JP2014530019A - グリシルｔＲＮＡ合成酵素及びカドヘリンを利用した癌予防又は治療剤のスクリーニン方法（ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎａｇｅｎｔｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｕｓｉｎｇｇｌｙｃｙｌ−ｔＲＮＡｙｎｔｈｅｔａｓｅａｎｄｃａｄｈｅｒｉｎ） - Google Patents

グリシルｔＲＮＡ合成酵素及びカドヘリンを利用した癌予防又は治療剤のスクリーニン方法（ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎａｇｅｎｔｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｕｓｉｎｇｇｌｙｃｙｌ−ｔＲＮＡｙｎｔｈｅｔａｓｅａｎｄｃａｄｈｅｒｉｎ） Download PDF

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Abstract

本発明は、グリシルtRNA合成酵素(GRS)及びカドヘリンを利用した新たな癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、GRS及びCDH、特にCDHとの結合水準を変化させる試験製剤をスクリーニングする癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関するものである。本発明はGRSとCDHの新規な使用で、癌の予防及び治療剤をスクリーニング方法を提供する。本発明の方法は、多様な癌疾患の新たな治療剤の開発に有用に利用することができる。

Description

本出願は、2011年10月10日に出願された大韓民国特許出願第10-2011-0103306（出願番号）に基づく優先権を主張するものであり、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は、グリシルtRNA合成酵素(GRS)及びカドヘリンを利用した新たな癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関し、より詳細にはGRS又はこれの断片及びCDH6（又はCDH18)との結合水準を変化させる試験製剤をスクリーニングする癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法に関するものである。
遺伝的コードが発展するに従い翻訳機構の必須要素であるアミノアシル-tRNAのような蛋白質が台頭している。それぞれのアミノ酸に適用される20種の酵素は、各アミノ酸を細胞質にあるような起源のtRNAとの付着を触媒し、以降充填されたtRNAはリソソーム蛋白質合成に使用される前翻訳機能(ex-translational function)が、大腸菌での遺伝的調節、N,crassa(Kamper et al.,1992.Mol.Cell.Biol.12,499-511)のミトコンドリアでのRNAスプライシングなどを含む、多くのtRNA合成酵素について明らかになり、脊椎動物での機能の多様性は、免疫反応と血管形成の他の調節も含まれる(Park et al.,2005.Trends.Biochem.Sci.30.569-574)。このような拡張された機能は、細分化されたモチーフとドメイン、つまり内部の短いシーケンスモチーフと重なったGST、ロイシンジッパー、さらにヘリックス-ターン-ヘリックス域の増加と関連がある(Guo et al.,2010 FEBS Lett.584,434-442)。細分化されたモチーフとドメイン追加は、新たな機能を提供する新たな蛋白質-蛋白質相互作用を促進する。多くの疾病の内、aaRSsと哺乳動物の細胞から多重-tRNA合成酵素複合体の部分である蛋白質と関係があるものの内の一部が、前翻訳機能の破壊又は変化に起因するものと思われる。チロシルとグリシル-tRNA合成酵素で突然変異を引起こすCharcot-Marie-Tooth疾病は、アミノアシル活性を破壊しない(Jordanova et al.,2006.Net.Genet.38,197-202.;Nangle et al.,2007.Proc,Nati.Acad.Sci.USA 104,11239-11244)。
翻訳機構の必須構成要素で驚くべきことは、代替スプライシング又は自然的蛋白質加水分解によるチロシルとグリシル-tRNA合成酵素の特殊な断片の結合と、PMN細胞にあるCXCR1と2(Wakasugi and Schimmel,1999.Science 284,147-151)及び内皮細胞にあるVE-cadherinを含む細胞外受容体を通じたシグナルとが観察されることである。これら２種類の合成酵素は、前翻訳機能を促進する特別な条件下で哺乳動物の細胞から分泌される(Wakasugi et al.,2002.Proc.Natl.Acad .Sci.USA 99,173-177;Yang et al.,2007.Structure 15,793-805)。このような観察結果、注釈をつけることにより、翻訳をしない生理的環境に置かれているtRNA合成酵素の前翻訳機能を解き明かす一つの方法への可能性を示す(Park et al.,2008.Proc,Nati.Acad.Sci.USA 105,11043-11049;Sampath et al.,2004.Cell 110,195-208)。このような考察により、ヒトの血清における特殊な合成酵素の存在を研究した。
本発明者らはAARSの構造と機能の関係と臨床的観察を持続的に研究するために、GRSに焦点を絞り、癌の微細環境で循環する蛋白質のGRSの潜在的役割について研究した結果、CDHがGRSの受容体に作用してERK経路を調節し、細胞の死滅と成長を調節することを確認して、本発明を完成した。
従って、本発明の目的は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS(glycyl-tRNAynthethase)又はこの断片と、CDH(cadherin)を接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；及び
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階を含む癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の他の目的は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片、CDH及び試験製剤を接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階；
(ｅ）前記（ｄ）段階で確認された試験製剤をCDH発現細胞に接触させる段階；及び
(ｆ）CDH発現細胞のアポトーシス（apoptosis）を測定する段階を含むことを特徴とする、癌の予防及び治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
前記のような目的を達成するために、本発明は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片と、CDHを接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；及び
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階を含む癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明は他の目的を達成するために、本発明は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片、CDH及び試験製剤を接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階；
(ｅ）前記（ｄ）段階で確認された試験製剤をCDH発現細胞に接触させる段階；及び、
(ｆ）CDH発現細胞のアポトーシスを測定する段階を含むことを特徴とする癌の予防及び治療剤のスクリーニング方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
定義
他の定義がない限り、本明細書における全ての技術的及び科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。下記の参考文献は、本発明の明細書で使用された用語の一般的な定義を有する技術の一つを提供する。Singleton et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed.,1988); and Hale & Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。また、次の定義は、本発明の実施のため、読者に役立つように提供する。
本発明で“発現”とは、細胞において蛋白質又は核酸の生成を意味する。
本発明で“宿主細胞”とは、任意の手段（例えば、電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ沈殿法、微細注入法、形質転換法、ウィルス感染など）により細胞内に導入された異種性DNAを含む原核又は真核細胞を意味する。
本発明で“ポリペプチド(polypeptide)”は、“ポリペプチド(polypeptides)”又は“蛋白質”と交換可能に使用され、例えば、自然状態の蛋白質から一般的に発見されるようなアミノ酸残基の重合体を意味する。
本発明で“GRSポリペプチド”は、グリシルtRNA合成酵素で知られているポリペプチド”を意味する。前記GRSポリペプチドは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(Genbank Accession No.AAA86443.1)又はGenbank Accession No.AAA57001.1（配列番号５）、EAL24449.1（配列番号６）、BAA06338.1（配列番号７）、NP-002038.2（配列番号８）、AAHO7755.1（配列番号９）、AAHO7722.1（配列番号10）でもある。さらに、本発明のGRSはこの機能的同等物を含む。
本発明で“GRS断片”とは、GRSポリペプチドの一部の断片で、Ｃ−末端アンチコドン結合ドメインを含む断片を意味する。例えば、それは、配列番号１の全長におけるGRSアミノ酸配列の511番目のアミノ酸から最後の685番目のアミノ酸（配列番号２）からなり、Ｃ−末端アンチコドン結合ドメイン（配列番号11、配列番号１における511番目から674番目のアミノ酸）を含むものであり得る。さらに、本発明のGRS断片は、これの機能的同等物を含む。一方、GRSミトコンドリア型（例えば、配列番号７）は、細胞質型（例えば、配列番号１）とは異なり、54個のアミノ酸が付加されているので、Ｃ−末端アンチコドン結合ドメインの位置は、このような点を反映した配列であって当業者により理解できる。
前記の機能的同等物とは、GRS又はこれの断片のアミノ酸配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上の配列相同性（つまり、同一性）を有するポリペプチドを意味する。例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列相同性を有するポリペプチドを含むもので、配列番号１又は配列番号２で表示されるポリペプチドと実質的に同質の生理活性を示すポリペプチドを意味する。ここで、“実質的に同質の生理活性”とは、CDH、特にCDH6又はCDH18と結合して、ERKR経路を活性化して癌細胞を抑制又は死滅させることを意味する。前記機能的同等物は、GRS又はこれの断片のアミノ酸配列の内の一部が、置換又は欠失の結果により生成できるものでもある。前記においてアミノ酸の置換は、好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は下記の通りである；脂肪族アミノ酸(Gly,Ala,Pro)、疎水性アミノ酸(Ile,Leu,Val)、芳香族アミノ酸(Pyr,Tyr,Prp)、酸性アミノ酸(Asp,Glu)、塩基性アミノ酸(His,Lys,Arg,Gln,Asn)、及び硫黄含有アミノ酸（Cys,Met)。前記機能的同等物には、本発明のGRSポリペプチドのアミノ酸配列のもとで、アミノ酸の一部が欠失された変形体も含まれる。前記アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくは、本発明のポリペプチドの生理活性に直接的に関連していない域に位置している。さらに、アミノ酸の欠失は、好ましくは、GRSポリペプチドの生理活性に直接関与していない部分に位置している。前記GRSポリペプチドのアミノ酸配列の両端末又は配列内に幾つかのアミノ酸が付加された変形体も含まれる。本発明の機能的同等物の範囲には、本発明によるポリペプチドの基本骨格、及びこれの生理活性を維持しながらポリペプチドの一部の化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安全性、貯蔵性、揮発性又は溶解度などを変更させるための構造変更がこれに含まれる。
