KR101398079B1 - 글리실-티알엔에이 합성효소 및 캐드헤린을 이용한 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

글리실-티알엔에이 합성효소 및 캐드헤린을 이용한 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리실 tRNA 합성효소 (GRS) 및 캐드헤린을 이용한 새로운 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GRS 및 CDH, 특히 CDH와의 결합 수준을 변화시키는 시험제제를 스크리닝하는 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 GRS와 CDH의 신규한 용도로 암의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다양한 암 질환의 새로운 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

글리실-티알엔에이 합성효소 및 캐드헤린을 이용한 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 {method for screening an agent preventing or treating cancer using glycyl-tRNA synthetase and cadherin}
본 발명은 글리실 tRNA 합성효소 (GRS) 및 캐드헤린을 이용한 새로운 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GRS 또는 이의 단편 및 CDH6 (또는 CDH18)와의 결합 수준을 변화시키는 시험제제를 스크리닝하는 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
유전적 코드가 발전함에 따라 번역기구의 필수요소인 aminoacyl tRNA 같은 단백질 등이 대두되고 있다. 각각의 아미노산에 적용되는 20가지 효소들은 각 아미노산을 세포질에 있는 같은 기원의 tRNA과의 부착을 촉진시키고, 그 후 충전된 tRNAs들은 리보좀 단백질 합성에 사용된다. 놀랍게도, 전-번역 기능 (ex-translational function) 들이 대장균에서의 유전적 조절, N. crassa (Kamper et al., 1992. Mol. Cell. Biol. 12,499-511) 의 미토콘드리아에서의 RNA 스플라이싱 등을 포함하여 많은 tRNA 합성효소들에 대해서 밝혀졌고, 척추동물에서 기능의 다양성은 면역반응과 혈관형성의 다른 조절들을 포함한다 (Park et al., 2005. Trends. Biochem. Sci. 30,569-574). 이러한 확장된 기능은 세분화된 모티프(motif)와 도메인 즉, 내부의 짧은 씨퀀스 모티프(sequence motif)와 덧붙여진 GST, 류신 지퍼 그리고 헬릭스-턴-헬릭스 영역의 증가와 관련이 있다(Guo et al., 2010 FEBS Lett. 584,434-442). 세분화된 모티프와 도메인 추가는 새로운 기능을 제공하는 새로운 단백질-단백질 상호작용을 촉진한다. 수 많은 질병 중에서 AARSs 과 포유동물의 세포에서 다중-tRNA 합성효소 복합체의 부분인 단백질등과 관계가 있는 것 중 일부가 전-번역기능의 파괴 또는 변화로 기인한 것이라 생각된다. 게다가 tyrosyl-와 glycyl-tRNA 합성효소에서 돌연변이를 야기시키는 Charcot-Marie-Tooth 질병은 아미노아실 활성을 파괴시키지 않는다 (Jordanova et al., 2006. Nat. Genet. 38,197-202. ; Nangle et al., 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104,11239-11244).
번역기구의 필수 구성요소로 놀라운 것은 대체 스플라이싱 또는 자연적 단백질 가수분해에 의한 tyrosyl- 와 glycyl-tRNA 합성효소의 특수한 절편의 결합과 PMN 세포에 있는 CXCR 1과 2, 그리고 내피세포에 있는 VE-cadherin을 포함한 세포 밖 수용체들을 통한 신호가 관찰된다는 것이다 (Wakasugi and Schimmel, 1999. Science 284,147-151). 특별한 조건하에서 포유동물 세포로부터 분비되는 두 가지 합성효소는 그것들의 이전 번역 기능을 가능하게 한다 (Wakasugi et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,173-177; Yang et al., 2007. Structure 15, 793-805.). 이러한 관찰 결과, 아마도 주석을 다는 것(annotating) 의해 번역을 수행하지 않는 생리적 환경에 놓여있는 tRNA 합성효소들의 전 번역기능(ex-translational functions)을 밝히는 한 가지 방법으로의 가능성을 보여준다 (Park et al., 2008. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105,11043-11049; Sampath et al., 2004. Cell 119,195-208.). 이러한 결과는 우리로 하여금 인간 혈청(serum)에서 특수한 합성효소의 존재를 확인하게 하였다.
이에 본 발명자들은 AARS의 구조와 기능의 관계와 임상적 관찰을 지속적으로 연구하기 위해 우리는 GRS에 초첨을 두고, 암의 미세환경에서 순환하는 단백질인 GRS의 잠재적 역할에 대해서 연구한 결과, CDH가 GRS의 수용체로 작용하여 ERK 경로를 조절하여 세포의 사멸과 성장을 조절함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
(a) GRS(glycyl tRNA synthetase) 또는 이의 단편, CDH6(cadherin-6) 또는 CDH18 및 시험제제를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 GRS와 CDH6 또는 CDH18의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) GRS 또는 이의 단편, CDH 및 시험제제를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준이 변화된 시험제제를 CDH를 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 사멸여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) GRS(glycyl tRNA synthetase) 또는 이의 단편, CDH(cadherin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) GRS 또는 이의 단편, CDH 및 시험제제를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준이 변화된 시험제제를 CDH를 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 사멸여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
정의
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); 및 Hale ＆ Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. 또한 다음의 정의는 본 발명의 실시를 위해 독자(reader)에게 도움을 주기 위해 제공된다.
본 발명에서 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 발명에서 "숙주세포(host cell)"이라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.
본 발명에서 "폴리펩티드(polypeptide)"는 "폴리펩티드들(polypeptides)" 또는 "단백질(들)"과 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "GRS 폴리펩티드"는 글리실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 GRS 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (Genbank Accession No. AAA86443.1) 또는 Genbank Accession No. AAA57001.1 (서열번호 5), EAL24449.1 (서열번호 6), BAA06338.1 (서열번호 7), NP_002038.2 (서열번호 8), AAH07755.1 (서열번호 9), AAH07722.1 (서열번호 10)일 수 있다. 또한 본 발명의 GRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명에서 "GRS 단편"은 GRS 폴리펩티드의 일부 단편으로 C-말단 안티코돈 결합 도메인을 포함하는 단편을 말한다. 예를 들어, 서열번호 1의 전체길이 GRS 아미노산 서열의 511번째 아미노산에서 마지막 685번째 아미노산(서열번호 2)까지로 이루어져 있으며 C-말단 안티코돈 결합 도메인(서열번호 11, 서열번호 1의 511번째 아미노산에서 674번째 아미노산)을 포함하는 단편으로, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다. 또한 본 발명의 GRS 단편은 이의 기능적 동등물을 포함한다. 한편, GRS의 mitochondria form (예를 들어, 서열번호 7)은 cytosol form (예를 들어, 서열번호 1)과 달리 54개의 아미노산이 부가되어 있으므로 C-말단 안티코돈 결합 도메인의 위치는 이러한 점을 반영한 서열로 당업자에게 이해될 수 있다.
상기 기능적 동등물이란 GRS 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서,"실질적으로 동질의 생리활성"이란 CDH, 특히 CDH6 또는 CDH18과 결합하여 ERK 경로를 활성화하여 암 세포를 억제 또는 사멸시키는 것을 말한다. 상기 기능적 동등물은 GRS 또는 이의 단편의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 GRS 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 GRS 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 GRS 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 GRS의 아미노산 서열(서열번호 1) 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 GRS의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, GRS 또는 이의 단편의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예를 들어, GRS의 경우 서열번호 3, GRS 단편의 경우 서열번호 4)을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substally pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie ＆ Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 발명에서 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 "GRS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 핵산은 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함한다. 즉, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖거나 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한 본 발명에서 GRS 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 바람직하게 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는다. 상기 핵산은 천연에서 분리되거나 위에서 기술한 바와 같이 유전공학적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 "아날로그(analog)"라 함은 표준 물질(reference molecule)과 구조적으로 유사하지만, 표준 물질의 특이적 치환기가 치환에 의해 대체됨으로써 표적이나 조절 방법이 변형된 물질을 말한다. 표준물질과 비교할 때, 아날로그는 당업자에 의해 예상될 수 있는 바와 같이 동일 또는 유사하거나 향상된 유용성(utility)를 가진다. 향상된 성질(예: 표적 물질에 대한 더 높은 결합 친화력)을 갖는 공지의 화합물 변이체를 규명하기 위한 아날로그의 합성 및 스크리닝은 약리 화학적 분야에 공지된 방법이다.
본 발명에서 "상동체(homologues)"라 함은 단백질 및/또는 단백질 서열을 언급하는 경우에는 공통의 조상 단백질(common ancestral protein) 또는 단백질 서열에서 자연적으로 또는 인위적으로 유래된 것을 나타낸다. 유사하게 핵산 및/또는 핵산 서열은 그들이 공통의 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인위적으로 유래되었을 때 상동하다.
본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예: 2개의 폴리펩티드)를 결합(combine)시키거나, 제제와 세포(예; 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpresion)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다.
본 발명에서 "제제(agent)" 또는 "시험 제제(test agent)"라 함은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법으로 스크리닝 될 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱 (beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 어떤 시험 제제는 합성 물질일 수 있으며, 다른 시험 제제는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응 (esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같은 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스(biased)" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용될 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).
본 발명의 방법에 스크리닝되는 시험 제제의 라이브러리는 GRS 또는 이의 단편이나 아날로그에 대한 구조 연구를 근거로 제조될 수 있다. 이런 구조 연구는 GRS에 결합할 가능성이 있는 시험 제제의 규명을 가능하게 한다.
GRS의 3차원적 구조는 여러 방법, 예컨대, 결정학 구조 및 분자적 모델링(crystal structure and molecular modeling)으로 연구될 수 있다. X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용하는 단백질 구조 연구 방법이 문헌에 잘 알려져 있다: Physical Bio-Chemistry, Van Holde, K. E.(Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp.221-239, and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisengerg ＆ D. C. Crothers(Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). GRS의 구조에 대한 컴퓨터 모델링은 스크리닝하기 위해 시험 제제의 디자인을 위한 다른 수단을 제공한다. 분자적 모델링 방법은 문헌에 개시되어 있다: U.S. Pat. No. 5, 612,894 and U.S. Pat. No. 5,583,973. 또한 단백질 구조는 중성자 회절(neutron diffraction) 및 NMR(nuclear magnetic resonance)에 의해 결정될 수 있다: Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972) and NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986).
본 발명자들은 GRS(glycyl tRNA synthetase)가 CDH와 상호작용하여 ERK 경로를 조절하여 세포의 사멸과 성장을 조절하는 점을 처음으로 규명하였다. 즉, 본 발명자들은 GRS가 CDH6와 상호작용하여 PP2A를 통해 ERK 경로를 조절하여 세포의 사멸과 성장을 조절하는 점을 규명하였다.
