JP2763026B2 - ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 - Google Patents
ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＢ細胞分化因
子をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクタ
ー、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関
する。 【０００２】 【従来の技術】Ｂ細胞分化因子（B cell differentiati
on Factor : BCD F : 特にマウスではT cell Replacing
Factor （ＴＲＦ）ともよばれ、また最近はＩＬ−５と
も呼ばれている）は、Ｔ細胞系列から産生され、Ｂ細胞
に直接作用し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポ
リペプチドからなる因子である。 【０００３】抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあ
るいは癌細胞などの生体異物と反応し、これらを不活性
化したり排除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化
因子は、特定抗原（生体異物）に特異的なＢ細胞クロー
ン即ち特定抗原に感作されたＢ細胞クローンを抗体産生
細胞に誘導して、該抗原に対する抗体を産生させること
から、ＢＣＤＦは、種々の感染症および癌の治療の面か
ら有用な物質である。即ち、ＢＣＤＦは、この因子の生
体内での過少によってひきおこされると考えられる自己
免疫疾患や免疫不全症等の診断、治療のみならず種々の
感染症や癌の治療に利用できることが期待される。 【０００４】ＢＣＤＦの活性には、種特異性があるとい
われている。従って本因子をヒトにおける上記のような
疾患、感染症、癌などの診断あるいは治療に用いるため
には、ヒト由来のＢＣＤＦを使用することが望まれる。
これまで、ＢＣＤＦあるいはＴＲＦに関していくつかの
研究がなされている。まず、マウスのＢＣＤＦ（もしく
はＴＲＦ）については、R.W.Duttonら（Prog.Immunol.,
１, 355 (1971)) およびA.Schimpl およびE.WecKer
（Nature, 237 ,15 (1972))によって報告された。その
後、ヒトにおいてもマウスのＢＣＤＦ（もしくはＴＲ
Ｆ）に相当する物質の存在がGeha, R.S.ら（J.Exp.Me
d., 138 , 1230(1973)), Fauci, A.S. ら（J.Immunol.,
117 , 2100 (1976))およびHirano, T.ら（J.Immunol.,
119 , 1235 (1977))によって報告されているが、以下
に述べるように構造についても不明な点が多く、また、
関与する遺伝子も不明のため、混沌とした状態である
（Kishimoto, T., Ann.Rev.Immunol., ３, 133 (198
5)) 。 【０００５】従来、ヒトＢＣＤＦを得るには、ヒト末梢
血より分離した正常ヒトＴ−細胞をマイトゲン刺激して
培養することにより、その培養上清から得る方法がとら
れている（Hirano, T.ら、J.Immunol., 126 , 517 (198
1)およびRalph, P. ら、J.Immunol. 132 , 1858 (198
4))。上記のRalph, P. らは、マイトゲン刺激した正常
ヒトＴ細胞の３ｌの培養上清から、硫安沈澱、ＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィー（ＤＥ−５２）、
ウルトロゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＡ４
４）、ブルーアガロースおよびレッドアガロースによる
アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどにより約１１，０００倍まで精製
し、ゲル濾過法による分子量が約２０，０００であるこ
とを測定したが、純粋なＢＣＤＦを得るまでには至って
おらず、また得られた量も極微量（３ｌの培養上清から
４．２μｇ）であった。 【０００６】また、Okada, M. ら（J.Exp.Med., 157 ,
583 (1983)) は、正常ヒトＴ細胞とヒトＴ細胞株ＣＥＭ
−ＡＧR とを融合して得たヒトＴ細胞融合株の培養液か
らヒトＢＣＤＦを得る方法を報告しているが、一般にヒ
ト融合細胞株は、継代培養中に物質の産生能が低下する
傾向があり、実用面での物質生産には不向きと考えられ
る。ヒトＢＣＤＦには、ＢＣＤＦＩとＢＣＤＦIIの二種
類があり、各々の性質は下記の様に報告されている（Te
ranishi, T. らJ.Immunol., 128 , 1903 (1982) および
Hirano, T.ら、J.Immunol. 132 , 229 (1984)) 。即
ち、 【０００７】ＢＣＤＦＩ： 分子量：２０，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：６．５〜８．０ 作用：スタフィロコッカス アウレウス コワンＩ（St
aphylococcus aureusCowan Ｉ（ＳＡＣ））刺激Ｂ細胞
（ブラスト化Ｂ細胞）を免疫グロブリン（Ｉｇ）産生細
胞に分化・誘導する。 ＢＣＤＦII： 分子量：２２，０００、３６，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：５〜６ 作用 １）ＥＢウイルスでトランスフォームさせたＢリ
ンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）にＩｇＧ産生を誘導す
る。 ２）ＢＣＤＦＩ存在下にＳＡＣで刺激されたＢ細胞のＩ
ｇ産生細胞への分化を増強する（ＢＣＤＦII単独ではこ
の作用はない）。 【０００８】最近、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬ
Ｖ）によりトランスフォームされたヒトＴ細胞の１株Ｖ
Ｔ−１を用いたヒトＢＣＤＦの生産方法が報告されてい
る（岸本忠三、平野俊夫、特開昭６１−１１５０２４お
よび特開昭６１−１１５０２５号）。これらの出願の発
明者らは、ＶＴ−１細胞の無血清培養上清１０ｌより、
限外濾過、ＡｃＡ−３４ゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフォカシング、逆相クロマトグラフィー
を用いて、１０４２倍まで精製し（収率１．８％）、ヒ
トＢＣＤＦの分子量は３．５±０．５×１０4 ダルトン
（ゲル濾過法）または２．２±０．２×１０4 ダルトン
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）、等電点は
４．９〜５．１、またＮ末端部分のアミノ酸配列は、Pr
o-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser-Lys-Asp-Val-Ala-Ala-
であると報告している。 【０００９】この精製ＢＣＤＦは、その活性をＥＢウイ
ルスでトランスフォームさせた細胞であるＣＥＳＳのＩ
ｇＧ生産量を指標にして精製している点および分子量や
ＰＩ値などからＢＣＤＦIIと考えられる。一方、前記の
Ralph, p. らが報告したヒトＢＣＤＦの分子量はゲル濾
過法で２０，０００ダルトンである。これはＢＣＤＦＩ
と考えられるが、その構造やその他の物理化学的性質は
明らかにされていない。また、上記のＶＴ−１細胞を用
いたＢＣＤＦの生産方法は、既述のヒト末梢血からの細
胞やヒトＴ融合細胞を用いた方法に比べ改善はされてい
るが、多量の培養上清から得られるＢＣＤＦ量は極微量
であり、またＨＴＬＶ感染細胞を出発原料としている点
からも医薬を目的とする工業的生産には向いていない。
このように、ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）に関して
は、その構造が明らかにされていないばかりか、物理化
学的性質ならびに機能について不明な点が多い。また、
それを大量に生産し実用に供することは従来の技術では
不可能であった。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子組み
換え技術を駆使し、これらの問題を解決しようとするも
のである。即ち、本発明はヒトＢＣＤＦ高生産細胞から
ＢＣＤＦ ｍＲＮＡを単離し、ＢＣＤＦ生産を支配する
ＢＣＤＦ遺伝子（即ちＤＮＡ配列）、あるいはまた染色
体由来のＢＣＤＦ遺伝子を明らかにすると共に、ＢＣＤ
Ｆ分子の構造（アミノ酸配列）を明らかにすることによ
り、組み換えＤＮＡ技術でＢＣＤＦの大量生産および医
薬などへの応用の可能性を提供しようとするものであ
る。尚、本発明におけるヒトＢ細胞分化因子はＢＣＤＦ
Ｉに相当するものであるが、本発明と同様な手法により
他のＢＣＤＦの構造も明らかにすることも出来よう。 【００１１】 【課題を解決するための手段】ヒトＢＣＤＦ遺伝子の調製と塩基配列の決定 本発明のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡは、既に本発明者らに
よって調製されたマウスのＢ細胞分化因子の遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）がクローニングされたプラスミドｐＳＰ６Ｋ−
ｍＴＲＦ２３（特願昭６１−１５７２２７号明細書）の
ＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（マウスのＢ細胞分化因子の
遺伝子の全コーディング領域を含んでいる）をプローブ
として以下に述べるようにして得ることができる。尚、
プラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３が導入されている
大腸菌（ＨＢ１０１／ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３）は、
ＳＢＭ２８５と命名され、微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８８
２８の受託番号を得て寄託されている。 【００１２】先ず、ヒト染色体ＤＮＡに、マウスのＢ細
胞分化因子遺伝子とハイブリダイズする配列が存在する
かどうかを確かめるため、例えば正常ヒト胎盤細胞より
抽出したＤＮＡをＰｖｕIIあるいはＰｓｔＩで消化し、
上記のプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３のＢａｍＨ
Ｉ−ＡｃｃＩ断片をニックトランスレイション法により
32Ｐでラベル後、これをプローブとしてサザーンブロッ
トハイブリダイゼイション（Southern blot hybridizat
ion ）を行う。ヒト胎盤からのＤＮＡをＰｖｕIIで消化
した場合は３．０kbのＤＮＡ断片が、またＰｓｔＩで消
化した場合は４．１kbのＤＮＡ断片が上記プローブとハ
イブリダイズすることが認められ、ヒト染色体にマウス
のＢ細胞分化因子遺伝子と類似の配列をもつＤＮＡが存
在することが確認される。この結果は、上記のプローブ
を用いてヒトのＢＣＤＦ ｃＤＮＡをクローニングでき
ることを示すものである。 【００１３】次に上記知見をもとにヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡライブラリーを調製する。先ず、Maeda, M. ら（J.
Exp.Med., 162 , 2169 (1985))によって確立されている
ヒトＴ細胞株ＡＴＬ−２の培養細胞から常法（Nikaido,
T. ら、Nature, 311 , 631(1984)) に従い、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡを調製し、ｐＣＤベクターを用いるOkay
ama-Berg法（Okayama, H. 及びBerg, P., Mol.cell.Bio
l., ３, 280 (1983)) に準じ、ｃＤＮＡライブラリーを
調製する。 【００１４】次にこのｃＤＮＡライブラリーをいくつか
の群に分け、それらからプラスミドＤＮＡを分離し、Ｓ
ａｌＩまたはＢａｍＨＩで消化したのち、上記のプロー
ブ（ 32ＰでラベルされたＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ ＤＮＡ
断片）とサザーンブロットハイブリダイゼイション（So
uthern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)) を行
い、マウスのＢ細胞分化因子の遺伝子とハイブリダイズ
するＤＮＡ断片をもつ群を選択する。続いて、ポジティ
ブとなった群の各クローンについて、上記のプローブを
用いて同様にサザーンブロットハイブリダイゼイション
を行うことにより、上記プローブとハイブリダイズする
クローンを選択する。 【００１５】このポジティブなクローンには、ヒトＢＣ
ＤＦのｃＤＮＡ遺伝子をもつプラスミドが含まれている
と考えられる。このようにして得られるポジティブなク
ローンの一つ（ｐｈ−ＩＬ−５−３０）がもつプラスミ
ドはｐＣＤＶＴＲＦと命名され、またそのプラスミドを
大腸菌ＨＢ１０１株へ導入した形質転換体（ＨＢ１０１
／ｐＣＤＶＴＲＦ）はＳＢＭ２８６と命名され、微工研
にＦＥＲＭ ＢＰ−１１７１の受託番号を得て寄託され
ている。次にポジティブなクローンのプラスミドについ
て、制限酵素解析および上記プローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、確かにマウスＢ細胞分化因子遺伝子
と類似したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡがクローン化されて
いることを確認し、以下に記すようにそのＤＮＡの塩基
配列を決定するとともに、そのＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活
性を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子で
あるかを調べる。 【００１６】先ず、常法に従いそのクローンのプラスミ
ド（例えば、ｐｈ−ＩＬ−５−３０）の制限酵素切断マ
ップを調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５に挿入されているｃＤ
ＮＡ（ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ遺伝子を含む）を一旦ｐ
ＵＣ１８等の適当なプラスミドのＢａｍＨＩサイトにク
ローニングしなおし、ジデオキシ法（Sanger, F.ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))に従って、
上記ｃＤＮＡの塩基配列をきめる。本発明者らの実験に
よれば、上記方法によって、ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡを
含む図１のｃＤＮＡ塩基配列が得られた。 【００１７】ヒトＢ細胞分化因子をコードする領域の決
定 上記で得られたｃＤＮＡ塩基配列にヒトＢ細胞分化因子
をコードする領域が含まれることは、次のようにして決
定した。即ち、この塩基配列のオープンリーディングフ
レームを探すとともに、既に本発明者らによって決定さ
れているマウスＢ細胞分化因子遺伝子の塩基配列と比較
することにより、ヒトＢ細胞分化因子（ヒトＢＣＤＦ）
ポリペプチドをコードする領域とアミノ酸配列を決定す
る（図２）。そして、そのコーディング領域のアミノ酸
配列およびヒトＢＣＤＦが細胞外に分泌される蛋白質で
あることから、ヒトＢＣＤＦの前駆体ポリペプチドは、
Ｎ末端側に１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチド
（リーダー配列）を含む１３４個のアミノ酸からなるポ
リペプチドであることが分かった（図３参照）。即ち、
図３のアミノ酸配列のうち２０〜１３４番目が成熟ヒト
ＢＣＤＦポリペプチドである。 【００１８】前駆体のアミノ酸配列中には、２ヵ所Ｎ−
グリコシル化可能部位（４７番および９０番のＡｓｎ）
および後述するとおり少なくとも１ケ所のＯ−グリコシ
ル化可能部位（２２番のＴｈｒ）があり、ここに糖鎖が
付加されることを考えると、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポ
リペプチドの計算分子量（１３，１４９）は、既に報告
されているヒトＢＣＤＦＩ（糖鎖が付加されている）の
分子量（約２０，０００）と矛盾は無い。尚、図３に示
すポリペプチドのＮ末端のＭｅｔ（メチオニン）は、翻
訳後の修理過程（post translational modification pr
ocess ）で、フォルミル化やアセチル化されることがあ
り、またＭｅｔが取り除かれたりすることもある。ま
た、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポリペプチドのＮ末端のア
ミノ酸も同様な過程でアセチル化されることがある。 【００１９】一方、前記のプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−
３０に挿入されているｃＤＮＡ、即ち上記の如く同定し
たＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活性を有する蛋白質（ポリペプ
チド）を生産する遺伝子であることは当該遺伝子を組み
込んだ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞が
産生する蛋白質の活性を測定することによって知ること
ができるが、また以下のようにしても調べられる。 【００２０】即ち、先ずプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３
０に挿入されているヒトＢＣＤＦｃＤＮＡ全部を含むＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐＳＰ６４ベクターに再クロー
ンする。ｐＳＰ６４は、挿入された外来遺伝子がＳＰ６
プロモーター支配下にのみ発現されうるように改良され
たベクターであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＰ６ＲＮＡポ
リメラーゼ存在下に挿入された外来遺伝子のｍＲＮＡを
合成することができる（Krieg, P.A. およびMelton, D.
