JPH025865A - ヒトの血小板由来の成長因子受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、成長因子及びその受容体、及び特にヒトの血
小板由来成長因子受容体に関するものである。

（発明の背景） 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は間葉細胞の主要なマ
イトジェンである。このタンパク質は、ジスルフィド結
合で結合している２本のポリペプチド６ＪＩＡ及びＢか
らなる３２ｋＤａのへテロニｉ体タンパク質である。こ
のＰＤＧＦＡＢヘテロニ量体に加えて、ＡＡＩびＢＢと
表わされる２個のホモ二ｉ体が同定されている。現在の
ところ、ＰＤＧＦのＡＡ型がＰＤＧＦ受容体に結合する
という直接的証拠はない。

ＰＤＧＦ由来の分裂促進の最初の事象は、細胞膜上での
、ＰＤＧＦとその受容体との結合である。

この相互作用は受容体チロシンキナーゼの活性化、ホス
ファチジルイノシトールのターンオーバー増加、遺伝子
群の発現促進、ホスホリパーゼＡ２の活性化、細胞形の
変化、細胞性カルシウム濃度ノ増加、細胞内ｐＨの変化
及びインターナリゼーション及び結合ＰＤＧＦの分解を
含む、多くの初期細胞応答の引き金を引く。これらの変
化につづいて、標的細胞の増殖速度の増加が起こる。

インビトロでのあるポリペプチドの、特別な細胞型の増
殖促進能は、インビボでの同様の機能を保証しないが、
細胞に関する多くの成長因子の役割が、その因子の生物
全体に果たす役割を測定することで研究されている。イ
ンビトロで、血小板由来成長因子は、繊維芽細胞、平滑
筋細胞及びダリア細胞などの間葉細胞に対する血清中の
主要なポリペプチドマイトジェンである。インビボでは
、ＰＤＧＦは血液血小板のα顆粒中に含まれて循環して
おり、血液中を遊離して循環してはいない。

凝血及び血小板粘着の際、この頚粒は、しばしば血管の
障害部位に放出され、血管の修復にＰＤＧＦが差し向け
られる。またＰＤＧＦは、動脈の中間層から内層への、
動脈平滑筋細胞の移動を促進し、そこでそれらは障害の
初期応答として増殖する。

細胞増殖が身体の中でどのようにコントロールされてい
るのかを調べるため、ＰＤＧＦが研究されている。この
成長因子は傷の治癒、アテローム性動脈硬化症及び細胞
のがん性トランスホーメーション関連遺伝子、特にｃ−
ｍｙｃ、及びｃ　−ｆｏｓの刺激に関係している。それ
ゆえ、ＰＤＧＦアゴニストは、障害治癒の促進に有用で
ある。ＰＤＧＦアンタゴニストは、アテローム性動脈硬
化症、心血管系の手術（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）後に起こる血管閉塞の遅延
及びがん細胞増殖のコントロールに有用である。

（関連文献） マウスのＰＤＧＦ受容体が同定、精製され（ダニエル（
Ｄａｎ　ｉｅ　１）　等、プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　　ＵＳＡ　（１９８
５）　８２．２６８４〜２６８７）、また配列決定され
ている（ヤーデ：／　（Ｙａｒｄｅｎ）等、ネイチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９８６）３２３．２２６−２
３２）。

（発明の概要） ここでは、ヒトの血小板由来成長因子受容体（ｈＰＤＧ
Ｆ−Ｒ）をコードするＤＮＡ配列が単離され、かつ配列
決定された。この配列を含む発現構築物は、ホ乳類細胞
の膜中に分泌され若しくは組込まれる受容体をコードし
ている。組込まれた受容体は、この受容体を欠く細胞で
の、ＰＤＧＦ感受性マイトジェン応答に関し、野生型受
容体と機能的に等価である。この構築物は、細胞のＰＤ
ＧＦ応答の促進、ＰＤＧＦ結合に応答してそのシグナル
を伝達するのに関連している領域の決定、変異した類似
物の提供及び薬剤の生理学的活性の評価に１吏用するこ
とができる。

