KR20090040364A

KR20090040364A - 포스포리파제 Ｄ 및 ＲＨＥＢ의 상호작용에 의한 포유류 라파마이신 표적 (ｍ-ＴＯＲ) 활성의 조절 방법

Info

Publication number: KR20090040364A
Application number: KR1020097004571A
Authority: KR
Inventors: 류성호; 서판길; 하상훈; 이미남; 이현주; 김일신; 김도형; 이태훈
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2009-04-23
Also published as: WO2008016282A1; KR101072504B1; US20090304667A1; US8168177B2

Abstract

본 발명은 포스포리파아제 D (PLD) 및 Rheb (Ras homolog enriched in brain)에 의한 mTOR 조절 메커니즘의 신규한 연구 결과에 기초한 포유류 라파마이신 표적 (mTOR) 조절 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 mTOR 억제제 검출방법, mTOR 억제제에 의한 mTOR 관련 대사성 질환의 치료용 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

포스포리파제 Ｄ 및 ＲＨＥＢ의 상호작용에 의한 포유류 라파마이신 표적 (ｍ-ＴＯＲ) 활성의 조절 방법{METHOD OF REGULATING MAMMALIAN TARGET-OF-RAPAMYCIN ACTIVITY BY INTERACTION BETWEEN PHOSPHOLIPASE D AND RHEB}

본 발명은 포스포리파아제 D (PLD) 및 Rheb (Ras homolog enriched in brain)에 의하여 포유류 라파마이신 표적 (mammalian target-of-rapamycin; mTOR)를 조절하는 메커니즘에 대한 신규한 연구 결과에 기초한 mTOR 조절 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 mTOR 억제제 검출방법, mTOR 억제에 의한 mTOR 관련 대사성 질환의 치료용 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

본 출원은 2006년 8월 4일자로 가출원된 미국특허출원 제60/821,542호의 전문을 우선권 주장하고, 상기 문헌을 본 명세서에 참조로서 포함한다.

mTOR은 세린/트레오닌 (serine/threonine) 단백질 키나아제의 일종으로, 그들의 촉매 영역의 서열 유사성에 기초하여, PI 3-키나아제 연관 키나아제로 명명된 신호화 단백질 신규 상과 (superfamily)에 속한다. mTOR 경로는 최근 대두된 암, 당뇨병, 비만, 과오종(hamartoma syndromes), 조직/기관 비대, 등의 치료를 위한 표적이다. 최근 연구는 이것의 꼬마선충(C.elegans) 및 초파리에서의 수명 조절의 매개체로서의 역할을 입증하였다. 이러한 경로의 중요성에도 불구하고, 여러가지의 생물학적 프로세스, 영양소에 의한 이것의 조절 메커니즘은 알려지지 않은 상태이다.

게다가, mTOR은 활성화에 지질 2차 전령 포스파티딘산 (PA)을 필요로 한다. PA는 PLD의 효소적 산물이다. PLD는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine;PC)을 가수분해하여 PA를 생성하는 것으로, 분열촉진 신호 (mitogenic signals)가 mTOR 경로에 영향을 미치는 매개가 되는 mTOR 상류 조절자(mTOR upstream regulators)의 또 다른 부류를 구성한다. 현재까지 동정된 포유류 PLD 이소자임, PLD1 및 PLD2은 신경전달물질, 호르몬 및 성장 인자와 같은 다양한 신호를 감지하여, 증식, 분비, 호흡 급증 (respiratory burst) 및 액틴 세포골격 재구성 등과 같은 복합 생리적 현상을 조절한다.

PA가 mTOR과 결합하고, mTOR19의 하류(downstream) 효과제(effectors)로 알려져 있는 S6K1과 4EBP1를 인산화시키는 작용을 활성화시킨다. 그러나, PA가 세포에서 mTOR을 활성화시키는 메커니즘은 알려지지 않은 상태이다. 최근, 본 발명자들은 PLD2가 mTOR/raptor 복합체와 특이적으로 기능적 복합체를 형성하여 분열촉진 신호를 변환함을 발견하여, PLD2 내의 TOS 모티프를 통한 랩터(raptor)와의 상호작용에 의하여 제공되는 바와 같은 mTOR 키나아제의 PLD2 활성화에 PA의 국부적 생성이 필수적임을 제안하였다 (Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291). 상기와 같은 mTOR/랩터 복합체를 위한 기능적 및 물리적 매개체로서의 PLD2의 동정을 기초로, 본 발명자들은 PLD2와 Rheb 간의 상호관련성을 시험하여 본 발명을 완성하였다.

발명의 요약

본 발명의 일 측면은 PLD 및 Rheb에 의한 mTOR 활성 조절의 메커니즘을 밝히는데 있다. 보다 상세하게는, mTOR 활성은 하기 단계에 의해 활성화될 수 있다;

1) PLD2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 것;

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산 (phosphatidic acid; PA)가 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 것; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 의하여 Rheb이 mTOR와 결합하여, mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 것.

상기에 기초하여, 본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계 중 하나 이상의 단계를 조절함으로써 수행되는 mTOR 활성 조절 방법을 제공하는 것이다:

1) PLD2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계;

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산 (phosphatidic acid; PA)이 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 단계; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 의하여 Rheb이 mTOR와 결합하여, mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 mTOR 활성 저해제 검출 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 mTOR 활성 저해제 검출 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

후보 물질을 시료 세포에 접촉시키는 단계;

PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR에 결합할 수 있도록 하는 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용을 측정하는 단계; 및

상기 후보 물질의 접촉이 없는 시료 세포에서와 비교하여, PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 수준이 감소할 때, 상기 후보 물질을 mTOR 활성 저해제로서 결정하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 mTOR 관련 대사성 질환 치료제의 탐색용 표적으로 서 사용 가능한 전장 PLD2의 476 번째부터 612 번째까지의 아미노산 서열을 제공하는 것으로, 이 때 상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 mTOR 활성을 저해시킴으로써, mTOR 관련 대사성 질환을 치료하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

상기 치료 방법은 하기의 단계 중, 하나 이상의 단계를 억제함으로써 mTOR 관련 대사성 질환을 치료하는 방법일 수 있다 :

상기 조성물은 mTOR 억제제의 유효량을 활성 성분으로 포함할 수 있다.

mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등을 포함할 수 있다.

이하, 상세한 설명을 참조로 하여 본 발명을 더 잘 이해할 수 있으며, 동시에 본 발명의 보다 완전한 이해와 그것의 수반된 많은 이점이 쉽게 분명해질 것이다.

본 발명자들은 mTOR/raptor/PLD2/Rheb 복합체가 류신이 풍부한 조건에서 안정화되고, PLD2는 Rheb 결합에 의해 활성화되며, 생성된 PA는 Rheb의 mTOR와의 결합을 증가시키고, 최종적으로 mTOR이 활성화된다고 생각하였다. 이와 같은 생각은 하기하는 바와 같이 실험적으로 입증되었으며, 이를 통하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 mTOR 시그널링의 조절 메커니즘을 연구하였고, 세포 성장의 적절한 조절을 위한 상류 시그널 (upstream signals)에 대한 반응에 랩터 및 GβL을 포함하는 mTOR 복합체(mTOR/raptor)의 관여함을 확인하였다. 이러한 인슐린 및/또는 영양소로부터 유래되는 상류 시그널은 결절 경화증 복합체 1/2 및 Rheb에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 게다가, mTOR의 활성화에 지질 2차 전령 포스파티딘산 (PA)이 필요하다. 본 발명은 mTOR 활성의 조절제, 및 이들 간의 물리적/기능적 연결을 확인하고, 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군, 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등과 같은 mTOR 관련 대사성 질환에 대한 추가적 통찰을 제공한다.

정의(Definition)

'mTOR'은 포유류 라파마이신 표적(mammalian target-of-rapamycin)을 의미한다. 본 발명에 있어서, mTOR은 인간을 포함한 포유류에서 유래하는 것일 수 있고, 유래 종(source species)에 따른 그 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명에 있어서, mTOR은 예를 들어, 인간 (Homo sapiens, NP 004949))과 같은 포유류, 초파리(Drosophila melanogaster, NP524891)), 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans, Q95Q95)) 등으로부터 유래하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 mTOR을 사용할 수 있다.

본 발명에서 'PLD'는 포스포리파아제 D(phospholipase D)를 의미하며, 포유류 PLD 이소자임은 PLD1 및 PLD2의 두 종류를 포함한다. 본 발명에서 PLD는 인간을 포함하는 모든 포유류로부터 유래한 것일 수 있고, 유래 종(source species)에 따른 PLD의 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 PLD1 (NM 030992, Rattus norvegicus 유래); 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 PLD2 (NM 002663, Homo sapiens 유래)를 사용할 수 있다.

'PA'는 PLD의 효소적 산물의 하나인 포스파티딘산(phosphatidic acid)을 의미한다. mTOR의 활성화를 위하여 지질 2차 전령 포스파티딘산 (PA)이 필요하다.

'Rheb'는 'Ras homolog enriched in brain'을 의미한다. 본 발명에서, 랩터(raptor)는 인간, 마우스(mouse) 등을 포함하는 포유류로부터 유래한 것일 수 있고, 유래 종(source species)에 따른 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 랩터는 인간 유래의 것일 수 있고, SEQ ID NO: 4 (Accession No. NP 065812)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

'랩터(raptor)'는 mTOR의 조절 관련 단백질을 의미한다. 본 발명에서, 랩터는 인간을 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있고, 유래 종에 따른 아미노산 서열은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 랩터는 인간 유래의것일 수 있고, SEQ ID NO: 5 (Accession No. Q8N122)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 한 측면은 PLD 및 Rheb에 의한 mTOR 활성 조절의 메커니즘을 밝히는 것과 관련 있다. 보다 상세하게, mTOR 활성은 하기 단계에 의해 활성화될 수 있다;

1) PLD2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 Rheb가 PLD2를 통하여 mTOR 와 결합하는 것;

2) PLD2로부터 생성된 PA (phosphatidic acid; PA)가 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 포스파티딘산의 농도가 증가하는 것; 및

상기 메커니즘은 도 23에 모식적으로 나타내었다. 따라서,상기의 단계 1) 내지 3) 중 하나 이상의 단계를 조절함으로써, mTOR 활성을 조절 또는 저해시킬 수 있다.

