JPH07173199A

JPH07173199A - アパミンレセプターの単離のための組成物、アパミン結合タンパク質及びそれらの利用

Info

Publication number: JPH07173199A
Application number: JP5205917A
Authority: JP
Inventors: Patricia Tyson Sokol; パトリシア・タイソン・ソコル; Mohammad Reza Ziai; モハマド・レザ・ジアイ; Manik Chandra; マニク・チヤンドラ
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1995-07-11
Also published as: AU674010B2; CA2101468A1; EP0588036A3; NZ248292A; EP0588036A2; AU4429593A; KR940005664A

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は細胞材料からアパミンレセプターを
単離するためのアフィニティーマトリックスとして有用
な組成物において、アパミンの遊離のカルボキシル基に
共有結合によりカップリングした遊離のアミノ基を有す
る誘導アガロースマトリックスを含むことを特徴とする
組成物に関する。本発明はさらに脊椎動物組織試料から
単離され、特異的にアパミンと結合する約８０ＫＤａの
タンパク質、及び該タンパク質の分解生成物と思われる
約５５ＫＤＡのタンパク質、ならびに該タンパク質又は
その分解生成物と思われるタンパク質に結合する抗体に
関する。本発明はさらにアパミンレセプタータンパク質
をコードする核酸配列又はその生物学的活性フラグメン
トを含む単離核酸フラグメント、及び該核酸フラグメン
トを含む宿主細胞に関する。【効果】治療的に有効であり得る化合物の同定及び分
離の手段を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】カリウム（Ｋ）チャンネルは、非常に多
様な分子及び機能を含む内在膜タンパク質であり、実際
にすべての哺乳類細胞中に存在する。これらのタンパク
質は主に静止膜電位の維持を担い、外部の減極刺激、あ
る種のリガンドの結合、又はカルシウムあるいはＡＴＰ
の細胞内濃度の変化に応答して急速に活性化される。ニ
ューロン又は心臓ミオサイトなどの興奮可能細胞の場
合、Ｋ−チャンネルが作用電位の持続時間を決定し、中
枢神経系及び心臓機能における生命機能を行う（Ｒｕｄ
ｙ，Ｂ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２５：７２９−
７４９，（１９８８）；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．
Ｖ．，於Ｃｏｏｋ，Ｎ．Ｓ．（ｅｄ．）．Ｐｏｔａ
ｓｓｉｕｍＣｈａｎｎｅｌｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，
Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｌ，
ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄＬｔｄ．，３４８−３７
２，（１９９０）にて考察）。カルシウム−活性化Ｋ−
チャンネルサブファミリーは少なくとも３つの識別で
きるイオン電流：大（ＢＫ）、中（ＩＫ）及び小（Ｓ
Ｋ）導電性チャンネルを含む（Ｃａｓｔｌｅ，Ｍ．
Ａ．，ｅｔａｌ．，ＴＩＮＳ，１２：５９−６５，
（１９８９）；Ｈａｙｌｅｔｔ，Ｂ．Ｇ．及びＤ．
Ｈ．Ｊｅｎｋｅｎｓｏｎ，於Ｃｏｏｋ，Ｎ．Ｓ．（ｅ
ｄ．）．ＰｏｔａｓｓｉｕｍＣｈａｎｎｅｌｓ：Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｏｔ
ｅｎｔｉａｌ，ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏｄＬｔ
ｄ．，７０−９５，（１９９０）；Ｌａｔｏｒｒｅ，
Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．５１：３８５−３９９，（１９８９）にて考察）。
これらのＫ−チャンネルはカルシウム〔Ｃａ²⁺〕ｉの細
胞内濃度の上昇に応答して活性化される。カルシウム
〔Ｃａ²⁺〕ｉの他に、ＢＫ及びＩＫチャンネルは膜電位
の変化にも感応性であるがＳＫ−チャンネルは有意な電
位感応性を持たない。

【０００２】機能的にＳＫ−チャンネルは、多くのニュ
ーロンの活動電位の後に続く後過分極に含まれる。これ
らは交感神経節ニューロン、海馬ニューロン、神経分泌
ニューロン及び脊椎運動ニューロン、ならびに骨格筋細
胞を含む（Ｒｕｄｙ，Ｂ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５：７２９−７４９，（１９８８）；Ｌａｔｏｒ
ｒｅ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．５１：３８５−３９９，（１９８９）；Ｐｅ
ｎｎｅｆａｔｈｅｒ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３０４０
−３０４４，（１９８５）；Ｍａｒｔｙ，Ａ．，ＴＩＮ
Ｓ１２：４２０−４２４（１９８９）；Ｌａｎｃａｓ
ｔｅｒ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１
１：２３−３０，（１９９１）；及びＳｔｒｏｎｇ，
Ｐ．Ｎ．，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．４６：１３７−
１６２（１９９０））。さらにＳＫ−チャンネルは気管
平滑筋細胞における外に向かう自然の一時的電流（Ｓａ
ｕｎｄｅｒｓ，Ｈ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５７：１１１４−１１
１９，（１９９１））、α₁−アドレノセプター、ニュ
ーロテンシンレセプター及びＡＴＰレセプターのＰ₂の
阻害作用（Ｈａｙｌｅｔｔ，Ｂ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，
於Ｃｏｏｋ，Ｎ．Ｓ．（ｅｄ．）．Ｐｏｔａｓｓｉｕ
ｍＣｈａｎｎｅｌｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃｌａｓ
ｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＴｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｌ，７０−９
５，（１９９０）及びＳｔｒｏｎｇ，Ｐ．Ｎ．，Ｐｈａ
ｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，４６：１３７−１６２，（１９
９０））において大きな役割を果すことが示唆された。

【０００３】ニューロンの、及び骨格筋のＳＫ−チャン
ネルはみつばちのへび毒−誘導ペプチド毒であるアパミ
ンにより特異的に激しく阻害される（Ｌａｔｏｒｒｅ，
Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．５１：３８５−３９９（１９８９）；Ｂｌａｔｚ，
Ａ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．８４：１−２３，（１９８４）；Ｂｌａｔｚ，Ａ．
Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２３：７１８−７
２０（１９８６）及びＢｌａｔｚ，Ａ．Ｌ．，ｅｔａ
ｌ．，ＴＩＮＳ１０：４６３−４６７（１９８
７））。すべての指示するところにより、アパミンレセ
プター複合体はＳＫ−チャンネルと同一であるか、又は
密接に関連している。アパミンは１８アミノ酸の神経毒
性ペプチドであり、ラット脳シナプトソーム及びラット
脳片中に１種類の結合部位を有し、見掛けの解離定数
（Ｋ_d）が１０−２５ｐＭである（Ｈａｂｅｒｍａｎ
ｎ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
９４：３５５−３６４（１９７９）；及びＭｏｕｒｒ
ｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．３８
２：２３９−２４９（１９８６））。アパミンは洗剤に
より可溶化された脳のレセプター部位に、温度依存性及
び高アフィニティー（Ｋ_d＝３０−１５０ｐＭ）結合す
ることもできる（Ｓｅａｇａｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：４０５１−４
０５７（１９８６）；Ｓｅａｇａｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：５６５−５７０（１９８
７）；Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｎｔｏｍａｒｃｈｉ，Ｈ．，ｅ
ｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：１
−６（１９８４）及びＷｕ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒ
ａｉｎＲｅｓ．３６０：１８３−１９４（１９８
５））。ラットの脳シナプトソーム及び脳片に関して報
告されたＢ_max値は１０−３０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク
質であるが（Ｍｏｕｒｒｅ，Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｂｒ
ａｉｎＲｅｓ．３８２：２３９−２４９（１９８
６）；Ｓｅａｇａｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：４０５１−４０５７（１９
８６）及びＷｕ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲ
ｅｓ．３６０：１８３−１９４（１９８５））、洗剤に
より可溶化されたレセプターの場合は０．４５−１７ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパク質の範囲である（Ｓｅａｇａｒ，
Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：５６
５−５７０（１９８７）；Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｎｔｏｍａ
ｒｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１４２：１−６（１９８４））。

【０００４】アパミンレセプターのポリペプチド成分は
数グループにより研究された。〔¹²⁵Ｉ〕アパミンを用
いた架橋及びその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにオートラ
ジオグラフィーを行う研究は、ラットの脳シナプトソー
ム膜のアパミン結合タンパク質が２つのタンパク質種、
８０−８６ＫＤａの大タンパク質及び報告されたほとん
どの試料において５０−５９ＫＤａの小バンドを含むこ
とを示した（Ｓｅａｇａｒ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：４０５１−４０５７
（１９８６）；Ｓｅａｇａｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３８９５−３
８９８（１９８５）；及びＬｅｖｅｑｕｅ，Ｃ．，ｅｔ
ａｌ．，ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ２７５：１８５
−１８９（１９９０））。抗−アパミン抗−血清を用い
た２つのタンパク質バンドの部分的ペプチドマッピング
は、小さいほうのポリペプチドが大きい方のたんぱく質
のタンパク質分解フラグメントであり、脳におけるアパ
ミン結合タンパク質の別のサブユニットではないらしい
ことを示した。さらに培養ニューロン又は星状膠細胞の
細胞膜に〔¹²⁵Ｉ〕アパミンと架橋する能力を有する成
分がさらにある。ラットの心臓、肝臓及び平滑筋からの
膜への〔¹²⁵Ｉ〕アパミンの架橋も、８５−８７ＫＤａ
ポリペプチドがアパミン結合複合体の主要標識成分であ
ることを示した（Ｍａｒｑｕｅｚｅ，Ｂ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ１６９：２９５−２９８（１９
８７））。第２の５９ＫＤａタンパク質は肝臓膜のみで
同定された（Ｍａｒｑｕｅｚｅ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍ１６９：２９５−２９８（１９８
７））。

【０００５】小導電性カルシウム活性化カリウムチャン
ネル（ｓＫｃａ）の阻害は、活動電位を延長させ、一方
細胞内カルシウム濃度の増加によるその活性化は過分極
の速度を加速し、かくして活動電位の持続時間を短縮す
る。血管平滑筋細胞（静脈及び動脈などの）において、
ｓＫｃａの活性化は平滑筋膜の過分極を起こし、それが
今度は電圧ゲートカルシウムチャンネルの阻害を起こ
す。後者の阻害は血管を弛緩させ、血圧を下げる。心臓
の場合、ｓＫｃａの調節は不整脈の調整の非常に有用な
手段となることができる。神経系において、アルツハイ
マー患者の海馬はアパミン濃度の非常な減少を示す（Ｖ
ａｉｔｕｋａｔｉｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ７３：４６−５
２（１９８１））。さらにニューロン中のアパミンレセ
プターは学習及び記憶の過程に含まれることが報告され
た（Ｍｅｓｓｉｅｒ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．５５１：３２２−３２６（１９９１））。従
ってこのレセプターを操作すると認識を向上させること
もできる。ｓＫｃａの操作が重要な治療的可能性を有す
るにもかかわらず、このチャンネルに含まれるタンパク
質の同定に関して知られていることは比較的少ない。こ
こで本発明はカリウムチャンネル機能の研究における重
要な要素を提供する。

【０００６】

【発明の概略】本発明はアパミンの遊離のカルボキシル
基に共有結合によりカップリングした遊離のアミノ基を
有する誘導アガロースマトリックスを含む組成物に関す
る。このマトリックスは洗剤により可溶化した細胞又は
細胞膜からアパミンレセプターを単離するのに有用であ
る。本発明は誘導マトリックスをアパミンと、縮合反応
条件下のカーボジイミドの存在下で、及び好ましくはＮ
−ヒドロキシスルホコハク酸イミドの存在下で接触させ
ることを含む、アフィニティーマトリックスの製造法に
も関する。本発明は細胞材料からのアパミンレセプター
の単離法；アパミンに特異的に結合する精製及び単離タ
ンパク質；アパミンレセプターをコードする配列を含む
核酸フラグメント；ならびに組み替えにより製造された
アパミンレセプター自身にも関する。精製及び単離タン
パク質はＳＫ−チャンネルと関連するアパミンレセプタ
ーに相当すると思われる。そのようなレセプターは、
脳、骨格、心臓、血管平滑筋、膵臓、腎臓及び肝臓組織
などの多様な動物組織中のカルシウム活性化カリウムチ
ャンネルと関連する。さらに本発明はアパミンレセプタ
ー遺伝子及びタンパク質の発現に有用な宿主細胞ならび
に組み替えベクターに関する。

