JPS62501841A - Ｅｂｚｄ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脳に由来するポリペプチド因子及びそれに対する抗体発明の背景 発明の分野 細胞の成長及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性のホルモン及び因子によ って開始され、促進され、維持されそして調節されることは明らかである。細胞 ホメオスタシス機構の変化及び／又は破壊は成長に関連した疾患（腫瘍形成を含 む）の基本的原因であると思われる。成長調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々 の疾患（例えば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるのでそれらの単 離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興味があり、更にまた特に有糸分裂が癌に 影啓を及ぼすかもしれない場合のその有糸分裂の基本的機構を理解することにか なりの興味がある。

成長及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によって調節され、その場合 に蛋白質はリガンド又はレセプターとして役立つことができる。脳の機能及び外 部及び内部の刺激に対する応答のその調節についてのその上の研究は、痛み、気 分、等のような刺激に対する応答の調節に伴われる無数の化合物が単離される結 果となっている。

不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に用いられているベンゾジ アゼピン（ＢＺＤ）は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）で仲介された抑制性神経伝 達の増強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。ＢＺＤによるＧＡ ＢＡ−作動性（−ｅｒｇｉｃ）伝達の調節における第一段階は特定の中枢神経系 中の高い親和性かつ飽和できる結合性部位に対する結合であると思われ、この場 合にその結合性部位は“超分子複合体”　（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃ ｏｍｐｌｅｘ）の成分であると考えられる。

この系を理解すること、並びにその系を調節又は制御することができることの必 要性は、天然リガンド及びそれが機能する態様を知ることに依存している。

これらの因子の検知、単離及び精製は、その混合物の複雑性、その混合物中の種 々の成分の諸活性の逸脱、広範囲の種類の試薬による諸成分の非活性化への感受 性、化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するその化合物をもつ可能 性、及び種々の精製段階を追跡するためのバイオアッセイを提供することにおい てしばしば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにもかかわらず、精 製及び分離に実質的な進歩があり、その進歩は関心のある生成物の検知及び単離 の助けとなっている。

従米荻斐ｐ見所 Ｂｅａ　Ｉ等、Ｃａ　ｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅ　、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　（１９７ ９）　３　：　９３−９６は、成長及びＤＮＡ合成を正常細胞中でよりも形質転 換細胞中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在することを報告しているｍ 　Ｈｏ１ｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８ ０）　７７　：５９８９−５９９２は、上皮細胞成長阻害物質の精製を記載して いる。

Ｌｅｔａｎｓｋｙ、　Ｂｉｏｓｃｉ、　Ｒｅ　、　（１９８２）　２　：　３９ −４５は、ウシの胎盤から精製されたペプチドが腫瘍の成長及びＤＮＡ中へのチ ミジンの取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層大きな程度に抑制するこ とを報告している。ＣｈｅｎＸＴｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

」吐ユ１９８２）ユニ　３６４−３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水 流体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄｉｎｇ及び５ｃｈａｌｌｙ　、 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９８２）７９　：　７０１４ −７０１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗分裂促進活性を示す 精製ペプチドをブタの視床下部から単離することを報告している。これらの殆ど の因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基本的構造は知られてい ない。

ジアゼパム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８３）６０　：　３８３　３８５、　Ｃｏｓ　 ｔａ等１．〜〕シ」Ｌエン２］トリｊλにューｎ＋ａｃｏ１．　（１９８４）　 ２３　：　９８９−９９１、Ｆｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ 。

（１９８４）　２３　：　１３５９−１３６２、及びへＲｈｏ等、５ｃｉｅｎｃ ｅ　（１９８５）　２２９：１７９−１８２によって報告されそして説明されて いる。

凹−汁 新規な諸方法及び諸組成物が提供され、諸組成物は、ゲル浸透カラムで酸性水性 アセトニトリルを用い次いで逆相１１ＰＬＣで線状グラジェントの酸性（０，１ ％トリフルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から単離することので き、その上にそのような諸組成物の諸成分及びそのような諸成分と実質的に相同 の領域をもつ諸ポリペプチドが提供される。その諸組成物及び諸成分は、ジアゼ パムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、新生物細胞の成長を遅 延させル用途があるであろう。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列 が提供され、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの生産を可能にす る。主題のポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。

詩淀少ズＪＬ！ｉ目其ｌ勘− 天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わせ、個々のポリペプチド 化合物類、それの生理学的に活性なフラグメント類からなる新規な諸組成物、及 び種々のポリペプチドをコードしている核酸配列類が提供される。そのポリペプ チドはを椎動物、特に哺乳動物の脳細胞中に自然に見いだされるポリペプチドに 相同であるか又は実質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をもつ。そ の諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細胞中に特異的に位置してい るか又は脳以外の広範囲の種々の組織中に一般的に見いだされる。そのポリペプ チドは、ホモジナイズされた脳組織又はその精製された両分を用いてクロマトグ ラフィーカラムから酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによって単離 可能であることを特徴とする。一つの因子は逆十旧１円、Ｃ及びゆるやかな線状 グラジェントの酸性水性アセトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実 質的に純粋に単離することができる。その他の成分については所望の活性は水性 酸性ｎ−プロパツールを線状グラジェントとして用いて更に精製することができ る。そのクロマトグラムは、約０．１〜０．５　＋ｎ１／　ｍ　ｉ　ｎの流量で 合理的な分離を得るために４時間以上の時間にわたって展開することができる。

逆相１１ＰＬＣを用いての分離では脳組織からの部分的に精製されたサンプルと なるのが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透クロマトグラフィーを用い溶離 剤として酸性水性アセトニトリルを用い、特に均一に溶出することによって好都 合に達成することができる。好都合には、媒質は０．１％トリフルオロ酢酸水溶 液中の４０％アセトニトリルであることができる。

二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ。

内因性ペンゾジアゼビンオイド又はエンドゼビン（ＥＢＺＤ）と呼ばれる一つの 因子は、ベイリウム（ｖａｌｉｕｍ）アゴニストとしてジアゼパムレセプターに 結合する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明らかである。ＥｎＺＤ は、低い投与量では、哺乳動物に興雪及び増強された意識を引き起こし、一方高 い投与量では、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体については、低い投与量 では心臓拍動度数は低下し、一方高い投与量では心臓拍動度数は増大する。それ らの化合物はジアゼパム結合性阻害剤について公表された（前記のＧｕｔｄｏｔ ｔｉ等の文献）配列との幾らかの相応を示す。

そのペプチドは、脳シナプトソームへのベンゾジアゼピンの結合を抑制すること において、約１〜１０囲、普通には３〜６戸〇に、をもつことを更に特徴とする （後記の実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル浸透クロマトグラ フィーによって測定して約７〜１５ｋＤａｌ、普通には８〜１２ｋＤａｌ、又は ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで６〜１０　ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記の実験の 項を参照のこと）。そのペプチドは親水性である。１ｏｏｏユニット／ｍｇを越 える比活性を得ることができる（後記の実験の項を参照のこと）。

ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢＺＤのアミノ酸３３〜５ ２を含むフラグメント（異なった種の中の共通配列）はジアゼパム結合性阻害剤 としての活性をもつ。

第二の成分は脳因子（ＢＦ）と呼ばれ、そして前記したようにして脳Ｍｉ織から 単離することができる。この因子はＥＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、 そしてゲル浸透精製においてＥ［ｌＺＤよりも遅い。その化合物は、総て後記の 実験の項に記載されているように、肺癌細胞の成長を抑制するのに、並びに軟寒 天コロニー形成及びコロニー形成率を抑制するのに有効であることが見いだされ ている。

ＢＦは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーからめて約５〜２０ｋＤａｌ、ｖ 通には約８〜１８　ｋＤａｌの分子量をもつ。

その蛋白質は逆相１１ＰＬｃ及び線状グラジェントの０．１％ＴＦＡ水性ｎ−プ ロパツールを用い、約２０〜２６％ｎ−プロパツールで溶離して精製することが できる。その精製された蛋白質は少なくとも約１５Ｘ１０″ユニツト／μｇの比 活性をもつことができる（後記の実験の項を参照のこと）。

第三成分は、アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤのアミノ酸５４〜５９） をコードするオリゴヌクレオチドのプールであるプローブを用いて得ることがで きる。その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー配列及びストップ トランスファー配列をもち、それで表面膜蛋白質として作用することができ、こ の場合にそのペプチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実質的に脳組 織中に位置している。

その蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特にを椎動物、一層特定的には削孔動 物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ、ネズミ、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得る ことができる。それらの化合物は天然に生じるままに用いることができ、又は種 々の方法で、例えば、グリコジル化を欠乏させ、末端アシル化（特にアセチル化 又はホルミル化）を欠乏させ、レセプター（例えば、抗体）への競合的結合能力 のような生理学的活性をもつフラグメントを使用し、欠失、挿入を行い、他のペ プチドに融合させ、他のペプチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハブ テンに共有結合させ、又は１個以上の、普通には数で約１０％以下の、一層普通 には数で約５％以下の、挿入、欠失、トランジション又はトランスバージョンに よって変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、変更することができ る。

各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する。

ＥＢＺＤポリペプチド ＥＢＺＤポリペプチドは約２０キロドルトン（ｋＤａｌ）未満、普通には約１５ ｋＤａ１未満であることを特徴とし、そして普通には少なくとも約１　ｋＤａｌ 、一層普通には少なくとも約２ｋＤａｌである。

そのポリペプチド組成物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下で０．１％水性トリフル オロ酢酸中の０〜６０％アセトニトリルの線状グラジェントを用いて、２８〜５ ０％アセトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、一層特定的には約２９ 〜３６％アセトニトリル、一層特異的には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内 で１１−ボンダバック（Ｂｏｎｄａｐ、１ｋ）　−Ｃｒ　ｅカラムから？８出す ることを更に特徴とする。

ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、一層普通には少なくとも約２０ 個のアミノ酸、そして約１２５個よりも少ないアミノ酸、９通には約１００個よ りも少ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は１、後記の実験の項で説明するよう に））Ａ　Ｇ　Ｂ又はゲル浸透クロマトグラフィーを用いて約７〜１５ｋＤａｌ の範囲内の分子量をもつ。

ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも１つ、好ましくは下記の アミノ酸配列の少なくとも２つ、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくと も３つをもつことを更に特徴とし、その場合にその配列は３個までのアミノ酸の 挿入又は欠失又はその組み合わせによって維持されていてもよい。

ａ　、Ｙ　ａａ　＠　ａａ”　ΔｒＫ　ロ　八　Ｔ　ａａ　’ｂ、ＫＷＤＡＷ ｃ、ＡＭａａ’ＡＹ　（Ｘ）ｘＶＥＥ ｄ　、　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａ’　Ｅ　Ｅ　Ｍ　Ｌ　Ｆ　Ｉ　Ｙ　ａａｏＩ ｆ　Ｙ　Ｋｅ、ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤｆ、ＱＡＴＶＧＤ　ＩＮＴＥ ＲＰＧＭＬＤＦＴＧＫｇ、にＧＴＳＫＥＤへ 上記の配列において、 ａａ”は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及びヒスチジンであり； ａａｂはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であって、それは酸性、塩基 性、又は中性でもよく、好ましくは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性ア ミノ酸であり；ａａｃはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であることが でき、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定的には約５〜６個の炭素原子をも つ塩基性又は中性アミノ酸であり；ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは 極性又は非極性でもよ（、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個の炭素原子を もつものであり； ａａ”は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド ロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつものであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性又は酸性でもよく、特に酸性ア ミノ酸又はそのアミドであって且つ４〜５個の炭素原子をもつであり； Ａｒは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン及び トリプトファン、特にＹを包含し；ａａｑは脂肪族アミノ酸、特に４〜６個の炭 素原子をもつ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に４〜５個の炭素原子を もつ中性極性である時にはアミド基をもち、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり ； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり、それはいずれのアミノ酸でもよく、特に脂肪族 アミノ酸、−１’ｆｆｌ特定的には第一中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそ のアミド、及び第三塩基性アミノ酸をもつものであり；そして ＸはＯ又は１である。

