KR101424080B1 - 아파민을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

아파민을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 아파민을 유효성분으로 포함하여 구성되며, 상기 아파민은 간세포의 상피세포 형질의 지속성을 높이거나 전사인자인 AP-1을 조절하여 상피 중간엽 세포 전이현상을 억제하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 간질환 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타내는 아파민 성분이 유효성분으로 포함되는 간질환 예방 및 치료용 조성물이 제공되며, 이로 인한 아파민의 새로운 약리효과 규명으로 향후 봉독의 주요성분인 아파민의 효용가치를 극대화할 수 있게 된다

Description

아파민을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF LIVER DISEASE CONTAINING APAMIN}
본 발명은 간질환 예방 및 치료를 목적으로 아파민(apamin)을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
만성 간질환은 국내에서 성인병 및 사망의 중요한 원인으로 이 질환의 병인규명, 예방 및 치료 등에 대한 연구는 매우 중요하다.
일반적으로 가장 대표적인 간질환은 간염, 지방간, 간경변, 그리고 간암 등이 있으며, 이와 같은 간질환은 바이러스(Virus) 감염, 담즙정체(Cholestasis), 철(Fe)/구리(Cu)의 축적, 갈락토스혈증(Galactosemia), 그리고 티로신혈증(Tyrosinaemia) 등과 같은 대사성 질환들에서 기인되는 것으로 알려져 있다.
간성상 세포(Hepatic stellate cell)는 간장의 대식세포에 해당하는 쿠퍼세포들에서 유리되는 많은 활성산소들에 의하여 활성화되어 사이토카인(Cytokine)들의 분비와 함께 간성상 세포의 변질을 유발하고 증식이 되어 단백질 합성이 촉진되면서 콜라겐(Collagen)의 축적현상이 진행되고 결국에는 간 조직 내에 경화를 유발하는 콜라겐의 농도가 증가하여 간 섬유화(Liver fibrosis)를 초래하는 것으로 알려져 있으나 아직도 정확한 분자적 기전은 알려져 있지 않다.
봉독은 꿀벌의 독낭에 들어있는 약 40여 가지의 다양한 성분으로 구성되어 있는 복합체로 구성되어 있다. 이러한 성분들은 하기에 기술한 바와 같이 각기 다른 효과를 나타낸다.
한국등록특허공보 제10-0981089호(히스타민을 함유하는 백반증 치료용 약제학적 조성물)에는 0.01mM초과 10mM이하의 히스타민을 유효성분을 포함하는 것으로 이는 봉독으로부터 분리된 것을 특징으로 한 백반증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.
한국공개특허공보 제10-2011-0082335호(봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물)에는 봉독을 함유하며, 이 봉독의 유효성분을 확인한 바, 멜리틴, 아파민, 포스포리파아제가 함유되어 있는 피부미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.
이와 같이 봉독의 유효성분마다 각기 다른 효과를 나타내며, 현재 봉독의 성분 중 하나인 아파민(apamin)을 포함하는 간질환 예방 및 치료효과에 대한 연구는 행하여진 바 없다.
한국등록특허공보 제10-0981089호 "히스타민을 함유하는 백반증 치료용 약제학적 조성물" 한국공개특허공보 제10-2011-0082335호 "봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물"
본 발명의 목적은 꿀벌에서 분리한 봉독의 성분 중의 하나인 아파민(apamin)을 이용하여 간질환에서 흔히 발생하는 간세포의 상피 중간엽 세포 전이현상에서 아파민(apamin)의 작용기전을 밝히고 이의 효능을 탐색함으로써 간질환 예방 및 치료에 효과적인 아파민(apamin)을 포함한 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 아파민을 유효성분으로 포함한다.
상기 아파민은 꿀벌 유래 봉독에서 분리되는 것이 특징으로, 상기 약학 조성물 1㎖당 0.5~2㎍을 포함하는 것이 특징이다.
상기 아파민은 상피 중간엽 세포 전이현상을 억제하는 것을 특징으로, 특히 간세포의 상피세포 형질의 지속성을 높이거나 전사인자인 AP-1을 조절하여 상피 중간엽 세포 전이현상을 억제하는 것이 특징이다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제가 추가로 첨가하며, 바람직하게는 상기 담체로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 중 어느 하나 이상을 사용하며, 상기 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 중 어느 하나 이상을 사용하는 것이 특징이다.
상기 약학 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되는 것이 특징이다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의해, 간질환 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타내는 아파민 성분이 유효성분으로 포함되는 간질환 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
또한, 상기 간질환 예방 및 치료용 조성물은 봉독의 유효성분인 아파민을 사용함으로써 국내 양봉농가의 소득원 창출이 가능해지고, 아파민의 새로운 약리효과 규명으로 향후 봉독의 주요성분인 아파민의 효용가치를 극대화할 수 있게 된다.
