体

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JPH03178999A
JPH03178999A JP2269728A JP26972890A JPH03178999A JP H03178999 A JPH03178999 A JP H03178999A JP 2269728 A JP2269728 A JP 2269728A JP 26972890 A JP26972890 A JP 26972890A JP H03178999 A JPH03178999 A JP H03178999A
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ebzd
amino acid
brain
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Mohammed Shoyab
ショヤブ，モハメッド
Hans Marquardt
マルカート，ハンス
George J Todaro
トダロ，ジョージ　ジェイ
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Oncogen LP
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
患（腫瘍形成を含む）の基本的原因であると思われる。
増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（例え
ば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興（１
） 味が持たれており、更にまた特に有糸分裂が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセプ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に
用いられているベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）ば、γ−ア
ミノ酪酸（ＧＡＢＡ）で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。
ＢＺＤによるＧＡＢＡ−作動性伝達の調節における第一
段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ飽
和できる結合部位に対する結合であると思われ、この場
合にその結合部位は“超分子複合体”（ｓｕｐｅｒｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）の（２） 成分であると考えられる。この系を理解すること、及び
その系を調節又は制御することができることの必要性は
、天然リガンド及びそれが機能する態様を知ることに依
存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる。
〔従来の技術〕
Ｂｅａ　Ｉ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏ　ｈ　ｓ、（１９７９）　３　：９３−９６は、増殖
及びＤＩＪＡ合成を正常細胞中でよりも形質転換細胞中
で一層抑制するペプチドがヒト（３） の尿中に存在することを報告している。Ｈｏ１ｌｅｙ等
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１
９８０）７７　：　５９８９−５９９２は、上皮細胞成
長阻害物質の精製を記載している。
Ｌｅｔａｎｓｋｙ、、Ｂｉｏｓｃｉ、　Ｒｅ　、　（１
９８２）　２　：　３９　４５ば、ウシの胎盤から精製
されたペプチドが腫瘍の増殖及びＤＮＡ中−５のチミジ
ンの取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く
抑制することを報告しでいる。Ｃｈｅｎ、、Ｔｒｅｎｄ
ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、（１９８２）　７　：
３６４−３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水
流体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄｉｎｇ
及び５ｃｈａｌｌｙ　、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８２）７９ニア０１４−７０
１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗−
分裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視床下
部から単離することを報告している。これらの殆どの因
子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基本
的構造は知られていない。
ジアゼパム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
［ＪＳＡ（１９８３）６０　　：　　　３８３　　３８
５Ｃｏｓ　ｔａ等、ハ■シｈａｒｍａｃｏ１．　（１９
８４）２３　：　　９８９　９９１（４） Ｆｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、　
（１９８４）２３　：　１３５９Ｉ３６２、及びＡｌｈ
ｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２９　：　１
７９１８２によって報告されそして説明されている。
〔発明の概要〕
新規な方法及び組成物が提供され、これらの組成物は、
ゲル浸透カラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジェントの酸性（０，１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される。
（５） 〔具体的な説明〕 天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な組成物、及び種々のポ
リペプチドをコードしている核酸配列が提供される。そ
のポリペプチドはを椎動物、特に哺乳動物の脳細胞中に
天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は実
質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をもつ
。
その諸組酸物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。
このポリペプチドは、ホモジナイズされた脳組織又はそ
の精製された両分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
ＨＰＬＣ及びゆるやかな直線グラジェントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の成分につい
ては所（６） 望の活性は水性酸性ｎ−プロパツールを直線グラジェン
トとして用いて更に精製することができる。
そのクロマトグラムは、約０．１〜０．５　ｍＱ　７分
の流速で合理的な分離を得るために４時間以上の時間に
わたって展開することができる。逆相）ＩＰＬＣを用い
ての分離では脳組織からの部分的に精製されたサンプル
をもたらすのが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透
クロマトグラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセト
ニトリルを用い、特に均一に溶出することによって好都
合に遠戚することができる。好都合には、媒体は０．１
％トリフルオロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルで
あることができる。
二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼピン（Ｅ
ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム（ｖａｌ
ｉｕｍ）アゴニス１−としてジアゼパムレセプターに結
合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明
らかである。ＥＢＺＤは、低い投与量では、哺乳動物に
興奮及び増強された意識を引（７） き起こし、一方高い投与量では、鎮静を引き起こす。拍
動心臓細胞集合体については、低い投与量では心臓拍動
度数は低下し、一方高い投与量では心臓拍動度数は増大
する。それらの化合物はジアゼパム結合性阻害剤につい
て公表された（前記のＧｕｉｄｏｔｔｉ等の文献）配列
との幾らかの相同性を示す。
このペプチドは、脳シナプトソームへのベンゾジアゼピ
ンの結合を抑制することにおいて、約１〜１０団、普通
には３〜６団のＫｉをもつことを更に特徴とする（後記
の実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約７〜１５ｋ
Ｄａｌ、普通には８〜１２ｋＤａ　Ｉ、又は５Ｏ３−Ｐ
ＡＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記
の実験の項を参照のこと）。このペプチドは親水性であ
る。１０００ユニツト／■を越える比活性を得ることが
できる（後記の実験の項を参照のこと）。
ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのアごノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異な（
８） った種にわたる共通配列）はジアゼパム結合性阻害剤と
しての活性をもつ。
第二の成分は脳因子（ＢＰ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い。その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の成長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
ＢＦは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５〜２０ｋＤａｌ、普通には約８〜１８ｋＤａｌの
分子量をもつ。この蛋白質は逆相１１ＰＬｃ及び直線グ
ラジェントの０．１％ＴＦＡ水性ｎ−プロパツールを用
い、約２０〜２６％ｎ−プロパツールで溶出して精製す
ることができる。その精製された蛋白質は少なくとも約
１５Ｘ１０３ユニツト／μｇの比活性をもつことができ
る（後記の実験の項を参照のこと）。
第三成分は、アミノ酸配列）［ＷＤＩＶＮ　（ｈＥＢＺ
Ｄのアミ（９） ノ酸５４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチドのプ
ールであるプローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダ配
列及びストップトランスファー配列をもち、それで表面
膜蛋白質として作用することができ、この場合にそのペ
プチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実質
的に脳組織中に位置している。
これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特にを椎
動物、−層特定的には哺乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコジル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセプター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のペプチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合させ、又は（１０） １個以上の、普通には数で約１０％以下の、−層普通に
は数で約５％以下の、挿入、欠失、トランジション又は
トランスバージョンによって変更されるアミノ酸をもつ
ことによって変異させて、変更することができる。
各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する。
ＥＢＺＤポリペプチド ＥＢＺＤポリペプチドは約２０キロドルトン（ｋＤａｌ
）未満、普通には約１５ｋＤａ１未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約１ｋＤａ＋、−Ｎｇ
通には少なくとも約２ｋＤａｌである。
そのポリペプチド組成物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下
で０．１％水性トリフルオロ酢酸中の０〜６０％アセト
ニトリルの直線グラジェントを用いて、２８〜５０％ア
セトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、−層
特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、−層特異的
には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμｍボンダ
バック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　−ＣＩａカラムから溶出
することを更に特徴とする。
ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、（１１
） 一層普通には少なくとも約２０個のアミノ酸、そして約
１２５個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よ
りも少ないアごノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実
験の項で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマト
グラフィーにおいて約７〜１５ｋＤａ　Ｉの範囲内の分
子量をもつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも２つ
、−層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
