JPH03172183A - 脳因子発現系 - Google Patents

脳因子発現系

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JPH03172183A
JPH03172183A JP2269726A JP26972690A JPH03172183A JP H03172183 A JPH03172183 A JP H03172183A JP 2269726 A JP2269726 A JP 2269726A JP 26972690 A JP26972690 A JP 26972690A JP H03172183 A JPH03172183 A JP H03172183A
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cells
amino acid
brain
sequence
ebzd
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Mohammed Shoyab
ショヤブ，モハメッド
Hans Marquardt
マルカート，ハンス
George J Todaro
トダロ，ジョージ　ジェイ
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Oncogen LP
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    • Y10S530/839—Nerves; brain

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである．細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
！！Ａ（腫瘍形成を含む）の基本的原因であると思われ
る．増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（
例えば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途がある
のでそれらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興
味が持たれており、更にまた特に有糸分裂が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセブ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした．不安解消剤、Ｍ痩剤、筋弛緩剤及び
鎮静剤として普通に用いられているペンゾジアゼピン（
ＢＺＤ）は、γ−アミノ＃＃（ＧＡＢＡ）で仲介された
抑制性神経伝達の増強作用に基づく薬理学的効果を発揮
すると考えられる，　ＢＺＤによるＧＡＢＡ一作働性伝
達の調節における第一段階は中枢神経系中の特異的な高
い親和性を有しかつ飽和できる結合部位に対する結合で
あると思われ、この場合にその結合部位は“超分子複合
体”（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ
）の成分であると考えられる．この系を理解すること、
及びその系を調節又は制御することができることの必要
性は、天然りガンド及びそれが機能する態様を知ること
に依存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアフセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる． 〔従来の技術〕 ＢｅａＩ等、　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂ
ｉｏ　　ｈ　　ｓ．（１９７９）３　　：９３　−　９
６は、増殖及びＤＮＡ合威を正常細胞中でよりも形質転
換細胞中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在す
ることを報告している。ｌ−１ｏ１１ｅｙ等、Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔ１、＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　（１９８０）７
７　：　５９８９−５９９２は、上皮細胞成長阻害物質
の精製を記載している。
Ｌｅｔａｎｓｋｙ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｒｅ　．（１９
８２）　２　：　３９−４５は、ウシの胎盤から精製さ
れたべブチドが腫瘍の増殖及びＤＮＡ中へのチミジンの
取り込みを正常細胞中でよりも新住物中で一層強く抑制
することを報告している。Ｃｈｅｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．（１９Ｂ２）　７　：３６
４　−　３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水
流体から単鰭することを報告している，　Ｒｅｄｄｉｎ
ｇ及びＳｃｈａｌｌｙ　．．Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ１、　
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９８２）７９：７０１４−７
０１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗
一分裂促進活性を示す精製されたべブチドをブタの視床
下部から単離することを報告している。これらの殆どの
因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基
本的構造は知られていない． ジアゼパム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ．　　Ｎａｔ１、　　八ｃａｄ．　　Ｓｃｉ，　　
ＵＳＡ（１９８３）６０　　：　　　３８３　　　３８
５、Ｃｏｓ　ｔａ等、Ｎｅｕｒｏ　ｈａｒｍａｃｏ１、
　（１９８４）２３　：　９８９−９９ＬＦｅｒｒｅｒ
ｏ等、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏ１、　（１９８４）
２３　：　１３５９　一ｌ３６２、及びＡｌｈａ等、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２９　：　１７９　−
１８２によって報告されそして説明されている．〔発明
の概要〕 新規な方法及び組成物が提供され、これらの組威物は、
ゲル浸透力ラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジェントの酸性（０．１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペブチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする．主題のポリペブチドに特異的に結合
する抗体が提供される．〔具体的な説明〕 天然の生理学的に活性なポリベプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリベプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な＆ｆｌ戒物、及び種々
のポリペブチドをコードしている核酸配列が提供される
．そのポリペプチドは脊椎動物、特に呻乳動物の脳細胞
中に天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又
は実質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列を
もつ．その諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そし
て脳細胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範
囲の種々の組織中に一般的に見いだされる．このポリベ
プチドは、ホモジナイズされた脳組織又はその精製され
た画分を用いてクロマトグラフィー力ラムから酸性水性
アセトニトリル溶離剤で溶出することによって単翻可能
であることを特徴とする．一つの因子は逆相Ｈｆ’ＬＣ
及びゆるやかな直線グラジエントの酸性水性アセトニト
リルを用いてクロマトグラフィーによって実質的に純粋
に単離することができる。その他の成分については所望
の活性は水性酸性ｎ−プロバノールを直線グラジエント
として用いて更に精製することができる．そのクロマト
ダラムは、約０．　１〜０．５ａｄ！／分の流速で合理
的な分離を得るために４時間以上の時間にわたって展開
することができる．逆相ＨＰＬＣを用いての分離では脳
組織からの部分的に精製されたサンプルをもたらすのが
普通である．部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグラフ
ィーを用い溶財剤として酸性水性アセトニトリルを用い
、特に均一に溶出することによって好都合に達成するこ
とができる。好都合には、媒体は０．１％トリフルオロ
酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルであることができ
る． 二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼビンオイド又はエンドゼピン（Ｅ
ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム（νａｌ
ｉｕｓ＋）アゴニストとしてジアゼパムレセブターに結
合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明
らかである，　ＥＢＺＤは、低い投与量では、咄乳動物
に興奮及び増強された意識を弓き起こし、一方高い投与
量では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体につい
ては、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い
投与量では心臓拍動度数は増大する．それらの化合物は
ジアゼパム結合性阻害剤について公表された（前記のＧ
ｕｉｄｏｔｔｉ等の文献）配列との幾らかの相同性を示
す． このペブチドは、脳シナブトソームへのペンゾジアゼビ
ンの結合を抑制することにおいて、約１〜１０−、普通
には３〜６−のＫｉをもつことを更に特徴とする（後記
の実験の項を参照のこと）．天然のポリペブチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約７　〜１５
ｋＤａｌ，　９通には８〜１２ｋＤａ＋，又はＳＯＳ−
ＰＡＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後
記の実験の項を参照のこと）．このペプチドは親水性で
ある，　１０００ユニット／■を越える比活性を得るこ
とができる（後記の実験の項を参照のこと）。
ＥＢＺロのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのアミノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異なっ
た種にわたる共通配列）はジアゼバム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ． 第二の成分は脳因子（ＢＦ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い．その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の戒長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
ＢＦは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５〜２０ｋＤａ１％普通には約８〜１８ｋＤａｌの
分子量をもつ．この蛋白質は逆相１１ＰＬＣ及び直線グ
ラジエントのＯ．ｌ％ＴＦ＾水性ｎ−プロパノールを用
い、約２０〜２６％ｎ−プロパノールで溶出して精製す
ることができる．その精製された蛋白質は少なくとも約
１５　Ｘ　１０’ユニット／ｎの比活性をもつことがで
きる（後記の実験の項を参照のこと）。
第三成分は、アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤ
のアミノ酸５４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペブチドの主要部分は細胞の外にある．この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している． これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には補乳動物（ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズξ、霊長類（特にヒト）、等を含む）から得るこ
とができる．それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセブター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のべブチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
プテンに共有結合さセ、又は１個以上の、普通には数で
約１０％以下の、一層普通には数で約５％以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリベプチドを更に詳細に考慮する。
ＥＢＺＤボリペプチド ＥＢＺＤボリベブチドは約２０キロドルトン（ｋｃａｌ
）未満、普通には約１５ｋＤａｌ未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約１　ｋＤａｌ，一層
普通には少なくとも約２ｋＤａｌである。
そのポリペブチド組戒物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件ｆ
でＯ．　１％水性トリフルオロ酢酸中のＯ〜６０％アセ
トニトリルの直線グラジエントを用いて、２８〜５０％
アセトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、一
層特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、一層特異
的には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμ−ボン