主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブクラス分けられる。下記 の表はそのサブクラスを示している：脂肪族 中性 非極性　ＧＡＰＶＬＩ 極性　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　ＤＥ 塩基性　ＫＲ 芳香族　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の少なくとも１個を含むポ リペプチドは特に興味のあるものである： ａ　、ＴＫＰａａ’ＤＥＥＭＬＦＩＹａａ’１ｌＹＫ０八Ｔａａ’Ｇｂ、ＫＷＤ ＩＶａａ’　ａａ’Ｌａａ’ａａｊａａ’ａａ’ＫＥａａ”へＭａａ’へｙ　（ Ｘ）　ｘＶＥＥａａ’にに ｃ、ＫＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤＦＴ上記の配列において、 ａａ’　、ａａ”　、ａａｑ、及びＡｒは前記で定義した通りであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜６個の炭素原子をもつ中性又 は酸性、一層特定的には５〜６個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることがで き；ａａ’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、−Ｓ普通には３〜４個 の炭素原子をもち且つ特にヒドロキシル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ 極性アミノ酸であり；ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置換 基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特に極性又は酸性アミノ酸で あることができ； ａａ’は脂肪族アミノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子をもつ中性又は塩基性ア ミノ酸、一層特定的には非極性中性アミノ酸であり； ａａ’は中性又は酸性のいずれかであり、中性である時には好ましくは非極性で あり、そして特に約２〜５個の、一層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族 アミノ酸であり；ａａ″は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、−Ｎｖ通に は４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素又は硫黄）官能基、特にヒドロ キシル基又はメチルチオ基をもつ極性アミノ酸であり； ａａＬは脂肪族中性アミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭素原 子をもつ極性アミノ酸であり；ａａ″′は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性 アミノ酸であり； ａａ’は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性又は 塩基性アミノ酸であり、この場合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であ り；ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に３〜６個の炭素原子をも つ非極性アミノ酸、好ましくはＡであり；ａａ”は３〜４個の炭素原子をもつ脂 肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロキシル 基をもち、好ましくはＡであり； Ｘ′はＸと同じであり、ｆ通には１〜３個のアミノ酸であり、それは脂肪族アミ ノ酸であり、それは一般的には４〜６個の炭素原子をもつ中性、酸性又は塩基性 であることができ、特にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド、 及び塩基性アミノ酸であり； Ｘは０又は１であり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜６個の、普通には５〜６ 個の炭素原子をもつ極性又は非極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸で ある時には、特にメチルチオ基をもつ。

Ｘの他に更に、本発明のポリペプチド群の種々のメンバー間に共通構造を維持す るために１〜３個、好ましくは１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理 解されるであろう。

又、アミノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが、ある場合には、Ｄ−アミノ酸が使用 されてもよい。

特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範囲内に入る少なくとも１ ０個、普通には少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸から なるそのフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラグメントをもつ： ψＺ’　−ａａ’−ａａ２−ａａ″−ａａ’　−ａａ’−ａａ６−ａａ’　−ａ ａ’Ｋ　−ａａ”−ａａ目−ａａ”−ａａ”−ａａＩ４−　Ｐ　−ａａ”−ａａ ”Ｅ　−ａａＩ９−　Ｍ　−Ｌ　−ａａ２２−ａａ”　−Ｙ　−ａａ”−ａａ” ａａ”　−Ｋ　−Ｑ　−Ａ　−Ｔ　−ａａ”　−Ｇ　−ａａ”−ａａ”−ａａ３ ６ａａゴ’−ａａ”−ａａ”　−Ｐ　−Ｇ−ａａ４２−ａａ”　−Ｄ　−ａａ” ａａ４ｈ−Ｇ　−ａａ”−ａａ４９−　Ｋ−Ｗ　−Ｄ　−Ａ−Ｗ−ａａ５５ａａ ５６−　Ｌ　−ａａ５′！−ａａ５９−ａａ”−ａａ”　−Ｋ　−Ｅ　−Ｂａｂ ａＡ−Ｍ　−ａａ”−ａａ”−Ｙ　−（Ｘ）ｘ　−Ｖ−Ｅ−Ｅａａ７３−　Ｋ　 −Ｋ　−ａａ”−ａａ７７−ａａ”−ａａ７９−　ＺＣ上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜９個のアミノ酸であり、 そのアミノ酸は脂肪族又は芳香族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいずれの配列も、例えばＥ　 Ａ　Ａ又はＨ−Ｅ　−Ｔ　−Ｒ等もａａ’に結合することができ、またこの場合 に、２個のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれかのアミノ酸を選 ぶことができ、好ましくは同じライン上のアミノ酸が一緒に採用され； ａａ“６″１は２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特にグリ シン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり； ａａ５１１６＋　２５＋　３５＋　３’Ｔ−５５・６０＋　６１＋　６１１＋７ ３・７９は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特にａａ５＋ ＋６°！Ｓ、　３５°３７゜７：１１？９がいずれかのものであり、そして残り が好ましくは極性アミノ酸、特にセリン、スレオニン、システィン、メチオニン 、アスパラギン及びグルタミンであり；ａａ”　６１　ｆｆ°Ｉ？＋＋９＋３２ °３４′３Ｂ＋　Ｓ＆＋　５９°ｂ４＋　７８は脂肪族中性アミノ酸（極性及び 非極性アミノ酸を包含する）又は脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及び グルタミン酸であり；特にａａＩ′７°３２°ｆｆ４＋　５９・７８は中性アミ ノ酸である時に非極性であり、残りは中性アミノ酸である時に極性であり、そし てまたａａ”６゛７°Ｉｆｆ＋＋９＋２４°３Ｂ＊Ｓｂ・６４　は好ましくは酸 性アミノ酸であり；ａａＺｌ　ｌｏ＋　１３＋　２２＋　２％・２６・２７・４ ２＋　４３°４５°４９・７７は脂肪族中性アミノ酸又は芳香族アミノ酸、特に フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、及びトリプトファンであり、好まし くは、ａａＺｌ　Ｉ　Ｏ＋　２６＋　２？・４５＋ｊ’ｌは好ましくは芳香族ア ミノ酸であり、一方残りのアミノ酸は好ましくは脂肪族アミノ酸であり；ａａ３ ＋　９″＋　２＋　１４１３６１３９・４６・４８＋５８°６７°７６は脂肪族 中性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニンであり、この場合にａａ’ ・′６・６７・７６は塩基性以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは 塩基性以外の時に好ましくは極性であり、但しａａ４″は極性でも非極性でもよ く、そしてａａ１暑２・＋　４＋　３’＋＋　４Ｂ−’１１１１６７°７６は好 ましくは塩基性アミノ酸であり；ａａ”は塩基性又は芳香族、特にフェニルアラ ニンであり；Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてＺＣは０１ｉ、ＮＯ ３、又は１〜６個の、３￥ＩＬ通には１〜４個のアミノ酸の、特に２〜６個の、 普通には４〜６個のアミノ酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列 Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔの範囲内の配列である。

１個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には３個用Ｊ−，の変更を伴 わない）、そしてその共通配列はＸとし７て示した以外の３個まで、好ましくは ２個以下のアミノ酸の挿入又は欠失を必要とするかもしれないことが理解される 。

興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少なくとも１５個、好ましく は少なくとも３０個のアミノ酸を配列上記の配列において、いずれかの部位にあ るいずれかのアミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換されてもよく 、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用され、一方下方のアミノ酸は一緒に採 用され、−ＪＭ好ましくは同じライン上のアミノ酸は一諸に採用され、そして星 印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を意図しており、そしてＺは Ｏ又は１である。その配列は合計で１０個までの、普通には合計で８個までのア ミノ酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ−末端は追加の配列Ｖ　−Ｈ −Ｅ　−Ｔ　−Ｒ又はそれのいずれかの部分をもっことができ、そしてＣ−末端 は配列Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｔ又はそれのいずれかの部分をもっことができる。

特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約１５個、好ましくは少なく とも約２０個、一層好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸をもち、下記の配 列の１つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのような配列は少なくと も１０個、好ましくは少なくとも１２個、そして一層好ましくは少なくとも１５ 個の、星印（＊）で示したアミノ酸を含む（ｂ＝ウシ、ｈ＝ヒト）。

Ｅ−Ｍ−に−に−Ｉ−Ｌ−Ｅ−Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ−Ｔ主題の発明の特に好ましい組 成物については、上記の諸配列が、約５個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失 され又は置換されて、又はそれらの組み合せによって、変更されていることがな く、好ましくは約３個以下のアミノ酸によって変更されている。

ＥＢＺＤ組成物は少なくとも約２０％の純度、一層普通には少なくとも約３０％ の純度、好ましくは少なくとも約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９ ５％の純度、望ましくは１００％の純度である。由来組織からの成分を実質的に 含まず、１重量％未満、好ましくは約０．１重量％未満、一層好ましくは約０． ００１重量％未満の、由来Ｍｉ織からの成分をもっＥＢＺＤ組成物は特に興味が ある。主題のＥＢＺＤｋＪｉ成物は、後記の実験の項で記載する゛アッセイ条件 下で粗シナブトソーム膜に結合する：ＬＨ−ジアゼパムの４０％競争に必要な量 によって測定して、少なくとも１５ユニツト／■の比活性をもつ。比活性は普通 には少なくとも５００ユニツト／■、好ましくは少なくとも約１０００ユニツト ／ｍｇであり、そして１２５ｏユニット／■以上であってもよい。一般的には、 松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織１ｇ当り少なくとも約１０Ｉ ！ｇ当量あり、そして普通には脈絡叢生の湿った＆［［１ｇ当り少なくとも約２ ０ｔｔｇ当量ある。前記したように、主題の化合物は心臓細胞集合体の収縮にお いて心臓収縮度数に影響を及ぼすことができ、少ない投与量では心臓収縮度数を 低下させ、この少ない投与量は一般的には約１５０ｘ／＋ｎｊ未満である（実験 の項を参照のこと）。ＥＢＺＤのその他の特徴は、生理学的活性がＥＢＺＤにつ いて立証される種々の試験から明らかである。

１」１玉 脳因子は少なくとも２ｋＤａｌ、　一層普通には少な（とも５ｋＤａｌそして約 ２５ｋＤａ１以下、−ｉｔ通には約２２ｋＤａ１以下であることを特徴とする。

脳因子は、細胞成長調節アッセイによって立証されるように、少なくとも約１× ｌｏ３、一層普通には少なくとも約５×１０：ｌ、好ましくは少なくとも約１０ ６、好ましくは少なくとも約１．５Ｘ１０’の比活性をもつ。脳因子は普通には 少なくとも約１０％の純度、一層普通には少なくとも約５０％の純度、好ましく は少なくとも約８０％の純度、−ｉ好ましくは少なくとも約９５％の純度、望ま しくは１００％の純度である。特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの 成分、例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質、それらの組み合 せ、等を実質的に含まないことが望ましい。

脳因子の配列は、Ｎ−末端近くに又はＮ−末端に実質的に下記のアミノ酸配列を もつ配列を含む：Ｎ−に−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−に−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−に− １−Ｘ−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示す。

脳因子はヒｌ−Ｔ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又は器官移植ｍ織をもつ 宿主の治療のための免疫調節剤としての用途があり、単独で、又はその他の免疫 抑制剤、例えばシクロスポリンＡ又はコルチコステロイドとの併用で用いられる 。

ｇ−通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少なくとも６５％、好まし くは少なくとも約７５％の相同である（個数での％は、欠失、挿入、及び変量を 追加の差異として計算することを意図している）。

主題の脳因子は細胞成長の抑制及び軟寒天コロニー形成の抑制においても活性を 有する。従って、主題の化合物はインビトロ内及びインビボにおいて新生物細胞 の増殖を抑制するのに用途があり、一方、正常細胞にほとんど影響を及ぼさず、 通常は新生物細胞と正常細胞との間を少なくとも１桁の、好ましくは少なくとも ２桁のオーダーで識別することができる。

銑皿皇ｌ 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもっ：Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ｌｅａ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

５’−ＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＡＧ Ｔ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＣＣＣｌ起５（ニア１　（ｙ）ｒ　ａ　、ウシの脳に由来 するとＤＮＡクローンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ配配列（＊）。

アミノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係で番号づけされている。ＥＢ ＺＤと相応する領域は太線によって上に線引きされており、そして疎水性及び非 変更のアミノ酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在的なグリコジル化部 位は囲まれている。

それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％、’　ＪＶｊ汁ｓｍには 少なくとも約７５％、そして好ましくは少なくとも％’＞９５％をもつ。ＵＰ、 ＺＤとの相応性をもつ、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は少 なくとも約１０％の純度・好ましくは少なくとも約５０％の純度、一層好ましく ハ少なくとも約８０％の純度、そして特に好ましくは少なりトモ約９５％の純度 、望ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物は望ましくはそれの 由来する組織からの成分を含まない。

膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に特徴とする。

興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントとして含まれ、それはヌク レオチド１７０の又はヌクレオチド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリ ペプチドを含む。

