JP2002508652A - 新規なヒト増殖因子 - Google Patents

新規なヒト増殖因子

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JP2002508652A JP51080098A JP51080098A JP2002508652A JP 2002508652 A JP2002508652 A JP 2002508652A JP 51080098 A JP51080098 A JP 51080098A JP 51080098 A JP51080098 A JP 51080098A JP 2002508652 A JP2002508652 A JP 2002508652A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なヒト増殖因子である、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3タンパク質に関する。これらのタンパク質は、Xenopus laevisのXAGタンパク質と相同性を共有し、そして結腸組織に見いだされ得る。huXAG-1は、ガン性結腸細胞において特異的に見いだされ、それゆえ大腸ガンの増殖因子であり得る。特に、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法と同様に、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペプチドもまた提供される。本発明はさらに、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法、ならびにこれらのタンパク質の診断的および治療的使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なヒト増殖因子 発明の背景 発明の分野 本発明は、新規なヒト増殖因子に関する。より詳細には、huXAG-1、huXAG-2、 およびhuXAG-3をコードする単離された核酸分子が提供される。huXAG-1、huXAG- 2、およびhuXAG-3ポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、および組 換え方法と同様に、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペプチドもまた提供 される。本発明はさらに、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3活性のアゴニスト およびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法、ならびにhuXAG-1 、huXAG-2、およびhuXAG-3の診断的および治療的使用に関する。 関連技術 増殖因子 細胞分裂の制御は、プログラムされた一連の事象に依存する、多細胞存在物の 基本的な局面である。同定されている細胞増殖およびその制御の１つの因子は、 種々のポリペプチド増殖因子の存在である。増殖因子は、インビトロでの細胞培 養のための増殖培地の必須成分であり、そしてインビボでの細胞生存に関与する 。今日までに同定されているいくつかの増殖因子としては、インビボでの血管系 の修復に関与しているPDGF（血小板由来増殖因子）；外胚葉起源および中胚葉起 源の細胞に分裂促進剤として作用するEGF（表皮性増殖因子）；EGFに類似の分裂 促進剤としてさようするが、正常細胞を寒天中で増殖させ得るTGF-α（トランス フォーミング増殖因子）；いくつかの細胞については分裂促進剤および他の細胞 については増殖インヒビターであるTGF-β（トランスフォーミング増殖因子）； ならびに交感ニューロンおよび胚ニューロンの発生および維持に関与するNGF（ 神経増殖因子）が挙げられる。Watsonら、Molecular Biology of the Gene,975 頁（Benjamin/Cummings 1987）。 特定の細胞型が特定の増殖因子を必要とすることは明らかである。ペプチド増 殖因子は、種々の組織から産生され、そして分泌される。標的細胞は、代表的に は、増殖因子の放出部位に近接して位置する（パラクリン応答）。これらの増殖 促進活性および分化誘導活性に加えて、増殖因子はそれらの標的細胞における広 範な効果を誘発し、そしてこのような炎症、免疫反応、および創傷修復のような プロセスに関与する。Pimentel,E．Handbook of Growth Factors,第１巻：Gener al Basics（CRC Press 1994）を参照のこと。 種々のヒト組織の細胞における増殖因子遺伝子発現のモニタリングは、インビ トロおよびインビボの両方での異常肥大の検出および研究に有用である。さらに 、組織特異的増殖因子の正常より高い発現もののモニタリングは、特定のガンの 早期診断に有用である。 さらに、ポリペプチド増殖因子は、インビトロでの細胞増殖の刺激および細胞 の生存の補助のための非常に重要な細胞培養試薬である。 インビトロおよびインビボの両方での使用のために特定の細胞の増殖を刺激お よび／または阻害するポリペプチドについての探索が存続している。さらに、特 定の細胞または組織型の同定を補助するために定性的に使用され得、そして細胞 、組織、または器官が、特定のポリペプチドのそれらの発現において異常である かどうかを評価するために定性的に使用され得る新規な組織特異的マーカーにつ いての探索が続く。 ほとんどのカエル種における幼生の前面に、小さくかつ粘着性の細胞パッチ（ patch）（セメント腺（cement gland）と称される）が存在する。セメント腺は 、脳および任意の他の神経組織の前方に位置し、そして胚性外胚葉から発生する （Drysdaleら、Dev．Growth Differ．34:51-59(1992)）。セメント腺の形成は、 複数のシグナルによって影響される(Siveら、Dev．Dyn．205:265-280(1996)）。 この様なシグナルの１つはXAGタンパク質であり、これはセメント腺において非 常に高レベルで発現され、そしてより後方の孵化腺（hatching gland）において より低レベルで発現される。これは、咽頭（Jamrichら、Development 105:779-7 86(1989)）および肺原基においてより後期に発現される分泌タンパク質をコード する。 結腸直腸ガン 結腸直腸ガンは、１年あたり多くの人々を冒すガンである。病気の予後は、症 例の約50％と乏しい。なぜなら、腫瘍はしばしば、疾患が広がりそして末期段階 に達するまで検出されないからである。早期診断は、ガンが転移する前に阻止し 、それにより改善された予後を導く機会を増加させるために重要である。 早期腫瘍診断の１つの方法は、特定の腫瘍に特異的なマーカーまたは抗原の存 在の検出である。これらの通常タンパク質様のマーカーは腫瘍によって合成され 、そして血清中および／または腫瘍の表面上に見いだされ得る。これまでのとこ ろ、結腸直腸ガンについては限られた数の腫瘍マーカーしか、臨床的使用を有す ることは見いだされていない。これらは、ガン胎児性抗原（CEA）およびシアル 酸付加（sialyated）Lewis a抗原（CA 19.9）を含む。不運なことに、患者の状 態が結腸直腸ガンとして正確に診断されている患者のうちの約40％は、最初に検 査した場合に、これらの抗原のいずれでも上昇した血漿レベルを有さない。腫瘍 を検出するため、およびこの群について治療をモニターするために使用され得る 市販の血清診断マーカーが必要である。 診断の別の方法は、特定の疾患または状態に関連する遺伝子の存在を検出する ことに関与する。高い危険性の患者における大腸ガンの早期検出のための遺伝的 スクリーニング試験によって検出され得る遺伝的マーカーについての必要性が存 在する。 従って、本発明の目的は、結腸直腸ガンの検出のための新規なマーカーを提供 することである。 本発明の別の目的は、結腸直腸ガンを診断およびモニタリングするのに適切な 新規なマーカーを提供することである。このような新規なマーカーは、ガンを診 断するため、および大腸ガン特異的ポリペプチドの生物学的機能を結合および阻 害するための、大腸ガン特異的ポリペプチドを結合する新規な抗体または他のア ンタゴニストを作製するのにさらに使用され得る。 本発明のさらなる目的は、結腸直腸ガン細胞に関連するマーカーに特異的なア ッセイ方法を用いる、患者における結腸直腸ガンの検出およびモニタリングのた めの方法およびキットを提供することである。 発明の要旨 本発明は、ヒト増殖因子をコードする新規な群の単離された核酸分子を提供す る。この増殖因子は、互いに良好な程度の配列類似性を示す小さな分泌タンパク 質である。 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列または1996年６月27日にATCC受 託番号97641として細菌宿主中で寄託されたcDNAクローンによってコードされる アミノ酸配列を有するhuXAG-1（大腸ガン特異的遺伝子（CCSG）ともいう）ポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する 。ヌクレオチド配列は、寄託されたhuXAG-1クローンを配列決定することによっ て決定された。そしてこの配列は、配列番号１に示される。配列は、約20アミノ 酸残基のリーダー配列を有し、そして約20kDaの推定分子量を有する、約175アミ ノ酸残基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。成 熟huXAG-1のアミノ酸配列を、配列番号２に示す（配列番号２の約１から約155ま でのアミノ酸残基）。 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド 配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（a） 配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するhuXAG-1ポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列；（b）配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するがＮ末端メチ オニン残基を欠いたhuXAG-1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（c） 配列番号２の約１位〜約155位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-1をコード するヌクレオチド配列；（d）ATCC受託番号97641に含まれるcDNAクローンによっ てコードされる完全なアミノ酸配列を有するhuXAG-1ポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列；（e）ATCC受託番号97641に含まれるcDNAクローンによってコ ードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-1ポリペプチドをコードするヌクレ オチド配列；および（f）上記の（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）のヌ クレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。 本発明はまた、配列番号４に示されるアミノ酸配列または1997年６月27日にAT CC受託番号209134として寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有 するhuXAG-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核 酸分子を提供する。寄託されたhuXAG-2クローンを配列決定することによって決 定されたヌクレオチド配列（これは、配列番号３に示される）は、約23アミノ酸 残基のリーダー配列とともに約172アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオ ープンリーディングフレームを含む。成熟huXAG-2のアミノ酸配列を、配列番号 ４に示す（配列番号４の約１から約149までのアミノ酸残基）。 従って、本発明の別の局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配 列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（a）配 列番号４の完全なアミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドをコードするヌク レオチド配列；（b）配列番号４の完全なアミノ酸配列を有するがＮ末端メチオ ニン残基を欠いたhuXAG-2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（c）配 列番号４の約１位から約149位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-2をコード するヌクレオチド配列；（d）ATCC受託番号209134に含まれるcDNAクローンによ ってコードされる完全アミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列；（e）ATCC受託番号209134に含まれるcDNAクローンによって コードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-2ポリペプチドをコードするヌク レオチド配列；および（f）上記の（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）の ヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。 本発明はまた、配列番号６に示されるアミノ酸配列または1997年７月３日にAT CC受託番号209137として寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有 するhuXAG-3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核 酸分子を提供する。寄託されたhuXAG-3クローンを配列決定することによって決 定されたヌクレオチド配列（これは、配列番号５に示される）は、約23アミノ酸 のリーダー配列とともに、約166アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオー プンリーディングフレームを含む。成熟huXAG-3レセプターのアミノ酸配列を、 配列番号６に示す（配列番号６の約１から約143までのアミノ酸残基）。 従って、本発明の別の局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配 列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する：（a）配 列番号６の完全なアミノ酸配列を有するhuXAG-3ポリペプチドをコードするヌク レオチド配列；（b）配列番号６の完全なアミノ酸配列を有するがＮ末端メチオ ニン残基を欠いたhuXAG-3ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（c）配 列番号６の約１位から約143位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-3をコード するヌクレオチド配列；（d）ATCC受託番号209137に含まれるcDNAクローンによ ってコードされる完全なアミノ酸配列を有するhuXAG-3ポリペプチドをコードす るヌクレオチド配列；（e）ATCC受託番号209137に含まれるcDNAクローンによっ てコードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-3ポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列；および（f）上記の（a）、（b）、（c）、（d）、または（e） のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。 本発明のさらなる実施態様は、上記の（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、 もしくは（f）のhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3のヌクレオチド配列のいず れかに少なくとも95％同一、およびより好ましくは少なくとも96％、97％、98％ 、または99％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはス トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の（a）、（b）、（c ）、（d）、（e）、または（f）のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ ヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。このハイブリダイズするポリヌ クレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基の みまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハ イブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（a）、（b） 、（c）、（d）、または（e）のアミノ酸配列を有するhuXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組 換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作 製する方法および組換え技術によるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプ チドまたはペプチドの生成のためにそれらを使用する方法に関する。 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離さ れたhuXAG-1ポリペプチドを提供する：（a）配列番号２に示されるリーダー配列 を含む、完全な175アミノ酸配列を有するhuXAG-1ポリペプチドのアミノ酸配列； （b）配列番号２に示されるリーダー配列を含むがＮ末端メチオニン残基を欠い た、完全な175アミノ酸配列を有するhuXAG-1ポリペプチドのアミノ酸配列；（c ）配列番号２の１位から155位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-1ポリペプ チド（リーダーを含まない）のアミノ酸配列；（d）リーダーを含み、ATCC受託 番号97641に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を 有するhuXAG-1ポリペプチドのアミノ酸配列；および（e）ATCC受託番号97641に 含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-1 ポリペプチドのアミノ酸配列。 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離さ れたhuXAG-2ポリペプチドを提供する：（a）配列番号４に示されるリーダー配列 を含む、完全な172アミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドのアミノ酸配列； （b）配列番号４に示されるリーダー配列を含むがＮ末端メチオニン残基を欠い た、完全な172アミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドのアミノ酸配列；（c ）配列番号４の１位から149位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-2ポリペプ チド（リーダーを含まない）のアミノ酸配列；（d）リーダーを含み、ATCC受託 番号209134に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を 有するhuXAG-2ポリペプチドのアミノ酸配列；および（e）ATCC受託番号209134に 含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-2 ポリペプチドのアミノ酸配列。 本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離され たhuXAG-3ポリペプチドを提供する：（a）配列番号６に示されるリーダー配列を 含む、完全な166アミノ酸配列を有するhuXAG-3ポリペプチドのアミノ酸配列；（ b）配列番号６に示されるリーダー配列を含むがＮ末端メチオニン残基を欠いた 、完全な166アミノ酸配列を有するhuXAG-3ポリペプチドのアミノ酸配列；（c） 配列番号６の１位から143位までのアミノ酸配列を有する成熟huXAG-3ポリペプチ ド（リーダーを含まない）のアミノ酸配列；（d）リーダーを含み、ATCC受託番 号209137に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有 するhuXAG-3ポリペプチドのアミノ酸配列；および（e）ATCC受託番号2091 37に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟huXA G-3ポリペプチドのアミノ酸配列。 本発明のポリペプチドはまた、上記のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリ ペプチドに、少なくとも95％同一、およびより好ましくは少なくとも96％、97％ 、98％、または99％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。 本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（a）、（b）、（c）、（d） 、または（e）に記載のアミノ酸配列を有するhuXAG-1、huHAG-2、またはhuXAG-3 ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリ ペプチドに関する。本発明のhuXAG-1、huHAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドの エピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少 なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、およびより好ましくは少なくと も約30アミノ酸〜約50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。 上記の本発明のポリペプチド全体まで、およびこれを含むアミノ酸配列を含む任 意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれることが理解さ れる。別の実施態様において、本発明は、上記の（a）、（b）、（c）、（d）、 または（e）に記載のアミノ酸配列を有するhuXAG-1、huHAG-2、またはhuXAG-3ポ リペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。 本発明はさらに、本明細書中に記載のアミノ酸配列を有するhuXAG-1、huHAG-2 、またはhuXAG-3ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を 提供する。このような抗体は、以下に記載のように診断的または治療的に有用で ある。 本発明はまた、huXAG-1、huHAG-2、またはhuXAG-3タンパク質によって誘導さ れる細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方 法を提供する。この方法は、huXAG-1、huHAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を発 現する細胞と候補化合物とを接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、お よび細胞応答と標準的な細胞応答とを比較する工程を含み、標準は候補化合物の 非存在下で接触が行われる場合にアッセイされ；それにより、標準を越えて増加 した細胞応答は、化合物がアゴニストであることを示し、そして標準を越えて減 少した細胞応答は、化合物がアンタゴニストであることを示す。 ヒト結腸直腸ガンを検出およモニタリングするための方法は、huXAG-1をコー ドする遺伝子の知見に基づく。このタンパク質は、ヒト結腸直腸ガン由来の細胞 において発現されるが、他のヒト組織においては発現されないことが見いだされ た。第１の実施態様において、この方法は、生物学的サンプル（好ましくは組織 生検）におけるhuXAG-1 nRNA発現のレベルを測定し、そして測定と標準値を比較 する。mRNA発現のレベルは、ノーザンブロット分析、S1ヌクレアーゼマッピング 、およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む、種々の周知の方法によってアッ セイされ得る。 第２の実施態様において、ヒト結腸直腸ガンを検出およびモニタリングする方 法は、生物学的サンプルと、huXAG-1、そのアナログ、または部分と反応する抗 体またはその部分とを接触させる工程、および抗体がサンプルと反応するかどう か観察する工程を含む。生物学的サンプルは、全血、血清、腹水液、組織生検、 腫瘍、組織培養物、またはそれらの組織学的調製物であり得る。抗体は、huXAG- 1ポリペプチド、またはそれらのアナログもしくは抗原性部分に対して惹起され 得る。より詳細には、この抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体 、またはそれらのアナログもしくは部分であり得、これらは好ましくは、CEA、N CA、CA19.9、α-1-酸性糖タンパク質と交差反応しないか、または血液型物質Ａ 、Ｂ、およびＨと交差反応しない。免疫アッセイは、レセプターとサンプルとの 間の反応の程度を観察するのに利用され得る。 患者からの生物学的サンプルにおける腫瘍細胞の診断および同定を可能にする 検出方法もまた、意図される。この方法において、サンプルは、複数の試験の少 なくとも１つに供され、各々の試験は特定の腫瘍マーカーに特異的である。試験 は任意の型のアッセイであり得、好ましくは腫瘍マーカーに特異的な抗体を使用 する免疫アッセイであり得る。試験は、それらの１つが特定のマーカーの存在を 示すまで、連続的に行われ得る。 さらに、腫瘍マーカーに特異的な複数の異なる抗体を含む、結腸直腸ガンにつ いて患者をスクリーニングするためのキットが意図される。これらの抗体は、以 下のマーカーのうちの１つと反応する抗体を含み得る：huXAG-1；CEA；NCA；CA1 9.9；およびα-1-酸性糖タンパク質。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子発現の変更されたレベルに関連する 疾患の診断のための方法もまた提供される。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のレセプターを同定するための方法もまた 、提供される。 本発明のさらなる局面は、身体におけるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3の 活性の増加したレベルを必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法 は、本発明の単離されたhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3ポリペプチドまた はそれらのアゴニストの治療有効量を含む組成物をこのような個体に投与する工 程を含む。 本発明のなおさらなる局面は、身体におけるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG- 3の活性の減少したレベルを必要とする個体を処置するための方法に関し、この 方法は、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3アンタゴニストの治療有効量を含む 組成物をこのような個体に投与する工程を含む。本発明における使用のための好 ましいアンタゴニストは、huXAG-1特異的抗体、huXAG-2特異的抗体、またはhuXA G-3特異的抗体である。 図面の簡単な説明 図１は、huXAG-1のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列 （配列番号２）を示す。タンパク質は、約20アミノ酸残基のリーダー配列（下線 ）および約20kDaの推定分子量を有する。成熟huXAG-1タンパク質の予測されるア ミノ酸配列もまた示す。 図２A〜Bは、huXAG-2のヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸 配列（配列番号４）を示す。タンパク質は、約23アミノ酸残基のリーダー配列（ 下線）を有する。成熟huXAG-2タンパク質の予測されるアミノ酸配列もまた示す 。 図３A〜Bは、huXAG-3のヌクレオチド配列（配列番号５）および推定アミノ酸 配列（配列番号６）を示す。タンパク質は、約23アミノ酸残基のリーダー配列（ 下線）を有する。成熟huXAG-3タンパク質の予測されるアミノ酸配列もまた示す 。 図４A〜Bは、huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3タンパク質のアミノ酸配列と 、Xenopus laevis XAGタンパク質（配列番号７）との間の類似性領域を示す。コ ンセンサス配列を示す（配列番号８）。 図５は、huXAG-1アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル 領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数ならびに表 面確率が示される。「抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図１の約20 から約43まで、約44から約52まで、約61から約72まで、約90から約103まで、約1 13から約125まで、および約138から150までのアミノ酸残基は、huXAG-1タンパク 質の示される高度に抗原性の領域に対応する。図１におけるこれらの高度に抗原 性のフラグメントは、それぞれ配列番号２の以下のフラグメントに対応する：約 -1から約23まで、約24から約32まで、約41から約52まで、約70から約83まで、約 93から約105まで、および約118から約130までのアミノ酸残基。 図６は、図５について上記のような、huXAG-2アミノ酸配列の分析を示す。抗 原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図２の約23から約38まで、約43から 約53まで、約94から約112まで、および約120から138までのアミノ酸残基は、huX AG-2タンパク質の示される高度に抗原性の領域に対応する。図２におけるこれら の高度に抗原性のフラグメントは、それぞれ配列番号４の以下のフラグメントに 対応する：約-1から約15まで、約20から約30まで、約71から約89まで、および約 97から約115までのアミノ酸残基。 図７は、図５について上記のような、huXAG-3アミノ酸配列の分析を示す。「 抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図３の約25から約44まで、約104か ら約155まで、および約132から150までのアミノ酸残基は、huXAG-3タンパク質の 示される高度に抗原性の領域に対応する。図３におけるこれらの高度に抗原性の フラグメントは、それぞれ配列番号６の以下のフラグメントに対応する：約２か ら約21までの、約81から約92まで、および約109から約127までのアミノ酸残基。 詳細な説明 本発明者らは、３つのメンバー：huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3からなる ヒト増殖因子の新規なファミリーを同定した。これらのタンパク質は、Xenopus laevisのXAGタンパク質との相同性を共有しており、これは、胚形成に関与し、 そして成体組織において発現される。増殖因子の過剰発現は、疾患状態（例えば 、ガン）を導き得る。増殖因子の過少発現もまた、例えば、損傷組織において有 害であり得る。 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するhuXAG-1ポリペプチド をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、これはクロ ーン化cDNAを配列決定することによって決定された。配列番号１に示されるヌク レオチド配列は、cDNAクローンを配列決定することによって得られ、これは、19 96年６月27日に、アメリカンタイプカノレチャーコレクション、12301 Park Law n Drive，Rockville，Maryland 20852に寄託され、そして受託番号97641を与え られた。寄託されたクローンは、BamHIおよびAsp718I制限エンドヌクレアーゼ切 断部位を用いて、pBluescript SK(-)プラスミド（Stratagene，LaJolla，CA）に 挿入されている。 本発明はまた、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、これは クローン化cDNAを配列決定することによって決定された。配列番号３に示される ヌクレオチド配列は、cDNAクローンを配列決定することによって得られ、これは 、1997年６月27日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Park L awn Drive，Rockville，Maryland 20852に寄託され、そして受託番号209134を与 えられた。寄託されたクローンは、BclIおよびAsp718I制限エンドヌクレアーゼ 切断部位を用いて、pBluescript SK(-)プラスミド（Stratagene，LaJolla，CA） に挿入されている。 本発明はまた、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するhuXAG-3ポリペプ チドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、これは クローン化cDNAを配列決定することによって決定された。配列番号５に示される ヌクレオチド配列は、cDNAクローンを配列決定することによって得られ、これは 、1997年７月３日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Park L awn Drive，Rockville，Maryland 20852に寄託され、そして受託番号209137を与 えられた。寄託されたクローンは、BamHIおよびAsp718I制限エンドヌクレアーゼ 切 断部位を用いて、pBluescript SK(-)プラスミド（Stratagene，LaJolla，CA）に 挿入されている。 本発明のhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3タンパク質は、Xenopus laevisのX AGタンパク質との配列相同性を共有する（図４）（配列番号７）。 