JPH04503352A - 組換えｄｎａ分子、宿主、方法及びヒトソマトメジン担体タンパク質様ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＮＡ分子、宿主、方法及びヒトソマトメジン担体タンパク質様ポリペプ チド 米国連邦政府の援助による研究・開発に基づいてなされた発明の権利に関する陳 述 米国政府は、この発明に払い込み済のライセンスを有し、米国保健福祉省、Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ Ｈｕｍａｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔによって与えられた認可番号第５ＳＳ−Ｃ （３）Ｉ　Ｒ４３ＨＤ２１３２３−０１８ＮＧ及び認可番号第２Ｒ４４ＨＤ２１ ３２３−０２によって規定されている適正な条件で、特許権者が、他人にライセ ンスを与えるよう要求する制限された状態の権利をもっている。

発明の分野 この発明は、ヒトソマトメジン担体タンパク質サブユニット及びその製造方法に 関する。さらに詳しくは、この発明は、ヒトソマトメジン様ポリペプチドに結合 し、インシュリン様成長因子としても知られている担体タンパク質サブユニット に関する。さらにこの発明は、特に純粋なヒトソマトメジン担体タンパク質サブ ユニットに関する。またこの発明はヒト血漿から上記の担体タンパク質サブユニ ットを製造する方法に関する。この製造方法には、一連の各種クロマトグラフィ の段階によって、ヒト血清画分Ｃａｈｎ■−１から製造する方法が含まれている 。この発明の担体タンパク質サブユニットと方法は、各種の治療、診断などの有 用な用途に用いることができる。

またこの発明は、ヒトソマトメジン担体タンパク質様ポリペプチドをコードする ＤＮＡ分子、組換えＤＮＡ分子、かような分子で形質転換された宿主、ヒトソマ トメジン担体タンパク質様ポリペプチドの製造方法、前記分子を使用して製造さ れるヒトソマトメジン担体タンパク質様ポリペプチド、宿主及び方法に関する。

更に詳しくは、この発明は、ＤＮＡ分子と、適切な宿主でのその発現に関する。

上記の組換えＤＮＡ分子は、前記のヒト担体タンパク質の生物活性を有するポリ ペプチドをコードするＤＮＡ分子をもっている。以下の開示から明らかなように 、この発明のＤＮＡ分子、岨換えＤＮＡ分子、宿主及び方法は、各種の治療、診 断などの有用な用途に有用なポリペプチドの製造に使用することができる。

発明の背景 ソマトメジン（“Ｓ「とも呼称される）は有用な生物学的特性を有するホルモン である。ＳＭは、約７．５００ダルトンの分子量を有するポリペプチドである。

ＳＭは、（ａ）成長ホルモン（“ＧＨ“とも呼称される）の成長促進作用を仲介 し、（ｂ）弱いインシュリン様活性を有しくそのため“インシュリン様増殖因子 ”又は”ＩＧＦ″とも呼ばれている）　、（Ｃ）各種骨格組織などの組織に対し て分裂促進性であり、及び（（至）大きな担体タンパク質に結合した血漿で輸送 される。ヒトには、２種のＳＭ組成がある。

ＳＭ−Ｃは塩基性のポリペプチドでＳＭ−Ｃと呼ばれることがある。

ＳＭ−Ｃは出生後のＧＨの成長促進作用を仲介する。ＳＭ−Ａは、主として、Ｉ ＧＦ−ｍとして知られているポリペプチドと、各種の量の修飾形ＳＭ−Ｃとの混 合物である（　５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｂ、　Ｍ、編集”Ｉｎｓｕ−ｔｉｎ−１ｉｋ ｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ／Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ”中の５ｐｅｎ ｃｅｒ、　Ｂ、　Ｍ。

等、”Ｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ｆ（ｕＬＩｌａｎ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ− １ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ［ａｎｄｌ［Ｗｉｔｈ　Ｓｏｍａｔｏ ｍｅｄｉｎｓ　Ｃａｎｄ　Ａ　Ｗｉｔｈ　ＲＡＴ　ＳＭ　Ｉ　ａｎｄｌ“（Ｗａ ｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ、　１９８３年）参照）　、　ＩＧＰ−ｎはＧ Ｈ依存性は小さいが、胎児の成長に役割をもっている。

ＳＭは、骨形成（例えば骨粗しよう症の治療時）、創傷の治癒、動物とＧＨ欠損 症のヒトの成長を刺激し、生体内で有用である。ＳＭ−Ｃの血清中濃度は、先端 巨大症、脳下垂体性巨人症、ＧＨ欠損症及びその外の成長関連症状を診断するの に測定されるＣＧｒｅｅｎｓｐａｎ　Ｆ、Ｓ、とＦｏｒｓｈａｍ、　Ｐ、Ｈ，編 集“Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌＢｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　８９頁（ １９８６年）の５ｐｅｎｃｅｒ　Ｂ、Ｍ、“Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ″（Ａｐ ｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ）参照〕。またＳＭは、組織培養 で各種の細胞の増殖を生体外で刺激するのにも用いられるので正常な及び異常な 細胞増殖の調節の研究に有用である。ある種の乳癌細胞と腎臓癌細胞が産生ずる ＳＭは、癌組織の増殖を保持するのに必要な、癌細胞と血管の繊維状組織の両者 の増殖を刺激する（Ｓｐｅｎｃｅｒ　ＬＭ、等、“Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　Ａｕｔｏ −Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｃａｒｃｉｎｏ ｍａ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ”　。

Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、、４６４ｍ！、４ ４８頁、１９８６年；　Ｈｕｆｆ　Ｋ、に１等、“５ｅｃｒｅｔｆｏｎ　ｏｆ　 Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ−ｔａｒ−１−ｒｅｌａｔｅ ｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ ｌｓ”Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　４６巻、４６１３〜４６１９頁、 １９８６年参照）。

ＳＭの作用を阻止することは、これらの癌の増殖を制御するのに有用である。

ヒトＳＭは、他のタンパク質によって生体内で輸送され調節されるようである（ Ｈｉｎｔｚ　Ｒ，Ｌ、等、”Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃ−ｉ ｆｉｃ　Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　Ｐａｒ 　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ”、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｂｎｄｏ−ｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　、４５巻、９８８頁、 １９７７年参照）。