主題のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として用い体の生産のための抗原 として用いることができる。慣用の方法に従ってポリクロナール又はモノクしナ ールのいずれかを調製することができる。主題のポリペプチド又はそれのフラグ メント、一般的には少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそれ自 体で使用することができるが、しかし好ましくは、免疫系を活性化するアジュバ ント又は抗原に結合させられる０種々の抗原、例えば、血清アルブミン、遊孔カ サガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、グロブリン、等を用い ることができる。ポリペプチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ ルタルアルデヒド、マレイミド安、ｅ、香酸、ジアゾ安息香酸等を利用すること ができる。アジュバン１−としてはフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、 水酸化アルミニウム、等がある。抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この 場合に２〜４週間の間隔で１回以上の追加免疫注入を行なう。モノクロナール抗 体を用いる場合には、通常は原免疫及び追加免疫の注射をマウスに注入し、その 肺臓を単離し、その肺臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ−を用い て融合させる。例えば、Ｇａ１ｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６虹５５ ０；ＫｅｎｎｅｔＬ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ旧ｃｒｏｂｉｏｌ ｏ　ａｎｄハ慇匹旦、　（１９７８）　８１　：　７７　；米国特許第４，３８ １．２９２号及び第４，３６３，７９９号を参照のこと。しかしながら、特別の 目的に対しては、その他の哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）を、ヒｔ−Ｆ 　ｃ　鎖をもつ抗体の生産のために、用いることができる。

ＥＢＺＤポリペプチド及びＥＢＺＤポリペプチドに特異的に結合する抗体は、個 々に又は−緒にして、インビボ及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合 物はジアゼパムレセプターへの結合のためのアゴニストとして用いることができ る。主題の化合物は、ジアゼパムレセプターの数及び分布をめるのに用いること ができる。加えて、主題の化合物は哺乳動物宿主の心臓拍動を調節するのに、哺 乳動物宿主を鎮静させるのに、又は哺乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用途 がある。

脳因子ポリペプチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、個々に 又は−緒になって、インビボ及びインビトロの両方で用途がある。そのポリペプ チドは腫瘍抑制特性をもっているので、そのポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の 成長を抑制するために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合物と共 に用いることができる。それ故に主題の化合物は下記の場合のような状態で用い ることができる：正常細胞を突然変異させる場合、この場合には突然変異の発生 の結果として正常細胞及び腫瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる ：骨髄が哺乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生細胞の成長を抑制す る場合；細胞集団中の主題のポリペプチドについての結合部位を検知する場合、 等。その脳因子ポリペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又はとり出すた めに用いることができる。

脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソーム中に封入する（この場 合にリポソームは腫瘍細胞について特異的な又は優先的な抗体に結合していても よい）か等によって、腫瘍細胞の成長を折抑するために生体内で用いることがで きる。他の方法としては、主題のポリペプチドは免疫調節剤として用いることが できる。

ポリペプチドは、ポリペプチドについての診断において、それ自体で又は抗体と の組み合せで用いることができる。

診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又は両方がラベルされ又はラベルさ れないであろう。多数の診断アッセイが文献に記載されており、主題のポリペプ チド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素放射性核種、フルオレッサー、粘 質、補酵素、粒子（例えば磁性粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含 む。これらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３．８１７，８３７号 、第３．８５０．７５２号、第４．１７４，３８４号、第４，２７７．４３７号 及び第４，３７４．９２５号を参照のこと。

種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘテロゲニアスイムノアッ セイに分けられ、この場合その区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体を その特定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなければならないがど うかに依存する。種々のアッセイ法はＥ　Ｉ　Ａ、　ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ホモ ゲニアスＥＩＡ、　ドツト−プロット、ウエスターンズ（Ｗｅｓ　ｔｅｒｎｓ） 等と称される。

主題のポリペプチドに対する抗体は抗イデイオタイプを生産するために抗原とし てそれ自体で用いることができ、この抗イデオタイプは競合抗原として役立つこ とができ、主題のポリペプチドのエピトープ部位と競合するエピトープ部位をも つ。それ故に、これらの抗イデイオタイプはジアゼパムアゴニストとして、腫瘍 抑制剤として、主題のポリペプチドの代用品として、又は主題のポリペプチドに 対するアンタゴニストとして役立つことができる。

上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプチド群、並びに結合特異 性のような生理学的特性、例えばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共 有する非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然源、主として脳組 織から得ることができる。しかしながら、主題の天然組成物は多数の種々の組織 、例えば肺臓及び精巣中に見いだすことができる。

主題の化合物を単離するために、脳組織から血餅を排除し、ホモジナイズし、酸 性（ｐＨ＜４）条件下で有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４ｋＤａ １未満である。低分子量物質を除去する。その生成物を次いでゲル浸透カラム及 び約３５〜４５％アセトニトリルを含有する０、１％トリフルオロ酢酸水溶液溶 離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑制剤として作用するらしい化合物 を排除する。その諸両分をバイオアッセイによって観察する。その生成ＥＢＺＤ 画分を、逆相高圧液体クロマトクラフィーカラム、例えば、μｍボンダバ、２ク ーＣＩ８カラムを用い、水性０．１％トリフルオロ酢酸中の約０〜６０％アセト ニトリルの線状グラジェントを用い、そして長いカラム及び遅い溶出速度、例え ば４時間以上、好ましくは５時間以上を用いて更に精製した。主題のＥ［ｌＺＤ 化合物は約３０〜５０％アクリロニトリル、−ｍ特定的には３０〜４０％７クリ ロニトリルの両分中に見いだされる。

ＢＦ化合物含有画分を、逆相１１ＰＬｃを用い、０．１％水性７セトニトリルの 線状グラジェントを用い、３２〜３６％アセトニトリルで溶離し、このプロセス を１回以上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を次いで、逆相肝し Ｃを用い、０．１％水性ｎ−プロパツールの線状グラジェントを用い、約２２〜 ２４％ｎ−プロパツールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り返して、更に精 製する。

他の方法として、主題のポリペプチドは、特にポリペプチドが３０個未満のアミ ノ酸、一層特定的には２５個未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合成 することができる。

例えば、ｎａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　 Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｓ　ｎ−ｔｈｅＳｉｓ、“Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ＋　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　”　。

５ｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 、　Ｐａｒｔ　Ａ＋　Ｖｏｌ、　２＋Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅｒ［、 ＾ｃａｄｅｍｔｃ　Ｐｒｅｓｓ　（米国）　１９８０．１〜２８４頁を参照のこ と。

比較的大きなポリペプチド、特に約２０個以上のアミノ酸をもつもの、一層特定 的には約３０個のアミノ酸をもつものについては、そのポリペプチドをコードす る配列を得るためにハイブリッドＤＮＡ技術を用いることができ、それは次いで 公知の方法に従って所望のポリペプチドの発現に用いることができる。ポリペプ チドをコードするためにゲノムＤＮＡ。

ｃＤＮＡ、合成りＮＡ又はそれらの組み合せを用いることができ、いずれかのイ ントロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライシング系をもつ宿主細 胞を用いることによって解決される。はとんどの場合において、オープンリーデ ィングフレームが用いられ（イントロンなし）、この場合にそのリーディングフ レームをコードする配列は発現宿主中で機能する転写及び翻訳調節シグナルに連 結される。

特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺ［ｌについて得られるｃＤＮＡがある。

このｃＤＮＡは開始のメチオニンから約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグ ナルから下流のポリ　（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを含む。下記はヒト及 びウシｃＤＮＡ配列を示している。

八ＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴ−−ＣＴＡＡＴＡ、ＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴ ＣＡＴＡＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧ−−−−−−−−−−− −−ＴＴ−−−−−−−Ｃ−丁一−−−−ＧＴ−ＧＡへ　３′ＣＴＣＡＡＧＡＣ ＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡ　５１１ＴＧＡＣＴ＾＾ＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧ ＾八ＡＣＧＧＴＴＡＣＴＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴにＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡ ＧＴＡＧＡＴＧ八八ＴＴＡ八八八ＧＴＡＴＣＴＴ　’５９０へへＴＴＡへへへＴ ／ＡＣＴＴＣＧ／ＡＴ（ｐｏｌｙ　＾）−３’　６０７上記はウシとヒトのヌク レオチド及びＩＥＢＺＤの推定されたアミノ酸配列との比較を示している。ヒト の配列において異なっている残部はウシの配列の上及び下に示されており、それ は３つのオーバラップするｃＤＮＡクローンからめられた。ヌクレオチド残部は ウシのクローンの複合配列に関して番号付けされており、アミノ酸残基は開始の メチオニンに関して番号付けされている。ウシ、の配列のリーディングフレーム は星印（＊）に挟まれている。ポリ　（Ａ）＋３つの別個のクローンの付加部位 における差異は逆スラッシュによって示されている。ウシのｃＤＮＡブローフ゛ を調製するのに用いられたＮａｅ　Ｉ及び旧ｎｄｍの制限部位が示されている。

実験の項で示した配列、又はそのフラグメント、少なくとも約４５個の塩基（１ ５個以上のコドン）をもつフラグメントが、主題の発明のポリペプチドの発現に 用いることができる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダプター等を 用いることによって、その配列を天然産配列から変化させて、サイレント突然変 異又は非野生型アミノ酸をコードするコドンをもつ配列を作ることができる。従 って、天然ポリペプチド、及び相応の生理学的特性をもつがしかし】個以上のア ミノ酸の異なっているポリペプチドの両方を作ることができる。

使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平滑末端または付着端を有 していることができる。発現のために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得 るかまたは文献に記載されている。従って、適当な宿主における発現のために、 発現ベクター内に対象の配列を導入することができる。宿主は、原核生物または 真核生物、すなわち、細菌、藻類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例え ば、マウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であることができる。発現ベ クターは、コード配列の挿入のために完全に組立てられていようが本発明のポリ ペプチドのコード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの場合、以下の ように特徴付けられる。

常にというわけではないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または多数の コピー数のエビソーム要素を提供する、野生型複製系以外の複製系が入手可能で ある。宿主ゲノム中にコード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必 要ないであろう。コード配列は、５′末端および３′末端において、しばしば野 生型の制御領域以外の、転写および翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナルの それぞれによってはさまれている。従って、プロモーター領域は５′末端におい て用いられ、キャップ配列、制御された発現のためのオペレーター、およびエン ハンサ−配列等を含み、構成的発現のためのプロモーター制御を含んでいないこ とができる。３′末端においては、ターミネータ−１終止コドン、および最適に はポリアデニル化配列等が存在する。転写および翻訳制御配列およびコード配列 の発現造成物は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換された宿主に関 する選択および発現ベクターを保有する細胞に対する競争的好都合の提供の双方 を可能にする１種もしくはそれ以」二のマーカーに連結される。

マーカーは、栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生物剤（ｂｉ ｏｃｉｄｅ）耐性、例えば、種々の抗生物質および重金属等に対する耐性、およ び免疫等含んでいることができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるように 選択される。

多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与えるポリリンカーが、配列と 転写および翻訳開始制御配列と終止制御配列の間に存在している。従って、コー ド配列の適当な設計によってまたはアダプターを用いることによって、コード配 列をポリリンカー領域内に挿入することができる。

ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結して、融合生成物を得るこ とが望ましい場合があり、この場合、この５′−配列がリーダー配列、とりわけ 分泌リーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする。種々の分泌リー ダーは例えば、次の文献に記載されている：米国特許第４．４１１．９９４号、 ＥＰＡ８８．６３２および１１６，２０１゜コード配列は正しいリーダーフレー ムで分泌リーダーおよびプロセッシングシグナルに連結されることによって、そ の融合コード配列を発現ベクター中に挿入して発現造成物を提供することができ る。

ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の増殖後、細胞を集菌しこ れを熔解してポリペプチドを単離することができる。ポリペプチドが分泌される 場合には、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離することができる。

ポリペプチドの単離および精製のために種々の技法が存在しており、例えば、ア フィンティークロマトグラフィー、ＨＰｌ、Ｃ。

電気泳動、グラジェント遠心分離および溶剤抽出等がある。

用途に応じて、対象化合物は種々の方法で配合することができる。生体内投与に 対しては、対象化合物を生理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、 リン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することができる。その濃度は、特 定の適用、およびその通用が局所的であるか一般的であるかということなどに応 じて広く変化する。投与は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮 下的等であることができる。

天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００ｉ／ｍ／である。

投与方法に応じて、用量は約０．５〜５００ｘ／ｋｇまで、より通常には約５〜 ５０バ／ｋｇまで変化することができ、用量が２５μｇ／ｋｇを越える場合には 精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所望の反応、投与方法および用量の反復 性等によって変化する。

以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は限定を目的とするもので はない。

Ｂｌｏ−５ｉｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ−２５０ゲルロ過肝ＬＣカラムを、バイオ−ランド ラボラトリーズ（リッモンド、カルフォルニア）より購入した。μｍＢｏｎｄａ ｐａｋ　−Ｃ＋　ｓカラムをウォーターズアソシエート（ミルフォールド、マサ チューセッツ）より入手した。

トリプシン（ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシンおよびスタフィロコツカル・アウ レウス（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｏｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　８プロテアーゼは 、ワーリントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）から得る。エンドプロティナーゼＬ ｙｓ−Ｃをベーリンガーマンハイムから得た。

