JPH03169896A - 脳因子 - Google Patents

脳因子

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JPH03169896A
JPH03169896A JP2269724A JP26972490A JPH03169896A JP H03169896 A JPH03169896 A JP H03169896A JP 2269724 A JP2269724 A JP 2269724A JP 26972490 A JP26972490 A JP 26972490A JP H03169896 A JPH03169896 A JP H03169896A
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cells
sequence
amino acid
ebzd
amino acids
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JP2269724A
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Mohammed Shoyab
ショヤブ，モハメッド
Hans Marquardt
マルカート，ハンス
George J Todaro
トダロ，ジョージ　ジェイ．
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Oncogen LP
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
患（腫瘍形戒を含む）の基本的原因であると思われる。
増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（例え
ば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興味が
持たれており、更にまた特に有糸分裂が癌に影響を及ぼ
すかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を理解
することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセブ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に
用いられているペンゾジアゼビン（ＢＺＤ）は、Ｔ−ア
≧ノ酪酸（ＧＡＢＡ）で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる，
　ＢＺＤによるＧＡＢＡ一作働性伝達の調節における第
一段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ
飽和できる結合部位に対する結合であると思われ、この
場合にその結合部位は“超分子複合体”（ｓｕｐｅｒｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）の成分であると考
えられる。この系を理解すること、及びその系を調節又
は制御することができることの必要性は、天然リガンド
及びそれが機能する態様を知ることに依存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の戒分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸戒分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能′性、及び種々の精製段階を追跡
するためのパイオアッセイを提供することにおいてしば
しば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それに
もかかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、そ
の進歩は関心のある生或物の検出及び単離の助けとなっ
ている。
〔従来の技術〕
Ｂｅａ　ｌ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋．　Ｂ
ｉｏ　ｈ　ｓ．（１９７９）　３　：９３　−　９６は
、増殖及びＤＮＡ合成を正常細胞中でよりも形質転換細
胞中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在するこ
とを報告している。Ｈｏｌｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９８０）７７　：　５
９８９−５９９２は、上皮細胞威長阻害物質の精製を記
載している。
Ｌｅｔａｎｓｋｙ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｒｅ　．　（１
９８２）　２　：　３９−４５は、ウシの胎盤から精製
されたべブチドが腫瘍の増殖及びＤＮＡ中へのチ壽ジン
の取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑
制することを報告している。Ｃｈｅｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ
　Ｂｉｏｃｈｅａ＋．　Ｓｃｉ．（１９８２）　７　：
３６４　−　３６５は、癌抑制特性をもったべブチドを
腹水流体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄｉ
ｎｇ及びＳｃｈａｌｌｙ　，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９８２）７９：７０１４−
７０１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して
抗一分裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視
床下部から単離することを報告している．これらの殆ど
の因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの
基本的構造は知られていない。
ジアゼバム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（
１９８３）６０　：　　３８３−３８５、Ｃｏｓ　ｔａ
等、Ｎｅｕｒｏ　ｈａｒｍａｃｏｌ．　（１９８４）２
３：　９８９−９９１、Ｆｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒｏ
ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　（１９８４）２３　：　１３５
９　−１３６２、及びＡｌｈｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　（
１９８５）　２２９　：　１７９　−１８２によって報
告されそして説明されている。
〔発明の概要〕 新規な方法及び組戒物が提供され、これらの組戒物は、
ゲル浸透力ラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジエントの酸性（０．１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の或分
及びそのような戒分と実質的に相同の領域をもつポリベ
ブチドが提供される。その組戒物及び戒分は、ジアゼバ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される．〔具体的な説明〕 天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメンｌ−［を含む新規な組成物、及び種々の
ポリペプチドをコードしている核酸配列が提供される。
そのポリベブチドは脊椎動物、特に哺乳動物の脳細胞中
に天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は
実質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をも
つ。
その諸組威物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。
このポリペプチドは、ホモジナイズされた脳組織又はそ
の精製された両分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
ＨＰＬＣ及びゆるやかな直線グラジエントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の戒分につい
ては所望の活性は水性酸性ｎ−プロパノールを直線グラ
ジエントとして用いて更に精製することができる。
そのクロマトグラムは、約０．　１〜０．５ｍ／分の流
速で合理的な分離を得るために４時間以上の時間にわた
って展開することができる。逆相ＨＰＬＣを用いての分
離では脳組織からの部分的に精製されたサンプルをもた
らすのが普通である．部分的な精製は、ゲル浸透クロマ
トグラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリ
ルを用い、特に均一に溶出することによって好都合に達
或することができる．好都合には、媒体はＯ．　１％ト
リフルオロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルである
ことができる。
二或分は実質的に異なった生理学的活性及び組威をもつ
．内因性ペンゾジアゼビンオイド又はエンドゼビン（Ｅ
ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム（ｖａｌ
ｉｕａ＋）アゴニストとしてジアゼパムレセプターに結
合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明
らかである。ＥＢＺＤは、低い投与量では、哺乳動物に
興奮及び増強された意識を引き起こし、一方高い投与量
では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体について
は、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い投
与量では心臓拍動度数は増大する。それらの化合物はジ
アゼパム結合性阻害剤について公表された（前記のＧｕ
ｉｄｏｔＬｉ等の文献）配列との幾らかの相同性を示す
．このペブチドは、脳シナプトソームへのペンゾジアゼ
ビンの結合を抑制することにおいて、約１〜ＬＭ、普通
には３〜６団のＫｉをもつことを更に特徴とする（後記
の実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約７〜１５ｋ
Ｄａ　ｌ、普通には８〜１２ｋＤａｌ，又はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記
の実験の項を参照のこと）。このペブチドは親水性であ
る。１０００ユニット／ｍｇを越える比活性を得ること
ができる（後記の実験の項を参照のこと）。
ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのアミノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異なっ
た種にわたる共通配列）はジアゼパム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。
第二の戒分は脳因子（ＢＰ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＩＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そして
ゲル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い。その化合物
は、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌
細胞の成長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形
威及びコロニー形或率を抑制するために有効であること
が見いだされている． ＢＦは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５　〜２０ｋＤａｌ，普通には約８〜１８ｋＤａｌ
の分子量をもつ。この蛋白質は逆相ＨＰＬＣ及び直線グ
ラジエントの０．　１％ＴＦＡ水性ｎ−プロパノールを
用い、約２０〜２６％ｎ−プロパノールで溶出して精製
することができる。その精製された蛋白質は少なくとも
約１５　Ｘ　１０３ユニット／ｎの比活性をもつことが
できる（後記の実験の項を参照のこと）。
第三成分は、アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤ
のアミノ酸５４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるブローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペブチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。
これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には補乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセブター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のベプチドに融合させ、他
のべブチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
ブテンに共有結合させ、又は１個以上の、普通には数で
約１０％以下の、一層普通には数で約５％以下の、挿入
、欠失、トランジシゴン又はトランスバージゴンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリベブチドを更に詳細に考慮する。
ＥＢＺＤポリベブチド ＥＢＺＤボリペプチドは約２０キロドルトン（ｋＤａｌ
）未満、普通には約１５ｋＤａ１未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約１　ｋｃａｌ、一層
昔通には少なくとも約２ｋＤａｌである。
そのポリペプチド組成物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下
で０．１％水性トリフルオロ酢酸中のＯ〜６０％アセト
ニトリルの直線グラジエントを用いて、２８〜５０％ア
セトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、一層
特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、一層特異的