これらのタンパク質は生体内でＳＭと結合してＳＭの生物活性を調節するようで ある。中性ｐＨ下でヒト血清をゲル濾過した結果、免疫反応性ＳＭ−Ｃ活性の９ ５％と恐ら＜　［ＧＰ−ＩＩ活性が、約１５０、０００〜１６０．０００ダルト ン（１５０〜１６０キロダルトン即ち、ｋＤａ）の位置と、３５〜５０ｋＤａの 範囲に少量溶出することが分かった。ご（少量の免疫反応性活性が７．５ｋＤａ に溶出する。そこには遊離のＳＭが現れるはずである（Ｓ１１ｉｉ１１．Ｇ、１ ０、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　 、３４巻、８３〜８９頁、１９８４年参照）。

このことはＳＭが血漿中でより大きなタンパク質と複合していることを示す。

ヒト血漿中の少なくとも２種のクラスのタンパク質又はタンパク質複合体がＳＭ と結合すると報告されている（Ｄｒｏｐ、　Ｓ、　Ｌ。

等、”［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ａ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ−ｂｉｎｄ ｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＦｒｏｍＨｕｍａｎ　Ａｍｎ１ｏｔｉｃ　Ｆｌｕｉｄ ；　Ｌｅｖｅｌｓ　Ｉｎ　Ｆｅｔａｌ、　Ｎｅｏｎａｔａｌ、　ＡｎｄＡｄｕｌ ｔ　５ｅｒａ’　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、、 ５９巻、　９０８頁、１９８４年；　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｊ、Ｒ，等、“Ａｆｆｉ ｎｉｔｙ　１ａｂｅｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｓｏｍａｔ−ｏｍｅｄｉｎ−Ｃ＋／ ［ｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｉ　Ｂｉｎｄｉｎｇ 　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、“Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、７５巻、１３５０頁 、１９８５年参照）。本願では、一方のクラスの天然のタンパク質又はタンパク 質複合体を、その機能がＳＭを輸送することのようなので、ＳＭ“担体タンパク 質”と呼称する。この用語はその担体タンパク質が単一のタンパク質であること を示そうとするものではない。１つ以上の担体タンパク質があり、それはタンパ ク質複合体である。

本願では他方のクラスのものを“羊水結合タンパク質″又は“ＡＰＢＦ”と呼ぶ 。１つ以上のＡＦＢＰがある。ＳＭと結合する追加のクラスのタンパク質又はタ ンパク質複合体を見出すことも可能である。

担体タンパク質活性は、ＳＭ−Ｃ活性と同様にＧＨ−依存性でＧＨ欠損症のヒト では低く、ＧＨ産生腫瘍、先端巨大症として知られている症状を有する患者では 高い（Ｗｈｉｔｅ　Ｒ，Ｍ、等、“ＴｈｅＧｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｄｅ ｐｅｎｄｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒａｔ ｅｉｎ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ”、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、Ｍｅｔａｂｌ、　５３巻、４９頁、１９８１年参照）。担体タンパク質は 、潜在的に価値のある用途を示す生物学的特性を示す。生体内では、ＳＭが担体 タンパク質と結合すると、ＳＭの半減期が、試験される動物の種によって約１時 間から約２４時間まで増大すると報告され（Ｃｏｈ−ｅｎ、　Ｋ、　Ｌ、等、” Ｔｈｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｈａｌｆ−１ｉｆｅ　ｏｆ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　Ａ ｃｔｉｖｉｔｙ：Ｂｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　 Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ”、Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃ−活性になる。他のモデル系の 研究は、担体タンノくり質を含有する不純な製剤は、（ａ）潅流されているラッ トの心臓での５ｌｉｌの代謝作用を消失させ（Ｍｅｕｌｉ、Ｃ，等、’Ｎ５ＩＬ Ａ−ｃａｒｒｉｅｒ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｂｏｌｉｓｈｅｓ　Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｏ ｎ　ロｆ　Ｎｏｎ５ｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅＡｃｔ ｉｖｉｔｙ　（ＮＳＩＬＡ−ｓ）　Ｏｎ　Ｐｅｒｆｕｓｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅａｒ ｔ”、Ｂｉａ、　１４巻、２５５頁、１９７８年）、う）培養中の細胞でのＳＭ の分裂促進作用を阻害しくＫｎａｕｅｒ、　Ｄ、Ｊ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、７７巻、７２５２−７２５６頁、１９８０年及びＫｕｆｆｅ ｒ、　Ａ、Ｄ、等、’Ｐａｒｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａ　 ５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｏｆ　ＴｈｅＩｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋ ｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｈ ｉｇｈ−ｐｅｒ−ｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ ｈｙ’　、　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ。

３３６巻、８７−９２頁、１９８４年）、及び（ｅ）ラットの脂肪組織でのＳＭ のインシュリン様活性を阻止する（Ｚａｐｆ、　Ｊ、等、“Ｉｎｈｉｂｉｔ−ｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｎｏｎ５ｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌｅ　 Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ａｃｔｉ−ｖｉｔｙ　Ｏｎ　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　Ｒ ａｔ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｂｙ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｔｏ　Ｉｔｓ　ＣａｒｒｉｅｒＰｒ ｏｔｅｉｒｒ”、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、６３巻、１０７７頁、１９ ７９年）。担体タンパク質の一部分純粋の製剤は、ＳＭを測定する競合結合アッ セイを行う試験で放射能標識を付けたＳＭとともに使用されている（Ｍｏｓｅｓ 、　Ａ、Ｃ，等、Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　ｙ−１１０４巻、５３６頁、１９７ ９年参照）。

その価値のある生物学的特性のため、その活性の原因である担体タンパク質若し くはそのサブユニットを単離し特性を決定しようと多（の努力がなされている。

本願の発明がなされる前は、担体タンパク質若しくはその活性サブユニットを純 粋な形で単離して特性を決定しようという試みはことごと（失敗している。これ は血漿中の担体タンパク質の濃度が低いことが一部影響している。精製に成功す るには、担体タンパク質が酵素によって消化され、特にｐＨの変化に対し不安定 なために、活性の損失の問題も解決しなければならない。担体タンパク質サブユ ニットの精製は、血漿中にＡＰＢＰが存在し、これもソマトメジンと結合するの でさらに複雑である。