’Ｈ−ラベル化ジアゼパム、Ｒ○１５−１７８８、フルニトラゼパムおよびβ− カルボリンをＮＥＷ、ボストン、マサチューセッツから得た。キャリヤフリー＋ ２５１−ヨウ素はアマ−ジャム（アーリントンハイト、イリノイ）生産のもので あった。

々ｙｑ脳起−源−ΦＪ受−トニ全し二４ｚア」旦ンご（じ−Ｂ　Ｚ　Ｄ　）−Ｑ 、ｆＩ７３４ 新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０ｇ湿重星）を融解し次いで細断した。細断 した組織を、２３７９ｍ１．のエタノール（９８％）、１８．５ｍ７の？５１１ Ｃ２、および２．５ｍ７のアブロティニン〔ウシの肺源の２３　ＴＩＩＪ／　ｍ ｌ　（シグマケミカル社）〕から成る２４００−の抽出緩衝液中に縣濁させた。

混合物をワーリングコマーシャル混合機中でホモジナイズした。ホモジネートを ４℃で一夜で攪拌し、ベックマン型１９０−ター中８０００ｒｐｍで３０分間遠 心分翻し、次いで上澄みを注意深く除去した。最終量は約２０７０−であった。

クロロホルム（２０７０ｍＺ）および２０７−の耐性の水（２０３ｍｌの水と４ ｒｎ！の濃１１Ｃｆｆ　）を上澄みに添加し、混合物を約１時間激しく攪拌し、 次いで室温に放置し二相に分離した。水性の上相を注意深（除去し次いでスペク トラポール透析膜チューブ（３，５００ＭＷカフトオフ、アメリカンサイエンテ ィフィックプロダクト）中、４℃で０．１　Ｍ酢！２ＯＮを２回取り換えて透析 した。透析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾燥材料（７８５ｎｖｒ）を粗分画 と称した。

ゲルン゛５クロマトグーフィー Ｂｌｏ−５ｉｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　２５０カラム（６０Ｘ２．１ｃｍ）を高速液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付け た。粗分画を０．１％三フッ化酢酸を用い４０％アセトニトリル水溶液中に８■ ／ｍＺの濃度で溶解した。

カラムを０．１％三フッ化酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）と供に４０％アセトニトリルを用 いて平衡化した。２ｄのアリコート（１６ｍｇのタンパク質）を注入し次いで０ ，１％？農度のＩ’ＦＡを有する４０％アセトニトリル水溶液を移動相として均 一に溶出を行った。流速を’ｌ　ｍｌ　７分に設定しそしてチャートスピードを ０．２５ｃｔｎ／分に設定した。クロマトグラフィー処理を室温で行った。５ｆ ｆｌ／の分画を採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いでベンゾジアゼ ピン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−ＢＣＡ）および成長抑制活性について３ 回分析した。

ＢＺＤ　−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述べた如く、４９回のク ロマ１−グラフィー操作を行った。全ての操作に対する活性分画を集め次いで凍 結乾燥した。約６５■の活性な乾燥粉末を得た。これをＴ　Ｓ　Ｋ−２５０分画 と称した。この分画は約９３６ユニツトのＢＺＤ−ＢＣＡ活性を含有していた。

ＴＳＫ−２５０’Ｗのψ　π゛束？　クロマトグーフィーＴＳＫ−２５０分画を ０．１％ＴＦＡに溶解しく２ｍｇ／ｍり、更にμｍ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　−Ｃ、 ｇカラム（７８宵ｍ（内径）Ｘ３０ｃｍ）を用い室温で逆相１１１’ＬＣにより 分別した。試料を均一に適用し、カラムを洗浄し次いで０．１％ＴＦＡで平衡化 した。流速を２ｍｌ／分に設定し、そしてチャート速度を０．２５ｃｍ／分に設 定した。第一の溶剤０．１％ＴＦＡと第二の溶剤０．１％ＴＦＡ中のアセトニト リルと間での線状グラジェント法を用いた。グラジェントの条件は２０分内で０ 〜２８％、次いで１４０分内で２８〜４２％、１０分内で４２〜５２％更に６分 内で５２〜１００％であった。全ての溶剤は、ＩＩＰＬｃ等級のものであった。

４ｍＺＯ分画を採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでｎＺＤ　− ＢＣＡに対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜３２％アセトニトリル 濃度間で溶出した。

分画３６と分画３７をプールし、次いで１２−の０，１％ＴＦＡで希釈した。混 合物を、μｍ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　−Ｃｒ　ｓカラム（３，９ｍｍ（内径）Ｘ３ Ｑｃ＋ｎ）に均一に適用した。流速は１ｍ７７分であり、チャート速度は０．２ ５ｃｍ／分であった。第１の溶剤０．１％ＴＦＡと第二の溶剤０．１％ＴＦＡを 有する了セトニトリルとの間で線状グラジェント法を用いた。グラジェント条件 は次の通りであった。１０分内で０〜３０％、次いで６０分内で３０〜４０％で あった。分画を採取した。殆ど全ての活性（約８５０ユニツト）部分は３１％ま でのアセトニトリル濃度で分画６内に溶離した。この分画をＩＩＰＬＣＣ＋ａ分 画と称し、これは約６８０ｐｇのタンパクを有していた。

また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従ってヒトＥＢＺＤも精製し た。

ゞシ　ブトソームの９□［ 粗シナプス膜分画を、体重２００　ｇまでのスブラーグードーレイ系ラットの脳 又は新鮮なウシの脳皮質のいずれかからＺｕｃｋｉｎ等　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、 　八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７４）ヱ１　：　４８０２−４８０６）の記 載の如く調製した。シナプス膜を、５０ｍＭのトリス−１１Ｃ６（ｐｌ＋７．／ Ｉ）で３回洗浄し、緩衝液中にくりかえし縣濁さ一仕次いで遠心分離によりペレ ット化した。洗浄したシナブトソーム膜を５０ｍＩＩＩトリスー１１（Ｊ　（ｐ ｌ＋７．４）に縣濁させ次いで−２０℃で保存した。

ＥＢＺＤ−′七人　”！′　のためのアーセイ種々の両分又は精製されたタンパ ク質による、洗浄されたシナプトソームへの’Ｈ−ＢＺＤの結合の阻害を、結合 性競争活性の指標として使用した。シナプトソーム膜への３Ｈ−ＢＺＤの結合を 、２５囲のβ−カルボリンの不在又は存在のいづれかで使い捨ての１２　Ｘ　７ ５　ｎ＋のポリプロピレン管中において２通り実施した。その結合混合物は、所 望の種々の濃度の試験化合物、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＡ’　（ｐＨ＝　７． ４　）　、シナプス膜懸濁液（７０〜１００硝のタンパク質）、１〜５１の’Ｈ −ＢＺＤ及び合計体積０．１−中０．５％の最終濃度のジメチルスルホギシドを 含んだ。４℃で３０分間のインキュベーションの後、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ＝　７．４　）中１０％の冷ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００ ）　０．７−をおのおのの管に添加した。そのＱ　ｆｆ）液をすぐ４℃でＣＦ／ Ｂフィルターにより真空濾過した。そのフィルターを、１■／ｍＺのＢＳＡを含 む５０ｍＭの冷Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ＝　７．４　）　１０　ｍｌにより 洗浄した。そのフィルターを、計数バイアルに移し、そしてアクアシン（八ｑｕ ａｓｓｉｎｅ）　（ＮＥＮ）　１０−を、おのおののバイアｌしに添加し、そし てＢｅｃｋｍａｎβ−カウンターを用いて放射能を測定した。２５−のβ−カル ボリンの存在において結合した放射能（合計結合の２〜８％）は、非特異的であ ると思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された。タンパク質濃度を、標 準としてＢＳＡを用いて、Ｌｏｗｒｙ、など、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

（１９５１）　１９．ｆｉ：　２６５〜２７５ノ方法によッテ測定１．り。

ｌ１１！」」ビＬ肛しヱ四１凛μすＬ」１吐）０．１Ｍ（７）リン酸ナトリウＬ 　（ｐＨ＝７．２）　、０．１％ｃ７）ＳＤＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％ のポリアクリルアミドビス−アクリルアミド（３０：０．８）の１５ｃｍの分離 ゲル（０，７５ｍｍの厚さ）を使用した。そのゲルは、ゲル２０ｍＺ当りＴＥＭ ＥＤ　（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）　１０　ｔｒｉを含み、そして、２０％の過硫酸ア ンモニウムの１．０μｍ／ｃｄのゲルを用いることによって重合化された。分離 ゲルの条件と同一の１．１街液条件を用る３、５％のアクリルアミド溶液の上層 ゲルを、低層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約３１１を残して、コム（Ｃｏｍｂ ）を、その上のゲル中に挿入した。

０、ＯＩＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）　、７Ｍの尿素、１％のＳＤＳ 及び１％の２−メルカプトエタノール中サンプル４０μｌを、２分間煮沸し、そ してすぐに適用した。そのランニング緩衝液は、０．１％のＳＤＳを含む０．１ 　Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝　７．２　）であった。トラッキング染料がゲ ルの底に達するまで、そのゲルを、室温で５　Ｖ　／　ｃｒＱで実施した。

そのゲルを、５０％メタノール及び９％酢酸中に固定し、固定溶液中において０ ．１％Ｃｏｏｍａｓｉｅブルーにより染色し、そして５０％メタノール及び９％ 酢酸により脱染色した。脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた。

１５％の分離ゲル及び５％のスタッキングゲルを使用する、しａｅ＋＋＋ｍｌｉ 、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７　：　６８０〜６８５のＰＡＧＥ法も また、使用された。ゲル上のタンパク質を、Ｍｅｒｒｉｌ、など、、　５ｃｉｅ ｎｃｅ（１９８１）　２ニレ１４３７〜１４３９の銀染色法又はクーマシープル 染色法のいづれかによって検出した。

タンパク′″′のヨウソヒ Ｂａｒｒｉｄｇｅ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏ！、（１９７８）５０　： 　５４〜６５ニよ−）　テ記載されているクロラミン−Ｔ法を用いて１２５Ｈに より又はＢｉｏｃｂｅｍ、　Ｊ、（１９７３）１３３　：　５２９〜５３９に記 載されている５Ｉ−Ｂｏｌ　ｔｏｎ及びｔｌｕｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク 質をラベル化した。

邸μ国４七り叔抗盗血生 ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラット中において調製した 。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｖｔｌｅｙラットを、完全フロインドア ジュバント中に乳化された、合計２０ｔｔｇの精製クンバク質により感作した。

続く追加免疫接種を、不完全フロインドアジュバント中タンパク質１０Ｒを用い て２週間隔で与えた。試験採血をおのおのの接種の後、１週間で行い、そして下 に概説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体についてスクリーンした 。そのアッセイのために適切な抗血清は、一般的に、２〜３回のみの追加免疫接 種の後、得られた。

ウサギ（およそ３　ｋｇの重さのニューシーラントホワイトウサギ）中における 精製されたウシの脳のＥＢＺＤに対する抗血清をまた、ラットのために記載され た同じ方法によって調製した。但し、４０μｇ及び２０ｕｇのタンパク質を、そ れぞれ、１次接種及び追加免疫注射のために使用した。

−ジオイムノアッセイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　Ｘ　１０　”ｃｐｍ／ｎの比活性にクロ ラミンＴにより放射性ヨウ化化し、そして４℃でＴ　Ｎ　Ｅ　Ｎ　緩衝液（２０ ｍＭのＴｒｉｓ−！ｌ（Ｊ　、　ｐＨ＝　７．４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ　。

１５０ｍＭのＮａｃＩｌ；　０．０５％のＮＰ４０；０．１％のＢＳＡ）中に保 存した。

ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポリプロピレン管（３−の 容量）に添加された：精製された脳因子の標準又はサンプル１０ｔｔｌ、ラット 抗血清（Ｔ　Ｎ　Ｅ　Ｎ　緩衝液中において１；３０に希釈された）１０μｌ及 び１２５１によりラベルされたウシの脳因子（〜５　Ｘ　１０’ｃｐｍ）　３０ ｐｌａ室温で４５分間のインキュベーションの後、熱失活された、ホルマリンに より固定されたＳ、アウレアス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）の１０％懸濁液５０μノ を添加し、そしてその混合物をさらに３０分間、放置した。次に、免疫吸若剤を ｎ−ブチルフタレート油のクッションを通して遠心分離しく１５．０００ｘ　ｇ 　、１分）、そしてＳ、アウレアスベレフト中の放射能活性の量を、ｒ−分光測 定によって測定した。−抗血清の不在において結合した放射能活性は、非特°異 的であると思われ、そしてデーターは、それに応じて修正された。