には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμ−ボンダ
バック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　−　Ｃ＋　ｓカラムから
溶出することを更に特徴とする。
ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、一層普
通には少なくとも約２０個のアミノ酸、そして約１２５
個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よりも少
ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約７〜１５ｋＤａ　ｌの範囲内の分子量を
もつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも２つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
ａ．　Ｙ　ａａ”　ａａ’　Ａｒ　Ｋ　Ｑ　Ａ　Ｔ　ａ
ａ’ｂ．ＫＷＩ）ＡＭ ｃ．　Ａ　Ｍ　ａａｃＡ　Ｙ　（Ｘ）Ｘ　Ｖ　Ｅ　Ｅｄ
．　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａ’　Ｅ　Ｅ　Ｍ　Ｌ　Ｆ
　Ｉ　Ｙ　ａａ”　ＩＩ　Ｙ　Ｋｅ．ＱＡＴＶＧＤ　　
ＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤｆ．ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧ
ＭＬＤＦＴＧＫｇ．κＧＴＳＫＥＤＡ 上記の配列において、 ａａ’は芳香族アξノ酸、特にフェニルアラニン及びヒ
スチジンであり； ａａ’はいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アξノ酸
であり； ａａ’はいずれかのアミノ酸、特に脂肪族７５ノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性゛、一層特
定的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性ア
ミノ酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａ＠は脂肪族中性アご
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもので
あり；ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミドで
あって且つ４〜５個の炭素原子をもつものであり； Ａｒは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フエニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリブトファン、特にＹを包含
し； ａａ’は脂肪族アミノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； Ｘは１〜３個のアξノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アξノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり；そして ＸはＯ又は１である。
主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＢ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである： ａ，　ＴＫＰａａ’　ＤＥＢＭＬ！ＪＹａａ＠ＨＹＫＱ
ＡＴａａ’　Ｇｂ．　ＫＷＤＡＷａａ’　ａａ’　　Ｌ
ａａ’　ａａＪａａ’　ａａ’　ＫＥａａ″’　ＡＭａ
ａ’ＡＶ　（Ｘ）．　ＶＥＥ　ａａ’　ＫＫｃ，　ＫＱ
ＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤＰＴ上記の配列におい
て、 ａａ’　Ｈ　ａａ”　＋　ａａｑ％及びＡｒは前記で定
義した通りであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜６個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には５〜６
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ： ａａ’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、一
層普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アごノ
酸であり； ａａ’は脂肪族アξノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アミノ酸であることができ； ａａ’は脂肪族アミノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性
中性アミノ酸であり； ａａｊは中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、一層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族ア泉ノ
酸であり； ａａ”は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、一層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり：ａａ’　は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり； ａａ″″は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり； ａａ’は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性ア逅ノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａ１は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又は
極性ア逅ノ酸であり、極性である時には、特にヒドロキ
シル基をもち、好ましくはＡであり；Ｘ′はＸと同じで
あり、普通には１〜３個のアミノ酸であり、それは脂肪
族ア逅ノ酸であり、それ゛は一般的には４〜６個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアごド
、及び塩基性アξノ酸であり； ＸはＯ又は１であり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性ア壽ノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Ｘの他に更に、本発明のポリペプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために１〜３個、好ましくは
１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが
、ある場合には、Ｄ一アミノ酸が使用されてもよい。
特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：ψ−Ｚ’　−ａａ’−ａａ”−ａａ”
−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’＝Ｋ−ａａ
”−ａａ”−ａａ”−ａａＩ３−ａａ”−Ｐ−ａａ”−
ａａ１Ｅ−ａａ”−Ｍ−Ｌ−ａａ”−ａａ”−Ｙ−ａａ
”−ａａ”ａａ”−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｔ−ａａ”−Ｇ−ａａ
”−ａａ３Ｓ−ａａ３６ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−
Ｇ−ａａ”−ａａ”−Ｄ−ａａ”ａａ４ｈ−Ｇ−ａａ０
−ａａ４９〜Ｋ−Ｗ−Ｄ−Ａ−Ｗ−ａａ”ａａ”−Ｌ−
ａａ”−ａａ５９−ａａ”−ａａ”−Ｋ−Ｅ−ａａ”Ａ
−Ｍ−ａａ”−ａａ”−Ｙ−（Ｘ）ｘ　−Ｖ−Ｅ−Ｅａ
ａ”−Ｋ−Ｋ−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−　　
Ｚ’上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ＺＭは結合又はｌ〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜
９個のア粟ノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばＥ−＾−Ａ又はＨ−Ｅ−Ｔ−Ｒ等も
ａａ’　に結合することができ、またこの場合に、２個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアξノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じライン上
のアミノ酸が一緒に採用され；ａａ’・１１１は２〜６
個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特にグ
リシン、アラニン、ブロリン、パリン、ロイシン及びイ
ソロイシンであり； ａａ　Ｓ　ｖ　ｌ　ｋ　＋　！　Ｓ　＊　３Ｓ＋　３”
ｌｒ　５５＋　ｈＯｒ　６１＋　６１１１＋　７３・７
９　は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この
場合に特にａａｓＩ　ｌ　＆＋　！Ｓ１３５＋　３７＋
　７１＋　’１９がいずレカノちノテあり、そして残り
が好ましくは極性アミノ酸、特にセリン、スレオニン、
システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミン
であり； ａ　ａ　ｌ　ｒ　＆　＋７＋　１　？＋　Ｉ　９＋　２
２・２４＋　３１１＋　５６＋　５９＋　６４＋　？●
は脂肪族中性アミノ酸（極性及び非極性アミノ酸を包含
する）又は脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及
びグルタミン酸であり；特にａ　ａ　Ｉ　ｌ　？・３！
＋　２４＋　５９＋　？ｌＩは中性アミノ酸である時に
非極性であり、残りは中性アミノ酸である時に極性であ
り、そしてまたａ１・６・丁・Ｉ？・＋９・３４・■・
！１＆・ｂ４　は好ましくは酸性アミノ酸であり； ａａ！ｌ　ｌ＠＋　ｌｍ一２＊　ｔ’ｋ＋　＊ｈ＊　！
ｆｆ＋　４２・４Ｍ＋　４５＋　４９・？１は脂肪族中
性アミノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン
、ヒスチジン、チロシン、及びトリプトファンであり、
好ましくは、ａ　ａ　Ｚ　ｒ　１　（＋　＋　ｌ　６゜
！？＋　４ｓ＋　？’？は好ましくは芳香族ア逅ノ酸で
あり、一方残りのアミノ酸は好ましくは脂肪族アミノ酸
であり；ａａ３＋　９＋　Ｉ　ｌ＋　１　４＋　３６＋
　３９゜“＋　４１１ｒ　Ｓｌｌ＋　ｂ丁゛′Ｉ６は脂
肪族中性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニ
ンであり、この場合に８１゜５１１＋　６？＋　’１６
は塩基性以外の時に好ましくは非極性であり、そして残
りは塩基性以外の時に好ましくは極性であり、但しａ　
ａ　ａ　＆は極性でも非極性でもよく、モしてａａ’・
Ｉｔ・＋４・３９・０・ｓｓ・＆’？・？ｂは好ましく
は塩基性ア藁ノ酸であり；ａ　ａ　Ｚ　Ｚは塩基性又は
芳香族、特にフェニルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてｚｃは０
１｛，ＮＨ！、又は１〜６個の、普通には１〜４個のア
ミノ酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のアミノ
酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列Ｍ
−Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配列である． １個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも１５個、好ましくは少なくとも３０個のアξノ酸
を配列中にもつ： Ｅ　　　　　　　　　　　　Ｒ Ｓ Ｇ Ｖ Ｄ Ｌ Ｌ Ｔ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アξノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を
意図しており、モしてＺは０又は１である。その配列は
合計で１０個までの、普通には合計で８個までのアミノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ一末端は
追加の配列Ｖ−Ｈ−Ｅ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの部
分をもつことができ、モしてＣ一末端は配列’Ｍ−Ｐ−
Ｍ−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約１
５個、好ましくは少なくとも約２０個、一層好ましくは
少なくとも約３０個のアミノ酸をもち、下記の配列の１
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２
個、そして一層好ましくは少なくとも１５個の、 星印（＊） で示したアミノ酸 を含む （ｂ＝ウシ、 ｈ＝ヒト）。
本本 Ｄ−Ａ 参 Ｅ−Ｍ 本　　本　　　　傘本　本＊　本ネ＊＊Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｌ
−Ｇ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｍ−１−Ａ−Ｙ−
Ｖ−２−傘本 Ｋ−Ｋ−１−Ｌ−Ｅ−Ｔ−門−Ｐ−Ｍ−Ｔ本　本 Ｋ−κ−Ｋ−Ｙ Ｇ−１ 零　＊ Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−１ 本発明の特に好ましい組成物については、上記の諸配列
が、約５個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約３個以下
のアミノ酸によってである。
ＥＢＺＤ組成物は少なくとも約２０％の純度、一層普通
には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
それが由来する組織からの戒分を実質的に含まず、由来
組織からの戒分が１重量％未満、好ましくは約０．１重
量％未満、一層好ましくは約０．００１重量％未満であ