本発明において配列相同性及び同質性は、GRSのアミノ酸配列（配列番号１）又はこれの断片のアミノ酸配列と候補配列を整列してギャップ(gaps)を導入した後、GRSのアミノ酸配列に対する候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。必要な場合、最大百分率配列同質性を得るために、配列同質性の部分として保存的置換は考慮しない。さらに、GRSのアミノ酸配列のＮー末端、Ｃー末端、又は内部伸長、欠損又は挿入は、配列同質性又は相同性に影響を及ぼす配列として解析されない。さらに、前記配列同質性は、二つのポリペプチドのアミノ酸配列の類似した部分を比較するために一般的に使用される標準的な方法により決定することができる。BLASTのようなコンピュータプログラムは、二つのポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適にマッチングするように整列する（一つ又は二つの配列の電場配列に沿って、又は一つ又は二つの配列の予測された部分に沿って）。前記プログラムはデフォルトオープニングペナルティー(default opening penalty)及びデフォルトギャップペナルティー(default gap penalty)を提供し、コンピュータプログラムと共に、連係して使用できるPAM250（標準スコーリングマトリックス；Dayhoff et al.,in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol 5,supp 3,1978)のようなスコーリングマトリックスを提供する。例えば、百分率同質性は下記の通りに計算することができる。一致する配列の総数に100を掛けて、対応するスパン(matched span)内のより長い配列の長さと二つの配列を整列するために、さらに、長い配列内に導入されたギャップの数の和で割る。
本発明によるポリペプチドは、天然で抽出するか、又は遺伝工学的方法により作製することができる。例えば、一般的な方法により、前記ポリペプチド又はこれの機能的同等物を符号化する核酸（例えば、GRSの場合、配列番号３、GRS断片の場合、配列番号４）を作製する。前記核酸は適切なプライマーを使用して、PCR増幅することにより、作製することができる。他の方法で当業界に公知の標準的な方法により、例えば、自動DNA合成器(Biosearch又はApplied Biosystems社で販売するもの）を使用してDNA配列を合成することもできる。作製された核酸は、これに作動可能に連結され、かつ核酸の発現を調節する一つ以上の発現調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含むベクターに挿入されて、これより形成された組替え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を前記核酸の発現に適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記核酸により発現された実質的に純粋なポリペプチドを回収する。前記回収は当業界に公知の方法（例えば、クロマトグラフィー）を利用して行うことができる。前記で“実質的に純粋なポリペプチド”とは、本発明によるポリペプチドが宿主細胞から由来した他の如何なる蛋白質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成のための遺伝工学的方法は下記の文献を参考にすることができる：Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982; Sambrook et al.,Molecular Cloning; A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,Second(1998) and Third(2000) Editions; Gene Expression Technology,Method in Enzymology,Genetics and Molecular Biology,Method in Enzymology,Guthrie & Fink(eds.),Academic Press,San Diego,Calif. 1991; and Hitzeman et al.,J. Biol. Chem.,255,12073-12080 1990。
本発明のポリペプチドは、当業界に公知の化学的合成（Ｃreighton Proteins;Structures and Molecular Principles、W．H．Freeman and Co.,NY,1983)により、容易に製造することができる。代表的な方法として、これらに限定されるものではないが、液体又は固体状合成、断片凝縮、F-MOC又はT-BOC化学法が含まれる。(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams et al.,Eds.,CRC Press,Boca Raton Florida,1997; A Practical Approach,Atherton ＆ Sheppard,Eds.,IRL Press,Oxford,England,1989)。
本発明で“核酸”、“DNA配列”又は“ポリヌクレオチド”は、単一又は二重鎖の形態からなるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを意味する。他の制限がない限り、自然的に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸に混成化される自然的ヌクレオチドの公知のアナログも含まれる。
本発明で“プロモーター”とは、特定の宿主細胞から作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するDNA配列を意味し、“作動可能に連結される”とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合して、その機能又は発現が異なる核酸断片により影響を受けることを意味する。転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリソソーム結合部位をコーティングする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含むことができる。前記プロモーターとして、全ての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター、又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーターを使用することができる。
本発明で“GRSを符号化するポリペプチド”は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも70%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を符号化する塩基配列を有することができる。前記核酸は、DNA,cDNA及びRNA配列を全て含む。つまり、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を符号化する塩基配列を有するか、又は前記塩基配列に相補的な塩基配列を有することができる。好ましくは配列番号３で表示される塩基配列を有する。前記核酸は天然で分離されるか、又は上述した通り、遺伝工学的な方法により調節することができる。
本発明でGRS断片を符号化するポリペプチドは、配列番号２で表示されるアミノ酸配列、又はこれと少なくとも70%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を符号化する塩基配列を有することができる。好ましくは、配列番号４で表示される塩基配列を有する。前記核酸は天然で分離されるか、又は上述した通り、遺伝工学的方法により製造することができる。
本発明で“アナログ”とは、標準物質と構造的に類似するが、標準物質の特異的な置換基が置換により代替されることにより、標的や調節方法が変形された物質を意味する。標準物質と比較する時、アナログは当業者により予想できる通り、同一又は類似するか、又は向上された有用性を有する。向上された性質（例えば、標的物質に対するより高い結合親和力）を有する公知の化合物変異体を究明するためのアナログの構成及びスクリーニングは、薬理化学的分野に公知である。
本発明で“相同体”とは、蛋白質及び／又は蛋白質配列に言及する場合には、共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から自然的に、又は、人為的に由来したことを示す。類似した核酸及び／又は核酸配列は、それらが共通の祖先核酸、又は核酸配列から自然的に、又は、人為的に由来したときに相同する。
本発明で“接触”とは、これの一般的な意味であって、２個以上の製剤（例えば、２個のポリペプチド）を結合させるか、又は製剤と細胞（例えば、蛋白質と細胞）を結合させることを意味する。接触は試験管内で起こり得る。例えば、試験管又は他のコンテナーで２個以上の製剤を結合させるか、又は試験製剤と細胞又は細胞溶解物を結合させることである。さらに、接触は、細胞又はインシチュー(in situ)でも起ることもあり得る。例えば、２個のポリペプチドを符号化する組替えポリヌクレオチドを細胞内で共同発現させることにより、細胞又は細胞溶解物において２個のポリペプチドを接触させることである。
本発明で“製剤(agent)”又は“試験製剤(test agent)”とは、任意の物質、分子、元素、化合物、実在物、又はこれらの組合せを含む。例えば、これに制限はされないが、蛋白質、ポリヌクレオチド、小有機物質(small organic molecule)、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含む。さらに、自然産物、合成化合物、若しくは化学化合物、又は２個以上の物質の組合せでもある。別に指定されない限り、製剤、物質、及び化合物は交換可能に使用することができる。
具体的に、本発明のスクリーニング方法でスクリーニングできる試験製剤は、ポリペプチド、ベーターターンミメティック(beta-turn mimetics)、多糖類、燐脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーリックＮ-置換グリシン(oligomeric N-substituted glycines)、オリゴカーバメート(oligocarbamates)、糖類、脂肪酸、ピューラン、ピリミジン、又はこれらの誘導体、構造的アナログ又は組合せを含む。ある試験製剤は合成物質でもあって、他の試験製剤は天然物質でもある。前記試験製剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出所から得ることができる。組合せライブラリーは、ステップ-バイ-ステップ方式で合成できる多様な種類の化合物に生産することができる。多数の組合せライブラリーの化合物は、ESL(encoded synthetic libraries)方法(WO 95/12608,WO 95/12608,WO 93/06121,WO 94/08051,WO 95/395503及びWO 95/30642)により製造することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレー方法(WO91/18980)により製造することができる。バクテリア、カビ、植物、及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは、商業的な出所から得るか、又はフィールドで収集することができる。公知の薬理学的製剤は、構造的アナログを製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化反応、アミド化反応のような指示された又は無作為な化学的修飾にさらすことができる。