따라서, 본 발명은
(a) GRS(glycyl tRNA synthetase) 또는 이의 단편, CDH(cadherin) 및 시험제제를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
보다 구체적으로 암은 이에 제한되지는 않으나, 흑색종, 백혈병, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 피부암, 림프종, 재생불량성 빈혈 등을 포함한다. 상기에서 림프종은 호지킨씨 림프종 및 비호지킨씨 림프종을 모두 포함하며, 전구B세포종양(Precursor B-cell neoplasm)과 같은 B세포신생물(B-cell neoplasms), 전구T세포종양(precursor T-cell neoplasm)과 같은 T세포와 NK세포 신생물(T-cell and NK-cell neoplasm) 및 전형적호지킨병(classical Hodgkin lymphoma)와 같은 호지킨림프종(Hodgkin lymphoma, Hodgkin disease)을 포함한다.
아울러, 본 발명의 GRS 또는 이의 단편과 상호작용하는 단백질은 CDH(cadherin)일 수 있으며, 바람직하게는 CDH6 (K-cadherin, cadherin-6) 또는 CDH18(cadherin-18)일 수 있다. 상기 CDH6 또는 CDH18은 Genbank에 공지된 서열일 수 있다. 더 바람직하게는 CDH6의 경우 서열번호 12 (Genbank Accession No. AAH00019.1), 서열번호 13 (Genbank Accession No. NP_004923.1) 또는 서열번호 14 (Genbank Accession No. BAA06562.1)일 수 있으며, CDH18의 경우 서열번호 15 (Genbank Accession No. AAH31051.1), 서열번호 16 (Genbank Accession No. EAW68851.1) 또는 서열번호 17 (Genbank Accession No. NP_001035519.1) 일 수 있다. 본 발명의 실시예에 사용된 CDH6 및 CDH18은 각각 서열번호 12 및 서열번호 15를 사용하였다.
한편 본 발명의 스크리닝 방법은 CDH6와 상호작용하는 GRS단편을 활용할 수 있다. GRS의 단편, 예를 들어 서열번호 2로 표시되는 GRS의 anticodon 결합 도메인을 포함하는 단편을 이용하여
(a) GRS(glycyl tRNA synthetase) 단편, CDH 및 시험제제를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 GRS 단편과 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
한편, 본 발명에서 스크리닝 방법은
(c) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준이 변화된 시험제제를 CDH를 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 사멸여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하여,
(a) GRS 또는 이의 단편, CDH 및 시험제제를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 GRS와 CDH의 결합 수준이 변화된 시험제제를 CDH를 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 사멸여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 및 치료제의 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에서 GRS는 CDH와 상호작용하여 ERK 경로를 통해 암 세포를 사멸시키므로 GRS와 CDH의 결합 수준이 변화된 시험제제가 CDH와 상호작용하여 CDH를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 상기에서 시험제제는 CDH와의 결합에 대해서 GRS를 모방(mimick)하는 것일 수 있다.
본 발명에서 CDH를 발현하는 세포는 CDH6 또는 CDH18을 발현하는 세포일 수 있으며, 바람직하게는 암세포일 수 있고, 더 바람직하게는 신장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포 또는 이들로부터 유래 또는 분화된 세포일 수 있다.
본 발명에서 GRS와 CDH의 결합 수준의 변화는 결합 수준(level)의 증가 또는 감소일 수 있으며, 예를 들어, GRS와 CDH의 결합 수준의 증가는 ERK 경로에의 신호 전달의 증가의 유도에 의해, GRS와 CDH의 결합 수준의 감소는 GRS 기능의 모방을 통해 세포 사멸을 촉진(또는 증가)할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 다양한 생화학적 및 분자생물학적 기술이 상기 방법을 실시하는데 이용될 수 있다. 상기 기술은 다음의 문헌에 개시되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York(1987-1999).
바람직하게는, 상기 시험 제제가 먼저 GRS 또는 CDH의 생물학적 활성을 조절하는 능력이 있는지 선택적으로 어세이한다(1차 어세이 단계). 구체적으로 1차 단계에서는 시험 제제의 존재 하에서 분리된 GRS의 생물학적 활성을 어세이(어세이)하여 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 조절 제제(modulating agent)를 규명(identify)한다. 보다 바람직하게는 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(i) 시험 제제의 존재하에서 GRS 또는 CDH와 시험 제제를 접촉시키는 단계;
(ii) GRS 또는 CDH의 활성을 측정하여 이의 활성을 변화시키는 시험 제제를 선별하는 단계;
1차 어세이 단계에서는 GRS 또는 CDH의 여러 생물학적 활성에 대한 조절이 어세이될 수 있다. 예컨대, 시험 제제는 발현 수준, 예컨대, 전사 또는 번역을 조절하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 세포 내 수준 또는 안정성, 예컨대 번역 후 수식(post-translational modification) 또는 가수분해를 조절하는 활성이 있는지에 대하여 어세이될 수 있다.
이후, 상기 1차 어세이 단계를 통하여 생물학적 활성을 변화시키는 조절 제제를 규명한 후, 상기 시험 제제가 GRS와 CDH의 상호작용을 변화시키는 능력이 있는지를 더욱 테스트한다(2차 시험 단계).
상기 1차 및 2차 단계 모두, 변하지 않은(intact) GRS 및 이의 단편, 아날로그, 또는 기능적 동등물을 사용할 수 있다. 이들 어세이에 사용될 수 있는 단편은 일반적으로 GRS 의 생물학적 활성을 하나 이상 보유한다. 또한 상기 단편 또는 아날로그를 포함하는 융합 단백질이 시험 제제를 위한 스크리닝에 사용될 수 있다. GRS 의 기능적 동등물은 아미노산 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 가지기는 하나 GRS와 동일한 생체활성을 보유하는 것이므로 본 발명의 스크리닝 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
당업계에 통상적으로 실시되고 있는 다양한 어세이들이 GRS 또는 CDH, 이들의 상호작용를 조절하는 제제를 규명하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 제제는 세포 기반 어세이 시스템(cell based 어세이 system)으로 스크리닝될 수 있다. 예컨대, 스크리닝하기 위한 전형적인 세포 기반 어세이에서(즉, 2차 시험 단계에서), 시험 제제의 존재 하에서 리포터 유전자 활성(예: 효소 활성)을 측정하고, 이를 시험 제제의 부재 하에서의 리포터 유전자의 활성과 비교한다. 상기 리포터 유전자는 당업계에 공지된 임의의 검출가능한 폴리펩티드(반응 또는 리포터 폴리펩티드), 예컨대, 형광 또는 인광(phosphorescence)에 의해 검출가능한 폴리펩티드나 그것이 보유하고 있는 효소 활성에 의해 검출가능한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 검출가능한 반응 폴리펩티드(detectable reponse polypeptide)는, 예컨대, 루시퍼라제, 알파-글루쿠로니다제(glucuronidase), 알파-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질 및 인간 분비된 알칼린 인산화효소일 수 있다.
세포-기반 어세이에서, 시험 제제(예: 펩티드 또는 폴리펩티드)는 숙주세포 내에 존재하는 다른 벡터에 의해 발현될 수 있다. 어떤 방법에서는, 시험 제제의 라이브러리가 상기 벡터의 라이브러리(예: cDNA 라이브러리)에 의해 암호화된다. 상기 라이브러리는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며(Sambrook et al. and Ausubel et al., supra), 또는 다양한 상업적인 출처로부터 얻어질 수 있다.
상기 기재한 세포-기반 어세이 이외에, 비-세포 기반 방법에 의해서도 스크리닝될 수 있다. 상기 방법은, 예컨대, 모빌리티 쉬프트 DNA 결합 어세이(mobility shift DNA-binding assay), 메틸화 및 우라실 간섭 어세이 (methylation and uracil interference assay), DNase 및 히드록시 라디칼 풋프린팅 분석(DNase and hydroxyl radical footprinting analysis), 형광 편광(fluorescence polarization) 및 UV 교차결합(crosslinking) 또는 화학적 가교제(cross-linkers)를 포함한다. 일반적인 개요는 Ausubel 등의 문헌에 개시되어 있다(Ausubel et al., supra, chapter 12, DNA-Protein Interaction). 핵산 및 DNA/RNA 결합 단백질을 포함하는 공동-결합된 단백질(co-associating protein)을 분리하는 기술은, 절단가능한 가교제 디티오비스 (dithiobis)(succinimidylpropionate) 및 3,3'-디티오비스(sulfosuccinimidyl-propionate)를 포함하는 UV 교차 결합 또는 화학적 가교제를 포함한다(McLaughlin, Am. J. Hum. Genet., 59:561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:10712, 1996; and Chodosh, Mol. Cell. Biol., 6:4723-4733, 1986).
본 발명에 기재된 도면에 대해서 다음과 같이 설명한다.
도 1은 대식세포에서 분비된 GRS에 대해 나타낸다. (A) 표지된 세포를 혈청이 없는 배지에서 12시간 동안 배양하고, 배지에 분비된 단백질을 TCA로 침전 시킨 뒤 항(anti)-GRS 항체를 이용하여 면역 블롯팅(immunoblotting)을 수행하였다. GRS의 발현정도는 세포 전체를 용해시킨 GRS 면역 블롯팅으로 검출하였다. (B) RAW 264.7 세포를 혈청이 없는 배지에서 12시간 동안 배양하고, 배지에 분비된 단백질을 면역침전 시킨 뒤 항-GRS 항체를 이용하여 면역 블롯팅을 수행하였다. (C) 혈청이 없는 배지에서 배양한 여러 세포종류의 시간에 따른 GRS의 분비정도를 모니터링 했다. (D) 혈청이 없는 배지에서 12시간 배양한 미세아교세포(BV2), T 림프구 (Jurkat), 그리고 단핵구 유사 대식세포 (U937)에서 GRS의 분비를 위와 같이 관찰하였다.
도 2는 암세포로부터 유래된 Fas 리간드 신호에 의해 유도된 GRS 분비에 대해 나타낸다. (A) H460 암세포를 0.25 x 106cells/well 로 접종하였다. 12시간 후 혈청이 없는 배지로 교환하고 0.125 x 106 ~ 1 x 106cells/well 의 U937 단핵구와 6시간동안 함께 배양하였다. 그 후 배양배지에서 GRS의 분비 정도를 TCA 침전 및 면역 블롯팅으로 검출하였다. (B) U937 세포와 함께 배양한 HCT116 암세포와 GRS 분비의 확인을 상기와 같이 검출 하였다. (C) H460과 RAW 264.7 세포를 공동 배양하고 GRS 분비를 확인하였다. (D) 골수유래 대식세포(BMDM)과 H460 세포를 공동배양하고 GRS 분비 정도를 관찰하였다. (E) 12시간 동안 배양한 H460의 배지를 수거하여, RAW 264.7와 U937 세포를 6시간 동안 배양하는데 조건화된 배지(conditioned medium)로 사용하였다. GRS의 분비는 상기와 같은 방법으로 측정하였다. (F) Transwell 챔버에서 배양한 H460 세포를 U937과 함께 혹은 단독으로 혈청이 없는 배지(serum-free medium)에서 6시간 동안 배양하고, GRS 분비 정도를 분석하였다. (G) 활성화된 항-Fas 항체(CH11 clone, 5㎍/ml)를 정해진 시간마다 U937 세포에 처리하고 GRS 분비정도를 확인하였다. (H) 중성화시키는(Neutralizing) 항-Fas 항체(ZB4 clone, 0.2㎍/ml)를 공동배양시스템(co-culture system) 의 배지에 첨가하고 GRS 분비를 위와 같이 확인하였다.
