ES2279801T3 - Uso de proteinas de membrana asociadas al cancer de mama (bcpm) para el tratamiento, profilaxis y diagonostico del cancer de mama. - Google Patents

Uso de proteinas de membrana asociadas al cancer de mama (bcpm) para el tratamiento, profilaxis y diagonostico del cancer de mama. Download PDF

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Abstract

El uso de un anticuerpo capaz de unión inmunoespecífica a BST-2 (BCMP-17) o uno de sus fragmentos o derivados que comprende el dominio de unión del anticuerpo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama.

Description

Uso de proteínas de membrana asociadas al cáncer de mama (BCPM) para el tratamiento, profilaxis y diagnóstico del cáncer de mama.
Introducción
Esta invención se refiere a la identificación de proteínas de membrana no reseñadas previamente en las células de cáncer de mama humana que pueden formar dianas biológicas contra las que pueden hacerse anticuerpos terapéuticos u otros agentes farmacéuticos, o tener utilidad como marcadores de diagnóstico y pronóstico para el cáncer de mama y metástasis del cáncer de mama.
Fundamento de la invención
El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado no de piel entre las mujeres en los Estados Unidos. Ocupa el segundo lugar en las muertes por cáncer por detrás del de pulmón. Aproximadamente 180.000 nuevos casos se diagnosticarán en 1997 y aproximadamente 44.000 mujeres morirán de la enfermedad (National Cancer Institute, www.nci.nih.gov, USA, 1999). En el Reino Unido, el cáncer de mama es con mucho el más común de los cánceres entre las mujeres, con 34.600 nuevos casos en 1998 (Cancer Research Campaign, www.crc.org.uk, GB, 2000). El noventa y nueve por ciento de los cánceres de mama ocurren en mujeres. El riesgo de contraer cáncer de mama aumenta considerablemente con la edad; el riesgo de desarrollar cáncer de mama en algún momento de la vida se estima en 1 de cada 8 mujeres en Estados Unidos. El coste anual del tratamiento del cáncer de mama en Estados Unidos es de aproximadamente 10 mil millones de dólares (Fuqua, et al, 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA). La incidencia del cáncer de mama se ha elevado a lo largo de las últimas cinco décadas, pero recientemente se ha estacionado. Esto puede reflejar un periodo de detección temprana de los cánceres de mama con la mamografía. Hay muchos factores establecidos que pueden incrementar el riesgo en la mujer de padecer esta enfermedad. Esto incluye la avanzada edad, el historial previo de cáncer de mama, la exposición significativa a la radiación, el historial familiar de cáncer de mama, una clase socioeconómica superior, la ausencia de embarazos, la menarquía temprana, la menopausia tardía, o la edad del primer embarazo superior a los 30 años. El uso prolongado de contraceptivos orales a una edad temprana parece aumentar el riesgo ligeramente. La sustitución prolongada de estrógenos postmenopáusicos aumenta el riesgo de un 20 a un 40%. Se ha especulado con que una disminución de la edad de la menarquía, los modelos de nacimiento cambiantes, o una elevación en el uso de estrógenos exógenos ha contribuido a aumentar la incidencia del cáncer de mama (Fuqua, et al. 2000, American Asociation for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
Causas del cáncer de mama
El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea. Aunque las hormonas femeninas juegan un papel significativo en el origen y la evolución de muchos tumores de mama, hay muchos otros factores reconocidos o desconocidos implicados. Las perturbaciones en los oncogenes identificados incluyen la amplificación del HER-2 y de los genes receptores del factor de crecimiento epidérmico, y la sobreexpresión de ciclina D1. La sobreexpresión de estos oncogenes se ha asociado con un pronóstico significativamente más pobre. Igualmente, las alteraciones genéticas o la pérdida de genes supresores de tumores, como el gen p53, se ha documentado mucho en el cáncer de mama y también se asocian con un pronóstico pobre. Los investigadores han identificado dos genes, llamados BRCA1 y BRCA2, que predicen el cáncer de mama familiar premenopáusico. La evaluación del riesgo genético es hoy posible, lo que puede mejorar la identificación de candidatos para experiencias de quimioprevención (Fuqua, et al. 2000, American Asociation for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
Diagnóstico
El diagnóstico temprano del cáncer de mama es vital para asegurar el resultado más favorable para el tratamiento. Muchos países con sistemas de sanidad avanzados han instituido programas de exploración para el cáncer de mama. Esto típicamente toma la forma de rayos-x regulares de la mama (mamografía) durante el intervalo del grupo de edad de 50-60 años en los que se ha demostrado el mayor beneficio de esta intervención. Algunas autoridades han abogado por la extensión de estos programas más allá de los 60 y en el grupo de edad de 40-49. Las autoridades sanitarias en muchos países también han promovido la necesidad de una autoexploración regular de las mamas por las mujeres. Las anormalidades detectadas durante estos procedimientos de exploración y los casos sintomáticos se deberían confirmar normalmente con la citología de aspiración, la biopsia de aguja de núcleo con una técnica de ultrasonidos o estereotáctica para las lesiones no palpables o la biopsia excisional o incisional. Al mismo tiempo debe determinarse cualquier otra información relevante para el pronóstico y opciones de tratamiento, tal como el estatus del estrógeno (ER) y del receptor de progesterona (PR) (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.nih.gov).
Escenificación de la enfermedad y pronóstico
La escenificación es el proceso de descubrir cuánto se ha extendido el cáncer. El sistema de cenificación del American Joint Comittee on Cancer (AJCC), también conocido como sistema TNM, es el más usado generalmente para el cáncer de mama. El sistema de TNM para determinación de la escenificación da tres piezas clave de información:
La letra T seguida de un número de 0 a 4 describe el tamaño del tumor y la extensión a la piel o a pared del pecho bajo la mama.
La letra N seguida de un número de 0 a 3, indica si el cáncer se ha extendido a los nódulos linfáticos cerca de la mama y, si es así, si los nódulos afectados están adheridos a otras estructuras debajo del brazo.
La letra M, seguida de 0 ó 1 indica si hay metástasis del cáncer a otros órganos del cuerpo o a nódulos linfáticos que no están próximos a la mama.
Para hacer algo más clara esta información, las descripciones TNM pueden agruparse juntas en una serie más sencilla de etapas, llamadas etapa 0 hasta la etapa IV (0-4). En general, cuanto más bajo es el número, menos se ha extendido el cáncer. Un número alto, como el de la etapa IV (4) significa un cáncer más grave. (American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org).
Supervivencia del cáncer de mama por etapas
Etapa Tasa de supervivencia relativa de 5 años
0 100%
I 98%
IIA 88%
IIB 76%
IIIA 56%
IIIB 49%
IV 16%
(American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org) 
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Aunque la etapa anatómica (tamaño de tumor primario, implicación del nódulo linfático axilar) es un factor de pronóstico importante, otras características pueden tener valores predictivos. Por ejemplo, estudios del National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) y el International Breast Cancer Study Group (IBCSG) han demostrado que el grado nuclear del tumor y el grado histológico, respectivamente, son indicadores importantes de resultado después de la terapia adyuvante para el cáncer de mama. Hay una evidencia sustancial de que el estatus del receptor de estrógenos y las mediciones de la capacidad proliferativa del tumor primario (índice de marcado de timidina o mediciones citométricas de flujo de la fase-S y ploide) pueden tener un valor predictivo independiente importante. En la enfermedad en la etapa II, el estatus PR puede tener un valor de pronóstico mayor que en el estatus ER. La vascularización del tumor, c-erbB-2, c-myc, expresión p53, y la invasión de los vasos linfáticos pueden ser también indicadores de pronóstico en pacientes con cáncer de mama (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.org y sus referencias).
Tratamiento
La cirugía, la radioterapia, la terapia con hormonas y la quimioterapia son los tratamientos más comunes para el cáncer de mama.
Cirugía. La mayoría de las mujeres con cáncer de mama tendrán algún tipo de cirugía. El propósito de la cirugía es eliminar todo lo que se pueda del cáncer. Esto puede ser en forma de lumpectomía o de mastectomía más radical con reconstrucción de la mama. La cirugía también puede combinarse con otros tratamientos como la quimioterapia, la terapia con hormonas o la radioterapia. La cirugía también puede hacerse también para descubrir la extensión del cáncer de mama a los nódulos linfáticos debajo del brazo (disección axilar), para restaurar una apariencia más normal (cirugía reconstructiva), o para aliviar los síntomas del cáncer avanzado.
Quimioterapia. La quimioterapia es el uso de fármacos anicancerígenos para matar las células del cáncer. Cuando la quimioterapia se da después de la cirugía (terapia auxiliar) puede reducir la posibilidad de recurrencia del cáncer. La quimioterapia también se usa como el tratamiento principal para mujeres cuyo cáncer estaba extendido cuando se descubrió, o que se extiende mucho después del tratamiento inicial. La quimioterapia neoauxiliar se da antes de la cirugía, generalmente para contraer el tumor y hacerlo más fácil de extraer. La quimioterapia se da en ciclos, con un periodo de recuperación después de cada periodo de tratamiento. El proceso total dura de tres a seis meses. Generalmente es más efectivo usar varios fármacos mejor que uno solo individualmente. Las combinaciones más frecuentemente utilizadas son: ciclofosfamida, metrotexato y fluorouracil (CMF) ciclofosfamida, doxorrubicina (Adriamicina), y fluorouracil (CAF) doxorubicina (Adriamicina) y ciclofosfamida (AC), con o sin paclitaxel (Taxol) doxorubicina (Adriamicina), seguido por CMF.
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Radioterapia. La terapia con radiaciones se aplica generalmente al tratamiento del cáncer de mama. Se puede utilizar para reducir el tamaño del tumor antes de la cirugía o para destruir las células cancerígenas que queden en la mama, pared del pecho, o en la zona de debajo del brazo después de la cirugía.
Terapia hormonal y quimioprevención. La hormona estrógeno puede incrementar el crecimiento de las células del cáncer de mama en algunas mujeres. Se administra un fármaco como el tamoxifeno, que bloquea el efecto del estrógeno, para medir este crecimiento. Otro fármaco más nuevo como taloxifeno también bloquea el efecto del estrógeno sobre el tejido mamario y el cáncer de mama. Hay una gran evidencia cada vez mayor de que estos tratamientos antiestrógenos pueden tener también un efecto en la quimioprevención del cáncer de mama en individuos de alto riesgo.
Inmunoterapia. Trastuzumab (Herceptina) es un nuevo agente inmunoterapéutico que se une a un receptor de factor de crecimiento conocido como c-erbB2/HER2/neu, que está presente en cantidades pequeñas sobre la superficie de las células de la mama normales y a niveles mucho más altos en algunos cánceres de mama. Esta proteína puede causar que el cáncer crezca y se extienda más rápidamente. Herceptina puede detener que la proteína c-erbB2/HER2/neu promueva el crecimiento celular del cáncer de mama. Puede también ayudar al sistema inmune a atacar mejor al cáncer. La Herceptina se comienza generalmente después de que la quimioterapia y el tratamiento hormonal estándar no funcionan ya (American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org).
Desafíos terapéuticos
Los mayores desafíos en el tratamiento del cáncer de mama son mejorar las tasas de detección temprana, encontrar nuevos marcadores no invasivos que puedan usarse para seguir la progresión de la enfermedad e identificar la recaída, y encontrar terapias mejoradas y menos tóxicas, especialmente para enfermedades más avanzadas en las que la supervivencia de 5 años es todavía muy escasa. Se necesita enormemente identificar dianas que sean más específicas para las células del cáncer, idealmente unas que se expresen sobre la superficie de las células tumorales de forma que puedan atacarse prometiendo nuevas aproximaciones como toxinas dirigidas e inmunoterapéuticas.
Sumario de la invención
Esta invención proporciona métodos a utilizar para exploración, diagnóstico, pronóstico y terapia del cáncer de mama, para controlar la efectividad del tratamiento del cáncer de mama y para el desarrollo de fármacos para el tratamiento del cáncer de mama.
Hemos utilizado la espectrometría de masa para identificar los péptidos generados por electroforesis de gel y digestión tríptica de extractos de proteína de membrana de líneas de células mamarias humanas cultivadas en laboratorio. Las secuencias de péptidos se compararon con las bases de datos existentes de cADN y las secuencias de genes correspondientes identificadas. Muchas de estas no se habían detectado previamente en las membranas celulares de la mama y representan una nueva serie de proteínas de diagnóstico y/o valor terapéutico potencial.
Así, un primer aspecto de la invención proporciona métodos de diagnóstico del cáncer de mama que comprenden analizar una muestra de tejido de la mama con una electroforesis unidimensional para detectar una proteína de membrana asociada al cáncer de mama (BCMP). Solo la BCMP 17 (BST-2) se pretende que forme parte de la invención aquí expuesta. El término una "BCMP" o "BCMPs" se pretende que se refiera solo a BCMP 17 (BST-2). Estos métodos también son apropiados para explorar, pronosticar, monitorizar los resultados de la terapia, desarrollar el fármaco y descubrir las nuevas dianas para el tratamiento del fármaco.
Un segundo aspecto de la invención proporciona el uso de métodos de tratamiento del cáncer de mama, que comprenden la administración a un paciente de una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto que module (por ejemplo, regule hacia arriba o hacia abajo) o complemente la expresión o la actividad biológica (o ambas) de la BCMP en pacientes que tienen cáncer de mama, con el fin de (a) prevenir la aparición o desarrollo del cáncer de mama; (b) prevenir la progresión del cáncer de mama; o (c) mejorar los síntomas del cáncer de mama.
Un tercer aspecto de la invención proporciona métodos de exploración para compuestos que modulen (por ejemplo, hacia arriba o hacia abajo) la expresión de la actividad biológica de una BCMP.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona el uso de compuestos como se define en las reivindicaciones 1, 4 y 19 para la fabricación de un medicamento útil en anticuerpos monoclonales y policlonales capaz de unirse inmunoespecíficamente a una BCMP.
Así en un quinto aspecto, esta invención proporciona un método para explorar y/o diagnosticar el cáncer de mama en un sujeto humano, dicho método comprende la etapa de identificar la presencia o la ausencia de BCMP 17 definido para un peso molecular aparente de 15kDa, una secuencia de péptido de digestión tríptica de LQDASAEVER y número de acceso SwissProt Q10589 en una muestra biológica obtenida a partir de dicho sujeto humano.
En un sexto aspecto, esta invención proporciona un método para monitorización y/o evaluación del tratamiento de cáncer de mama en un sujeto humano, que comprende la fase de identificar la presencia o ausencia de las BCMPs como se definió antes en una muestra biológica obtenida a partir de dicho sujeto humano.
En un séptimo aspecto, esta invención proporciona un método para identificar la presencia o ausencia de células de cáncer de mama metastásicas en una muestra biológica obtenida a partir de un sujeto humano que comprende la fase de identificar la presencia o ausencia de las BCMPs como se definió antes.
En un octavo aspecto, esta invención proporciona un método para monitorizar y/o evaluar el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto humano, que comprende la etapa de determinar si la BCMPs como se definió antes aumenta/decrece en una muestra biológica obtenida de un paciente.
La muestra biológica utilizada puede ser de cualquier fuente, como una muestra de suero o una muestra de tejido, por ejemplo, tejido de mama. De hecho, cuando se busca la evidencia de un cáncer de mama metastásico, se debe mirar en los puntos principales de la metástasis de mama, por ejemplo, nódulos linfáticos, hígado, pulmón y/o huesos.
Estos aspectos de esta invención se establecen en las reivindicaciones y se explican más adelante.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1 a 8 y la figura 10 no se pretende que formen parte de la invención mostrada aquí.
La figura 9 muestra el nivel de expresión de mRNA en varios tejidos para BCMP 17.
Descripción detallada de la invención
La invención descrita en detalle más adelante proporciona métodos para la exploración, diagnóstico y pronóstico clínico del cáncer de mama en un sujeto mamífero, para identificar los pacientes que más probablemente respondan a un tratamiento particular, para monitorizar los resultados de la terapia del cáncer de mama, para investigación del fármaco y desarrollo del fármaco. La invención también abarca el uso de composiciones terapéuticas para un sujeto mamífero para tratar o prevenir el cáncer de mama. El sujeto mamífero puede ser un mamífero no humano, pero es preferiblemente humano, más preferiblemente un humano adulto, por ejemplo, un sujeto humano de al menos 21 años (más preferiblemente al menos 35 años, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o al menos 80) de edad. Para la claridad de la exposición y sin limitar de ningún modo, la invención se describirá con respecto al análisis de muestras de tejido mamario. Sin embargo, como apreciarán los expertos en la técnica, los ensayos y técnicas descritos después pueden aplicarse a otros tipos de muestras de pacientes, incluyendo un fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma o saliva), una muestra de tejido de un paciente en riesgo de tener cáncer de mama (por ejemplo, una biopsia, como una biopsia de tejido mamario) o sus homogenados. Estos métodos de esta invención son especialmente convenientes para exploración, diagnóstico y pronóstico de un sujeto vivo, pero pueden también utilizarse para diagnósticos postmortem en un sujeto, por ejemplo, para identificar a los miembros de la familia que tienen riesgo de desarrollar la misma enfermedad.
Como se utiliza aquí, tejido mamario se refiere a la propia mama, así como al tejido adyacente y/o dentro del estrato que está debajo de la mama.
Proteínas de membrana asociadas al cáncer de mama (BCMPs)
En un aspecto de la invención, una electroforesis unidimensional se utiliza para analizar el tejido mamario de un sujeto, preferiblemente un sujeto vivo, con el fin de medir la expresión de una o más proteínas de membrana asociadas al cáncer de mama (BCMPs) para exploración o diagnóstico del cáncer de mama, para determinar el pronóstico de un paciente de cáncer de mama, para monitorizar la efectividad de la terapia del cáncer de mama, o para el desarrollo de fármacos. Como se utiliza aquí, una "electroforesis unidimensional" (1D-electroforesis) significa una técnica que comprende electroforesis de desnaturalización; esto genera un gel unidimensional (1D-gel) que contiene una pluralidad de proteínas separadas. Preferiblemente, la etapa de electroforesis de desnaturalización utiliza electroforesis de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Especialmente preferidos son los métodos y aparatos altamente precisos y automatizables ("la Tecnología Preferida") descrita en WO 98/23950, con particular referencia a un protocolo preferido en las páginas 19-29. Brevemente, la tecnología preferida proporciona eficientes aparatos y métodos asistidos por ordenador, para identificar, seleccionar y caracterizar las biomoléculas en una muestra biológica. Una serie unidimensional se genera separando moléculas en un gel unidimensional de acuerdo con su movilidad electroforética. Un perfil digital generado por ordenador de la serie se genera representando la identidad, peso molecular aparente de una pluralidad de biomoléculas detectadas en una serie unidimensional, permitiendo así la comparación a través de ordenador de perfiles de múltiples muestras biológicas, así como la escisión asistida por ordenador de proteínas separadas de interés.
Un escáner preferido para detectar proteínas marcadas fluorescentemente se describe en WO 96/36882 y en la tesis PH.D. de David A. Basiji, titulada "Development of a High-throughput Fluorescente Scanner Employing Internal Reflection Optics and Phase-sensitive Detection (Total Internal Reflection, Electrophoresis)", Universidad de Washington (1997), Volumen 58/12-B de Dissertation Abstracts International, página 6686. Estos documentos describen un escáner de imagen diseñado específicamente para funcionamiento integrado automatizado a altas velocidades. El escáner puede ofrecer imágenes de geles que se han teñido con colorantes fluorescentes o tintes de plata, así como pantallas de fósforo de almacenamiento. La tesis de Basiji proporciona un sistema de detección sensible a fase para discriminar la fluorescencia modulada del ruido de la línea de base debido a la dispersión del láser o fluorescencia homogénea, pero el escáner puede también manejarse en un modo no sensible a fase. Esta capacidad de detección sensible a fase aumentaría la sensibilidad del instrumento por un orden de magnitud o más en comparación con los sistemas de imágenes de fluorescencia convencionales. La sensibilidad aumentada reduciría la carga de preparación de la muestra sobre los instrumentos anteriores mientras que la calidad de la imagen mejorada simplifica el análisis de la imagen posterior en el proceso.
Un escáner más preferido es el escáner Apolo 2 (Oxford Glycosciences, Oxford, UK) que es una versión modificada del escáner antes descrito. En el escáner Apolo 2, el gel se transporta a través del escáner sobre un sistema de transmisión de tornillo de avance de precisión. Es preferible dejar la placa de vidrio sobre el sistema de transmisión por correa que se describe en la tesis de Basiji al proporcionar un significado reproducible para transportar de forma segura el gel por delante de la óptica de formación de imágenes.
En el escáner Apolo 2, el gel se asegura contra tres topes de alineamiento que sostienen rígidamente la placa de vidrio en una posición conocida. Haciendo esto en conjunción con el sistema de transporte de precisión anterior, la posición absoluta del gel puede predecirse y registrarse. Esto asegura que coordinados de cada figura sobre el gel puedan determinarse con más seguridad y comunicarse, si se desea, a un robot de corte para la excisión de la figura. En el escáner Apolo 2, el vehículo que sostiene el gel tiene cuatro marcadores fluorescentes integrales a usar para corregir la geometría de imagen. Estos marcadores son una figura de control de calidad que confirma que el escaneo se ha llevado a cabo correctamente.
En comparación con el escáner descrito en la tesis de Basiji, los componentes ópticos del escáner Apolo 2 se han invertido. En el escáner Apolo 2, el láser, espejo guía de ondas y otros componentes ópticos están sobre la placa de vidrio que se está escaneando. El escáner descrito en la tesis de Basiji tiene estos componentes por debajo. En el escáner Apolo 2, la placa de vidrio se monta sobre el gel de escáner hacia abajo, de forma que la trayectoria óptica permanezca a través de la placa de vidrio. Haciendo esto, cualquier partícula de gel que pueda romperse fuera de la placa de vidrio caerá dentro de la base del instrumento más que en la óptica. Esto no afecta a la funcionalidad del sistema pero aumenta su fiabilidad.
Todavía más preferido es el escáner Apolo 13, en el que la salida de la señal se digitaliza hasta los datos de 16-bit completos sin ninguna saturación de pico o sin codificación de raíz cuadrada de la señal. Se ha aplicado también un algoritmo de compensación para corregir cualquier variación en la detección de la sensibilidad a lo largo de la trayectoria del haz de escaneo. Esta variación se debe a anomalías en la óptica y a diferencias en la eficacia de recogida a lo largo de la guía de la onda. Se realiza un calibrado utilizando una placa perspex con una fluorescencia uniforme por todas partes. Los datos recibidos del escaneo de esta placa se usan para determinar los factores de multiplicación necesarios para incrementar la señal desde cada nivel de píxel hasta un nivel diana. Estos factores se usan entonces en escaneos subsecuentes de geles para eliminar cualquier variación óptica interna.
Como se utiliza aquí, el término "Breast Cancer-associated Membrana Protein" (BCMP) (Proteína asociada al cáncer de mama) se refiere a una característica (por ejemplo, una banda en un gel 1D), detectable por electroforesis 1D de una muestra de tejido mamario, que está presente en el tejido mamario de un sujeto que tiene cáncer de mama. Las BCMP mostradas aquí se han identificado en extractos de proteína de membrana de líneas celulares mamarias humanas cultivadas en laboratorio mediante métodos y aparatos de la Tecnología Preferida (generalmente elecroforesis de gel 1D y digestión tríptica de extractos de proteína de membrana de líneas celulares mamarias humanas cultivadas en laboratorio). Se compararon secuencias de péptidos con las bases de datos SWISS-PROT y trEMBL (mantenidas por el Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) y el European Bioinformatics Institute (EBI) disponibles en http://www.expasy.com/) y la base de datos GenBank (mantenida por el Nacional Institute of Health (NIH) que está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/) y los genes correspondientes identificados. Las bases de datos e informes publicados, incluidas las bases de datos de proteínas expresadas en las células epiteliales luminales de la mama humana normal (Page et al. Proc Natl Acad Sci USA 1999 96(22):12589-94; GB solicitud de patente Nº 9919258.5) se investigaron para establecer si se había demostrado previamente que los productos de uno cualquiera de los genes identificados se expresaban en la membrana de células de la mama humana o en las células del cáncer de mama humano. Se identificaron dos grupos de BCMP: (1) secuencias de proteína que se equiparan a traslaciones conceptuales de cADNs para las que no se ha descrito función biológica o de proteína, para las que esta invención define la existencia del producto proteína y su localización en las membranas de las células del cáncer de mama humano; (2) proteínas conocidas que no se han descrito previamente en membranas de células mamarias, que esta invención muestra que están adicionalmente implicadas en el cáncer de mama humano. La BCMP 17 encuentra utilidad como marcadores para las células de la mama, especialmente de las células del cáncer de mama. La secuencia de aminoácidos de esa BCMP 17 está identificada por un número de acceso Q10589 de Swiss Prot y la secuencia se incorpora aquí por referencia. El peso molecular aparente es 15kDa y la secuencia de aminoácidos de péptidos de digestión tríptica de BCMP 17 identificados por espectrometría de masa en tandem y búsqueda en bases de datos como se describe en los Ejemplos, infra, es LQDASAEVER.