（具体的態様の説明） ｈＰＤＧＦ−Ｒを含む細胞の他にも、ヒトの血小板由来
成長因子受容体（ｈＰＤＧＦ−Ｒ）の生産方法及びその
生産のための核酸構築物が提供され、その組成物及び細
胞が診断、ｈＰＤＧＦ−Ｒシグナルの誘導に関する薬剤
の評価及びｈＰＤＧＦ−Ｈに関連する病気の治療に使用
される。特に、ｈＰＤＧＦ−Ｒをコードする発現構築物
が提供される。この構築物は、細胞をトランスフェクト
し、機能的に野生型受容体と等価な膜結合受容体を提供
し、かつ受容体欠失細胞にＰＤＧＦ感受性マイトジェン
応答を与えるのに用いることができる。このトランスフ
ェクトした細胞は、細胞のＰＤＧＦ誘導応答の研究、Ｐ
ＤＧＦ結合に応答したシグナルの伝達に関係する領域の
決定及び薬剤の生理学的活性の評価のモデルとして使用
することができる。このコードされでいる受容体又はそ
の結合領域も、ＰＤＧＦアゴニストの評価に使用される
。このＤＮＡ配列の他の利用法としては、多くの成長制
御関連遺伝子が密集している染色体５の領域内の欠失を
検出するプローブとしてこの配列断片を使用することを
挙げることができる。

ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするｃＤＮＡ配列のヌクレオチ
ド配列を、その受容体前駆体のアミノ酸配列とともに第
１図に示した。第１番のアミノ酸で始まる配列は、ヒト
のＰＤＧＦ−Ｒのアミノ末端に対応している。最初の３
２個のアミノ酸（−３２番から一１番で示されている）
は、シグナルペプチド配列をコードしている。熱棒の下
線はトランスメンブレン配列を示している（アミノ酸残
基５００番から５２４番）。潜在的Ｎ−グリコジル化部
位を線で示した。ｃＤＮＡの３′末端のポリアデニル化
部位に下線を付した。

本発明のＤＮＡ組成物はゲノムＤＮＡ又は、合成もしく
はそれらの組合せで調製されるｃ　ＤＮＡから誘導する
ことができる。このＤＮＡ組成物は、１個以上のイント
ロンが存在していてもよく、通常、少なくとも８個のコ
ドン（２４ｂｐ）　、より一般的には少なくとも１２個
のコドンを含む、ｈＰＤＧＦ−Ｒをコードする完全なコ
ード領域又は、その重要な断片を含んでいる。はとんど
の場合、野生型配列が使われるが、場合によっては、ア
ミノ酸配列を変化させたりサイレントな突然変異を起こ
す欠失、置換又は挿入などの１以上の突然変異が導入さ
れても良い。そのゲノム配列は通常５０Ｋｂｐを越えず
、より一般的には、約１０Ｋｂｐを越えず、好ましくは
６にｂｐ以下である。

ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ断片は、実質的にｈ
ＰＤＧＦ−Ｒとの＋ｉ同性を有する他種のＰＤＧＦ受容
体をコードするＤＮＡを単離するのに使用される。ｈＰ
ＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列由来の少なくとも約
１０ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド
以上、かつ約６ｋｎｔ（キロヌクレオチド）以下、通常
約Ｑ、５ｋｎｔ以下のヌクレオチドを有するＤＮＡ断片
の一部がプローブとして使用される。こΦプローブは、
細胞中に、ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするｍＲＮＡが存在
するか否かを調べるのに用いることができる。

さらに、ヒトのＰＤＧＦ受容体遺伝子は、多くの成長コ
ントロール関連遺伝子が密集する染色体５上の一部位に
位置する。少なくとも１つの遺伝病、５０？イナス症（
５ｑ　ｍ１ｎｕｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、この領域の
欠失に関係していることが示された。

このｈＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子配列の断片は、ゲノム中のこ
の重要な領域の構造を探り、また、ゲノム中のこの領域
に関連する遺伝病を診断するマーカーとして用いること
ができる。

また、このＤＮＡ断片又はその一部分も、ｈＰＤＧＦ−
Ｒの発現構築物を調製するのに用いられる。この構築物
には、本来の、もしくはその他のプロモーターの転写コ
ントロール下のｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列
が含まれている。通常、このプロモーターはホ乳類細胞
中に発現するための真核性プロモーターであり、その場
合、このホ乳類細胞はＰＤＧＦ受容体を欠くことも、欠
いていない場合もある。原核性宿主において、このＤＮ
Ａ配列を増巾し、もしくは、受容体タンパク質又はその
断片を産生じたい場合には、このプロモーターを原核性
プロモーターとしてもよい。通常強力なプロモーターが
高いレベルの転写及び発現を提供するのに使用される。