核酸分子 他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定 されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B iosystems，Inc.からのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定 されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、 上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって予想された。従って、この自動 化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知 のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを 含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA 分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％の同一、 より代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.99％の同一である。実際 の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチ によってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の 配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は 、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決 定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿 入または欠失のような点にて始まる配列決定されるDNA分子によって実際にコー ドされるアミノ酸配列とは完全に異なる。 他に示されない限り、本明細書中に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオ キシリボヌクレオチド(A，G，C，およびTと省略される)の配列として示される。 しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「核酸配列」によって、DNA分子ま たはポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてRNA分子 またはポリヌクレオチドにはリボヌクレオチド(A，G，C，およびU)の対応する配 列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシ ヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)によって置き換えられる） が意図される。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される配列 番号１の配列を有するRNA分子との言及は、配列番号１の各デオキシヌクレオチ ドA，GまたはCが、対応するリボヌクレオチドA，G，またはCによって置き換えら れ、そして各デオキシヌクレオチドTが、リボヌクレオチドUによって置き換えら れる配列を有するRNA分子を示すことが意図される。 本明細書中で提供される情報（例えば、配列番号１、配列番号３、または配列 番号５中のヌクレオチド配列）を用いて、huXAG-1ポリペプチド、huXAG-2ポリペ プチド、またはhuXAG-3ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的 なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてmRNAを用い るクローニングcDNAのための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、配 列番号１において記載される核酸分子は、ヒト結腸ガン組織由来のcDNAライブラ リー中で発見された。正常な結腸組織由来であるcDNAライブラリーがスクリーニ ングされる場合、対応する遺伝子配列は見出されなかった。配列番号１のhuXAG- 1 cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、配列番号１中のヌクレオチド配列の71 〜73位で開始コドンを有する175アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープ ンリーディングフレーム、約20アミノ酸残基の予想されるリーダー配列、および 約20kDaの推定分子量を含む。予想される成熟huXAG-1のアミノ酸配列は、アミノ 酸残基１から残基155で配列番号２に示される。 配列番号３に記載される核酸分子は、ヒト微小血管内皮細胞由来のcDNAライブ ラリーにおいて発見された。配列番号３のhuXAG-2 cDNAの決定されたヌクレオチ ド配列は、配列番号３中のヌクレオチド配列の88〜90位で開始コドンを有する17 2アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、約23 アミノ酸残基の予想されるリーダー配列を含む。予想される成熟huXAG-3のアミ ノ酸配列は、アミノ酸残基１から残基149で配列番号４に示される。 配列番号５に記載される核酸分子は、ヒト小腸由来のcDNAライブラリーにおい て発見された。配列番号５のhuXAG-3 cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、配 列番号５中のヌクレオチド配列の49〜51位で開始コドンを有する166アミノ酸残 基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、約23アミノ酸残基 の予想されるリーダー配列を含む。予想される成熟huXAG-3のアミノ酸配列は、 アミノ酸残基１から残基143で配列番号６に示される。 示されるように、本発明はまた、本発明のhuXAG-1タンパク質、huXAG-2タンパ ク質、およびhuXAG-3タンパク質の成熟形態を提供する。一旦粗面小胞体をにそ って伸長しているタンパク質鎖の輸送が開始されると、シグナル仮定に従って、 哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、成熟タンパク質のから切断され るシグナルまたは分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物細胞、および 昆虫細胞さえも、同じ特異性で分泌されるタンパク質を切断する。しかし、いく つかの場合において、分泌されるタンパク質の切断は完全に一様ではなく、その ことは、タンパク質に関して２つ以上の成熟した種を生じる。さらに、分泌され るタンパクの切断特異性は、完全なタンパク質の一次構造によって最終的に決定 される、すなわち、切断特異性はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であること は、長く知られている。従って、本発明は、それぞれ、ATCC寄託番号第97641号 に含まれ、そして配列番号２において示される対応するcDNAクローンによってコ ードされるか；ATCC寄託番号第209134号に含まれ、そして配列番号４において示 される対応するcDNAクローンによってコードされるか；またはATCC寄託番号第20 9137号に含まれ、そして配列番号６において示される対応するcDNAクローンによ ってコードされるアミノ酸配列を有する成熟したhuXAG-1ポリペプチド、huXAG-2 ポリペプチド、およびhuXAG-3ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提 供する。ATCC寄託番号第97641号、ATCC寄託番号第209134号、またはATCC寄託番 号第209137号として同定される宿主中に含まれるcDNAクローンによってコードさ れるアミノ酸配列を有する成熟したhuXAG-1タンパク質、huXAG-2タンパク質、ま たはhuXAG-3タンパク質によって、哺乳動物細胞（例えば、下記のようなCOS細胞 ）における、寄託された宿主中のベクターに含まれるクローンのヒトDNA配列に よってコードされる完全なオープンリーディングフレームの発現によって生成さ れる成熟した形態のhuXAG-1タンパク質、huXAG-2タンパク質、またはhuXAG-3タ ンパク質が意味される。以下に示すように、ATCC寄託番号第97641号、ATCC寄託 番号第209134号、またはATCC寄託番号第209137号に含まれるcDNAクローンによっ てコードされるアミノ酸配列を有する成熟したhuXAG-1タンパク質、huXAG-2タ ンパク質、またはhuXAG-3タンパク質は、コンピューター解析に基づいて予想さ れる切断部位の正確さに依存して、それぞれ、配列番号２（約１〜約155のアミ ノ酸）、配列番号４（約１〜約149のアミノ酸）、または配列番号６（約１〜約1 43のアミノ酸）において示される予想される「成熟した」huXAG-1タンパク質、h uXAG-2タンパク質、またはhuXAG-3タンパク質と異なっていてもよくか、または 異なっていなくてもよい。 タンパク質が、分泌リーダーならびにリーダー配列についての切断点を有する か否かを予想するための方法は利用可能である。なぜなら、分泌タンパク質につ いての切断特異性の多くは、成熟タンパク質のシグナル配列およびＮ末端内の特 定のアミノ酸残基、特に切断部位を近くを囲む残基に常在することが公知である からである。例えば、McGeoch(Virus Res．3:271-286(1985))の方法は、短いＮ 末端帯電領域、およびその後の完全な（切断されていない）タンパク質の非帯電 領域からの情報を用いる。von Heinje(Nucleic Acids Res．14:4683-4690(1986) )の方法は、切断部位を囲む残基、代表的には残基-13から+2からの情報を用い、 ここで+1は、成熟タンパク質のアミノ酸末端を示す。これらの方法の各々のため の公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断部位を予想する正確さは、75〜80％の範 囲内である。von Heinje、前出。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質につ いていつも同じ予想される切断点を生じるとは限らない。 huXAG-1タンパク質についてのリーダー配列は、配列番号２中のアミノ酸残基- 20〜-1からなることが予想されるが、予想される成熟huXAG-1タンパク質は、残 基１〜155からなり；huXAG-2タンパク質についてのリーダー配列は、配列番号４ 中のアミノ酸残基-23〜-1からなることが予想されるが、予想される成熟huXAG-2 タンパク質は残基１〜149からなることが予想され；そして、huXAG-3タンパク質 についてのリーダー配列は、配列番号６中のアミノ酸残基-23〜-1からなること が予想されるが、予想される成熟huXAG-3タンパク質は残基１〜143からなること が予想される。 当業者が理解するように、上記の配列決定誤差の可能性、ならびに異なる公知 のタンパク質におけるリーダーの切断部位の可変性に起因して、寄託されたcDNA によってコードされる予想されるhuXAG-1ポリペプチドは、約175のアミノ酸を含 むが、165〜185の範囲のアミノ酸で任意の場所であり得；そして、huXAG-1の予 想されるリーダー配列は約20アミノ酸であるが、約15〜約25アミノ酸の範囲で任 意の場所であり得る。寄託されたcDNAによってコードされる予想されるhuXAG-2 ポリペプチドは、約172のアミノ酸を含むが、167〜177の範囲のアミノ酸で任意 の場所であり得；そして、huXAG-2の予想されるリーダー配列は約23アミノ酸で あるが、約18〜約28アミノ酸の範囲で任意の場所であり得る。寄託されたcDNAに よってコードされる予想されるhuXAG-3ポリペプチドは、約166のアミノ酸を含む が、161〜171の範囲のアミノ酸で任意の場所であり得；そしてhuXAG-3の予想さ れるリーダー配列は約23アミノ酸であるが、約18〜約28アミノ酸の範囲で任意の 場所であり得る。 示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD NAの形態（例えば、クローニングによって得られるか、または合成的に生成され るcDNAおよびゲノムDNAを含む）であり得る。DNAは、二本鎖または一本鎖であり 得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得 るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得 る。 「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子（DN AまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、 本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたDNA分子のさら なる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶液中の 精製された（部分的または実質的）DNA分子を含む。単離されたRNA分子は、本発 明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明に従って 単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。 本発明の単離される核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の71 〜73位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム(ORF)を含むDNA分子 ；図１（後部の155アミノ酸）（配列番号２）において示される成熟huXAG-1タン パク質についてのコード配列を含むDNA分子；配列番号３に示されるヌクレオチ ド配列の88〜90位に開始コドンを有するオープンリーディングフレーム(ORF)を 含むDNA分子；図２（後部の149アミノ酸）（配列番号４）において示される成 熟huXAG-2タンパク質についてのコード配列を含むDNA分子；配列番号５に示され るヌクレオチド配列の49〜51位に開始コドンを有するオープンリーディングフレ ーム(ORF)を含むDNA分子；図３（後部の143アミノ酸）（配列番号６）において 示される成熟huXAG-3タンパク質についてのコード配列を含むDNA分子；および上 記のものとは実質的に異なる配列を含むが、遺伝暗号の縮重に起因してなおhuXA G-1タンパク質、huXAG-2タンパク質、またはhuXAG-3タンパク質をコードするDNA 分子を含む。当然のことながら、遺伝暗号は当該分野において周知である。従っ て、上記の縮重した変異体を生成することは、当業者にとって日常的である。 別の局面において、本発明は、1996年６月27日にATCC寄託番号第97641号とし て寄託されたプラスミドに含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸 配列を有するhuXAG-1ポリペプチドをコードする単離される核酸分子；1997年６ 月27日にATCC寄託番号第209134号として寄託されたプラスミドに含まれるcDNAク ローンによってコードされるアミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドをコー ドする単離される核酸分子；および1997年７月３日にATCC寄託番号第209137号と して寄託されたプラスミドに含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ 酸配列を有するhuXAG-3ポリペプチドをコードする単離される核酸分子を提供す る。さらなる実施態様において、成熟したhuXAG-1ポリペプチド、huXAG-2ポリペ プチド、もしくはhuXAG-3ポリペプチド、またはＮ末端メチオニンを欠く完全長h uXAG-1ポリペプチド、huXAG-2ポリペプチド、またはhuXAG-3ポリペプチドをコー ドする核酸分子が提供される。 本発明はさらに、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５において示さ れるヌクレオチド配列、または上記の寄託されたクローンに含まれるhuXAG-1 cD NA、huXAG-2 cDNA、もしくはhuXAG-3 cDNAのヌクレオチド配列を有する単離され る核酸分子、あるいは上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供 する。そのような単離される分子、特にDNA分子は、染色体とのインサイチュハ イブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのため、および例えばノーザンブ ロット分析によるヒト組織中のhuXAG-1遺伝子、huXAG-2遺伝子、またはhuXAG-3 遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。 本発明は、さらに、本明細書中で記載される単離した核酸分子のフラグメント に関する。寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号３ 、もしくは配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子 のフラグメントによって、本明細書中で考察されるように、診断的プローブおよ びプライマーとして有用である、長さが、少なくとも約15nt、そしてより好まし くは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらに より好ましくは少なくとも約40ntのフラグメントが意図される。当然のことなが ら、長さがより大きなフラグメント50，100，150，200，250，300，350，400， または450ntもまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または配列番号１、 配列番号３、または配列番号５において示されるようなヌクレオチド配列のすべ てではなくともほとんどに対応するフラグメントのように、本発明に従って有用 である。例えば、長さが少なくとも20ntのフラグメントによって、寄託されたcD NAのヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５に 示されるようなヌクレオチド配列からの20以上の隣接した塩基を含むフラグメン トが意図される。この遺伝子が寄託され、そして配列番号１、配列番号３、およ び配列番号５において示されるヌクレオチド配列が提供されるので、そのような DNAフラグメントを生成することは、当業者にとって日常的である。例えば、制 限工ンドヌクレアーゼ切断、または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフ ラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、そのようなフラグ メントは、合成的に生成され得る。 本発明のさらに好ましい核酸フラグメントは、huXAG-1タンパク質、huXAG-2タ ンパク質、およびhuXAG-3タンパク質のエピトープ保有部分をコードする核酸分 子を含む。特に、本発明のそのような核酸フラグメントは、以下をコードする核 酸分子を含む：配列番号２中の約-1〜約23のアミノ酸残基を含むポリペプチド； 配列番号２中の約24〜約32のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２中の 約41〜約52のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２中の約70〜約83のア ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２中の約93〜約105のアミノ酸残基を 含むポリペプチド；配列番号２中の約118〜約130のアミノ酸残基を含むポリペプ チド；配列番号４中の約-1〜約15のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ４中の約20〜約30のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４中の約71〜約 89のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４中の約97〜約115のアミノ酸 残基を含むポリペプチド；配列番号６中の約２〜約21のアミノ酸残基を含むポリ ペプチド；配列番号６中の約81〜約92のアミノ酸残基を含むポリペプチド；およ び配列番号６中の約109〜約127のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者ら は、上記のポリペプチドフラグメントが、huXAG-1タンパク質、huXAG-2タンパク 質、およびhuXAG-3タンパク質の抗原性領域であることを決定した。huXAG-1タン パク質、huXAG-2タンパク質、およびhuXAG-3タンパク質の他のそのようなエピト ープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。 さらに、本発明者らは、配列番号１の部分に関連する以下のcDNAクローンを同 定した：HE2DM19R（配列番号９）、HPFDA02R（配列番号10）、HBGDA10R（配列番 号11）、HBGDA22R（配列番号12）、HBGDA34R（配列番号13）、HBGDA58R（配列番 号14）、およびHBGDA46R（配列番号15）。 配列番号１の部分に関連する以下の公的なESTもまた同定した：GenBank寄託番 号第AA244356号（配列番号35）；GenBank寄託番号第T86663号(配列番号36)；Gen Bank寄託番号第AA055880号(配列番号37)；GenBank寄託番号第T24475号(配列番号 38)；およびGenBank寄託番号第T24892号（配列番号39）。 本発明者らはまた、配列番号３の部分に関連する以下のcDNAクローンを同定し た：HJPAJ39R(配列番号16)、HPASG11R(配列番号17)、HOSBP40R(配列番号18)、HT EAK67R(配列番号19)、HLQBB65R（配列番号20）、HLQBB77R(配列番号21)、および HJPAC37R(配列番号22)。配列番号３の部分に関連する公的なESTの数は、GenBank に列挙される。 配列番号５の部分に関連する以下の公的なESTを同定した：GenBank寄託番号第 T94990号（配列番号40）；およびGenBank寄託番号第T94936号(配列番号41)。 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条 件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC寄託第97641号、またはATCC寄 託番号第209134号、またはATCC寄託番号第209137号中に含まれるcDNAクローン） 中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離 した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」 によって、括弧内を含む溶液（50％ホルムアミド、５×SSC（150mMのNaCl、15mM のクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハート 液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サケ精子DNA）中42℃での 一晩のインキュベーション、続く約65℃にて0.1×SSCにおいてフィルターを洗浄 することが意図される。 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって 、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ま しくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさら により好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまた はRNAのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考 察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。 当然のことながら、参照のポリヌクレオチド（例えば、寄託されたcDNAクロー ン）のより大きな部分（例えば、長さが50，100，150，200，250，300，350，40 0，または450ntの部分）、または参照のポリヌクレオチドの完全長とまでもハイ ブリダイズするポリヌクレオチドはまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列ま たは配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５に示されるようなヌクレオチ ド配列のすべてではなくともほとんどに対応するポリヌクレオチドのように、本 発明に従ったプローブとして有用である。例えば、「長さが少なくとも20nt」の ポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 （例えば、寄託されたcDNA、または配列番号１、配列番号３、または配列番号５ に示されるようなヌクレオチド配列）からの20以上の隣接したヌクレオチドが意 図される。示されるように、そのような部分は、従来のDNAハイブリダイゼーシ ョン技術に従ったプローブとして、または例えば、Molecular Cloning，A Labor atory Manual，第２版、Sambrook，J.，Fritsch，E．F.、およびManiatis，T.編 、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY（1989）(そ の全開示は、本明細書中において参考として援用される)に記載されるようなポ リメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的配列の増幅のためのプライマーとしてのい ずれかで診断的に有用である。 huXAG-1 cDNAクローン、huXAG-2 cDNAクローン、およびhuXAG-3 cDNAクローン は寄託されており、そしてそれらの決定されたヌクレオチド配列が配列番号１、 配列番号３、および配列番号５それぞれにおいて提供されるので、huXAG-1 cDNA 分子、huXAgG-2 cDNA分子、およびhuXAG-3 cDNA分子の一部にハイブリダイズす るポリヌクレオチドを生成することは、当業者に日常的である。例えば、huXAG- 1 cDNAクローン、huXAG-2 cDNAクローン、またはhuXAG-3 cDNAクローンの制限エ ンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、huXAG-1 cDNA分子、huXAG-2 cDNA分子、またはhuXAG-3 cDNA分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチ ドである種々のサイズのDNA部分を生成するために容易に使用され得る。あるい は、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成 的に生成され得る。当然のことながら、ポリA配列（例えば、それぞれ、配列番 号１、配列番号３、および配列番号５に示されるhuXAG-1 cDNA、huXAG-2 cDNA、 およびhuXAg-3 cDNAの3'末端ポリ(A)付加物）にのみ、またはT(またはU)の相補 的な部分(stretch)にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の 一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれ ない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、poly(A)伸長またはその相補 物を含む任意の核酸分子（例えば、特に任意の二本鎖cDNAクローン）にハイブリ ダイズする。 示されるように、huXAG-1ポリペプチド、huXAG-2ポリペプチド、またはhuXAG- 3ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含むが、それらに限定 されない：それ自体によって、成熟ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分 子；成熟したポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、huXAG-1 の約20アミノ酸リーダー配列あるいは分泌配列、またはhuXAG-2の約23アミノ酸 リーダー配列あるいは分泌配列、またはhuXAG-3の約23アミノ酸リーダー配列あ るいは分泌配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタ ンパク質配列またはプレプロタンパク質配列）；成熟ポリペプチドのコード配列 で、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まず、更なる非コード配列とと もに集まっており、この配列はイントロンおよび非コード5'および3'配列（例え ば、転写、mRNAプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（ 例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性）を含む）において役割を担う転写 非翻訳配列）を含むがこれらに限定されない；さらなる機能性を提供するよう なさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、ポリペプチドを コードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容 易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定 の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ-ヒスチジンペ プチド（例えば、pQEベクター(Qiagen，Inc.)において提供されるタグ）、他の 中では、それらの多くは市販である。例えば、Gentzら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合 タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集 素タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであ り、それは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されている。以下で考 察されるように、他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてFcに融 合されるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3を含む。 本発明は、さらに、huXAG-1タンパク質、huXAG-2タンパク質、またはhuXAG-3 タンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変 異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。 「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝 子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。Genes II，Lewin，B.編、J ohn Wiley & Sons，New York(1985)。天然に存在しない変異体は、当該分野で公 知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 このような改変体としては、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって 産生された改変体が挙げられる。置換、欠失、または付加は、１つ以上のヌクレ オチドを含み得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方にお いて変化され得る。コード領域における変化は、保存的もしくは非保存的なアミ ノ酸の置換、欠失、または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、hu XAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質、またはその部分の特性および活 性を変化させない、サイレントな置換、付加、および欠失である。また、このこ とについて特に好ましいのは保存的置換である。最高に好ましいのは、配列番号 ２、配列番号４、もしくは配列番号６に示されるアミノ酸配列；または寄託され たcDNAクローンによってコードされる成熟huXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3 のアミノ酸配列を有する成熟タンパク質をコードする核酸分子である。 本発明のさらなる実施態様は、(a)配列番号２、配列番号４、または配列番号 ６中のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(b) 配列番号２、配列番号４、または配列番号６中のアミノ酸配列を有するが、Ｎ末 端メチオニンを欠如しているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(c) 配列番号２中のほぼ１位〜ほぼ155位、配列番号４中のほぼ１位〜ほぼ149位、ま たは配列番号６中のほぼ１位〜ほぼ143位のアミノ酸配列を有するポリペプチド をコードするヌクレオチド配列；(d)ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号20 9134、またはATCC受託番号209137に含まれるcDNAクローンによってコードされる アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；(e)それぞ れ、ATCC受託番号97641、ATCC受託番号209134、またはATCC受託番号209137に含 まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟huXAG-1、h uXAG-2、もしくはhuXAG-3ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるい は（f）(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)のヌクレオチド配列のいずれかに相補的 なヌクレオチド配列と、少なくとも95％同一、そしてより好ましくは少なくとも 96％、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ ドを含む単離された核酸分子を含む。