Rheb와 mTOR와의 결합은 GTPγS의 존재 하의 PA에 의하여 강화될 수 있으므로, PA 또는 GTPγS를 제거시킴으로써 상기 결합을 저해시킬 수 있다. 또한, PLD2와 Rheb 간의 상호 작용은 영양 수준, 바람직하게는 아미노산 농도, 보다 바람직하게는 류신의 농도에 의해 조절할 수 있고, 이러한 상호 작용은 고영양 조건하에서 안정화되며, 저영양 조건하에서 약화된다. 그러므로, PLD2와 Rheb 간의 상호 작용은 영양 수준, 바람직하게는 아미노산 농도, 보다 바람직하게는 류신의 농도를 감소시킴으로써 저해시킬 수 있다. 이와 유사한 방식으로, 영양 수준에 의하여 PLD2가 mTOR에 결합하는 것을 매개하는 랩터와 PLD2 간의 상호 작용을 또한 조절하여, 도 19에서 나타나는 바와 같이, mTOR, 랩터, PLD2, 및 Rheb로 구성되는 영양 의존적 mTOR 복합체를 형성할 수 있도록 할 수 있다.

상기에 기초하여, 본 발명의 또 다른 측면은 하기의 단계 중 하나 이상의 단계를 조절함으로써 수행되는 mTOR 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다:

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산 (phosphatidic acid; PA)가 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 단계; 및

상기 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계는 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용을 조절 또는 저해시킴으로써 조절 또는 저해될 수 있다. PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 조절 또는 저해는 PLD2의 Rheb 결합 부위 및/또는 Rheb의 PLD2 결합 부위를 변형시킴으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, PLD2의 Rheb 결합 부위는 전장 PLD2의 476번째 아미노산부터 612번째 아미노산까지의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 저해는 상기 PLD2의 Rheb 결합 부위를 변형시킴으로써 수행할 수 있고, 상기 변형은 전장 PLD2의 476번째 아미노산부터 612번째 아미노산까지의 아미노산 잔기들로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 결실시키거나, 상기 아미노산 잔기들로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것일 수 있다. 다른 방법으로, PLD2의 Rheb 결합 부위의 변형은 pH 또는 온도 등의 변화에 의해 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 mTOR 저해 방법에 의하여 리보솜 단백질 S6 키나아제 1 (S6K1; 예컨대, NP 003152, NP 082535, 등), 및 4E-결합 단백질-1 (4EBP1; 예컨대, NP 004086)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 mTOR 효과기(effector) 상의 mTOR의 인산화 활성이 저해된다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 활성 저해제 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 mTOR 활성 저해제 검출 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

후보 물질을 시료 세포에 접촉시키는 단계;

PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR에 결합할 수 있도록 하는 PLD2와 Rheb 간의 상호작용을 측정하는 단계; 및

상기 시료 세포는 PLD, 보다 바람직하게는 PLD2를 발현할 수 있는 모든 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 시료 세포는 인간 배아 신장 세포(HEK293), 인간 상피성 난소암 세포(OVCAR-3), COS7 세포, 인간 경부암 (HeLa) 세포, 인간 대장암 세포(PC-3), 인간 유방암 세포(MB231), 인간 간암 세포(HepG2), 인간 유방암 세포(MCF-7), 인간 T-세포 백혈병 세포(Jurkat) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 mTOR의 저해제는 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등의 mTOR 관련 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 또한, 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 mTOR 관련 대사성 질환에 대한 치료제 검출에도 사용될 수 있다.

PLD2와 Rheb 간의 상호 작용은 모든 통상적인 방법으로 측정 가능하며, 예컨대, 면역침전법 등으로 측정 가능하지만, 같은 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 관련 대사성 질환의 치료제 검출을 위한 표적 폴리펩타이드로서, 전장 PLD2의 476 번째 아미노산부터 612 번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 제공하는 것이다. 이 때, 상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 mTOR 활성을 저해시킴으로써, mTOR 관련 대사성 질환을 치료하는 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

상기 mTOR 관련 대사성 질환의 치료 방법은 하기의 단계 중 하나 이상의 단계를 억제함으로써 수행되는 것일 수 있다:

1) PLD2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD 2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계;

2) PLD2로부터 생산된 PA가 mTOR 인접부 이동하여 mTOR 인접부의 PA 농도가 증가하는 단계; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 기인하는 Rheb와 mTOR와의 결합에 의한 mTOR 키나아제 활성의 활성화.

보다 상세하게는, 상기 mTOR 관련 대사성 질환의 치료 방법은 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용을 저해시킴으로써 Rheb이 PLD2를 통하여 mTOR와 결합하는 것을 저해하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 치료 방법은 PLD2의 Rheb 결합 부위를 불활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. PLD2의 Rheb 결합 부위의 불활성화는 상기한 바와 같다. 다른 방법으로, 상기 치료 방법은 유효 성분으로서 mTOR 활성 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 mTOR 억제제는 본 발명에 따른 검출 방법에 의하여 검출된 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로서 mTOR 억제제의 유효량을 포함하는 것일 수 있다. mTOR 활성 억제제는 상기한 3 단계 중 하나 이상의 단계를 억제하는 활성을 갖는 모든 물질일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, mTOR 활성 억제제는 PLD2가 Rheb와 결합하지 못하도록 함으로써, 상기한 바와 같이, PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 것을 억제하는 활성을 갖는 모든 물질일 수 있다. 다른 예에서, mTOR 활성 억제제는 상기한 바와 같은 본 발명의 검출 방법에 의해 검출된 물질일 수 있다.

상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서, PLD2는 Rheb와 직접적으로 상호 작용하며, 이는 PLD2 활성화에 매우 중요하다는 것이 밝혀졌다. 중요하게도, 이러한 기능적 연결은 Rheb가 mTOR/랩터 복합체와 결합하는 것을 증가시키고, PA는 mTOR 키나아제 활성의 Rhheb 활성화를 증가시킨다. 그러므로, PLD2와 Rheb는 협력하여 영양-유도(nutrient-induced) mTOR 시그널링을 조절한다는 제안이 가능하다.

상기 결과에 기초하여, 랩터(raptor)가 PLD2와 결합하고, 이에 의하여 Rheb-유도 PLD2 활성화를 통한 mTOR 인접부의 PA 축적이 가능해져야 함이 Rheb의 mTOR과의 PA-의존적 결합을 통한 Rheb에 의한 mTOR 활성화의 전제 조건임을 제안하는 가설 모델이 상정 가능하다. 도 23에 이러한 모델을 도식적으로 나타내었다. PLD2와 Rheb 간의 상호 작용이 PLD2와 랩터와의 결합에 선행되어야 하는지는 불명확하다 하더라도, PA 생성 또는 PLD2 발현을 감소시킬 때 랩터/mTOR 상호작용이 제어되지 않았으므로, mTOR/랩터에 대한 밝혀지지 않은 신호가 직접적으로 PLD2/Rheb이 랩터에 결합하도록 할 가능성도 있다.

PLD2 뿐만 아니라 PLD1도 mTOR 경로를 활성화시킨다. 그러나, mTOR은 PLD2와만 상호 작용하는 것으로 보이며, 이는, 가능하게는 Cdc42/S6K1 시그널링을 통하여, mTOR 경로의 PLD1 의존적 활성화를 위한 또 다른 경로가 존재함을 의미하는 것이다. 본 발명에서는 또한 mTOR 시그널링에 대한 PLD1의 침묵효과 (silencing effect)가 PA 처리에 의하여 완벽하게 보상되지만, PLD2의 침묵의 경우에는 그렇지 않은 것으로 나타나서, PLD1과 PLD2 간에 명백한 차이점이 있음을 제안한다. mTOR 시그널링에서 PLD1의 역할은 PA 생성만으로도 매개될 수 있다. 이는 또한 이러한 효과를 매개하는데 mTOR의 다른 PA 표적 상류(upstream)가 필요할 수 있음을 의미하는 것이기도 하다. PLD1은 포스포이노시티드 4-포스페이트 5 키나아제(phosphoinositide 4-phosphate 5 kinase)를 통해서 PLD2에 신호를 보내기 때문에, PLD2는 PLD1의 조절 하에 있는 것일 수 있다.