【０００７】本発明のレセプターの単離法の場合、細胞
材料は洗剤により可溶化され；洗剤により可溶化された
材料を本発明のアフィニティーマトリックスと最高約４
℃の温度で、レセプターがアパミンに結合するのに十分
な時間接触させ；温度を少なくとも約４２℃に上げるこ
とによりレセプターをマトリックスから溶離させる。本
発明のタンパク質は約８０ＫＤａであり、約５５ＫＤａ
の分解生成物と思われるものも与える。単離タンパク質
又はその免疫原性あるいは生物学的活性部分を用いてポ
リクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を生成する
ことができ、それは今度はカリウムチャンネル、特に小
導電性カルシウム活性化カリウムチャンネルの構造及び
機能の研究に有用である。“生物学的活性”は、レセプ
ターと結合できる抗体の製造を誘引することができるタ
ンパク質又はフラグメント、及びカルシウム活性化カリ
ウムチャンネル（ＢＫ又はＩＫなど）と関連するが必ず
しもアパミンと結合しないタンパク質又はフラグメント
を意味する。本発明の他の具体化において、今やタンパ
ク質の配列が得られ、例としてＫｃａｌ１．８、ブタ
レセプターの配列を図８−１０に示す（配列ＩＤＮ
ｏ．：２）。本発明は、中から高緊縮条件下（下記の実
施例にて定義する通り）で配列ＩＤＮｏ．：２のアミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とハイブリッド
形成するいずれのヌクレオチド配列も含む。本発明の宿
主細胞はレセプターの活性を調節でき、従ってカリウム
チャンネルの活性を調節できる化合物の同定のために設
計されるスクリーンの開発の簡便な基礎となる。心臓の
場合、このチャンネルの調節は不整脈の調整の手段とな
り、従ってこのカリウムチャンネルを開く、又は閉じる
ことができるいずれの薬剤も有力な抗−不整脈剤と考え
られる。同様に静脈及び動脈のそれのような血管平滑筋
細胞の場合、カリウムチャンネルの活性化は平滑筋膜の
過分極を起こし、それが今度は電圧ゲートカルシウムチ
ャンネルの阻害を起こす。後者の阻害は血管を弛緩さ
せ、血圧を低下させる。レセプターは認識機能にも関連
している。レセプター濃度はアルツハイマー患者におい
て減少しており、それは学習及び記憶の過程に含まれ
る。従ってレセプターを活性化する化合物は、アルツハ
イマー患者の損なわれた認識機能の増進、又は記憶及び
学習容量の増強に有用であることができる。従ってカリ
ウムチャンネル活性を調節する化合物を検出できる簡単
な系は、非常に大きな治療的用途を持った薬剤の同定の
可能性を有する。又、検出できる標識を有する単離核酸
配列をアルツハイマー病の診断プローブとして用い、冒
されていると思われる患者の末梢神経におけるそのよう
なレセプターの発現度を決定することができる。〔発明の詳細な説明〕

【０００８】本発明はアパミンレセプター単離のための
アフィニティーマトリックス；アパミンと特異的に結合
するタンパク質及び分解生成物と思われるもの；タンパ
ク質又は分解生成物と思われるものと結合する抗体；タ
ンパク質をコードする核酸フラグメント；及び該核酸フ
ラグメントを含む宿主細胞及びその子孫又は誘導体に関
する。これらの具体化のそれぞれを順に下記にて議論す
る。

【０００９】細胞材料からのアパミン結合タンパク質又
はレセプターの有効な単離は、この目的に特異的に適合
させたアフィニティーマトリックスの設計を必要とす
る。この目的に必要なマトリックスは固相と洗剤により
可溶化した結合タンパク質をしっかり結合させ、リガン
ドとレセプターの解離速度を最小にしなければならな
い。

【００１０】遊離のアミノ基を有するクロマトグラフィ
ーマトリックスは、例えばガラス又はポリアクリルアミ
ドビーズを含むいずれの固体担体から成ることもできる
が、好ましい担体は誘導アガロースマトリックスであ
る。好ましい具体化においてアガロースは遊離のアミノ
基を有するスペーサーアームを持つ。この目的に有用な
材料の例はＥＡＨ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、遊離のアミノ基を有する炭素数が１２のスペーサ
ーアームを持つアガロースである。スペーサーアームは
もっと長いことももっと短いこともできるが立体障害を
起こす可能性がある程短くてはならない。アパミンの遊
離のカルボキシル基はカーボジイミド縮合により誘導ア
ガロースマトリックスの末端第３アミノ基とカップリン
グする。好ましい具体化の場合Ｎ−ヒドロキシスルホコ
ハク酸イミド（スルホ−ＮＨＳ）を縮合反応に加え、反
応中間体を安定化することによりリガンドのカップリン
グを増す（Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ａ
ｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：２２０−２２２
（１９８６））。カップリングは４^oの温度で行うのが
好ましいが、最高で室温か又はそれ以上で行うこともで
き、それに対応して収率が下がる。

【００１１】レセプターをアフィニティーマトリックス
への結合により“利用できる”ようにするために、レセ
プターを含む細胞又は細胞膜を洗剤中で可溶化する。ど
の洗剤がアパミン結合タンパク質をこのアフィニティー
マトリックスに結合させるかを決定するために、多くの
イオン性及び非−イオン性洗剤を調べる。１％ｗ／ｖの
ＣＨＡＰＳ又はＬｕｂｒｏｌ−ＰＸを用いて細胞膜を可
溶化した場合に最高の結合度が観察される。Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０又はＳＤＳ
の１％ｖ／ｖ組成物は固相アパミンをその結合タンパク
質に有効に結合させない。ＣＨＡＰＳの透析可能性を考
慮し、それが可溶化洗剤として好ましい。

【００１２】レセプター−リガンド解離の速度を減少さ
せるために、洗剤で可溶化した膜のアパミンアフィニテ
ィーマトリックスとのインキュベーション、ならびにそ
の後のすべての洗浄段階を４℃で行う。アパミンのその
レセプターへの結合はこの温度で安定であることが示さ
れた（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：３５５−３６４（１９
７９））。４−１６時間のインキュベーションの後に満
足できる結合が起こる。

【００１３】他方、アフィニティーマトリックスからの
アパミン結合材料の溶離は４２℃−５５℃で行うが、５
５℃もの高温ではレセプターが分解し得る。アパミンと
そのレセプター部位との会合は温度依存性であることが
報告された（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：３５５−３６４
（１９７９））。図１に示す通り、ビーズを溶離緩衝液
と共に３７℃で１５分間インキュベートしてもタンパク
質は溶離しない（１列）。しかし温度を４２℃に１５分
間急速に変えると８０ＫＤａタンパク質、ｐ８０が溶離
する（２列）。５５℃でさらにアフィニティーマトリッ
クスをインキュベートしても他のタンパク質の検出可能
な溶離はない（３列）。この方法を用いた単離タンパク
質（ｐ８０）の収量は、３００ｇの凍結ウシ脳をプロセ
シングした場合に約２０μｇである。

【００１４】ｐ８０とアパミンの相互作用の特異性を、
架橋実験により調べる。この目的で、単離ｐ８０をアフ
ィニティーマトリックスから溶離した直後に〔¹²⁵Ｉ〕
アパミンと、非標識アパミンを含んで、又は含まずにイ
ンキュベートする。単離ｐ８０のアパミン結合能力はア
フィニティーマトリックスから溶離した後２時間以内で
失われるので、これは必須の予備注意である。洗剤で可
溶化したアパミン結合部位の不安定性に関するこの観察
は、Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｎｔｏｍａｒｃｈｉｅｔａ
ｌ．，（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：１−６
（１９８４））により報告された発見と完全に一致す
る。その後〔¹²⁵Ｉ〕アパミン−ｐ８０複合体をＳｅｐ
ｈａｄｅｘＧ−５０カラムを通したゲル濾過により非
結合〔¹²⁵Ｉ〕アパミンから分離し、結合複合体を二官
能基性架橋剤ＤＭＳで処理する。図２（１列）に示す架
橋された材料、〔¹²⁵〕Ｉアパミンはｐ８０に独特の架
橋をするが、過剰の及び非架橋〔¹²⁵Ｉ〕アパミンは染
色前面（ｄｙｅｆｒｏｎｔ）に現れる。過剰の非標識
アパミンが含まれると〔¹²⁵Ｉ〕アパミンのｐ８０への
架橋が完全に阻害されるので、相互作用は特異的である
と思われる（図２、２列）。ＤＭＳの他に４種類の化学
的に異なる他の二官能基性架橋剤を用いて同一の実験を
繰り返す。いずれの場合もオートラジオグラム上の架橋
タンパク質のバンドはクーマシー染色ゲルにおけるｐ８
０のバンドと重なる。

【００１５】実質的に同一の結果を与える前記の方法の
小さい変更は、当該技術における熟練者に明らかであろ
う。本発明のこの具体化は実施例１−４でさらに記載す
る。以下の議論はウシ脳から単離されたアパミン−結合
タンパク質に関する。類似のタンパク質が他の脊椎動
物、特にヒトを含む他の哺乳類に存在することはわかる
であろう。さらにそのようなタンパク質は下記に示す通
り脳、心臓、腎臓、ニューロン、黒色腫及び神経芽細胞
腫などの他の組織にも存在する。別の種及び／又は組織
からの他の結合タンパク質サブタイプの単離は、記載の
方法により容易に行うことができる。従って本発明は供
給源にかかわらずアパミン結合特異性を有するいずれの
タンパク質も含む。

【００１６】特定の具体化において８０キロダルトン
（ＫＤａ）のアパミン結合タンパク質をウシ脳組織から
アフィニティー精製により単離する。脳組織からの膜粗
留分を洗剤中で可溶化し、アパミンセファロースビーズ
と接触させ、アパミン−結合タンパク質を単離する。ア
フィニティーマトリックスは上記に記載する。溶離物の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離は、後文でｐ８０と呼ぶ８０ＫＤ
ａのタンパク質の存在を示す（図１、２列）。

【００１７】ｐ８０とアパミンの相互作用の特異性を架
橋実験により調べる。単離ｐ８０を過剰の非標識アパミ
ンの存在下及び不在下の両方で放射標識アパミンと共に
インキュベートする。標識アパミン−ｐ８０複合体を非
結合アパミンから分離し、二官能基性架橋剤であるジメ
チルスベリン酸イミデート（ＤＭＳ）で処理する。架橋
された材料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフ
ィーで分析すると、アパミンとｐ８０の間の独特の結合
を示す（図２。２列）。他の化学的に異なる二官能基性
架橋剤を用いた同一の実験を数回繰り返し、類似のバン
ドが形成される。

【００１８】かくして精製されたタンパク質を用い、以
下の実施例に記載する通りポリクローナル及びモノクロ
ーナル血清の両方を製造する。ポリクローナル抗血清
は、ラット脳シナプトソーム試料のウェスタンブロッテ
ィングに用いる。結果は、抗血清が大きな８０ＫＤａタ
ンパク質（ｐ８０）及び小さい５５ＫＤａタンパク質
（ｐ５５）の２試料に結合することを示す。タンパク質
は免疫前血清を用いて検出されない（図３）。