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチ ド配列と少なくとも、例えば、95％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌ クレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXA G-3ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり ５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配 列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチ ド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド を得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るかもし くは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチ ドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列の これらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置でか、または参 照配列内のヌクレオチドの中で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続し た群でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。 実際には、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１、配列番号３、また は配列番号５に示されるヌクレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌク レオチド配列に少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかど うかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Scienc e Drive，Madison，WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを用い て従来通りに決定され得る。Bestfitは、SmlthおよびWaterman，Advances in Ap plied Mathematics．2:482-489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２ つの配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。Bstfitまたは任意の他の配列 整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に95％ 同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が 、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の 総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設 定される。 本出願は、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性を有するポリペプチドをコ ードするか否かに関係なく、配列番号１、配列番号３、または配列番号５におい て示される核酸配列または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも95％、96％、 97％、98％、または99％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子 がhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性を有するポリペプチドをコードしない 場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼー ションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用す るかをなお知るからである。huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性を有するポ リペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ(1)huXAG -1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子またはその対立遺伝子変異体をcDNAライブラ リーから単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosomes:A Manual of Basic Te chniques，Pergamon Press，New York(1988)に記載の、huXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に 対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、FISH)；および、(3)特 定の組織におけるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 mRNA発現を検出するための ノーザンブロット分析、が挙げられる。 しかし、実際に、huXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質活性を有す るポリペプチドをコードする配列番号１、配列番号３、または配列番号５におい て示される核酸配列、あるいは寄託されたcDNAの核酸配列に少なくとも95％、96 ％、97％、98％、または99％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。「hu XAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性を有するポリペプチド」によって、特定の 生物学的アッセイにおいて測定される場合、本発明のhuXAG-1、huXAG-2、または huXAG-3タンパク質（全長タンパク質、または好ましくは成熟タンパク質のいず れか）の活性と類似する（しかし、必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプ チドが意図される。huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性を測定するために、 細胞増殖アッセイが使用され得る。huXAG-1については、ガン性結腸細胞が使用 され得る。huXAG-2については、微小血管内皮細胞、ならびにhuXAG-2に応答性で ある他の細胞が使用され得る。huXAG-3については、結腸細胞ならびにhuXAG-3に 反応する他の細胞が使用され得る。当該分野で周知である細胞増殖アッセイを実 施するためのいくつかのプロトコルが存在する。代表的には、ヌクレオシドアナ ログの新たに合成されるDNAへの取り込みが、細胞の集団における増殖（活発な 細胞増殖）を測定するために用いられる。例えば、ブロモデオキシウリジン(Brd U)が、DNA標識試薬として用いられ得、そして抗BrdUマウスモノクローナル抗体( クローンBMC 9318 IgG1)が、検出試薬として用いられ得る。この抗体は、ブロモ デオキシウリジンを取り込んだDNAを含む細胞のみに結合する。多数の検出方法 が、このアッセイとともに使用され得、それには免疫蛍光法、免疫組織化学法、 E1、ISA、および比色定量法が含まれる。ブロモデオキシウリジン(BrdU)および 抗BrdUマウスモノクローナル抗体を含むキットは、Boehringer Mannheim(Indian apolis，IN)から市販されている。 従って、「huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質活性を有するポリペ プチド」は、適切な上記のアッセイにおいてhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 活性を示すポリペプチドを含む。活性の程度は、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXA G-3タンパク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは、「huXAG-1、huXA G-2、またはhuXAG-3タンパク質活性を有するポリペプチド」は、huXAG-1、huXAG -2、またはhuXAG-3タンパク質と比較して実質的に類似の活性を示す（すなわち 、候補ポリペプチドは、参照のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質に 比較してより高い活性、または約20倍以下低い活性、および好ましくは約10倍以 下低い活性を示す。） もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配 列、または配列番号１、配列番号３、または配列番号５に示される核酸配列に少 なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核 酸分子が「huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質活性を有する」ポリペ プチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列 の縮重改変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、これは上記の比較ア ッセイを実施することなしでさえ当業者に明らかである。縮重改変体でないその ような核酸分子について、合理的な数がまたhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認 識される。これは、当業者が、タンパク質の機能により低い有意性で影響しそう であるか、または有意には影響しそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例え ば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知ってい るからである。 例えば、どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関す るガイダンスは、Bowie，J.U.ら，「Deciphering the Message in Protein Sequ ences:Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Science 247:1306-1310(199 0)に提供される。ここで著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究する ための２つの主要なアプローチが存在することを示す。第一の方法は、進化のプ ロセスに依存し、ここで変異は、自然淘汰によって受容されるか拒絶されるかの いずれかである。第二のアプローチは、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ 酸変化を導入するために遺伝子操作を、そして機能を維持する配列を同定するた めに選択またはスクリーニングを用いる。著者らが述べるように、これらの研究 は、タンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにしている 。著者らは、どのアミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置で許容性であり そうであるかをさらに示している。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は非 極性側鎖を必要とし、一方表面の側鎖の特性は一般的にわずかしか保存されてい ない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Bowie，J.U.ら,前出およ びその中に引用される参考文献に記載される。 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるhuXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。 組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクショ ン(transvection)、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技 術を用いて宿主細胞に導入され得る。ベクターは、例えば、ファージベクター、 プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり 得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者 の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター に結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物の ような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクター がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。 目的のポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含むベクターが好まし い。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給される得るか、相補ベクタ ーによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供 給され得る。 この事に関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは、誘導性および ／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供する。このようなベクター の中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが 容易である環境因子によって誘導性のベクターである。 本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベ クター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオフ ァージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロ ウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポック スウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの 組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられ る。 DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファー ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ イルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終 結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む 。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは翻訳される べきポリペプチドの始めに翻訳開始を含み、そして終わりに適切に位置される終 止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー を含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉 酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における 培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙 げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli細胞、 Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵 母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞） ；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；ならびに 植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切 な培養培地および条件は当該分野で公知である。 細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9 （Qiagenから入手可能）;pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベク ター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにpt rc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pR1T5（Pharmaciaから入手可能）が含ま れる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、お よびpSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL （Pharmacicaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明 らかである。 本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、E.coli lacI およびlacZプロモーター、T3プロモーターおよびT7プロモーター、gptプロモー ター、λPRプロモーターおよびλPLプロモーター、ならびにtrpプロモーターが 含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSV チミジンキナーゼプロモーター、初期SV40プロモーターおよび後期SV40プロモー ター、レトロウイルスLTRのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)の プロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタ ロチオネインIプロモーター）が挙げられる。 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクシ ョン、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたら され得る。このような方法は、Davisら，Basic Methods in Molecular Biology( 1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクタ ー中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは 、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通 常約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては 、SV40エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の100〜270bpに位置される） 、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上 のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。 翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔内へか、周辺質空間内へか、または細胞 外環境内への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中 に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得るか、ま たはそれらは異種シグナルであり得る。 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし て分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付 加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、 または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリ ペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするた めにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製 の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善す るため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は 、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タン パク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。 例えば、EP-A-0 464 533（また、カナダ対応出願2045869)は、別のヒトタンパク 質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融 合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、治療およ び診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学 的特性を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用について、融合タンパ ク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後に Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療および診断にお ける使用の妨害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための 抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばhIL-5のよ うなヒトタンパク質は、hIL-5のアゴニストを同定するための高処理能力スクリ ーニングアッセイの目的でFc部分と融合されている。D.Bennettら，Journal of Molecular Recognition Vol．8:52-58(1995)、およびK.Johansonら，The Journa l of Biological Chemistry Vol.270 No.16:9459-9471(1995)を参照のこと。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質は、硫安沈殿またはエタノール 沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ ースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチ ンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され 、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC 」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化 学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細 胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換 え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主 に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリ コシル化され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿 主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。 huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、ATCC受託番号97641内のcDNAによってコードされるアミノ酸 配列、もしくは配列番号２におけるアミノ酸配列を有する単離されたhuXAG-1ポ リペプチド、または上記のポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプ チドを提供する。本発明はまた、ATCC受託番号209134内のcDNAによってコードさ れるアミノ酸配列、もしくは配列番号４におけるアミノ酸配列を有する単離され たhuXAG-2ポリペプチド、またはその一部を含むペプチドもしくはポリペプチド を提供する。本発明はさらに、ATCC受託番号209137内のcDNAによってコードされ るアミノ酸配列、もしくは配列番号６におけるアミノ酸配列を有する単離された huXAG-3ポリペプチド、またはその一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを 提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、（通常認識されるよ うに）同義語と考えられ、そして各用語は、文脈がペプチド結合によって結合さ れた少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すことを必要とする場合、交換可能に使 用され得る。用語「ポリペプチド」は、10より多いアミノ酸残基を含む鎖に対し て本明細書中で使用される。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプ チドの式または配列は、左から右へ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端の方 向に書かれる。 huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が 、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく改変され得ること が、当該分野で認識される。配列内のこのような差異が意図される場合、活性を 決定するタンパク質の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。一般 的に、類似の機能を実行する残基が使用される場合、三次構造を形成する残基の 置換が可能である。他の例において、残基の型は、変化がタンパク質の重要でな い領域で生じる場合、全く重要でないかもしれない。 従って、本発明は、さらに、実質的なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリ ペプチド活性を示すか、または下記に考察されるタンパク質部分のようなhuXAG- 1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質の領域を含むhuXAG-1、huXAG-2、およ びhuXAG-3ポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆 転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しか し通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む。小さな 変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響 しない。 代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびI leの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Serおよ びThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間の置 換、塩基性残基1、ysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間の置換 である。 上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントで ありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に 関するさらなるガイダンスは、Bowie，J.U.ら「Deciphering the Message in Pr otein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Science 247:130 6-1310(1990)に見出され得る。 従って、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のポリペプチドまたは 寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、もし くはアナログは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ 酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような 置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであるかそうで なくてもよく、または（ii）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、また は（iii）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例 えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されるもの、または （iv）さらなるアミノ酸が、IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーまたは分泌 配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に使用される配 列のような成熟ポリペプチドに融合されるもの、であり得る。このようなフラグ メント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であ ると考えられる。 特に興味深いものは、別の荷電したアミノ酸での、および中性または負電荷の アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。後者は減少した正電荷を有するタ ンパク質を生じ、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のタンパク質の特徴を改良 する。凝集の防止が高度に所望される。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じ るだけでなく、それらは免疫原性であり得るので、薬学的処方物を調製する場合 にも問題であり得る（Pinckardら、Clin Exp.Immunol．2:331-340（1967）;Robb insら、Diabetes 36:838-845（1987）;Clelandら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377（1993））。 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。 Ostadeら、Nature 361:266-268（1993）は、２つの既知の型のTNFレセプターの １つのみへのTNF-αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。従って、本 発明のhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3は、天然の変異または人工操作のいず れかに由来する１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。 示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的 アミノ酸置換のような、小さな性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。 表１。保存的アミノ酸置換体。 当然、当業者が作製するアミノ酸置換体の数は多くの因子に依存し、上記のも のを含む。一般には、所定のhu-XAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドに ついての置換体の数は、50、40、30、20、10、５、または３より多くはない。 機能に必須である、本発明のhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3のタンパク質 におけるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニン走査型変異誘発のよう な当該分野に公知の方法により同定され得る（CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085（1989））。後者の手順は、分子内の全ての残基に１つのアラニ ン変異を導入する。次いで得られる変異分子は、レセプター結合あるいはインビ トロまたはインビトロ増殖活性のような生物学的活性について試験される。リガ ンド-レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和 性標識のような構造分析により決定され得る（Smithら、J.Mol.Biol．224:899-9 04（1992）およびde Vosら、Science 255:306-312（1992））。 本発明のポリペプチドは、単離形態において好ましくは提供される。「単離さ れたポリペプチド」により、その天然の環境から除去されたポリペプチドが意図 される。従って、組み換え宿主細胞内で産生され、そして／またはその細胞内に 含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。また 、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主細胞または天然の供給源から、部 分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドが意図される。