この発現構築物は、適当な細胞宿主において安定な染色
体外維持可能なベクターの一部のときもあるし、また、
宿主ゲノムに組込まれていてもよい。この発現カセット
はトランスポゾン配列、溶原性ウィルス配列などのよう
な、宿主への挿入を可能にする配列に隣接している。通
常、マーカーを発現カセットに与えて、この発現カセッ
トを含む宿主細胞の選択を可能にする。このマーカーは
、同じＤＮＡ分子上にあっても、別のＤＮＡ分子にあっ
てもよいが、おなしＤＮＡ分子上であることが望ましい
。

ホ乳類細胞の場合、この受容体遺伝子自身が都合のよい
マーカーとなっている。しかし、原核細胞の場合には、
細胞毒性薬剤に対する耐性、栄養要求性宿主のプロトト
ロピーへの相補性、検出可能な産物の生産などのマーカ
ーがより都合がよい。

この発現構築物を、計画された宿主細胞により認識され
る複製システムに結合することができる。

種々の複製システムとして、レトロウィルス、シミアン
（ｓｉｍｉａｎ）ウィルス、ボバインバピローマ（ｂｏ
ｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａ）　　ウィルス等のウィル
ス複製システムを挙げることができる。さらに、この構
築物を増巾可能遺伝子、例えばＤＨＦＲ遺伝子に結合し
、この結果、ＰＤＧＦ−Ｒ遺伝子の複製物を多数作るこ
とができる。

宿主へのこの構築物の導入法は、各々の構築物に依存し
て色々ある。導入は、科学文献で詳細に報告されている
ように、融合、結合、トランスフェクション、トランス
フクトョン、エレクトロポレーション、インジェクショ
ン等を含む、いくつかの簡便な手段で行うことができる
。通常、この宿主細胞は培地中で継続的に継代できる不
朽化した細胞（ｉｍｒｎｏｒｔａｌｉｚｅｄ　ｃｅｌｉ
ｓ）である。はとんどの場合、これらの細胞、はＰＤＧ
Ｆ−Ｒを発現でき、また望ましい場合は、成熟ポリペプ
チドを提供する様にこのポリペプチドをプロセシングで
きる簡便なホ乳類細胞系である。プロセシングは、グリ
コジル化、コピキチン化、ジスルフィド結合形成などを
目的に行う。通常、宿主はｈＰＤＧＦ−Ｒを、この細胞
の膜内に挿入するためのシグナル配列を認識することが
できる。もし分泌が望まれるなら、トランスメンブレン
ロケータ−配列を欠失もしくは、変異し、このタンパク
質の膜挿入を阻止することができる。

このペプチド発現には、原核性又は真核性の広範な宿主
を使用することができる。有用な宿主には大腸菌、イー
スト、糸状菌類などのバクテリア、種々のマウス系列、
サル系列、チャイニース・ハムスター卵巣系列、ヒト系
列のような不朽化ホ乳類細胞などが含まれる。はとんど
の場合、このホ乳類細胞は不朽化細胞系列である。場合
によっては、これらの細胞を、悪性宿主から単離しても
よいし、また野生型細胞をオンコジーン、腫瘍ウィルス
等でトランスホームしてもよい。

多くの場合には、ＰＤＧＦ受容体を欠くホ乳類細胞をト
ランスフェクトし、そのシグナル配列がそのペプチドを
細胞膜に指し向けることが望ましい。リンパ細胞及び心
筋細胞は、受容体を欠く基本的細胞である。また、チャ
イニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）　、上皮細胞系
列及び多くのヒト腫瘍細胞系列はＰＤＧＦ受容体を欠い
ている。

トランスフェクトした細胞は、ＰＤＧＦに対する細胞応
答を研究するためのモデルとして使用される。コントロ
ールされた研究のため、ＰＤＧＦ受容体を欠くホ乳類細
胞をｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列を含む発現
構築物でトランスフエクトすることができる。野生型受
容体と機能的に等価でかつ、その細胞にＰＤＧＦ感受性
マイトジェン応答を与える受容体をコードする細胞が生
成する。このようにして、タンパク質性及び非タンパク
質性の合成化合物ばかりでなく、天然のＰＤＧＦ、テス
ト断片の結合性を分析することができる。実施例で示さ
れる様に、トランスフェクトした細胞を、ＰＤＧＦのＡ
Ａ体が受容体チロシンキナーゼを活性化することのｍＡ
ｌ１に用いた。