도 3은 여러 종류의 종양세포에서 분비된 GRS의 apoptosis 유도에 대해 나타낸다. (A) 용량별로 비오틴과 결합한 GRS(biotinylated GRS)를 streptavidin-HRP에 의해 포획된 MCF-7, HeLa, HCT116과 RAW 264.7 세포주들로 검출하였다. (B) RAW 264.7과 HCT116 세포에 재조합 인간 GRS를 정해진 농도별로 처리하고 세포 생존률을 MTT 어세이를 통해 측정하였다. 양성 대조군으로 Adriamycin(2mg/ml)을 사용하여 세포사멸을 유도하였다. (C) 세포 사멸에서 GRS의 효과는 flow cytometry를 사용한 sub-G1으로 관찰하였다. sub-G1 세포의 %는 그래프로 나타내었다. Cytokine의 활성을 불활성화 시키는지 여부를 알아보기 위해 GRS(150nM)를 끓였다. (D) 세포사멸을 유도하는 GRS을 활성 caspase 3의 세대로 관찰하였다. (E) Transwell을 사용하여 U937 세포에 HCT116을 넣거나 넣지 않은 채로 24시간동안 챔버에서 배양하고 세포 생존율을 위와 같이 분석하였다. GRS효과를 중화시키기 위해 배지에 항-GRS 항체를 첨가하였다. (F) RAW 264.7, MCF7, SH-SY5Y, HSF, HEK293, A549, H460, Hela 그리고 HCT116 세포에 농도의 GRS 혹은 adriamycin을 24시간동안 처리하고 MTT 어세이를 통해 세포 생존률에서의 효과를 확인하였다. 3회 실험의 평균으로부터 표준편차를 계산하여 오차막대를 표시하였다.
도 4는 GRS의 잠재적 수용체로써의 CDH6의 확인에 대해 나타낸다. (A) Fc- 융합 가용성 cadherin 군집(Fc-fused soluble cadherin family) 단백질의 패널(panel)을 His-tagged GRS 또는 BSA로 코팅된 plates에 결합시키고, 복합체를 IgG1 Fc-HRP 시약을 사용하여 검출하였다. (B) Cadherins과 GRS, Fc-CDH2, 6, 18 사이의 결합을 확고히 하기 위해 His-GRS와 함께 배양하였다. Fc-CDHs을 단백질 A/G 아가로즈와 함께 침전 시키고 함께 침전된 GRS를 면역 블롯팅법으로 검출하였다. (C) 평형분해상수(KD)를 계산하기 위해, 고정시킨 Fc-fused (to gold chips) cadherins을 31.25 nM~1 uM 의 GRS과 함께 배양하였다. GRS와 CDH6의 결합은 표면 플라즈몬 공명법(SPR)에 의해 검출하고 공명단위(RU)로 나타내었다.
(D) CDH6 와 GRS 도메인 펩타이드 사이의 결합을 확인하기 위해 Fc-CDH6를 GST 융합 단백질로 나타나는 GRS의 다른 도메인과 함께 배양하였다. GST-GRS 단백질을 GSH-sepharose beads와 함께 침전시키고 같이 침전된 CDH6를 면역 블롯팅법으로 검출하였다. (E) 면역 블롯팅법에 의한 CDH6의 발현으로 다섯 종류의 서로 다른 암세포를 결정하였다. (F) HCT116 세포에 비특이적 siRNA 조절 또는 다르게 고안된 두개의 siRNAs 표적 CDH6 (#1 과 #2)를 감염시키고 비오틴이 처리된 GRS 15nM를 첨가한 후 GRS과의 결합을 면역 블롯팅법으로 분석하였다. (G) HCT116 세포에 si-con와 si-CDH6를 위와 같은 방법으로 감염시키고 GRS의 결합여부를 FACS 분석법으로 측정하였다. (H) 150nM His-GRS와 함께 HCT116 세포를 배양하였다. GRS 영향을 중화시키기 위해, 300nM의 Fc-fused CDH6를 처리하고 MTT 어세이법으로 세포 생존률을 측정하였다. 오차막대는 표준 편차로 나타내었다.
도 5는 분비된 GRS가 고도로 인산화된 ERK 암세포의 apoptosis를 유도하는 것을 나타낸다. (A) HCT116 세포에 정해진 농도의 GRS를 1시간 동안 처리하고 서로 다른 3종류의 MARKs 인산화 여부를 각각의 특이적 항체를 이용하여 검출하였다. (B) 5종류의 암세포주에서 면역 블롯팅법으로 ERK의 인산화를 알아보았다. (C) 서로 다른 세 종류의 활성 Ras transfectansts를 발현하는 HEK293 세포에 GRS(150nM)를 처리하고 그것의 ERK 인산화 효과를 상기와 같은 방법으로 측정하였다. (D) GRS에 의해 유도된 여러 암 세포주 사멸의 민감성은 MTT 어세이로 측정하였다. 3번의 독립적인 실험의 평균으로 결과를 나타내었다. (E) Okadaic acid (PP2A 저해제), PP2B 저해제, PTP CD45 저해제, PTP B1 저해제 중 하나를 15분간 처리하고 GRS(150nM)를 넣거나 또는 넣지 않고 1시간 동안 배양하여 ERK의 인산화 정도를 측정하였다. CDH6과 PP2A의 상호작용에서 GRS가 미치는 영향은 HCT116 (F)와 Caki-1 (G) 세포에서 각각 공동 면역 침전법으로 확인하였다. (H) HCT116 세포에 GRS를 처리하고, 그것이 PP2A와 ERK의 상호작용에 미치는 영향을 공동 면역 침전법으로 관찰하였다.
도 6은 분비된 GRS가 생체 내(in vivo)에서 암세포 사멸을 유도하는 것을 나타낸다. (A) BALB/c nude mice에 HCT116 세포를 피하로 주입시키고 9일간 사육하였다. GRS (10와 20 ㎍/ dose), 또는 PBS vehicle를 암세포 내부로 주입하였다. (n=5 animal/group). 종양의 부피는 가장 긴 직경 가장 x 짧은 직경2 x 0.52 으로 계산하였다. (B) 대조군(왼쪽) 및 처리 (오른쪽, 20㎍ GRS) 후 12일된 팔의 대표적인 HCT116 이종 이식 종양 마우스 사진이다. (C) 종양 무게는 같은 날 측정하였다. (D) 표시된 투여량에 대조군과 GRS 처리된 군의 몸무게를 반영하였다.
(E) 최적의 커팅 온도 혼합물에 심은 조직(Optimal Cutting Temperature compound-embedded tissues)으로 만든 10㎛ 두께의 동결 박편으로 면역형광 염색을 하였다. 그 조직은 Yo-pro (녹색)으로 처리하여 면역형광현미경으로 관찰하였다. 핵은 DAPI(파란색) 으로 염색하였다. (F) BALB/c nude mice에 HCT116 세포들을 20㎍ GRS 또는 PBS와 함께 주입하고 15일 동안 사육하였다. (n=6 animal/group) (G) 처리 후 15일된, 대조군(왼쪽) 및 20㎍ GRS를 처리(오른쪽)한 팔의 대표적인 HCT116 이종 이식 종양 마우스 사진이다. (H) 투여 후 15일 째 대조군과 처리된 마우스의 종양무게를 측정하였다. (I) 대조군과 GRS 처리군의 체중을 측정하였다. (n=5). (J) OCT 혼합물로 만든 조직의 10 ㎛ 두께의 동결 박편으로 면역형광 염색을 하였다.
도 7은 생체 내에서, 분비된 GRS의 CDH6 의존적 항종양 효과를 나타낸다. (A) 비오틴 처리된 GRS (B-GRS)를 SN12 세포에 표시된 농도로 넣어 배양하고 streptavidin-conjugated horseradish peroxidase로 세포 결합 정도를 확인하였다.
(B) BALB/c nude mice에 SN12 세포를 5일간 피하 주사하고, 2 내지 6 mg/kg 용량의 GRS 또는 PBS vehicle을 4일간 매일 복막 내부에 투여하였다(n=5 animal/group). 종양의 부피는 가장 긴 직경 x 가장 짧은 직경2 x 0.52 으로 계산하였다. (C) 비오틴 처리된 GRS (B-GRS)를 RENCA 세포에 표시된 농도로 넣어 배양하고 세포 결합 정도는 상기와 같은 방법으로 확인하였다. (D) BALB/c nude mice에 RENCA 세포를 5일간 피하 주사하고, 2 내지 6 mg/kg 용량의 GRS 또는 PBS vehicle를 위와 같이 복막 내부에 투여하였다(n=5 animal/group). 종양 부피를 측정하였다. (E) 대조군과 처리군의 마우스 종양 무게를 측정하고 막대그래프로 나타냈다. (F) 대조군과 6mg/kg GRS 처리군으로 부터 SN12의 이종 이식 ERK의 인산화는 면역 블롯팅 법으로 측정하였다. (G) 종양 세포 대식 세포 미세환경에서, 분비된 GRS와 CDH6과의 상호 작용을 도식으로 표현하였다. GRS는 Fas 리간드와 같은 apoptotic 자극에 의해 대식세포로부터 분비되고 Ras- 변이 암세포와 같은 활성화된 ERK-암세포에서 높은 발현을 보이는 CDH6와 결합한다. GRS의 결합, CDH6에서 PP2A의 방출, 활성화된 ERK의 탈인산화의 결과로 표적(target) 세포의 사멸이 일어난다.