前記試験製剤は、自然的に生成される蛋白質又はその断片でもある。このような試験製剤は、自然出所、例えば、細胞又は組織溶解物から得ることができる。ポリペプチド製剤のライブラリーは、例えば、一般的な方法により生成されるか、又は商業的に入手できるcDNAライブラリーから得ることができる。前記試験製剤は、ペプチド、例えば、約5-30個、好ましくは約5-20個、さらに、好ましくは約7-15個のアミノ酸を有するペプチドでもある。前記ペプチドは、自然的に生成される蛋白質、ランダムペプチド、又は“バイアス(biased)”ランダムペプチドの切断物でもある。
前記試験製剤は“核酸”でもある。核酸試験製剤は、自然的に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス(biased)”ランダム核酸でもある。例えば、原核又は真核ゲノムの切断物は、蛋白質について記載したのと同様にして使用することができる。
いくつかの好ましい方法において、前記試験製剤は、小分子（例えば、約1,000以下の分子量を有する分子）である。小分子の調節製剤をスクリーニングするための方法には、高速分析アッセイを適用することができる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用できるSchultz(1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; The present inventorsller(1997) Mol Divers. 3:61-70; Fernandes(1998) Curr Opin Chem Biol 2:597-603; and Sittampalam(1997) Curr Opin Chem Biol 1:384-91。
本発明の方法にスクリーニング試験製剤のライブラリーは、GRS又はこれの断片であるが、アナログに対する構造研究を基に製造することができる。このような構造研究は、GRSに結合する可能性がある試験製剤の究明を可能にする。
GRSの３次元的構造は、多様な方法、例えば、結晶学構造、及び分子的モデリングで研究することができる。Ｘ-線結晶学を利用する蛋白質構造研究方法が文献によく知られている。Physical Bio-chemistry,Van Holde,K. E.(Prentice-Hall,New Jersey 1971),pp. 221-239,and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences,D. Eisenberg & D. C. Crothers(Benjamin Cummings,Menlo Park 1979)。GRSの構造に対するコンピュータモデリングは、GRSのスクリーニングのための試験製剤をデザインするための他の手段を提供する。分子的モデリング方法は文献に開示されている：U.S.Pat.No.5,612,894 and U.S.No.5,583,973。さらに、蛋白質構造は、中性子回折（neutron differaction）及びNMR(nuclear magnetic resonance)により決定できる：Physical Chemistry,4th Ed. Moore,W. J.(Prentice-Hall,New Jersey 1972),and NMR of Proteins and Nucleic Acids,K. Wuthrich(Wiley-Interrscience,New York 1986)。
本発明者らは、GRSが、CDHと相互作用してERK経路を調節し、細胞の死滅と成長を調節する点を初めて究明した。つまり、本発明者らは、GRSがCDH6と相互作用してPP2Aを通じてERK経路を調節し、細胞の死滅と成長を調節する点を究明した。
従って、本発明は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片と、CDHを接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階を含む癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供する。
より、具体的には、癌はこれらに制限はされないが、黒色腫、白血病、大腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳房癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、リンパ腫、再生不良性貧血などを含む。前記でリンパ腫は、ホジキン氏リンパ腫及び非ホジキン氏リンパ腫を全て含み、前躯Ｂ細胞腫瘍(Precursor B-cell neoplasm)のようなＢ型細胞新生物、前躯Ｔ細胞腫瘍のようなＴ細胞新生物とＮＫ細胞新生物、及び典型的ホジキン病のようなホジキンリンパ腫(Hodgkin lymphoma,Hodgkin disease)を含む。
本発明のGRS又はこの断片と相互作用する蛋白質は、CDHでもあり、好ましくはCDH6又はCDH18でもある。前記CDH6又はCDH18は、Genbankに公知の配列でもあり得る。より好ましくは、CDH6の場合、配列番号12、配列番号13又は配列番号14でもあって、CDH18の場合、配列番号15、配列番号16又は配列番号17でもある。本発明の実施例において、CDH6及びCDH18は、それぞれ配列番号12及び配列番号15を使用した。
一方、本発明のスクリーニング方法は、CDH6と相互作用するGRSを活用することができる。GRSの断片、例えば、配列番号２で表示されるGRSのanticoron結合ドメインを含む断片を利用して、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片と、CDHを接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階を含む癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
一方、本発明のスクリーニング方法は、（ｅ）前記（ｄ）段階で確認された試験製剤をCDH発現細胞に接触させる段階；及び（ｆ）CDH発現細胞のアポトーシスを測定する段階をさらに含むことでもある。本発明のスクリーニング方法は、
(ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS又はこの断片と、CDHを接触させる段階；
(ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
(ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；
(ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階；
(ｅ）前記（ｄ）段階で確認された試験製剤をCDH発現細胞に接触させる段階；及び
(ｆ）CDH発現細胞のアポトーシスを測定する段階を含むことを特徴とする癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法でもある。
本発明でGRSは、CDHと相互作用してERK経路を通じて癌細胞を死滅させるので、GRSとCDHの結合水準が変化した試験製剤がCDHと相互作用して、CDHを発現する細胞を死滅させることができる。前記試験製剤は、CDHとの結合に対してGRSを模倣するものでもあり得る。
本発明でCDHを発現する細胞は、CDH6又はCDH18を発現する細胞でもあって、好ましくは癌細胞でもあり、より好ましくは腎臓癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、又はこれらから由来又は分化された細胞でもある。
本発明でGRSとCDHの結合水準の変化は、結合水準の増加又は減少でもあって、例えば、GRSとCDHの結合水準の増加は、ERK経路への信号伝達増加の誘導により、細胞死滅を促進（又は増加）でき、GRSとCDHの結合水準の減少は、GRS機能の模倣を通じて細胞死滅を促進（又は増加）できる。
当業界に公知の多様な生化学的及び分子生物学的技術を本発明の実施に利用することができる。前記技術は下記の文献に開示されている。Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,Second(1989) and Third(2000) Editions; and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York(1987-1999)。
好ましくは、前記試験製剤が、まずGRS又はCDH生物学的活性を調節する能力があるかを選択的にアッセイする（１アッセイ段階）。具体的には、１次段階では、試験製剤の存在下で分離されたGRSの生物学的活性をアッセイして、前記ポリペプチドの生物学的活性を調節する調節製剤を究明する。より好ましくは下記の段階を含む。
(i)試験製剤の存在下でGRS又はCDH試験製剤を接触させる段階；
(ii)GRS又はCDHの活性を測定して、これの活性を変化させる試験製剤を選別する段階；
１次アッセイ段階では、GRS又はCDHの多様な生物学的活性に対する調節製剤がアッセイされることもある。試験製剤は、発現水準、例えば、転写又は翻訳を調節する活性があるかについてアッセイされることもある。さらに、前記試験製剤は、細胞内水準又は安全性、例えば、翻訳後修飾又は加水分解を調節する活性があるかについてアッセイされることもある。
以降、前記１次アッセイ段階を通じて生物学的活性を変化させる調節製剤を究明した後、前記試験製剤が、GRSとCDHの相互作用を変化させる能力があるかをテストする（２次試験段階）。
前記１次及び２次段階全てにおいて、変らないGRS及びこれの断片、アナログ又は機能的同等物を使用することができる。これらアッセイに使用できる断片は、一般的にGRSの生物学的活性を一つ以上保有する。前記断片又はアナログを含む融合蛋白質が、試験製剤のためのスクリーニングに使用される。GRSの機能的同等物は、アミノ酸欠失及び／又は挿入及び／又は置換を有するが、GRSと同一の生体活性を保有するものであるので、本発明のスクリーニング方法の実施に使用することができる。
当業界で一般的に実施されている多様なアッセイが、GRS又はCDH、これらの相互作用を調節する製剤の究明に使用することができる。前記製剤は、細胞基盤アッセイシステムでスクリーニングすることができる。例えば、スクリーニングするための典型的な細胞基盤アッセイにおいて（つまり、２次試験段階で）、試験製剤の存在下でリポーター遺伝子活性（例えば、酵素活性）を測定し、これを試験製剤の不在下でのリポーター遺伝子の活性と比較する。前記リポーター遺伝子は、当業界に公知の任意の検出可能なポリペプチド（反応又はリポーターポリペプチド）、例えば、蛍光又はリン光により検出可能なポリペプチドや、それが保有している酵素活性により検出可能なポリペプチドを符号化することができる。検出可能な反応ポリペプチドは、例えば、ルシフェラーゼ、アルファ -グルクロニダーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、クロラムペニコールアセチル転移酵素、緑色蛍光蛋白質、強化された緑色蛍光蛋白質、及びヒトから分泌されたアルカリ性リン酸化酵素である。
細胞基盤アッセイにおいて、試験製剤（例えば、ペプチド又はポリペプチド）は、宿主細胞内に存在する他のベクターにより発現することができる。ある方法では、試験製剤のライブラリーが前記ベクターのライブラリー（例えば、cDNAライブラリー）により符号化される。前記ライブラリーは当業界に公知の方法を利用して製造することができ(Sambrook et al.and Ausubel et al.,supra)、又は多様な商業的出所から得ることができる。