【００１９】８０ＫＤａ及び５５ＫＤａタンパク質との
相互作用が、血清が単一特異性でないことを示すのかど
うかを決定するために、モノクローナル抗体を製造し、
多くのラット組織におけるｐ８０／ｐ５５プロファイル
の分析に用いる。２種類の異なるモノクローナル抗体を
用いた場合の結果は、ウシ脳、ラット脳、ラット心臓、
ラット腎臓及びラット肝臓にｐ８０及びｐ５５の両方が
存在し、ラット腎臓及び肝臓ではｐ５５のバンドが２重
線であることを示す（図３Ｂ）。これはｐ８０とｐ５５
の間の免疫学的関連性を示す。

【００２０】比較的小さいアパミン結合タンパク質ｐ５
５及びｐ８０の部分的ペプチドマッピングと共に脱グリ
コシル化実験は、ｐ５５が脱グリコシル化ではなくタン
パク質分解によりｐ８８から誘導されるらしいことを示
した（Ｌａｖｅｑｕｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔｅｒｓ２７５：１８５−１８９（１９９
０））。ｐ５５が単離されたばかりの培養細胞の膜に存
在するかどうかを決定するためにさらに試験を行う。こ
の目的で、ヒト黒色腫Ａ３７５及びヒト髄芽細胞腫ＴＥ
６７１細胞からの原形質膜を多くのプロテアーゼ阻害剤
の存在下で調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、モノ
クローナル抗体Ｄ１５７を用いてイムノブロッティング
により分析する。図３（Ｃ）に示す通り、抗体は黒色腫
細胞（１列）及びＴＥ６７１細胞（列２）中に大きい８
０ＫＤａバンドのみを検出する。ｐ８０よりわずかに大
きい第２バンドも黒色腫細胞（１列）中に観察される。
この実験において、有意な量のｐ５５は検出できない。
この観察は、ｐ５５が生体内で生成されたｐ８０のタン
パク質分解フラグメントであるか、又は培養細胞中のア
パミン結合タンパク質複合体がラット及びウシの組織で
見いだされたものと異なるかのいずれかを示唆してい
る。後者の可能性は数グループにより示唆された（Ｓｅ
ａｇａｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ２５：４０５１−４０５７（１９８６）；及
びＳｅａｇａｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．７：５６５−５７０（１９８７））。しか
しこの仮定の直接の証拠はまだ示されておらず、アパミ
ンレセプター複合体の他のサブユニットの存在の可能性
は残されている。これらの結果は〔¹²⁵Ｉ〕アパミンの
その結合タンパク質への架橋により得られた結果と１つ
の大きな点に関して異なる。架橋実験の結果は、ｐ８０
及びｐ５５の両方が共有結合二官能基性架橋剤が有効で
あるために適したアフィニティーで〔¹²⁵Ｉ〕アパミン
と結合することを示している（Ｓｅａｇａｒ，Ｍ．
Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：
４０５１−４０５７（１９８６）；Ｗｕ，Ｋ．ｅｔａ
ｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．３６０：１８３−１９４（１
９８５）；及びＬｅｖｅｑｕｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，
ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２７５：１８５−１８９
（１９９０））。アパミンセファロース４Ｂカラムを用
いたアフィニティークロマトグラフィーは、ｐ８０のみ
が固相アパミンに結合し、検出可能な量のｐ５５は溶離
物中に見いだされないことを示す（図１、２列）。これ
はｐ５５がｐ８０より成熟度が低く、タンパク質分解及
び／又は翻訳後プロセシングにより生成され、そのアパ
ミン結合に対するアフィニティーがｐ８０よりずっと低
いという仮定と一致する。

【００２１】ラット組織片におけるｐ８０及びｐ５０の
位置決定のためにイムノペルオキシダーゼの方法を用い
る。この目的で、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組
織片を、モノクローナル抗体Ｄ１５７を１：１０の希釈
で含む腹水液と共にインキュベートする。このモノクロ
ーナル抗体は、細胞表面レセプターに対して誘起された
他の多くのマウスモノクローナル抗体と共通してホルマ
リン固定組織に対して非反応性であるか又は反応性が弱
い（例えばＣｏｒｎｅｔ，Ｗ．Ｃ．，ｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８４：３２１−
３２６（１９８５）を参照）。従ってこの研究の場合、
一貫した染色パターンのためにより濃縮された抗体の組
成物を用いることが必要である。図４に示す通り（Ａ及
びＢ）ラットの腎臓の場合、抗体染色は主にボーマン嚢
の緻密斑及びビセラル層（ｖｉｓｃｅｒａｌｌａｙｅ
ｒ）（図４Ａ）ならびにある種の回旋遠位尿細管の発光
表面（ｌｕｍｉｎａｒｓｕｒｆａｃｅ）（図４Ｂ）に
観察される。これらの構造の染色は標準片では観察され
ない（図４Ｃ）。現在、腎臓におけるｐ８０の位置が制
限されていることの意義は明確ではない。ある種の遠位
尿細管における抗−ｐ８０免疫反応性の出現がこれらの
遠位尿細管の発生及び／又は機能的段階を反映している
かもしれない。多くの報告によりウサギの腎刷子縁膜
（Ｚｗｅｉｆａｃｈ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ａｍｅｒ．
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｆ１８７−Ｆ１９６（１
９９１））、培養導管収集上皮（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ
ｄｕｃｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）の頂端膜（ａｐｉｃ
ａｌｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｆ．
Ｈ．ｅｔａｌ．，ＲｅｎａｌＰｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１３：７０−８１（１９９０））、培養髄厚上行
性肢細胞（ｍｅｄｕｌｌａｒｙｔｈｉｃｋａｓｃｅ
ｎｄｉｎｇｌｉｍｂｃｅｌｌ）（Ｃｏｒｎｅｊｏ，
Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１１
０：４９−５６（１９８９））及びヘンレループの厚上
行性肢中の管細胞の発光膜（（Ｋｌａｅｒｋｅ，Ｄ．
Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．９
５：１０５−１１２（１９８７））中にカルシウム−活
性化カリウム−チャンネルが同定されている。後者の位
置の場合、Ｋ−チャンネルはルーメンポジティブ経上皮
電位の保持に必要であり、ＮａＣｌの再吸収の調節（Ｋ
ｌａｅｒｋｅ，Ｄ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂ
ｒ．Ｂｉｏｌ．９５：１０５−１１２（１９８７））、
Ｋ⁺分泌、及び細胞体積の調節（Ｌｕ，Ｌ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６１９０−
１６１９４（１９９０）及びＷａｎｇ，Ｗ．，ｅｔａ
ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４：８１
−９６（１９９２））のために重要であり得る。しかし
研究されたほとんどの場合、腎臓機能に含まれるＣａ−
活性化Ｋ−チャンネルの多くはＢＫ型である（Ｗａｎ
ｇ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．５４：８１−９６（１９９２））。

【００２２】ラットの脳の場合、モノクローナル抗体Ｄ
１５７は脈絡叢（図５Ｄ）、及び海馬ニューロンならび
に裸神経繊維との反応性を示す。これらの構造は標準脳
片では染色されない（図５Ｅ）。〔¹²⁵Ｉ〕アパミンを
用いてＭｏｕｒｒｅｅｔａｌ．，（ＢｒａｉｎＲｅ
ｓ．３８２：２３９−２４９（１９８６））はラットの
脳の種々の領域におけるアパミン結合部位の分布を研究
した。海馬ニューロン、手綱及び臭球に高濃度の結合部
位が観察された。〔¹²⁵Ｉ〕を用いた他の結合研究（Ｈ
ａｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．９４：３５５−３６４（１９７９））
は、結合部位が主にラットの前脳、脳幹及び小脳に豊富
であることを示した。

【００２３】本文に記載する結果は、８０ＫＤａタンパ
ク質がカルシウム−活性化Ｋ⁺チャンネルと関連するア
パミンレセプターであるとする説明と一致する。下記の
通りさらに、推定アミノ酸配列の分析は４個の推定疎水
性トランスメンブランドメイン及び推定カルシウム結合
ドメインを含む構造を確証する。後者はドロソフィラ
（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のカルシウム活性化Ｋ⁺チャ
ンネルの成分と有意な相同を示す（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，
Ｎ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：５５
１−５５５（１９９１））。

【００２４】当該技術における熟練者は、例としたアパ
ミン結合タンパク質は脳から誘導するが、本発明がこの
供給源から誘導されたタンパク質に制限されないことを
認識するであう。本文に示す免疫化学的データが示す通
り、相同タンパク質が他の組織及び他の種に存在し、本
文に記載の方法により単離される。従って本発明は他の
組織で製造されるアパミン結合タンパク質、特に心臓、
血管平滑筋、ニューロン、腎臓、膵臓、ヒト黒色腫及び
神経芽細胞腫で発現されるアパミン結合タンパク質を含
む。

【００２５】上記の通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約９０−
９５％の純度である単離タンパク質は、モノクローナル
及びポリクローナル抗体の製造に有用であり、それらは
今度はアパミン結合タンパク質ｃＤＮＡ相同染色体の製
造に関するＤＮＡのスクリーニングに有用である。アパ
ミンレセプターは黒色腫及び神経芽細胞腫でも発現され
るので、モノクローナル抗体は適した造影剤と複合させ
ると腫瘍の造影に、又は適した細胞傷害剤と複合させる
と腫瘍の治療に有用である。又、モノクローナル抗体は
他の組織からのアパミンレセプターのアフィニティー精
製に有用である。例えば下記の実施例に記載する通りア
パミンと同様の方法で抗体をＥＡＨ−セファロース上に
固定し、実質的に同様の方法でアフィニティークロマト
グラフィーに利用することができる。代わりに抗体をシ
アノゲンブロミド活性化セファロースであるＡｆｆｉｇ
ｅｌ^R、又は他の適したアフィニティーマトリックスに
固定することができる。そのようなマトリックスは当該
技術における熟練者に周知である。

【００２６】単離されたレセプタータンパク質は、アパ
ミンの類似体として作用することができ、すなわちアパ
ミンレセプターの活性を調節することができる化合物の
同定にための分析にも有用である。例えばレセプタータ
ンパク質をアパミン結合活性と抵触しないいずれの手段
によっても固定することができる。その後固定されたレ
セプターを特定の化合物又は混合物と接触させ、レセプ
ターへの結合に関して放射標識アパミンと競争する能力
を評価する。又、ｐ８０あるいは他の単離アパミン結合
タンパク質は、神経変性の診断のために患者の血清中の
アパミンレセプターの量を測定する免疫検定の開発に有
用である。この方法の変法は当該技術における熟練者に
明らかであろう。本発明の上記の具体化は、実施例１−
６でさらに記載する。

【００２７】カルシウム活性化Ｋ⁺チャンネルと関連す
ると予想される全長アパミン結合タンパク質核酸配列
は、λ−ＺＡＰベクター中のブタ血管平滑筋（大動脈）
発現ｃＤＮＡライブラリから最初に単離される。このラ
イブラリをウシ脳アパミンレセプターに対して誘起され
たポリクローナル血清を用いてスクリーニングする。約
２００万プラーク形成単位をスクリーニングして４個の
陽性プラークを得、それを再スクリーニングしてプラー
ク精製する。

【００２８】λＺＡＰを標準的方法により“ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ”プラスミド中に形質転換する；その後Ｄ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ
を用いて消化し、ｃＤＮＡ挿入断片を放出させ、アガロ
ースゲル電気泳動により分析する。１個の１．６Ｋｂ
ｃＤＮＡクローン（Ｋｃａｌ１．６と称する）をノザ
ンハイブリッド形成、ゲノムサザンブロッティング及び
ＤＮＡ配列決定のために選ぶ。図６Ａに示す通りｃＤＮ
ＡＫｃａｌ１．６は成体ラット脳ｍＲＮＡ（１
列）、ウシ脳ｍＲＮＡ（２列）及びブタ脳ｍＲＮＡ（３
列）中に約２．１Ｋｂの単一バンドを検出する。しかし
プローブは新生ラット脳からのｍＲＮＡのノザンブロッ
トにおいて２．１及び３．０Ｋｂの大きさの２つのｍＲ
ＮＡバンドを明らかにする（図６Ｂ）。これらの結果
は、新生ラット脳の場合Ｋｃａｌ１．６とハイブリッ
ド形成する２つの異なるｍＲＮＡ種があり、おそらくｍ
ＲＮＡの交互（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）のスプライシング
により生じたということを示唆している。