例えば、組換え的 に産生されたバージョンのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドは、S mithおよびJohnson,Gene 67:31-40（1988）に記載される一工程方法により実質 的に精製され得る。 本発明のポリペプチドには、リーダーを含む寄託されたcDNAによりコードされ るポリペプチド；リーダーを含まない寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポ リペプチド（すなわち、成熟タンパク質）；配列番号２の約-20〜約155のアミノ 酸を含むポリペプチド；配列番号２の約-19〜約155のアミノ酸を含むポリペプチ ド；配列番号２の約１〜約155のアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号４の約- 23〜約149のアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号４の約-22〜約149のアミノ 酸を含むポリペプチド；配列番号４の約１〜約149のアミノ酸を含むポリペプチ ド；配列番号６の約-23〜約143のアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号６の約 -22〜約143のアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号６の約１〜約143のアミノ 酸を含むポリペプチド、ならびに寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチ ドに、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のポリペプチドに、少なくと も95％同一、そしてより好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％同 一であるポリペプチドが含まれ、そしてさらに少なくとも30アミノ酸、そしてよ り好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの一部が含 まれる。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なく とも、例えば、95％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリ ペプチド配列がhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドの参照アミノ酸 配列の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポ リペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換え れば、参照アミノ酸配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプ チドを得るために、参照配列において５％までのアミノ酸残基が欠失されるかも しくは他のアミノ酸と置換され得、または参照配列における５％までの総アミノ 酸残基の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は 、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参 照配列内または参照配列内の１つ以上の近接した基内の残基間のいずれかで個々 に散在したこれらの末端位置の間のどこかで、起こり得る。 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２、配列番号４、 または配列番号６に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによ りコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも95％、96％、97％、98％、ま たは99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Anal ysis Package，Version8 Unix版、Genetics Computer Group，University Resea rch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュー タープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発 明の参照配列に95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意 の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の割合が参 照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の 総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設 定される。 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲルまたは分 子篩いゲル濾過カラムでの分子量マーカーとして使用され得る。 下記に詳細に示すように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体 およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。これらは、下記のよ うにhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のタンパク質発現を検出するためのアッ セイにおいて有用であるか、またはhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3のタン パク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有 用である。さらに、このようなポリペプチドは、本発明の候補アゴニストおよび アンタゴニストでもあるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質の結合タ ンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され 得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245-24 6（1989）に記載されている。 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を 含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ 部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免 疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原性である場合、抗体応答を誘発 するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子 上の２、３の座位に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得る タンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の 免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例 えば、Geysenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002（1983）を参照の こと。 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が 結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一 部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応 する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli ffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.（1983）Antibodies that react with predetermined sites on proteins．Science 219:660-666(1983)を 参照のこと。タンパク質-反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一 次配列に頻繁に存在し、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得 、そしてインタクトなタンパク質（すなわち、免疫原性エピトープ）の免疫ドミ ナント領域にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。極度 に疎水性であるペプチドおよび６以下の残基のペプチドは、一般には、模倣タン パク質に結合する抗体の誘導に効果がなく；より長い、ペプチド、特にプロリン 残基を含むペプチドは、通常は有効である。Sutcliffeら、前出、661。例えば、 これらのガイドラインに従って設計された20のペプチドのうち18（インフルエン ザウイルス赤血球凝集素HA1ポリペプチド鎖の配列の75％を覆う8-39残基を含む ）は、HA1タンパク質またはインタクトなウイルスと反応する抗体を誘導した； そしてMuLVポリメラーゼからの12/12ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質からの1 8/18はそれぞれのタンパク質を沈澱させる抗体を誘導した。 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本 発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起す るのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナー からの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然の タンパク質と反応性がある抗体を分泌する。Sutcliffeら、前出、663。抗原性エ ピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパ ク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳後 プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使 用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸 ）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので 、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的ま たは定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、 Wilsonら、Cell 37:767-778（1984）777を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体 もまた、模倣タンパク質の精製（例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸 着クロマトグラフィーにより）に有用である。 上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチ ドまたはポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に 含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約 15〜約30アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸 配列の約30〜約50アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発 明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチ ドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドであると考えら れ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ま しくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水溶液中で実質的な溶解性 を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、 そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む 配列が特に好ましい。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3特異的抗体を産生するために使用され得る 抗原性ポリペプチドまたはペプチドの非限定的な例には、配列番号２における約 -1〜約23のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約24〜約32の アミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約41〜約52のアミノ酸残 基を含むポリペプチド；配列番号２における約70〜約83のアミノ酸残基を含むポ リペプチド；配列番号２における約93〜約105のアミノ酸残基を含むポリペプチ ド；配列番号２における約118〜約130のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列 番号４における約-1〜約15のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４にお ける約20〜約30のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約71〜 約89のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４における約97〜約115のア ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６における約２〜約21のアミノ酸残基 を含むポリペプチド；配列番号６における約81〜約92のアミノ酸残基を含むポリ ペプチド；配列番号６における約109〜約127のアミノ酸残基を含むポリペプチド が挙げられる。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメント がhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3のタンパク質の抗原性領域であることを決 定した。 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を 使用する組換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の 従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、 組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化 の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピト ープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例え ば、Houghtenは、４週間未満で、調製されそして特徴付けられた（ELISA-タイプ 結合研究により）HA1ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を示す1 0〜20mgの248の異なる13残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡 単な方法を記載している。Houghten，R.A.（1985）General method for the rap id solid-phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of ant igen-antibody interaction at the level of individual amino acids．Proc． Natl．Acad．Sci．USA 82:5131-5135。この「Simultaneous Multiple Peptide S ynthesis（SMPS）」プロセスは、さらにHoughtenら（1986）の米国特許第4,631, 211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための 個々の樹脂は、分離溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一 の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、同時に行われ る500〜1000以上の合成を可能にする。Houghtenら、前出、5134。 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方 法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Sutcliffeら、前出；Wil sonら、前出；Chow，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:910-914；およびBi ttle，F．J.ら、J．Gen．Virol．66:2347-2354（1985）を参照のこと。一般には 、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチ ドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）また は破傷風毒素）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、シス テインを含有するペプチドは、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシン イミドエステル（MBS）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングさ れ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤 を使用してキャリアーにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウス のような動物は、遊離またはキャリア-カップリングペプチドのいずれかで、例 えば、約100μgのペプチドまたはキャリアタンパク質およびFreundのアジュバン トを含むエマルジョンの腹腔内および/または皮内注射により免疫化される。い くつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用し てELISAアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するた めに、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清におけ る抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で 周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸収および選択された抗体の溶出 により増加され得る。 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち、抗体応答を惹起するタ ンパク質の部分は、全体のタンパク質が免疫原性である場合、当該分野で公知の 方法により同定される。例えば、Geysenら前出は、酵素-結合免疫吸収アッセイ における反応に十分に純粋な何百というペプチドの固体支持体上の迅速な併用的 合成の手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを 支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタン パク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により日常的に同定 され得る。例えば、口蹄疫ウイルスの被膜タンパク質における免疫学的に重要な エピトープは、タンパク質の213のアミノ酸配列全体を覆う全ての208の可能なヘ キサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりGeysenら（前出 ）によって位置付けされた。次いで、全ての20アミノ酸が順にエピトープ内の各 位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応 のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピト ープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作成され得る 。Geysen（1987）の米国特許第4,708,781号は、所望のタンパク質の免疫原性エ ピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。 さらになお、Geysen（1990）の米国特許第5,194,392号は、目的の抗体の特定 のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物 すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配 列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Geysen（19 89）の米国特許第4,433,092号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位 に相補的であるリガンドの位相等価であるモノマーの配列を検出または決定する 方法を記載する。同様に、Peralkylated Oligopeptide MixturesにおけるHought en，R．A.ら（1996）の米国特許第5,480,971号は、線状C1-C7-アルキル過アルキ ル化（peralkylated）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドの ライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アル キル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセット およびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保 有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され 得る。 「ポリペプチドおよびペプチド」のこの節に引用される各文書の全体の開示は 、ここで参考として本明細書中に援用される。 当業者が理解するように、本発明のhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3ポリペ プチドならびに上記のそれらのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン （IgG）の定常ドメインの一部と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの 融合タンパク質は、精製を促進し、そしてインビボで増加した半減期を示す。こ れは、例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免 疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタン パク質について示されている（EP A 394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86 （1988））。IgG部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパ ク質はまた、他の分子の結合および中和において、huXAG-1、huXAG-2、またはhu XAG-3モノマータンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも有効であり 得る（Fountoulakisら、J．Biochem．270:3958-3964（1995））。 huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3の診断および治療適用 本発明者らは、３つのメンバー：huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3からなる 、ヒト増殖因子の新規のファミリーを同定した。これらのタンパク質は、胚形成 に関連しそして生体組織において発現されるXenopus laevisのXAGタンパク質と 、相同性を共有する。増殖因子の過剰発現は、ガンのような疾患状態を導き得る 。増殖因子の発現不足もまた、例えば、損傷した組織において有害であり得る。 huXAG-1の発現は、大腸ガン組織において発見された。しかし、対応する遺伝 子発現は、正常な大腸組織において見出されなかった。従って、本発明のhuXAG- 1遺伝子は、ポリープ症（polypoisis）および非ポリープ症（non-polypoisis） ガンを含む大腸ガンの分子マーカーを提供する。huXAG-1遺伝子発現は、大腸ガ ンを有することが疑われる個体から採取された大腸組織または体液（すなわち、 血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において検出され得る。従って、本発明は 、大腸ガンの診断の間に有用な診断方法を提供する。これは、第一の個体からの 大腸組織または体液におけるhuXAG-1タンパク質をコードする遺伝子の発現レベ ルを測定する工程、および測定した遺伝子発現レベルを、大腸ガンを有さないこ とが知られている１体以上の個体から採取された標準huXAG-1遺伝子発現レベル と比較する工程を包含し、それによって標準と比較された遺伝子発現レベルの増 加は大腸ガンの指標である。示されるように、正常大腸組織におけるhuXAG-1遺 伝子発現が検出されていない場合、標準発現レベルは、大腸ガンの個体における huXAG-1の発現レベルよりも顕著に低い。 腫瘍診断が従来方法に従って既に作製されているので、本発明は予後指標とし て有用である。これにより、増加したhuXAG-1遺伝子発現を示す患者はより低い レベルの遺伝子を発現する患者と比較してより悪い診断結果を得る。 本発明はまた、種々の組織におけるhuXAG-2またはhuXAG-3のタンパク質の変化 レベルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組 織サンプルと比較して過剰の発現タンパク質が、疾患（例えば、腫瘍）または疾 患の疑いの存在を検出し得る。従って、本発明は、第一の個体から採取された組 織または体液におけるhuXAG-2またはhuXAG-3をコードする遺伝子の発現レベルを 測定する工程、およびその測定された遺伝子発現レベルを、診断される疾患を有 さないことが知られている１体以上の個体から採取された標準huXAG-2またはhuX AG-3遺伝子発現レベルと比較する工程を包含する診断方法を提供する。それによ って、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加は疾患の指標である。 「huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のタンパク質をコードする遺伝子の発現 レベルをアッセイすること」により、最初の生物学的サンプルにおけるhuXAG-1 、huXAG-2、もしくはhuXAG-3のタンパク質レベルまたはhuXAG-1、huXAG-2、もし くはhuXAG-3のタンパク質をコードするmRNAレベルを、直接的（例えば、絶対タ ンパク質レベルまたは絶対mRNAレベルを測定また評価することにより）または間 接的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhu XAG-3のタンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較することにより）のいずれか で、定性的または定量的に測定および評価することが意図される。 好ましくは、第一の生物学的試料におけるhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG- 3のタンパク質レベル、またはmRNAレベルは、標準のhuXAG-1、huXAG-2、もしく はhuXAG-3のタンパク質レベル、またはmRNAレベルと比較して測定または評価さ れる。標準は、疾患を有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから採 取される。当該分野において理解されるように、一旦、標準のhuXAG-1、huXAG-2 、もしくはhuXAG-3のタンパク質レベル、またはmRNAレベルが知られると、それ は比較のための標準として繰り返し使用され得る。 「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、あるいは huXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質またはmRNAを含む他の供給源か ら得られる任意の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サ ンプルは、分泌された成熟huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を含む 哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および随液）、および組織を 含む。huXAG-1発現の検出に好ましい組織は、結腸組織である。哺乳動物から組 織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプル がmRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。 本発明は、哺乳動物のガンの検出に有用である。１つの好ましい実施態様では 、本発明は、哺乳動物の結腸ガンの診断に有用である。好ましい哺乳動物として 、サル（monkey）、サル（ape）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、及 びヒトが挙げられる。特に好ましいのはヒトである。 全細胞RNAが、任意の適切な技術（例えば、ChomczynskiおよびSacchi，Anal． Biochem．162:156-159(1987)に記載されている一工程のグアニジン-チオシアネ ート-フェノール-クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得 る。次いで、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質をコードするmRNAの レベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロ ット分析、S1ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメ ラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-PCR）、およびリガーゼ連鎖反応と組 み合わせた逆転写（RT-LCR）を含む。 ノーザンブロット分析は、Haradaら、Cell 63:303-312(1990)に記載されてい るように行われ得る。簡潔には、全RNAが上記のように生物学的サンプルから調 製される。ノーザンブロットのためには、RNAは適切な緩衝液（例えば、グリオ キサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液）中で変性され、ア ガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロセルロースフィルターに転写され る。RNAがUVリンカーによってフィルターに結合された後、フィルターは、ホル ムアミド、SSC、デンハルト溶液、変性させたサケ精子、SDS、およびリン酸ナト リウム緩衝液を含有する溶液中で予備ハイブリダイゼーションされる。任意の適 切な方法（例えば、32PマルチプライムDNA標識システム(Amersham)）に従って標 識されたhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質cDNAが、プローブとして 使用される。一晩のハイブリダイゼーション後、フィルターは洗浄され、そし てＸ線フィルムに曝される。本発明に従うプローブとしての使用のためのcDNAは 、上記の節に記載されており、そして少なくとも15bpの長さが好ましい。 S1マッピングは、Fujitaら、Cell 49:357-367（1987）に記載されているよう に行われ得る。S1マッピングでの使用のためのプローブDNAを調製するために、 上記のcDNAのセンス鎖がテンプレートとして使用され、標識されたアンチセンス DNAが合成される。次いで、アンチセンスDNAが、適切な制限エンドヌクレアーゼ を使用して消化され、所望の長さのさらなるDNAプローブが生成され得る。この ようなアンチセンスプローブは、標的mRNA（すなわち、huXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3タンパク質をコードするmRNA）に対応する保護されたバンドを可視化 するために有用である。ノーザンブロット分析が、上記のように行われ得る。 好ましくは、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質をコードするmRNA のレベルは、Makinoら、Technique 2:295-301（1990）に記載されるようなRT-PC R法を使用してアッセイされる。この方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバ ンド中の「アンプリコン」の放射活性は、標的mRNAの初期濃度に直線的に相関す る。簡潔には、この方法は、RTプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物 中の生物学的サンプルから単離された全RNAを添加する工程を包含する。プライ マーのアニーリングのためのインキュベーション後、混合物はRT緩衝液、dNTP、 DTT、RNaseインヒビター、および逆転写酵素を補充され得る。RNAの逆転写を達 成するためのインキュベーション後、次いで、RT産物は標識されたプライマーを 使用するPCRに供される。あるいは、プライマーを標識するよりもむしろ、標識 されたdNTPがPCR反応混合物中に含まれ得る。PCR増幅は、従来技術に従ってDNA サーマルサイクラー中で行われ得る。