PA는 분열촉진 시그널에 의해 생성되는 지질 2차 전령으로서 알려져 있다. 하류 효과기의 동정을 의하여, 다양한 PA-결합 단백질이 발견되었다. 이들은 mTOR 뿐 아니라, Raf-1, 스핑고신 키나아제 1(sphingosine kinase 1), 포스파타아제 PP2A(phosphatase PP2A), 및 포스포디에스테라아제 4A1 (phosphodiesterases 4A1)을 포함한다. 그러나, 이러한 효과에 대한 PA의 작용 메커니즘은 더 연구되어야 하는 상태이다. 본 발명에 있어서, 다른 PA 결합 단백질의 조절에 있어서의 PLD2의 역할을 시험하는 것이 중요하다.

mTOR 경로가 세포 영양 상태에 의하여 조절되는 분자적 메커니즘과 이러한 경로의 장애가 어떻게 암, 당뇨병, 비만, 심장 비대증을 포함하는 조직/기관 비대증, 프로테우스 증후군(Proteus syndrome), 코우덴 병(Cowden disease), 포이츠-예거스 증후군 (Peutz-Jeghers syndrome), 결절성 경화증 복합(tuberous sclerosis complex) 등을 포함하는 과오종 증후군(hamartoma syndrome) 등과 같은 대사성 질환을 유발시키는지에 대한 이해가 중대하게 요구된다. 본 발명에서 발견한 상기 내용들은 이러한 이해의 달성을 향한 첫 번째 단계일 수 있다. 이는 mTOR 경로의 Rheb 매개 조절을 확인함으로써 뒷받침되어질 수 있다. PLD2의 Rheb와의 상호 작용은 영양이 풍부한 조건에서 안정화된다. PLD2의 raptor와의 상호 작용 또한 영양이 풍부한 조건에서 안정화된다. 이러한 두 상호 작용은 영양-유도 mTOR 활성화을 위한 조절점으로 여겨질 수 있다. 분자적 메커니즘의 확인은 영양분이 mTOR 복합체에 대하여 어떻게 영향을 미치는지에 대한 중요한 이해를 제공할 수 있다.

전립선 암 (prostate cancer) 및 유방암(breast cancer)을 포함하는 다양한 암 조직 및 종양에서 PA 생산이 증가하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 경우에서, PA 생산의 증가는 PLD의 과발현과 연관되어 있다. 그러나, 이것이 종양형성과 어떻게 관련되어 있는지에 관한 메커니즘은 알려진 바가 없다. 본 발명에서 mTOR 시그널링에서의 PLD2의 역할에 대하여 확인된 사항은 PLD2-매개 종양 형성을 위한 잠재적인 분자 메커니즘을 제안한다.

mTOR 시그널링은 대사성 질환에 대한 중요한 조절자로서 알려져 있다. 인슐린 수용체 기질-1 (IRS-1)은 mTOR 시그널링을 대한 새롭게 확인된 효과제이다. IRS-1의 분해 및 잘못된 위치화에 의하여 매개되는 세린 인산화를 통한 IRS-1의 오기능(malfunction)은 인슐린-유도 글루코스 섭취와 같은 정상 인슐린 시그널링을 언커플링하였다. PLD2와 Rheb에 의한 mTOR 시그널링의 비제어된 조절은 mTOR-의존적 IRS-1 오기능(malfunction)과 관련된 것일 수 있다.

상기 내용을 고려할 때, mTOR 시그널링의 매개자로서의 PLD2와 Rheb의 확인은 PLD2가 영양-조절된 mTOR 시그널링을 위한 중요한 분자적 연결 역할을 하고, 이에 의하여 대사성 질환의 치료를 위한 타겟이 될 수 있는 신규한 조절점을 제공할 수 있음을 제안한다.

도 1은 넉다운 (knockdown) PLD1 및/또는 PLD2로부터의 얻어진 면역블로팅 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 넉다운(knockdown) PLD1, PLD2 및/또는 Rheb로부터 얻은 포스파티딜-부탄올 형성(PBt formation) 수준을 나타낸 것이다.

도 3은 PLD2 또는 PLD1로 형질감염된 HA-Rheb^wt 부터 얻은 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 PLD2 발현 세포 용해물을 이용한 GST-pull down 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5의 상부 패널은 PLD2 단편을 도식적으로 나타낸 것이고, 하부 패널은 PLD2 조각 단편을 이용한 GST-pull down 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 PLD2 단편, 2F3 및 2F2를 이용한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 항- mTOR 항체에 대한 복합면역침전법(co-IP (immunoprecipitation)) 의 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 다양한 PLD 변이체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의하여 측정된 결합된 랩터 및 PLD2 (bound raptor and PLD2)의 수준을 나타낸 것이다.

도 9는 mTOR/raptor 복합체에서의 항-HA 항체에 대한 IP 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 GFP-2F3 또는 GFP-2F2로 형질감염된 HA-Rheb^Q64L에서의 항-HA 항체에 대한 co-IP 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 항-myc 면역침전법을 이용한 mTOR 키나아제 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 1-부탄올, t-부탄올, 포스파티딘산 및 라파마이신 각각으로 처리된 형질감염된 HA-RhebQ64L에서의 IP 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 GDPβS 또는 GTPγS 존재하에서 PA에 의해 GST-Rheb의 mTOR 복합체와의 결합으로부터 얻은 IP 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 14는 myc-mTOR 형질감염체에 대한 시험관 내 mTOR 키나아제 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 15는 HA-mTOR^wt와, myc-Rheb^wt 또는 myc-Rheb^D60I으로 형질감염된 COS7 세포 에서의 시험관 내 mTOR 키나아제 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 16은 류신의 존재 또는 부재 하에서의 PBt 형성 수준을 나타낸 것이다.

도 17은 류신의 존재 또는 부재 하에서 COS7 및 HEK293 세포에서의 항-mTOR 항체를 이용한IP 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 18은 류신 처리 후 HA-raptor^wt/PLD2^wt 형질감염체에서의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 19는 류신 처리 후 HA-Rheb^wt/PLD2^wt 형질감염체에서의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 20은 류신 처리 후 PLD2 siRNA 형질감염체에서의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 21은 GFP-2F3 또는 GFP-2F2 중 하나로 형질감염된 HA-Rheb^Q64L에서의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 22는 다양한 PLD2 변이체의 형질감염 후의 세포 크기에서의 변화를 나타낸 것이다.

도 23은 영양소-유도(nutrient-induced) mTOR 활성에서의 PLD2와 Rheb와의 협력을 보여주기 위한 작용 모델로서, mTOR 신호의 Rheb 활성화에서의 PLD2의 역할을 설명하는 것이다.

본 발명을 하기 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 설명한다, 그러나 본 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 재료의 준비

강화 화학발광 키트(chemiluminescence kit), glutathione-Sepharose 4B 및 디팔미토일포스파티딜(dipalmitoylphosphatidyl) [methyl-³H] 콜린 (choline)을 Amersham Biosciences에서 구입하였다. 호스라디시 페록시다제 (Horseradish peroxidase)-접합 염소 항-토끼 IgG와 염소 항-마우스 IgA/M/G는 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (Gainthersburg, MD)로부터 얻었다. ‘Park, J.B. et al. Cardiac phospholipase D2 localizes to sarcolemmal membranes and is inhibited by alpha-actinin in an ADP-ribosylation factor-reversible manner. J. Biol. Chem. 275, 21295-21301 (2000)´와 ‘Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276, 28252-28260 (2001)´ (상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 포함됨)에 기재된 바와 같이, PLD에 대한 다클론성 항체가 생성되었다.

mTOR, pS6K1 (pThr 389), S6K1 및 라파마이신(rapamycin)에 대한 항체들은 CeCell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 제공받았다. Rheb 항체는 SaSantaCruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 제공받았다. 다클론성 렙터 항체(Polyclonal raptor antibody)는 김도형 박사(미네소타 대학)로부터 제공받았다. 단백질 A-세파로즈는 RepliGen (Needham, MA)에서 제공받였다. CHAPS, 류신 및 류신 미첨가 RPMI-1640 배지는 Sigma(St.Louis, MO)로부터 제공받았다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 리포펙타민 (LipofectAMINE)은 Invitrogen(Carlsbad, CA)로부터 제공받았다. C-6 포스파티딘산은 Avanti (Alabaster, AL)에서, 재조합 4EBP1은 Stratagene(La Jolla, CA)에서 제공받았다.

하기의 실시예에서 사용된 세포 및 벡터는 특별한 언급이 없는 한 Invitrogen사로부터 제공받은 것을 사용하였다.

실시예 2 : 플라스미드의 제조

‘Park, J.B. et al. Cardiac phospholipase D2 localizes to sarcolemmal membranes and is inhibited by alpha-actinin in an ADP-ribosylation factor-reversible manner. J. Biol. Chem. 275, 21295-21301 (2000)´및‘Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276, 28252-28260 (2001)´에 기재된 바와 같은, PLD1^wt, PLD2^wt, PLD2^DN184, PLD2^DN308, PLD2^K758R 및 EGFP-PLD2^wt의 포유류 발현 벡터들 및 GST-태깅된 PLD2 단편의 박테리아 발현 벡터를 사용하였다.

HA-mTOR^wt, myc-mTOR^wt, myc-raptor^wt, HA-raptor^wt 및 HA-raptor^194YDC/AAAmt의 발현 벡터는 David M. Sabatini 박사 (MIT)로부터 제공받았다 (Kim, D.H., et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell 110, 163-175 (2002)). Rheb의 포유류 발현 벡터 및 GST-Rheb, GST-Rap1, 및 GST-R-Ras의 박테리아 발현 벡터는 Ariel F. Castro 박사(Indiana University, USA)로부터 제공받았다. PLD2로 TOS-motif 돌연변이를 도입시키기 위해, 야생형 (wild type) PLD2를 포함하는 pCDNA3.1(+)/PLD2를 하기의 올리고머를 이용하여 PCR 증폭하였다;

정방향(sense) (5' GGC CGA GAC CAA GTT TGT TAT CGC3' SEQ ID NO: 6), 역방향(antisense) (F265A:5' CCA TCG ATC CGC ACG CCG TGC CGT GCC TCC GTG CTC CTT TTC CCC ACT TGC ACC TCA GCG CCA GG3´; SEQ ID NO: 7), 역방향(antisense) (E266R:5' CCA TCG ATC CGC ACG CCG TGC CGT GCC TCC GTG CTC CTT TTC CCC ACT TGC ACC CTA AAG CCA GG3'; SEQ ID NO: 8).