도 8은 GRS 분비 조건을 나타낸다. (도1, 2와 연관) (A) 사람과 마우스 혈청에서 GRS 검출하였다. 3명의 사람(샘플당 약 80㎍의 단백질)과 2마리의 CL57BL/6 mice (샘플당 약 40㎍의 단백질)로부터 얻은 2㎕의 혈청 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고, GRS 검출을 위해 사람과 마우스간 교차 반응하는 항-human GRS 단일클론 항체로 블롯팅 하였다. 마찬가지로 같은 겔에서 사람과 마우스간 교차 반응하는 항-human -β-tubulin, -GAPDH, 그리고 -LDH 단일클론 항체들을 이용하여 각각 블롯팅 하였다. 양성 대조군의 항체 민감도를 확인하기 위해, 마우스 N2A 세포의 용해물 (약 단백질 10㎍ 정도)을 사용하였다. (B) 에스트로겐(50nM), EGF(100ng/ml), TNF-α(20ng/ml) 그리고 adriamycin (Adr, 1㎍/ml)을 처리한 RAW 264.7 세포와 GRS의 분비 정도를 정해진 시간별로 검출하였다. (C) RAW264.7, HCT116, HeLa 세포에 adriamycin(1㎍/ml), cycloheximide(CHX, 1㎍/ml)을 넣은 TNF-α(1ng/ml)을 처리하거나 glucose가 없는(deprived) 배지에서 정해진 시간동안 배양하고 각각의 세포로부터 GRS의 분비를 관찰하였다. (D) U937 세포에서도 정해진 자극에 의한 GRS 분비정도를 측정하였다. (E) adriamycin(Adr)을 처리한 RAW 264.7 세포에서 서로 다른 3가지 ARSs (GRS, KRS, YRS)의 분비여부를 확인하였다.
도 9는 GRS 분비가 세포 용해(cell lysis)와 관련이 없음을 나타낸다. (도2와 연관) RAW264.7 세포에 adriamycin(Adr), glucose deprivation(-Glu) 그리고 Fas ligand (Fas)를 4시간 동안 처리하였다. 양성대조군으로 세포에 UV (200J/m2)를 조사하고 18시간동안 배양하였다. 세포사멸과 생존률은 각각 FACS(A)과 MTT(B) 분석을 통한 sub-G1 세포 개체수로 측정하였다. (C) 세포 외액의 LDH enzyme 활성은 같은 조건 하에서 LDH cytotoxicity kit를 사용하여 측정하였다. (D) 혈장막 보존은 면역형광염색법으로 관찰하였다. 4%의 paraformaldehyde로 고정시킨 대식세포에 Yo-pro(녹색)과 propidium iodide(붉은색)을 처리한 후 면역형광 현미경으로 관찰하였다. 핵은 DAPI(파란색)으로 염색하였다. (E) 정해진 시간 별로 U937 세포에 활성화된 항-Fas 항체(CH11 clone, 5㎍/ml)을 처리하고, GRS 와 GAPDH의 전사 수준을 RT-PCR로 확인하였다. (F) 세포에 cycloheximide(CHX, 20㎍/ml)를 15분 동안 미리 처리한 후, 활성화된 항-Fas 항체를 첨가하였다. 4시간 동안 배양하고, 배지 속 단백질들을 TCA를 사용하여 침전시킨 후, SDS-PAGE로 분석했다.
도 10은 세포와의 결합에 의한 표적 세포의 확인과 apoptosis의 여러 매개자 중 GRS의 여러 효과들에 대해 나타낸다. (도3과 연관) (A) 정해진 시간마다 HeLa와 HCT116 세포에 비오틴이 첨가된 GRS (30nM)를 처리하고 면역 블롯팅으로 GRS의 세포와의 결합 정도를 관찰하였다. (B) 비오틴이 첨가된 GRS의 결합이 특별히 표지되지 않은 GRS와 경쟁하는지를 알아보기 위해, HeLa 세포에 His-GRS (150nM)를 15분 동안 미리 처리하거나 혹은 처리하지 않은 다음 비오틴이 첨가된 GRS에 첨가하고 30분간 배양하였다. 비오틴이 첨가된 GRS의 세포 결합 정도는 면역 블롯팅으로 확인하였다. (C) HCT116 세포에 여러 농도의 비오틴이 첨가된 GRS 또는 BSA를 1시간 동안 처리하였다. 비오틴이 첨가된 GRS(30nM)의 결합이 특별히 표지되지 않은 GRS와 경쟁하는지를 알아보기 위해, 그 세포들에 표지되지 않은 GRS(150nM)과 함께 미리 배양하였다. 비오틴이 첨가된 GRS와 HCT116 세포와의 결합은 Alexa488-conjugated streptavidin 을 이용한 면역형광 염색법으로 관찰 하였다. (D) BAX와 Bcl-2 에서 GRS의 효과는 각각에 특이적인 항체를 사용한 면역 블롯팅법으로 확인하였다. (E) 미토콘드리아에서 방출되는 cytochrome C에서 GRS의 효과를 확인하였다.
도 11은 인간 GRS에서 싸이토카인 활성영역을 확인한 것을 나타낸다. (그림3과 연관) (A) 표시된 기능적 영역으로 구성된 685 aa 인간 GRS는 GST 융합 단백질로 정제된 4개의 조각(F1-4)으로 분리 되어 있다. F1을 제외한 세 조각(F2-4)은 수용성 형태로 취득되었다. WHEP 영역은 특정 인간 aminoacyl - tRNA의 합성효소에 부착된 다기능 펩타이드 도메인이다. 촉매 및 anticodon 부착 영역은 각각 F1/F2와 F4에 있다. (B) 인간 GRS(D63-G674)의 3차원적 입체 구조와 싸이토카인 어세이에 사용된 인간 GRS(F2-4)의 결실 조각은 Accelrys DS Visualizer v2.0를 사용하여 다양한 색상으로 나타냈다. (C) 세포 생존율에서 GRS 조각의 효과는 MTT 분석을 사용하여 비교하였다.
도 12는 GRS와 CDH6과의 결합 확인한 결과를 나타낸다. (그림4와 연관) 해리 상수 (KD)를 계산하기 위해, Fc -융합 cadherins (CDH18)(A) 또는 Fc 단백질 (IgG)(B)을 골드 칩에 고정시키고 GRS (1uM ~ 31.25nM) 를 표면에 뿌렸다. 방법에서 설명한대로 cadherin과 GRS 사이의 결합은 SPR으로 확인하였다. (C) 비특이적 siRNA (si-con) 또는 CDH6(si-CDH6 #1와 #2)를 표적으로하는 siRNA을 감염시킨 HCT116에 GRS (30nM)을 처리하고 CDH6에서의 단백질 수준을 면역블롯팅법으로 확인하였다.
도 13은 CDH6와 ERK 인산화의 상호 관련성에 대해 나타낸다. (그림5와 연관) (A) 정해진 시간동안 150nM GRS를 HCT116 세포에 처리하고 ERK, p38 MAPK 그리고 JNK의 인산화 효과를 면역 블롯팅법으로 확인하였다. (B) Ras-transfected 293 세포 사멸에서 GRS의 영향은 flow cytometry를 사용하여 sub-G1으로 확인하였다. (C) 다양한 암세포주에서 CDH6의 발현 및 EKR 인산화의 세포수준에서의 비교를 면역 블롯팅법으로 비교하였다. 대조군으로 tubulin을 사용하였다. (D) HEK293 세포에 각각 Flag-tagged K-, N-, H-RAS (oncogenic mutants)을 감염시키고 웨스턴 블롯팅으로 CDH6의 발현에 미치는 효과를 확인하였다. (E) HCT 116 세포에 GRS를 처리하고, PP2A 인산화에 미치는 영향을 면역 블롯팅법으로 확인하였다.
도 14는 생체 내에서 GRS와 그것의 영역에서의 항암효과와 독성을 확인한 것을 나타낸다. (그림6,7과 연관) (A) BALB/c nude mice에 GRS F2 또는 F4 절편 20㎍을 첨가한 HCT116 세포를 주입하고 15일간 사육하였다. (n=6animal/group) (B) 두 종류의 GRS F2 및 GRS F4절편 주입 15일 후 HCT116 이종 이식 종양 마우스의 대표적 사진이다. (C) 주입 15일 후 GRS F2와 GRS F4 절편을 처리한 마우스의 종양무게 측정하였다. (D) GRS F2와 GRS F4 절편을 처리한 마우스의 날짜별 체중을 측정하였다. (n=6) SN12 (E)와 RENCA 세포(F)을 이종이식한 마우스의 체중측정을 측정하였다. (n=5) 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 GRS와 CDH의 신규한 용도로 암의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다양한 암 질환의 새로운 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 대식세포에서 분비된 GRS에 대해 나타낸다.
도 2는 암세포로부터 유래된 Fas 리간드 신호에 의해 유도된 GRS 분비에 대해 나타낸다.
도 3은 여러 종류의 종양세포에서 분비된 GRS의 apoptosis 유도에 대해 나타낸다.
도 4는 GRS의 잠재적 수용체로써의 CDH6의 확인에 대해 나타낸다.
도 5는 분비된 GRS가 고도로 인산화된 ERK 암세포의 apoptosis를 유도하는 것을 나타낸다.
도 6은 분비된 GRS가 생체 내(in vivo)에서 암세포 사멸을 유도하는 것을 나타낸다.
도 7은 생체 내에서, 분비된 GRS의 CDH6 의존적 항종양 효과를 나타낸다.
도 8은 GRS 분비 조건을 나타낸다.
도 9는 GRS 분비가 세포 용해(cell lysis)와 관련이 없음을 나타낸다.
도 10은 세포와의 결합에 의한 표적 세포의 확인과 apoptosis의 여러 매개자 중 GRS의 여러 효과들에 대해 나타낸다.
도 11은 인간 GRS에서 싸이토카인 활성영역을 확인한 것을 나타낸다.
도 12는 GRS와 CDH6과의 결합 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 CDH6와 ERK 인산화의 상호 관련성에 대해 나타낸다.
도 14는 생체 내에서 GRS와 그것의 영역에서의 항암효과와 독성을 확인한 것을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 분비 어세이 (Secretion assay)
Raw 264.7 세포를 조정배지(conditioned medium)에서 배양하였다. 10% TCA를 사용하여 배지를 모으고 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질들을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 면역 블롯을 하기위해 PVDF (polyvinylidene fluoride)로 옮겼다.
2. 공동 배양 어세이
U937 또는 RAW 264.7 세포(0.125 x 106cells~ 1x106/well)를 H460 또는 HCT116 세포(0.25 x 106/well) 위에 접종하여 6-well plates에 12시간 동안 배양하였다. 그 후 혈청이 없는 배지로 옮겨 6시간 동안 더 배양하였다. GRS의 분비여부를 알아보기 위해 배양한 배지를 모으고 10% TCA (Trichloroacetic acid)를 이용하여 단백질을 침전시켰다. 공동배양을 한 대식세포/단핵구와 종양사이에서 생리적 상호작용이 GRS 분비에 필수적인 인지 아닌지 증명하기 위해, 0.4㎛ 구멍을 가지는 삽입물이 들어가는 24-well transwell 세포배양 챔버를 사용하였다. H460 세포들을 이 챔버에 접종하고 U937세포들은 삽입물 안에 접종하고 H460:U937을 1:2 비율로 각각 따로 12시간 동안 배양하였다. 그리고 삽입물을 H460이 배양되고 있는 챔버로 옮겼다. 배양 24시간 후 삽입물을 제거 하고 분비물 분석을 위해 배지를 모았다.