前述した細胞基盤アッセイの他に、非細胞基盤方法によってもスクリーニングすることができる。前記方法は、例えば、モビリティシフトDNA結合アッセイ、メチル化及びウラシル干渉アッセイ、DNase及びヒドロキシラジカルフットプリンティング分析（DNaseand hydroxyl radical footprinting analysis)、蛍光偏光(fluorescence polarization) 、及びＵＶ交叉結合又は化学的架橋剤を含む。一般的な概要は、Ausubelなどの文献に開示されている(Ausubel et al.,supra,chapter 12,DNA-Protein Interaction)。核酸及びDNA/RNA結合蛋白質を含む共同結合した蛋白質を分離する技術は、切断可能な架橋剤ジチオビス(dithiobis)、及び3,3'-ジチオビス(succinimidyl-propionate)を含むＵＶ交叉結合又は化学的架橋剤を含む(McLaughlin,Am. J. Hum. Genet.,59:561-569,1996; Tang,Biochemistry,35:8216-8225,1996; Lingner,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,93:10712,1996; and Chodosh,Mol. Cell. Biol.,6:4723-4733,1986)。
本発明に記載された図面について下記の通り説明する。
図１は大食細胞より分泌されたGRSについて示す。（Ａ）標識された細胞を血清がない培地で12時間培養して、培地に分泌された蛋白質をTACで沈殿させて、抗GRS抗体を利用して免疫ブロッティングを行った。GRSの発現の程度は、細胞全体を溶解させたGRS免疫ブロッティングで検出した。（Ｂ）RAW264.7細胞を血清がない培地で12時間培養して、分泌された蛋白質を免疫沈殿させ、抗GRS抗体を利用して免疫ブロッティングを行った。（Ｃ）血清がない培地で培養した多様な細胞種類の時間によるGRSの分泌の程度をモニタリングした。（Ｄ）血清がない培地で12時間培養した微細膠細胞(BV2),Tリンパ球、さらに、単核球類似大食細胞(U937)で、GRSの分泌を上記のように観察した。
図２は癌細胞から由来したFasリガンドシグナルにより誘導されるGRS分泌について示す。（Ａ）H460癌細胞を0.25×106 cell/wellで接種した。12時間後、血清のない培地に交換して、0.25×106〜1×106 cell/wellのU937単核球と６時間培養した。以降、培養培地でGRSの分泌の程度をTCA沈殿及び免疫ブロット法で検出した。（Ｂ）U937細胞と共に培養したHCT116癌細胞とGRS分泌の確認を前記のように検出した。（Ｃ）H460とRAW264.7細胞を共同培養して、GRS分泌を確認した。（Ｄ）骨髄由来の大食細胞とH460細胞を共同培養して、GRSの分泌の程度を観察した。（Ｅ）12時間培養したH460の培地を回収して、RAW264.7とU937細胞を６時間培養するための条件化された培地として使用した。GRSの分泌は前記のような方法で測定した。（Ｆ）Transwellチャンバで培養したH460細胞をU937と共に又は単独で血清がない培地で６時間培養して、GRSの分泌の程度を分析した。（Ｇ）活性化された抗-Fas抗体（CH11 clone,5μg/ml）を定められた時間毎にu937細胞に処理して、GRSの分泌の程度を確認した。（Ｈ）中性化させる抗-Fas抗体(ZB4 clone,0.2μg/ml)を共同培養システムの培地に添加して、GRSの分泌を前記の通り確認した。
図３は多様な種類の腫瘍細胞から分泌されたGRSのアポトーシス誘導について示す。（Ａ）容量別にビオチンと結合したGRSを、ストレプトアビジン-HRPにより捕らえられたMCF-7,HeLa,HCT116とRAW264.7細胞株で検出した。（Ｂ）RAW264.7とHCT116細胞に組替えヒトのGRSを定められた濃度別に処理して、細胞生存率をMTTアッセイを通じて測定した。陽性対照群にアドリアマイシン(2mg/ml)を使用して、細胞死滅を誘導した。（Ｃ）細胞死滅におけるGRSの効果は、flow cytometryを使用したsub-G1で観察した。sub-G1細胞の百分率はグラフで示した。Cytokinの活性を不活性化させるか否かを調べるために、GRS(150nM)を沸騰させた。（Ｄ）細胞死滅を誘導するGRSを活性caspase3の生成により観察した。（Ｅ）transwellを使用してU937細胞にHCT116を入れるか又は入れないまま、24時間チャンバで培養して、細胞生存率を上記の通り分析した。GRS効果を中和させるために、培地に抗-GRS抗体を添加した。（Ｆ）RAW264.7,MCF7,SH-SY5Y,HSF,HEK293,A549,H460,Hela、及びHCT116細胞に定められたGRS又はアドリアマイシンを24時間処理して、MTTアッセイを通じて細胞生存率における効果を確認した。３回の実験の平均から標準偏差を計算して、error barを表示した。
図４は、GRSの潜在的受容体としてのCDH6の確認について示す。（Ａ）Fc-融合可溶性 cadherinファミリー蛋白質のパネルをHis-タグGRS又はBSAでコーティングされた板に結合させて、複合体をIgG1 Fc-HRP試薬を使用して検出した。（Ｂ）CadherinsとGRS Fc-CDH2,6,18間の結合を確固にするため、His GRSと共に培養した。Fc-CDHsを蛋白質A/Gアガロースと共に沈殿させ、共に沈殿されたGRSを免疫ブロット法で検出した。（Ｃ）平衡分解定数(KD)を計算するため、固定させたFc-融合(ゴールドチップに)cadherinsを31.25nM〜1uMのGRSと共に培養した。GRSとCDH6の結合は、表面プラズモン共鳴法(SPR)により検出して、共鳴単位(RU)で示した。（Ｄ）CDH6とGRSドメインペプチド間の結合を確認するために、Fc-CDH6をGRT融合蛋白質として表されたGRSの異なるドメインと培養した。GRT-GRS蛋白質をGRS-セファロースビーズと共に沈殿させ、共に沈殿されたCDH6を免疫ブロット法で検出した。（Ｅ）免疫ブロット法によるCDH6の発現で５種類の相異する癌細胞を決定した。（Ｆ）HCT116細胞に非特異的siRNA調節又は別に考案された二つのsiRNA標的CDH6（#1と#2）を感染させて、ビオチンが処理されたGRS15nMを添加した後、GRSとの結合を免疫ブロット法で分析した。（Ｇ）HCT116細胞にsiRNAとsi-CDH6を前記のような方法で感染させ、GRSの結合可否をFACS分析法で測定した。（Ｈ）150nM His GRSと共にHCT116細胞を培養した。GRS影響を中和させるために、300nMのFc-fused CDH6を処理して、MTTアッセイ法で細胞生存率を測定した。error barは標準偏差で示した。
図５は、分泌されたGRSが、高度にリン酸化されたERK癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。（Ａ）HCT116細胞に定められた濃度のGRSを１時間処理して、相異する３種類のMARKsリン酸化の可否をそれぞれ特異的抗体を利用して検出した。（Ｂ）５種類の癌細胞株から免疫ブロット法でERKのリン酸化を調べた。（Ｃ）相異する５種類の活性Ras transfectanstsを発現するHEK293細胞にGRS(150nM)を処理して、そのERKリン酸化効果を前記のような方法により測定した。（Ｄ）GRSにより誘導された多くの細胞株死滅の敏感性は、MTTアッセイで測定した。３回の独立的な実験の平均で結果を示した。（Ｅ）Okadaic acid(PP2A阻害剤)、PP2B阻害剤、PTP CD45阻害剤、PTP B1阻害剤の内、一つを15分間処理して、GRS(150nM)を入れるか又は入れずに１時間培養して、ERKのリン酸化程度を測定した。CDH6とPP2Aの相互作用でGRSが及ぼす影響は、HCT116（Ｆ）Caki-1(G)細胞からそれぞれ共同免疫沈殿法で確認した。（Ｈ）HCT116細胞にGRSを処理して、それがPP2AとERK相互作用に及ぼす影響は、共同免疫沈殿法で観察した。
図６は、分泌されたGRSが、生体内で癌細胞死滅を誘導することを示した。（Ａ）BALB/cヌードマウスにHCT116細胞を皮下注入して９日間飼育した。GRS(10と20μg/dose)、又はPBS vehicleを癌細胞内部に注入した(n=5匹/群)。腫瘍の量は最長直径×最短直径２×0.52で計算した。（Ｂ）処理後１２日経過した、対照群（左側）と処理（右側、20μgGRS)された腕の２つの代表的なHCT116異種移植腫瘍マウスの写真である。（Ｃ）腫瘍の重さは同日に測定した。（Ｄ）表示された投与量に対照群とGRS処理された群の体重を反映した。（Ｅ）最適なカッティング温度の混合物に植えた組織(Optimal Cutting Temperatyre compound-embedded tissues)で作った10μmの厚さの凍結薄片で免疫蛍光染色をした。その組織はYo-pro（緑色）で処理して、免疫蛍光顕微鏡で観察した。核はDAPI（青色）で染色した。（Ｆ）BALB/c ヌードマウスにHCT116細胞を20μgのGRS又はPBSと共に注入して、15日間飼育した(n=6匹/群)。（Ｇ）処理後15日経過した、対照群（左側）と処理（右側、20μgGRS)された腕の２つの代表的なHCT116異種移植腫瘍マウスの写真である。（Ｈ）投与後15日目に対照群と処理されたマウスの腫瘍の重さを測定した。（Ｉ）対照群とGRS処理群の体重を測定した(n=5)。（Ｊ）OCT混合物で作った組織（厚さ10μmの凍結薄片）を、免疫蛍光染色のために使用した。
図７は、生体内で分泌されたGRSのCDH6依存的抗腫瘍効果を示す。（Ａ）ビオチン処理されたGRS(B-GRS)を、SN12細胞に表示された濃度で入れて培養し、ストレプトアビジン-付着 horseradish peroxidaseで細胞結合程度を確認した。（Ｂ）BALB/cヌードマウスにSN12細胞を５日間皮下注射して、２乃至６mg/kg用量のGRS又はPBS vehicleを４日間毎日腹膜内部に投与した(n=5匹/群)。腫瘍の量は、最長直径×最短直径２×0.52で計算した。（Ｃ）ビオチン処理されたGRS(B-GRS)を、RENCA細胞に表示された濃度で入れて培養し、細胞結合程度は前記のような方法で確認した。（Ｄ）BALB/cヌードマウスにRENCA細胞を５日間皮下注射して、２乃至６mg/kg用量のGRS又はPBS vehicleを上記のように腹膜内部に投与し(n=5匹/群)、腫瘍の量を測定した。（Ｅ）対照群と処理群のマウス腫瘍重さを測定して棒グラフで示した。（Ｆ）対照群と６mg/kg GRS処理群における、SN12異種移植組織のERKのリン酸化は、免疫ブロット法で測定した。（Ｇ）腫瘍細胞−大食細胞微細環境で、分泌されたGRS CDH6の相互作用を図式で表現した。GRSは、Fasリガンドのようなアポトーシス刺戟により大食細胞から分泌されるRas変異癌細胞のような活性化されたERK癌細胞で高い発現を示すCDH6と結合する。CDH6からのPP2Aの放出、活性化されたERKの脱リン酸化の結果、標的細胞の死滅が起る。
図８は、GRS分泌条件を示す（図１、２と関連）。（Ａ）ヒトとマウスの血清からGRSを検出した。３人のヒト（サンプル当り約80μgの蛋白質）と２匹のCL57BL/6マウス（サンプル当り約40μgの蛋白質）から得た2μlの血清サンプルをSDS-PAGEで分析し、GRS検出のために、ヒトとマウス間で交叉反応する抗-ヒトGRS単一クローン抗体でブロッティングした。同様に、同じゲルでヒトとマウス間で交叉反応する抗-ヒトβ-チューブリン,GAPDH,及び、LDH単一クローン抗体を利用して、それぞれブロッティングした。陽性対照群の抗体敏感度を確認するために、マウスN2A細胞の溶解物（蛋白質10μg程度）を使用した。（Ｂ）エストロゲン(50nM)、EGF(100ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)、及び、アドリアマイシン(Adr,1μg/ml)を処理したRAW264.7細胞とGRS分泌程度を定められた時間別に検出した。（Ｃ）RAW264.7、HCT116、HeLa細胞にアドリアマイシン(1μg/ml)、シクロヘキシミド(CHX,1μg/ml)を入れたTNF-α(1ng/ml)を処理又はグルコースが無い培地で定められた時間培養して、それぞれの細胞からGRSの分泌を観察した。（Ｄ）U937細胞でも定められた刺戟によるGRSの分泌の程度を測定した。（Ｅ）アドリアマイシン(Adr)処理したRAW264.7細胞から相異する３種のARSs(GRS,KRS,YRS)の分泌の可否を確認した。