La BCMP 17 descrita antes puede utilizarse en el diagnóstico y terapia del cáncer de mama mencionado con más detalle más abajo.
Para cualquier BCMP dada, el nivel detectado obtenido después de analizar el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama en relación al nivel detectado obtenido después de analizar tejido mamario de sujetos sin cáncer de mama dependerá del protocolo analítico particular y de la técnica de detección que se use, siempre que esa BCMP se exprese diferencialmente entre tejido enfermo y normal. Por consiguiente, esta invención contempla que cada laboratorio establecerá un intervalo de referencia para cada PCMP en sujetos sin cáncer de mama de acuerdo con el protocolo analítico y técnica de detección en uso, como es convencional en la técnica de diagnóstico. Preferiblemente, al menos una muestra de tejido mamario positivo control de un sujeto que se sabe que tiene cáncer de mama o al menos una muestra de tejido mamario negativo control de un sujeto que se sabe que no tiene cáncer de mama (y más preferiblemente ambas muestras de control positiva y negativa) se incluyen en cada lote de muestras de ensayo analizadas.
En una realización, el nivel de expresión de una proteína se determina en relación a un valor de fondo, que se define como el nivel de señal obtenido a partir de una región próxima de la imagen que (a) es equivalente en área a la característica particular en cuestión; y (b) contiene característica de proteína no discernible.
Las BCMPs se pueden usar para la detección, pronóstico, diagnóstico o monitorización del cáncer de mama o para desarrollo de un fármaco. En una realización de la invención, el tejido de mama de un sujeto (por ejemplo, un sujeto que se sospecha tiene cáncer de mama) se analiza por electroforesis 1D para detección de una o más de las BCMPs. Una abundancia disminuida de dicha una o más BCMPs en el tejido mamario del sujeto en relación con el tejido mamario de un sujeto o sujetos que no tienen cáncer de mama (por ejemplo, una muestra de control) o un intervalo de referencia determinado previamente, indica la presencia o ausencia de cáncer de mama.
Como será evidente para los expertos en la técnica, una BCMP dada puede describirse de acuerdo con los datos proporcionados para esa BCMP. La BCMP es una proteína que comprende una secuencia de péptido descrita para esa BCMP (preferiblemente comprende una pluralidad de, más preferiblemente todas las secuencias de péptidos descritas para esa BCMP).
En una realización, se analiza el tejido de un sujeto para la detección cuantitativa de las BCMPs, en la que un cambio en la abundancia de la BCMP en el tejido mamario del sujeto en relación con el tejido mamario de un sujeto o sujetos sin cáncer de mama (por ejemplo, una muestra de control o un intervalo de referencia determinado previamente) indica la presencia de cáncer de mama.
Para cada BCMP esta invención proporciona adicionalmente el uso de (a) una preparación que comprende la BCMP aislada; (b) una preparación que comprende uno o más fragmentos de BCMP; y (c) anticuerpos que se unen a esa BCMP, a esos fragmentos, o tanto a esa BCMP como a esos fragmentos. Como se utiliza aquí, una BCMP se "aísla" cuando está presente en una preparación que está sustancialmente libre de proteínas contaminantes, por ejemplo, una preparación en la que menos del 10% (preferiblemente menos del 5%, más preferiblemente menos del 1%) de la proteína total presente es proteína(s) contaminante. Una proteína contaminante es una proteína que tiene una secuencia de aminoácido significativamente diferente de la de la BCMP aislada, como se determina por análisis espectral de masa. Como se utiliza aquí, una secuencia "significativamente diferente" es una que permita que la proteína contaminante se distinga de la BCMP por análisis espectral de masa, realizado según el Protocolo de Referencia.
Las BCMPs pueden investigarse por cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo pero no limitándose a ello, la Tecnología Preferida descrita aquí, los ensayos de quinasa, los ensayos de enzimas, los ensayos de unión y otros ensayos funcionales, inmunoensayos y western blotting. En una realización, las BCMPs se separan sobre un gel de 1D en virtud de sus MWs y se visualizan tiñendo el gel. En una realización, las BCMPs se tiñen con un colorante fluorescente y se obtiene la imagen con un escáner de fluorescencia. Sypro Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) es un colorante apropiado para este propósito. Un colorante fluorescente preferido se muestra en la Solicitud de EEUU nº 09/412.168, registrada el 5 de octubre de 1999, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
Alternativamente, las BCMP pueden detectarse en un inmunoensayo. En una realización, se lleva a cabo un inmunoensayo poniendo en contacto una muestra del sujeto objeto de ensayo con un anticuerpo anti-BCMP bajo condiciones tales que la unión inmunoespecífica puede ocurrir si la BCMP está presente y detectando o midiendo la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica por el anticuerpo. Pueden producirse anticuerpos anti-BCMP con los métodos y técnicas mostrados aquí.
En una realización, puede usarse la unión del anticuerpo en secciones de tejido para detectar la localización de BCMP aberrante o un nivel aberrante de una o más BCMP. En una realización específica, puede usarse un anticuerpo a una BCMP para ensayar un tejido del paciente (por ejemplo, una biopsia de tejido de mama) para el nivel de BCMP en el que un nivel aberrante de BCMP es indicativo de cáncer de mama. Como se utiliza aquí, un "nivel aberrante" significa un nivel que es mayor o menor en comparación con el nivel de un sujeto libre de cáncer de mama o un nivel de referencia. Si se desea, la comparación puede realizarse con una muestra equiparable del mismo sujeto, tomada a partir de una parte del cuerpo no afectada por cáncer de mama.
Puede utilizarse cualquier inmunoensayo apropiado, incluyendo, sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos utilizando técnicas como western blots, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión por gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de complemento-fijación, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A.
Por ejemplo, puede detectarse una BCMP en una muestra de fluido (por ejemplo, sangre, orina u homogenado de tejido mamario) por medio de un ensayo sándwich de dos etapas. En la primera etapa, un reactivo de captura (por ejemplo, un anticuerpo de BCMP) se usa para capturar el BCMP. El reactivo de captura puede inmovilizarse opcionalmente sobre una fase sólida. En la segunda etapa, se usa un reactivo de detección marcado directa o indirectamente para detectar la BCMP capturada. En una realización, el reactivo de detección es una lectina. Puede utilizarse cualquier lectina para este propósito que se une preferentemente a la BCMP mejor que a otras isoformas que tienen la misma proteína de núcleo que la BCMP o a otras proteínas que comparten el antígeno determinante reconocido por el anticuerpo. En una realización preferida, la lectina elegida se une a la BCMP con al menos una afinidad 2 veces más grande, más preferiblemente una afinidad al menos 5 veces más grande, todavía más preferido una afinidad al menos 10 veces más grande, que a esas isoformas que tienen la misma proteína de núcleo que la BCMP o a esas otras proteínas que comparten el determinante antígeno reconocido por el anticuerpo. Basándose en esta descripción, una lectina que es apropiada para detectar una BCMP dada puede identificarse fácilmente por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayando una o más lectinas enumeradas en la Tabla I de las páginas 158-159 de Sumar et al., Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, en las pp. 158-174. En una realización alternativa, el reactivo de detección es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que detecta inmunoespecíficamente otras modificaciones post-traslacionales, como un anticuerpo que se una inmnoespecíficamente a aminoácidos fosforilados. Ejemplos de esos anticuerpos incluyen aquellos que se unen a la fosfotirosina (BD Transduction Laboratories, catálogo nº: P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), aquellos que se unen a la fosfoserina (Zymed Laboratorios Inc., South San Francisco, CA, catalogo nº 61-8100) y aquellos que se unen a la fosfotreonina (Zymed Laboratoires Inc., South San Francisco, CA, catálogo nº 71-8200,
13-9200).
Si se desea, se puede usar también un gen que codifica una BCMP, un gen relacionado, secuencias o subsecuencias de ácido nucleico relacionado, incluyendo secuencias complementarias, para los ensayos de hibridación. Un nucleótido que codifique una BCMP o una de sus subsecuencias que comprenda al menos 8 nucleótidos, preferiblemente al menos 12 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 15 nucleótidos puede utilizarse como una sonda de hibridación. Los ensayos de hibridación pueden utilizarse para la detección, pronóstico, diagnóstico o monitorización de condiciones, trastornos, o estados de enfermedades, asociados con expresión aberrante de genes que codifican BCMPs, o para diagnóstico diferencial de sujetos con signos o síntomas sugerentes de cáncer de mama. En particular, dicho ensayo de hibridación puede llevarse a cabo por un método que comprende poner en contacto una muestra del sujeto que comprende ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar a un ADN o ARN que codifique una BCMP, bajo condiciones tales que dicha hibridación pueda ocurrir y detectar o medir cualquier hibridación resultante. Los nucleótidos pueden usarse para terapia de sujetos que tengan cáncer de mama, como se describe más abajo.
La invención también proporciona el uso de equipos de diagnóstico que comprenden un anticuerpo anti-BCMP. Además, dicho equipo puede comprender opcionalmente uno o más de lo siguiente: (1) instrucciones para usar el anticuerpo anti-BCMP para el diagnóstico, pronóstico, monitorización terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones; (2) un colaborador de unión marcado al anticuerpo; (3) una fase sólida (tal como una tira reactiva) sobre la que se inmoviliza el anticuerpo anti-BCMP; y (4) una etiqueta o marca que indique la aprobación reguladora para el uso diagnóstico, pronóstico o terapéutico o una cualquiera de sus combinaciones. Si no se proporciona ningún colaborador de unión marcado al anticuerpo, el propio anticuerpo anti-BCMP puede marcarse con un marcador detectable, por ejemplo, un medio radiactivo, fluorescente, enzimático, quimioluminescente. La invención también proporciona el uso de un equipo que comprende una sonda de ácido nucleico capaz de hibridar a ARN que codifica una BCMP. En una realización específica, el equipo comprende en uno o más contenedores un par de cebos (por ejemplo, cada uno en el intervalo de tamaño de 6-30 nucleótidos, más preferiblemente 10-30 nucleótidos y más preferiblemente 10-20 nucleótidos) que bajo condiciones de reacción apropiadas pueden cebar la amplificación de al menos una porción de un ácido nucleico que codifique una BCMP, como por una reacción en cadena de polimerasa (véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academia Press, Inc., San Diego, CA), una reacción en cadena de ligasa (véase EP 320,308), uso de Q\beta replicasa, reacción de sonda cíclica u otros métodos conocidos en la técnica.
Un equipo puede comprender opcionalmente una cantidad predeterminada de una proteína BCMP aislada o un ácido nucleico que codifique una BCMP, por ejemplo, para usar como un estándar o control.
Uso en estudios clínicos
Los métodos de diagnóstico de esta invención pueden ayudar a la monitorización de un estudio clínico, por ejemplo, para evaluar fármacos para la terapia del cáncer de mama. En una realización, las moléculas candidatas se ensayan para ver su capacidad para restaurar los niveles de BCMP en un sujeto que tiene cáncer de mama hasta los niveles en sujetos que no tienen cáncer de mama o, en un sujeto tratado (por ejemplo, después del tratamiento con taxol o doxorubacina), para preservar los niveles de BCMP hasta o cerca de los valores sin cáncer de mama. Los niveles de BCMP pueden investigarse.
En otra realización, los métodos de esta invención se usan para seleccionar candidatos para un estudio clínico para identificar individuos que tengan cáncer de mama; dichos individuos pueden entonces ser excluidos del estudio o pueden situarse en una cohorte separada para tratamiento o análisis. Si se desea, los candidatos pueden ser seleccionados al mismo tiempo para identificar individuos con cáncer de mama; los procedimientos para estas selecciones son bien conocidos en la técnica.
Purificación de BCMPs
En aspectos particulares, la invención proporciona el uso de BCMPs aisladas, preferiblemente BCMPs humanas, y fragmentos y derivados suyos que comprenden un determinante antígeno (es decir, puede ser reconocido por un anticuerpo) o que son de otra manera funcionalmente activas, así como secuencias de ácido nucleico que codifican lo precedente. "Funcionalmente activo" como se utiliza aquí se refiere a material que muestra una o más actividades funcionales asociadas a la BCMP de longitud-completa (tipo-salvaje), es decir, unión a un sustrato de BCMP o a un claborador de unión de BCMP, antigenicidad (unión a un anticuerpo anti-diana), inmunogenicidad, actividad enzimática, etc.
En realizaciones específicas, la invención proporciona el uso de fragmentos de péptidos de una BCMP que comprenden al menos 5 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos o al menos 75 aminoácidos. También se proporcionan fragmentos que carecen de algunas o todas las regiones de una BCMP, como son proteínas (por ejemplo, proteínas de fusión) que comprenden esos fragmentos. Se proporcionan ácidos nucleicos que codifican lo precedente.
Una vez que el ácido nucleico recombinante que codifica la BCMP, una porción de la BCMP, o un precursor de la BCMP se identifica, puede analizarse el producto génico. Esto se consigue con ensayos basados en las propiedades funcionales o físicas del producto, incluyendo marcado radioactivo del producto seguido de análisis con electroforesis de gel, inmunoensayo, etc.
Las BCMP identificadas aquí pueden aislarse y purificarse por métodos estándar que incluyen cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, y cromatografía de tamaño de columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o con cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.
Alternativamente, una vez que se identifica el ácido nucleico que codifica la BCMP, la secuencia de aminoácidos completa de la BCMP puede deducirse de la secuencia de nucleótidos de la región que codifica el gen contenida en el ácido nucleico recombinante. Como resultado, la proteína puede sintetizarse por métodos químicos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111).
En otra realización alternativa, la BCMP nativa pude purificarse a partir de fuentes naturales, por métodos estándar como los descritos antes (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad).
La invención así proporciona el uso de una BCMP aislada, un polipéptido relacionado con una BCMP aislada y un derivado o fragmento de una BCMP o de un polipéptido relacionado con BCMP; cualquiera de los precedentes puede producirse con técnicas de ADN recombinante o con métodos sintéticos químicos.
Aislamiento de ADN que codifica una BCMP
Las realizaciones específicas para la clonación de un gen que codifique una BCMP se presentan más abajo a modo de ejemplo y no de limitación.
Secuencias de nucleótidos que incluyen ADN y ARN y que comprenden una secuencia que codifica una BCMP o uno de sus fragmentos, o un polipéptido relacionado con BCMP, pueden sintetizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, como usar aproximaciones químicas convencionales o amplificación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las secuencias de nucleótidos permiten además la identificación y clonación del gen que codifica un homólogo de BCMP o un ortólogo de BCMP incluyendo, por ejemplo, exploración de bibliotecas de ADN, bibliotecas genómicas o bibliotecas de expresión.
Por ejemplo, para clonar un gen que codifique un BCMP por técnicas PCR, oligonucleótidos degenerados anclados (o una serie de los más probables oligonucleótidos) pueden diseñarse para todos los fragmento de péptidos de BCMP identificados como parte de la misma proteína. Las reacciones PCR bajo una variedad de condiciones pueden realizarse con cADN relevante y DNAs genómicos (por ejemplo, a partir de tejido de mama o de células del sistema inmune) de una o más especies. Además reacciones vectorette pueden realizarse sobre cualquier cADN y ADN genómico disponibles utilizando oligonucleótidos (que preferentemente están anidados) como antes.
La PCR vectorette es un método que permite la amplificación de fragmentos de ADN específicos en situaciones en las que solo se conoce la secuencia de un cebo. Así, este extiende la aplicación de PCR a extensiones de ADN en los que la información de la secuencia está solo disponible en un extremo. (Arnold C, 1991, PCR Methods Appl. 1(1):39-42; Dyer KD, Biotechniques, 1995, 19(4):550-2). La PCR vectorette puede realizarse con sondas que sean, por ejemplo, oligonucleótidos degenerados anclados (o lo más probable oligonucleótidos) que codifican fragmentos de péptido BCMP, utilizando como templado reservas de una biblioteca de ADN o de una biblioteca genómica.
Los oligonucleótidos degenerados anclados (y lo más probable oligonucleóidos) pueden designarse para todos los fragmentos de péptidos de BCMP. Estos oligonucleótidos pueden marcarse e hibridarse a filtros que contengan bibliotecas de ADN genómico y cADN. Los oligonucleótidos de péptidos diferentes de la misma proteína identifican a menudo los mismos miembros de la biblioteca. Las bibliotecas de ADN genómico y de cADN pueden obtenerse de cualquiera de las especies de mamíferos deseada o apropiada, por ejemplo, de humanos.
Las secuencias de nucleótido que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica una BCMP o un fragmento de BCMP de esta invención son útiles por su capacidad para hibridar selectivamente con extensiones complementarias de genes que codifican otras proteínas. Dependiendo de la aplicación, puede utilizarse una variedad de condiciones de hibridación para obtener secuencias de aplicación al menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% idéntico o 100% idénticas, a la secuencia de un nucleótido que codifique un BCMP.
Para un alto grado de selectividad, se usan condiciones relativamente rigurosas para formar los duplex, tal como condiciones de salinidad baja o de temperatura alta. Como se utiliza aquí, "condiciones altamente rigurosas" significa hibridación a ADN unido a filtro en 0.5 M NaHPO4, 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 1 mM EDTA a 65ºC, y lavado en 0,1xSSC/0,1% SDS a 68ºC (Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc, Nueva Cork, at p. 2.10.3; incorporado aquí por referencia en su totalidad). Para algunas aplicaciones se requieren condiciones menos rigurosas para la formación dúplex. Como se usa aquí "condiciones moderadamente rigurosas" significa lavado en 0,2xSSC/0,1% SDS a 42ºC (Ausubel et al., 1989, supra). Las condiciones de hibridación pueden hacerse más rigurosas por la adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex híbrido. Así, las condiciones de hibridación particulares pueden manipularse fácilmente, y se elegirán generalmente dependiendo de los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de 50% de formamida son: 42ºC para una sonda que es de un 95 a un 100% idéntica al fragmento del gen que codifica una BCMP, 37ºC para 90 a 95% de identidad y 32ºC para 70 a 90% de identidad.
En la preparación de las bibliotecas genómicas, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán partes o el total de una BCMP. Cualquier método apropiado para preparar fragmentos de ADN puede utilizarse en esta invención. Por ejemplo, el ADN puede romperse en sitios específicos utilizando, por ejemplo, varias enzimas de restricción. Alternativamente, uno puede usar ADNsa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede cortarse físicamente, como por ejemplo, por sonicación. Los fragmentos de ADN pueden entonces separarse de acuerdo con el tamaño con técnicas estándar, incluyendo pero no limitándose a ello, electroforesis de gel de policramida y agarosa, cromatografía de columna y centrifugación de gradiente de sacarosa. Los fragmentos de ADN pueden entonces insertarse dentro de vectores apropiados, incluyendo pero no limitándose a ello plásmidos, cósmidos, bacteriófagos lambda o T4, y cromosoma artificial de levadura (YAC). (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D.M (ed) 1985, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, UK vol. I, II; Ausubel F.M. et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York). La biblioteca genómica puede explorarse por hibridación de ácido nucleico a una sonda marcada (Benton and Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961).
Basándose en esta descripción, las bibliotecas genómicas pueden explorarse con sondas de oligonucleótidos degenerados marcados correspondientes a la secuencia de aminoácidos de cualquier péptido de la BCMP utilizando aproximaciones óptimas bien conocidas en la técnica. Cualquier sonda utilizada es al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos, o al menos 100 nucleótidos. Preferiblemente una sonda es de 10 nucleótidos o más larga, y más preferiblemente 15 nucleótidos o más larga.
La BCMP 17 mostrada aquí se descubrió que correspondía a isoformas de proteínas identificadas previamente codificadas por genes cuyas secuencias son públicamente conocidas. (Análisis de secuencia e identificación de proteínas realizado utilizando métodos descritos en los Ejemplos). Para explorar dicho genes puede utilizarse cualquier sonda que sea complementaria al gen o su complemento; preferiblemente la sonda es de 10 nucleótidos o más larga, más preferiblemente de 15 nucleótidos o más larga. Las bases de datos SWISS-PROT y trEMBL (mantenidas por el Swiss Institute de Bioinformatics (SIB) y el European Bioinformatics Institute (EBI) - que están disponibles en http://www.expasy.ch/) y la base de datos GenBank (mantenida por el Nacional Institute of Health (NIH) que está disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ proporcionan secuencias de proteínas para las BCMPs.
Cuando se explora una biblioteca, los clones con ADN insertado que codifica la BCMP o uno de sus fragmentos se hibridará a uno o varios miembros del correspondiente conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados (o su complemento). La hibridación de dichas sondas de oligonucleótidos a bibliotecas genómicas se lleva a cabo utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la hibridación con uno de los conjuntos degenerados antes mencionados de sondas de oligonucleótidos, o sus complementos (o con cualquier miembro de un conjunto así, o su complemento) puede realizarse bajo condiciones moderadamente rigurosas o altamente rigurosas como se definió antes, o puede llevarse a cabo en 2X SSC, 1,0% SDS a 50ºC y se lavan utilizando las condiciones de lavado descritas supra para la hibridación moderadamente rigurosa o altamente rigurosa.
En otro aspecto más, los clones que contienen secuencias de nucleótidos que codifican la BCMP entera, un fragmento de una BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o un fragmento de un polipéptido cualquiera de los precedentes relacionado con una BCMP pueden también obtenerse por exploración de bibliotecas de expresión. Por ejemplo, el ADN de la fuente relevante se aísla y se preparan fragmentos al azar y se ligan a un vector de expresión (por ejemplo, un bacteriófago, plásmido, fagémido o cósmido) de forma que la secuencia insertada en el vector sea capaz de ser expresada por la célula huésped en la que se introduce después el vector. Entonces pueden usarse varios ensayos de exploración para seleccionar la BCMP expresada o los polipéptidos relacionados con la BCMP. En una realización, pueden usarse varios anticuerpos antiBCMP para identificar los clones deseados utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix IV. Las colonias o placas de la biblioteca se ponen en contacto con los anticuerpos para identificar aquellos clones que se unen al anticuerpo.
En una realización, colonias o placas que contienen ADN que codifica una BCMP, un fragmento de una BCMP, un polipéptido relacionado con BCMP, o un fragmento de un polipéptido relacionado con la BCMP pueden detectarse utilizando DYNA Beads de acuerdo con Olsvick et al., 29th ICAAC, Houston, Texas 1989, incorporado aquí por referencia. Los anticuerpos antiBCMP se reticulan a DYNA Beads M280 tosiladas, y estas cuentas que contienen anticuerpos se ponen en contacto entonces con colonias o placas que expresan polipéptidos recombinantes. Las colonias o placas que expresan una BCMP o un polipéptido derivado de BCMP se identifican como cualquiera de los que se unen a las cuentas.
Alternativamente, los anticuerpos antiBCMP pueden inmovilizarse no específicamente en un soporte adecuado, como resina Celite® o sílice. Este material se usa entonces para absorber las colonias de bacterias que expresan la proteína BCMP o el polipéptido relacionado con BCMP como se describe aquí.
En otro aspecto, la amplificación de la PCR puede usarse para aislar del ADN genómico un ADN sustancialmente puro (por ejemplo, un ADN sustancialmente libre de ácidos nucleicos contaminantes) que codifica la BCMP entera o una de sus partes. Preferiblemente dicho ADN es al menos puro en un 95%, más preferiblemente al menos en un 99% puro. Las secuencias de oligonucleótidos, degenerados o de otra forma, que corresponden a las secuencias de pépido de BCMP mostradas aquí pueden usarse como cebos.