担体タンパク質は糖タンパク質である。中性ｐＨ下の血清中で担体タンパク質は ＳＭと結し、得られた複合体は、ゲル濾過法で測定すると、約１５０〜１６０ｋ Ｄａの分子量をもっている。中性ｐＨ下での担体タンパク質複合体の分子量は、 他の測定法で測定したところ約１２５ｋＤａであった。酸性条件下で血清もしく は血漿をゲル濾過クロマトグラフィに付すと、結合していたＳＭが担体タンパク 質から分離し、分子量が約４０〜５０ｋＤａの担体タンパク質のユニットが精製 すると報告されている。そのユニットもソマトメジンと結合する（Ｈｉｎｔｚ、 　Ｒ，Ｌ、等、’Ｄｅｍｏｎ−ｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐ ｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ＦｏｒＳｏｍａｔ ｏｍｅｄｉｎ−１Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　 、４５巻、９８８頁、１９７７年参照）。４０〜５０ｋＤａの酸性で安定なユニ ットは１５０〜１６０ｋＤａの担体タンパク質複合体を再生するよう誘導できな いので、他の文献は、担体タンパク質も、それ自体ソマトメジンと結合しない酸 性に対して不安定なユニットで一部構成されていると示唆している（Ｍｏｓｅｓ 、　Ａ、Ｃ，等、Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　。

１０４巻、５３６頁、１９７９年参照）　、　Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏは、血清を ３５〜５５％の硫酸アンモニウム溶液で処理し、沈澱を単離し、その沈澱を０． ０５Ｍ　トリス液、ｐＨ８，２０に溶解し、トリス緩衝液を用いるＤＢＡｆ！セ ファデックスＡ−５０のクロマトグラフィに付したと報告している（Ｆｕｒｌａ ｎｅｔｔｏ、　Ｒ，Ｗ、“Ｔｈｅ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　ＣＢｉｎｄｉ−ｎ ｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　Ｆｏｒ　Ａ　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ ｏｕｓ　５ｕｂｕｎｉｔ　５ｔｒｕｃ−ｔｕｒｅ”　、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　、５１巻、１２頁、１９８０年参照）。Ｆ ｕｒｌａｎｅｔｔｏはそれ以上の精製を開示しなかった。

むしろ、Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏは、各種の両分で実験を行って、血清中のソマト メジン−〇結合活性が少なくとも２つのユニットで構成され、一方はストークス 半径が３６人でＳＭ−Ｃと結合しくいわゆる酸性で安定なユニット）、他方はス トークス半径が３０〜３８人でＳＭ−Ｃと結合しない（いわゆる酸性で不安定な ユニット）というＰｕｒｌａｎｅｔｔｏの見解を確認している。

Ｗｉ　１ｋｆｎｓは、アフィニティ・ラベリング法によって、ＳＭ−Ｃと複合し た血漿タンパク質を同定した（Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｊ、Ｒ，等、“Ａｆｆｉｎｉ ｔｙ−１ａｂｅｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｓｏｍａｔｏｎｅｄｉｎ−Ｃ／Ｉｎ５ｕ ｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒ−ｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　［Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ”　、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、７５巻、１３５０頁、１ ９８！４参Ｍ）。＋　２　’　［−ＳＭ−Ｃｔ−１全血漿ト、血漿のセファデッ クスＧ−２００ｉ１分とにおいてＳＭ−Ｃと結合したタンパク質に共存結合で架 橋結合させた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法とオ ートラジオグラフィとによッテ、さらニＡＦＢＰを約１６０．１１０　、８０． ５ｏ及び２５ｋＤａの種に同定した。Ｗｉｌｋｉｎｓ等は、１６０ｋＤａの担体 タンパク質複合体は、６つの約２５ｋＤａ（２４−２８ｋＤａ）のサブユニット の複合体で構成され、各々サブユニット＋ＳＭ−Ｃで構成されていると仮定した 。しかし、Ｗｉｌｋｉｎｓ等は、この２５ｋＤａのサブユニットの単離若しくは 精製の報告はしなかった。他の研究者は、わずかに大きいサブユニット構造を提 案したが確認していない（Ｄａｕｇｈａｄａｙ、　Ｗ＋Ｈ，等、”Ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ＳｏｍａｔｏｍｅｄｉｎＢｉｎｄｉｎｇ　ｉｎ　 Ｈｕａ＋ａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ｂｙ　Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　 Ａｎｄ　Ｇｅ１Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ”　、Ｊ、　ＣＬ［Ｎ、　Ｂｎｄｏｃｒｉ ｎａｌ、　Ｍｅｔａｂ、　、５５巻、９１６頁、１９８２年参照）。

いく人もの研究者が、酸性で安定な４０〜５０ｋＤａの担体タンパク質ユニット をヒト血漿から単離しようとして失敗したことを報告している。Ｄｒａｚｎｉｎ 等は、わずかに１％のＳＭ結合活性を含有する物質を報告したがその物質が担体 タンパク質若しくはＡＦＢＰに由来するものか否かは開示していない（Ｄｒａｚ ｎｉｎ。

Ｂｏ等、Ｇ、　Ｇｆｏｒｄａｎｏ等編集−Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ　ａｎｄ　 Ｇｒｏｗｔｈ’の１４９〜１６０頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９７９ 年）参照）　ｏ　Ｆｒｙｋｌｕｎｄ等は、新しい凍結ヒト血漿を、ポリエチレン グリコール沈澱法、カルボキシメチル−セファデックスクロマトグラフィ及びゲ ル濾過法で分画した（Ｐｒｙｋｌｕｎｄ、　Ｌ、等、Ｇ、Ｈ，５ａｔｏ等編集Ｈ ｏｒｍｏｎ−ｅｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅの４９〜５９頁（Ｃｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　１９７９年）参照 ）　ｏ　Ｐｒｙｋｌｕｎｄ等は、その担体タンパク質が、３５ｋＤａと４５ｋＤ ａの２つの似ていない連鎖で構成されていると提案した。Ｆｒｙｋｌｕｎｄ等は グリシンがＮ末端分子分析法によって遊離されたことを開示したが、そのグリシ ンがどの連鎖に由来するのか、または両端ともにグリシンで終わっているか否か は同定しなかった。ｆ’ｒｙｋｌｕｎｄ等の製剤の報告された結合活性は非常に 低（その純度は報告されなかった。Ｐｒｙｋ−１ｕｎｄ等は、担体タンパク質若 しくはＡＦＢＰがその製剤中に存在しているか否かを確認しなかった。Ｍｏｒｒ ｔｓ、　Ｄ、Ｈ，等は、ヒトＣｏｈｎ画分■を酢酸で抽出し、　１２’Ｉ−ＩＧ Ｆ−［とともにインキュベートし、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００のクロマト グラフィに付すことによって粗製のＳＭ結合性画分を得たと報告している（Ｍｏ ｒｒｉｓ。