A., Nucl.Acid.Res., 12, 7057 (1984) 、およびKonars
ka, M.M.ら、Cell, 38, 731 (1984)) 。 【００２１】次にこのようにして、上記のｃＤＮＡから
ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されるｍＲＮＡ溶液を、アフリ
カツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙ
ｔｅ）に注射して培養し、培養上清に分泌されてくるｍ
ＲＮＡからの翻訳産物（蛋白質）のＢＣＤＦ活性を測定
する。ヒトＢＣＤＦ（特にヒトＢＣＤＦＩ）活性は、既
に記載したように、Staphylococcus aureus Cowan Ｉ
（ＳＡＣ）で刺激したヒトＢ細胞のＩｇＭ産生誘導能を
コントロールと比較して調べることにより測定される。
このようにして上記のｃＤＮＡが、ヒトＢＣＤＦ活性を
有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子である
ことが確かめられるとともに、本発明のＤＮＡによる特
許請求の範囲に示すようなヒトＢＣＤＦポリペプチドの
大量生産の可能性を示す。 【００２２】ヒトＢＣＤＦの発現 本発明によれば、上記のようにして調製された、遺伝子
配列を使用することにより、ヒトＢＣＤＦを製造するこ
とが可能である。例えば、ヒトＢＣＤＦをコードする遺
伝子としてｃＤＮＡを使用する場合には、ｃＤＮＡの
５′側上流に適当な他のプロモーター（例えばＳＶ４０
由来のプロモーター）を挿入した発現ベクターを造成
し、適当な細胞（例えば、酵母細胞、大腸菌細胞、或い
はＣＯＳ−Ｉ細胞やＣＨＯ細胞等の動物細胞）でヒトＢ
細胞を分化させる蛋白質をつくることもできる。この場
合、前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ領域を用いること
が好ましいが、成熟形蛋白質（ポリペフチド）をコード
するｃＤＮＡ領域を用いてもよい。また、当該蛋白質を
コードするＤＮＡの直近の５′上流に、適当な制限酵素
（例えばＨｉｎｄIII ）切断部位を適当な方法、例えば
部位特異的ミュータジェネシス（site directed mutage
nesis ）法を用いて設けておくと外来プロモーターの導
入が容易である。 【００２３】本発明によれば、ｃＤＮＡを用いる代わり
に、ヒト染色体からイントロンを含むヒトＢＣＤＦ遺伝
子を調製し、これを用いて、上記と同様にしてヒトＢ細
胞を分化する蛋白質を製造することもできる。即ち、ヒ
トＢＣＤＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を上記ｃＤＮＡをプ
ローブとして、適当なヒト遺伝子ライブラリー（例え
ば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のヒト遺伝子ラ
イブラリー）から分離し、次にｃＤＮＡの場合と同様、
ヒトＢＣＤＦをコードするＤＮＡ領域の５′上流に適当
なプロモーターを挿入した発現ベクターを造成し、この
発現ベクターによって形質転換あるいはトランスフェク
ションされた細胞を培養することにより、ヒトＢＣＤＦ
を効率よく製造することができる。 【００２４】この場合の宿主細胞は、好ましくはスプラ
イス能力のある細胞が使用される。特に動物細胞が好ま
しい。なお、ヒト染色体由来のＢＣＤＦ遺伝子が組み込
まれた発現ベクター（ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅ）が導入されている大腸菌（ＨＢ１０１／ｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ）は、ＳＢＭ ２９３と命名さ
れ、微工研に国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７７を
得て寄託されている。 【００２５】組換えヒトＢＣＤＦの精製 上記のようにして造成された動物細胞が産生する組換え
ヒトＢＣＤＦは、適当な方法、例えばモノクローナル抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾
過、逆相高速液体クロマトグラフィーなどによって精製
することができる。本発明者らは、このようにして精製
・純化された組換えヒトＢＣＤＦを、アミノ酸配列分析
や電気泳動分析にかけ、このアミノ酸配列分析の結果お
よびヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子の塩基配列からの
推定（例えば図２参照）に基づいて、成熟型ヒトＢＣＤ
Ｆのポリペフチド部分の構造は、前記のとおり図３の第
２０番のＩｌｅから第１３４番のＳｅｒまでの配列を有
することを明らかにすると共に、その２次元的配列の推
定も行った（図１６）。以下、実施例をもって本発明を
説明する。 【００２６】 【実施例】 （１）ヒトＢＣＤＦ遺伝子の確認 先に、本発明者らは、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の産生
を司る遺伝子、即ちＤＮＡ配列を同定した（特願昭６１
−１５７２２７号明細書）。そしてこの遺伝子によって
産生されるマウスＴＲＦは、ＴＲＦ活性〔１）マウス慢
性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ1 ）をＩｇＭ抗体産生細胞に分
化させる活性、２）抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作させた
マウス脾臓内Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オバルブミン）で
刺激し、特異的抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＧ）産生細胞に分
化させる活性、３）ｉｎ ｖｉｖｏで活性化したＢ細胞
ブラストのＩｇＭ合成誘導活性〕およびＢＣＧＦII活性
〔１）ＢＣＬ1 細胞の分裂促進、２）デキストラン硫酸
刺激休止Ｂ細胞の分裂促進〕をもっていることを明らか
にした。 【００２７】マウスＴＲＦ ｍＲＮＡに相補するｃＤＮ
Ａを含むプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３をＢａｍ
ＨＩおよびＡｃｃＩで消化して、６５４bpよりなるＢａ
ｍＨＩ−ＡｃｃＩフラグメントを分離した。マウスＢＣ
ＤＦ（ＴＲＦ）の全コーディング領域を含んでいる、こ
のフラグメントをニックトランスレイションによって 32
Ｐでラベルしたものをプローブにしてヒト染色体ＤＮＡ
のサザンブロットハイブリダイゼーションを常法（Sout
hern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975))に従って
行った。 【００２８】ヒト染色体ＤＮＡは正常ヒト胎盤よりYaoi
ta, Y.およびHonjo, T. (Biomed.Res., １, 164 (198
0)) に準じて抽出したのち、各々２μｇをＰｖｕIIまた
はＰｓｔＩで消化してサザンブロットハイブリダイゼー
ションのために０．６％アガロースゲルで電気泳動し
た。泳動後、ゲル中のＤＮＡはニトロセルロースフィル
ター（Schleicher & Schuel (Dassel)) に移し上記のプ
ローブとハイブリダイズさせた。 【００２９】洗浄条件を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）、５０℃、４５分で行うと、ＰｖｕII
で消化した場合には３．０kbのＤＮＡフラグメントが、
そしてＰｓｔＩで消化した場合には４．１kbのＤＮＡフ
ラグメントがマウスＢＣＤＦプローブとハイブリダイズ
することが判明した。このプローブは、マウス染色体Ｄ
ＮＡのフラグメントには、よりストリンジェント（ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔ）な条件でもハイブリダイズすることよ
り、ヒト染色体ＤＮＡ中にマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃ
ＤＮＡと全く同一ではないが相同性の高い配列があるこ
とが判明し、このプローブを用いてヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡクローンのスクリーニングが可能であると判断し
た。 【００３０】（２）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡクローンの
分離 ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡライブラリーは下記の如く作成
した。M.Maeda ら（J.Exp.Med., 162 , 2169 (1985))が
成人性Ｔ細胞白血病患者の血液より樹立したヒトＴ細胞
株ＡＴＬ−２をＲＰＭＩ １６４０＋１０％牛胎児血清
の培地中、３７℃、５％ＣＯ2 中で培養して細胞を集め
た。この細胞より常法（Nikaido, T. ら、Nature, 311
, 631 (1984)) に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し
た。このポリ（Ａ）+ ＲＮＡ ３μｇを用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成したが、方法はｐＣＤベクターを用
いるOkayama-Berg法（Okayama, H. およびBerg, P., Mo
l.Cell.Biol., ３, 280 (1983)) に準じ、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株）の形質転換体として２×１０
5 個の独立のｃＤＮＡクローンを得た。 【００３１】この２×１０5 個のｃＤＮＡクローン中に
ヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するｃＤＮＡが存在するかど
うかを調べるため、全形質転換体の混合物からプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各々２μｇのＤＮＡをＳａｌＩまた
はＢａｍＨＩで消化し、上記の方法によりサザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｐＣＤ
ベクターに１カットを入れるＳａｌＩ消化では４．１kb
のＤＮＡフラグメントがハイブリダイズし、これに対し
てインサートされたｃＤＮＡのほぼ両端の位置で切断す
るＢａｍＨＩ消化では１．０kbのＤＮＡフラグメントが
ハイブリダイズすることが判った。 【００３２】これらの結果からｃＤＮＡライブラリー中
にヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を持つクロ
ーンが含まれていることが示唆された。そこで前記マウ
スのプローブを用いて上記の２×１０5 個のｃＤＮＡク
ローンを常法のコロニーハイブリダイゼイション（Hana
han, D. およびMeserlson M., Gene, 10, 63 (1980))に
準じてスクリーニングした。スクリーニングの結果２９
クローンがマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃＤＮＡプローブ
とハイブリダイズし、この２９クローンのプラスミドＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ切断マップおよびエンドヌク
レアーゼで消化したＤＮＡフラグメントの上記プローブ
を用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、この２
９クローンは全て同一と判断された。 【００３３】（３）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡの塩基配列
決定およびヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのポリペプチドのア
ミノ酸配列 上記２９クローンのうちの一つｐｈ−ＩＬ−５−３０を
更に詳細に調べた。制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を常法に従い調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿入さ
れたｃＤＮＡを一旦ｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍＨＩ
サイトにサブクローニングし、ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を
常法に従いジデオキシ法（Sanger, F.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))によって決定した。そ
の結果、挿入されたｃＤＮＡはポリＡテールを除く８１
６の塩基対よりなることが判った。 【００３４】この結果とマウスのＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の
ＤＮＡ配列を比較することによってヒトＢＣＤＦのコー
ディング領域を決定し、ヒトＢＣＤＦの前駆体が１３４
個のアミノ酸からなると決定された。ヒトＢＣＤＦはＴ
細胞外に分泌されるためにこの１３４個のアミノ酸配列
中、Ｎ末端配列にシグナル配列を含むことが予想され、
成熟したヒトＢＣＤＦは上記１３４個のアミノ酸配列中
２０番目のアミノ酸から１３４番目までのアミノ酸より
なるポリペプチドを含む分子であると考えられる。 【００３５】このアミノ酸配列中には、２ヵ所のＮ−グ
リコシル化可能部位（図３中、４７番および９０番のＡ
ｓｎ）および少なくとも１ケ所のＯ−グリコシル化可能
部位（図３中、２２番目のＴｈｒ）があり、この付加の
可能性のある糖の分子量とポリペプチドの分子量（２０
番〜１３４番のポリペプチドで１３，１４９）を加算す
ると、ＢＣＤＦＩの分子量として報告されている２０，
０００に矛盾しない。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）と比較
すると、前駆体ではヒトＢＣＤＦのアミノ酸数は一つ多
い。ヒトＢＣＤＦの二個所のＮ−グリコシル化の可能サ
イトはマウスＢＣＤＦの１番目と３番目のＮ−グリコシ
ル化可能サイトと一致する。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）
中の三つのシステイン残基のうち、Ｃ末端側の二つのシ
ステイン残基はヒトＢＣＤＦにおいても保存されてい
る。マウスおよびヒトのＢＣＤＦのコーディング領域の
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は各々７８％および７
０％の相同性を持つ。 【００３６】ｐｈ−ＩＬ−５−３０のＰｓｔＩフラグメ
ント（５１５bp）をニックトランスレイションによって
32Ｐでラベルしたものをプローブに用いて前記のヒト染
色体ＤＮＡのＰｖｕIIまたはＰｓｔＩで消化したＤＮＡ
フラグメントについて前記のとおりサザンブロットハイ
ブリダイゼーションを行った結果、マウスＢＣＤＦプロ
ーブを用いた時と同様、それぞれ４．１kbおよび３．０
kbのフラグメントとハイブリダイズした。ヒトのプロー
ブを用いた場合、洗浄条件を０．１×ＳＳＣ−０．１％
ＳＤＳ、６５℃、４５分というストリンジェントな条件
にしても充分なハイブリダイズがなされた。 【００３７】また、このヒトのプローブを用いてＡＴＬ
−２ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを常法に従い（Thomas, D.D.,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 5201 (1980))、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションを行った結果１．０
kbのただ１本のバンドを認めた。このことは、本発明者
らが同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がヒト染色体ＤＮＡ配
列中、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）遺伝子に特異的な相同
遺伝子であること、またこのヒトＢＣＤＦ遺伝子からは
ただ一種類のｍＲＮＡのみしか翻訳されていないことを
示している。 【００３８】（４）ヒトＢＣＤＦ活性の測定 上記のようにして同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がその生