PCR puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un ciclador térmico Perkin-Elmer CETUR y Taq polimerasa (Gene Amp® o AmpliTaq ADN polimerasa). Se puede elegir para sintetizar varios cebos degenerados diferentes, para usar en las reacciones PCR. También es posible variar la rigurosidad de las condiciones de hibridación utilizadas al cebar las reacciones PCR, para permitir grados mayores o menores de similitud de secuencia de nucleótido entre los cebos degenerados y las secuencias correspondientes en el ADN. Después de la amplificación satisfactoria de un segmento de la secuencia que codifica una BCMP, dicho segmento puede clonarse molecularmente y secuenciarse, y utilizarse como una sonda para aislar un clon genómico completo. Esto, a su vez, permitirá la determinación de la secuencia de nucleótidos completa del gen, el análisis de esta expresión y la producción de su producto proteína para el análisis funcional, como se describe infra.
El gen que codifica una BCMP también puede identificarse por selección de mRNA por hibridación de ácido nucleico seguido de traslación in vitro. En este procedimiento, se usan los fragmentos para aislar mRNAs complementarios por hibridación. Dichos fragmentos de ADN pueden representar ADN purificado disponible que codifica una BCMP de otras especies (por ejemplo, ratón, humano). El análisis de inmunoprecipitación o ensayos funcionales (por ejemplo, la capacidad de agregación in vitro; unión al receptor) de los productos de traslación in vitro de los productos aislados de los mRNAs aislados identifica el mRNA y, por consiguiente, los fragmentos de ADN complementarios que contienen las secuencias deseadas. Además, los mRNAs específicos se pueden seleccionar por absorción de polisomas aislados a partir de las células a anticuerpos inmovilizados que específicamente reconocen una BCMP. Un cADN radiomarcado que codifica una BCMP puede sintetizarse utilizando el mRNA seleccionado (a partir de los polisomas adsorbidos) como un templado. El cADN o mRNA radiomarcado puede usarse entonces como una sonda para identificar los fragmentos de ADN que codifican una BCMP de entre otros fragmentos de ADN genómicos.
Las alternativas para aislar un ADN genómico que codifica una BCMP incluyen, pero no se limitan a ello, sintetizar químicamente la propia secuencia de gen a partir de una secuencia conocida o hacer cADN al mRNA que codifica la BCMP. Por ejemplo, el RNA para clonar cADN del gen que codifica una BCMP puede aislarse a partir de las células que expresan la BCMP. Los expertos en la técnica comprenderán a partir de esta descripción que pueden usarse otros métodos. Cualquier célula eucariótica adecuada puede servir como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular del gen que codifica la BCMP. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la BCMP pueden aislarse a partir de fuentes de vertebrados, mamíferos, primates, humanos, porcinos, bovinos, felinos, aves, equinos, caninos o murinos. El ADN puede obtenerse por procedimientos estándar conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), por síntesis química, por clonación de cADN, o por la clonación de ADN genómico, o de sus fragmentos, purificados a partir de la célula deseada. (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Appoach, MRL Press, Ltd., Oxford, UK, vol. I, II). Los clones derivados de AND genómico pueden contener regiones de AND intron y reguladoras además de regiones de codificación; los clones derivados de cADN contendrán sólo secuencias de exon.
El gen identificado y aislado o el cADN pueden insertarse entonces dentro de cualquier vector de clonación apropiado. Pueden usarse muchos sistemas de vector-huésped conocidos en la técnica. Como apreciarán los expertos en la técnica, la única limitación es que el sistema de vector elegido debe ser compatible con la célula huésped usada. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a ello, bacteriófagos como derivados lambda, plásmidos como PBR322 o derivados plásmidos pUC del vector Bluescript (Stratagene) o virus modificados como adenovirus, virus adenoasociados o retrovirus. La inserción en un vector de clonación puede realizarse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene terminales cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Alternativamente, cualquier sitio deseado puede producirse ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los terminales de ADN; estos conectores ligados pueden comprender nucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican las secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector partido y el gen que codifica una BCMP pude modificarse por prolongación con homopolímeros. Pueden introducirse moléculas recombinantes en las células huésped vía transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de forma que se generen varias copias de la secuencia genética.
En realizaciones específicas, la transformación de células huésped con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen aislado que codifica la BCMP, el cADN o la secuencia de ADN sintetizado permite la generación de múltiples copias del gen. Así el gen puede obtenerse en cantidades grandes desarrollando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado a partir del ADN recombinante aislado.
Las secuencias de nucleótido incluyen secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácido con aminoácidos funcionalmente equivalentes, secuencias de nucleótidos que codifican BCMPs, fragmentos de BCMP, polipéptidos relacionados con BCMP, o fragmentos de polipéptidos relacionados con una BCMP.
En una realización específica, puede crearse una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido relacionado con una BCMP introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos de una BCMP así que sustituciones, adiciones o supresiones de uno o más aminoácidos se introducen en la proteína codificada. Pueden utilizarse técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigidas al sitio y mutagénesis mediadas por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservativas se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se sustituye con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales con cargas similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptópano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas aromáticas laterales (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, pueden introducirse mutaciones al azar a lo largo de todo o parte de la secuencia de codificación, como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden explorarse respecto a su actividad biológica para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse y puede determinarse la actividad de la proteína.
Expresión de ADN que codifica BCMPs
La secuencia de nucleótidos que codifica una BCMP, una BCMP análoga, o un péptido relacionado con BCMP, o un fragmento u otro derivado de uno cualquiera de lo anterior puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traslación de la secuencia codificadora de la proteína insertada. Las señales traslacionales y transcripcionales necesarias pueden también suministrarse por el gen nativo que codifica la BCMP o sus regiones contiguas. Pueden utilizarse muchos sistemas de vector-huésped en esta invención para expresar la secuencia de codificación de la proteína. Esto incluye, pero no se limita a ello, los sistemas de células mamíferas infectadas con virus (por ejemplo, vaccina virus, adenovirus, etc); los sistemas de células de insectos infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos como vectores de levadura que contienen levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plásmido, o ADN cósmido. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de vector-huésped utilizado, puede usarse un gran número de uno cualquiera de los elementos de traslación y transcripción adecuados. En realizaciones específicas, se expresa una secuencia de nucleótidos que codifica un gen humano (o una secuencia de nucleótidos que codifica una porción activa funcionalmente de una BCMP humana). En otra realización más, se expresa un fragmento de BCMP que comprende un dominio de la BCMP.
Puede utilizarse uno cualquiera de los métodos descritos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales de control translacional y transcripcional apropiadas y las secuencias de codificación de proteínas. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una BCMP o uno de sus fragmentos puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de forma que la BCMP o el fragmento se expresen en un huésped transformado con una molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una BCMP puede controlarse con un elemento promotor o potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión del gen que codifica una BCMP o un polipéptido relacionado con una BCMP incluyen, aunque no se limitan a ello, la región promotora primera SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), las secuencias regulatorias del gen metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), el promotor de tetraciclina (Tet) (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551); vectores de expresión procarióticos tal como el promotor \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci USA 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25;
véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94); vectores de expresión de plantas que comprenden la región promotora de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) o el promotor 35SRNA del virus de mosaico de coliflor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de la levadura u otros hongos como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor PGK, (fosfoglicerol quinasa) el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcionales, que muestran especificidad de tejido y que se han utilizado en animales transgénicos: región de control de gen I de elastasa que está activa en las células acinar pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control de gen de insulina que está activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control de gen de inmunoglobulina que está activa en las células linfoides (Grosschedl et al., 198, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control de virus de tumor mamario de ratón que está activo en células linfoides, de mama, testiculares y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control de gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., 1987 Genes and Devel. 1:268-276), región de control de alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985,mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), región de control de gen de alfa 1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1985:7, Genes and Devel. 1:161-171), región de control de gen de betaglobina que está activa en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; región de control de gen de proteína básica de mielina que está activa en las células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control de gen de cadena-2 ligera de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); enolasa específica neuronal (NSE) que está activa en las células neuronales (Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83); la región de control de gen (BDNF) del factor neutrófico derivado del cerebro que está activo en las células neuronales (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823); el promotor de proteína acídica fibrilarmente glial (GFAP) que está activo en astrocitos (Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5):619-631: Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83) y la región de control de gen de la hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
En una realización específica, se usa un vector que comprende un promotor operablemente conectado a un ácido nucleico codificador de BCMP, uno o más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). En una realización específica, se hace un constructo de expresión subclonando una BCMP o una secuencia de codificación de polipéptido relacionado con BCMP en el sitio de restricción EcoRI de cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de Glutathione S-Transferasa; Smith and Johnson, 1988, Gene 7:31-40). Esto permite la expresión del producto de BCMP o el polipéptido relacionado con BCMP a partir del subclon en el marco de lectura correcto.
En células huésped de mamíferos pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación de BCMP o la secuencia de codificación de un polipéptido relacionado con BCMP puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traslación de adenovirus, por ejemplo, el último promotor y la secuencia líder tripartita. El gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma del adenovirus por una recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados. (Por ejemplo, véase Logan & Sheik, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). Pueden requerirse señales de iniciación específicas para traslación eficaz de secuencias de codificación de anticuerpos injertados. Estas señales incluyen el codon de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codon de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traslación del inserto completo. Estas señales de control trasnacional exógenas y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede mejorarse con la inclusión de elementos potenciadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Los vectores de expresión que contienen insertos de un gen que codifica una BCMP o un polipéptido relacionado con una BCMP pueden identificarse por tres aproximaciones generales: (a) hibridación de ácido nucleico, (b) presencia o ausencia de funciones de gen "marcador", y (c) expresión de secuencias insertadas. En la primera aproximación, la presencia de un gen que codifica una BCMP insertada en un vector de expresión puede detectarse por hibridación de ácido nucleico utilizando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen insertado que codifica una BCMP. En la segunda aproximación, el sistema de huésped/vector recombinante puede identificarse y seleccionarse basándose en la presencia o ausencia de ciertas funciones de gen "marcador" (por ejemplo, actividad de timidina quinasa, resistencia a los antibióticos, transformación de fenotipo, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) causado por la inserción de un gen que codifica una BCMP en el vector. Por ejemplo, si el gen que codifica la BCMP se inserta dentro de la secuencia de gen marcador del vector, los recombinantes que contenga el gen que codifica el inserto de BCMP pueden identificarse por la ausencia de la función de gen marcador. En la tercera aproximación, se pueden identificar vectores de expresión recombinantes ensayando el producto génico (es decir, BCMP) expresado por el recombinante. Dichos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades funcionales o físicas de la BCMP en los sistemas de ensayo in vitro, por ejemplo, uniéndose con un anticuerpo anti-BCMP.
Además, puede elegirse una cepa de célula huésped que modula la expresión de secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en el modo específico deseado. Pueden elevarse expresiones a partir de ciertos promotores en presencia de ciertos inductores; así, puede controlarse la expresión de la BCMP o el polipéptido relacionado con BCMP fabricados genéticamente Además, las células huésped diferentes tiene mecanismos específicos y característicos para la modificación y el procesamiento translacional y postranslacional (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas). Sistemas huésped o de líneas celulares apropiadas pueden elegirse para asegurar la modificación y el procesamiento deseados para la expresada proteína extraña. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano producirá un producto no glicosilado y la expresión en la levadura producirá un producto glicosilado. Pueden utilizarse células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para procesar apropiadamente el transcripto primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped mamarias incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3 y WI38. además, los sistemas de expresión vector/huésped diferentes pueden producir reacciones de procesamiento de diferente alcance.
Para la producción de alto rendimiento de proteínas recombinantes de larga duración, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden fabricarse las líneas celulares que expresan establemente la proteína de gen de trayectoria o expresada diferencialmente. Mejor que usar vectores de expresión que contengan orígenes virales de replicación, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc), y un marcador seleccionado. Después de la introducción del ADN extraño, se puede dejar crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido, y entonces se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido dentro de sus cromososmas y crecer para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método pude usarse ventajosamente para fabricar líneas celulares que expresan la proteína de gen de trayectoria o expresada diferencialmente. Dichas líneas celulares pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de compuestos que afecten a la actividad endógena de la proteína de gen de trayectoria o expresada diferencialmente.
Pueden utilizarse varios sistemas de selección, incluyendo aunque sin limitarse a ello, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, et al., 190, Cell 22:817) pueden utilizare en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia antimetabolitos como la base de la selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e higro, que confiere resistencia a los genes de higromicina (Santerre, et al., 1984, Gen 30:147).
En otras realizaciones específicas, el derivado, análogo o fragmento de BCMP puede expresarse como una fusión, o un producto de proteína quimérico (que comprende la proteína, el fragmento, análogo, o el derivado añadido via un enlace péptido a una secuencia de proteína heteróloga). Por ejemplo, los polipéptidos pueden fusionarse con el dominio constante de inmonuglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), o porciones de esto (CH1, CH2, CH3, o una cualquiera de sus combinaciones y porciones) que resulten en polipéptidos quiméricos. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, aumentar la vida media in vivo, y potenciar el suministro de un antígeno a lo largo de una barrera epitelial hasta el sistema inmune. Se ha mostrado un incremento en la vida media in vivo y en la purificación facilitada para proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de las inmonuglobulinas de mamíferos. Véase, por ejemplo, EP 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (198). Un suministro aumentado de un antígeno a lo largo de la barrera epitelial hasta el sistema inmune se ha demostrado para antígenos (por ejemplo, insulina) conjugados a un colaborador de unión a FcRn como o fragmentos de Fc e IgG (véase, por ejemplo, PCT publicaciones WO 6/22024 y WO 99/04813).
Los ácidos nucleicos que codifican una BCMP, un fragmento de una BCMP, o un polipéptido relacionado con una BCMP pueden fusionarse a una etiqueta epitopo (por ejemplo, la etiqueta hemaglutinina ("HA") o etiqueta bandera) para ayudar en la detección y purificación del polipéptido expresado. Por ejemplo, un sistema descrito en Janknecht et al. tiene en cuenta la purificación adecuada de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897).
Las proteínas de fusión pueden hacerse ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación apropiado, y expresando el producto quimérico por métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, una proteína de fusión puede estar hecha por técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, con el uso de un sintetizador de
péptidos.
Tanto la secuencia genómica como la de ADN pueden clonarse y expresarse.
Estructura de dominio de BCMPs
Los dominios de algunas BCMP se conocen en la técnica y han sido descritas en la literatura científica. Además, los dominios de una BCMP pueden identificarse utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, uno o más dominios de una BCMP pueden identificarse utilizando uno o más de los siguientes programas: ProDom, TMpred y SAPS. ProDom compara la secuencia de aminoácidos de un polipéptido a una base de datos de dominios compilados (véase, por ejemplo, www.toulouse.inra.fr/prodom.html; Corpet F., Gouzy J. & Kahn D., 1999, Nucleic Acids Res., 27:263-267). TMpred predice las regiones de extensión de membrana de un polipéptido y sus orientaciones. Este programa utiliza un algoritmo que está basado en un análisis estadístico de TMbase, una base de datos de proteínas de transmembrana presentes naturalmente (véase, por ejemplo, \underbar{www.ch.embnet.org/software/TMPRED\_form.html}; Hofmann & Stoffel (1993) "TMbase - A database of membrane spanning proteins segments". Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166). El programa SAPS analiza los polipéptidos respecto a las características significativas estadísticamente como grupos de carga, repeticiones, regiones hidrofóbicas, dominios composicionales (véase, por ejemplo, Brendel et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2002-2006). Así, basándose en esta descripción, el experto identificará los dominios de una BCMP que tiene actividad de unión o enzimática, y además podrá identificar las secuencias de nucleótido que codifican dichos dominios. Estas secuencias de nucleótido pueden entonces usarse para la expresión recombinante de fragmentos de BCMP que retienen la actividad de unión o enzimática de la BCMP.
Basándose en esta invención, el experto puede identificar dominios de una BCMP con una actividad de unión o enzimática, y además identificar secuencias de nucleótido que codifican esos dominios. Estas secuencias de nucleótidos pueden entonces usarse para la expresión recombinante de fragmentos de BCMP que retienen la actividad enzimática o de unión de la BCMP.
En una realización, una BCMP tiene una secuencia de aminoácido suficientemente similar a un dominio identificado de un polipéptido conocido. Como se utiliza aquí, el término "suficientemente similar" se refiere a una primera secuencia de nucleótido o aminoácido que contiene un número suficiente de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos, tal que la primera y segunda secuencias de nucleótidos o aminoácidos tengan o codifiquen un dominio estructural común o una actividad funcional común o ambos.
Un dominio BCMP puede determinarse por su función utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un dominio puede determinarse por su actividad de quinasa o por su capacidad para unirse al ADN utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. La actividad de quinasa puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la capacidad de un polipéptido para fosforilar un sustrato. La actividad de unión a ADN puede alcanzarse, por ejemplo, midiendo la capacidad de un polipéptido de unirse a un elemento de unión a ADN en un ensayo de desviación de electromovilidad.
Producción de anticuerpos a BCMPs
De acuerdo con la invención puede crearse una BCMP, un análogo de BCMP, una proteína relacionada con BCMP o un fragmento oe derivado de uno cualquiera de ellos, como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unan inmunoespecíficamente a tal inmunógeno. Dichos inmunógenos pueden aislarse por cualquier medio apropiado incluyendo los métodos antes descritos. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a ello anticuerpos quiméricos, humanizados, biespecíficos, monoclonales, policlonales, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de FAB, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epitopo de uno cualquiera de los citados. El término "anticuerpo" como se utiliza aquí se refiere a moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, moléculas que contengan un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
En una realización, anticuerpos que reconocen productos génicos de genes que codifican BCMPs están disponibles públicamente. En otra realización, los métodos conocidos por los expertos en la técnica se utilizan para producir anticuerpos que reconozcan una BCMP, un análogo de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o un fragmento o derivado de uno cualquiera de estos.
En una realización se producen anticuerpos de un dominio específico de una BCMP. En una realización específica se usan fragmentos hidrofílicos de una BCMP como inmunógenos para la producción de anticuerpos.
En la producción de anticuerpos, la proyección del anticuerpo deseado puede realizarse por técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo ELISA (ensayo inmunoabsorbente undo a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconozcan un dominio específico de una BCMP, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se una a un fragmento de BCMP. Para la selección de un anticuerpo que se una específicamente a un primer homólogo de BCMP, pero que no se una específicamente a (o se una menos ávidamente a) un segundo homólogo de BCMP, se puede seleccionar sobre la base de una unión positiva al primer homólogo de BCMP y una ausencia de unión (o unión reducida) al segundo homólogo de BCMP. Igualmente, para la selección de un anticuerpo que se una específicamente a una BCMP pero que no se una específicamente (o se una menos ávidamente) a una isoforma diferente de la misma proteína (como una glicoforma diferente que tenga el mismo péptido núcleo que la BCMP), se puede elegir sobre la base de unión positiva a la BCMP y una ausencia de unión (o unión reducida) a la isoforma diferente (por ejemplo, una glicoforma diferente). Así, esta invención proporciona el uso de un anticuerpo (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) que se une con una afinidad mayor (preferiblemente al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 5 veces, todavía más preferiblemente al menos una afinidad 10 veces mayor) a una BCMP que a una diferente isoforma o isoformas (por ejemplo, glicoformas) de la BCMP. Los anticuerpos policlonales que pueden usarse en los métodos de la invención son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados. También puede usarse un suero inmune sin fraccionar. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales de una BCMP, un fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o un fragmento de polipéptido relacionado con una BCMP. En una realización particular, pueden obtenerse anticuerpos policlonales de conejo a un epitopo de una BCMP o un polipéptido relacionado con una BCMP. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales pueden inmunizarse varios animales huésped por inyección con una versión nativa o sintética (por ejemplo, recombinante) de una BCMP, un fragmento de una BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, incluyendo pero sin limitarse a ello, conejos, ratones, ratas, etc. La Tecnología Preferida descrita aquí proporciona BCMP aisladas adecuadas para cada inmunización. Si la BCMP se purifica por electroforesis de gel, puede usarse la BCMP para la inmunización con o sin extracción previa a partir de gel de poliacrilamida. Pueden usarse varios auxiliares para potenciar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies huésped, incluyendo, pero no limitándose a ello, el auxiliar de Freund completo o incompleto, un gel mineral como el hidróxido de aluminio, una sustancia activa de superficie como la lisolecitina, poliol plurónico, un polianión, un péptido, una emulsión grasa, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y un auxiliar como el BCG (bacilo de Calmette-Guerin) o corynebacterium parvum. Auxiliares adicionales son también bien conocidos en la técnica.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos hacia la BCMP, un fragmento de una BCMP, o un polipéptido relacionado con BCMP, puede utilizarse cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983; Immunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y una cualquiera de sus subclases. El hibridoma que produce la mAbs puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales sin gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545). Los anticuerpos monoclonales incluyen pero no se limitan a ello, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras de ratón-humano). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las porciones diferentes se derivan de especies animales diferentes, como aquellas que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de una murina mAb. (véase, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de EEUU nº 4.816.567; y Boss et al., Patente de EEUU Nº 4,816397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes complementariamente (CDRs) de especies no humanas y una región armazón a partir de una molécula de inmnoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Queen, Patente de EEUU nº 5.585.089).
Los anticuerpos monoclonales humanizados quiméricos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo utilizando métodos descritos en la Publicación PCT nº WO 87/02671; solicitud de Patente Europea 184, 187; Aplicación de Patente Europea 171,496; solicitud de Patente Europea 173,94; Publicación PCT nº WO 86/01533; Patente de EEUU nº 4.816.567; solicitud de Patente Europea 125, 023; Better et al., 1988, Science 240:101-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218; Nhishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Word et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; Patente de EE.UU. 5.22.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (198) Science 239:1534; y Biedler et al., 198, J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos se desean particularmente para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Dichos anticuerpos pueden producirse utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadena ligera o pesada Humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan en la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una porción de una BCMP. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana se alteraron por la reordenación de ratones transgénicos durante la diferenciación de célula B, y subsecuentemente sufrieron cambio de clase y mutación somática. Así, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM y IgE útiles terapéuticamente. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immuno. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir esos anticuerpos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.625.126; patente de EE.UU. 5.633.425; patente de EE.UU. 5.569.825; patente de EE.UU. 5.661.016; patente de EE.UU. 5.545.806. Además, las empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a la descrita antes.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epitopo seleccionado pueden generarse utilizando una técnica llamada "selección guiada". En esta aproximación se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratones, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epitopo (Jespers et al. (1994) Bio/technoloy 12:899-903).
Los anticuerpos también pueden generarse utilizando varios métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales sobre la superficie de partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En particular, esos fagos pueden utilizarse para presentar dominios de unión de antígenos expresados a partir de una biblioteca de anticuerpo combinatorio o de repertorio (por ejemplo, humano o murina). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que une el antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o unido al antígeno o ser capturado en una superficie sólida o cuenta. Los fagos usados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión M13 y fd expresados a partir de fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizado con disulfuro recombinantemente fusionados a cualquiera de las proteínas de gen III o gen VIII o Jenny de fagos. Los métodos de representación de fagos que pueden utilizarse para fabricar los anticuerpos incluyen los mostrados en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in immunology 57:191-280 (1994); PCT Solicitud No. PCT/GB91/01134; PCT Publicaciones WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de EE.UU nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fago, las regiones de codificación de anticuerpo a partir del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento que se una al antígeno deseado y que se exprese en cualquier huésped deseado, incluyendo células mamarias, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias, por ejemplo, como se describe con detalle a continuación. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica como los mostrados en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); and Hawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); and Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir anticuerpos y Fvs de cadena simple incluyen los descritos en las Patentes de EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
La invención además proporciona el uso de anticuerpos biespecíficos, que pueden fabricarse por métodos conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunogobulina, en la que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Debido a la selección al azar de las cadenas ligeras y pesadas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se da generalmente por etapas de cromatografía de afinidad es bastante engorrosa y el rendimiento del producto es bajo. Procedimientos similares se muestran en WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
De acuerdo con una aproximación diferente y más preferida, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente se lleva a cabo con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH3 y CH2. Se prefiere que la región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, esté presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfeccionan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales producen rendimientos mayores o cuando las proporciones no son particularmente significativas.