ａ、　　Ｙ　　ａａＩ！　ａａ”　　Ａｒ　　Ｋ　　（
］　　Ａ　　Ｔ　　ａａｂｂ、　Ｋ　Ｗ　Ｄ　Ａ　Ｗ ｃ、ＡＭａａ’ＡＹ（Ｘ）ｘＶＥＥ ｄ、　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａｐＥ　Ｅ　Ｍ　Ｌ　Ｆ
　Ｉ　Ｙ　ａａｌｌｔｌ　Ｙ　Ｋｅ、ＱＡＴＶＧＤＩＮ
ＴＥＲＰＧＭＬＤｆ、ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥｌ？ＰＧＭ
ＬＤＦＴＧＫｇ、ＫＧＴＳＫＥＤ八 （１２） 上記の配列において、 ａａ’″は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及び
ヒスチジンであり； ａａｂはいずれかのアくノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり； ａａｃはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、−層特定
的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それば極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａｅは脂肪族中性アミ
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもので
あり；ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミドで
あって且つ４〜５個の炭素原子をもつもの（１３） であり； Ａｒは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にＹを包含
し； ａａｑは脂肪族アごノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、−層特定的には第一
中性アくノ酸、第二酸性アくノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり；そして Ｘは０又は１である。
主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： （１４） 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＥ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　Ｆ　ＨＹ　Ｗ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアもノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである： ａ、　ＴＫＰａａ’　ＤＥＥＭＬＦＩＹａａ’　ＨＹＫ
ＱＡＴａａ’　Ｇｂ、　　ＫＷＤＡＷａａ９　ａａｈ　
　Ｌａａ’　　ａａ’　　ａａ’　　ａａ’　　ＫＥａ
ａ’　　八Ｍａａ”ＡＹ　（Ｘ）ＸＶＥＥ　ａａ’　Ｋ
Ｋ ｃ、　ＫＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤＦＴ上記の
配列において、 ａａ’　１　ａａＯ＋　ａａｑ、及びＡｒは前記で定義
した通りであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜６個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、−層特定的には５〜６
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸で（１５） あることができ； ａａ９は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、−
層普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アくノ
酸であり； ａａｈは脂肪族アごノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アごノ酸であることができ； ａａ”は脂肪族アミノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、−層特定的には非極性
中性アミノ酸であり； ａａ’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、−層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族アくノ
酸であり； ａａｋは脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、−層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり；（１６） ａａ’　は脂肪族中性アミノ酸、特にヒドロキシル官能
基及び約３〜４個の炭素原子をもつ極性アミノ酸であり
； ａａ″′は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり； ａａ’は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａａ′″は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性
又は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒド
ロキシル基をもち、好ましくはＡであり；Ｘ′はＸと同
しであり、普通には１〜３個のアごノ酸であり、それは
脂肪族アミノ酸であり、それは−船釣には４〜６個の炭
素原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、
特にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミ
ド、及（１７） び塩基性７５ノ酸であり； Ｘは０又は１であり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Ｘの他に更に、本発明のポリペプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために１〜３個、好ましくは
１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然Ｌ−アξノ酸であるが
、ある場合には、Ｄアミノ酸が使用されてもよい。
特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：（１８） φ−ＺＨ−ａａ’−ａａ”−ａａ’−ａａ’−ａａ’−
ａａ”−ａａ７−ａａ８に−ａａ”−ａａ”−ａａ’　
２−ａａ”−ａａ”−Ｐ−ａａ”−ａａ”Ｅ−ａａ”−
Ｍ−Ｌ−ａａ”−ａａ２３−Ｙ−ａａ”−ａａ”ａａ”
−に−Ｑ−八−Ｔ−ａａ”−Ｇ−ａａ”−ａａ３５−ａ
ａ”ａａ３７−ａａ３Ｂ−ａａ”−Ｐ−Ｇ−ａａ”−ａ
ａ４３−Ｄ−ａａ４５ａａ４６−Ｇ−ａａ”−ａａ”−
に−Ｗ−Ｄ−Ａ−Ｗ−ａａ”ａａ”−Ｌ−ａａｓｌｌ−
ａａ５９−ａａ６０−ａａ”−に−Ｅ−ａａ”＾−Ｍ−
ａａ”−ａａ”−Ｙ−（Ｘ）ｘ　−Ｖ−Ｅ−ＩＥａａ”
−Ｘ−Ｘ−ａａ？６−ａａ”−ａａ”−ａａ７９−　　
Ｚ’上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜１０個のアごノ酸、好ましくは１〜
９個のアミノ酸であり、そのアくノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸ア旦ノ酸のいず
れの配列も、例えばＥ−Ａ−Ａ又はＩＩ−Ｒ−Ｔ−Ｒ等
もａａ’　に結合することができ、またこの場合に、（
１９） ２個のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいず
れかのアもノ酸を選ぶことができ、好ましくは同しライ
ン上のア砧ノ酸が一緒に採用され；ａａ４＋１１・１は
２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アくノ酸、
特にグリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン
及びイソロイシンであり； ａａ５°Ｉ　６＋　２５＋　３５°３７１５５１６０１
６１１６８１　’Ｌ３＋　７９は脂肪族中性非極性又は
極性アミノ酸であり、この場合に特に３，５・＋６・２
ｓ・３５・′３７・７３・フ９がいずれかのものであり
、そして残りが好ましくは極性アミノ酸、特にセリン、
スレオニン、システィン、メチオニン、アスパラギン及
びグルタミンであり； ａａｌ＋　６＋　７＋　１７＋　１９＋　３２＋　３４
＋　３８−５６°！＋ｌ＋　６４＋　７０は脂肪族中性
アミノ酸（極性及び非極性アξ）酸を包含する）又は脂
肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミン
酸であり、特に、ｌ、Ｉ＋？・３２・３４・ｓ９・７８
は中性アミノ酸である時に非極性であり、残りは中性ア
ミノ酸である時に極性であり、そしてまたａａＩ＋　６
＋　７＋　＋　７＋　＋　９＋　３４＋　３１１＋　５
６＋　６４は好ましくは酸性ア（２０） ミノ酸であり； ａａ２１１０＋　＋　３＋　２３＋　ＺＳ＋　２６＋　
２り°４２°４ｆｆ＋　４５＋　４９＋　？マは脂肪族
中性アごノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニ
ン、ヒスチジン、チロシン、及びトリプトファンであり
、好ましくは、ａａ２＋１０・２６・２７・４５１７は
好ましくは芳香族アミノ酸であり、一方残りのアミノ酸
は好ましくは脂肪族アミノ酸であり；ａ　ａ　ｊｌ　＋
　９　＋　Ｉ　”°１４＋　３６°３９＋　４６＋　４
８＋　Ｓ８＋　６７１７６は脂肪族中性又は塩基性ア泉
ノ酸、即ちリジン及びアルギニンであり、この場合にａ
ａ’・５８・６″・７６は塩基性以外の時に好ましくは
非極性であり、そして残りは塩基性以外の時に好ましく
は極性であり、但しａａＪ６は極性でも非極性でもよく
、モしてａａ３・＋２・＋４・３９・４１１・ｓ８″６
７・７６は好ましくは塩基性アミノ酸であり；ａａ２２
は塩基性又は芳香族、特にフェニルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてがはＯＨ
，Ｎｌ２、又はＩ〜６個の、普通には１〜４個のアミノ
酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のアミノ酸の
、特に極性又は非極性アミ（２１） ノ酸の配列、特に配ＪＩＪＭ−Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配
列である。
１個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
アもノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも１５個、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸
を配列中にもつ： （２２） Ｅ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、−層好まし
くは同じライン上のアくノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にア逅）酸がないこと）を
意図しており、そして２は０又は１である。その配列は
合計で１０個までの、普通には合計で８個までのアミノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ−末端は
追加の配列シーＨ−Ｅ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの部
分をもつことができ、モしてＣ−末端は配列Ｍ−Ｐ−Ｍ
−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約１
５個、好ましくは少なくとも約２０個、−層好ましくは
少なくとも約３０個のアミノ酸をもち、（２３） 下記の配列の１つに含まれるポリペプチドがあり、その
場合にそのような配列は少なくとも１０個、好ましくは
少なくとも１２個、そして−層好ましくは少なくとも１
５個の、星印（＊）で示したアミノ酸を含む（ｂ＝ウシ
、ｈ＝ヒト）。
Ｄ−Ａ−Ｗ−３−９−Ｌ−Ｇ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−に４４−Ａ
−Ｍ−１−Ａ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｅ−Ｍ−に−に−Ｉ−Ｌ−
Ｅ−Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔ（２４） （ｈＥＢＺＤ） Ｋ−に−に−Ｙ−Ｇ−１ 本発明の特に好ましい組成物については、上記の諸配列
が、約５個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約３個以下
のアミノ酸によってである。
ＥＢＺＤ組成物は少なくとも約２０％の純度、−層普通
には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、−層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
それが由来する組織からの成分を実質的に含まず、由来
組織からの職分が１重量％未満、好ましくは約０．１重
量％未満、−層好ましくは約０．００１重量％未満であ
るＥＢＺＤ組放物は特に興味がある。木兄（２５） 明のＥＢＺＤ組成物は、後記の実験の項で記載するアッ
セイ条件下で粗シナブトソープ膜への”Ｉ＋−ジアゼパ
ムの結合を４０％競争に必要な量によって測定して、少
なくとも１５ユニツト／■の比活性をもつ。
比活性は普通には少なくとも５００ユニット／ｍｇ、好
ましくは少なくとも約１０００ユニツト／■であり、そ
して１２５０ユニット／＋ｎｇ以上であってもよい。−
船釣には、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿っ
た組織１ｇ当り少なくとも約１０１！ｇ当量あり、そし
て普通には脈絡叢生の湿った組織１ｇ当り少なくとも約
２０ｇ当量ある。前記したように、本発明の化合物は心