Ｄ、　Ｈ，等”５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ−ｂｉｎｄ ｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　：　Ａｌｋａ−１ｉｎｅ　ｐＨ−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄ ｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｃｆｄ−Ｓｔａｂｌｅ、　６０，００ ０Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｔｎｔｏ　Ｓｍａｌｌ ｅｒ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ’、Ｆ！ｎｄｏ−ｃｒｉｎｏｌｏ　、１１１！ａ、 ８０１〜８０５頁、１９８２年参照）。

Ｍｏｒｒｉｓ等は、見掛けの分子量が６０．０００と４６．０００で結合性放射 性ＳＭ−Ｃを含有する画分を報告した。Ｍｏｒｒｉｓ等は、これらの両分をｐＨ ８，０ｊ：暴露すると、６０．０００　ト４６．０００ダル）　：／（７）　１ ２Ｊ−［ＧＰ−１結合活性体が４６．０００と３０．０００の複合体を有する画 分にシフトすると報告した。これらの画分はそれ以上精製されなかった。Ｍａｒ ｔｉｎ等は、その酸性で安定なユニットに対するポリクローナル抗体を製造した と報告した。酸性で安定なユニットは、２Ｍ酢酸、７５ｍＭ　ＮａＣｆでヒトＣ ｏｈｎｌｆ分■を抽出することによって単離された。ＳＭをＳＰ−セファデック スに吸着させることによって除去した後、酸性で安定なユニットをＩＧＦ−ｎ− アフィニティークロマトグラフィで得て、免疫化に用いた。

Ｍａｒｔｉｎ等は、ＨＰＬＣを用いると酸性で安定なユニットをさらに精製する ことができることを開示した。その最終生成物の純度を確認するデータは何も与 えられなかった（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｊ、Ｌ。

等、’Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ａｃ１ｄ−３ｔａｂｌｅ　Ｉｎ５ｕ ｌｉｎ−Ｌｉｋｅ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｄｅｔｅｃｔｓ　１５０，０００　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＷｅｉｇｈｔＨｏ ｒｍｏｎｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａ ｓｍａ”　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｎ−ｄｏｃｒｉｎａｌ、　Ｍｅｔａｂ、、２６ １巻、７９９〜８０１頁、１９８５年参照）。

Ｋｕｆｆｅｒ等は、彼がインシュリン様成長因子の阻害剤（ＳＭ）として報告し たものの部分的精製について報告した（Ｋｕｆｆｅｒ、　Ａ、Ｄ。

等、“Ｐａｒｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　５ｐｅｃｉｆｉ ｃ　ｒｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆｔｈｅ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔ ｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｈａｓｅ　Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆ ｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”、　Ｊ、ｏｆ 　Ｃｈｒｏｍｓすｍ、３３６巻、８７〜９２頁、１９８４年参照）　ｏ　Ｋｕｆ ｆｅｒ等は、セファデックスＧ−７５とＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−３０カラムを用い る、酸性条件下でのイオン交換クロマトグラフィと連続ゲルクロマトグラフィに よッテ、Ｃｏｈｎｌｒ分ＩＶ−１から分子量が１６．０００〜１８．０００（７ ）　ＳＭ阻害剤を製造した。アフィニティクロマトグラフィと高性能液体クロマ トグラフィにかけた後、Ｋｕｆｆｅｒ等は、　“大きな明らかに均一なタンパク 質のピークと、小さな不均一なピーク”に対応する活性の２つのピークとして“ 阻害活性”を得た。Ｋｕｆｆｅｒ等は核ピークの活性体の単離は報告しなかった 。

上記の研究は、いずれもソマトメジン様ポリペプチドに結合できるヒト担体タン パク質サブユニットのクラスを開示していない。さらにこれらのどの研究も、Ｓ Ｍに結合できかつ均一に精製された担体タンパク質のサブユニットを開示してい ない。担体タンパク質がＡＦＢＰ若しくは汚染物の代わりに単離されたことを確 証し、生物活性を試験するには純度が要求される。不純な製剤は酵素を含有して いるので生成物を不安定にし、容易に分解するが変性する。また不純な製剤は動 物やヒトには使用できない。その理由は、もとの血清に存在しているか又は精製 過程で生成した多くの不純物は抗原性なので望ましくない生物学的作用を生ずる ことがあるからである。

例えば骨粗しよう症のヒトに使うには汚染物をすべて除去する必要がある。とい うのはこれらの汚染物が抗原性であるか又は不利な生物学的作用をもっているか らである。

その外の研究者は、ＳＭに結合しつる異なるタンパク質をヒトの妊娠中期の羊水 から単離して得たが、その羊水はタンパク質若しくはＡＰＢＰ’に結合する。こ のＡＦＢＰは担体タンパク質でもなく担体タンパク質のサブユニットでもない（ Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｊ。

Ｒｏ等、’Ａｆｆｉｎｉｔｙ−１ａｂｅｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｓｏｍａｔｏｍ ｅｄｉｎ−Ｃ／Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　［Ｂ ｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ’、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　［ｎｖｅｓｔ、、７５ １！、１３５０頁、１９８５年参照）　。ＡＦＢＰは、（ａ）担体タンパク質の いわゆる酸性に対して安定なユニットより小さく、分子量が３２−４０ｋＤａの 範囲にあり、（ｂ）グリコジル化されておらず、（Ｃ）その報告されたＮ末端分 子中のこの発明の担体タンパク質サブユニットとは異なり（Ｐｏｖｏａ　Ｇ、等 、＝Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａ−ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ａ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒｏｍ　 Ｍｉｄｔ−ｅｒｍ　Ｈｕｍａｎ　Ａｍｎ１ｏｔｉｃ　Ｆｌｕｉｄ”　、Ｂｕｒ、 　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１４４巻、１９９−２０４頁、１９８４年参照） 、及び（ｄ異なる免疫学的特性をもっている（Ｄｒｏｐ、　Ｓ、Ｌ、Ｓ＋等“Ｉ ｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ａ　ｓｏｍａｔｏｍｅ−ｄｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎ ｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ａｍｎ１ｏｔｉｃ　Ｆｌｕｉｄ： 　Ｌｅｖｅｌｓ１９８５年参照）。ＡＦＢＰに対する抗血清は、１５０ｋＤａの 担体タンパク質若しくはその酸性で安定なユニットと交差反応しない。