En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmnoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que estas estructuras asimétricas facilitan la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunogloblinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina, en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta aproximación se muestra en WO 94/04690 publicada el 3 de marzo de 1994. Para más detalles para generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Zurres et al., Methods in Enzymlogy, 1986, 121:210.
La invención proporciona el uso de fragmentos activos funcionalmente, derivados o análogos de las moléculas de inmunoglobulina anti-BCMP. Funcionalmente activo significa que el fragmento, derivado o análogo sea capaz de elicitar anticuerpos anti-anti-idiotipo (por ejemplo, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo del que se deriva el fragmento, derivado o análogo. Específicamente, en una realización preferida la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede potenciarse por supresión del marco y secuencias de CDR que son C-terminal a la secuencia de CDR que específicamente reconoce el antígeno. Para determinar qué secuencias de CDR se unen al antígeno, péptidos sintéticos que contienen las secuencias de PCR se pueden usar en los ensayos de unión con el antígeno por cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica.
Esta invención proporciona el uso de fragmentos de anticuerpo tal como, aunque no se limite a ello, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epitopos específicos pueden generarse con técnicas específicas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan con digestión en pepsina de la molécula anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab')2 . La invención también proporciona el uso de dímeros de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos, o el uso de cualquiera de sus fragmentos mínimos como anticuerpos Fvs o de cadena simple (SCAs) (por ejemplo, como se describe en la patente de EEUU 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:54-54) o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo. Los anticuerpos de cadena simple se forman uniendo los fragmentos de cadena ligera y de cadena pesada de la región Fv via un puente aminoácido, resultando en un polipéptido de cadena simple. Pueden utilizarse técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la invención proporciona el uso de proteínas de fusión de las inmunogloblinas (o sus fragmentos funcionalmente activos), por ejemplo, en que la inmnoglobulina se fusiona vía un enlace covalente (por ejemplo, un enlace de péptido), tanto en el términus-N como en el términus-C a una secuencia de aminoácido de otra proteína (o porción suya, preferiblemente al menos 10, 20 o 50 porciones de aminoácido de la proteína) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente, la inmunoglobulina, o uno de sus fragmentos, se une covalentemente a otra proteína en el terminus-N del dominio constante. Como se estableció antes, dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, incremento de la vida media in vivo, y potenciar el suministro de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmune.
Las inmunogloblinas útiles en la invención incluyen análogos y derivados que están modificados, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula en tanto en cuanto esa unión covalente no perturbe la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no como limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellas que además se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupos de protección/bloqueo conocidos, ruptura proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitándose a ello, ruptura química específica, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anteriores anticuerpos pueden utilizarse en los métodos relativos en la técnica para la localización y actividad de las BCMP, por ejemplo, para representación en imágenes de estas proteínas, midiendo sus niveles en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc.
Expresión de anticuerpos
Los anticuerpos a utilizar según la invención pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos,en particular por síntesis química o por expresión recombinante, y se producen preferiblemente por técnicas de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos suyos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifique el anticuerpo. Si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo se conoce, un ácido nucleico que codifique el anticuerpo puede unirse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describió en Kutmeier et al., 1994, Bio Techniques 17:242), lo que, brevemente, implica la síntesis de solapamiento de oligonucleótidos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, alineamiento y ligado de estos nucleótidos, y después la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede obtenerse clonando el anticuerpo. Si un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el particular anticuerpo no está disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifique el anticuerpo puede obtenerse a partir de una fuente apropiada (por ejemplo, una biblioteca de cADN de anticuerpo, o una biblioteca de cADN generada a partir de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo) por amplificación de PCR utilizando cebos sintéticos hibridables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación utilizando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular.
Si una molécula de anticuerpo que específicamente reconozca un antígeno particular no está disponible (o una fuente para una biblioteca de cADN para clonar un ácido nucleico que codifica ese anticuerpo), anticuerpos específicos para un antígeno particular pueden generarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, más preferiblemente, generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo puede obtenerse por exploración de bibliotecas de expresión de Fab (por, ejemplo, como se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que unen el antígeno específico o por exploración de las bibliotecas de anticuerpo (Véase, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, puede introducirse en un vector que contenga la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, PCT Publicación WO 86/05807; PCT Publicación WO 89/01036; y la patente de EE.UU Nº 5.122.464). También están disponibles los vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa para la coexpresión con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Entonces, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede utilizarse para introducir la sustitución o supresión de nucleótido necesarios para sustituir (o suprimir) uno o más residuos de cisteína de región variable que participan en una unión de disulfuro intracadena con un residuo de aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Esas modificaciones pueden llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o supresiones específicas en una secuencia de nucleótido, por ejemplo, pero no se limita a ello, mutagénesis química, mutagénesis dirigida hacia el sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol., Chem. 253:6551), métodos basados en PCT, etc.
Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., Nature 314:452-454) empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad de antígeno apropiada con genes de moléculas de anticuerpos humanas de una actividad biológica apropiada. Como se describió supra, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las diferentes porciones se derivan a partir de especies de animales diferentes, como aquellas que tienen una región variable derivada de una mAb murina y una región constante de anticuerpo humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido una molécula de anticuerpo que codifica un ácido nucleico, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Así, se describen aquí métodos para preparar la proteína expresando ácido nucleico que contenga las secuencias de molécula de anticuerpo. Los métodos que son bien conocidos en la técnica pueden utilizarse para construir los vectores de expresión que contienen secuencias de codificación de una molécula de anticuerpo y señales de control traslacional y transcripcional. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una célula huésped por técnicas convencionales y las células transfeccionadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo.
Las células huésped utilizadas para expresar un anticuerpo recombinante pueden ser tanto células bacterianas como Escherichia coli, o preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa. En particular, las células de mamíferos como las células de ovarios de hámsters chinos (CHO), en conjunción con un vector como el elemento promotor de gen primero intermediario mayor a partir del cytomegalovirus humano, es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Una gran variedad de sistemas de vector de expresión puede utilizarse para expresar una molécula anticuerpo. Dichos sistemas de expresión de huésped representan vehículos por los que las secuencias de codificación de interés se pueden producir y subsecuentemente purificar, pero también representan células que pueden, cuando se transformen o transfeccionen con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresar las molécula de anticuerpo in situ. Esto incluye, pero no se limita a ello, microorganismos como la bacteria (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformada con ADN de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN cósmido o ADN plásmido que contiene secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; los sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias de codificación de antivirus; los sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, el virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, Ti plásmido) que contienen secuencias de codificación de anticuerpo; o sistemas de células mamarias (por ejemplo., COS, CHO, BHK, 293, células 3T3) que esconden constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamíferos (por ejemplo, promotor metalotioneina) o a partir de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor último adenovirus; el promotor 7.5 K del virus vaccinia).
En los sistemas bacterianos, puede seleccionarse un número de vectores de expresión ventajosamente dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo expresada. Por ejemplo, cuando se debe producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula anticuerpo, pueden desearse vectores que dirigen la expresión de niveles altos de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a ello, el vector de expresión pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia de codificación de anticuerpo puede ligarse individualmente al vector en marco con la región de codificación lac Z de forma que se produzca la proteína de fusión; los vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos exteriores como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, esas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células sometidas a lisis por absorción y unirse a una matriz e cuentas de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de ruptura de proteasa de factor Xa o trombina de forma que el producto génico diana clonado pueda liberarse desde el resto GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar los genes extraños. El virus se desarrolla en células Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen poliohedrina) del virus y situarse bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor polihedrina). En células huésped de mamíferos, pueden utilizarse varios de sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo, un sistema de expresión de adenovirus).
Como se expuso antes, puede elegirse una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, ruptura) de productos de proteína puede ser importante para la función de la proteína.
Para larga duración, y producción de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente un anticuerpo de interés puede producirse transfectando las células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótido del anticuerpo y la secuencia de nucleótido de un seleccionable (por ejemplo, neomicina o higromicina), y seleccionando para la expresión del marcador seleccionable. Esas líneas celulares fabricadas genéticamente pueden ser particularmente útiles en la exploración y evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden incrementarse por amplificación de vector (para una revisión véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of clones genes in mammalian cells in DNA cloning, vol.3 (Academia Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de las células huésped, aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia con el gen de anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 193, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión, el primer vector codifica un polipéptido de cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten expresión igual de polipéptidos de cadena ligera y pesada. Alternativamente, puede usarse un vector único que codifica ambos polipéptidos, el de cadena ligera y el de pesada. En dichas situaciones, la cadena ligera debe situarse después de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 190, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 77:2197). Las secuencias de codificación para las cadenas ligera y pesada pueden comprender cADN o ADN genómico.
Una vez que la molécula de anticuerpo se ha expresado recombinantemente, puede purificarse con cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad como con la proteína A o el antígeno específico, y cromatografía de columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.
Alternativamente, cualquier proteína de fusión puede purificarse utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se está expresando. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al., permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc Natl Acad. Sci USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia tal que el marco de lectura abierta del gen se fusiona translacionalmente a un tag amino-terminal que consiste en seis residuos de histidina. El tag sirve como un dominio de unión a la matriz para la proteína de fusión. Extractos de células infectadas con virus de vaccinia recombinante se cargan en columnas de agarosa-ácido nitriloacético Ni2+ y las proteínas marcadas con histidina se eluyen selectivamente con tampones que contienen imidazol.
Anticuerpos conjugados
En una realización preferida anticuerpos anti-BCMP o fragmentos suyos, se conjugan a un resto diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse para diagnosis o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía de emisión de positrones), y iones metálicos paramagnéticos. Véase generalmente Patente de EE.UU. Nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse a anticuerpos para usar como diagnósticos, conforme a esta invención. Enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos convenientes incluyen estreptavidina, avidina y biotina; materiales fluorescentes convenientes incluyen umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; materiales luminiscentes convenientes incluyen luminol; materiales bioluminiscentes convenientes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y materiales radiactivos convenientes incluyen núclidos 125I, 131I y 99Tc.
Anticuerpos BCMP o sus fragmentos pueden conjugarse a un resto de agente o fármaco terapéutico para modificar una respuesta biológica. El resto de agente o fármaco terapéutico no se construye limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto fármaco puede ser una proteína o polipéptido que poseen una deseada actividad biológica. Esas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, o difteria toxina; una proteína como el factor de necrosis tumoral, \alpha-interferon, \beta-interferon, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejidos, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o un modificador de respuesta biológica como la linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6), factor estimulante de colonia de macrofagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de nervios (NGF) u otro factor de crecimiento.
Las técnicas para conjugar esos restos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Inmunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Reisfeld et al., (eds.), pp, 243-56 (Alan R. Liss. Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery" en "Controlled Dug Delivery" (2ª Ed)., Robinson et al., (eds.), pp 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.) pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwuin et al., (eds.) pp. 303-16 (Academic Ppress 1985), and Thorpe et al., "The preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates" Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado como describe Segal en la Patente de EE.UU. Nº 4.676.980.
Un anticuerpo con o sin un resto terapéutico conjugado a él puede usarse como un terapéutico que se administra solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) y/o citoquina(s).
Diagnóstico de cáncer de mama
De acuerdo con esta invención, muestras ensayo de tejido de mama, suero, plasma u orina obtenidas de un sujeto que se sospecha tiene cáncer de mama pueden usarse para diagnóstico o monitorización. En una realización, un cambio en la abundancia de una o más BCMPs en una muestra ensayo en relación a una muestra control (de un sujeto o sujetos libres de cáncer de mama) o a un intervalo de referencia determinado previamente indica la presencia de cáncer de mama. En otra realización, la relativa abundancia de una o más BCMPs en una muestra ensayo en comparación con una muestra control o un intervalo de referencia previamente determinado indica un subtipo de cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama familiar o esporádico). En aún otra realización, la relativa abundancia de una o más BCMPs en una muestra ensayo en relación con una muestra control o un intervalo de referencia determinado previamente indica el grado o severidad del cáncer de mama (por ejemplo, la probabilidad de metástasis). En cualquiera de los métodos citados, la detección de una o más BCMPs puede opcionalmente combinarse con la detección de uno o más biomarcadores adicionales para cáncer de mama. Cualquier método conveniente en la técnica puede emplearse para medir el nivel de BCMPs, incluyendo, pero no limitándose a la Tecnología Preferida descrita aquí, ensayos de quinasa, inmunoensayos para detectar y/o visualizar las BCMP (por ejemplo, Western blot, inmunoprecipitación seguida de electroforesis sobre gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio, inmunocitoquímica, etc.). En casos en que una BCMP tiene una conocida función, un ensayo para esta función puede ser medir la expresión de BCMP. En una realización adicional, un cambio en la abundancia de mARN que codifica BCMPs en una muestra ensayo en relación a una muestra control o a un intervalo de referencia determinado previamente, indica la presencia de cáncer de mama. Cualquier ensayo de hibridación conveniente puede usarse para detectar la expresión de BCMP por detección o visualización de mARN que codifica la BCMP (por ejemplo, ensayos Northern, dot blots, hibridación
in situ, etc).
En otra realización de la invención, anticuerpos marcados, derivados y análogos suyos, con unión específica a una BCMP puede usarse para fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar cáncer de mama. Preferiblemente, el cáncer de mama se detecta en un animal, más preferiblemente en un mamífero y lo más preferiblemente en un humano.
Ensayos de exploración
La invención proporciona métodos para identificar agentes (por ejemplo, compuestos candidatos o compuestos e ensayo) que se unen a una BCMP o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la expresión o actividad de una BCMP. La invención también proporciona métodos de identificación de agentes, compuestos candidatos o compuestos ensayo que se unen a un polipéptido relacionado con una BCMP o una proteína de fusión a BCMP o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la expresión o actividad de un polipéptido relacionado con o una proteína de fusión a BCMP. Ejemplos de agentes, compuestos candidato o compuestos ensayo incluyen pero no se limitan a, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN), carbohidratos, lípidos, proteínas, péptidos, péptidomiméticos, pequeñas moléculas y otros fármacos. Pueden obtenerse agentes utilizando cualquiera de las numerosas aproximaciones en métodos de bibliotecas combinatorias conocidas en la técnica, incluyendo, bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida o fase en solución paralelas dirigibles espacialmente; los métodos de bibliotecas sintéticos requieren desconvolución; el método de blioteca "una cuenta-un compuesto"; y métodos de biblioteca sintéticos utilizando selección por cromatografía de afinidad. La aproximación biblioteca biológica se limita a bibliotecas de péptidos, mientras las otras cuatro aproximaciones son aplicables a péptidos, oligómeros no péptidos o bibliotecas de pequeñas moléculas de compuestos (Lamm, 1997, Anticancer Drig Des. 12:145; patente de EE.UU. 5.738.996; y patente de EE.UU. Nº 5.807.683).
Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en DeWitt et al., 1993, Proc. Natl Acad. Sci, EE.UU. 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl Acad. Sci, EE.UU. 91:11422, Zuckerman et al., 1994, Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science, 261:1303; Carrelll et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl 33:2061; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.
Bibliotecas de compuestos pueden presentarse, por ejemplo en solución (por ejemplo, Houghton1992, Bio/Techni-
ques 13:412-421), o en cuentas (Lam, 1991, Nature, 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (patente de EE.UU. Nº 5.223.409), esporas (patentes Nºs 5.571.698, 5.403.484; y 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc. Natl Acad. Sci, USA. 89:1865-1869) o fagos (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl Acad. Sci, USA 87:6378-6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310).
En una realización, agentes que interaccionan con, (es decir, se unen a) una BCMP, un fragmento de BCMP, (es decir, un fragmento activo funcionalmente), un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP se identifican en un sistema de ensayo a base de células. De acuerdo con esta realización, las células que expresan una BCMP, un fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP se ponen en contacto con compuesto candidato o un compuesto control y se determina la capacidad del compuesto candidato para interaccionar con la BCMP. Si se desea, este ensayo puede usarse para explorar una pluralidad (es decir, una biblioteca) de compuestos candidatos. La célula, por ejemplo, puede ser de origen procariótico (por ejemplo, E. coli) o eucariótico (por ejemplo, levadura o mamífero). Además las células pueden expresar la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP endógenamente, o ser sometidas a ingeniería genética para expresar la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP. En ciertos casos, la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP o el compuesto candidato está marcado, por ejemplo, con una marca radiactiva (como 32P, 35S, y 125I) o una marca fluorescente (como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido o fluorescamina) para determinar la detección de una interacción entre una BCMP y un compuesto candidato. La capacidad del compuesto candidato para interaccionar directa o indirectamente con BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la interacción entre un compuesto candidato y una BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP puede determinarse por citometria de flujo, un ensayo de centelleo, inmunoprecipitación o análisis Western blot.
En otra realización, agentes que interaccionan con (es decir, se unen a) un fragmento de BCMP, (por ejemplo, un fragmento activo funcionalmente), un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP se identifican en un sistema de ensayo libre de células. De acuerdo con esta realización, una BCMP nativa o recombinante o un fragmento suyo, o una proteína de fusión o un fragmento suyo, se pone en contacto con un compuesto candidato o un compuesto control y se determina la capacidad del compuesto candidato para interaccionar con la BCMP, o un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP. Si se desea, este ensayo puede usarse para expresar una pluralidad (por ejemplo una biblioteca) de compuestos candidatos. Preferiblemente, la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, es primeramente inmovilizada, por ejemplo, poniendo en contacto la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, con un anticuerpo inmovilizado que específicamente reconoce y se une a él, o poniendo en contacto una preparación purificada de BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, con una superficie diseñada para unir proteínas. La BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, puede ser parcial o completamente purificada (por ejemplo, parcial o completamente libre de otros polipéptidos) o parte de un lisato celular. Además, la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, puede ser biotinilado utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockfod, IL). La capacidad del compuesto candidato para interaccionar con una BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, un sistema de ensayo a base de células se usa para identificar agentes que se unen o modulan la actividad de una proteína, como una enzima, o una porción suya activa biológicamente, que es responsable de a producción o degradación de una BCMP o es responsable de modificación post-translacional de una BCMP. En una primera exploración, una pluralidad (por ejemplo, una bilioteca) de compuestos se pone en contacto con células que natural o recombinantemente expresan: (i) una BCMP, una isoforma de BCMP, una homóloga de BCMP, un polipéptido relacionado con BCMP, una proteína de fusión de BCMP, o un fragmento activo biológicamente de cualquiera de los precedentes; e (ii) una proteína que es responsable de procesamiento de una BCMP, isoforma de BCMP, una homóloga de BCMP, un polipéptido relacionado con BCMP, una proteína de fusión de BCMP, o fragmento con el fin de identificar compuestos que modulan la producción, degradación o modificación post-translacional de una BCMP, isoforma de BCMP, una homóloga de BCMP, un polipéptido relacionado con BCMP, una proteína de fusión de BCMP, o fragmento. Si se desea, los compuestos identificados en la primera exploración pueden ensayarse en una segunda exploración frente a células que expresan natural o recombinantemente la BCMP específica de interés. La capacidad del compuesto candidato para modular la producción, degradación o modificación post-translacional de una BCMP, isoforma, homóloga, un polipéptido relacionado con BCMP, o una proteína de fusión de BCMP puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, sin limitación, citometria de flujo, un ensayo de centelleo, inmunoprecipitación o análisis Western blot.
En otra realización, agentes que interaccionan competitivamente con (es decir, se unen a) una BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP se identifican en un ensayo de unión competitivo. De acuerdo con esta realización, las células que expresan una BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP se ponen en contacto con un compuesto candidato y un compuesto que se sabe interacciona con la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP; la capacidad del compuesto candidato para interaccionar preferencialmente con la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, se determina entonces. Alternativamente, agentes que interaccionan preferencialmente con (es decir, se unen a) BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP, se identifican en un sistema de ensayo libre de células poniendo en contacto la BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP con un compuesto candidato y un compuesto que se sabe interacciona con la BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP. Como se ha establecido más arriba, la capacidad del compuesto candidato para interaccionar con una BCMP, fragmento de BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, un fragmento de un polipéptido relacionado con una BCMP, o una proteína de fusión de BCMP puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos ensayos, ya sea basados en células o libres de células, pueden usarse para explorar una pluralidad (por ejemplo, una biblioteca) de compuestos candidatos.
En otra realización, agentes que modulan (es decir, regulan hacia arriba o hacia abajo) la expresión o actividad de una BCMP o un polipéptido relacionado con una BCMP, se identifican poniendo en contacto células (por ejemplo, células de origen procariótico o eucariótico) que expresan la BCMP o un polipéptido relacionado con una BCMP, con un compuesto candidato o un compuesto control (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y determinan la expresión de la BCMP, un polipéptido relacionado con una BCMP, o proteína de fusión de BCMP, mARN que codifica la BCMP, o mARN que codifica el polipéptido relacionado con la BCMP. El nivel de expresión de una BCMP seleccionada, un polipéptido relacionado con una BCMP, mARN que codifica la BCMP, o mARN que codifica el polipéptido relacionado con la BCMP.. en la presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de la BCMP, polipéptido relacionado con la BCMP, mARN que codifica la BCMP, o mARN que codifica el polipéptido relacionado con la BCMP, en la ausencia del compuesto candidato (por ejemplo, en la presencia del compuesto control). El compuesto candidato puede entonces identificarse como un modulador de la expresión de la BCMP o el polipéptido relacionado con la BCMP basado en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de la BCMP o mARN es significativamente más grande en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como estimulador de expresión de la BCMP o mARN. Alternativamente, cuando la expresión de la BCMP o mARN es significativamente menor en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión de la BCMO o mARN. El nivel de expresión de una BCMP o el mARN que lo codifica puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la expresión de mARN puede ser evaluada por análisis de Western blot.
En otra realización, los agentes que modulan la actividad de una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP se identifican poniendo en contacto una preparación que contiene la BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP o células (por ejemplo, células procarióticas o eucarióticas) que expresan la BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP con un compuesto ensayo o compuesto control y determinan la capacidad del compuesto ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP. La actividad de una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP puede evaluarse detectando la inducción de una trayectoria de transducción de señal celular de la BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP (por ejemplo, Ca2+ intracelular, diacilglicerol, IP3, etc), detectando actividad enzimática o catalítica de la diana en un sustrato conveniente, detectando la inducción de un gen reportero (por ejemplo, un elemento regulador que es sensible a una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP y está operablemente ligado a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o detectando una respuesta celular, por ejemplo diferenciación celular, o proliferación celular. Basándose en esta descripción, técnicas conocidas por los expertos en la técnica pueden usarse para medir esas actividades (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 5.401.639), que se incorpora aquí por referencia). El compuesto candidato puede entonces identificarse como un modulador de la actividad de una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP, comparando los efectos del compuesto candidato con el compuesto control. Compuestos control convenientes incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) y solución salina normal
(NS).
En otra realización, agentes que modulan (es decir regulan hacia arriba o hacia abajo) la expresión, actividad o ambos, expresión y actividad de una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP se identifican en un modelo animal. Ejemplos de animales convenientes incluyen, pero no se limitan a ello, ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, perros y gatos. Preferiblemente, los animales usados representan un modelo de cáncer de mama /por ejemplo, xenoinjertos de líneas celulares de cáncer de mama humano como MDA-MB-345 en ratones con Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID) privados de estrógeno, Eccles et al., 1994 Cell Biophysics 24725, 279). Estos pueden utilizarse para ensayar compuestos que modulan niveles de BCMP, ya que la patología exhibida en estos modelos es similar a la del cáncer de mama. De acuerdo con esta realización, el compuesto ensayo o un compuesto control se administra (por ejemplo, oralmente, rectalmente o parenteralmente como intraperitonelamente o intravenosamente) a un animal conveniente, y se determina el efecto sobre la expresión, actividad o ambos de la BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP. Cambios en la expresión de BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP pueden evaluarse por los métodos señalados más arriba. En aún otra realización, una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP se usa como "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o de tres híbridos para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP (por ejemplo, véase, patente de EE.UU. Nº 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., (1993) Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Publicación PCT Nº WO 94/10300). Como apreciarán los expertos en la técnica, esas proteínas de unión están también probablemente implicadas en la propagación de señales por las BCMPs de la invención, como por ejemplo, elementos hacia arriba y hacia abajo de una trayectoria de señalización que implica a la BCMP.