臓細胞集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼ
すことができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下さ
せ、この少ない投与量は一般的には約１５０Ｉｔｇ／−
未満である（実験の項を参照のこと）。ＢＢＺＤのその
他の特徴は、生理学的活性がＥＢＺＤについて立証され
る種々の試験から明らかである。
（２６） くとも５ｋＤａ＋そして約２５ｋＤａ　ｌ以下、−層普
通には約２２ｋＤａｌ以下であることを特徴とする。脳
因子は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるよう
に、少なくとも約１×１０３、−層普通には少なくとも
約５×１０３、好ましくは少なくとも約１０６、好まし
くは少なくとも約１．５Ｘ１０７の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約１０％の純度、−層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、−層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくはｌ００％の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの成分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、Ｎ−末端近くに又はＮ−末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む二Ｎ４−Ｅ−１
、−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−に−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−に−１−Ｘ
−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示す
。
脳因子はヒトＴ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のため（２７） の免疫調節剤としての用途があり、単独で、又はその他
の免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ又はコルチコス
テロイドとの併用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも１桁の、好ましくは少なくとも２桁のオ
ーダーで識別することができる。
股蛋亘亘 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： （２８） （２９） （３０） （３１） （３２） Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　＊ ＡＡＡ　　ＴＴＧ　　ＡＡＣＴＡＡＡＧ＾八ＡＡＴＧへ
ＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡ八６９３ へ３３） 上記鴛ＩＩ□□□遜吸：ウシの脳に由来するｃＤＮ＾ク
ローンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列
（＊）。アミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの
関係で番号づけされている。ＥＢＺＤと相同な領域は太
線によって上に線引きされており、そして疎水性及び非
荷電のアミノ酸の延長領域は細線で線引きされている。
潜在的なグリコジル化部位は囲まれている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、−層普通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ。ＥＢＺＤとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約１０％の純度、好ましくは少なくとも約５
０％の純度、−層好ましくは少なくとも約８０％の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
。
膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。
（３４） 興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チ）”２７０又は２７３のメヂオニンで始まるポリペプ
チドを含む。
本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イデイオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、−船釣には
少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット（ｋｅｙｂｏｌｅ　ｌ　ｊｍｐｅｔ）ヘモ
シアニン、グロブリン、等を用いることができる。ポリ
ペプチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えば
グルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息
香酸等を利用することが（３５） できる。アジュパン１−としてばフロイント（Ｆｒｅｕ
ｎｄ）アジュバント、水酸化アルミニラ１１、等がある
。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔で１回収−Ｌの追加免疫法則を行なう。
モノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及
び追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し
、その牌臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パーｌ
チーと融合させる。
例えば、Ｇａ１ｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕ笠１−９Ｕｉ＜１９８７）旦ニア７；米国特
許第４，３８１，２９２号及び第４，３６３，７９９号
を参照のこと。しかしながら、特定の目的に対しては、
その他の咄乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）を、ヒ
ｉＦｃ鎖をもつ抗体の生産のために、用いることができ
る。
ＥＢＺｆｌポリペプチド及びＥＢＺＩ）ポリペプチドに
特異的に結合する抗体は、個々に又は−緒にして、イン
ビボ及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合物
はジアゼパムレセプターへの結合のためのアゴニストと
して用いることができる。本発明（３６） の化合物は、ジアゼパムレセプターの数及び分布を求め
るのに用いることができる。加えて、本発明の化合物は
哺乳動物宿主の心臓拍動を調節するのに、哺乳動物宿主
を鎮静させるのに、又は哺乳動物宿主に興奮を引き起さ
せるのに用いられる。
脳因子ポリペプチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に
結合する抗体は、個々に又は−緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある。
このポリペプチドは腫瘍抑制特性をもっているので、こ
のポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制するた
めに、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合
物と共に用いることができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる：正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果どして正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる；骨
髄が哺乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合；細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポ（３７） リペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又は゛と
り出すために用いることができる。
脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する（この場合にリポソームはＩｌｌ瘍細胞
に対する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよ
い）か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために
生体内で用いることができる。他の方法としては、本発
明のポリペプチドは免疫調節剤として用いることができ
る。
このポリペプチドは、ポリペプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラヘルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性
粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３，
８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第（３８
） ４．１７４，３８４号、第４，２７７．４３７号及び第
４，３７４．９２５号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかと・うかに依存する。種々のアッセイ法
はＥＩＡ　、　）ＥＬＩＳＡ、ＲＴ八、ホモゲニアスＥ
ＩＡ　、　　ド・ントーフ゛口・ント、ウエスターンズ
（Ｗｅｓ　ｔｅｒｎｓ）等と称される。
本発明のポリペプチドに対する抗体ば抗イデイオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イデイオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビｌ−−ブ部位と競合する
エピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イデイオタイプはジアゼパムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
（３９） 上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組成物は多数の種々の組織、例えば肺
臓及び精巣中に見いだすことができる。
本発明の化合物を単離するために、脳組織から血餅を排
除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４ｋＤａ
！未満である低分子量物質を除去する。
その生成物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０、１％トリフルオロ酢酸水
溶液溶離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑制
剤として作用するらしい化合物を排除する。その詩画用
をバイオアッセイによって観察する。その生成したＥＢ
ＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、
例えば、μｍボンダパック−ｃｐ、カラ１、を用い、水
性０．１％トリフル（４０） オロ酢酸中の約０〜６０％アセトニトリルの線状グラジ
ェントを用い、そして長いカラム及び遅い溶出速度、例
えば４時間以上、好ましくは５時間以上を用いて更に精
製した。本発明のＥＢＺＤ化合物は約３０〜５０％アク
リロニトリル、−層特定的には３０〜４０％アクリロニ
トリルの両分中に見いだされる。
ＢＰ化合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％
水水性上セトニ１−リル直線グラジェントを用い、３２
〜３６％アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回
以上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を
次いで、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％水性ｎ−プロパ
ツールの直線グラジェントを用い、約２２〜２４％ｎ−
プロパツールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り返
して、更に精製する。
他の方法として、本発明のポリペプチドは、特にポリペ
プチドが３０個未満のアミノ酸、−層特定的には２５個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って台底する
ことができる。例えば、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ、　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ
　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ。
”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ″。
（４１） Ｓｐｅｃｉａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　　Ｐａｒｔ　　Ａ
。
Ｖｏｌ、　２＋　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅｒ
［、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（米国）　１９８０
．１〜２８４頁を参照のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約２０個以上のアミノ