産を支配しているポリペプチドあるいはそのポリペプチ
ドよりなる物質にヒトＢＣＤＦＩ活性があることを以下
の方法で確認した。プラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０の
ヒトＢＣＤＦｃＤＮＡインサート全部と小部分のベクタ
ーＤＮＡを含むＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをｐＳ
Ｐ６４ベクターに再クローンした。このプラスミドをＳ
ａｌＩで消化した後、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用い
てｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成させた（Krieg,
P.A. およびMelton, D.A., Nucleic Acid Res., 12, 7
057 (1984) ；およびKonarska, M.M.ら、Cell, 38, 731
(1984)) 。 【００３９】このようにして調製したｍＲＮＡ溶液をア
フリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏ
ｃｙｔｅ）に注射し、２０℃４８時間培養後、培養液中
に分泌された生成物を集めて遠心分離して、その上清を
濃縮装置（Centricon 10；Amicon社製）で４倍に濃縮し
たものをヒト・リコンビナントＢＣＤＦとして、以下の
実験に用いた。このヒト・リコンビナントＢＣＤＦがＢ
ＣＤＦＩ活性を持つか否かをＳＡＣで刺激したヒトＢ細
胞のＩｇＭ産生誘導能で調べた。ヒトＢ細胞に富むフラ
クションを正常ヒト血液からSaiki, O. およびRalph,
P., Eur.J.Immunol., 13, 31 (1984))に準じて調製
し、１×１０5 細胞／１００μｌの細胞をＳＡＣ（０．
００１〜０．００２５％）で刺激した。次いで上記ヒト
・リコンビナントＢＣＤＦを１５％濃度になるよう添加
し、３７℃、５％ＣＯ 2 下、６日間培養した。 【００４０】培養上清中のＩｇＭ量をエンザイムイムノ
アッセイキットで測定したところ、１１０ng／ウェルの
値が認められ、コントロールが約５０ng／ウェルであっ
たのに対し、有意にＩｇＭ産生が誘導された。この誘導
はＩＬ−２（５０ｕ／ml）添加によって１３５ng／ウェ
ルまで増強された。コントロールにもＩｇＭ産生が認め
られたのは、完全にＴ細胞を含まないＢ細胞フラクショ
ンを得ることが困難なためと考えられる。 【００４１】（５）ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の単離・
同定 既に、実施例（１）で正常ヒト胎盤細胞の染色体にヒト
ＢＣＤＦ遺伝子の存在を認めていたが、ここでは別の供
給源からヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を単離した。即ち、
その供給源として、ヒト胎児肝臓ＤＮＡのＡｌｕＩ−Ｈ
ａｅIII 部分消化断片を持つシャロン４Ａファージライ
ブラリー（Maniatis, T.ら、Cell, 15,687-702(197
8))、ヒト胎盤ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片をもつ
シャロン４Ａファージライブラリー（Yaoita, Y.および
Honjo, T., Biomed.Res.１, 164(1980) に準じて作製）
およびヒトＩｇＥ産生ミエローマ細胞株２６６Ｂ１のＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片を持つシャロン４Ａファ
ージライブラリー（Nishida, Y. ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 79, 3833-3837(1982))を選んだ。 【００４２】次に、この３種のライブラリーを用いて、
既述のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断
片（５１５bp）をプローブとしてファージのスクリーニ
ングを、ベクトンおよびデービス（Becton, W.D.および
Davis, R.W., Science, 196, 180-182(1977))の方法に
準じて行った。胎児肝臓、胎盤及びミエローマの各々の
ライブラリーより各５×１０5 個のファージプラークを
スクリーニングしてプローブとハイブリダイズする３個
のクローンλ１２（胎児肝臓ライブラリーより）、λ２
２（胎盤ライブラリーより）およびλ３８（ミエローマ
ライブラリーより）を得た。 【００４３】続いて、この３個のクローンの制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図を常法に従い作製し、ヒトＢＣＤ
Ｆ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をプローブとし
て用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）分析した。分析のストラテジーおよびヒトＢＣＤＦ
遺伝子の構成を図４に示すが、図中Ｅ，ＨおよびＢは各
々ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩによる切
断部位を示し、黒ボックス部はエクソン領域を示す。こ
の分析の結果によれば、これら３個のクローンのインサ
ートは互いにオーバーラップしており、図４に示す各ク
ローンに共通の３．２kb ＢａｍＨＩ断片のみが上記の
プローブとハイブリダイズした。従ってこの３．２kb
ＢａｍＨＩ断片にヒトＢＣＤＦをコードする全てのエク
ソンが含まれていると考え、この３．２kb ＢａｍＨＩ
断片を分離し、ＨｉｎｄIII で消化後２つになった１．
６kb断片の各々をｐＵＣ１８ベクターにサブクローニン
グした。 【００４４】次いで、Yanisch-Perron, C.ら（Gene, 3
3, 103-119(1985))に従い、上で得られた２個の１．６k
b断片をクローンしたプラスミドの各々を両端からエク
ソヌクレアーゼIII 及びVII で消化して、ユニディレク
ショナルディリーション（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａ
ｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）ミュータントクローンのシリー
ズを作製した。このミュータントプラスミドのインサー
トのヌクレオチド配列は、常法（Sanger, F.ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 74, 5463-5469(1977) に従い、ジデ
オキシチェインターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃ
ｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によって決定し
た。 【００４５】ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ地図及び４個のエクソンと３個のイントロン
の配置（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）も、ヌクレオチド
配列分析のストラテジーと共に図４に示す。また、実際
のヒトＢＣＤＦ遺伝子を含むＢａｍＨＩ ３．２kb断片
のヌクレオチド配列を図５〜図９に示す。ここで明らか
になったヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子上のエクソン部分の
ヌクレオチド配列は、先に明らかにしたヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と完全に一致した。 【００４６】上記の結果から、染色体遺伝子において、
第１エクソンは、ヒトＢＣＤＦ前駆体ポリペプチド鎖の
Ｎ末端側の第１アミノ酸（Ｍｅｔ）から第４８アミノ酸
（Ｇｌｕ）迄を、第２エクソンは第４９アミノ酸（Ｔｈ
ｒ）から第５９アミノ酸（Ａｓｎ）迄を、第３エクソン
は第６０アミノ酸（Ｈｉｓ）から第１０２アミノ酸（Ｌ
ｙｓ）迄を、そして第４エクソンは第１０３アミノ酸
（Ｌｙｓ）から第１３４アミノ酸（Ｓｅｒ）迄をそれぞ
れコードしていることが分かった。 【００４７】（６）ヒトＢＣＤＦ発現ベクターの造成 実施例（２）で取得したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡおよび
実施例（５）で取得したヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を用
いて、次の４種類の動物細胞発現ベクターを作製した。 ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ 【００４８】Ａ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよ
びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒの作製
（図１０） 実施例（２）で、オカヤマ−ベルグ法（Okayama, H. お
よびBerg, P., Mol.Cell Biol., ３，280(1983))に従
い、ｐＣＤベクターにｃＤＮＡをクローニングし、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１形質転換クローンｐｈ−ＩＬ−５
−３０を得た。このクローンよりプラスミドを分離し、
ＢａｍＨＩ消化およびＰｓｔＩでの部分消化を行い、ヒ
トＢＣＤＦの全コーディング領域を含むｃＤＮＡである
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａを得た。 【００４９】次いで、ヒトＢＣＤＦコーディング領域の
直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトを導入する目的
で、図１１に示すヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列
中の２重下線を引いた部位で、同図に示す配列と逆方向
のＤＮＡストランドとハイブリダイズする３０ｍｅｒの
オリゴヌクレオチド：５′−GCAGAACGTTTCAAGCTTATGAGG
ATGCTT−３′（下線部のＡＡＧＣＴＴはＨｉｎｄIII 切
断配列を示す）を用いて常法（Messing, J. in Methods
in Enzymology, vol. 101 Part C, pp62-65 (Academic
Press, Ed. Wu, R.））に従い、部位特異的ミュータジ
ェネシスを行い、クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５
ｃＤＮＡ（ＨｉｎｄIII ）を得た。 【００５０】このファージＤＮＡをＨｉｎｄIII で消化
し、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域に相当するｃＤ
ＮＡを含むＨｉｎｄIII 断片をベクターｐｄＫＣＲ（Ni
kaido, T. ら、Nature, 311, 631−635 (1984)：ｐｄＫ
ＣＲベクターはｐＫＣＲベクターのｐＢＲ３２２部分が
ｐＢＲ３２７に置換したベクターである）のＨｉｎｄII
I サイトに正しい方向に導入し、発現ベクターｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５−ｃＤＮＡを作製した。 【００５１】次に、この発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡのＳａｌＩサイトにジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ：ｄｈｆｒ）遺伝子発現ユニットを導入する目的
で、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡプラスミドをＳａ
ｌＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を粘
着末端とした。ｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットは、ｐＳＶ
2 ｄｈｆｒ（ＢＲＬ Ｉｎｃ．）のＰｖｕIIサイトにＢ
ａｍＨＩリンカーを付加したプラスミドｐＳＶ2ｄｈｆ
ｒ−ＢＬを作製し、これをＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで切断部位を粘着末端として、ｄｈｆ
ｒ遺伝子発現ユニット断片を分離した。この断片を先に
得た１カットの入ったｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ
に連結して、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｄｈｆｒを作製
した。 【００５２】Ｂ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ及び
ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒの作製
（図１２） 実施例（５）で得たヒトＢＣＤＦ遺伝子を有するファー
ジクローンλ１２から、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺
伝子領域を含む３．２kbＢａｍＨＩ断片を分離してｐＵ
Ｃ１８ベクターにサブクローニングし、形質転換体ｐＵ
Ｃ１８−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅを得た。この形質転換体の
プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、ヒト
ＢＣＤＦをコードする全遺伝子領域を含むＢａｍＨＩ−
ＰｓｔＩ断片（２．２kb）を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅを得た。 【００５３】次いで、前記Ａ）と同様に、部位特異的ミ
ュータジェネシスを行い、ヒトＢＣＤＦコーディング領
域の直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトが導入された
クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ（Ｈｉｎ
ｄIII ）を得た。このファージＤＮＡをＢａｍＨＩとＰ
ｓｔＩで消化し、ヒトＢＣＤＦ遺伝子をｐＵＣ１９にサ
ブクローニングして得たプラスミドｐＵＣ１９−ｈＩＬ
−５ｇｅｎｅ（ＨｉｎｄIII ）を更にＨｉｎｄIII で部
分的に消化して、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺伝子領
域をベクターｐｄＫＣＲのＨｉｎｄIII サイトに正しい
方向で導入して、発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｇｅｎｅを作製した。 【００５４】次いでこの発現ベクターのＮｒｕＩサイト
にｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットを導入する目的でｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅプラスミドをＮｒｕＩで消化
し、生成した粘着末端に前記Ａ）で得られたｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニット断片を連結させて、ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒを作製した。以上で作製した
４種の発現ベクターは、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉ
ｒｕｓ４０）アーリープロモーターによりヒトＢＣＤＦ
およびｄｈｆｒの発現が司られており、また、ＳＶ４０
の複製オリジンを含んでいる。さらに、発現量を増強さ
せるため、ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ及びヒトＢＣＤＦ遺
伝子共に５′および３′非翻訳領域の不必要な部分が除
去されている。 【００５５】（７） 動物細胞によるヒトＢＣＤＦの発
現 実施例（６）で作製されたヒトＢＣＤＦ発現ベクターを
用いて、ＣＯＳ−Ｉ細胞およびＣＨＯ細胞でヒトＢＣＤ
Ｆの発現を行わせた。動物細胞株ＣＯＳ−Ｉ（サル腎臓