Agentes identificados por los ensayos de exploración descritos más arriba pueden usarse para tratamientos como se describe aquí. Además, la invención también proporciona el uso de un agente que interacciona con, o modula la actividad de, una o más BCMPs de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama.
Uso terapéutico de BCMPs
La invención es útil para el tratamiento o prevención de varias enfermedades y trastornos por administración de un compuesto terapéutico. Esos compuestos incluyen, pero no se limitan a, BCMPs, análogos de BCMP o polipéptidos relacionados con la BCMP y derivados (incluyendo fragmentos) suyos; anticuerpos de lo precedente; ácidos nucleicos que codifican BCMPs, análogos de BCMP, polipéptidos relacionado con la BCMP y fragmentos suyos, ácidos nucleicos antisentido a un gen que codifica una BCMP o polipéptido relacionado con la BCMP; y modulador (por ejemplo, agonistas y antagonistas) de un gen que codifica una BCMP o polipéptidos relacionado con la BCMP. Esta invención está basada en la identificación de genes que codifican BCMPs implicadas en el cáncer de mama. El cáncer de mama puede tratarse (por ejemplo, para mejorar síntomas o retardar la aparición o progresión) o prevenirse por administración de un compuesto terapéutico que promueve la función o expresión de una o más BCMPs que han disminuido en el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama, o por administración de un compuesto terapéutico que reduce la función o expresión de una o más BCMPs que han aumentado en el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama.
En una realización, uno o más anticuerpos que se unen cada uno específicamente a una BCMP se administran solos o en combinación con uno o más compuestos o tratamientos terapéuticos adicionales. Ejemplos de esos compuestos o tratamientos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, taxol, ciclofosfamida, tamoxifeno y doxorubacina.
Preferiblemente, un producto biológico como un anticuerpo es alogénico al sujeto al que se administra. En una realización preferida, una BCMP humana o polipéptido relacionado con la BCMP humana, una secuencia de nucleótido que codifica una BCMP humana o polipéptido relacionado con la BCMP humana, o un anticuerpo a una BCMP humana o polipéptido relacionado con la BCMP humana, se administra a un sujeto humano para terapia (por ejemplo para mejorar los síntomas o para retardar la aparición o progresión) o profilaxis.
Tratamiento y prevención del cáncer de mama
El cáncer de mama se trata o previene por administración a un sujeto que se sospecha tiene cáncer de mama o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama, de un compuesto que modula (es decir, aumenta o disminuye) el nivel o actividad (es decir, función) de una o más BCMPs que están diferencialmente presentes en el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama en comparación con tejido mamario de sujetos libres de cáncer de mama. En una realización, el cáncer de mama se trata o previene administrando a un sujeto que se sospecha tiene cáncer de mama o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama, un compuesto que regula hacia arriba (es decir, aumenta) el nivel o actividad (es decir, función) de una o más BCMPs que están disminuidas en el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama. Ejemplos de ese compuesto incluyen, pero no se limitan a,: BCMPs, fragmentos de BCMP y polipéptido relacionado con la BCMP (por ejemplo, para uso en terapia génica); y para las BCMPs o polipéptidos relacionados con la BCMP con actividad enzimática, compuestos o moléculas conocidos para modular esa actividad enzimática. Otros compuestos que pueden usarse, por ejemplo agonistas de BCMP, pueden identificarse usando ensayos in vitro.
El cáncer de mama se trata también o previene por administración a un sujeto que se sospecha tiene cáncer de mama o está en riesgo de desarrollarlo, de un compuesto que regula hacia abajo el nivel de actividad de una o más BCMPs que están incrementadas en el tejido mamario de sujetos que tienen cáncer de mama. En otra realización, se administra un compuesto que regula hacia arriba el nivel o actividad de una o más BCMPs que están disminuidas en el tejido mamario de sujetos con cáncer de mama. Ejemplos de esos compuestos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, ribozimas, anticuerpos dirigidos contra BCMPs, y compuestos que inhiben la actividad enzimática de una BCMP. Otros compuestos útiles, por ejemplo antagonistas de BCMP y antagonistas de BCMP de pequeña molécula, pueden identificarse usando ensayos in vitro.
En una realización preferida, la terapia o profilaxis se adapta a las necesidades de un sujeto individual. Así, en realizaciones específicas, compuestos que promueven el nivel o función de una o más BCMPs se administran profilácticamente o terapéuticamente a un sujeto que se sospecha que tiene, o sabe que tiene, cáncer de mama en el que los niveles o funciones de dicha una o más BCMPs están ausentes o disminuidas en relación a un intervalo de referencia normal o control. En realizaciones adicionales, compuestos que promueven el nivel o función de una o más BCMPs se administran profilácticamente o terapéuticamente a un sujeto que se sospecha tiene o sabe que tiene cáncer de mama en el que los niveles o funciones de dicha una o más BCMPs están aumentados en relación a un intervalo de referencia o control. En realizaciones adicionales, compuestos que disminuyen el nivel o función de una o más BCMPs se administran profilácticamente o terapéuticamente a un sujeto que se sospecha tiene o sabe que tiene cáncer de mama en el que los niveles o funciones de dicha una o más BCMPs están disminuidos en relación a un intervalo de referencia o control. El cambio en la función o nivel de BCMP debido a administración de esos compuestos puede detectarse fácilmente, por ejemplo, obteniendo una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido mamario, sangre u orina o una muestra de tejido como un tejido de biopsia) y ensayando in vitro los niveles o actividades de esas BCMPs, o los niveles de mARNa que codifican esas BCMPs, o cualquier combinación de lo precedente. Esos ensayos pueden realizarse antes y después de la administración del compuesto como se ha descrito aquí.
Los compuestos incluyen, pero no se limitan a cualquier compuesto, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, proteína, péptido, anticuerpo, ácido nucleico, etc., que restaura el perfil de la BCMP hacia lo normal, con la condición de que esos compuestos o tratamientos no incluyan taxol, ciclofosfamida, tamoxifeno, y doxorubacina. Los compuestos pueden darse en combinación con cualquier otro compuesto, incluyendo taxol, ciclofosfamida, tamoxifeno y doxorubacina.
Terapia con vacunas
Las BCMPs pueden ser útiles como material antígeno, y pueden usarse en la producción de vacunas para tratamiento o profilaxis del cáncer de mama. Ese material puede ser "antígeno" y/o "inmunógeno". Generalmente, "antígeno" se toma para significar que la proteína es capaz de usarse para aumentar anticuerpos o es capaz de inducir una respuesta anticuerpo en un sujeto. "Inmunógeno" se toma para significar que la proteína es capaz de elicitar una respuesta inmune protectora en un sujeto. Así, en el último caso, la proteína puede ser capaz de no solo generar una respuesta anticuerpo, sino además, una respuesta inmune no basada en anticuerpo.
La persona experta apreciará que los homólogos o derivados de las BCMPs también encontrarán uso como material antígeno/inmunógeno. Así, por ejemplo, proteínas que incluyen una o más adiciones, supresiones, sustituciones o similares son útiles en esta invención. Además, puede ser posible sustituir un aminoácido con otro o de "tipo" similar. Por ejemplo, sustituyendo un aminoácido hidrófobo con otro. Se puede usar un programa como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima para insertar espacios en cualquier secuencia apropiada. Es posible calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad plus conservación de tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTc alineará la extensión más larga de secuencias similares y asignará un valor a la correspondencia. Así es posible obtener una comparación donde se encuentran varias regiones de similitud, teniendo cada una diferente línea. Se contemplan ambos tipos de análisis.
En el caso de homólogos y derivados, el grado de identidad con una proteína como se describe aquí es menos importante que que el homólogo o derivado retenga su antigenicidad o inmunogenicidad. Sin embargo se proporcionan, convenientemente, homólogos o derivados que tienen al menos 60% de similitud (como se estableció más arriba) con las proteínas o polipéptidos descritos aquí. Preferiblemente, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos 70% de similitud, más preferiblemente al menos 80% de similitud. Lo más preferiblemente, se proporcionan homólogos o derivados que tienen al menos 90% o incluso 95% de similitud.
En una aproximación alternativa, los homólogos o derivados podrían ser proteínas de fusión, que incorporan restos que hacen la purificación más fácil, por ejemplo etiquetando efectivamente la proteína o polipéptido deseado. Puede ser necesario eliminar la "etiqueta" o puede ser el caso de que la propia proteína de fusión retenga suficiente antigenicidad para ser útil.
Es bien conocido que es posible explorar una proteína o polipéptido antígenos para identificar regiones epitópicas, es decir aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad de la proteína o polipéptido. Métodos bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para ensayar fragmentos y/o homólogos y/o derivados respecto a su antigenicidad. Así, los fragmentos deberían incluir una o más de esas regiones epitópicas o ser suficientemente similares a esas regiones para retener sus propiedades anfígenas/inmunógenas. Así, para fragmentos útiles conforme a esta invención el grado de identidad es casi irrelevante, ya que puede ser 100% idéntico a una parte particular de una proteína o polipéptido, homólogo o derivado como se ha descrito aquí. La cuestión clave, una vez más, es que el fragmento retenga las propiedades anfígenas/inmunógenas de la proteína de la que se deriva.
Lo que es importante para los homólogos, derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido del que se derivan. Así, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de fragmentos antígenos/o inmunógenos de una BCMP, o de sus homólogos o derivados.
Las BCMPs, o sus fragmentos antígenos, pueden proporcionarse solas, como preparación aislada o purificada. Pueden proporcionarse como parte de una mezcla con una u otras más proteínas o sus fragmentos antígenos. En un aspecto adicional, por consiguiente, la invención proporciona el uso de una composición antígena que comprende una o más BCMPs y/ uno o más fragmentos antígenos suyos. Esa composición puede usarse para la detección y/o diagnóstico de cáncer de mama.
En un sexto aspecto, esta invención proporciona un método de detección y/o diagnóstico de cáncer de mama, que comprende:
Poner en contacto con una muestra a ensayar una BCMP antígena, o uno de sus fragmentos antígenos, o una composición anfígena, y detectar la presencia de anticuerpos de cáncer de mama.
En particular, la proteína, su fragmento antígeno o composición antígena puede usarse para detectar anticuerpos IgA, IgM p IgG. Convenientemente, la muestra a investigar será una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de sangre o saliva.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una BCMP antígena,uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena en la detección y diagnóstico de cáncer de mama. Preferiblemente, la detección y/o diagnóstico se realiza in vitro.
Las BCMPs antígenas, sus fragmentos antígenos o composición antígena útiles en esta invención pueden proporcionarse como un kit para usar en la detección y o diagnóstico in vitro de cáncer de mama. Así, en un aspecto adicional, esta invención proporciona el uso de un kit para usar en la detección y o diagnóstico in vitro de cáncer de mama, cuyo kit comprende una BCMP antígena, uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena.
Además,la BCMP antígena, uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena, puede usarse para inducir una respuesta inmune contra el cáncer de mama. Así, en todavía otro aspecto, la invención proporciona el uso de una BCMP antígena,uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena en medicina.
En un aspecto adicional, esta invención proporciona el uso de una respuesta inmune en un sujeto, cuya composición comprende una BCMP antígena,uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena de la invención. Convenientemente, composición será una composición de vacuna, que comprende opcionalmente uno o más auxiliares convenientes. Esa composición vacuna puede ser una composición profiláctica o terapéutica.
La composición vacuna útil en la invención puede incluir uno o más auxiliares. Ejemplos bien conocidos en la técnica incluyen geles orgánicos, como hidróxido de aluminio, y emulsiones agua en aceite, como auxiliar de Freund incompleto. Otros auxiliares útiles son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En aún otros aspectos, esta invención proporciona el uso de una BCMP antígena,uno de sus fragmentos antígenos o una composición antígena de la invención en la preparación de una composición inmunógena, preferiblemente una vacuna. Esa composición inmunógena es útil para inducir una respuesta inmune en un sujeto; y puede usarse en un método para el tratamiento o profilaxis de cáncer de mama en un sujeto, o para vacunar a un sujeto contra el cáncer de mama, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad efectiva de una BCMP, al menos un fragmento suyo antígeno o una composición antígena, preferiblemente como una vacuna.
En una realización específica, una preparación de BCMPs o fragmentos de péptidos de BCMP definidos antes se usa como vacuna para el tratamiento del cáncer de mama. Esas preparaciones pueden incluir auxiliares u otros vehículos.
En otra realización, una preparación de oligonucleótidos que comprende 10 o más nucleótidos consecutivos complementarios a una secuencia de nucleótidos que codifica BCMPs o fragmentos de péptidos de BCMP se definió más arriba para usar como vacunas para el tratamiento de cáncer de mama. Esas preparaciones pueden incluir auxiliares u otros vehículos.
Terapia génica
En una realización específica, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica una BCMP, fragmento de BCMP, polipéptido relacionado con BCMP o un fragmento de polipéptido relacionado con BCMP, se administran para promover la función BCMP por vía de terapia génica. La terapia génica se refiere a administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización, el ácido nucleico produce su poliéptido codificado que media en un efecto terapéutico promoviendo la función BCMP.
Cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica pueden usarse conforme a esta invención. Ejemplos de métodos se describen a continuación.
Para revisión general de la terapia génica, véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991 Biotherapy 3:87-95; Toldtoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; y Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante pueden usarse como se describe en Ausubel et al., (eds), 1993, Current protocols in Molecular BIology, John Wiley & Sons, Nueva York; y Kriegler, 1990, Gene transfer and expresión, A Laboratory manual, Stochton Press, Nueva York.
En un aspecto preferido, el compuesto comprende un ácido nucleico que codifica una BCMP o fragmento o proteína quimérica suyos, siendo parte ese ácido nucleico de un vector de expresión que expresa una BCMP o fragmento o proteína quimérica suyos en un huésped conveniente. En particular, ese ácido nucleico tiene un promotor conectado operablemente a la región de codificación de BCMP, siendo ese promotor inducible o constitutivo (y opcionalmente, específico del tejido). En otra realización particular, se usa una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de codificación de BCMP y otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica del ácido nucleico de BCMP (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., Nature 342:435-438).
El suministro del ácido nucleico a un sujeto puede ser directo, en cuyo caso el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o vector que soporta el ácido nucleico; esta aproximación se conoce como terapia génica in vivo. Alternativamente, el suministro del ácido nucleico al sujeto puede ser indirecto, en cuyo caso las células se transforman primero con el ácido nucleico in vitro y después se trasplantan al sujeto; esta aproximación se conoce como terapia génica ex vivo .
En una realización específica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, donde se expresa para producir el producto codificado. Esto puede realizarse por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se convierte en intracelular, por ejemplo, por infección utilizando un retroviral atenuado o defectuoso u otro vector viral (véase patente EE.UU. Nº 4.980.286); por inyección directa de ADN desnudo; por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont); revistiéndolo con lípidos, receptores de superficie de células o agentes de transfección; por encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas; administrándolo en conexión con un péptido que se sabe entra en el núcleo; o administrándolo en conexión con un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase por ejemplo, Wu and Wu, 1987, Biol Chem. 262:4429-4432), que puede usarse para dirigirse a tipos de células que expresan los receptores específicamente. En otra realización, un complejo ácido nucleico-ligando puede formarse en el que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para interrumpir endosomas, permitiendo al ácido nucleico dirigirse in vivo para recogida y expresión específica de la célula, dirigiéndose a un receptor específico (véase, por ejemplo, PCT Publications WO 92/06180 abril 16, 1992 (Wu et al.): WO 92/22635, diciembre 23, 1992 (Wilson et al.); WO92/20316 noviembre 26, 1992 (Fundeis et al.) WO93/14188 julio 22, 1993 (Clarke et al.) WO93/20221 octubre 14, 1993 (Young)). Alternativamente el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro de la célula huésped de ADN para expresión, por recombinación homóloga (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 198, Nature
324:435-438).
En una realización específica, se usa un vector viral que contiene un ácido nucleico que codifica una BCMP. Por ejemplo, se puede usar un vector retroviral (Véase Millar et al., 1993, Meth. Enzymol, 217:581-599). Estos vectores retrovirales se han modificado para suprimir las secuencias retrovirales que no son necesarias para empaquetado del genoma viral e integración en la célula huésped ADN. El ácido nucleico que codifica la BCMP a usar en la terapia génica se clona en el vector, lo que facilita el suministro de un gen a un sujeto. Más detalles acerca de los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen mdr1ua células tallo hematopoyéticas con el fin de hacer las células tallo más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en la terapia génica son: Clowes et al., J. Clin Invest. 93:644-651; Kiem et al., 1994, Blood, 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Himan Gene Therapy 4:129-141; y Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel, 3:110-114.
Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan naturalmente los epitelios respiratorios donde pueden causar una leve enfermedad. Otros objetivos para sistemas de suministro a base de adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales, y los músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células sin división. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demostraron el uso de vectores adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de mono Rhesus. Otros ejemplos del uso de adnovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-1545; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin Invest, 91:225-234; PCT Publicación WO94/12649; and Wang, et al., 1995, Gene Therapy 2:775-783.
Virus adeno-asociados se han propuesto también para usar en terapia génica (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300; Patente Nº 5.436.146).
Otra aproximación de la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo de tejidos por métodos como la electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato cálcico, o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células se colocan entonces después bajo selección para aislar aquellas células que se han recogido y expresan los genes transferidos. Esas células se suministran entonces a un sujeto.
En esta realización el ácido nucleico se introduce en una célula previamente a la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Esa introducción puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero no limitándose a la transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, función celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas son conocidas en la técnica para la introducción de genes extraños en células (véase, por ejemplo, Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther 29:69-92) y pueden usarse de acuerdo con esta invención, siempre que no se perturben las necesarias funciones de desarrollo y fisiológicas de las células receptoras. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico sea expresable por la célula y preferiblemente heredable y expresable por su progenie celular.
Las células resultantes recombinantes pueden suministrarse a un sujeto por distintos métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, las células epiteliales se inyectan, por ejemplo, subcutáneamente. En otra realización, las células de piel recombinantes se aplican como un injerto de piel en el sujeto. Los glóbulos rojos recombinantes (por ejemplo, células de tallo hematopoyéticas o progenitoras) se administran preferiblemente de modo intravenoso. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, la condición del sujeto, etc., y puede determinarse por cualquier experto en la técnica.
Las células en las que puede introducirse el ácido nucleico con fines de terapia génica abarcan cualquier tipo de célula disponible deseada, e incluyen pero no se limitan a ello, células neuronales, células glial (por ejemplo, oligodendrocitos o astrocitos), células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; glóbulos rojos como linfocitos T, linfocitos B, monolitos, macrofagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, varias células tallo o progenitoras, en particular células tallo o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, obtenidas de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica o hígado fetal.
En una realización preferida, la célula usada para terapia génica es autóloga al sujeto que se trata.
En una realización en la que se usan células recombinantes en terapia génica, un ácido nucleico que codifica una BCMP se introduce en las células de modo que es expresable por las células de su progenie, y las células recombinantes se administran in vivo para efecto terapéutico. En una realización específica se usan células tallo o progenitoras. Cualquier célula tallo o progenitora que puede aislarse y mantenerse in vitro puede usarse de acuerdo con esta realización de esta invención (véase por ejemplo, PCT publicación WO 94/08598, abril 28, 1994; Stemple and Anderson, 1992, Cell
71:973-985; Rheiwald, 1980, meth. Cell. Biol. 21ª:229; y Pittelkow and Scout, 1986, mayo Clinic Proc. 61:771).
En una realización específica, el ácido nucleico a introducir para fines de terapia génica comprende un promotor inducible operablemente conectado a la región que codifica, de modo que la expresión del ácido nucleico es controlable controlando la presencia o ausencia del apropiado inductor de transcripción.
La inyección directa de un ADN que codifica una BCMP puede también realizarse de acuerdo con, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente de EE.UU. Nº 5.589.466. estas técnicas implican la inyección de "ADN desnudo", es decir, moléculas de ADN en la ausencia de liposomas, células o cualquier otro material además de un soporte conveniente. La inyección de ADN que codifica una proteína y operablemente conectado a un promotor conveniente da lugar a la producción de la proteína en células próximas al sitio de inyección y la provocación de una respuesta inmune en el sujeto a la proteína codificada por el ADN inyectado. En una realización preferida, el ADN desnudo que comprende (a) ADN que codifica una BCMP y (b) un promotor se inyectan en un sujeto para provocar una respuesta inmune a la BCMP.
Inhibición de BCMPs para tratar el cáncer de mama
En una realización de esta invención, el cáncer de mama se trata o previene por administración de un compuesto que antagoniza (inhibe) el nivel(es) y/o función(es) de una o más BCMP que son elevadas en el tejido de mama de sujetos que tienen cáncer de mama en comparación con el tejido mamario de sujetos libres de cáncer de mama.
Compuestos útiles para este fin incluyen pero no se limitan a ello, anticuerpos a- BCMP (y fragmentos y derivados de ácidos nucleicos que codifican las BCMPS disfuncionales que se usan para"dejar fuera de combate" la función BCMP endógena por recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Otros compuestos que inhiben la función BCMP pueden identificarse por uso de ensayos in vitro conocidos, por ejemplo, ensayos respecto a la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la unión de una BCMP a otra proteína o un colaborador de unión, o para inhibir una función BCMP conocida. Preferiblemente esa inhibición se ensaya in vitro o en un cultivo celular, pero también pueden emplearse ensayos genéticos. La Tecnología Preferida también puede usarse para detectar niveles de las BCMPs antes y después de la administración del compuesto. Preferiblemente, ensayos in vitro o in vivo se emplean para determinar el efecto de un compuesto específico y si su administración es indicada para el tratamiento del tejido afectado, como se describe con más detalle a continuación.
En una realización específica, un compuesto que inhibe una función BCMP se administra terapéuticamente o profilácticamente a un sujeto en el que se detecta un nivel de tejido mamario o actividad funcional de la BCMP incrementados (por ejemplo, más grande del nivel normal o del nivel deseado), en comparación con el tejido mamario de sujetos libres de cáncer de mama o un intervalo de referencia determinado. Pueden emplearse métodos estándar en la técnica para medir el aumento en un nivel o función de BCMP, como se destaca más arriba. Las composiciones inhibidoras preferidas de BCMP incluyen pequeñas moléculas, es decir, moléculas de 1.000 daltons o menos. Esas moléculas pueden identificarse por los métodos de exploración aquí descritos.
Regulación antisentido de BCMPs
En una realización específica, la expresión BCMP se inhibe por el uso de ácidos nucleicos antisentido. Esta invención proporciona el uso terapéutico o profiláctico de ácidos nucleicos que comprenden al menos seis nucleótidos que son antisentido a un gen o cADN que codifica una BCMP o una porción suya. Como se usa aquí, un ácido nucleico "antisentido" de BCMP se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridar por virtud de alguna secuencia complementariamente a una porción de un ARN (preferiblemente mARN) que codifica una BCMP. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una región que codifica y/ o no codifica de un rARN que codifica una BCMP. Esos ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como compuestos que inhiben la expresión BCMP, y pueden usarse en el tratamiento o prevención del cáncer de mama.
Los ácidos nucleicos antisentido son oligonucleótidos de doble hebra o de hebra única, ARN o ADN o una modificación o derivado suyos, y pueden administrarse directamente a una célula o producirse intracelularmente por transcripción de secuencias introducidas, exógenas.
La invención puede usar composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de los ácidos nucleicos antisentido de BCMP en un soporte farmacéuticamente aceptable, como se describe infra.
En otra realización, la invención es útil en métodos para inhibir la expresión de una secuencia de ácido nucleico de una BCMP en una célula procariótica o eucariótica que comprende proporcionar la célula con una cantidad efectiva de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido de BCMP de la invención.
Ácidos nucleicos antisentido y sus usos se describen con detalle a continuación.
Ácidos nucleicos antisentido de BCMP
Los ácidos nucleicos antisentido de BCMP son de al menos seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos que oscilan desde 6 a aproximadamente 50 oligonucleótidos. En aspectos específicos, los oligonucleótidos son al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, o al menos 200 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas suyas y pueden ser de hebra única o de doble hebra. Los oligonucleótidos pueden estar modificados en el resto base, en el resto azúcar, o en el esqueleto fosfato. Los oligonucleótidos pueden incluir otros grupos añadidos como péptidos; agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (por ejemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84:648-652; PCT Publicación Nº WO 88/09810, publicado en diciembre 15, 1988) o de la barrera sangre-cerebro (véase por ejemplo, PCT Publicación Nº WO 89/10134, publicada en abril 25, 1988); agentes de escisión desencadenada de hibridación (por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res.