るＥＢＺＤ＆［ｌ或物は特に興味がある。本発明のＥＢ
ＺＤ＃Ｊｉ成物は、後記の実験の項で記載するアッセイ
条件下で粗シナブトソープ膜への３Ｈ−ジアゼパムの結
合を４０％競争に必要な量によって測定して、少なくと
も１５ユニット／ｍｇの比活性をもつ。
比活性は普通には少なくとも５００ユニット／ｍｇ、好
ましくは少なくとも約１０００ユニット／ｍｇであり、
モして１２５０ユニット／ｍｇ以上であってもよい。
一般的には、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿
った組織１ｇ当り少なくとも約１０趨当量あり、そして
普通には脈絡叢中の湿った組織１ｇ当り少なくとも約２
０Ｊｔｇ当量ある。前記したように、本発明の化合物は
心臓細胞集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及
ぼすことができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下
させ、この少ない投与量は一般的には約１５０ｇ／ＩＩ
１１未満である（実験の項を参照のこと）。ＥＢＺＤの
その他の特徴は、生理学的活性がＥＢＺＤについて立証
される種々の試験から明らかである。
員四ヱ 脳因子は少なくとも２ｋＤａｌ、一層普通には少なくと
も５ｋＤａｌそして約２５ｋＤａ１以下、一層普通には
約２２ｋＤａｌ以下であることを特徴とする。脳因子は
、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように、少
なくとも約１×１０３、一層普通には少なくとも約５×
１０７、好ましくは少なくとも約１０６、好ましくは少
なくとも約１．５×１０７の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約１０％の純度、一層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの戒分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、Ｎ一末端近くに又はＮ一末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む：Ｎ−Ｋ−Ｅ−
Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−　１−
Ｘ−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示
す。
脳因子はヒｌ−Ｔ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫
又は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤
としての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤
、例えばシクロスボリンＡ又はコルチコステロイドとの
併用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも１桁の、好ましくは少なくとも２桁のオ
ーダーで識別することができる。
股蛋亘質 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　
Ｐｒｏ　　＾ｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　
　　−ＩＴＴＣ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　Ｃ
ＣＧ　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣ　ＴＣＣ　　　６７ＡＴ
Ｇ ＡＣＴ　　ＧＡＡ ＡＡＡ らＴＴ　　ｔｉＡＡ ＬｉＡＡ ｒｉ’ｌｉ しＩＡ しＡＩ ４Ｆ３１ しｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　
Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｈｉｓ　　Ｌｙｓ八Ａ
Ａ　　ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＡ　　ＴＣ
Ｔ　　ＧＣＡ　　ＧＡＣ　　ＣＡＴ　　ＡＡＧょｈ起ｌ
（７）”８：ウシの脳に由来するｃＤＮ＾クローンのヌ
クレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列（＊）．ア
ミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係で番号
づけされている。ＥＢＺＤと相同な領域は太線によって
上に線引きされており、そして疎水性及び非荷電のアミ
ノ酸の延長領域は細線で線引きされている．潜在的なグ
リコシル化部位は囲まれている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、一層普通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ．　ＥＢＺＤとの相同性をも
つ、太線の引かれた配列は特に興味がある．その蛋白質
は少なくとも約ｌＯ％の純度、好ましくは少なくとも約
５０％の純度、一層好ましくは少なくとも約８０％の純
度、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、
望ましくは純粋であることを更に特徴とする．その化合
物は望ましくはそれの由来する組織からの戒分を含まな
い。
膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。
興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。
゛本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原とし
て用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディ
オタイプ抗体の生産のための抗原として用いることがで
きる。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノ
クロナール抗体のいずれかを調製することができる．本
発明のポリペプチド又はそれのフラグメント、一般的に
は少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントは
それ自体で使用することができるが、しかし好ましくは
、免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させ
られる．種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホ
ールリンベット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモ
シアニン、グロプリン、等を用いることができる。ポリ
ペプチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えば
グルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息
香酸等を利用することができる．アジュバントとしては
フロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、水酸化アル
ミニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔で１回以上の追加免疫注射を行なう．モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
その肺臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
ーと融合させる。
例えば、Ｇａｌｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕ二困■（１９８７）鉦：７７；米国特許第４
，３８１，２９２号及び第４．３６３．７９９号を参照
のこと。しかしながら、特定の目的に対しては、その他
の哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）を、ヒ｝　Ｆ
ｃｔＷをもつ抗体の生産のために、用いることができる
。
ＥＢＺＤポリペプチド及びＥＢＺＤボリペプチドに特異
的に結合する抗体は、個々に又は一緒にして、インビボ
及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合ｅｔは
ジアゼバムレセブターへの結合のためのアゴニストとし
て用いることができる．本発明の化合物は、ジアゼバム
レセブターの数及び分布を求めるのに用いることができ
る。加えて、本発明の化合物は哺乳動物宿主の心臓拍動
を調節するのに、哺乳動物宿主を鎮静させるのに、又は
補乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用いられる．脳
因子ポリベブチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に結
合する抗体は、個々に又は一緒になって、インビボ及び
インビトロの両方で用途がある。
このポリベブチドはａｍ抑制特性をもっているので、こ
のポリベブチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制するた
めに、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合
物と共に用いることができる．それ故に本発明の化合物
は下記の場合のような状態で用いることができる：正常
細胞を突然変異させる場合、この場合には突然変異の発
生の結果として正常細胞及び腫瘍発生細胞で生じる差異
を区別することが望まれる；骨髄が哺乳動物宿主からと
り出されている場合に腫瘍発生細胞の増殖を抑制する場
合；細胞集団中の該ポリペプチドについての結合部位を
検知する場合、等。この脳因子ポリベブチドはＴ細胞を
他の細胞から区別するか又はとり出すために用いること
ができる。
脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する（この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい）
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。
このポリベブチドは、ポリペプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性
粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３．
　８１７．　８３７号、第３．　８５０．　７５２号、
第４，１７４，３８４号、第４，２７７，４３７号及び
第４，３７４．９２５号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
ＥＩＡ　，　ＥＬＩＳＡ　，ＲＩＡ　，ホモゲニアスＥ
ＩＡ　，　　ドットープロット、ウエスターンズ（　Ｗ
ｅｓ　ｔｅｒｎｓ）等と称される。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イデイオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イデイオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビトーブ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ．それ故に、これらの抗イデイオタ
イプはジアゼパムアゴニストとして、腫瘍抑制剤として
、主題のポリペプチドの代用品として、又は主題のポリ
ペプチドに対するアンタゴニストとして役立つことがで
きる。
上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼバムレセブター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形戒する．天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然１或物は多数の種々の組織、例えばＩ
！ｌＩｌ臓及び精巣中に見いだすことができる。
本発明の化合物を単離するために、脳組織から血餅を排
除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４　ｋＤ
ａｌ未満である低分子量物質を除去する。
その生成物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０．１％トリフルオロ酢酸水
溶液溶離剤を用いて処理して、その生或物の活性の抑制
剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両分
をパイオアッセイによって観察する。その生或したＥＢ
ＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、
例えば、μ−ボンダバッター〇．カラムを用い、水性０
．１％トリフルオロ酢酸中の約Ｏ〜６０％アセトニトリ
ルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及び遅
い溶出速度、例えば４時間以上、好ましくは５時間以上
を用いて更に精製した。本発明のＢＢＺＤ化合物は約３
０〜５０％アクリロニトリル、一層特定的には３０〜４
０％アクリロニトリルの画分中に見いだされる．ＢＦ化
合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％水性ア
セトニトリルの直線グラジエントを用い、３２〜３６％
アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回以上繰り
返して、更に精製する。この濃縮された百分を次いで、
逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％水性ｎ−プロパノールの
直線グラジエントを用い、約２２〜２４％ｎ−プロパノ
ールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り返して、更
に精製する．他の方法として、本発明のポリペプチドは
、特にポリペプチドが３０個未満のア逅ノ酸、一層特定
的には２５個未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従
って合或することができる。例えば、Ｂａｒａｎｙ及び
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐ
ｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ″Ｔｈｅ　ｐ８ｐｔ