酸をもつもの、−層特定的には約３０個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる。ポリペプチドをコード
するためにゲノムＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。はとんどの場合において、オーブンリーディングフ
レームが用いられ（イントロンなし）、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される。
特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
（４２） れるｃＤＮＡがある。このｃＤＮＡ　Ｉ＝よ開始のメチ
オニンから約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグナ
ルから下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを
含む。
下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している。
５’　−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡ
ＡＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴａｅｌ ↓ Δ （４３） Ｈｉｎｄ　Ｉｎ ↓ Ａ （４４） ＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ八八ＧＣＴＣＡＡ
ＧＡＣＡＧＣＣＣへへＧＡＴＡ　　　５１１ＴＧＡＣＴ
八八ＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＡ
ＣＴＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴ
ＣＡＧＴＡＧＡＴＧ八八ＴＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴ　
　、５９０ＴＧＴＴＡＣＴＴＴ／ＡＣＴＴＣＧ／八Ｔ（
ｐｏｌｙ　　八）−３’　　　６０７上記はウシとヒト
のヌクレオチド及びＥＢＺＤの推定されたアごノ酸配列
を比較して示している。ヒトの配列において異る残部は
ウシの配列の上及び下に示されており、それは３つのオ
ーバラップするｃＤＮＡクローンから求められた。ヌク
レオチド残部はウシのクローンの複合配列に関して番号
付けされており、アミノ酸残基は開始のメチオニンに関
して番号付けされている。ウシの配列のリーディングフ
レームは星印（＊）に挟まれている。３つの別個のクロ
ーンのポリ（Ａ）→−付加部位における差異は逆スラッ
シュによって示されている。
ウシのｃＤＮＡプローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌの制限部位が示されている。
実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグ
メントが、本発明のポリペプチドの発（４５） 現に用いることができる。インビトロ突然変異誘発、突
然変異誘発、アダプター等を用いることによって、その
配列を天然配列から変化させて、サイレント突然変異を
有するか又は非野生型アミノ酸をコードするコドンを有
する配列を作ることができる。従って、天然ポリペプチ
ド、及び相応の生理学的特性を有するがしかし１個以上
のアごノ酸の異なっているポリペプチドの両方を作るこ
とができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に人手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ヘクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていよ（４６） うが、本発明のポリペプチドのコード配列と組合わせて
組立てられていようが、多くの場合、以下のように特徴
付けられる。常にというわけではないが一般には、宿主
中で維持されるべき少数または多数のコピー数のエビソ
ーム要素を提供する、野生型複製系以外の複製系が人手
可能である。宿主ゲノム中にコード配列を組込むことが
望ましい場合には、複製糸は必要ないであろう。コード
配列は、５′末端および３′末端において、しばしば野
生型の制御領域以外の、転写および翻訳開始シグナルお
よび終結制御シグナルのそれぞれによって挟まれている
。従って、プロモーター領域は５′末端において用いら
れ、キャップ配列、制御された発現のためのオペレータ
ー、およびエンハンサ−配列等を含み、構成的発現のた
めにプロモーター制御を含んでいないことができる。３
′末端においては、ターミネークー、終止コドン、およ
び最適にはポリアデニル化配列等が存在する。
転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている（４７） 形質転換された宿主に関する選択および発現ベクターを
保有する細胞に対する競争的好都合の提供の双方を可能
にする１種もしくはそれ以上のマーカーに連結される。
マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養性の付与によ
る補完、殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性、例えば、種
々の抗生物質および重金属等に対する耐性、および免疫
等含んでいることができる。種々の配列は、宿主中で機
能的であるように選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生成物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′−配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダー４８） −は例えば、次の文献に記載されている：米国特許第４
．４１Ｌ９９４号、ＥＰＡ８Ｂ、６３２および１１６，
２０１゜コード配列は正しいリーディングフレームで分
泌リーダーおよびプロセッシングシグナルに連結される
ことによって、その融合コード配列を発現ベクター中に
挿入して発現造成物を提供することができる。
ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ１電気泳動、グラジェン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
用途に応して、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノ−（４９） ル等中に導入することができる。その濃度は、特定の適
用、およびその適用が局所的であるか全身的であるか、
等に応して広（異る。投与は、非経口的、静脈内的、腹
腔内的、動脈内的および皮下的等であることができる。
天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００Ｊ１
ｇ／ｄである。投与方法に応じて、用量は約０．５〜５
００μｇ／ｋｇまで、より通常には約５〜５０ｐｇ／ｋ
ｇまで変化することができ、用量が２５μｇ／ｋｇを越
える場合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所
望の反応、投与方法および用量の反復性等によって変化
する。
以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０ゲルロ過Ｈｆ’ＬＣカ
ラムを、パイオーラッドラボラトリーズ（リッチモンド
、カルフォルニア）より購入した。ｇ　−Ｂｏｎｄａｐ
ａｋ−Ｃ＋ａ（５０） カラムをつＡ〜−一ターズアソシエ−１−（ξルフォー
ルド、マッチューセッツ）より人手した。トリプシン（
ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシンおよびスタフィロコッ
カル・アウレウス国−を奸財Ｊ−匹郊（＋！−ａｕｒｅ
ｕｓ）ｖ８プロテアーゼは、ワーリントン（Ｗｏｒｔｈ
ｉｎｇｔ、ｏｎ）から得る。エンドブロテイナーゼ１．
．ｙｓ−Ｃをべ一すンガーマンハイムから得た。３Ｉ＋
−ラベル化ジアゼパム、Ｒ０１５−１７８８、フルニト
ラゼパムおよびβカルボリンをＮＥＷ　、ボストン、マ
サチ、フ、−セツツから得た。キャリヤフリー１２５１
−ヨウ素はアマ−ジャム（アーリントンハイト、イリノ
イ）製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０ｇ湿重量〉を融解
し次いで細断した。細断した組織を、２３７９ｍＲのエ
タノール（９８％’）　、１８．５ｄの濃ＩＬＩ、およ
び２、５　ｍｌのアブロティニン〔ウシの肺源の２３　
ＴＩＵ／ｍｌ　（シグマケミカル社）〕から成る２４０
０ｄの抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリング
コマ（５１） −シャル混合機中でホモジナイズした。ホモシネ・−１
・を４°Ｃで一夜で撹拌し、ベックマン型１９０−ター
中８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、次いで上澄み
を注意深く除去した。最終量は約２０７０ｄであった。
クロ１コホルム（２０７０ｄ）および２０７　ｍｌ、の
酸性の水（２０３ｍｆｆの水と４ｄの濃ＨＣｆｆ）を上
澄みに添加し、混合物を約１時間激しく撹拌し、次いで
室温に放置し二相に分離した。水性の上相を注意深く除
去し次いでスペクトラポール透析膜チューブ（３，５０
０ＭＷカットオフ、アメリカンザイエンテイフィックプ
ロダクト）中、４°Ｃで０．１　Ｍ酢酸２０！！。
を２回取り換えて透析した。透析した上澄みを凍結乾燥
した。凍結乾燥材料（７８５■）を粗分側と称した。
ゲル゛　クロマトグラフィー Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０Ｘ　２．
１　ｃｍ）を高速液体クロマトグラフィー（ｌＩＰｌ、
ｃ）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付けた
。粗分側を０、　］％三フッ化酢酸を用い４０％アセト
ニトリル水溶液中に８１Ｉ＋ｇ　／　ｍｌの濃度で溶解
した。カラムを（５２） ０．１％三フッ化酢酸（ＴＦＡ）と共に４０％アセ］〜
ニトリルを用いて平衡化した。２成のアリコート（１６
■のタンパク質）を注入し次いで０．１％濃度のＴＦＡ
を有する４０％アセトニトリル水溶液を移動相として均
一に溶出を行った。流速を２ｒｒｄｌ１分に設定しそし
てチャートスピードを０．２５ｃｍ／分に設定した。
クロマトグラフィー処理を室温で行った。５ｍの分画を
採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いでベン
ゾジアゼピン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−ＢＣＡ
）および成長抑制活性について３回分析した。
ＢＺＤ−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述
べた如＜、４９回のクロマトグラフィー操作を行った。
全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した。約６
５ｍｇの活性な乾燥粉末を得た。これをＴＳＫ−２５０
分画と称した。この分画は約９３６ユニツトのＢＺＤ−
ＢＣＡ活性を含有していた。
ＴＳＫ−２５０の　　１　　　クロマトグラフィーＴＳ
Ｋ−２５０分画を０．１％ＴＦＡに溶解しく２■／ｄ）
、更にｐ−Ｂｏｎｄａｐａｋ−Ｃｚ＋カラム（７８ｍｍ
　（内径）×（５３） ３０ｃｍ）を用い室温で逆相ＨＰＬＣにより分別した。
試料を均一に適用し、カラムを洗浄し次いで０．１％Ｔ
ＦＡで平衡化した。流速を２ｍＲ１分に設定し、そして
チャート速度を０．２５ｃｍ／分に設定した。第一の溶
剤０．１％ＴＦＡ　と第二の溶剤０．１％ＴＦＡ中のア
セトニトリルと間での線状グラジェント法を用いた。グ
ラジェントの条件は２０分内で０〜２８％、次いで１４
０分内で２８〜４２％、１０分内で４２〜５２％更に６
分内で５２〜１００％であった。全ての溶剤は、ＨＰＬ
Ｃ等級のものであった。４成の分画を採取した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでＢＺＤ−ＢＣ
Ａに対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜３
２％アセトニトリル濃度間で溶出した。
分画３６と分画３７をプールし、次いで１２−の０．１
％ＴＰＡで希釈した。混合物を、Ｂ　−Ｂｏｎｄａｐａ
ｋ−Ｃｌａカラム（３，９ｍｍ（内径）Ｘ３０ｃｍ）に
均一に適用した。流速は１ｍ１．７分であり、チャート
速度は０．２５ｃｍ／分であった。第一の溶剤０．１％
ＴＦＡと第二の溶剤０．１％ＴＦＡを有するアセトニト
リルとの間で直線グラジェント法を用いた。グラジェン
ト条件（５４） は次の通りであ、うた。１０分内で０〜３０％、次いで
６０分内で３０〜・４０％であった。分画を採取した。
殆ど全ての活性（約８５０ユニッｌ−）部分は３１％ま
でのアセにトリル の分画をＩＩＰＬｃ　　Ｃ＋ｎ分画と称し、これは約６
１（０ｕｇのタンパクを有していた。
また、ヒｉ・の脳組織を用いて一Ｌ述の手順に実質的に
従ってヒ）　ＥＢＺＤを精製した。
脳−辷Ｌー／’七笠二左生廻製 粗シナプス膜分画を、体重２００ｇまでのスプラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｅ
ａｄ。
熟ち一ＩＩｓΔ（１９７４）刀，　：　４８０２−４８
０６）の記載の如く調製した。シナプス膜を、５０ｍＭ
のトリス−ＩＩＣＩ！．（ｐ．Ｈ７、４）で３回洗浄し
、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離により
ペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を５０ｍＭ
　ｌ−リス−ＩＩＣｎ　（ｐＨ７、４）に懸濁させ次い
で一２０°Ｃで保存した。
（５５） 洗浄されたシナブ１ーソームへの３Ｈ−ＢＺＤの結合の
阻害を、結合競争活性の指標として使用した。シナプ１
ーソー１、膜への’Ｈ−ＢＺＤの結合を、２５ノ泪のβ
カルボリンの不在下又は存在下のいずれかで使い捨ての
１２　Ｘ　７５ｍｍのポリプロピレン管中において２通
り実施した。その結合混合物は、所望の種々の濃度の試