細胞）は、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコの修正
エッセンシャル培地で継代を行い、５０〜７０％コンフ
ルエントの状態の細胞を用いて、Graham, F. L. および
van der Eb, A. J. (Virology, 52, 456−467 (1973)）
に準じて、リン酸カルシウム法でトランスフェクション
を行った。直径１０cmの培養シャーレの細胞当たり各々
１０μｇの、実施例（６）で得られた４種類の発現ベク
ターを使用した。 【００５６】３日間、３７℃、５％ＣＯ2 下で培養を行
い、上清のＢＣＤＦ活性を調べると共に、細胞からFree
man ら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA,80,4094 （1983））
に従ってＲＮＡを抽出した。得られたＲＡＮを用いて、
Nambu,J.R.ら（Cell, 35,47-56（1983））に従いノーザ
ンブロット分析を行い（２０μｇＲＮＡ／レーン）、ヒ
トＢＣＤＦｍＲＮＡの発現量を調べた。用いたプローブ
は、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域を含むＭ１３ｍ
ｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ（ＨｉｎｄIII ）の、Ｈｉ
ｎｄIII −ＰｓｔＩ断片である。ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞での発現はＣＨＯｄｈｆｒ- 株を
用いて行った。細胞は１０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ
α+ （ＧＩＢＣＯ）で継代をし、上記と同様にトランス
フェクションを行った。用いた発現ベクターはｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒおよびｐｄＫＣＲ−
ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒである。 【００５７】トランスフェクション後４８時間培養を行
い、weissman, C. (Nucleic AcidsRes. 11, 687 (198
3)) に従い、１０％透析牛胎児血清を含むＭＥＭα
- （ＧＩＢＣＯ）で培養選別後、培養液にメトトレキセ
ート０．１μＭを添加し、更に数日培養を行ってメトト
レキセートに耐性のコロニーを分離し、継代後その上清
のＢＣＤＦ活性を調べた。高発現細胞株を得る目的で、
Simonsen, C.C.およびLevinson, A.D. (Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 80, 2495-2499 (1983)) に従い、継代培養
液に更に高濃度のメトトレキセートを段階的に１mMまで
添加し、ヒトＢＣＤＦ産生細胞株を樹立した。 【００５８】ヒトＢＣＤＦのアッセイ方法は、T cell r
eplacing factor の活性測定方法をとり、Kinashi,T.ら
（Nature,324,70-73（1986））にしたがった。アッセイ
に用いた細胞は、ＢＣＬ1 マウス慢性Ｂ白血病細胞（in
vivo 継代株或いはＢＣＬ1クローン５Ｂ1 ｂ（ＡＴＣ
Ｃ ＴＩＢ１９７））であり、この細胞をサンプル希釈
系列と混和し、５×１０-3個／２００μl ずつ９６穴平
底プレート中で４８時間５％ＣＯ2 、３７℃で培養し
た。 【００５９】培地は１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−
１６４０であり、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノ
ール、５０Ｕ／mlのペニシリンＧ、５０μg ／mlのスト
レプトマイシンを含んでいる。４８時間後、細胞を遠心
で集め、ハンクス液で洗浄後、２００μl ／穴に懸濁
し、その半量の１００μl の細胞を用いてプロテインＡ
プラークアッセイをGronowicz,E.ら（Eur.J.Immunol.,
6 ,588-590（1976））に従って行い、ＩｇＭ産生細胞数
を測定した。ＢＣＬ1 細胞がマウス由来であるため、上
記アッセイ法ではヒトＢＣＤＦの測定感度はマウスＢＣ
ＤＦに比して劣る（精製標品を用いた結果では、約１／
１００が、測定可能であった。 【００６０】ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｃＤＮＡ及びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅの発現ベ
クターでトランスフェクションし、３日後の両細胞のヒ
トＢＣＤＦ ｍＲＮＡをノーザンブロット分析により分
析すると、両者共に１kbに相当する位置にハイブリダイ
ゼーションバンドを認めた。このことはＣＯＳ−Ｉ細胞
中でヒトＢＣＤＦ遺伝子の転写物が正しくスプライスさ
れていることを示した。又ヒトＢＣＤＦ ｍＲＮＡの発
現量は、驚くべきことに、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈ
ＩＬ−５ｇｅｎｅの方がＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡに比して約２０倍高かった。 【００６１】また、ＢＣＤＦ活性を表すプロティンＡ・
プラークアッセイ（ＰＦＣ Ｎｏ．）でも、上記ノーザ
ンブロット分析と同様の傾向が観察された。即ち、両発
現ベクターでトランスフェクションし、３日間培養した
ＣＯＳ−Ｉ細胞の培養上清の２０％と共に培養したＢＣ
Ｌ1 細胞のプラーク形成数を調べたところ表１に示すよ
うに、コントロール（宿主細胞ＣＯＳ−Ｉ）との差で比
較すると、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅの方が、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａより約１７倍も高いプラーク形成数を与えた。 【００６２】 【表１】 【００６３】このことは、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅの方がｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡによるより
トランスフェクション効率が高いことに起因する可能性
を否定は出来ないが、むしろヒトＢＣＤＦ遺伝子のイン
トロン部分にＳＶ４０プロモータに働く未知の増強機能
が存在していることを示唆している。 【００６４】（８）ヒトＢＣＤＦの精製と物性 ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅでト
ランスフェクションし、３日間後の培養液６４０ｍl
（直径１０ｃｍの培養シャーレ６４枚分）よりヒトＢＣ
ＤＦの精製を行った。培養液を遠心後、上清をラット抗
マウスＢＣＤＦ（ＩＬ−５）モノクローナル抗体を担体
セルロファイン（チッソ（株））に結合させたアフィニ
ティーカラム（３mlベッド要領）にかけ、ヒトＢＣＤＦ
をカラムに吸着させた（ヒトＢＣＤＦによるＢＣＬ1 細
胞のＩｇＭ産生細胞への変換は、抗マウスＢＣＤＦ抗体
により完全に抑制されたので、本アフィニティーカラム
を精製に使用した）。 【００６５】次いでこのカラムを次の順序に従って洗浄
した。 １Ｍ ＮａＣｌ ５０ml、 ０．５％ ＮＰ−４０，５０ml、 ＰＢＳ（ph７．２），５０ml、 Ｈ2 Ｏ，５０ml。 【００６６】次に、４mlの１Ｍ酢酸を使って吸着された
ヒトＢＣＤＦを溶出し、溶出液をスピードバックコンセ
ントレーターによって１００μl まで濃縮した。この濃
縮液をSuperose１２カラム（ファルマシア）を２連結し
たＨＰＬＣにかけ、ゲル濾過による精製を行った。カラ
ムは予め、ＰＢＳ（pH７．２）で平衡化を行い、同じ緩
衝液で溶出した（流速０．３ml／分）。溶出液をＯＤ
210 とバイオアッセイでモニターし、活性画分を分子量
４０Ｋ付近に回収した。その溶出パターンを図１３に示
す。図中、斜線部分はＢＣＤＦ活性を有する画分を示
し、実線は蛋白質を、点線はＢＣＤＦ活性を各々示し、
矢印は標準分子量蛋白質（分子量マーカー）の溶出位置
を示す。 【００６７】この活性画分をセンシューパックＶＰ−３
０４−１２５１（センシュー科学、プロテインＣ4 に相
当）による逆相ＨＰＬＣにかけた。吸着されたヒトＢＣ
ＤＦを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、溶
出液のアセトニトリル濃度を０％から８０％に直線的に
上昇させることにより溶出した（流速０．５ml／分）。
その溶出パターンを図１４に示す。図中、斜線部分は、
ＢＣＤＦ活性を有する画分を示し、点線はアセトニトリ
ルの濃度を示す。精製されたヒトＢＣＤＦはアセトニト
リル５５％付近の溶出位置に回収された。収量は約３μ
ｇであった。 【００６８】こうして、精製されたヒトＢＣＤＦについ
て、０．１５μｇ／５０μｌ／レーンでＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量測定を行った。
その泳動パターンを図１５に示す。図中、４）は分子量
マーカーのレーンであり、１）〜３）のレーンには次の
処理を行った精製ヒトＢＣＤＦを泳動させた。 １）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール及
び熱による処理をしていない、 ２）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール処
理を行い、熱処理はしていない、 ３）精製後溶出液中で、４℃２週間保存したサンプル、
２−メルカプトエタノール及び熱による処理をしていな
い、 【００６９】図１５に示すとおり、２−メルカプトエタ
ノール処理及び熱処理をしないヒトＢＣＤＦサンプルで
はゲル濾過の結果と一致して約４０Ｋの単一バンドを示
したが、このサンプルを２−メルカプトエタノール処理
をすると（熱処理はしない）、ゲル上の分子量は約２０
Ｋの単一バンドとなった。また、溶出液（０．１％ＴＦ
Ａ、約５５％アセトニトリル）中、４℃で２週間保持し
た後にも酸化的条件にもかかわらずゲル上の分子量は約
２０Ｋの単一バンドとなった。このことは活性体のヒト
ＢＣＤＦが単量体の分子量約２０Ｋよりなる２量体（分
子量約４０Ｋ）であることを示す。 【００７０】精製したヒトＢＣＤＦの２μｇ（単量体と
して約１００ｐｍｏｌｅ）を使い、Ｎ末端アミノ酸配列
の決定をHewick, R. M. ら（J. Biol. Chem., 256, 799
0-7997（1981））に準じて、ガス−フェイズプロテイン
シークエンサーを用いて行った。各サイクルで得られた
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相系
ＨＰＬＣで分析し、Ｎ末端より２７番目のアミノ酸迄の
配列を第２表に示すとおり決定した。 【００７１】 【表２】 【００７２】この結果は、実施例（３）で示したヒトＢ
ＣＤＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から予想した１３
４個のアミノ酸からなるヒトＢＣＤＦ前駆体は、動物細
胞からの分泌時にＮ末端より１９番目のアミノ酸である
アラニンのＣ末端でリーダー配列が切断され（図３）、
ＣＯＳ−Ｉ細胞あるいはおそらくそのナチュラルなソー
スであるＴ細胞からは、イソロイシンをＮ末端アミノ酸
に持ち、単量体が１１５個のアミノ酸からなる２量体の
糖蛋白質として分泌されることを示すものである。 【００７３】なお、７番目、１４番目および２０番目に
スレオニン（Ｔｈｒ）が検出されたにもかかわらず、塩
基配列からスレオニンと判断される３番目のアミノ酸が
検出されなかったことは、この３番目のアミノ酸残基に
糖鎖が付加されていることを強く示している。この糖鎖
はＯ−グリコシド結合で付加していると考えられる。以
上よりＣＯＳ−Ｉ細胞によって発現された成熟した組換
え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ヒトＢＣＤＦの性質を次
に示すが、単量体のアミノ酸配列の推定された２次元的
配列を図１６に示す。 【００７４】 Ｎ末端アミノ酸配列がイソロイシンよ
り始まる一種類であること、自然状態での分子量は約４
０Ｋであり、２−メルカプトエタノール処理又は０．１
％ＴＦＡ−５５％アセトニトリルでの長時間処理後では
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で約２０Ｋ
を示すことから、ヒトＢＣＤＦのペプチド部分はホモダ
イマーよりなる。 成熟したヒトＢＣＤＦのペプチド部分はイソロイシ
ンから始まる１１５個のアミノ酸よりなり、単量体のペ
プチド部分の分子量は１３，１４９である。 【００７５】 成熟したヒトＢＣＤＦは２量体性の糖
蛋白質である。このことは、成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ
酸配列中Ｎ末端から２８番目及び７１番目のアスパラギ
ンがＮ−グリコシド化を受ける可能性のある配列である
こと、又３番目のスレオニンがアミノ酸配列決定におい
て検出出来なかったことより、Ｏ−グリコシド化を受け
ていると考えられること、単量体の分子量がＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で約２０Ｋであ
り、ペプチド部分の分子量１３，１４９と開きがあるこ
となどから推察される。従って、成熟ヒトＢＣＤＦ単量
体には分子量の合計が約７，０００弱の糖鎖が結合して
いると考えられる。 【００７６】 成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列中、
Ｎ末端から４４番目及び８６番目のシステインの状態は
不明であるが、０．１％ＴＦＡ−５５％アセトニトリル
の長時間処理で酸化条件にもかかわらず、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に相当する
分子量を示すことから、２量体の形成は分子間のＳ−Ｓ
架橋によるものではないと考えられる。しかし、２−メ
ルカプトエタノール処理で速やかにＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に解離することよ
り、Ｓ−Ｓ架橋が単量体の分子内に存在し、２量体形成
に必要なコンフォメーション保持を司っていることが考
えられる。これらの観察より４４番目のシステインと８
６番目のシステインは分子内架橋を形成しているのでは
ないかと推察される。 【００７７】 ヒトＢＣＤＦ遺伝子の解析から判った
エクソン−イントロン構造より、成熟ヒトＢＣＤＦの第
１アミノ酸（Ｉｌｅ）から第２９アミノ酸（Ｇ１ｕ）迄
が第１エクソン、第３０アミノ酸（Ｔｈｒ）から第４０
アミノ酸（Ａｓｎ）迄が第２エクソン、第４１アミノ酸
（Ｈｉｓ）から第８３アミノ酸（Ｌｙｓ）迄が第３エク
ソン、第８４アミノ酸（Ｌｙｓ）から第１１５アミノ酸
（Ｓｅｒ）が第４エクソンに由来している。 ヒトＢＣＤＦの精製は、ＣＯＳ−Ｉ細胞のトランジ
エント・エクスプレッション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）による培養液６４０mlから出発し
て、純粋なヒトＢＣＤＦを約３μｇ得た。ＣＯＳ−Ｉ細
胞のトランスフォーメーションの効率が約１０-3である
ことを考えると、ＣＨＯ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅ−ｄｈｆｒ細胞株の発現量はヒトＢＣＤＦの医療等
へのより広範囲の利用を目的とした生産株となり得ると
考えられる。 【００７８】 【発明の効果】本発明によればヒトＢＣＤＦＩ活性を示
す物質をコードするＤＮＡ配列およびそのポリペプチド
部分の構造が明らかにされ、ＤＮＡ組み換え技術を用い
たヒトＢＣＤＦの大量生産の可能性が提供された。本発
明の方法で得られる組換えヒトＢＣＤＦは、感染症や免
疫不全症などの治療に有用な薬剤として、そのまま或い
は薬学的に許容できる担体とともに薬剤組成物として患
者に投与することが可能である。
子をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクタ
ー、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関
する。 【０００２】 【従来の技術】Ｂ細胞分化因子（B cell differentiati
on Factor : BCD F : 特にマウスではT cell Replacing
Factor （ＴＲＦ）ともよばれ、また最近はＩＬ−５と
も呼ばれている）は、Ｔ細胞系列から産生され、Ｂ細胞