ＰＤＧＦ依存の分裂促進の研究に加えて、このトランス
フェクトした細胞は、ＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴ
ニストとして機能する薬剤の能力を評価するのに用いる
ことができる。特に４トランスフエクトした細胞をテス
ト薬剤に接触させて、受容体チロシンキナーゼの活性量
又はＤＮＡ合成速度をＰＤＧＦ又は既知の活性をもつそ
の類似物の存在、又は非存在下でコントロール細胞と比
較することによって測定することができる。

トランスフェクトした細胞によって発現されるｈＰＤＧ
Ｆ−Ｒタンパク質も使用される。もし、このペプチドが
分泌されるなら、このペプチドは、発現宿主が増殖した
上清中から単離することができる。もし分泌されないな
ら、このペプチドは、発現宿主の溶解物から単離するこ
とができる。その後、このペプチドをＨＰＬＣ，電気泳
動、勾配遠心、特にＰＤＧＦその他を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いた従来技術によって単離
し、実質的に純粋な産物、特に細胞成分混入物のない産
物が得られる。

この受容体タンパク質又は、この受容体タンパク質の結
合部位である外部ドメインを形成するこの受容体のアミ
ノ末端の約３３番から始まり約５００番までのアミノ酸
は、ＰＤＧＦをアフィニティー精製するのに使用できる
。この外部ドメインも固体基質に固定して用いるか、溶
液中に遊離した状態で、ＰＤＧＦアゴニスト及びアンタ
ゴニストとして有用な薬剤を確認するのに使用される。

このタンパク質もしくは、ｈＰＤＧＦ−Ｒの約５２５番
からカルボキシ末端までの、このタンパク質め細胞内部
分もチロシンキナーゼ活性を有する酵素として用いられ
る。さらに、この受容体のアミノ末端配列のアミノ酸１
番から３２番には、トランスフェクトした細胞の膜を通
過させる構造タンパク質を決めるシグナル配列が含まれ
ている。

このシグナル配列はｈＰＤＧＦ−Ｒとともに使用できる
が、他のタンパク質とも使うことができる。

ペプチド又はその一部も、ポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体を生産するのに使用できる。

抗体は、例えばマウス等の適当なを椎動物宿主を、ペプ
チド単独でもしくは従来のアジュバントと組合せて免疫
化することによって生産される。通常２回以上の免疫化
を行ない、そして、その血液又は膵臓を、最後の注射か
ら数日後に収穫すればよい。

ポリクローナル抗血清には、イムノグロブリンを沈殿化
し、これを単離し、ついでアフィニティー精製を含む精
製を行った。モノクローナル抗体には、通常、膵臓細胞
をハイブリドーマに選択的な条件下で、骨髄細胞系列の
ような不朽化リンパ細胞と融合する。それからこのハイ
ブリドーマを制限希釈条件下でクローン化し、ついでそ
の上清を、望ましい特異性をもつ抗体に関してスクリー
ニングした。抗体を産生ずるための技術は文献でよ（知
られているものであり、米国特許第４．３８１゜２９２
号、第４．４５１．５７０号及び第４．６１８．５７７
号に例示されている。

（実施例） （ヒト腎臓λＧＴ１１ｃＤＮＡライブラリー及びヒト胎
盤λＧＴ１０ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング） マウＸＰＤＧＦ受容体（ｍＰＤＧＦ−Ｒ）タンパク質を
コードする全ＤＮＡ配列をヒト胃＠ｃ　Ｄ　ＮＡライブ
ラリーの２５０，０００個のプラークをスクリーニング
するプローブとして用いた。μｇ当り１２　Ｘ　１０’
ｃｐｍＯ比活性をもつプローブを作るのにニック・トラ
ンスレーションを使用した。３０％ホルムアミド、１×
デンハート溶液、５ｘＳＳＣ。

０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）及び−当り
５００μｇのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーシ
ョンバッファ中このフィルターをプローブ（ｍ１当り１
０５Ｃｐｍ）とインキュベーションした。

４０℃、１４時間のハイブリダイゼーションの後、この
フィルターを５５℃の０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
溶液で４度洗浄し、さらに６５℃の０．２×ＳＳＣで２
度洗浄した。それからこのフィルターを空気乾燥してか
ら、１６時間の露光を行った。

１０個の陽性クローンが得られ、これを、全ｍＰＤＧＦ
−Ｒのプローブを用いて再スクリーニングした。個々の
クローンを単離し、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼを用
いた制限分析を行った。