ｔｄｅ３１　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　，Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐａｒ
ｔ　Ａ．Ｖｏｌ．　２＋　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈ
ｏｆｅｒ＆Ｉ、ＡｃａｄｅＩＩＩｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（米
国）　１９８０、１〜２８４頁を参照のこと。
比較的大きなポリベブチド、特に約２０個以上のアミノ
酸をもつもの、一層特定的には約３０個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる．ポリペプチドをコード
するためにゲノムＤＮＡ．　ｃＤＮＡ，合ｔｃＤＮＡ又
はそれらの組み合せを用いることができ、いずれかのイ
ントロンの存在はそのイントロンのための機能的スブラ
イシング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決さ
れる。ほとんどの場合において、オーブンリーディング
フレームが用いられ（イントロンなし）、この場合にそ
のリーディングフレームをコードする配列は発現宿主中
で機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される。
特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
れるｃＤＮＡがある。このｃＤＮＡは開始のメチオニン
がら約１２０ｂ，までの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂ９を含む。
下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している。
５’　−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡ
ＡＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴＮａｅｌ ↓ −ＣＧ Ｈｉｎｄ　ｍ 上 −−Ｌ；　　Ａ ８７ ＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡ−ＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡ
ＣＣＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡ　　４３４−−−−−Ｔ
−Ａ−ＴＧＴ−−−−−ＧＴＧ−−−ＡＴ〜−−−−−
−−−−ＧＡＣ−ＡＴＧＣＣＴＴＩＩ；ＴＴＴＴＴ−Ｃ
ＴＡＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＡ−
−−−−−−−−−−−−ＴＴ−−−−−−−Ｃ−Ｔ−
−−−−Ｇ↑−ＧＡＡ　３’＾ＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡ
ＧＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡ
ＴＡ　　５１１ＴＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧ
ＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＡＣ↑＾ＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧ
ＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＴＧ＾＾ＴＴ
ＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴ　　５９０ＴＧＴＴＡＣＴＴＴ
／ＡＣＴＴＣＧ／＾Ｔ（ｐｏｌｙ　Ａ）−３’　　６０
７上記はウシとヒトのヌクレオチド及びＥＢＺＤの推定
されたアξノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列
において異る残部はウシの配列の上及び下に示されてお
り、それは３つのオーバラップするｃＤＮＡクローンか
ら求められた。ヌクレオチド残部はウシのクローンの複
合配列に関して番号付けされており、アミノ酸残基は開
始のメチオニンに関して番号付けされている。ウシの配
列のリーディングフレームは星印（＊）に挟まれている
．３つの別個のクローンのポリ（Ａ）十付加部位におけ
る差異は逆スラッシュによって示されている。
ウシのｃＤＮＡブローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［Ｉの制限部位が示されている。
実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグ
メントが、本発明のポリベブチドの発現に用いることが
できる．インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし１個以上のアミノ酸の異な
っているポリペプチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる．発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ベクタ
ー内に対象の配列を導入することができる．宿主は、原
核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻類、菌類、
例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マウス細胞、
ハムスター細胞、モンキー細胞等であることができる。
発現ベクターは、コード配列の挿入のために完全に組立
てられていようが、本発明のポリペプチドのコード配列
と組合わせて組立てられていようが、多くの場合、以下
のように特徴付けられる。常にというわけではないが一
般には、宿主中で維持されるべき少数または多数のコピ
ー数のエビソーム要素を提供する、野生型複製系以外の
複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコード配列を
組込むことが望ましい場合には、複製系は必要ないであ
ろう。コード配列は、５′末端および３′末端において
、しばしば野生型の制御領域以外の、転写および翻訳開
始シグナルおよび終結制御シグナルのそれぞれによって
挟まれている。従って、プロモーター領域は５′末端に
おいて用いられ、キャップ配列、制御された発現のため
のオペレーター、およびエンハンサー配列等を含み、構
或的発現のためにプロモーター制御を含んでいないこと
ができる。３′末端においては、ターミネーター、終止
コドン、および最適にはポリアデニル化配列等が存在す
る。
転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にする１種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される．マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリン力一が、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をボリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生成物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる：米国特許第４，４１１．９９４号、ＥＰＡ８８．
　６３２および１１６，２０１　．コード配列は正しい
リーディングフレームで分泌リーダーおよびプロセッシ
ングシグナルに連結されることによって、その融合コー
ド配列を発現ベクター中に挿入して発現造戊物を提供す
ることができる。
ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、グラジエン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理・学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、
リン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することが
できる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局
所的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投
与は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および
皮下的等であることができる。
天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００ｌｔ
ｇ／ｌＩ１である．投与方法に応じて、用量は約０．　
５〜５００ｘ／ｋｇまで、より通常には約５〜５０屑／
ｋｇまで変化することができ、用量が２５ｇ／ｋｇを越
える場合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所
望の反応、投与方法および用量の反復性等によって変化
する。
以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
亥：」暖 Ｂｉｏ−Ｓｉｔ　ＴＳＫ−２５０ゲルロ過ＨＰＬＣカラ
ムを、バイオーラッドラボラトリーズ（リッチモンド、
カルフォルニア）より購入した。μ−Ｂｏｎｄａｐａｋ
　−　Ｃ　＋　ｓカラムをウォーターズアソシエート（
ごルフォールド、マサチューセッツ）より入手した。ト
リブシン（ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシンおよびスタ
フィ口コツカル・アウレウス困凰蛙鮭匹匹虹ａｕｒｅｕ
ｓ）ｖ８プロテアーゼは、ワーリントン（Ｗｏｒｔｈｉ
ｎｇｔｏｎ）から得る。エンドブロティナーゼＬｙｓ　
−　Ｃをべ一リンガーマンハイムから得た。３Ｈ−ラベ
ル化ジアゼバム、ＲＯ１５−１７８８、フルニトラゼバ
ムおよびβカルボリンをＮＥＷ　，ボストン、マサチュ
ーセッツから得た。キャリャフリー１　２５７−ヨウ素
はアマーシャム（アーリントンハイト、イリノイ）製の
ものであった。
ウシの　　　のエンドーベンゾジアゼビノイド新鮮な又
は凍結したウシの脳（４８０　ｇ湿重量）を融解し次い
で細断した。細断した組織を、２３７９ｒｄのエタノー
ル（９８％）　、１８．５ｄの濃ＭＣＩ、および２．　
５　ｄのアブロティニン〔ウシの肺源の２３　ＴＩＵ／
ｄ（シグマケミカル社）〕から或る２４００ｄの抽出緩
衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマーシャル
混合機中でホモジナイズした。ホモジネートを４゜Ｃで
一夜で撹拌し、ベックマン型１９ローター中８０００ｒ
ｐａ＋で３０分間遠心分離し、次いで上澄みを注意深く
除去した。最終量は約２０７０　ｄであった。クロロホ
ルム（２０７０ｄ）および２０７ｄの酸性の水（２０３
ＩＩＩ１の水と４ＩＩＩｉの濃｝１ｃｊ！）を上澄みに
添加し、混合物を約１時間激しく撹拌し、次いで室温に
放置し二相に分離した。水性の上相を注意深く除去し次
いでスベクトラボール透析膜チューブ（３．　５００Ｍ
Ｗカットオフ、アメリカンサイエンティフィックプロダ
クト）中、４℃で０．　１　Ｍ酢酸２０ｆを２回取り換
えて透析した。透析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾
燥材料（７８５■）を粗分画と称した。
ル゛　クロマトグラフ　ー Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０　Ｘ　２
．Ｉ　Ｃｌｌ　）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付け
た。粗分画を０．　１％三フフ化酢酸を用い４０％アセ
トニトリル水溶液中に８■／ＩＩ１の濃度で溶解した．
カラムを０．　１％三フフ化酢酸（ＴＦ＾）と共に４０
％アセトニトリルを用いて平衡化した。２ｄのアリコー
ト（１６■のタンパク質）を注入し次いで０．　１％濃
度のＴＦＡを有する４０％アセトニトリル水溶液を移動
相として均一に溶出を行った。流速を２ｍ／分に設定し
そしてチャートスピードを０．２５ＣＩ／分に設定した
。
クロマトグラフィー処理を室温で行った．５ＩＩ１の分
画を採取した．各分画のアリコートを凍結乾燥し次いで
ペンゾジアゼビン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−Ｂ
ＣＡ）および或長押制活性について３回分析した． ＢＺＤ−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述
ベた如く、４９回のクロマトグラフィー操作を行った．
全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した．約６
５■の活性な乾燥粉末を得た．これをＴＳＫ−２５０分
画と称した。この分画は約９３６ユニットのＢＺＤ−Ｂ
ＣＡ活性を含有していた。
ＴＳＫ−２５０　　　の　　１　　　クロマトグーフィ
−ＴＳＫ−２５０分画を０．１％ＴＦＡに溶解しく２■
／ｙｔｌ”）、更にｇ　−　Ｂｏｎｄａｐａｋ　−　Ｃ
　＋　＠カラム（７８ｍｍ　（内径）×３０ＣＩ）を用
い室温で逆相ＨＰＬＣにより分別した。試料を均一に適
用し、カラムを洗浄し次いで０．１％ＴＦＡで平衡化し
た。流速を２ｄｌ分に設定し、そしてチャート速度を０
．２５ｃｍ／分に設定した。第一の溶剤０．　１％ＴＦ
Ａと第二の溶剤０．　１％ＴＦＡ中のアセトニトリルと
間での線状グラジエント法を用いた．グラジエントの条
件は２０分内でＯ〜２８％、次いで１４０分内で２８〜
４２％、１０分内で４２〜５２％更に６分内で５２〜１
００％であった。全ての溶剤は、ＨＰＬＣ等級のもので
あった．４−の分画を採取した．各分画のアリコートを
凍結乾燥し、次いでＢＺＤ−ＢＣＡに対し３回分析した
．大部分の活性部分が、３１〜３２％アセトニトリル濃
度間で溶出した。
分画３６と分画３７をプールし、次いで１２ｄの０．　
１％ＴＦＡで希釈した。混合物を、μ−Ｂｏｎｄａｐａ
ｋ−Ｃ，，カラム［３．９ｎｍ（内径）Ｘ３０ｃｍ）に
均一に適用した。流速はｌｄｌ分であり、チャート速度
は０．２５ｃｍ／分であった。第一の溶剤０．　１％Ｔ
ＦＡと第二の溶剤０．　１％ＴＦＡを有するアセトニト
リルとの間で直線グラジエント法を用いた。グラジェン
ト条件は次の通りであった。１０分内で０〜３０％、次
いで６０分内で３０〜４０％であった。分画を採取した
。殆ど全ての活性（約８５０ユニット）部分は３１％ま
