JPH03193800A - 脳由来の膜蛋白質 - Google Patents

脳由来の膜蛋白質

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JPH03193800A
JPH03193800A JP2269727A JP26972790A JPH03193800A JP H03193800 A JPH03193800 A JP H03193800A JP 2269727 A JP2269727 A JP 2269727A JP 26972790 A JP26972790 A JP 26972790A JP H03193800 A JPH03193800 A JP H03193800A
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amino acid
brain
cells
ebzd
amino acids
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JP2269727A
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Mohammed Shoyab
ショヤブ，モハメッド
Hans Marquardt
マルカート，ハンス
George J Todaro
トダロ，ジョージ　ジェイ
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Oncogen LP
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
患（腫瘍形成を含む）の基本的原因であると思われる。
増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（例え
ば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興味が
持たれており、更にまた特に有糸分裂が癌に影響を及ぼ
すかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を理解
することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はりガント又はレセプ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に
用いられているベンゾジアゼピン（ＢＺＤ）は、Ｔ−ア
ミノ酪酸（ＧＡＢ＾）で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。
ＢＺＤによるＧＡＢＡ−作動性伝達の調節における第一
段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ飽
和できる結合部位に対する結合であると思われ、この場
合にその結合部位は′１超分子複合体”（ｓｕｐｅｒＩ
ｌｏｌｅｃｕＩａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）の成分であると
考えられる。この系を理解すること、及びその系を調節
又は制御することができることの必要性は、天然リガン
ド及びそれが機能する態様を知ることに依存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる。
〔従来の技術〕
Ｂｅａ　１等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏ　ｈ　ｓ、（１９７９）　３　：９３−９６は、増殖
及びＤＮＡ合成を正常細胞中でよりも形質転換細胞中で
一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在することを報
告している。Ｈｏ１ｌｅｙ等、上皮細胞成長阻害物質の
精製を記載している。
Ｌｅｔａｎｓｋｙ、　Ｂｉｏｓｃｉ、　Ｒｅ　、（１９
８２）　２　：　３９−４５は、つゝシの胎盤から精製
されたペプチドが腫瘍の増殖及びＤＮＡ中へのチミジン
の取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑
制することを報告している。Ｃｈｅｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、（１９８２）　７　：３
６４−３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水流
体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄｉｎｇ及
び５ｃｈａｌｌｙ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、（１９Ｂ２）７９ニア０１４−７０１
８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗−分
裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視床下部
から単離することを報告している。これらの殆どの因子
は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基本的
構造は知られていない。
ジアゼパム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（
１９８３）６０：　　３８３　３８５、Ｃｏｓ　ｔａ等
、Ｎｅｕｒｏ　ｈａｒｍａｃｏｌ、　（１９８４）２３
　：　　９８９−９９１、Ｆｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒ
ｏｐｈａｒｍａｃｏｌ、　（１９８４）２３　：　１３
５９−１８２によって報告されそして説明されている。
〔発明の概要〕
新規な方法及び組成物が提供され、これらの組成物は、
ゲル浸透カラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジェントの酸性（０，１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される。
〔具体的な説明〕
天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な組成物、及び種々のポ
リペプチドをコードしている核酸配列が提供される。そ
のポリペプチドはを推動物、特に哺乳動物の脳細胞中に
天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は実
質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をもつ
。
その諸組酸物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。
このポリペプチドは、ホモジナイズされた脳組織又はそ
の精製された両分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
ＨＰＬＣ及びゆるやかな直線グラジェントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の成分につい
ては所望の活性は水性酸性ｎ−プロパツールを直線グラ
ジェントとして用いて更に精製することができる。
そのクロマトグラムは、約０．１〜０．５ｄ／分の流速
で合理的な分離を得るために４時間以上の時間にわたっ
て展開することができる。逆相肝ＬＣを用いての分離で
は脳組織からの部分的に精製されたサンプルをもたらす
のが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグ
ラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリルを
用い、特に均一に溶出することによって好都合に達成す
ることができる。好都合には、媒体はＯ，１％トリフル
オロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルであることが
できる。
二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼビン（Ｅ
ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム（ｖａ　
ｌ　ｉ　ｕｍ）アゴニストとしてジアゼパムレセプター
に結合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であること
は明らかである。ＥＢＺＤは、低い投与量では、哺乳動
物に興奮及び増強された意識を引き起こし、一方高い投
与量では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体につ
いては、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高
い投与量では心臓拍動度数は増大する。それらの化合物
はジアゼパム結合性阻害剤について公表された（前記の
Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等の文献）配列との幾らかの相同性を
示す。
このペプチドは、脳シナプトソームへのペンゾジアセヒ
ンの結合を抑制することにおいて、約１〜ＩＭ、普通に
は３〜６縮のＫｉをもつことを更に特徴とする（後記の
実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル浸
透クロマトグラフィーによって測定して約７〜１５ｋＤ
ａｌ、普通には８〜１２ｋＤａ　Ｉ、又は５ＯＳ−ＰＡ
ＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記の
実験の項を参照のこと）。このペプチドは親水性である
。１０００ユニツト／■を越える比活性を得ることがで
きる（後記の実験の項を参照のこと）。
ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのアミノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異なっ
た種にわたる共通配列）はジアゼパム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。
第二の成分は脳因子（ＢＰ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い。その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の成長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
ＢＰは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５〜２０ｋＤａｌ、普通には約８〜１８ｋＤａｌの
分子量をもつ。この蛋白質は逆相ＨＰＬＣ及び直線グラ
ジェントの０．１％ＴＦＡ水性ｎ−プロパツールを用い
、約２０〜２６％ｎ−プロパツールで溶出して精製する
ことができる。その精製された蛋白質は少なくとも約１
５　Ｘ　１０３ユニツト／ｎの比活性をもつことができ
る（後記の実験の項を参照のこと）。
第三成分は、アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤ
のアミノ酸５４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペプチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。
これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特にを推
動物、−層特定的には哺乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコジル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセプター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のペプチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合させ、又は１個以上の、普通には数で
約１０％以下の、−層普通には数で約５％以下の、挿入
、欠失、トランジジョン又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する。
ＥＢＺＤポ１ペプチ゛ ＥＢＺＤポリペプチドは約２０キロドルトン（ｋＤａｌ
）未満、普通には約１５ｋＤａ１未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約１　ｋｃａｌ、−層
普通には少なくとも約２ｋＤａｌである。
そのポリペプチド組成物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下
でＯ，１％水性トリフルオロ酢酸中の０〜６０％アセト
ニトリルの直線グラジェントを用いて、２８〜５０％ア
セトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、−層
特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、−層特異的
には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμｍボンダ
バック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　−Ｃ＋　ｅカラムから溶
出することを更に特徴とする。
ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、−層普
通には少なくとも約２０個のアミノ酸、そして約１２５
個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よりも少
ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約７〜１５ｋＤａ　ｌの範囲内の分子量を
もつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも２つ
、−層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
ａ、　Ｙ　ａａ”　ａａ”　Ａｒ　Ｋ　Ｑ　Ａ　Ｔ　ａ
ａｂｂ、に誓ＤＡＷ ｃ、　Ａ　Ｍ　ａａｃＡ　Ｙ　（Ｘ）ｘ　Ｖ　Ｅ　Ｅｄ
、　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａ’　Ｅ　Ｅ　Ｍ　Ｌ　Ｆ
　Ｔ　Ｙ　ａａ”　ＨＹ　Ｋｅ、ＱＡＴＶＧＤ　ＩＮＴ
ＥＲＰＧＭＬＤｆ、ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤ
ＦＴＧＫｇ、ＫＧＴｓＫＥＤＡ 上記の配列において、 ａａ”は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及びヒ
スチジンであり； ａａ’はいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり； ａａＣはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、−層特定
的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａ′Ｉは脂肪族中性ア
ミノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒ
ドロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもの
であり；ａａ″′は脂肪族アミノ酸であり、それは中性
極性又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミ
ドであって且つ４〜５個の炭素原子をもつものであり； Ａｒは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にＹを包含
し； ａａ”は脂肪族アミノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、−層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものでありｉそして ＸはＯ又は１である。
主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＥ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである： ａ、　　ＴＫＰａａ’　　ＤＥＥＭＬＦＩＹａａ”　　
ＨＹＫＱＡＴａａ’　　Ｇｂ、　　ＫＷＤＡＷａａ’　
　ａａｈ　　Ｌａａ’　　ａａ’　　ａ’ａ”　　ａａ
’　　ＫＥａａ”　　八Ｍａａ”ＡＹ　（Ｘ）、　ＶＥ
Ｅ　ａａ’　ＫＫｃ、　　ＫＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰ
ＧＭＬＤＦＴ上記の配列において、 ａａ’　、　ａａ”　、　ａａｑ、及びＡｒは前記で定
義した通りであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜６個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、−層特定的には５〜６
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、−
層普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミノ
酸であり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アミノ酸であることができ； ａａ’は脂肪族アミノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、−層特定的には非極性
中性アミノ酸であり； ａａ’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、−層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり； ａａｋは脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、−層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり；ａａＬ　は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり； ａａ”″は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり； ａａ”は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａａ”は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはＡであり；Ｘ′はＸと同じ
であり、普通には１〜３個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは−船釣には４〜６個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり； Ｘは０又は１であり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Ｘの他に更に、本発明のポリペプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために１〜３個、好ましくは
１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが
、ある場合には、Ｄ−アミノ酸が使用されてもよい。
特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：ψ−Ｚ’　−ａａ’−ａａ”−ａａ３
−ａａ’−ａａ’−ａａ６−ａａ７−ａａ”Ｋ−ａａ”
−ａａ”−ａａ”−ａａＩ３−ａａ”−Ｐ−ａａ１６−
ａａ”Ｅ−ａａ”−Ｍ−Ｌ−ａａ”−ａａ”−Ｙ−ａａ
”−ａａ”ａａ”−に−Ｑ−Ａ−Ｔ−ａａ”−Ｇ−ａａ
３４−ａａ”−ａａ”ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−Ｇ
−ａａ”−ａａ”−Ｄ−ａａ”ａａ４６−Ｇ−ａａ”−
ａａ”−に−Ｗ−Ｄ−Ａ−Ｗ−ａａ”ａａ”−Ｌ−ａａ
”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−に−Ｅ−ａａ”Ａ−Ｍ−
ａａｂ７−ａａ”−Ｙ−（Ｘ））（−Ｖ−Ｅ−Ｅａａ”
−に−に−ａａ″６−ａａ”−ａａ”−ａａ７９−　　
Ｚｃ上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜
９個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えば！Ｅ−Ａ−Ａ又はＨ−！ｌ！−Ｔ−
Ｒ等もａａ’　に結合することができ、またこの場合に
、２個のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にい
ずれかのアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じラ
イン上のアミノ酸が一緒に採用され；ａａ’・ｌｌ＋ｌ
＋は２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ
酸、特にグリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイ
シン及びイソロイシンであり； ａ　ａ　Ｓ　＋　１６　＋　２５　＋　３５°３’＋＋
　５５＋　ｂｏｙ　６１＋　６！１′９３１　？９は脂
肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特
にａａＳｖ　１６′ＺＳ＋　３５＋　３７−７３＋　７
９がいずれかのものであり、そして残りが好ましくは極
性アミノ酸、特にセリン、スレオニン、システィン、メ
チオニン、アスパラギン及びグルタミンであり； ａ　ａ　ｈ＋　　　　　　　　　　　　６４　＋　？　
ｌは脂肪族中性アミノ酸（極性及び非極性アミノ酸を包
含する）又は脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸
及びグルタミン酸であり；特にａａ’・７・３２・３４
・Ｓ９・′ｌは中性アミノ酸である時に非極性であり、
残りは中性アミノ酸である時に極性であり、そしてまた
、ａＩｎ　ｂ＋　？、＋？＋　１９＋　３４＋　３１１
１５６１６４　は好ましくは酸性アミノ酸であり； ａａＺ−１０＋　１３＋　２３＋　２５＋　２６＋　！
？＋　４２＋　４３＋　４５＋　４９＋　７７ハ脂肪族
中性アミノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニ
ン、ヒスチジン、チロシン、及びトリプトファンであり
、好ましくは、ａａＬｌ＠・ｔ６・ｚ７・４５・７７は
好ましくは芳香族アミノ酸であり、一方残りのアミノ酸
は好ましくは脂肪族アミノ酸であり；ａａ３°９°１１
１１３６°：＋９°４ｈ１８°Ｓ＠＋　６？°７６は脂
肪族中性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニ
ンであり、この場合にａａ”・Ｓ１１・６７・７には塩
基性以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは
塩基性以外の時に好ましくは極性であり、但しａａ４ｂ
は極性でも非極性でもよく、そしてａａ３＋　１２′＋
　４＋　３９＋４１１＋Ｓｌｌ・６７°７６は好ましく
は塩基性アミノ酸であり；ａ　ａ　Ｚ　１は塩基性又は
芳香族、特にフェニルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてＺｅはＯ
Ｈ，ＮＨｚ、又は１〜６個の、普通には１〜４個のアミ
ノ酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のアミノ酸
の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列Ｍ−
Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配列である。
１個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも１５個、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸
を配列中にもつ： Ｔ Ｅ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、−層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を
意図しており、そして２はＯ又は１である。その配列は
合計で１０個までの、普通には合計で８個までのアミノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ−末端は
追加の配列Ｖ−Ｈ−Ｅ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの部
分をもつことができ、そしてＣ−末端は配列Ｍ−Ｐ−Ｍ
−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約１
５個、好ましくは少なくとも約２０個、−層好ましくは
少なくとも約３０個のアミノ酸をもち、下記の配列の１
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少な（とも１０個、好ましくは少なくとも１２
個、そして−層好ましくは少なくとも１５個の、星印（
＊）で示したアミノ酸を含む（ｂ＝ウシ、ｈ＝ヒト）。
傘　木本 Ｈ−Ｍ−に−に−１−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔ（ｂ
ＥＢＺＤ） ＊　＊ に−に−に−Ｙ−Ｇ−１ （ｈＥＢＺＤ） １’−ｔ！−Ｈ−Ｐ−Ｌｉ−Ｍ−Ｌ−υ−１’−Ｔ−６
−に一へ−に−Ｗ−Ｄ−へ−Ｗ−Ｎ−Ｅ本発明の特に好
ましい組成物については、上記の諸配列が、約５個より
も多いアミノ酸が挿入され、欠失されもしくは置換され
て、又はそれらの組み合せによって、変更されているこ
とがなく、好ましくは変更は約３個以下のアミノ酸によ
ってである。
ＥＢＺＤ組成物は少なくとも約２０％の純度、−層普通
には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、−層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
それが由来する組織からの成分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が１重量％未満、好ましくは約０．１重
量％未満、−層好ましくは約０．００１重量％未満であ
るＥＢＺＤ組成物は特に興味がある。本発明のＥＢＺＤ
組成物は、後記の実験の項で記載するアッセイ条件下で
粗シナブトソーブ膜への３Ｈ−ジアゼパムの結合を４０
％競争に必要な量によって測定して、少なくとも１５ユ
ニツト／■の比活性をもつ。
比活性は普通には少な（とも５００ユニツト／■、好ま
しくは少なくとも約１０００ユニツト／■であり、そし
て１２５０ユニット／■以上であってもよい。−船釣に
は、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織
１ｇ当り少なくとも約１０Ｉ！ｇ当量あり、そして普通