ＲＩＡ反応物質についての検定されるべき組織は次のようにして加工された。新 鮮な又は冷凍された組織（およそ１ｇの正味重量）を、１０−の冷たいホモジナ イゼーション緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−１１Ｃ６、ｐＨ＝　７．４　；　５ ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍＭのＮａＣ１；　０．２％のＮ　Ｐ２Ｏ；　０． ２ｍＭのフェニルメチルフルホニルフルオリド；−当り　１００カリクレイン阻 害剤ユニツトのＴｒａｓｙｌｏｌ）に添加し、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎＭｉ織ホ モジナイザーにより３度、１°５秒間の破壊により均質化した。その抽出物を除 去し、そして１００，０ＯＯＸ　ｇで３０分間の遠心分離により残骸をきれいに した。次に、その上清液を、５分間９５℃へ加熱し、そして低速度で遠心分離し 、沈殿したタンパク質を除去した。一連の１＝３の希釈度の抽出物を、ＴＮＥＮ 緩街液により調製し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。おのおののセッ トのアッセイと共に標準曲線が含まれ、そして免疫反応性物質の量を、直接的な 比較により算定した。

ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃを含む０．１　Ｍ のＴｒｉｓ−アセテート（ｐ）ｌ＝８．０）　４０ｔｒｇ中において２４℃で１ ６時間、消化した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重量基準で１０：１であった。ペ プチドフラグメントを、水中０．０５％ＴＦＡから０．０４５％ＴＦΔを含む６ ０％アセトニトリルの綿状２ｈグラジエントを用いるμｍ１１ｏｎｄａｐａｋ　 −Ｃ＋　ａカラム（Ｗａ　ｔｅｒｓ　）でのｒｐｔｌｒ’Ｌｃによって分離した 。ペプチドをモニターし、そして２１４ｎＭでのそれらの吸収によって同定し、 集め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した。

Ｂｌｏ−３ｉｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ−２５０のカラムからウシの脳のＥＢＺＤの溶なプ ロフィールを決定した。ＢＺＤ結合の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１ １，５００）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピークとしてカラ ムから現われた。分取用逆相カラムのＴＳＫ−２５０からの活性フラクション２ ４のり、コマトゲラフイーの結果、その活性は３１〜３２％のアセ１、ニトリル の間で溶出された。分析用逆相カラトに基・づく、プールされたフラクション３ Ｇ及び３７の再りロマトグラフィーは、対称的なピークとして活性クンバク質の 溶出をもたらした。その精製は第１表に要約される。

第１表：ウシの脳のＥＢＺＤＯｔｒｆｆ製粗原料　７８５ｂ１，０１０’　１． ２９　１００１１ＰＬＣ−Ｃ＋ａ　Ｏ，６８ｃ８５０　１，２５０　８４．２ａ ：上記のアッセイ条件下で粗シナブトソーム膜に結合する”Ｈ−ジアゼパムの４ ０％競争を必要とする材料。

ｂ：直接的に計量された、プールされた材料。

Ｃ：　２８０ｍμでの吸収度から計算された。

ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイすることは不可能であった 。合計ユニットを示すこの数は、フラクション２４及び２５におけるＴＳＫ−２ ５０クロマトグラフイー処理の後、回収した。

８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法で達成した。阻害度は、 タンパク質の濃度が上昇するにつれて、上昇した。しかしながら、最大の阻害度 は、８汁の濃度の純粋なタンパク質でさえわずかに５２％に過ぎないことが見出 された。Ｋｉイ直は、’ＪＩ−ジ′アゼバム又は’　Ｈ−Ｒ０１５−１７８８ノ いづれがリガンドとして使用されても、約５団であることが見出された。

精製されたタンパク質の均質性は、６Ｍの尿素の存在においてＰＡＧＥによって 示された。ペプチドの分子量は、１０．５にドルトンであると算定された。Ｌａ ｅｍｍｌ　ｉの５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による精製されたタンパク質（ウシ又はヒト ）の分析もまた、見掛のＭｒ〜７にドルトンを有する単一のバンドを与えた。精 製されたタンパク質は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡと共に、水中４０％ アセトニトリルを用いるＢｌｏ−５ｉｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−２５０カラム（６０ｃ ｍＸ７．５ｕ＋の内部直径）から単一の対称ピークとして出現した。その見掛の 分子量は、このゲル浸透クロマトグラフィー法によって約１１．５にドルトンで あることが計算された。その精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、類似する物理化 学的特性及び生物学的特性を示した。

シナブトソーム膜への、１′ｌ−ラベルされた（クロラミン−Ｔ法又はＢｏｌｔ ｏｎ及びＨｕｎｔｅｒ法のいづれかによる）精製タンパク質の特異的結合は観察 されなかった。

並岨ｑ分布 ＲＩＡ系を展開させて組織抽出物、体液および組織培養細胞中のＥＢＺＤを定量 した。種々のペプチドによる、ウシＥＩＩＺＤに対するラット抗血清に結合した ウシ脳からのＩＺＪ−ラベル付ＥＢＺＤの除去を測定した。ウシおよびヒトのＥ ＢＺＤは、ウシＥＢＺＤタンパク質に対して調製されたう７）抗血清に結合して いる＋２Ｊ−ラベル付ウシＥＩＩＺＤとの競争において同様な力を示した。この ことは、両方のタンパク質中に全く同様な免疫原決定基が存在していることを示 している。エンドプロテイナーゼＬ　ｙ　ｓ　−Ｃ消化によって得られそして逆 相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって精製されたウシＥＩＩＺＤのペプチドフラグメント はいずれもなんらの免疫反応性も示さなかった。従って、ＥＢＺＤの免疫原決定 基はエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによって生じた単ペプチドフラグメントの いずれにも保有されていない。ラビットの種々の組織中のＥＢＺＤの分布を下記 第２表に示す。

第２表：種々のラビット組織中の１ＥＢＺＤの分布組　織　パ当量／ｍ織１ｇ（ 湿重） 脳　３．８０ 腎臓　３．４２ 唾液腺　１．７６ 肝臓　１．５２ 胃　１．２７ 結腸　１．０５ 肺臓　０．９７ 肺　０．８４ 心臓　０．７３ 胸腺　０．６７ 膵臓　０．５０ 大腿筋　０．３７ 甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ）　０．０６ 血ｆｎ　マタｌｅｔ　ＩｆＩｌ’Ｊ　Ｎ、Ｄ。

Ｎ、０．−検出できず。

ＲＩＡ法の詳細は前述しである。

血清また血漿以外の試験Ｍｉ織はすべて、ＲＩＡによって検出されるＥＩＩＺＤ を含有していた。ウシの脳、肺臓および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５ 　、７．６および６．８硝当量を含有していたが、ヒトの脳は＆ｌｌ織１ｇ（湿 重）当り１５．７ｊＩｇ当量を含有していることが見い出された。ラビット脳中 のＥＢＺＤの濃度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるかに低いも のであることが見い出された。ＥＢＺＤはモンキーの脳中にも見い出された。ウ シのタンパク質に対する抗血・清はラットおよびマウスの脳中に免疫学的交差反 応物質をほとんど検知しなかった。ＥＢＺＤがヒトの脳を髄液および腹水液中に 存在していることも見い出された。ヒト乳癌細胞ＣＭＣＦ７）肝癌細胞（ＨＥＰ ２）、神経芽肝細胞（ＭＴＢ　１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ１２７）お よび膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ、それぞれ？層線細胞 （〜１０９細胞）１−当り９．１　、８．９　、８．６　、０．３２および０． ２６Ｊ１ｇ当量のＥＢＺＤを含有していた。ＥＢＺＤ　１■は約６Ｘ１０”分子 を含んでいる。従って、ＭＣＦ？、ＨＥＰ２およびＨ−ｒ’　Ｂ　１４細胞は細 胞１個当り〜５Ｘ１０’分子のＥ　１３　Ｚ　Ｄを含有している。従って、ＥＢ ＺＤは哺乳動物の組織中に広く分布しており、そしてこれとは異なったＤＢＩは 脳に特有のペプチドではない。広い組織分布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的 なものというよりむしろ一般的なものであろうということを示唆している。

第３表ニラビット脳の種々の領域におけるＥＢＺＤの分布組　織　μｇ等量／組 織１ｇ（湿重） 大脳　３．４ 小脳　７．５ 延髄　５．３ 下垂体　１．３ 嗅球　２，６ 松果体　１７．４ 脈絡叢　２６．７ 橋　１４．３ ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経　１．７ 視神経　１６．２ 嗅索　８．３ Ｅ　Ｂ　Ｚ　Ｄ　＞Ｈ度は前述の如くにＲＩＡによって測定した。

第３表は、ｔＡによって測定されたラビット脳の種々の領域におけるＥＢＺＤの 分布を要約している。脳の領域はすべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、Ｅ　 Ｂ　Ｚ　ｏ　＞７４度の実質的な局所的変化があることが示された。試験したラ ビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡叢において見い出され、そして最低濃 度は下垂体において見い出された。

ＥＢＺＤ　（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ）　：体ｆｆ１２．３〜２．６　ｋｇの雄性ニ ューシーラントラビットをこの実験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ ）等、ニューロファーマコル、（ル捜工逼小ａｒｍａ＋匹１Ω−（１９７２年） ■＝１〜１６頁に記載の直接穿刺法に若干の変更を施すことによってｉｃｖ注射 を行なった。動物は、頭蓋に小さな穴（直径０．８ｍ＠）を開ける（ベンドパル ビタール麻酔下）ことによって実験の２日前に準備した。この穴は正中線に対し て１．　Ｏｎ＋側方およびブレグマに対して１．０龍口吻側に位置している。実 験の日、注射の直前に、皮膚の傷上に局所麻酔薬を噴霧する。＃２６の針を頭蓋 の表面から１２ｍ園の深さまで鉛直に挿入する。正確な位置決めは大脳を髄液の 出現によって指示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、この針を同 じ深さまで再度挿入する。注射は、常に、注射器微量ビユレットを用いて１０Ｉ ！ｌの容量で３０〜６０秒間にわたって実施する。対照の動物には同容量の滅菌 食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌した等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊 離塩基として表現される。

動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ　ｔａｎｃｈ　１ｏｎ） 内に位置させる。結腸温度は、リーズ−ノースラップ・スピードマックス・レコ ーダー（１，６６ｄ３−　Ｎｏｒ　ｔｈｒｕｐＳｐｅｅｄｏｍａｘ　ｒｅｃｏｒ ｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線が引かれているＹＳＩＳキスンニング ・テレザーモメーター（ＹＳＩ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒｍｏｍｅ ｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタプローブによって測定される。実験は ２２．０±１．０℃の常温室内で実施する。

興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示される。

２５■／　ｋｇのベンドパルビタールを静脈内に投与されたラビットは麻酔にか かり、その麻酔時間の間は自らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向け になっていることができる。ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていること ができなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。

瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を含む種々のパラメータの 肉眼的観察によって挙動を評価した。

さらに、ある種の雷同的（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃ）応答、例えば、強迫的にか じったり引掻いたりすることを注意深く観察した。

注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する。

呼吸は９０ｍ１ｎから２０４ｍ１ｎまで増加した。運動活性の増大。

機能亢進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）なし。痛覚脱失なし。

１００　Ｊ！ｇ 注射の１０分後、呼吸は９８ｍ１ｎから６５ｍ１ｎまで減少。

強迫的咀暗および軽度の興奮。興奮は短時間続いた。機能亢進なし。痛覚脱失な し。

２００μｇ 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８ｍｉｎから５０ｍ１ｎまで ）。注射の１０分後、立直り反射欠如。動物は深い麻酔状態にはなかったつｂ　 ＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛覚欠如なし。

胚土し真■１細−胞■陪負しぎ巾□ｔζ隼事μ蔓扶４−を収ｊト堕す−Σ、速渡 −調〜範８日齢のヒナ鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を噴個細胞に分離し３ 日間回転培養にイ」シた。この方法により、直径約１５０ミクロンの小さな規則 的球形の細胞が生ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており、規則 的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル（Ｍｙｒｄａ］）およびデハーン （Ｄｅｌｌａａｎ）、ジェイ、セル、フィズ、（Ｌヱｍｌ↓ぼ互がよ）　（１９ ８３年）皿３１９〜３２５頁〕。電気生理学的特性を基準にすれば、この調製物 は成体の哺乳動物のプルキンエ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダル およびデハーン、ディ・イニシェイション・オヴ・ザ・ハートビート（Ｔｈｅ　 Ｉｎ１ｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅａｒｔｂｅａｔ）デニス・ノープル （Ｄｅｎｉｓ　Ｎｏｂｌｅ）　１３．１９７５年、オンクスフォート・ユニバー シティ・プレス社（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ロン ドン、ｐ、７）。これらの集塊は２４℃で平衡化しｂ　ＥＢＺＤを用いて２４時 間処理した。２つの個別の実験において、１００μｇ／ｍｌの量で処理した集塊 の収縮速度は対照と有意に相違した。これを以下に示す。