に直接作用し、これを抗体産生細胞に分化・誘導するポ
リペプチドからなる因子である。 【０００３】抗体は、生体に侵入する細菌、ウイルスあ
るいは癌細胞などの生体異物と反応し、これらを不活性
化したり排除したりする機能をもっている。Ｂ細胞分化
因子は、特定抗原（生体異物）に特異的なＢ細胞クロー
ン即ち特定抗原に感作されたＢ細胞クローンを抗体産生
細胞に誘導して、該抗原に対する抗体を産生させること
から、ＢＣＤＦは、種々の感染症および癌の治療の面か
ら有用な物質である。即ち、ＢＣＤＦは、この因子の生
体内での過少によってひきおこされると考えられる自己
免疫疾患や免疫不全症等の診断、治療のみならず種々の
感染症や癌の治療に利用できることが期待される。 【０００４】ＢＣＤＦの活性には、種特異性があるとい
われている。従って本因子をヒトにおける上記のような
疾患、感染症、癌などの診断あるいは治療に用いるため
には、ヒト由来のＢＣＤＦを使用することが望まれる。
これまで、ＢＣＤＦあるいはＴＲＦに関していくつかの
研究がなされている。まず、マウスのＢＣＤＦ（もしく
はＴＲＦ）については、R.W.Duttonら（Prog.Immunol.,
１, 355 (1971)) およびA.Schimpl およびE.WecKer
（Nature, 237 ,15 (1972))によって報告された。その
後、ヒトにおいてもマウスのＢＣＤＦ（もしくはＴＲ
Ｆ）に相当する物質の存在がGeha, R.S.ら（J.Exp.Me
d., 138 , 1230(1973)), Fauci, A.S. ら（J.Immunol.,
117 , 2100 (1976))およびHirano, T.ら（J.Immunol.,
119 , 1235 (1977))によって報告されているが、以下
に述べるように構造についても不明な点が多く、また、
関与する遺伝子も不明のため、混沌とした状態である
（Kishimoto, T., Ann.Rev.Immunol., ３, 133 (198
5)) 。 【０００５】従来、ヒトＢＣＤＦを得るには、ヒト末梢
血より分離した正常ヒトＴ−細胞をマイトゲン刺激して
培養することにより、その培養上清から得る方法がとら
れている（Hirano, T.ら、J.Immunol., 126 , 517 (198
1)およびRalph, P. ら、J.Immunol. 132 , 1858 (198
4))。上記のRalph, P. らは、マイトゲン刺激した正常
ヒトＴ細胞の３ｌの培養上清から、硫安沈澱、ＤＥＡＥ
セルロースカラムクロマトグラフィー（ＤＥ−５２）、
ウルトロゲルカラムクロマトグラフィー（ＡｃＡ４
４）、ブルーアガロースおよびレッドアガロースによる
アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどにより約１１，０００倍まで精製
し、ゲル濾過法による分子量が約２０，０００であるこ
とを測定したが、純粋なＢＣＤＦを得るまでには至って
おらず、また得られた量も極微量（３ｌの培養上清から
４．２μｇ）であった。 【０００６】また、Okada, M. ら（J.Exp.Med., 157 ,
583 (1983)) は、正常ヒトＴ細胞とヒトＴ細胞株ＣＥＭ
−ＡＧR とを融合して得たヒトＴ細胞融合株の培養液か
らヒトＢＣＤＦを得る方法を報告しているが、一般にヒ
ト融合細胞株は、継代培養中に物質の産生能が低下する
傾向があり、実用面での物質生産には不向きと考えられ
る。ヒトＢＣＤＦには、ＢＣＤＦＩとＢＣＤＦIIの二種
類があり、各々の性質は下記の様に報告されている（Te
ranishi, T. らJ.Immunol., 128 , 1903 (1982) および
Hirano, T.ら、J.Immunol. 132 , 229 (1984)) 。即
ち、 【０００７】ＢＣＤＦＩ： 分子量：２０，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：６．５〜８．０ 作用：スタフィロコッカス アウレウス コワンＩ（St
aphylococcus aureusCowan Ｉ（ＳＡＣ））刺激Ｂ細胞
（ブラスト化Ｂ細胞）を免疫グロブリン（Ｉｇ）産生細
胞に分化・誘導する。 ＢＣＤＦII： 分子量：２２，０００、３６，０００（ゲル濾過法） ＰＩ：５〜６ 作用 １）ＥＢウイルスでトランスフォームさせたＢリ
ンパ芽球様細胞（Ｂ−ＬＣＬ）にＩｇＧ産生を誘導す
る。 ２）ＢＣＤＦＩ存在下にＳＡＣで刺激されたＢ細胞のＩ
ｇ産生細胞への分化を増強する（ＢＣＤＦII単独ではこ
の作用はない）。 【０００８】最近、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬ
Ｖ）によりトランスフォームされたヒトＴ細胞の１株Ｖ
Ｔ−１を用いたヒトＢＣＤＦの生産方法が報告されてい
る（岸本忠三、平野俊夫、特開昭６１−１１５０２４お
よび特開昭６１−１１５０２５号）。これらの出願の発
明者らは、ＶＴ−１細胞の無血清培養上清１０ｌより、
限外濾過、ＡｃＡ−３４ゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフォカシング、逆相クロマトグラフィー
を用いて、１０４２倍まで精製し（収率１．８％）、ヒ
トＢＣＤＦの分子量は３．５±０．５×１０4 ダルトン
（ゲル濾過法）または２．２±０．２×１０4 ダルトン
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）、等電点は
４．９〜５．１、またＮ末端部分のアミノ酸配列は、Pr
o-Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-Ser-Lys-Asp-Val-Ala-Ala-
であると報告している。 【０００９】この精製ＢＣＤＦは、その活性をＥＢウイ
ルスでトランスフォームさせた細胞であるＣＥＳＳのＩ
ｇＧ生産量を指標にして精製している点および分子量や
ＰＩ値などからＢＣＤＦIIと考えられる。一方、前記の
Ralph, p. らが報告したヒトＢＣＤＦの分子量はゲル濾
過法で２０，０００ダルトンである。これはＢＣＤＦＩ
と考えられるが、その構造やその他の物理化学的性質は
明らかにされていない。また、上記のＶＴ−１細胞を用
いたＢＣＤＦの生産方法は、既述のヒト末梢血からの細
胞やヒトＴ融合細胞を用いた方法に比べ改善はされてい
るが、多量の培養上清から得られるＢＣＤＦ量は極微量
であり、またＨＴＬＶ感染細胞を出発原料としている点
からも医薬を目的とする工業的生産には向いていない。
このように、ヒトＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ）に関して
は、その構造が明らかにされていないばかりか、物理化
学的性質ならびに機能について不明な点が多い。また、
それを大量に生産し実用に供することは従来の技術では
不可能であった。 【００１０】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子組み
換え技術を駆使し、これらの問題を解決しようとするも
のである。即ち、本発明はヒトＢＣＤＦ高生産細胞から
ＢＣＤＦ ｍＲＮＡを単離し、ＢＣＤＦ生産を支配する
ＢＣＤＦ遺伝子（即ちＤＮＡ配列）、あるいはまた染色
体由来のＢＣＤＦ遺伝子を明らかにすると共に、ＢＣＤ
Ｆ分子の構造（アミノ酸配列）を明らかにすることによ
り、組み換えＤＮＡ技術でＢＣＤＦの大量生産および医
薬などへの応用の可能性を提供しようとするものであ
る。尚、本発明におけるヒトＢ細胞分化因子はＢＣＤＦ
Ｉに相当するものであるが、本発明と同様な手法により
他のＢＣＤＦの構造も明らかにすることも出来よう。 【００１１】 【課題を解決するための手段】ヒトＢＣＤＦ遺伝子の調製と塩基配列の決定 本発明のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡは、既に本発明者らに
よって調製されたマウスのＢ細胞分化因子の遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）がクローニングされたプラスミドｐＳＰ６Ｋ−
ｍＴＲＦ２３（特願昭６１−１５７２２７号明細書）の
ＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ断片（マウスのＢ細胞分化因子の
遺伝子の全コーディング領域を含んでいる）をプローブ
として以下に述べるようにして得ることができる。尚、
プラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３が導入されている
大腸菌（ＨＢ１０１／ｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３）は、
ＳＢＭ２８５と命名され、微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８８
２８の受託番号を得て寄託されている。 【００１２】先ず、ヒト染色体ＤＮＡに、マウスのＢ細
胞分化因子遺伝子とハイブリダイズする配列が存在する
かどうかを確かめるため、例えば正常ヒト胎盤細胞より
抽出したＤＮＡをＰｖｕIIあるいはＰｓｔＩで消化し、
上記のプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３のＢａｍＨ
Ｉ−ＡｃｃＩ断片をニックトランスレイション法により
32Ｐでラベル後、これをプローブとしてサザーンブロッ
トハイブリダイゼイション（Southern blot hybridizat
ion ）を行う。ヒト胎盤からのＤＮＡをＰｖｕIIで消化
した場合は３．０kbのＤＮＡ断片が、またＰｓｔＩで消
化した場合は４．１kbのＤＮＡ断片が上記プローブとハ
イブリダイズすることが認められ、ヒト染色体にマウス
のＢ細胞分化因子遺伝子と類似の配列をもつＤＮＡが存
在することが確認される。この結果は、上記のプローブ
を用いてヒトのＢＣＤＦ ｃＤＮＡをクローニングでき
ることを示すものである。 【００１３】次に上記知見をもとにヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡライブラリーを調製する。先ず、Maeda, M. ら（J.
Exp.Med., 162 , 2169 (1985))によって確立されている
ヒトＴ細胞株ＡＴＬ−２の培養細胞から常法（Nikaido,
T. ら、Nature, 311 , 631(1984)) に従い、ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡを調製し、ｐＣＤベクターを用いるOkay
ama-Berg法（Okayama, H. 及びBerg, P., Mol.cell.Bio
l., ３, 280 (1983)) に準じ、ｃＤＮＡライブラリーを
調製する。 【００１４】次にこのｃＤＮＡライブラリーをいくつか
の群に分け、それらからプラスミドＤＮＡを分離し、Ｓ
ａｌＩまたはＢａｍＨＩで消化したのち、上記のプロー
ブ（ 32ＰでラベルされたＢａｍＨＩ−ＡｃｃＩ ＤＮＡ
断片）とサザーンブロットハイブリダイゼイション（So
uthern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)) を行
い、マウスのＢ細胞分化因子の遺伝子とハイブリダイズ
するＤＮＡ断片をもつ群を選択する。続いて、ポジティ
ブとなった群の各クローンについて、上記のプローブを
用いて同様にサザーンブロットハイブリダイゼイション
を行うことにより、上記プローブとハイブリダイズする
クローンを選択する。 【００１５】このポジティブなクローンには、ヒトＢＣ
ＤＦのｃＤＮＡ遺伝子をもつプラスミドが含まれている
と考えられる。このようにして得られるポジティブなク
ローンの一つ（ｐｈ−ＩＬ−５−３０）がもつプラスミ
ドはｐＣＤＶＴＲＦと命名され、またそのプラスミドを
大腸菌ＨＢ１０１株へ導入した形質転換体（ＨＢ１０１
／ｐＣＤＶＴＲＦ）はＳＢＭ２８６と命名され、微工研
にＦＥＲＭ ＢＰ−１１７１の受託番号を得て寄託され
ている。次にポジティブなクローンのプラスミドについ
て、制限酵素解析および上記プローブとのハイブリダイ
ゼーションにより、確かにマウスＢ細胞分化因子遺伝子
と類似したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡがクローン化されて
いることを確認し、以下に記すようにそのＤＮＡの塩基
配列を決定するとともに、そのＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活
性を有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子で
あるかを調べる。 【００１６】先ず、常法に従いそのクローンのプラスミ
ド（例えば、ｐｈ−ＩＬ−５−３０）の制限酵素切断マ
ップを調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５に挿入されているｃＤ
ＮＡ（ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ遺伝子を含む）を一旦ｐ
ＵＣ１８等の適当なプラスミドのＢａｍＨＩサイトにク
ローニングしなおし、ジデオキシ法（Sanger, F.ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))に従って、
上記ｃＤＮＡの塩基配列をきめる。本発明者らの実験に
よれば、上記方法によって、ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡを
含む図１のｃＤＮＡ塩基配列が得られた。 【００１７】ヒトＢ細胞分化因子をコードする領域の決
定 上記で得られたｃＤＮＡ塩基配列にヒトＢ細胞分化因子
をコードする領域が含まれることは、次のようにして決
定した。即ち、この塩基配列のオープンリーディングフ
レームを探すとともに、既に本発明者らによって決定さ
れているマウスＢ細胞分化因子遺伝子の塩基配列と比較
することにより、ヒトＢ細胞分化因子（ヒトＢＣＤＦ）
ポリペプチドをコードする領域とアミノ酸配列を決定す
る（図２）。そして、そのコーディング領域のアミノ酸
配列およびヒトＢＣＤＦが細胞外に分泌される蛋白質で
あることから、ヒトＢＣＤＦの前駆体ポリペプチドは、
Ｎ末端側に１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチド
（リーダー配列）を含む１３４個のアミノ酸からなるポ
リペプチドであることが分かった（図３参照）。即ち、
図３のアミノ酸配列のうち２０〜１３４番目が成熟ヒト
ＢＣＤＦポリペプチドである。 【００１８】前駆体のアミノ酸配列中には、２ヵ所Ｎ−
グリコシル化可能部位（４７番および９０番のＡｓｎ）
および後述するとおり少なくとも１ケ所のＯ−グリコシ
ル化可能部位（２２番のＴｈｒ）があり、ここに糖鎖が
付加されることを考えると、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポ
リペプチドの計算分子量（１３，１４９）は、既に報告
されているヒトＢＣＤＦＩ（糖鎖が付加されている）の
分子量（約２０，０００）と矛盾は無い。尚、図３に示
すポリペプチドのＮ末端のＭｅｔ（メチオニン）は、翻
訳後の修理過程（post translational modification pr
ocess ）で、フォルミル化やアセチル化されることがあ
り、またＭｅｔが取り除かれたりすることもある。ま
た、上記の成熟ヒトＢＣＤＦポリペプチドのＮ末端のア
ミノ酸も同様な過程でアセチル化されることがある。 【００１９】一方、前記のプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−
３０に挿入されているｃＤＮＡ、即ち上記の如く同定し
たＤＮＡがヒトＢＣＤＦ活性を有する蛋白質（ポリペプ
チド）を生産する遺伝子であることは当該遺伝子を組み
込んだ発現ベクターによって形質転換された宿主細胞が
産生する蛋白質の活性を測定することによって知ること
ができるが、また以下のようにしても調べられる。 【００２０】即ち、先ずプラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３
０に挿入されているヒトＢＣＤＦｃＤＮＡ全部を含むＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐＳＰ６４ベクターに再クロー
ンする。ｐＳＰ６４は、挿入された外来遺伝子がＳＰ６
プロモーター支配下にのみ発現されうるように改良され
たベクターであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＰ６ＲＮＡポ
リメラーゼ存在下に挿入された外来遺伝子のｍＲＮＡを
合成することができる（Krieg, P.A. およびMelton, D.