5:539-549).
En un aspecto preferido, se proporciona un oligonucleótido antisentido de BCMP, preferiblemente de ADN de única hebra. El oligonucleótido puede modificarse en cualquier posición en su estructura con sustituyentes generalmente conocidos en la técnica.
El oligonucleótido antisentido de BCMP puede comprender al menos uno de los siguientes restos de base modificados: 5-fluoruracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidro-
metil)uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tioruridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inopina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, uracil-5-ácido oxacético metiléster, uracil-5 ácido oxacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracil, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y otros análogos de base.
En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un resto de azúcar modificado, por ejemplo, uno de los siguientes restos de azúcar: arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.
En aún otra realización, el oligonucleótido comprende al menos uno de los siguientes esqueletos de fosfato modificados: un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforo amidoditioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriester, y formacetal, o un análogo de formacetal.
\newpage
En aún otra realización, el oligonucleótido es un oligonucleótido \alpha-anomérico. Un oligonucleótido \alpha-anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con RNA complementario en que, contrariamente a las unidades-\beta usuales, las hebras corren paralelas entre sí (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids. Res. 15:6625-6641).
El oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenado por hibridación, agente de transporte, o agente de ruptura desencadenada por hibridación.
Los oligonucleótidos pueden sintetizarse por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de ADN automatizado (como están disponibles comercialmente en Bioserch, Applied Biosystems, etc). Como ejemplos, oligonuleótidos de fosforotioato pueden sintetizarse por el Método de Stein et al., (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), y pueden prepararse oligonucleótidos de metilfosfonato por uso de soportes de polímeros de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:7448:7451).
En una realización específica, el ácido nucleico antisentido de BCMP se produce intracelularmente por transcripción desde una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector pude introducirse in vivo de modo que sea captado por una célula, dentro de cuya célula el vector o una porción suya se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN). Ese vector contendrá una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido de BCMP. Ese vector puede permanecer episomal o llegar a integrarse cromosómicamente, en tanto en cuanto pueda ser transcrito para producir el deseado ARN antisentido. Esos vectores pueden construirse por tecnología de ADN estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión en células de mamíferos. La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido de BCMP puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en células de mamíferos, preferentemente humanos. Esos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Ejemplos de esos promotores se destacan más arriba.
Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria a al menos una porción de un transcripto de ARN de un gen que codifica una BCMP, preferiblemente un gen humano que codifica una BCMP. Sin embargo aunque preferida, no se requiere absoluta complementariedad. Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN", como se refiere aquí, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones altamente rigurosas comprenden hibridación en dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65ºC y lavado en 0,1xSSC/0,1%SDS a 68ºC, o condiciones moderadamente rigurosas comprenden lavado en 0,2xSSC/o,1%SDS a 42ºC) con el ARN, formando un duplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido de BCMP de doble hebra, una hebra única del ADN dúplex puede así ensayarse o puede ensayarse una formación triple. La capacidad para hibridar dependerá tato del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más largo es el ácido nucleico hibridante, más desigualdades de base puede tener con un ARN codificante de BCMP e incluso formar un duplex estable (o triplex, como puede ser el caso). Un experto en la técnica puede garantizar un grado tolerable de desigualdad por el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.
Uso terapéutico de ácidos nucleicos antisentido de BCMP
Los ácidos nucleicos antisentido de BCMP pueden usarse para tratar o prevenir cáncer de mama cuando la diana BCMP está sobreexpresada en el tejido mamario de sujetos sospechosos de tener o sufrir cáncer de mama. En una realización preferida, se usa un oligonucleótido de BCMP antisentido de ADN de única hebra.
Los tipos celulares que expresan o sobreexpresan ARN que codifica una BCMP pueden identificarse por varios métodos conocidos en la técnica. Esos tipos celulares incluyen, pero no se limitan a leucocitos (por ejemplo, neutrófilos, macrofagos, monocitos) y células residentes (por ejemplo, astrocitos, células glial, células neuronales y células ependimales). Esos métodos incluyen, pero no se limitan a, hibridación con un ácido nucleico específico de BCMP (por ejemplo, por hibridación Northern, hibridación puntiforme, hibridación in situ), observando la capacidad del ARN desde el tipo celular para ser trasladado in vitro a una BCMP, inmunoensayo, etc. En un aspecto preferido, el tejido primario de un sujeto puede ensayarse para expresión de BCMP antes del tratamiento, por ejemplo, por inmunoquímica o hibridación in situ.
Composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un ácido nucleico antisentido de BCMP en un excipiente farmacéuticamente aceptable, pueden administrarse a un sujeto que tenga cáncer de mama.
La cantidad de ácido nucleico antisentido de BCMP que será efectiva en el tratamiento del cáncer de mama puede determinarse por técnicas clínicas estándar.
En una realización específica, composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más ácidos nucleicos antisentido de BCMP se administran via liposomas, micropartículas o microcápsulas. En varias realizaciones, esas composiciones pueden usarse para conseguir liberación sostenida de los ácido nucleico antisentido de BCMP. En una realización específica, puede ser deseable usar liposomas dirigidos vía anticuerpos a antígenos de tumores identificables específicos (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:248-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:
16337-16342).
Ribozima inhibidor y aproximaciones de triple hélice
En otra realización, los síntomas de cáncer de mama pueden mejorarse disminuyendo el nivel de una BCMP o actividad de BCMP utilizando secuencias de genes que codifican la BCMP en conjunción con métodos bien conocidos de "knock out" de genes, ribozima o triple hélice para disminuir la expresión génica de BCMP. En esta aproximación las moléculas de ribozima o de triple hélice se usan para modular la actividad, expresión o síntesis del gen que codifica la BCMP, y así mejorar los síntomas de cáncer de mama. Esas moléculas pueden diseñarse para reducir o inhibir la expresión de un gen diana mutante o no mutante. Técnicas para la producción y uso de esas moléculas son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Las moléculas de ribozima diseñadas para romper catalíticamente transcriptos de gen de mARN que codifican una BCMP pueden usarse para prevenir la traslación de gen de mARN diana y, por consiguiente, la expresión del producto génico. (Véase, por ejemplo, PCT Internacional Publication WO90/11364, publicada en octubre 4, 1990; Sarver et al., Science 247:122-1225).
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la ruptura específica de ARN. (Para una revisión, véase Rossi,1994, Current Biology 4, 469-471). El mecanismo de la acción de la ribozima implica hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima a ARN diana complementario, seguido de evento de ruptura endonucleolítico. La composición de las moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias complementarias al gen de mARN diana, y debe incluir la secuencia catalítica bien conocida, responsable de la ruptura de mARN. Para esta secuencia, véase, por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 5.093.246.
Aunque las ribozimas que rompen mARN en sitios de secuencias de reconocimiento específicos pueden usarse para destruir mARN que codifica una BCMP, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo rompen mARN en ubicaciones dictadas por regiones contiguas que forman pares de base complementarios con el mARN diana. El único requisito es que el mARN diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'UG-3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describe más completamente en Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Referente, VCH Punlishers, Nueva York (véase especialmente la figura 4, página 833) y en Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334, 585-591.
Preferiblemente la ribozima se obtiene por ingeniería genética, así que el sitio de reconocimiento de ruptura se localiza cerca del extremo 5' del mARN que codifica la BCMP, es decir, para aumentar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de transcriptos de mARN no funcionales.
Las ribozimas también incluyen endoribonucleasas de ARN (de ahora en adelante "Cech-type ribozimas") como la que está presente naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como la IVS, o L-19IVS RNA) y que ha sido descrita extensamente por Thomas Cech y colaboradores (Zaug et al., Science, 224, 574-578, Zaug and Cech, 1986, Science, 231, 470-475; Zaug et al., 1986, Nature; 324, 429-433; publicada solicitud de patente internacional Nº WO88/04300 por University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47, 207-216). Las ribozimas tipo Cech tienen un sitio activo con ocho pares de bases que hibrida a una secuencia de ARN diana y tiene lugar la ruptura del ARN diana. Los ribozimas tipo Cech con un sitio activo con ocho pares de bases que están presentes en los genes que codifican la BCMP pueden usarse conforme a la invención.
Como en la aproximación antisentido, los ribozimas pueden estar compuestos por oligonucleótidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, dirección, etc) y se suministrarán a células que expresen la BCMP in vivo. Un método preferido de suministro implica usar un constructo de ADN que "codifica" la ribozima bajo control de un promotor pol II o pol II constitutivo fuerte, de modo que las células transfectadas producirán suficientes cantidades de la ribozima para destruir el mARN endógeno que codifica la BCMP e inhibir la traslación. Debido a que las ribozimas, a diferencia de las moléculas antisentido, son catalíticas se requiere una menor concentración intracelular para conseguir eficacia.
La expresión BCMP endógena puede también reducirse por inactivación o "knocking out" del gen que codifica la BCMP, o el promotor de ese gen, utilizando recombinación homóloga dirigida (por ejemplo, véase, Smithies et al.,1985, Nature 317;230-234, Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et al, 1989, Cell 5:313-321; y Zijlstra et al., 1989, Nature, 342:435-438, cada uno de los cuales se incorpora por referencia que en su totalidad). Por ejemplo, puede usarse un gen mutante que codifica una BCMP no funcional (o una secuencia de ADN no relacionada completamente) flanqueado por homólogos de ADN al gen endógeno (ya sea las regiones que codifican o las regiones reguladoras del gen que codifica la BCMP), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan el gen diana in vivo. La inserción del constructo de ADN, via la recombinación homóloga dirigida, da lugar a inactivación del gen diana. Esas aproximaciones son particularmente seguidas en el campo de la agricultura donde las modificaciones a células ES (tallo embriónico) pueden usarse para generar descendientes animales con un gen diana inactivo (por ejemplo, véase Thomas and Capecchi, 1987 y Thompson, 1989, supra). Sin embargo esta aproximación puede adaptarse para usar en humanos siempre que los constructos de ADN recombinante se administren directamente o se dirijan al sitio requerido in vivo utilizando vectores virales apropiados.
Alternativamente, la expresión endógena de un gen que codifica una BCMP puede reducirse dirigiendo secuencias de desoxiribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen (es decir, el gen promotor y/o potenciador) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen que codifica la BCMP en células diana en el cuerpo. (Véase generalmente Helen, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene et al., 1992, Ann. N.Y. Acad Sci., 660, 27-36, y Maher, 1992, Bioassays 14(12) 807-815). Las moléculas de ácido nucleico a usar en formación de triple hélice para la inhibición de transcripción deberán ser de única hebra y compuestos por desoxinucleótidos. La composición base de estos desoxinucleótidos debe diseñarse para promover la formación de triple hélice via reglas de apareamiento de base de Hoogsteen, que generalmente requiere que estén presentes extensiones considerables de purinas o pirimidinas en una hebra de un duplex. Las secuencias de nucleótidos pueden ser de base pirimidina, lo que dará lugar a TAT y tripletes CGC+ a través de las tres hebras asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en pirimidina proporcionan base complementaria a una región rica en purina de una única hebra del duplex en una orientación paralela a esa hebra. Además, las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser elegidas ricas en purina, que contengan por ejemplo una extensión de residuos G.
Estas moléculas formarán una triple hélice con un duplex de ADN que es rico en pares GC, en el que la mayoría de los residuos de purina se localizan sobre una única hebra del duplex dirigido, dando lugar a tripletes GGC a través de las tres hebras en el triplex.
Alternativamente, las secuencias potenciales que pueden ser dirigidas para formación de triple hélice, pueden aumentarse creando una molécula de ácido nucleico llamada "switchback". Las moléculas "switchback" se sintetizan en una manera 5'-3', 3'-5' alternante, tal que crean pares de bases primero con una hebra de un duplex y después con la otra, eliminando la necesidad de que una extensión considerable de purinas o pirimidinas esté presente en una hebra del duplex.
En casos en que las moléculas antisentido ribozima o de triple hélice descritas aquí se utilizan para inhibir expresión de gen mutante, es posible que la técnica pueda así reducir o inhibir tan eficientemente la transcripción (triple élice) o traslación (antisentido, ribozima) de mARN producido por alelos génicos normales de una BCMP, que pueda surgir la situación de que la concentración de BCMP presente sea menor de lo que es necesario para un fenotipo normal. En esos casos, para garantizar que se mantienen niveles sustancialmente normales de actividad de un gen que codifica una BCMP, puede usarse la terapia génica para introducir en las células moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan la BCMP que muestra actividad génica normal y que no contiene secuencias susceptibles a cualquier tratamiento antisentido, de ribozima o de triple hélice que pueda utilizarse. Alternativamente, en casos en que el gen codifica una proteína extracelular, BCMPs normales se pueden co-administrar con el fin de mantener el nivel requerido de actividad de BCMP.
Moléculas de ARN y ADN antisentido, de ribozima y de triple hélice pueden prepararse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para la síntesis de moléculas de ADN y ARN, como se ha descrito antes. Estos incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligodesoxiribonucleótidos y oligoribonucleótidos bien conocidas en la técnica, como por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, moléculas de ARN pueden generarse por transcripción in vivo e in vitro de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Esas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa convenientes como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, los constructos de cADN antisentido que sintetizan ARN antisentido constitutiva o indeciblemente, dependiendo del promotor usado, pueden introducirse establemente en líneas celulares.
Ensayos de compuestos terapéuticos o profilácticos
Esta invención también proporciona ensayos para usar en descubrimiento de fármacos con el fin de identificar o verificar la eficacia de compuestos para el tratamiento o prevención del cáncer de mama. Los compuestos ensayo pueden investigarse respecto a su capacidad para restaurar niveles de BCMP en un sujeto que tiene cáncer de mama hasta niveles encontrados en sujetos libres de cáncer de mama o de producir cambios similares en modelos animales experimentales de cáncer de mama. Compuestos capaces de restaurar niveles de BCMP en un sujeto que tiene cáncer de mama hasta niveles encontrados en sujetos libres de cáncer de mama o de producir cambios similares en modelos animales experimentales de cáncer de mama pueden usarse como compuestos ejemplo para posterior descubrimiento de fármacos, o ser usados terapéuticamente. La expresión BCMP puede ensayarse por la Tecnología preferida, inmunoensayos, electroforesis de gel seguida de visualización, detección de actividad de BCMP, o cualquier otro método mostrado aquí o conocido por los expertos en la técnica. Esos ensayos pueden usarse para explorar fármacos candidatos, en monitorización clínica o en desarrollo de fármacos, donde la abundancia de BCMP puede servir como un marcador subrogado para diagnóstico clínico.
En varias realizaciones específicas, pueden realizarse ensayos in vitro con células representativas de tipos de células implicadas en un trastorno del sujeto, para determinar si un compuesto tiene un efecto deseado sobre esos tipos de células.
Los compuestos para usar en terapia pueden ensayarse en sistemas de modelos animales convenientes previamente al ensayo en humanos, incluyendo pero no limitándose a ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos, etc., Para ensayo in vivo, antes de administración a humanos, puede usarse cualquier sistema modelo animal conocido en la técnica.
Ejemplos de modelos de animales de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a, xenoinjertos de líneas celulares de cáncer de mama humano como MDA-MB-435 en ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID) privados de estrógeno (Eccles et al., 1994 Cell Biophysics 24/25, 279). Estos pueden utilizarse para compuestos de ensayo que modulan niveles de BCMP, ya que la patología exhibida en estos modelos es similar a la del cáncer de mama. Es también evidente para el experto en la técnica, que basándose en esta descripción, pueden producirse animales transgénicos con mutaciones "knock out" del gen o de los genes que codifican una o más BCMPs. Una mutación "knock out" de un gen es una mutación que causa que el gen mutado no se exprese, o se exprese de forma aberrante o a un nivel bajo, tal que la actividad asociada a ese producto génico es casi totalmente ausente. Preferiblemente, el animal transgénico es un mamífero, más preferiblemente, el animal transgénico es un ratón.
En una realización, los compuestos ensayo que modulan la expresión de una BCMP se identifican en animales no humanos (por ejemplo, ratones, ratas, monos, conejos y cobayas), preferiblemente modelos animales no humanos para cáncer de mama, que expresan la BCMP. De acuerdo con esta realización un compuesto ensayo o un compuesto control se administra a los animales, y se determina el efecto del compuesto ensayo sobre la expresión de una o más BCMPs. Un compuesto ensayo que altera la expresión de una BCMP (o una pluralidad de BCMPs) puede identificarse comparando el nivel de la BCMPo BCMPs seleccionadas (o mARN(s) que codifican lo misma) en un animal o grupo de animales tratados con un compuesto ensayo con el nivel de la BCMP(s)9 o mARN(s) en un animal o grupo de animales tratados con un compuesto control. Técnicas conocidas por los expertos en la técnica pueden usarse para determinar los niveles de mARN y proteína, por ejemplo, hibridación in situ. Los animales pueden ser o no sacrificados para ensayar los efectos de un compuesto ensayo.
En otra realización los compuestos ensayo que modulan la actividad de una BCMP o una porción suya biológicamente activa se identifican en animales no humanos (por ejemplo, ratones, ratas, monos, conejos y cobayas), preferiblemente modelos animales no humanos para cáncer de mama, que expresan las BCMPs. De acuerdo con esta realización un compuesto ensayo o un compuesto control se administra a los animales, y se determina el efecto del compuesto ensayo sobre la actividad de una BCMP. Un compuesto ensayo que altera la actividad de una BCMP (o una pluralidad de BCMPs) puede identificarse ensayando animales tratados con un compuesto control y animales tratados con el compuesto ensayo. La actividad de la BCMP puede evaluarse detectando la inducción de un mensajero segundo celular de la BCMP (por ejemplo, intracelular Ca2+, diacilglicerol, IP3, etc.,) detectando la actividad catalítica o enzimática de la BCMP o de su colaborador de unión, detectando la inducción de un gen reportero (por ejemplo, un elemento regulador que es sensible a una BCMP operablemente conectado a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, como proteína de luciferasa o fluorescente verde), o detectando una respuesta celular (por ejemplo, diferenciación celular o proliferación celular). Técnicas conocidas por los expertos en la técnica se pueden utilizar para detectar cambios en la actividad de una BCMP (véase por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 5.401.639, que se incorpora aquí por referencia).
En aún otra realización, los compuestos ensayo que modulan el nivel o expresión de una BCMP (o pluralidad de BCMPs) se identifican en sujetos humanos que tienen cáncer de mama, preferiblemente los que tienen cáncer de mama severo. De acuerdo con esta realización, un compuesto ensayo o un compuesto control se administra al sujeto humano, y el efecto del compuesto ensayo sobre la expresión de BCMP se determina analizando la expresión de la BCMP o mARN que codifica lo mismo en una muestra biológica (por ejemplo, tejido mamario, suero, plasma u orina). Un compuesto ensayo que altera la expresión de una BCMP puede identificarse comparando el nivel de la BCMP o el mARN que codifica lo mismo en un sujeto o grupo de sujetos tratados con un compuesto ensayo. Alternativamente, alteraciones en la expresión de una BCMP pueden identificarse comparando el nivel de una BCMP o mARN que codifica lo mismo en un sujeto o grupo de sujetos antes y después de la administración del compuesto ensayo. Técnicas conocidas por los expertos en la técnica se pueden utilizar para obtener la muestra biológica y analizar la expresión de mARN o de proteína. Por ejemplo, la Tecnología Preferida descrita aquí puede usarse para evaluar cambios en el nivel de una BCMP.
En otra realización, los compuestos ensayo que modulan la actividad de una BCMP (o pluralidad de BCMPs) se identifican en sujetos humanos que tienen cáncer de mama, (preferiblemente los que tienen cáncer de mama severo). En esta realización, un compuesto ensayo o un compuesto control se administra al sujeto humano, y se determina el efecto de un compuesto ensayo sobre la actividad de una BCMP. Un compuesto ensayo que altera la actividad de una BCMP puede identificarse comparando muestras biológicas de sujetos tratados con un compuesto control, con muestras de sujetos tratados con el compuesto ensayo. Alternativamente, alteraciones en la actividad de una BCMP pueden identificarse comparando la actividad de una BCMP en un sujeto o grupo de sujetos antes y después de la administración del compuesto ensayo. La actividad de la BCMP puede evaluarse detectando en una muestra biológica (por ejemplo, tejido mamario, suero, plasma u orina) la inducción de trayectoria de transducción de señal celular de la BCMP (por ejemplo, Ca2+ intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), actividad catalítica o enzimática de la BCMP o de un colaborador de unión suyo, o una respuesta celular, por ejemplo diferenciación celular o proliferación celular. Técnicas conocidas por los expertos en la técnica se pueden utilizar para detectar cambios en la inducción de un segundo mensajero de una BCMP o cambios en una respuesta celular. Por ejemplo, RT-PCR se pueden usar para detectar cambios en la inducción de un mensajero segundo celular.
En una realización preferida, un compuesto ensayo que cambia el nivel o expresión de una BCMP hacia niveles detectados en sujetos control (por ejemplo, humanos libres de cáncer de mama) se selecciona para posterior ensayo o uso terapéutico. En otra realización preferida, un compuesto ensayo que cambia la actividad de una BCMP hacia la actividad encontrada en sujetos control (por ejemplo, humanos libres de cáncer de mama) se selecciona para posterior ensayo o uso terapéutico.
En otra realización, compuestos ensayo que reducen la severidad de uno o más síntomas asociados con el cáncer de mama se identifican en sujetos humanos que tienen cáncer de mama, preferiblemente sujetos que tienen cáncer de mama severo. De acuerdo con esta invención, un compuesto ensayo o un compuesto control se administran a los sujetos, y se determina el efecto de un compuesto ensayo sobre uno o más síntomas del cáncer de mama. Un compuesto ensayo que reduce uno o más síntomas puede identificarse comparando los sujetos tratados con un compuesto control con los sujetos tratados con el compuesto ensayo. Técnicas conocidas por los médicos familiarizados con el cáncer de mama pueden usarse para determinar si un compuesto ensayo reduce uno o más síntomas asociados con el cáncer de mama. Por ejemplo, un compuesto ensayo que reduce la carga del tumor en un sujeto con cáncer de mama será beneficioso para los sujetos con cáncer de mama.
En una realización preferida, el compuesto ensayo que reduce la severidad de uno o más síntomas asociados con el cáncer de mama en un humano que tiene cáncer de mama se selecciona para posterior ensayo o uso terapéutico.
Composiciones terapéuticas o profilácticas y su uso
La invención es útil en métodos de tratamiento (y profilaxis) que comprenden la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto activo. En un aspecto preferido, el compuesto se purifica sustancialmente (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero no limitándose a vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano. En una realización específica, un mamífero no humano es el sujeto.
Formulaciones y métodos de administración que se pueden usar cuando el compuesto comprende un ácido nucleico se han descrito más arriba; a continuación se describen formulaciones y rutas de administración apropiadas adicionales. Se conocen varios sistemas de suministro y pueden usarse para administrar el compuesto activo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Métodos de inducción pueden ser parenterales o enterales e incluir pero no limitarse a, ruta intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección bolus, por absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas en el sistema nervioso central por cualquier ruta conveniente, incluyendo inyección intraventricular e inyección intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un cateter intraventricular, por ejemplo unido a un depósito, como el depósito Omnaya. La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, usando un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente para aerosoles.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en el área que necesita el tratamiento, esto puede conseguirse por ejemplo, y no por limitación, por infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo ese implante de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, como membranas elásticas, o fibras. En una realización, la administración puede ser por inyección directa en el tejido mamario o en el sitio (o primer sitio) de un tumor maligno o tejido neoplásico o preneoplásico.
En otra realización, el compuesto puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treta et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein and Fidler (eds), Liss, nueva Cork, pp.353-356 (1989); López-Berestein, ibid., pp. 317-327, véase generalmente ibid.)
En aún otra realización, el compuesto puede suministrarse en un sistema de liberación controlado. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980 surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavalability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.) Wiley, Nueva York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg, 71:105). En aún otra realización, un sistema de liberación controlada puede situarse en la proximidad de la diana terapéutica, es decir, el pecho, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984).
Otros sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (1990) Science 249:1527-1533).