ダパック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　　Ｃｐｓカラムから溶
出することを更に特徴とする。
ポリペブチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、一層普
通には少なくとも約２０個のアξノ酸、そして約１２５
個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よりも少
ないアミノ酸をもつ．天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約７〜ｌ５ｋＤａ　＋の範囲内の分子量を
もつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアごノ酸配列の少なくとも２つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
ａ．　Ｙ　ａａ”　ａａ”＾ｒκＱ　Ａ　Ｔ　ａａ’ｂ
．　Ｋ　Ｗ　Ｄ　Ａ　Ｗ ｃ．　Ａ　Ｍ　ａａ’　Ａ　’ｌ　（Ｘ）Ｘ　Ｖ　Ｅ　
Ｅｄ．　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａ’　Ｅ　Ｅ　Ｍ　Ｌ
　Ｆ　Ｉ　Ｙ　ａａ●ＨＹＫｅ．ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥ
ＲＰＧＭＬＤｆ．ＱＡＴＶＧＤＴＮＴＥＲＰＧＭＬＤＦ
ＴＧＫｇ．ＫＧＴＳ）　　Ｅ　ＤＡ 上記の配列において、 ａａ”は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン及びヒ
スチジンであり； ａａゝはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり； ａａｃはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定
的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａ’は脂肪族中性ア旦
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもので
あり；ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性ア短ノ酸又はそのアミドで
あって且つ４〜５個の炭素原子をもつものであり； Ａ『は芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にＹを包含
し； ａａｑは脂肪族アミノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； Ｘは１〜３個のアごノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり；そして ＸはＯ又はｌである。
主覇の発明の目的のため、種々のアξノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＥ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリペブチドは特に興味のあるも
のである； ａ，　　ＴＫＰａａ’　ＯＥＥＭＬＦＩＹａａ’　ＨＹ
ＫＱＡＴａａ’　Ｇｂ．　　Ｋ一ロＡＷａａ’　　ａａ
ｌ′　　Ｌａａ’　　ａａ’　　ａａ’　　ａａ’　　
κＥａａ”　　ＡＭａａ’ＡＶ　　（Ｘ），ｌＶＥＥ　
ａａ’　ＫＫＣ．　κＱＡＴνＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬ
ＤＦＴ上記の配列において、 ａａ’　，　ａａ”　Ｉ　ａａＱ、及びＡｒは前記で定
義した通りであり； ａａ’は脂肪族アξノ酸であり、それは特に約４〜６個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には５〜６
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ； ａａ’は脂肪族中性アもノ酸、特に、約３〜５個の、−
７１普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロ
キシル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミ
ノ酸であり； ａａ’−は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル
置換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、
特に極性又は酸性アミノ酸であることができ； ａ１は脂肪族アミノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子を
もつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性中
性アミノ酸であり； ａａ’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、一層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり； ａａ”は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、一層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルヂオ
基をもつ極性アミノ酸であり；ａａ’　　は脂肪族中性
アミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭
素原子をもつ極性アミノ酸であり； ａａ’″は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり； ａａ″は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａａ’は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である特には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはＡであり；Ｘ′はＸと同じ
であり、普通にはｌ〜３個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは一般的には４〜６個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり； Ｘは０又はｌであり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Ｘの他に更に、本発明のポリベプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために１〜３個、好ましくは
１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう．又、アミノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが
、ある場合には、Ｄ−アξノ酸が使用されてもよい． 特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：ψ−Ｚ’　−ａａ’−ａａ”−ａａ’
−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ”κ一ａａ”
−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−ａａ”−ａａ
”Ｅ−ａａ”−Ｍ−Ｌ−ａａ”−ａａ”−Ｙ−ａａ！Ｓ
−ａａ”ａａ”−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｔ−ａａ’″−Ｇ−ａａ
”−ａａ”−ａａ”ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−Ｇ−
ａａ４２−ａａ”−Ｄ−ａａ”ａａ”−Ｇ−ａａ”−ａ
ａ”一κ一Ｗ−Ｄ−八一Ｗ−ａａ”ａａ”−Ｌ−ａａ”
−ａａ”−ａａ”−ａａ”一Ｋ一Ｅ−ａａ”Ａ−Ｍ−ａ
ａ”−ａａ”−Ｙ−（Ｘ）ｘ　−Ｖ−Ｅ−Ｅａ　ａ　？
　３−κ〜Ｋ−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−　Ｚ
’上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜ｌＯ個のアξノ酸、好ましくはｌ〜
９個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばＥ−Ａ−＾又はＩＩ−Ｅ−Ｔ−Ｒ等
もａａ’に結合することができ、またこの場合に、２個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同しライン上
のアミノ酸が一緒に採用され；ａ　ａ　４　ｒ　ａ　ｌ
　ｌ　’は２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性
アミノ酸、特にグリシン、アラニン、ブロリン、パリン
、ロイシン及びイソロイシンであり； ａａ　・＋　　　　　　　　　　１＠１３＋　７９は脂
肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特
にａａ’・１６・２５・３５・３７・７コ・７９がいず
れかのものであり、そして残りが好ましくは極性アごノ
酸、特にセリン、スレオニン、システイン、メチオニン
、アスパラギン及びグルタミンであり； ａ　ａ　ｌ　＋　ｂ　＋　？　１？゜ｌ？＋　３！＋　
３４＋　３１Ｓ６゜Ｓ９＋　６４＋　？＠は脂肪族中性
アミノ酸（極性及び非極性アミノ酸を包含する）又は脂
肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミン
酸であり；特にａ　ａ　１？・コｚ・：ｌ４１　５９・
７８は中性アミノ酸である時に非極性であり、残りは中
性アミノ酸である時に極性であり、そしてまた，，ｌ＋
＆・７・＋７一雫・３４・■・５６・−４は好ましくは
酸性アξノ酸であり； ａａ２．　＋６＋　＋３−２３＋　！Ｓｌ！１！？１４
ｔｒ　４３＋　４５＋　４９＋　？？は脂肪族中性アミ
ノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフエニルアラニン、ヒス
チジン、チロシン、及びトリブトファンであり、好まし
くは、ａａ”・ＩＯ＋！＆・２叩・４Ｓ・？１は好まし
くは芳香族アミノ酸であり、一方残りのアξノ酸は好ま
しくは脂肪族アミノ酸であり；ａａ’・９・１ｚ・１４
・３ｂ・コ啼・４−・４●・■・ｈ？・７ａは脂肪族中
性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニンであ
り、この場合にａａ’“ＳＩ＋　ｈｌ＋　１６は塩基性
以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩基
性以外の時に好ましくは極性であり、但しａａ４６は極
性でも非極性でもよく、そしてａａｆｆ，ｌ！・１４・
：＋９０・Ｓｌ′・６７・７６　は好ましくは塩基性ア
ミノ酸であり；ａ　ａ　Ｒ　ｔは塩基性又は芳香族、特
にフェニルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてがはＯｉ
ｌ　，　ＮＨｚ　、又は１〜６個の、普通には１〜４個
のアミノ酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のア
ミノ酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配
列Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配列である。
１個以上の共通アξノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
ア短ノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くともｌ５個、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸
を配列中にもつ： Ｅ Ｒ Ｓ Ｇ Ｖ Ｄ Ｌ　　　　　ＬＴ Ｅ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのア【ノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一賭に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を
意図しており、そして２は０又はｌである。その配列は
合計で１０個までの、普通には合計で８個までのアξノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ一末端は
追加の配列ν−１１−Ｈ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの
部分をもつことができ、モしてＣ一末端は配列Ｍ−Ｐ−
Ｍ−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約ｌ
５個、好ましくは少なくとも約２０個、一層好ましくは
少なくとも約３０個のア旦ノ酸をもち、下記の配列の１
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２
個、そして一層好ましくは少なくとも１５個の、星印（
＊〉で示したア旦ノ酸を含む（ｂ＝ウシ、ｈ＝ヒト）． ＊２０ Ｖ−Ｈ−Ｅ−Ｔ−Ｒ−Ｆ−Ｅ−Ａ−Ａ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−１
−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｋ−Ｎ−Ｇ傘　　　　＄　　零　　
　　　　　率　　　　　　　本＊＊＊　　傘Ｄ−Ａ−Ｗ
−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｇ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｋ−Ｅ−Ｅ−Ａ−Ｍ−
　１−Ａ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−傘傘＊ Ｅ一門−κ−Ｋ−１−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔ（ｂ