3. 세포 사멸 어세이 (Apoptosis assay)
테스트된 세포를 정해진 시간에 다양한 농도의 재조합 GRS로 처리한 후 수거했다. 수거한 세포를 PBS로 세척한 후 70% 에탄올로 1시간 동안 고정시키고 PBS에 녹인 50 ㎍/ml propidium iodide 용액으로 염색하였다. CellQuest 프로그램을 이용한 FACS를 사용하여 샘플당 20,000개의 세포를 읽었다. MTT 분석을 위해 5mg/ml 농도의 MTT 용액 20㎕를 150 ml 배양 배지에 첨가하였다. 4시간 동안 배양 후 200㎕의 DMSO를 첨가하였다. 570nm 흡광도에서 microplate reader(TECAN, Mannedorf, Swiss)로 측정하였다. pro-caspase 3 부터 활성화된 caspase 3의 generation은 각각의 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 검출하였다.
4. 가용성 수용체 결합 어세이 (Soluble receptor binding assay)
GRS의 수용체를 확인하기 위해 ELISA 검출에 Maxisorp plate(Nunc, Rochester, NY)를 사용하였다. plate에 PBS (phosphate buffered saline)에 녹인 정제된 his-tagged GRS(1 ㎍/ml) 또는 BSA(1 ㎍/ml)로 코팅을 하고 4% non-fat milk를 처리하였다. 1 ㎍/ml의 Fc-융합 cadherin family 단백질을 plate에 첨가하고 0.05%의 PBST (PBS-tris)로 씻은 후, 항-human IgG1 Fc-HRP (horseradish peroxidase)를 넣고 배양하였다. 배양 후 씻어낸 다음 TMB (tetramethylbenzidine) 용액을 첨가하여 450nM에서 흡광도를 측정하였다. 상호작용을 확인하기 위하여 1㎍/ml의 정제된 Fc-CDH2, 6, 18에 1㎍/m의 His-GRS를 넣고 2시간 동안 배양하였다. 이 반응은 단백질 A/G agarose 와 Fc-융합 cadherins의 면역학적 침전을 일으켰고 복합체 검출을 위해 항-GRS를 이용하여 면역 블롯팅을 수행하였다.
5. 이종이식 마우스 모델 (Xenograft mice model)
동물 실험은 서울 대학교 대학 동물 관리 및 사용위원회 지침을 준수하였다.
BALB/c nude female mice에 20-gauge 주사를 사용하여 피하로 3 x 107세포의 HCT116, SN12와 RENCA를 주입하여 발암을 유도하였다. 2주마다 종양의 성장을 확인하고, 종양형성이 관찰되면 캘리퍼로 크기를 측정하였다(종양 부피는 길이 x 넓이 2 x 0.52로 계산하였다). 신장 종양 세포인 SN12과 RENCA를 5일 동안 키우면서 His-GRS 단백질을 복막 내부에 4일 동안 매일 주입하였다. 복귀모델을 만들기 위해 종양세포를 9일 동안 키우고 His-GRS 단백질을 종양 내로 주입시켰다. His-GRS 단백질을 종양세포에 주입하거나 넣지 않고서 성장모델을 만들었다. 희생을 시킨 후 종양의 무게를 측정하고 면역형광염색을 위해 최적의 절단 온도(OCT) 혼합물에 깊이 박았다. 10㎛로 잘라진 동결절편을 슬라이드에 부착시켜 PBS를 처리한 다음 4% paraformaldehyde로 고정시켰다. 2% CAS가 함유된 PBS를 처리하고 Yo-Pro-1(Invitrogen) 로 37℃ 에서 2시간 동안 염색하였다. 0.1% Tween 20이 함유된 PBS로 슬라이드를 씻어내고 DAPI(Invitrogen)로 핵을 37℃ 에서 30분간 염색하였다. 부착된 절편을 공초점 면역형광 현미경(Nikon C-1 confocal microscope)으로 관찰하였다.
6. 세포배양(cell culture)과 재료
RAW264.7, SH-SY5Y, HSF(인간피부 섬유아세포), HEK293, BV2, MCF-7, SN12, SK-BR-3, BT474 그리고 HeLa 세포들을 10% fetal bovine serum, 50㎍/ml streptomycin, penicillin을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지에서 배양하였다. A549, H322, H460, HCT116, Caki-1, RENCA, HT1080 과 Jurkat 세포 배양을 위해서, 앞에서와 같은 첨가물을 넣은 RPM1640 배지를 사용하였다. full-length human GRS (Abcam, Cambrage, UK)에 대해 토끼 다중클론 항체(Rabbit polyclonal antibody)를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석을 하였다. CDH6을 표적으로하는 Si-RNAs(5'-UUUCAUAGAACUCAGCAAAUUCUGG-3' (서열번호 18)와 5'-UAAUAAUGAAGAGAUCUCCUGCUCC-3' (서열번호 19))을 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로 부터 구입하여 사용하였다. 음성 대조군으로 Stealth universal RNAi(Invitrogen)을 사용하였다.
7. 재조합 인간 GRS 의 합성
685개의 아미노산을 암호화하는 Human GRS cDNA를 pET-28의 EcoRI과 XhoI 제한효소 위치에 클로닝 하고, E. coli Rosetta에서 IPTG 유도로 과발현을 확인하였다. nickel affinity chromatography(Invitrogen)을 이용하여 매뉴얼 지시대로 His-tagged GRS을 정제하였다. GST-GRS 절편 역시 E. coli Rosetta에서 IPTG 유도로 발현을 확인하였다. GST-fusion 단백질은 glutathione-sepharose에 0.5% Triton X-100을 함유한 PBS 완충용액을 사용하여 정제하였다. lipopolysaccharide (LPS)를 제거하기 위해, 100 mM NaCl을 함유한 10mM pyrogen-free potassium phosphate 완충액(pH 6.0)에 단백질 용액을 희석시켰다. 희석 후, GRS-함유 용액을 같은 완충액에 미리 평형을 맞춘 polymyxin resin(Bio-Rad)에 넣고 2시간 동안 방치한 후 제거 하였다. LPS 잔여물을 제거하기 위해 용액에 20% glycerol을 함유한 PBS를 넣고 희석시키고, Mustang E membrane(Pall Gelman Laboratory, Ann Arbor, USA)의 Acrodisc unit을 통과시켜 여과하였다.
8. GRS 분비 어세이
RAW 264.7 세포는 배지의 70% 정도 증식할 때까지 배양하였다. 세포를 2회 세척하고 혈청과 glucose가 없는 DMEM 배지에서 더 배양하였다 Adriamycin (1㎍/ml, Calbiochem, San Diego, CA), cycloheximide (1㎍/ml, Sigma St. Louis, MO)을 넣은 TNF-α (1ng/ml, BD Pharmingen, San Diego, CA), Fas-리간드 (10ng/ml, Millipore) 또는 항-Fas 항체 (5㎍/ml, clone CH11, Millipore, Billerica, MA) 를 혈청이 없는 배지에 추가로 첨가하였다. 정해진 시간마다 배양배지를 모으고 500g에서 10분간 원심분리 하고 오염물을 제거하기 위해 20,000g에서 15분간 더 원심분리 하였다. 4℃ 에서 12시간 동안 10% TCA를 처리한 상층액을 18,000g에서 15분간 원심분리하여 단백질을 얻는다. 얻어진 침전물을 100 mM HEPES 완충액(pH 8.0)에 녹이고 10% SDS/PAGE 로 분리한 후, 단백질을 PVDF membrane 으로 트랜스퍼 시켜 다중 클론 항-GRS 항체로 면역 블롯팅을 실시한다. 상충액 중 일부를 항-IgG로 미리 제거시키고 항-GRS 를 넣어 4℃에서 2시간 동안 방치한다. 여기에 Protein A agarose(Invitrogen)를 첨가하고 그 혼합물을 4℃에서 4시간 동안 방치한다. 단백질 A agarose beads를 침전시키고 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10mM NaF, 1mM sodium orthovanadate, 10% glycerol 과 protease 저해제 (Calbiochem)을 함유한 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)으로 3회 세척한 후 결한한 단백질들을 같은 완충액을 사용하여 제거한다.
9. 세포괴사(necrosis) 어세이와 혈장 막 보존 평가
RAW264.7 세포를 6-well 접시에 접종하고 12시간 배양하였다. 세포를 2회 세척한 후 표시한 조건 배지로 더 배양 하였다. 배지 속 LDH 함량을 측정하기 위해 배지를 보아 2,000g 에서 15분간 원심분리 하였다. 상층액으로 LDH-cytotoxicity assay kit(BioVision, Mountain view, CA)을 사용하여 지시한 방법에 따라 LDH 효소 활성을 측정하였다. 총 세포 중 LDH % 로 LDH 방출 정도를 나타내고 세포 생존률을 계산하였다. 면역형광 염색법으로 막 보존정도를 관찰하기 위해 22x22 mm cover glasses에 세포를 접종하고 24시간 배양하였다. 배양접시를 PBS로 2회 세척하고 표시한 조건 배지로 배양하였다. 세포를 4% paraformaldehyde로 10분간 고정시키고 차가운 PBS로 2회 헹구었다. 커버글라스에 PBS에 녹인 3% CAS를 떨어뜨리고 30분간 배양한 뒤, PBS에 50㎍/ml propidium iodide, 5uM Yo-Pro-1 (Invitrogen) 넣고 녹인 용액을 첨가하여 1시간 동안 더 배양하였다. 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)을 사용하여 염색하였다. 세포들을 형광현미경 (Nikon C-1 confocal microscope)에 고정시켜 관찰하였다.
10. 세포 결합 어세이
6-well 접시에 세포를 접종하고 12시간 동안 배양하였다 비오틴이 첨가된 GRS 를 배양 배지에 넣고 정해진 시간 동안 더 배양하였다. 세포들을 차가운 PBS로 4회 세척한 후, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 10mM NaF, 1mM sodium orthovanadate, 10% glycerol 과 단백질 분해효소 저해제(protease inhibitor)가 함유된 50mM Tris-HCl(pH 7.4) 완충액으로 용해시키고, 18,000g에서 15분간 원심분리 하였다. 추출된 단백질(30㎍)을 SDS/PAGE으로 분해시키고, streptavidin-coupled Horseradish peroxidase(HRP) (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 검출하였다. 재조합 GRS(1.5mg)을 비오틴화 시키기 위해 PBS에 녹인 0.25mg sulfo-NHS-SS-biotin (Pierce)을 넣고 4℃에서 2시간 반 동안 방치하였다. 면역형광 염색법으로 GRS의 세포와의 결합을 확인하기 위해 22x22 mm 커버글라스에 세포를 접종하고 12시간 동안 배양하였다. 배양 접시에 비오틴 첨가 GRS 또는 BSA를 넣고 1시간 동안 배양하였다. 세포에 4% paraformaldehyde을 넣고 10분간 고정 시킨 후 차가운 PBS로 2회 세척하였다. PBS에 녹인 3% CAS를 커버글라스에 넣고 30분간 배양하고, Alexa488-conjugated streptavidin(Invitrogen)으로 비오틴 결합 GRS을 표지하였다. 세포들을 공초점 면역형광 현미경에 고정시켜 관찰하였다. flow cytometry로 GRS의 세포 결합 정도를 관찰하기 위해 특이적 si-RNA을 세포들에 감염시키고 48시간 동안 배양하였다. 기술한 방법으로 처리한 세포들을 PBS로 3회 세척하고, FACS 완충액(2% BSA 함유한 PBS)에 녹인 Alexa488-conjugated streptavidin (Invitrogen) 으로 1시간 동안 염색하였다. 그 후 세포들을 PBS로 3회 세척하였다. CellQuest software (BD Biosciences, Mountain view, CA) 프로그램을 이용한 사용한 flow cytometry 로 세포들을 분석하였다.
