ES2296927T3 - Bcmp-101, una proteina asociada al cancer. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que: a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1); o b) es un derivado que tiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) que tiene una identidad de secuencia de 95% con el polipéptido del SEQ ID NO: 1 y que muestra la actividad inmunológica de dicho polipéptido.

Description

BCMP-101, una proteína asociada al cáncer.

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido (BCMP 101), composiciones que comprenden anticuerpos que son inmunoespecíficos para el polipéptido. También se proporciona el uso del polipéptido en la diagnosis del cáncer de mama.

Cáncer de Mama

El cáncer de mama es el cáncer no de piel diagnosticado más frecuentemente entre las mujeres en los Estados Unidos. Es el segundo sólo en comparación con el cáncer de pulmón en muertes relacionadas con el cáncer. En el Reino Unido, el cáncer de mama es con mucho el cáncer más corriente en mujeres, con 34.600 nuevos casos en 1998 (Cancer Research Compaing, http//www.crc.org.uk, UK, 2000). El noventa y nueve por ciento de los cánceres de mama se presenta en mujeres. El riesgo de desarrollar cáncer de mama aumenta constantemente con la edad; se estima que el riesgo en vida de desarrollar cáncer de mama es 1 de 8 para las mujeres en los Estados Unidos. El coste anual del tratamiento del cáncer de mama en los Estados Unidos es de aproximadamente 10 millardos de dólares (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org. USA). La incidencia del cáncer de mama ha aumentado a lo largo de las cinco últimas décadas, pero últimamente se ha ralentizado. Esto puede reflejar un período de detección temprana de los cánceres de mama mediante mamografía. Numerosos factores establecidos pueden aumentar el riesgo en mujeres de tener la enfermedad. Estos incluyen una edad más avanzada, un historial de cáncer de mama previo, una exposición significativa a radiación, un fuerte historial familiar de cáncer de mama, una clase socioeconómica más alta, nuliparidad, menarquia temprana, menopausia tardía, o una edad en el primer embarazo superior a 30 años. El uso prolongado de contraceptivos orales pronto en la vida parece incrementar ligeramente el riesgo. La reposición postmenopáusica prolongada de estrógenos aumenta el riesgo de 20 a 40%. Se ha especulado que un descenso de la edad en la menarquia, el cambio de patrones de nacimiento, o un aumento del número de estrógenos exógenos han contribuido al aumento de la incidencia del cáncer de mama (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org. USA).

Causas del Cáncer de Mama

El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea. Si bien las hormonas femeninas juegan un papel significativo en el origen y la evolución de muchos tumores mamarios, existen otros varios factores reconocidos y desconocidos implicados. Las perturbaciones de oncogenes identificados incluyen la amplificación de los genes HER-2 y del receptor del factor de crecimiento epidérmico, y la sobreexpresión de la ciclina D1. La sobreexpresión de estos oncogenes ha sido asociada con una prognosis significativamente peor. De un modo similar, las alteraciones genéticas o la pérdida de genes supresores tumorales, tales como el gen p53, han estado bien documentadas en el cáncer de mama y también están asociadas con una peor prognosis. Los investigadores han identificado dos genes, denominados BRCA1 y BRCA2, que son predictivos del cáncer de mama familiar premenopáusico. La evaluación del riesgo genético es posible ahora, lo que puede aumentar la identificación de candidatos para las pruebas de quimioprevención (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org. USA).

Diagnosis

La diagnosis temprana del cáncer de mama es vital para asegurar el resultado más favorable para el tratamiento. Muchos países con sistemas sanitarios avanzados han instituido programas de escrutinio para el cáncer de mama. Esto adopta típicamente la forma de radiografías regulares de la mama (mamografía) durante el intervalo de 50-60 años de edad donde se ha demostrado un mayor beneficio para esta intervención. Algunas autoridades han propugnado la extensión de tales programas más allá de los 60 y al grupo de los 40-49 años de edad. Las autoridades sanitarias en muchos países también han promovido la importancia del autoexamen regular de la mama por las mujeres. Las anomalías detectadas durante estos procedimientos de escrutinio y los casos que se presentan como sintomáticos podrían ser confirmados típicamente mediante citología de aspiración, biopsia por punción con aguja gruesa con una técnica estereotáctica o ultrasónica para lesiones no palpables, o biopsia incisional o excisional. Al mismo tiempo se podría determinar otra información relevante para las opciones de tratamiento y la prognosis, tal como el estado del receptor de estrógeno (ER) y de progesterona (PR) (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.org).

Estadiaje y Prognosis de la Enfermedad

El estadiaje del cáncer de mama es la clave para elegir el tratamiento óptimo para cada paciente y para seleccionar aquellos pacientes a los que les irán bien las formas de terapia menos intensivas de aquellos para los cuales es esencial la forma de terapia intensiva. En la actualidad el procedimiento de estadiaje implica biopsias de los bultos y de los nódulos linfáticos auxiliares, combinadas con una extensa histopatología. El estadiaje de los pacientes puede ser incorrecto con el consiguiente sobre- o infra-tratamiento. Propiamente dicho, existe la necesidad de nuevos marcadores que se puedan correlacionar con la fase de la enfermedad y utilizar para guíar fiablemente las decisiones de tratamiento. Tales nuevos marcadores podrían no sólo beneficiar a los pacientes y a los profesionales de la salud seleccionando el tratamiento óptimo, sino que podrían proporcionar beneficios de coste y tiempo significativos en el laboratorio de histología.

Algunos tumores de mama se vuelven refractarios a los tratamientos, debido a que las células cancerosas desarrollan resistencia a los fármacos de la quimioterapia o pierden su sensibilidad hormonal, conduciendo a una enfermedad metastásica o recurrente que a menudo es incurable. Más recientemente, se ha centrado la atención en el desarrollo de terapias inmunológicas (Green, M.C., et al. Cancer Treat Rev. 26, 269-286 (2000); Davis, I.D., et al. Immunol. Cell Biol. 78, 179-195 (2000); Knuth, A., et al. Cancer Chemother Pharmacol. 46, S46-51 (2000); Shiku, H., et al. Cancer Chemother Pharmacol. 46, S77-82 (2000); Saffran, D.C., et al. Cancer Metastasis Rev. 18, 437-449 (1999)), tales como vacunas y anticuerpos monoclonales (mAbs) para el cáncer, como medio para iniciar y dirigir la respuesta inmunitaria del anfitrión contra las células tumorales. En 1998 la FDA aprobó el uso de Herceptin® (Stebbing, J., et al. Cancer Treat. Rev. 26, 287-290 (2000); Dillman, R.O. Cancer Biother. Radiopharm. 14, 5-10 (1999); Miller, K.D., et al. Invest. New Drugs 17, 417-427 (1999)), un mAb que reconoce la proteína del receptor erbB2/HER2-neu, como un tratamiento para el cáncer de mama metastásico. Combinado con la quimioterapia, se ha demostrado que Herceptin® prolonga el tiempo de progreso de la enfermedad, cuando se compara con pacientes que reciben sólo quimioterapia (Baselga, J., et al. Cancer Res. 58, 28-25-2831 (1998)). Herceptin®, no obstante, es sólo eficaz en el tratamiento de 10-20% de los pacientes cuyos tumores sobreexpresan la proteína erbB2. De este modo, ha adquirido una creciente importancia la identificación de otras dianas o antígenos adecuados para la inmunoterapia del cáncer de
mama.

Una diana proteica ideal para la inmunoterapia del cáncer debe tener un perfil de expresión restringido en los tejidos normales y se debe sobreexpresar en los tumores, de manera que la respuesta inmunitaria será dirigida a las células tumorales y no contra otros órganos. Por añadidura, la proteína diana se debe exponer sobre la superficie celular, donde será accesible a los agentes terapéuticos. Se han identificado antígenos tumorales para numerosos tipos de cáncer, utilizando técnicas tales como el escrutinio diferencial de ADNc (Hubert, R.S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 14523-14528 (1999); Lucas, S., et al. Int. J. Cancer. 87, 55-60 (2000)), y la purificación de proteínas de la superficie celular que son reconocidas por los anticuerpos específicos de tumores (Catimel, B., et al. J. Biol. Chem. 271, 25664-25670 (1996)). La proteómica se puede utilizar como un enfoque alternativo para identificar los antígenos de los tumores de mama (EP 1208381, EP 1159618).

La presente invención está basada en la identificación de una nueva proteína (BCMP 101) como diana para la terapia y diagnosis del cáncer.

BCMP 101 se identificó y clonó a partir de membranas celulares de cáncer de mama MDA-MB468. La expresión de BCMP 101 en tejido humano normal mostró que los niveles más altos de expresión se encontraron en tejido mamario, de riñón y vejiga. La expresión de BCMP 101 fue elevada en líneas celulares de cáncer de riñón en comparación con los tejidos normales. Además, también se observaron niveles elevados de expresión del gen BCMP 101 en tejido tumoral de un conjunto de siete muestras normales y tumorales emparejadas de pacientes con cáncer de mama. La secuencia de BCMP 101 (Fig. 1, SEQ ID NO: 1) coincide con la entrada de GenBank (disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): proteína CAD 10629-NSE2 [Homo sapiens]- una nueva proteína que contiene NS), que fue publicada después de la fecha de prioridad de esta solicitud. Las secuencias EST que codifican fragmentos de BCMP101 se describen en los Números de Acceso a la Base de Datos En Línea EMBL AI827549 (13-7-1999), AI202941 (13-7-1999) y AI963114 (23-8-1999).

De este modo, la presente invención proporciona un polipéptido que:

a)

comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1); o

b)

es un derivado que tiene una o más sustituciones, modificaciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1); y que muestra la actividad inmunológica de dicho polipéptido.

En la presente solicitud, el término "polipéptidos de la invención" se utiliza para hacer referencia a todos los polipéptidos descritos en a) a c) antes.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en forma aislada o recombinante, sustancialmente pura, y se pueden fusionar con otros radicales. En particular, las fusiones de los polipéptidos de la invención con proteínas informadoras de la localización tales como la Proteína Fluorescente Verde (Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.625.048, 5.777.079, 6.054.321 y 5.804.387) o la proteína fluorescente DsRed (Matz, M. V. et al., Nature Biotech. 17:969-973.) son contempladas específicamente por la presente invención. Los polipéptidos de la invención se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura; es decir, están libres, hasta un grado sustancial, de otros polipéptidos. Así, se puede proporcionar un polipéptido de la invención en una composición en la que es el componente predominante presente (esto es está presente a un nivel de al menos 50%; preferiblemente al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95%; cuando se determina en una base peso/peso excluyendo los disolventes o los
portadores).

Con el fin de apreciar completamente la presente invención, se comentarán ahora con mayor detalle los polipéptidos dentro del alcance de a)-b) anteriores. Resultará evidente para un experto en la técnica que los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen BCMP 101 (SEQ ID NO: 1), y sus derivados, y formas modificadas.

Polipéptidos dentro del alcance de a)

Un polipéptido dentro del alcance de a), puede consistir en la secuencia de aminoácidos concreta proporcionada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) o puede tener una secuencia de aminoácidos N-terminal adicional y/o C-terminal adicional con respecto a la secuencia proporcionada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Las secuencias N-terminales o C-terminales adicionales se pueden proporcionar por varias razones. Los mecanismos para proporcionar tales secuencias adicionales son bien conocidos en la técnica.

Las secuencias adicionales se pueden proporcionar con el fin de alterar las características de un polipéptido concreto. Esto puede ser útil para mejorar la expresión o la regulación de la expresión en sistemas de expresión concretos. Por ejemplo, una secuencia adicional puede proporcionar alguna protección contra la escisión proteolítica. Esto se ha realizado para la hormona Somatostatina fusionándola en su extremo N a parte de la enzima \beta-galactosidasa (Itakwa et al., Science 198: 105-63 (1977)).