도 1은 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상이 염증관련 사이토카인에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
A: TNF-α의 생산량, B: IL-1β의 생산량
TGF-β1(transforming growth factor-β1): 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상을 유도하기 위하여 통상적으로 사용되는 형질전환생장인자
TGF-β1+Apa: TGF-β1와 아파민
도 2는 아파민이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 상피 세포 및 중간엽 세포의 표지자에 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯을 통하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
상피세포의 표지자: 이카드헤린(E-cadherin)
중간엽세포의 표지자: 비멘틴(vimentin), 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐-1(collagen-1), 알파-SMA(α-smooth muscle actin)
표준마커: GAPDH
도 3은 아파민이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 상피 세포 및 중간엽 세포의 발현 변화를 면역형광염색을 통하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
NC: 정상대조군(Normal control)
상피세포의 표지자: 이카드헤린(E-cadherin)
중간엽세포의 표지자: 비멘틴(vimentin)
복합(merged): 이카드헤린(E-cadherin)+비멘틴(vimentin)
도 4는 아파민이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 전사인자 AP-1을 통하여 이의 작용이 조절됨을 나타낸 도면이다.
AP-1: 전사인자
Free probe: AP-1과 결합하고 남은 probe
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 꿀벌에서 분리한 봉독의 성분 중의 하나인 아파민(apamin)을 이용하여 간질환에서 흔히 발생하는 간세포의 상피 중간엽 세포 전이현상에서 아파민(apamin)의 작용기전을 밝히고 이의 효능을 탐색한 바, 간세포의 상피세포 형질의 지속성을 높이거나 전사인자인 AP-1을 조절하여 상피 중간엽 세포 전이현상을 억제함을 확인함으로써 본 발명의 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 아파민(apamin)을 유효성분으로 포함하는 것으로 구성된다.
즉, 상기의 본 발명은 아파민(apamin)을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물로써 간질환 예방 및 치료에 있어 매우 효과를 나타냄을 알 수 있으며, 특히, 상기 아파민(apamin)은 본 발명의 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물 1㎖당 0.5~2㎍을 포함하는 것이 바람직한데, 이는 아파민 함유량이 0.5㎍ 미만일 경우 간질환 및 간경화와 관련된 사이토카인의 함량을 감소시키는데 그 효과가 미흡하며, 간세포의 세포전이현상을 수복시키는 것을 확인할 수 없으며, 2㎍을 초과하면 더 우수한 효과는 나타나지 않으면서 오히려 세포독성을 나타내는 문제가 발생하기 때문에 오히려 국내 양봉농가의 소득원 창출의 목적을 이룰 수 없게 된다.
또한, 본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
이때 제형은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다. 즉, 이는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 선정하여 이루어질 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위내에서 선택될 수 있음을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체로는 제제 할 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 또한, 약학적으로 허용되는 부형제로는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 유효성분인 아파민(apamin) 분리
봉독은 농촌진흥청의 농업과학기술원에서 사육중인 서양종 꿀벌로부터 봉독채집장치(청진테크, 한국)를 이용하여 봉독을 분리하고 불순물을 제거하여 순수한 봉독을 분리 해내었다.
이렇게 분리된 봉독으로부터 아파민 성분을 분리 해내어 준비하였다.
<실시예 2> 본 발명의 아파민(apamin) 성분을 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물 제조
실시예 1의 아파민(apamin) 성분이 함유된 조성물 300 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제 형식의 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제조하였다.
<실험예 1> 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β)의 발현량 확인
1. 세포주
간세포 실험을 위한 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분양받은 마우스 유래의 간세포주 AML12를 DMEM/F-12 배지에 10% FBS와 ITS(Insulin-transferrin-selenium)를 넣어 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
이때, 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상을 유도하기 위하여 2 ng/㎖의 TGF-β1을 48시간동안 처리하여 간세포의 변화 양상을 관찰하였다.
2. 세포 시험군
실험군은 정상대조군(Normal control, NC), 2 ng/㎖의 TGF-β1을 처리한 대조군, 2 ng/㎖의 TGF-β1 투여전 30분간 아파민을 0.5, 1, 2 g/㎖씩을 각각 처리한 실험군으로 구분하여 시험하였다.
3. 실험방법
시료는 세포모델의 배양 상등액을 이용하였으며 염증성 사이토카인의 발현량을 ELISA 분석 키트(enzyme-linked immunosorbent assay kit)를 이용하여 측정하였다.
TNF-α와 IL-1β의 일차항체와 이차항체를 순서대로 반응시키고 3, 3', 5, 5'-테트라메틸 벤지딘을 첨가하여 발색시킨 다음 ELISA 리더기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 TNF-α와 IL-1β의 표준용액을 이용한 기준단위(standard)를 이용하여 시료의 농도를 환산하였다.
4. 실험결과
상기 실험방법을 통해 실험한 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 발현은 아파민을 처리한 후 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
<실험예 2> 단백질의 분리와 웨스턴 블롯 분석
1. 세포주와 세포 시험군
상기 실험예1에 기재되어 있는 바와 동일한 조건의 세포주와 세포 시험군을 이용하였다.
2. 실험방법
분리한 간세포는 IPH 용리 완충액(50 mM pH 8.0 Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 100 mM PMSF, 1 mg/㎖ 류펩틴, 1 mg/㎖ 아프로티닌 및 1 M DTT)를 첨가한 후, 4℃에서 30분 동안 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하였다.