増幅を達成するための適切な数のラウンド 後、PCR反応混合物はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。ゲルの乾燥 後、適切なバンド（huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質をコードするm RNAに対応する）の放射活性は、画像解析機を使用して定量される。RTおよびPCR 反応の成分および条件、試薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で 周知である。RT-PCR法の変形は当業者に明らかである。 逆転写された標的のmRNAを増幅する任意のオリゴヌクレオチドプライマーのセ ットが使用され得、そして上記の節で記載されるように設計され得る。 生物学的サンプル中のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質レベルの アッセイは、任意の当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく 技術が、生物学的サンプル中のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質レ ベルをアッセイするために好ましい。例えば、組織中でのhuXAG-1、huXAG-2、ま たはhuXAG-3タンパク質の発現は、伝統的な免疫組織学的方法で研究され得る。 これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル） によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次 抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染 色が得られる。組織はまた、ウェスタンブロットまたはドット／スロットアッセ イ（Jalkanen，M.ら、J．Cell．Biol．101:976-985(1985);Jalkanen，Mら、J．C ell．Biol．105:3087-3096(1987)）のためのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 タンパク質の遊離のために、例えば、尿素および中性の界面活性剤を用いて抽出 され得る。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術において、huXAG-1、huXAG-2 、またはhuXAG-3タンパク質の定量は、それぞれ単離されたhuXAG-1、huXAG-2、 またはhuXAG-3タンパク質を標準として使用して達成され得る。この技術はまた 、体液にも適用され得る。これらのサンプルに関して、huXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3タンパク質のモル濃度は、血清、血漿、尿、随液などのような異なる 体液について、それぞれhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質含量の標 準値の設定を補助する。次いで、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質 の量の正常値は、健常な個体に由来する値を使用して設定され得、これは、試験 被検体から得られる値と比較され得る。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質遺伝子発現を検出するために有 用な他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッ セイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA））を含む。例えば、huXAG-1 、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質特異的モノクローナル抗体は、それぞれhu XAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を検出および定量するための、免疫 吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中 に存在するhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質の量は、直線回帰コン ピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較に よ って算出され得る。腫瘍抗原を検出するためのこのようなELISAは、Iacobelliら 、Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30（1988）に記載されている 。別のELISAアッセイにおいては、２つの異なる特異的なモノクローナル抗体が 、体液中のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を検出するために使用 され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そ して他方が酵素標識プローブとして使用される。 上記の技術は、本質的に、「一工程」または「二工程」アッセイとして行われ 得る。「一工程」アッセイは、固定化抗体とhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 タンパク質とを接触させる工程を包含し、そして洗浄する工程、標識された抗体 と混合物とを接触させる工程は含まない。「二工程」アッセイは、洗浄する工程 、その後、標識された抗体と混合物とを接触させる工程を包含する。他の従来の 方法もまた、適切に使用され得る。通常、支持体上にアッセイ系の１つの成分を 固定することが所望され、それによって系の他の成分は、その成分との接触およ びサンプルからの容易な除去を生じることが可能となる。 適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒する オキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安 定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好 ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素-標識抗体／基質反応によって形成さ れる過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて 、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（125I、121I）、炭 素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（111In）、および テクネチウム（99mTc））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび ローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。 個体から得られる生物学的サンプル中のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タ ンパク質レベルをアッセイすることに加えて、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG- 3タンパク質はまた、画像解析によってインビボで検出され得る。huXAG-1、huXA G-2、またはhuXAG-3タンパク質のインビボでの画像解析のための抗体標識または マーカーとして、Ｘ線撮影法、NMR、またはESRによって検出可能なものが挙げら れる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射する が、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような 放射性同位元素が挙げられる。NMRおよびESRのための適切なマーカーとして、関 連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素の ような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。 放射性同位元素（例えば、131I、111In、99mTc）、放射性不透明体（radio-op aque）基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能 な画像解析部分で標識されている、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク 質-特異的抗体または抗体フラグメントが、ガンについて試験される哺乳動物中 に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよ び使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とさ れる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位 元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５ 〜20ミリキュリーの範囲の99mTcである。次いで、標識抗体または抗体フラグメ ントは、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を含む細胞の位置にそれ ぞれ優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、S.W．Burchielら、「Imm unopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragments」（T umer Imaging第13章：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W．Burchiel およびB.A．Rhodes編、Masson Publishing Inc．(1982)）に記載されている。 本発明での使用のためのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質特異的 抗体は、完全なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質またはその抗原性 ポリペプチドフラグメントに対して惹起され得る。これは、アルブミンのような キャリアタンパク質と共に、またはそれが充分に長い（少なくとも約25アミノ酸 ）場合はキャリアを伴わずに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して 提示され得る。 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗 体」（Mab）は、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質に特異的に結合し 得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメン トのような）を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2フラグメントは完全な抗 体のFcフラグメントを欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして 完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Wahlら、J．Nucl．Med． 24:316-325(1983)）。従って、これらのフラグメントが好ましい。 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、huXAG-1 、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する 細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され 得る。好ましい方法において、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質の 調製物は、それが天然の混入物を実質的に含まないように、上記のように調製さ れ、そして精製される。次いで、このような調製物は、より大きな特異的活性の ポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。 最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（あるいはそ のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質結合フラグメント）である。こ のようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature 256:4 95(1975)；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:511(1976)；Kohlerら、Eur．J．Immu nol．6:292(1976)；Hammerlingら：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrido mas，Elsevier，N.Y.，(1981)pp563-681）を用いて調製され得る。一般に、この ような手順は、huXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質抗原、またはよ り好ましくはhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3タンパク質発現細胞で動物（ 好ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、抗huXAG-1、 抗huXAG-2、または抗huXAG-3タンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認 識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る； しかし、10％ウシ胎児血清（約56℃で不活化した）を補充し、約10g/lの非必須 アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシン を補充したEarle改変イーグル培地中で細胞を培養することが好ましい。このよ うなマウスの脾細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意 の適切な骨髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、アメリカンタ イプカルチャーコレクション，Rockville，Marylandから入手可能な親骨髄腫細 胞株（SP2O）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞 はHAT培地中で選択的に維持され、次いでWandsら(Gastroenterology 80:225-232 (1981))に記載されているような限界希釈によってクローニングされる。 次いで、このような選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、huXAG-1、huX AG-2、またはhuXAG-3タンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同 定するためにアッセイされる。 あるいは、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質抗原に結合し得るさ らなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る 。このような方法は、抗体はそれ自体が抗原であるという事実を使用し、従って 、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、huXAG- 1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質特異的抗体は、動物（好ましくは、マウ ス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリ ドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、huXAG-1 、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質-特異的抗体に結合する能力が、それぞれh uXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体 を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は 、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質-特異的抗体に対する抗イディオ タイプ抗体を含み、そしてさらなるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク 質-特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。 本発明の抗体のFabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントおよび他のフラグ メントが、本明細書中に開示される方法に従って用いられ得ることが認識される 。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Fabフラグメントを生成 するため）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを生成するため）のような酵 素を用いるタンパク質分解切断により生成される。あるいは、huXAG-1、huXAG-2 、またはhuXAG-3タンパク質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用を通して 、または合成化学を通して生成され得る。 ヒトにおける腫瘍の診断のために、インビボでのイメージングを用いて、増強 されたレベルのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質を検出する場合、 「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。この ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の 遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分 野で公知である。総説については、Morrison，Science 229:1202(1985);Oiら， BioTechniques 4:214(1986);Cabillyら，米国特許第4,816,567号;Taniguchiら， EP 171496;Morrisonら，EP 173494;Neubergerら，WO 8601533;Robinsonら，WO 8 702671;Boulianneら，Nature 312:643(1984);Neubergerら，Nature 314:268(198 5)を参照のこと。 本発明のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質特異的抗体にさらに適 切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナ ーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、Δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母 アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリ オースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アス パラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレア ーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グル コアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。 適切な放射性同位体標識の例は、3Ｈ、111In、99mTc、125I、131Ｉ、32Ｐ、35 Ｓ、14Ｃ、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Ｙ、67Cu、217Ci、211At 、212Pb、47Sc、109Pdなどを含む。111Inおよび99mTcは、インビボでのイメージ ングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、125Ｉまた は131Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避 するからである。さらに、この放射性核種（radionucleotide）は、イメージン グのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Perkinsら，Eur．J．Nucl ．Med．10:296-301(1985);Carasquilloら，J．Nucl．Med．28:281-287(1987)） 。例えば、1-(p-イソチオシアネートベンジル)-DPTAを用いてモノクローナル抗 体にカップリングした111Inは、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みを ほとんど示さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Estebanら ，J．Nucl．Med．28:861-870(1987)）。 適切な非放射性同位体標識の例は、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56Feを 含む。 適切な蛍光標識の例は、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネー ト標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフ ィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド（o-phthaldehyde）標識、およびフルオ レサミン標識を含む。 適切な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を含む。 化学発光標識の例は、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジ ニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エス テル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含 む。 核磁気共鳴コントラスト剤の例は、Gd、Mn、および鉄のような重金属原子核を 含む。 上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Kennedyら，Clin．Chim ．Acta 70:1-31(1976)およびSchursら，Clin．Chim．Acta 81:1-40(1977)により 提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド 方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキ シ-スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考 として援用される。 本発明のポリペプチドは、増殖因子であり、そしてそれ自体、細胞（例えば、 結腸細胞、乳房細胞、肝細胞、および肺細胞）の増殖を刺激するために用いられ 得る。 huXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3とXenopus XAGとの相同性に起因して、これ らの遺伝子は、ヒトの胚の増殖および発生、そしてまた成体の寿命に関与するモ ルフォゲンであると考えられる。さらに、これらの遺伝子は、破骨細胞腫、乳ガ ン、結腸ガン、および肝細胞ガンを含む、多くの腫瘍型において高度に発現され る。これらはまた、ヒトの肺において発現される。 本発明のポリペプチドは、肝細胞の増殖および分化を刺激するために用いられ 得、従って肝臓の疾患および病状（すなわち、肝硬変により引き起こされる劇症 肝不全（fulminant liver failure）、ウイルス性肝炎および毒性物質（すなわ ち、アセトアミノフェン、四塩化炭素、および他の当該分野で公知の肝臓毒素） により引き起こされる肝臓損傷）を軽減または処置するために用いられ得る。本 発明のポリペプチドはまた、例えば、外科手術後の肝臓の再生を刺激または促進 するために用いられ得る。 本発明のポリペプチドは、種々の病理学的状態により引き起こされる肺の損傷 を予防および治癒するために用いられ得る。増殖因子として、本発明のポリペプ チドは、増殖および分化を刺激し、そして肺胞および細気管支上皮（bronchiola r epithelium）の修復を促進して急性または慢性の肺損傷を防止、減衰、または 処置し得る。例えば、肺胞の進行的損失をもたらす気腫、ならびに細気管支上皮 および肺胞の壊死を生じる吸息損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる ）は、本発明のポリペプチドを用いて効果的に処置され得る。huXAG-3は、好ま しくは、肺組織の増殖を促進するために用いられる。 本発明のポリペプチドはまた、乳房組織の増殖および分化を刺激し得、そのた めに外科手術、外傷、またはガンに起因する乳房組織損傷の治癒を促進するため に用いられ得る。 本発明はまた、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドのレセプター の同定のための方法を提供する。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公 知の多数の方法(例えば、リガンドパニングおよびFACSソーティング（Coliganら ，Current Protocols in Immun.，1(2)，第５章(1991)）)により同定され得る。 好ましくは、ポリアデニル化RNAがこのポリペプチドに対して応答性の細胞から 調製され、そしてこのRNAから作製されるcDNAライブラリーがプールに分割され 、そしてCOS細胞またはこのポリペプチドに対して応答性ではない他の細胞をト ランスフェクトするために用いられる発現クローニングが用いられる。スライド ガラス上で増殖したトランスフェクト細胞は、標識されたポリペプチドに曝露さ れる。ポリペプチドは、部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位のヨウ素化ま たは包接（inclusion）を含む種々の手段により標識され得る。固定化およびイ ンキュベーションの後、スライドは、オートラジオグラフ分析に供される。ポジ ティブプールが同定され、そして反復性のサブプール化および再スクリーニング プロセスを用いてサブプールが調製および再トランスフェクトされ、最終的に推 定のレセプターをコードする単一のクローンを得る。 レセプター同定のための代替となるアプローチとしては、標識されたポリペプ チドは、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性連結され 得る。架橋材料は、PAGE分析により分離され、そしてｘ線フィルムに曝露される 。ポリペプチドのレセプターを含む標識された複合体は、切り出され、ペプチド フ ラグメントに分離され、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列 決定から得られるアミノ酸配列は、一連の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設 計してcDNAライブラリーをスクリーニングし、推定のレセプターをコードする遺 伝子を同定するために用いられる。 本発明は、huXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3の作用を作動するか、またはh uXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3の機能をブロックする化合物を同定するため に、化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、 哺乳動物細胞（例えば、結腸細胞）、スクリーニングされるべき化合物、および3 ［Ｈ］チミジンを、細胞が正常に増殖する細胞培養条件下で合わせる工程を含 む。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実 施され、そして化合物の存在下での細胞増殖の量と比較され、化合物が細胞増殖 を刺激するか否かを決定し得る。 アンタゴニストについてスクリーニングするために、huXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3の存在下で同じアッセイを調製し得、そして化合物が細胞増殖を防止 する能力を測定し、そしてアンタゴニスト能力の決定が行われる。細胞増殖の量 は、3［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラ フィーにより測定される。 別の方法では、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3レセプターを発現する哺乳 動物細胞または膜調製物は、標識されたhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3とと もに化合物の存在下でインキュベートされる。次いで、化合物がこの相互作用を 増強またはブロックする能力が測定され得る。あるいは、huXAG-1、huXAG-2、ま たはhuXAG-3とレセプターとの相互作用の後の公知のセカンドメッセンジャー系 の応答は、化合物の存在下または非存在下で測定および比較される。このような セカンドメッセンジャー系は、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル、 またはホスホイノシチド加水分解を含むがこれらに限定されない。 潜在的なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3アンタゴニストの例は、ポリペプ チドに結合する、抗体、またはある場合はオリゴヌクレオチドを含む。あるいは 、潜在的なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3アンタゴニストは、huXAG-1、huXA G-2、またはhuXAG-3レセプターに結合するが、セカンドメッセンジャーの応答を 誘 発しないhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3の変異体形態であり得る。それゆえ 、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3の作用は、効果的にブロックされる。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のアンタゴニストは、腫瘍増殖を阻害する ために有用であることが意図される。発生モルフォゲン（例えば、huXAG-1、huX AG-2、またはhuXAG-3）の誤発現に関連する腫瘍増殖は、成体組織におけるこれ らのポリペプチドの発現をオフにすることにより減少または防止され得る。 別の潜在的なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3アンタゴニストは、アンチセ ンス技術を用いて調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、 三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを通して遺伝子発現を制御す るために用いられ得、この両方の方法は、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの 結合に基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列の5'コード部分（これは、本発明 の成熟ポリペプチドをコードする）は、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRN Aオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、 転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Lee ら，Nucl．Acids Res．6:3073(1979);Cooneyら，Science 241:456(1988)；およ びDervanら，Science 251:1360(1991)を参照のこと）、それにより、huXAG-1、h uXAG-2、またはhuXAG-3の転写および生成を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌ クレオチドは、cDNAにインビボでハイブリダイズし、そしてhuXAG-1、huXAG-2、 またはhuXAG-3ポリペプチドへのcDNA分子の翻訳をブロックする（アンチセンス- Okano，J.，Neurochem．56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense In hibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオ リゴヌクレオチドはまた、アンチセンスRNAまたはDNAがhuXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3の生成を阻害するためにインビボで発現され得るように、細胞に送達 され得る。 潜在的なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3アンタゴニストは、huXAG-1、huXA G-2、またはhuXAG-3レセプターの結合部位に結合し、そしてこの部位を占有し、 それによりレセプターがhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3に対して接近不可能 にし、その結果、正常な生物学的活性が防止される低分子を含む。低分子の例は 、小ペプチドまたはペプチド様分子を含むがこれらに限定されない。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3のアンタゴニストは、過剰増殖障害（ガン 、特に肝細胞ガン、破骨細胞腫、乳ガン、および結腸ガンを含む）を処置するた めに用いられ得る。 投与態様 個体におけるhuXAG-1、huXAG-2、もしくはhuXAG-3活性の標準レベルもしくは 正常レベルにおける減少により引き起こされる状態、またはhuXAG-1、huXAG-2、 もしくはhuXAG-3活性の増強されたレベルにより回復され得る状態が、それぞれ 、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質の投与により処置され得ること が理解される。