Ｄｒｏｐ等は、ラジオイムノアッセイ（Ｒ［Ａ）で測定したＡＦＢＰのレベルが 、幼年期中に減少しくこれは担体タンパク質と逆である）、また担体タンパク質 と異なり、日中に有意に変化することが見出されたと報告した。またＥｎｂｅｒ ｇは、次の４つのクロマトグラフィの工程：ＣＭ−Ａｆｆｉ　ｅｌ　ｂｌｕｅ、 ヒドロキシルアパタイト、高速タンパク質液体クロマトグラフィゲル濾過法及び 高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ヒドロキシルアパタイトによって、ヒ ト成人の血漿からＡＰＢＰを単離した（Ｂｎｂｅｒｇ　Ｇ、、“Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　Ｈｉｇｈ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｓｏｍ ａｔｏｍｅｄｉｎＢｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｒｏａ＋　Ｈｕｍａｎ　 Ｐｌａｓｍａ”、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏ　ｈｙ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１３５＠、１７８〜１８２頁、１９８６年参照）　 ａ　Ｅｎｂｅ−「ｇは、“可能な”Ｎ末端分子１　ａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−を報告 したが、それは、ＡＦＢＰが単離されたのであって、Ｅ！ｎｂｅｒｇが誤って結 論した１５０ｋＤａの担体タンパク質ではないことを証明している。

ＳＭに結合するタンパク質も細胞培養抽出物中に同定された（例えばＡｄａｍｓ 、　Ｓ、０．等、Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏヒー、１１５１！、５２０〜５２６頁 、１９８４年）。これまでにその担体タンパク質は単離されていない。５ｐｅｎ ｃｅｒは、肝臓細胞の初代培養物が、ＳＭと複合するタンパク質を産生ずること を初めて示したＣ３ｐｅｎｃｅｒ８」１、“Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　Ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅｄ　Ｒａｔ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　Ｔｏ　５ｔｕｄｙ　Ｔｈｅの正常及 び異常の細胞形がＳＭと複合するタンパク質を合成することが見出された。バッ ファローラットの肝臓腫瘍の培養細胞（ＢＲＬ３Ａ）は、抗体反応性、Ｎ末端の アミノ酸分子及びグリコジル化されていないことで担体タンパク質と異なる３３ ｋＤａのＳＭ結合性タンパク質を生成する（Ｌｙｏｎｓ　Ｒ，Ｍ、等、”Ｃｈａ ｒａｃｔ−ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｔｉ ｍｕｌａｔｏｒｙ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ″ＭＳＡ’４５巻、２６３〜２７０頁、１ ９８６年；　Ｍｏｔｔｏｌａ、　Ｃ０等、Ｊ、ｏｆ　Ｒｉａｌ。

Ｃｈｅｍ、２６１巻、１１８０〜１１８８頁、１９８６年参照）　ｏ　Ｒｏｍａ ｎｕｓ等は、上記の結合性タンパク質に対する抗体が胎児血清中に存在するタン パク質と交差反応するが成熟ラットの血清とは交差反応しないと報告した（Ｒｏ ｎ＋ａｎｕｓ　Ｊ、Ａｏ等、“Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗ−ｔｈ　Ｆ ａｃｔｏｒ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｎ　Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ａ ｎｄ　Ａｄｕｌｔ　ＲａｔＳｅｒｕｍ　ａｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌ ｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ＵｓｉｎｇＡ　Ｎｅｗ 　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　ＦｒｏｍＢＲＬ−３Ａ　Ｒａｔ　Ｌｉｖｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ’　、Ｂ ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｕ−１１１８巻、１７４３頁、１９８６年参照）。上記の ＢＲＬ−３Ａ結合性タンパク質はＡＦＢＰのげつ菌類相当物かもしれないが、Ｎ 末端分子のデータは２つの分子間に全く類似性がない。

多（のタンパク質とポリペプチドが組換えＤＮＡ技術を用いて製造されている。

この方法で担体タンパク質様ポリペプチドを製造する報告は発表されていない。

担体タンパク質様ポリペプチド遺伝子をクローン化し発現するのに、組換えＤＮ Ａ法の技術を使うには多くの障害がある。担体タンパク質様ポリペプチドをコー ドする遺伝子を得ることは、種々の理由のため困難である。本願発明の前には、 担体タンパク質及び担体タンパク質サブユニットのタンパク質配列は知られてい なかったので、サブユニットをコードするＤＮＡ分子は知られていなかった。ヒ ト組織の起源は全（確認されていなかった。

繊維芽細胞は、特性が決定されていない大きなＳＭ結合性タンパク質を少量産生 することは分かっていた（Ａｄａｍｓ、　Ｓ、０．等、Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ 　、１１５＠、５２０〜５２６頁、１９８４年参照）。肝臓は、ソマトメジンの 主な起源であるが、担体タンパク質を産生ずることは全（知られていなかった。

その上に、肝臓は、リボヌクレアーゼがあるためｍＲＮＡを単離するのに用いる ことは困難である。血清中の担体タンパク質の量は非常に少ない。

したがって、ｍＲＮＡはまれである。担体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を 含有するゲノムは介在配列を含有している。これらの理由とその外の理由のため に、担体タンパク質様ポリペプチドをコードする遺伝子を単離しようとする通常 の方法すなわち、所望の分子を大量含有しているｍＲＮＡの起源を同定し、その ｍＲＮＡからｃＤＮＡのライブラリーを作り、所望の分子を有するｃＤＮＡと雑 種形成するよう設計されたオリゴヌクレオチドブーブでライブラリーをスクリー ニングして、それらｃＤＮＡ分子から遺伝子を単離するかあるいは組立てるとい う方法には多くの落し穴があった。

発明の開示 本願では以下の用語を使用する。

ソマトメジン様のもの：　ＳＭ−ＣＳＳＭ−Ａ、　ＩＣＦ−１及びＩＧＦ−１に 限定されている訳ではないがこれらを含む、ヒトＳＭ若しくはインシュリン様成 長因子の１つの生物活性を示すポリペプチド。そのポリペプチドは、天然のヒト ＳＭのアミノ酸の外に他のアミノ酸を含有しているか、または天然ヒトＳＭの全 アミノ酸を含有していない。