Las secuencias adicionales también pueden ser útiles en la alteración de las propiedades de un polipéptido para ayudar a la identificación o purificación. Por ejemplo, se puede proporcionar una proteína de fusión en la que un polipéptido se enlaza a un radical susceptible de ser aislado mediante cromatografía de afinidad. El radical puede ser un antígeno o un epítopo y la columna de afinidad puede comprender anticuerpos inmovilizados o fragmentos de anticuerpo inmovilizados que se unen a dicho antígeno o epítopo (deseablemente con un alto grado de especificidad). La proteína de fusión se puede eluir usualmente de la columna mediante la adición de un eluyente apropiado.

Las secuencias N-terminales o C-terminales adicionales pueden, no obstante, estar presentes simplemente como resultado de una técnica concreta utilizada para obtener un polipéptido de la presente invención y no necesitan proporcionar ninguna característica ventajosa particular al polipéptido de la presente invención. Tales polipéptidos están dentro del alcance de la presente invención.

Cualquiera que sea la secuencia N-terminal o C-terminal que esté presente, se prefiere que el polipéptido resultante muestre la actividad inmunológica o biológica del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Polipéptidos dentro del alcance de b)

Volviendo ahora a los polipéptidos definidos en b) antes, una persona experta en la técnica apreciará que estos polipéptidos son derivados del polipéptido proporcionado en a) antes. Tales derivados muestran preferiblemente la actividad inmunológica o biológica del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1). Un experto en la técnica apreciará que los derivados pueden incluir modificaciones post-traduccionales, por ejemplo pero sin limitación, fosforilación, glicosilación y farnesilación.

Pueden ocurrir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, que no afectan a la función de un polipéptido. Estas incluyen deleciones, inserciones y sustituciones de aminoácidos y pueden resultar del empalme alternativo y/o de la presencia de múltiples sitios de inicio y/o sitios de parada de la traducción. Pueden aparecer polimorfismos como resultado de la infidelidad del proceso de traducción. De este modo se pueden tolerar cambios en la secuencia de aminoácidos que no afectan a la función biológica o inmunológica de los polipéptidos.

La persona experta apreciará que a menudo se pueden realizar diversos cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una actividad concreta para producir derivados (a veces conocidos como variantes o "muteínas") que tienen al menos una proporción de dicha actividad, y que tienen preferiblemente una proporción sustancial de dicha actividad. Tales derivados de los polipéptidos descritos en a) antes están dentro del alcance de la presente invención y se comentan con más detalle más abajo. Estos incluyen derivados alélicos y no alélicos.

Un ejemplo de un derivado del polipéptido de la invención es un polipéptido como se ha definido en a) antes, aparte de la sustitución de uno o más aminoácidos por uno o más aminoácidos diferentes. La persona experta sabe que diversos aminoácidos tienen propiedades similares. A menudo se pueden sustituir uno o más de tales aminoácidos de un polipéptido por uno o más de tales otros aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de ese polipéptido.

Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina se pueden sustituir a menudo entre sí (aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas). De estas sustituciones posibles, se prefiere utilizar la glicina y la alanina para sustituirlas entre sí (puesto que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y utilizar la valina, la leucina y la isoleucina para sustituirlas entre sí (puesto que tienen cadenas laterales alifáticas más largas que son hidrófobas).

Otros aminoácidos que se pueden sustituir a menudo entre sí incluyen:

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fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

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lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas);

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aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

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asparragina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales amidicas);

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cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre); y

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el ácido aspártico y el ácido glutámico se pueden sustituir por fosfo-serina y fosfo-treonina, respectivamente (aminoácidos con cadenas laterales ácidas).

Las sustituciones de esta naturaleza son referidas a menudo como sustituciones de aminoácidos "conservativas" o "semi-conservativas".

También se pueden realizar deleciones o inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia de aminoácidos proporcionada en a) (SEQ ID NO: 1) antes. Así, por ejemplo, se pueden suprimir los aminoácidos que no tienen un efecto sustancial sobre la actividad biológica y/o inmunológica del polipéptido, o al menos que no eliminan tal actividad. Tales deleciones pueden ser ventajosas puesto que la longitud total y el peso molecular de un polipéptido se pueden reducir a la vez que se conserva su actividad. Esto puede posibilitar que se reduzca la cantidad del polipéptido requerida para un propósito concreto - por ejemplo, se pueden reducir los niveles de dosificación.

También se pueden realizar inserciones de aminoácidos relativas a la secuencia proporcionada en a) (SEQ ID NO: 1) antes. Esto se puede realizar para alterar las propiedades de un polipéptido de la invención (p. ej. para ayudar a la identificación, purificación o expresión, como se ha explicado antes con relación a las fusiones de proteínas).

Los cambios de aminoácidos relativos a la secuencia proporcionada en a) (SEQ ID NO: 1) antes se pueden realizar utilizando cualquier técnica adecuada p. ej. utilizando mutagénesis dirigida al sitio (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551).

Se debe apreciar que se pueden realizar sustituciones o inserciones de aminoácidos dentro del alcance de la presente invención utilizando aminoácidos de origen natural o de origen no natural. Se utilicen aminoácidos naturales o sintéticos, se prefiere que sólo estén presentes L-aminoácidos.

Cualquiera que sea el cambio de aminoácido que se realice (ya sea por medio de sustitución, modificación, inserción o deleción), los polipéptidos preferidos de la presente invención tienen al menos una identidad de secuencia de 95% con un polipéptido como se ha definido en a) antes. Son muy preferidas identidades de secuencia de al menos 98% o al menos 99%.

El término identidad se puede utilizar para describir la similitud entre dos secuencias polipeptídicas. El grado de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede calcular utilizando un programa tal como "bestfit" (Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias. El alineamiento está basado en la maximización de la puntuación lograda utilizando una matriz de similitudes de aminoácidos, tal como la descrita por Schwarz y Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed págs. 353-358.

Un paquete de soporte lógico bien conocido en la técnica para llevar a cabo este procedimiento es el programa CLUSTAL. Este compara las secuencias de aminoácidos de dos polipéptidos y encuentra el alineamiento óptimo insertando espacios en cualquier secuencia según sea apropiado. También se puede calcular la identidad o la similitud del aminoácido (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo utilizando un paquete de soporte lógico tal como BLASTX. Este programa alinea el tramo más largo de secuencia similar y asigna un valor al ajuste. Para cualquier otra comparación del patrón, se pueden encontrar varias regiones de similitud, que tienen cada una una puntuación diferente. Un experto en la técnica apreciará que dos polipéptidos de diferentes longitudes se pueden comparar sobre la longitud total del fragmento más largo. Alternativamente se pueden comparar regiones pequeñas. Normalmente se comparan secuencias de la misma longitud para realizar una comparación útil.

Cuando están presentes altos grados de identidad de secuencia habrá relativamente pocas diferencias en la secuencia de aminoácidos. Así por ejemplo puede haber menos de 20, menos de 10, o incluso menos de 5 diferencias.

La persona experta apreciará que para la preparación de uno o más polipéptidos de la invención, el enfoque preferido estará basado en técnicas de ADN recombinante.

Un polipéptido de la invención puede ser útil como material antigénico, y se puede utilizar en la producción de vacunas para el tratamiento o la profilaxis del cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón. Tal material puede ser "antigénico" y/o "inmunogénico". Generalmente, se utiliza "antigénico" para significar que el polipéptido es susceptible de ser utilizado para aumentar los anticuerpos o por supuesto es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en un sujeto. "Inmunogénico" se utiliza para significar que el polipéptido es susceptible de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Así, en el último caso, el polipéptido puede ser susceptible no sólo de generar una respuesta de anticuerpo sino, además, respuestas inmunitarias no basadas en anticuerpos.

Es bien sabido que es posible escrutar un polipéptido antigénico para identificar las regiones epitópicas, esto es aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad del polipéptido. Se pueden utilizar métodos bien conocidos por la persona experta para analizar la antigenicidad de los fragmentos y/o homólogos y/o derivados. Así, los fragmentos para su uso en la presente invención pueden incluir una o más de tales regiones epitópicas o ser suficientemente similares a tales regiones para conservar sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. De este modo, para los fragmentos para su uso de acuerdo con la presente invención el grado de identidad es quizás irrelevante, puesto que pueden ser idénticos en un 100% a una parte concreta de un polipéptido de la invención. El evento clave puede ser que el fragmento conserva las propiedades antigénicas/inmunogénicas del polipéptido del que está derivado.

Los homólogos, derivados y fragmentos pueden poseer al menos un grado de la antigenicidad/inmunogenicidad del polipéptido del que están derivados.

La persona experta apreciará que para la preparación de uno o más de tales polipéptidos, el enfoque preferido estará basado en técnicas de ADN recombinante. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos o sus fragmentos se pueden utilizar por derecho propio.

Así, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que:

c)

comprende o consiste en la secuencia de ADN mostrada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 2) o su ARN equivalente; o

d)

una secuencia que es complementaria a las secuencias de c).

Estas moléculas de ácido nucleico se comentan ahora con mayor detalle.

El término identidad se puede utilizar también para describir la similitud entre dos secuencias de ADN individuales. El programa "bestfit" (Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics, 482-489 (1981)) es un ejemplo de un tipo de soporte lógico para ordenadores utilizado para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias de ácido nucleico, mientras que el programa GAP posibilita el alineamiento de las secuencias en toda su longitud y encuentra el alineamiento óptimo insertando espacios en cualquier secuencia según sea apropiado. Se prefiere que las secuencias que muestran identidad sustancial con cualquiera de las de c), o d) tengan p. ej. al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o 95% de identidad de secuencia.

Se prefiere que la molécula de ácido nucleico sea un fragmento de la secuencia proporcionada en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 2), que no corresponde a los siguientes fragmentos: pb 558-1054, pb 80-565 o pb 45-547, de acuerdo con la numeración de nucleótidos de la Fig. 1 (SEQ ID NO: 2).

Los polipéptidos de la invención pueden ser codificados por una gran variedad de moléculas de ácido nucleico, teniendo en cuenta la degeneración bien conocida del código genético. Todas estas moléculas están dentro del alcance de la presente invención. Se pueden insertar en vectores y clonar para proporcionar grandes cantidades de ADN o ARN para un estudio adicional. Los vectores adecuados se pueden introducir en las células anfitrionas para posibilitar la expresión de los polipéptidos de la invención utilizando mecanismos conocidos por la persona experta en la
técnica.

El término "ARN equivalente" cuando se utiliza más arriba indica que una molécula de ARN dada tiene una secuencia que es complementaria a la de una molécula de ADN dada, teniendo en cuenta el hecho de que en el ARN "U" reemplaza a "T" en el código genético. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada, recombinante o químicamente sintética.

Las técnicas para clonar, expresar y purificar polipéptidos son bien conocidas por las personas expertas. Los constructos de ADN se pueden generar fácilmente utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Estas técnicas son descritas, por ejemplo por J. Sambrook et al, en Molecular Cloning 3ª Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2000); en Old & Primrose Principles of Gene Manipulación 5ª Edición, Blackwell Scientific Publications (1994); y en Stryer Biochemistry 4ª Edición, W H Freeman and Company (1995). Después se pueden facilitar modificaciones de los constructos de ADN y de los polipéptidos expresados tales como la adición de promotores, intensificadores, secuencias señal, secuencias líder, señales de inicio y parada de la traducción y regiones para el control de la estabilidad del ADN, o la adición de compañeros de fusión.

Normalmente el constructo de ADN se insertará en un vector, que puede tener su origen en fagos o en plásmidos. La expresión del polipéptido se logra mediante la transformación o transfección del vector en una célula anfitriona que puede ser de origen eucariótico o procariótico. Tales vectores y células anfitrionas adecuadas forman aspectos adicionales de la presente invención.

Los nucleótidos de la presente invención, que incluyen ADN y ARN, y que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, se pueden sintetizar utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando enfoques de química convencional o amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los nucleótidos de la presente invención también permiten la identificación y clonación del gen que codifica un polipéptido como se define en la presente memoria de cualquier especie, por ejemplo escrutando genotecas de ADNc, genotecas genómicas o genotecas de expresión.