実験１：　（測定された収縮速度・（秒）１５回の収縮量間隔）Ｎ　平　均　標 準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　１４　１１．４８　１．４４　０．３８処理　 １４　７．９４　２．０４　０．５５実験２： Ｎ　平　均　標準偏差　ＳＥ肝ΔＮ 未処理　１３　２４．５９　３，１８　０．８８処理　１２　１９．３３　２． ３７　０．６８各実験におい゛乙スチュ・−プント下テストによれば、処理され た母集団は有意に未処理の母集団と異なっている。これら２つの母集団が同じも のであるという確率は０８０００１より小さい（ｐ　＝０．０ＯＯＯ）。

ｌ叫決定 ウシおよびヒトのＥＢＺＤの″アミノ酸配列は、（ａ）エンドブロティナーゼリ シンＣ，（ｂ）キモトリプシン、（Ｃ）スフフィロコツカル・アウ！／ウス（勺 四±ｙＬＱ−９匹卯−Ｌ　旦匹隠）Ｖ８および（ｄ）臭化シアンを用いたｂ　Ｅ ＢＺＤおよびｈ　ＥＢＺＤの消化により得られたペプチドのマイクロシーフェン ス分析によって決定した。ベプヂドフラグ、メンｌ〜は揮発性溶剤を用いてｒ　 ｐ　ｔｌ　Ｐ　Ｉ、Ｃによって精製、した。アミノ末端をブロックしたペプチド を１２Ｎ＋１（Ｊ中で周囲温度において１６時間インキュベーションした。

次いで、試料を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを、４７０Ａ型気相プロ テインシークエンサー（Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）〔アプライド・ バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＋Ｉｎｃ、）　） による自動反復エドマン分解に付した。ｒｐ　ＩＩＰＬＣによってフェニルチオ ヒダントインアミノ酸を分析した。

これとは別に、タンパク質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ）またはペプチドを、６Ｎ １１Ｃｊ７を用いて１０５℃で１６〜２０時間減圧において加水分解した。得ら れたアミノ酸をフェニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ（Ｐｉｃｏ）　Ｔ 　Ａ　Ｇシステム〔ウォーターズ・アソシエーツ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉ ａｔｅｓ）　）によって分析した。フェニルチオカルバモイルアミノ酸を２５４ ｎＭの吸光度によって検出した。

旦廻少囮ヱ構過 ｂ　ＥＢＺＤおよびｈ　ＢＢＺＤのアミノ酸配置を、６ＮＨＣＩ！テ加水分解し た後、アミノ酸自動分析装置を用いて決定した。これらのタンパク質には、シス ティンを除くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデータから計算 された最小分子量は約９，９００であり、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによって確認され た値と一致する。

ト■−末端アミノ酸は、数ザイクルのエドマン分解を実施し。

た場合でされ検出されなかった。このことは、ｂ　ＥＢＺＤおよびｈ　ＥＢＺＤ の末端アミノ基がブロックされていることを示唆している。配列は実験の部（Ｅ ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　５ｅｃｔｉｏｎ）に記載のよ・うに決定した。ｂ　Ｈ ＢＺＤおよびｈ　ＥＢＺＤの配列を、公表されているＤＢＩの配列と比較しなが ら以下に示す。

ｂ　ＥＢＺＤ配列と異なるｈ　ＥＢＺＤアミノ配列中の残基には下線を引いた。

ｈ　ＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂ　ＥＢＺＤのアミノ酸配列との比較は、ヒトお よびウシのＥＢＺＤが数個の保存的置換基によってのみ互いに他と相違している のかもしれないということを示している。６個のアミノ酸１ｆＡ基の中の５個が ＤＮＡレベルにおけるたった１個の塩基変化と一致する。これらの結果は、ヒト およびウシのＥＢＺＤが異なる種の間で構造的に高度に保存されていることを立 証している。

文り！」Ｕシカ１匹子至韮じゴ］ＤＮへの６　および」しズ仇ウシの組織から単 離したポリ　（Ａ“）ＲＮＡをｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。第１鎖の ｃＤＮＡ合成はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素 とを使用して実施した。第２鎖は大腸菌ＲＮａｓｅ　Ｉ＋　、ＤＮＡポリメラー ゼ■およびＤＮＡリガーゼ（ＮＡＤ”）を使用して合成した。

Ｓ、ヌクレアーゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の大断片による フィルイン反応によって２木鎖ｃＤＮＡを平滑末端化した。ターミナルデオキシ ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、デオキシグアニン残基約１５個 をｃＤＮＡの３′末端に酵素的に加えた。次に、このＧの尾部をもつｃＤＮＡを Ａ−５０カラム上でサイズ分別して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと４人されな かったデオキシグアニン残基とを除去した。次に、プールしたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの 濃縮を、ＥｃｏＲＩで消化したλｇｔ、１０　ＤＮＡの存在下におけるエタノー ル沈殿によって　実施した。

ＥｃｏＲＩで切断したλｇｔ、ｌｏに対するＧの尾部をもつｃＤＮＡの連結反応 は、３′末端にデオキシシトシン１２個を含みそして５′末端に旦ｃｏＲＩ開裂 ＤＮＡの１本領突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１木鎖オリゴヌクレオ チドリンカーを使用して新規の方法によって実施した。連結したＤＮＡのユ虹ｖ ｉｔｒｏパッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ ”１ｌｆｆｆ中へ導入した。これは、組換え（野生型でない）フヱージに感染す ると細胞溶菌される。その方法により、放射性標識合成オリゴヌクレオチド〔１ ７ヌクレオチド長：その配列はウシＥＢＺＤ中と見出される６個の連続するアミ ノ酸（ＫＷＤＡＷＮ）によって予想した）を使用し、プラークからのＤＮＡを二 重にスクリーニングした。コドンが不明なので、オリゴヌクレオチドの３２種の 縮重プールとしてＭＳＩを合成した。ＭＳＩによるスクリーニングにより陽性の プラークを得これをプラーク精製し、そして１．８　ｋ　ｂの挿入部を含有する ことをか示された。この挿入部をプラスミドｐ　ＥＭＢＬ中にサブクローン化し た。これをｐＦＩＰｌと称する。挿入部を制限地図化した後、続いて適当な数片 をＭ１３株中に更にサブクローン化し、そしてＳａｎｇｅｒ−Ｃｏｕｌｓｅｒの ジデオキシ法によって配列を決めた。

ｐＭＰｌ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほとんど同じ挿入部の５′末端 から約３００塩基対のＤＮＡ配列を含んでいた。

更に、ｐＭＰｌのヌクレオチド配列により、配列が決定されているウシＥＢＺＤ に関して決定したアミノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）アミノ酸配列が 予想された。これらの２種のタンパク質が密接に関連していることはアミノ酸配 列の顕著な保存性によって示唆されている。配列が決まっているＥＢＺＤからア ミノ酸３個を除去することにより、残りのアミノ酸をｐＭＰｌの配列と連関させ ることができ、この結果アミノ酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存 的置換を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。

ｐＭＰｌの発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性のタンパク質をコードす ることのできる関連遺伝子の群の一員であることを示している。最後に注意すべ き点は、配列の決定されたウシの脳の因子よりも大きいクンバク質をｐＭＰ　１ がコードしている点である。なぜなら、リーディングフレームが、そのタンパク 質の公知の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているからである。

且μば■匠りλ灸央 ウシの肺臓を使用している前記の方法を繰返した。得られたｃＤＮＡは０．６　 ｋｂｐの挿入部であり、これを９　ＥＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得 た。配列決定を行なったところ、ｐｈｐｌと相同のコード配列が得られた。ウシ のエンドゼピン（ｂ　ＥＩＩＺＤ）をコードするＤＮＡ断片を、Ｄｙａ　Ｉ消化 および−Ｎａｅｌ消化を組合せることにより、ｃＤＮＡプラスミド（ＥＢＺＤ） から切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製し、発現ベクター（ｐｓ Ｍｌ　、　２）中にＳｔｕ　Ｉ部位に挿入した。ρＳＭＩ　、　２発現ベクター の形成は、ｐｔｌＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｂｏｌ ｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ（１９７７）　２　：　９５）　、ｐＴＲ２１３のＩａｃ プロモーターおよびリボソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７９）ヱ５：　７６０−７６４　）　を ｐｔ、ｃ３００のｉ−Ｚ融合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎｔｅ等、Ｃｅ１ｌ（１９８０ ）２０　：　５４３−５５３　）にスプライシングすることによって行なった。

得られたプラスミドはクローニング部位例えばＳｔｕ１部位にｔｉｉ人された外 来遺伝子を融合タンパク質として発現することができる。この構造において、Ｅ ＢＺＤに関する全コード配列は、ｃｒｏタンパク質の最初の２個のアミノ酸をコ ードするＤＮＡに位相を合わせて融合された。プラスミドｐｓＢ１０８は挿入部 を正しい配向で含んでおり、プラスミドｐｓＢ１０３は挿入部を誤った配向で含 んでおり、そしてプラスミドｐｓＢ１２５は挿入部を含んでいない。各種のプラ スミドを含む大腸菌ＨＢＩＯＩクローンを対数期まで増殖させ、そして振とうし ながら３７℃で２時間、最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを加えることによって誘導 した。この細胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄剤処理によって溶菌した 。基本的に、溶菌物は上清（細胞質ゾル）とベレフ）　（！ＩＩ胞質内封入体） とに分けて、免疫化学的技術によって分析することができる。

発現したＥＢＺＤ融合タンパク質のレベルを、競争的ラジオイノ、ノアソセイに よって測定した。その結果が示すところによれば、正しい配向で挿入部をもつＥ ＢＺＤ発現ベクター（ｐｓ８１０８）を含む大腸菌クローンだけが高いレベルの ＥＢＺＤポリペプチドを産生ずる。大部分のｃｒｏ　−ＥＢＺＤは上清分画（細 胞質ゾル）中に見出された。ペレット分画（細胞質封入体）中には、検出可能な 量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐｓＢ１２５クローンのいずれ の溶菌物においてもｃｒｏ　−ＥＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘 導後に、細胞培養物１１当り０．５■のｃｒｏ　−ＥＢＺＤが産生されたものと 推定される。

ウシの〜か゛の′　３（社）Ｌ装 ゲＪ］し１Ｌ三１ユ３６乞Ｚエニー Ｂ１ｏ−５ｉｌ　Ｔ　Ｓ　Ｋ−２５０分取用カラム（６０Ｘ２．１ｃｍ）を高圧 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｗａ　ｔｅｒｓ八５ｓへｃｉａ ｔｅｓ）に取付けた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％を含む水中の４０％ アセトニトリル中に粗製分画を８■／ｄの濃度で熔解した。カラムを０．１％Ｔ ＦＡを含む４０％アセトニトリルで平衡化した。アリコー）２ｍＺ（タンパク質 １６■）を注入し、最終濃度０．１％のＴＦＡを含む水中の４０％アセトニトリ ル移動相によって均一に展開を実施した。

ＢＰの位置（分画２３）が分かった後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分 画を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであった。前記の浸透クロマ トグラフィーから脳因子（ＣＩ　Ａ）の見掛けの分子量を計算したところ、約１ ８ｋＤａ　ｌであった。

Ｔ　Ｓ　Ｋ−２５０百ゝの゛　ＵｆＵ　クロマトグラフ仁二１５試行からのＴＳ Ｋ−２５０画分２３をプールした（容量７５ｍＺ）、プールされた材料を水中０ ．１％ＴＦＡにより２倍に稀釈した。この混合物を、水中０．１％ＴＦＡにより あらかじめ平衡化されたμｍボンダパフクーＣＩ８カラム（７８１−内径×３０ ０１）に室温にて均一に注入した。−次溶剤０．１％ＴＦＡと二次溶剤０．１％ ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの間で直線グラジェントを用いた。グラジェント 条件は２０分間に０〜２８％、１４０分間に２８〜４２％、１０分間に４２〜５ ２％、そして次に６分間に５２〜１００％であった。すべての溶剤はＩＩ　Ｐ　 Ｌ　Ｃグレードであった。４ｍ／の両分を集めた。各両分のアリコートを５０鱈 のＢＳＡと共に乾燥し、そしてＣＩＡについてアッセイした。ＣＩＡの２個のピ ークを貯蔵した。

第１の活性（α）は３２〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶出し 、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間のアセトニトリル？農度で溶 出した。α活性のこれ以上の精製は次のようにして行った。

１０試行からの活性画分３０及び３１をプールし、そして０．１％ＴＦＡにより ２倍に稀釈した。稀釈されたサンプルをμｍボンダバックカラム（７８Ｘ　３０ ０龍）に均一に適用し、そしてカラムを０．１％ＴＦＡで洗浄しそして平衡化し た。流速は１ｍ１１分であり、そしてチャートスピードは０．１Ｃｍ／分であっ た。やはり、第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有する アセトニトリルとの間で直線グラジェントを用いた。グラジェント条件は、４０ 分間に０〜３０％、２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に３８〜１００ ％であった。最初の１２画分は６　ｍｌであり、そして次に４ｍＩ画分を集めた 。アリコートをＣＩＡについてアッセイした。活性は３２〜３３，５％の間のア セトニトリル濃度において？岩田した。