担体タンパク質：ヒト血漿中に存在する糖タンパク質若しくは糖タンパク質複合 体であって、ＳＭ様ポリペプチドの結合を行う工程によって生体内でヒトＳＭの 生物活性を調節する性能を示し、成長ホルモン依存性で、ＳＭと複合すると生理 的ｐＨ条件で約１２５．０００〜１６０．０００ダルトンの見掛けの分子量を示 す。またこの担体タンパク質は多形である。例えば、異なる個体の細胞は、原型 に、生理的には類似しているが、構造がわずかに異なる担体タンパク質の種を産 生ずる。

サブユニット：ポリペプチドの断片、一部、または大きなタンパク質ユニットの 成分。サブユニットという用語は、他の別個のポリペプチド連鎖と共有結合もし くはその外の形態の結合で結合した別個のポリペプチド連鎖という通常の意味に 限定されない。

担体タンパク質サブユニット：担体タンパク質のサブユニ連鎖。またポリペプチ ドは、同じアミノ酸連鎖のシスティンの間に１つ又はそれ以上のジスルフィド結 合をもっている。

担体タンパク質様ポリペプチド：担体タンパク質のヒトソマトメジン調節生物活 性を示し、ソマトメジン様ポリペプチドと結合できるポリペプチド。担体タンパ ク質様ポリペプチドは担体タンパク質のソマトメジン−ｃｗｓｍ活性を示すもの が好ましい。担体タンパク質様ポリペプチドは、上記のソマトメジン調節活性を もっている場合、ソマトメジン様ポリペプチドに結合できる担体タンパク質サブ ユニットである。このポリペプチドは、担体タンパク質又はこのような担体タン パク質サブユニットのアミノ酸の外に１つ又はそれ以上のアミノ酸を含有してい る。このポリペプチドは、担体タンパク質若しくほこのような担体タンパク質の サブユニットのアミノ酸の全部を含有しているわけではない。というのは、１つ 又はそれ以上のアミノ酸が削除されたか又は１つの又はそれ以上のアミノ酸が他 のアミノ酸で置換されているからである。

したがって、担体タンパク質様ポリペプチドは、アミノ酸残基が添加され、削除 され若しくは取替えられた、担体タンパク質若しくは担体タンパク質サブユニッ トのアミノ酸配列をもっている。担体タンパク質様ポリペプチドは、担体タンパ ク質の天然グリコジル化がなされているか、担体タンパク質の天然グリコジル化 がないか、又は担体タンパク質の天然グリコジル化とは異なるグリコジル化がな されている。したがって、担体タンパク質様ポリペプチドは、担体タンパク質の 関連する天然グリコジル化がなされていない。このポリペプチドは、天然グリコ ジル化がなされている形態で測定した場合、約４０．０００〜５０．０００ダル トン又はそれ未満の分子量のものが好ましい。このポリペプチドは、前記形態で 測定した場合、約ｓｏ、　ｏｏｏダルトン又はそれ未満の分子量のものがさらに 好ましい。

ソマトメジン−Ｃ（ＳＭ−Ｃ”若しくはＩＧＰ−１″）：出生後の成長を調節す る主要ホルモン。ＳＭ−Ｃは、ＧＨの成長促進作用を仲介し、担体タンパク質と 結合する。

ヌクレオチド：糖の部分（ペントース）、ホスファート及び複素環式塩基で構成 されているＤＮＡ若しくはＲＮＡのモノマー単位。その４つのＤＮＡ塩基はアデ ニン（Ａ’）、グアニン（“Ｇ”）、シトシン（Ｃ’）及びチミン（“Ｔ”）で ある。４つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ”）である。

ＤＮＡ分子：隣接するペントースの３′と５′の炭素間をホスホジエステル結合 で互いに接続されたヌクレオチドの配列で構成された、全ヒトゲノム以外の分子 。ＤＮＡ分子は、ヒトゲノムの一部分である、ヌクレオチドの単離された配列で 構成されている。ＤＮＡ分子は、単一のＤＮＡ分子（通常“−重鎖ＤＮＡ”と呼 ばれている）、または相補的ヌクレオチドで構成されている２つのＤＮＡ分子（ 通常“二重４１　ＤＮＡ”と呼ばれている）で構成されている。

組換えＤＮＡ分子：少なくとも２つのＤＮＡ分子を連結若しくは付加することに よって得られる、少なくとも１つのヌクレオチド配列を育するＤＮＡ分子。

ゲノム：細胞若しくはウィルスの全ＤＮＡ　、これは生物のポリペプチドをコー ドする遺伝子、オペレーター、プロモーター及びリポソーム結合部位などの相互 作用部位をもっている。

遺伝子：そのｍＲＮＡによって、特異的ポリペプチドのアミノ酸の配列をコード するＤＮＡ分子。

ｃＤＮＡ　：　ＲＮＡを鋳型として用いて第１　ＤＮＡ鎖をＲＮＡ指向性合成法 で合成し、次いでそのＤＮＡ鎖を鋳型として用いてＤＮＡ指向性合成法で第２　 ＤＮＡ鎖を合成することによって、ＲＮＡ分子から産生される二重鎖ＤＮＡ分子 。

二重ＩＩ　ＤＮＡ分子であり、その分子は宿主内で複製される。プラスミドが単 細胞生物内に置かれると、その生物の特性がそのプラスミドのＤＮＡのために変 化する。プラスミドで形質転換された細胞は“形質転換細胞”と呼ばれる。

ウィルス：細胞若しくは生物に感染しうる、タンパク質の外皮若しくはニート内 のＤＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子。

イルス、ニスミドなどの、宿主を形質転換しかつ宿主内で複製しうるＤＮＡ分子 であり、かようなりＮＡ分子は、ＤＮＡの必須の生物機能、例えば複製、コート タンパク質の産生の損失、又はプロモーター若しくは結合部位の損失なしに決定 可能なしかたで切断される１つ又はそれ以上の部位を存し、形質転換された宿主 を同定するのに適切なマーカー、例えばテトラサイクリン耐性を有する。