ＥＢＺＤ） 傘　傘 Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−１ （ｈＥＢＺＤ） ＊　傘 Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｇ−１ 本発明の特に好ましい組威物については、上記の諸配列
が、約５個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約３個以下
のアミノ酸によってである． ＥＢＺＤ＆［ｌ成物は少なくとも約２０％の純度、一層
普通には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なく
とも約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５
％の純度、望ましくは１００％の純度である。
それが由来する組織からの戒分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が１重量％未満、好ましくは約０．　１
重量％未満、一層好ましくは約０．００１重量％未満で
あるＥＢＺＤ＆ｌｌＩ戒物は特に興味がある。本発明の
ＥＢＺＤ＆ｌｌ底物は、後記の実験の項で記載するアッ
セイ条件下で粗シナブトソープ膜への３１１−ジアゼバ
ムの結合を４０％競争に必要な量によって測定して、少
なくとも１５ユニット／■の比活性をもつ．比活性は普
通には少なくとも５００ユニット／■、好ましくは少な
くとも約１０００ユニット／■であり、モしてｌ２５０
ユニット／■以上であってもよい．一般的には、松果体
、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織１ｇ当り少
なくとも約１０趨当量あり、そして普通には脈絡叢中の
湿った組織ｔｇ当り少なくとも約２Ｏｎ当量ある。前記
したように、本発明の化合物は心臓細胞集合体の収縮に
おいて心臓収縮度数に影響を及ぼすことができ、少ない
投与量では心臓収縮度数を低下させ、この少ない投与量
は一般的には約１５０，ｑ／一未満である（実験の項を
参照のこと）　，　ＥＢＺＤのその他の特徴は、生理学
的活性がＥＢＺＤについて立証される種々の試験から明
らかである。
羅四ヱ 脳因子は少なくとも２ｋＤａｌ，一層普通には少なくと
も５ｋＤａ＋そして約２５ｋＤａ　＋以下、一層普通に
は約２２ｋＤａｌ以下であることを特徴とする。脳因子
は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように、
少なくとも約ＩＸＩＯ’，一層普通には少なくとも約５
×１０３、好ましくは少なくとも約１０６、好ましくは
少なくとも約１．５Ｘ１０７の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約１０％の純度、一層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの成分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、Ｎ一末端近くに又はＮ一末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む：Ｎ−Ｋ−Ｅ−
Ｌ−Ｄ−１’−Ｖ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−κ−１−
χ−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示
す。
脳因子はヒトＴ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスボリンＡ又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビト口及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも■桁の、 好ましくは少なくとも２桁のオーダーで識別することが
できる。
欣１ｕ１貢 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： ＴらＣ　　ＴＴＡ ６ＡＡ しＡＴ　　Ｌ；１”ｒ １ｉＬｉＴ　　ＡＡ’１ Ｌｉ’ｌ’ｌ　　Ｌ；ｉＡ ししＩ ｂｕｔ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　傘 ＡＡＡ　　丁ＴＧ　　ＡＡＣ　　ＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴ
ＧＡＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡ　　１６９３＝Ｌ
起（Ｕ号辺４し吸：ウシの脳に由来するｃＤＮ＾クロー
ンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列（＊
）。アミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係
で番号づけされている。ＥＢＺＤと相同な領域は太線に
よって上に線引きされており、そして疎水性及び非荷電
のアミノ酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在
的なグリコシル化部位は囲まれている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、一層普通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ。ＥＢＺＤとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約１０％の純度、好ましくは少なくとも約５
０％の純度、一層好ましくは少なくとも約８０％の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする．その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
．膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更
に特徴とする． 興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む． 本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る．慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる．本発
明のポリベプチド又はそれのフラグメント、一般的には
少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる．種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ）ヘモシ
アニン、グロプリン、等を用いることができる．ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔でＩ回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
そのＩｌｌ！！臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合
パートナーと融合させる。
例えば、Ｇａｌｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０；ＫｅｎｎｅＬＬ等、　Ｃｕｒｒｅｎｔ
　　Ｔｏ　　ｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
　　　　ａｎｄ　　Ｉｍ＋＋＊ｕ−既旦ｕ（１９８７）
８１　：　７７　；米国特許第４，３８１，２９２号及
び第４．３６３，７９９号を参照のこと．しかしながら
、特定の目的に対しては、その他の咄乳動物、例えば霊
長Ｍ（例えばヒト）を、ヒトＦｃ鎖をもつ抗体の生産の
ために、用いることができる．ＥＢＺＤポリペプチド及
びＥＢＺＤポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個
々に又は一緒にして、インビボ及びインビトロの両方に
用途がある。主題の化合物はジアゼバムレセプターへの
結合のためのアゴニストとして用いることができる．本
発明の化合物は、ジアゼパムレセプターの数及び分布を
求めるのに用いることができる．加えて、本発明の化合
物は噛乳動物宿主の心臓拍動を調節するのに、噛乳動物
宿主を鎮静させるのに、又は噛乳動物宿主に興奮を引き
起させるのに用いられる．脳因子ポリペプチド及び脳因
子ポリペブチドに特異的に結合する抗体は、個々に又は
一緒になって、インビボ及びインビトロの両方で用途が
ある．このポリベプチドは腫瘍抑制特性をもっているの
で、このポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制
するために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細
胞混合物と共に用いることができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる：正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる：骨
髄が噛乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合；細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる．脳因子ポリペプチド
は、腫瘍中に注入するか、リポソーム中に封入する（こ
の場合にリポソームはＩＵＩ，細胞に対する特異的な又
は優先的な抗体に結合していてもよい）か、等によって
、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体内で用いること
ができる。他の方法としては、本発明のポリペブチドは
免疫調節剤として用いることができる．このポリペブチ
ドは、ポリペプチドについての診断において、それ自体
で又は抗体との組み合せで用いることができる．診断ア
ッセイでの使用のためにそのいずれか又は両方がラベル
され又はラベルされないであろう．多数の診断アッセイ
が文献に記載されており、該ポリペプチド、又は抗体へ
の種々のラベル、例えば酵素、放射性核種、フルオレッ
サー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性粒子）等の直接
又は間接のいずれかでの結合を含む．これらのアッセイ
の例示としては、例えば米国特許第３．８１７，８３７
号、第３，８５０．７５２号、第４，１７４，３８４号
、第４．２７７，４３７号及び第４　，　３７４　．　
９２５号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリベプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
Ｅｌ＾、ＥＬＩＳＡ　，ＲｒＡ　、ホモゲニアスＥＩＡ
　，　　ドットープロット、ウエスターンズ（Ｗｅｓｔ
ｅｒｎｓ）等と称される。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イディオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イディオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエビトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イディオタイプはジアゼパムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
上記のポリベプチドは、天然源に由来する天然ポリベプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然＆［１戒物は多数の種々の組織、例え
ば牌臓及び精巣中に見いだすことができる． 本発明の化合物を単離するために、脳Ｍｉ織から血餅を
排除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条件下
で有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４ｋＤ
ａｌ未満である低分子量物質を除去する。
その生威物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０．　１％トリフルオロ酢酸
水溶液熔離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑
制剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両
分をパイオアッセイによって観察する。その生成したＥ
ＢＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム
、例えば、μ−ボンダバッターＣ．カラムを用い、水性
０．１％トリフルオロ酢酸中の約０〜６０％アセトニト
リルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及び
遅い溶出速度、例えば４時間以上、好ましくは５時間以
上を用いて更に精製した．本発明のＥＢＺＤ化合物は約
３０〜５０％アクリロニトリル、一層特定的には３０〜
４０％アクリロニトリルの百分中に見いだされる．ＢＰ
化合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、０．　１％水
性アセトニトリルの直線グラジエントを用い、３２〜３
６％アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回以上
繰り返して、更に精製する．このＩＩ１された両分を次
いで、逆相１｛ＰＬＣを用い、０．　１％水性ｎ−プロ
パノールの直線グラジエントを用い、約２２〜２４％ｎ
−プロパノールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り
返して、更に精製する．他の方法として、本発明のポリ
ペプチドは、特にポリベプチドが３０個未満のアミノ酸
、一層特定的には２５個未満のアミノ酸の場合に、公知
の技術に従って合成することができる．例えば、Ｂａｒ
ａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｓｏｆｉｄ−Ｐｈ
ａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ，“↑ｈ
ｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，　　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　，Ｓｐｅｃｉａｌ　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ．　　Ｐａｒｔ　Ａ＋Ｖｏ１、　２＋　Ｇｒｏ
ｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅｒＷ、Ａｃａｄｅｎ＋ｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ（米国）　１９８０、１〜２８４頁を参照
のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約２０個以上のアミノ
酸をもつもの、一層特定的には約３０個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチトをコードする配列
を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペブチ
ドの発現に用いることができる。ポリベプチドをコード
するためにゲノムＤＮＡ，　ｃＤＮＡ，合成ＤＮＡ又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。ほとんどの場合において、オープンリーディングフ
レームが用いられ（イントロンなし）、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される． 特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
れるｃＤＮＡがある．このｃＤＮＡは開始のメチオニン
から約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを含む。
下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している．５’　
−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧ
ＴＴＧＣＧＣＴＴＮａｅｌ １ Ｇ Ｇ Ｇ １１ｉｎｄ　　［１ ↓ Ｃ一 −Ｃ−−−− 一〇 −−−−−−ＧＡ ８７ ＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＡ−ＧＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡ
ＣＣＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＴＡ　　４３４−−一一一↑
一Ａ−ＴＧＴ−−−−−ＧＴＧ−−−ＡＴ−−−−−−
−−−−ＧＡＣＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡ
ＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡ　　　５
１１ＴＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡ
ＡＣＧＧＴＴＡＣＴＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡ
ＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧ
ＴＡＴＣＴＴ　　　５９０ＴＧＴＴＡＣＴＴＴ／ＡＣＴ
ＴＣＧ／ＡＴ＜ｐｏｌｙ　　Ａ）−３’　　　６０７上
記はウシとヒトのヌクレオチド及びＥＢＺＤの推定され
たアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列にお
いて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており、
それは３つのオーバラップするｃＤＮ＾クローンから求
められた．ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合配
列に関して番号付けされており、アミノＭ残基は開始の
メチオニンに関して番号付けされている．ウシの配列の
リーディングフレームは星印（＊）に挟まれている。３
つの別個のクローンのポリ（Ａ）十付加部位における差
異は逆スラッシュによって示されている。
ウシのｃＤＮＡプローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌ［Ｉの制限部位が示されている．実
験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくとも
約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグメ
ントが、本発明のポリベプチドの発現に用いることがで
きる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダプ
ター等を用いることによって、その配列を天然配列から
変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野生
型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作ること
ができる。従って、天然ポリベプチド、及び相応の生理
学的特性を有するがしかし１個以上のアミノ酸の異なっ
ているポリペブチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる．発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ヘクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、噛乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペブチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、５′末端および３′末
端において、しばしば野生型の制′４’ｌｊ　Ｈ域以外
の、転写および翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナ
ルのそれぞれによって挟まれている．従って、プロモー
ター領域は５′末端において用いられ、キャップ配列、
制御された発現のためのオペレーター、およびエンハン
サー配列等を含み、構成的発現のためにプロモーター制
御を含んでいないことができる。３′末端においては、
ターミネーター、終止コドン、および最適にはポリアデ
ニル化配列等が存在する．転写および翻訳制御配列およ
びコード配列の発現造成物は、しばしば、ベクターが導
入されている形質転換された宿主に関する選択および発
現ベクターを保有する細胞に対する競争的好都合の提供
の双方を可能にする１種もしくはそれ以上のマーカーに
連結される。マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養
性の付与による補完、殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性
、例えば、種々の抗生物質および重金属等に対する耐性
、および免疫等含んでいることができる。種々の配列は
、宿主中で機能的であるように選択される。
多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリン力一が、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生戒物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる：米国特許第４，４１１，９９４号、ＥＰＡ８８．
　６３２および１１６，２０１　．コード配列は正しい
リーディングフレームで分泌リーダーおよびプロセッシ
ングシグナルに連結されることによって、その融合コー
ド配列を発現ベクター中に挿入して発現造底物を提供す
ることができる． ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペブチドを単
離することができる．ポリペブチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペブチドを単離す
ることができる．ポリペブチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンテイー
クロマトグラ７イー、｝ＩＰＬｃ、電気泳動、グラジエ
ント遠心分離および溶剤抽出等がある． 用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる．生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００汀／
ｄである．投与方法に応じて、用量は約０．　５〜５０
０ＩＩｇ／ｋｇまで、より通常には約５　〜５０ｇ／ｋ
ｇまで変化することができ、用量が２５ｇ／ｋｇを越え
る場合には精神安定作用が生ずる．特定の用量は、所望
の反応、投与方法および用量の反復性等によって変化す
る． 以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０ゲルロ過ＨＰＬＣ力ラ
ムを、パイオーランドラボラトリーズ（リッチモンド、
カルフォルニア）より購入した，　Ｂ　−Ｂｏｎｄａｐ
ａｋ−Ｃ．．カラムをウォーターズアソシエート（５ル
フォールド、マサチューセジツ）より入手した．トリプ
シン（ＴＰＣκ処理）、−キモトリプシンおよびスタフ
ィ口コッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｏ
ｌ　ａｕｒｅｕｓ）ｖ８ブロテアーゼは、ワーリントン
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）から得る。エンドブロティ
ナーゼＬｙｓ　−　Ｃをベーリンガーマンハイムから得
た。３Ｈ−ラベル化ジアゼバム、ＲＯ１５−１７８８、
フルニトラゼパムおよびβカルボリンをＮＩＪ　，ボス
トン、マサチューセッンから得た。キャリャフリー１２
５１−ヨウ素はアマーシャム（アーリントンハイト、イ
リノイ）製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０　ｇ湿重量）を融
解し次いで細断した．細断した組織を、２３７９ｄのエ
タノール（９Ｂ％）　、Ｈ？．５−の濃ＨＣｉ！、およ
び２．　５　ｄのアブ口ティニン〔ウシの肺源の２３　
ＴＩＵ／ｄ（シグマケミカル社）〕から成る２４００ｄ
の抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコマ
ーシャル混合機中でホモジナイズした．ホモジネートを
４゜Ｃで一夜で撹拌し、ベックマン型ｌ９ローター中８
０００ｒｐｍ＋で３０分間遠心分離し、次いで上澄みを
注意深く除去した．最終量は約２０７０ｄであった。ク
ロロホルム（２０７０ＩＩ１）および２０７ｌｄの酸性
の水（２０３ｄの水と４ｄの濃ＨＣｊ！）を上澄みに添
加し、混合物を約１時間激しく撹拌し、次いで室温に放
置し二相に分離した。水性の上相を注意深く除去し次い
でスベクトラポール透析膜チューブ（３，５００ＭＷカ
ットオフ、アメリカンサイエンティフィックプロダクト
）中、４　”ＣでＯ．　ｌ　Ｍ酢酸２Ｏｆを２回取り換
えて透析した。透析した上澄みを凍結乾燥した．凍結乾
燥材料（７８５■）を粗分画と称した． ゲル′　クロマトグーフィー Ｂｉｏ−Ｓｊｌ　ＴＳＸ−２５０カラム（６０Ｘ　２．
　Ｉ　Ｃｌｌ）を高速液体クロマトグラフィ−（ＩＩＰ
ＬＣ）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付け
た．粗分画を０．１％三フッ化酢酸を用い４０％アセト
ニトリル水溶液中に８　ｍｇ　／　Ｍｌ１の濃度で熔解
した．カラムを０．　１％三フッ化酢酸（ＴＰ＾）と共
に４０％アセトニトリルを用いて平衡化した．２Ｉｄの
アリコート（１６■のタンパク質）を注入し次いで０．
　１％濃度のＴＦＡを有する４０％アセトニトリル水溶
液を移動相として均一に溶出を行った。流速を２−／分
に設定しそしてチャートスピードを０．２５ＣＩ／分に
設定した．クロマトグラフィー処理を室温で行った，５
１ｄの分画を採取した。各分百のアリコートを凍結乾燥
し次いでペンゾジアゼピン（ＢＺＤ）結合競合活性（Ｂ
ＺＤ−ＢＣＡ）および成長押制活性について３回分析し
た． ＢＺＤ．−ＢＣ八の位置を知った後（分画２４）、先に
述べた如く、４９回のクロマトグラフィー操作を行った
．全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した．約
６５■の活性な乾燥粉末を得た．これをＴＳκ〜２５０
分画と称した．この分画は約９３６ユニットのＢＺＤ−
ＢＣＡ活性を含有していた．ＴＳＫ−２５０　　　の　
　　　　　クロマトグーフィ−ＴＳＫ−２５０分画を０
．　１％ＴＰＡに溶解し（２■／一）、更にμ−Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ　−　Ｃ　，　ａカラム（７８ｍｍ　（内径
）×３０ｃｍ）を用い室温で逆相ＨＰＬＣにより分別し
た．試料を均一に適用し、カラムを洗浄し次いで０．　
１％ＴＦＡで平衡化した。流速を２ＩＩ１／分に設定し
、そしてチャート速度を０．２５ｃ■／分に設定した．
第一の溶剤０．　１％ＴＦ＾と第二の溶剤０．　１％Ｔ
ＰＡ中のアセトニトリルと間での線状グラジエント法を
用いた．グラジエントの条件は２０分内で０〜２８％、
次いで１４０分内で２８〜４２％、ｌＯ分内で４２〜５
２％更に６分内で５２〜１００％であった．全ての溶剤
は、ＨＰＬＣ等級のものであった．４Ｍ１の分画を採取
した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでＢＺＤ−ＢＣ
Ａに対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜３
２％アセトニトリル濃度間で溶出した．分画３６と分画
３７をプールし、次いで１２ｍの０．１％ＴＰＡで希釈
した．混合物を、ｐ　−　Ｂｏｎｄａｐａｋ　−　Ｃ　
＋　ｅカラム〔３．９■（内径）Ｘ３０ｃｍ）に均一に
適用した．流速は１４／分であり、チャート速度は０．
２５ｃｍ／分であった．第一の溶剤０．１％ＴＦＡと第
二の溶剤０．１％ＴＦＡを有するアセトニトリルとの間
で直線グラジエント法を用いた。グラジェント条件は次
の通りであった。ｌＯ分内で０〜３０％、次いで６０分
内で３０〜４０％であった。分画を採取した．殆ど全て
の活性（約８５０ユニット）部分は３１％までのアセト
ニトリル濃度で分画６内に溶離した。この分画をＨＰＬ
Ｃ　　Ｃａｍ分画と称し、これは約６８ｏｎのタンパク