験化合物、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆｆ　（ｐＨ＝７
、　４　）　、シナプス膜懸＠液（７（１”　１００ｕ
ｇ　（＋）　タフ　ハク質）、１〜５ｍＭの３Ｈ−ＢＺ
Ｄ及び合計体積０．　ｉ　ｄ中０．　５％の最終濃度の
ジメチルスルホキシドを含んだ。４°Ｃで３０分間のイ
ンキュベーションの後、０、　１　ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｆ　（ｐｌ＋＝　７．　４　）中１０％の冷ボリエナレ
ングリコール（ＰＥＧ６０００）　０．　７　ｍを各々
の管に添加した。その懸濁液をすぐ４℃でＧＦ／Ｂフィ
ルターにより真空濾過した。そのフィルターを、１　ｍ
ｇ／ｄのＢＳＡを含む５０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ＝７、　４　）　ＬＭにより洗浄した。そのフィ
ルターを、計数バイアルに移し、そしてアクアシン（Ａ
ｑｕａｓｓｉｎｅ）　（ＮＥＮ）　１０ｍｌを、各バイ
アルに添加し、そしてＢｅｃｋｍａｎ　β−カウンター
を用いて放射能を測定しく５６） た。２５団のβ−カルボリンの存在において結合した放
射能（合計結合の２〜８％）は、非特異的であると思わ
れ、そしてデーターはそれに応じて修正された。タンパ
ク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いて、Ｌｏｉｙｒｙ
＋など，、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９５１）
　１９３　：２６５〜２７５の方法によって測定した。
ボＩアクリルアくド゛ル　’＝’　　　ＰＡＧＥ）０、
　１　Ｍのリン酸す１−リウム（ｐｎ−７．　２　）　
、０．　１％のＳＤＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％
のポリアクリルアミドビス−アクリルア旦ド（３０　：
　０．　８　）の１５ｃｍの分離ゲル（０．７５ｍｍの
厚さ）を使用した。そのゲルは、ゲル２０ｍ１当りＴＥ
ＭＥＤ（ＢｉｏＲａｄ）　１０μｌを含み、そして、２
０％の過硫酸アンモニウムの１．０μｌ／　ｍＲのゲル
を用いることによって重合されたものである。分離ゲル
の条件と同一の緩衝液条件を用いる３．５％のアクリル
アミド溶液の上層ゲルを、下層ゲルの一］二に注いだ。
上層ゲルの約３ｍｏ＋を残して、コム（Ｃｏｍｂ）を、
その上のゲル中に挿入した。
０、０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．　２　）　
、７　Ｍの尿素、１％のＳＯＳ及び１％の２−メルカプ
トエ（５７） タノール中ザンブル４０ｐｌを、２分間煮沸し、そして
すぐに適用した。そのランニング緩衝液は、０６１％の
ＳＯＳを含む０．　１　Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝
　７．　２　）であった。トラッキング染料がゲルの底
に達するまで、そのゲルを、室温で５　Ｖ　／　ｃｍで
泳動させた。そのゲルを、５０％メタノール及び９％酢
酸中に固定し、固定溶液中において０．　１％クーマシ
ープルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）により染色し
、そして５０％メタノール及び９％酢酸により脱染色し
た。脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた。
１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２
７　：　６８０　〜６８５〜１４３９の銀染色法又はク
ーマシーブルー染色法のいずれかによって検出した。
又ｌバｌ屓至旦皇ヱ但 Ｂａｒｒｉｄｇｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ
．　（１９７８）５０　：　５４〜６５によって記載さ
れているクロラミン−Ｔ法を用いてＩ２Ｊにより、又は
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　（１９７３）、　１３３　：　
５２９〜５３９に記載されている”Ｊ−Ｂｏｌｔｏｎ及
びＨｕｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベルした
。
（５８） ＥＢＺＤに対する抗体産生 ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅＤ
ａｗｌｅｙラットを、完全フロインドアジュバント中に
乳化された、合計２０μｇの精製タンパク質により感作
した。続く追加免疫接種を、不完全フロインドアジュバ
ント中タンパク質１１０ｌ１を用いて２週間隔で与えた
。各接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記に概
説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体につ
いてスクリーンした。
そのアッセイのために適切な抗血清は、−船釣に、２〜
３回のみの追加免疫接種の後、得られた。
ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニコ、−シーラントホワ
イトウサギ）における精製されたウシの脳のＥＢＺＤに
対する抗血清をまた、ラットのために記載のＰＡＧＥ法
もまた、使用された。ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒ
ｉｌ、など、　、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２旦
：　１４３７された同じ方法によって調製した。但し、
４０■及び２０Ｉ１ｇのタンパク質を、それぞれ、１次
接種及び追加免疫注射のために使用した。
（５９） ラジオイムノアッセイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　ＸＩＯＩ０ｃｐ
ｍ／μｇの比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し
、そして４°ＣでＴＮＥＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣＩ２、ｐｔｌ＝　７．４　；　５　ｍＭのＥ［ｌ
ＴＡ　；　　１５０ｍＭのＮａＣｊ２　；　０．０５％
のＮＰ−４０ｉ　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管（３ｒｒｄｌの容量）に添加された：精
製された脳因子の標準又はサンプル１０ｍ、ラット抗血
清（ＴＮＥＮ緩衝液中において１：３０に希釈された）
１０１ｚ／及び＋２５Ｉによりラヘルされたウシの脳因
子（〜５　Ｘ１０’ｃｐｍ）　３０ｍ、室温で４５分間
のインキュベーションの後、熱失活されホルマリンによ
り固定されたＳ、アウレアス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）の１
０％懸濁液５０ｍを添加し、そしてその混合物をさらに
３０分間放置した。次に、免疫吸着剤をｎ−ブチルフタ
レート油のクツションを通して遠心分離しく１５，０Ｏ
ＯＸ　ｇ　、　　１分）、モしてＳ、アウレアスペレッ
ト中の放射能活性の量を、ｒ−分光測定によって測定し
た。抗血清の不在において結合した放射（６０） 能は非特異的であると思われ、そしてデーターはそれに
応じて修正された。
ＲＩＡ反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織（お
よそＩｇの正味重量）を、１０　ｍｌの冷ホモジナイゼ
ーシゴン緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−１１Ｃｊ２、ｐ
Ｈ＝　７．４　；　５　ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍ
ＭのＮａＣ１；　０．２％のＮＰ４０　；　０．２　ｍ
Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド；ｍｌ当り１
００カリクレイン阻害剤ユニツトのＴｒａｓｙｌｏｌ）
に添加し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザー
により３回、■５秒間の破壊により均質化した。その抽
出物を取り出し、そしてｔｏｏ、ｏｏ。
×ｇで３０分間の遠心分離により残骸を除去した。
次に、この上清液を、５分間９５°Ｃへ加熱し、そして
低速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連
の１：３の希釈の抽出物を、ＴＮＥＮ緩衝液により調製
し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標準曲線
は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性物質の
量を、直接的な比較により算定した。
（６１） 々のプロテアーゼによるペプチドの　断　びウシ及びヒ
トのＥＢＺＤを、エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃを含
む０．１　ＭのＴｒｉｓ−アセテ−）　（ｐＨ＝８、０
　）　４０μｇにおいて２４°Ｃで１６時間消化した。
ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準で１０：１であった
。ペプチドフラグメントを、水中０．０５％ＴＦＡから
０．０４５％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリルまでの
直線２時間グラジェントを用いてμｍＢｏｎｄａｐａｋ
　　Ｃ＋ｏカラム（Ｗａ　ｔｅｒｓ）でのｒｐＨＰＬＣ
によって分離した。ペプチドをモニターし、そして２１
４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、集め、凍結乾
燥し、そしてアッセイのために使用した。
Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した。ＢＺＤ結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１１　、５０
０）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピ
ークとしてカラムから現われた。分取用逆相カラム（６
２） ＴＳＫ−２５０からの活性フラクション２４のクロマト
グラフィーの結果、その活性は３１〜３２％のアセトニ
トリルの間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プ
ールされたフラクション３６及び３７の再りロマトグラ
′ノイーは、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出を
もたらした。その精製は第１表に要約される。
第１表：ウシの脳のＥＢＺＤの精製 粗原料 ７８５ｂ　　　１，０１０’　　　　　　　１．２９０
０ ＨＰｌ、Ｃ−Ｃ＋ｅ　　　Ｏ，６８’　　　　８５０　
　　　　　　Ｌ２５０ａ：上記の゛アッセイ条件下で粗
シナブトソーム膜への３１＋−ジアゼパムの結合に対す
る４０％競争のために必要とする材料。
ｂ：プールされた材料の直接計量による。
Ｃ：２８０ｍμでの吸光度から計算された。
ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にア８４．２ （６３） ツセイすることば不可能であった。この数は、フラクシ
ョン２４及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフイ
ー処理の後に回収された合計ユニッＩ・を示す。
８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で遠戚した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、」二昇した。しかしながら、最大の阻害度は、８囲
の濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎない
ことが見出された。Ｋｉ値は、３Ｈジアゼパム又は３ｔ
ｌ−ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして使用
されても、約５団であることが見出された。
精製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示さ刺た。ペプチドの分子量は、１
０．５にドルトンであると算定された。
Ｌａｃｍｍｉｉ　の５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による精製され
た蛋白質（ウシ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ〜
７にドルＩ・ンを有する単一のバンドを与えた。精製さ
れたタンパク質は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡ
　と共に、水中４０％アセトニトリルを用いる（６４） Ｂｉｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０ｃｍ　Ｘ
　７．５　ｍｍの内部直径）から単一の対称ピークとし
て出現した。その見掛分子量は、このゲル浸透クロマト
グラフィー法によって約１１．５にドルトンであること
が計算された。この精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、
類似する物理化学的特性及び生物学的特性を示した。
シナプトソーム膜への、′２５Ｉ−ラベルされた（クロ
ラミン−Ｔ法又はＢｏｌｔｏｎ及び１ｌｕｎｔｅｒ法の
いずれかによる）精製タンパク質の特異的結合は観察さ
れなかった。
Ｕ礼生分泰 ＲＩＡ系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のＥＢＺＤを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シＥＢＺＤに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の１２５１−ラベル化ＥＢＺＤの除去を測定した。ウシ