분리한 단백질을 브래드포드법(Bradford)법으로 정량하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인에 옮겼다.
이 멤브레인은 일차 항체 항-이카드헤린(항-E-cadherin),항-비멘틴(항-Vimentin), 항-피브로넥틴(항-Fibronectin), 항-콜라겐-1(항-Collagen-1), 그리고 항-알파-SMA(항-α-smooth muscle actin)와 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세척 후 멤브레인을 2차 항체로 2시간 반응시켰다.
항체들에 대한 발현 분석은 HRP(horseradish peroxidase-linked) 이차항체에 의해 발현되는 ECL 웨스턴 블롯 분석(enhanced chemiluminescence Western Blot Analysis 시스템을 이용하였으며 X-ray 필름에 현상하여 비교 분석하였다.
3. 실험결과
상기 실험방법을 통해 실험한 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 상피세포의 표지자인 이카드헤린(E-cadherin)은 TGF-β1 처리 후 간세포에서 현저히 감소하였으나, 아파민의 처리로 이의 발현이 다시 증가하는 것을 관찰하였다.
대표적인 중간엽세포의 표지자인 비멘틴(vimentin), 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐-1(collagen-1), 알파-SMA(α-smooth muscle actin)는 TGF-β1 처리 후 현저히 증가하는 것을 확인하였으며, 이의 발현은 아파민을 처리하였을 때 감소하였으며 특히, 2 g/㎖의 농도의 아파민에서 가장 적합한 농도의 효과를 나타내었다.
<실험예 3> 면역형광염색
1. 세포주와 세포 시험군
상기 실험예1에 기재되어 있는 바와 동일한 조건의 세포주와 세포 시험군을 이용하였다.
2. 실험방법
간세포는 사이토스핀(cytospin)을 이용하여 슬라이드 글라스(slide glass)에 세포를 부착한 후, 4% 포르말린으로 10분간 고정시켰다.
메탄올과 아세톤을 1:1로 만든 용액으로 5분간 반응시켜 세포막 투과성을 증가시킨 후 PBS로 세척하였다.
항-E-cadherin, 항-Vimentin에 대한 1차 항체를 37℃에서 1시간 반응시키고, AF(Alexa Fluoro)이차 항체로 37℃에서 30분간 반응시켜 형광항체를 표지하였다.
대조염색은 Hoechst 33342로 핵염색을 수행하였다.
3. 실험결과
TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상을 확인하기 위하여 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과, 도 2의 웨스턴 블롯 결과와 같이 TGF-β1의 처리는 상피세포의 표지자인 E-cadherin의 발현을 감소시켰고, 중간엽세포의 표지자인 vimentin의 발현을 증가시켰다. 그러나 아파민(TGF-β1+ apa)의 처리로 이러한 현상이 수복되며 이의 발현 양상은 정상대조군과 비슷함을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> EMSA(Electromobility Shift Assay) 분석
1. 세포주와 세포 시험군
상기 실험예1에 기재되어 있는 바와 동일한 조건의 세포주와 세포 시험군을 이용하였다.
2. 실험방법
간세포 핵 내 전사인자의 발현을 확인하기 위하여 EMSA를 수행하였다.
간세포에서 핵단백질을 분리한 후 DIG-label EMSA kit를 이용하여 DIG로 표지한 AP-1 올리고와 핵단백질을 상온에서 15분간 반응시켜 이를 전기영동하여 AP-1 단백질의 핵 내 발현을 비교 분석하였다.
3. 실험결과
상기 도 1,2,3의 기전을 확인하기 위하여 단백질 발현의 하위단계인 전사인자의 발현을 확인한 결과, 도 4에 나타나있듯이 TGF-β1으로 유도된 간세포의 상피 중간엽 세포전이현상에서 전사인자 AP-1의 발현이 증가하였으며 이의 발현은 아파민 처리 후 감소함을 확인하였다.
이와 같이 봉독의 유효성분인 아파민은 간세포 모델에 투여한 결과 간질환 및 간경화와 관련된 사이토카인의 생산량이 감소함을 확인하였고, 간질환에서 일어나는 간세포의 세포전이현상을 수복시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공함으로써 국내 양봉농가의 소득원 창출이 가능해지고, 아파민의 새로운 약리효과 규명으로 향후 봉독의 주요성분인 아파민의 효용가치를 극대화할 수 있게 된다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 아파민을 유효성분으로 포함하여 간세포의 상피 중간엽 세포전이를 억제하는 것을 특징으로 하는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아파민은 꿀벌유래 봉독에서 분리되는 것을 특징으로 하는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아파민은 상기 약학 조성물 1㎖당 0.5~2㎍을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 아파민은 간세포의 상피세포 형질의 지속성을 높이거나 전사인자인 AP-1을 조절하여 상피 중간엽 세포 전이현상을 억제하는 것을 특징으로 하는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 중 어느하나이상을 추가로 첨가하는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 중 어느 하나 이상인,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 부형제는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 중 어느 하나 이상인,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 상기 약학적 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태로 구성되는,
    간경변 예방 및 치료용의 약학적 조성물.
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