を有していた． また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒトＥＢＺＤを精製した． 〜シナプトソームの！　１ 粗シナブス膜分画を、体重２００ｇまでのスブラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｉ１、　Ａｃ
ａｄ．匙豆υ５Ａ（１９７４）７１　：　４８０２−４
８０６）の記載の如く調製した．シナフ゜ス膜を、５０
ｍＭのトリスー１１（Ｊ　（ｐＨ７．４）で３回洗浄し
、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離により
ペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を５０ａＭ
　｝リスーｕｃｉ．　（ｐＨ７．４）に懸濁させ次いで
−２０℃で保存した。
ＥＢＺＤ−辷八　　　　についてのア　セイ種々の両分
又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナブト
ソームへの３｝１−ＢＺロの結合の阻害を、結合競争活
性の指標として使用した。シナブトソーム膜への３１１
−ＢＺ［＋の結合を、２５−のβ−カルボリンの不在下
又は存在下のいずれかで使い捨ての１２　Ｘ　７５ｍの
ボリブロビレン管中において２通り実施した．その結合
混合物は、所望の種々の濃度の試験化合物、２０＋＋Ｍ
のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ＝７．　４　）　、シナブ
スＭ！！！濁液（７０　−　１００Ｉｌｇのクンバク質
）　、１〜５ｍＭ（７）３Ｈ−ＢＺＤ及び合計体積０．
　１　ａｆ中０．５％の最終濃度のジメチルスルホキシ
ドを含んだ．４℃で３０分間のインキュベーションの後
、０．　１　ＭのＴｒｉｓ−ｌ１ｃｊ！　（ｐＨ＝　７
．　４　）中１０％の冷ポリエチレングリコール（ＰＥ
０６０００）　０．　７−を各々の管に添加した．その
懸濁液をすぐ４゜ＣでＧＦ／Ｂフィルターにより真空濾
過した．そのフィルターを、ＩＩＩＩｇ／ＩＩｉのＢＳ
Ａを含む５０−Ｍの冷Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ　（ｐＨ一７
．　４　）　１０ｄにより洗浄した。そのフィルターを
、計数バイアルに移し、そしてアクアシン（Ａｑｕａｓ
−ｓｉｎｅ）（ＮＥＮ）１０Ｉｄを、各バイアルに添加
し、そしてＢｅｃｋｍａｎβ一カウンターを用いて放射
能を測定した。２５−のβ一カルボリンの存在において
結合した放射能（合計結合の２〜８％）は、非特異的で
あると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正され
た。タンパク質濃度を、標準としてＢＳ＾を用いて、Ｌ
Ｏ＠ＴＶ＋など，，Ｊ．　Ｂｉｏ１、　Ｃｈｅｓｔ．（
１９５１）ユ超：２６５〜２７５の方法によって測定し
た．ポリアクリルアミドゲル　　゛　　ＰＡＧＥ）０．
　１　Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．　２　）　、
０．　１％のＳＯＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％の
ポリアクリルアミドビスーアクリルアミド（３０：０．
８）の１５ｃｍの分離ゲル（０．　７５ｍの厚さ）を使
用した．そのゲルは、ゲル２０ｄ当りＴｔ！ＭＥＤ（Ｂ
ｉｏＲａｄ）　１０Ｉｌ１を含み、そして、２０％の過
硫酸アンモニウムの１．　０　ｍ／Ｉｌｉのゲルを用い
ることによって重合されたものである．分離ゲルの条件
と同一の緩衝液条件を用いる３．５％のアクリルアミド
溶液の上層ゲルを、下層ゲルの上に注いだ．上層ゲルの
約３閣を残して、コム（Ｃｏｍｂ）を、その上のゲル中
に挿入した．０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７
．　２　）　、７　Ｍの尿素、１％のＳＯＳ及び１％の
２−メルカプトエタノール中サンプル４０ＩＪ１を、２
分間煮沸し、そしてすぐに適用した．そのランニング緩
衝液は、０．　１％のＳＯＳを含む０．　１　Ｍのリン
酸ナトリウム（ｐｌ１＝７．２）であった．トラッキン
グ染料がゲルの底に達するまで、そのゲルを、室温で５
Ｖ／ＣＩで泳動させた。そのゲルを、５０％メタノール
及び９％酢酸中に固定し、固定溶液中において０．　１
％クーマシープルー（Ｃｏｏｓａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）に
より染色し、そして５０％メタノール及び９％酢酸によ
り脱染色した．脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた．
１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅｍｓｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２２
７　：　６８０　〜６８５のＰＡＧＥ法もまた、使用さ
れた．ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒ　ｉ　１　＋　
など，，　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２１１　：　
１４３７〜ｌ４３９の銀染色法又はクーマシーブルー染
色法のいずれかによって検出した． ンパク　のヨウソ Ｂａｒｒｉｄｇｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏ１
、（１９７８）５０　：　５４〜６５によって記載され
ているクロラミンーＴ法を用いて１２５Ｉにより、又は
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　（１９７３）ユ３３　：　５２
９〜５３９に記載されている”Ｊ−Ｂａｌｔｏｎ及び｝
ｌｕｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベルした。
ＥＢＺＤに欠する ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅ−
　Ｄａｗｌｅｙラットを、完全フロイントアジュバント
中に乳化された、合計２０１！ｇの精製タンパク質によ
り感作した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントア
ジュバント中タンパク質１０，ｗを用いて２週間隔で与
えた。各接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記
に概説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体
についてスクリーンした．そのアッセイのために適切な
抗血清は、一般的に、２〜３回のみの追加免疫接種の後
、得られた．ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニュージー
ランドホワイトウサギ）における精製されたウシの脳の
ＥＢＺＤに対する抗血清をまた、ラットのために記載さ
れた同じ方法によって調製した．但し、４０ｉＩｇ及び
２０ｌ！ｇのタンパク質を、それぞれ、１次接種及び追
加免疫注射のために使用した。
ラジオイムノアッセイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３×１０ｌｏｃｐＩ
Ｉ／ｎの比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し、
そして４゜ＣでＴＮＥＮ緩衝液（２０ｓＭのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ＝　７．４　　；　　５ｍＭのＥＤＴＡ　
　；　　　１５０ｍＭの　ＮａＣｌ　　；０．０５％の
ＮＰ−４０　；　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管Ｃ３ｄの容量）に添加された：精製され
た脳因子の標準又はサンプルｌＯｐｌ、ラット抗血清（
ＴＮＥＮ緩衝液中において１：３０に希釈された）１０
ｄ及びＩ！Ｓｌによりラベルされたウシの脳因子（〜５
　Ｘ　ｌｏ’ｃｐｓ）　３０ｍ。室温で４５分間のイン
キュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固定
されたＳ．アウレアス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の１０％！
Ｑ濁液５０ｄを添加し、そしてその混合物をさらに３０
分間放置した．次に、免疫吸着剤をｎ−ブチルフタレー
ト油のクッションを通して遠心分離し（１５，０００ｘ
　ｇ　，　　１分）、そしてＳ．アウレアスペレット中
の放射能活性の量を、ｒ一分光測定によって測定した。
抗血清の不在において結合した放射能は非特異的である
と思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された． ＲＩＡ反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された．新鮮な又は冷凍された組織（お
よそＩｇの正味重量）を、１（ｌｄの冷ホモジナイゼー
ション緩衝液（２０ｍＨのＴｒｉｓ−ＭＣＩ，ｐＨ　＝
１−　４　；　５　ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｓ＋Ｍ
のＮａＣｆ　；　０．　２％のＮＰ４０　；　０．２　
ｇｇＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド；一当り
１００カリクレイン阻害剤ユニットのＴｒａｓｙｌｏｌ
）に添加し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザ
ーにより３回、■５秒間の破壊により均質化した．その
抽出物を取り出し、そしてｔｏｏ，ｏｏｏ×ｇで３０分
間の遠心分離により残骸を除去した．次に、この上清液
を、５分間９５゜Ｃへ加熱し、そして低速度で遠心分離
し、沈殿した蛋白質を除去した。一連のｌ：３の希釈の
抽出物を、ＴＮＥＮ緩衝液により調製し、そしてラジオ
イムノアッセイに使用した．標準曲線は各セットのアッ
セイを含み、そして免疫反応性物質の量を、直接的な比
較により算定した。
ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドプロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃを含む０．１ＭのＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ＝
８．　０　）　４０ｘｒにおいて２４゜Ｃで１６時間消
化した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準で１０：１
であった．ペブチドフラグメントを、水中０．０５％Ｔ
ＦＡから０．０４５％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリ
ルまでの直線２時間グラジエントを用いてμ−Ｂｏｎｄ
ａｐａｋ　−　Ｃ　＋　ｓカラム（Ｗａｔｅｒｓ）での
ｒｐＨＰＬＣによって分離した。ベプチドをモニターし
、モして２１４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、
集め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した． Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した，　ＢＺＤ結
合の競争活性は、リボヌクレアーゼ（肝〜１１　，　５
００）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一の
ピークとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムＴ
ＳＫ−２５０からの活性フラクション２４のクロマトグ
ラフィーの結果、その活性は３１〜３２％のアセトニト
リルの間で溶出した．分析用逆相カラムに基づく、プー
ルされたフラクション３６及び３７の再クロマトグラフ
ィーは、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもた
らした。その精製は第１表に要約される． 第１表：ウシの脳のＥＢＺＤの精製 粗原料　７８５１　　１．０１０’　　　　　１．２９
１００ ａ：上記のアンセイ条件下で粗シナブトソーム膜への３
１１−ジアゼパムの結合に対する４０％競争のために必
要とする材料． ｂニプールされた材料の直接計量による。
Ｃ：２８０ｍμでの吸光度から計算された。
ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアンセイす
ることは不可能であった．この数は、フラクション２４
及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す， ８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で達威した．阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した．しかしながら、最大の阻害度は、８−の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎないこ
とが見出された．Ｋｉ値は、３■ジアゼバム又は”Ｈ　
−　ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして使用
されても、約５−であることが見出された。
猜製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示された。ペプチドの分子量は、１
０．５Ｋドルトンであると算定された．Ｌａｅｓ＋ｓ＋
ｌｉのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による精製された蛋白質（ウ
シ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ〜７Ｋドルトン
を有する単一のバンドを与えた．精製されたタンパク質
は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡ　と共に、水中
４０％アセトニトリルを用いるＢｊｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ
−２５０カラム（６０ａａ　Ｘ　７．　５　ｍの内部直
径）から単一の対称ピークとして出現した．その見掛分
子量は、このゲル浸透クロマトグラフィー法によって約