A., Nucl.Acid.Res., 12, 7057 (1984) 、およびKonars
ka, M.M.ら、Cell, 38, 731 (1984)) 。 【００２１】次にこのようにして、上記のｃＤＮＡから
ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製されるｍＲＮＡ溶液を、アフリ
カツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏｃｙ
ｔｅ）に注射して培養し、培養上清に分泌されてくるｍ
ＲＮＡからの翻訳産物（蛋白質）のＢＣＤＦ活性を測定
する。ヒトＢＣＤＦ（特にヒトＢＣＤＦＩ）活性は、既
に記載したように、Staphylococcus aureus Cowan Ｉ
（ＳＡＣ）で刺激したヒトＢ細胞のＩｇＭ産生誘導能を
コントロールと比較して調べることにより測定される。
このようにして上記のｃＤＮＡが、ヒトＢＣＤＦ活性を
有する蛋白質（ポリペプチド）を生産する遺伝子である
ことが確かめられるとともに、本発明のＤＮＡによる特
許請求の範囲に示すようなヒトＢＣＤＦポリペプチドの
大量生産の可能性を示す。 【００２２】ヒトＢＣＤＦの発現 本発明によれば、上記のようにして調製された、遺伝子
配列を使用することにより、ヒトＢＣＤＦを製造するこ
とが可能である。例えば、ヒトＢＣＤＦをコードする遺
伝子としてｃＤＮＡを使用する場合には、ｃＤＮＡの
５′側上流に適当な他のプロモーター（例えばＳＶ４０
由来のプロモーター）を挿入した発現ベクターを造成
し、適当な細胞（例えば、酵母細胞、大腸菌細胞、或い
はＣＯＳ−Ｉ細胞やＣＨＯ細胞等の動物細胞）でヒトＢ
細胞を分化させる蛋白質をつくることもできる。この場
合、前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ領域を用いること
が好ましいが、成熟形蛋白質（ポリペフチド）をコード
するｃＤＮＡ領域を用いてもよい。また、当該蛋白質を
コードするＤＮＡの直近の５′上流に、適当な制限酵素
（例えばＨｉｎｄIII ）切断部位を適当な方法、例えば
部位特異的ミュータジェネシス（site directed mutage
nesis ）法を用いて設けておくと外来プロモーターの導
入が容易である。 【００２３】本発明によれば、ｃＤＮＡを用いる代わり
に、ヒト染色体からイントロンを含むヒトＢＣＤＦ遺伝
子を調製し、これを用いて、上記と同様にしてヒトＢ細
胞を分化する蛋白質を製造することもできる。即ち、ヒ
トＢＣＤＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を上記ｃＤＮＡをプ
ローブとして、適当なヒト遺伝子ライブラリー（例え
ば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のヒト遺伝子ラ
イブラリー）から分離し、次にｃＤＮＡの場合と同様、
ヒトＢＣＤＦをコードするＤＮＡ領域の５′上流に適当
なプロモーターを挿入した発現ベクターを造成し、この
発現ベクターによって形質転換あるいはトランスフェク
ションされた細胞を培養することにより、ヒトＢＣＤＦ
を効率よく製造することができる。 【００２４】この場合の宿主細胞は、好ましくはスプラ
イス能力のある細胞が使用される。特に動物細胞が好ま
しい。なお、ヒト染色体由来のＢＣＤＦ遺伝子が組み込
まれた発現ベクター（ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅ）が導入されている大腸菌（ＨＢ１０１／ｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ）は、ＳＢＭ ２９３と命名さ
れ、微工研に国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７７を
得て寄託されている。 【００２５】組換えヒトＢＣＤＦの精製 上記のようにして造成された動物細胞が産生する組換え
ヒトＢＣＤＦは、適当な方法、例えばモノクローナル抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾
過、逆相高速液体クロマトグラフィーなどによって精製
することができる。本発明者らは、このようにして精製
・純化された組換えヒトＢＣＤＦを、アミノ酸配列分析
や電気泳動分析にかけ、このアミノ酸配列分析の結果お
よびヒトＢＣＤＦをコードする遺伝子の塩基配列からの
推定（例えば図２参照）に基づいて、成熟型ヒトＢＣＤ
Ｆのポリペフチド部分の構造は、前記のとおり図３の第
２０番のＩｌｅから第１３４番のＳｅｒまでの配列を有
することを明らかにすると共に、その２次元的配列の推
定も行った（図１６）。以下、実施例をもって本発明を
説明する。 【００２６】 【実施例】 （１）ヒトＢＣＤＦ遺伝子の確認 先に、本発明者らは、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の産生
を司る遺伝子、即ちＤＮＡ配列を同定した（特願昭６１
−１５７２２７号明細書）。そしてこの遺伝子によって
産生されるマウスＴＲＦは、ＴＲＦ活性〔１）マウス慢
性Ｂ白血病細胞（ＢＣＬ1 ）をＩｇＭ抗体産生細胞に分
化させる活性、２）抗原（ＤＮＰ−ＫＬＨ）感作させた
マウス脾臓内Ｂ細胞を抗原（ＤＮＰ−オバルブミン）で
刺激し、特異的抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＧ）産生細胞に分
化させる活性、３）ｉｎ ｖｉｖｏで活性化したＢ細胞
ブラストのＩｇＭ合成誘導活性〕およびＢＣＧＦII活性
〔１）ＢＣＬ1 細胞の分裂促進、２）デキストラン硫酸
刺激休止Ｂ細胞の分裂促進〕をもっていることを明らか
にした。 【００２７】マウスＴＲＦ ｍＲＮＡに相補するｃＤＮ
Ａを含むプラスミドｐＳＰ６Ｋ−ｍＴＲＦ２３をＢａｍ
ＨＩおよびＡｃｃＩで消化して、６５４bpよりなるＢａ
ｍＨＩ−ＡｃｃＩフラグメントを分離した。マウスＢＣ
ＤＦ（ＴＲＦ）の全コーディング領域を含んでいる、こ
のフラグメントをニックトランスレイションによって 32
Ｐでラベルしたものをプローブにしてヒト染色体ＤＮＡ
のサザンブロットハイブリダイゼーションを常法（Sout
hern, E.M., J.Mol.Biol., 98, 503 (1975))に従って
行った。 【００２８】ヒト染色体ＤＮＡは正常ヒト胎盤よりYaoi
ta, Y.およびHonjo, T. (Biomed.Res., １, 164 (198
0)) に準じて抽出したのち、各々２μｇをＰｖｕIIまた
はＰｓｔＩで消化してサザンブロットハイブリダイゼー
ションのために０．６％アガロースゲルで電気泳動し
た。泳動後、ゲル中のＤＮＡはニトロセルロースフィル
ター（Schleicher & Schuel (Dassel)) に移し上記のプ
ローブとハイブリダイズさせた。 【００２９】洗浄条件を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃ（ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍクエ
ン酸ナトリウム）、５０℃、４５分で行うと、ＰｖｕII
で消化した場合には３．０kbのＤＮＡフラグメントが、
そしてＰｓｔＩで消化した場合には４．１kbのＤＮＡフ
ラグメントがマウスＢＣＤＦプローブとハイブリダイズ
することが判明した。このプローブは、マウス染色体Ｄ
ＮＡのフラグメントには、よりストリンジェント（ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔ）な条件でもハイブリダイズすることよ
り、ヒト染色体ＤＮＡ中にマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃ
ＤＮＡと全く同一ではないが相同性の高い配列があるこ
とが判明し、このプローブを用いてヒトＢＣＤＦのｃＤ
ＮＡクローンのスクリーニングが可能であると判断し
た。 【００３０】（２）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡクローンの
分離 ヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡライブラリーは下記の如く作成
した。M.Maeda ら（J.Exp.Med., 162 , 2169 (1985))が
成人性Ｔ細胞白血病患者の血液より樹立したヒトＴ細胞
株ＡＴＬ−２をＲＰＭＩ １６４０＋１０％牛胎児血清
の培地中、３７℃、５％ＣＯ2 中で培養して細胞を集め
た。この細胞より常法（Nikaido, T. ら、Nature, 311
, 631 (1984)) に従い、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを調製し
た。このポリ（Ａ）+ ＲＮＡ ３μｇを用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成したが、方法はｐＣＤベクターを用
いるOkayama-Berg法（Okayama, H. およびBerg, P., Mo
l.Cell.Biol., ３, 280 (1983)) に準じ、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株）の形質転換体として２×１０
5 個の独立のｃＤＮＡクローンを得た。 【００３１】この２×１０5 個のｃＤＮＡクローン中に
ヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するｃＤＮＡが存在するかど
うかを調べるため、全形質転換体の混合物からプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各々２μｇのＤＮＡをＳａｌＩまた
はＢａｍＨＩで消化し、上記の方法によりサザンブロッ
トハイブリダイゼーションを行った。その結果、ｐＣＤ
ベクターに１カットを入れるＳａｌＩ消化では４．１kb
のＤＮＡフラグメントがハイブリダイズし、これに対し
てインサートされたｃＤＮＡのほぼ両端の位置で切断す
るＢａｍＨＩ消化では１．０kbのＤＮＡフラグメントが
ハイブリダイズすることが判った。 【００３２】これらの結果からｃＤＮＡライブラリー中
にヒトＢＣＤＦ遺伝子に相当するＤＮＡ配列を持つクロ
ーンが含まれていることが示唆された。そこで前記マウ
スのプローブを用いて上記の２×１０5 個のｃＤＮＡク
ローンを常法のコロニーハイブリダイゼイション（Hana
han, D. およびMeserlson M., Gene, 10, 63 (1980))に
準じてスクリーニングした。スクリーニングの結果２９
クローンがマウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）ｃＤＮＡプローブ
とハイブリダイズし、この２９クローンのプラスミドＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼ切断マップおよびエンドヌク
レアーゼで消化したＤＮＡフラグメントの上記プローブ
を用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、この２
９クローンは全て同一と判断された。 【００３３】（３）ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡの塩基配列
決定およびヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのポリペプチドのア
ミノ酸配列 上記２９クローンのうちの一つｐｈ−ＩＬ−５−３０を
更に詳細に調べた。制限エンドヌクレアーゼ切断マップ
を常法に従い調べた後、ｐｈ−ＩＬ−５−３０に挿入さ
れたｃＤＮＡを一旦ｐＵＣ１８プラスミドのＢａｍＨＩ
サイトにサブクローニングし、ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を
常法に従いジデオキシ法（Sanger, F.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA, 74, 5463 (1977))によって決定した。そ
の結果、挿入されたｃＤＮＡはポリＡテールを除く８１
６の塩基対よりなることが判った。 【００３４】この結果とマウスのＢＣＤＦ（ＴＲＦ）の
ＤＮＡ配列を比較することによってヒトＢＣＤＦのコー
ディング領域を決定し、ヒトＢＣＤＦの前駆体が１３４
個のアミノ酸からなると決定された。ヒトＢＣＤＦはＴ
細胞外に分泌されるためにこの１３４個のアミノ酸配列
中、Ｎ末端配列にシグナル配列を含むことが予想され、
成熟したヒトＢＣＤＦは上記１３４個のアミノ酸配列中
２０番目のアミノ酸から１３４番目までのアミノ酸より
なるポリペプチドを含む分子であると考えられる。 【００３５】このアミノ酸配列中には、２ヵ所のＮ−グ
リコシル化可能部位（図３中、４７番および９０番のＡ
ｓｎ）および少なくとも１ケ所のＯ−グリコシル化可能
部位（図３中、２２番目のＴｈｒ）があり、この付加の
可能性のある糖の分子量とポリペプチドの分子量（２０
番〜１３４番のポリペプチドで１３，１４９）を加算す
ると、ＢＣＤＦＩの分子量として報告されている２０，
０００に矛盾しない。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）と比較
すると、前駆体ではヒトＢＣＤＦのアミノ酸数は一つ多
い。ヒトＢＣＤＦの二個所のＮ−グリコシル化の可能サ
イトはマウスＢＣＤＦの１番目と３番目のＮ−グリコシ
ル化可能サイトと一致する。マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）
中の三つのシステイン残基のうち、Ｃ末端側の二つのシ
ステイン残基はヒトＢＣＤＦにおいても保存されてい
る。マウスおよびヒトのＢＣＤＦのコーディング領域の
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は各々７８％および７
０％の相同性を持つ。 【００３６】ｐｈ−ＩＬ−５−３０のＰｓｔＩフラグメ
ント（５１５bp）をニックトランスレイションによって
32Ｐでラベルしたものをプローブに用いて前記のヒト染
色体ＤＮＡのＰｖｕIIまたはＰｓｔＩで消化したＤＮＡ
フラグメントについて前記のとおりサザンブロットハイ
ブリダイゼーションを行った結果、マウスＢＣＤＦプロ
ーブを用いた時と同様、それぞれ４．１kbおよび３．０
kbのフラグメントとハイブリダイズした。ヒトのプロー
ブを用いた場合、洗浄条件を０．１×ＳＳＣ−０．１％
ＳＤＳ、６５℃、４５分というストリンジェントな条件
にしても充分なハイブリダイズがなされた。 【００３７】また、このヒトのプローブを用いてＡＴＬ
−２ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを常法に従い（Thomas, D.D.,
Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77, 5201 (1980))、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーションを行った結果１．０
kbのただ１本のバンドを認めた。このことは、本発明者
らが同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がヒト染色体ＤＮＡ配
列中、マウスＢＣＤＦ（ＴＲＦ）遺伝子に特異的な相同
遺伝子であること、またこのヒトＢＣＤＦ遺伝子からは
ただ一種類のｍＲＮＡのみしか翻訳されていないことを
示している。 【００３８】（４）ヒトＢＣＤＦ活性の測定 上記のようにして同定したヒトＢＣＤＦ遺伝子がその生
産を支配しているポリペプチドあるいはそのポリペプチ
ドよりなる物質にヒトＢＣＤＦＩ活性があることを以下
の方法で確認した。プラスミドｐｈ−ＩＬ−５−３０の
ヒトＢＣＤＦｃＤＮＡインサート全部と小部分のベクタ
ーＤＮＡを含むＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントをｐＳ
Ｐ６４ベクターに再クローンした。このプラスミドをＳ
ａｌＩで消化した後、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用い
てｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを合成させた（Krieg,
P.A. およびMelton, D.A., Nucleic Acid Res., 12, 7
057 (1984) ；およびKonarska, M.M.ら、Cell, 38, 731
(1984)) 。 【００３９】このようにして調製したｍＲＮＡ溶液をア
フリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞（ｏｏ
ｃｙｔｅ）に注射し、２０℃４８時間培養後、培養液中
に分泌された生成物を集めて遠心分離して、その上清を
濃縮装置（Centricon 10；Amicon社製）で４倍に濃縮し
たものをヒト・リコンビナントＢＣＤＦとして、以下の
実験に用いた。このヒト・リコンビナントＢＣＤＦがＢ
ＣＤＦＩ活性を持つか否かをＳＡＣで刺激したヒトＢ細
胞のＩｇＭ産生誘導能で調べた。ヒトＢ細胞に富むフラ
クションを正常ヒト血液からSaiki, O. およびRalph,
P., Eur.J.Immunol., 13, 31 (1984))に準じて調製
し、１×１０5 細胞／１００μｌの細胞をＳＡＣ（０．
００１〜０．００２５％）で刺激した。次いで上記ヒト
・リコンビナントＢＣＤＦを１５％濃度になるよう添加
し、３７℃、５％ＣＯ 2 下、６日間培養した。 【００４０】培養上清中のＩｇＭ量をエンザイムイムノ
アッセイキットで測定したところ、１１０ng／ウェルの
値が認められ、コントロールが約５０ng／ウェルであっ
たのに対し、有意にＩｇＭ産生が誘導された。この誘導
はＩＬ−２（５０ｕ／ml）添加によって１３５ng／ウェ
ルまで増強された。コントロールにもＩｇＭ産生が認め
られたのは、完全にＴ細胞を含まないＢ細胞フラクショ
ンを得ることが困難なためと考えられる。 【００４１】（５）ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の単離・
同定 既に、実施例（１）で正常ヒト胎盤細胞の染色体にヒト
ＢＣＤＦ遺伝子の存在を認めていたが、ここでは別の供
給源からヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を単離した。即ち、
その供給源として、ヒト胎児肝臓ＤＮＡのＡｌｕＩ−Ｈ
ａｅIII 部分消化断片を持つシャロン４Ａファージライ
ブラリー（Maniatis, T.ら、Cell, 15,687-702(197
8))、ヒト胎盤ＤＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片をもつ
シャロン４Ａファージライブラリー（Yaoita, Y.および
Honjo, T., Biomed.Res.１, 164(1980) に準じて作製）
およびヒトＩｇＥ産生ミエローマ細胞株２６６Ｂ１のＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ部分消化断片を持つシャロン４Ａファ
ージライブラリー（Nishida, Y. ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA, 79, 3833-3837(1982))を選んだ。 【００４２】次に、この３種のライブラリーを用いて、