でのアセトニトリル濃度で分画６内に溶離した。この分
画をＨＰＬＣ　　Ｃｒｓ分画と称し、これは約６８０Ｋ
のタンパクを有していた。
また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒトＥＢＺＤを精製した。
２シナフ″トソームのｉｌ言 粗シナブス膜分画を、体重２００ｇまでのスプラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．ム且ＵＳＡ（１９７４）７１　：　４８０２−４
８０６）の記載の如く調製した。シナブス膜を、５０−
のトリスーＨＣＩ．　（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、緩
衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離によりペレ
ット化した。洗浄したシナブトソーム膜を５０−トリス
ーＨＣｆ　（ｐＨ７．４）に懸濁させ次いで−２０″Ｃ
で保存した。
ＥＢＺＤ一　人　　　　についてのアッセイ種々の画分
又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブト
ソームへの’Ｈ　−　ＢＺＤの結合の阻害を、結合競争
活性の指標として使用した。シナブトソーム膜への３Ｈ
　−　ＢＺＤの結合を、２５団のβ−カルボリンの不在
下又は存在下のいずれかで使い捨ての１２　Ｘ　７５ｍ
ｍのポリプロピレン管中において２通り実施した。その
結合混合物は、所望の種々の濃度の試験化合物、２０−
のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ＝７．　４　）　、シナプ
ス膜懸濁液（７０〜１００ｄのタンパク質）　，　１　
〜５１Ｍ（７）３Ｈ−ＢＺＤ及び合計体積０．　１　ｄ
中０．　５％の最終濃度のジメチルスルホキシドを含ん
だ．４゜Ｃで３０分間のインキュベーションの後、０．
１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ　（ｐＨ＝　７．　４　）
中１０％の冷ボリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００
）　０．　７　ｍを各々の管に添加した。その懸濁液を
すぐ４℃でＧＦ／Ｂフィルターにより真空濾過した。そ
のフィルターを、ｌｆｆｉｇ／ｄのＢＳＡを含む５０Ｉ
ＩＩＭの冷Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ＝７．　４　）　
１０ｄにより洗浄した．そのフィルターを、計数バイア
ルに移し、そしてアクアシン（Ａｑｕａｓ−ｓ　ｉｎｅ
）　（ＮＥＮ）　１０Ｉｄを、各バイアルに添加し、そ
してＢｅｃｋｍａｎ　β一カウンターを用いて放射能を
測定した。２５−のβ一カルボリンの存在において結合
した放射能（合計結合の２〜８％）は、非特異的である
と思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された。
タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いて、Ｌｏｗ
ｒｙ＋など．，Ｊ．　Ｒｉｏｔ，　Ｃｈｅｏ＋．（１９
５１）ユＵ：２６５〜２７５の方法によって測定した．
ポリアクリルアミドゲル　””　　　ＰＡＧＥ）０．　
１　Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）、０．１％
のＳＤＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％のポリアクリ
ルアごドビスーアクリルアミド（３０：０．８）の１５
ａ＊の分離ゲル（０．７５ｍｍの厚さ）を使用した。そ
のゲルは、ゲル２０ｄ当りＴＥＭＥＤ（ＢｉｏＲａｄ）
　１０ｍを含み、そして、２０％の過硫酸アンモニウム
のｌ．Ｏｊ１１／一のゲルを用いることによって重合さ
れたものである。分離ゲルの条件と同一の緩衝液条件を
用いる３．５％のアクリルア５ド溶液の上層ゲルを、下
層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約３帥を残して、コム
（Ｃｏｍｂ）を、その上のゲル中に挿入した。
０．ＯＩＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．　２　）　
、７　Ｍの尿素、１％のＳＯＳ及び１％の２−メルカプ
トエタノール中サンプル４０ハを、２分間煮沸し、そし
てすぐに適用した．そのランニング緩衝液は、０．１％
のＳＤＳを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　
７．　２　）であった。トラッキング染料がゲルの底に
達するまで、そのゲルを、室温で５■／ＣＩＩ１で泳動
させた。そのゲルを、５０％メタノール及び９％酢酸中
に固定し、固定溶液中において０．　１％クーマシーブ
ルー（Ｃｏｏｍａｓｔｅ　ｂｌｕｅ）により染色し、そ
して５０％メタノール及び９％酢酸により脱染色した。
脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた。
１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅｍ＊ｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２
７　：　６８０　〜６８５ＯＰＡＧＥ法もまた、使用さ
れた。ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒｉｌ，など．，
　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２旦：　１４３７〜１
４３９の銀染色法又はクーマシーブルー染色法のいずれ
かによって検出した。
タンパク　のヨウソ Ｂａｒｒｉｄｇｅ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ
．　（１９７８）５０　：　５４〜６５によって記載さ
れているクロラミンーＴ法を用いて１２５■により、又
はＢｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　（１９７３）ユ３３　：　
５２９〜５３９に記載されている”’Ｉ−Ｂｏｌｔｏｎ
及びｆｆｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベルし
た。
ＥＢＺＤに・する ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅ−
Ｄａｗｌｅｙラットを、完全フロイントアジュバント中
に乳化された、合計２０Ｈの精製タンパク質により感作
した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントアジュバ
ント中タンパク質１０ｘを用いて２週間隔で与えた。各
接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記に概説さ
れているラジオイムノアフセイ法を用いて抗体について
スクリーンした．そのアッセイのために適切な抗血清は
、一般的に、２〜３回のみの追加免疫接種の後、得られ
た。
ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニュージーランドホワイ
トウサギ）における精製されたウシの脳のＥＢＺＤに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、４０ｌｔｇ及び２０Ｊ１ｇの
タンパク質を、それぞれ、１次接種及び追加免疫注射の
ために使用した。
ラジオイムノアッセイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　ＸＩＯ”ｃｐｍ
／ｎの比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し、そ
して４℃でＴＮＥＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈ（
Ｆ！、ｐＨ−７．４　；　５＋＋＋ＭのＥＤＴＡ　；　
　１５０ｍＭのＮａＣｌ　；　０．０５％のＮＰ−４０
　；　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とボ
リプロビレン管（３−の容Ｎ）に添加された：精製され
た脳因子の標準又はサンプル１０ｊｌ１、ラット抗血清
（ＴＮＥＮｉｌ衝液中においてｌ：３０に希釈された）
ｌＯＩｔｌ及び目５Ｉによりラベルされたウシの脳因子
（〜５　×１０７ｃｐｍ）　３０ｔｒｌ．室温で４５分
間のインキュベーションの後、熱失活されホルマリンに
より固定されたＳ．アウレアス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の
１０％懸濁液５０ｍを添加し、そしてその混合物をさら
に３０分間放置した。次に、免疫吸着剤をｎ−プチルフ
タレート油のクッションを通して遠心分離し（１５．０
００ｘ　ｇ　，　　１分）、モしテｓ．アウレアスヘレ
ット中の放射能活性の量を、ｒ一分光測定によって測定
した。抗血清の不在において結合した放射能は非特異的
であると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正さ
れた。
ＲｒＡ反応性物質についての検定されるべきｉｔｌＩ織
は次のようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組
織（およそ１ｇの正味重！）を、１０ｍの冷ホモジナイ
ゼーシラン緩衝液（２０−のＴｒｉｓ−Ｈ（／！，ｐＨ
＝　７，　４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍＭ
のＮａＣｌ　；　０．　２％のＮＰ４０　；　０．２　
ｍｌｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド；一当り
１００カリクレイン阻害剤ユニットのＴｒａｓｙｌｏｌ
）に添加し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザ
ーにより３回、１５秒間の破壊により均質化した。その
抽出物を取り出し、そして１００．０００×ｇで３０分
間の遠心分離により残骸を除去した。
次に、この上清液を、５分間９５℃へ加熱し、そして低
速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連の
１：３の希釈の抽出物を、Ｔ　Ｎ　Ｂ　Ｎ　緩衝液によ
り調製し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標
準曲線は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性
物質の量を、直接的な比較により算定した。
ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドブロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃを含むＯ．　ｌ　ＭのＴｒｉｓ−アセテー｝　（
ｐＨ＝８．　０　）　４０ｔｔｇにおいて２４℃で１６
時間消化した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準でｌ
Ｏ：１であった。ベプチドフラグメントを、水中０．０
５％ＴＦＡから０．０４５％ＴＦＡを含む６０％アセト
二トリルまでの直線２時間グラジエントを用いてμ−Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ−Ｃ，ｓカラム（Ｗａｔｅｒｓ）でのｒ
ｐＨＰＬｃによって分離した。ペプチドをモニターし、
モして２１４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、集
め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した。
Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した。ＢＺＤ結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１１，５００
）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピー
クとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムＴＳＫ
−２５０からの活性フラクション２４のクロマトグラフ
ィーの結果、その活性は３１〜３２％のアセトニトリル
の間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プールさ
れたフラクション３６及び３７の再クロマトグラフィー
は、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたらし
た。その精製は第１表に要約される。
第１表：ウシの脳のＥＢＺＤの精製 粗原料 ７８５ｂ １，０１０’ １．２９ １００ ＨＰＬＣ ｃ，．　　　０．６８ｅ８５０　　　　　　　１，２５
０８４．２ ａ：上記のアッセイ条件下で粗シナプトソーム膜への３
Ｈ−ジアゼパムの結合に対する４０％競争のために必要
とする材料。
ｂ：プールされた材料の直接計量による。
ｃ：２８０ｍμでの吸光度から計算された。
ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイす
ることは不可能であった。この数は、フラクション２４
及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す。
８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で達成した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した。しかしながら、最大の阻害度は、８−の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎないこ
とが見出された．Ｋｉ値は、３Ｈ−ジアゼバム又は３Ｈ
　−　ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして使
用されても、約５一であることが見出された。
精製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示された。ベプチドの分子量は、１
０．５Ｋドルトンであると算定された。
Ｌａｅａ＋ａ＋１ｉのＳＯＳ−ＰＡＧＥ法による精製さ
れた蛋白質（ウシ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ
〜７Ｋドルトンを有する単一のバンドを与えた。精製さ