１１．５Ｋドルトンであることが計算された．この精製
されたヒトの脳のεＢＺＤは、類似する物理化学的特性
及び生物学的特性を示した．シナブトソーム膜への　１
！５１−ラベルされた（クロラミン−Ｔ法又はＢｏ　ｌ
　ｔｏｎ及びｌｆｕｎ　ｔｅｒ法のいずれかによる）精
製タンパク質の特異的結合は観察されなかった． 旦迎坐仕奄 ＲＩＡ系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のＥＢＺＤを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シＥＢＺロに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の１１５■−ラベル化ＥＢＺＤの除去を測定した。ウシ
およびヒトのＢＢＺＤは、ウシＥＢＺＤ蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するＩＩＪ−ラベル化ウ
シＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示した。この
ことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が存
在していることを示している．エンドプロティナーゼＬ
ｙｓ−Ｃ消化によって得られモして逆相ＨＰＬＣによっ
て精製されたウシＢＢＺＤのペプチドフラグメントはい
ずれもなんらの免疫反応性も示さなかった．従って、ｆ
！ＢＺＤの免疫原決定基はエンドブロティナーゼＬｙｓ
−Ｃによって生じた単一ペプチドフラグメントのいずれ
にも保有されていない．ラビットの種々の組織中のＥＢ
ＺＤの分布を下記第２表に示す． 第２表：種々のラ 組織 脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 肺臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状Ｊｌｉ（Ｔｈｙｒｏｉｄ） ビット組織中のＥＢＺＤの分布 Ｋ当量／ｍ織１ｇ（湿重） ３．８０ ３．４２ １．７６ １．５２ １．２７ １．０５ ０．９７ ０．８４ ０．７３ ０．６７ ０．５０ ０．３７ ０．０６ Ｎ．Ｄ．　＝検出できず． ＲｌＡ法の詳細は前述してある． 血清または血漿以外の試験組織はすべて、Ｒｌ＾によっ
て検出されるｌｌｉＢＺＤを含有していた．ウシの脳、
牌臓および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　，
　７．　６および６．８Ｒ当量を含有していたが、ヒト
の脳は組織１ｇ（湿重）当り１５．７ａｇ当量を含有し
ていることが見い出された．ラビット脳中のＥＢＺＤの
濃度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはる
かに低いものであることが見い出された．　Ｅ８ＺＤは
モンキーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク質に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された．ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（ＨＥＰ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ　
１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）および
膠芽腫細胞（Ｈ↑８１０）について計算したところ、そ
れぞれ濃縮細胞（〜１０’細胞）ｌＩＩ１当り９．１、
８．９　，　８．６　，０．３２および０．２６＃１ｒ
当量のＥＢＺＤを含有していた。ＥＢＺＤ　１　ｎは約
６Ｘ１０”分子を含んでいる．従って、ＭＣＰ　７．　
ＨＥＰ　２およびＨＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜５
Ｘ１０’分子のＥ！ＢＺＤを含有している．従って、Ｅ
ＢＺＤは補乳動物の組織中に広く分布しており、モして
０８１　とは異り脳に特有のべブチドではない．広い組
織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的なものという
よりむしろ一般的なものであろうということを示唆して
いる． 大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ ｌ７．４ ２６．７ ｌ４．３ １．７ １６．２ ＥＢＺＤ濃度は前述の如くにＲＩＡ によって測定した． 第３表は、ＲＩＡによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢ−ＺＤの分布を要約している．脳の
領域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、ＢＢＺ
Ｄ濃度の実質的な局所的変化があることが示された．試
験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡叢に
おいて見い出され、そして最低濃度は下垂体において見
い出された。
ＥＢＺＤの　命（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ）　’ｒ体重２．
３〜２．６ｋｇの雄性ニュージーランドラビットをこの
実験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、
ニューロファーマコル．（■肛炒ｈａｒ−ｍａｃｏ１、
）　　（１９７２年）１１：１−１６頁に記載されたの
直接穿刺法に若干の変更を施すことによってｉｃν注射
を行なった．動物は、頭蓋に小さな穴（直径０．８閣）
を開ける（ベントバルビタール麻酔下）ことによって実
験の２日前に準備した．この穴は正中線に対して１．　
０鴎側方およびプレグマに対して１．　０鵬口吻側に位
置している．実験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局
所麻酔薬を噴霧する。
＃２６の針を頭蓋の表面から１２一の深さまで鉛直に挿
入する．正確な位置決めは大脳脊髄液の出現によって指
示される．針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、こ
の針を同じ深さまで再度挿入する．注射は、常に、注射
器微量ビュレットを用いてｌＯ〆の容量で３０〜６０秒
間にわたって実施する．対照の動物には同容量の滅菌食
塩水を与える．薬剤はすべて滅菌した等張の食塩水中に
溶解し、そしてその遊離塩基として表現される． 動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ
ｔａｎｃｈｉｏｎ）内に位置させる．結腸温度は、リー
ズーノースランプ・スピードマックス・レコーダー（Ｌ
ｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　Ｓｐｅｅｄｏｓａｘ　ｒ
ｅｃｏｒｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線が引
かれているＹＳＩスキャンニング・テレサーモメーター
（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒａ＋ｏｍ
ｅｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタブローブに
よって測定される．実験は２２．０±１．　０　’Ｃの
常温室内で実施する．興奮活性は立直り反射の回復時間
の短縮によって示される．２５■／ｋｇのベントバルビ
タールを静脈内に投与されたラビットは麻酔にかかり、
その麻酔時間の間は自らを正常な直立位置まで動いて戻
すことなく仰向けになっていることができる．ラビット
が仰向けの姿勢をこれ以上続けていることができなくな
った時を立直り反射の回復時間と考えた． 瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した．さらに、ある種の常同的（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉ
ｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した．ｂ　ＥＢＺＤ 到星 注射のｌＯ分後、動物は連続的な咀哨反応を開始する．
呼吸は９０分から２０４分まで増加した．運動活性の増
大。機能冗進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）なし
．痛覚脱失なし． 則虹屋 注射のＩＯ分後、呼吸は９８分から６５分まで減少．強
迫的咀哨および軽度の興奮．興奮は短時間続いた．ａ能
冗進なし．痛覚脱失なし．２００ｎ 注射の４分後、動物は目を閉じる．呼吸減少（ｌ０８分
から５０分まで〉．注射のＩＯ分後、立直り反射欠如．
動物は深い麻酔状態にはなかった．ｂＥＢＺＤ投与の２
８分後、立直り反射は回復した．痛覚欠如なし。
８日齢のヒナＡ　（ｃｈ　ｉｃｋｅｎ）の胚から心室を
単個細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法に
より、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞
が生ずる．集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合して
おり、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダ
ル（Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（ＤｅＨａａｎ）、
ジエイ．セル．フィズ．　（Ｊ．Ｃｅ旦迂社ｈ）（１９
８３年）旦互３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特性を
基準にすれば、この調製物は威体の噛乳動物のブルキン
エ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルおよ
びデハーン、ディ・イニシエイション・オヴ・ザ・ハー
トビート（Ｔｈｅ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ
　Ｈｅａｒｔｂｅａｔ）デニス・ノーブル（Ｄｅｎｔｓ
　Ｎｏｂｌｅ）編、１９７５年、オツクスフォート・ユ
ニバーシティ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）　、ロンドン、ｐ．　７　）　
．これらの集塊は２４℃で平衡化しｂＥＢＺＤを用いて
２４時間処理した．２つの個別の実験において、１００
ｘ／ｄの量で処理した集塊の収縮速度は対照と有意に相
違した．これを以下に示す．実験１： （測定された収縮速度（秒）／５回の収縮間間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　１４
　　　１１．４８　　　　１，４４　　　　０．３８処
理　１４　　７，９４　　２．０４　　０．５５実験２
： Ｎ　　平　均　　標準偏差　ＳＲ　Ｍｌ！ＡＮ未処理　
　１３　　　２４．５９　　　　３．１８　　　　０．
８８処理　１２　　１９．３３　　２．３７　　０．６
８各実験において、スチューデントＴテストによれば、
処理された母集団は有意に未処理の母集団と異なってい
る．これら２つの母集団が同じものであるという確率は
０．０００１より小さい（ｐ　＝　０．００００）．起
ｉＪｌ定 ウシおよびヒトのＥＢＺＤのアミノ酸配列を、（ａ）エ
ンドプロティナーゼリシンＣ、（ｂ）キモトリブシン、
（Ｃ）スタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　
Ｉｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　ＶＢおよび（ｄ）
臭化シアンを用いたｂＥＢＺＤおよびｈｔ！ＢＺＤの消
化により得られたペプチドのマイクロシークエンス分析
によって決定した．ペプチドフラグメントは揮発性溶剤
を用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した．アミノ末端を
ブロックしたべブチドを１２Ｎ　ＨＣｊ！中で周囲温度
において１６時間インキユベーションした．次いで、試
料を凍結乾燥によって乾燥させた．ベプチドを、４７０
Ａ型気相プロテインシークエンサー（ＰｒｏｔｅｉｎＳ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ）　（アブライド・バイオシステムズ
社（Ａｐｐ目ｅｄ　８ｊｏｓｙｓｔｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
）による自動反復エドマン分解に付した，　ｒｐＦＩＰ
Ｌｃによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析
した． これとは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはベブチドを、６ＮＨＣｆｆｉを用いて１０５“Ｃで
１６〜２０時間減圧において加水分解した．得られたア
ミノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しビコ
（Ｐｉｃｏ）ＴＡＧ　システム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ（ＷａＬｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）　）に
よって分析した。フエニルチオカルバモイルアミノ酸を
２５４ｎＭの吸光度によって検出した。
硅ｐ坐牝ヱ量遣一 ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤのアミノ酸配置を、６８ｌ
ｌＣｆで加水分解した後、アミノ酸自動分析装置を用い
て決定した。これらの蛋白質には、システインを除くす
べての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータ
から計算された最小分子量は約９，９００であり、ＳＯ
Ｓ−ｒ’ＡＧＨによってｒａ認された値と一致する。
Ｎ一末端アミノ酸は、敗サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アξノ基がブロックされて
いることを示唆している．配列は実験の部に記載のよう
に決定した，　　ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を
、公表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示