En una realización específica en que el compuesto es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándola de modo que se convierte en intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (véase patente de EE.UU. Nº 4.980.286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de superficie o agentes de transfección de células, o administrándola en unión a un péptido similar a homeobox que se sabe entra en el núcleo (véase por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para expresión por recombinación homóloga.
Esta invención también usa composiciones farmacéuticas. Esas composiciones comprenden una cantidad efectiva terapéuticamente de un compuesto, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o reseñada en la U.S. Pharmacopeia u otras farmacopeas reconocidas generalmente para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "excipiente" se refiere a un diluyente, auxiliar, excipiente, o vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Esos excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el excipiente preferido cuando la composición farmacéutica se administra de forma intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas pueden también emplearse como excipientes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos convenientes incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada desecada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener cantidades pequeñas de agentes de humectación o emulsificación, a agentes tampón de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con ligantes y excipientes tradicionales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir excipientes estándar como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Esas composiciones contendrán una cantidad efectiva terapéuticamente del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad conveniente de excipiente para proporcionar la forma de administración adecuada al sujeto. La formulación se adaptará al modo de administración.
En una realización preferida, la formulación se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición deberá incluir también un agente de solubilización y un anestésico local como lidocaína para disminuir el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran separadamente o mezclados juntos en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se administra por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéuticamente estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
Los compuestos activos pueden formularse como formas neutras o salinas. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres como los derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y los formados con grupos carboxilo, como los derivados de hidróxidos cálcico, potásico, amónico, cálcico, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad de compuesto activo que será efectiva en el tratamiento del cáncer de mama puede determinarse por técnicas clínicas. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptima.
La dosis precisa a emplear en la formulación dependerá de la ruta de administración, y de la gravedad de la enfermedad o trastorno, y deberá decidirse de acuerdo con el juicio del médico y de las circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, intervalos de dosis convenientes para administración intravenosa son generalmente aproximadamente 20-500 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosis convenientes para administración intranasal son generalmente aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos animales.
Los supositorios generalmente contienen ingredientes activos en el intervalo de 0,5% a 10% en peso; las formulaciones orales preferiblemente contienen 10% a 95% de ingrediente activo.
La invención usa un kit o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas. Opcionalmente asociada con esos recipientes puede estar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental regulando la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya nota refleja (a) aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana, (b) directrices para su uso, o las dos.
Los ejemplos 2, 3, y 4 no pretenden formar parte de la invención.
Ejemplo 1 Identificación de proteínas de membrana expresadas en líneas celulares de cáncer de mama
Utilizando el siguiente Protocolo de Referencia, las proteínas en las membranas de líneas celulares de cáncer de mama se separaron por SDS-PAGE y se analizaron.
Materiales y métodos Ia- Fraccionamiento en crudo de líneas celulares de carcinoma de mama adherentes
Las líneas celulares de mama humana, MDA-MB(ATCC:HTB-132), T47D (ATCC:HTB-133) y BT20 (ATCC:
HTB-19) se cultivaron bajo varias condiciones de cultivo de tejidos (para la línea celular BT20: el medio de cultivo fue medio Tagle modificado, suero de ternera fetal al 10%, mezcla de aminoácidos no esenciales, glutamina 2 mM, 1% penicilina +estreptomicina. Para las líneas celulares T47D y MDA-MB-468 el medio de cultivo fue DMF12, suero de ternera fetal al 10%, glutamina 2 mM, 1% penicilina +estreptomicina. Las células se cultivaron en el medio de cultivo citado antes a 37ºC en CO_{2} al 5%). Las células se sometieron a lisis y se fraccionaron conforme a los protocolos descritos a continuación.
5 ml de tampón de homogenización frío (TrisHCl 50 mM, sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM pH 7,4) con antiproteinasa (cóctel de inhibidor de Sigma Proteinasa P2714) se añadieron a una serie de diez placas de cultivo de 15 cm^{2} que contenían células de carcinoma de mam 10e8 (aproximadamente 10 mg de proteína). Las células se rasparon de las placas con el tampón de homogenización frío y se transfirieron a un recipiente de 5 ml (colocado sobre hielo). La muestra resultante se sonicó (sobre hielo) utilizando un Soniprep MSE 150 con una sonda de fondo plano durante 10 segundos a una amplitud de 5 micrones. Las muestras se decantaron después a un tubo falcon de 15 ml y se centrifugaron a 1000g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante resultante se transfirió a un tubo de ultracentifugación clara de 11x60 mm, teniendo cuidado de no perturbar el pélet (proteína insoluble), y el tubo se rellenó con tampón de homogenización hasta casi lleno. El tubo se centrifugó después a 100x100 g durante 1 hora a 4ºC y después se colocó sobre hielo, y se separó el sobrenadante (citosol).
El pélet (fracción de membrana) se lavó suavemente en un homogenizador de vidrio (5-pasadas), se transfirió a un tubo de ultracentrífuga limpio y se centrifugó a 100x100 g durante 1 hora a 4ºC. Esta última etapa se repitió después, lavando con NaCl 0,5 M para quitar las proteína periféricas. La producción de proteína de membrana lavada de células de carcinoma de mam 10e8 fue aproximadamente 1-2 mg de proteína.
1b- Extracción de proteínas de membranas lavadas con el detergente Tx114
Esta extracción proporciona tres fracciones potenciales: insoluble en detergente, proteína de membrana periférica y proteína de membrana integral.
Membranas de células crudas se prepararon como se ha descrito en 1a más arriba y se resuspendieron en TrisHCl 50 mM, EDTA 1 mM 1,5% Triton X114, inhibidores de proteinasa, pH 7,4 via homogenización utilizando un homogenizador Dounce.
La mezcla de membrana Triton X114 (Tx114) se revolvió fuertemente y se incubó sobre hielo durante 30 minutos. Después de esto la mezcla de membrana (Tx114) se centrifugó durante 10 minutos a 13000 g a 4ºC y el sobrenadante se extrajo cuidadosamente de cualquier pélet de proteína insoluble en el detergente.
El sobrenadante (Tx114) se calentó a 37ºC durante 3 minutos en un baño de agua y después se centrifugó a 13000 durante 3 minutos. La capa acuosa de arriba se separó y la fase detergente inferior se resuspendió en 1 ml de TrisHCl 50 mM, EDTA 0,2 mM pH 7,4. esta extracción se repitió dos veces más.
La fase acuosa representa proteínas de membrana hidrofílicas y la fase detergente representa proteínas de membrana hidrófobas.
La proteína se extrajo de las fases acuosa y detergente por extracción con cloroformo-metanol como se describe en 1d a continuación. La producción de proteínas de membrana hidrofílicas de células 10e8 fue aproximadamente 0,5 mg y la producción de proteínas de membrana hidrófobas fue aproximadamente 0,1-0,2 mg. Finalmente, la proteína de membrana se solubilizó en aproximadamente 30 microlitros de tampón de lisis 1D (1-2 \mug/\mu l).
1c- Extracción de proteínas de membrana lavadas con el detergente digitonina
El pélet de membrana lavado de 1a se extrajo utilizando un tampón que contenía detergente como sigue.
El tampón de digitonina (0,01% en TrisHCl 50 mM pH 7,4) enfriado en hielo se añadió a la fracción de membrana, la solución resultante se homogenizó con 10 pasadas y se situó sobre hielo durante 30 minutos para permitir que la proteína se solubilice.
La muestra se centrifugó entonces a 13000 x g durante 5 minutos a 4ºC para convertir en pélet cualquier proteína insoluble, y el sobrenadante se extrajo utilizando cloroformo-metanol como se describe en 1d a continuación. La producción de proteína extraída con digitonina de células de carcinoma 10e8 fue aproximadamente 30-50 microgramos.
1d- Extracción de proteína de solución acuosa o detergente utilizando cloroformo/metanol
400 \mul de metanol, 100 \mul de cloroformo y 300 \mul de agua se añadieron a 100-200 \mul de una solución de detergente de 1b y 1c. La mezcla resultante se revolvió fuertemente y se agitó durante 60 segundos y después se centrifugó a 13000 x g durante 10 minutos a 20ºC.
Se generaron dos capas, con la proteína requerida en la interfase entre las dos capas. La capa de arriba se separó cuidadosamente, se añadieron 300 \mul de metanol y se invirtió el tubo, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 13000g a 4ºC para peletizar la proteína. El metanol se eliminó y se dejó secar el pélet al aire durante 5 a 10 minutos.
Después se resolubilizó este pélet en tampón de lisis 1D (TrisHCl 63 mM pH 7,4, glicerol al 10%, SDS 2%, Azul de bromofenol 0,0025%, mercaptoetanol al 2%).
1e- Tecnología de gel 1D
Pelets de proteína o de membrana se solubilizaron en tampón de muestra 1D (1-2 \mul). El tampón muestra y la mezcla de proteínas se calentaron entonces a 95ºC durante 3 minutos.
Un gel de gradiente de acrilamida al 9-16% se moldea con un gel de apilado y un peine de apilado conforme al procedimiento descrito en Ausubel F.M: et al., eds., 1989 Current Protocols en Molecular Biology, Vol. II, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc. Nueva York,sección 10.2, incorporado aquí por referencia en su totalidad.
30-50 microgramos de las mezclas de proteínas obtenidas del detergente y los estándares de peso molecular (66,45,31,21,14 kDa) se añadieron a los pocillos del gel de apilado utilizando la punta de un apipeta de 10 microlitros y las muestras se desarrollaron a 40 mA durante 5 horas.
Las placas se abrieron, el gel se situó en una bandeja de fijador (ácido acético al 10% etanol al 40%, agua 50%) y se agitaron durante la noche. Después de esto el gel se cebó durante 30 minutos agitando en una solución de cebo (ácido acético al 7,5% (75 ml), SDS al 0,05% (5 ml de 10%). El gel se incubó entonces con un colorante fluorescente (ácido acético al 7,5%, colorante doméstico OGS al 0,06% (600 \mul) agitando durante 3 horas. Sypro Rred (Sondas Moleculares, Inc., Eugene, Oregon) es un colorante conveniente para este propósito. Un colorante fluorescente preferido se describe en la solicitud de patente de EE.UU. Nº 09/412.168, registrada en Octubre 5, 1999, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
Se produce un resultado legible por ordenador por formación de imágenes de los geles teñidos por flruorescencia con un escáner Apollo 3 (Oxford Glycosciences, Oxford, UK). Este escáner se desarrolla a partir del escáner descrito en WO 96/36882 y la tesis de doctorado de David A. Basiji, titulada Desarrollo de un escáner de fluorescencia de alto rendimiento que emplea óptica de reflexión interna y detección sensible a fase (Reflexión interna total, Electroforesis)'', Universidad de Washington (1997), volumen 58/12-B de Dissertation Abstracts International, página 6686, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia. La última realización de este instrumento incluye las siguientes mejoras: El gel se transporta a través del escáner sobre un sistema de accionamiento por un tornillo regulador. Esto es preferible a dejar la placa de vidrio sobre el sistema accionado por correa que se define en la tesis de Basiji ya que proporciona un medio reproducible de transportar con seguridad por delante de la óptica de imágenes. El gel se asegura en el escáner frente a tres interrupciones de alineación que mantienen rígidamente la placa de vidrio en una posición conocida. Haciendo esto en conjunción con el sistema de transporte de precisión citado y el hecho de que el gel está unido a la placa de vidrio, la posición absoluta del gel puede predecirse y registrarse. Esto garantiza que coordenadas precisas de cada característica en el gel pueden comunicase al robot de corte para excisión. Este robot de corte tiene una disposición de montaje idéntica para la placa de vidrio para preservar la precisión posicional.
El soporte que mantiene el gel en su lugar tiene marcadores fluorescentes integrales (designados M1, M2, M3) que se usan para corregir la geometría de imagen y son un modelo de característica de control de calidad para confirmar que el escaneo se ha llevado a cabo correctamente. Los componentes ópticos del sistema se han invertido. El láser, espejo, guía de ondas y otros componentes ópticos están ahora por encima de la placa de vidrio a escanear. La realización de la tesis de Basisi tiene a estos por debajo. La placa de vidrio se monta por consiguiente en el escáner con el lado del gel hacia abajo, de modo que la trayectoria óptica permanece a través de la placa de vidrio. Haciendo esto, cualquier partícula de gel que pueda romperse desde la placa de vidrio caerá sobre la base del instrumento más que en la óptica.
Al escanear los geles, se separaron del tinte, se lavaron con agua y se dejaron secar al aire brevemente y se pasaron al Apollo 3. Después de la formación de imágenes, los geles se secaron en bolsas de polietileno que contenían un pequeño volumen de solución de teñido, y después se almacenaron a 4ºC.
Los pesos moleculares aparentes se calcularon por interpolación de una serie de marcadores de peso molecular conocidos que se desarrollan a lo largo de las muestras.
1f- Recuperación y análisis de proteínas seleccionadas
Las proteínas se cortaron con un robot de los geles por el proceso descrito en la Patente de EE.UU. Nº 6.064.754, secciones 5.4 y 5.6, 5.7, 5.8 (incorporadas aquí por referencia, como es aplicable a electroforesis ID, con modificación al cúter robótico como sigue: el cúter empieza en lo más alto de la banda, y corta un disco de gel de 1,7 mm de diámetro desde el borde izquierdo de la banda, después el cúter se mueve 2 mm a la derecha, y 0,7 mm hacia abajo y corta un disco más. Esto se repite. El cúter se mueve entonces hacia atrás a una posición directamente por debajo del primer corte del gel, pero desplazado 2,2 mm hacia abajo, y se repite la pauta de tres cortes diagonales. Esto se continúa para la longitud total del gel.
Nota: Si se observa que la banda se ensancha significativamente debe hacerse una corrección también de lado, es decir, en lugar de volver a una posición directamente por debajo de un corte de gel previo, el corte debe desviarse ligeramente a la izquierda (en la izquierda de la banda) y/o a la derecha (a la derecha de la banda). Las proteínas contenidas dentro de los fragmentos de gel se procesaron para generar péptidos trípticos; secuencias parciales de aminoácidos de estos péptidos se determinaron por espectroscopia de masa como se describe en WO 98/533323 y Solicitud Nº 09/094.996, registrada en junio 15, 1998.
Las proteínas se procesaron para generar péptidos de disgestión trípticos. Los péptidos trípticos se analizaron por espectometría de masa utilizando un espectrómetro de masa PerSeptive Biosystems Voyager- DTM STR Tiempo de vuelo de ionización por deserción por láser asistida por matriz (MALDI-TOF), y péptidos trípticos seleccionados se analizaron por espectrometría de masas en tandem (MS7MS) utilizando un espectrómetro de masa (Q-TOF) tiempo de vuelo cuadrupolar de micromasa, (Micromass. Altrincham, U.K.) equipado con una fuente de pulverización Z de electropulverización de nanoflujoTM. Para la secuencia de aminoácidos e identificación parcial de BCMPs se investigaron espectros de masa en tandem no interpretados de péptidos trípticos utilizando el programa de búsqueda SEQUEST (Eng et al.,1884, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:976-989), versión v.C.1. Los criterios para la identificación de la base de datos incluyeron: la ruptura específica de tripsina; la detección de una serie de iones a, b e y en péptidos restituidos de la base de datos, y un incremento de masa para todos los residuos Cys para explicar la carbamidometilación. La base de datos investigada era una base da datos construida por entradas de proteínas en la base de datos no redundante mantenida por el Nacional Centre for Biological Information (NCBI) que es accesible en http./w.w.w.ncbi.nlm.nhi.gov/. después de identificación de las proteínas mediante correlación espectral-espectral utilizando el programa SEQUEST, las masas detectadas en los espectros de masa MALDI-TOF se asignaron a péptidos de digestión trípticos dentro de las proteínas identificadas. En los casos en que no pudieron ser identificadas secuencias de aminoácidos mediante búsqueda con espectros MS/MS no interpretados de péptidos de disgestión trípticos utilizando el programa SEQUEST, los espectros de masa en tandem de los péptidos se interpretaron manualmente, utilizando métodos conocidos en la técnica. (en el caso de interpretación de espectros de masa por fragmentación de baja energía de iones péptido véase Gaskell et al., 1992, Rapad Común. Mass Spectrum, 6:658-662).
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Ejemplo 2 Mapas de genes en secuencias de ADN genómicas por via de espectros en tandem derivados de espectrometría de masa de fragmentos de proteína en digestión con tripsina Espectrometría de masa
Para BCMP81, digestiones trípticas de proteínas cortadas del gel ID se analizaron por MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems, Framinghan, MA) utilizando un láser de longitud de onda de 337 nm para desorción y el modo reflectron de análisis. Una masa seleccionada ([M+H] = 1557,81) se caracterizó además por espectrometría de masa en tandem utilizando un QTOF-MS equipado con una fuente iónica de nanopulverización, (Micromass UK Ltd. Manchester). Antes del análisis MALDI las muestras se desalaron y concentraron utilizando C18 Zip TipsTM (Millipore, Bedford, MA). Las muestras para MS tandem se purificaron utilizando un sistema nano LC (LC Packigns, Ámsterdam, The Netherlands) que incorpora material C18 SPE.
El espectro tandem se analizó manualmente (Biemann K, Sequencing of peptides by Tandem Mass Spectroscopy and high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193:255-79) para determinar la secuencia de aminoácidos posicional parcial junto con las masas que permanecen en los extremos N y C de los fragmentos de péptidos /Tabla 4).
TABLA 4 Información de secuencia de aminoácidos derivada de análisis de BCMP 81 por espectrometría de masa en tandem
1
^{a} \begin{minipage}[t]{145mm}La "secuencia núcleo" es una secuencia de aminoácidos parcial de un péptido deducida de la interpretación del espectro de masa de fragamento del péptido.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa terminal N del péptido es la masa entre el comienzo de la secuencia núcleo y el términus-N del péptido.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa terminal-C es la masa entre el final de la secuencia de núcleo y el terminus-C del péptido.\end{minipage} 
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La secuencia leida del espectro tandem (MEQQQQLQQR) se encontró presente en una translación del ADN genómico humano de Nº de acceso ALO21707 (disponible en http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez) comenzando en la posición de nucleótido 55443 (BLAST, Altschul, Stephen F., Gish, Warren, Millar, Webb, Myers, Eugene W., and Lipman, David J. (1990). Basil Local alignement search tool. J. Mol. Bio. 215; 403-410. gapped BLAST se describe en Altschul, Stephen F., Gish, madden, Thomas L., Schaffer, Alejandro A., Zhang, Zheng, Miller, Webb y lipman, David, J. (1997). GappedBLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas. Nucleic. Res. 25(17); 3389-3402).
El examen adicional de las secuencias que rodean esta posición identifica secuencias de ADN que pueden ser trasladadas para igualar un espectro de masa MALDI adicional. Este espectro de masa se convirtió en una secuencia de aminoácidos conceptual (LWGLTEMFPER), cuya masa iguala el fragmento de tripsina potencial que puede ser trasladado desde la secuencia de ADN (Figura 1). Así, dos vectores de esta extensión de ADN genómico se definen en términos de marcos de lectura, es decir, la secuencia derivada del espectro de masa en tandem es seguida ampliamente por un codon de parada o stop en la traslación del ADN genómico, que indica o que este es el final de los genes o que hay un intron en esta posición. Sin embargo, cualquier intron potencial debe empezar después del residuo R en el terminus C del espectro tandem.
La secuencia de ADN genómico correspondiente a 2kbs de cualquier lado de las secuencias que igualan el espectro de masa se usó en una búsqueda BLAST frente a Expressed Sequences tags (ESTs) (http://w.w.w..ncbi.nlm.nih.gov). EST AA316462 iguala en >99% frente a las regiones de esta secuencia genómica y favorece la identificación de los límites de intron y exon. Esta alineación identifica 4 exones pero las secuencias EST no son de suficiente calidad para determinar la secuencia de proteínas del gen completo, ni son lo bastante buenas para precisar la posición de los límites del intron/exon, particularmente en la ausencia de cualquier secuencia homóloga. Un espectro de masa final puede ser igualado a una traslación de la secuencia genómica. (GDAEKPEEELEEDDDEELDETLSER) una vez se ha hecho un empalme desde 54575 (DDee(ag) a 5485 (e(ag)/LDET) en AL021707, las posiciones aproximadas de estos sitios de empalme se han determinado a partir de los ESTs.
Hay una isla CpG que comienza en posición 54823 en AL021707. Las islas CpG en secuencias de ADN genómico a menudo indican regiones donde pueden empezar los genes (por ejemplo, Kundu TK, Rao MR, CpG islanda in chromatin organization and gene expresión, J. Biochem (Tokio) 199 febrero; 125(2):217-22). Un marco de lectura abierto es evidente desde el nucleótido 54461 de AL021707 comenzando con ATG (metionina). El codon stop en exon 4 de este gen se define siguiendo la serie de marco de lectura por los espectros a través de las secuencias 3'EST de AA316462. Esta combinación de espectros, secuencias de ADN y secuencias EST produce la secuencia de proteína requerida dada más abajo (Figura 1). La secuencia de ADN correspondiente se da más abajo (Figura 1). Las posiciones de las secuencias de espectros, intrones y exones dentro del fragmento genómico se dan en la Figura 2.
Se identificó un clon de longitud completa.
Preparación de ARN total
ARN total se preparó a partir de ca. 108 células de cultivos de líneas celulares MB-MDA468, BT20, PC3M, T47D y Ca151 utilizando triazol (Life Technologies) y se resuspendieron en ca. 1 \mug/\mul.
Clonación de cADN
La región de codificación predicha de BCMP 81 se amplificó por PCR utilizando cebos BCMP 81 F (5' cctacagt
catggctgccgc3'), y BCMP 81 R.
(5' cctacagtcatggctgccgc3'), 30 ng de cADN de glándula mamaria (Clontech), y reactivos PCR (Qiagen, UK) utilizando los parámetros cíclicos: 40 ciclos de 95ºC durante 15s, 55ºC durante 1 minuto. Se obtuvo un único producto 500bp, se purificó en columna de otros reactivos (Qiagen, UK) y se secuenció con cebos BCMP 81 F y BCMP 81 R (AB1377, Oxford University Contract Sequencing).
El fragmento de cADN de longitud completa que codifica BCMP 81 se ha clonado a partir de una biblioteca de cADN de glándula mamaria y se secuenció para confirmar la identidad y marco de lectura.
El peso molecular de la proteína cortada del gel ID era entre 14 y 19kDa, determinado a partir de una escala de masa de proteína, la masa predicha de la proteína de longitud completa trasladada conceptualmente es 15,3kDa. Aunque una isla CpG se identifica rápidamente y se observa en la anotación del GenBank en la región de equiparación péptido/ADN genómico, no se predice proteína de estas secuencias de ADN. Los datos de péptidos han permitido una descripción completa de la proteína, el mARN que es trasladado y la estructura genómica del gen que lo codifica.
Perfil de mARN de BCMP 81 en líneas celulares de tejido normal humano y cáncer de próstata y de mama
RT-PCR en tiempo real se usó para medir cuantitativamente la expresión BCMP 81 en mARNs (Clontech) y líneas celulares de cáncer de mama. cADNs se sintetizaron a partir de 1-5 \mug de ARN total utilizando un cebo oligo dT y el kit Superscript II RT (Life Tecnologies). Reacciones que contenían 10 ng de cADN, 10pmoles de cebos sentido (5' gagctagatgagcccgtc3') y antisentido (5' gatcataaaggaagtcccaa3') y reactivos de detección de secuencia verde SYBR (PE Biosystems, UK). Las condiciones PCR fueron: un ciclo a 50ºC durante 2 minutos, 1 ciclo a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 15 s, 55ºC durante 1 minuto. La acumulación del producto PCR se midió en tiempo real como el incremento en la fluorescencia del colorante indicador, y los datos se analizaron utilizando el programa Sequence Detector v1.6.3 (PE Biosystems). Las curvas estándar que relacionan el número de copias de templado con el número de ciclos de fluorescencia y amplificación se generaron utilizando el producto PCR como una templado y se usaron para calcular el número de copias de mARN de BCMP 81 en cada
muestra.