れたタンパク質は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡ
と共に、水中４０％アセトニトリルを用いるＢｉｏ−Ｓ
ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０ＣＩ　Ｘ　７，　５
　ｙｎｓの内部直径）から単一の対称ピークとして出現
した。その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラフ
ィー法によって約１１．５Ｋドルトンであることが計算
された。この精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、類似す
る物理化学的特性及び生物学的特性を示した。
シナブトソーム膜への、１５１−ラベルされた（クロラ
逅ンーＴ法又はＢｏｌｔｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ法のいず
れかによる）精製クンバク質の特異的結合は観察されな
かった。
Ｕ迎坐盆奄 ＲＩＡ系を展開して＆ｌＩｍ抽出物、体液および組織培
養細胞中のＥＢＺＤを定量した。種々のペプチドによる
、ウシＥＢＺＤに対するラット抗血清に結合したウシ脳
からの１２５１−ラベル化ＥＢＺＤの除去を測定した。
ウシおよびヒトのＥＢＺＤは、ウシＥＢＺＤ蛋白質に対
して調製されたラット抗血清に結合する＋！ＳＩラベル
化ウシＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示した。
このことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基
が存在していることを示している。
エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によって得られモ
して逆相ＨＰＬＣによって精製されたウシＥＢＺＤのベ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった。従って、ＥＢＺＤの免疫原決定基はエンド
ブロティナーゼＬｙｓ−Ｃによって生じた単一ベブチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々のＭｗＸ中のＥＢＺＤの分布を下記第２表に示す
。
第２表二種々のラビット組織中のＥＢＺＤの分布紐　織
　　　　　　　Ｋ当量／Ｍ！ａｌｇ（湿重）脳　　　　
　　　　　　　　　　　　３．８０腎臓　　　　　３．
４２ 唾液腺　　　　　　　　　　　１．７６肝臓　　　　　
ｌ．５２ 胃　　　　　　　　　　　　１．２７ 結腸　　　　　１．ｏ５ 牌臓　　　　　ｏ．９７ 肺　　　　　　　　　　　　　　　０．８４心臓　　　
　　０．７３ 胸！　　　　　　０．６７ 膵臓　　　　　０．５０ 大腿筋　　　　　　　　　　　０．３７甲状腺（Ｔｈｙ
ｒｏｉｄ）　　　　　　　０．０６血清または血漿　　
　　　　　Ｎ．Ｄ．Ｎ．Ｄ．＝検出できず。
ＲＩＡ法の詳細は前述してある。
血清または血漿以外の試験組織はすべて、ｌ？ＩＡによ
って検出されるＨＢＺＤを含有していた。ウシの脳、肺
臓および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　．　
７．　６および６．８■当量を含有していたが、ヒトの
脳は組織１ｇ（湿重）当り１５．７Ｉｔｇ当量を含有し
ていることが見い出された。ラビット脳中のＥＢＺＤの
濃度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはる
かに低いものであることが見い出された。ＥＢＺＤはモ
ンキーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク譬に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（ＨＥＰ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ　
１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）および
膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ、
それぞれ濃縮細胞（〜ｉｏ’細胞）ｌｄ当り９．ｌ．８
．９　．　８．６　．０．３２および０．２６趨当量の
ＥＢＺＤを含有していた，ＥＢＺＤＩＩ！ｇは約６×Ｉ
Ｏ１″分子を含んでいる。従って、ＭＣＦ　７，　ＨＥ
Ｐ　２およびＨＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜５×１
０７分子のＥＢＺＤを含有している。
従って、ＥＢＺＤは哺乳動物のｍ織中に広く分布してお
り、そしてＤＢＩとは異り脳に特有のべブチドではない
。広い組織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的なも
のというよりむしろ一般的なものであろうということを
示唆している。
ト脳の種々の領域におけるＥＢＺ［ｌの分布ｎ当量／，
Ｉ織１ｇ（湿重） ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ １７．４ ２６．７ ■４．３ １．７ １６．２ 第３表：ラビッ 組織 大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 ＥＢＺＤ濃度は前述の如くにＲＩＡ によって測定した。
第３表は、ＲＩＡによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢＺＤの分布を要約している。
脳の領域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、Ｅ
ＢＺＤｄ度の実質的な局所的変化があることが示された
。試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡
叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体におい
て見い出された。
ＥＢＺＤの　”（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ）　：体重２．３
〜２．　６　ｋｇの雄性ニュージーランドラビットをこ
の実験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等
、ニューロファーマコル．（ハ肛並軸Ｌｍａｃｏｌ．）
　　（１９７２年）１１：１〜１６真に記載されたの直
接穿刺法に若干の変更を施すことによってｉｃｖ注射を
行なった。動物は、頭蓋に小さな穴（直径０．　８　ｒ
ｍａ　）を開ける（ベントバルビタール麻酔下）ことに
よって実験の２日前に準備した。この穴は正中線に対し
て１．　Ｏ　ｗｎ側方およびブレグマに対して１．０ｍ
ｍ口吻側に位置している。実験の日、注射の直前に、皮
膚の傷上に局所麻酔薬を噴霧する；＃２６の針を頭蓋の
表面から１２ｍｍの深さまで鉛直に挿入する。正確な位
置決めは大脳脊髄液の出現によって指示される。針を引
き抜き、針に薬剤溶液を充填して、この針を同じ深さま
で再度挿入する。
注射は、常に、注射器微量ビュレットを用いて１０μｌ
の容量で３０〜６０秒間にわたって実施する。対照の動
物には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌
した等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基とし
て表現される。
動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ
　ｔａｎｃｈ　ｔｏｎ）内に位置させる。結腸温度は、
リーズーノースラップ・スピードマックス・レコーダー
（Ｌｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｓｐｅｅｄｏｍａｘ
　ｒｅｃｏｒｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線
が引かれているＹＳＩスキャンニング・テレサーモメー
ター（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒｍｏ
ｍｅｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタプローブ
によって測定される。実験は２２．０±１．０゜Ｃの常
温室内で実施する。
興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る。．２５■／ｋｇのベントバルビタールを静脈内に投
与されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は
自らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けに
なっていることができる。
ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の常同的（ｓ　ｔｅｒｅｏ　ｔｙ
ｐ　ｉｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いた
りすることを注意深く観察した。
ｂ　ＥＢＺＤ 則屋 注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する。
呼吸は９０分から２０４分まで増加した。
運動活性の増大。機能冗進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）なし。痛覚脱失なし． 則虹屋 注射の１０分後、呼吸は９８分から６５分まで減少。強
迫的咀噌および軽度の興奮。興奮は短時間続いた。機能
冗進なし。痛覚脱失なし。
２００　ｎ 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８分
から５０分まで）．注射の１０分後、立直り反射欠如。
動物は深い麻酔状態にはなかった。
ｂＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。
８日齢のヒナ烏（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を単個
細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法により
、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔くルダル（
Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（Ｄｅｌｌａａｎ）、ジ
ェイ．セル．フィズ．（ム蝕旦ｄｈｈ）（１９８３年）
量亙３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特性を基準にす
れば、この調製物は戒体の啼乳動物のプルキンエ線維、
主たる心臓の伝導系に似ている〔泉ルダルおよびデハー
ン、ディ・イニシェイｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔｂｅａ
ｔ）デニス・ノーブル（Ｄｅｎｉｓ　Ｎｏｂｌｅ）＆ｌ
ｉｉｌ、１９７５年、オンクスフォート・ユニバーシテ
ィ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｐｒｅｓｓ）　、ロンドン、ｐ．７〕。これらの集塊は
２４℃で平衡化しｂＥＢＺＤを用いて２４時間処理した
。２つの個別の実験において、１００／／ｌｒ／ｄの量
で処理した集塊の収縮速度は対照と有意に相違した。こ
れを以下に示す。
実験１： （測定された収縮速度（秒）／５回の収縮間間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差、ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　１４
　　　１１４８　　　　１．４４　　　　０．３８処理
　１４　　７．９４　　２．０４　　０．５５実験２： Ｎ　　平　均　　標準偏差　ＳＨ　ＭＥＡＮ未処理　　
１３　　　２４．５９　　　　３．１８　　　　０．８
８処理　１２　　１９．３３　　２，３７　　０．６８
各実験において、スチューデントＴテストによれば、処
理された母集団は有意に未処理の母集団と異なっている
．これら２つの母集団が同じものであるという確率はｏ
．ｏｏｏｔより小さイ（ｐ　−　０．００００）．なｌ
む先Ｌ ウシおよびヒトのＥＢＺＤのアミノ酸配列を、（ａ）エ
ンドブロティナーゼリシンＣ、（ｂ）キモトリブシン、
（Ｃ）スタフィ口コツカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　
Ｉｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８および（ｄ）
臭化シアンを用いたｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの消化
により得られたペプチドのマイクロシークエンス分析に
よって決定した。ベプチドフラグメントは揮発性溶剤を
用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した。アミノ末端をブ
ロックしたべブチドを１２ＮＨＣＮ中で周囲温度におい
て１６時間インキユベーションした。次いで、試料を凍
結乾燥によって乾燥させた。ペブチドを、４７０Ａ型気
相プロテインシークエンサー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕ
ｅｎｃｅｒ）　［アプライド・バイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ．））に
よる自動反復エドマン分解に付した。ｒｐＨＰＬＣによ
ってフエニルチオヒダントインアミノ酸を分析した。
これとは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはベプチドを、６ＮＩＩＣ／！を用いて１０５゜Ｃで
１６〜２０時間減圧において加水分解した。得られたア
ξノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ
（Ｐｉｃｏ）ＴＡＧシステム〔ウォーターズ・アソシエ
ーツ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）　）によ
って分析した。フェニルチオ力ルバモイルアミノ酸を２
５４ｎＭの吸光度によって検出した。
■別生北ヱ構這 ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤノ７’ミノ酸配置を、６Ｎ
ｌｌＣｆｆｉで加水分解した後、アミノ酸自動分析装置
を用いて決定した。これらの蛋白質には、システィンを
除くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これらの