11. 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance) 분석
Cadherin-Fc fusion 단백질과 GRS의 결합은 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 Array System (BioRad)을 이용한 SPR 기술로 확인하였다. CDH6, 18 and IgG (음성대조군)을 제조사 지시(~1000 RU each)에 따른 아민 결합 방법으로 GLC 골드 칩에 고정시켰다. 정제시킨 GRS를 다양한 농도로 0.005% Tween 20를 함유한 PBS에 녹인 유동 세포에 100 ㎕/min 으로 60초간 넣고 600초 동안 분리시킨다. 결합정도는 공명단위(RU)의 변화로 확인하고 공명단위는 1pg/mm2으로 정의하였다. Sensogram은 대조군 표면으로부터 기록된 결합 반응을 뺀 것으로 하였다. 평형 분해 상수는 Proteon ManagerTMsoftware(ver2.1)을 이용하여 계산하였다. 자료는 Langmuir 1:1 결합 모델을 사용하여 평가하였다.
12. RT-PCR 어세이
세포들을 6-well 접시에 12시간 배양시킨 후, 2회 세척하고 자극을 주었다. random hexamer과 함께 RNeasy mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNAs을 추출하고, GRS 특이적 프라이머와 GAPDH을 넣고 RT-PCR을 수행하였다
13. Cytochrome C 방출(release) 어세이
cytochrome C의 전이(Translocation)는 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. HeLa세포에 150nM GRS를 넣고 정해진 시간 동안 배양한 후, 세포를 모아 10mM potassium chloride, 1.5mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 1mM DTT와 20mM 단백질 분해효소 저해제(Calbiochem)을 넣은 HEPES (pH 7.5) 저장성 완충액(얼음에 5분 동안 넣어둔)으로 녹여 6번 균질화 시킨다. 균질화 시킨 샘플을 10,000g에서 10분간 원심분리 한다. 상층액에서 얻은 단백질로 SDS-PAGE을 실시하고 cytochrome C와 tubulin에 대한 다중클론항체를 탐침으로 사용한다.
<실험결과>
1. 대식세포로부터 GRS의 분비
3명의 다른 사람의 혈청과 2마리의 서로 다른 CL57BL/6의 혈청으로부터 GRS 가 검출되었다. β-tubulin, LDH 또는 GAPDH도 아닌 세포용해의 부족은 일관되게 같은 샘플에서 검출되었다. 이러한 결과는 분비된 GRS의 생리학적 기능에 대해 더 많이 알게 되는 계기가 되었다. 암의 미세적 환경에서 분비된 GRS의 생리학적 기능에 대한 단서를 찾기 위해 GRS의 분비가 배양된 세포로부터 검출될 수 있는지, 만약 검출된다면, 그러한 분비가 세포타입에 따라 특이적인 것 인지 실험하였다. 6가지 다른 세포주(H322, A549, HEK293, HCT116, RAW 264.7, HeLa)를 혈청이 없는 배지에서 12시간 동안 배양하고, TCA를 사용한 배지로부터 분비된 단백질들을 침전시켰다. 침전된 단백질들을 항-GRS 다중항체(α-GRS)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 실험에 사용한 6가지 세포들 중 오직 쥐의 대식세포 세포주인 RAW 264.7에서만 GRS가 검출되었다. 같은 조건 하에서 tubulin은 배지로 방출되지 않았고, 배지에 존재하는 GRS는 세포용해로 인한 것이 아님을 관찰 할 수 있었다.
GRS의 분비에 대해 더 확실히 하기 위해 혈청이 없는 배지에서 배양된 RAW 264.7의 세포에 있는 단백질들을 면역 침전시켜 α-GRS로 블롯팅하였다. Full-length GRS는 α-GRS에 의해 획득된 면역침전물에서 검출되었지만, mock IgG과 함께 검출되지는 않았다. RAW 264.7 세포에서 시간에 따른 GRS 분비경향을 보면 GRS는 12시간 기아 시킨 배지에서 검출되었고, 그 이후 시간부터 다소 증가하였다.(도 1C)
GRS 분비의 명백한 특성을 감안하여, T 림프구 Jurkat 세포, microglia-유래 BV2 세포 그리고 유사 대식세포 U937 단핵구와 같은 다른 면역세포를 연구하였다. GRS는 RAW 264.7 세포와 같은 배지조건에서 U937 세포에서만 검출되었고 Jurkat 과 BV2에서는 검출되지 않았다.(도 1D) 따라서 GRS는 기아 조건에서 대식세포 또는 단핵구에서 부터 분비됨을 알 수 있었다.
2. 다양한 apoptotic 스트레스는 GRS 분비를 유도.
기아조건 외에 GRS 분비가 다른 자극에 의해 분비될 수 있는지 알아보기 위해 RAW 264.7 세포에 신호 분자를 처리하였다. 이것들은 대식세포에서 싸이토카인 생산을 조절하는 에스트로겐; 대식세포 분화에 영향을 끼치는 TNF-α; 대식세포와 종양세포에서부터 분비되는 EGF, 추가로 DNA 손상을 통한 세포사멸을 유도하는 Adriamycin으로 실험하였다. 이 4종류의 리간드 각각에 6시간 동안 처리 후, Adriamycin 만이 GRS 분비를 유도하였다.(도 8B) 이러한 결과는 세포사멸 스트레스(apoptotic stress)가 GRS의 분비에 중요함을 나타낸다. 이러한 가능성을 가지고 RAW 264.7 세포에 다른 세포사멸 스트레스(apoptotic stresses)를 처리하고 시간별 GRS 분비를 비교하였다. Adriamycin, glucose-deprivation와 cycloheximide을 넣은 TNF-α를 처리하여 비교 하였을 때, RAW 264.7에 Adriamycin 처리 시 GRS가 시간 의존적으로 분비되었고, 인간대장암세포인 HCT116와 자궁경부암세포인 HeLa 에서는 분비되지 않았다(도 8C). 이러한 세 종류의 세포사멸 스트레스는 U937 세포에서도 GRS 분비를 유도하였다(도 8D). GRS 대조적으로 KRS, YRS, 다른 알려진 AARS 싸이토카인들은 Adriamycin을 처리한 U937 세포들에서 검출되지 않았다.(도 8E)
3종류의 세포사멸 스트레스를 처리하자마자 GRS가 분비되기 때문에 GRS 분비가 세포 용해물로부터 나타난 것은 아니다. 이러한 결과를 확고히 하기 위해 sub-G1 세포 주기 population 관찰과 MTT 어세이를 통해 세포 용해정도를 확인하였다. 우리는 GRS의 분비를 유도하는 조건의 어떠한 세포사멸 스트레스도 세포 주기와 생존율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.(도 9A와 B) 우리는 역시 정해진 배지에서 cytosolic lactate dehydrogenase(LDH)의 활성을 측정하였다. 배지에서 LDH 활성은 세포추출물에는 10% 미만이었고 정해진 배지에서 증가하지 않았다.(도 9C) 세포막 보존이 세포사멸이나 괴사과정에서 파괴되기 때문에 RAW 264.7 세포를 막 투과성 Yo-Pro와 막 비투과성 propidium iodide으로 염색하였다(Bhatnagar et al., 2007. Blood 110, 3234-3244). 세포사멸 스트레스 유도 후 핵은 어떤 염색약으로도 염색 되지 않았다. 그러나, UV (200 J/m2)를 쪼인 후 18시간 동안 배양시킨 대식세포에서는 핵 DNA가 염색되었다.(도 9D) 이러한 결과는 GRS 분비가 세포 용해나 막 파괴로 인한 것이 아니라는 사실과 일치한다.
3. 암세포에서 유래한 Fas 리간드에 의한 GRS 분비 유도
여러 기능들 중, 대식세포는 암세포 미세 환경의 면역 감시에서 중요한 역할을 한다. 대식세포가 종양세포로 접근 하는 것이 GRS 분비에 영향을 끼치는지 알아보기 위해, H460(human large cell lung tumor)와 U937 세포를 공동 배양 하였다. 의미있게도 KRS, YRS와 WRS을 제외한 GRS의 분비만 관찰되었고, U937세포의 증가에 따라 그 분비량도 증가하였다.(도 2A)
HCT116과 U937 세포, H460과 RAW 264.7 세포들의 공동 배양에서도 GRS분비를 확인할 수 있었다.(도 2B와 C) 추가로 공동 배양에서 골수유래 대식세포(BMDM)를 사용하여 실험하여 전-생체 어세이(ex-vivo assay)에서도 역시 GRS가 분비됨을 확인하였다.(도 2D) 그 후 GRS 분비에 종양과 대식세포 사이의 물리적 접촉이 요구되는지 알아보기 위해 앞서 설명한 것과 같이 조건배지와 Transwell 배양접시를 사용하였다(Khodarev et al., 2002. J. Cell. Sci. 116,1013-1022). 의미있게도, H460에서 모은 조건 배지는 RAW 264.7과 U937에서 GRS분비를 유도하였다.(도 2E) Transwell 접시 챔버에 있는 H460과 삽입물(inserts)에서 배양하던 U937 세포를 각각 분리하였다. U937 세포수가 증가함에 따라 GRS분비량도 증가하였다.(도 2F) 이러한 결과는 GRS 분비에 암과 대식세포간의 물리적 접촉이 영향을 끼치지 않음을 나타낸다.