両分３０〜３２をプールした。１２ｍ１の０．１％ＴＦＡをプールされた両分に 加えた。混合物（２４ｍｊ）を、０．１％ＴＦＡで平衡化された分析用μｍボン ダパックＣ１１ｌカラム（３，９×３００１）上に均一に適用した。流速及びチ ャートスピードはそれぞれ０．４ｎｔｆ／分及び０．１ｃｍ／分であった。やは り、第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有するアセトニ トリルの間で直線グラジェントを用いた。グラジェント条件は、２５分間に０〜 ３０％、２００分間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１００％であった ６２Ｉ１１／の画分を集めた。両分のアリコートをＣＩＡについてアッセイした 。活性は分析用Ｃ１１ｌカラムから、約３４％のアセトニトリル濃度において？ ８出しまた。

画分２９−３１をプールし、そしＴ、　０．１　％Ｔ　Ｆ　Ａ　Ｔ：　２倍に稀 釈し、そしてμｍボンダバックＣＩ８カラム（３，９Ｘ　３００１ｍ）に適用し た。第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−プロ パツールとの間の直線グラジェントを用いた。グラジェント条件は、４０分間に ０〜１８％、２２５分間に１８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であっ た。流速は０．４ａ／／分であり、そしてチャートスヒートは０、１　ｃｍ　／ 分に設定された。両分を集め、そしてアリコートをＣＩＡについてアッセイした 。活性は約２３％のｎ−プロパツール濃度において溶出した。

両分２８及び２９をプールし、そしてｏ、１％ＴＦＡにより５倍を希釈し、そし てＯ０１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−プロパ／　−）Ｌｉヲ７Ｊｚ　２　ｔｇ剤 として用いてμｍボンダパ、りＣ１８カラム（３１９Ｘ　３００胃−）上で再ク ロマトグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジェント条件はすぐ上に記 載したのと同じであった。最初の８個の両分は６−であり、そして１．６−の両 分を集めた。各画分のアリコートをＧｒＡについてアッセイした。はとんどの活 性が両分１５〜１７に現われた。両分１５〜１７は約１５Ｉｒｇの蛋白質及び約 ２３０　ｘ　１０’ユニツトのＣＩＡを含有していた。この両分をＩＰＩ、ｃ　 Ｃ１ｌ＋’画分とした。

最終精製画分は、ＣＣＬ６４を試験細胞として用いて蛋白質ｇ当り１５．３３　 Ｘ　１０３ユニツトの比活性を有していた。

次の第４表は結果を要約する。

第４表　ウシ脳因子の精製 粗製物　３，６８０　１，５５１　０．４２１　１００ＴＳＫ−２５０６３０２ ，７６０４，３８１８１１１ＰＬｃ−Ｃｉ８ＳＯ，０１５２３０１５，３３３， ００１４，８（＊）ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジンの 取り込みを５０％阻害するために必要な材料ＤＮＡへの１２Ｊ−デオキシーグ」 ジンの肛飢這立１１旦ゑ星訓Ｉ峻Ｗ肌節アッセイ アッセイはＮｕｎｃ９６ウエルプレート（Ｋａｍｓｔｒｕｐｖｅｊ　９０　＋　 ＤＫ４＋０００　、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ　、デンマーク）中で行った。ヒト肺癌細 胞（Ａ５４９）又はミンクの肺細胞（ＣＣＬ　６４）を試験細胞としテ使用シた 。１０％ウシウシ血ｆ（ＦＣ８）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ　／ 　Ｓ　）　（０，５７ｍｇ／　ｍｌずつ）及びグルタミンを伴うドルベコ改変イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）　５０　ｔｔｌ中３．５Ｘ１０’細胞を、端のウェル以 外のすべてのウェルに導入した。端のウェルには５０ｕｌのＰＢＳを導入し、そ してプレートを３７℃にてインキュベートした。試験サンプルを、１０％ＦＣ３ ，Ｐ／Ｓ及びグルタミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４日後 、５０μ！の試験サンプルを各試験ウェルに加え、他方対照ウェルには５０Ｉの 培地のみを加えた。フ゛レートを３７℃にて３日間インキュベートした。４日目 に、１２５（−ヨード−２′−デオキシウリジンのン容液（（４Ｃｉ／ｍｇ−０ ，５ｍＣｉ／ｍｌ　（０，１μＺアイソト一プ／ｍＺ、１０％ＦＣ３ＳＰ／Ｓ、 グルタミンを含有するＤｌＩＥＭ中）Ｌｏｏｍを各ウェルに加え、そしてプレー トを３７℃にてインキュベートシた。５日目に、培地をウェルから吸引し、２０ ０μ！のＰＢＳで１回洗浄した。次に、２００μｌのメタノールを各ウェルに加 え、プレートを１０分間インキュベートし、そしてメタノールを吸引により除去 した。水酸化すｌ・リウム（２００μ！、ＩＭ）を各ウェルに加え、プレートを ３０分間３７℃にてインキュベートし、そして次に水酸化ナトリウムをタイター チック（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ）プラグ（フロー・ラプス）により取り出した。

プラグを１２Ｘ７５ｍｍのブラスチソクチューフ′にＩ多し、そして放射能を定 量測定するためにＴ−カウンターで計数し、た。

Ｉフ］・アガー・コロニニ期、吉ヱ又丈工１０％ウシ血清を含有するｒ１ＭＥＭ １００５％寒天（アガーノープル；ディフコラボラトリーズ、ブトロイ］・、ミ シガン）の２、０　ｍｌの基層を６０−ｍのコスタ−組織培養１■に加えた。同 じ培地−ウシ血情混合物、１．０Ｘ１０’　Ａ３４９　Ａｇ３　（ソフトアガー 増殖クローン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験されるべきサンプルを含有す る０、　３％寒天を加えた。プレートを空気中５％Ｃ（ｈの加湿雰囲気中で３７ ℃にてインキュベートし、そして７日後に適切な補充物を含有する０、３％寒天 ２、　Ｑ　ｍｌの添加により再供給した。コロニーを固定せず染色しないで測定 し、そして低倍率の無作為の視野５個当り６細胞より多いコロニーの数を７日及 び１４日後に計数した。

コロニー影Ｆハアッセイ このアッセイは６ウエルーフアルコンプレー１□（９，６ＣＩＡの面積／ウェル ）中で行った。　Ａ３４９細胞（２００）を各ウェル中、１０％ＦＣ３，Ｐ／Ｓ 及びグルタミンを含む１＋ｎＺのＤＭＥＭ中にプレートした。プレーｔ−した直 後に、１．０　ｍｌの培地中種々の？震度の試験材料を２連で加えた。対照ウェ ルには試験材料をなんら含まない１．　Ｏｍｌ！の培地のみを加えた。プレート を空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃にて１ｏ日間インキュベートし、５０ ％メタノール中０．２％メチレンブルー１．０　ｍＺを各ウェルに添加し、そし て２０分間放置し、染料を除去し、そして各ウェルを０．１　ｍＺの水で２回洗 浄し、そして空気乾燥した。コロニーのサイズ及び数を定量測定した。

止置学力」惺 ＤＮＡ合成の５０％阻害が、それぞれ９８Ｉｇ／ｌａｌ、２１１！ｇ／　ｍｌ及 び９５Ｉｇ／ｍＺの粗両分、Ｔ　Ｓ　Ｋ−２５０画分及び最終純蛋白質において 観察された。従って、Ａ３４９ヒト肺癌細胞における５０％ＤＮＡ合成阻害が純 蛋白質の約９ｎＭ濃度におりＢＦはまた、寒天（Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞Ａ３ ４９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコロニー形成の５０％減 少が約７６ｎｇ／−のｂＢＦにおいて見られた。

Ａ３４９細胞のコロニー形成率はこの蛋白質により肌著に阻害サレタ。１３ｎｇ ／ｍｌ　（１，２４ＩＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形成率は対照のそれ に比べて５０％に過ぎなかった。約８０ｎｇ／−のｂＢＦの存在下ではＡ３４９ 細胞のコロニーは見られなかった。

Ａ３４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非存在下で増殖せしめ、そして 細胞の増殖を直接細胞計数にモニターした場合、ｂＢＦは量依存的に細胞増殖を 阻害することが見出された。すなわち、ＤＮＡへの１２Ｊ−デオキシウリジンの 取り込みは細胞増殖の良好な基準である。

ｂＢＦはＡ３４９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７５　Ａｇ）及びヒト乳癌細胞（ ＭＣＦ−７）の種々のクローンの増殖を阻害した。ヒト包皮線維芽細胞（ＷＴ− ２６）の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子はまた、ネズミ線維芽細胞セル ライン３Ｔ３−Ａ３１に対して増殖刺激的である。

ヒトＴリンパＬ　殖に欠する交果　びアロ　原に、する■■変立反褒 ヒトＴ−細胞機能（Ｚａｒｌｉｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９ ７６）２１　：　４６８−４７６　）に対する脳因子の効果を研究するために、 同種異系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された増殖性及び細胞変性 ヒトリンパ球を生じさせそして測定するためのミクロ法を用いた。末梢血リンパ 球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を正常個体のヘパリン処理血液から、フィコール−ハイバク遠 心により単離した。次にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗浄 し、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒト血清（）（Ｓ）が補 充されたＲ　ＰＭＩ　１６４０培地（ギプコ、グランドアイル、ＮＹ）中にＩ　 Ｘ　１０’　ＰＢＬ／ａＺの濃度で懸濁した。

次に、０．１　ｍｊのこれらのＰＢＬ　（応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃ ｅｌｌ）と称する〕を９６−ウェルプレートの２連の丸底ウェルのそれぞれに加 え、そして次に０．０５ｍＺの培地のみ又は２Ｘ１０’個のＸ−線照射された（ ２５００Ｒａｄ）同種異系細胞〔“刺激細胞”（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｃｅ ｌｌ）と称する〕を含有する０、０５ｍ１の培地、及び０．０５ｍ７の培地のみ 又は種々の濃度の脳因子（０，９〜７５ユニツ）ＩＩＷ因子／ウェルをもたらす ）を含有する培地を加えた。

細胞を５％ＣＯ□インキュベーター中で３７℃にてインキュベートし、そして２ 日目及び５日目に０．０５−の培地を各ウェルから取り出し、そして次にもとの 濃度の脳因子を含有する培地０．０５−を添加した。

増殖応答を決定するため、６日目に各群からのウェルの内容物をプールし、そし て０．１　Ｉｎ！を９６−ウェルプレートの４連のウェルのそれぞれに加え、次 に０．０２５ｍＺの容量中１μＣｉの３Ｈ−チミジン（’Ｈ−ＴｄＲ，ニューイ ングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）を加えた。６時間後、ウェルの内容 物を多ウェル収得器を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し、これらの ストリップをシンチレーション液体を含有するバイアルに移し、そして３Ｈ−Ｔ ｄＲ取り込みをβ−カウンター中での計数により決定した。

細胞変性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果を決定するため、６日目にウ ェルからプール を９６−ウェルプレートの３連の球底ウェルに加え（０．１５＋ｎ／／ウエル） 、そしてＱ，１５ｍＺの４倍逐次稀釈物も３連のウェルのそれぞれに加えた。Ｓ 　Ｉ　Ｃｒラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）を調製するため、同種 異系刺激細胞の提供者から生じたリンボブラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞 １．５Ｘ１０６を５００μＣ　ｉ　”　Ｃｒ（ＮａｚＣｒ０４，　ニューイング ランドニューフレア、ボストン、ＭＡ）により３７℃にて１時間ラベルし、次に 標的細胞を１５％熱不活性化ウシつシ血清（ＦＣＳ）を含有する培地で３回洗浄 し、そしてこの培地に６Ｘ１０’°細胞／−で再懸濁した。次に、０．０５−の 標的細胞を、エフェクター細胞を収容する各ウェルに、及び培地のみ〔自然（ｓ ｐｏｎ−ｔａｎｅｏｕｓ）　”　Ｃ　ｒ放出を決定するため〕又は洗剤のみ（　 Ｓ　Ｉ　Ｃ　ｒ放出を決定するため）を収容するウェルに加え、そしてプレート を３７℃にて６時間インキュベートした。次に、上清の一定のアリコートを各ウ ェルから取り出し、そしてγカウンター中で計数するためにチューブに移した。