【００２９】次にＥｃｏＲＩ切断−ゲノムサザンブロッ
トをＫｃａｌ１．６ｃＤＮＡを用いて精査する。図
７に示す通り、高緊縮度でブロットの洗浄を繰り返した
後、Ｋｃａｌ１．６プローブはヒト（１列）及びサル
（２列）において単一の１４Ｋｂバンドを検出する。し
かしラット（３列）、マウス（４列）、イヌ（５列）、
牛（６列）、ウサギ（７列）及びニワトリ（８列）では
ハイブリッド形成のパターンが種々である。酵母（９
列）の場合はハイブリッド形成が検出されない。この実
験は種々の種においてｐ８０をコードする遺伝子の間に
有意な配列の相同性があることを示す。さらにヒト及び
サルにおけるｐ８０をコードする遺伝子はおそらく他の
種の場合より類似している。

【００３０】その後Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮＡをクエ
ンチする。得られたヌクレオチド配列は、クローンが全
長ではなく、開始メチオニン残基が欠けていることを示
している。全−長クローンを得るために、Ｋｃａｌ
１．６をプローブとして用い、もとのブタ大動脈ｃＤＮ
Ａをスクリーニングし、陽性のクローンを関連性及び挿
入断片の大きさに関して制限マッピングならびに電気泳
動により分析する。Ｋｃａｌ１．６よりわずかに長い
と思われる１つのｃＤＮＡクローン（Ｋｃａｌ１．８と
称する）を選び、Ｔａｇポリメラーゼ配列決定法により
配列決定する。ヌクレオチド配列（配列ＩＤＮｏ．：
１）を枠内で翻訳すると、ｃＤＮＡＫｃａｌ１．８
は開始メチオニン及び停止部位を用いて４３７アミノ酸
（図８−１０）のタンパク質（配列ＩＤＮｏ．２）を
コードする。配列の疎水性分析（図１１）は、４つの強
い疎水性推定トランスメンブランドメイン（ＴＭＤＩ−
４）、短いアミノ末端及び長いカルボキシル末端の存在
を示す。配列はいくつかの興味深い特徴を有する。それ
は星印で示す強い“ＥＦ−Ｈｎａｄ”共通配列（図８−
１０において）を含む。ＥＦ−Ｈａｎｄ共通配列は、カ
ルモジュリン及びトロポニンＣファミリーの実際にすべ
てのカルシウム結合タンパク質メンバーに存在する。事
実、Ｋｃａｌ１．８のＥＦ−Ｈａｎｄのモチーフはカ
ルモジュリンならびに以前にクローニングされたドロソ
フィラのカルシウム活性化Ｋ−チャンネルの成分、“Ｓ
ｌｏ”のそれとほとんど完全に一致する（Ｏｈａｎｄｒ
ａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｖｏｌ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．１９：１６４−１６７（１９９１））。さらにＫｃ
ａｌ１．８の推定“ＥＦ−Ｈａｎｄ”モチーフにフラ
ンキングする配列は、トロポニンＣ、ミオシン、カルレ
チクリン、ＰＥＰ−１９、及び他のいくつかを含む多く
の既知のカルシウム結合タンパク質と有意な相同性を有
する。小導電性カルシウム−活性化カリウムチャンネル
（ｓＫｃａ）はカルシウム結合部位をもっていなければ
ならないので、それはさらにＫｃａｌ１．８が実際に
ｓＫｃａをコードするという信念を支持する。“ＥＦ−
Ｈａｎｄ”モチーフが実際にＫｃａｌ１．８タンパク
質のカルシウム結合部位ならば、膜の細胞質側に“ＥＦ
−Ｈａｎｄ”モチーフを置く。Ｋｃａｌ１．８のアミ
ノ酸配列はさらにタンパク質キナーゼＣ部位及び１個
のチロシンキナーゼリン酸化部位（示していない）も含
む。さらにタンパク質のＣ−末端部分に“ロイシンジ
ッパー”モチーフを同定することができる（図８−１
０、四角で囲んだ“Ｌ”）。現在Ｋｃａｌ１．８のこ
のモチーフの意義は、あるとしても明確でない。しかし
これらの推定リン酸化部位の存在は“ＥＦ−Ｈａｎｄ”
モチーフと共に、タンパク質のＮ−及びＣ−末端の両方
を原形質膜の細胞質側に置くと思われる。

【００３１】Ｋｃａｌ１．８のアパミンレセプターと
しての同定をさらに確認するために、ＫｃａｌｃＤＮ
Ａを安定な哺乳類発現ベクターであるｐＲＣ／ＣＭＶに
導入し、それを用いてＣＶ−Ｉ細胞（アフリカ緑猿腎臓
（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄ
ｎｅｙ））をトランスフェクションする。Ｋｃａｌ１．
８遺伝子生成物を安定して発現する細胞を選び、非標識
アパミンの存在下又は非存在下で放射標識アパミンと接
触させる。多くのトランスフェション生成物が放射標識
アパミンの結合の増強を示し、それによりＫｃａｌの同
定をさらに確証する。

【００３２】前記の議論及び図８−１０（配列番号１及
び２）に示す配列は、ブタ平滑筋アパミンレセプターに
関するものである。しかし本発明は例としての特定の配
列以外も含むことを理解されるであろう。得られるタン
パク質分子にサイレント変化を起こす配列における欠
失、挿入又は置換などの配列の変更も含まれる。例えば
遺伝コードの縮重を反映する、又はある部位に化学的に
同等のアミノ酸を与える遺伝配列における変更が含ま
れ；従って疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対
するコドンはグリシンなどの疎水性の弱い他の残基、あ
るいはバリン、ロイシン又はイソロイシンなどのもっと
疎水性の強い残基をコードするコドンにより置換するこ
とができる。同様に１個の負に帯電した残基の他への置
換、例えばアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、あ
るいは１個の正に帯電した残基の他への置換、例えばリ
シンのアルギニンへの置換を起こす変更も生物学的に同
等の生成物を与えると思われる。タンパク質分子のＮ−
末端及びＣ−末端部分の変更を起こすヌクレオチド変化
もタンパク質の活性を変化させるとは思われない。シス
テインが存在するとタンパク質が組み替えにより製造さ
れる場合に望ましくない多量体が形成され、それにより
精製及び結晶化法が複雑になるので、配列中に存在する
１個又はそれ以上のシステインを除去するのが望まし
い。ある場合には、タンパク質の生物学的活性への変更
の効果を研究するために配列の突然変異体を作るのが実
際に望ましい。コードされた生成物の生物学的活性の保
持の決定と同様に、提案された修正はそれぞれ当該技術
における日常的熟練の範囲内である。本発明は他の種及
び他の組織から得た相同配列も含む。すでに上記で示し
た通り、図８−１０に描いた核酸配列（配列番号１）は
比較的緊縮条件下で、ヒトを含む他の多くの種に存在す
る核酸フラグメントとハイブリッド形成し、従って他の
非−ブタ配列を単離する能力を示す。さらに血管平滑筋
以外の種類の組織からのアパミンレセプターも存在する
ことが知られている。血管平滑筋の他に脳、骨格筋及び
肝臓が単一の種類の結合部位を発現することが繰り返し
示された（Ｈａｙｌｅｔｔ，Ｂ．Ｇ．，ｅｔａｌ．，
ＰｏｔａｓｓｉｕｍＣｈａｎｎｅｌｓ；Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｏｔｅｎｔ
ｉａｌ，７０−９５（１９９０）；Ｈａｂｅｒｍａｎ
ｎ．Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，
９４：３５５−３６４（１９７９）；Ｍｏｕｒｒｅ，
Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．３８２：２
３９−２４９（１９８６）；Ｓｅａｇａｒ，Ｊ．Ｊ．，
ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：４０
５１−４０５７（１９８６）；Ｓｅａｇａｒ，Ｍ．
Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：５６
５−５７０（１９８７）；Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｎｔｏｍａ
ｒｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１４２：１−６（１９８４）；及びＷｕ，Ｋ．，
ｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．３６０：１８３−
１９４（１９８５））。他方、大動脈組織は標的部位の
異種集団を示していると思われる。従って図８−１０
（配列番号１）に開示されている配列は他の種及び組織
からの対応するレセプターを単離するためのプローブと
して用いることができる。別の種類のレセプターは以下
のようにして単離する。問題の特定の種類の組織からの
ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリを放射標識Ｋ
ｃａｌ１．８ｃＤＮＡを用いて調べ、中程度の緊縮
下で洗浄する（例えば１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５
５℃）。陽性と思われるプラークを再度スクリーニング
して信頼性を確認する。その後陽性のプラークを当該技
術における既知の方法に従ってプラスミドの保護（ｒｅ
ｓｃｕｅ）に用いる。保護されたプラスミドを精製し、
適した制限酵素を用いて切断し、エチジウムブロミドで
染色したアガロースゲル中で分析する。第２のゲルをニ
トロセルロースフィルターに移し、標識されたＫｃａｌ
１．８を用いて調べ、中及びその後高緊縮（０．１ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）洗浄下で続けて洗浄
し、Ｘ−線フィルムに露光する。高緊縮条件下でＫｃａ
ｌ１．８に強くハイブリッド形成する挿入断片は、レ
セプターｃＤＮＡ候補であるらしいことを示す。これら
の推定レセプターの同定を以下の実施例に記載する案に
従って、又は当該技術において既知の日常的方法に従っ
てさらに確認することができる。従って本発明は図８−
１０に描いたヌクレオチド及びアミノ酸配列（配列ＩＤ
Ｎｏ．：１及びＮｏ．：２）のみでなく、中又は高緊
縮条件下で図８−１０のアミノ酸配列（配列ＩＤＮ
ｏ．：２）をコードするヌクレオチド配列（配列ＩＤ
Ｎｏ．：１）とハイブリッド形成するヌクレオチド配
列、ならびにそれによりコードされる生物学的活性タン
パク質又はフラグメントも含む。核酸配列を用い、選ば
れた細胞系に関して原核及び真核の両方の多様な宿主細
胞中でレセプタータンパク質を発現することができる。
適した真核細胞の例には、哺乳類細胞、植物細胞、酵母
細胞及び昆虫細胞が含まれる。適した原核宿主には大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）及び枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。

【００３３】適した発現ベクターは宿主細胞の選択に基
づいて選ばれる。細菌細胞の形質転換で用いるのに適し
た多くのベクターが周知である。例えばプラスミド及び
バクテリオファージ、例えばλファージが細菌、特に大
腸菌の宿主の場合に最も普通に用いられるベクターであ
る。哺乳類及び昆虫細胞の両方の場合、外因性ＤＮＡを
発現させるためにウィルスベクターが多く用いられる。
特に哺乳類細胞は通常ＳＶ４０、ポリオーマウィルスを
用いて形質転換されるか、又はｐＲＣ／ＣＭＶなどのプ
ラスミドを用いてトランスフェクションされ、培養昆虫
細胞はバクロウィルス発現ベクターを用いて形質転換す
ることができる。酵母ベクター系には酵母セントロメア
プラスミド、酵母エピソームプラスミド及び酵母組み込
みプラスミドが含まれる。本発明はクレイムされている
核酸フラグメントにより形質転換又はトランスフェクシ
ョンされたすべての宿主細胞、ならびにこれを得るのに
用いられた発現ベクターも含む。特にトランスフェクシ
ョンのために選ばれる宿主細胞は、転写前にわずかな少
量の（すなわちバックグラウンド）レセプター発現を示
す細胞である（例えば図１２を参照）。