およびヒトのＥＢＺＤは、ウシＥＢＺＤ蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合する１２５１ラベル化ウ
シＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示した。この
ことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が存
在していることを示している。
（６５） エンドブロティナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によって得られそ
して逆相ＨＰＬＣによって精製されたウシＥＢＺＤのペ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった。従って、ＥＢＺＤの免疫原決定基はエンド
プロティナーゼＬｙｓ−Ｃによって生じた単一ペプチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々の組織中のＥＢＺＤの分布を下記第２表に示す。
（６６） 脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 膵臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ） ３．８０ ３．４２ １．７６ １．５２ １．２７ １．０５ ０．９７ ０．８４ ０．７３ ０．６７ ０．５０ ０．３７ ０．０６ Ｎ、Ｄ、−検出できず。
１？ＴＡ法の詳細は前述しである。
血清または血漿以外の試験組織はすべて、（６７） によって検出されるＥＢＺＤを含有していた。ウシの脳
、膵臓および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　
、７．６および６．８に当量を含有していたが、ヒＩ〜
の脳は組織］、ｇ（湿重）当り１５．７μｇ当量を含有
していることが見い出された。ラビット脳中のＥＢＺＤ
の濃度ば、ウシまたはヒ１〜の脳中に存在する濃度より
はるかに低いものであることが見い出された。ＥＢＺＤ
はモンキーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク質に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳を髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（Ｈ［！Ｐ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ
　１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）およ
び膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ
、それぞれ濃縮細胞（〜１０９細胞）１ｍ当り９．１゜
８．９　、８．６．０．３２および０．２６ｉ当量（７
）　ＥＢＺＤを含有していた。ＥＢＺＤ　１μｇは約６
Ｘ１０Ｉ３分子を含んでいる。従って、ＭＣＦ　７．　
ＨＥＰ　２および１（ＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜
５Ｘ１０’分子のＥＢＺＤを含有している。
（６８） 従って、ＥＢＺＤは哺乳動物の組織中に広く分布してお
り、そしてＤＢＩ　とは異り脳に特有のペプチドではな
い。広い組織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的な
ものというよりむしろ一般的なものであろうということ
を示唆している。
大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ １７．４ ２６．７ １４．３ １．７ １６．２ （６９） 第３表は、ＲＩＡによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢＺＤの分布を要約している。
脳のＮ域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、Ｅ
ＢＺＤ濃度の実質的な局所的変化があることが示された
。試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡
叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体におい
て見い出された。
ＥＢＺＤの　　（ａｎａｌｅｆｉＣ）活体重２．３〜２
．６　ｋｇの雄性ニューシーラントラビットをこの実験
の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、ニュ
ーロファーマコル、（狂肛独国Ｌｍａｃｏ１．）　　（
１９７２年）ｕ：１〜１６真に記載されたの直接穿刺法
に若干の変更を施すことによってｉｃｖ注射を行なった
。動物は、頭蓋に小さな穴（直径０、８　ｍｍ　）を開
ける（ベンドパルビタール麻酔下）ことによって実験の
２日前に準備した。この穴は正中線に対して１．Ｏｍｍ
側方およびプレグマに対して１．０　ｍｍ口吻側に位置
している。実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局所
麻酔薬を噴霧する。
＃２６の針を頭蓋の表面から１２ｍｍの深さまで鉛直に
（７０） 挿入する。正確な位置決めは大脳を髄液の出現によって
指示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、
この針を同じ深さまで再度挿入する。
注射は、常に、注射器微量ビユレットを用いて１０μｌ
の容量で３０〜６０秒間にわたって実施する。対照の動
物には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌
した等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基とし
て表現される。
動物は−・般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（
Ｓｔａｎｃｈｉｏｎ）内に位置させる。結腸温度は、リ
ーズ−ノースランプ・スピードマックス・レコーダー（
Ｌｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｏｐ　Ｓｐｅｅｄｏｍａｘ　
ｒｅｃｏｒｄｅｒ）　１に記録されるように特別に電線
が引かれているＹＳＩＳキスンニング・テレサーモメー
ター（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒｍｏ
ｍｃｔｅｒ）に接続されている直腸ザーミスタブローブ
によって測定される。実験は２２．０±１．０°Ｃの常
温室内で実施する。
興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る。２５■／ｋｇのベンドパルビタールを静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その（７１） 麻酔時間の間は自らを正常な直立位置まで動いて戻すこ
となく仰向けになっていることができる。
ラビットが仰向げの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の富岡的（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉ
ｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した。
　ＥＢＺＤ 測星 注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する。
呼吸は９０分から２０４分まで増加した。
運動活性の増大。機能亢進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉ　ｔｙ）なし。痛覚脱失なし。
則財屋 注射の１０分後、呼吸は９８分から６５分まで減少。強
迫的咀噌および軽度の興奮。興奮は短時間続いた。機能
亢進なし。痛覚脱失なし。
（７２） 狙曵コ翌 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８分
から５０分まで）。注射の１０分後、立直り反射欠如。
動物は深い麻酔状態にはなかった。
ｂＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。
８日齢のヒナ鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を単個
細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法により
、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル（
Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（ＤｅＨａａｎ）、ジェ
イ、セル、フィズ、（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ　ｓ、）（１
９８３年）具亙３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特性
を基準にすれば、この調製物は戒律の哺乳動物のプルキ
ンエ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルお
よびデハーン、デイ・イニシエイション・オヴ・ザーハ
ートビート（Ｔｈｅ　Ｉｎ１ｔｉａｔｉｏｎ（７３） ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔｂｅａｔ）デニス・ノープル
（Ｄｅｎｉｓ　Ｎｏｂｌｅ）編、１９７５年、オツクス
フォート・ユニバーシティ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　
ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｉ’ｒｅｓｓ）　、ロンドン
、ｐ、７〕。これらの集塊は２４°Ｃで平衡化しｂＥＢ
ＺＤを用いて２４時間処理した。２つの個別の実験にお
いて、１００ｕ／ｍｆ！、の量で処理した集塊の収縮速
度は対照と有意に相違した。これを以下に示す。
実験１： （測定された収縮速度（秒）１５回の収縮量間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　１４
　　１１．４８　　　１．４４　　　０．３８処理　１
４　７．９４　２．０４　０．５５実験２： Ｎ　　平　均　　標準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　
１３　　２４．５９　　　３．１８　　　０．８８処理
　１２　１９．３３　２．３７　０．６８各実験におい
て、スチューデントＴテストによれば、処理された母集
団は有意に未処理の母集団と異なっている。これら２つ
の母集団が同じものであるという確率は０．０００１よ
り小さい（ｐ　＝　０．００００）。
（７４） 摺１敷（尾− ウシおよびヒＩ・のＥＲＺＤのアご）酸配列を、（ａ）
エンドブロティナーゼリシンＣ，（ｂ）　＝Ｉ“モトリ
プシン、（Ｃ）スタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔ
ａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８およ
び（ｄ）臭化シアンを用いたｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺ
Ｄの消化により得られたペプチドのマイクロシーフェン
ス分析によって決定した。ペプチドフラグメントは揮発
性溶剤を用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した。アミノ
末端をブロックしたペプチドを１２Ｎ　ＩＩＣｎ中で周
囲温度において１６時間・インキュベーションした。次
いで、試料を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを
、４７０Δ型気相プロテインシークエンサー（Ｐｒｏｔ
、ｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ）　［アプライド・バイオ
システムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ
＋　Ｉｎｃ、）　〕による自動反復エドマン分解に（ｔ
Ｌ、た。ｒ　ｐ　Ｉｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃによってフェニルチ
オヒダントインアミノ酸を分析した。
これどは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはペプチドを、６ＮＨＣｆを用いて１０５”Ｃで１６
〜２０時間減圧において加水分解した。得られたア（７
５） ミノ酸をフェニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ
（Ｐｉｃｏ）ＴＡＧ　システム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ０１ａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ））によ
って分析しノた。フェニルチオカルバモイルアミノ酸を
２５４ｎＭの吸光度によって検出した。
ＥＢＺＤ　１７）化粟横ｊ隻 ｂＥＢＺＤおよびｂＥＢＺＤのアミノ酸配列を、６Ｎｌ
ｉＣ忍で加水分解した後、アミノ酸自動分析装置を用い
て決定した。これらの蛋白質には、システィンを除くす
べての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータ
から言４算された最小分子量は約９，９００であり、５
ＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された値と一致する。
Ｎ−末端アもノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を、公
表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示す。
（７６） ｂＥＢＺＤ配列と異なるｂＥＢＺＤアくノ酸配列中の残
基には下線を引いた。
ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＥＢＺＤのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるた（７７） った１個の塩基変化と一致する。これらの結果は、ヒト
およびウシのＥＢＺＤが異なる種の間で構造的に高度に
保存されていることを立証している。
ウシの組織から単離したポリ（Ａ”″）ＲＮＡをｃＤＮ
ＡＤＮＡレベルとして使用した。第１鎖のｃＤＮＡ合戒
はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）
逆転写酵素とを使用して実施した。第２鎖は大腸菌ＲＮ
ａｓｅ　Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガー
ゼ（ＮＡＤ”　）を使用して合成した。Ｓｌヌクレアー
ゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の大断
片によるフィルイン反応によって２木調ｃＤＮＡを平滑
末端化した。ターごナルデオキシヌクレオチジルＩ・ラ
ンスフェラーゼを使用して、デオキシグアニン残基約１
５個をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に加えた。次に、こ
のＧの要部をもつｃＤＮＡをＡ−５０カラム上でサイズ
分別して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと導入されなか
ったデオキシグアニン残基とを除去した。次に、プール
したｃＤＮＡの濃縮を、ＥｃｏＲＩ（７８） で消化したλｇｔ、１０　　ＯＮＡの存在下におけるエ
タノール沈殿によって実施した。
ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ、ｉ０に対するＧの足部を
もつｃＤＮＡの連結反応は、３′末端にデオキシシトシ
ン１２個を含みそして５′末端に１ＥｃｏＲＩ開裂ＤＮ
Ａの１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１
木鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法
によって実施した。連結したＤＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒ
。
バラゲージングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６
００ｒｋ−ｍｋ”　ｌｌｆ　（２中へ導入した。これは
、組換え（野生型でない）フェージに感染すると細胞溶
菌される。その方法により、放射性標識合成オリゴヌク
レオチド〔１７ヌク１／オチド長：その配列はウシＥＢ
ＺＤ中に見出される６個の連続するアえ）酸（ＫＷＤＡ
ＷＮ）によって推定した〕を使用し、プラークからのＤ
ＮＡを二重にスクリーニングした。コドンが不明なので
、オリゴヌクレオチドの３２種の縮重ブールとしてＭＳ
Ｉを合成した。ＭＳＩにょるスクリーニングにより陽性
のプラークを得これをプラーク精製し、そして１．８ｋ
ｂの挿入部を含有するこ（７９） とが示された。この挿入部をプラスξドｐＥＭＢＬ中に
サブクローン化した。これをｐＭＰｌと称する。挿入部
を制限地図化した後、続いて適当な数片をＭ１３株中に
更にサブクローン化し、そしてＳａｎｇｅｒＣｏｕ　１
ｓｅｒのジデオキシ法によって配列を決めた。
ｐＭＰｌ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほとん
ど同じ挿入部の５′末端から約３００塩基対の１）ＮＡ
配列を含んでいた。更に、ｐＭＰｌのヌクレオチド配列
により、配列が決定されているウシＨＢＺＤに関して決
定したアミノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）ア
ミノ酸配列が予想された。これらの２種の蛋白質が密接
に関連していることはアごノ酸配列の顕著な傑作性によ
って示唆されている。配列が決まっているＥＢＺＤから
アミノ酸３個を除去することにより、残りのア主ノ酸を
ｐＭＰｌの配列と関連させることができ、この結果アミ
ノ酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存的置
換を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。
ｐＭＰｌの発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の（８０
） 群の一員であることを示している。最後に注意すべき点
は、配列の決定されたウジの脳の因子ヨリも大きい蛋白
質をｐＭＰｌがコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アごノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。
旦財男加え五□発項− ウシの膵臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮＡは０．６ｋｂｐの挿入部であり、これをｐ
　Ｉｉ　Ｍ　Ｂ　Ｌ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得
た。配列決定を行なったところ、ｐＭＰｌと相同のコー
ド配列が得られた。ウシのエンドゼビン（ｂｌＥＢＺＤ
）をコードするＤＮＡ断片を、Ｄｒａ　Ｉ消化およびＮ
ａｅ　Ｉ消化を組合せることにより、ｃ、Ｄ　Ｎ　Ａプ
ラスくド（ＥＢＺＤ）から切り出した。その断片をゲル
電気泳動によって精製し、発現ベクター（ｐＳＭ　１　
、２）中にＳｔｕ　Ｉ部位に挿入した。ｐｓＭｌ、２発
現ベクターの形成は、ｐＢＲ３２２の複製開始点および
β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｂｏｌ　１ｖａｒ等、Ｇｅｎ
ｅ（１９７７）　２　：　９５）　、ｐＴＲ２１３のＩ
ａｃプロモーターおよびリボソーマル結合部位（８１） ［Ｒｏｂｅｒｔｓ　　等、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１．１
．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　［ｌ５Ａ（１９７９
）並二　７６０−７６４　］をｐＬＧ３００のｉ−Ｚ融
合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎｔｅ等、Ｃｅ１ｌ（１９８０）
２０　：　　５４３　５５３　）にスプライシングする
ことによって行なった。得られたプラスミドはクローニ
ング部位例えばＳｔｕ　Ｉ部位に挿入された外来遺伝子
を融合蛋白質として発現することができる。この構造に
おいて、ＥＢＺＤに関する全コード配列は、ｃｒｏ蛋白
質の最初の２個のア５ノ酸をコードするＤＮＡ　に位相
を合わせて融合された。プラスミドｐｓＢ１０８は挿入
部を正しい配向で含んでおり、プラスごドｐｓＢ１０３
は挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラスミド
ｐｓＢ１２５は挿入部を含んでいない。各種のプラスミ
ドを含む大腸菌ＨＢ　］、０１クローンを対数期まで増
殖させ、そして振とうしなから３７°Ｃで２時間、最終
濃度■ｍＦＩまでＩＰＴＧを加えることによって誘導し
た。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄剤
処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清（細胞
質ゾル）とペレット（細胞質内封入体）とに分けて、免
疫化学的技術によって分析すること（８２） ができる。
発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐｓＢ１０８）を含む大腸菌クローンだけが高
いレベルのＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大部分の
ｃｒｏ−ＥＢＺＤは」二清分画（細胞質ゾル）中に見出
された。ペレット分画（細胞質封入体）中には、検出可
能な量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐ
ｓＢ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃｒｏ
−［！ＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘導
後に、細胞培養物１１当り０．５　ｍｇのｃｒ。
ＥＢＺＤが産生されたものと推定される。
Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０分取用カラム（６０Ｘ
　２．　Ｉ　Ｃｌ１１）を高圧液体クロマトグラフィー
（ＩＩＰＬｃ）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０
．１％を含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画
を８　ｇ　／　ｍｆｌの濃度で溶解した。カ（８３） ラムを０．１％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリルで平
衡化した。アリコー１−２ｍ（タンパク質１６■）を注
入し、最終濃度０．１％のＴＦＡを含む水中の４０％ア
セトニトリル移動相によって均一に展開を実施した。Ｂ
Ｐの位置（分画２３）が分かった後で、前記の操作を二
〜三百回行なった。分画を監視する方法は後述する細胞
増殖調節アッセイであった。前記の浸透クロマトグラフ
ィーから脳因子（ＣＩＡ）の見掛けの分子量を計算した
ところ、約１８ｋＤａｌであった。
ＴＳＫ−２５０の　　１　　　クロマトグラフィ−１５
試行からのＴＳＫ−２５０画分２３をプールした（容量
７５戚）。プールされた材料を水中０．１％ＴＦＡによ
り２倍に希釈した。この混合物を、水中０．１％ＴＦＡ
によりあらかじめ平衡化されたμｍボンダバック−ＣＩ
８カラム（７８ｍｍ内径Ｘ　３００ｍｍ）に室温にて均
一に注入した。−次溶剤０．１％ＴＦＡと二次溶剤０．
１％ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの間で直線グラジェ
ントを用いた。グラジェント条件は２０分間に０〜２８
％、１４０分間に２８〜４２％、１０分間に４２（８４
） 〜５２％、そして次に６分間に５２〜１００％であった
。
すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであった。４−の両分
を集めた。各画分のアリコートを５０ｔｔｇのＢＳＡ　
と共に乾燥し、モしてＧＴＡについてアッセイした。
（ｄＡの２個のピークを貯蔵した。第１の活性（α）は
３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第２のピーク（β）は３４，５〜３６％の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
１０試行からの活性画分３０及び３１をプールし、そし
て０．１％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμｍボンダバックカラム（７８Ｘ、３００腑）
に均一に適用し、そしてカラムを０．１％ＴＦＡで洗浄
しそして平衡化した。流速は１成／分であり、そしてチ
ャートスピードは０．１ｃ＋ｎ／分であった。やはり、
第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃
度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジェントを
用いた。グラジェント条件は、４０分間に０〜３０％、
２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に３８〜１
００％であった。最初の１２画分は６（８５） ｍｌであり、そして次に４ｄ画分を集めた。アリコート
をＣＩＡについてアッセイした。活性は３２〜３３．５
％の間のアセトニトリル濃度において溶出した。
画分３０〜３２をプールした。１２ｄの０．１％ＴＦＡ
をプールされた両分に加えた。混合物（２４成を、０、
１％ＴＥＡで平衡化された分析用μｍボンダバックＣＩ
８カラム（３，９Ｘ　３００ｍｍ）上に均一に適用した
。流速及びチャートスピードはそれぞれ０．４　ｄ／分
及び０．１ｃｍ／分であった。やはり、第１溶剤０、１
％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有するアセ
トニトリルの間で直線グラジェントを用いた。
グラジェント条件は、２５分間に０〜３０％、２００分
間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％で
あった。２ｒｄの画分を集めた。画分のアリコートをＣ
ＩＡについてアッセイした。活性は分析用Ｃｌ１ｌカラ
ムから、約３４％のアセトニトリル濃度において溶出し
た。
画分２９−３１をプールし、そして０．１％ＴＦＡで２
倍に希釈し、モしてμｍボンダバックＣｌ１ｌカラム（
８６） （３，９ｘ　３００ｍｍ）に適用した。第１溶剤０．１
％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−
プロパツールとの間の直線グラジェントを用いた。グラ
ジェント条件は、４０分間に０〜１８％、２２５分間に
１８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であった
。流速は０．４　ｍｌ　７分であり、そしてチャー１−
スピードはＯ，］、　ｃｍ　７分に設定された。画分を
集め、そしてアリコートをＧＩＡについてアッセイした
。活性は約２３％のｎ−プロパツール濃度において溶出
した。
画分２８及び２９をプールし、そして０．１％ＴＦＡに
より５倍希釈し、モしてＯ，］％ＴＦＡの濃度を有する
ｎ−プロパツールを第２溶剤として用いてμボンダバッ
クＣ：ｌｌ＋カラム（３１９Ｘ　３００ｎｕ＋＋）　Ｊ
：で再クロマｌ−グラフ処理した。クロマトグラフ条件
及びグラジェント条件はすぐ上に記載したのど同じであ
った。最初の８個の画分は６　ｍｆｌであり、そして１
、６　ｍの両分を集めた。各両分のアリコートをＧＩＡ
についてアッセイした。はとんどの活性が百分１５〜１