クローン化：１つのかような生物、細胞若しくはＤＮＡ分子由来の生物、細胞若 しくはＤＮＡ分子の集団を得る工程。

発現制御配列：遺伝子に操作して連結した場合、遺伝子の発現を制御し調節する ＤＮＡ配列。これには次のものが含まれる。すなわち、ｌａｃ系、ヱＬ系、ｔａ ｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主要オペレーターとプロモーターの領域、Ｔ７系 、ｆｄコートタンパク質の制御領域、５Ｖ−４０の制御配列、アクチン系、メタ ロチオネイン系、ＬＴＲ（レトロウィルスの、プロモーターを含有する長い末端 の繰返し部分）系、並びに真核細胞若しくは原核細胞または生物とそのウィルス 若しくはその結合体の遺伝子の発現を制御することが知られているその外の配列 で形質転換されつる、真核細胞若しくは原核細胞又は生物。

担体タンパク質サブユニット この発明によれば、ソマトメジン様ポリペプチドに結合できるヒト担体タンパク 質サブユニットを入手することによって前記問題点が解決される。この発明の担 体タンパク質サブユニットのソマトメジン様ポリペプチドに結合する性能は、こ れらのサブユニットが、生体外にて、はぼ生理的ｐＨ下でソマトメジン−〇に結 合することによって証明された。この結合活性は、この発明の担体タンパク質サ ブユニットが、先焦りで、ソマトメジン様ポリペプチドと結合し、天然の担体タ ンパク質の輸送と調節の活性を実質的に与えることを証明した。

本願で担体タンパク質サブユニットがソマトメジン様ポリペプチドに結合する性 能に言及する際は、この性能が、前記のポリペプチドに’ｋ（ｌもしくは生体内 で結合することを意味する。担体タンパク質サブユニットは、インシュリンと結 合する性能は実質的にもっていない。

この発明の担体タンパク質サブユニットは各々単一のポリペプチド鎖を構成して いる。この発明の担体タンパク質サブユニットは、下記式： （式中、Ｒはシスティン若しくは半シスチン）で表されるＮ末端アミノ酸分子を もっている。半シスチンは、ジスルフィド結合によって、同じポリペプチド鎖中 の別の半シスチンアミノ酸に結合したアミノ酸を意味する。担体タンパク質は多 形であるから、担体タンパク質サブユニットのアミノ酸分子も、その担体タンパ ク質の多形特性によって変化する。例えば、担体タンパク質サブユニットは、Ｎ 末端から５番目の位置のアラニン（“Ａ１７ａ”）の代わりにグリシン（“Ｇｌ ｙ”）残基をもっている。同様に、Ｎ末端から１４番目の位置にあるＧｉｕはｐ ｈｅで一部時々取替えられる。

この発明の担体タンパク質サブユニットは、ある範囲の分子量をもっている。本 願に記載する担体タンパク質サブユニットの分子量は、β−メルカプトエタノー ル″ＢＭＢ″のような適切な還元剤の存在下で行われる、分子量が公知のタンパ ク質に対して５ＤＳ−ＰＡＧＢゲル電気泳動法で測定した分子量である。

公知のタンパク質標準品は、２００．０００　（ミオシン（Ｈ鎖）〕、９７、４ ００（ホスホリラーゼｂ）　、６６．２００（ウシ血清アルブミン）、４３．０ ００　（オボアルブミン’）　、２５．７００　（αキモトリプシノーゲン’） 　、１８，４００　（β−ラクトグロブリン）及び１４，３００　（リゾチーム ）であった。分子量の約１５．０００．２１．０００．２６．０００及び３０、 ０００ダルトンの担体タンパク質サブユニットが単離され同定された。これらの 担体タンパク質サブユニットは分子量が異なる。というのは、これらは、担体タ ンパク質中にその大きさのポリペプチドとして存在しているか、又は、酵素によ る消化若しくは他の原因によって切断されるからである。これらの差異の原因が 何であっても、この発明の担体タンパク質サブユニットは、分子量が約３０．０ ００又はそれ未満である。

この発明の担体タンパク質サブユニットとしては、分子量が約１５．０００から 約ａｏ、　ｏｏｏのものが好ましい。

この発明の担体タンパク質サブユニットは、過ヨウ素酸シッフ試薬に対する陽性 反応と、アガロースに架橋結合されたコンカナバリンＡ　（Ｃａｎ−Ａセファロ ース、ファーマシア社）と結合する性能によって分かるように、糖タンパク質で ある。

Ｃａｎ−Ａセファロースに対する結合性はグルコースとマンノースの残基を含有 する糖タンパク質に特有のものである。特異的残基は、α−Ｄ−マンノピラノシ ルとα−Ｄ−グルコピラノシルの残基を含有している。それ故に担体タンパク質 サブユニットは実質的にグリコジル化されている。

またこの発明は、ＳＭ結合性を有する特に純粋な担体タンパク質サブユニットを 提供するものである。この発明の担体タンパク質サブユニットは、特に、他のタ ンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、多糖類、脂質及び塩を含有していない。こ の発明によれば、ヒトと動物の治療剤に、動物成長促進剤として用いたり、ヒト などの動物診断剤とヒトなどの動物の研究用途に用いるのに充分な純度でこれら のサブユニットを得ることができる。

またこの発明は、ソマトメジン様ポリペプチドに結合できる少なくとも１つの担 体タンパク質すブユニット若しくはその医薬として許容される塩、及び医薬とし て許容される担体の有効量からなる治療様組成物を提供するものである。このよ うな治療様組成物の担体タンパク質サブユニットは、少なくとも１つの特に純粋 な担体タンパク質サブユニットである。

この発明の担体タンパク質サブユニットの組成物は、ＳＭの重要な生物学的特性 に関連する多くの治療用途をもっている。

ヒト担体タンパク質サブユニットを含有する組成物は、増大し調節されていない ８Ｍ依存性の成長に関連する疾患の治療に育用である。したがって、結合によっ てＳＭを不活性化する、この発明の担体タンパク質サブユニットの性能によって 、いくつもの症状を新たに治療することができる。このような治療において、担 体タンパク質サブユニットの有効量は、生物学的に活性で調節されていないＳＭ が過剰に存在している際に、そのＳＭの活性を阻止若しくは不活性化するのに充 分な量であることは明らかである。例えば、担体タンパク質サブユニットの有効 量は、モル基準で、生物学的に活性のＳＭの量の１０倍以上である。例えば、い （つも癌即ち繊維肉腫、軟骨肉腫及び肝癌細胞系はＳＭを産生ずることが分かっ ている（Ｄａ　Ｌａｒｃ。