【００３４】好ましい具体化の場合、アパミンレセプタ
ーをコードする核酸配列を用いて真核細胞、好ましくは
哺乳類細胞をトランスフェクションする。与えられた配
列のアパミン結合タンパク質を製造する能力を最初に決
定する場合、その中に推定レセプターＤＮＡ配列を連結
したｐｃＤＮＡＩ又はＰＳＧ５などのプラスミド及びＣ
ＭＴ−１又はＣＯＳ−１あるいは−７細胞を用いた一時
的発現を用いることができる。ＣＭＴ−１細胞をカルシ
ウムホスフェート沈澱法を用いてトランスフェクション
し、トランスフェクションの２４時間以内に培地に亜鉛
を添加してＳＶ４０ラージ（ｌａｒｇｅ）Ｔ抗原を誘起
する。トランスフェクションの７２時間後、ＲＮＡ単離
又はアパミン結合測定法のために細胞を収穫する。ｃＤ
ＮＡ及び疑似トランスフェクション細胞の間で発現を比
較し、トランスフェクションされた細胞によりレセプタ
ー活性が得られるかどうかを決定する。陽性の宿主細胞
は、同種の非−トランスフェクション宿主細胞において
観察されるバックグラウンド量の約２倍のアパミン結合
を示す宿主細胞であることが好ましい。

【００３５】スクリーニングの開発に配列を用いるため
に、ＤＮＡの安定な発現が望ましい。この場合、レセプ
ターをコードするＤＮＡを選択可能なマーカーを含む安
定なベクター、例えばｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡＩ
Ｎｅｏ、ｐＸＴＩ又はｐＭＡＭＮｅｏ中に連結する。
プラスミドＤＮＡを線状化し、そのようなベクターに適
した細胞系、例えばＣＶ−１、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ−２又
はＮＩＨ３Ｔ３細胞にエレクトロポレーションにより導
入する。トランスフェクションに成功した細胞は選択に
より同定され、単離クローンを取り上げて増幅する。Ｋ
ｃａｌメッセージの転写を決定するために、細胞ＲＮＡ
を単離し、アガロースゲル上で電気泳動により分離す
る。内在的及び外因的ｍＲＮＡの検出は、Ｋｃａｌをプ
ローブとして用いて行う。

【００３６】外因的（トランスフェクションされた）ｍ
ＲＮＡの同定は、ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の４００ｂ
ｐフラグメントが種の間で最も分岐しておりクロスハイ
ブリッド形成の率が低くなるので、この領域を用いて調
べることができる。

【００３７】ある単離ＤＮＡ配列が機能的アパミンレセ
プターを与える能力は簡単なアパミン結合測定法により
決定される。トランスフェクション細胞は前記の通りに
調製する（Ｄａｎｉｅｌ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５：１８５−１
９３（１９９１））。結合測定法は標準的方法で行われ
（Ｍｏｕｒｒｅ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＲ
ｅｓ．３８２：２３９−２４９（１９８６））、各細胞
系に関するレセプターへのリガンドの最大結合の値及び
解離定数（Ｋ_d）を算出する。

【００３８】培養トランスフェクション細胞におけるカ
リウムチャンネル活性の測定の評価はさらに、⁸⁶Ｒｂ流
出分析により行われる（Ｖａｉｔｕｋａｔｉｓ，Ｊ．
Ｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
７３：４６−５２（１９８１）、これにより参照として
挿入）。簡単に記載すると、安定にトランスフェクショ
ンされた細胞にミクロタイタープレート中で⁸⁶Ｒｂを終
夜負荷し、その後培地を捨て、付着細胞を３回洗浄して
同位体を除去する。その後細胞を２０ｍＭのＣａＣｌ₂
及び１００μＭのカルシウムイオノホアＡ２３１８７を
含む等張緩衝液と共に３７℃で３０分間インキュベート
する。ウェルから上澄み液を回収し、計数する。細胞層
をＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に可溶化し、これも計数
し、⁸⁶Ｒｂの流出パーセントを記載の通りに算出する。
実験は１ｍＭのアパミン（ｓＫｃａ阻害剤として）又は
１μＭのカリブトトキシン（ＢＫｃａ阻害剤として）の
存在下あるいは不在下で行い、標準実験は緩衝液を用い
てインキュベートされる細胞と平行して、しかしイオノ
ホアを加えずに行う。クローンＤＮＡ疑似トランスフェ
クション生成物を含むトランスフェクション生成物と野
生型ＣＶ−Ｉ細胞（内在性流出の測定のため）における
パーセント流出を比較する。そのような分析はチャンネ
ルにおけるその機能への構造的変化の影響、及び異なる
レセプターサブタイプの間の機能的差の評価にも有用で
ある。この分析は推定レセプター／チャンネルの活性の
確認、ならびに効果の確認の両方に有用である。

【００３９】

【生物学的材料の寄託】以下の生物学的材料を１９９２
年６月１５日、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１Ｐａｒｋｌ
ａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌ
ａｎｄに寄託し、与えられた寄託番号を示す：材料寄託番号Ｋｃａｌ１．８を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ６９０１７本発明の上記の具体化を実施例７−９によりさらに例示
する。

【００４０】

【実施例】１．組織のホモジネーション及び原形質膜の可溶化凍結したばかりのウシ脳（３００ｇ）を、５体積の緩衝
液“Ｈ”；トリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）、ＫＣｌ（３．
０ｍＭ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ＰＳ
ＭＦ（０．１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、ロイペ
プチン（２．０μｇ／ｍｌ）、ｐＨ７．０中４℃にてＷ
ａｒｉｎｇブレンダー中で２分間ホモジネートする。ホ
モジネートを４℃で４５分間５００ｘｇにて遠心する。
上澄み液を捨て、粗膜ペレットを１５％ｖ／ｖのグリセ
ロールを含む１００ｍｌの緩衝液“Ｈ”中に再懸濁し、
使用するまで１０ｍｌのアリコートとして−８０℃で保
存する。

【００４１】どの洗剤がこのアフィニティーマトリック
スにアパミン結合タンパク質を結合させるかを決定する
ために、多くのイオン性及び非イオン性洗剤を調べる。
シナプトソームの溶解に１％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ又はＬ
ｕｂｒｏｌ−ＰＸを用いた場合、最高の結合度が観察さ
れる。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−
４０又はＳＤＳの１％ｖ／ｖ組成物は固相アパミンをそ
の結合タンパク質に十分に結合させない。ＣＨＡＰＳの
透析性を考慮し、これを可溶化洗剤として選択する。

【００４２】凍結アリコート（５０ｍｌ）を３７℃の水
浴中で急速に解凍し、同量の氷冷緩衝液“Ｓ”：トリス
−ＨＣｌ（４０ｍＭ）、Ｋｃｌ（１０ｍＭ）、ＣａＣｌ
₂（０．１ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（０．１ｍＭ）及びＣＡＨ
ＰＳ（２％ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４と共に穏やかに混合す
る。混合物を４℃で３０分間穏やかに振り、４℃にて３
０分間３０，０００ｘｇで遠心し、透明の上澄み液を集
める。

【００４３】２．アパミン−セファロース４Ｂアフィニ
ティーマトリックスの調製ＥＡＨ−セファロース４Ｂ（２０ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を２０ｍ
ＭのＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）、
ｐＨ７．０を用い、製造者の記載の通りに洗浄する。ビ
ーズを０．５μモルのアパミンを含む２０ｍＭのＭＯＰ
Ｓ、ｐＨ７．０の５．０ｍｌに再懸濁し、トレーサーと
して１．０ｐモルの〔¹²⁵Ｉ〕アパミンを補う。固体の
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カー
ボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉ
ｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及びＮ−ヒ
ドロキシスルホコハク酸イミド（スルホ−ＮＨＳ、Ｐｉ
ｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ，ＩＬ）を、それぞれ１００ｍＭ及び５．０ｍＭの最
終濃度で懸濁液に加える。懸濁液を４℃にて２４時間混
合し、ビーズを０．５ＭのＮａＣｌを含む１０体積の２
０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０で３回洗浄し、アリコー
トをガンマカウンターで計数する。トレーサーアパミン
のカップリングに基づいてカップリング効率を計算す
る。本方法によりＥＡＨセファロースビーズ１ｍｌ当た
り３３ｎＭのアパミンがカップリングする。

【００４４】３．アパミン結合タンパク質の精製ＣＨＡＰＳにより可溶化した膜（５０ｍｌ）を、４℃で
各回３０分間１．０ｍｌのＥＡＨ−セファロースビーズ
（充填量）と共にインキュベートし、振ることにより２
回予備−清浄化する。５００ｘｇにて５分間遠心するこ
とによりビーズを除去し、上澄み液を１．０ｍｌのアパ
ミン−セファロースビーズ（充填量）に加える。懸濁液
を常に振りながら４℃で４時間インキュベートし、４℃
で５００ｘｇにて５分間遠心し、上澄み液を捨てる。各
回に等量の蒸留水で希釈した５０ｍｌの氷冷緩衝液
“Ｓ”で穏やかに再懸濁し、その後上記のように遠心す
ることにより、ビーズを４℃で４回洗浄する。アパミン
結合タンパク質を溶離するために、ビーズの最終的ペレ
ットをＣＨＡＰＳ（０．１％ｗ／ｖ）を含む１０ｍｌの
トリス−ＨＣｌ（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、ｐ
Ｈ７．４（結合緩衝液“Ｂ”）中に再懸濁し、常に振り
ながら４２℃の水浴中に１５分間置く。図１に示す通
り、３７℃の溶離緩衝液中で１５分間ビーズをインキュ
ベートしても溶離せず、４２℃に急激に変えると８０Ｋ
Ｄタンパク質、ｐ８０（図１、１列）が溶離する。５５
℃でさらにインキュベートしても他のタンパク質の検出
可能な溶離はない（図３、３列）。１５００ｘｇで１０
分間遠心することによりビーズを除去し、上澄み液を集
める。この方法をもう１回繰り返し、上澄み液を集め
る。溶離したアパミン結合タンパク質を含む上澄み液
は、結合研究に直接用いるか、又は４℃における負圧透
析により濃縮して−２０℃で保存する。

【００４５】４．〔¹²⁵Ｉ〕アパミン結合タンパク質の
架橋架橋実験によりｐ８０とアパミンの間の相互作用の特異
性を調べる。アパミンアフィニティーマトリックスから
溶離したタンパク質留分（１００ｎｇ）を氷上で、１．
０ｐモルの〔¹²⁵Ｉ〕アパミン（２２００ｃｉ／ｍＭ、
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏ
ｎ、ＭＡ）と共に、非標識アパミン（最終濃度１．０μ
Ｍ）を含むか又は含まない最終体積１００μｌの緩衝液
“Ｂ”中で１時間インキュベートする。ｐ８０のアパミ
ン結合能力はアフィニティーマトリックスから溶離した
後２時間以内に失われるので、これは必須の予備注意で
ある。洗剤で可溶化したアパミン結合タンパク質のこの
不安定性に関する観察は、Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｎｔｏｍａ
ｒｃｈｉｅｔａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１４２：１−６（１９８４））の発見と一致する。
その後〔¹²⁵Ｉ〕アパミン−ｐ８０複合体を、硼酸ナト
リウム（５０ｍＭ）緩衝液、ｐＨ８．０で予備−平衡化
したＧ−５０セファデックス“Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ”カ
ラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）上に４℃で負荷すること
により非結合〔¹²⁵Ｉ〕アパミンから分離する。集めら
れた空留分（１００μｌ）に、ジメチルスルホキシド中
の１０ｍＭストックのジメチルスベリン酸イミデート
（ＤＭＳ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の１０μｌを加える。混合物
を氷上で１時間インキュベートし、酢酸アンモニウム
（最終１００ｍＭ）を加えることによりクエンチし、凍
結乾燥し、ガンマカウンターで計数し、ＰｈａｓｔＳ
ｙｓｔｅｍ（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、
又は従来の方法により分析する。ゲルを固定し、０．１
％のＰｈａｓｅＧｅｌ−Ｂｌｕｅ（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）、２０％の酢酸及び２０％ｖ／ｖのメタノー
ルを用いて染色し、蒸留水中の５％ｖ／ｖの酢酸及び２
５％ｖ／ｖのメタノール中で脱色する。オートラジオグ
ラフィーをＸ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルム及び１枚の強調
スクリーンを用いて−８０℃で行う。