PCR에 의해 생성된 DNA 단편 및 pCDNA3.1(+)/PLD2(WT)를 XhoI 및 Cla I로 처리하였다. 주형으로서 myc-Rheb를 사용한 표준 PCR 클로닝 방법을 사용하여 His-Rheb를 생성하였다. Rheb의 PCR 단편들을 pRSET-B 벡터의 BamHI/EcoRI 부위 내로 in frame 서브클로닝하였다. 모든 돌연변이 구조체를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. myc-S6K1, myc-4EBP1 및 HA-raptor 단편 (HA-raptor^1-646, HA-raptor^1020-1335, HA-raptor^647-1335, HA-raptor⁶⁴⁷ ^-1019)의 포유류 발현 벡터는 David M. Sabatini 박사(MIT)로부터 제공받았다. N-말단이 결실된 PLD2 단편은 다음의 참고 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 사용하였다 (Park, J.B. et al. Cardiac phospholipase D2 localizes to sarcolemmal membranes and is inhibited by alpha-actinin in an ADP- ribosylation factor-reversible manner. J. Biol. Chem. 275,21295-21301 (2000), 본 명세서에 참조로서 포함됨). 박테이라 발현용으로 사용되는 GST-융합 PLD2 단편은 다음의 참고 문헌에 기재된 바와 같이 준비하였다 (Park, J.B. et al. Cardiac phospholipase D2 localizes to sarcolemmal membranes and is inhibited by alpha-actinin in an ADP-ribosylation factor-reversible manner. J. Biol. Chem. 275，21295-21301 (2000) and "Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276, 28252-28260 (2001), 본 명세서에 참조로서 포함됨).

실시예 3 : RNA 간섭(interference)

21-뉴클레오타이드 정방향 및 역방향 RNA 올리고머 쌍들은 Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO)에 의해 합성 및 어닐링된 것을 사용하였다 (Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨).

PLD2에 대하여 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:

sense, 5'-AAG AGG UGG CUG GUG GUG AAG-3' (SEQ ID NO: 9) 및

antisense, 5'-CUU CAC CAC CAG CCA CCU CUU-3'(SEQ ID NO: 10),

상기 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 703-723을 코딩하는 인간 PLD2 에 해당한다. 모든 siRNA 서열은 NCBI 데이터베이스의 BLAST를 거쳐, PLD2 서열에 대하여 완전하게 매치되는 것들이 확인되었다. 루시페라제 GL2 듀플렉스를 Dharmacon Research, Inc.로부터 구입하였고, 음성 대조군으로 사용하였다. shRNA-코딩 렌티바이러스 플라스미드는 pLKO 벡터를 사용하여 5'-GAGGACACTGGGAATATATTC -3' (SEQ ID NO: 11)의 인간 Rheb mRNA 서열을 타겟팅하도록 구축되었다.

PLD2 침묵(silencing)에 대한 실험(add-back experiment)을 위하여, 인간 PLD2 cDNA (PLD2의 뉴클레오타이드 703-723; AAGAGGTGGCTGGTGGTGAAG, SEQ ID NO: 12)의 3 개의 잔기 (밑줄)를 치환하여 PLD2^wt addback 변이체를 위한 'AAGAGATGGCTAGTAGTGAAG'으로 만들었다. 이 돌연변이는 침묵 돌연변이이다. 이 유전자를 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen)으로 서브클로닝하고, 제한 효소 KpnI 및 XbaI으로 분해하였다. 이러한 돌연변이는 뉴클레오타이드 서열 분석을 통해 확인하였다.

실시예 4. 세포 배양 및 플라스미드/siRNA 감염(transfection)

COS7 세포 (ATCC, CRL-1651)를 37℃, 5% CO₂ 습윤 대기 하에 두고 10% 우아 혈청 배양액 (HyClone)이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. HEK293 세포 (ATCC : CRL-1573)를 10% 우태 혈청 배양액 (HyClone)이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. 하기의 참고 문헌에 기재된 바와 같이, 조직 배양 디쉬(dish)에서 증식된 세포를 LipofectAMINE을 사용하여 일시적으로 감염시켰다 (Park, J.B. et al. Cardiac phospholipase D2 localizes to sarcolemmal membranes and is inhibited by alpha-actinin in an ADP-ribosylation factor-reversible manner. J. Biol. Chem. 275，21295-21301 (2000) and Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276, 28252-28260 (2001), 본 명세서에 참조로서 포함됨). 세포를 감염 후 24시간 동안 재조합 단백질을 발현시키도록 두고, 추가 24시간 동안 혈청이 없는 상태에서 배양시켰다. 그리고 난 후, 세포에 대하여 류신 제거(deprivation), 복합 면역 침전법, 또는 GST pull-down 분석을 수행하였다. 류신 제거는 상기한 바와 같이 수행하였다. 약술하면, 처음 24시간동안 세포로부터 혈청을 제거한 후, 류신 무첨가 RPMI 1640 배양액에서 류신 제거를 수행하였다.

실시예 5 : 복합 면역 침전법

COS7 세포 수확 후, ice-cold 용해 완충 용액 (40mM HEPES pH7.5, 120mM 염화나트륨, 1mM EDTA, 10mM 피로인산염, 10mM 글리세로인산염, 50mM NaF, 1.5mM 소듐오르토바나데이트, 0.5% CHAPS, 1mM PMSF, 프로테아제 억제제 칵테일)에서 간단히 소니케이션하여 전체 추출물을 제조하였다. 정제된 추출물을 각자의 항체 2μg과 혼합하였다. 그리고 나서, 단백질 A-세파로스 비드(beads)를 첨가하여 항체 복합체를 분리하였다. 용해 완충 용액으로 4회 세척 후, 최종 면역 침전물을 세척 완충 용액 (50mM HEPES pH7.5, 150mM 염화나트륨)으로 1회 세척하고, Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech), 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Watmann), Power supply (Amersham Pharmacia Biotech), Electrophoretic Transfer unit (Hoefer Scientific Instruments), 및 ECL^TM (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다.

실시예 6 : 시험관 내 ( in vitro ) 결합 분석

대장균 (E. coli, Invitrogen)에서 발현된 GST 융합 단백질 (PLD2 fragments, GST-Rheb, GST-Rap1, 및 GST-R-Ras)를 글루타치온-세파로스 4B 비즈(beads)를 사용하여 분리하고, PLD2 또는 HA-Rheb^wt유전인자를 딴자리(ectopically) 발현하는 세포 용해물과 함께 배양하였다. 4℃에서 2시간 동안의 배양 후, 비즈를 세척하고, SDS-PAGE를 수행하였다. E. coli과 COS7 세포를 복합 면역 침전용으로 사용된 용해 완충 용액으로 용해시켰다. 하기의 문헌에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘(His6)-태깅된 PLD2를 킬레이팅 세파로스 친화력 컬럼 크로마토그래피에 의하여 바큘로바이러스-감염된 Sf9 세포 (Invitrogen)의 계면활성제 (detergent) 추출물로부터 정제하였다 (Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J．Biol．Chem． 276，28252―28260（2001），본 명세서에 참조로서 포함됨). 상기에 설명한 바와 같이, 재조합 단백질 (GST-Rheb, GST-2F3, GST-2F2, 및 His-Rheb)을 GSH 또는 니켈을 사용하여 친화성 정제 후, 추가로 용출시켰다. 시험관내 결합 분석은 ice-cold 용해 완충용액(10% 글리세롤을 포함하는 것을 제외하고 복합 면역 침전에 사용된 것과 동일)에 서 수행하였다 .

실시예 7 : 웨스턴 블롯 분석

8-16% 농도구배 겔 상에서 SDS-PAGE하여 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시키고, 5% 탈지 우유 가루를 함유하는 TTBS 완충용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.6, 150mM 염화나트륨, 및 0.05% Tween-20)으로 차단시켰다. SDS-PAGE는 하이퍼필름 (Amersham Pharmacia Biotech), 니트로셀룰로오스 멤브레인 (Watmann), 전력 공급기 (Amersham Pharmacia Biotech), 전기영동 변환 장치 (Hoefer Scientific Instruments) 및 ECL^TM (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 수행하였다. 멤브레인은 상온에서 4시간 동안 제조자 제안 농도에서 1차 항체와 함께 인큐베이팅하였다. TTBS 완충 용액으로 미결합 항체를 씻어내었다. 이어서, 멤브레인을 horseradish peroxidase가 접합된 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하고, TTBS 완충 용액으로 5회 세척하였으며, ECL 시스템을 이용하여 전개시켰다.

실시예 8 : 생체 내 PLD 분석

생체 내 PLD 활성 (In vivo PLD activity)은 포스파티딜-부탄올의 생성을 측정하여 분석하였다 (Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276， 28252-28260 (2001) and "Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨).

간단히 요약하면, 세포를 [³H] 미리스틴산 (2μCi/ml)과 함께 8 시간 동안 로딩시킨 후, DMEM으로 2회 세척하였다. 표지된 세포를 0.4% 부탄올과 함께 10분 동안 배양하여 기본 PLD 활성을 측정하였다. 메탄올 : 1M 염화나트륨 : 클로로포름 (1:1:1 부피비) 용액 1.2ml을 이용하여 전체 지질을 추출하고, 실리카 겔 플레이트상의 박층크로마토그래피로 분리하였다. 생성된 [³H]포스파티딜-부탄올의 양은 총 [³H] 지질의 백분율로서 나타내어, 세포 표지(cell labeling) 효율성 차이를 계산하였다.