特異的”Ｃｒ放出％を次のようにして決定した。

第５表、ヒ）Ｔ−リンパ球のアロ抗原誘導増殖応答に対する脳因子の効果 Ｖ　Ｃｘ　Ｏ　１０３．６９０ Ｖ　Ｃｘ　７５　７０，１４０　３３ Ｖ　Ｃｘ　２５　６４，５０７　３８ Ｖ　Ｃｘ　８　７８，２８７　２５ Ｖ　Ｃｘ　２．７　８７，０９５　１６Ｖ　Ｃｘ　Ｏ．９　９９．５５２　４ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体■のヘパリン処理血液から得られ、そして 個体ＣからのＸ−線照射された（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ（Ｃに）によ り刺激され、そして６日後、”Ｈ−チミジン（ＨＴｄＲ）の取り込みを上に詳述 したようにして決定した。ＣＰＭ＝カウント／分。

脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提共者のＰＢＬのＴ−細胞増殖応答 に対して観察された。脳因子による一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性ニーリ ンパ球の生成に対して観察された。

同じ量の”Ｃｒ放出を生じさせる未処理のエフェクター細胞の数として、７５ユ ニツトの脳因子と共にインキュベートされた約１６倍多くのエフェクター細胞が ４２％のＳＩＣｒｆｉ出を生じさせるために必要である。

上記の結果から、この発明の化合物はインビトロ及びインビボの両方における広 範囲の用途で使用され得ることが明らかである。この発明のポリペプチド及び抗 体は、生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳を髄液中のこのような 蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外的に決定するため、組織中の細胞によって 形成されるポリペプチドの量の決定のため、診断的に使用することができる。さ らに、この発明の化合物はポリペプチドのりセプターの決定のために使用するこ とができる。さらに、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下で腫 瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤として、又はジアゼバムリセブタ ーもしくはＧＡＢＡ−作動性リセプターと関連する生理学的機能を調節するため に使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化合物及びその断片は、 外科的処置又は術後処置等のために、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、 又は癌における正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除去するために他 の添加物と組合わせて使用することができる。脳因子化合物はまた、Ｔ−細胞の 増殖の調節のためにも使用することができる。

ＥＢＺＤ化合物はＥＢＺＤリセプターの活性を調節するためにも使用することが できる。

前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例により幾分詳細に説明したが 、幾らかの変化及び変更を、添付された請求の範囲の範囲内で実施することがで きることは自明である。

手続補正Ｗ（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８６１００１０９ ２、発明の名称 脳に由来するポリペプチド因子及びそれに対する抗体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　オンコゲン ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （ｌｌ　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者 」の欄 （２）委任状 （３）　明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１）　（２１別紙の通り （３）　明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の 浄！（内容に変更なし）８、添付書類の目録　゛ （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３ン　明ｔ−１１１″ｉｇの翻訳文　ｆｉｌ（４）　請求の範囲の翻訳文　１ ｉＩＴＩ国除調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．ジアゼパムレセプターをもつ細胞の生理学的活性を調節する方法において、 該細胞にジアゼパムレセプター結合量の、哺乳動物の脳中に見いだされるＥＢＺ Ｄポリペプチドの配列と実質的に同一の配列をもつ、少なくとも約１５個のアミ ノ酸のポリペプチドを適用すること、 を特徴とする上記の方法。
2. ２．該哺乳動物が霊長類又はウシである、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該配列が下記の配列の少なくとも１つを含む、請求の範囲第１項記載の方法 ： ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 ｃ．【配列があります】 ｄ．【配列があります】 ｅ．【配列があります】 上記の配列において、 ａａａは芳香族アミノ酸であり； ａａｂ及びａａｃはいずれかのアミノ酸であり；ａａｄ及びａａｅは脂肪族中性 アミノ酸であり；ａａｐは脂肪族アミノ酸であり； Ａｒは芳香族アミノ酸であり； ａａｑは脂肪族アミノ酸であり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり；そしてｘは０又は１である。
4. ４．該ポリペプチドが下記の配列の少なくとも１つを含む、請求の範囲第３項記 載の方法： ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 上記の配列において、 ａａｆは４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり；ａａｇは３〜５個の 炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｈは中性又は酸性の、３〜５個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり； ａａｉは約２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり； ａａｊは２〜５個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり；ａａｋは３〜５個の 炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｉは３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｍは４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ酸であり； ａａｎは３〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり； ａａｐは４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族中性極性又は酸性アミノ酸であり； ａａｑは４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり；ａａｒは３〜６個の 炭素原子をもつ脂肪族中性アミノ酸であり； ａａｓは３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性アミノ酸であり； Ｘ′は４〜６個の炭素原子をもつアミノ酸１〜３個であり；ｘは０又は１であり ；そして ａａｏは４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性アミノ酸である。
5. ５．該ポリペプチドが哺乳動物の脳に由来し、そして逆相ＨＰＬＣカラムで０． １％水性トリフルオロ酢酸中の約３０％〜３６％アセトニトリルからの画分中に 溶出し、そして約７〜１５ＫＤａｌのものである、請求の範囲第１項記載の方法 。
6. ６．該ポリペプチドが実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第５項記 載の方法： 【配列があります】 上記の配列で、Ｚは０又は１であり、一つの部位にある複数のアミノ酸は、各々 のアミノ酸がその部位で用いられてもよいことを示しており、そして星印（＊） は、結合がその部位で用いられてもよいことを意図している。
7. ７．該ポリペプチドが実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第６項記 載の方法： 【配列があります】
8. ８．該ポリペプチドが実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第６項記 載の方法： 【配列があります】
9. ９．該ポリペプチドが実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第６項記 載の方法： 【配列があります】
10. １０．該細胞が心臓器官を構成しており、該量が該心臓の心臓拍動を調節するの に十分である、請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．該細胞が宿主の一部であり、そして該量が該宿主の挙動を変更するのに十 分である、請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．１５〜１２５個のアミノ酸をもちそして少なくとも１個のエピトープ部位 をもつポリペプチド配列からなり、哺乳動物の細胞からの成分を実質的に含まな い組成物であって、該エピトープ部位は哺乳動物の脳中に見いだされるポリペプ チドとは交差反応性でありそして試験管内でジアゼパムレセプターと特異的に結 合することができ、該ポリペプチドは下記のペプチド配列の少なくとも１つを含 んでいる、該組成物：ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 ｃ．【配列があります】 ｄ．【配列があります】 ｅ．【配列があります】 上記の配列において、 ａａａは芳香族アミノ酸であり； ａａｂ及びａａｃはいずれかのアミノ酸であり；ａａｄ及びａａｅは脂肪族中性 アミノ酸であり；ａａｐは脂肪族アミノ酸であり； Ｘは１〜３個のアミノ酸であり；そしてｘは０又は１である。
13. １３．該組成物が下記の配列の少なくとも１つを含んでいる、請求の範囲第１２ 項記載の組成物： ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 上記の配列において、 ａａｆは４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり；ａａｇは３〜５個の 炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｈは中性又は酸性の、３〜５個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり； ａａｉは約２〜６個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり； ａａｊは２〜５個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ酸であり；ａａｋは３〜５個の 炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｔは３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性極性アミノ酸であり； ａａｍは４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ酸であり； ａａｎは３〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり； Ｘ′は４〜６個の炭素原子をもつアミノ酸１〜３個であり；ｘは０又は１であり ；そして ａａｏは４〜６個の炭素原子をもつ脂肪族中性アミノ酸である。
14. １４．該ポリペプチド配列が実質的に下記の配列、又はそれの少なくとも約３０ 個のアミノ酸をもつ生理学的に活性なフラグメントを含む、請求の範囲第１２項 記載の組成物：【配列があります】 上記の配列で、一つの部位にある複数のアミノ酸は、各々のアミノ酸がその部位 で用いられてもよいことを示しており、そして星印（＊）は、結合がその部位で 用いられてもよいことを意図している。
15. １５．該ポリペプチド配列が実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第 １４項記載の組成物：【配列があります】
16. １６．実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第１４項記載の組成物： 【配列があります】
17. １７．実質的に下記のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第１４項記載の組成物： 【配列があります】
18. １８．該ポリペプチド配列が配列【配列があります】を含む、請求の範囲第１４ 項記載の組成物。
19. １９．該ポリペプチド配列が配列【配列があります】を含む、請求の範囲第１４ 項記載の組成物。
20. ２０．請求の範囲第１２項に記載の組成物に結合することができ、そして請求の 範囲第１２項に記載の組成物又はそれの免疫原フラグメントに応答して調製され ている抗体。
21. ２１．モノクローナル抗体である、請求の範囲第２０項記載の抗体。
22. ２２．哺乳動物の脳中に見いだされ、約７，０００〜１５，０００の分子量をも ちそしてジアゼパムレセプターに優先的に結合することができるポリペプチドの 存在を検知する方法であって、請求の範囲第２０項に記載の抗体を、該ポリペプ チドを含有していると思われる試料と混合し、そして該抗体との複合体形成の存 在を決定する、ことを特徴とする上記の方法。
23. ２３．少なくとも２種の成分をもちそしてａ）哺乳動物の脳細胞から得ることが でき、ｂ）新生物細胞の成長をインビトロで優先的に遅らせることができ、 ｃ）中枢神経系細胞のＣＡＢＡ−作働性応答を調節することができ、 ｄ）ＣＣＬ６４細胞での細胞成長調節アッセイにおいて少なくとも１ユニット／ ｍｇをもち、 ｅ）ベンゾジアゼパムとのシナプトソームの結合競合において少なくとも２ユニ ット／ｍｇをもち、そしてｆ）逆相ＨＰＬＣにおいて、水性０．１Ｍトリフルオ ロ酢酸−アセトニトリルでの３０％〜４０％アセトニトリル画分で溶出する、 ことを特徴とする組成物。
24. ２４．活性ポリペプチド成分に関して実質的に均一なポリペプチド組成物であっ て、該ポリペプチドは、水性０．１Ｍトリフルオロ酢酸−ｎ−プロパノールでの ２０％〜２６％ｎ−プロパノール画分で溶出すること、約８〜１８ＫＤａｌであ ること、腫瘍細胞又はＴ細胞の成長を抑制すること、及び哺乳動物の脳中に見い だされる、ことを特徴とする、上記のポリペプチド組成物又はその生理学的に活 性なフラグメント。
25. ２５．少なくとも約１．５×１０７ユニット／ｍｇの細胞調節活性をもつ、請求 の範囲第２４項記載のポリペプチド組成物。
26. ２６．ヒト又はウシの脳組織に由来する、請求の範囲第２４項記載のポリペプチ ド組成物。
27. ２７．下記の配列の範囲内に入る少なくとも６個のアミノ酸をもつＮ−末端近位 アミノ酸配列をもつ、請求の範囲第２４項記載のポリペプチド組成物： 【配列があります】 上記の配列においてＸはいずれかのアミノ酸である。
28. ２８．実質的に全配列をもつ、請求の範囲第２７項記載のポリペプチド組成物。
29. ２９．新生物細胞又はＴ細胞を成長抑制量の請求の範囲第２４項記載の組成物と 接触させることを特徴とする、該細胞の成長を抑制する方法。
30. ３０．明細書に記載したような膜蛋白質と実質的に同一のアミノ酸組成をもつポ リペプチド又はメチオニン９０又は９１で始まるそのフラグメントを含む組成物 。
31. ３１．請求の範囲第２４項に記載の組成物に結合することができ、そして請求の 範囲第２４項に記載の組成物又はそれらの免疫原フラグメントに応答して調製さ れている抗体。
32. ３２．単クローン性抗体である、請求の範囲第３１項記載の抗体。
33. ３３．請求の範囲第３０項に記載の組成物に結合することができ、そして請求の 範囲第３０項に記載の組成物又はそれらの免疫原フラグメントに応答して調製さ れている抗体。
34. ３４．請求の範囲第１４項に記載の組成物をコードしており、そして適切な方向 で、少なくとも１つの、野生型プロモーター以外のプロモーター、野生型ターミ ネーター以外のターミネーター、又は野生型複製系以外の複製系に結合されてい るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ発現造成物。
35. ３５．該複製系、プロモーター及びターミネーターが真核生物宿主中で機能的で ある、請求の範囲第３４項記載のＤＮＡ発現造成物。
36. ３６．請求の範囲第２４項に記載の組成物をコードしており、そして適切な方向 で、少なくとも１つの、野生型プロモーター以外のプロモーター、野生型ターミ ネーター以外のターミネーター、又は野生型複製系以外の複製系に結合されてい るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ表現構造体。
37. ３７．該複製系、プロモーター及びターミネーターが原核生物宿主中で官能性で ある、請求の範囲第３６項記載のＤＮＡ発現造成物。
38. ３８．請求の範囲第３０項に記載の組成物をコードしており、そして適切な方向 で、少なくとも１つの、野生型プロモーター以外のプロモーター、野生型ターミ ネーター以外のターミネーター、又は野生型複製系以外の複製系に結合されてい るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ表現構造体。
39. ３９．該複製系、プロモーター及びターミネーターが原核生物宿主中で官能性で ある、請求の範囲第３８項記載のＤＮＡ発現造成物。