Fas ligand 분비에 의해 종양세포가 면역 감시망를 회피하여 (Igney and Krammer, 2002. J. Leukoc. Biol. 71,907-920) 세포 사멸 스트레스(apoptotic stresses)와 공동배양 된 종양세포에 의해 GRS분비가 일어날 수 할 수 있기 때문에, Fas 리간드가 GRS 분비에 관여하는지 여부를 조사하였다. 이러한 가능성을 확인하기 위해 조건 배지에 U937 세포에 대한 Fas 항체를 과량 첨가하고 이것이 GRS분비를 유도하는지 살펴보았다. 그리고 이 처리 후, 시간에 따라 배지에서 GRS가 축적됨을 확인하였다.(도 2G) Fas 리간드와 GRS분비 사이의 상관관계를 확인하기 위해 공동배양시스템에 과량의 중화시키는 Fas 항체를 첨가하였다. 효과를 중화시킨 후에는 배지에서 GRS 분비가 감소하였다.(도 2H) 그러나 RT-PCR 분석법으로 확인한 결과 GRS에 해당되는 유전자의 전사에 Fas가 영향을 미치는지에 대한 증거는 없었다.(도 9E) 또한, cycloheximide과 함께 denovo 단백질 합성 봉쇄는 GRS의 분비를 저해하지 않았다.(도 9F) 이러한 결과는 암세포 유래 Fas 리간드에 의해 GRS의 모델이 분비된다는 사실과 일치한다.
4. 분비된 GRS의 세포와의 결합
분비된 GRS의 표적세포를 확인하기 위해, 비오틴이 첨가된 GRS를 여러 농도로 처리한 인간 유방암세포인 MCF7, HeLa, HCT116과 RAW 264.7을 배양하였다. 실험 결과 비오틴 첨가된 GRS(biotinylated GRS)가 HCT116, HeLa과 RAW 264.7 세포에서는 용량 의존적으로 검출되었지만 MCF7에서는 검출되지 않았다.(도 3A) 같은 조건에서, 비오틴 첨가된 BSA(biotinylated BSA)는 4종류 세포 어디에서도 검출되지 않았다. 다음으로, HeLa와 HCT116 세포에서 시간별 GRS의 결합정도를 관찰하였다. 비오틴 첨가된 GRS의 결합은 세포와 함께 배양한지 5분 뒤부터 검출되었고 15~30분에서 최고로 증가하였다.(도 10A) GRS에 의한 세포 결합 특이성을 확인하기 위해, 표지되지 않은 GRS와 함께 세포를 15분간 배양하고 그 후, 비오틴 첨가된 GRS를 첨가하였다. 세포에 표지되지 않은 GRS가 미리 처리 되었을 때, 비오틴 신호가 눈에 띄게 억제되었다.(도 10B) GRS의 세포 결합은 면역형광염색으로 더 관찰 하였다. 염색의 강도는 GRS의 양에 따라 증가하였지만 표지되지 않은 GRS가 첨가 되었을 때는 감소하였다.(도 10C); 따라서, 염색의 강도는 GRS 결합정도에 따라 특이적이다. 이러한 결과들을 볼 때 분비된 GRS는 특이 종양세포와 대식세포를 표적으로 함을 알 수 있다.
5. 종양세포에서 GRS의 pro-apoptotic 효과
GRS 분비가 Fas와 같은 apoptotic 리간드에 의해 유도되며 종양세포와 결합한 GRS가 대식세포로부터 분비되므로, 우리는 GRS가 pro-apoptotic 효과를 나타내는지 여부를 조사하였다. 세포 생존률과 사멸을 MTT 법으로 관찰하였고, sub-G1 세포 증식(population)을 flow cytometry 로 확인하였다. GRS를 처리했을 때, RAW 264.7에서는 나타나지 않았으나 HCT116 세포의 생존률이 투여량 의존적으로 감소하였다.(도 3B) RAW 264.7에서 나타나지 않은 HCT116에서의 sub-G1 증식은 역시 GRS의 처리에 의해 증가하였다.(도 3C) GRS 처리로 인한 Apoptotic 세포사멸은 caspase 3의 활성에 의해 확인되었다.(도 3D) Bax과 Bcl-2 그리고 cytochrome C.의 세포적 수준의 관찰로 GRS의 apoptotic 활성을 실험하였다. 비록 GRS가 BAX의 세포적 수준에는 영향을 미치지 못했지만 anti-apoptotic mediator Bcl-2 유도에는 영향이 있었고(도 10D) 세포 사멸에서 알려진 신호인 cytochrome C. 방출을 증가시켰다.(도 10E) 가열 불활성화 된 GRS는 어떠한 pro-apoptotic 효과를 발휘하지 못했고(도 3C와 D), 기본형태의 GRS는 pro-apoptoticactivity에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
GRS가 생리학적 환경에서 세포사멸을 유도하는지 알아보기 위해 Transwell 챔버에 항-GRS 항체를 넣거나 넣지 않은 채로 HCT116 와 U937를 공동배양 하였다. 그러나, α-GRS의 첨가는 U937세포의 생존률에서 GRS의 효과를 손상시켰다.(도 3E) 추가 실험에서 GRS는 인간폐포선암인 A549와 H460, HCT116, HeLa를 포함한 여러 가지 종양세포주의 생존률을 감소시켰다. 그러나 GRS는 MCF-7, neuroblastoma SH-SY5Y 세포, 인간 피부 섬유아세포(human skin fibroblasts : HSF), 인간태아신장(human embryonic kidney : HEK293), RAW 264.7 세포의 생존률에는 영향을 끼치지 못했다.(도 3F) 따라서, GRS는 암세포 특이적으로 pro-apoptotic 활성을 나타낸다.
6. 안티코돈 바인딩(Anticodon-binding) 도메인은 세포사멸에 영향을 미침
GRS의 pro-apoptotic 활성에 도메인이 미치는 영향을 확인하기 위해, 4개의 절편의 구조물을 나타내는 인간 GRS의 알려진 x-ray crystal 구조를 사용하였다.(도 11A와 11B) 4개의 절편들 중 3개의 가용성 형태(F2~4)를 얻었다. 낮은 안정성과 가용성 때문에 우리는 GRS의 N-terminal 절편을 얻는 데에는 실패하였다(F1). F2~4 절편들을 각각 HeLa와 RAW 264.7 세포에 첨가하였다. 150nM 농도의 GRS와 175 아미노산 C-terminal 안티코돈 결합 영역(ABD)은 HeLa 세포의 생존률을 감소시켰다. 이와 대조적으로 F2와 F3 절편은 GRS 또는 ABD의 활성을 비교할 수 없었다. 이러한 결과는 ABD가 GRS의 pro-apoptotic 싸이토카인 활성을 가지는 곳임을 나타낸다.(도 11C)
7. GRS의 기능적 수용체로써의 cadherin-6
분비된 N-terminal-truncated WRS가 혈관생성을 저해하기 위해 VE-cadherin과 결합하는 것을 감안하고(Tzima et al., 2005. J. Biol. Chem. 80,2405-2408), 여러 cadherins(CDHs)가 종양세포의 생존과 악성에 연관이 있음이 알려져 있으므로(Cavallaro and Chrostofori, 2004. Nat. Rev. Cancer 4,118-132), 우리는 GRS가 11가지 다른 CDH 단백질과 결합할 수 있는지 실험하였다. 개별적으로, 인간 IgG1의 Fc 절편과 융합하는 11가지 다른 cadherins의 세포외 영역과 His-GRS의 상호작용을 ELISA 어세이 법으로 확인하였다. 이 스크리닝은 GRS의 다른 CDH들을 제외한 CDH6 와 CDH18와의 특이적 결합을 확인하기 위한 것이었다.(도 4A) GRS의 CDH2을 제외한 CDH6 와 CDH18와의 결합 여부는 in vitro pull-down assay로 확인하였다.(도 4B)
GRS의 CDH6과 CDH18과의 결합 친화력을 표면 플라즈몬 공명어세이법(Surface plasmon resonance assay)으로 측정하였다. GRS는 CDH6와 CDH18에 각각 K D=3.4와 1.25nM 정도로 결합하였고(도 4C와 도 12A), IgG 단백질과는 결합하지 않았다.(도 12B) 다음 연구에서는, F2와 F3이 아닌 F4 절편으로 부호화된 ABD 영역에서만 CDH6과 결합하는 것을 pull-down 어세이로 확인하였다.(도 4D)
CDH6는 간암, 신장암, 작은 폐암세포(SCLC)의 병인과 연관이 있기 때문에 (Shimoyama et al., 1995. Cancer Res. 55,2206-2211; Li et al., 2005. Anticancer Res. 25,377-381), CDH6가 종양세포에서 GRS의 기능적 수용체로써 작용할 수 있는지 조사하였다. 우선 실험한 종양세포주 들 중에서 CDH6 단백질 발현 정도를 확인하였다. 우리는 CDH6 발현이 GRS-insensitive 암세포(MCF7, SH-SY5Y)에서는 그렇지 않으나 GRS-sensitive 암세포(HCT116, H460, HeLa)중에서 상향조절(up-regulated)됨을 확인했다.(도 4E) 웨스턴 블롯 분석(도 4F)과 flow cytometry를 이용하여 GRS와 HCT116과의 결합이 CDH6 전사가 비특이적 control si-RNA이 아닌 특이적인 si-RNA에 의해 억제 될 때 줄어듬을 확인하였다.(도 4G와 12C) 그리고 나서 CDH6의 가용성 세포외부 영역이 GRS의 apoptotic 활성을 상쇄시킬 수 있는지를 실험하였다. HCT116 세포 생존률에서, 가용성 CDH6 수용체 단백질의 첨가에 의해 GRS의 영향이 줄어드는 것을 확인하였다.(도 4H) 이러한 결과는 CDH6가 종양세포에서 GRS의 기능적 수용체임을 나타낸다.
8. ERK 활성 억제를 통한 GRS의 세포 사멸 유도
GRS 처리가 유도하는 세포 사멸 메커니즘을 조사하기 위해, HCT116 세포에 GRS를 처리하고 3 mitogen-activated 단백질 키나제인 ERK, p38 MAPK, JNK에서의 효과를 관찰하였다. 우리는 인산화 된 ERK와 p38 MAPK의 수준이 GRS 처리 용량과 시간에 따라 감소함을 확인하였고, JNK에서는 확인되지 않았다.(도 5A와 13A) ERK의 활성이 암세포의 증식과 생존과 연관되어 있음이 알려져 있기 때문에(Warner and Mclntosh, 2009. Mol. Cell 34,3-11), 우리는 암세포의 GRS에 대한 apoptotic 민감성이 ERK의 활성 상태에 의해 결정되는지 실험하였다. 흥미롭게도, GRS-sensitive HCT116, H460, HeLa 암세포들은 ERK의 인산화가 증가되어진 상태였고, 반면 GRS-insensitive SH-SY5Y 와 MCF7 암세포들은 그렇지 못했다.(도 5B) 이러한 결과는 ERK의 활성 상태와 암세포의 GRS 민감성과 양의 상관관계가 있음을 보여준다.