El conocimiento de la estructura de ácidos nucleicos se puede utilizar para originar anticuerpos y para la terapia génica. Los mecanismos para esto son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se comenta con más detalle en la presente memoria.

Utilizando sistemas de expresión apropiados, los polipéptidos de la invención se pueden expresar en forma glicosilada o no glicosilada. Las formas no glicosiladas se pueden producir mediante la expresión en anfitriones procarióticos, tales como E. coli.

Los polipéptidos que comprenden una metionina N-terminal se pueden producir utilizando algunos sistemas de expresión, mientras que en otros el polipéptido maduro carecerá de este resto. Las técnicas preferidas para la clonación, expresión y purificación de un polipéptido de la invención se resumen más abajo:

Los polipéptidos se pueden preparar en condiciones nativas o desnaturalizantes y después replegar con posterioridad. Los vectores de expresión baculovirales incluyen plásmidos secretores (tales como pACGP67 de Pharmingen), que pueden tener una secuencia de una etiqueta epitópica clonada en marco (p. ej. myc, V5 o His) para ayudar a la detección y permitir la posterior purificación del polipéptido. Los vectores de expresión de mamíferos pueden incluir pCDNA3 y pSecTag (ambos de Invitrogen), y pREP9 y pCEP4 (Invitrogen). Los sistemas de E. coli incluyen la serie pBad (etiquetados con His-Invitrogen) o la serie pGex (Pharmacia).

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención, referidas en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico "codificantes", la presente invención también incluye moléculas de ácido nucleico complementarias. Así, por ejemplo, ambas hebras de una molécula de ácido nucleico de doble hebra están incluidas en del alcance de la presente invención (estén o no asociadas entre sí). También están incluidas las moléculas de ARNm y las Moléculas de ADN complementarias (p. ej. las moléculas de ADNc).

Las moléculas de ácido nucleico que pueden hibridar con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico comentadas antes también están cubiertas por la presente invención. Tales moléculas de ácido nucleico son referidas en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico "hibridantes". Las moléculas de ácido nucleico hibridantes pueden ser útiles como sondas o cebadores, por ejemplo.

Deseablemente tales moléculas hibridantes tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y preferiblemente tienen al menos 25 o al menos 50 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ácido nucleico hibridantes preferiblemente hibridan con ácidos nucleicos dentro del alcance de c) (SEQ ID NO: 2), o d) anteriores específicamente.

Deseablemente las moléculas hibridantes hibridarán con tales moléculas en condiciones de hibridación restrictivas. Un ejemplo de las condiciones de hibridación restrictivas es aquel en el que la hibridación intentada se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 65ºC utilizando una solución salina que es aproximadamente 0,9 molar. No obstante, la persona experta será capaz de variar tales condiciones según sea apropiado con el fin de tener en cuenta variables tales como la longitud de la sonda, la composición de bases, el tipo de iones presentes, etc. Para un alto grado de selectividad, se utilizan condiciones relativamente restrictivas para formar los dúplex, tales como condiciones de bajo contenido de sales o alta temperatura. Según se utiliza en la presente memoria, "condiciones altamente restrictivas" significa hibridación a un ADN unido a un filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65ºC, y lavado en 0,1\timesSSC/SDS al 0,1% a 68ºC (Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., New York, en la pág. 2.10.3). Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones menos restrictivas para la formación de los dúplex. Según se utiliza en la presente memoria "condiciones moderadamente restrictivas" significa lavado en 0,2\timesSSC/SDS al 0,1% a 42ºC (Ausubel et al., 1989, supra). Las condiciones de hibridación también se pueden volver más restrictivas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex híbrido. Así, las condiciones concretas de hibridación se pueden manipular fácilmente, y se elegirán generalmente dependiendo de los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son: 42ºC para una sonda que es 95 a 100% idéntica al fragmento de un gen que codifica un polipéptido como se define en la presente memoria, 37ºC para una identidad de 90 a 95% y 32ºC para una identidad de 70 a 90%. En la preparación de genotecas genómicas, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán partes o la totalidad de un polipéptido como se define en la presente memoria. El ADN se puede escindir en sitios específicos utilizando diferentes enzimas de restricción. Alternativamente, se puede utilizar ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cortar físicamente, por ejemplo, mediante sonicación. Los fragmentos de ADN se pueden separar después según el tamaño mediante técnicas normalizadas, incluyendo pero no limitadas a electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida, cromatografía en columna y centrifugación en gradiente de sacarosa. Los fragmentos de ADN se pueden insertar después en vectores adecuados, incluyendo pero no limitados a plásmidos, cósmidos, bacteriófagos lambda o T_{4}, y cromosomas artificiales de levaduras (YAC). (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2000 , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Glover, D. M. (ed.), 1985 , DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. 1, II; Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., New York). La genoteca genómica se puede escrutar mediante hibridación del ácido nucleico a la sonda marcada (Benton & Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein & Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961).

La manipulación del ADN que codifica un polipéptido es una técnica particularmente potente tanto para modificar proteínas como para generar grandes cantidades de proteína con fines de purificación. Esto puede implicar el uso de técnicas de PCR para amplificar una secuencia de ácido nucleico deseada. Así los datos de secuencia proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar para diseñar cebadores para su uso en la PCR de manera que se puede buscar una secuencia deseada y después amplificar hasta un alto grado.

Típicamente, los cebadores tendrán al menos cinco nucleótidos de largo y tendrán generalmente al menos diez nucleótidos de largo (p. ej. de quince a venticinco nucleótidos de largo). En algunos casos, se pueden utilizar cebadores de al menos treinta o al menos treinta y cinco nucleótidos de longitud.

Se puede utilizar la síntesis química como alternativa adicional. Esta puede ser automatizada. Se pueden sintetizar químicamente y ligar entre sí secuencias relativamente cortas para proporcionar una secuencia más larga.

Además de utilizarlas como cebadores y/o sondas, las moléculas hibridantes de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar como moléculas antisentido para alterar la expresión de los polipéptidos de la presente invención mediante la unión a moléculas de ácido nucleico complementarias. Esta técnica se puede utilizar en la terapia antisentido.

Según se utiliza en la presente memoria, un ácido nucleico "antisentido" hace referencia a un ácido nucleico susceptible de hibridación en virtud de alguna secuencia complementaria a una porción de un ARN (preferiblemente ARNm) que codifica un polipéptido de la invención. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una región codificante y/o no codificante de un ARNm que codifica un polipéptido de la invención. Tales ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como compuestos que inhiben la expresión, y se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención del cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón.

La expresión de un polipéptido de la invención puede ser inhibida mediante el uso de ácidos nucleicos antisentido. Tales ácidos nucleicos que comprenden al menos seis nucleótidos son antisentido con respecto a un gen o un ADNc que codifica un polipéptido de la invención.

Una molécula de ácido nucleico hibridante puede tener un alto grado de identidad de secuencia a lo largo de su longitud con una molécula de ácido nucleico dentro del alcance de c)-d) anteriores (p. ej. al menos 50%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 90% o 95% de identidad de secuencia). Como apreciará la persona experta, cuanto mayor sea la identidad de secuencia que una molécula de ácido nucleico de hebra sencilla tiene con otra molécula de ácido nucleico, mayor será la probabilidad de que hibride con una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas.

En vista de la descripción anterior la persona experta apreciará que un gran número de ácidos nucleicos están dentro del alcance de la presente invención. A no ser que el contexto lo indique de otro modo, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes características:

1)

pueden ser ADN o ARN;

2)

pueden ser de hebra sencilla o doble;

3)

se pueden proporcionar en forma recombinante, p. ej enlazadas covalentemente a una secuencia contigua 5' y/o una 3' para proporcionar una molécula que no se produce en la naturaleza;

4)

se pueden proporcionar sin secuencias contiguas 5' y/o 3' que normalmente se producen en la naturaleza;

5)

se pueden proporcionar en forma sustancialmente pura. Así se pueden proporcionar en una forma que está sustancialmente libre de proteínas contaminantes y/o de otros ácido nucleicos; y

6)

se pueden proporcionar con intrones o sin intrones (p. ej. como ADNc).

Si se desea, se puede utilizar también un gen que codifica un polipéptido de la invención, un gen relacionado, o secuencias o subsecuencias de ácido nucleico, incluyendo secuencias complementarias, en análisis de hibridación. Se puede utilizar un nucleótido que codifica un polipéptido de la invención, o subsecuencias del mismo que comprenden al menos 8 nucleótidos, como sonda de hibridación. Los análisis de hibridación se pueden utilizar para la detección, prognosis, diagnosis o vigilancia de las afecciones, trastornos, o enfermedades, asociados con la expresión aberrante de genes que codifican un polipéptido como se define en la presente memoria, o para la diagnosis diferencial de pacientes con signos o síntomas que sugieren cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón. En concreto, tal análisis de hibridación se puede llevar a cabo mediante un método que comprende poner en contacto una muestra de un paciente que contiene ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico susceptible de hibridar con ADN o ARN que codifica un polipéptido de la invención, en condiciones tales que pueda ocurrir la hibridación, y detectar o medir cualquier hibridación resultante. Los nucleótidos se pueden utilizar para la terapia de pacientes que tienen cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón, como se describe más
abajo.

Se puede utilizar una preparación de oligonucleótidos que comprende 10 o más nucleótidos consecutivos complementarios a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención o fragmento del mismo para su uso como vacunas para el tratamiento de cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón. Tales preparaciones pueden incluir coadyuvantes u otros vehículos.

Los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, se pueden administrar para promover la función del polipéptido por medio de la terapia génica. La terapia génica hace referencia a la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico promoviendo la función del polipéptido.

En un aspecto preferido, el compuesto comprende un ácido nucleico de la invención, tal como un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, siendo dicho ácido nucleico parte de un vector de expresión que expresa un polipéptido de la invención en un anfitrión adecuado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor enlazado operablemente a la región codificadora del polipéptido, siendo dicho promotor inducible o constitutivo (y, opcionalmente, específico del tejido). En otra realización concreta, se utiliza una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificantes y cualquier otra secuencia deseada están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado del genoma, proporcionando de este modo la expresión intracromosómica del ácido nucleico (Koller & Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435438).

La liberación del ácido nucleico en un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al ácido nucleico o al vector que porta el ácido nucleico; este enfoque es conocido como terapia génica in vivo. Alternativamente, la liberación del ácido nucleico en el paciente puede ser indirecta, en cuyo caso las células se transforman primero con el ácido nucleico in vitro y después se trasplantan al paciente; este enfoque es conocido como terapia génica ex vivo.

Como se ha descrito en la presente memoria, BCMP 101 está asociado con el cáncer, en particular cáncer de mama y de riñón y como tal proporciona un medio de detección/diagnosis. Así, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método de escrutinio y/o diagnosis del cáncer de mama en un sujeto que comprende la etapa de detección y/o cuantificación de la cantidad de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de la invención en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto. En una realización adicional, los anticuerpos que reconocen los polipéptidos de la invención se utilizan para detectar la cantidad de un polipéptido como se ha descrito en la presente memoria en una muestra biológica.

En una realización, se puede utilizar la unión del anticuerpo en secciones de tejido para detectar la localización aberrante del polipéptido o un nivel aberrante de polipéptido. En una realización específica, se puede utilizar el anticuerpo contra un polipéptido de la invención para analizar el tejido de un paciente (p. ej., una biopsia de mama) en cuanto al nivel del polipéptido donde un nivel aberrante de polipéptido es indicativo de cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón. Según se utiliza en la presente memoria, un "nivel aberrante" significa un nivel que aumenta en comparación con el nivel en un sujeto sin cáncer o con un nivel de referencia.

Los inmunoanálisis adecuados incluyen, sin limitación, sistemas de análisis competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias western, radioinmunoanálisis, ELISA (análisis inmunoabsorbente con enzima ligada), inmunoanálisis "sándwich", análisis de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en gel, análisis de inmunodifusión, análisis de aglutinación, análisis de fijación del complemento, análisis inmunorradiométricos, inmunoanálisis fluorescentes e inmunoanálisis con proteína A.