従って、本発明はさらに、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活 性の増加したレベルを必要とする個体を処置する方法を提供する。この方法は、 このような個体に、それぞれ、単離された本発明のhuXAG-1、huXAG-2、またはhu XAG-3ポリペプチドの有効量を含む薬学的組成物を投与する工程を含む。特に好 ましいのは、このような個体におけるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3活性の レベルを増加させるのに有効な、成熟形態のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 タンパク質である。このような処置は、肺、肝臓、結腸、および骨における組織 の再増殖の刺激において特に有用であることが意図される。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド組成物は、個々の患者の臨床 状態（特にhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド単独での処置の副作 用）、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド組成物の送達部位、投与 方法、投与スケジュール、および実施者に公知の他の要素を考慮して、良好な医 療行為と一致した様式で処方および投薬される。従って、本明細書中の目的のた めのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドの「有効量」は、このよう な考慮によって決定される。 一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるhuXAG-1、huXAG-2、また はhuXAG-3ポリペプチドの総薬学的有効量は、患者の体重あたり、約１μg/kg/日 〜10mg/kg/日の範囲であるが、上記のように、これは治療的自由裁量に供される 。より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましく はヒトについてホルモンで、約0.01〜１mg/kg/日である。連続的に与えられる場 合、 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドは、代表的には、約１μg/kg/時 間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射、または例えば 、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バッ ク溶液もまた用いられ得る。変化を観察するために必要とされる処置の長さ、お よび処置後に応答が起きるまでの間隔は、所望される効果に従って変化するよう である。 本発明のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドを含む薬学的組成物 は、経口、直腸、非経口、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所（粉 末、軟膏、点眼薬、または経皮パッチによるような）、頬に、または経口もしく は鼻腔内スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、 任意の型の非毒性の固体、半固体、または液体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材 料、または処方助剤を意味する。本明細書中で用いられる用語「非経口」は、静 脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮下、および関節内の注射および注入を含む投 与態様をいう。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドはまた、持続放出系により適 切に投与される。持続放出組成物の適切な例は、造形品（例えば、フィルムまた はマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出 マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、L-グル タミン酸とγ-エチル-L-グルタメートとのコポリマー（Sidman，U.ら，Biopolym ers 22:547-556(1983)）、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)（R．Lange rら，J．Biomed Mater．Res．15:167-277(1981)およびR．Langer，Chem．Tech． 12:98-105(1982)）、エチレンビニルアセテート（R．Langerら，同書）、または ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を含む。持続放出huXAG-1、huXAG- 2、またはhuXAG-3ポリペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたhuXAG-1 、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドを含む。huXAG-1、huXAG-2、またはｈuX AG-3ポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法により調製される （DE 3,218,121;Epsteinら，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)82:3688-3692(1985) ;Hwangら，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)77:4030-4034(1980);EP 52,322;EP 36 ,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142，641;日本国特許出願第83-1 18008号;米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号;ならびにEP 102,324） 。通常、リポソームは、小さな（約200〜800オングストローム）単層型のもので あり、ここで脂肪含量は約30mol.％コレステロールより高く、選択される比率は 、最適なhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド治療のために調整され る。 非経口投与のために、１つの実施態様では、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG- 3ポリペプチドは、一般的に、所望の程度の純度で単位投薬量の注射可能な形態 （溶液、懸濁液、または乳濁液）のこのポリペプチドを、薬学的に受容可能なキ ャリア（すなわち、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性 であり、処方物の他の成分と適合性であるキャリア）と混合することにより処方 される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリペプチドに対して 有害であることが公知である他の化合物を含まない。 一般的に、処方物は、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドを、液 体キャリアまたは微細に分割された固体キャリアまたはその両方と均一にかつ直 接接触させることにより調製される。次いで、必要に応じて、産物は、所望の処 方物に成形される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリア、より好ましくは レシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例 は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液を含む。固定油 およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルはまた、ならびにリポソームは 、本明細書中で有用である。 キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加 剤を適切に含む。このような物質は、用いられる投薬量および濃度でレシピエン トに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他 の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤； 低分子量（約10残基未満）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペ プチド）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク 質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、 アスパラギン酸、またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースもしくはその 誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類 、 および他の炭水化物；EDTAのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビト ールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；ならびに／あるいは ポリソルベート、ポロオキサマー（poloxamer）またはPEGのような非イオン性界 面活性剤を含む。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドは、代表的に、このようなビ ヒクルに、約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは１〜10mg/mlの濃度で、約３〜８ のpHで処方される。上述の賦形剤、キャリア、または安定化剤の特定のものの使 用が、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド塩の処方をもたらすこと が理解される。 治療的投与のために用いられるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチ ドは、無菌でなければならない。無菌は、無菌の濾過メンブレン（例えば、0.2 ミクロンメンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的huXAG-1 、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチド組成物は、一般的に、無菌の出入り口を 有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針が貫通し得るストッパ ーを有するバイアル）に入れられる。 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドは、通常、単位用量のまたは 多回用量の容器（例えば、シールされたアンプルまたはバイアル）において、水 溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として保存される。凍結乾燥処方物の １例として、10mlバイアルが、無菌濾過された１％（w/v）水性huXAG-1、huXAG- 2、またはhuXAG-3ポリペプチド溶液５mlで満たされ、そして得られた混合物は凍 結乾燥される。注入溶液は、凍結乾燥されたhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3 ポリペプチドを、静菌性の注射用蒸留水を用いて再構成することにより調製され る。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上 の容器を含む、薬学的パックおよびキットを提供する。このような容器に、薬品 または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により処方さ れた形態での注意書であって、ヒトへの投与のための製品の製造、使用、または 販売の機関による認可を反映する注意書が付随し得る。さらに、本発明のポリペ プチドは、他の治療化合物と組み合わせて用いられ得る。 染色体アッセイ 本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染 色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし 得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、実 際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんど染色体位置 の標識に利用可能でない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これら の配列と疾患に関連する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcD NAは、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3タンパク質遺伝子のゲノムDNAをクロー ニングするために使用される。これは、種々の周知の技術および一般に市販され ているライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、この目的 のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マッピングのために使用され る。代表的には、染色体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試行錯誤 が、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプロー ブを同定するために必要であり得る。 いくつかの場合において、さらに、配列は、cDNAからPCRプライマー（好まし くは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の3'非翻 訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがら ず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用 される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブ リッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を 含むそれらのハイブリッドのみが増幅部分を生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に 使用して、特定の染色体由来の部分のパネルまたは類似の様式での大きなゲノム クローンのプールを用いて、準位置決定(sublocalization)が達成され得る。染 色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、イ ンサイチュハイブリダイゼーション、標識してフロー選別した(flow-sorted)染 色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築 するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。 cDNAクローンの中期染色体スプレッド（spread）への蛍光インサイチュハイブ リダイゼーション（「FISH」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するために 使用され得る。この技術は、50bpまたは60bpほどの短いcDNA由来のプローブを用 いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら，Human Chromosomes:A Manual Of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと 。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．McK usick，Mendelian Inheritance In Man(Johns Hopkins University，Welch Medi cal Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、同 じ染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に 隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列における相違 を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、 いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるよ うである。 物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患 に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的 原因遺伝子の１つであり得る。これは、１メガベースのマッピング解像度、およ び20kbあたり１遺伝子と仮定する。 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、例示のために提供され、そして 限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理 解される。 実施例１：E.coliにおけるhuXAG-1ポリペプチドの発現および精製 寄託されたcDNAにおいて成熟huXAG-1をコードするDNA配列を、huXAG-1のアミ ノ酸末端配列および遺伝子に対してベクター配列３'に特異的なPCRオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位 を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'および３'の配列に添加した。 ５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'CGC CCA TGG GCC AGA GAT ACC A CA G 3'（配列番号23）を有し、これは下線を付したNcoI制限部位を含んだ。 ３'プライマーは、配列5'CGC AAG CTT TTA CAA TTC AGT CTT CAG C 3'（配列 番号24）を有し、これは下線を付したHindIII制限部位を含んだ。 あるいは、以下のプライマーが使用され得る： 制限部位は、細菌発現ベクターpQE60の制限酵素部位に対して都合良く、これ らの実施例においてM15/rep4宿主細胞における細菌発現のために使用した（Qiag en，Inc．Chatsworth，CA，91311）。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性（「A mpr」）をコードし、細菌の複製起点（「ori」）、IPTG誘導プロモーター、リボ ソーム結合部位（「RBS」）、6-Hisタグ、および制限酵素部位を含む。 増幅されたhuXAG-IDNAおよびベクターpQE60の両方をNcoIおよびHindIIIで消化 し、次いで消化されたDNAを一緒に連結した。huXAG-1 DNAの制限されたpQE60ベ クターへの挿入は、huXAG-1コード領域を、ベクターのIPTG誘導プロモーターの 下流に、かつこれに作動可能に連結するように、そしてhuXAG-1の翻訳のために 適切に位置される開始ATGにインフレームに配置した。 連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換 した。このような手順は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manua l、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y ．(1989)に記載されている。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプ レッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Kanr）を付与する）を含有す るE.coli株M15/rep4を本明細書に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用し た。この株（これは、huXAG-1タンパク質を発現するために適切である多くの株 の内の唯一である）は、Qiagenから市販されている。 形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増 殖するそれらの能力により同定した。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し 、そしてクローン化DNAの同定を制限分析により確認した。 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン （25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（「O/N」）増 殖した。 O/N培養物を用いて約1:100〜1:250の希釈で大規模培養に接種した。細胞を、0 .4と0.6との間の600nmでの吸光度（「OD600」）にまで増殖させた。次いで、イ ソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を加えて１mMの最終濃度 にし、lacIリプレッサーを不活性化することにより、lacリプレッサー感受性プ ロモーターからの転写を誘導した。細胞をさらに３〜４時間引き続きインキュベ ートした。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により採集し、そして破 壊した。日常的な回収技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、そしてタ ンパク質を封入体から８Ｍ尿素中へ可溶化した。可溶化したタンパク質を含む８ Ｍ尿素溶液を、50mM Tris(pH7.0)＋400または200mM NaCl中でPD-10カラムを通し 、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳 んだ。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンド トキシンを除去した。次いで、濾過滅菌した。濾過滅菌したタンパク質調製物を 、上記のTris緩衝液中で保存した。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準的な方法による調製物の分析は、調製 物が、約16kDaの推定分子量を有する約90％のモノマーhuXAG-1を含むことを明ら かにした。 実施例２：E.coliにおけるhuXAG-2ポリペプチドの発現および精製 寄託されたcDNAクローン中の成熟huXAG-2をコードするDNA配列を、huXAG-2の アミノ末端および遺伝子に対してベクター配列3’に特異的なPCRオリゴヌクレオ チドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部位を 含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ5’および3’配列に付加した。 5’オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を付したAflIII制限部位を含む配 列5'GAC CGC ACATGT TCT GAT GGA CAT AAT GGG CTT GGA AAG GGT TTT G 3'（配 列番号25）を有していた。 3’プライマーは、下線を付したHindIII制限部位を含む配列5'GAC CGC AAGCTT CTC TGA TGA AAG AAG GGG CAC ATT CTT ATT ACA ATT C 3'（配列番号26）を有 していた。 この制限部位は、これらの実施例中でM15/rep4宿主細胞中の細菌発現のために 使用される細菌発現ベクターpQE60（Qiagen，Inc.，Chatsworth,CA，91311）中 の制限酵素部位に好都合である。pQE60はアンピシリン抗生物質耐性（「Amp」） をコードし、そして細菌の複製起点（「ori」）、IPTG誘導プロモーター、リボ ソーム結合部位（「RBS」）、6-Hisタグ、および制限酵素部位を含む。 増幅されたhuXAG-2 DNAおよびベクターpQE60を両方とも、AflIIIおよびHindII Iで消化し、次いで消化されたDNAを互いに連結させた。huXAG-2 DNAの制限され たpQE60ベクターへの挿入は、ベクターのIPTG誘導可能なプロモーターの下流で かつ作動可能に連結され、そしてhuXAG-2の翻訳に適切に位置する開始ATGにイン フレームであるhuXAG-2コード領域を配置した。 E.coliの形質転換、huXAG-2の発現および精製を、実施例１に示す手順に従っ て実施した。 実施例３：E.coli中のhuXAG-3ポリペプチドの発現および精製 寄託されたcDNAクローン中の成熟huXAG-3をコードするDNA配列を、huXAG-3の アミノ末端配列および遺伝子に対してベクター配列3’に特異的なPCRオリゴヌク レオチドプライマーを用いて増幅した。クローニングを容易にするための制限部 位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ5’および3’配列に付加した。 5’オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を付したBspHI制限部位を含む配列 5'GAC CGC TCATGA ATA AAA AAG GAA AAG AGG CCT CCT CAG ACA CTC 3'（配列番 号27）を有していた。 3’プライマーは、下線を付したHindIII制限部位を含む配列5'GAC CGC AAGCTT CTT TGA AGT GAA GGC TTT TTT CTA TCA TTT ATT ATA G 3'（配列番号28）を有 していた。 この制限部位は、これらの実施例中でM15/rep4宿主細胞中の細菌発現に使用さ れる細菌発現ベクターpQE60（Qiagen，Inc.，Chatsworth,CA，91311）中の制限 酵素部位に好都合である。pQE60はアンピシリン抗生物質耐性（「Amp」）をコー ドし、そして細菌の複製起点（「ori」）、IPTG誘導可能なプロモーター、リボ ソーム結合部位（「RBS」）、6-Hisタグ、および制限酵素部位を含む。 増幅されたhuXAG-3 DNAおよびベクターpQE60を両方とも、BspHIおよびHindIII で消化し、次いで消化されたDNAを互いに連結させた。huXAG-3 DNAの制限された pQE60ベクターへの挿入は、ベクターのIPTG誘導可能なプロモーターの下流でか つ作動可能に連結され、そしてhuXAG-3の翻訳に適切に位置する開始ATGにインフ レームであるhuXAG-2コード領域を配置した。 E.coliの形質転換、huXAG-3の発現および精製を、実施例１に示す手順に従っ て実施した。 実施例４：バキュロウイルス発現系における成熟huXAG-1のクローニングおよび 発現 寄託されたクローンにおける完全huXAG-1をコードするcDNA配列を、この遺伝 子の５'配列および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用い て増幅する： ５'プライマーは、配列5'CGC GGA TCC GCC ATC ATG GAG AAA ATT CCA GTG 3' （配列番号29）を有し、これは下線を付したBamHI制限酵素部位に続き図１にお けるhuXAG-1の配列の18塩基を含む。発現ベクター（以下に記載）に挿入した、 ヒトhuXAG-1をコードする増幅したフラグメントの5'末端は、有効なシグナルペ プチドを提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のために有効なシグナル（ Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:947-950(1987)によって記載される）を、構築物 のベクター部分に適切に配置する。 ３'プライマーは、配列CGC GGA TCC TTA CAA TTC AGT CTT CAG C 3'（配列番 号30）を有し、これは下線を付したBamHI制限部位に続き図１に示されるhuXAG-1 コード配列の最後の19ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含む。 あるいは、以下のプライマーが使用され得る： 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグ メントをBamHIで消化し、そして１％アガロースゲルで再び精製する。このフラ グメントを、本明細書中でF2と命名する。 ベクターpA2-GPを用いて、Summersら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experime ntal Station Bulletin No．1555（1987）に記載の標準的な方法を用いて、huXA G-1をバキュロウイルス発現系において発現する。この発現ベクターは、Autogra pha californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモー ター、それに続く都合のよい制限部位を含む。AcMNPV gp67のシグナルペプチド （Ｎ末端メチオニンを含む）は、BamHI部位のちようど上流に位置する。シミア ンウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化の ために用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクト シダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、そしてポリヘド リン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイ ルスDNAとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列によって両側に隣接さ せ、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。 当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、輸送などのために適切 に位置したシグナル（例えば、必要ならばインフレームでのAUGおよびシグナル ペプチド）を提供するならば、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、 pAc373、pVL941、およびpAcIM1）が、pA2-GPの代わりに用いられ得る。このよう なベクターは、とりわけ、Luckowら、Virology，170:31-39に記載される。 当該分野で公知の日常的な手順を用いて、プラスミドを制限酵素BamHIで消化 し、次いでウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、市販のキッ ト（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いてDNAを１％アガロース ゲルから単離する。このベクターDNAを、本明細書中で「Ｖ」と命名する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼでともに連 結する。E.coli HB101細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に 播く。XbaIを用いて個々のコロニーからのDNAを消化し、次いでゲル電気泳動に よって消化産物を分析することによって、ヒトhuXAG-1遺伝子を有するプラスミ ドを含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定によ り確認する。このプラスミドを、本明細書中でpBac huXAG-1と命名する。 ５μgのプラスミドpBac huXAG-1を、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．USA， 84:7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μgの 市販の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharm ingen，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGol dTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac huXAG-1を、50μlの無血清グレー ス培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイター プレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンおよび90 μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートす る。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１mlを有 する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下 する。プレートを、新たに添加した溶液を混合するために、前後に振盪する。次 いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェク ション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグ レース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で ４日間培養を続ける。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるよう にプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現クロー ンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technolog ies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（このタイプの「 プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersbu rg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜 10頁）においても見い出され得る）。 