【００４６】図２（１列）に示す通り、〔¹²⁵Ｉ〕アパ
ミンはｐ８０に独特の架橋をし、過剰の及び非架橋〔
¹²⁵Ｉ〕アパミンは染色前線に現れる。過剰の非標識ア
パミンが含まれる場合ｐ８０への〔¹²⁵Ｉ〕アパミンの
架橋が完全に阻害されるので、相互作用は特異的である
と考えられる（図２、２列）。ＤＭＳの他に化学的に異
なる他の４種類の二官能基性架橋剤を用いて同一の実験
を繰り返す。それぞれオートラジオグラム上の架橋タン
パク質のバンドはクーマシー染色ゲル上のｐ８０のバン
ドと重なる。

【００４７】５．モノクローナル抗体の調製雌のｂａｌｂ／ｃマウス（８−１０週令）を、上記の要
領で製造したアフィニティー精製アパミン結合タンパク
質を用いて免疫化する。マウスは、完全フロイントアジ
ュバントに乳化した合計２．０μｇのタンパク質を用
い、１回の腹腔内及び６回の同量の皮下注射により免疫
化する。動物を３０日間放置し、その後不完全フロイン
トアジュバントを用いる以外は前と同様に免疫化する。
動物を２種間毎に不完全フロイントアジュバント中に乳
化した１００ｎｇのタンパク質を１回腹腔内注射するこ
とにより追加免疫する。４回目の免疫化の１４日後に、
眼窩洞から試験的に出血させ、ポリクローナル血清を集
め、アフィニティー精製レセプターとの反応につき試験
する。その後最終的免疫化を行い、３日後に動物を犠牲
にし、脾臓を取り出す。

【００４８】陽性のポリクローナル血清を与える動物か
らの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３と融合する。イハイブリドーマを選択し、標準的
方法でサブクローニングする（Ａｕｓｕｂｅｒ，Ｆ．
Ｍ．，ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙＩＩ：１１．３−１１．１６，Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。ハイブリ
ドーマの上澄み液を、前記の通り精製アパミン結合タン
パク質を標的抗原として用いた固相ＥＬＩＳＡ（Ｚｉ
ａ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ８２：２３３−２４１（１９８５）及びＨａｙ
ａｓｈｉｂｅ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ１１：８９−９５（１９９０））、ならびに
アパミン結合中和分析によりスクリーニングする。この
分析の場合、ウシ脳原形質膜を希釈ハイブリドーマと４
℃で１時間インキュベートする。結合測定法は、４℃に
て緩衝液“Ｂ”：トリス−ＨＣｌ（２０ｍＭ）、ＫＣｌ
（５．０ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）、ＰＭＳＦ
（０．１ｍＭ）、ＳＣＨ３２，６１５（０．１ｍＭ）、
ｐＨ７．４中で行う。レセプターの結合測定法は、合計
体積２００μｌ；シナプトソーム膜（５０μｌ）、〔
¹²⁵Ｉ〕アパミン（２０μ中０．１ｐＭ）、ハイブリド
ーマ上澄み液（５０μｌ）及び緩衝液Ｂ（２００μｌま
で）中で行う。混合物を４℃で２時間インキュベートす
る。分析混合物をガラス繊維フィルターＧＦ／Ｃ上で濾
過する。膜を緩衝液Ｂで洗浄し、フィルターをＰｈａｒ
ｍａｃｉａ−ＬＫＢガンマカウンターで計数する。標準
的案によりプリスタンで予備処理したｂａｌｂ／ｃマウ
ス中で腹水液を製造し、集める。前記の方法により少な
くとも２種類のハイブリドーマが得られ、ここでＡ１１
４及びＤ１５７と同定するモノクローナル抗体を製造す
る。両方の抗体はＩｇＧ１サブタイプであり、他のＩｇ
Ｇ又はＩｇＭイソタイプによる汚染は検出されない。

【００４９】６．ｐ８０の分布ｐ８０に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体
を生成し、ｐ８０ウエスタンブロッティングを可能に
し、組織片における免疫細胞化学を行う。２匹の免疫化
マウスからの抗−ｐ８０ポリクローナル抗血清を、上記
の通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロー
ス上に移したラット脳シナプトソーム試料を用いたウエ
スタンブロッティング（標準的方法、Ｖｅｃｔａｓｔａ
ｉｎＡＢＣキットにより検出、ＶｅｃｔｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅＣＡ）で
用いる。図３（Ａ）に示す通り、２匹の免疫化マウスか
らの抗血清は大きい８０ＫＤａタンパク質（ｐ８０）及
び小さい５５ＫＤａタンパク質（ｐ５５）バンドと反応
し（１列及び２列）、これらのいずれも免疫前血清を用
いた場合は検出されない（３列）。ｐ５５タンパク質に
対する免疫化学的反応性の存在は、２つの可能性を示唆
している。マウス抗血清が単一特異性でないか、又はｐ
８０及びｐ５５が免疫学的に関連しているかである。こ
の疑問を解決するために、モノクローナル抗体Ｄ１５７
を用い、いくつかのラット組織でｐ８０／ｐ５５プロフ
ァイルを分析する。標準的方法及び記載されている方法
（Ｏｈａｎｄｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏ
ｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１９：１６４−１６７（１９９
１））により、ラットの組織からのホルマリン固定パラ
フィン埋め込み片の調製、一次抗体の適用、アビジン−
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）によ
る検出、ヘマトキシリンによる対比染色及び固定を行
う。図３（Ｂ）に示す通り、１：１０，０００に希釈さ
れたモノクローナル抗体Ｄ１５７はウシ脳（１列）、ラ
ット脳（２列）、ラット心臓（３列）、ラット腎臓（４
列）及びラット肝臓（５列）から単離した膜においてｐ
８０及びｐ５５と強く反応する。ラット腎臓及び肝臓の
場合、ｐ５５バンドは２重線として現れる（図３Ｂ、４
及び５列）。１：１０，０００希釈における他の抗−ｐ
８０モノクローナル抗体であるＡ１１４の場合も同一の
結果がえらる。これらのモノクローナル抗体のｐ８０及
びｐ５５との免疫反応性は、２つのタンパク質が免疫学
的に関連していることを示す。８０ＫＤａアパミン結合
タンパク質の他に５５ＫＤａタンパク質が存在すること
は、いくつかのグループにより実証された（Ｓｅａｇａ
ｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５：４０５１−４０５７（１９８６），Ｓｅａｇａ
ｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０：３８９５−３８９８（１９８５），Ｌｅｖ
ｅｑｕｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ
ｅｒｓ２７５：１８５−１８９（１９９０）及びＭａ
ｒｑｕｅｚｅ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ１６９：２９５−２９８（１９８７））。

【００５０】７．発現ライブラリのスクリーニング λ−ＵｎｉＺＡＰ λＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａＪｏｌｌａ，ＣＡ）中のブタ大動脈発現ｃＤＮＡラ
イブラリを、二次抗体及び検出系としてマウス抗−アパ
ミン結合タンパク質ポリクローナル抗血清（Ｍ２）の
１：１０００希釈液及びＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣ
キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩ
ｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて調べ
る。この方法で約２ｘ１０⁶個のプラーク形成単位をス
クリーニングする。

【００５１】スクリーニングの第１ラウンドから４個の
陽性のプラークを選択する。これらを再スクリーニング
し、ｃＤＮＡ挿入片を含むプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ）をヘルパーファージを用いて保護する。基と
なるプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ及びＸｈｏＩを用いて消化し、ｃＤＮＡ挿入片を放
出させ、アガロースゲル電気泳動により分析する。１個
の１．６ＫｂｃＤＮＡ（Ｋｃａｌ１．６と称する）
をノザンハイブリッド形成、ゲノムサザンブロッティン
グ及びＤＮＡ配列決定のために選択する。ノザンハイブ
リッド形成の場合、ｍＲＮＡを凍結ラット組織から“Ｆ
ａｓｔＴｒａｃｋ”ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて単離
するか、又はＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｓ（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入する。ゲノムサザンブロット
の場合、“Ｚｏｏ−ｂｌｏｔ”をＣｌｏｎｔｅｃｈＬ
ａｂｓから購入し、製造者の記載の通りにプロセシング
する。図６Ａに示す通り、ｃＤＮＡＫｃａｌ１．６
は成体ラット脳ｍＲＮＡ（１列）、ウシ脳ｍＲＮＡ（２
列）、及びブタ脳ｍＲＮＡ（３列）において約２．１Ｋ
ｂの１個のｍＲＮＡバンドを検出する。しかしプローブ
は、新生ラット脳（図６Ｂ）からのｍＲＮＡのノザンブ
ロットにおいて２．１及び３．０Ｋｂの大きさの２個の
ｍＲＮＡを明らかにする。これらの結果は、新生ラット
脳の場合、おそらくｍＲＮＡの交互スプライシングから
生ずる、Ｋｃａｌ１．６とハイブリッド形成する２個
の異なるｍＲＮＡ種があることを示す。次にＥｃｏＲＩ
切断−ゲノムサザンブロットを、Ｋｃａｌ１．６ｃ
ＤＮＡで調べる。図７に示す通り、高緊縮度におけるブ
ロットの洗浄を繰り返した後、Ｋｃａｌ１．６プロー
ブはヒト（１列）及びサル（２列）において１個の１４
Ｋｂバンドを検出する。しかしラット（３列）、マウス
（４列）、イヌ（５列）、ウシ（６列）、ウサギ（７
列）及びニワトリ（８列）において１４Ｋｂ−３．０Ｋ
ｂの範囲のハイブリッド形成の可変パターンがある。酵
母ＤＮＡ（９列）の場合は検出可能なハイブリッド形成
はない。これらの結果は種々の種においてｐ８０をコー
ドする遺伝子の間に顕著な相同性があることを示す。

【００５２】８．Ｋｃａｌ１．６の配列決定 “Ｔａｇ−Ｔｒａｃｋ”配列決定系（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐ．）又は“Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ”系（Ｕ．Ｓ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）
を用いてＤＮＡ配列決定を行う。得られたヌレオチド配
列は、クローンが全長ではなく、開始メチオニン残基を
欠いていることを示す。全長クローンを得るために、Ｋ
ｃａｌ１．６をプローブとして用いて最初のフダ大動
脈ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする。陽性のク
ローンを関連性及び挿入断片の大きさにつき制限マッピ
ング及び電気泳動により分析する。Ｋｃａｌ１．６よ
りわずかに長い１個のｃＤＮＡクローン（Ｋｃａｌ
１．８と称する）を単離し、配列決定する。Ｋｃａｌ
１．８のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図８−１０に
示す。ｃＤＮＡは４３７アミノ酸をコードし；ヒドロパ
シープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙｐｌｏｔ）（図
１１）は４個の強い疎水性推定トランスメンブランドメ
インを示す。推定カルシウム結合ドメインがあり、それ
はドロソフィラの推定カルシウム活性化Ｋ−チャンネル
をコードするクローニングｃＤＮＡｓｌｏのそれと密接
に一致している。しかし他の領域にはＫｃａｌ１．８
とｓｌｏの間に有意な配列相同性はない。