には脈絡叢生の湿った組織１ｇ当り少なくとも約２０■
当量ある。前記したように、本発明の化合物は心臓細胞
集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼすこと
ができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下させ、こ
の少ない投与量は一般的には約１５０■／！Ｉｔ１未満
である（実験の項を参照のこと）。ＥＢＺＤのその他の
特徴は、生理学的活性がＥＢＺＤについて立証される種
々の試験から明らかである。
呈四ヱ 脳因子は少な（とも２ｋＤａｌ、−層普通には少なくと
も５　ｋＤａｌそして約２５ｋＤａ　１以下、−層普通
には約２２ｋＤａｌ以下であることを特徴とする。脳因
子は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように
、少なくとも約１×１０３、−層普通には少なくとも約
５Ｘ１０’、好ましくは少なくとも約１０６、好ましく
は少なくとも約１．５Ｘ１０’の比活性をもつ。
脳因子は普通には少な（とも約１０％の純度、−層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、−層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの成分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、Ｎ−末端近くに又はＮ−末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む：Ｎ４−Ｅ−Ｌ
−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−に−Ｌ−Ｆ−シーＤ−に−Ｉ−Ｘ４
−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示す。
脳因子はヒトＴ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスポリンＡ又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも１桁の、好ましくは少なくとも２桁のオ
ーダーで識別することができる。
談蛋亘ｉ 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　Ｐｒｏ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　　　−ＩＴＴＣＧ
ＧＧ　　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　　ＣＧＧ　
　ＣＴＧ　ＣＧＣＴＣＣ６７ＡＴＧ　　ＴＴＴ　　ＣＡ
Ｇ　　ＴＴＴ　　ＣＡＴ　　［ｉにＡ　　ＧＧに　　Ｔ
Ｌ；じ　’ｒＩＪＩＪｔｉ几ハ１１１　１、Ｌ、Ｉ　　
Ｌ＋ＡＡ　　ＩＪＬ；’１’　　Ｌｉ’ｌ’ｉ’　　Ｌ
；ＡＡ　　［ｉら八　し１’Ｔ　　［；［；Ｔ　　６［
ｉＧ　　１１４’／ょＬ起１お可９Ｊ１匹：ウシの脳に
由来するｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列及び推定
されたアミノ酸配列（＊）。アミノ酸残基は提案された
開始メチオニンとの関係で番号づけされている。ＥＢＺ
Ｄと相同な領域は太線によって上に線引きされており、
そして疎水性及び非荷電のアミノ酸の延長領域は細線で
線引きされている。潜在的なグリコジル化部位は囲まれ
ている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、−層普通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ。ＥＢＺＤとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蒼白質は
少なくとも約１０％の純度、好ましくは少なくとも約５
０％の純度、−層好ましくは少なくとも約８０％の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
。
膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。
興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。
本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イデイオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってボリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、−船釣には
少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｔｍｐｅｔ）ヘモシ
アニン、グロブリン、等を用いることができる。ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔で１回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その肺臓を単離し、
その肺臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
−と融合させる。
例えば、Ｇａ１ｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０：Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕ−ｎ９ｉ！２ＬＬ（１９８７）８１　：　７
７　；米国特許第４，３８１．２９２号及び第４．３６
３，７９９号を参照のこと。しかしながら、特定の目的
に対しては、その他の哺乳動物、例えば霊長類（例えば
ヒト）を、ヒ）Ｆｃ鎖をもつ抗体の生産のために、用い
ることができる。
ＥＢＺＤポリペプチド及びＥＢＺＤポリペプチドに特異
的に結合する抗体は、個々に又は−緒にして、インビボ
及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合物はジ
アゼパムレセプターへの結合のためのアゴニストとして
用いることができる。本発明の化合物は、ジアゼパムレ
セプターの数及び分布を求めるのに用いることができる
。加えて、本発明の化合物は哺乳動物宿主の心臓拍動を
調節するのに、哺乳動物宿主を鎮静させるのに、又は哺
乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用いられる。
脳因子ポリペプチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に
結合する抗体は、個々に又は−緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある。
このポリペプチドは腫瘍抑制特性をもっているので、こ
のポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制するた
めに、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合
物と共に用いることができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる：正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる；骨
髄が哺乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合；細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる。
脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する（この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい）
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。
このポリペプチドは、ポリペプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性
粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３．
８１７，８３７号、第３．８５０．７５２号、第４．１
７４，３８４号、第４，２７７．４３７号及び第４．３
７４，９２５号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
ＥＩＡ　、　ＥＬＩＳＡ　。
ＲＩＡ　、ホモゲニアスＥＩＡ　、　　ドツト−プロッ
ト、ウエスターンズ（Ｗｅｓ　ｔｅｒｎｓ）等と称され
る。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イデイオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イデイオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエピトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イデイオタイプはジアゼパムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組成物は多数の種々の組織、例えば肺
臓及び精巣中に見いだすことができる。
本発明の化合物を単離するために、脳組織がら血餅を排
除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４ｋＤａ
１未満である低分子量物質を除去する。
その生成物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０、１％トリフルオロ酢酸水
溶液溶離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑制
剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両分
をバイオアッセイによって観察する。その生成したＥＢ
ＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、
例えば、μｍボンダパック−Ｃ１１カラムを用い、水性
０．１％トリフルオロ酢酸中の約０〜６０％アセトニト
リルの線状グラジェントを用い、そして長いカラム及び
遅い溶出速度、例えば４時間以上、好ましくは５時間以
上を用いて更に精製した。本発明のＥＢＺＤ化合物は約
３０〜５０％アクリロニトリル、−層特定的には３０〜
４０％アクリロニトリルの両分中に見いだされる。
ＢＦ化合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％
水性アセトニトリルの直線グラジェントを用い、３２〜
３６％アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回以
上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を次
いで、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％水性ｎ−プロパツ
ールの直線グラジェントを用い、約２２〜２４％ｎ−プ
ロパツールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り返し
て、更に精製する。
他の方法として、本発明のポリペプチドは、特にポリペ
プチドが３０個未満のアミノ酸、−層特定的には２５個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合成する
ことができる。例えば、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ、　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ
　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ＋”Ｔｈｅ　Ｐｃ１ｐｔｉｄｅｓ
、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　。
５ｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｔｄ
ｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ＋　Ｐａｒｔ　Ａ。
Ｖｏｌ、　２＋　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅｒ
［ＳＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（米国）　１９８０
．１〜２８４頁を参照のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約２０個以上のアミノ
酸をもつもの、−層特定的には約３０個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる。ポリペプチドをコード
するためにゲノムＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、合成りＮＡ又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。はとんどの場合において、オーブンリーディングフ
レームが用いられ（イントロンなし）、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される。
特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