실시예 9 : mTOR 활성의 시험관 내 키나아제 분석

재조합 myc-mTOR은 하기 문헌에 표시된 단백질과 함께 발현시키고, 항-myc 항체를 사용한 면역침전법을 수행하였다 (Lee, S. et al. Actin directly interacts with phospholipase D, inhibiting its activity. J. Biol. Chem. 276, 28252-28260 (2001) 및 Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨). 재조합 4EBP1 (Stratagen)를 시험관 내 키나아제 분석용 기질로서 사용하였다. 활성은 항-포스포-4EBP1 항체(phosphor-37/46)를 이용하여 측정하였다. 키나아제 분석은 25mM Hepes pH7.4, 50mM 염화칼륨, 10mM 염화마그네슘, 4mM 염화망간, 20% 글리세롤, 2mM DTT, 0.1mM ATP, 1μg 4EBP1를 포함하는 완충용액을 면역침전물과 혼합한 후 30℃에서 15분 동안 배양하여 수행하였다.

실시예 10 : PLD2 와 Rheb와의 상호 작용 측정

지금까지 PLD2 와 Rheb 간의 상호작용에 대하여 보고된 바가 없었기 때문에,본 발명의 연구는 PLD2 와 Rheb 간의 기능적 및/또는 물리적 관련성이 존재하는지 여부를 시험하면서 시작되었다. 또한, Rheb가 mTOR을 활성화시킨다는 보고는 있었지만, 그 메커니즘은 밝혀지지 않았다.

Rheb-매개 mTOR 활성화에 있어서의 PLD의 잠재적 수반 여부를 측정하기 위해, 각각의 PLD 이소자임 (포유류는 2개의 이소자임, PLD1 및 PLD2을 갖고, 이들은 약 50%의 상동성을 갖는다)은 특정 siRNA에 의해 침묵시켰다(silenced). HA-Rheb^Q64L를 표시된 siRNAs와 함께 HEK293 세포에서 발현시켰다. 얻어진 용해물에 대하여 도 1의 항체들을 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 실험 결과는 도 1에 나타내었고, PLD2의 넉다운(knock-down)은 잘 알려진 mTOR 기질인 S6K1 및 4EBP1의 포스포레이션을 특이적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있다. Rheb에 의하여 유도된 세포외 신호 조절 단백질 키나아제 (extracellular signal-regulated protein kinase; ERK)의 인산화가 PLD1 또는 PLD2 또는 이들 모두의 넉다운에 의하여 조절되지 않은 것으로 보아, Rheb-유도 mTOR 활성화에 있어서의 PLD2의 작용은 특이적인 것으로 보인다.

한편, PA 생성에 Rheb가 필요한지 여부를 측정하기 위해, PLD 이소자임의 활성에 대한 Rheb 효과를 측정하였다. PLD2 또는 PLD1은 Rheb에 대한 shRNA와 함께 COS7 세포로 감염시켰다. 48시간 후, 20시간 동안 혈청을 제거하고 세포를 배양하고, 4시간 동안 [³H] 미리스틴산으로 표지시키고, 실시예 1 내지 8에 기재된 바와 같이 PLD 분석을 수행하였다. 포스파티딜-부탄올 형성 (PBt formation)을 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. Rheb의 침묵(silencing)을 웨스턴 블롯 분석법에 의해 확인하고, 도 2의 그래프 내에 shRheb로 표시하여 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, Rheb 침묵에 의한 Rheb의 효과는 PLD2로 제한되며, 이는 Rheb가 PLD2에 특이적으로 필요함을 제안하였다. 이러한 결과들은 PLD2와 Rheb가 모두 mTOR 활성화에 필요함을 보여주는 것이다.

실시예 11 : PLD2 와 Rheb 간의 상호 작용의 경향

PLD2와 Rheb 간의 기능적 관련성을 뒷받침하기 위하여, PLD2와 Rheb 간의 물리적 연결을 측정하였다. COS7 세포에서의 PLD2 또는 PLD1와 함께 HA-Rheb^wt를 과발현시켰다. HA-면역침전법에서의 PLD 이소자임의 수준을 측정하였다. HA-Rheb^wt를 PLD2 또는 PLD1와 함께 형질감염시키고, 얻어진 용해물에 대하여 항-HA 항체를 사용하여 면역침전법을 수행하였다. 상기한 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 HA-면역침전법에서의 결합된 PLD 이소자임을 측정하였다. 얻어진 실험 결과를 도 3에 나타내었다 (IP; 면역침전, T.Lys.; 총 용해물). 도 5에 나타난 바와 같이, HA 면역침전법에서, PLD2는 관찰되는 반면 PLD1는 관찰되지 않았다. Rheb의 GTP- 또는 GDP 형태는 세포 내 또는 시험관 내에서 PLD2와의 상호 작용의 측면에서 어떠한 선호도도 보이지 않았다.

PLD2와 Rheb 간의 상호 작용은 실시예 6에 기재된 GST-pull down 분석법으로 추가로 시험되었다. GST-융합 단백질 (GST-Rheb, GST-Rap1 및 GST-R-Ras)은 발현시키고, PLD2-발현 세포 용해물을 사용하여 GST-pull down 분석법을 수행하였다. 실험 결과는 도 4에 나타내었고, GST-융합 단백질은 별표로 표시하였다. 도 4는 PLD2는 GST-Rheb와 상호 작용하지만 GST-Ras 또는 GST-Rap1와는 상호작용하지 않는 것으로 나타났다. 동일한 pull-down 시험에서 PLD1은 검출되지 않았으므로, 이러한 상호작용은 PLD2에 특이적인 것이라고 할 수 있다.

Rheb가 PLD2와 어떻게 상호 작용하는지를 이해하기 위해, 일련의 절단된 (truncated) PLD2 변이체들을 준비하였고, 이들의 Rheb와의 결합 능력을 실시예 6에 기재된 바와 같은 GST-pull down 분석법으로 측정하였다. 실험 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 있어서, 상부 패널은 사용된 PLD2 단편의 모식도이며, 하부 패널은 GST-pull down 분석법의 결과를 보여주는 것이다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, PLD2 상의 Rheb 결합 부위 (docking site)는 전장 Rheb의 476번째부터 612번째 까지의 아미노산을 포함하는 부위로 맵핑되었다.

상호 작용이 직접적인지 여부를 밝히기 위하여, 정제된 PLD2 및 Rheb를 상기 상기한 바와 같은 시험관 내 결합 분석용으로 재구성하였다. 재조합 PLD2 및 His-Rheb를 발현시키고, Sf9 세포 및 E.coli로부터 각각 정제시켰다. 또한, GST, GST-2F3 (PLD2의 476번째 내지 612번째 아미노산), 및 GST-2F2 (PLD2의 315번째 내지 475번째 아미노산)를 발현시키고, GSH-세파로즈 비즈를 이용하여 E. coli로부터 정제하였다. 정제된 GST-융합 단백질 (각각 40nM)들은 PLD2 및 His-Rheb를 포함하는 단백질 혼합물과 혼합한 후, 항-PLD 항체 및 단백질 A-아가로스 비즈(bead)를 첨가하여 단백질 혼합물로부터 PLD2를 침전시켰다. 결합된 단백질을 상기한 바와 같은 웨스턴 블롯팅으로 검출하였다. 실험결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 나타나는 바와 같이, PLD2의 476번째 내지 612번째 아미노산을 상호작용이 유도되었다. 상기 결과로 보아, Rheb와 PLD2는 물리적 및 기능적으로 모두 연결되어있고, 그들의 상호 작용은 PA 발생을 유발한다.

실시예 12 : PLD2에 의해 매개되는 Rheb의 mTOR와의 결합 및 이의 mTOR의 Rheb 활성화에 대한 효과 분석

Rheb/PLD2 복합체는 PLD2/랩터/mTOR 복합체와 연관되어있다는 본 발명자의 이전 연구 결과 (Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨), 및 상기 얻어진 결과에 기초하여, 본 실시예에서는 mTOR 복합체가 랩터, PLD2, 및 Rheb를 포함하는지 여부를 시험하였다.

COS7 세포 용해물을 다른 용해 조건, CHAPS 및 Triton X-100을 이용하여 제작하고, 상기한 바와 같은 항-mTOR 항체에 대한 복합면역침전법 (co-IP)을 수행하였다. 실험결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 랩터, PLD2 및 Rheb가 mTOR 복합체에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

Rheb는 랩터 복합체에 결합하는 것으로 확인되었고, 이러한 상호 작용은 도 8에 나타난 바와 같은 TOS 모티프 의존적(TOS motif-dependent manner)으로 PLD2에 의하여 강화되었다. HA-Rheb^Q64L를 표시된 PLD2 변이체와 함께 COS7 세포로 감염시키고, 얻어진 용해물에 대하여 항-HA 항체를 사용하여 면역침전법을 수행하였다. 결합된 랩터 및 PLD2의 수준을 웨스턴 블로팅으로 검출하였다. 실험결과를 도 8에서 나타내었으며, 이는 Rheb와 mTOR 복합체 간의 분자적 가교(molecular bridge)로서의 PLD2의 중요성을 제안하였다.