En otro aspecto, la presente memoria proporciona un método para la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer de mama, en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se une al menos a un polipéptido de la invención.

Un medio conveniente para tal detección/cuantificación implicará el uso de anticuerpos. Así, los polipéptidos de la invención también encuentran uso en la producción de anticuerpos. Así, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona anticuerpos, que se unen a un polipéptido de la invención y el uso de estos anticuerpos en la preparación de una composición para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer de mama. En particular, la preparación de composiciones que comprenden o que consisten en anticuerpos conjugados a un radical terapéutico adecuado para su uso en la terapia del cáncer de mama es una realización preferida de este aspecto de la invención.

Los anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos de la presente invención de manera que se pueden utilizan para purificar y/o inhibir la actividad de tales polipéptidos.

Así, el polipéptido de la invención, se puede utilizar como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a tal inmunógeno. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos producidos mediante una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones de moléculas de inmunoglobulina inmunológicamente activas, esto es, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD y IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

En la producción de anticuerpos, el escrutinio del anticuerpo deseado se puede completar mediante mecanismos conocidos en la técnica, p. ej. ELISA (análisis inmunoabsorbente con enzima ligada). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de un polipéptido de la invención, se pueden analizar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento polipeptídico que contiene tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo polipeptídico pero que no se une específicamente a (o se une menos ávidamente a) un segundo homólogo polipeptídico, se puede seleccionar sobre la base de la unión positiva al primer homólogo polipeptídico y la carencia de unión al (o unión reducida al) segundo homólogo polipeptídico.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos a un polipéptido de la invención, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subclases. El hibridoma que produce los mAbs de la invención se puede cultivar in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, los mAbs se pueden producir en animales sin gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545).

Los mAbs incluyen pero no están limitados a mAbs humanos y mAbs quiméricos (p. ej., quimeras de humano-ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que porciones diferentes están derivadas de especies animales diferentes, tales como los que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada un mAb de múrido. (Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especie no humana que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especia no humana y una región marco de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.089).

Los mAbs quiméricos y humanizados se pueden producir mediante mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos en la publicación WO 87/02671; EP 184.187; EP 171.496; EP 173.494; la publicación WO 86/01533; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; EP 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos se pueden producir utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes endógenos de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina, pero que pueden expresar los genes humanos de la cadena pesada y ligera. Los ratones transgénicos son inmunizados de la manera normal con un antígeno seleccionado, p. ej., todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los mAbs dirigidos contra el antígeno se pueden obtener utilizando tecnología convencional de hibridomas. Los transgenes de la inmunoglobulina humana albergados por el ratón transgénico se reorganizan durante la diferenciación de las células B, y con posterioridad experimentan reordenamiento génico de las clases "class switching" y mutación somática. Así, utilizando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión de conjunto de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un estudio detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y mAbs humanos y los protocolos para producir tales anticuerpos, véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.625.126; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.633.425; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.569.825; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.661.016; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.806.

Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado utilizando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque se utiliza un mAb no humano seleccionado, p. ej., un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903).

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar utilizando diferentes métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios de los anticuerpos funcionales se presentan sobre la superficie de partículas de fagos que portan la secuencia de polinucleótidos que los codifican. En particular, tales fagos se pueden utilizar para presentar dominios de unión a antígenos expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatoria (p. ej., humana o de múrido). El fago que expresa un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con el antígeno, p. ej., utilizando un antígeno marcado o un antígeno unido o capturado sobre una superficie o cuenta sólida. Los fagos utilizados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos incluyendo los dominios de unión fd y M13 expresados a partir de fagos con Fab, Fv o dominios de anticuerpos Fv estabilizados con disulfuro fusionados recombinantemente a la proteína del gen III o el gen VIII del fago. Los métodos de presentación en fagos que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997) Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT/GB91/01134; la publicación WO 90/02809; la publicación WO 91/10737; la publicación WO 92/01047; la publicación WO 92/18619; la publicación WO 93/11236; la publicación WO 95/15982; la publicación WO 95/20401; y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

Como se ha descrito en las referencias anteriores, tras la selección de los fagos, las regiones de los fagos que codifican los anticuerpos se pueden aislar y utilizar para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y expresar en cualquier anfitrión deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras, y bacterias, p. ej., como se describe con detalle más abajo. Por ejemplo, también se pueden emplear las técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).

Los ejemplos de las técnicas que se pueden emplear para producir Fvs y anticuerpos de cadena sencilla incluyen los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

La invención proporciona adicionalmente el uso de anticuerpos biespecíficos, que se pueden elaborar mediante métodos conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos completos está basada en la expresión simultánea de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Debido al surtido al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en la publicación WO 93/08829, y Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.

De acuerdo con un enfoque diferente y más preferido, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Se prefiere que tengan la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente al menos en una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan simultáneamente en un organismo anfitrión adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en las que proporciones no iguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es posible, no obstante, insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales produce altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen una trascendencia concreta.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par híbrido de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no buscadas, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo de separación fácil. Este enfoque se describe en la publicación WO 94/04690. Para los detalles adicionales para la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.

La invención proporciona fragmentos, derivados o análogos funcionalmente activos de las moléculas de inmunoglobulina anti-polipéptido. "Funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de obtener anticuerpos anti-anti-idiotipo (esto es, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo del que deriva el fragmento, derivado o análogo. Específicamente, en una realización preferida la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede aumentar mediante deleción del marco y de las secuencias CDR que con C-terminales con respecto a la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias CDR se unen al antígeno, se pueden utilizar péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR en análisis de unión con el antígeno mediante cualquier método de análisis de unión conocido en la técnica.

La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero no limitados a, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. La invención también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invención, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como Fvs o anticuerpos de cadena sencilla (SCA) (p. ej., como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:42342; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de cadena sencilla están formados enlazando los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv a través de un puente de aminoácidos, produciendo un polipéptido de cadena sencilla. Se pueden utilizar las técnicas para ensamblar los fragmentos Fv funcionales de E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).

En otras realizaciones, la invención proporciona polipéptidos de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o sus fragmentos funcionalmente activos), por ejemplo en los que la inmunoglobulina se fusiona a través de un enlace covalente (p. ej., un enlace peptídico), en el extremo N o el extremo C a una secuencia de aminoácidos de otro polipéptido (o porción del mismo, preferiblemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos del polipéptido) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente la inmunoglobulina, o su fragmento, se enlaza covalentemente al otro polipéptido en el extremo N del dominio constante. Como se ha mencionado antes, tales polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación, incrementar la vida media in vivo, y aumentar la liberación de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario.

Las inmunoglobulinas de la invención incluyen análogos y derivados que están modificados, esto es, mediante el anclaje covalente de cualquier tipo de molécula con tal que tal anclaje covalente no deteriore la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que han sido modificado adicionalmente, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, transformación mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo numerosas modificaciones químicas cualesquiera mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a escisión química específica, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos precedentes se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y actividad de los polipéptidos de la invención, p. ej., para generar imágenes y radioimágenes de estos polipéptidos, medir sus niveles en muestras biológicas apropiadas, en métodos diagnósticos, etc. y para radioterapia.

Los anticuerpos de la invención se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferiblemente mediante una técnica de expresión recombinante.

La expresión recombinante de anticuerpos, o de sus fragmentos, derivados o análogos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, se puede ensamblar un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (p. ej., como describen Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo que, brevemente, implica la síntesis de porciones que contienen oligonucleótidos solapantes de la secuencia que codifica el anticuerpo, recocido y ligación de esos oligonucleótidos, y después amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede obtener clonando el anticuerpo. Si no está disponible un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el anticuerpo concreto, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, se puede obtener un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente apropiada (p. ej., una genoteca de ADNc de anticuerpos, o una genoteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o de las células que expresan el anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica concreta.

Si no está disponible una molécula de anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno concreto (o una fuente para una genoteca de ADNc para la clonación de un ácido nucleico que codifica tal anticuerpo), se pueden generar los anticuerpos específicos para un antígeno concreto mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, más preferiblemente, generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, se puede obtener un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo mediante el escrutinio de genotecas de expresión de Fab (p. ej., como describen Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para los clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico mediante escrutinio de genotecas de anticuerpos (Véase, p. ej., Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).

Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, éste se puede introducir en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, p. ej., la publicación WO 86/05807; la publicación WO 89/01036; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.122.464). También están disponibles vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa para la expresión simultánea con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Después, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede utilizar para introducir una o varias sustituciones o deleciones de nucleótidos necesarias para sustituir (o suprimir) uno o más restos cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario con un resto aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones se pueden llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o deleciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero no limitados a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos basados en PCR, etc.

Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452454) empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano con la actividad biológica apropiada. Como se ha descrito más arriba, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las diferentes porciones están derivadas de especies animales diferentes, tales como los que tienen una región variable derivada de un mAb de múrido y una región constante de anticuerpo humano, p. ej., anticuerpos humanizados.

Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención, el vector para la producción del anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. Así, los métodos para preparar los polipéptidos de la invención expresando el ácido nucleico que contiene las secuencias de la molécula de anticuerpo se describen en la presente memoria. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen una molécula de anticuerpo que codifica las secuencias y las señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas por Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).

El vector de expresión se transfiere a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan después mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.

Las células anfitrionas utilizadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención pueden ser células bacterianas tales como E. coli, o, preferiblemente, células eucarióticas, especialmente para la expresión de la moléculas de anticuerpo recombinante completa. En particular, células de mamífero tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO); junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).

Se puede utilizar una variedad de sistemas de expresión del vector en el anfitrión para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión en el anfitrión representan vehículos mediante los cuales se pueden producir y con posterioridad purificar las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen pero no están limitados a microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cosmídico recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levaduras (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen las secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (p. ej., células COS, CHO, BHK, HEK 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p. ej., el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vacunal).

En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente numerosos vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que esté siendo expresada. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal polipéptido, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo, podrían ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos polipeptídicos de fusión que ya estén purificados. Tales vectores incluyen, pero no están limitado, al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo puede estar ligada individualmente en el vector en marco con la región codificante lac Z de manera que se produce un polipéptido de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también se pueden utilizar para expresar polipéptidos foráneos como polipéptidos de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales polipéptidos de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a una matriz de cuentas glutationa-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión para la trombina o la proteasa del factor Xa de manera que el producto del gen diana clonado se puede liberar del radical GST.

En un sistema de insecto, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de la polihedrina) del virus y colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina). En células anfitrionas de mamífero, se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus (p. ej., un sistema de expresión de adenovirus.

Como se ha comentado antes, se puede elegir una cepa de células anfitrionas que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la manera específica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de los productos polipeptídicos puede ser importante para la función del polipéptido.

Para la producción a largo plazo, con altos rendimientos de anticuerpos recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden producir líneas celulares que expresan establemente un anticuerpo de interés transfectando las células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un marcador seleccionable (p. ej., neomicina o higromicina), y seleccionar la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas celulares diseñadas pueden ser concretamente útiles en el escrutinio y la evaluación de agentes que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo se pueden aumentar mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplificación for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula anfitriona aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

La célula anfitriona se puede transfectar simultáneamente con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de una cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que posibilitan una igual expresión de los polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede utilizar un único vector que codifica los polipéptidos tanto de la cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se debe colocar antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención ha sido expresada recombinantamente, ésta se pueden purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (p. ej., cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad por ejemplo con proteína A o antígeno específico, y cromatografía en columna de clasificación por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica normalizada para la purificación de polipéptidos.

Alternativamente, se puede purificar fácilmente cualquier polipéptido de fusión utilizando un anticuerpo específico para el polipéptido de fusión que está siendo expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la fácil purificación de los polipéptidos de fusión no desnaturalizados expresados en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación vacunal de manera que el marco de lectura abierto del gen se fusiona traduccionalmente a una etiqueta amino terminal que consiste en seis restos histidina. La etiqueta sirve como un dominio de unión a la matriz para el polipéptido de fusión. Los extractos de células infectadas con virus vacunales recombinantes se cargan en columnas de Ni^{2+}-ácido nitriloacético-agarosa y las proteínas con la etiqueta de histidina se hacen eluir selectivamente con tampones que contienen imidazol.