【００５３】Ｋｃａｌ１．８中に、ｃＡＭＰ依存性タ
ンパク質キナーゼ、ならびに推定カゼインキナーゼリン
酸化部位に関する１つの強い共通配列がある。Ｋｃａｌ
１．８はいずれの既知の電圧ゲートＫ−チャンネル、
ナトリウムチャンネル又はカルシウムチャンネルとも有
意な相同性を持たない。

【００５４】９．Ｋｃａｌ１．８の発現Ｎｅｏ^rマーカーを含む安定な哺乳類発現プラスミドで
あるｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にｃＤ
ＮＡを導入することにより、Ｋｃａｌ１．８遺伝子生
成物を安定して発現するＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ７０）を製造する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター
からＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを用いた消化によりＫｃａ
ｌ１．８配列を抽出し、ｐＲｃ／ＣＭＶの対応する部
位に連結する。細胞のトランスフェクションのために、
トランスフェクションの前日にＣＶ−１細胞の密集１０
０ｍｍ皿を分断し、再平板化し、細胞が確実に対数成長
期にあるようにする。エレクトロポレーションのため
に、トリプシンを用いて細胞を収穫し、リン酸塩−緩衝
食塩水で１回、及び２７２ｍＭのスクロース、７ｍＭの
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４及び１ｍＭのＭｇＣｌ₂
を含む等張低イオン濃度緩衝液（緩衝液Ｅ）で２回洗浄
する。細胞をこれと同一の緩衝液に、１．５ｘ１０⁶細
胞／ｍｌの最終濃度で再懸濁する。２０μｇの適したベ
クターを４０単位のＳｃａＩを用いて３７℃で２時間消
化し、プラスミドを直線化する。直線化したプラスミド
をフェノール／クロロホルムで抽出し、ＥｔＯＨ沈澱さ
せ、４００μｌの緩衝液Ｅに再懸濁する。再懸濁したＤ
ＮＡを４００μｌのＣＶ−１細胞（１ｘ１０⁶細胞）と
混合し、エレクトロポレーションの前に室温で２分間イ
ンキュベートする。２５μファラッドにて３００−Ｖパ
ルスを用いたＢｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーによりエレ
クトロポレーションを行う。トランスフェクションは二
重に行う。懸濁液を室温で５分間さらにインキュベート
し、その後１０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃ
ｏの修正イーグル培地を１０ｍｌｓ入れた１００ｍｍの
組織培養皿に平板化する。トランスフェクションの２日
後にＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの最終濃度で加える。
単離したＧ４１８−抵抗性コロニーを同定する。それら
をクローニングシリンダーを用いて選択し、増幅する。

【００５５】トランスフェクションされた細胞を収穫
し、洗浄する。それらを結合緩衝液“Ｂ”：トリス−Ｈ
Ｃｌ１０ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、ｐＨ７．４中で、
１μＭの冷アパミンの存在下又は不在化で、〔¹²⁵Ｉ〕
アパミンと共にインキュベートする。インキュベーショ
ンは冷アパミンと共に４℃で３０分間、その後
〔¹²⁵Ｉ〕アパミン（２０，０００ｃｐｍ／ウェル）と
共に４℃で１時間である。その後標的細胞を濾過し、結
合緩衝液及びＢＳＡで洗浄する。フィルターをガンマカ
ウンターで計数する。

【００５６】図１２に示す通り、トランスフェクション
生成物＃１、３、１０及び１２は、示されている他のト
ランスフェクション生成物と比較して〔¹²⁵Ｉ〕アパミ
ンの結合の有意な増加を示す。

【００５７】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。

【００５８】１．細胞材料からアパミンレセプターを単
離するためのアフィニティーマトリックスとして有用な
組成物において、アパミンの遊離のカルボキシル基に共
有結合によりカップリングした遊離のアミノ基を有する
固体担体マトリックスを含むことを特徴とする組成物。

【００５９】２．第１項に記載の組成物において、固体
担体マトリックスが遊離のアミノ基を有するスペーサー
アームを含む誘導アガロースマトリックスであることを
特徴とする組成物。

【００６０】３．第２項に記載の組成物において、アガ
ロースがＥＡＨ−セファロースであることを特徴とする
組成物。

【００６１】４．第１項に記載の組成物において、カッ
プリングをカーボジイミド縮合により行うことを特徴と
する組成物。

【００６２】５．細胞材料からアパミンレセプターを単
離するのに有用な組成物の製造法において、縮合反応条
件下のカーボジイミドの存在下で遊離のアミノ酸を有す
る誘導アガロースマトリックスをアパミンと、マトリッ
クスとアパミンのカップリングに十分な時間接触させる
段階を含むことを特徴とする方法。

【００６３】６．第５項に記載の方法において、反応を
約４℃で行うことを特徴とする方法。

【００６４】７．第５項に記載の方法において、反応を
Ｎ−ヒドロキシスルホコハク酸イミドの存在下で行うこ
とを特徴とする方法。

【００６５】８．第５項に記載の方法において、アガロ
ースマクトリックスが遊離のアミノ基を有するスペーサ
ーアームを含むことを特徴とする方法。

【００６６】９．第８項に記載の方法において、マトリ
ックスがＥＡＨ−セファロースであることを特徴とする
方法。

【００６７】１０．細胞材料からアパミンレセプターを
単離する方法において、洗剤により可溶化したアパミン
レセプターを含む細胞材料を、アパミンに共有結合によ
りカップリングした遊離のアミノ基を有する誘導アガロ
ースマトリックスを含むアフィニティーマトリックス
と、最高４℃の温度にてレセプターがアパミンに結合す
るのに十分な時間接触させ、温度を少なくとも約４２℃
に上げることによりレセプターをアフィニティーマトリ
ックスから溶離させる段階を含むことを特徴とする方
法。

【００６８】１１．第１０項に記載の方法において、ア
ガロースマトリックスが遊離のアミノ基を有するスペー
サーアームを含むことを特徴とする方法。

【００６９】１２．第１０項に記載の方法において、ア
フィニティーマトリックスがＥＡＨ−セファロースを含
むことを特徴とする方法。

【００７０】１３．アパミンに特異的に結合する単離及
び精製タンパク質。

【００７１】１４．第１３項に記載のタンパク質におい
て、脳、心臓、血管平滑筋、腎臓、ニューロン、膵臓、
黒色腫及び神経芽細胞腫から成る群より選ばれる組織か
ら単離されることを特徴とするタンパク質。

【００７２】１５．第１４項に記載のタンパク質におい
て、脳組織から単離されることを特徴とするタンパク
質。

【００７３】１６．第１３項に記載のタンパク質におい
て、約９０−９５％の純度であることを特徴とするタン
パク質。

【００７４】１７．第１５項に記載のタンパク質におい
て、分子量が約８０ＫＤａであることを特徴とするタン
パク質。

【００７５】１８．第１７項に記載のタンパク質におい
て、分子量が約５５ＫＤａであることを特徴とするタン
パク質。

【００７６】１９．第１３項に記載のタンパク質におい
て、小導電性カルシウム活性化カリウムチャンネルと関
連することを特徴とするタンパク質。

【００７７】２０．有効量の第１３項に記載の組成物を
含む免疫原性組成物。

【００７８】２１．アパミンレセプター又はその一部に
結合するモノクローナル抗体。

【００７９】２２．第２１項に記載の抗体において、分
子量が約８０ＫＤａのアパミン結合タンパク質に対して
誘起されることを特徴とする抗体。

【００８０】２３．第２１項に記載の抗体において、細
胞破壊剤と複合させることを特徴とする抗体。

【００８１】２４．第２１項に記載の抗体において、造
影剤と複合させることを特徴とする抗体。

【００８２】２５．アパミンレセプタータンパク質又は
生物学的に活性なそのフラグメントをコードする核酸配
列を含む単離核酸フラグメント。

【００８３】２６．第２５項に記載のフラグメントにお
いて、脳、心臓、平滑筋、腎臓、肝臓、膵臓及びニュー
ロンから成る群より選ばれる組織中で発現されるレセプ
ターをコードすることを特徴とするフラグメント。

【００８４】２７．第２５項に記載のフラグメントにお
いて、高緊縮条件下で配列が、配列ＩＤＮｏ．：２の
アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリッド形成
することを特徴とするフラグメント。

【００８５】２８．第２５項に記載のフラグメントにお
いて、Ｋｃａｌ１．８の配列を含むことを特徴とする
フラグメント。

【００８６】２９．組み替えにより製造され、単離され
たアパミンレセプタータンパク質、又は生物学的に活性
なそのフラグメント。

【００８７】３０．通常は少量のアパミンレセプターの
みを発現する宿主細胞中で発現された、組み替えにより
製造されたアパミンレセプタータンパク質。

【００８８】３１．第２５項に記載の誘導体フラグメン
トを用いて形質転換又はトランスフェクションされた宿
主細胞、及びその子孫。

【００８９】３２．第３１項に記載の宿主細胞におい
て、その非形質転換又は非トランスフェクション状態の
宿主細胞の約２倍の量でアパミンに結合することを特徴
とする宿主細胞、及びその子孫ならびに誘導体。

【００９０】３３．第２５項に記載のフラグメントを含
む組み替えベクター。

【００９１】３４．第２３項に記載のベクターにおい
て、図７に描かれた配列又はその生物学的活性フラグメ
ントを含むことを特徴とするベクター。

【００９２】３５．第３４項に記載のベクターにおい
て、Ｋｃａｌ１．８の配列を含むことを特徴とするベ
クター。

【００９３】３６．第３３項に記載のベクターを含む宿
主細胞。

【００９４】３７．第３５項に記載のベクターを含む宿
主細胞。

【００９５】３８．宿主細胞中でアパミンレセプターを
発現する方法において、第２５項に記載のフラグメント
を用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクション
する段階を含むことを特徴とする方法。

【００９６】３９．第３８項に記載の方法において、配
列ＩＤＮｏ．：１に描かれている核酸配列を含むこと
を特徴とする方法。

【００９７】４０．第３８項に記載の方法において、フ
ラグメントがＫｃａｌ１．８の核酸配列を含むことを
特徴とする方法。

【００９８】４１．アパミンレセプター活性を調節する
ことができる化合物の同定法において、第２５項に記載
のフラグメントを用いて形質転換又はトランスフェクシ
ョンした宿主細胞と化合物又は化合物の混合物を接触さ
せ、宿主細胞がアパミンに結合する能力への影響の存在
又は不在を観察する段階を含むことを特徴とする方法。

【００９９】４２．チャンネル活性を調節することがで
きる化合物の同定法において、第１項に記載のフラグメ
ントを用いて形質転換又はトランスフェクションした宿
主細胞と化合物又は化合物の混合物を接触させ、宿主細
胞の⁸⁶ＲＢ流出分析において輸送能力への影響の存在又
は不在を観察する段階を含むことを特徴とする方法。

【０１００】

【表１】

【０１０１】

【表２】

【０１０２】

【表３】

【０１０３】

【表４】

【０１０４】

【表５】

【０１０５】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】アパミン−セファロース４Ｂマトリック
ス上のアフィニティークロマトグラフィーにより単離さ
れたアパミン結合タンパク質、ｐ８０のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びクーマシー染色分析したクロマトグラフである。
ＣＨＡＰＳにより可溶化されたウシ脳膜を負荷し、広げ
るように洗浄したアフィニティー樹脂を３７℃（１
列）、４２℃（２列）及び５５℃（３列）で順に溶離す
る。４列及び５列はそれぞれＣＨＡＰＳ及びＳＤＳで可
溶化した膜タンパク質全体のプロファイルである。予備
−染色分子量標準は、ホスホリラーゼＢ、ウシ血清アル
ブミン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラー
ゼ、大豆トリプシン阻害剤及びリゾチームである。

【図２】精製ｐ８０への〔¹²⁵Ｉ〕アパミンの架橋。
精製ｐ８０を、過剰の非標識アパミンを含まずに（１
列）又は含んで（２列）〔¹²⁵Ｉ〕アパミンと共にイン
キュベートする。複合体を脱塩し、架橋し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーを行った
オートラジオグラムである。