El análisis de la distribución de tejido mARN por RT-PCR cuantitativo (Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, P.M. Real Time quantitative PCR, Genome Res. 6, 986-994 (1996) verifica la fuente de la proteína (MDA-MB468) y su potencial como un antígeno de cáncer de mama con ambas líneas celulares BT20 y MDA-MB468 mostrando expresión aumentada significativamente sobre la glándula mamaria normal (Figura 3). La escasez de las versiones EST de la base de datos pública de esta proteína se refleja en las copias generalmente bajas de mARN (generalmente <200 per ng de cADN) vistas en estas muestras.
Ejemplo 3 Clonación de la nueva proteína BCMP 11 Espectrometría de masa
Las proteínas cortadas del gel ID se sometieron a digestión en tripsina y se analizaron por MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Alplied Biosystems) utilizando un láser de longitud de onda de 337 nm para desorción y el modo reflectron de análisis. Dos masas seleccionadas para BCMP 11 ([M+H] = 152452,65 y 941,47) se caracterizaron además por espectrometría de masa en tandem utilizando un QTOF-MS equipado con una fuente iónica de nanopulverización ((Micromass UK Ltd.). Antes del análisis MALDI las muestras se desalaron y concentraron utilizando C18 Zip TipsTM (Millipore). Las muestras para MS tandem se purificaron utilizando un nanosistema LC (LC Packings) que incorpora material C18 SPE.
Los espectros tandem se analizaron manualmente (Bienmann K. Sequencing of peptides by Tandem Spectrometry and high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193:455-79) para determinar la secuencia de aminoácidos posicional parcial junto con las masas que permanecen en los extremos N y C de los fragmentos de péptidos (Tabla 5).
Se encontró que tres espectros de proteínas BCMP 11 (un espectro tandem, Tabla 5 y un espectro de masa MALDI, Figura 4a), igualaban una traslación de un EST de una biblioteca de carcinoma de pulmón humano (número de acceso AI458391), que definía un marco de lectura abierto (ORF) de 166 aminoácidos (Figura 4a). Una búsqueda BLAST de una base de datos EST humana ((http://w.w.w..ncbi.nlm.nih.gov/blast) con entrada AI458391 identificó varios ESTs que se solapaban, proporcionando secuencias 5' y 3' UTR adicionales. Un segundo espectro tandem de péptidos de BCMP 11 (Tabla 5) identificó una discrepancia en estas secuencias EST: el codon predicho 146 codificaba para glutamina o arginina dependiendo de cual EST estaba siendo trasladado. El espectro de masa muestra claramente que la arginina está presente en la proteína aislada, siendo la glutamina un error de secuenciación o
polimorfismo.
TABLA 5 Información de secuencia de aminoácidos derivada de análisis de BCMP 11 por espectrometría de masa en tandem
2
^{a} \begin{minipage}[t]{145mm}La "secuencia de núcleo" es una secuencia de aminoácidos parcial de un péptido deducida de la interpretación del espectro de masa de fragmento del péptido.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa Terminal N del péptido es la masa entre el comienzo de la secuencia de núcleo y el términus-N del péptido.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa Terminal-C es la masa entre el final de la secuencia de núcleo y el terminus-C del péptido.\end{minipage} 
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Un clon de longitud completa se amplificó por PCR a partir de T-47D cADN (Fig 4a).
Preparación de ARN total y síntesis de cADN
El ARN total se preparó a partir de muestras de células y tejidos cultivados utilizando reactivo Triazol (Life Technologies), conforme a las instrucciones del fabricante, y se resuspendieron en agua libre de ARNSA a una concentración de 1 \mug/\mul. 1 a 5 \mug de ARN total se usaron como un templado para síntesis de cADN utilizando un oligocebo DT y el kit de transcripción inversa Superscript II (Life Technologies). Los cADNs se purificaron en columna y se eluyeron a una concentración de 10 ng/ \mul.
Clonación de cADN de BCMP
La BCMP 11 ORF de longitud completa predicha se amplificó por PCR a partir de cADNs t-47D, utilizando los siguientes cebos. F, 5' GGCAAGTCACTTCTTCTC 3'; r, 5' GTATTTGTCAATGTGCCAGAGG3'. Las reacciones contenían 10 ng de cADN y reactivaos para PCR (Qiagen), y usaron los siguientes parámetros de ciclación: 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºc durante 30 segundos. Los productos PCR se purificaron en columna (Qiagen), se clonaron en un vector T/A (Invitrogen) y la secuencia de nucleótidos se verificó subscuentemente (Universidad de Oxford, Sequencing Facility, UK).
La proteína BCMP 11 predicha es altamente homóloga a hAG-2 una nueva proteína humana codificada por un cADN clonado a partir de las líneas celulares de cáncer de mama (Thompson, D.A. & Weigel, R.J. hAG-2, el humano homólogo del gen de glándula de cemento de Xenopus XAG-2, se coexpresa con receptor de estrógeno en líneas celulares de cáncer de mama. Biochem. Biophys. Res.Commun, 251, 111-116 (1998)) hAG-2 es el humano homólogo de XAG-2, una proteína de Xenopus laevis que se expresa en la glándula de cemento durante el crecimiento de la rana (Aberger, F. Widinger, G. Grunz, H. & Richter, K. Anterior especification of embryonic ectoderm: the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2. Mech. Dev 72, 115-130 (1998)). Proteínas hAG-2 y BCMP 11 son 71% idénticas, con similitud de secuencia relativamente baja en los extremos-N (Fig. 4b). Se predice que BCMP11, como hAG-2, son una proteína extracelular con una secuencia de señal Terminal-N (http://psort.nibb.ac.jp).
Expresión mARN de BCMP en tejidos humanos
Hemos usado RT_PCR cuantitativo en tiempo real (Heid, C:A: Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996); Morrison, T.B., Weis, J.J. & Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Gree I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954-958 (1998)) para analizar la distribución de mARN de BCMP 11 en líneas celulares de tejidos humanos normales y de cáncer de mama (Fig.5) Los cebos usados para PCR fueron como sigue, sentido, 5'CTGGAGGATTGCAATACTC3', antisentido, 5'. GCATAAGGTTTAGCATGATG 3'. Reacciones que contenían 10 ng de cADN, preparadas como se ha descrito antes, reactivos de detección de secuencia verde SYBR (BE Biosystems) y cebos sentido y antisentido se ensayaron en un sistema de detección de secuencia ABI7700, (BE Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo a 50ºC durante 2 minutos, 1 ciclo a 95ºC durante 10 minutos y 40 ciclos de 95ºC durante 15 s, 55ºC durante 1 minuto. La acumulación de producto PCR se midió en tiempo real como el incremento en la fluoresecenica verde SYBR, y los datos se analizaron utilizando el programa Sequence Detector v1.6.3 (BE Biosystems). Se generaron curvas estándar que relacionan el número de copias de templado inicial con la fluorescencia y el ciclo de amplificación utilizando el producto como un templado, y se usaron para calcular número de copias de BCMP 11 en cada muestra.
Los niveles más altos de expresión de BCMP 11 se observaron en colon (2800 copias ng-1 cADN9, con niveles inferiores de expresión en glándula mamaria, intestino delgado y tráquea (295-435 copias ng-1 cADN) (Fig. 5). mARN de BCMP se detectaron también en células t-47D (1200 copias ng-1 cADN) la fuente de proteína BCMP 11 usada en este estudio, y la expresión en esta línea celular era elevada en comparación con el tejido mamario normal. Poco o ningún mARN de BCMP11 se detectó en otras líneas celulares o tejidos normales examinados.
La distribución de tejido de BCMP 11 y hAG-2 mARN es muy similar. Ambos genes muestran una pauta trestringida de expresión en tejidos humanos normales, siendo el colon el sitio principal de expresión para ambos genes. (Fig. 5, Thompson, D.A. & Weigel, R.J. hAG-2, the humna nologue of the Xenopus lavéis cement gland gene XAG-2, is co-expressed with estrogen receptor in breast cancer lines. Biochem. Biophys. Res. Común. 251, 111-116 (1998). La expresión hAG-2 era coincidente con la expresión de ER y los niveles de mARN de hAG-2 en células MCFt aumentaron cuando las células se trataron con estradiol (Thompson and Weigel, supra). Similarmente mARN de BCMP 11 se detectó en células t-47D ER positivas, pero no se observó expresión en las líneas celulares negativas ER CAL51, BT20 y MDA_MB-468 Figura 5). La regulación ascendente coincidente de dos genes altamente homólogos que residen al lado uno de otro sobre el cromosoma 7 (véase localización cromosómica a continuación) sugiere un mecanismo para control coordinado que puede estar ligado no sólo al status ER sino también a terapias dirigidas ER como el Tamoxifeno.
Localización cromosómica
Una búsqueda Blast de una base de datos genómica humana con la secuencia cADN de BCMP 11 (Fig.,4a) identificó dos entradas, ACO00493 y ACO7333, con identidad a los extremos 5' y 3' de BCMP11 respectivamente. Ambos clones se han mapeado a cromosoma 7p21- El hAG-2ORF completo se ha mapeado también al mismo cóntigo como BCMP 11 en entrada ACO73333, demostrando que estos genes altamente homólogos están agrupados juntos en el genoma humano.
Ejemplo 4 Clonación de la nueva proteína BCMP 84 Espectrometría de masa
Las proteínas cortadas del gel ID se sometieron a digestión en tripsina y se analizaron por MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Alplied Biosystems) utilizando un láser de longitud de onda de 337 nm para desorción y el modo reflectron de análisis. Una masa seleccionada para BCMP 11 ([M+H] = 1667.73) se caracterizó además por espectrometría de masa en tandem utilizando un QTOF-MS equipado con una fuente iónica de nanopulverización (Micromass UK Ltd.). Antes del análisis MALDI las muestras se desalaron y concentraron utilizando C18 Zip TipsTM (Millipore). Las muestras para MS tandem se purificaron utilizando un nanosistema LC (LC Packings) que incorpora material C18 SPE.
Los espectros tandem se analizaron manualmente (Bienmann K. Sequencing of peptides by Tandem Spectrometry and high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193:455-79) para determinar la secuencia de aminoácidos posicional parcial junto con las masas que permanecen en los extremos N y C de los fragmentos de péptidos (Tabla 6).
TABLA 6 Información de secuencias de aminoácidos derivada de análisis por espectrometría de masa de BCMP 84
3
^{a} \begin{minipage}[t]{145mm}La "secuencia de núcleo" es una secuencia de aminoácidos parcial de un péptido deducida de la interpretación del espectro de masa de fragmento del péptido.\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa Terminal N del péptido es la masa entre el comienzo de la secuencia de núcleo y el términus-N del péptido.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{145mm}La masa Terminal-C es la masa entre el final de la secuencia de núcleo y el terminus-C del péptido.\end{minipage}
Se encontró que la secuencia de aminoácidos tandem y tres espectros de masa MALDI igualaban una traslación de un EST de una línea celular de un carcinoma de colon humano (número de acceso AA315020) (Fig.6.) Se identificaron ESTs que se solapan, que establece una ORF completa de 104 aminoácidos.
Un clon de longitud completa se amplificó por PCR a partir de MDA-MB-468 cADN.
Preparación de ARN total y síntesis cADN
El ARN total se preparó a partir de muestras de células y tejidos cultivados utilizando reactivo Triazol (Life Technologies), conforme a las instrucciones del fabricante, y se resuspendieron en agua libre de ARNA a una concentración de 1 \mug/\mul. 1 a 5 \mug de ARN total se usaron como un templado para síntesis de cADN utilizando un oligocebo DT y el kit de transcripción inversa Superscript II (Life Technologies). Los cADNs se purificaron en columna (Quiagen) y se eluyeron a una concentración de 10 ng/ \mul.
Clonación de cADN de BCMP 84
La BCMP 11 ORF de longitud completa predicha se amplificó por PCR a partir de cADNs de MDA-MB-468, utilizando los siguientes cebos. F, 5' ATAGGACAACAGAACTCTCACC 3'; R, 5' GCTTCAACGGAACTTTGCAGAG 3'. Las reacciones contenían 10 ng de cADN y reactivos para PCR (Qiagen), y usaron los siguientes parámetros de ciclación: 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos. Los productos PCR se purificaron en columna (Qiagen), se clonaron en un vector T/A (Invitrogen) y la secuencia de nucleótidos se verificó subsecuentemente (Universidad de Oxford, Facility Sequencing, UK).
La proteína BCMOP 84 predicha muestra similitud con la familia S100 de proteínas de unión de calcio (por ejemplo, s100A13, número de acceso Q99584 tiene 36% de identidad y 67% de homología con BCMP 84) y un cADN recientemente identificado (AAGO1893), que es idéntico a BCMP 84 en la mayoría de su longitud, se ha denominado S100A14 y se ha anotado como un miembro nuevo de la familia S100 de las proteínas que se unen al calcio. Sin embargo, no se ha demostrado que AAG01893/S100A14 se una al calcio y este gen y BCMP 84 carecen de restos de unión a calcio que se conservan entre miembros de esta familia de proteínas. Las diferencias de 2 aminoácidos entre BCMP 84 y S100A14 son probablemente polimorfismos e igualan las variaciones inter-individuos que se han encontrado en BCMP 84. El análisis de la secuencia de proteínas no revela restos de proteínas que puedan indicar una función o localización celular particular para BCMP 84.
Expresión de mARN de BCMP 84 en tejidos humanos
Hemos usado RT-PCR cuantitativo en tiempo real (Heid, C:A: Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996); Morrison, T.B., Weis, J.J. & Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954-958 (1998)) para analizar la distribución de mARN de BCMP 11 en líneas celulares de tejidos humanos normales y de cáncer de mama (Fig.5) Los cebos usados para PCR fueron como sigue, sentido, 5'TCTGTCACTCTGTCTTGGA 3', antisentido, 5'. TAGCCAGCTCCTCTCTGTT 3'. Reacciones que contenían 10 ng de cADN, preparadas como se ha descrito antes, reactivos de detección de secuencia verde SYBR (BE Biosystems) y cebos sentido y antisentido se ensayaron en un sistema de detección de secuencia ABI7700, (BE Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo a 50ºC durante 2 minutos, 1 ciclo a 95ºC durante 10 minutos y 40 ciclos de 95ºC durante 15 s, 55ºC durante 1 minuto. La acumulación de producto PCR se midió en tiempo real como el incremento en la fluorescencia verde SYBR, y los datos se analizaron utilizando el programa Sequence Detector v1.6.3 (BE Biosystems). Se generaron curvas estándar que relacionan el número de copia de templado inicial con la fluorescencia y el ciclo de amplificación utilizando el producto PCR amplificado como un templado, y se usaron para calcular número de copia de BCMP 11 en cada
muestra.
La distribución de mARN de BCMP se rstringió a unos pocos tejidos, con los niveles más altos de expresión en colon, tiroides y timo (260-930 copias ng-1 cADN) y sólo bajos niveles de mensaje de BCMP 84 se detectaron en otros tejidos normales, incluyendo la glándula mamaria. El mARN de BCMP 84 se detectó en células BT-20 y MDA-MB-468 (300 y 1600 copias ng-1 de cADN respectivamente) pero no en líneas de carcinoma de mam T-47D o CAL51.
Localización cromosómica Formación de mapas de híbridos de radiación
La localización cromosómica de genes de BCMP 84 se consiguió por exploración del panel híbrido de radiación Genebridge 4 (research Genetics Inc) utilizando los siguientes pares de cebos derivados de la región 3' no trasladada:
Sentido, 5' TCAGCTTCCTTCCCCAGGTC 3';
Antisentido, 5' CCCAGCTCCATTATTCA 3'.
Las condiciones de PCR para amplificación de secuencias de PCMP 84 se desnaturalizaron a 94ºC durante 30 s, seguido de templado y extensión a 55ºC durante 30 s (40 ciclos), utilizando TaqAdn polimerasa (Qiagen) y 25 ng ADN por reacción. Los cebos amplificaron el fragmento esperado 215bp de los ADN de línea celular híbrida positiva y ADN genómico humano, y fallaron en amplificar el producto del ADN genómico del hámster (control).
\newpage
Los datos de mapas de híbridos de radiación se sometieron al servidor de formación de mapas STS del Whitehead Institute/MIT Centre for Genome Research (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contiog/rhmapper.pl) para su análisis.
El mapeo de híbrido de radiación localizó los genes de BCMP 84 en cromosoma 1q21 entre los marcadores STS AFM291xh1 y AFM220xf8 dentro del agrupamiento de genes de proteínas de unión al calcio. Así, aunque BCMP 84 muestra sólo limitada homología con los otros miembros de la familia STS y carece obviamente de dominios de unión a calcio, está claramente relacionado con esta gran familia de proteínas.
Ejemplo 5 Análisis de distribución de tejidos Materiales y métodos Análisis de mARN cuantitativo
BCMP 7AXG (AF088867) y 23 NCAM2 (015394) no forman parte de la invención.
El nivel de ARN de BCMPs 7, 17 y 23, es decir la proteína secretada XAG (AF088867), BST2 (Q10589) y NCAM2 (015394) en diferentes tipos de células se determinaron por PCR en tiempo real cuantitativo, utilizando el colorante de ADN de doble hebra, SYBR Green 1, utilizando metodologías y reactivos como se describen en Morrison et al., Biotechniques (1998) 24:954-8, utilizando el sistema de detección de secuencia ABI7700 (PE Biosystems, UK).
En resumen, la cuantificación de los niveles de mARN se consiguió generando una curva estándar,utilizando el producto PCR (Qiagen UK) como un templado. Se consiguieron PCRs que contenían 104, 105, 106 y 107 moléculas de templado por triplicado para determinar el número de ciclo en el que la señal de amplificación entra en el intervalo lineal logarítmico (el ciclo umbral, Ct). La curva estándar así define la relación entre Ct y concentración de templado, y puede usarse para derivar la concentración de templado inicial en una muestra desconocida a partir de su correspondiente valor de Ct. Las muestras se desarrollaron en duplicado, utilizando cada una 10 ng de cADN de primera hebra como material de partida.
Los cADN de tejido humano se derivaron por transcripción inversa con oligocebos dT (SuperscriptII-Life Technologies, UK) a partir de ARNs (Clontech USA) recogidos de fuentes humanas múltiples. Los ARNs totales para las líneas celulares humanas T47D Ca151, MDA-MB468, PC3, PC3M y BT20 se generaron de muestras de cultivo de tejidos extraídos con Trizol (Life Technologies, UK).
Las secuencias de cebo usadas para medir los niveles de mARN de proteínas secretadas putativas XAG BST2 y NCAM2 fueron:
XAG
Hacia delante
agataccacagtcaaacctg
A la inversa
gcactcatccaagtgatgaa
\vskip1.000000\baselineskip
BST
Hacia delante
gatggagtgtcgcaatgtcacc
A la inversa
agacgcgtcctgaagcttatgg
\vskip1.000000\baselineskip
NCAM2
Hacia delante
gatcatagagctgtcgcagacc
A la inversa
tgtagtctcccttgtccctttcc
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Los resultados se muestran en las Figuras 8-10. En las Figuras, la anotación "x10" significa que el valor para la muestra es 10 veces más alto que el indicado.

Claims (19)

1. El uso de un anticuerpo capaz de unión inmunoespecífica a BST-2 (BCMP-17) o uno de sus fragmentos o derivados que comprende el dominio de unión del anticuerpo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama.
2. El uso según la reivindicación 1, en que el anticuerpo es monoclonal o humanizado.
3. El uso según la reivindicación 1 o 2, en que el anticuerpo se conjuga a un resto de fármaco o agente terapéutico.
4. El uso de BST-2 (BCMP-17) y uno o más de sus fragmentos o derivados antígenos o inmunógenos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis del cáncer de mama.
5. El uso según la reivindicación 4, en que el medicamento es capaz de elicitar una respuesta inmune en un sujeto.
6. El uso según la reivindicación 5, en que el medicamento es una vacuna.
7. Un método para exploración, diagnóstico o pronóstico del cáncer de mama en un sujeto, o para monitorizar el efecto de un fármaco contra el cáncer de mama o la terapia administrada a un sujeto, que comprende detectar cuantitativamente BST-2 (BCMP-17) en una muestra del sujeto.
8. El método según la reivindicación 7, en que la muestra es una muestra de tejido de mama.
9. El método según la reivindicación 7 u 8, en que la etapa de detección cuantitativa comprende:
a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo para capturar BST-2(BCMP-17); y
b) detectar el BST-2 capturado utilizando un reactivo de detección directa o indirectamente marcado.
10. Un método para exploración, diagnóstico o pronóstico de cáncer de mama en un sujeto o para monitorizar el efecto de un fármaco contra el cáncer de mama o la terapia administrada a un sujeto, que comprende:
a) poner en contacto una o más sondas de oligonucleótidos que comprenden 10 o más nucleótidos consecutivos complementarios a una secuencia de nucleótidos que codifica BST-2(BCMP-17), con un ARN obtenido de una muestra biológica del sujeto o con cADN copiado a partir del ARN, en que ese contacto ocurre bajo condiciones que permiten la hibridación de la sonda a la secuencia de nucleótido si está presente.
b) detectar la hibridación, si la hay entre la sonda y la secuencia de aminoácido, y
c) comparar la hibridación, si la hay, detectada en la etapa b) con la hibridación detectada en una muestra control, o con un intervalo de referencia previamente determinado.
11. Un método de exploración, diagnóstico o pronóstico del cáncer de mama en un sujeto o para monitorizar el efecto de un fármaco contra el cáncer de mama o la terapia administrada a un sujeto, que comprende:
a) poner en contacto con una muestra a investigar BST-2 (BCMP-17), o uno o más de sus fragmentos o derivados antígenos o inmunógenos; y
b) detectar la presencia de anticuerpos de BST-2.
12. El uso in vitro de BST-2 (BCMP-17) y/o uno o más de sus fragmentos o derivados antígenos o inmunógenos; o un anticuerpo capaz de unión inmunoespecífica a BST-2, o uno de sus fragmentos o derivados que comprende el dominio de unión del anticuerpo; para exploración, diagnóstico o pronóstico de cáncer de mama en un sujeto o para monitorizar el efecto de un fármaco contra el cáncer de mama o la terapia administrada a un
sujeto.
13. Un método de exploración de agentes contra el cáncer de mama que interaccionan con BST-2 (BCMP-17) o una de sus porciones biológicamente activas, método que comprende:
poner en contacto BST-2 o una de sus porciones biológicamente activas, con un agente candidato; y
determinar la capacidad del agente candidato para interaccionar con el BST-2, o una de sus porciones biológicamente activas.
14. Un método de exploración para agentes contra el cáncer de mama que modula la actividad de BST-2 (BCMP-17) o una de sus porciones biológicamente activas, método que comprende:
en una primera parte, poner en contacto un agente candidato con BST-2, o una de sus porciones biológicamente activas; y
comparar la actividad de BST-2 o una de sus porciones biológicamente activas en la primera parte después de adición del agente candidato con la actividad de BST-2 o una de sus porciones biológicamente activas en una parte control, o con intervalo de referencia previamente determinado.
15. Un método de exploración de agentes contra el cáncer de mama que modulan la expresión o actividad de BST-2 (BCMP-17), que comprende:
poner en contacto una enzima que es responsable de la producción o degradación de BST-2 con un agente candidato; detectar modulación de la actividad de esa enzima.
16. Un método de exploración de agentes anti-cáncer de mama que modulan la expresión o actividad de BST-2 (BCMP-17), que comprende:
poner en contacto un primer grupo de células que expresan BST-2 con un agente candidato;
poner en contacto un segundo grupo de células que expresan BST-2 con un agente control; y
comparar el nivel de expresión de mARN que codifica BST-2 en el primero y segundo grupo de células, o comparar el nivel de inducción de un segundo mensajero celular en el primero y segundo grupo de células.
17. Un método de exploración de o identificación de agentes contra el cáncer de mama que modulan la expresión o actividad de BST-2 (BCMP-17), método que comprende:
administrar un agente candidato a un primer grupo de mamíferos no humanos:
administrar un agente control a un segundo grupo de mamíferos no humanos; y
comparar el nivel de expresión o actividad de BST-2 o expresión de mARN que codifica BST-2 en el primero y segundo grupos, o comparar el nivel de inducción de un segundo mensajero celular en el primero y segundo grupos.
18. El método de la reivindicación 17, en que los mamíferos son modelos animales de cáncer de mama.
19. El uso de un nucleótido o ribozima antisentido BST-2 (BCMP-17) que interacciona con, o modula la actividad de BST-2 (BCMP-17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama.
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