Rheb의 mTOR 복합체와의 결합 강화는 또한 상기한 바와 같은 정제된 mTOR 면역 침전을 이용하는 시험관 내 결합 분석으로 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. HA-mTOR^wt 및 myc-raptor^wt의 감염 후, mTOR/랩터 복합체를 항-HA 항체로 면역 침전시켰다. 얻어진 면역 침전을 100μM GTPγS의 존재하에서, 표시된 바와 같은 정제된 PLD2 및 GST-Rheb (40nM)를 사용하여 시험관 내 결합 분석을 위하여 추 가적으로 배양하였다. 2 시간 동안의 배양 후, 면역침전을 세척하고, 웨스턴 블롯을 수행하였다.

mTOR 신호에서의 물리적 연결로서 PLD2의 중요성은 PLD 침묵(silencing) 후 PA 처리에 의해 더욱 강조되며, 이는 본 발명자들의 이전 연구에서 보고된 바와 같은 세포 내 mTOR 활성을 증가시키는 것으로 나타났다 (Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨). 흥미롭게도, PLD2 발현이 낮아지면, PA는 mTOR 경로를 더 이상 활성화시키지 않는 것으로 보고되어 있다. 그러나, PLD1 발현이 낮을 때, PA는 mTOR를 활성을 유지시킬 수 있고, 이는 mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는데 PLD2 자체가 중요함을 제안한다. PLD2와 Rheb와의 연결의 중요성은 PLD2의 Rheb 결합 부위로부터 유래된 단편, 2F3 및 2F2를 이용하여 측정하였다. HA-Rheb^Q64L를 GFP-2F3 또는 GFP-2F2로 형질감염 후, 상기 세포를 혈청 제거하고 배양한 후, 상기한 바와 같은 항-HA 항체를 이용하여 복합 면역침전(co-IP) 분석을 수행하였다. 실험결과는 도 10에 나타내었다. 도 5 및 도 10에 나타난 바와 같이, 세포에서 Rheb의 PLD2와의 상호 작용은 GFP-2F3에의하여 제거되지만(abrogated), GFP-2F2에 의해서는 그렇지 않았다. 이는 Rheb-과발현 세포에서의 GFP-2F3 과발현에 의하여 감소된 S6K1 인산화와 밀접한 관련성을 갖는다 (도 10 참조).

Rheb 유도 mTOR 키나아제 활성은 GFP-2F3 과다 발현에 의해 하향조절(downregulated)되는지 여부를 측정하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다. HA-Rheb^Q64L, GFP-2F3 및 myc-mTOR^wt의 형질감염 후, 상기한 바와 같은 항-myc 면역침전법을 이용하여 시험관 내 mTOR 키나아제 분석을 수행하였다. 실험 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, Rheb 유도 mTOR 키나아제 활성은 또한 GFP-2F3 과다 발현에 의해 하향조절되었으며, 이는 Rheb 유도 mTOR 활성화를 위하여 Rheb/PLD2 결합이 중요함을 제안하는 것이다. 이는 물리적 연결과 함께 PLD2의 효소적 활성화가 mTOR의 Rheb 활성화에 있어서 중요하다는 가능성을 제기하는 것이다.

실시예 13 : mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 Rheb 활성에서의 PA의 역할

PA가 세포 내에서 mTOR을 활성화시키는 메커니즘은 이전 연구에서 보고된 바 없다 (Kim, D.H., et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell 110, 163-175 (2002), 본 명세서에 참조로서 포함됨). 단지 mTOR의 입체형태적 변화 또는 상류 조절자의 특이적 동원 (specific recruitment)이 제안되었을 뿐이다.

본 실시예에서는 PA가 Rheb/mTOR 결합을 증가시킬 수 있고, mTOR의 PA 의존적 입체형태적 변화를 통해 mTOR을 활성화시킬 수 있다는 견해를 시험하였다. HA-Rheb^Q64L의 감염 후, 세포를 24 시간 동안 혈청 제거하고 배양한 후, 1-부탄올 (1- BtOH, 0.4%), t-부탄올 (t-BtOH, 0.4%), 포스파티딘산(C-6 PA, 100uM), 및 라파마이신 (20nM)을 각각으로 처리하였다. 실험 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타난 결과는, PA에 의한 1-부탄올 처리된 세포에서의 구조(rescue) 시험에서 확인되는 바와 같이, Rheb가 mTOR 신호를 활성화시키는데 PA가 필수적으로 필요하다는 것을 보여주므로, 상기와 같은 견해가 보다 뒷받침되게 되었다. 또한, mTOR과 Rheb 간의 상호 작용은 1-부탄올 처리한 세포에서 약화됨이 관찰되었는데, 이는 이들의 상호작용에 PA 생산이 중요함을 암시하는 것이다.

mTOR/랩터/PLD2을 면역 침전법으로 정제한 후, PA와 함께 정제된 GST-Rheb에 대한 시험관 내 bait로 사용하였다. HA-mTOR, myc-랩터, 및 PLD2를 형질감염시키고, 항-HA 항체를 사용하여 얻어진 용해물을 면역침전하였다. 얻어진 면역침전물을 정제된 GST-Rheb (40nM), PA (10μM), GDPβS (100μM), 또는 GTPγS (100μM)를 사용하는 시험관 내 결합 분석에 사용하였다. 실험 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, PA는 GTPγS 존재하에서 GST-Rheb가 mTOR 복합체와 결합하는 것을 증진시킴을 알 수 있었다.

도 14 및 15에서 나타나는 바와 같이, 이러한 결합 증진은 시험관 내 및 생체 내 모두에서의 mTOR 활성화와 연관이 있다. Myc-mTOR, HA-랩터 및 PLD2를 HEK293 세포로 감염시키고, 얻어진 용해물은 항-myc 항체로 면역 침전하였다. 실험결과는 도 14에 나타내었다 (IVK: 시험관 내 키나아제 분석). HA-mTOR^wt와 myc-Rheb^wt 또는 myc-Rheb^D60I를 COS7 세포로 감염시키고, 24 시간 동안 두어 발현시켰다. 혈청이 결핍된 상태에서의 24 시간 배양 후, 100 μM PA는 세포에 처리하고, 얻어진 용해물에 대하여 mTOR에 대한 시험관 내 키나아제 분석을 수행하였다. 실험결과는 도 15에 나타내었다.

상기 실험 결과들은 PLD2가 Rheb와 mTOR 복합체 간의 물리적 연결을 제공하고, 그 결과로서, mTOR 복합체의 인접부에서 생성된 PA가 Rheb/mTOR 복합체 결합을 증진시켜 mTOR를 활성시킨다는 것을 제안한다.

실시예 14 : 영양 의존적 PLD2 활성 측정

이전에, 본 발명자들은 PLD2/랩터 상호 작용과 PLD2의 효소적 활성이 모두 mTOR 경로 자극에 필요함을 제안한 바 있다 (Ha, S.H., Kim, D.H., Kim, I.S., Kim, J.H., Lee, M.N., Lee, H.J., Kim, J.H., Jang, S.K., Suh, P.G., Ryu, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals. Cell. Signal. 18 (2006) 2283-2291, 본 명세서에 참조로서 포함됨). 이러한 관련성은 PLD2가 mTOR 복합체와의 물리적 및 기능적 연결을 갖는 신규한 결합 단백질임을 제안하는 것이다.

지금까지, 영양 신호에서의 PLD2의 기능은 제안된 바 없다. 이러한 이유로, 영양 신호에 있어서의 PLD2의 중요성을 시험하였다. S6K1에 대한 류신의 자극 효과는 1-부탄올에 의해 현저하게 감소되었다. 이러한 결과에 기초하여, 영양 수준에 대응하는 PLD2 활성을 측정하였다. PLD2^wt를 형질감염시키고, 24시간 동안 두어 발 현시켰다. 16시간 동안 혈청 결핍 상태에서 배양하고 8시간 동안 [³H]미리스틴산(2(Ci/ml)으로 표지한 후, 세포를 라파마이신 (20nM), D-PBS, 및 류신 무첨가 배양액 (biowhittaker)으로 처리하였다. 45분 후, 류신 첨가 배양액을 포함하는 동일한 처방을 0.4% 1-부탄올과 함께 첨가하여 PBt 형성을 측정하였다. 실험 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 알 수 있는 바와 같이, PLD2 활성은 아미노산 농도, 특히 류신의 농도에 의해 가역적으로 조절되었다.

PLD2 활성과 복합체 형성과의 관련성을 밝히기 위하여, PLD2와 mTOR 간의 상호 작용을 시험하였다. mTOR 특이적 저해제인 라파마이신에 의한 mTOR 저해는 PLD2와 mTOR와의 상호 작용에 대하여 효과가 없었다. 그러나, 도 17에 보여지는 바와 같이, 내생(endogenous) PLD2와 내생 mTOR 복합체와의 상호 작용은 류신 결핍 상태에서 배양된 COS7과 HEK295 세포에 류신을 처리함으로써 증가되었다. 도 17의 실험 결과는 융합성(confluent) COS7 및 HEK293 세포를 용해시키고, 류신 결핍 세포를 류신으로 처리한 후 항-mTOR 항체를 사용하여 면역 침전시켜서 얻은 것이다.

HA-랩터^wt/PLD2^wt 또는 HA-Rheb^wt/PLD2^wt를 HEK293 세포로 감염시키고, 세포를 류신 결핍 상태에서 배양하였다. 류신 처리 후 Co-IP (복합면역침전법)을 수행한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 실험 결과를 도 18 (HA-raptor^wt/PLD2^wt) 및 19 (HA-Rheb^wt/PLD2^wt)에 나타내었다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 류신에 의한 증가는 PLD2와 랩터 간의 결합 증진에 의한 것이다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 중요한 점 은, Rheb와 PLD2 간의 상호 작용은 또한, 고영양 조건하에서는 안정화되고, 저영양 조건 하에서는 약화되는 것과 같이, 영양 수준에 의해 조절된다는 것이고, 이로 인하여 mTOR, raptor, PLD2, 및 Rheb로 구성되는 영양 의존성 mTOR 복합체를 확인할 수 있다. 이러한 실험 결과는 류신의 농도에 대한 PLD2 활성의 가역적인 조절과 밀접한 관련이 있다.

실시예 15 : 영양소(류신) 신호에서의 PLD2 / Rheb 상호 작용의 필수적 역할

PLS2 siRNA를 형질감염시킨 후, 세포를 45분 동안 류신 결핍 상태에서 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 류신(0-100μM)으로 15분간 처리하고, 얻어진 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 실험 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에서 나타나는 바와 같이, PLD2 침묵 (silencing)이 S6K1 인산화에 대한 류신의 효과를 완벽하게 하향 조절(downregulated)하는 것으로 나타났다.