れるｃＤＮＡがある。このｃＤＮＡは開始のメチオニン
から約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを含む。
下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している。
５’　−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡ
ＡＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴ５”　−Ｇ−Ｔ−−−ＧＧ−Ｃ
−−−−−Ｔ　　−−−−−−−ＴＮａｅｌ ↓ ｉｎｄ　ｍ ↓ −ＣＧ　　−−−−−−〜−−− ＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡ
ＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡ　　５１１ＴＧＡＣＴＡ
ＡＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＡＣ
ＴＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣ
ＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴへへへ＾ＧＴＡＴＣＴＴ　　
　５９０ＴＧＴＴＡＣＴＴＴ／ＡＣＴＴＣＧ／ＡＴ（ｐ
ｏｌｙ　　Ａ）−３’　　　６０７上記はウシとヒトの
ヌクレオチド及びＥＢＺＤの推定されたアミノ酸配列を
比較して示している。ヒトの配列において異る残部はウ
シの配列の上及び下に示されており、それは３つのオー
バラップするｃＤＮＡクローンから求められた。ヌクレ
オチド残部はウシのクローンの複合配列に関して番号付
けされており、アミノ酸残基は開始のメチオニンに関し
て番号付けされている。ウシの配列のリーディングフレ
ームは星印（＊）に挟まれている。３つの別個のクロー
ンのポリ（Ａ）士付加部位における差異は逆スラッシュ
によって示されている。
ウシのｃＤＮＡプローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄＩ［ｒの制限部位が示されている。
実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグ
メントが、本発明のポリペプチドの発現に用いることが
できる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし１個以上のアミノ酸の異な
っているポリペプチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ベクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペプチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合ζ以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、５′末端および３′末
端において、しばしば野生型の制御Ｉ領域以外の、転写
および翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナルのそれ
ぞれによって挟まれている。従って、プロモーター領域
は５′末端において用いられ、キャップ配列、制御され
た発現のためのオペレーター、およびエンハンサ−配列
等を含み、構成的発現のためにプロモーター制御を含ん
でいないことができる。３′末端においては、ターミネ
ータ−１終止コドン、および最適にはポリアデニル化配
列等が存在する。
転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にする１種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される。マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生成物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′−配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる：米国特許筒４，４１１，９９４号、ＥＰＡ８８．
６３２および１１６，２０１゜コード配列は正しいリー
ディングフレームでｌリーダーおよびプロセッシングシ
グナルに連結されることによって、その融合コード配列
を発現ベクター中に挿入して発現造成物を提供すること
ができる。
ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ，電気泳動、グラジェン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその通用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００　ｔ
ｒｇ／ｒｄである。投与方法に応じて、用量は約０．５
〜ｂ で変化することができ、用量が２５ｘ／ｋｇを越える場
合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所望の反
応、投与方法および用量の反復性等によって変化する。
以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
Ｂｌｏ−３ｉｔ　ＴＳＫ−２５０ゲルロ過ＨＰＬＣカラ
ムを、バイオ−ラッドラボラトリーズ（リッチモンド、
カルフォルニア）より購入した。μ−Ｂｏｎｄａｐａｋ
−Ｃ＋ａカラムをウォーターズアソシエート（ミルフォ
ールド、マサチューセッツ）より人手した。トリプシン
（ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシンおよびスタフィロコ
ッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｏｌ　ａ
ｕｒｅｕｓ）ｖ８プロテアーゼは、ワーリントン（Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）から得る。エンドプロティナーゼ
Ｌｙｓ　−Ｃをベーリンガーマンハイムから得た。３Ｈ
−ラベル化ジアゼパム、ＲＯ１５−１７８８、フルニト
ラゼパムおよびβ−カルボリンをＮＥＷ　、ボストン、
マサチューセッツから得た。キャリヤフリー＋ｚｓＩ−
ヨウ素はアマ−ジャム（アーリントンハイト、イリノイ
）製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０ｇ湿重量）を融解
し次いで細断した。細断した組織を、２３７９Ｉｄのエ
タノール（９８％”）　、１８．５ｄの濃ＨＣｆ、およ
び２、５　ｍのアブロティニン〔ウシの肺源の２３７Ｉ
Ｕ／ｄ（シグマケミカル社）〕から成る２４００ｄの抽
出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマーシ
ャル混合機中でホモジナイズした。ホモジネートを４°
Ｃで一夜で撹拌し、ベックマン型１９０−ター中８００
０ｒｐｍで３０分間遠心分離し、次いで上澄みを注意深
く除去した。最終量は約２０７０ｄであった。クロロホ
ルム（２０７０ｍ）および２０７ｄの酸性の水（２０３
ｄの水と４　ｍｌの濃ＨＣｊ２）を上澄みに添加し、混
合物を約１時間激しく撹拌し、次いで室温に放置し二相
に分離した。水性の上相を注意深く除去し次いでスペク
トラポール透析膜チューブ（３，５００Ｍ−カットオフ
、アメリカンサイエンティフィックプロダクト）中、４
°Ｃで０．１Ｍ酢酸２Ｏｆを２回取り換えて透析した。
透析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾燥材料（７８５
■）を粗分画と称した。
゛ノ噴゛クロマトグラフィー Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０Ｘ　２．
１　ｃｍ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付けた。粗
分画を０、１％三フフ化酢酸を用い４０％アセトニトリ
ル水溶液中に８■／ｌｌ１１の濃度で溶解した。カラム
を０、１％三フフ化酢酸（ＴＦＡ）　と共に４０％アセ
トニトリルを用いて平衡化した。２Ｉｄのアリコート（
１６■のタンパク質）を注入し次いで０．１％ｆｉ度ノ
ｒｐＡを有する４０％アセトニトリル水溶液を移動相と
して均一に溶出を行った。流速を２１ｎＩ！、７分に設
定しそしてチャートスピードを０．２５ｃｍ／分に設定
した。
クロマトグラフィー処理を室温で行った。５−の分画を
採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いでベン
ゾジアゼピン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−ＢＣＡ
）および成長抑制活性について３回分析した。
ＢＺＤ−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述
べた如＜、４９回のクロマトグラフィー操作を行った。
全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した。約６
５■の活性な乾燥粉末を得た。これをＴＳＫ−２５０分
画と称した。この分画は約９３６ユニツトのＢＺＤ−Ｂ
ＣＡ活性を含有していた。
ＴＳＫ−２５０の゛　８　　　クロマトグーフィーＴ、
５Ｋ−２５０分画を０．１％ＴＦ八に溶解しく２■／戚
）、更にμｍＢｏｎｄａｐａｋ−Ｃ１ｌｌカラム（７８
ｍ＋ａ　（内径）Ｘ３０ｃｍ）を用い室温で逆相ＨＰＬ
Ｃにより分別した。試料を均一に適用し、カラムを洗浄
し次いで０．１％ＴＦＡで平衡化した。流速を２ｍ１分
に設定し、そしてチャート速度を０．２５ｃｍ／分に設
定した。第一の溶剤０．１％ＴＦＡと第二の溶剤０．１
％ＴＦＡ中のアセトニトリルと間での線状グラジェント
法を用いた。グラジェントの条件は２０分内で０〜２８
％、次いで１４０分内で２８〜４２％、１０分内で４２
〜５２％更に６分内で５２〜１００％であった。全ての
溶剤は、ＨＰＬＣ等級のものであった。４ｍの分画を採
取した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでＢＺＤ−ＢＣ
Ａに対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜３
２％アセトニトリル濃度間で溶出した。
分画３６と分画３７をプールし、次いで１２ｍの０．１
％ＴＦＡで希釈した。混合物を、ｇ　−Ｂｏｎｄａｐａ
ｋ−ＣＩａカラム〔３，９閣（内径）Ｘ３０ｃｍ）に均
一に適用した。流速はｌＩ！１／分であり、チャート速
度は０．２５ｃＩＩｌＺ分であった。第一の溶剤０．１
％ＴＦＡと第二の溶剤０．１％ＴＦＡを有するアセトニ
トリルとの間で直線グラジェント法を用いた。グラジェ
ント条件は次の通りであった。１０分内で０〜３０％、
次いで６０分内で３０〜４０％であった。分画を採取し
た。殆ど全ての活性（約８５０ユニツト）部分は３１％
までのアセトニトリル濃度で分画６内に溶離した。この
分画をＨＰＩ、ＣＣｐｓ分画と称し、これは約６８０ｊ
１ｇのタンパクを有していた。
また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒトＥＢＺＤを精製した。
９シ　ブトソームの８１ 粗シナプス膜分画を、体重２００　ｇまでのスプラ−ブ
ード−レイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいず
れかからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。
鎖ｉ、　ＵＳ八（１９７４）亙：　４８０２−４８０６
）の記載の如く調製した。シナプス膜を、５０ｍＭのト
リス−ＨＣ／！　（ｐＨ７，４）で３回洗浄し、緩衝液
中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離によりベレット
化した。洗浄したシナプトソーム膜を５０ｍＭ　）リス
−ＨＣｆ　（ｐ。
７．４）に懸濁させ次いで一２０°Ｃで保存した。
ＥＢＺＤ−八　　　　についてのアッセイ種々の両分又
は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブトソ
ームへの３Ｈ−ＢＺＤの結合の阻害を、結合競争活性の
指標どして使用した。シナプトソーム膜への”Ｈ−ＢＺ
Ｄの結合を、２５禮のβ−カルボリンの不在下又は存在
下のいずれかで使い捨ての１２　Ｘ　７５ｍｍのポリプ
ロピレン管中において２通り実施した。その結合混合物
は、所望の種々の濃度の試験化合物、２０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ＝７、４　）　、シナプス膜懸濁液
（７０〜１００ｎのタンパク質）、１〜５ｍＭの３８−
　ＢＺＤ及び合計体積０．１　ｄ中０．５％の最終濃度
のジメチルスルホキシドを含んだ。４℃で３０分間のイ
ンキュベーションの後、０．１ＭのＴｒｉｓ−Ｈ（／！
　（ｐＨ＝　７．４　）中１０％の冷ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ６０００）　０．７　ｍを各々の管に添
加した。その懸濁液をすぐ４°ＣでＧＦ／Ｂフィルター
により真空濾過した。そのフィルターを、ｌｒｒｒｇ／
ｄのＢＳＡを含む５０１の冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐ
Ｈ＝７、４　＞　１０１ｄにより洗浄した。そのフィル
ターを、計数バイアルに移し、そしてアクアシン（Ａｑ
ｕａｓ−ｓｉｎｅ）（ＮＥＮ）１０ｍを、各バイアルに
添加し、そしてＢｅｃｋｍａｎβ−カウンターを用いて
放射能を測定した。２５声のβ−カルボリンの存在にお
いて結合した放射能（合計結合の２〜８％）は、非特異