す． ｒ−ＤＢｒ　　　　　　　　ＫＫＫＹ．　．ｂＥＢＺロ
配列と異なるｈＥＢＺＤアミノ酸配列中の残基には下線
を引いた． ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＥＢＺロのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置ｍ基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している．６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるたった１個の塩基変化
と一致する．これらの結果は、ヒトおよびウシのＥＢＺ
Ｉ）が異なる種の間で構造的に高度に保存されているこ
とを立証している。
ウシの＆Ｉｌ織から単離したポリ　（Ａ”　）ＲＮＡを
ｃＤＮＡ合戒用の鋳型として使用した。第１　１１のｃ
ＤＮＡ合威はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウィルス
（ＡＭν）逆転写酵素とを使用して実施した．第２鎖は
大腸菌ＲＮａｓｅ　Ｈ　，　　ＤＮＡポリメラーゼ■お
よびＤＮＡリガーゼ（ＮＡＤ’　）を使用して合威した
ａ　Ｓｌヌクレアーゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩの大断片によるフィルイン反応によって２
本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化した。ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼを使用して、デオキシ
グアニン残基約１５個をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に
加えた．次に、このＧの尾部をもつｃＤＮ＾をＡ−５０
カラム上でサイズ分別して、５００塩基対未満のｃＤＮ
Ａと導入されなかったデオキシグアニン残基とを除去し
た．次に、プールしたｃＤＮ八の濃縮を、ＥｃｏＲＩで
消化したλｇｔ．１０　　０ＮＡの存在下におけるエタ
ノール沈殿によって実施した。
影遼ＲＩで切断したλｇｔ．ＩＯに対するＧの尾部をも
つｃＤＮＡの連結反応は、３′末端にデオキシシトシン
１２個を含みそして５′末端にＥｃｏＲＩ開裂ＤＮＡの
１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１本鎖
オリゴヌクレオチドリン力一を使用して新規の方法によ
って実施した．連結したＤＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒｏパ
ッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６０
０　ｒｋ−　ｔａｋ”　Ｉｆｆ　ｌ中へ導入した．これ
は、組換え（野生型でない）フエージに感染すると細胞
溶菌される。その方法により、放射性ｊａ識合戒オリゴ
ヌクレオチド〔１７ヌクレオチド長：その配列はウシＨ
ＢＺＤ中に見出される６個の連続するアミノ酸（ＫＷＤ
ＡＷＮ）によって推定した〕を使用し、プラークからの
ＤＮＡを二重にスクリーニングした。コドンが不明なの
で、オリゴヌクレオチドの３２種の縮重プールとしてＭ
ＳＩを合成した。ＭＳ１によるスクリーニングにより陽
性のブラークを得これをブラーク精製し、そして１．８
ｋｂの挿入部を含有することが示された。この挿入部を
プラスミドｐＥＭＢＬ中にサブクローン化した．これを
ｐＭＰ１と称する．挿入部を制限地図化した後、続いて
適当な数片をＭ１３株中に更にサブクローン化し、そし
てＳａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｅｒのジデオキシ法によっ
て配列を決めた．ｐＭＰＩ中に含まれるｃＤＮＡは、Ｍ
ＳＩの種とほとんど同し挿入部の５′末端から約３００
塩基対のＤＮＡ配列を含んでいた．更に、ｐＭＰ１のヌ
クレオチド配列により、配列が決定されているウシＥＢ
ＺＤに関して決定したアミノ酸配列と類似の（但し、同
一ではない）アミノ酸配列が予想された。これらの２種
の蛋白質が密接に関連していることはアミノ酸配列の頴
著な保存性によって示唆されている。配列が決まってい
るＥＢＺＤからアミノ酸３個を除去することにより、残
りのアミノ酸をｐＭＰＪの配列と関連させることができ
、この結果アミノ酸４３％が保存される。更に、多数の
変化が保存的置換を含んでいる（前記の記載を参照され
たい）。
ｐＭＰ１の発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している．最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をｐ
ＭＰ１がコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである． 聾覗遣仁王■又』− ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮ＾は０．６ｋｂｐの挿入部であり、これをｐ
ＥＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＩ）を得た．配列
決定を行なったところ、ｐＭＰ１と相同のコード配列が
得られた。ウシのエンドゼビン（ｂＥＢＺＤ）をコード
するＤＮＡ断片を、』劇１消化およびＮａｅ　Ｉ消化を
組合せることにより、ｃＤＮＡプラスミド（ＥＢＺＤ）
から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製
し、発現ベクター（ｐＳＭ　１　．　２）中にＳｔｕ　
１部位に挿入した，ｐｓＭ１．２発現ベクターの形或は
、ｐＢＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺
伝子（Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ（１９７７）　２　
：　９５）　、ｐＴＲ２１３のＩａｃプロモーターおよ
びリポソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、ｌ’ｒｏ
ｃ．　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＬＩＳＡ（
１９７９）７６：　　１６０−ＩＧ４　）をｐｔ，ｃ３
ｏｏのｉ　−Ｚ融合遺伝子（ＧｕａｒｃｎＬｃ等、Ｃｅ
ｌｌ（１９８０）２０：　５４３　　５５３　）にスプ
ライシングすることによって行なった。得られたプラス
ミドはクローニング部位例えばＳｔｕ　１部位に揮人さ
れた外来遺伝子を融合蛋白質として発現することができ
る。この構造において、ＥＢＺＤに関する全コード配列
は、ｃｒｏ蛋白質の最初の２個のアミノ酸をコードする
ＯＮ八に位相を合わせて融合された。ブラスミドｐｓＢ
１０８は挿入部を正しい配向で含んでおり、プラスミド
ｐｓＢ１０３は挿入部を誤った配向で含んでおり、そし
てプラスミドｐｓＢ１２５は神入部を含んでいない。各
種のプラスミドを含む大腸菌ＨＢＩＯＩ　クローンを対
数期まで増殖させ、そして振とうしなから３７゜Ｃで２
時間、最終濃度ｌ１までＩＰＴＧを加えることによって
誘導した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム
洗浄剤処理によって溶菌した。基本的に、溶菌物は上清
（細胞質ゾル）とペレット（細胞質内封人体）とに分け
て、免疫化学的技術によって分析することができる。
発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐ５８１０１１１１）を含む大腸菌クローンだ
けが高いレベルのＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大
部分のｃｒｏ−ＥＢＺＤは上清分画（細胞質ゾル）中に
見出された。ペレット分画（細胞質封入体）中には、検
出可能な量だけが見出された。一方、ｐｓｎｌ０３また
はｐｓＢ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃ
ｒｏ−ＥＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘
導後に、細胞培養物１１当り０．　５　ｔｐｇのｃｒｏ
εＢＺＤが産生されたものと推定される。
［１ｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳκ−２５０分取用カラム（６０
Ｘ　２．　１　ｃ＋＋＋）を高圧液体クロマトグラフィ
−（［’ＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦ八）０
．１％を含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画
を８■／　ｒｎｌの濃度で熔解した。カラムを０．　Ｉ
％ＴＰＡを含む４０％アセトニトリルで平衡化した。ア
リコート２−（タンパク質１６■）を注入し、最終濃度
０．　１％のＴＦＡを含む水中の４０％アセトニトリル
移動相によって均一に展開を実施した。ＲＦの位置（分
画２３）が分かった後で、前記の操作を二〜三百回行な
った。分画を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッ
セイであった。前記の漫透クロマトグラフィーから脳因
子（Ｇｌ＾）の見掛けの分子量を計算したところ、約１
８ｋＤａ　ｌであった。
ＴＳＫ−２５０　　　の゛　１　　　クロマトグラフィ
−１５試行からのＴＳＫ−２５０画分２３をプールした
（容量７５ｄ）。プールされた材料を水中０．　１％Ｔ
ＦＡにより２倍に希釈した。この混合物を、水中０．１
％ＴＦ八によりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダパッ
クーＣ．カラＡ（７８ｎｕｎ内径Ｘ　３００ｍｍ）に室
温にて均一に注入した。一次溶剤０．　１％ＴＦＡと二
次溶剤０．　１％ＴＦ八を｛’Ｂうアセトニトリルとの
間で直線グラジエントを用いた。グラジエント条件は２
０分間にＯ〜２８％、　１４０分間に２８〜４２％、１
０分間に４２〜５２％、そして次に６分間に５２〜１０
０％であった．すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであっ
た。４−の画分を集めた。各画分のアリコートを５０ｎ
のＢＳＡ　と共に乾燥し、モしてＧｌ＾についてアッセ
イした。
ＣＩＡの２個のピークを貯蔵した。第１の活性（α）は
３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
桔製は次のようにして行った。
ＩＯ試行からの活性画分３０及び３ｌをプールし、そし
て０．１％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμ−ボンダパックカラム（７８　Ｘ　３００腑
）に均一に適用し、モしてカラムを０．　１％ＴＦＡで
洗浄しそして平衡化した。流速は１ｄ／分であり、そし
てチャートスピードはＱ．ｌｃ＋ｓ／分であった。やは
り、第ｌ溶剤０．　１％ＴＦＡと第２溶剤０．　１％↑
Ｆ＾の濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジ
エントを用いた。グラジエント条件は、４０分間に０〜
３０％、２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に
３８〜１００％であった．最初の１２画分は６一であり
、そして次に４一画分を集めた。アリコートをＣＩＡに
ついてアッセイした。活性は３２〜３３．５％の間のア
セトニトリル濃度において？容出した。
両分３０〜３２をプールした。１２ｄの０．１％ＴＦＡ
をプールされた両分に加えた。混合物（２４ｄを、０．
　１％ＴＦＡで平衡化された分析用μ−ボンダバックＣ
．カラム（　３．　９　ｘ　３００ａｎ）上に均一に適
用した．，流速及びチャートスピードはそれぞれ０．　
４　１１１ｆ／分及び０．１ｃｍ／分であった。やはり
、第１溶剤０．　ｌ％ＴＦＡと第２溶剤０．　１％ＴＦ
＾の濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジエン
トを用いた。
グラジエント条件は、２５分間に０〜３０％、２００分
間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％で
あった。２−の画分を集めた。画分のアリコートをＧＴ
Ａについてアッセイした。活性は分析用Ｃ．カラムから
、約３４％のアセトニトリル濃度において溶出した。
画分２９−３１をプールし、そして０．　１％ＴＰＡで
２倍に希釈し、モしてμ−ボンダバックＣ．カラム（３
．９Ｘ　３００ｍｍ）に適用した。第１溶剤０．　ｌ％
ＴＦＡと第２溶剤０．　１％ＴＰＡの濃度を有するｎ−
プロバノールとの間の直線グラジエントを用いた。グラ
ジエント条件は、４０分間に０〜１８％、２２５分間に
１８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であった
。流速は０．４−／分であり、そしてチャートスピード
は０．１ｃｍ／分に設定された。両分を集め、そしてア
リコートをＧｌ＾についてアッセイした。活性は約２３
％のｎ−プロパノール濃度において溶出した．両分２８
及び２９をプールし、そしてＯ．ｌ％ＴＰＡにより５倍
希釈し、そしてＯ．　ｌ％ＴＦＡの濃度を有するｎ−プ
ロバノールを第２？ｆＩ剤として用いてμ−ボンダバッ
クＣ．カラム（３１９Ｘ　３００＋ｎｍ）上で再クロマ
トグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジエン
ト条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初の８
個の両分は６ＩＩ１であり、そして１．　６　ｄの両分
を集めた。各両分のアリコートをＣＩＡについてアッセ
イした。ほとんどの活性が両分１５〜ｌ７に現われた。
画分１５〜１７は約１５Ｊｌｇの蛋白質及び約２３０Ｘ
１０″ユニットのＣＩＡを含有していた。
この画分をｔｌＰＬｃ　　ＣＢ’画分とした。最終精製
画分は、ＣＣＬ６４を拭験細胞として用いた蛋白質ｎ当
り１５．３３　Ｘ　ｔｏ３ユニソトの比活性を有してい
た。
次の第４表は結果を要約する． 第４表　ウシ脳因子の精製 粗製物 ＴＳＫ−２５０ ＋１１”Ｉ，Ｃ−Ｃ１８’　　０．０１５６３０ ３，６８０ １，５５１ ２．　７６０ ２３０ ０．４２１ ４．３８ １５．３３３．００ １００ １８１ １４．８ （傘）　ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキ
シウリジンの取り込みを５０％阻害するために必要な材