図９は、GRS分泌が細胞溶解と関連がないことを示した（図２と関連）。RAW264.7細胞にアドリアマイシン(Adr)、グルコース剥奪(Glu)、及び、FASリガンド(Fas)を４時間処理した。陽性対照群で、細胞にUV(200J/m2)を照射して18時間培養した。細胞死滅と生存率はそれぞれFACS(A)とMTT(B)分析を通じたsub-G1細胞個体数で測定した。（Ｃ）細胞外液のLDH enzyme活性を同じ条件下でLDH cytotoxicity kitを使用して測定した。（Ｄ）血漿膜保存は免疫蛍光染色法で観察した。4%のパラホルムアルデヒドで固定させた大食細胞にYo-pro（緑色）と、propidium iodide（赤色）を処理後免疫蛍光顕微鏡で観察した。核はDAPI（青色）で染色した。（Ｅ）定められた時間別に、U937細胞に活性化された抗-Fas抗体(CH11 clone,5μg/ml)を処理して、GRSとGAPDHの転写水準をRT-PCRで確認した。（Ｆ）シクロヘキシミド(CHX,20μg/ml)を15分間予め処理後、活性化された抗-Fas抗体を添加した。４時間培養して、培地内蛋白質をTCAを使用して沈殿させて、SDS-PAGEで分析した。
図10は、細胞との結合による標的細胞の確認とアポトーシスのさまざまな媒介者の内、GRSの効果について示す（図３と関連）。（Ａ）定められた時間毎に、HeLaとHCT116細胞にビオチンが添加されたGRS(30nM)を処理して、免疫ブロット法でGRSの細胞との結合の程度を観察した。（Ｂ）ビオチンが添加されたGRSの結合が、特別に標識されていないGRSと競争するか否かを調べるために、HeLa細胞にHis GRS（150nM)を15分間予め処理するか、又は処理していない次のビオチンが添加されたGRSに添加して30分間培養した。ビオチンが添加されたGRSの細胞結合程度は免疫ブロット法で確認した。（Ｃ）HCT116細胞にさまざまな濃度のビオチンが添加されたGRS又はBSAを１時間処理した。ビオチンが添加されたGRS(30nM)の結合が、特別に表示されないGRSと競争するかを調べるために、その細胞に表示されていないGRS(150nM)と共に予め培養した。ビオチンが添加されたGRSとHCT116細胞との結合は、Alexa488-付着ストレプトアビジンを利用した免疫蛍光染色法で観察した。（Ｄ）BAXとBci-2でGRSの効果は、それぞれの特異的な抗体を使用した免疫ブロット法で確認した。（Ｅ）ミトコンドリアで放出されるシトクロムCでGRSの効果を確認した。
図11は、ヒトのGRSでサイトカイン活性域を確認したことを示す（図３と関連）。（Ａ）表示された機能的ドメインからなる685aaヒトGRSは、GRT融合蛋白質として精製された４個の断片(F1-4)に分離されている。F1を除く３個の断片(F2-4)は、水溶性形態で取得した。WHEP域は、特定のヒトアミノアシル-tRNAの合成酵素に付着した多機能ペプチドドメインである。触媒及びアンチコドン付着域は、それぞれF1/F2とF4にある。（Ｂ）ヒトのGRS(D63-G674)の３次元的立体構造とサイトカインアッセイに使用されたヒトのGRS(F2-4)欠失断片は、ACCELRYS DS Visualizer v2.0を使用して多様な色相を示した。（Ｃ）細胞生存率におけるGRS断片の効果は、MTT分析を使用して比較した。
図12は、GRSとCDH6の結合を確認した結果を示す（図４と関連）。解離定数(KD)を計算するために、Fc-融合cadherins(CDH18)(A)又はFc蛋白質(IgG)(B)をゴールドチップに固定させて、GRS(1uM〜31.25nM)を表面に撒いた。cadherinとGRS間の結合はSPRで確認した。（Ｃ）非特異的siRNA(si-con)又はCDH6(si-CDH6 #1と#2)を標的にするsiRNAを感染させたHCT116にGRS(3-nM)を処理して、CDH6での蛋白質水準を免疫ブロット法で確認した。
図13は、CDH6とERKリン酸化の相互関連性について示す（図５と関連）。（Ａ）定められた時間の間、150nMGRSをHCT116細胞に処理して、ERK、p38 MAPK、及び、JNKのリン酸化効果を免疫ブロット法で確認した。（Ｂ）死滅したRas-形質感染293細胞における、GRSの影響を、flow cytometryを使用してsub-G1で確認した。（Ｃ）多様な癌細胞における、CDH6の発現及びERKリン酸化の細胞水準での比較を、免疫ブロット法で比較した。対照群にチューブリンを使用した。（Ｄ）HEK293細胞にそれぞれFlag-タグK-,N-,H-RAS(oncogenic mutants)を感染させて、ウェスタンブロット法でCDH6の発現に及ぼす効果を確認した。（Ｅ）HCT 116細胞にGRSを処理して、PP2Aリン酸化に及ぼす影響を免疫ブロット法で確認した。
図14は、生体内でGRSとその域における抗癌効果と毒性を確認したことを示す（図６，７と関連）。（Ａ）BALB/cヌードマウスにGRS F2又はF4切片20μgを添加したHCT116細胞を注入して15日間飼育した(n=6匹/群)。（Ｂ）２種のGRS F2及びGRS F4切片を注入して15日後のHCT116異種移植腫瘍マウスの代表的写真である。（Ｃ）注入15日後、GRS F2とGRS F4切片を処理したマウスの腫瘍重さを測定した。（Ｄ）GRS F2とGRS F4切片を処理したマウスの日付別体重を測定した(n=6)。SN12(E)とRENCA細胞(F)を異種移植したマウスの体重を測定した(n=5)。誤差の棒グラフは標準偏差を示す。
本発明は、GRSとCDHの新規な使用に関し、癌の予防及び治療剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、多様な疾患の新たな治療剤の開発に有用に利用することができる。
図１は、大食細胞から分泌されたGRSについて示す。 図２は、癌細胞から由来したFasリガンドシグナルにより誘導されるGRSの分泌について示す。 図３は、多様な種類の腫瘍細胞から分泌されたGRSのアポトーシス誘導について示す。 図４は、GRSの潜在的受容体としてのCDH6の確認について示す。 図５は、分泌されたGRSが高度にリン酸化されたERK癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。 図６は、分泌されたGRSが生体内で癌細胞の死滅を誘導することを示す。 図７は、生体内で分泌されたGRSのCDH6依存的抗腫瘍効果を示す。 図８は、GRS分泌条件を示す。 図９は、GRS分泌が細胞溶解と関連がないことを示す。 図10は、細胞との結合による標的細胞の確認とアポトーシスのさまざまな媒介者のうち、GRSの多様な効果について示す。 図11は、ヒトのGRSでサイトカイン活性域を確認したことを示す。 図12は、GRSとCDH6との結合を確認した結果を示す。 図13は、CDH6とERKのリン酸化の相互関連性について示す。 図14は、生体内でGRSとその域での抗癌効果と毒性を確認したことを示す。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみであり、本発明の内容は、下記実施例に限定されるものではない。
<実験方法>
１．分泌アッセイ
RAW264.7細胞を調整培地で培養した。10%TCAを使用して、培地を集めて蛋白質を沈殿させた。沈殿した蛋白質は、SDS-PAGEを通じて分離し、免疫ブロッティングをするためにPVDFに移した。
２．共同培養アッセイ
U937又はRAW264.7細胞(0.125×106 cells〜1×106 well)を、H460又はHCT116細胞のために接種して、6-well platesで12時間培養した。次に、血清のない培地に移して６時間培養した。GRSの分泌可否を調べるため、培養した培地を集めて10%TCAを利用して蛋白質を沈殿させた。共同培養した大食細胞／単核球と腫瘍間で生理的相互作用がGRS分泌に必須的であるか否かを証明するために、0.4μmの孔を有する挿入物が挿入できる24-well transwell細胞培養チャンバを使用した。H460細胞をこのチャンバに接種して、U937細胞は挿入物内に接種して、H460:U937を1:2の比でそれぞれ別々に12時間培養した。挿入物をH460が培養されているチャンバに移した。培養24時間後、挿入物を除去して分泌物分析のために培地を集めた。
３．細胞死滅アッセイ
テストされた細胞を定められた時間に、多様な濃度の組替えGRSで処理後、回収した。回収した細胞をPBSで洗浄後、70%エタノールで１時間固定させ、PBSに溶かした50μg/ml propidium iodide溶液で染色した。CellQuestプログラムを利用したFACSを使用して、サンプル当り20,000個の細胞を読んだ。MTT分析のため、5mg/ml濃度のMTT溶液20μlを培養培地に添加した。４時間培養後、200μlのDMSOを添加した。570nMnの吸光度をmicroplate reader(TECAN,Mannedorf,Swiss)で測定した。pro-caspase 3からの活性化されたcaspase 3の生成は、それぞれの抗体を利用した免疫ブロット法で検出した。
４．可溶性受容体結合アッセイ
GRSの受容体を確認するため、Maxisorp plate(Nunc,Rochester,NY)をELISA検出に使用した。plateに、PBSに溶かした精製されたhis-タグGRS(1μg/ml)又はBSA(1μg/ml)でコーティングして、4%脱脂乳を処理した。1μg/mlの融合cadherinファミリー蛋白質をplateに添加して、0.05%のPBST(PBS-tris)で洗浄後、抗-human IgG1 Fc-HRPを入れて培養した。培養後、洗浄して、TMB(tetramethylbenzidine)溶液を添加して、450nMで吸光度を測定した。相互作用を確認するために、1μg/mlの精製されたFc-CDH2,6,18に1μg/mlのHis-GRSを入れて２時間培養した。この反応は、蛋白質A/GアガロースとFc-融合cadherinsの免疫学的沈殿を起こして、複合体検出のために抗-GRSを利用して、免疫ブロッティングを行った。
５．異種移植マウスのモデル
動物実験は、ソウル大学校大学動物管理及び使用委員会指針を遵守して行った。BALB/cヌード雌性マウスに20-gauge注射を使用して、皮下に3×107細胞のHCT116,SN12とRENCAを注入して、発癌を誘導した。２週毎に腫瘍の成長を確認して、腫瘍形成が観察されるとキャリパスで大きさを測定した（腫瘍の量は長さ×幅２×0.52で計算した）。伸長腫瘍細胞であるSN12とRENCAを５日間育てながら、His GRS蛋白質を腹膜内部に４日間毎日注入した。復帰モデルを作るため、腫瘍細胞を９日間育てて、His GRS蛋白質を腫瘍内に注入した。His GRS蛋白質を腫瘍細胞に注入するか又は注入せずに成長モデルを作った。犠牲にした後、腫瘍の重さを測定して、免疫蛍光染色のために、最適の切断温度(OCT)混合物に深く差込んだ。10μmに切断された凍結切片をスライドに付着させて、PBSを処理後、4%パラホルムアルデヒドで固定させた。2%CASが含有されたPBSを処理して、Yo-Pro-1(Invitrogen)で37℃で２時間染色した。0.1%Tween20が含有されたPBSでスライドを洗浄して、DAPIで核を37℃で30分間染色した。付着した切片を共焦点免疫蛍光顕微鏡で観察した。
６．細胞培養と材料
RAW264.7,SH-SY5Y,HSF（ヒトの皮膚繊維芽細胞）、HEK293、BV2,MCF-7,SN12,SK-BR-3,BT474、HeLa細胞を、15%牛胎兒血清,50μg/mlストレプトマイシン,ペニシリンを添加したDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培地で培養した。A549,H322,H469,Caki-1,RENCA,HT1080とJurkat細胞の培養のため、前記の通り、添加物を添加したRPM1640培地を使用した。full-length human GRS(Abcam,Cambrage,UK)に対して、ウサギの多重クローン抗体を使用して、ウェスタンブロッティング分析をした。CDH6を標的とするSi-RANs(5'UUUCAUAGAACUCAGCAAAUUCUGG-3'（配列番号18）と5'-UAAUAAUGAAGAGAUCUCCUGCUCC-3'（配列番号19))をInvitrogen(Carlsbad,CA)から購入して使用した。陰性対照群にStealth universal RNAi(Invitrogen)を使用した。