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos se conjugan a un radical diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos se pueden utilizar para la diagnosis o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diferentes enzimas, grupos prostéticos, sustancias fluorescentes, sustancias luminescentes, sustancias bioluminescentes, núclidos radiactivos, metales emisores de positrones (para su uso en tomografía de emisión de positrones), e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase generalmente la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.741.900 para los iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para su uso como agentes de diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; las sustancias fluorescentes adecuadas incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; las sustancias luminescentes adecuadas incluyen luminol; las sustancias bioluminescentes adecuadas incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y los núclidos radiactivos adecuados incluyen I^{125}, I^{131}, In^{111} y Tc^{99}.

Los anticuerpos de la invención o sus fragmentos se pueden conjugar a un agente terapéutico o radical de fármaco para modificar una respuesta biológica dada. No se debe considerar que el agente terapéutico o radical de fármaco está limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el radical de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria; un polipéptido tal como el factor de necrosis tumoral, interferón \alpha, interferón \beta, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biológica tal como una linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), el factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales radicales terapéuticos con los anticuerpos son bien conocidas, véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Alternativamente, un anticuerpo se puede conjugar con un segundo anticuerpo para formar un producto heteroconjugado de anticuerpo como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980.

Se puede utilizar un anticuerpo con o sin un radical terapéutico conjugado con él como agente terapéutico que se administra solo o combinado con uno o varios factores citotóxicos y/o citoquinas.

Los anticuerpos se pueden originar estimulando su producción en un anfitrión animal adecuado (p. ej. un pollo, ratón, rata, cobaya, conejo, oveja, cabra o mono) cuando el polipéptido de la presente invención se inyecta al animal. Si fuera necesario, se puede administrar un coadyuvante junto con el polipéptido de la invención. Los anticuerpos se pueden purificar después en virtud de su unión a un polipéptido de la invención.

Se pueden producir anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas. Estos se pueden formar fusionando células de mieloma y células de bazo que producen el anticuerpo deseado con el fin de formar una línea celular inmortal. Esta es la técnica bien conocida de Kohler y Milstein (Nature 256 52-55 (1975)).

Un aspecto adicional de la invención proporciona métodos de escrutinio para agentes que modulan (p. ej., regulan al alza o regulan a la baja) una característica, p. ej., de la expresión o de la actividad enzimática o de unión, de un polipéptido de la invención.

La invención proporciona métodos para identificar agentes activos (p. ej., compuestos químicos, proteínas, o péptidos) que se unen a un polipéptido de la invención y/o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la expresión o la actividad de un polipéptido de la invención. Los ejemplos de los agentes candidato, incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos (p. ej., ADN y ARN), carbohidratos, lípidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, agonistas, antagonistas, moléculas pequeñas y otros fármacos. Los agentes activos se pueden obtener utilizando cualquiera de los numerosos enfoques adecuados en los métodos con genotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: genotecas biológicas; genotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas dirigibles espacialmente; métodos con genotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de la genoteca "una cuenta-un compuesto"; y métodos de genotecas sintéticas que utilizan selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de la genoteca biológica está limitado a genotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a péptidos, oligómeros no peptídicos o genotecas de moléculas pequeñas de compuestos (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.738.996; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.807.683)

Los ejemplos de los métodos para la síntesis de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.

Se pueden presentar genotecas de compuestos, p. ej., presentadas en solución (p. ej., Houghten, 1992, Bio/Techni-
ques 13:412421), o en cuentas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409), esporas (Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), plásmidos (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) o fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310).

En una realización, los agentes que interactúan con (esto es, se unen a) un polipéptido de la invención se identifican en un sistema de análisis basado en células. De acuerdo con esta realización, las células que expresan un polipéptido de la invención se ponen en contacto con un agente candidato o un agente de control y se determina la capacidad del agente candidato para interactuar con dicho polipéptido. Si se desea, este análisis se puede utilizar para escrutar una pluralidad (p. ej. una genoteca) de agentes candidato. La célula, por ejemplo, puede ser de origen procariótico (p. ej., E. coli) o de origen eucariótico (p. ej., levadura o mamífero). Adicionalmente, las células pueden expresar el polipéptido de la invención endógenamente o estar diseñadas genéticamente para expresar dicho polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido de la invención o el agente candidato se marca, por ejemplo con un marcador radiactivo (tal como P^{32}, S^{35} o I^{125}) o un marcador fluorescente (tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído o fluorescamina) para posibilitar la detección de una interacción entre un polipéptido y un agente candidato. La capacidad del agente candidato para interactuar directamente o indirectamente con el polipéptido de la invención se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pero sin limitación, la interacción entre un agente candidato y un polipéptido de la invención se puede determinar mediante citometría de flujo, un análisis de centelleo, inmunoprecipitación o análisis mediante transferencia western.

En otra realización, los agentes que interactúan con (esto es, se unen a) un polipéptido de la invención se identifican en un sistema de análisis sin células. De acuerdo con esta realización, un polipéptido nativo o recombinante de la invención se pone en contacto con un agente candidato o un agente de control y se determina la capacidad del agente candidato para interactuar con dicho polipéptido. Si se desea, este análisis se puede utilizar para escrutar una pluralidad (p. ej. una genoteca) de agentes candidato. Preferiblemente, el polipéptido se inmoviliza primero, por ejemplo, poniendo en contacto el polipéptido con un anticuerpo inmovilizado que reconoce específicamente y se une a él, o poniendo en contacto una preparación de polipéptido purificada con una superficie diseñada para unirse a proteínas. El polipéptido puede ser purificado parcialmente o completamente (p. ej., parcialmente o completamente libre de otros polipéptidos) o ser parte de un producto lisado celular. Adicionalmente, el polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de la invención y un dominio tal como glutationina-S-transferasa. Alternativamente, el polipéptido se puede biotinilar utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, III.). La capacidad del agente candidato para interactuar con el polipéptido se puede duplicar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

En otra realización, se utiliza un sistema de análisis basado en células para identificar agentes activos que se unen y/o modulan la actividad de una proteína, tal como una enzima, o una porción biológicamente activa de la misma, que es responsable de la producción o degradación del polipéptido de la invención o es responsable de la modificación post-traduccional del polipéptido. En un primer escrutinio, se ponen en contacto una pluralidad (p. ej., una genoteca) de agentes con células que expresan naturalmente o recombinantamente: (i) un polipéptido de la invención; y (ii) una proteína que es responsable del procesamiento del polipéptido con en fin de identificar compuestos que modulan la producción, degradación, o modificación post-traduccional del polipéptido. Si se desea, se pueden someter a ensayo después los agentes activos identificados en el primer escrutinio en un segundo escrutinio frente a células que expresan naturalmente o recombinantamente el polipéptido específico de interés. La capacidad del agente candidato para modular la producción, degradación o modificación post-traduccional de un polipéptido se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo sin limitación, citometría de flujo, un análisis de centelleo, inmunoprecipitación y análisis mediante transferencia western.

En otra realización, los agentes que interactúan competitivamente con un polipéptido de la invención se identifican en un análisis de unión competitiva. De acuerdo con esta realización, las células que expresan el polipéptido se ponen en contacto con un agente candidato y un agente conocido por interactuar con el polipéptido; después se determina la capacidad del agente candidato para interactuar competitivamente con el polipéptido. Alternativamente, los agentes que interactúan competitivamente con un polipéptido de la invención se identifican en un sistema de análisis sin células poniendo en contacto dicho polipéptido con un agente candidato y un agente conocido por interactuar con el polipéptido. Como se ha mencionado antes, la capacidad del agente candidato para interactuar con un polipéptido de la invención se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos análisis, ya sean basados en células o sin células, se pueden utilizar para escrutar una pluralidad (p. ej., una genoteca) de agentes candidato.

En otra realización, los agentes que modulan (esto es, regulan al alza o regulan a la baja) la expresión de un polipéptido de la invención se identifican poniendo en contacto las células (p. ej., células de origen procariótico u origen eucariótico) que expresan el polipéptido con un agente candidato o un agente de control (p. ej., solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y determinando la expresión del polipéptido, o del ARNm que codifica el polipéptido. El nivel de expresión de un polipéptido seleccionado, o del ARNm que codifica el polipéptido, en presencia del agente candidato se compara con el nivel de expresión del polipéptido o del ARNm que codifica el polipéptido en ausencia del agente candidato (p. ej., en presencia de un agente de control). El agente candidato se puede identificar después como un modulador de la expresión del polipéptido basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del polipéptido, o del ARNm que codifica el polipéptido, es significativamente mayor en presencia del agente candidato que en su ausencia, el agente candidato se identifica como un estimulador de la expresión del polipéptido, o del ARNm que codifica el polipéptido. Alternativamente, cuando expresión del polipéptido, o del ARNm que codifica el polipéptido, es significativamente menor en presencia del agente candidato que en su ausencia, el agente candidato se identifica como un inhibidor de la expresión del polipéptido o del ARNm que codifica el polipéptido. El nivel de expresión de un polipéptido de la invención o del ARNm que lo codifica se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica basándose en la presente descripción. Por ejemplo, expresión del ARNm se puede evaluar mediante análisis de transferencia Northern o RT-PCR, y los niveles de proteína se pueden evaluar mediante análisis de transferencia western.

En otra realización, los agentes activos que modulan la actividad de un polipéptido de la invención se identifican poniendo en contacto una preparación que contiene el polipéptido, o células (p. ej., células procarióticas o eucarióticas) que expresan el polipéptido con un agente candidato o un agente de control y determinando la capacidad del agente candidato para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad del polipéptido. La actividad de un polipéptido se puede evaluar detectando su efecto sobre un "efector aguas abajo" por ejemplo, pero sin limitación, la inducción de una ruta celular de transducción de la señal del polipéptido, detectando la actividad catalítica o enzimática de la diana sobre un sustrato adecuado, detectando la inducción de un gen informador (p. ej., un elemento regulador que es sensible a un polipéptido de la invención y está enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, p. ej., luciferasa), o detectando una respuesta celular, por ejemplo, diferenciación celular, o proliferación celular según sea el caso, basándose en la presente descripción, se pueden utilizar mecanismos conocidos por los expertos en la técnica para medir estas actividades (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.401.639). El agente candidato se puede identificar después como modulador de la actividad de un polipéptido de la invención comparando los efectos del agente candidato frente al agente de control. Los agentes de control adecuados incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) y solución salina normal (NS).

En otra realización, los agentes activos que modulan (esto es, regulan al alza o regulan a la baja) la expresión, actividad o tanto la expresión como la actividad de un polipéptido de la invención se identifican en un modelo animal. Los ejemplos de los animales adecuados incluyen, pero no están limitados a, ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, perros y gatos. Preferiblemente, el animal utilizado representa un modelo de cáncer de mama y/o cáncer de riñón. De acuerdo con esta realización, se administra el agente candidato o un agente de control (p. ej., oralmente, rectalmente o parenteralmente por ejemplo intraperitonealmente o intravenosamente) a un animal adecuado y se determina el efecto sobre la expresión, actividad o tanto la expresión como la actividad del polipéptido. Los cambios en la expresión de un polipéptido se pueden evaluar mediante cualquier método adecuado descrito antes, basándose en la presente descripción.

En otra realización más, un polipéptido de la invención se utiliza como "proteína cebo" en un análisis con dos híbridos o un análisis con tres híbridos para identificar otras proteínas que se unen o interactúan con el polipéptido (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Bio/Techniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y la publicación WO 94/10300). Como apreciaran los expertos en la técnica, tales proteínas de unión están implicadas probablemente en la propagación de las señales de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, como elementos aguas arriba o aguas abajo de una ruta de señalización que implica los polipéptidos de la invención.