料アッセイはＮｕｎｃ９６ウエルプレート（Ｋａｓ＋ｓ
　Ｌｒｕｐｖｃｊ９０，　ＤＫ−ＣＯＯＯ＋　Ｒｏｓｋ
ｉｌｄｅ　，デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細胞（
Ａ５４９）又はミンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細
胞として使用した．１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（０．５７
■／Ｉｄずつ）及びグルタミンを伴うドルベコ改変イー
グル培地（ＤＭＥＭ）　５０　Ｉｌ１中３．５×１０３
細胞を、端のウエル以外のすべてのウェルに導入した。
端のウエルには５０ｍのＰＢＳを導入し、そしてプレー
トを３７゜Ｃにてインキユベートした。
試験サンプルを、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った．４
日後、５０ｍの試験サンプルを各試験ウエルに加え、他
方対照ウエルには５０ｔｔｌの培地のみを加えた。プレ
ートを３７゜Ｃにて３日間インキユベートした。４日目
に、ｉｓｌ−ヨード−２′−デオキシウリジンの溶液（
（４Ｃｉ／■−０．　５ｍＣｉ　／ｘｔｌ　（０．　Ｉ
　Ｊアイソトープ／　ｍｌ、１０％ＦＣＳ　ＳＰ／Ｓ，
グルタミンを含有するＤＭＥＭ中）１００μｌを各ウエ
ルに加え、モしてフ゜レートを３７゜Ｃにてインキユヘ
ートした。５日目に、培地をウエルから吸引し、２００
　Ｉ１！のＰＢＳで１回洗浄した。次に、２００　Ｉｌ
ｌのメタノールを各ウエルに加え、プレートをｌＯ分間
インキユベートし、そしてメタノールを吸引により除去
した．水酸化ナトリウム（２００ｐＩ，　　ＩＭ）を各
ウエルに加え、プレートを３０分間３７’Ｃにてインキ
ユベートし、そして次に水酸化ナトリウムをタイターテ
ック（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ）プラグ（フロー・ラブス）に
より取り出した．プラグを１２　Ｘ　７５０１１のプラ
スチックチューブに移し、そして放射能を定量測定する
ためにＴ一カウンターで計数した。
ソフトアガー・コロニー　　アッセイ １０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中０．５％寒天（ア
ガーノーブル；ディフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン）の２．０一の基層を６０ｎｍのコスター組織
培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、１．　Ｏ
　ｘｌＯ’　Ａ５４９＾ｇ３　（ソフトアガー増殖クロ
ーン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験されるべきサ
ンプルを含有する０．３％寒天を加えた。
プレートを空気中５％ＣＯ．の加湿雰囲気中で３７゜Ｃ
にてインキユベートし、そして７日後に適切な補充物を
含有する０．３％寒天２．　０　ｄの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野５個当り６細胞より多いコロニー
の数を７日及び１４日後に計数した。
コロニーノ　率アッセイ このアッセイは６ウエルーファルコンプレート（　９．
　６　ｃｒＡの面積／ウエル）中で行った。Ａ５４９細
胞（２００）を各ウエル中、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ
及びグルタミンを含むｌ　ａｌｌのＤＭＥＭ中にプレー
トした。プレートした直後に、１．　０　ｔｔｔｌの培
地中種々の濃度の試験材料を２連で加えた。対照ウエル
には試験材料をなんら含まない１．　０　ｄの培地のみ
を加えた。プレート空気中５％ＣＯ２の加湿雰聞気中３
７゜Ｃにて１０日間インキユベートし、５０％メタノー
ル中０．２％メチレンプル−１．０−を各ウエルに添加
し、そして２０分間放置し、染料を除去し、そして各ウ
エルを０．１ｄの水で２回洗浄し、そして空気乾燥した
。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
生理ヱ迫且責 ＤＮＡ合成の５０％阻害が、それぞれ９８ｎ／ｄ、２１
ｔｒｉ／ｙｄ及び９５ｎｇ／ａｙｊ！の粗画分、ＴＳκ
−２５０画分及び最終純蛋白質において観察された。従
って、Ａ５４９ヒト肺癌細胞における５０％ＤＮＡ合成
阻害が純蛋白質の約９ｎＭ濃度において見られた。
ｂＢＦはまた、寒天（Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞八５４
９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の５０％減少が約１６ｎｇ／ｔａｉｌのｂＢ
Ｆにおいて見られた。Ａ５４９細胞のコロニー形成率は
この蛋白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／ｉｔ（
１．２４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形成率
は対照のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約８０ｎ
Ｂ／ｒｎｆｌのｂＢＦの在在下では八５４９細胞のコロ
ニは見られなかった。
八５４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非在在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、ｂＢＦは量依在的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、ＤＮＡへの１２５Ｉ−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
ｂＢＦはＡ５４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５　Ａ
ｇ）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−　７　）の種々のクロ
ーンの増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（Ｗｌ−２
６）の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、
ネズミ線維芽細胞セルライン３Ｔ３−＾３１に対して増
殖刺激的である。
ヒトＴ一細胞機能（Ｚａｒｌｉｎ５等、Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　　４６Ｂ−４
７６　）に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘバリン処理血
液から、フィコールーハイバク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（ＨＳ）が補充されたＲ　ＰＭＩ　１６４０の培
地（ギブコ、グランドアイル、ＮＹ）中にｌ×１０’Ｐ
ＢＬ／ｄの濃度で恕濁した。次に、０，ｌｔｄのこれら
のＰＢＬ　（応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅｌ
ｌ）と称する〕を９６−ウエルプレートの２連の丸底ウ
エルのそれぞれに加え、そして次に０．０５ｄの培地の
み又は２ＸＩＯ’個のＸ一線照射された（２５００Ｒａ
ｄ）同種異系細胞〔゜゛刺激細胞”（ｓｔｉａ＋ｕｌａ
ｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と称する〕を含有する０．０５−
の培地、及び０．０５ｙｉｌの培地のみ又は種々の濃度
の脳因子（０．９〜７５ユニット扇因子／ウエルをもた
らず）を含有する培地を加えた。細胞を５％Ｃ（ｈイン
キュベーター中で３７゜Ｃにてインキユベートし、そし
て２日目及び５日目に０．０５ｚｆｆｉの培地を各ウエ
ルから取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有
する培地０．０５＋＋ｆを添加した。
増殖応答を決定するため、６日目に各群からウエルの内
容物をプールし、そして０．　１−を９６−ウエルプレ
ートの４連のウエルのそれぞれに加え、次に０．０２５
ｄの容量中１μＣｉの’＋１−チミジン（３ＨＴｄＲ　
，ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）
を加えた。６時間後、ウエルの内容物を多ウエル収得器
を用いて゛ガラスフィルターストリンプ上に収得し、こ
れらのストリップをシンチレーション液体を含有するバ
イアルに移し、そして’Ｈ　−　ＴｄＲ取り込みをβ一
カウンター中での計数により決定した． 細胞変１４：Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果
を決定するため、６日目にウエノレからフ゜−ノレされ
た残りのリンパ球を９６−ウエルプレートの３連のＬＲ
底ウエルに加え（０．１５ｄ／ウェル）、そして０．１
５ｍＦ！の４倍逐次希釈物も３連のウェルのそれぞれに
加えた。ＳＩＣ，ラヘル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃ
ｅｌｌ）を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者か
ら生したリンポプラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞
１．５ＸｌＯ’を５００μＣｉ”Ｃｒ（ＮａｚＣｒＯｎ
，　ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ
）により３７゜Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細胞を
１５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培
地で３回洗浄し、そしてこの培地に６ＸｌＯ’細胞／　
ｔｎｌで再ｐ４した。次に、０．０５１ｄの標的細胞を
、エフエクター細胞を収容する各ウエルに、及び培地の
み〔自然（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）　”Ｃｒ放出を決
定するため〕又は洗剤のみ（５１（，放出を決定するた
め）を収容するウエルに加え、そしてプレートを３７℃
にて６時間インキユベートした。次に、上清の一定のア
リコートを各ウエルから取り出し、モしてγカウンター
中で計数するためにチューブに移した。特異的ＳＩＣ，
放出％を次のようにして決定した。
次の第５表が結果を示す。
第５表、ヒトＴ−リンパ球のアロ抗原 誘４増殖応答に対する脳因子の効果 ２０７ １０３．６９０ ？０，　１４０ ６４，５０７ ７８．２８７ ８７．０９５ ９９　５５２ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体■のヘパリン処理
血液から得られ、そして個体ＣからのＸ一線照射された
（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ）により刺
激され、そして６目後、３］１−チミジン（’Ｈ　Ｔｄ
Ｒ）の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
ＣＰＭ−カウント／分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬＯＴ一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ−リンパ球
の生威に対して観察された。
同し量の５ＩＣ，放出を生じさせる未処理のエフエクタ
ー細胞の数として、７５ユニットの脳因子と共にインキ
ユベートされた約１６倍多くのエフエクター細胞が４２
％の５ＩＣｒ放出を生じさせるために必要である。
上記の結果から、この発明の化合物はインビト口及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血消、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、＆ＩＮ織中の細胞によって形威され
るポリベプチトの量の決定のため、診断的に使用するこ
とができる。さらに、この発明の化合物はポリペプチド
のりセプターの決定のために使用することができる。さ
らに、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存
在下で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤
として、又はジアゼパムリセプターもしくはＧＡＢＡ一
作働性リセプターと関連する生理学的機能を調節するた
めに使用することができる。従って、脳組織由来の脳因
子化合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等の
ために、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉種、又は
癌における正常細胞と腫瘍細胞との混合物からＲｔＵ細
胞を除去するために他の添加物と組合わせて使用するこ
とができる。脳因子化合物はまた、Ｔ一細胞の増殖のｊ
ＰＪ　ｆ！ｆｆのためにも使用することができる。ＥＢ
ＺＤ化合物はＥＢＺロリセブターの活性を調節するため
にも使用することができる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、活性ポリペプチド成分を含有し該活性ポリペプチド
    成分に関して実質的に均一なポリペプチド組成物であっ
    て、該ポリペプチドは、水性０．１Ｍトリフルオロ酢酸
    −ｎ−プロパノールでの２０％〜２６％ｎ−プロパノー
    ル画分で溶出すること、約８〜１８ｋＤａｌであること
    、腫瘍細胞又はＴ細胞の成長を抑制すること、及び哺乳
    動物の脳中に見いだされる、ことを特徴とする、上記の
    ポリペプチド組成物又はその生理学的に活性なフラグメ
    ント、をコードしており、そして適切な方向で、少なく
    とも１つの、野生型プロモーター以外のプロモーター、
    野生型ターミネーター以外のターミネーター、又は野生
    型複製系以外の複製系に結合されているＤＮＡ配列を含
    むＤＮＡ表現構造体。 ２、該複製系、プロモーター及びターミネーターが原核
    生物宿主中で官能性である、請求の範囲第１項記載のＤ
    ＮＡ発現造成物。
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