既述のヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断
片（５１５bp）をプローブとしてファージのスクリーニ
ングを、ベクトンおよびデービス（Becton, W.D.および
Davis, R.W., Science, 196, 180-182(1977))の方法に
準じて行った。胎児肝臓、胎盤及びミエローマの各々の
ライブラリーより各５×１０5 個のファージプラークを
スクリーニングしてプローブとハイブリダイズする３個
のクローンλ１２（胎児肝臓ライブラリーより）、λ２
２（胎盤ライブラリーより）およびλ３８（ミエローマ
ライブラリーより）を得た。 【００４３】続いて、この３個のクローンの制限エンド
ヌクレアーゼ切断地図を常法に従い作製し、ヒトＢＣＤ
Ｆ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片をプローブとし
て用いたサザンブロットハイブリダイゼーション（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）分析した。分析のストラテジーおよびヒトＢＣＤＦ
遺伝子の構成を図４に示すが、図中Ｅ，ＨおよびＢは各
々ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩによる切
断部位を示し、黒ボックス部はエクソン領域を示す。こ
の分析の結果によれば、これら３個のクローンのインサ
ートは互いにオーバーラップしており、図４に示す各ク
ローンに共通の３．２kb ＢａｍＨＩ断片のみが上記の
プローブとハイブリダイズした。従ってこの３．２kb
ＢａｍＨＩ断片にヒトＢＣＤＦをコードする全てのエク
ソンが含まれていると考え、この３．２kb ＢａｍＨＩ
断片を分離し、ＨｉｎｄIII で消化後２つになった１．
６kb断片の各々をｐＵＣ１８ベクターにサブクローニン
グした。 【００４４】次いで、Yanisch-Perron, C.ら（Gene, 3
3, 103-119(1985))に従い、上で得られた２個の１．６k
b断片をクローンしたプラスミドの各々を両端からエク
ソヌクレアーゼIII 及びVII で消化して、ユニディレク
ショナルディリーション（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａ
ｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）ミュータントクローンのシリー
ズを作製した。このミュータントプラスミドのインサー
トのヌクレオチド配列は、常法（Sanger, F.ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA, 74, 5463-5469(1977) に従い、ジデ
オキシチェインターミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃ
ｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法によって決定し
た。 【００４５】ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子の制限エンドヌ
クレアーゼ地図及び４個のエクソンと３個のイントロン
の配置（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）も、ヌクレオチド
配列分析のストラテジーと共に図４に示す。また、実際
のヒトＢＣＤＦ遺伝子を含むＢａｍＨＩ ３．２kb断片
のヌクレオチド配列を図５〜図９に示す。ここで明らか
になったヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子上のエクソン部分の
ヌクレオチド配列は、先に明らかにしたヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と完全に一致した。 【００４６】上記の結果から、染色体遺伝子において、
第１エクソンは、ヒトＢＣＤＦ前駆体ポリペプチド鎖の
Ｎ末端側の第１アミノ酸（Ｍｅｔ）から第４８アミノ酸
（Ｇｌｕ）迄を、第２エクソンは第４９アミノ酸（Ｔｈ
ｒ）から第５９アミノ酸（Ａｓｎ）迄を、第３エクソン
は第６０アミノ酸（Ｈｉｓ）から第１０２アミノ酸（Ｌ
ｙｓ）迄を、そして第４エクソンは第１０３アミノ酸
（Ｌｙｓ）から第１３４アミノ酸（Ｓｅｒ）迄をそれぞ
れコードしていることが分かった。 【００４７】（６）ヒトＢＣＤＦ発現ベクターの造成 実施例（２）で取得したヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡおよび
実施例（５）で取得したヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子を用
いて、次の４種類の動物細胞発現ベクターを作製した。 ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ 【００４８】Ａ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよ
びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒの作製
（図１０） 実施例（２）で、オカヤマ−ベルグ法（Okayama, H. お
よびBerg, P., Mol.Cell Biol., ３，280(1983))に従
い、ｐＣＤベクターにｃＤＮＡをクローニングし、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１形質転換クローンｐｈ−ＩＬ−５
−３０を得た。このクローンよりプラスミドを分離し、
ＢａｍＨＩ消化およびＰｓｔＩでの部分消化を行い、ヒ
トＢＣＤＦの全コーディング領域を含むｃＤＮＡである
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａを得た。 【００４９】次いで、ヒトＢＣＤＦコーディング領域の
直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトを導入する目的
で、図１１に示すヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列
中の２重下線を引いた部位で、同図に示す配列と逆方向
のＤＮＡストランドとハイブリダイズする３０ｍｅｒの
オリゴヌクレオチド：５′−GCAGAACGTTTCAAGCTTATGAGG
ATGCTT−３′（下線部のＡＡＧＣＴＴはＨｉｎｄIII 切
断配列を示す）を用いて常法（Messing, J. in Methods
in Enzymology, vol. 101 Part C, pp62-65 (Academic
Press, Ed. Wu, R.））に従い、部位特異的ミュータジ
ェネシスを行い、クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５
ｃＤＮＡ（ＨｉｎｄIII ）を得た。 【００５０】このファージＤＮＡをＨｉｎｄIII で消化
し、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域に相当するｃＤ
ＮＡを含むＨｉｎｄIII 断片をベクターｐｄＫＣＲ（Ni
kaido, T. ら、Nature, 311, 631−635 (1984)：ｐｄＫ
ＣＲベクターはｐＫＣＲベクターのｐＢＲ３２２部分が
ｐＢＲ３２７に置換したベクターである）のＨｉｎｄII
I サイトに正しい方向に導入し、発現ベクターｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５−ｃＤＮＡを作製した。 【００５１】次に、この発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡのＳａｌＩサイトにジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ：ｄｈｆｒ）遺伝子発現ユニットを導入する目的
で、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡプラスミドをＳａ
ｌＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を粘
着末端とした。ｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットは、ｐＳＶ
2 ｄｈｆｒ（ＢＲＬ Ｉｎｃ．）のＰｖｕIIサイトにＢ
ａｍＨＩリンカーを付加したプラスミドｐＳＶ2ｄｈｆ
ｒ−ＢＬを作製し、これをＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで切断部位を粘着末端として、ｄｈｆ
ｒ遺伝子発現ユニット断片を分離した。この断片を先に
得た１カットの入ったｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ
に連結して、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｄｈｆｒを作製
した。 【００５２】Ｂ）ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ及び
ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５−ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒの作製
（図１２） 実施例（５）で得たヒトＢＣＤＦ遺伝子を有するファー
ジクローンλ１２から、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺
伝子領域を含む３．２kbＢａｍＨＩ断片を分離してｐＵ
Ｃ１８ベクターにサブクローニングし、形質転換体ｐＵ
Ｃ１８−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅを得た。この形質転換体の
プラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、ヒト
ＢＣＤＦをコードする全遺伝子領域を含むＢａｍＨＩ−
ＰｓｔＩ断片（２．２kb）を得た。この断片をファージ
Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩサイト間
にクローニングし、Ｍ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅを得た。 【００５３】次いで、前記Ａ）と同様に、部位特異的ミ
ュータジェネシスを行い、ヒトＢＣＤＦコーディング領
域の直近の５′上流にＨｉｎｄIII サイトが導入された
クローンＭ１３ｍｐ１９−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ（Ｈｉｎ
ｄIII ）を得た。このファージＤＮＡをＢａｍＨＩとＰ
ｓｔＩで消化し、ヒトＢＣＤＦ遺伝子をｐＵＣ１９にサ
ブクローニングして得たプラスミドｐＵＣ１９−ｈＩＬ
−５ｇｅｎｅ（ＨｉｎｄIII ）を更にＨｉｎｄIII で部
分的に消化して、ヒトＢＣＤＦをコードする全遺伝子領
域をベクターｐｄＫＣＲのＨｉｎｄIII サイトに正しい
方向で導入して、発現ベクターｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｇｅｎｅを作製した。 【００５４】次いでこの発現ベクターのＮｒｕＩサイト
にｄｈｆｒ遺伝子発現ユニットを導入する目的でｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅプラスミドをＮｒｕＩで消化
し、生成した粘着末端に前記Ａ）で得られたｄｈｆｒ遺
伝子発現ユニット断片を連結させて、ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒを作製した。以上で作製した
４種の発現ベクターは、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉ
ｒｕｓ４０）アーリープロモーターによりヒトＢＣＤＦ
およびｄｈｆｒの発現が司られており、また、ＳＶ４０
の複製オリジンを含んでいる。さらに、発現量を増強さ
せるため、ヒトＢＣＤＦ ｃＤＮＡ及びヒトＢＣＤＦ遺
伝子共に５′および３′非翻訳領域の不必要な部分が除
去されている。 【００５５】（７） 動物細胞によるヒトＢＣＤＦの発
現 実施例（６）で作製されたヒトＢＣＤＦ発現ベクターを
用いて、ＣＯＳ−Ｉ細胞およびＣＨＯ細胞でヒトＢＣＤ
Ｆの発現を行わせた。動物細胞株ＣＯＳ−Ｉ（サル腎臓
細胞）は、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコの修正
エッセンシャル培地で継代を行い、５０〜７０％コンフ
ルエントの状態の細胞を用いて、Graham, F. L. および
van der Eb, A. J. (Virology, 52, 456−467 (1973)）
に準じて、リン酸カルシウム法でトランスフェクション
を行った。直径１０cmの培養シャーレの細胞当たり各々
１０μｇの、実施例（６）で得られた４種類の発現ベク
ターを使用した。 【００５６】３日間、３７℃、５％ＣＯ2 下で培養を行
い、上清のＢＣＤＦ活性を調べると共に、細胞からFree
man ら（Proc.Natl.Acad.Sci. USA,80,4094 （1983））
に従ってＲＮＡを抽出した。得られたＲＡＮを用いて、
Nambu,J.R.ら（Cell, 35,47-56（1983））に従いノーザ
ンブロット分析を行い（２０μｇＲＮＡ／レーン）、ヒ
トＢＣＤＦｍＲＮＡの発現量を調べた。用いたプローブ
は、ヒトＢＣＤＦの全コーディング領域を含むＭ１３ｍ
ｐ１９−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ（ＨｉｎｄIII ）の、Ｈｉ
ｎｄIII −ＰｓｔＩ断片である。ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞での発現はＣＨＯｄｈｆｒ- 株を
用いて行った。細胞は１０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ
α+ （ＧＩＢＣＯ）で継代をし、上記と同様にトランス
フェクションを行った。用いた発現ベクターはｐｄＫＣ
Ｒ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡ−ｄｈｆｒおよびｐｄＫＣＲ−
ｈＩＬ−５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒである。 【００５７】トランスフェクション後４８時間培養を行
い、weissman, C. (Nucleic AcidsRes. 11, 687 (198
3)) に従い、１０％透析牛胎児血清を含むＭＥＭα
- （ＧＩＢＣＯ）で培養選別後、培養液にメトトレキセ
ート０．１μＭを添加し、更に数日培養を行ってメトト
レキセートに耐性のコロニーを分離し、継代後その上清
のＢＣＤＦ活性を調べた。高発現細胞株を得る目的で、
Simonsen, C.C.およびLevinson, A.D. (Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 80, 2495-2499 (1983)) に従い、継代培養
液に更に高濃度のメトトレキセートを段階的に１mMまで
添加し、ヒトＢＣＤＦ産生細胞株を樹立した。 【００５８】ヒトＢＣＤＦのアッセイ方法は、T cell r
eplacing factor の活性測定方法をとり、Kinashi,T.ら
（Nature,324,70-73（1986））にしたがった。アッセイ
に用いた細胞は、ＢＣＬ1 マウス慢性Ｂ白血病細胞（in
vivo 継代株或いはＢＣＬ1クローン５Ｂ1 ｂ（ＡＴＣ
Ｃ ＴＩＢ１９７））であり、この細胞をサンプル希釈
系列と混和し、５×１０-3個／２００μl ずつ９６穴平
底プレート中で４８時間５％ＣＯ2 、３７℃で培養し
た。 【００５９】培地は１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−
１６４０であり、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノ
ール、５０Ｕ／mlのペニシリンＧ、５０μg ／mlのスト
レプトマイシンを含んでいる。４８時間後、細胞を遠心
で集め、ハンクス液で洗浄後、２００μl ／穴に懸濁
し、その半量の１００μl の細胞を用いてプロテインＡ
プラークアッセイをGronowicz,E.ら（Eur.J.Immunol.,
6 ,588-590（1976））に従って行い、ＩｇＭ産生細胞数
を測定した。ＢＣＬ1 細胞がマウス由来であるため、上
記アッセイ法ではヒトＢＣＤＦの測定感度はマウスＢＣ
ＤＦに比して劣る（精製標品を用いた結果では、約１／
１００が、測定可能であった。 【００６０】ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５
ｃＤＮＡ及びｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅの発現ベ
クターでトランスフェクションし、３日後の両細胞のヒ
トＢＣＤＦ ｍＲＮＡをノーザンブロット分析により分
析すると、両者共に１kbに相当する位置にハイブリダイ
ゼーションバンドを認めた。このことはＣＯＳ−Ｉ細胞
中でヒトＢＣＤＦ遺伝子の転写物が正しくスプライスさ
れていることを示した。又ヒトＢＣＤＦ ｍＲＮＡの発
現量は、驚くべきことに、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈ
ＩＬ−５ｇｅｎｅの方がＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩ
Ｌ−５ｃＤＮＡに比して約２０倍高かった。 【００６１】また、ＢＣＤＦ活性を表すプロティンＡ・
プラークアッセイ（ＰＦＣ Ｎｏ．）でも、上記ノーザ
ンブロット分析と同様の傾向が観察された。即ち、両発
現ベクターでトランスフェクションし、３日間培養した
ＣＯＳ−Ｉ細胞の培養上清の２０％と共に培養したＢＣ
Ｌ1 細胞のプラーク形成数を調べたところ表１に示すよ
うに、コントロール（宿主細胞ＣＯＳ−Ｉ）との差で比
較すると、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎ
ｅの方が、ＣＯＳ−Ｉ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮ
Ａより約１７倍も高いプラーク形成数を与えた。 【００６２】 【表１】 【００６３】このことは、ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅの方がｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡによるより
トランスフェクション効率が高いことに起因する可能性
を否定は出来ないが、むしろヒトＢＣＤＦ遺伝子のイン
トロン部分にＳＶ４０プロモータに働く未知の増強機能
が存在していることを示唆している。 【００６４】（８）ヒトＢＣＤＦの精製と物性 ＣＯＳ−Ｉ細胞をｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅでト
ランスフェクションし、３日間後の培養液６４０ｍl
（直径１０ｃｍの培養シャーレ６４枚分）よりヒトＢＣ
ＤＦの精製を行った。培養液を遠心後、上清をラット抗
マウスＢＣＤＦ（ＩＬ−５）モノクローナル抗体を担体
セルロファイン（チッソ（株））に結合させたアフィニ
ティーカラム（３mlベッド要領）にかけ、ヒトＢＣＤＦ
をカラムに吸着させた（ヒトＢＣＤＦによるＢＣＬ1 細
胞のＩｇＭ産生細胞への変換は、抗マウスＢＣＤＦ抗体
により完全に抑制されたので、本アフィニティーカラム
を精製に使用した）。 【００６５】次いでこのカラムを次の順序に従って洗浄
した。 １Ｍ ＮａＣｌ ５０ml、 ０．５％ ＮＰ−４０，５０ml、 ＰＢＳ（ph７．２），５０ml、 Ｈ2 Ｏ，５０ml。 【００６６】次に、４mlの１Ｍ酢酸を使って吸着された
ヒトＢＣＤＦを溶出し、溶出液をスピードバックコンセ
ントレーターによって１００μl まで濃縮した。この濃
縮液をSuperose１２カラム（ファルマシア）を２連結し
たＨＰＬＣにかけ、ゲル濾過による精製を行った。カラ
ムは予め、ＰＢＳ（pH７．２）で平衡化を行い、同じ緩
衝液で溶出した（流速０．３ml／分）。溶出液をＯＤ
210 とバイオアッセイでモニターし、活性画分を分子量
４０Ｋ付近に回収した。その溶出パターンを図１３に示
す。図中、斜線部分はＢＣＤＦ活性を有する画分を示
し、実線は蛋白質を、点線はＢＣＤＦ活性を各々示し、
矢印は標準分子量蛋白質（分子量マーカー）の溶出位置
を示す。 【００６７】この活性画分をセンシューパックＶＰ−３
０４−１２５１（センシュー科学、プロテインＣ4 に相
当）による逆相ＨＰＬＣにかけた。吸着されたヒトＢＣ
ＤＦを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）存在下、溶
出液のアセトニトリル濃度を０％から８０％に直線的に
上昇させることにより溶出した（流速０．５ml／分）。
その溶出パターンを図１４に示す。図中、斜線部分は、
ＢＣＤＦ活性を有する画分を示し、点線はアセトニトリ
ルの濃度を示す。精製されたヒトＢＣＤＦはアセトニト
リル５５％付近の溶出位置に回収された。収量は約３μ
ｇであった。 【００６８】こうして、精製されたヒトＢＣＤＦについ
て、０．１５μｇ／５０μｌ／レーンでＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量測定を行った。
その泳動パターンを図１５に示す。図中、４）は分子量
マーカーのレーンであり、１）〜３）のレーンには次の
処理を行った精製ヒトＢＣＤＦを泳動させた。 １）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール及
び熱による処理をしていない、 ２）精製直後のサンプル、２−メルカプトエタノール処
理を行い、熱処理はしていない、 ３）精製後溶出液中で、４℃２週間保存したサンプル、
２−メルカプトエタノール及び熱による処理をしていな
い、 【００６９】図１５に示すとおり、２−メルカプトエタ
ノール処理及び熱処理をしないヒトＢＣＤＦサンプルで
はゲル濾過の結果と一致して約４０Ｋの単一バンドを示
したが、このサンプルを２−メルカプトエタノール処理
をすると（熱処理はしない）、ゲル上の分子量は約２０
Ｋの単一バンドとなった。また、溶出液（０．１％ＴＦ
Ａ、約５５％アセトニトリル）中、４℃で２週間保持し
た後にも酸化的条件にもかかわらずゲル上の分子量は約
２０Ｋの単一バンドとなった。このことは活性体のヒト
ＢＣＤＦが単量体の分子量約２０Ｋよりなる２量体（分
子量約４０Ｋ）であることを示す。 【００７０】精製したヒトＢＣＤＦの２μｇ（単量体と
して約１００ｐｍｏｌｅ）を使い、Ｎ末端アミノ酸配列
の決定をHewick, R. M. ら（J. Biol. Chem., 256, 799
0-7997（1981））に準じて、ガス−フェイズプロテイン
シークエンサーを用いて行った。各サイクルで得られた
フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を逆相系
ＨＰＬＣで分析し、Ｎ末端より２７番目のアミノ酸迄の
配列を第２表に示すとおり決定した。 【００７１】 【表２】 【００７２】この結果は、実施例（３）で示したヒトＢ
ＣＤＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から予想した１３
４個のアミノ酸からなるヒトＢＣＤＦ前駆体は、動物細
胞からの分泌時にＮ末端より１９番目のアミノ酸である
アラニンのＣ末端でリーダー配列が切断され（図３）、
ＣＯＳ−Ｉ細胞あるいはおそらくそのナチュラルなソー
スであるＴ細胞からは、イソロイシンをＮ末端アミノ酸
に持ち、単量体が１１５個のアミノ酸からなる２量体の
糖蛋白質として分泌されることを示すものである。 【００７３】なお、７番目、１４番目および２０番目に
スレオニン（Ｔｈｒ）が検出されたにもかかわらず、塩
基配列からスレオニンと判断される３番目のアミノ酸が
検出されなかったことは、この３番目のアミノ酸残基に
糖鎖が付加されていることを強く示している。この糖鎖
はＯ−グリコシド結合で付加していると考えられる。以
上よりＣＯＳ−Ｉ細胞によって発現された成熟した組換
え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ヒトＢＣＤＦの性質を次
に示すが、単量体のアミノ酸配列の推定された２次元的
配列を図１６に示す。 【００７４】 Ｎ末端アミノ酸配列がイソロイシンよ
り始まる一種類であること、自然状態での分子量は約４
０Ｋであり、２−メルカプトエタノール処理又は０．１
％ＴＦＡ−５５％アセトニトリルでの長時間処理後では
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で約２０Ｋ
を示すことから、ヒトＢＣＤＦのペプチド部分はホモダ
イマーよりなる。 成熟したヒトＢＣＤＦのペプチド部分はイソロイシ
ンから始まる１１５個のアミノ酸よりなり、単量体のペ
プチド部分の分子量は１３，１４９である。 【００７５】 成熟したヒトＢＣＤＦは２量体性の糖
蛋白質である。このことは、成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ
酸配列中Ｎ末端から２８番目及び７１番目のアスパラギ
ンがＮ−グリコシド化を受ける可能性のある配列である
こと、又３番目のスレオニンがアミノ酸配列決定におい
て検出出来なかったことより、Ｏ−グリコシド化を受け
ていると考えられること、単量体の分子量がＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で約２０Ｋであ
り、ペプチド部分の分子量１３，１４９と開きがあるこ
となどから推察される。従って、成熟ヒトＢＣＤＦ単量
体には分子量の合計が約７，０００弱の糖鎖が結合して
いると考えられる。 【００７６】 成熟ヒトＢＣＤＦのアミノ酸配列中、
Ｎ末端から４４番目及び８６番目のシステインの状態は
不明であるが、０．１％ＴＦＡ−５５％アセトニトリル
の長時間処理で酸化条件にもかかわらず、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に相当する
分子量を示すことから、２量体の形成は分子間のＳ−Ｓ
架橋によるものではないと考えられる。しかし、２−メ
ルカプトエタノール処理で速やかにＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動ゲル上で単量体に解離することよ
り、Ｓ−Ｓ架橋が単量体の分子内に存在し、２量体形成
に必要なコンフォメーション保持を司っていることが考
えられる。これらの観察より４４番目のシステインと８
６番目のシステインは分子内架橋を形成しているのでは
ないかと推察される。 【００７７】 ヒトＢＣＤＦ遺伝子の解析から判った
エクソン−イントロン構造より、成熟ヒトＢＣＤＦの第
１アミノ酸（Ｉｌｅ）から第２９アミノ酸（Ｇ１ｕ）迄
が第１エクソン、第３０アミノ酸（Ｔｈｒ）から第４０
アミノ酸（Ａｓｎ）迄が第２エクソン、第４１アミノ酸
（Ｈｉｓ）から第８３アミノ酸（Ｌｙｓ）迄が第３エク
ソン、第８４アミノ酸（Ｌｙｓ）から第１１５アミノ酸
（Ｓｅｒ）が第４エクソンに由来している。 ヒトＢＣＤＦの精製は、ＣＯＳ−Ｉ細胞のトランジ
エント・エクスプレッション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）による培養液６４０mlから出発し
て、純粋なヒトＢＣＤＦを約３μｇ得た。ＣＯＳ−Ｉ細
胞のトランスフォーメーションの効率が約１０-3である
ことを考えると、ＣＨＯ／ｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅ
ｎｅ−ｄｈｆｒ細胞株の発現量はヒトＢＣＤＦの医療等
へのより広範囲の利用を目的とした生産株となり得ると
考えられる。 【００７８】 【発明の効果】本発明によればヒトＢＣＤＦＩ活性を示
す物質をコードするＤＮＡ配列およびそのポリペプチド
部分の構造が明らかにされ、ＤＮＡ組み換え技術を用い
たヒトＢＣＤＦの大量生産の可能性が提供された。本発
明の方法で得られる組換えヒトＢＣＤＦは、感染症や免
疫不全症などの治療に有用な薬剤として、そのまま或い
は薬学的に許容できる担体とともに薬剤組成物として患
者に投与することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、クローン化されたｐｈ−ＩＬ−５−３
０に挿入されているヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ遺伝子を含
むｃＤＮＡの塩基配列図である。 【図２】図２は、図１の塩基配列中のヒトＢＣＤＦポリ
ペプチドをコードする領域を、そのコードするアミノ酸
配列とともに示す図である。 【図３】図３は、図２の下段に示したアミノ酸配列（ヒ
トＢＣＤＦ前駆体のアミノ酸配列）中における、成熟ヒ
トＢＣＤＦポリペプチド部分およびリーダー配列部分を
説明するための図である。 【図４】図４は、ヒトＢＣＤＦ遺伝子の塩基配列解析の
ストラテジーおよび当該遺伝子の構成を示す図である。 【図５】図５は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図６】図６は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図７】図７は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図８】図８は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図９】図９は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図１０】図１０は、ｃＤＮＡ発現ベクターｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃ
ＤＮＡ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。 【図１１】図１１は、ファージＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡの
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩサイトに挿入されるヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。 【図１２】図１２は、ヒトＢＣＤＦ発現ベクターｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−
５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。 【図１３】図１３は、組換えヒトＢＣＤＦのＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ１２ＨＰＬＣカラムでのゲル濾過による溶出パタ
ーンを示すグラフである。 【図１４】図１４は、組換えヒトＢＣＤＦのセンシュー
パックＶＰ−３０４−１２５１カラムでの逆相ＨＰＬＣ
による溶出パターンを示すグラフである。 【図１５】図１５は、精製された成熟組換えヒトＢＣＤ
ＦのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動染色パター
ンを示す図である。 【図１６】図１６は、成熟型組換えヒトＢＣＤＦ単量体
のポリペプチド部分のアミノ酸配列の推定された２次元
構造を示す図である。
０に挿入されているヒトＢＣＤＦのｃＤＮＡ遺伝子を含
むｃＤＮＡの塩基配列図である。 【図２】図２は、図１の塩基配列中のヒトＢＣＤＦポリ
ペプチドをコードする領域を、そのコードするアミノ酸
配列とともに示す図である。 【図３】図３は、図２の下段に示したアミノ酸配列（ヒ
トＢＣＤＦ前駆体のアミノ酸配列）中における、成熟ヒ
トＢＣＤＦポリペプチド部分およびリーダー配列部分を
説明するための図である。 【図４】図４は、ヒトＢＣＤＦ遺伝子の塩基配列解析の
ストラテジーおよび当該遺伝子の構成を示す図である。 【図５】図５は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図６】図６は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図７】図７は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図８】図８は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図９】図９は、ヒトＢＣＤＦ染色体遺伝子（ＢａｍＨ
Ｉ ３．２kb断片）の全塩基配列の内の一部分を示す図
である。 【図１０】図１０は、ｃＤＮＡ発現ベクターｐｄＫＣＲ
−ｈＩＬ−５ｃＤＮＡおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−５ｃ
ＤＮＡ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。 【図１１】図１１は、ファージＭ１３ｍｐ１９ＤＮＡの
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩサイトに挿入されるヒトＢＣＤＦ
ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。 【図１２】図１２は、ヒトＢＣＤＦ発現ベクターｐｄＫ
ＣＲ−ｈＩＬ−５ｇｅｎｅおよびｐｄＫＣＲ−ｈＩＬ−
５ｇｅｎｅ−ｄｈｆｒ構築の過程を示す図である。 【図１３】図１３は、組換えヒトＢＣＤＦのＳｕｐｅｒ
ｏｓｅ１２ＨＰＬＣカラムでのゲル濾過による溶出パタ
ーンを示すグラフである。 【図１４】図１４は、組換えヒトＢＣＤＦのセンシュー
パックＶＰ−３０４−１２５１カラムでの逆相ＨＰＬＣ
による溶出パターンを示すグラフである。 【図１５】図１５は、精製された成熟組換えヒトＢＣＤ
ＦのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動染色パター
ンを示す図である。 【図１６】図１６は、成熟型組換えヒトＢＣＤＦ単量体
のポリペプチド部分のアミノ酸配列の推定された２次元
構造を示す図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/54 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥ
Ｓ．，ＶＯＬ．14，ＮＯ．22 （1986)
Ｐ．9149−9158
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/09
C07K 14/54
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．次のアミノ酸配列（Ｉ）： 【化１】を有するヒトＢ細胞分化因子又はその前駆体をコードす
るＤＮＡ。 ２．次の塩基配列（II）： 【化２】 を有する請求項１に記載のＤＮＡ。 ３．染色体遺伝子である、請求項１に記載のＤＮＡ。 ４．次のアミノ酸配列（Ｉ）： 【化３】を有するヒトＢ細胞分化因子又はその前駆体をコードす
るＤＮＡを含んで成るベクター。 ５．前記ＤＮＡが次の塩基配列（II）： 【化４】 を有する、請求項４に記載のベクター。 ６．ｐｈ−ＩＬ−５−３０である、請求項４又は５に記
載のベクター。 ７．次のアミノ酸配列（Ｉ）： 【化５】を有するヒトＢ細胞分化因子又はその前駆体をコードす
るＤＮＡを含んで成るベクターにより形質転換された宿
主細胞。 ８．前記ＤＮＡが次の塩基配列（II）： 【化６】 を有する請求項７に記載の宿主細胞。 ９．前記ベクターがｐｈ−ＩＬ−５−３０である、請求
項７又は８に記載の宿主細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8206192A JP2763026B2 (ja) | 1986-09-20 | 1996-08-05 | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22328486 | 1986-09-20 | ||
| JP61-223284 | 1986-09-20 | ||
| JP8206192A JP2763026B2 (ja) | 1986-09-20 | 1996-08-05 | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62236842A Division JP2642103B2 (ja) | 1986-09-20 | 1987-09-21 | ヒトｂ組胞分化因子 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9335748A Division JP3016756B2 (ja) | 1986-09-20 | 1997-12-05 | ヒトｂ細胞分化因子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09215496A JPH09215496A (ja) | 1997-08-19 |
| JP2763026B2 true JP2763026B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=26515488
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8206192A Expired - Lifetime JP2763026B2 (ja) | 1986-09-20 | 1996-08-05 | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2763026B2 (ja) |
-
1996
- 1996-08-05 JP JP8206192A patent/JP2763026B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，ＶＯＬ．１４，ＮＯ．２２ （１９８６） Ｐ．９１４９−９１５８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09215496A (ja) | 1997-08-19 |
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