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーションの 後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで 、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチ ューブ中に再懸濁する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換え バキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染さ せるために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそ れらを４℃で保存する。適切に挿入されたhESSB I、II、およびIIIを含むクロー ンを、このプラスミド制限マッピングおよび配列決定を含むDNA分析によって同 定する。これを、本明細書中でV-huXAG-1と命名する。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を 、約２（約１〜約３）の感染多重度（「MOI」）で組換えバキュロウイルスhuXAG -1で感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステ インを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburgから入手可 能）に置き換える。42時間後、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓ-シ ステイン（Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベ ートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパ ク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。 実施例５：バキュロウイルス発現系におけるhuXAG-2タンパク質のクローニング および発現 この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を使用して完全 なタンパク質をコードするクローン化DNA（その天然に関連する分泌シグナル（ リーダー）配列）をバキュロウイルスに挿入し、Summersら、A Manual of Met h ods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas Ag ricultural Experimental Station Bulletin No．1555(1987)に記載される標準 的な方法を使用して成熟huXAG-2タンパク質を発現させる。この発現ベクターは 、Autographa californica核多核体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリン プロモーター、続いて都合のよい制限部位（例えば、BamHIおよびAsp718）を含 む。シミアンウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を効率的なポリアデ ニル 化のために使用する。組換えウイルスの簡単な選択のために、プラスミドは、同 方向に弱いDrosophilaプロモーターの制御下にE.coli由来のβガラクトシダーゼ 遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入され た遺伝子を、両側で野生型ウイルスDNAでの細胞媒介性相同組換えのためのウイ ルス配列によって隣接させて、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存 可能なウイルスを生成する。 多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、pAc373、pVL941およびpAcIM1 ）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、分泌などに適切に 配置されたシグナル（必要ならば、シグナルペプチドおよびインフレームのAUG を含む）を提供する限り、上記のベクターの代わりに使用され得る。このような ベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31-39に記載される。 寄託されたクローン中の全長huXAG-2タンパク質をコードするcDNA配列（AUG開 始コドンおよび図２に示される天然に関連するリーダー配列（配列番号４）を含 む）を、遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプラ イマーとを用いて増幅する。5’プライマーは、配列5'GACT TGATCA GCC ATC ATG GAG ACG CGG CCT CGT CTC GGG GCC ACC TG3'（配列番号31）を有し、これは下 線を付したBclI制限酵素部位、真核生物細胞における翻訳の開始に効率的なシグ ナル（Kozak，M．J.Mol.Biol．196:947-950(1987)により記載される）、続いて 図２に示される完全なhuXAG-2タンパク質の32塩基の配列（AUG開始コドンで始ま る）を含む。3’プライマーは、配列5'GACT GGTACC GAA GGG GCA CAT TCA TGT T AC AAT TCA TCT TCA AG3'（配列番号32）を有し、これは下線を付したAsp718I制 限部位、続いて図２に示される3’配列に相補的な35ヌクレオチド配列を含む。 増幅フラグメントを、市販のキット（「Geneclean」 BIO 101 Inc.，La Jolla ，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントをBcl IおよびAsp718Iで消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。このフ ラグメントを本明細書中で「Ｆ１」と命名する。 このプラスミドを制限酵素BclIおよびAsp718Iで消化し、そして必要に応じて ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の日常の手順を用いて脱リン酸 化し得る。次いで、DNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla ， Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNAを本明細書中 で「Ｖ１」と命名する。 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、T4DNAリガーゼで互い に連結する。E.coli HB 101または他の適切なE.coli宿主（例えば、XL-1 Blue（ Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA）細胞を連結混合物で形質転換させて 、そして培養プレート上に塗布する。PCR法を用いてhuXAG-2遺伝子を有するプラ スミドを含む細菌を同定する。このPCR法において、プライマーの一方は遺伝子 を増幅するのに使用され、そして第二のプライマーはベクター内部に良好に由来 し、その結果huXAG-2遺伝子フラグメントを含むそれらの細菌コロニーのみがDNA の増幅を示す。クローン化されたフラグメントの配列を、DNA配列決定により確 認する。このプラスミドは、本明細書中においてpBachuXAG-2と命名する。 ５μgのプラスミドpBachuXAG-2を、FelgnerらProc.Natl.Acad.Sci.USA 84:741 3-7417(1987)に記載されるリポフェクション法を用いて1.0μgの市販の直線化バ キュロウイルスDNA（「BaculoGoldTMバキュロウイルスDNA」Pharmingen,San Die go，CA.）と、同時トランスフェクトした。１μgのBaculoGoldTMウイルスDNAお よび５μgのプラスミドpBachuXAG-2を、50μlの無血清グレース培地（Life Tech nologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウ ェル中で混合する。その後、10μlのLipofectinおよび90μlのグレース培地を添 加し、混合し、そして室温で15分間インキュベートした。次いで、トランスフェ クション混合物を、1mlの無血清グレース培地を有する35mm組織培養プレート中 に播種したSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。プレートを前後に揺らし 、新たに添加された溶液を混合する。次いで、プレートを27℃で５時間インキュ ベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そし て10％のウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加する。プレート をインキュベーターに戻し、そして培養を27℃で４日間継続する。 ４日後、上清を回収し、そしてプラークアッセイをSummersおよびSmith、前出 に記載のように行う。「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg） を有するアガロースゲルを使用して、青色染色プラークを生成するgal発現クロ ーンの簡単な同定および単離を可能にする（この型の「プラークアッセイ」の詳 述はまた、Life Technologies Inc.，Gaithersburgにより配布される昆虫細胞培 養およびバキュロウイルス学についての使用者ガイド、９〜10頁に見い出され得 る。）。適切なインキュベーションの後、青色染色プラークは、マイクロピペッ ター（例えば、Eppendorf）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含むア ガーを、200μlのグレース培地を含む微小遠沈管中に再懸濁し、そして組換えバ キュロウイルスを含む懸濁液を使用して、35mmディッシュ中に播種したSf9細胞 を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採取して、次いでこれ らを４℃に保存する。この組換えウイルスをV-huXAG-2と呼ぶ。 huXAG-2遺伝子の発現を確認するために、Sf9細胞を、10％の熱不活化FBSを補 充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）で 組み換えバキュロウイルスV-huXAG-2で感染させる。６時間後、培地を除去し、 そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Rockville，MDから入手可能）と置換する。放射標識タンパク質が所望さ れる場合、42時間後に、５μCiの35Sメチオニンおよび５μCiの35S-システイン （Amershamから入手可能）を添加する。細胞を、さらに16時間インキュベートし 、次いでそれらを遠心分離により採取する。上清中のタンパク質および細胞内タ ンパク質を、SDS-PAGEに続くオートラジオグラフィー（放射標識されている場合 ）により分析する。精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微小配列決定 を使用して、成熟タンパク質のアミノ末端配列、従って、分泌シグナルペプチド の切断点および長さを決定し得る。 実施例６：バキュロウイルス発現系におけるhuXAG-3タンパク質のクローニング および発現 この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を使用して、 全長タンパク質（天然に関連する分泌シグナル（リーダー）配列を含む）をコー ドするクローン化DNAをバキュロウイルスに挿入して、Summersら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texa s Agricaultural Experimental Station Bulletin No．1555(1987)に記載のよう に標準的な方法を用いて成熟huXAG-3タンパク質を発現させる。 多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、pAc373、pVL941およびpAcIM1 ）が、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻訳、分泌などに適切に 配置されたシグナル（必要に応じてシグナルペプチドおよびインフレームなAUG を含む）を提供する限り、上記のベクターの代わりに使用され得る。このような ベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31-39に記載される。 寄託されたクローン中の全長huXAG-3タンパク質をコードするcDNA配列（図３ （配列番号６）に示されるAUG開始コドンおよび天然に関連するリーダー配列を 含む）を、遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて増幅する。5’プライマーは、配列5'GACT GGATCC GCC ATC ATG ATG CTA CAC TCA GCT TTG GGT CTC TGC CTC 3'（配列番号33）を有し、これは 下線を付したBamHI制限酵素部位、真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシ グナル（Kozak，M．J.Mol.Biol．196:947-950(1987)により記載される）、続い て図３に示される完全なhuXAG-3タンパク質の33塩基の配列（AUG開始コドンで始 まる）を含む。3’プライマーは、配列5'GACT GGTACC GAA GGC TTT TTT CTA TCA TCT CTT ATA GCT CCT CAT ATG 3'（配列番号34）を有し、これは下線を付したA sp718I制限部位に続いて図３に示される3’配列に相補的な31ヌクレオチド配列 を含む。 増幅フラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla ，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントをBam HIおよびAsp718Iで消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。この フラグメントを本明細書中で「Ｆ１」と命名する。 このプラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp718Iで消化し、そして必要に応じて ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で日常の手順を用いて脱リン酸化し得 る。次いで、DNAを市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla,Ca.） を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを本明細書中で 「Ｖ１」と命名する。 組換えウイルスの形成ならびにhu-XAG-3の発現および精製は、実施例５に記載 の手順に従って実施される。 実施例７：哺乳動物細胞におけるhuXAG-1、huXAG-2、およびhuXAG-3のクローニ ングおよび発現 哺乳動物細胞における、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子配列の一過 的発現に使用されるベクターのほとんどは、SV40複製起点を有するはずである。 このことは、ウイルスDNA合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えば、C OS細胞）において、高コピー数のベクターの複製を可能にする。任意の他の哺乳 動物細胞株もまた、この目的に利用し得る。 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開 始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン サー、ドナーによって隣接するKozak配列および介在配列、ならびにRNAスプライ シングのためのアクセプター部位が挙げられる。非常に有効な転写を、SV40由来 の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例 えば、RSV、HTLV1、HIVI）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモ ーターで達成し得る。しかし、細胞シグナルもまた使用され得る（例えば、ヒト アクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとし ては、例えば、pSV1、およびpMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pRSVcat（A TCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109）のよう なベクターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela、28 3、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、 アフリカミドリザル細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニー ズハムスター卵巣細胞が挙げられる。 あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイ グロマイシン）どの同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の同定 および単離を可能にする。 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパ ク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、目的の遺伝子の数百 または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別 の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら、 Biochem J．227.277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(19 92)）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖さ せ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に取 り込まれる増幅遺伝子（単数または複数）を含む。チャイニーズハムスター卵巣 （CHO）細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。 発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT R）（Cullenら、Molecular and Cellular Biolugy，438-447（1985年３月））お よびCMV-エンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985）） を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamH1、Xba1、お よびAsp718）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに 、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化、および 終結シグナルを含む。 実施例７(a)：COS細胞におけるhuXAG-1のクローニングおよび発現 発現プラスミドphuXAG-1 HAを、huXAG-1をコードするcDNAを発現ベクターpcDN AI/AmpまたはpcDNAIII(Invitrogen，Inc.から入手し得る)内へクローニングする ことによって作製する。 発現ベクターpcDNAI/ampは以下：（１）E.coliおよび他の原核生物細胞におけ る増殖に効果的なE.coli複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択の ためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのSV40 複製起点；（４）CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５）血 液凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易にする、「HA」タグ）をコードす るいくつかのコドン、続いて終結コドンおよび配列されたポリアデニル化シグナ ルを含み、その結果cDNAは、都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、 そしてポリリンカーにおける制限部位によってSV40イントロンおよびポリアデニ ル化シグナルに作動可能に連結し得る。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:767-778( 1984)によって記載されたインフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピ トープに対応する。標的タンパク質に対するHAタグの融合体は、HAエピトープを 認識する抗体を用いて組み換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする 。pcDNAIIIは、さらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。 huXAG-1をコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモ ーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域へクローン化する 。プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。寄託されたクローンのhuXA G-1 cDNAを、上記のE.coliにおけるhuXAG-1の発現のためのベクターの構築につ いてと同様に、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。本実施 例において使用される適切なプライマーは、以下のようである。下線のBamHI部 位、Kozak配列、AUG開始コドン、および完全huXAG-1の5'コード領域の18bpを含 む5'プライマーは以下の配列を有する：5'CGC GGA TCC GCC ATC ATG GAG AAA AT T CCA GTG 3'（配列番号29）。下線のBamHI部位、終止コドン、および3'コード 配列の19bpを含む3'プライマーは以下の配列を有する(3'末端で)：5'CGC GGA TC C TTA CAA TTC AGT CTT CAG C3'（配列番号30）。 あるいは、以下のプライマーが使用され得る： PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、BamHIで消化し、次い で連結する。連結混合物を、E.coli株SUREへ形質転換し(Stratagene Cloning Sy stems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037から入手可能)、 そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニー の増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラスミ ドDNAを耐性コロニーから単離し、huXAG-1-コードフラグメントの存在について 制限分析または他の手段によって試験する。 組換えhuXAG-1の発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring H arbor，New York(1989)に記載のDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現ベク ターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるhuXAG-1の発現のための条 件下でインキュベートする。 huXAG-1-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Antibodies:A Labor atory Manual,第２版;Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har bor，New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によっ て検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２日後に、細胞を 、35S-システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識す る。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら（上記に引 用された）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ N P-40、0.1％ SDS、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA 特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次 いで、沈降されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって 分析する。期待されるサイズの発現産物が細胞溶解物において観察され、これは ネガティブコントロールにおいては観察されない。 実施例７(b)：COS細胞におけるhuXAG-2のクローニングおよび発現 発現プラスミドphuXAG-2 HAを、huXAG-2をコードするcDNAを発現ベクターpcDN AI/AmpまたはpcDNAIII(Invitrogen，Inc.から入手し得る)内へクローニングする ことによって作製する。 huXAG-2をコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモ ーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域へクローン化する 。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。下線の部位、Kozak配列、A UG開始コドン、および完全huXAG-2の5'コード領域の32bpを含む5'プライマーは 以下の配列を有する：5'GACT TGATCA GCC ATC ATG GAG ACG CGG CCT CGT CTC GG G GCC ACC TG 3'(配列番号31)。下線のAsp718I部位、終止コドン、および3'コー ド配列の35bpを含む3'プライマーは以下の配列を有する(3'末端で)：5'GACT GGT ACC GAA GGG GCA CAT TCA TGT TAC AAT TCA TCT TCA AG 3'(配列番号32)。 PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampは、BamHIおよびAsp718Iで 消化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SUREへ形質転換し(Stratagen e Cloning Systems)、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアン ピシリン耐性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーテ ィングする。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、huXAG-2-コードフラグ メントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。 組換えhuXAG-2の発現のために、COS細胞を、上記のように発現ベクターでトラ ンスフェクトする。細胞をベクターによるhuXAG-2の発現のための条件下でイン キュベートする。 huXAG-2-HA融合タンパク質の発現を、上記の方法を用いて放射標識化および免 疫沈降法によって検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２ 日後に、細胞を、35S-システインを含む培地中で８時間インキュベートすること によって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そして界面 活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％SDS、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて 細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質をSDS- PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現 産物が細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては 観察されない。 実施例７(c)：COS細胞におけるhuXAG-3のクローニングおよび発現 発現プラスミドphuXAG-3 HAを、huXAG-3をコードするcDNAを発現ベクターpcDN AI/AmpまたはpcDNAIII(Invitrogen，Inc.から入手し得る)内へクローニングする ことによって作製する。 huXAG-3をコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロモ ーターによって導かれるように、ベクターのポリリンカー領域へクローン化する 。プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。下線のBamHI部位、Kozak配 列、AUG開始コドン、および完全huXAG-3の5'コード領域の33bpを含む5'プライマ ーは以下の配列を有する：5'GACT GGATCC GCC ATC ATG ATG CTA CAC TCA GCT TT G GGT CTC TGC CTC 3'(配列番号33,)。下線のAsp718I部位、終止コドン、および 3'コード配列の31bpを含む3'プライマーは以下の配列を有する(3'末端で)：5'GA CT GGTACC GAA GGC TTT TTT CTA TCA TCT CTT ATA GCT CCT CAT ATG 3'(配列 番号34)。 PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampは、BamHIおよびAsp718Iで 消化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SUREへ形質転換し(Stratagen e Cloning Systems)、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアン ピシリン耐性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーテ ィングする。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、huXAG-3-コードフラグ メントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。 組換えhuXAG-3の発現のために、COS細胞を、DEAE-DEXTRANを用いて、発現ベク ターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるhuXAG-3の発現のための条 件下でインキュベートする。 huXAG-3-HA融合タンパク質の発現を、上記の方法を用いて放射標識化および免 疫沈降法によって検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２ 日後に、細胞を、35S-システインを含む培地中で８時間インキュベートすること によって標識する。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そして界面 活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて 細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質をSDS- PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現 産物が細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては 観察されない。 実施例７(d)：CHO細胞におけるhuXAG-1のクローニングおよび発現 ベクターpC4を、huXAG-1タンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC4 は、プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミ ドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプ ラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハ ムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選 択培地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによっ て選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝 子の増幅は、よく考証されている（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertin o，J.R.およびSchimke，R.T.，1978，J Biol．Chem．253:1357-1370(1978)、Ham lin，J.1、.およびMa，C.，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143(1990)、 Page，M.J.およびSydenham，M.A.，Biotechnology 9:64-68(1991)を参照のこと ）。漸増濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的 酵素DHFRを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第二の遺伝子がDH FR遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅 遺伝子（単数または複数）の1,000を越えるコピーを有する細胞株を開発するた めに使用され得るこのアプローチは、当該分野で公知である。