７．組替えヒトのGRSの合成
685個のアミノ酸を符号化するHuman GRS cDNAをpET-28のEcoRIとXhoI制限酵素位置にクローニングして、E.coli RosettaでIPTG誘導により過発現を確認した。nickel affinity chromatography(Invitrogen)を利用して、マニュアル指示の通りにHIS-タグGRSを精製した。GST-GRS切片も、E.coli RosettaでIPTG誘導により発現を確認した。GRS-fusion蛋白質は、glutathione-セファロースに0.5%Triton X-100を含有するPBS緩衝溶液を使用して精製した。lipopolysaccharide(LPS)を除去するために、100mM NaClを含有した10mM pyrogen-free potassium phosphate緩衝溶液(pH6.0)に蛋白質溶液を希釈した。希釈後、GRS含有溶液を、同じ緩衝溶液で予め平衡にしたpolymyxin resin(Bio-Rad)に入れて、２時間放置後除去した。LPS残余物を除去するために、溶液に20%グリセロールを含有したPBSを入れて希釈し、Mustang E membrane(Pall Gelman Laboratory,Ann Arbor,USA)のAcrodisc unitを通過させてろ過した。
８．GRS分泌アッセイ
RAW264.7細胞は、培地の70%程度に増殖するまで培養した。細胞を２回洗浄して、血清とグルコースの無いDMEM培地で培養した。アドリアマイシン(1mg/ml,Calbiochem,San Diego,CA),シクロヘキシミド(1ug/ml,Sigma St. Louis,MO)を含有したTNF-a(1ng/ml,BD Pharmingen,San Diego,CA),Fas-リガンド(10ng/ml,Millipore)又は抗-Fas抗体(5μg/ml,clone CH11,Millipore,Billerice,MA)を血清の無い培地に追加添加した。定められた時間毎に培養培地を集めて、500gで10分間遠心分離し、汚染物を除去するために、20,000gで15分間遠心分離した。4℃で12時間10%TCAを処理した上澄液を、18,000gで15分間遠心分離して蛋白質を得た。得られた沈殿物を100mM HEPES緩衝液(pH8.0)に溶かして、10%SDS/PAGEで分離した後、蛋白質をPVDF membraneでトランファーさせて多重クローン抗体で免疫ブロッティングを行った。上澄液中の一部を抗-IgGで予め除去して、抗 -GRSを入れて4℃で２時間放置した。これにProtein A アガロース(Invitrogen)を添加してその混合物を4℃で４時間放置した。Protein A アガロース ビーズを沈殿させて、150mM NaCl,1%Triton X-100,10mMNaF,1mM sodium orthovanadate,10%グリセロールとprotease阻害剤(Calbiochem)を含有した50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)で３回洗浄後、結合した蛋白質を同じ緩衝液を使用して除去した。
９．細胞壊死アッセイと血漿膜保存評価
RAW264.7細胞を6-well皿に接種して12時間培養した。細胞を２回洗浄後、表示した条件の培地で培養した。培地内のLDH含量を測定するために、培地を集めて2,000gで15分間遠心分離した。上澄液を回収し、LDH-cytotoxicity assay kit(BioVision viw,CA)を使用して、指示された方法によりLDH酵素活性を測定した。全体細胞の内のパーセンテージでLDH放出の程度を示し、細胞生存率を計算した。免疫蛍光染色法で膜保存の程度を観察するために、22×22mm cover glassesに細胞を接種して24時間培養した。培養皿をPBSで２回洗浄して、表示した条件の培地で培養した。細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定させて、冷たいPBSで２回洗浄した。カバーガラスにPBSに溶かした3%CASを添加して30分間培養後、PBSに50μg/ml propidium iodide,5uM Yo-Pro-1(Invitrogen)を入れて溶かした溶液を添加して、１時間培養した。核は4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)を使用して染色した。細胞を蛍光顕微鏡に固定させて観察した。
１０．細胞結合アッセイ
6-well皿に細胞を接種して12時間培養した。ビオチンが添加されたGRSを培養培地に入れて定められた時間培養した。細胞を冷たいPBSで４回洗浄後、150mM NaCl,2mM EDTA,1%Triton X-100,1%sodium deoxycholate,10mM NaF,1mM sodium orthovanadate,10%グリセロールと蛋白質分解酵素阻害剤が含有された50mM Tris-HCl(pH7.4)緩衝液で溶解させて、18,000gで15分間遠心分離した。抽出された蛋白質(30μg)をSDS/PAGEで分解し、ストレプトアビジン-附Horseradish peroxidase(HRP)(Pierce,Rockford,IL)を使用して検出した。組替えGRS(1.5mg)をビオチン化させるために、PBSに溶かした0.25mg sulfo-NHS-SS-biotin(Pierce)を入れて４℃で２時間放置した。免疫蛍光染色法でGRSの細胞との結合を確認するために、22×22mmカバーガラスに細胞を接種して12時間培養した。培養皿にビオチン添加GRS又はBSAを入れて１時間培養した。細胞に4%パラホルムアルデヒドを入れて10分間固定後、冷たいPBSで２回洗浄した。PBSに溶かした3%CASをカバーガラスに添加して30分間培養し、Alexa488-付着ストレプトアビジン(invitrogen)でビオチン結合GRSを表示した。細胞は共焦点免疫蛍光顕微鏡に固定して観察した。fiow cytometryでGRSの細胞結合程度を観察するために、特異的si-RNAを細胞に感染させて48時間培養した。前記の方法で処理した細胞をPBSで３回洗浄し、FACS緩衝液(2%BSA含有PBS)に溶かしたAlexa488-付着ストレプトアビジン(invitrogen)で１時間染色した。次いで、細胞をPBSで３回洗浄した。cellQuest software(BD Biosciences,Mountain view.CA)プログラムを利用したflow cytometryで細胞を分析した。
１１．表面プラスモン共鳴分析
Cadherin-Fcfusion蛋白質とGRSの結合は、ProteOn XPR36蛋白質相互作用Array System(BioRad)を利用したSPR技術により確認した。CDH6、18 and IgG（陰性対照群）を製造社の指示によるアミン結合方法により、GLCゴールドチップに固定させた。精製したGRSを多様な濃度で0.005%Tween 20を含有したPBSに溶かした流動細胞に、100μl/minで60秒間入れて600秒間分離させた。結合程度は共鳴単位(RU)の変化で確認し、共鳴単位は1pg/mm2に定義した。Sensogramは対照群表面から記録された反応を差引いたものにした。平衡分解定数はProteon ManagerTM software(ver2.1)を利用して計算した。資料はLangmuir 1:1結合モデルを使用して評価した。
１２．RT-PCRアッセイ
細胞を6-well皿で12時間培養した後、２回洗浄して刺戟を与えた。random hexzmerと共にRNeasy mini kit(QIAGEN,Valencia,CA)を使用して総RNAsを抽出し、GRS特異的プライマーとGAPDHを入れてRT-PCRを行った。
１３．シトクロム Cの放出アッセイ
シトクロム Cの転移はウェスタンブロットで確認した。HeLa細胞に150nM GRSを入れて定められた時間培養した後、細胞を集めて、10mM 塩化カリウム,1.5mM MgCl2、0.5mM EDTA,1mM DTTと20mM蛋白質分解酵素阻害剤を入れたHEPES(PH7.5)貯蔵性緩衝液（氷に５分間入れておいた）で溶かして６回均質化した。均質化したサンプルを10,000ｇで10分間遠心分離した。上澄液から得た蛋白質でSDS-PAGEを実施して、シトクロム Cとチューブリンに対する多重クローン抗体を探針に使用した。
<実験結果>
１．大食細胞からGRSの分泌
３人の別々の人の血清と２匹の別々のCL57BL/6の血清からGRSが検出された。β-チューブリン、LHD又はGAPDHでもない細胞溶解の不足は、一括して同じサンプルから検出された。このような結果は、分泌されたGRSの生理学的機能についてより多く知るきっかけとなった。癌の微細的環境から分泌されたGRSの生理学的機能に対する手掛かりを掴むために、GRSの分泌が、培養された細胞から検出できるのか、もし検出できるとすれば、そのような分泌が細胞のタイプによって特異的なものであるのか否かについて実験した。６種の相異する細胞株(H322,A549,HEK293、HCT116,RAW264.7,HeLa)を血清の無い培地で12時間培養して、TCAを使用した培地から分泌された蛋白質を沈殿させた。沈殿された蛋白質を抗GRS多重抗体（α-GRS)を利用してウェスタンブロットで検出した。実験に使用した６種の細胞の内、ただ、マウスの大食細胞細胞株であるRAW264.7でのみGRSが検出された。同じ条件下でチューブリンは、培地に放出されず、培地に存在するGRSは、細胞溶解によるものでないことが観察された（図１Ａ）。
GRSの分泌をさらに確認にするために、血清の無い培地で培養されたRAW264.7の細胞にある蛋白質を免疫沈殿させて、α-GRSでブロッティングした。全長GRSは、α-GRSによって獲得された免疫沈殿物から検出されたが、mock IgGと共には検出されなかった。RAW264.7の細胞において、時間に伴うGRS分泌傾向を見れば、GRSは12時間飢えさせた培地で検出され、以降の時間からは多少増加した（図１Ｃ）。
GRS分泌の明らかな特性を勘案して、Ｔリンパ球 Jhrket細胞、microglia-由来 BV2細胞、及び、類似大食細胞U937単核球のような他の免疫細胞を研究した。GRSは、RAW264.7細胞と同じ培地条件下で、U937細胞でのみ検出され、JhrketBV2では検出されなかった（図１Ｄ）。従って、GRSは飢餓条件下で大食細胞又は単核球から分泌されたことが分かった
２．多様なアポトーシスストレスはGRS分泌を誘導
飢餓条件下で、GRS分泌が他の刺戟によって生じるか否かを知るために、RAW264.7細胞にシグナル分子を処理した。これらには、大食細胞からサイトカイン生産を調節するエストロゲン、大食細胞分化に影響を及ぼすTNF-α、大食細胞と腫瘍細胞から分泌されるEGF、追加してDNA損傷を通じた細胞死滅を誘導するアドリアマイシンが含まれる。これら４種のリガンドそれぞれに６時間かけて処理した後、アドリアマイシンだけがGRS分泌を誘導した（図８Ｂ）。このような結果は細胞死滅ストレスがGRSの分泌に重要であることを示した。このような機能性を有するRAW264.7細胞に、他の細胞死滅ストレスを処理して、時間別にGRS分泌を比較した。アドリアマイシン処理時に、グルコース欠乏とシクロヘキシミドを入れたTNF-αを処理した結果、RAW264.7からGRSが時間依存的に分泌されたが、ヒトの大腸癌細胞であるHCT116と子宮頸部癌細胞であるHeLaでは分泌されなかった（図８Ｃ）。このような３種の細胞死滅ストレスはU937細胞からもGRS分泌を誘導した（図８Ｄ）。GRSと対照的に、KRS,YRS,他に知られたAARSサイトカインは、アドリアマイシンを処理したU937細胞からは検出されなかった（図８Ｅ）。