Así, la presente invención proporciona análisis para su uso en el descubrimiento de fármacos con el fin de identificar o verificar la eficacia de agentes para el tratamiento o la prevención del cáncer, en particular cáncer de mama y/o cáncer de riñón. Los agentes candidato se pueden analizar en cuanto a su capacidad para modular los niveles de un polipéptido de la invención, en un sujeto que tiene cáncer de mama y/o cáncer de riñón. Los agentes activos susceptibles de modular los niveles de un polipéptido de la invención en un sujeto que tiene cáncer de mama y/o cáncer de riñón frente a los niveles encontrados en sujetos sin cáncer de mama y/o cáncer de riñón, o para producir cambios similares en modelos animales experimentales de cáncer de mama y/o cáncer de riñón, se pueden utilizar como agentes guía para el descubrimiento adicional de fármacos, o utilizar terapéuticamente. La expresión de un polipéptido de la invención se puede analizar, por ejemplo, mediante inmunoanálisis, electroforesis en gel seguida de visualización, detección de la actividad, o cualquier otro método ilustrado en la presente memoria o conocido por los expertos en la técnica. Tales análisis se pueden utilizar para escrutar fármacos candidato, en la vigilancia clínica o en el desarrollo de fármacos, donde la abundancia de un polipéptido de la invención puede servir como marcador concertado para enfermedades clínicas.

Un experto en la técnica también apreciará que un polipéptido de la invención anterior se puede utilizar en un método para el diseño basado en la estructura de un agente, en particular una molécula pequeña que actúa para modular (p. ej. estimular o inhibir) la actividad de dicho polipéptido, comprendiendo dicho método:

1)

determinar la estructura tridimensional de dicho polipéptido;

2)

deducir la estructura tridimensional del sitio o los sitios de unión probablemente reactivos del agente;

3)

sintetizar los agentes candidato que se pronostica que reaccionan o se unen al sitio reactivo o de unión deducido; y

4)

someter a ensayo si el agente candidato es capaz de modular la actividad de dicho polipéptido.

Se apreciará que es probable que el método descrito antes sea un proceso iterativo.

La composición se suministrará usualmente como parte de una composición farmacéutica, estéril que incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del método deseado para administrarla al paciente).

Se puede proporcionar en una forma de dosificación unitaria, se proporcionará generalmente en un recipiente sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Tal kit podría incluir normalmente (aunque no necesariamente) instrucciones para su uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.

La composición farmacéutica se puede adaptar a la administración mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo mediante la ruta oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica farmacéutica, por ejemplo mezclando el ingrediente activo con uno o varios portadores o excipientes en condiciones estériles.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración oral se pueden presentar en forma de unidades discretas tales como cápsulas o comprimidos; en forma de polvos o gránulos; en forma de soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos; o en forma de espumas o batidos comestibles; o en forma de emulsiones).

Los excipientes adecuados para los comprimidos o las cápsulas de gelatina dura incluyen lactosa, almidón de maíz o sus derivados, ácido esteárico o sus sales.

Los excipientes adecuados para su uso con las cápsulas de gelatina blanda incluyen por ejemplo aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos, o líquidos etc.

Para la preparación de soluciones y jarabes, los excipientes que se pueden utilizar incluyen por ejemplo agua, polioles y azúcares. Para la preparación de suspensiones, se pueden utilizar aceites (p. ej. aceites vegetales) para proporcionar suspensiones de aceite en agua o de agua en aceite.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración transdérmica se pueden presentar en forma de parches discretos destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado de tiempo. Por ejemplo, el ingrediente activo se puede liberar del parche mediante iontoforesis como se describe generalmente en Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986).

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración tópica se pueden formular en forma de pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Cuando se formulan en forma de pomada, el ingrediente activo se puede emplear con una base para pomadas parafínica o miscible con agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular en una crema con una base para crema de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración tópica al ojo incluyen gotas oculares donde el ingrediente activo se disuelve o suspende en un portador adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración tópica en la boca incluyen grageas, pastillas y enjuagues bucales.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración rectal se pueden presentar en forma de supositorios o enemas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración nasal donde el portador es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula en el intervalo de 20 a 500 micras que se administra de manera que se toma esnifado, esto es mediante la rápida inhalación a través del conducto nasal desde el recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz. Las composiciones adecuadas donde el portador es un líquido, para su administración en forma de una pulverización nasal o en forma de gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración mediante inhalación incluyen espolvoreables o nieblas de partículas finas que se pueden generar por medio de diferentes tipos de aerosoles, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medidas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración vaginal se pueden presentar en forma de pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o composiciones para su pulverización.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas a la administración parenteral incluyen soluciones inyectables acuosas y no acuosas estériles que pueden contener anti-oxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que vuelven la composición sustancialmente isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Los excipientes que se pueden utilizar para las soluciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o de múltiples dosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden ser almacenadas en condiciones de deshidratación mediante congelación (liofilizadas) requiriendo solamente la adición del líquido estéril portado, por ejemplo agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones inyectables extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos
estériles.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorantes, sales (los propios polipéptidos de la presente invención se pueden proporcionar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente activos además del polipéptido de la presente invención.

Las dosificaciones del agente activo de la presente invención pueden variar entre unos límites amplios, dependiendo de la enfermedad o trastorno que se va a tratar, la edad y la condición del individuo que se va a tratar, etc. y un médico determinará por último las dosificaciones apropiadas que se van a utilizar. Esta dosificación se puede repetir tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, se pueden reducir la cantidad y/o la frecuencia de la dosificación, de acuerdo con la práctica clínica normal.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de al menos un anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento del cáncer de mama. En particular, la preparación de las composiciones que comprenden o consisten en los anticuerpos conjugados con un radical terapéutico adecuado para ser utilizado en la terapia del cáncer de mama, es una realización preferida de este aspecto de la invención.

En el contexto de la presente invención, se puede obtener la muestra biológica de cualquier fuente, tal como una muestra de suero o una muestra de tejido, p. ej. tejido de mama o riñón. Cuando se busca una evidencia de metástasis, se podría mirar en los sitios principales de metástasis de mama tales como los nódulos linfáticos, el hígado, el pulmón y/o los huesos y de metástasis de riñón, tales como los nódulos linfáticos, el pulmón y/o los huesos.

Los rasgos preferidos de cada aspecto de la invención son como los de cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis.

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que no se deben considerar en modo alguno limitantes del alcance de la presente invención. Los ejemplos hacen referencia a las figuras en las que:

Fig. 1: muestra la secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2) de BCMP 101. El espectro de masas en tándem está en negrita y en cursiva. Los espectros de masas MALDI están en negrita y subrayados. La secuencia peptídica utilizada para producir el anticuerpo monoclonal frente a BCMP 101 está sombreada.

Fig. 2: muestra la distribución en los tejidos del ARNm de BCMP 101. Se cuantificaron los niveles de ARNm en tejidos normales (incluyendo riñón) y dos líneas celulares de cáncer de riñón (línea celular de tumor de Wilm G401 y línea celular de riñón embrionario humano 293) mediante RT-PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm se expresan como el número de copias ng^{-1} ADNc.

Fig. 3: muestra la expresión del ARNm de BCMP 101 en tejidos de mama normales y tumorales. Se midieron los niveles de ARNm de BCMP 101 en tejidos normales y tumorales emparejados de siete pacientes con cáncer de mama mediante RT-PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm se expresan como el número de copias ng^{-1} ADNc.

Fig. 4: compara la expresión del ARNm de BCMP 101 en tejidos tumorales mamarios metastásicos/no metastásicos. A=Muestras 1-23, que derivan de muestras de tumor que no implican metástasis en los nódulos linfáticos. B=Muestras 26-50, que derivan de muestras tumorales que implican metástasis en un número variable de nódulos linfáticos. C=8 muestras de tejidos mamarios normales (mamoplastias de reducción). Los niveles de ARNm se expresan como el número de copias ng^{-1} ADNc. Hay una diferencia estadísticamente significativa entre todas las muestras tumorales y las muestras normales (ensayo de la T, p<0,05).

Fig. 5: Análisis RT PCR in situ de la expresión de BCMP 101 en secciones de tejido de cáncer de mama ductal invasivo (panel superior), y la consecutiva sección de control negativa en la cual los cebadores de BCMP 101 han sido remplazados por cebadores para un gen de control (Antígeno Específico de Próstata) (panel inferior). Obsérvese la elevada expresión de BCMP 101 (tinción oscura) en una porción de hiperplasia epitelial (típica del carcinoma de mama), flanqueada por dos flechas en el panel superior.

Fig. 6: localización celular de BCMP 101 en líneas celulares de cáncer de mama. Microscopía de fluorescencia que muestra la expresión de BCMP 101 etiquetado con AFP SuperGlo® C-terminal en las líneas celulares MDA-MB468 (A) y T47D (B). La localización de la membrana se indica mediante flechas blancas. Aumento utilizando objetivo de inmersión en aceite \times60.

Fig. 7: localización inmunohistoquímica de la proteína de expresión BCMP 101 en secciones de tejido de carcinoma de mama. La inmunotinción de BCMP 101 en células de carcinoma está indicada por flechas.

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Ejemplo 1

Identificación y Clonación de BCMP 101 Se aisló la proteína BCMP 101 de membranas celulares MDA-MB468.

Se cultivó la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB-468 (ATCC:HTB-132) y se extrajeron las membranas integrantes con el detergente Tx114. Estas se analizaron con posterioridad mediante electroforesis en gel bidimensional como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.064.754 y 6.278.794.

Espectrometría de Masas

Las proteínas separadas del gel 2D fueron digeridas con tripsina y analizadas mediante MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems) utilizando a un láser con una longitud de onda de 337 nm para la desorción y el análisis en la modalidad reflectrón. Las masas seleccionadas para BCMP 101 se caracterizaron adicionalmente mediante espectrometría de masas en tándem utilizando QTOF-MS equipado con una fuente de iones de nanopulverización, (Micromass UK Ltd.). Antes del análisis MALDI las muestras se desalaron y se concentraron utilizando C18 Zip Tips® (Millipore). Las muestras para el MS en tándem se purificaron utilizando un sistema nano LC (LC Packings) que incorpora material C18 SPE.

Utilizando un programa de búsqueda SEQUEST (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5:976-989), se buscaron los espectros de masas en tándem no interpretados de péptidos sometidos a digestión con tripsina frente a una base de datos de proteínas de dominio público construidas de entradas de proteínas en la base de datos no redundante mantenida por el National Centre for Biotechnology Information (NCBI) a la que se puede acceder en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y también construidas de entradas de Etiquetas de Secuencia Expresada (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html). Como resultado de una búsqueda en las bases de datos, se determinó la siguiente secuencia de aminoácidos de un péptido sometido a digestión con tripsina de BCMP 101 a partir de un emparejamiento con un péptido sometido a digestión con tripsina en una traducción conceptual de EST AI472043: NSESFAAWCR (SEQ ID NO: 3, mostrada en la Fig. 1).

EST AI472043 corresponde a los pares de bases 558-1054 de la secuencia de ADN de la Fig. 1. Se utilizaron los EST AI684699 (correspondiente a los pb 80-565) y AI827549 (correspondiente a los pb 45-547) para establecer el ORF completo (obsérvese que AI827549 incluye el codón de terminación en marco inmediatamente aguas arriba del ATG). Se diseñó el cebador efector utilizado para amplificar el clon completo para las secuencias genómicas en la entrada AC021396 (véase más abajo el Ejemplo 3 en la localización cromosómica). La proteína identificada tenía un pI de 5,3 y un PM de 39940 Da medido mediante análisis en gel 2-D como se ha descrito antes, el pI y el PM pronosticados para esta proteína son 5,34 y 34474 respectivamente.