【図３】ラット脳膜におけるｐ８０のウエスタンイム
ノブロッティングの結果を示す図に代る写真である。（Ａ）マウスＭ１（１列）、マウスＭ２（２列）及び非
免疫マウス（３列）を、ラット脳膜タンパク質のＳＤＳ
−可溶化試料のイムノブロッティングに用いる。ブロッ
トは下記の通りに展開する。矢印は２個の免疫反応性バ
ンド、ｐ８０及びｐ５５の位置を示す。（Ｂ）抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を、ウ
シ脳（１列）、ラット脳（２列）、ラット心臓（３
列）、ラット腎臓（４列）及びラット肝臓（５列）から
の膜のＳＤＳ変性試料のイムノブロッティングに用い
る。矢印はｐ８０及びｐ５５の位置を示す。（Ｃ）抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を、培
養ヒト黒色腫細胞Ａ３７５（１列）及びヒト髄芽細胞腫
細胞ＴＥ６７１（２列）からの膜のＳＤＳ変性試料のイ
ムノブロッティングに用いる。ｐ８０の位置を矢印で示
す。

【図４】ラット組織におけるｐ８０の免疫細胞化学的
位置決定。抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を
用いてラット腎臓のホルマリン−固定パラフィン埋め込
み片を染色した組織片を示す図に代る写真である（Ａ及
びＢ）。標準片をパネルＣに示す。

【図５】図４の処置同様に、ラット脳の片もモノクロ
ーナル抗体Ｄ１５７で染色して得られた組織片を示す図
に代る写真である（Ｄ）か、又は標準片（Ｅ）として用
いた組織片を示す図に代る写真である。

【図６】アパミンレセプターをコードするｍＲＮＡの
ノザンブロッティングの結果を示す図に代る写真であ
る。（Ａ）成体ラット脳（１列）、ウシ脳（２列）又はブタ
脳（３列）から単離したポリＡ⁺−ｍＲＮＡを変性アガ
ロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上にブロット
し、³²Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮＡとハイブリ
ッド形成させ、オートラジオグラフを行う。（Ｂ）新生ラット脳から単離したポリＡ⁺−ｍＲＮＡを
変性アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に
ブロットし、³²Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮＡと
ハイブリッド形成させ、オートラジオグラフを行う。矢
印は２個のハイブリッド形成ｍＲＮＡバンドの大きさ
（キロ塩基）を示す。

【図７】Ｋｃａｌ１．６のゲノムサザンハイブリッ
ド形成分析の結果を示す図に代る写真である。ヒト（１
列）、サル（２列）、ラット（３列）、マウス（４
列）、イヌ（５列）、ウシ（６列）ウサギ（７列）、ニ
ワトリ（８列）及び酵母（９列）からのＥｃｏＲＩ切断
−ゲノムＤＮＡを³²Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮ
Ａとハイブリッド形成させ、オートラジオグラフを行
う。

【図８】Ｋｃａｌ１．８ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及びそのアミノ酸翻訳を示す図である。下線のアミ
ノ酸はタンパク質のトランスメンブランドメインの可能
性を示す。長円形はタンパク質キナーゼＣの可能性のあ
る部位を示す。（＊）はカルシウム結合部位を形成する
可能性のあるアミノ酸を示す。

【図９】Ｋｃａｌ１．８ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列及びそのアミノ酸翻訳を示す図である。下線のアミ
ノ酸はタンパク質のトランスメンブランドメインの可能
性を示す。長円形はタンパク質キナーゼＣの可能性のあ
る部位を示す。（＊）はカルシウム結合部位を形成する
可能性のあるアミノ酸を示す。

【図１０】Ｋｃａｌ１．８ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド配列及びそのアミノ酸翻訳を示す図である。下線のア
ミノ酸はタンパク質のトランスメンブランドメインの可
能性を示す。長円形はタンパク質キナーゼＣの可能性の
ある部位を示す。（＊）はカルシウム結合部位を形成す
る可能性のあるアミノ酸を示す。

【図１１】Ｋｃａｌ−１．８ｃＤＮＡによりコード
されるタンパク質に関するヒドロパシープロット。推定
ではあるが強い４個の疎水性ドメインを矢印で示す。

【図１２】ｐＲＣ／ＣＭＶベクター中のＫｃａｌ−
１．８ｃＤＮＡを用いてトランスフェクションしたＣ
Ｖ−１細胞の原形質膜へのアパミンの結合様式を示す図
である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年９月１４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】アパミン−セファロース４Ｂマトリックス
上のアフィニティークロマトグラフィーにより単離され
たアバミン結合タンパク質、ｐ８０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
及びクーマシー染色分析したクロマトグラフを示す図に
代る写真である。ＣＨＡＰＳにより可溶化されたウシ脳
膜を負荷し、広げるように洗浄したアフィニティー樹脂
を３７℃（１列）、４２℃（２列）及び５５℃（３列）
で順に溶離する。４列及び５列はそれぞれＣＨＡＰＳ及
びＳＤＳで可溶化した膜タンパク質全体のプロファイル
である。予備−染色分子量標準は、ホスホリラーゼＢ、
ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニックア
ンヒドラーゼ、大豆トリプシン阻害剤及びリゾチームで
ある。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】精製ｐ８０への〔^１２５Ｉ〕アパミンの架橋。
精製ｐ８０を、過剰の非標識アパミンを含まずに（１
列）又は含んで（２列）〔^１２５Ｉ〕アパミンと共にイ
ンキュベートする。複合体を脱塩し、架橋し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーを行っ
たポリアクリルアミド空気泳動の結果を示す図に代るオ
ートラジオグラムの写真である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】ラット脳膜におけるｐ８０のウエスタンイムノ
ブロッティングの結果を示すゲル電気泳動図に代る写真
である。（Ａ）マウスＭ１（１列）、マウスＭ２（２列）及び非
免疫マウス（３列）を、ラット脳膜タンパク質のＳＤＳ
−可溶化試料のイムノブロッティングに用いる。ブロッ
トは下記の通りに展開する。矢印は２個の免疫反応性バ
ンド、ｐ８０及びｐ５５の位置を示す。（Ｂ）抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を、ウ
シ脳（１列）、ラット脳（２列）、ラット心臓（３
列）、ラット腎臓（４列）及びラット肝臓（５列）から
のＳＤＳ変性試料のイムノブロッティングに用いる。矢
印はｐ８０及びｐ５５の位置を示す。（Ｃ）抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を、培
養ヒト黒色腫細胞Ａ３７５（１列）及びヒト髄芽細胞腫
細胞ＴＥ６７１（２列）からの膜のＳＤＳ変性試料のイ
ムノブロッティングに用いる。ｐ８０の位置を矢印で示
す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】ラット組織におけるｐ８０の免疫細胞化学的
位置決定。抗−ｐ８０モノクローナル抗体、Ｄ１５７を
用いてラット腎臓のホルマリン−固定パラフィン埋め込
み片を染色した組織片に係る生物の形態を示す図に代る
写真である（Ａ及びＢ）。標準片の染色した組織片に係
る生物の形態を示す図に代る写真をパネルＣに示す。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】図４の処置同様に、ラット脳の片もモノクロー
ナル抗体Ｄ１５７で染色して得られた組織片に係る生物
の形態を示す図に代る写真である（Ｄ）か、又は標準片
（Ｅ）として用いた組織片に係る生物の形態を示す図に
代る写真である。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】アパミンレセプターをコードするｍＲＮＡのノ
ザンブロッティングの結果を示すゲル電気泳動図に代る
写真である。（Ａ）成体ラット脳（１列）、ウシ脳（２列）又はブタ
脳（３列）から単離したポリＡ^＋−ｍＲＮＡを変性アガ
ロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上にブロット
し、^３２Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮＡとハイブ
リッド形成させ、オートラジオグラフを行う。（Ｂ）新生ラット脳から単離したポリＡ^＋−ｍＲＮＡを
変性アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に
ブロットし、^３２Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６ｃＤＮＡと
ハイブリッド形成させ、オートラジオグラフを行う。矢
印は２個のハイブリッド形成ｍＲＮＡバンドの大きさ
（キロ塩基）を示す。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】Ｋｃａｌ１．６のゲノムサザンハイブリッド
形成分析の結果を示すゲル電気泳動図に代る写真であ
る。ヒト（１列）、サル（２列）、ラット（３列）、マ
ウス（４列）、イヌ（５列）、ウシ（６列）ウサギ（７
列）、ニワトリ（８列）及び酵母（９列）からのＥｃｏ
ＲＩ切断−ゲノムＤＮＡを^３２Ｐ−標識Ｋｃａｌ１．６
ｃＤＮＡとハイブリッド形成させ、オートラジオグラ
フを行う。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者モハマド・レザ・ジアイアメリカ合衆国ニユージヤージイ州08543 モントベイル・ノツテインガムコート66 (72)発明者マニク・チヤンドラアメリカ合衆国ニユージヤージイ州07675 リバーベイル・ニユーストリート615

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アパミンの遊離のカルボキシル基に共有
結合した遊離のアミノ基を有する固体支持体マトリック
スを含んでなる細胞材料からアパミンレセプターを単離
するためのアフィニティーマトリックスとして有用な組
成物。
【請求項２】細胞材料からアパミンレセプターを単離
するのに有用な組成物の製造法において、縮合反応条件
下のカーボジイミドの存在下で遊離のアミノ基を有する
誘導アガロースマトリックスをアパミンと、マトリック
スとアパミンのカップリングに十分な時間接触させる段
階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】細胞材料からアパミンレセプターを単離
する方法において、洗剤により可溶化したアパミンレセ
プターを含む細胞材料を、アパミンに共有結合した遊離
のアミノ基を有する誘導アガロースマトリックスを含む
アフィニティーマトリックスと、最高約４℃の温度にて
レセプターがアパミンに結合するのに十分な時間接触さ
せ、次いで温度を少なくとも約４２℃に上げることによ
りレセプターをアフィニティーマトリックスから溶離さ
せる段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】アパミンに特異的に結合する単離及び精
製タンパク質。
【請求項５】有効量の請求項４に記載の組成物を含む
免疫原性組成物。
【請求項６】アパミンレセプター又はその一部に結合
するモノクローナル抗体。
【請求項７】アパミンレセプタータンパク質又は生物
学的に活性なそのフラグメントをコードする核酸配列を
含む単離核酸フラグメント。
【請求項８】組み替えにより製造され、単離されたア
パミンレセプタータンパク質、又は生物学的に活性なそ
のフラグメント。
【請求項９】通常は少量のアパミンレセプターのみを
発現する宿主細胞中で発現された、組み替えにより製造
されたアパミンレセプタータンパク質。
【請求項１０】請求項７に記載の誘導体フラグメント
を用いて形質転換又はトランスフェクションされた宿主
細胞、又はその子孫。
【請求項１１】請求項７に記載のフラグメントを含む
組み替えベクター。
【請求項１２】請求項１１に記載のベクターを含む宿
主細胞。
【請求項１３】宿主細胞中でアパミンレセプターを発
現する方法において、請求項７に記載のフラグメントを
用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションす
る段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】アパミンレセプター活性を調節するこ
とができる化合物の同定法において、請求項７に記載の
フラグメントを用いて形質転換又はトランスフェクショ
ンした宿主細胞と化合物又は化合物の混合物を接触さ
せ、宿主細胞がアパミンに結合する能力への影響の存在
又は不在を観察する段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】チャンネル活性を調節することができ
る化合物の同定法において、請求項７に記載のフラグメ
ントを用いて形質転換又はトランスフェクションした宿
主細胞と化合物又は化合物の混合物を接触させ、宿主細
胞の⁸⁶ＲＢ流出分析において輸送能力への影響の存在又
は不在を観察する段階を含むことを特徴とする方法。