クローンＨＫ−６という名の最も大きい挿入物（２，３
ｋｂ）を含むクローンについて、さらに特徴を明らかに
し、かつグイデオキシターミネータ−を用いて配列決定
を行った。クローンＨＫ−６は、ヌクレオチド３５５４
から５６９１までの受容体配列と、ポリＡティル由来の
９個の塩基を含んでいた。

２．３ｋｂのＨＫ−６ＤＮＡから作る、ニック・トラン
スレーションプローブを、ヒトの胎盤ｃＤＮＡライブラ
リーの２５０，０００個のプラークをスクリーニングす
るのに用いた。このスクリーニングは高ハイブリダイゼ
ーション・ストリンジエンシー条件（上述ハイブリダイ
ゼーションバッファー中５０％ホルムアミド）で行った
。このフィルターを４２℃、１４〜１６時間、−当り５
Ｘ１０’ｃｐｍのプローブとインキュベーションした。

さらに、このフィルターを６５℃の０．１％Ｓ　Ｓ　Ｃ
，０，１％ＳＤＳ溶液で４度洗浄した。

ＨＫ−６ブローブを用いた第２のスクリーニングの後、
７個のクローンを選択し、ＥｃｏＲＩエンドヌクレアー
ゼを用いた制限消化により分析した。

４．５ｋｂの挿入物を含むクローン（ＨＰ−７）を選択
し、その特徴を明らかにした。このクローンの配列を第
１図に示す。

（発現ベクターの構築） ヒ）ＰＤＧＦ受容体の全コード配列を含む、４．５ｋｂ
ＤＮＡ断片をＥＣ０ＲＩ消化により、ＨＰ−７クローン
から単離した。ゲル精製した断片を、ＳＶ４０発現ベク
ターｐＳＶ７Ｃのポリリンカー領域のＥｃｏＲＩ部位に
クローン化した。ｐＳＶ７ｄ発現ベクター（デービス、
カルホルニア大学、Ｐ、ルシュウ（Ｌｕｃｉｗ）により
提供された）は、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＳＶ
４０ヌクレオチド　　　５１９０−５２７０）　　、二
≧」三！２ＲＩ　　Ｓ　≦　１１ＸｂａＩ及びＳａｌ　
Ｉの制限部位とそれにつづく３個の翻訳終止コドン（Ｔ
ＡＡ）を含む合成ポリリンカー、及びＳＶ４０ポリアゾ
ニレ−ジョンシグナル（Ｓｖ４０ヌクレオチド２５５６
−２７７０）を含むｐＭＬ誘導体である（トルート（Ｔ
ｒｕｅｔｔ）等、ＤＮＡ　（１９８４）４　．３３３−
３４９）。

ＨＰ−７由来のｃＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ断片をｐ
ｓＶ７ｄのＥｃｏＲＩ部位に揮大した。この発現ベクタ
ーにおいて、ｈＰＤＧＦ−受容体遺伝子は、ＳＶ４０プ
ロモーターの転写コントロール下にある。

ＳＶ４０プロモーターに対し、ＰＤＧＦ受容体挿入物（
４，５ｋｂ）の正しい方向を保証するため、この陽性ク
ローンをＳｍａＩエンドヌクレアーゼで消化し、受容体
配列の部位５７３番及び発現ベクターのポＩＪ　ＩＪラ
ッカ領域で切断した。

正しい転写方向をもつ受容体を含むクローンは、発現ベ
クタと受容体の５′末端の５７３塩基対を含む３．２ｋ
ｂの断片に加えて、４．Ｑｋｂの挿入物を放出した。こ
のプラスミドｐＳＶＲＨ５は、抗生物質ネオマイシン耐
性を与えるｐｓＶ２ｎｅｏプラスミドとともに細胞のコ
トランスフェクションに用いた。

（ＣＨＯ細胞の培養のトランスフェクション）ｔｌ、　
Ｃ，Ｓ、　Ｆ、ティシュ・カルチャー・ファシリティ−
から入手した、ＣＨＯ細胞クロりンＫｌを、３７℃、５
％ＣＯ□／９５％空気中、１０％ＦＣ３（Ｕ、Ｃ，Ｓ、
Ｆ、　　ティシュ・カルチャー・ファシリティ−）及び
ペニシリン及びストレプトマイシンを補ったハム（ｔ（
ａｍ）　Ｆ　−１２培地中で増殖した。