７に現われた。画分１５〜１７は約１５ｇの蛋白質及び
約２３０　Ｘ　１０’ユニツトのＣＩＡを含有していた
。
（８７） この画分をＨＰＩ、ｃ−ｃ、８５画分どした。最終精製
画分は、ＣＣ１，６４を試験細胞として用いた蛋白質μ
ｇ当り１５．３３　Ｘ　１０’ユニツトの比活性を有し
ていた。
次の第４表は結果を要約する。
ＴＳＫ−２５０ ３０ ２，７６０ ４，３８ ８１ （＊） ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２ＳＪ−デオキシウリジ
ンの取り込みを５０％阻害するために必要な材料アッセ
イばＮｕｎｃ９６ウエルプレー）　（Ｋａｍｓｔｒｕｐ
ｖｅｊ９（Ｌ　ＤＫ　　４＋０００＋　Ｒｏｓｋｉｌｄ
ｅ　、デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細胞（Ａ５４
９）又はミンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細胞とし
て使用した。１０％ウシウシ８８） 児血清（Ｆｅ２）及びペニシリン／ストレプトマイシン
（Ｐ／　５）（０，５７ｍｇ／ｄずつ）及びグルタミン
を伴うドルベコ改変イーグル培地（ＤＭＥ？Ｉ）５０ｍ
中３．５×１０３細胞を、端のウェル以外のすべてのウ
ェルに導入した。端のウェルには５０μＥのＰＢＳを導
入し、そしてプレートを３７℃にてインキュベートした
。
試験サンプルを、１０％ＦＣ５、Ｐ／Ｓ及びグルタミン
を含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４日後
、５０／Ｊｌの試験サンプルを各試験ウェルに加え、他
方対照ウェルには５０ｍの培地のみを加えた。プレート
を３７°Ｃにて３日間インキュベートした。４日目に、
１′ｌ−ヨード−２′−デオキシウリジンの溶液（（４
Ｃｉ／■−０，５ｍＣｔ　／ｒｄ　（０，１ｌ１１アイ
ソトープ／−１１０％ＦＣ３、Ｐ／Ｓ、グルタミンを含
有するＤＭＥＭ中）１００１１１を各ウェルに加え、そ
してプレート に、培地をウェルから吸引し、２００μｌのＰＢＳで１
回洗浄した。次に、２００　１１１のメタノールを各ウ
ェルに加え、プレートを１０分間インキュベートし、そ
してメタノールを吸引により除去した。水酸化（８９） ナトリウム（２００μｌ、ＬＭ）を各ウェルに加え、プ
レートを３０分間３７°Ｃにてインキュベートし、そし
て次に水酸化ナトリウムをタイクーチツク（Ｔｉｔｅｒ
ｔｅｃ）プラグ（フロー・ラプス）により取り出した。
プラグを１２Ｘ７５ｍｍのプラスチックチューブに移し
、そして放射能を定量測定するためにＴ−カウンターで
計数した。
ソフトアガー・コロニー　　アッセイ １０％ウシ血清を含有するＨＵＭ中０．５％寒天（アガ
ーノープル；デイフコラボラトリーズ、デトロイト、ξ
シガン）の２．０成の基層を６０印のコスタ−組織培養
皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、１．　Ｏ　ｘ
ｌＯ’　Ａ５４９　Ａｇ３　（ソフトアガー増殖クロー
ン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験されるべきサン
プルを含有する０．　３％寒天を加えた。
プレートを空気中５％ＣＯ□の加湿雰囲気中で３７°Ｃ
にてインキュベートし、そして７日後に適切な補充物を
含有する０．　３％寒天２、Ｏｒｄの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野５個当り６細胞（９０） より多いコロニーの数を７日及び１４１ノ後に計数した
。
コロニー形成率アッセイ このアッセイは６ウエルーフアル：１ンブレート（９，
６ｃＪの面積／ウェル）中で行った。Ａ３４１胞（２０
０）を各ウェル中、ｌＯ％ＦＣ５、Ｐ／Ｓ及びグルタミ
ンを含む１　ｍｌのＤＭＥＭ中にプレートした。プレー
Ｉ・シた直後に、１．０　ｍｌの培地中種々の濃度の試
験拐料を２連で加えた。幻照ウェルには試験材料をなん
ら含まない１．０Ｍの培地のみを加えた。プレート空気
中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７°Ｃにて１゜日間イン
キュベートし、５０％メタノール中０．２％メチレンブ
ルー１．０−を各ウェルに添加し、そし２て２０分間放
置し、染料を除去し２、そして各ウェルを０．１　ｄの
水で２回洗浄し、そして空気乾燥した。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
注」ＬＺ的−牲４貿− ＤＮＡ合戒合成０％阻害が、それぞれ９８ｄｇ／ｄ、２
１ｔｔｇ　／　ｍｌ及び９５ｎｇ／ｍｕの粗両分、ＴＳ
Ｋ−２５０画分及び最終純蛋白質において観察された。
従って、八５４９（９１） ヒト乳癌細胞における５０％ＤＮＡ合或阻害が純蛋白質
の約９ｎＦＩ濃度において見られた。
ｂＢＦはまた、寒天（Δｇ）　−Ｊ：：でのヒト肺癌細
胞Ａ３４９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー
中でのコロニー形成の５０％減少が約７６ｎｇ／ｍｊ！
のｂＢＦにおいて見られた。Ａ３４９細胞のコロニー形
成率はこの蛋白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／
ｍＲ（１，２４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー
形成率は対照のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約
８０ｎｇ／ｍ℃のｂｒ（Ｆの存在下ではＡ３４９細胞の
コロニーは見られなかった。
Ａ３４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非存在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、ｂＢＦは鼠依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわら、ＤＮＡへの１２５１−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
ｂＢＦはへ５４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５八ｇ
）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の種々のクローンの
増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（ｗｘ−２６）の
（９２） 増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、ネズミ
線維芽細胞セルライン３Ｔ３−Ａ３１に対して増殖刺激
的である。
ヒトＴ−細胞機能［Ｚａｒｌｉｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　　４６８−４
７６　）に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのξクロ法を用いた。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘパリン処理血
液から、フィコール−ハイバク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（Ｈ３）が補充されたＲ　ＰＭＩ　１６４０の培
地（ギブコ、グランドアイル、ＮＹ）中に１×１０６Ｐ
ＢＬ／ｄの濃度で懸濁した。次に、０．　Ｉ　Ｉｄのこ
れらのＰＢＬ［応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｔｎｇ　ｃｅ
ｌｌ）と称する〕を９６−ウェルプレートの２連の丸底
ウェルのそれぞれに加え、そして次に０．０５ｄの培地
のみ又（９３） は２Ｘ１０５個のＸ−線照射された（２５００Ｒａｄ）
同種異系細胞〔゛刺激細胞″（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ
　ｃｅｌｌ）と称する］を含有する０、０５ｍＲの培地
、及び０．０５ｍ１の培地のみ又は種々の濃度の脳因子
（０，９〜７５ユニツト脳因子／ウエルをもたらす）を
含有する培地を加えた。細胞を５％ＣＯ２インキュベー
ター中で３７°Ｃにてインキュベートし、そして２日目
及び５日目に０．０５ｍの培地を各ウェルから取り出し
、そして次にもとの濃度の脳因子を含有する培地０．０
５ｍ１を添加した。
増殖応答を決定するため、６日目に各群からウェルの内
容物をプールし、そして０．１　ｄを９６−ウェルプレ
ートの４連のウェルのそれぞれに加え、次に０．０２５
ｄの容量中ｌμＣｔの３Ｈ−チごジン（３ＨＴｄＲ、ニ
ューイングランドニューフレア、ボストン、ＭＡ）を加
えた。６時間後、ウェルの内容物を多ウェル収得器を用
いてガラスフィルターストリップ上に収得し、これらの
ストリップをシンチレーション液体を含有するバイアル
に移し、そして”Ｈ−ＴｄＲ取り込みをβ−カウンター
中での計数（９４） により決定した。
細胞変性′Ｆリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果を
決定するため、６日日にウェルがらブー１しされた残り
のリンパ球を９６−ウェルプレー１・の３運の球底ウェ
ルに加え（０，１５ｄ／ウエル）、そして０．１５ｍｊ
！の４倍逐次希釈物も３連のウェルのそれぞれに加えた
。”Ｃｒラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ、　ｃｅｌｌ
）を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者から住じ
たリンボブラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞］、５
Ｘ１０６を５００　μＣＭ”Ｃｒ（ＮａｚＣｒ０４．−
’−：ｙ−−イングランドニューク、レア、ボストン、
門へ）により３７°Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細
胞を１５％熱不活性化ウシつシ血清（Ｆｅ２）を含有す
る培地で３回洗浄し、そしてこの培地に６Ｘ１０’細胞
／　ｍｌで再懸濁した。次に、０．０５ｍの標的細胞を
、エフェクター細胞を収容する各ウェルに、及び培地の
み〔自然（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）５１Ｃｒ放出を決
定するため〕又は洗剤のみ（５１Ｃｒ放出を決定するた
め）を収容するウェルに加え、そしてプレートを３７°
Ｃにて６時間インキュベートした。次に、］二清の一定
のア（９５） リコートを各ウェルから取り出し、モしてγカウンター
中でａｉ数するためにチ、エーブに移した。特異的５１
（：ｒ放出％を次のようにして決定した。
次の第５表が結果を示す。
第５表、ヒトＴ リンパ球のアロ抗原 ０７ １０３．６９０ ７０．１４０ ６４　５０７ ７８．２８７ ８７　０９５ ９５５２ 末梢血リンパ球（Ｉ）ＢＬ）は正常個体Ｖのヘパリン処
理血液から得られ、そして個体ＣからのＸ−線（９６） 照射された（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ
）により刺激され、そして６日後、３１１−チミジン（
３ＩＩ　ＴｄＲ）の取り込みを上に詳述したようにして
決定した。
ＣＰＭ　＝カウント／分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬのＴ−細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ−リンパ球
の生成に対して観察された。
同し量の５１Ｃｒ放出を生しさせる未処理のエフェクタ
ー細胞の数として、７５ユニツトの脳因子と共にインキ
ュベートされた約１６倍多くのエフェクター細胞が４２
％の５ＩＣｒ放出を生じさせるために必要である。
上記の結果から、この発明の化合物はインド１〜口及び
インビボの両方における広範囲の用途で使用され得るこ
とが明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は
、生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳を
ｍ液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞
外的に決定するため、組織中の細胞によって形成される
ポリペプ（９７） チドの量の決定のため、診断的に使用することができる
。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのりセプク
ーの決定のために使用することができる。さらに、この
発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下で腫瘍
細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤として、又
はジアゼバムリセプターもしくはＧＡＢＡ−作動性リセ
プターと関連する生理学的機能を調節するために使用す
ることができる。従って、脳組織由来の脳因子化合物及
びその断片は、外科的処置又は術後処置等のために、例
えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌における
正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除去する
ために他の添加物と組合わせて使用することができる。
脳因子化合物はまた、Ｔ−細胞の増殖の調節のためにも
使用することができる。ＩＥＢＺＤ化合物はＥＢＺＤリ
セプターの活性を調節するためにも使用することができ
る。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施（９８） することができることは自明である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １、膜蛋白質と実質的に同一のアミノ酸組成をもつポリ
    ペプチド又はメチオニン３７、６８又は６９で始まるそ
    のフラグメントを含む組成物、に結合することができ、
    そして該組成物又はそれらの免疫原フラグメントに応答
    して調製されている抗体。
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