データから計算された最小分子量は約９．９００であり
、ＳＯＳ−ＰＡＧＥによって確認された値と一致する。
Ｎ一末端アミノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を、公
表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示す。
ＤＢＩ ＭＫＴＹＶＥＫＶＥＨＬ ８５ ｒ−ＤＢＩ　　　　　　　　　ＫＫＫＹ．．ｂＥＢＺＤ
配列と異なるｈＥＢＺＤア〔ノ酸配列中の残基には下線
を引いた。
ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＥＢＺＤのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるたった１個の塩基変化
と一致する。これらの結果は、ヒトおよびウシのＥＢＺ
Ｄが異なる種の間で構造的に高度に保存されていること
を立証している。
ウシの組織から単離したポリ（Ａ”　）ＲＮＡをｃＤＮ
Ａ合或用の鋳型として使用した。第１鎖のｃＤＮＡ合或
はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）
逆転写酵素とを使用して実施した。第２鎖は大腸菌ＲＮ
ａｓｅ　Ｉｔ、ＤＮ／ｌボリメラーゼＩおよびＤＮＡリ
ガーゼ（ＮＡＤ”　）を使用して合威した。ＳＩヌクレ
アーゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの
大断片によるフィルイン反応によって２本ｔｉｃＤＮ＾
を平滑末端化した。ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼを使用して、デオキシグアニン残基
約１５個をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に加えた。次に
、このＧの尾部をもつｃＤＮＡをＡ−５０カラム上でサ
イズ分別して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと導入され
なかったデオキシグアニン残基とを除去した。次に、プ
ールしたｃＤＮＡの濃縮を、ＥｃｏＲＩで消化したλｇ
ｔ．１０　　０ＮＡの存在下におけるエタノール沈殿に
よって実施した。
ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ．　ｔｏに対するＧの尾部
をもつｃＤＮＡの連結反応は、３′末端にデオキシシト
シンｌ２個を含みそして５′末端にＥｃｏＲ　Ｉ開裂Ｄ
ＮＡの１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む
１本鎖オリゴヌクレオチドリン力一を使用して新規の方
法によって実施した。連結したＤＮＡのｉｎ　　ｖｉｔ
ｒｏパッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株
Ｃ６００　ｒｋ−　ｍｋ″″Ｈｆｌ中へ導入した。これ
は、組換え（野生型でない）フェージに感染すると細胞
溶菌される。その方法により、放射性標識合或オリ゛ゴ
ヌクレオチド〔１７ヌクレオチド長：その配列はウシＥ
ＢＺＤ中に見出される６個の連続するアミノ酸（ＫＷＤ
ＡＷＮ）によって推定した）を使用し、プラークからの
ＤＮＡを二重にスクリーニングした。コドンが不明なの
で、オリゴヌクレオチドの３２種の縮重ブールとしてＭ
ＳＩを合成した。ＭＳＩによるスクリーニングにより陽
性のブラークを得これをプラーク精製し、そして１．８
ｋｂの挿入部を含有することが示された。この挿入部を
プラスξＦｐＥＭＢＬ中・にサプクローン化した。これ
をｐＭＰ１と称する。挿入部を制限地図化した後、続い
て適当な数片をＭ１３株中に更にサブクローン化し、そ
してＳａｎｇｅｒ一Ｃｏｕｌｓｅｒのジデオキシ法によ
って配列を決めた。
ｐＭＰＩ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほとん
ど同じ挿入部の５′末端から約３００塩基対のＤＮＡ配
列を含んでいた。更に、ｐＭＰ１のヌクレオチド配列に
より、配列が決定されているウシＥＢＺＤに関して決定
したアａノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）アミ
ノ酸配列が予想された。これらの２１！！の蛋白質が密
接に関連していることはアミノ酸配列の顕著な保存性に
よって示唆されている。配列が決まっているＥＢＺロか
らアミノ酸３個を除去することにより、残りのアミノ酸
をｐＭＰ１の配列と関連させることができ、この結果ア
ごノ酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存的
置換を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。
ｐＭＰ１の発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している。最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をｐ
ＭＰ１がコードしている点である．なぜなら、リーディ
ングフレームが、その蛋白質の公知の末端アミノ酸の上
流および下流の両方に延びているからである。
幽別遺伝王坐発遇 ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮＡは０．６ｋｂｐの挿入部であり、これをｐ
ＥＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得た。配列決
定を行なったところ、ｐＭＰ１と相同のコード配列が得
られた。ウシのエンドゼビン（ｂＥＢＺＤ）をコードす
るＤＮＡ断片を、Ｄｒａ　Ｉ消化およびＮａｅ　Ｉ消化
を組合せることにより、ｃＤＮＡプラスミド（ＥＢＺＤ
）から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精
製し、発現ベクター（ｐＳＭ　１　．２）中にＳｔｕ　
１部位に挿入した。ｐｓＭ１．２発現ベクターの形或は
、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺
伝子（Ｂｏｌｉｖａｒ．等、Ｇｅｎｅ（１９７７）　２
　：　９５）　、ｐＴＲ２１３のｌａｃプロモーターお
よびリボソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｐｒｏ
ｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　（１
９７９）四：　７６０−７６４　）をｐＬＧ３００のｉ
　−Ｚ融合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎ　ｔｅ等、Ｃｅｌｌ０
９８０）２０：　５４３−５５３　）にスブライシング
することによって行なった。得られたブラスミドはクロ
ーニング部位例えばＳｔｕ　Ｉ部位に挿入された外来遺
伝子を融合蛋白質として発現することができる。この構
造において、ＥＢＺＤに関する全コード配列は、ｃｒｏ
蛋白質の最初の２個のアごノ酸をコードするＤＮＡに位
相を合わせて融合された．ブラスミドｐｓＢ１０８は挿
入部を正しい配向で含んでおり、プラスξドρＳＢ１０
３は挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラスミ
ドｐｓＢ１２５は挿入部を含んでいない。各種のプラス
ミドを含む大腸菌ＨＢＩＯＩクローンを対数期まで増殖
させ、そして振とうしなから３７゜Ｃで２時間、最終濃
度ＩＩＩＩＭまでＩＰＴＧを加えることによって誘導し
た。この細胞を遠心によって収集し、リゾヂーム洗浄剤
処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清（細胞
質ゾル）とベレット（細胞質内封人体）とに分けて、免
疫化学的技術によって分析することができる。
発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐｓＢ１０８）を含む大腸菌クローンだけが高
いレベルのＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大部分の
ｃｒｏ−ＥＢＺＤは上清分画（細胞質ゾル）中に見出さ
れた。ベレット分画（細胞質封入体）中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐｓ
Ｂ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃｒｏ−
ＥＢＺＤは検出されなかった。Ｉ　ＰＴＧによる誘導後
に、細胞培養物１乏当り０．　５■のｃｒｏ−ＥＢＺＤ
が産生されたものと推定される。
Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０分取用カラム（６０Ｘ
　２．　１　ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフィー（Ｉ
ＩＰＬｃ）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｓ）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　０．
　１％を含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画
を８■／一の濃度で溶解した。カラムを０．　１％ＴＦ
八を含む４０％アセトニトリルで平衡化した。アリコー
ト２ＩＩＩ１（タンパク質１６■）を注入し、最終濃度
０．１％のＴＦＡを含む水中の４０％アセトニトリル移
動相によって均一に展開を実施した。ＢＰの位置（分画
２３）が分かった後で、前記の操作を二〜三百回行なっ
た。分画を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッセ
イであった。前記の浸透クロマトグラフィーから脳因子
（ＣＩＡ）の見掛けの分子量を計算したところ、約１８
ｋＤａｌであった。
ＴＳＫ−２５０　　　の　　７　　　クロマトグーフィ
−１５試行からのＴＳＫ−２５０画分２３をプールした
（容量７５−）。プールされた材料を水中０．１，％Ｔ
ＦＡにより２倍に希釈した。この混合物を、水中０．１
％ＴＦＡによりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダバッ
ク−ＣＩｌ１カラム（７８ｍｍ内径Ｘ　３００ｍｍ）に
室温にて均一に注入した。一次溶剤０．１％ＴＦＡと二
次溶剤０．１％ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの間で直
線グラジエントを用いた。グラジエント条件は２０分間
に０〜２８％、１４０分間に２８〜４２％、ｌＯ分間に
４２〜５２％、そして次に６分間に５２〜１００％であ
った．すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであった。４Ｉ
ｄの画分を集めた。各両分のアリコートを５０ＮのＢＳ
Ａと共に乾燥し、そしてＣＩＡについてアッセイした。
ＣＩＡの２個のピークを貯蔵した。第１の活性（α）は
３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
１０試行からの活性画分３０及び３ｌをプールし、そし
て０．１％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμ−ボンダパックカラム（７８　Ｘ　３００鴫
）に均一に適用し、そしてカラムを０．　１％ＴＦＡで
洗浄しそして平衡化した。流速はｌｄ／分であり、そし
てチャートスピードは０．ＩＣ！ｌ／分であった。やは
り、第１溶剤０．−ｌ％ＴＰＡと第２溶剤０．　１％Ｔ
ＦＡの濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジ
エントを用いた。グラジエント条件は、４０分間にＯ〜
３０％、２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に
３８〜１００％であった。最初の１２画分は６一であり
、そして次に４ＩＩｉ画分を集めた．アリコートをＣＩ
Ａについてアンセイした。活性は３２〜３３．５％の間
のアセトニトリル濃度において溶出した。
両分３０〜３２をプールした。１２ｄの０．　１％ＴＦ
Ａをプールされた両分に加えた．混合物（２４蔵を、Ｏ
．ｌ％ＴＦＡで平衡化された分析用μ−ボンダパックＣ
Ｉｌｌカラム（　３．　９　Ｘ　３００ｍｍ）上に均一
に適用した。流速及びチャートスピードはそれぞれ０．
　４　１ｎ１／分及び０．１ｃｍ／分であった。やはり
、第１溶剤０．　１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦ＾
の濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジエント
を用いた。
グラジエント条件は、２５分間に０〜３０％、２００分
間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％で
あった。２ｄの両分を集めた。画分のアリコートをＧ［
Ａについてアッセイした。活性は分析用Ｃｌｌｌカラム
から、約３４％のア七トニトリル濃度において溶出した
。
画分２９−３１をプールし、そして０．１％ＴＦＡで２
倍に希釈し、そしてμ−ボンダパックＣｌｌｌカラム（
３．９Ｘ　３００閣）に適用した。第１溶剤０．１％Ｔ
ＦＡと第２溶剤０．　１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−プ
ロバノールとの間の直線グラジエントを用いた。グラジ
エント条件は、４０分間にＯ〜１８％、２２５分間に１
８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であった。
流速は０．４ｄ／分であり、そしてチャートスピードは
０．１ｃｍ／分に設定された。画分を集め、そしてアリ
コートをＣＩＡについてアッセイした。活性は約２３％
のｎ−プロパノール濃度において溶出した．両分２８及
び２９をプールし、そして０．　１％ＴＦＡにより５倍
希釈し、そして０．１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−プロ
パノールを第２溶剤として用いてμ一ボンダパックＣｌ
ｆｉ力ラム（３１９Ｘ　３００ｍｍ）上で再クロマトグ
ラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジエント条
件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初の８個の
両分は６ｄであり、そして１．　６　ｍの両分を集めた
。各両分のアリコートをＣＩＡについてアッセイした。
ほとんどの活性が画分１５〜１７に現われた。両分１５
〜１７は約ｌ５Ｉ！Ｉｌの蛋白質及び約２３０　Ｘ　１