ｐｓＶＲＨ５プラスミドＤＮＡ（１０μｇ）及びｐｓＶ
２ｎｅｏ　　（ｌμｇ）を、カルシウム沈殿法（ファン
・デル・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）等、メソッズ　
エンザイモロジー（！Ｊｅｔｈｏｅｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）（１９８０）６５巻、８２６−８３９頁）に
より、トランスフェクトしたＤＮＡの分解を防ぐための
１０μｇのクロロキノン・ジホスフェート（ＣＤＰ）添
加条件下（ルスマン（Ｌｕｔｈｍａｎ）及びマグヌソン
（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）　、ヌクレイツク・アシッズ・
リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、）（１９８
３）　　９１巻、１２９５〜１３０８頁）、ｌＸ１０’
個のＣＨＯ細胞のコトランスフェクションに用いた。こ
のＤＮＡに露してから１２時間後、この細胞をトリプシ
ン処理し、その５倍（１：　５）希釈物を再ブレーティ
ングした。２４時間後、ネオマイシン類似物の抗生物質
Ｇ４１８（ギブコ）を４００μｇ／ｍｉ！濃度となるよ
うに培地に添加した。

選択のための２週間の後、個々のコロニーをつり上げ２
４穴プレートに移した。この集密培養物について、抗受
容体抗体を用いたイムノプロットによる、ＰＤＧＦ受容
体の存否の検定を行った。

この検定で陽性のコロニーをエンド・リミッティング・
ダイリューションにより単一細胞クローンとした。

安定なトランスフェクト細胞について、ＲＮＡ保護検定
法で測定するＰＤＧＦ受容体メツセージの発現（ジン（
Ｚｉｎｎ）等、セル（Ｃｅｌｌ）（１９８３）３１．８
６５〜８７９頁）及び抗ホスホチロシン抗体により検出
される、ＰＤＧＦ依存の受容体タンパク質の存在（フラ
ケルトン（Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ）等、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリーＵ、Ｂｉｏ１．Ｃｈ
ｅｍ、）　　（１９８４）　　２５９巻、７９０９−７
９１５頁）に関するテストを行った。

（ＣＨＯ細胞におけるｈＰＤＧＦ−ＲｃＤＮＡの発現） ＳＶ４０初期プロモーターの転写コントロールＦ１ヒト
受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡでトランスフェ
クトしたＣＨ○細胞（ＣＨＯ−）ＩＲ５）及び、マウス
受容体ｃＤＮＡを含む同様のプラスミドでトランスフェ
クトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｒ１８）を先に報告され
ているように可溶化した（エスコベド（Ｂｓｃｏｂｅｄ
ｏ　）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＞　（１９８８）２
６３巻、１４８２−１４８７頁）。先に報告されている
ように、この受容体カルボキシ末端領域中の配列を特異
的に認識する抗体を用いた、ウェスタン・プロット分析
により、この抽出物の分析を行った（エスコベド（Ｅｓ
ｃｏｂｅｄｏ）等（上述）　；キーティング（Ｋｅｅｔ
ｉｎｇ）等、上述（１９８７）２６２巻、７９３２−３
９３７頁）、１９５ＫＤａのタンパク質は、成熟受容体
であり、一方、１６０ＫＤａのタンパク質は、その受容
体の前駆体である。

このトランスフェクタントにおける受容体タンパク質の
発現がこの受容体の細胞内配列を認識する抗体を用いて
示された。ヒト受容体の最も高い発現を行うクローンを
選択し、次の実験に用いた。

このトランスフェクタントは、以下に述べる競合結合実
験で示されるように、”Ｉ−ＰＤＧＦでラベルした受容
体を有していた。

（種々のＰＤＧＦ型のＰＤＧＦ受容体への競合的結合） ヒトの組換えＡＡ及びＢＢホモニ量体くコリンズ（Ｃｏ
ｌｌｉｎｓ）等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９
８７）３２８巻、６２１−６２４頁）が受容体部位に対
して競合し、かつ、″′Ｉラベル化ＰＤＧＦに置き換る
能力を研究した。各ホモニ量体を、イーストの発現シス
テム（ブレーク（Ｂｌａｋｅ）等、プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイｚンス（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　（１
９８４）８１巻、４６４２−４６４６頁）により選択的
に産生させ、ついで、その他の間葉細胞増殖因子を欠き
、従って、ホ乳類発現システム中に存在する可能性のあ
る因子の混入のアーチファクトを回避したイースト培地
から精製した。