또한, HA-Rheb^Q64L을 GFP-2F3 또는 GFP-2F2로 형질감염시키고, 얻어진 세포를 45분 동안 류신 결핍 상태에 두었다. 15분 동안 류신(100μM) 처리 후, 세포 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 실험 결과는 도 21에 나타내었다. 상기 결과는 GFP-2F3이 과발현되면, S6K1 인산화가 특이적으로 하향 조절됨을 보여준다. 이러한 실험 결과는 류신-유도 mTOR 신호화에서의 Rheb/PLD2 결합의 중요성을 제안하는 것이다.

mTOR 활성 증가는 세포 크기 제어 및 세포 성장 조절과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 나타났다. 도 22에 표시된 PLD2 변이체를 형질감염시킨 후, 세포를 배양하여, PLD2 돌연변이의 감염 후, 세포를 배양하여 융합시켰다. 48시간 동안 상기 세포를 리플레이팅(replating) 후, Multisizer 3 (Beckman Coulter)를 사용하여 세포 크기를 측정하였다 (Kim, D.H., et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell 110, 163-175 (2002), 본 명세서에 참조로서 포함됨). 실험 결과는 도 22에 나타내다. 상기 결과는 PLD2 과발현은 TOS-모티프 의존적 방식으로 세포 크기가 증가시킴을 보여준다. 이러한 실험 결과는 세포 성장 조절을 위한 mTOR 신호에서의 PLD2의 기능적 역할을 보여주는 것이며, 이는 mTOR/랩터/PLD2/Rheb 복합체 형성을 통하여 달성된다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD OF REGULATING MAMMALIAN TARGET-OF-RAPAMYCIN ACTIVITY BY INTERACTION BETWEEN PHOSPHOLIPASE D AND Rheb <130> OPP20070879KR <150> US 60/821,542 <151> 2006-08-04 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2549 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mammalian target-of-rapamycin (mTOR) [Homo sapiens] <400> 1 Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg 20 25 30 Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val 35 40 45 Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr 50 55 60 Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala 65 70 75 80 Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val 85 90 95 Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg 100 105 110 Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys 115 120 125 Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr 130 135 140 Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg 145 150 155 160 Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala 165 170 175 Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp 180 185 190 Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly 195 200 205 Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu 210 215 220 Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu 225 230 235 240 Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn 245 250 255 Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val 260 265 270 Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu 275 280 285 Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met 290 295 300 Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln 305 310 315 320 Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr 325 330 335 Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala 340 345 350 Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu 355 360 365 Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys 370 375 380 Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala 385 390 395 400 Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr 405 410 415 Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala 420 425 430 Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe 435 440 445 Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro 450 455 460 Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala 465 470 475 480 Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly 485 490 495 Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly 500 505 510 Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile 515 520 525 Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser 530 535 540 Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly 545 550 555 560 Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala 565 570 575 Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe 580 585 590 Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp 595 600 605 His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg 610 615 620 Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His 625 630 635 640 Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu 645 650 655 Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg 660 665 670 Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala 675 680 685 Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val 690 695 700 Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser 705 710 715 720 Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln 725 730 735 Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln 740 745 750 Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile 755 760 765 Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys 770 775 780 Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala 785 790 795 800 Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp 805 810 815 Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser 820 825 830 Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val 835 840 845 Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu 850 855 860 Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr 865 870 875 880 Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro 885 890 895 Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala 900 905 910 Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp 915 920 925 Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp 930 935 940 Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg 945 950 955 960 Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr 965 970 975 Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln 980 985 990 Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile 995 1000 1005 Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val Lys 1010 1015 1020 Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met Arg Glu 1025 1030 1035 1040 Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile Leu Leu Ile 1045 1050 1055 Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys Leu Tyr Leu Pro 1060 1065 1070 Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met His Asp Asn Ser Pro 1075 1080 1085 Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala Ala Ile Gln Leu Phe Gly 1090 1095 1100 Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys 1105 1110 1115 1120 Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu 1125 1130 1135 Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala 1140 1145 1150 Ser Arg Ile Ile His Pro Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu 1155 1160 1165 Leu Arg Ser Thr Ala Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu 1170 1175 1180 Gly Lys Lys Tyr Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val 1185 1190 1195 1200 Arg His Arg Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile 1205 1210 1215 Val Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr 1220 1225 1230 Gln His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly 1235 1240 1245 Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile Asn 1250 1255 1260 Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp Asp Trp 1265 1270 1275 1280 Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Ser 1285 1290 1295 Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln Ala Tyr Asn Pro 1300 1305 1310 Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val Ser Cys Trp Ser Glu 1315 1320 1325 Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ser Ile Glu Leu Ala 1330 1335 1340 Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu 1345 1350 1355 1360 Ala Glu Phe Met Glu 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Amino acid sequence of phospholipase D1 [Rattus norvegicus] <400> 2 Met Ser Leu Arg Ser Glu Ala Arg Val Asn Thr Ser Thr Leu Gln Lys 1 5 10 15 Ile Ala Ala Asp Met Arg Asn Leu Ile Glu Asn Leu Asp Thr Arg Glu 20 25 30 Leu His Phe Glu Gly Glu Glu Val Glu Tyr Asp Ala Ser Pro Gly Asp 35 40 45 Pro Thr Ala Gln Glu Ala Cys Ile Pro Phe Ser Ser Ile Tyr Asn Thr 50 55 60 Gln Gly Phe Lys Glu Pro Asn Ile Gln Ile Tyr Leu Ser Gly Cys Pro 65 70 75 80 Val Lys Ala Gln Val Leu Glu Val Glu Arg Phe Thr Ser Thr Ser Arg 85 90 95 Met Pro Ser Val Asn Leu Tyr Thr Ile Glu Leu Thr His Gly Glu Phe 100 105 110 Thr Trp Gln Val Lys Arg Lys Phe Lys His Phe Gln Glu Phe His Arg 115 120 125 Glu Leu Leu Lys Tyr Lys Ala Phe Ile Arg Ile Pro Ile Pro Thr Lys 130 135 140 Arg His Thr Phe Arg Arg Gln Asn Val Lys Glu Glu Pro Arg Glu Met 145 150 155 160 Pro Ser Leu Pro Arg Ser Ser Glu Asn Ala Ile Gln Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Phe Gly Arg Arg Lys Gln Leu Glu Asp Tyr Leu Thr Lys Ile Leu Lys 180 185 190 Met Pro Met Tyr Arg Asn Tyr 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Leu Asp Leu Gly Pro Trp Ala Val 450 455 460 Ser Leu Ala Leu Ser Val Gly Ile Phe Pro Tyr Val Leu Lys Leu Leu 465 470 475 480 Gln Ser Ser Ala Arg Glu Leu Arg Pro Leu Leu Val Phe Ile Trp Ala 485 490 495 Lys Ile Leu Ala Val Asp Ser Ser Cys Gln Ala Asp Leu Val Lys Asp 500 505 510 Asn Gly His Lys Tyr Phe Leu Ser Val Leu Ala Asp Pro Tyr Met Pro 515 520 525 Ala Glu His Arg Thr Met Thr Ala Phe Ile Leu Ala Val Ile Val Asn 530 535 540 Ser Tyr His Thr Gly Gln Glu Ala Cys Leu Gln Gly Asn Leu Ile Ala 545 550 555 560 Ile Cys Leu Glu Gln Leu Asn Asp Pro His Pro Leu Leu Arg Gln Trp 565 570 575 Val Ala Ile Cys Leu Gly Arg Ile Trp Gln Asn Phe Asp Ser Ala Arg 580 585 590 Trp Cys Gly Val Arg Asp Ser Ala His Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Leu 595 600 605 Ser Asp Pro Ile Pro Glu Val Arg Cys Ala Ala Val Phe Ala Leu Gly 610 615 620 Thr Phe Val Gly Asn Ser Ala Glu Arg Thr Asp His Ser Thr Thr Ile 625 630 635 640 Asp His Asn Val Ala Met Met Leu Ala Gln Leu Val Ser Asp Gly Ser 645 650 655 Pro Met Val Arg Lys Glu Leu Val Val Ala Leu Ser His Leu Val Val 660 665 670 Gln Tyr Glu Ser Asn Phe Cys Thr Val Ala Leu Gln Phe Ile Glu Glu 675 680 685 Glu Lys Asn Tyr Ala Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Glu Gly Gly Ser 690 695 700 Leu Thr Pro Val Arg Asp Ser Pro Cys Thr Pro Arg Leu Arg Ser Val 705 710 715 720 Ser Ser Tyr Gly Asn Ile Arg Ala Val Ala Thr Ala Arg Ser Leu Asn 725 730 735 Lys Ser Leu Gln Asn Leu Ser Leu Thr Glu Glu Ser Gly Gly Ala Val 740 745 750 Ala Phe Ser Pro Gly Asn Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr 755 760 765 Leu Gly Ser Pro Glu Asn Glu Glu His Ile Leu Ser Phe Glu Thr Ile 770 775 780 Asp Lys Met Arg Arg Ala Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Asn Ser Leu Ile 785 790 795 800 Gly Val Ser Phe Asn Ser Val Tyr Thr Gln Ile Trp Arg Val Leu Leu 805 810 815 His Leu Ala Ala Asp Pro Tyr Pro Glu Val Ser Asp Val Ala Met Lys 820 825 830 Val Leu Asn Ser Ile Ala Tyr Lys Ala Thr Val Asn Ala Arg Pro Gln 835 840 845 Arg Val Leu Asp Thr Ser Ser Leu Thr Gln Ser Ala Pro Ala Ser Pro 850 855 860 Thr Asn Lys Gly Val His Ile His Gln Ala Gly Gly Ser Pro Pro Ala 865 870 875 880 Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Leu Thr Asn Asp Val Ala Lys Gln Pro 885 890 895 Val Ser Arg Asp Leu Pro Ser Gly Arg Pro Gly Thr Thr Gly Pro Ala 900 905 910 Gly Ala Gln Tyr Thr Pro His Ser His Gln Phe Pro Arg Thr Arg Lys 915 920 925 Met Phe Asp Lys Gly Pro Glu Gln Thr Ala Asp Asp Ala Asp Asp Ala 930 935 940 Ala Gly His Lys Ser Phe Ile Ser Ala Thr Val Gln Thr Gly Phe Cys 945 950 955 960 Asp Trp Ser Ala Arg Tyr Phe Ala Gln Pro Val Met Lys Ile Pro Glu 965 970 975 Glu His Asp Leu Glu Ser Gln Ile Arg Lys Glu Arg Glu Trp Arg Phe 980 985 990 Leu Arg Asn Ser Arg Val Arg Arg Gln Ala Gln Gln Val Ile Gln Lys 995 1000 1005 Gly Ile Thr Arg Leu Asp Asp Gln Ile Phe Leu Asn Arg Asn Pro Gly 1010 1015 1020 Val Pro Ser Val Val Lys Phe His Pro Phe Thr Pro Cys Ile Ala Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asp Lys Asp Ser Ile Cys Phe Trp Asp Trp Glu Lys Gly Glu Lys 1045 1050 1055 Leu Asp Tyr Phe His Asn Gly Asn Pro Arg Tyr Thr Arg Val Thr Ala 1060 1065 1070 Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gln Asp Cys Ser Leu Leu Leu Thr Ala Thr 1075 1080 1085 Asp Asp Gly Ala Ile Arg Val Trp Lys Asn Phe Ala Asp Leu Glu Lys 1090 1095 1100 Asn Pro Glu Met Val Thr Ala Trp Gln Gly Leu Ser Asp Met Leu Pro 1105 1110 1115 1120 Thr Thr Arg Gly Ala Gly Met Val Val Asp Trp Glu Gln Glu Thr Gly 1125 1130 1135 Leu Leu Met Ser Ser Gly Asp Val Arg Ile Val Arg Ile Trp Asp Thr 1140 1145 1150 Asp Arg Glu Met Lys Val Gln Asp Ile Pro Thr Gly Ala Asp Ser Cys 1155 1160 1165 Val Thr Ser Leu Ser Cys Asp Ser His Arg Ser Leu Ile Val Ala Gly 1170 1175 1180 Leu Gly Asp Gly Ser Ile Arg Val Tyr Asp Arg Arg Met Ala Leu Ser 1185 1190 1195 1200 Glu Cys Arg Val Met Thr Tyr Arg Glu His Thr Ala Trp Val Val Lys 1205 1210 1215 Ala Ser Leu Gln Lys Arg Pro Asp Gly His Ile Val Ser Val Ser Val 1220 1225 1230 Asn Gly Asp Val Arg Ile Phe Asp Pro Arg Met Pro Glu Ser Val Asn 1235 1240 1245 Val Leu Gln Ile Val Lys Gly Leu Thr Ala Leu Asp Ile His Pro Gln 1250 1255 1260 Ala Asp Leu Ile Ala Cys Gly Ser Val Asn Gln Phe Thr Ala Ile Tyr 1265 1270 1275 1280 Asn Ser Ser Gly Glu Leu Ile Asn Asn Ile Lys Tyr Tyr Asp Gly Phe 1285 1290 1295 Met Gly Gln Arg Val Gly Ala Ile Ser Cys Leu Ala Phe His Pro His 1300 1305 1310 Trp Pro His Leu Ala Val Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ile Ser Val Tyr 1315 1320 1325 Ser Val Glu Lys Arg Val Arg 1330 1335 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide for PCR of PLD2 <400> 6 ggccgagacc aagtttgtta tcgc 24 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide (F265A) <400> 7 ccatcgatcc gcacgccgtg ccgtgcctcc gtgctccttt tccccacttg cacctcagcg 60 ccagg 65 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide (E266R) <400> 8 ccatcgatcc gcacgccgtg ccgtgcctcc gtgctccttt tccccacttg caccctaaag 60 ccagg 65 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense oligonucleotide corresponding to human PLD2 coding nucleotides 703-723 <400> 9 aagagguggc ugguggugaa g 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide corresponding to human PLD2 coding nucleotides 703-723 <400> 10 cuucaccacc agccaccucu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of human Rheb coding gene <400> 11 gaggacactg ggaatatatt c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotides 703-723 of PLD2 <400> 12 aagaggtggc tggtggtgaa g 21