3종류의 GRS-sensitive 세포주 중에서, HCT116와 H460 세포는 ERK의 활성을 이끄는 KRAS 변이를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. Ras-Raf-MEK-ERK cascade는 암세포 증식과 활성에 중요한 신호경로이다(Roberts and Der, 2007. Oncogene 26,3291-3310). 따라서 우리는 종양 Ras 변이에 의한 ERK의 활성이 GRS 처리에 대한 apoptotic 민감성을 주는지 실험하였다. 이러한 목적으로, 일반적으로 GRS 처리에 무감각한 HEK293 세포를 선택하였다. 세종류의 Ras-active 돌연변이들(KRAS, HRAS, NRAS)을 HEK293으로 유도하고 확립된 세포주로 만들었다. 선택된 안정한 세포주들에서 감염된 Ras 돌연변이가 각각 발현되었고, 돌연변이 유도 후, ERK 인산화가 급격히 증가하였다. 세포주에 GRS를 처리하고 ERK 인산화에서의 효과를 관찰하였다. 3종류의 세포주에서, 현저하게 GRS는 ERK의 인산화를 억제하였다.(도 5C) GRS 처리가 Ras를 감염시킨 HEK293 세포의 생존률과 사멸에 영향을 미치는지 실험하였다. MTT 어세이와 flow cytometry를 사용하여, GRS 처리가 세포 생존을 억제하고 3종류의 Ras transfectants 사멸을 증가시킴을 확인하였다. 이와 대조적으로, control HEK293세포에서는 GRS 처리효과가 관찰되지 않았다.(도 5D와 13B). 이러한 결과는 활성화된 ERK의 탈인산화에 의해 GRS가 Ras-활성화된 종양세포의 apoptosis를 유도 할 수 있다는 가설과 일치한다.
CDH6에 의한 ERK 인산화의 음성적 조절(negative regulation)이 보편적으로 모든 세포타입에 적용되는지 실험하였다. 실험한 세포주들 중에서, HCT116, renal carcinoma SN12, breast carcinoma cell SK-BR-3, renal carcinoma Caki-1은 높은 수준의 CDH6과 인산화 된 ERK 발현을 보였다.(도 13C) 그러나, 신장암세포 RENCA과 섬유육종 세포주(fibrosarcoma cell line)HT1080에서는, 높은 수준의 ERK 인산화를 보였으나 CDH6는 검출할 수 없는 수준이었다. 이와 반대로, breast carcinoma cell line BT474에서는 높은 수준의 CDH6을 보였음에도 불구하고 ERK 인산화는 낮은 수준을 나타냈다. 덧붙여 HEK293 세포에 K-, N- 과 HRAS를 감염(transfection) 시킨 것은 CDH6의 세포적 수준에는 영향을 미치지 않았다.(도 13D) 이러한 모든 결과는 CDH6의 세포적 수준이 ERK의 활성과 직접적 연관이 없음을 나타낸다.
다양한 세포주에서 GRS 처리에 따른 apoptotic 스트레스에 대한 민감성을 테스트 하였다. 높은 수준의 CDH6과 ERK 인산화를 나타내는 세포들에서만 GRS-induced apoptosis에 민감성을 보였다.(도 5D) 높은 수준의 CDH6 단백질과 ERK 인산화의 GRS-induced apoptosis와의 상관과계는 8종류의 세포주로 확장 실험하였다.
ERK의 인산화는 upstream MEK 1과 2 키나아제 뿐만 아니라, 인산화효소(phosphatases)에 의해서도 조절된다(Keyse, 2000. Curr. Opin. Cell. Biol. 12,186-192; Gronda et al., 2001. Mol. Cell. Biol. 21,6851-6858; Wang et al., 2003. EMBO J. 22,2658-2667). 그러나 MEK의 인산화는 GRS처리에 의해 줄어들지 않는다.(data not shown) GRS가 인산화효소(phosphatases) 활성화에 의해 ERK 인산화를 억제시키는지 알아보기 위해, 4종류의 포스파타아제 저해제를 HCT116 세포에 처리하고 ERK의 GRS-유도 인산화에 얼마나 영향을 미치는지 확인하였다. 4종류의 포스파타아제 중에서 okadaic acid phosphatase 2A (PP2A) 저해제가 특히 ERK의 GRS-의존적 저해(GRS-dependent inhibition)를 막았다.(도 5E) GRS 처리는 CDH6과 PP2A 사이의 상호작용을 약화시키고(도 5F와 G), PP2A의 비활성화 형태인 PP2A의 인산화를 감소시켰다.(도 13E)(Chen et al., 1992. Science 257,1261-1264; Janssens and Goris, 2001. Biochem. J. 53,417-439). 부수적으로, PP2A와 ERK의 상호작용이 증가하였다.(Fig 5H). 이러한 결과로 GRS가 CDH6로부터 PP2A를 방출 시켜 PP2A의 활성을 유도하고, ERK를 탈인산화 시키는 것을 알 수 있다.
9. 생체 내(in vivo) 에서 GRS의 항-tumor 효과
GRS가 생체 내(in vivo)에서도 활성을 가지는지에 대한 가능성을 알아보기 위해 HCT116 세포를 이용한 이종이식모델에서 GRS를 테스트 하였다. 첫 번째 실험에서 HCT116 세포들을 Balb/C nude mice에 주입하고, 종양크기가 평균 100mm2 정도 될 때 까지 키웠다. 9일째, 종양세포에 Vehicle 단독 혹은 10㎍ 또는 20㎍의 GRS를 종양에 직접 주입하였다. 21일째 종양부피는 vehicle을 처리한 그룹에서 대략 2.5배 증가하였다. 대조적으로, GRS-주입은 투여량에 따라 종양부피가 감소하였다.(도 6A와 B) 종양무게는 10 ㎍ 와 20 ㎍의 GRS 처리 후 각각 56%와 34% 감소하였다.(도 6C) 마우스의 체중과 체형의 변화가 거의 없는 것은 GRS 투여에 따른 과독성이 발생하지 않았음을 나타낸다.(도 6B와 D) 면역형광 분석으로 종양에 20㎍의 GRS를 투여 한 것이 apoptosis를 유도하는지 알아보았다. control 조직에서 보다 GRS 처리한 종양 조직에서 더 많은 수의 Yo-Pro-1-positive 종양세포가 나타났다.(도 6E)
다음으로, 종양형성 초기단계에서 GRS의 효과를 실험하였다. nude mice에 HCT116 세포를 주입할 때 GRS(20㎍)와 함께 처리 또는 무처리 하였다. vehicle control에서 종양부피가 185mm2까지 증가하였고, 세포에 GRS가 함께 주입된 실험군에서는 종양이 성장하지 않았다.(도 6F와 G) Vehicle control과 비교해 볼 때, GRS 처리 후 종양의 무게는 46%까지 감소하였다. GRS 처리한 동물의 HCT116 세포에서apoptosis가 분명히 관찰되었다.(도 6J) 다시 한번, 마우스의 체중과 체형의 변화가 거의 없는 것은 GRS 투여에 따른 과독성이 발생하지 않는다는 것을 증명한다.(도 6G와 I)
GRS의 촉매영역(F2)이 아닌 ABD(F4)는 cell-based 어세이에서 apoptotic 활성을 유도하기에 충분하였다. 생체 내(in vivo)에서도 GRS의 두 개 영역 사이에서의 구별이 보이는지 알아보기 위해, Balb/C nude mice에 HCT116 세포를 20㎍의 촉매 영역 또는 ABD 절편과 함께 주입하였다. F4절편은 종양의 성장을 저해하였으나 F2는 그렇지 않았다.(도 14A와 B) GRS 단독으로 주입한 것과 비교할 때 종양 무게의 감소는 37%와 46% 였다.(도 14C) 두 개 절편 모두 주입 결과 거의 독성을 주지 않았다.(도 14D) 따라서, in vitro cell-based 어세이에서 보였던 ABD의 apoptotic 활성이 생체 내(in vivo)에서도 반복 확인되었다.
10. 생체 내(in vivo)에서 CDH6-의존적 항-종양 효과
CDH6 및 ERK의 인산화 마커를 도출하는 종양형성 세포는 생체 내에서 GRS의 anti-tumor 활성이 CDH6 의존적일 수 있는 가능성을 야기시켜, GRS에 의해 강한 apoptosis 활성이 유도되었다. 이러한 가능성을 실험하기 위해 신장암세포에서 GRS의 세포결합여부와 CDH6과의 관련성을 확인하였다. GRS는 CDH6의 높은 발현율을 나타내는 신장 암세포인 SN12와만 결합하고, 낮은 수준의 CDH6 발현율을 보이는 RENCA 세포와는 결합하지 않았고(도 7A와 C), 이것은 GRS의 활성은 CDH6의 발현정도에 의존적임을 나타낸다. 이러한 이해는 두 가지 세포주에서, 이종이식 모델을 사용한 GRS의 항-종양 활성 실험에 의해 확인되었다. SN12와 RENCA 세포를 nude mice에 이식하고 두 종류의 용량(2mg/kg와 6mg/kg)으로 GRS 단백질을 매일 1회, 총 4회 복막 주입하였다. 이 두 모델에서 GRS는 SN12의 성장만 저해하였고(도 7B), RENCA 세포 성장은 저해하지 못했다.(도 7D) SN12의 종양무게는 2 mg/kg와 6 mg/kg 용량의 GRS 주입 후, 각각 36% 와 58% 정도 감소하였다. 그러나 RENCA 의 종양무게는 같은 조건에서 오직 7% 와 15% 감소하였다.(도 7E) 동물의 체중변화가 거의 없는 것은 두 종류의 이종이식 마우스 모델에서 과독성이 발생하지 않았음을 나타낸다.(도 14E와 F) ERK를 처리한 상태에서 GRS의 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블롯팅으로 ERK의 인산화를 관찰하였다. SN12 이종이식 샘플에서, ERK의 탈인산화는 GRS 처리 그룹에서 확연히 관찰되었고(도 7F), GRS의 CDH6-의존적 apoptotic 활성은 in vitro에서 cell-based 어세이로 증명하고 in vivo에서 반복 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 GRS와 CDH의 신규한 용도로 암의 예방 및 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다양한 암 질환의 새로운 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (8)

  1. (a) 서열번호 1로 표시되는 GRS(glycyl tRNA synthetase) 또는 서열번호 2 또는 서열번호 11로 표시되는 이의 단편, 서열번호 12로 표시되는 CDH6(cadherin-6) 또는 서열번호 15로 표시되는 CDH18(cadherin-18) 및 시험제제를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 GRS와 CDH6 또는 CDH18의 결합 수준의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 백혈병, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 피부암, 림프종, 재생불량성 빈혈인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은
    (c) 상기 GRS와 CDH6 또는 CDH18의 결합 수준이 변화된 시험제제를 CDH6 또는 CDH18를 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 사멸여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서, CDH6 또는 CDH18를 발현하는 세포는 신장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포 및 대장암 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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