ＢＡＬ　Ｂ／Ｃ３Ｔ３細胞及びＣＨＯ）ランスフェクタ
ント（ＣＨＯ−ＨＲ５）をＡＡ又はＢＢの濃度を順次高
めた条件下で＋２’Ｉ−ＰＤＧＦとインキュベートした
くウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）　等上述（１９８
２）７９．５０６７−５０７０）。

結合は、３７℃、４５分間細胞懸濁液中で行った。

未結合の、放射性ラベル化ＦＤＣＦは、フィコール（Ｆ
ｉｃｏｌｌ）勾配遠心により除去した（オーカンスキー
（Ｏｒｃｈａｎｓｋｙ）等、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　（１９８６）　　ｌ
　３６．１６９−１７３）。ＣＩＯ細胞の”Ｉ−ＰＤＧ
Ｆとのインキベーションで測定した非特異的結合は、結
合放射活性の２５％であった。

この結合実験は、このトランスフェクトした細胞がｈＰ
ＤＧＦとその受容体の相互作用を研究するモデルとして
使用できることを示している。特に、この実験は、この
トランスフェクトしたヒト受容体が以下に示す結果によ
って示されるように、本来のマウスの受容体と機能的に
同一であることを示した。ＰＤＧＦのＡＡ型及びＢＢ型
の両方共、ヒト受容体トランスフェクシントにおける１
２５１−ＰＤＧＦラベル化部位に対して競合した。本来
のマウス受容体と同様、トランスフェクトしたヒト受容
体に対してもＢＢ型はＡＡ型よりも高い親和性をもって
いた。イーストで発現されたとき、ＰＤＧＦのＡＡ型は
異常、なプロセシングを受け、トランスフェクトした細
胞及びマウス３Ｔ３細胞の両方に対し、そのＢＢ型より
も低い親和性を示した。この競合パターンの一致は、そ
のＡＡ型が本来のマウス受容体との相互作用と同様の様
式で、トランスフェクトしたヒト受容体と相互作用する
ことを示し６、つまり、これら受容体が機能的に同一で
あることを示している。

（ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼの活性化）受容体チ
ロシンキナーゼを活性化する、組換えＡＡ及びＢＢホモ
ニ量体及びヒトの部分精製ＡＢＰＤＧＦの能力を研究し
た。イースト由来のＡＡ及びＢＢホモニ量体型及び血小
板由来のＡＢ型は、トランスフェクトされたヒト受容体
のオートホスホリレーションを促進した。

ヒトのＰＤＧＦ受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトしり
ＣＨＯＩ抱（ＣＨＯ−ＨＲ５）及びＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３
細胞を種々の型のＰＤＧＦ　（ＡＡ。

ＢＢ及びＡＢ）と量を変化させてインキ；ベートした。

ポリアクリルアミド−３ＤＳ電気泳動につづいて、リン
酸化した受容体を、抗ホスホチロシン抗体を用いたウェ
スタンプロットによって固定した（ワンプ（Ｗａｎｇ）
　、モレキュラー、アンド・セルラー・バイオロジー（
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）（１９８５）５巻、３
６４０−３６４３頁）。

この受容体タンパク買を、２００ＫＤａの分子量マーカ
ーと共泳動した。トランスフェクトされたヒト受容体の
オートホスホリレーションを促進するのに有効な各型の
濃度は、本来のマウス３Ｔ３受容体又は、トランスフェ
クトされたマウス受容体に対し、同じオートホスホリレ
ーションを与える濃度と同一であった。

これらの結果は、まず、ＰＤＧＦのＡＡ型が、受容体チ
ロシンキナーゼを活性化することを示している。トラン
スフェクトした細胞に使用する前に、ＡＡ型がｈＰＤＧ
Ｆ活性を有していること、又は単一受容体がＰＤＧＦの
全三種の型を認識できることは示されていなかった。さ
らに、これらの結果は、ヒ）ｃＤＮＡが、マウス３Ｔ３
細胞における、ＰＤＧＦ依存のチロシンキナーゼ活性が
由来する野生型受容体と機能的に等しい受容体をコード
していることを示している。

従って、このトランスフェクトした細胞は、ＰＤＧＦで
誘導されるマイトジェン応答を研究するための有用なモ
デルである。

（トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＤＮＡ合
成速度） ヒトのＰＤＧＦ受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトした
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＨＲ５）及びＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３
細胞を、飽和濃度までの二型のＰＤＧＦとインキ；ベー
トした。未処理の細胞及びウシ胎児血清（Ｆｅ２）で処
理した細胞を、各々ネガティブ及びポジティブコントロ
ールとして使用した。

ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みのレベルを、先に報告
されているような、酸沈敗北物質の放射活性により測定
した（エスコベド（Ｅｓｃｏｂｅｄｏ）　、上述）。

ヒト又はマウスの受容体によるＣＨＯ細胞のトランスフ
ェクションは、ＰＤＧＦ感受性のマイトジェン応答を与
えた。全ての型のＰＤＧＦは、ヒトの受容体トランスフ
ェクシント及びマウスのネカティブ受容体をもつ細胞双
方におけるＤＮＡ合成を促進した。

これらデータは、血小板由来のＡＢ型と同様に、Ａ鎖ホ
モ二竜体及びＢ鎖ホモニ量体は、このヒトｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列によってコードされる受容体を介して作用できる
マイトジェンであることを示した。

トランスフェクトしたヒト受容体を含むＣＨＯ細胞及び
マウス３Ｔ３細胞に関するこれらの型のＰＤＧＦのマイ
トジェン作用は、この応答が機能的に同一の受容体によ
って仲介されることを示している。

これらの研究は、他の成長因子の混入を回避した成長因
子調製物と、測定された全てのＰＤＧＦ応答がこの単一
のトランスフェクトされた受容体ｃＤＮＡに帰因する受
容体発現システムの使用によって可能となったものであ
る。

この明細書に記述した全ての刊行物及び特許出願は、本
発明が関係する当業者の技術水準を示している。全ての
刊行物及び特許出願は、過去に各刊行物又は特許出願が
参考として組込まれていることを特別に、及び個々に示
されているのと同種度に、参考として組込んだ。本発明
は、十分説明されてきたので、添付した特許請求の範囲
の精神又は範囲を逸脱することなしに多くの変化及び修
正がなしうろことは、普通の当業者にとっては明白であ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするｃＤＮＡ配列の
ヌクレオチド配列を、その受容体前駆体のアミノ酸配列
とともに示す。 第１図（その２） その３）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトの血小板由来の成長因子受容体（ｈＰＤＧＦ
   −Ｒ）をコードする約５０Ｋｂｐ以下のＤＮＡ断片。 （２）上記断片が約６Ｋｂｐ以下のｃＤＮＡ配列を含む
   、請求項（１）記載のＤＮＡ断片。 （３）少なくとも約１０個のヌクレオチドのｈＰＤＧＦ
   −ＲをコードするＤＮＡ配列を必須部分として成る配列
   を含むプローブ。 （４）上記プローブが約２５乃至１００個のヌクレオチ
   ドを含む、請求項（３）記載のプローブ。 （５）転写の５′−３′の方向に、１つのプロモーター
   、及び自然界でｈＰＤＧＦ−ＲコードＤＮＡ配列に結合
   している以外のＤＮＡに結合している該プロモーターの
   転写制御下にあるｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配
   列を含む、ｈＰＤＧＦ−Ｒの発現構築物。 （６）上記プロモーターが真核性プロモーターである、
   請求項（５）記載の発現構築物。（７）ｈＰＤＧＦ−Ｒ
   のアミノ末端配列の約３３番から約５００番までのアミ
   ノ酸を必須部分として成るＰＤＧＦ受容体結合活性を有
   するｈＰＤＧＦ−Ｒ断片。 （８）ｈＰＤＧＦ−Ｒ又は生理学的に活性のあるその断
   片の実質的に純粋な調製物。 （９）転写の５′−３′の方向に、１つのプロモーター
   及び、自然界でｈＰＤＧＦ−ＲコードＤＮＡ配列に結合
   している以外のＤＮＡに結合している該プロモーターの
   転写制御下にあるｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配
   列を含むｈＰＤＧＦの発現構築物でトランスフェクトし
   た細胞。 （１０）（ａ）ｈＰＤＧＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列
   を含む発現構築物でトランスフェクトした結果としてｈ
   ＰＤＧＦ−Ｒ受容体を含むホ乳類細胞を薬剤と接触させ
   ること、及び（ｂ）非トランスフェクト細胞又は、既知
   の応答を与える薬剤と比較して、該細胞におけるＰＤＧ
   Ｆ誘導の応答量を測定することを含む、薬剤に対するｈ
   ＰＤＧＦアゴニスト又はアンタゴニストとして機能する
   能力の評価方法。