０’ユニットのＣＩＡを含有していた。
この画分をＨＰＬＣ　　Ｃ＋ａ’画分とした。最終精製
画分は、ＣＣＬ６４を試験細胞として用いた蛋白質μｇ
当り１５．３３Ｘ１０３ユニットの比活性を有していた
。
次の第４表は結果を要約する。
粗製物　　３，６８０　　　１．５５１ＴＳＫ−２５０
　　　　　６３０　　　　２，７６０ＨＰＬＣ−ＣＩ８
５　０．０１５　　　　　２３００．４２１ ４．３８ １５，３３３．００ １００ １８１ １４．８ ０→ ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジ
ンの取り込みを５０％阻害するために必要な材料アッセ
イはＮｕｎｃ９６ウエルプレート（Ｋａｍｓ　ｔｒｕｐ
ｖｅｊ９０，　ＤＫ−４，０００．　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ
　，デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細胞（Ａ５４９
）又はミンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細胞として
使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びペニシリ
ン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（０．５７■／ｄず
つ）及びグルタミンを伴うドルベコ改変イーグル培地（
ＤＭＥＭ）５０ｐ！中３．５×１０７ｌｌ胞を、端のウ
エル以外のすべてのウエルに導入した。端のウエルには
５０ｐ１のＰＢＳを導入し、そしてプレートを３７℃に
てインキユベートした。
試験サンプルを、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４
日後、５０Ｉｌ！の試験サンプルを各試験ウエルに加え
、他方対照ウエルには５０μｌの培地のみを加えた。プ
レートを３７゜Ｃにて３日間インキユベートした。４日
目に　１　２５１−ヨード−２′−デオキシウリジンの
溶液（　（４Ｃｉ／ｌａｇ　　０．　５ｍＣｉ　／ｔａ
ｌｌ　（０．　１　ｔｄアイソトープ／戚、１０％ＦＣ
Ｓ　，　Ｐ／Ｓ、グルタミンを含有するＤＭＥＭ中）１
００ｍを各ウエルに加え、モしてフ゜レートを３７゜Ｃ
にてインキユベートした。５日目に、培地をウエルから
吸引し、２００ＩＪ１のＰＢＳで１回洗浄した。次に、
２００ｍのメタノールを各ウエルに加え、プレートを１
０分間インキユベートし、そしてメタノールを吸引によ
り除去した。水酸化ナトリウム（２００　ｌ１！、ＬＭ
）を各ウエルに加え、プレートを３０分間３７゜Ｃにて
インキユベートし、そして次に水酸化ナトリウムをタイ
ターテック（Ｔｉ　ｔｅｒ−ｔｅｃ）プラグ（フロー・
ラプス）により取り出した。
プラグを１２　Ｘ　７５ｍｍのプラスチックチューブに
移し、そして放射能を定量測定するためにγ一カウンタ
ーで計数した。
ソフトアガー・コロニー阻　アッセイ １０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中０．　５％寒天（
アガーノーブル；ディフコラｌラトリーズ、デトロイト
、ξシガン）の２．　０　ｄの基層を６０１ＩＩＩＩ１
のコスター組織培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混
合物、１．　Ｏ　ＸＩＯ’　Ａ５４９　Ａｇ３　（ソフ
トアガー増殖クローン３）細胞及び２連の種々の濃度の
試験されるべきサンプルを含有する０．　３％寒天を加
えた。
プレートを空気中５％ＣＯ．の加湿雰囲気中で３７℃に
てインキユベートし、そして７日後に適切な補充物を含
有する０．　３％寒天２．０Ｉｄの添加により再供給し
た。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして低
倍率の無作為の視野５個当り６細胞？り多いコロニーの
数を７日及びｌ４日後に計数した。
コロニーノ　ニア・・セイ このアッセイは６ウエルーファルコンプレート（　９．
　６　ｃｎの面積／ウエル）中で行った。Ａ５４９細胞
（２００）を各ウエル中、１０％ＦＣＳ　ＳＰ／Ｓ及び
グルタミンを含むｌ一のＤＭＥＭ中にプレートした。プ
レートした直後に、１．０一の培地中種々の濃度の試験
材料を２連で加えた。対照ウエルには試験材料をなんら
含まない１．　０　ｄの培地のみを加えた。プレート空
気中５％ＣＯ■の加湿雰囲気中３７゜Ｃにて１０日間イ
ンキユベートし、５０％メタノール中０．２％メチレン
ブル−１．　０　１ｄを各ウエルに添加し、そして２０
分間放置し、染料を除去し、そして各ウエルを０．　１
　ｄの水で２回洗浄し、そして空気乾燥した。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
生遠望剪丘置 ＤＮＡ合戒の５０％阻害が、それぞれ９８ｎ／ｔｔｄｌ
、２１Ｊｒｇ／ＩＩＩｉ及び９５ｎｇ／ｒ！Ｉ１の粗画
分、ＴＳＫ−２５０画分及び最終純蛋白質において観察
された。従って、Ａ５４９ヒト肺癌細胞における５０％
ＤＮＡ合或阻害が純蛋白質の約９ｎＭ濃度において見ら
れた。
ｂＢＦはまた、寒天（Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞Ａ５４
９の足場独・立性増殖を阻害した。ソフトアガー中での
コロニー形或の５０％減少が約７６ｎｇ／一のｂＢＦに
おいて見られた。４５４９ｔａ胞のコロニー形戒率はこ
の蛋白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／ｍｌ（１
．２４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形或率は
対照のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約８０ｎｇ
／ｍのｂＢＦの存在下では八５４９細胞のコロニーは見
られなかった。
八５４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非存在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、ｂＢＦは量依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、ＤＮＡへの１２５１−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
ｂＢＦはＡ５４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５　Ａ
ｇ）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−　７　）の種々のクロ
ーンの増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（ＷＩ−２
６）の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、
ネズミ線維芽細胞セルライン３Ｔ３−Ａ３１に対して増
殖刺激的である。
ヒトＴ一細胞機能（Ｚａｒｌｔｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　　４６８−４
７６　）に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘパリン処理血
液から、フィコールーハイバク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（ＨＳ）が補充されたＲ　ＰＭ１　１６４０の培
地（ギブコ、グランドアイル、ＮＹ）中にｌ×１０６Ｐ
ＢＬ／ｄの濃度で懸濁した。次に、Ｏ．　ｌ　Ｉｄのこ
れらのＰＢＬ　（応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃ
ｅｌｌ）と称する）を９６−ウエルプレートの２連の丸
底ウエルのそれぞれに加え、そして次に０．０５ｄの培
地のみ又？２×１０７個のＸ一線照射された（２５００
Ｒａｄ）同種異系細胞〔“刺激細胞”（ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と称する〕を含有する０．０５ｄ
の培地、及び０．０５ｄの培地のみ又は種々の濃度の脳
因子（０．９〜７５ユニット脳因子／ウエルをもたらす
）を含有する培地を加えた。細胞を５％ＣＯ■インキュ
ベーター中で３７℃にてインキユベートし、そして２日
目及び５日目に０．０５−の培地を各ウエルから取り出
し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有する培地０．
０５ＩＩｒｌを添加した。
増殖応答を決定するため、６日目に各群からウエルの内
容物をプールし、モしてｏ．　ｉ　Ｉｄを９６−ウエル
プレートの４連のウエルのそれぞれに加え、次に０．０
２５ｄの容量中゛μＣｉの″ＩＩ−チミジン（″Ｈ−Ｔ
ｄＲ　，ニューイングランドニュークレア、ボストン、
ＭＡ）を加えた。６時間後、ウエルの内容物を多ウエル
収得器を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し
、これらのストリップをシンチレーシゴン液体を含有す
るバイアルに移し、そして３Ｈ−ＴｄＲ取り込みをβ一
カウンター中での計数により決定した。
細胞変性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生戒に対する効果を決
定するため、６日目にウエノレからフ゜−ノレされた残
りのリンパ球を９６−ウエルプレートの３連の球底ウエ
ルに加え（０．１５ｍｆ／ウエル）、そして０．１５−
の４倍逐次希釈物も３連のウエルのそれぞれに加えた。
５１Ｃｒラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）
を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者から生じた
リンポプラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞１．５×
１０７を５００ｐｃｉ”Ｃｒ（Ｎａ．ＣｒＯ．，　ニュ
ーイングランド二二一クレア、ボストン、ＭＡ）により
３７゜Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細胞を１５％熱
不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地で３回
洗浄し、そしてこの培地に６×１０７細胞／　ｒｎｌで
再懸濁した。次に、０．０５ｄの標的細胞を、エフェク
ター細胞を収容する各ウエルに、及び培地のみ〔自然（
ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）　”Ｃｒ放出を決定するため
〕又は洗剤のみ（ＳＩＣｒ放出を決定するため）を収容
するウエルに加え、そしてプレートを３７”Ｃにて６時
間インキユベートした。次に、上清の一定のアリコート
を各ウエルから取り出し、そしてγカウンター中で計数
するためにチューブに移した。特異的ＳＩＣ，放出％を
次のようにして決定した。
次の第５表が結果を示す。
第５表、 ヒトＴ リンパ球のアロ抗原 ２０７ １０３．６９０ ７０，１４０ ６４．５０７ ７８，２８７ ８７．０９５ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体Ｖのヘバリン処理
血液から得られ、そして個体ＣからのＸ一線照射された
（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ）により刺
激され、そして６日後、３Ｈ−チミジン（’Ｈ　ＴｄＲ
）の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
ＣＰＭ＝カウント／分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬのＴ一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ−リンパ球
の生或に対して観察された。
同じ量の５　１　（：　ｒ放出を生じさせる未処理のエ
フエクター細胞の数として、７５ユニットの脳因子と共
にインキユベートされた約１６倍多くのエフェクター細
胞が４２％のＳＩＣ，放出を生じさせるために必要であ
る。
上記の結果から、この発明の化合物はインビト口及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリベブチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形成されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セプターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼパムリセブターもしくはＧＡＢＡ一作働
性リセブターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫゛瘍細胞を
除去するために他の添加物と組合わせて使用することが
できる。脳因子化合物はまた、Ｔ一細胞の増殖の調節の
ためにも使用することができる。ＥＢＺＤ化合物はＥＢ
ＺＤリセブタ一の活性を調節するためにも使用すること
ができる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、活性ポリペプチド成分を含有し該活性ポリペプチド
    成分に関して実質的に均一なポリペプチド組成物であっ
    て、該ポリペプチドは、水性０．１Ｍトリフルオロ酢酸
    −ｎ−プロパノールでの２０％〜２６％ｎ−プロパノー
    ル画分で溶出すること、約８〜１８ｋＤａｌであること
    、腫瘍細胞又はＴ細胞の成長を抑制すること、及び哺乳
    動物の脳中に見いだされる、ことを特徴とする、上記の
    ポリペプチド組成物又はその生理学的に活性なフラグメ
    ント。 ２、少なくとも約１．５×１０＾７ユニット／ｍｇの細
    胞調節活性をもつ、特許請求の範囲第１項記載のポリペ
    プチド組成物。 ３、ヒト又はウシの脳組織に由来する、特許請求の範囲
    第１項記載のポリペプチド組成物。 ４、下記の配列の範囲内に入る少なくとも６個のアミノ
    酸をもつＮ−末端近位アミノ酸配列をもつ、特許請求の
    範囲第１項記載のポリペプチド組成物： 【遺伝子配列があります】 上記の配列においてＸはいずれかのアミノ酸である。 ５、次のアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第４項に
    記載のポリペプチド組成物： 【遺伝子配列があります】 上記の配列においてＸはいずれかのアミノ酸である。
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