Claims

하기의 단계 중 하나 이상의 단계를 조절함으로써 수행되는 mTOR 활성 조절 방법:

1) 포스포리파아제 D (phospholipase D; PLD) 2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계;

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산 (phosphatidic acid; PA)이 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 단계; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 의하여 Rheb이 mTOR와 결합하여, mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 조절은 PLD2의 Rheb 결합 부위, Rheb의 PLD2 결합 부위, 또는 이들 모두를 변형시킴으로써 mTOR 활성을 억제하여 수행하고, 상기 PLD2의 Rheb 결합 부위는 전장 PLD2의 476 지점에서 612 지점까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 방법.
제 2항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 조절은 전장 PLD2의 476 지점에서 612 지점까지의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 결실시킴으로써 mTOR 활성을 억제하여 수행하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 PLD2를 통한 Rheb의 mTOR와의 결합의 조절은 포스파티딘산(PA) 또는 GTPγ을 제거시킴으로써 mTOR 활성을 억제하여 수행하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 조절은 류신(leucine)의 농도를 감소시킴으로써 mTOR 활성을 억제하여 수행하는 것인 방법.
하기의 단계를 포함하는 mTOR 활성 저해제 검출 방법:

후보 물질을 시료 세포에 접촉시키는 단계;

PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR에 결합할 수 있도록 하는 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용을 측정하는 단계; 및

상기 후보 물질의 접촉이 없는 시료 세포에서와 비교하여, PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 수준이 감소할 때, 상기 후보 물질을 mTOR 활성 저해제로서 결정하는 단계.
제 6항에 있어서, 상기 시료 세포는 인간 신장 배아 세포, 인간 상피성 난소암 세포, COS7 세포, 인간 경부암 세포, 인간 대장암 세포, 인간 유방암 세포, 인간 간암 세포, 인간 유방암 세포, 및 인간 T-세포 백혈병 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 mTOR 활성의 저해제는 mTOR 관련 대사성 질환의 치료제로 사용되는 것인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 과오종 (hamartoma syndromes) 및 조직/기관 비대로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
하기의 단계 중, 하나 이상의 단계를 억제함으로써 mTOR 관련 대사성 질환 을 치료하는 방법 :

1) 포스포리파아제 D (phospholipase D; PLD) 2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계;

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산 (phosphatidic acid; PA)이 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 단계; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 의하여 Rheb이 mTOR와 결합하여 mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 단계.
제 10항에 있어서, 상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 과오종 (hamartoma syndromes) 및 조직/기관 비대로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 저해는 PLD2의 Rheb 결합 부위, Rheb의 PLD2 결합 부위, 또는 이들 모두를 변형시켜서 수행하고, 상기 PLD2의 Rheb 결합 부위는 전장 PLD2의 476 지점부터 612 지점까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
제 12항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 저해는 전장 PLD2의 476 지점부터 612 지점까지의 아미노산 잔기로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 결실시킴으로써 수행하는 것인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 PLD2를 통한 Rheb의 mTOR와의 결합의 저해는 포스파티딘산(PA) 또는 GTPγ을 제거시킴으로써 수행하는 것인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 PLD2와 Rheb 간의 상호 작용의 저해는 류신을 제거시킴으로써 수행되는 것인 방법.
mTOR 억제제의 유효량을 활성 성분으로 포함하는 mTOR 관련 대사성 질환의 치료용 조성물로서, 상기 mTOR 억제제는 다음 중 하나 이상의 단계를 억제하는 활성을 갖는 것인 조성물:

1) 포스포리파아제 D (phospholipase D; PLD) 2와 Rheb 간의 상호 작용에 의하여 PLD 2를 통하여 Rheb가 mTOR와 결합하는 단계;

2) PLD2로부터 생산된 포스파티딘산(phosphatidic acid; PA)이 mTOR 인접부로 이동하여 mTOR 인접부의 PA의 농도가 증가하는 단계; 및

3) mTOR 인접부의 PA 농도 증가에 의하여 Rheb이 mTOR와 결합하여, mTOR 키나아제 활성을 활성화시키는 단계.
제 16항에 있어서, 상기 mTOR 관련 대사성 질환은 암, 당뇨병, 비만, 과오종 (hamartoma syndromes) 및 조직/기관 비대로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 mTOR 저해제는 PLD2의 Rheb 결합 부위, Rheb의 PLD2 결합 부위, 또는 이들 모두를 변형시켜 PLD2와 Rheb와의 상호 작용을 억제하는 물질이고, 상기 PLD2의 Rheb 결합 부위는 PLD2 전장의 476 지점부터 612 지점까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 mTOR 저해제는 포스파티딘산 (PA) 또는 GTPγ의 수준을 감소시키는 물질인 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 mTOR 저해제는 류신(leucine)의 농도를 감소시키는 물질인 조성물.
암, 당뇨병, 비만, 과오종 (hamartoma syndromes) 및 조직/기관 비대로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 mTOR 관련 대사성 질환의 치료제 검출을 위한 표적 폴리펩타이드로서, 전장 PLD2의 476 지점부터 612 지점까지의 아미노산을 필수적으로 포함하는 표적 폴리펩타이드.