３種の細胞死滅ストレス処理後、直ぐにGRSが分泌されるので、GRS分泌は細胞溶解物から現れたものではない。この結果を確認するため、sub-G1細胞周期ポピュレーションの観察とMTTアッセイにより、細胞溶解の程度を決定した。GRSの分泌を誘導する条件の如何なる細胞死滅ストレスも、細胞周期と生存率に影響を及ぼさないことが分った（図９ＡとＢ）。そこで定められた培地でcytosolic lactate dehydrogenase(LDH)の活性を測定した。培地におけるLDH活性は、細胞抽出物におけるそれの10%未満であって、定められた培地で増加しなかった（図９Ｃ）。細胞膜の保存は、アポトーシスやネクローシスにおいて損なわれるため、RAW264.7細胞を膜透過性Yo-Proと膜非透過性propidium iodideで染色した(Bhatnagar et al.,2007.Blood 110,3234-3244)。細胞死滅ストレス誘導後、核は如何なる染色剤によっても染色されなかった。しかし、UV(200J/m2)を照射後18時間培養した大食細胞は、核DNAが染色された（図９Ｄ）。このような結果は、GRS分泌が細胞溶解や膜破壊によるものでないことと一致する。
３．癌細胞から由来したFasリガンドによるGRS分泌誘導
多様な機能の内、大食細胞は癌細胞微細環境の免疫監視において重要な役割をする。大食細胞が腫瘍細胞に接近することが、GRS分泌に影響を及ぼすかを確認するために、H460(human large cell lung tumor)とU937細胞を共同培養した。GRSの分泌のみが有意に観察され、KRSとYRSとWRSの分泌は観察されなかった。U937細胞の増加に従って、その分泌量も増加した（図２Ａ）。
HCT116とU937細胞、H460とRAW264.7細胞の共同培養でもGRS分泌を確認することができた（図２ＢとＣ）。追加して共同培養で骨髄由来大食細胞を使用して実験し、生体外アッセイでもGRSが分泌されることを確認した（図２Ｄ）。次に、GRS分泌に腫瘍と大食細胞間の物理的接触が求められるかを確認するため、上述した通り、条件培地とTranswell培養皿を使用した（Khodarev et al.,2002.J.Cell.Sci.116,1013-1022)。H460細胞から回収した条件培地は、RAW264.7とU937細胞からのGRS分泌を有意に誘導した（図２Ｅ）。Transwell皿チャンバにあるH460と挿入物で培養していたU937細胞をそれぞれ分離した。U937細胞数が増加するにしたがって、GRS分泌量も増加した（図２Ｆ）。このような結果は、GRS分泌に癌と大食細胞間の物理的接触が求められないことを示す。
Fasリガンド分泌により、腫瘍細胞が免疫監視網を避けて、細胞周期ストレスと共同培養された腫瘍細胞によりGRS分泌が起り得るので、FasリガンドがGRS分泌に関与するか否かを調べた。このような可能性を確認するために、条件培地にU937細胞に対するFas-抗体を過量添加して、これがGRS分泌を誘導するかを調べた。この処理後、時間に従って培地にGRSが蓄積されることを確認した（図２Ｇ）。FasリガンドとGRS分泌間の相関関係を確認するために、共同培養システムに過量の拮抗するFas-抗体を添加した。効果を中和させた後には、培地でGRS分泌が減少した（図２Ｈ）。しかしながら、RT-PCR分析法で確認した結果、GRSに該当する遺伝子の転写に、Fasが影響を及ぼすか否かに対する証拠はなかった（図９Ｅ）。さらに、シクロヘキシミドとde novo蛋白質合成酵素の封鎖は、GRSの分泌を阻害しなかった（図９Ｆ）。これらの結果は、癌細胞由来のFasリガンドによりGRSが分泌するモデルと一致した。
４．分泌されたGRSの細胞との結合
分泌されたGRSの標的細胞を確認するために、ビオチンが添加されたGRSを多様な濃度で処理したヒトの乳房癌細胞であるMCF7,HeLa,HCT116とRAW264.7を培養した。実験の結果、ビオチンが添加されたGRSがHCT116、HeLaとRAW264.7細胞では用量依存的に検出されたが、MCF7では検出されなかった（図３Ａ）。同じ条件でビオチンが添加されたBSAは、４種のどの細胞からも検出されなかった。HeLaとHCT116細胞において時間別にGRSの結合程度を観察した。ビオチンが添加されたGRSの結合は、細胞と共に培養して５分後から検出されて、15〜30分で最高に増加した（図10Ａ）。GRSによる細胞結合特異性を確認するため、標識されていないGRSと共に細胞を15分間培養した後、ビオチンが添加されたGRSを添加した。細胞に標識されていないGRSが予め処理された時、ビオチンシグナルが目立って抑制された（図10Ｂ）。GRSの細胞結合は免疫蛍光染色で観察した。染色の強度はGRSの量によって増加したが、標識されていないGRSが添加された時は減少した（図10Ｃ）。従って、染色の強度はGRS結合の程度によって特異的である。このような結果から見て、分泌されたGRSは、特に腫瘍細胞と大食細胞を標的としたことが分かる。
５．腫瘍細胞におけるGRSの前アポトーシス効果
GRS分泌がFasのようなアポトーシスリガンドにより誘導されて、腫瘍細胞と結合したGRSが、大食細胞から分泌されるので、GRSが前アポトーシス効果を示すか否かを調べた。細胞生存率と死滅をMTT法で観察し、sub-G1細胞増殖をflow cytometryで確認した。GRSを処理した時、RAW264.7では現れなかったが、HCT116細胞の生存率が投与量依存的に減少した（図３Ｂ）。RAW264.7で現れなかったHCT116でのsub-G1の増殖は、GRSの処理によって増加した（図３Ｃ）。GRS処理によるアポトーシス細胞死滅は、caspase 3の活性によって確認された（図３Ｄ）。BaxとBcl-2の細胞的水準、及びシトクロムCの放出の観察により、GRSのアポトーシス活性を実験した。GRSはBAXの細胞的水準には影響を及ぼさなかったが、anti-アポトーシス mediator Bcl-2のレベルを減少させ（図10Ｄ）、細胞死滅のシグナルとして知られるシトクロムCの放出を増加させた（図10E）。加熱不活性化されたGRSは、如何なる前アポトーシス効果をも発揮できず（図３ＣとＤ）、基本形態のGRSは、前アポトーシスに重要な影響を及ぼすことが示された。
GRSが生理学的環境で細胞死滅を誘導するかを確認するために、Transwellチャンバに抗-GRS抗体を入れるか又は入れないままで、HCT116とU937を共同培養した。HCT116細胞の生存率は、U937との共同培養により減少した。しかしながら、α-GRSの添加は、U937細胞の生存率において、GRSの効果を損なわせた（図３Ｅ）。追加実験で、GRSは、ヒトの肺胞腺癌であるA549とH460,HCT116、HeLaを含むさまざまな腫瘍細胞株の生存率を減少させた。しかし、GRSは、MCF-7,neuroblastomaSH-SY5Y細胞、ヒトの皮膚繊維芽細胞、ヒトの胎児腎臓、RAW264.7細胞の生存率には、影響を及ぼさなかった（図３Ｆ）。従って、GRSは、癌細胞特異的に前アポトーシス活性を示した。
６．アンチコドンバインディング(Anticodon-binding)ドメインは細胞死滅に影響を及ぼす
GRSの前アポトーシス活性にドメインが及ぼす影響を確認するために、４個の異なる切片の構造物を示す、ヒトのGRSの知られたx-ray crystal構造を使用した（図11Aと11B)。４個の異なる切片の内、３個の可溶性形態(F2〜4)を得た。低い安全性と可溶性のため、GRSのN-terminal切片を得ることは失敗した（F1）。F2〜4切片をそれぞれHeLaとRAW264.7細胞に添加した。150nM濃度のGRSと175アミノ酸C-terminalアンチコドン結合域(ABD)は、HeLa細胞の生存率を減少させた。これとは対照的に、F2とF3切片では、GRS又はABDの活性を比較できなかった。このような結果は、ABDが、GRSの前アポトーシスサイトカイン活性を有する個所であることを示した（図11Ｃ）。
７．GRSの機能的受容体としてのcadherin-6
分泌されたN-terminal-truncated WRSが血管生成を阻害するためにVE-cacadherinと結合することを勘案して(Tzima et al.,2005.J.Biol.Chem.80,2405-2408)、さまざまなcadherins(CDHs)が腫瘍細胞の生存と悪性に関連のあることが知られているので(Cavallaro and Chrostofori,2004.Net.Rev.Cancer 4,118-132)、GRSが11種の相異するCDH蛋白質と結合できるかを実験した。個別にヒトのIgG1のFc切片と融合する11種の異なるcadherinsの細胞の域とHis GRSの相互作用をELISAアッセイ法で確認した。このスクリーニングは、GRSのCDH6とCDH18との特異的結合を確認するためのものであり、その他のCDHに関するものではない（図４Ａ）。GRのCDH6とCDH18との結合（CDH2とではなく）の可否は、in vitro pull-down assayで確認した（図４Ｂ）。
GRSのCDH6とCDH18との結合親和力を表面プラスモン共鳴アッセイ法で測定した。GRSはCDH6とCDH18にそれぞれKＤ=3.4と1.25nM程度で結合し（図４Ｃと12Ａ)、IgG蛋白質とは結合しなかった（図12Ｂ）。次の研究では、F2とF3でないF4切片で符号化されたABD域でのみ、CDH6と結合することをpull-downアッセイで確認した（図４Ｄ）。また、F2とF3でないF4切片のみが、CDH6と結合することをELISAアッセイで確認した（F1切片は解明できない）（図４Ｉ）。
CDH6は肝癌、腎臓癌、小さい肺癌細胞(SCLC)の病因と関連があるので(Shimoyama et al.,1995.Cancer Res.55,2206-2211,Li et al.,2005.Anticancer Res.25,377-381)、CDH6が腫瘍細胞からGRSの機能的受容体として作用することができるか、否かを調べた。まず、実験した腫瘍細胞株の内、CDH6蛋白質の発現の程度を確認した。CDH6発現がGRS-非感受性癌細胞(MCF7,SH-SY5Y)ではそうではなかったが、GRS-感受性癌細胞（HCT116、H460,HeLa)の内で、上向調節されたことを確認した（図４Ｅ）。ウェスタンブロット分析（図４Ｆ）とflow cytometryを利用して、GRSとHCT116との結合が、CDH6転写が非特異的対照群si-RNAではない特異的なsi-RNAによって抑制される時、減少することを確認した（図４Ｇと12Ｃ）。次に、CDH6の可溶性細胞の外部域が、GRSのアポトーシス活性を相殺できるか否かについて実験した、HCT116細胞の生存率から、可溶性CDH6受容体蛋白質の添加により、GRSの影響が減少することを確認した（図４Ｈ）。このような結果は、CDH6が腫瘍細胞においてGRSの機能的受容体であることを示す。
８．ERK活性抑制を通じたGRSの細胞死滅誘導
GRS処理が誘導する細胞死滅メカニズムを調べるために、HCT116細胞にGRSを処理して、3mitogen-activated蛋白質キナーゼであるERK、p38、MAPK、JNKにおける効果を観察した。リン酸化されたERKとp38MAPKの水準がGRS処理用量と時間によって減少することが確認され、JNKでは確認されなかった（図５Ａと13Ａ）。ERKの活性が癌細胞の増殖と生存に関連があることが知られているので(Warner and Mclntosh,2009.Mol.Cell 34,3-11)、癌細胞のGRSに対するアポトーシス敏感性が、ERKの活性状態により決定されるかを実験した。GRS-感受性HCT116、H460、HeLa癌細胞は、ERKのリン酸化が増加された状態であり、一方、GRS-非感受性SH-SY5YとMCF7癌細胞はそうではなかった（図５Ｂ）。このような結果は、ERKの活性状態と癌細胞のGRS敏感性とに、量の相関関係があることを示す。
３種のGRS-感受性細胞株の内で、HCT116とH460細胞はERKの活性を導くKRAS変異を含んでいるものとして知られている。Ras-Raf-MEK-ERK經路は癌細胞増殖と活性に重要なシグナル経路である。従って、腫瘍Ras変異によるERKの活性化が、GRS処理に対するアポトーシス敏感性を与えるかを実験した。このような目的で、一般的にGRS処理に無感覚なHEK293細胞を選択した。３種のRas-active突然変異をHEK293で誘導して確立された細胞株を作った。選択された安全な細胞株から染色されたRas突然変異がそれぞれ発現されて、突然変異誘導後、ERKリン酸化が急激に増加した。細胞株にGRSを処理してERKリン酸化での効果を観察した。３種の細胞株において、GRSは顕著にERKのリン酸化を抑制した（図５Ｃ）。GRS処理が、Rasを感染させたHEK293細胞の生存率と死滅に影響を及ぼすかを実験した。MTTアッセイとflow-cytometryを使用して、GRS処理が細胞生存を抑制して、３種のRas-transfectantsの死滅を増加させることを確認した。一方、対照群のHEK293細胞ではGRS処理効果が観察されなかった（図５Ｄと13Ｂ）。このような結果は、活性化されたERKの脱リン酸化により、GRSがRas活性化された腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できるとの仮説と一致する。