的であると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正
された。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いて
、Ｌｏｗｒｙ＋など、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
（１９５１）　１９３　：２６５〜２７５の方法によっ
て測定した。
ポリアクリルアミドゲル ０、１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．　２　）　、
０．　１％のＳＤＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％の
ポリアクリルアミドビス−アクリルアミド（３０　：　
０．　８　）の１５ｃｍの分離ゲル（０．７５ｍｍの厚
さ）を使用した。そのゲルは、ゲル２Ｍ！当りＴＥＭＥ
Ｄ（ＢｉｏＲａｄ）　ＩＯＪを含み、そして、２０％の
過硫酸アンモニウムの１．　０　ｍ／ｄのゲルを用いる
ことによって重合されたものである。分離ゲルの条件と
同一の緩衝液条件を用いる３．５％のアクリルアミド溶
液の上層ゲルを、下層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約
３ａｍを残して、コム（Ｃｏｍｂ）を、その上のゲル中
に挿入した。
０、ＯＩＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．　２　）　
、７　Ｍの尿素、１％のＳＯＳ及び１％の２−メルカプ
トエタノール中サンプル４０ｍを、２分間煮沸し、そし
てすぐに適用した。そのランニング緩衝液は、０、１％
のＳＯＳを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７
．　２　）であった。トラッキング染料がゲルの底に達
するまで、そのゲルを、室温で５Ｖ／ｃｍで泳動させた
。そのゲルを、５０％メタノール及び９％酢酸中に固定
し、固定溶液中において０．　１％クーマシープルー（
Ｃｏｏｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）により染色し、そして５
０％メタノール及び９％酢酸により脱染色した．脱染色
の後、そのゲルを乾燥せしめた。
１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２
７　：　６８０　〜６８５のＰＡＧＥ法もまた、使用さ
れた。ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒｉｌ．など、、
　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２旦：　１４３７〜１
４３９の銀染色法又はクーマシーブルー染色法のいずれ
かによって検出した。
タンパク　のヨウソヒ Ｂａｒｒｉｄｇｅ，　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚ　ｍｏｌ．
　（１９７８）５０　：　５４〜６５によって記載され
ているクロラミン−Ｔ法を用いて１１■により、又はＢ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　（１９７３）　１３３　：　５２
９〜５３９に記載されている”’Ｉ　　Ｂｏｌｔｏｎ及
びＨｕｎ　ｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベルし
た。
ＥＢＺＤに・　る ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅ−
Ｄａｗｌｅｙラットを、完全フロインドアジュバント中
に乳化された、合計２０■の精製タンパク質により感作
した．続く追加免疫接種を、不完全フロインドアジュバ
ント中タンパク質１０躍を用いて２適間隔で与えた．各
接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記に概説さ
れているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体について
スクリーンした。
そのアッセイのために適切な抗血清は、−船釣に、２〜
３回のみの追加免疫接種の後、得られた。
ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニューシーラントホワイ
トウサギ）における精製されたウシの脳のＥＢＺＤに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、４０Ｉ！ｇ及び２０１！ｇの
タンパク質を、それぞれ、１次接種及び追加免疫注射の
ために使用した。
一ジオイムノア　セイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　ＸＩＯ”ｃｐｓ
／躍の比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し、そ
して４°ＣでＴＮＥＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−１
１Ｃｊ！、ｐＨ＝７．４　；　５＋＋＋ＭのＥＤＴＡ；
　　１５０ｍＭのＮａＣｊｌ！　；　０．０５％のＮＰ
−４０；　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管（３−の容量）に添加された：精製され
た脳因子の標準又はサンプル１０１１１、ラット抗血清
（ＴＮＥＮ緩衝液中において１：３０に希釈された）１
０Ｉ及び＋′■によりラベルされたウシの脳因子（〜５
　Ｘ１０’ｃｐｍ）　３０１．室温で４５分間のインキ
ュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固定さ
れたＳ、アウレアス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）の１０％懸濁
液５０ｍを添加し、そしてその混合物をさらに３０分間
放置した。次に、免疫吸着剤をｎ−ブチルフタレート油
のクツションを通して遠心分離しく１５．０００Ｘ　ｇ
　、　１分）、そしてＳ、アウレアスペレット中の放射
能活性の量を、ｒ−分光測定によって測定した。抗血清
の不在において結合した放射能は非特異的であると思わ
れ、そしてデーターはそれに応じて修正された。
ＲＩＡ反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織（お
よそ１ｇの正味重量）を、１０ｄの冷ホモジナイゼーシ
ョン緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．
４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍＭのＮａＣ１
；　０．２％のＮＰ４０　；　０．２　ｍＭのフェニル
メチルスルホニルフルオリド；ｄ当り１００カリクレイ
ン阻害剤ユニツトのＴｒａｓｙｌｏｌ）に添加し、そし
てＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーにより３回、１
５秒間の破壊により均質化した。その抽出物を取り出し
、そして１００．０００Ｘｇで３０分間の遠心分離によ
り残骸を除去した。
次に、この上清液を、５分間９５°Ｃへ加熱し、そして
低速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連
の１：３の希釈の抽出物を、ＴＮＩＩ！Ｎ緩衝液により
調製し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標準
曲線は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性物
質の量を、直接的な比較により算定した。
ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドブロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃを含む０．１　ＭのＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ
＝８、０　）　４０ｇにおいて２４°Ｃで１６時間消化
した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準で１０：１で
あった。ペプチドフラグメントを、水中０．０５％ＴＦ
Ａから０．０４５％ＴＦ＾を含む６０％アセトニトリル
までの直線２時間グラジェントを用いてμｍＢｏｎｄａ
ｐａｋ−Ｃ，＠カラム（Ｗａ　ｔｅｒｓ）でのｒｐＨＰ
ＬＣによって分離した。ペプチドをモニターし、そして
２１４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、集め、凍
結乾燥し、そしてアッセイのために使用した。
Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した。ＢＺＤ結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１１　、５０
０）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピ
ークとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムＴＳ
Ｋ−２５０からの活性フラクション２４のクロマトグラ
フィーの結果、その活性は３１〜３２％のアセトニトリ
ルの間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プール
されたフラクション３６及び３７の再クロマトグラフィ
ーは、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたら
した。その精製は第１表に要約される。
ａ：上記のアッセイ条件下で粗シナプトソーム膜への３
Ｈ−ジアゼパムの結合に対する４０％競争のために必要
とする材料。
ｂ：プールされた材料の直接計量による。
Ｃ：２８０ｍμでの吸光度から計算された。
ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイす
ることは不可能であった。この数は、フラクション２４
及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフイー処理の
後に回収された合計ユニットを示す。
８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で達成した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した。しかしながら、最大の阻害度は、８渕の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎないこ
とが見出された。Ｋｉ値は、３Ｈ−ジアゼパム又は３Ｈ
−ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして使用さ
れても、約５犀であることが見出された。
精製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示された。ペプチドの分子量は、１
０．５にドルトンであると算定された。
Ｌａｅｍｍｌｉの５Ｏ５−ＰＡＧＥ法による精製された
蛋白質（ウシ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ〜７
にドルトンを有する単一のバンドを与えた。精製された
タンパク質は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡと共
に、水中４０％アセトニトリルを用いるＢｌｏ−５ｉｌ
　ＴＳＫ−２５０カラム（６０Ｃ１ｌ　Ｘ　７．５　ｗ
ｍの内部直径）から単一の対称ピークとして出現した。
その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラフィー法
によって約１１．５にドルトンであることが計算された
。この精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、類偵する物理
化学的特性及び生物学的特性を示した。
シナプトソーム膜への、Ｉ！Ｊ−ラベルされた（クロラ
ミン−Ｔ法又はＢｏｌｔｏｎ及びＨｕｎ　ｔｅｒ法のい
ずれかによる）精製タンパク質の特異的結合は観察され
なかった。
Ｕ廻■立査 ＲＩＡ系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のＢＢＺＤを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シＥＢＺＤに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
のＩｔＳ■−ラベル化ＨＢＺＤの除去を測定した。ウシ
およびヒトのＥＢＺＤは、ウシＥＢＺＤ蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合する１！Ｓ■−ラベル化
ウシＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示した。こ
のことは、両方の蓋白質中に全く同様な免疫原決定基が
存在していることを示している。
エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ消化によって得られそ
して逆相ＨＰＬＣによって精製されたウシＥＢＺＤのペ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった。従って、ＥＢＺＤの免疫原決定基はエンド
プロティナーゼＬｙｓ−Ｃによって生じた単一ペプチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々の組織中のＥＢＺＤの分布を下記第２表に示す。
脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 肺臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ） 血清または血漿 Ｎ、Ｄ、＝検出できず。
ＲＩＡ法の詳細は前述しである。
３．８０ ３．４２ 工、７６ １．５２ １．２７ １．０５ ０．９７ ０．８４ ０．７３ ０．６７ ０．５０ ０．３７ ０．０６ Ｎ、Ｄ。
血清または血漿以外の試験組織はすべて、ＲＩＡによっ
て検出されるＥＢＺＤを含有していた。ウシの脳、肺臓
および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　、７．
６および６．８　ｐｔｔ当量を含有していたが、ヒトの
脳は組織１ｇ（湿重）当り１５．７ｇ当量を含有してい
ることが見い出された。ラビット脳中のＥＢＺＤの濃度
は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるかに
低いものであることが見い出された。ＥＢＺＤはモンキ
ーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク賞に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳を髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（ＩＦ！Ｐ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ
　１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）およ
び膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ
、それぞれ濃縮細胞（〜１０９細胞）１ｄ当り９．１゜
８．９　、８．６．０．３２および０．２６．ｃｗ当量
のＥＢＺＤを含有していた。ＥＢＺＤ　１　ｎは約６Ｘ
１０”分子を含んでいる。従って、ＭＣＦ　７．　ＨＥ
Ｐ　２および）ＩＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜５Ｘ
１０’分子のＥＢＺＤを含有している。
従って、ＥＢＺＤは哺乳動物の組織中に広（分布してお
り、そしてＤＢＩとは異り脳に特有のペプチドではない
。広い組織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的なも
のというよりむしろ一般的なものであろうということを
示唆している。
大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ １７．４ ２６．７ １４．３ １．７ １６．２ ＥＢＺＤ濃度は前述の如くにＲＩＡによって測定した。
第３表は、ＲＩ＾によって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢＺＤの分布を要約している。
脳の領域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、Ｅ
ＢＺＤ濃度の実質的な局所的変化があることが示された
。試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡
叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体におい
て見い出された。
ＥＢＺＤの　　（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ　　’体重２．３
〜２．６ｋｇの雄性ニューシーラントラビットをこの実
験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、ニ
ューロファーマコル、（肢肛ＵハＬｍａｃｏ１．）　　
（１９７２年）１１：１〜１６真に記載されたの直接穿
刺法に若干の変更を施すことによってｉｃｖ注射を行な
った。動物は、頭蓋に小さな穴（直径０、８　ｍ　）を
開ける（ベンドパルビタール麻酔下）ことによって実験
の２日前に準備した。この穴は正中線に対して１．０１
１１側方およびプレグマに対して１．０園口吻側に位置
している。実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局所
麻酔薬を噴霧する。
＃２６の針を頭蓋の表面から１２ｍの深さまで鉛直に挿
入する。正確な位置決めは大脳を髄液の出現によって指
示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、こ
の針を同じ深さまで再度挿入する。
注射は、常に、注射器微量ビユレットを用いて１０バの
容量で３０〜６０秒間にわたって実施する。対照の動物
には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌し
た等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基として
表現される。
動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ
ｔａｎｃｈｉｏｎ）内に位置させる。結腸温度は、リー
ズ−ノースラップ・スピードマックス・レコーダー（Ｌ
ｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｓｐｅｅｄｏｍａｘ　ｒ
ｅｃｏｒｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線が引
かれているＹＳＩＳキスンニング・テレサーモメーター
（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅ１ｅｔｈｅｒｖ＋ｏａ
ｅｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタプローブに
よって測定される。実験は２２．０±１．０℃の常温室
内で実施する。
興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る。２５■／ｋｇのベンドパルビタールを静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は自
らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けにな
っていることができる。
ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の常置的（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉ
ｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した。
　ＥＢＺＤ 則互 注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する。
呼吸は９０分から２０４分まで増加した。
運動活性の増大。機能先進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉ　ｔｙ）なし。痛覚脱失なし。
１００μｇ 注射の１０分後、呼吸は９８分から６５分まで減少。強
迫的咀噌および軽度の興奮。興奮は短時間続いた。機能
亢進なし。痛覚脱失なし。
不用」（ 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８分
から５０分まで）。注射の１０分後、立直り反射欠如。
動物は深い麻酔状態にはなかった。
ｂＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。
８日齢のヒナ鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を単個
細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法により
、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル（
Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（Ｄａ）Ｉａａｎ）、ジ
エイ、セル、フィズ、（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈ　ｓ、）（
１９８３年）■亙３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特
性を基準にすれば、この調製物は成体の哺乳動物のプル
キンエ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダル
およびデハーン、デイ・イニシエイｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅ
ａｒｔｂｅａｔ）デニス・ノープル（Ｄｅｎｉｓ　Ｎｏ
ｂｌｅ）編、１９７５年、オツクスフォート・ユニバー
シティ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ）　、ロンドン、ｐ、７〕。これらの集
塊は２４℃で平衡化しｂＥＢＺＤを用いて２４時間処理
した。２つの個別の実験において、１００ｇ／Ｒ１の量
で処理した集塊の収縮速度は対照と有意に相違した。こ
れを以下に示す。
実験１： （測定された収縮速度（秒）１５回の収縮量間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差　５Ｒ１ＡＮ未処理　　１４　　
１１．４Ｂ　　　　１．４４　　　０．３８処理　１４
　７．９４　２．０４　０．５５実験２： Ｎ　　平　均　　標準偏差　ＳＥＭＥＡＮ未処理　　１
３　　２４．５９　　　３．１８　　　０．８８処理　
１２　１９．３３　２，３７　０．６８各実験において
、スチューデントＴテストによれば、処理された母集団
は有意に未処理の母集団と異なっている。これら２つの
母集団が同じものであるという確率は０．０００１より
小さい（ｐ−０，００００）。
配ｌ敷先定 ウシおよびヒトのＥＢＺＤのアミノ酸配列を、（ａ）エ
ンドプロティナーゼリシンＣ１（ｂ）キモトリプシン、
（Ｃ）スタフィロコッカル・アウレウスＳｔａ　ｈ　Ｉ
ｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８および（ｄ）臭
化シアンを用いたｂｌＥＢＺＤおよびｈｔ！ＢＺＤの消
化により得られたペプチドのマイクロシーフェンス分析
によって決定した。ペプチドフラグメントは揮発性溶剤
を用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した。アミノ末端を
ブロックしたペプチドを１２ＮＨＣ／！中で周囲温度に
おいて１６時間インキュベーションした。次いで、試料
を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを、４７０Ａ
型気相プロテインシークエンサー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ）　（アプライド・バイオシステムズ社
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、
）　）による自動反復エドマン分解に付した。　ｒｐＨ
ＰＬＣによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分
析した。
これとは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはペプチドを、６ＮＨＩＪを用いて１０５℃で１６〜
２０時間減圧において加水分解した。得られたアミノ酸
をフェニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ（Ｐｉ
ｃｏ）ＴＡＧシステム〔ウォーターズ・アソシエーツ（
Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）　）によって分
析した。フェニルチオカルバモイルアミノ酸を２５４ｎ
Ｍの吸光度によって検出した。
■別Ω止学講盈 ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤのアミノ酸配置を、６ＮＨ
Ｃ／！で加水分解した後、アミノ酸自動分析装置を用い
て決定した。これらの蛋白質には、システィンを除くす
べての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータ
から計算された最小分子量は約９，９００であり、５Ｏ
５−ＰＡＧＥによって確認された値と一致する。
Ｎ−末端アミノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を、公
表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示す。
ｂＥＢＺＤ配列と異なるｈＥＢＺＤアミノ酸配列中の残
基には下線を引いた。
ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＥＢＺＤのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるたった１個の塩基変化
と一致する。これらの結果は、ヒトおよびウシのＥＢＺ
Ｄが異なる種の間で構造的に高度に保存されていること
を立証している。
ウシの組織から単離したポリ（Ａ“）ＲＮＡをｃＤＮＡ
合成用の鋳型として使用した。第１鎖のｃＤＮＡ合成は
オリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭν）逆
転写酵素とを使用して実施した。第２鎖は大腸菌ＲＮａ
ｓｅ　Ｈ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーセ
（ＮＡＤ”　）を使用して合成した。Ｓ１ヌクレアーゼ
消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片
によるフィルイン反応によって２末鎖ｃＤＮＡを平滑末
端化した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼを使用して、デオキシグアニン残基約１５個
をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に加えた。次に、このＧ
の尾部をもつｃＤＮＡをＡ−５０カラム上でサイズ分別
して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと導入されなかった
デオキシグアニン残基とを除去した。次に、プールした
ｃＤＮＡの濃縮を、ＥｃｏＲＩで消化したλｇｔ、１０
　　ＯＮＡの存在下におけるエタノール沈殿によって実
施した。
ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ、１０に対するＧの尾部を
もつｃＤＮＡの連結反応は、３′末端にデオキシシトシ
ン１２個を含みそして５′末端にＥｃｏＲＩ開裂ＤＮＡ
の１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１本
鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法に
よって実施した。連結したＤＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒ。
パッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６
００ｒｋ−ｍｋ”　Ｈｆ　ｊ！中へ導入した。これは、
組換え（野生型でない）フエージに感染すると細胞溶菌
される。その方法により、放射性標識合成オリゴヌクレ
オチド（１７ヌクレオチド長：その配列はウシＥＢＺｔ
ｌ中に見出される６個の連続するアミノ酸（ＫＷＤ静Ｎ
）によって推定した〕を使用し、プラークからのＤＮＡ
を二重にスクリーニングした。コドンが不明なので、オ
リゴヌクレオチドの３２種の縮重プールとしてＭＳＩを
合成した。ＭＳＩによるスクリーニングにより陽性のプ
ラークを得これをプラーク精製し、そして１．８ｋｂの
挿入部を含有することが示された。この挿入部をプラス
ミドｐＥＭＢＬ中にサブクローン化した。これをｐＭＰ
ｌと称する。挿入部を制限地図化した後、続いて適当な
数片をＭ１３株中に更にサブクローン化し、そしてＳａ
ｎｇｅｒＣｏｕｌｓｅｒのジデオキシ法によって配列を
決めた。
ｐＭＰｌ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほとん
ど同じ挿入部の５′末端から約３００塩基対のＤＮＡ配
列を含んでいた。更に、ｐＭＰｌのヌクレオチド配列に
より、配列が決定されているウシＥＢＺＤに関して決定
したアミノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）アミ
ノ酸配列が予想された。これらの２種の蛋白質が密接に
関連していることはアミノ酸配列の顕著な保存性によっ
て示唆されている。配列が決まっているＥＢＺＤからア
ミノ酸３個を除去することにより、残りのアミノ酸をｐ
ＭＰｌの配列と関連させることができ、この結果アミノ
酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存的置換
を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。
ｐＭＰｌの発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している。最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をｐ
ＭＰｌがコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。
旦堕遺伝子少発里 ウシの肺臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮＡは０．６ｋｂｐの挿入部であり、これをｐ
ＥＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得た。配列決
定を行なったところ、ｐＭＰｌと相同のコード配列が得
られた。ウシのエンドゼピン（ｂＥＢＺＤ）　ヲコード
するＤＮＡ断片を、Ｄｒａ　Ｉ消化およびＮａｅ　Ｉ消
化を組合せることにより、ｃＤＮＡプラスミド（ＥＢＺ
Ｄ）から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって
精製し、発現ベクター（ｐＳＭ　１．２）中にＳｔｕ　
１部位に挿入した。ｐｓＭｌ、２発現ベクターの形成は
、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺
伝子（Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ（１９７７）　２　
：　９５）　、ｐＴＲ２１３のＩａｃプロモーターおよ
びリボソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ　　等、　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ（１９７９）匹：　７６０−７６４　）をｐＬ
Ｇ３００のｉ−Ｚ融合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎｔｅ等、Ｃ
ｅ１ｌ（１９８０）２０　：　５４３　５５３　）にス
プライシングすることによって行なった。得られたプラ
スミドはクローニング部位例えばＳｔｕ　１部位に挿入
された外来遺伝子を融合蛋白質として発現することがで
きる。この構造において、ＥＢＺＤに関する全コード配
列は、ｃｒｏ蛋白質の最初の２個のアミノ酸をコードす
るＤＮＡに位相を合わせて融合された。プラスミドｐｓ
Ｂ１０Ｂは挿入部を正しい配向で含んでおり、プラスミ
ドｐｓＢ１０３は挿入部を誤った配向で含んでおり、そ
してプラスミドｐｓＢ１２５は挿入部を含んでいない。
各種のプラスミドを含む大腸菌ＨＢＩＯＩクローンを対
数期まで増殖させ、そして振とうしなから３７“Ｃで２
時間、最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを加えることによっ
て誘導した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチー
ム洗浄剤処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上
清（細胞質ゾル）とベレット（細胞質内封入体）とに分
けて、免疫化学的技術によって分析することができる。
発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐｓＢ１０８）を含む大腸菌クローンだけが高
いレベルのＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大部分の
ｃｒｏ−ＥＢＺＤは上清分画（細胞質ゾル）中に見出さ
れた。ペレット分画（細胞質封入体）中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐｓ
Ｂ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃｒｏ−
ＥＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘導後に
、細胞培養物１１．当り０．５■のｃｒ。
ＥＢＺＤが産生されたものと推定される。
Ｂｔｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０分取用カラム（６０Ｘ
　２．１　ａ＋＋）を高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅ
ｓ）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦ八）０．１％
を含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画を８■
／Ｉｄの濃度で溶解した。カラムを０．１％ＴＦＡを含
む４０％アセトニトリルで平衡化した。アリコート２ｄ
（タンパク質１６■）を注入し、最終濃度０．１％のＴ
ＦＡを含む水中の４０％アセトニトリル移動相によって
均一に展開を実施した。ＢＰの位置（分画２３）が分か
った後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分画を監
視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであった。
前記の浸透クロマトグラフィーから脳因子（ＣＩＡ）の
見掛けの分子量を計算したところ、約１８ｋＤａｌであ
った。
ＴＳＫ−２５０の　　１　　　クロマトグラフィ−１５
試行からのＴＳＫ−２５０画分２３をプールした（容量
７５ｄ）。プールされた材料を水中０．１％ＴＦＡによ
り２倍に希釈した。この混合物を、水中０．１％ＴＦＡ
によりあらかじめ平衡化されたμｍボンダパック−Ｃ１
ｌｌカラム（７８鵬内径ｘ　３００ｍｍ）に室温にて均
一に注入した。−次溶剤０．１％ＴＦＡと二次溶剤０．
１％ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの朋で直線グラジェ
ントを用いた。グラジェント条件は２０分間に０〜２８
％、１４０分間に２８〜４２％、１０分間に４２〜５２
％、そして次に６分間に５２〜１００％であった。
すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであった。４ｄの両分
を集めた。各両分のアリコートを５０１！ｇのＢＳＡと
共に乾燥し、そしてＣＩＡについてアッセイした。
ＣＩＡの２個のピークを貯蔵した。第１の活性（α）は
３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
１０試行からの活性画分３０及び３１をプールし、そし
て０．１％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμｍボンダパックカラム（７８Ｘ　３００ｍｍ
）に均一に適用し、そしてカラムを０．１％ＴＦＡで洗
浄しそして平衡化した。流速は１戚／分であり、そして
チャートスピードは０．１ｃｍ／分であった。やはり、
第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦへの濃
度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジェントを
用いた。グラジェント条件は、４０分間に０〜３０％、
２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に３８〜１
００％であった。最初の１２画分は６−であり、そして
次に４ｄ画分を集めた。アリコートをＣＩＡについてア
ッセイした。活性は３２〜３３．５％の間のアセトニト
リル濃度において溶出した。
両分３０〜３２をプールした。１２Ｉｄの０．１％ＴＰ
Ａをプールされた両分に加えた。混合物（２４ｔｌ！を
、０．１％ＴＦＡで平衡化された分析用μｍボンダパッ
クｃｐｓカラム（３，９Ｘ　３００ｍｍ）上に均一に適
用した。流速及びチャートスピードはそれぞれ０．４　
ｄ／分及び０．１ｃｍ／分であった。やはり、第１溶剤
０．１％ＴＦＡ　と第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有
するアセトニトリルの間で直線グラジェントを用いた。
グラジェント条件は、２５分間に０〜３０％、２００分
間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％で
あった。２ｄの画分を集めた。両分のアリコートをＧｌ
＾についてアッセイした。活性は分析用Ｃ１１ｌカラム
から、約３４％のアセトニトリル濃度において溶出した
。
画分２９−３１をプールし、そして０．１％ＴＦＡで２
倍に希釈し、そしてμｍボンダパックｃｐｓカラム（３
，！ｊｘ　３００＋ａｍ）に適用した。第１溶剤０．１
％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−
プロパツールとの間の直線グラジェントを用いた。グラ
ジェント条件は、４０分間に０〜１８％、２２５分間に
１８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であった
。流速は０．４ｄ／分であり、そしてチャートスピード
は０．１ｃｍ／分に設定された。画分を集め、そしてア
リコートをＣＩＡについてアッセイした。活性は約２３
％のｎ−プロパツール濃度において溶出した。
両分２８及び２９をプールし、そして０．１％ＴＦＡに
より５倍希釈し、そして０．１％ＴＦＡの濃度を有する
ｎ−プロパツールを第２溶剤として用いてμ−ボンダパ
ックＣｌ１１カラム（３１９ｘ　３００ｍｍ）上で再ク
ロマトグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジ
ェント条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初
の８個の両分は６−であり、そして１．６−の画分を集
めた。各両分のアリコートをＣＩＡについてアッセイし
た。はとんどの活性が両分１５〜１７に現われた。画分
１５〜１７は約１５Ｎの蛋白質及び約２３０　Ｘ　１０
’ユニツトのＣＩＡを含有していた。
この画分をＨＰＬＣ−Ｃ，，５画分とした。最終精製画
分は、ＣＣＬ６４を試験細胞として用いた蛋白質ｎ当り
１５．３３Ｘ１０３ユニツトの比活性を有していた。
次の第４表は結果を要約する。