Se amplificó un Clon Completo mediante PCR a partir de ADNc de MDA-MB-468: Preparación de ARN Total y Síntesis de ADNc

Se preparó ARN total a partir de células cultivadas y muestras de tejido utilizando reactivo Trizol (Life Technologies), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se resuspendió en agua sin ARNasa a una concentración de 1 \mug/\mul. Se utilizaron de 1 a 5 \mug de ARN total como molde para la síntesis de ADNc utilizando un cebador oligo dT y el kit de transcripción inversa Superscript II (Life Technologies). Los ADNc se purificaron en columna (Qiagen) y se hicieron eluir a una concentración de 10 ng/\mul.

Clonación de ADNc de BCMP 101

El ORF de BCMP 101 completo pronosticado se amplificó mediante PCR de los ADNc MDA-MB468, utilizando los siguientes cebadores:

Efector:	5' TGTGCAAATGACCCTGGAGTTG 3';	(SEQ ID NO: 4)
Antisentido:	5' GGCTGCTACTGCAAACAGTTCC 3'.	(SE ID NO: 5)

Las reacciones contenían 10 ng de ADNc y reactivos para la PCR (Clontech, kit para PCR Advantage-GC 2), y se utilizaron los siguientes parámetros de ciclación: 1 ciclo de 94ºC durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, 72ºC. durante 90 segundos. Los productos de la PCR se purificaron en columna (Qiagen), se clonaron en un vector T/A (Invitrogen) y con posterioridad se verificó la secuencia de nucleótidos (Universidad de Oxford, Sequencing Facility, UK).

La secuencia de BCMP 101 (Fig. 1, SEQ ID NO: 1) coincide con la siguiente entrada de GenBank (disponible en: http://www.ncbi.nim.nih.gov/): proteína CAD10629-NSE2 [Homo sapiens]-Una nueva proteína que contiene NS (emitida el 24 Oct. 2001)).

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Ejemplo 2

Expresión de ARNm de BCMP 101 en Tejidos Humanos

Se utilizó una RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. y Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996); Morrison, T. B., Weis, J. J. y Wittwer, C. T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954-958 (1998)) para analizar la distribución del ARNm de BCMP 101 en tejidos humanos normales y líneas celulares de cáncer de riñón (Fig. 2). Obsérvese la diferencia de 40 veces entre la escala a mano derecha, utilizada para las líneas celulares de cáncer de riñón, y la escala a mano izquierda, utilizada para los tejidos humanos normales, que incluyen riñón
normal.

Cuantificación de ARNm de BCMP 101 mediante RT-PCR

Se utilizó una RT-PCR en tiempo real para medir cuantitativamente la expresión de BCMP 101 en ARNm de tejidos humanos normales (Clontech), ARNm de líneas celulares de cáncer de riñón (Ambion), tejidos de cáncer de mama retirados durante la cirugía, y tejido de mama normal retirado durante mamoplastia de reducción de mama. En la operación se obtuvo la aprobación ética para las muestras de mama normales y tumorales (Universidad de Oxford, UK). Los cebadores utilizados para la PCR fueron los siguientes:

efector:	5' GGTCAACGATCTGTACCGCTAC 3',	(SEQ ID NO: 6)
antisentido:	5' GCCGATCTTGAACTCGCGCTTG 3'.	(SE ID NO: 7)

Las reacciones que contenían 10 ng de ADNc, preparadas como se ha descrito antes, los reactivos de detección de la secuencia verde SYBR (PE Biosystems) y los cebadores efector y antisentido se analizaron en un sistema de detección de secuencias ABI7700 (PE Biosystems). Las condiciones de la PCR fueron 1 ciclo a 50ºC durante 2 min, 1 ciclo a 95ºC durante 10 min, y 40 ciclos de 95ºC durante 15 s, 65ºC durante 1 min. Se midió la acumulación de producto de la PCR en tiempo real como el incremento de la fluorescencia verde SYBR, y los datos se analizaron utilizando el programa Sequence Detector v1.6.3 (PE Biosystems). Se generaron las curvas patrón referentes al número de copias del molde inicial para la fluorescencia y el ciclo de amplificación utilizando el producto de la PCR amplificado como molde, y se utilizaron para calcular el número de copias de BCMP 101 en cada muestra.

En conjunto, la distribución del ARNm de BCMP 101 era baja en tejidos normales, con los niveles de expresión más altos en glándula mamaria, riñón y vejiga (130-240 copias ng^{-1} ADNc) (Fig. 2). En contraste, se detectó ARNm de BCMP 101 a un nivel elevado en dos líneas celulares de cáncer de riñón, línea celular de Riñón Embrionario Humano 293 y línea celular G401 de tumor de Wilm (3300 y 11.000 copias ng^{-1} ADNc respectivamente)
(Fig. 2).

Puesto que se identificó BCMP 101 en la línea celular derivada de cáncer de mama MDA-MB-468 los autores de la presente invención midieron la distribución del ARNm de BCMP 101 en muestras de tejido mamario normal y tumoral de pacientes adyacentes emparejadas de siete pacientes con cáncer de mama (Fig. 3). La expresión de BCMP 101 aumentó en todas las muestras tumorales con respecto a sus tejidos normales emparejados, mostrando cuatro de las muestras un aumento de la expresión de 4 veces o mayor. La diferencia entre los grupos de muestras tumorales normales y tumorales emparejadas era muy significativa estadísticamente, con un valor de p de 0,014. Así, BCMP 101 muestra un patrón de expresión restringido en tejidos humanos normales, y es elevado en algunos tumores mamarios, sugiriendo que esta proteína tiene potencial como diana terapéutica.

Para examinar adicionalmente la expresión de este gen en tejidos de cáncer de mama, se amplió la cuantificación de los niveles de ARNm de BCMP 101 a un grupo más de 40 muestras de tumor, 20 de pacientes con metástasis en los nódulos linfáticos y 20 de pacientes sin metástasis en los nódulos linfáticos (Fig. 4). La expresión de ARNm de BCMP 101 era elevada en la mayoría de las muestras de carcinoma, con respecto los controles de tejido de mama normal, no obstante, no había una asociación significativa de expresión con la metástasis en los nódulos linfá-
ticos.

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Ejemplo 3

Localización Cromosómica

Una búsqueda Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov(BLAST) con la secuencia de ADNc de BCMP 101 (Figura 1) frente a htgs (Secuencias de Genoma de Alto Rendimiento (High-Throughput Genome Sequences)), devuelve el siguiente clon de GenBank: AC021396, mapeado para el cromosoma 8q23.

Además, se ha identificado un gen responsable de la Enfermedad Poliquística del Riñón (PKD) en un modelo de rata de PKD autosómica dominante en el cromosoma 5 de rata (Localización del primer locus genético, PKDr1, que controla la enfermedad poliquística del riñón dominante autosómica en rata Han:SPRD cy/+ (Location of the first genetic locus, PKDr1, controlling autosomal dominant policystic kidney disease in Han:SPRD cy/+rat), Bihoreau Mont., Ceccherini I, Browne J, Kranzlin B, Romeo G, Lathrop G M, James M R, Gretz N., Hum Mol Genet 1997 Abril;6(4):609-13). Un mapeo de ligamiento detallado del cromosoma 5 de rata situó este locus PKD a aproximadamente 25 cM del gen de la proencefalina, que en seres humanos está localizado en 8q23-q24.

Una posterior búsqueda Blast del genoma humano (http://www.ensembl.org) con la secuencia de ADNc de BCMP 101 mapea el gen para el clon AC021396 de GenBank en el cromosoma 8, banda q24.21.

\newpage

Ejemplo 4

RT-PCR in situ

Para ilustrar adicionalmente la implicación de BCMP 101 en el cáncer de mama, se ha llevado a cabo el análisis mediante RT-PCR in situ para la expresión de BCMP 101 en secciones de tejidos de carcinoma de mama ductal invasivo.

Se seccionaron tejidos de mama embebidos en parafina, fijados con formalina de pacientes con carcinoma ductal (grosor 5 micrómetros) sobre portas de vidrio (proporcionados por el Banco de Tejidos Humanos para Investigación, Departmento de Patología Celular, Peterborough District Hospital, Thorpe Road, Peterborough PE3 6DA). Brevemente, el tejido fue desprendido de la cera en xileno, rehidratado gradualmente en alcohol y lavado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de ser permeabilizado en Triton X-100 al 0,1% durante 3 minutos seguido de tratamiento con Proteinasa K durante 30 minutos a 37ºC.

Se llevó a cabo la RT PCR in situ directa en GeneAmp In Situ PCR System 1000 (Perkin Elmer Biosystems) utilizando un kit GeneAmp Thermostable rTth RT PCR (Perkin Elmer Biosystems). Los cebadores utilizados para amplificar BCMP 101 fueron los siguientes:

efector:	5'-TTCACCTCTCCGCGGGTAGCCT-3',	(SEQ ID NO: 8)
antisentido:	5'-GGAAGTTACCCACATATACGGC-3'.	(SEQ ID NO: 9)

Los parámetros del ciclo térmico fueron: 1 ciclo de 94ºC durante 2,5 minutos seguido de 20 ciclos de 94ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 50 segundos, y 72ºC durante 30 segundos. El producto amplificado fue detectable mediante la incorporación directa de Digoxigenina-11-dUTP (Roche Diagnostics Ltd.) estable a los álcalis que se añadió a la mezcla de reacción. Después de lavar en PBS se incubó un anticuerpo anti-Digoxigenina-Oro (Roche Diagnostics Ltd.) sobre la sección de tejido durante 30 minutos a la temperatura ambiente, esto estuvo seguido de una etapa de potenciación con plata (reactivos potenciadores con plata de Roche Diagnostics Ltd.) durante cuyo momento el producto de expresión amplificado se volvió visible al microscopio óptico. El tejido fue contrateñido con hematoxilina (Dako Ltd.) y las imágenes fueron capturadas por medio de una cámara digital anclada al microscopio óptico (objetivo \times10).

En las imágenes emparejadas de la Fig. 5 el panel superior demuestra la expresión de BCMP 101 en el tejido con cáncer de mama, el panel inferior representa una sección consecutiva de control negativo donde los cebadores de BCMP101 han sido remplazados por los cebadores para un gen de control (Antígeno Específico de Próstata). Resulta claramente evidente a partir de estas Figuras que BCMP 101 es expresado significativamente en las células epiteliales ductales cancerosas de este tejido de cáncer de mama (compárese con el tejido de mama circundante y el experimento de control negativo). Por ejemplo, se ha flanqueado una porción de hiperplasia epitelial (típica del carcinoma de mama) con dos flechas (panel superior); esto muestra que la zona de tinción oscura (que representa la expresión de BCMP101) está restringida a las células cancerosas.

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Ejemplo 5

Localización Celular de BCMP 101 en Líneas Celulares de Cáncer de Mama

Se utilizó el marcaje con proteína fluorescente verde (GFP) SuperGlo® C-terminal para determinar la localización celular de BCMP 101 en las líneas celulares MDA-MB468 y T47D.

El ORF de BCMP 101 completo fue clonado mediante PCR en el vector pQBI25/50-fIN1 (Qbiogene) dando como resultado una adición en marco de la proteína SuperGlo®(sg)GFP en el extremo C terminal de la proteína expresada. La transfección transitoria de ADNc de BCMP 101 marcada con sgGFP en las líneas celulares MDA-MB468 y T-47D se logró utilizando el reactivo de transfección Superfect® (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las células transfectadas se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos, después se lavaron de nuevo en PBS antes de ser montadas en medio de montaje fluorescente con una base acuosa (Dako Ltd.). Las imágenes de fluorescencia se capturaron utilizando una cámara digital DC300F anclada a un microscopio de fluorescencia DMIRE2 (Leica Microsystems (UK) Ltd.)

El análisis de la localización celular de BCMP 101 marcado con GFP demostró una elevada expresión en el retículo de Golgi y endoplásmico así como una expresión significativa asociada con la membrana plasmática en las líneas celulares tanto MDA-MB468 como T47D (Fig. 6). Se observaron niveles particularmente elevados de localización de BCMP 101 de membrana plasmática en zonas de contacto célula-célula (Fig. 6B)). Estos datos sugieren un papel para BCMP 101 en la transducción de una señal celular mediada por el contacto célula-célula.