CDH6によるERKリン酸化の陰性的調節が、普遍的に全ての細胞タイプに適用されるかを実験した。実験した細胞株の内、HCT116、renal carcinoma SN12、breast carcinoma cell SK-BR-3、及びrenal carcinoma Caki-1は、高い水準のCDH6とリン酸化されたERK発現を示した（図13Ｃ）。しかし、腎臓癌細胞株RENCAと繊維肉腫細胞株(fibrosarcoma cell line)HT1080では、高い水準のERKリン酸化を示したが、CDH6は検出できない水準であった。これとは逆に、breast carcinoma cell line BT474では、高い水準のCDH6を示したにも拘らず、ERKリン酸化は低い水準を示した。HEK293にK,NとHRASを感染させたことは、CDH6の細胞的水準には影響を及ぼさなかった（図13Ｄ）。このような全ての結果は、CDH6の細胞的水準がERKの活性と直接的な関連がないことを示した。
多様な細胞株におけるGRS処理によるアポトーシスストレスに対する敏感性をテストした。高い水準のCDH6とERKリン酸化を示す細胞でのみGRS-inducedアポトーシスに敏感性を示した（図５Ｄ）。高い水準のCDH6蛋白質とERKリン酸化のGRS-inducedアポトーシスとの相関関係については、８種の細胞株で拡張実験をした。
ERKリン酸化は、upstrean MEK 1と2キナーゼだけでなく、リン酸化酵素によっても調節される（Keyse,2000.Curr.Opin.Cell.Biol.12,186-192,Gronda et al.,2001.Mol.Cell Biol.21,6851-6858,Wang et al.,2003.EMBO J.22,2658-2667）。しかし、MEKのリン酸化は、GRS処理により減少しなかった(data not shown)。GRSがリン酸化酵素の活性化により、ERKのリン酸化を抑制するか否かを調べるために、４種のホスファターゼ阻害剤をHCT116細胞に処理して、ERKのGRS誘導リン酸化にどれ程の影響を及ぼすかを確認した。４種のホスファターゼの内、okadaic acid phosphatase 2A(PP2A)阻害剤が特にERKのGRS依存的阻害を防いだ（図５Ｅ）。GRS処理はCDH6とPP2A間の相互作用を弱化させ（図５ＦとＧ）、PP2Aの非活性化形態のPP2Aのリン酸化を減少させた（図13Ｅ）(Chen et al.,1992.Science 257,1261-1264,Janssens and Goris,2001.Biochem.J.53,417-439)。付随的に、PP2AとERKの相互作用が増加した（図５Ｈ）。このような結果から、GRSがCDH6からPP2Aを放出させ、PP2Aの活性を誘導して、ERKを脱リン酸化することが分かる。
９．生体内におけるGRSの抗腫瘍効果
GRSが生体内でも活性を有するかについて、その可能性を調べるために、HCT116細胞を利用した異種移植モデルでGRSをテストした。１番目の実験では、HCT116細胞をBalb/C ヌードマウスに注入して、腫瘍の大きさが平均100mm２程度になるまで育てた。９日目に腫瘍細胞にvehicle単独又は10μg又は20μgのGRSを腫瘍に直接注入した。21日目の腫瘍量はvehicleを処理した群において、ほぼ2.5倍増加した。対照的に、GRSの注入は、投与量に従って腫瘍の量を減少させた（図６ＡとＢ）。腫瘍の重さは10μgと20μgのGRS処理後、それぞれ56%と34%減少した（図６Ｃ）。マウスの体重と体型の変化が殆どないのは、GRSの投与による過毒性が発生しなかったことを示した（図６ＢとＤ）。免疫蛍光分析を用いて、腫瘍に20μgのGRSを投与することによって、アポトーシスが誘導されるかを調べた。control組織よりは、GRSを処理した腫瘍組織において、より多い数のYo-Pro-1-positive腫瘍細胞が現れた（図６Ｅ）。
腫瘍形成の初期段階で、GRSの効果を実験した。HCT116細胞をヌードマウスに、GRS(20μg)と共に又は無しで注入した。Vehicle controlにおいて、腫瘍量が185mm２にまで増加し、細胞GRSが共に注入された実験群では、腫瘍が成長しなかった（図６ＦとＧ）。Vehicle controlと比べた時、GRS処理後の腫瘍の重さは46%まで減少した。GRS処理した動物のHCT116細胞でアポトーシスが明らかに観察された（図６Ｊ）。さらに、マウスの体重と体型の変化が殆どないのは、GRS投与による過毒性が発生しなかったことを証明する（図６ＧとＩ）。
GRSの触媒域（F2）ではないABD（F4）は、細胞基盤（cell based）アッセイでアポトーシス活性を誘導するに十分であった。生体内でもGRSの二つの域間での区別ができるかを調べるために、Balb/C ヌードマウスにHCT116細胞を20μgの触媒域又はABD切片と共に注入した。F4切片は腫瘍の成長を阻害したが、F2は阻害しなかった（図14ＡとＢ）。GRS単独で注入したものと比べると、腫瘍の重さの減少は37%と46%であった（図14Ｃ）。二つの切片全てを注入した結果、殆ど毒性を与えなかった（図14Ｄ）。従って、in vitro細胞基盤アッセイで示したABDのアポトーシス活性は、生体内でも繰返し確認された。
10．生体内におけるCDH6依存的抗腫瘍効果
CDH6及びERKのリン酸化マーカーを導出する腫瘍形成細胞における、GRSにより誘導された強力なアポトーシス活性は、生体内のGRSの抗腫瘍活性が、CDH6依存的であり得る可能性をもたらした。このような可能性を実験するために、腎臓癌細胞におけるGRSの細胞結合の可否とCDH6との関連性を確認した。GRSはCDH6の高い発現率を示す腎臓癌細胞のSN12のみに結合して、低い水準のCDH6発現率を示すRENCA細胞とは結合せず（図７ＡとＣ）、これはGRSの活性が、CDH6の発現程度に依存的であることを示す。このような理解は、２種の細胞株から異種移植モデルを使用したGRSの抗腫瘍活性実験により確認された。SN12とRENCA細胞をヌードマウスに移植して、２種の用量(2mg/kgと6mg/kg)でGRS蛋白質を毎日１回全４回腹膜注入した。この二つのモデルにおいて、GRSはSN12の成長だけを阻害し（図７Ｂ）、RENCA細胞の成長は阻害できなかった（図７Ｄ）。SN12の腫瘍の重さは、2mg/kgと6mg/kg用量のGRS注入後、それぞれ36%と58%程度減少した。しかし、RENCAの腫瘍の重さは同じ条件で、7%と15%減少した（図７Ｅ）。動物の体重変化が殆どないのは、２種の異種移植マウスモデルで過毒性が発生しないことを示す（図14ＥとＦ）。ERKを処理した状態でGRSの効果を確認するために、ウェスタンブロッティングでERKのリン酸化を観察した。SN12の異種移植サンプルにおいて、ERKの脱リン酸化は、GRS処理群において明らかに観察され（図７Ｆ）、GRSのCDH6依存的アポトーシス活性は、in vitroで細胞基盤アッセイにより証明され、in vivoで繰返して確認された。
上述した通り、本発明はGRSとCDHの新規な使用により、癌の予防及び治療剤をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、多様な疾患の新たな治療剤の開発に有用に利用することができる。

Claims (9)

  1. (ａ）試験製剤の存在下又は非存在下で、GRS(glycyl-tRNAynthethase)又はこの断片、CDH(cadherin)を接触させる段階；
    (ｂ）試験製剤の存在下又は非存在下で、前記GRSとCDHの結合水準を測定する段階；
    (ｃ）試験製剤が存在する場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準と、試験製剤が存在しない場合のGRS又はこの断片とCDH間の結合水準を比較する段階；及び
    (ｄ）GRS又はこの断片とCDH間の結合水準を変化させた試験製剤を確認する段階を含む癌の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
  2. 前記癌は、黒色腫、白血病、大腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳房癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、リンパ腫、再生不良性貧血であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
  3. 前記GRSは、配列番号１、配列番号５乃至配列番号10からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
  4. 前記断片は、配列番号２又は配列番号11のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
  5. 前記CDHは、CDH6又はCDH18であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 前記CDH6は、配列番号12,13及び14からなる群より選ばれたアミノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 前記CDH18は、配列番号15,16及び17からなる群より選ばれたアミノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載の方法。
  8. （ｅ）前記（ｄ）段階で確認された試験製剤をCDH発現細胞に接触させる段階；及び
    （ｆ）CDH発現細胞のアポトーシスを測定する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  9. 前記CDH発現細胞は、腎臓癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞及び大腸癌細胞からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項８記載の方法。
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Narayan et al. CDK phosphorylation of the discs large tumour suppressor controls its localisation and stability
Cholay et al. Functional interaction between the ubiquitin-specific protease 25 and the SYK tyrosine kinase
Barry et al. 14-3-3: Shc scaffolds integrate phosphoserine and phosphotyrosine signaling to regulate phosphatidylinositol 3-kinase activation and cell survival
Zhou et al. Phosphorylation at tyrosine 262 promotes GADD34 protein turnover
Kim et al. UVB-induced nuclear translocation of TC-PTP by AKT/14-3-3σ axis inhibits keratinocyte survival and proliferation
Nishinakagawa et al. Analysis of cell cycle arrest and apoptosis induced by RCAS1

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