第４表　ウシ脳因子の精製 粗製物　　３，６８０　　１，５５１　　　０．４２１
ＴＳＫ−２５０６３０２，７６０４，３８ＨＰＬＣ−Ｃ
１８’　　０．０１５　　　　２３０　　　１５．３３
３．ＯＯ１４，８ （ネ） ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジ
ンの取り込みを５０％阻害するために必要な材料アッセ
イはＮｕｎｃ９６ウエルプレート（Ｋａｍｓｔｒｕｐｖ
ｅｊ９０、　ＤＫ−４，０００，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ　、
デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）又
はミンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細胞として使用
した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びペニシリン／
ストレプトマイシン（Ｐ　／　Ｓ　）　（０，５７■／
ｉずつ）及びグルタミンを伴うドルベコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ）　５０　ｄ中３．５×１０３細胞を、端
のウェル以外のすべてのウェルに導入した。端のウェル
には５０１１！のＰＢＳを導入し、そしてプレートを３
７°Ｃにてインキュベートした。
試験サンプルを、１０％ＰＣＳ　、　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４
日後、５０ｄの試験サンプルを各試験ウェルに加え、他
方対照ウェルには５０ｄの培地のみを加えた。プレート
を３７°Ｃにて３日間インキュベートした。４日目に、
１′■−ヨード−２′−デオキシウリジンの溶液（（４
ｃｔ／■−０，５ｍｃｉ　／１ｌｔ１（０，１ｔｌアイ
ソトープ／ｄ、１０％ＦＣ３、Ｐ／Ｓ、グルタミンを含
有するＤＭＥＭ中）１００ｍを各ウェルに加え、そして
プレートトを３７°Ｃにてインキュベートした。５日目
に、培地をウェルから吸引し、２００　ｄのＰＢＳで１
回洗浄した。次に、２００Ｉのメタノールを各ウェルに
加え、プレートを１０分間インキュベートし、そしてメ
タノールを吸引により除去した。水酸化ナトリウム（２
００ｍ、ＬＭ）を各ウェルに加え、プレートを３０分間
３７°Ｃにてインキュベートし、そして次に水酸化ナト
リウムをタイターチック（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ）プラグ（
フロー・ラプス）により取り出した。
プラグを１２　Ｘ　７５ｍｍのプラスチックチューブに
移し、そして放射能を定量測定するためにＴ−カウンタ
ーで計数した。
ソフトアガー・コロニー　　ア　セイ １０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中０．５％寒天（ア
ガーノープル；デイフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン）の２．０　ｍの基層を６０ｍｍのコスタ−組
織培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、１．　
ＯＸＩＯ’　Ａ３４９　Ａｇ３　（ソフトアガー増殖ク
ローン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験されるべき
サンプルを含有する０、３％寒天を加えた。
プレートを空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７°Ｃ
にてインキュベートし、そして７日後に適切な補充物を
含有する０、　３％寒天２．０　ｄの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野５個当り６細胞より多いコロニー
の数を７日及び１４日後に計数した。
コロニー／　′アッセイ このアッセイは６ウエルーフアルコンプレート（９，６
ｄの面積／ウェル）中で行った。へ５４９細胞（２００
）を各ウェル中、１０％ＦＣＳ　、　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＩＩｄのＤＭＥＭ中にプレートした。プレー
トした直後に、１．０　ｄの培地中種々の濃度の試験材
料を２連で加えた。対照ウェルには試験材料をなんら含
まない１．０　ｍｌ！の培地のみを加えた。プレート空
気中５％Ｃ（ｈの加湿雰囲気中３７°Ｃにて１０日間イ
ンキュベートし、５０％メタノール中０．２％メチレン
ブルー１．０１ｄを各ウェルに添加し、そして２０分間
放置し、染料を除去し、そして各ウェルを０．１ｄの水
で２回洗浄し、そして空気乾燥した。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
ま理ヱ亙に！ ＤＮＡ合成の５０％阻害が、それぞれ９８ｘ／ｒＲ１，
２１ｔｒｙ／ｒｔｔｌ及び９５ｎｇ／ｍの粗画分、ＴＳ
Ｋ−２５０画分及び最終純蛋白質において観察された。
従って、Ａ５４９ヒト肺癌細胞における５０％ＤＮＡ合
成阻害が純蛋白質の約９ｎＭ濃度において見られた。
ｂＢＦはまた、寒天（Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞Ａ３４
９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の５０％減少が約７６ｎｇ／ｍｅのｂＢＦに
おいて見られた。Ａ３４９細胞のコロニー形成率はこの
蛋白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／１ｔｄｌ　
（１、２４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形成
率は対照のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約８０
ｎｇ／−のｂＢＦの存在下ではＡ３４９細胞のコロニー
は見られなかった。
Ａ３４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存′在下又は非存
在下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数に
モニターした場合、ｂＢＦは量依存的に細胞増殖を阻害
することが見出された。すなわち、ＤＮＡへの＋２５Ｉ
−デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準
である。
ｂＢＦはＡ３４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５　Ａ
ｇ）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の種々のクローン
の増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（Ｗｌ−２６）
の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、ネズ
ミ線維芽細胞セルライン３Ｔ３−Ａ３１に対して増殖刺
激的である。
ヒトＴ−細胞機能（Ｚａｒｌｉｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｔ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　　４６Ｂ−４
７６）に対する脳因子の効果を研究するために、同種異
系的（ａｌ　ｌｏｇｅｎｅｉｃａｌ　ｌｙ）に誘導され
た増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測
定するためのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘパリン処理血
液から、フィコール−ハイバク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（Ｈ５）が補充されたＲＰ旧１６４０の培地（ギ
プコ、グランドアイル、ＮＹ）中に１×１０６ＰＢＬ／
ｉｄの濃度で懸濁した。次に、ｏ、　ｉ　ｒｄのこれら
のＰＢＬ　［応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅｌ
ｌ）と称する］を９６−ウェルプレートの２連の丸底ウ
ェルのそれぞれに加え、そして次に０．０５ｄの培地の
み又は２Ｘ１０５個のＸ−線照射された（２５００Ｒａ
ｄ）同種異系細胞〔“刺激細胞′″（ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と称する〕を含有する０、０５ｄの
培地、及び０．０５−の培地のみ又は種々の濃度の脳因
子（０，９〜７５ユニツト脳因子／ウエルをもたらす）
を含有する培地を加えた。細胞を５％ＣＯ２インキュベ
ーター中で３７°Ｃにてインキュベートし、そして２日
目及び５日目に０．０５ｍｊ！の培地を各ウェルから取
り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有する培地
０．０５ｄを添加した。
増殖応答を決定するため、６日目に各群からウェルの内
容物をプールし、そして０，１ｄを９６−ウェルプレー
トの４連のウェルのそれぞれに加え、次に０．０２５ｄ
の容量中ｌμＣｉの３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ、ニ
ューイングランドニューフレア、ボストン、ＭＡ）を加
えた。６時間後、ウェルの内容物を多ウェル収得器を用
いてガラスフィルターストリップ上に収得し、これらの
ストリップをシンチルーシゴン液体を含有するバイアル
に移し、そして３Ｈ−ＴｄＲ取り込みをβ−カウンター
中での計数により決定した。
細胞変性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果を決
定するため、６日目にウェルからブー／しされた残りの
リンパ球を９６−ウェルプレートの３連の球底ウェルに
加え（０，１５ｄ／ウエル）、そして０．１５Ｉ１１の
４倍逐次希釈物も３連のウェルのそれぞれに加えた。５
ＩＣｒラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）を
調製するため、同種異系刺激細胞の提供者から生じたリ
ンボブラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞１．５Ｘ１
０６を５００μｃｉ”Ｃｒ（ＮａｚＣｒＯａ＋−ｓ−イ
ングランドニューフレア、ボストン、Ｈ＾）により３７
°Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細胞を１５％熱不活
性化ウシつ児血清（ＦＣＳ）を含有する培地で３回洗浄
し、そしてこの培地に６Ｘ１０’細胞／−で再懸濁した
。次に、０．０５ｄの標的細胞を、エフェクター細胞を
収容する各ウェルに、及び培地のみ〔自然（ｓｐｏｎｔ
ａｎｅｏｕｓ）　”　Ｃｒ放出を決定するため〕又は洗
剤のみ（５１Ｃｒ放出を決定するため）を収容するウェ
ルに加え、そしてプレートを３７°Ｃにて６時間インキ
ュベートした。次に、上清の一定のアリコートを各ウェ
ルから取り出し、そしてＴカウンター中で計数するため
にチューブに移した。特異的５ＩＣｒ放出％を次のよう
にして決定した。
次の第５表が結果を示す。
第５表、ヒトＴ−リンパ球のアロ抗原 誘導増殖応答に対する脳因子の効果 １０３．６９０ ？０，１４０ ６４．５０７ ７８．２８７ ８７．０９５ ９９．５５２ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体Ｖのヘパリン処理
血液から得られ、そして個体ＣからのＸ−線照射された
（　２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ）により
刺激され、そして６日後、３Ｈ−チミジン（３ＨＴｄＲ
）の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
ＣＰＭ　＝カウント／分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬのＴ−細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ−リンパ球
の生成に対して観察された。
同じ量の５１Ｃｒ放出を生じさせる未処理のエフェクタ
ー細胞の数として、７５ユニツトの脳因子と共にインキ
ュベートされた約１６倍多くのエフェクター細胞が４２
％の５ＩＣｒ放出を生じさせるために必要である。
上記の結果から、この発明の化合物はインビトロ及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳を髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形成されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セブターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼバムリセプターもしくはＧＡＢＡ−作動
性リセプターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除
去するために他の添加物と組合わせて使用することがで
きる。脳因子化合物はまた、Ｔ−細胞の増殖の調節のた
めにも使用することができる。ＥＢＺＤ化合物はＥＢＺ
Ｄリセプターの活性を調節するためにも使用することが
できる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １、膜蛋白質と実質的に同一のアミノ酸組成をもつポリ
    ペプチド又はメチオニン３７、６８又は６９で始まるそ
    のフラグメントを含む組成物。
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