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Ejemplo 6

Expresión de BCMP 101 en Tejidos de Cáncer de Mama mediante Inmunohistoquímica

Se utilizó el análisis inmunohistoquímico para determinar la expresión de la proteína de BCMP 101 en secciones de tejidos de carcinoma de mama.

Se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico de secciones congeladas de un tumor de mama (de Peterborough Tissue Bank, ref. Núm. 6574-Human Research Tissue Bank, Departmento de Patología Celular, Peterborough District Hospital, Thorpe Road, Peterborough PE3 6DA - http://www.tissuebank.co.uk/).

Se descongelaron las secciones congeladas a la temperatura ambiente durante 30 minutos, y se fijaron en acetona a 4ºC durante 10 minutos. Las secciones se lavaron con posterioridad dos veces en PBS.

La actividad hidrógenoperoxidasa endógena se sofocó tratando los portas en hidrógenoperoxidasa al 3%/PBS durante 10 minutos, seguido de 2 lavados en PBS. El tejido se bloqueó en suero de burro al 10%/PBS durante 1 hora antes de la adición de 2 microgramos/ml de anticuerpo policlonal primario (en suero de burro al 2,5%).

Se originó anticuerpo policlonal para BCMP 101 en conejos inmunizados con un péptido específico (Abcam Ltd., Cambridge, UK). Se eligió la secuencia peptídica para la síntesis basándose en los gráficos del carácter hidrófobo, la antigenicidad, y la probabilidad superficial. El péptido se sintetizó utilizando la química de Fmoc con un resto cisteína añadido al extremo para permitir el acoplamiento reactivo de los tioles específicos de la Hemocianina de Lapa Ojo de Cerradura antes de la inmunización. El péptido BCMP 101 utilizado fue: SYKEVPTADPTGVDR (SEQ ID NO: 10, esta secuencia está sombreada en la Fig. 1).

El análisis de transferencia Western de los productos lisados de células T47D y MDA-MB468 se utilizó para confirmar que el anticuerpo presentaba reacción cruzada con una sola banda del tamaño pronosticado. Después de 3 lavados en PBS las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con biotina (anti-conejo de Burro conjugado con Biotina-SP-AffiniPure®, Jackson ImmunoResearch) diluido a 1:200 (2,5 microgramos/ml en suero de burro al 2,5%/PBS) durante 1 hora. Los portas se lavaron 3 veces en PBS y el tejido se incubó con Estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch) diluida 1:100 (5 microgramos/ml en suero de burro al 2,5%/PBS), seguido de tres lavados de 5 minutos en PBS. La señal de anticuerpo se detectó utilizando solución sustrato DAB (Dako Ltd.) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

El análisis inmunohistoquímico de la expresión de BCMP 101 demostró niveles muy bajos en múltiples tejidos normales. En contraste, se detectaron niveles elevados de inmunorreactividad con BCMP 101 en las células de carcinoma del tejido de cáncer de mama (Fig. 7).

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Ejemplo 7

Estudio en Dos Híbridos de Levadura de los Factores que Interaccionan con BCMP 101 Construcción de plásmidos presa

Se preparó ADNc cebado al azar, se ligó un vector apropiado utilizando métodos conocidos en la técnica, y se transformó en células electrocompetentes como se describe en la publicación WO 00/66722 y la publicación WO 02/12290.

Se recogió el ADNc de células (antes) y se transformó en la cepa de levadura YHGX13 (MATalpha Gal4delta Gal80delta ade2-101::KAN R, his3, leu2-3, -112, trpl-901, ura3-52 URA3::UASGALI-LacZ, Met) como se describe en las Solicitudes de Patente anteriores.

Construcción de Plásmidos cebo

Se clonaron fragmentos cebo en vectores apropiados utilizando métodos conocidos en la técnica. La amplificación, la PCR y el escrutinio de la colección con el sistema de dos híbridos en levadura fueron los descritos en la publicación WO 00/66722. Cuando el número de clones celulares His+ <285 se utiliza en todas las colonias el procedimiento del protocolo de sellado-recubrimiento (stamp-overlay protocol). Si el número de clones celulares His+ >285 y <5000: entonces el procedimiento de recubrimiento y después los protocolos de sellado-recubrimiento en todas las colonias azules (véase la publicación WO 00/66722 secciones 2.B y 2.C).

El Análisis de Sellad-Recubrimiento (stamp-overlay assay)

Se hicieron crecer colonias His+ durante la noche a 30ºC en placas de microtitulación que contenían medio DO-Leu-Trp-His+Tetraciclina con sacudimiento. Al día siguiente del cultivo nocturno, las 96 colonias se sellaron sobre una placa de 15 cm de DO-Leu-Trp-His. Se aplicaron 4 colonias de levadura de control en la misma placa. Después de 2 días de crecimiento a 30ºC, se realizó un análisis de recubrimiento (overlay assay) sobre esta placa con 80 ml de la mezcla de recubrimiento (véase la publicación WO 00/66722 sección 2.B.). Después de 2 horas de incubación, la placa se fotografíó con una cámara CCD. La intensidad azul se cuantificó por medio del soporte lógico Genetools® (SYNGENE) y se normalizó para las aplicaciones de control. Se identificaron los clones positivos y se rescataron y transformaron los plásmidos en células electrocompetentes como se describe en la publicación WO 02/12290 y en la publicación WO 00/66722.

Interacciones Proteína-Proteína

La identificación de la secuencia de nucleótidos de la presa fue como se ha descrito (publicación WO 02/12290 y publicación WO 00/66722) o alternativamente, las secuencias de nucleótidos de la presa se compararon entre sí y se agruparon aquellas que compartían identidad en una región significativa (60 nt) para formar una secuencia contigua (Contig) cuya identidad se averiguó de la misma manera que para los fragmentos presa individuales (publicación WO 02/12290 y publicación WO 00/66722). Los Dominios de Interacción Seleccionados se determinaron también como se describe en las solicitudes más adelante.

Principales Factores que Interaccionan con BCMP 101

BCMP 101 interacciona con la alfa-catenina 1 (Acceso Swiss-Prot P35221) y componentes de la membrana de las vesículas AP1M2 recubiertas con clatrina (Acceso GenBank NP _{-} 005489) y AP47 (Acceso GenBank NP _{-} 115882).

La alfa-catenina 1 se asocia con los dominios citoplásmicos de múltiples cadherinas localizadas en la membrana plasmática y como tales se piensa que juegan un importante papel en la adherencia célula-célula. Interesantemente, la alfa-catenina 1 muta en la familia de células de cáncer de colon humano invasivo HCT-8 y es por lo tanto un gen supresor de la invasión en el cáncer de colon humano (Vermeulen, S. J., Nollet, F., Teugels, E., Vennekens, K. M., Malfait, F., Philippe, J., Speleman, F., Bracke, M. E., van Roy, F. M. y Mareel, M. M. The alpha E-catenin gen (CTNNA1) acts as an invasion-suppressor gen in human colon cancer cells. Oncogene 18, 905-915 (1999)). Una evidencia adicional sostiene una interacción entre BCMP101 y la alfa-catenina 1 en las células de cáncer de mama. En primer lugar, la alfa-catenina fue identificada en un análisis proteómico de la misma línea celular de cáncer de mama (MDA-MB-468) que la descrita antes en el Ejemplo 1. En segundo lugar, la asociación de BCMP 101 con la alfa-catenina 1 es responsable de la localización en la membrana plasmática del PCMP 101 marcado con GFP observado en las líneas celulares de cáncer de mama (Fig. 6A), y en particular la observación de que el BCMP 101 estaba asociado a la membrana plasmática en los sitios de contacto célula-célula (Fig. 6B). Así BCMP 101 está asociado con un complejo de proteínas de membrana con un papel conocido en el progreso del tumor.

La Fig. 6 también muestra una cierta localización citosólica y en el Golgi del BCMP 101 marcado con GFP. Esto coincide con la interacción de BCMP 101 con AP1M2 y AP47 que son parte del complejo adaptador AP-1 que es reclutado del citosol sobre la red de membranas de Golgi en trans, donde se ensambla con la clatrina en un recubrimiento que dirige la vesícula en ciernes implicada en el tráfico de proteínas a otras membranas celulares incluyendo la membrana plasmática.

<110> Oxford GlycoSciences (UK) Ltd

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Terrett, Jonathan A

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<120> PROTEÍNA

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<130> P0081-W001

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<150> GB 0114643.0

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<151> 2001-06-15

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0205264.5

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<151> 2002-03-06

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<160> 10

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 310

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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4

5

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<210> 2

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<211> 1054

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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6

7

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Asn Ser Glu Ser Phe Ala Ala Trp Cys Arg}

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<210> 4

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgcaaatg accctggagt tg

\hfill

22

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<210> 5

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 5

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ggctgctact gcaaacagtt cc

\hfill

22

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<210> 6

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcaacgat ctgtaccgct ac

\hfill

22

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<210> 7

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gccgatcttg aactcgcgct tg

\hfill

22

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<210> 8

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttcacctctc cgcgggtagc ct

\hfill

22

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<210> 9

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 9

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ggaagttacc cacatatacg gc

\hfill

22

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<210> 10

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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\sa{Ser Tyr Lys Glu Val Pro Thr Ala Asp Pro Thr Gly Val Asp Arg}

Claims (17)

1. Un polipéptido aislado que:

a)

comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1); o

b)

es un derivado que tiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) que tiene una identidad de secuencia de 95% con el polipéptido del SEQ ID NO: 1 y que muestra la actividad inmunológica de dicho polipéptido.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1, que se proporciona como parte de un polipéptido de fusión.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante que:

a)

comprende o consiste en la secuencia de ADN mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o su ARN equivalente; o

b)

una secuencia que es complementaria a la secuencia de a);

4. Un vector que comprende una o más moléculas de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3.

5. Una célula anfitriona transformada/transfectada con un vector como se define en la reivindicación 4.

6. Un método de escrutinio para y/o la diagnosis del cáncer de mama o la vigilancia y/o la evaluación del tratamiento del cáncer de mama en un sujeto que comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o 2, o una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto.

7. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o 2, que está conjugado con un radical terapéutico adecuado para ser utilizado en la terapia del cáncer de mama.

8. Un anticuerpo como se define en la reivindicación 7, donde el radical terapéutico se selecciona entre una toxina, un agente citotóxico o una citoquina.

9. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que es monoclonal, biespecífico, quimérico, o humanizado.

10. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que está pegilado.

11. Un método de escrutinio de agentes que interaccionan con uno o más polipéptidos como se definen en la reivindicación 1 o 2, comprendiendo dicho método:

(a)

poner en contacto dicho polipéptido con un agente candidato; y

(b)

determinar si un agente candidato interacciona o no con dicho polipéptido.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la determinación de la interacción entre el agente candidato y el polipéptido comprende detectar cuantitativamente la unión del agente candidato y dicho polipéptido.

13. Un método de escrutinio de agentes que modulan

i)

la expresión y/o actividad de un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o 2, o

ii)

la expresión de una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3,

comprendiendo dicho método:

a)

comparar la expresión y/o actividad de dicho polipéptido o la expresión de dicha molécula de ácido nucleico, en presencia de un agente candidato con la expresión y/o actividad de dicho polipéptido o la expresión de dicha molécula de ácido nucleico, en ausencia del agente candidato o en presencia de un agente de control, y

b)

determinar si el agente candidato hace que la expresión o actividad de dicho polipéptido o la expresión de dicho ácido nucleico, cambie.

14. El método de la reivindicación 13, donde el nivel de expresión y/o actividad de dicho polipéptido o el nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico se compara con un intervalo de referencia predeterminado.

15. Al menos un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o 2, para su uso en medicina.

16. El uso de al menos un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 en la preparación de un medicamento para su uso en la profilaxis y/o tratamiento del cáncer de mama.

17. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 opcionalmente junto con uno o más excipientes, coadyuvantes, portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.