続いて、メトトレ キサートが取り除かれる場合、細胞株は、宿主細胞の染色体（単数または複数） に取り込まれる増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。 プラスミドpC4は、ラウス肉腫ウイルス（Cullenら、Molec．Cell．Biol.,5:43 8-447(1985)）の長末端反復（LTR）の目的の強力なプロモーターの遺伝子、およ びヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Boshartら、Cell 41:521-530(1985)）の 最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントの遺伝子の発現を含む 。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にするBamHI、XbaIおよびAsp 718制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミド は、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロンおよびポリアデニル化部 位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現（例えば、ヒトβアクチンプロ モーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例 えば、HIVおよびHTLVI）からの長末端反復のために使用し得る。ClontechのTet- OffおよびTet-On遺伝子発現系ならびに類似の系を使用して、哺乳動物細胞中で 調節された方法でhuXAG-1遺伝子を発現し得る(Gossen，M.およびBujard，H．199 2，Proc Natl.Acad．Sci．USA 89:5547-5551)。mRNAのポリアデニル化のために 、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も同様 に使用し得る。染色体に挿入された目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、 選択マーカー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン）での同時トラン スフェクトに基づいて選択し得る。開始における２つ以上の選択マーカー（例え ば、G418およびメトトレキサート）を使用することが有用である。 プラスミドpC4を制限酵素BamHIで消化し、ついでウシ小腸ホスファターゼを用 いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１ ％アガロースゲルから単離する。 完全huXAG-1タンパク質をコードするDNA配列（リーダー配列を含む）を、遺伝 子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅 する。5'プライマーは、配列5'CGC GGA TCC GCC ATC ATG GAG AAA ATT CCA GTG 3'(配列番号29)を有し、これは、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いてKozak ，M.，J．Mol．Biol．196:947-950(1987)によって記載されるような、真核生物 における翻訳開始のための有効なシグナル、そして図１（配列番号１）に示され るhuXAG-1のコード配列の18塩基を含む。3'プライマーは、配列5'CGC GGA TCC T TA CAA TTC AGT CTT CAG C3'(配列番号30)を有し、これは、下線を付したBamHI 制限酵素部位、続いて図１（配列番号１）に示されるhuXAG-1遺伝子の非翻訳領 域に相補的な19ヌクレオチドを含む。 あるいは、以下のプライマーを使用し得る： 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIで消化し、次いで１％ア ガロースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化 ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101細胞またはXL-1 B lue細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いてプラスミドpC4に 挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。 活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ クションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（Fe lgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSV2-neoとともに同時トランス フェクトする。プラスミドpSV2-neoは優性選択マーカー（G418を含む一群の抗生 物質への耐性を与える酵素をコードするTn5由来の遺伝子neo）を含む。細胞を、 １mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプシン 処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートと1mg/ml G418で補充 したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Greiner，German y）に播種する。約10〜14日の後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで 異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を用いて 、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトト レキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μM、 ２μM、５μM、10μM、20μM）含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を 、クローンが100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。 所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析に よってか、または逆相HPLC分析によって分析する。 実施例７(e)：CHO細胞におけるhuXAG-2のクローニングおよび発現 ベクターpC4を、huXAG-2タンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC4 を制限酵素BclIおよびAsp718Iで消化し、ついでウシ腸ホスファターゼを用いて 、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％ア ガロースゲルから単離する。 完全huXAG-2タンパク質をコードするDNA配列（そのリーダー配列を含む）を、 遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて 増幅する。5'プライマーは、配列5'GACT TGATCA GCC ATC ATG GAG ACG CGG CCT CGT CTC GGG GCC ACC TG 3'(配列番号31)を有し、これは、下線を付したBclI制 限酵素部位、続いてKozak，M.，J．Mol．Biol．196:947-950(1987)によって記載 されるような、真核生物における翻訳開始のための有効なシグナル、そして図２ （配列番号３）に示されるhuXAG-2のコード配列の32塩基を含む。3'プライマー は、配列5'GACT GGTACC GAA GGG GCA CAT TCA TGT TAC AAT TCA TCT TCA AG 3'( 配列番号32)を有し、これは、下線を付したAsp718I制限酵素部位、続いて図２（ 配列番号３）に示されるhuXAG-2遺伝子の非翻訳領域に相補的な35ヌクレオチド を含む。 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼBclIおよびAsp718Iで消化し、 次いで１％アガロースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグメントおよ び脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101細胞 またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いてプ ラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。 活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ クションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチンを用 いて、0.5μgのプラスミドpSV2-neoとともに同時トランスフェクトする。細胞を 、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプシ ン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートと1mg/ml G418で補 充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Greiner，Germ any）に播種する。約10〜14日の後、単一のクローンをトリプシン処理し、次い で異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を用い て、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメト トレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μM 、２μM、５μM、10μM、20μM）含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順 を、クローンが100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す 。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析 によってか、または逆相HPLC分析によって分析する。 実施例７(f)：CHO細胞におけるhuXAG-3のクローニングおよび発現 ベクターpC4をまた、huXAG-3タンパク質の発現のために使用する。プラスミド pC4を制限酵素BamHIおよびAsp718Iで消化し、ついでウシ腸ホスファターゼを用 いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％ アガロースゲルから単離する。 完全huXAG-3タンパク質をコードするDNA配列（そのリーダー配列を含む）を、 遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて 増幅する。5'プライマーは、配列5'GACT GGATCC GCC ATC ATG ATG CTA CAC TCA GCT TTG GGT CTC TGC CTC 3'(配列番号33)を有し、これは、下線を付したBamHI 制限酵素部位、続いてKozak，M.，J．Mol．Biol．196:947-950(1987)によって記 載されるような、真核生物における翻訳開始のための有効なシグナル、そして 図３（配列番号５）に示されるhuXAG-3のコード配列の33塩基を含む。3'プライ マーは、配列5'GACT GGTACC GAA GGC TTT TTT CTA TCA TCT CTT ATA GCT CCT CA T ATG 3'(配列番号34)を有し、これは、下線を付したAsp718I制限酵素部位、続 いて図３（配列番号５）に示されるhuXAG-3遺伝子の非翻訳領域に相補的な31ヌ クレオチドを含む。 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718Iで消化し、 次いで１％アガロースゲルで再び精製する。次いで、単離したフラグメントおよ び脱リン酸化ベクターをT4DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101細胞 またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いてプ ラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。 活性なDHFR遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフ ェクションのために使用する。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチンを 用いて、0.5μgのプラスミドpSV2-neoとともに同時トランスフェクトする。細胞 を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプ シン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートと1mg/ml G418で 補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Greiner，Ge rmany）に播種する。約10〜14日の後、単一のクローンをトリプシン処理し、次 いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を用 いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメ トトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μ M、２μM、５μM、10μM、20μM）含む新たな６ウエルプレートに移す。同じ手 順を、クローンが100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返 す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分 析によってか、または逆相HP1、C分析によって分析する。 実施例８：huXAG-1 mRNA発現の組織分布 ノーザンブロット分析を行って、とりわけSambrookら（上記に引用される）に よって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるhuXAG-1をコードする遺伝子 の発現レベルを試験した。本発明のhuXAG-1タンパク質の完全ヌクレオチド配列 を含むcDNAプローブ（配列番号１）を、rediprimeTMDNA標識系（Amersham Life Science）を用いて、製造業者の説明書に従って、32Pで標識した。標識後、プロ ーブを、CHROMA SPIN-100TMカラム（Clontech Laboratories，Inc.）を用いて、 製造業者のプロトコル番号PT1200-1に従って、精製した。次いで、精製した標識 化プローブを使用して、huXAG-1をコードする遺伝子の発現について、種々のヒ ト組織を試験した。 種々のヒト組織（H）またはヒト免疫系組織（IM）を含む多組織ノーザン（MTN ）ブロットをClontechから入手し、そしてExpressHybTM Hybridization Solutio n（Clontech）を用いて、製造業者のプロトコル番号PT1190-1に従って、標識化 プローブで試験した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に続いて、ブロットを 取り付け、そして-70℃にて一晩フィルムに暴露し、そして標準的な手順に従っ てフィルムを現像した。ヒト結腸ガン由来の細胞においてシグナルが検出された 。遺伝子が結腸ガン特異的であることをさらに確かめた他のいずれの組織におい てもシグナルは検出されなかった。 実施例９：huXAG-2 mRNA発現の組織分布 実施例８に記載の方法を用いて、ノーザンブロット分析を行って、ヒト組織に おけるhuXAG-2遺伝子の発現を試験した。huXAG-2の発現は、遍在性であることが 示された。 実施例10：huXAG-3 mRNA発現の組織分布 実施例８に記載の方法を用いて、ノーザンブロット分析を行って、ヒト組織に おけるhuXAG-3遺伝子の発現を試験した。発現が、結腸組織、小腸組織、および 肺組織において検出された。 本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外に実施され得るこ とは明白である。 本発明の多数の改変および変更が、上記の教示に照らして可能であり、それゆ え添付の請求項の範囲内である。 本明細書中に参考として援用される全ての刊行物（特許、特許明細書、学術誌 の記事、研究室マニュアル、書籍、または他の文献）の開示の全体が、本明細書 で参考として援用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エブナー，ラインハルト アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザーズバーグ，シェルボーン テラス ナンバー316 9906 (72)発明者 エンドレス，グレゴリー エイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20850, ポトマック，クラゲット ファーム ドラ イブ 9729

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．単離された核酸分子であって、 （a）配列番号２の約-20から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-23 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-23から約143までのアミノ酸 を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （b）配列番号２の約-19から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-22 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-22から約143までのアミノ酸 を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （c）配列番号２の約１から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約１か ら約149までのアミノ酸、または配列番号６の約１から約143までのアミノ酸を含 むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （d）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列； （e）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列；および （f）（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）に記載のヌクレオチド配列の いずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列に少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ２．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１の（a）、 （b）、（c）、（d）、（e）、または（f）に記載のヌクレオチド配列に同一の ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオ チドを含み、ここで該ポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼー ション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、単離された核酸分子。 ３．請求項１の（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）に記載のアミノ酸配 列を有するhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドのエピトープ保有部 分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 ４．配列番号２の約-1から約23までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番 号２の約24から約32までのアミノ酸残基を含むポリペプチド：配列番号２の約41 から約52までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約70から約83ま でのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約93から約105までのアミ ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約118から約130までのアミノ酸残基 を含むポリペプチド；配列番号４の約-1から約15までのアミノ酸残基を含むポリ ペプチド；配列番号４の約20から約30までのアミノ酸残基を含むポリペプチド； 配列番号４の約71から約89までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４ の約97から約115までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６の約２か ら約21までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６の約81から約92まで のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号６の約109から約127までの アミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択されるhuXAG-1、huXAG-2、 またはhuXAG-3ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする、請求項３に記 載の単離された核酸分子。 ５．単離された核酸分子であって、 （a）配列番号１に示される配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって 、ここで該フラグメントが配列番号１からの少なくとも50の連続するヌクレオチ ドを含むが、ただし該単離された核酸分子が、配列番号９、配列番号10、配列番 号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号35、配列番 号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、またはそれらの任意のサブフラグ メントではない、ヌクレオチド配列； （b）配列番号３に示される配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって 、ここで該フラグメントが配列番号３からの少なくとも50の連続するヌクレオチ ド を含むが、ただし該単離された核酸分子が、配列番号16、配列番号17、配列番号 18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、またはそ れらの任意のサブフラグメントではない、ヌクレオチド配列； （c）配列番号５に示される配列のフラグメントのヌクレオチド配列であって 、ここで該フラグメントが配列番号５からの少なくとも50の連続するヌクレオチ ドを含むが、ただし該単離された核酸分子が、配列番号40もしくは配列番号41、 またはそれらの任意のサブフラグメントではない、ヌクレオチド配列；および （d）（a）、（b）、または（c）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド 配列、 からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核 酸分子。 ６．請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を含む、組 換えベクターを作製するための方法。 ７．請求項６に記載の方法によって生成される、組換えベクター。 ８．請求項７に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を含む、組換え 宿主細胞を作製する方法。 ９．請求項８に記載の方法によって生成される、組換え宿主細胞。 １０．huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドを生成するための組換え 方法であって、請求項９に記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現され る条件下で培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を含む、組換え 方法。 １１．単離されたポリペプチドであって、 （a）配列番号２の約-20から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-23 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-23から約143までのアミノ酸 ； （b）配列番号２の約-19から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-22 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-22から約143までのアミノ酸 ； （c）配列番号２の約１から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約１か ら約149までのアミノ酸、または配列番号６の約１から約143までのアミノ酸； （d）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ポ リペプチドのアミノ酸配列； （e）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポ リペプチドのアミノ酸配列；および （f）（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）に記載のポリペプチドのいず れか一つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群より選択される配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有する、 単離されたポリペプチド。 １２．huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドのエピトープ保有部分を 含み、ここで該部分が、配列番号２の約-1から約23までのアミノ酸残基を含むポ リペプチド；配列番号２の約24から約32までのアミノ酸残基を含むポリペプチド ；配列番号２の約41から約52までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ２の約70から約83までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約93か ら約105までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の約118から約130 までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４の約-1から約15までのアミ ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号４の約20から約30までのアミノ酸残基を 含むポリペプチド；配列番号４の約71から約89までのアミノ酸残基を含むポリペ プチド；配列番号４の約97から約115までのアミノ酸残基を含むポリペプチド； 配列番号６の約２から約21までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番 号６の約81から約92までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号６ の約109から約127までのアミノ酸残基を含むポリペプチドからなる群より選択さ れる、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド。 １３．組換え宿主細胞において生成されるかまたは含まれる、請求項１１に記載 の単離されたポリペプチド。 １４．前記組換え宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の単離され たポリペプチド。 １５．単離された核酸分子であって、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペ プチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、１〜50の保存的アミノ酸 置換を除いて、該ポリペプチドが、 （a）配列番号２の約-20から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-23 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-23から約143までのアミノ酸 を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （b）配列番号２の約-19から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-22 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-22から約143までのアミノ酸 を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （c）配列番号２の約１から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約１か ら約149までのアミノ酸、または配列番号６の約１から約143までのアミノ酸を含 むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （d）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列； （e）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポ リペプチドをコードするヌクレオチド配列；および （f）（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）に記載のヌクレオチド配列の いずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列を有する、単離された核酸分子。 １６．単離されたhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドであって、こ こで、１〜50の保存的アミノ酸置換を除いて、該ポリペプチドが、 （a）配列番号２の約-20から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-23 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-23から約143までのアミノ酸 ； （b）配列番号２の約-19から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約-22 から約149までのアミノ酸、または配列番号６の約-22から約143までのアミノ酸 ； （c）配列番号２の約１から約155までのアミノ酸、または配列番号４の約１か ら約149までのアミノ酸、または配列番号６の約１から約143までのアミノ酸； （d）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する全長ポ リペプチドのアミノ酸配列； （e）ATCC受託番号97641、またはATCC受託番号209134、またはATCC受託番号20 9137に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ポ リペプチドのアミノ酸配列；および （f）（a）、（b）、（c）、（d）、または（e）に記載のポリペプチドのいず れか一つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列、 からなる群より選択される配列を有する、単離されたポリペプチド。 １７．請求項１１に記載のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3ポリペプチドに特 異的に結合する、単離された抗体または抗体フラグメント。 １８．減少したレベルのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3を必要とする個体を 処置するための方法であって、該個体に、請求項１７に記載の単離された抗体ま たは抗体フラグメントを含む組成物を投与する工程を含む、方法。 １９．増加したレベルのhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3を必要とする個体を 処置するための方法であって、該個体に、請求項１１に記載の単離されたポリペ プチドを含む組成物を投与する工程を含む、方法。 ２０．診断方法であって、 （a）個体の細胞または体液中のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子の発 現レベルを測定する工程；および （b）該個体のhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子の発現レベルと、標準 huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子の発現レベルとを比較し、それにより 該標準を越えるhuXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3遺伝子の発現レベルの増加ま たは減少が、huXAG-1、huXAG-2、またはhuXAG-3関連障害の指標である工程、を 含む、診断方法。 ２１．（a）個体の結腸直腸細胞または体液中のhuXAG-1遺伝子の発現レベルを測 定する工程；および （b）該個体のhuXAG-1遺伝子の発現レベルと、標準huXAG-1遺伝子の発現レベ ルとを比較し、それにより該標準を越えるhuXAG-1遺伝子の発現レベルの増加が 、大腸ガンの指標である工程、 を含む、請求項２０に記載の診断方法。 ２２．前記huXAG-1遺伝子の発現レベルが、mRNAを検出することによってアッセ イされる、請求項２１に記載の方法。 ２３．前記huXAG-1遺伝子の発現レベルが、huXAG-1タンパク質を検出することに よってアッセイされる、請求項２１に記載の方法。 ２４．前記タンパク質が抗体で検出される、請求項２３に記載の方法。
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