Ｊ、Ｅ、等、”Ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎ ｅ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｍｕｌｔ−ｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｔｉｍｕｌａｔ ｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ＭＳＡ”−ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、 Ｎａｔｕｒｅ、２７２Ｓ、３５６〜３５８頁、１９７８年参照。）乳癌と腎臓癌 は、癌の増殖を自己刺激するＳＭを産生ずる（Ｓｐｅｎｃｅｒ　Ｂ、Ｍ。

等、”Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　Ａｕｔｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａ ｎ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｃａｒｃｉｎ−ｏｍａ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｂｙ　Ｓｏｍａｔ ｏｍｅｄｉｎｓ’　、Ａｎｎａｌｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ＡｃａｄｅｍｙＳｃｉ ｅｎｃｅｓ、４６４巻、４４８〜４４９頁、１９８６年参照）。内皮細胞と繊維 芽細胞の増殖もＳＭで刺激されるので、乳癌が産生ずるＳＭはバラ分泌として作 用して、腫瘍の生存に重要な支持ストローマ組織の増殖を刺激する（Ｂａｒ　Ｒ ，Ｓ、等、′″Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ＰａｒＭｕｌｔｆｐｌｆｃａｔｉｏｎ−ｓ ｔｆｍｕｌａｔｆｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎ　Ｈｕｍａｎ　Ａｒｔｅｒｉａ ｌａｎｄ　Ｖｅｎｏｕｓ　８ｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ”、Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

Ｍｅｔａｂ、　、５２巻、　８１４頁、１９８１年：　Ｃｌｅｍｍｏｎｓ　Ｄ、 Ｒｏ等、’Ｈｏｒ−ｍｏｎａｌ　Ｃｏｎｔ−ｒｏｌ　Ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｒｅａ ｃｔｉｖｅ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＢｙ　Ｃｕ１ｔｕ ｒ−ｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ″″、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ、、６７巻、１０頁、１９８１年参照）。この発明のヒト担体タンパク 質サブユニットを投与すれば、ＳＭの作用を阻止することによって、腫瘍の増殖 速度を低下させ、さらに、悪性細胞を他の薬剤に対してより感受性にすることが 期待できる。

また担体タンパク質サブユニットによる治療は、糖尿病性増殖性網膜症の二次的 症状の失明を防止するのに役立つであろう。５ｐｅｎｃｅｒ等は、ＳＭ−Ｃが糖 尿病性網膜症の内皮と繊維芽細胞の増殖を刺激する因子の１つであるようである ことを示した（Ｌｏｒｅｎｚｉ、　Ｍ＋、５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｂ、Ｍ、等、”Ｉ ｍｐｒｏｖｅｄ　Ｄｉａｂａｔ−ｉｃ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｒａｐｉｄ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆＲｅｔｔｎｏ ｐａｔｈｙ’、Ｎｅｗ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ　、３０８１！、１６０頁、１９８３年；　Ａｓｈｔｏｎ　ＩＫ、等、’Ｐ ｌａｓｍａ　ＢＯｍｌｌｔＯｍｅｄｉｎ　１ｒｌｄｉａｂｅｔｉｃｓ　ｗｉｔｈ 　ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ　ａｎｄ　ｊｏｉｎｔ　ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅｓ’ （Ｓｐｅｎｃｅｒ、　Ｂ、Ｍ、編集″［ｎ５ｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ 　Ｐａｃｔｏｒｓ／Ｓｏｍａｔｏｍ−ｅｄｉｎｓ’、　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇ ｒｕｙｔｅｒ中）参照）　、　ＳＭ−Ｃ（及び多分ＩＧＰ−Ｉ［も）のこの有害 な作用を阻止する担体タンパク質サブユニットの性能は、有用な新しい治療法に なる。

またこの発明の担体タンパク質サブユニット・は抗体を作るのに有用である。こ の発明によれば、純粋な担体タンパク質サブユニットは、高い力価、高い親和性 若しくは高い阻止特性を有するポリクローナル抗体と、現在は入手できないモノ クローナル抗体とを産生ずる抗原として使用できる。これらの抗体は、イムノア ッセイ、即ちアフィニティクロマトグラフイとイムノヒストケミストリーが、担 体タンパク質の活性を阻止するために特異的な測定をするのに利用できる。

また担体タンパク質サブユニットは、体液中のＳＭの遊離レベルを測定する第１ の手順を行うのに利用できる。この方法により、全ＳＭだけしか測定できない現 在の方法が改良されるであろう。というのは、遊離レベルは、実際に、ＳＭの生 物活性を決定するものだからである。担体タンパク質サブユニットの抗体は、流 体中の遊離ＳＭから、ＳＭ−担体タンパク質複合体を分離するのに利用されるで あろう。そのとき遊離のＳＭは、例えばＲＩＡで測定できる。

またこの発明は、少なくとも１つのソマトメジン様ポリペプチドと実質的に複合 した少なくとも１つの担体サブユニットからなる組成物を提供するものである。

このような組成物は、８−１１の治療用途をもつでいるであろう。ＳＭは、多（ の治療用途に潜在的に有用な生物活性をもっている。

しかし、血漿中に要求されるＳＭの定常レベルを維持するためには、毎日多数の 注射をしなければならない、というのは紺の半減期は遊離状態で１時間より短い からである。この障害は大量投与で克服することはできない、その理由は、（ａ ）ＳＭが皮下組織、筋肉組織及び血管組織（繊維芽細胞、内皮細胞、筋肉細胞、 脂肪細胞及び内皮細胞）に対して強い分裂促進因子であり、局所組織の増殖を起 こし、（ｂ）大量の遊離ＳＩＪが低血糖症を起こし、及び（Ｃ）定常の血漿中濃 度を維持するのに必要なＳＭの過剰量は経費が効率的でないからである。

ＳＭは、この発明の担体タンパク質サブユニットに複合させることによって、安 全で有効な整理学的な方法で、かつその半減期を有意に延長して、標的組織に送 ることができる。ＳＭ担体タンパク質サブユニット複合体中のＳＭは、注射部位 では分裂促進性ではなく、また低血糖性でもない。この複合体は、制御され長期 間にわたって吸収されるように製剤することができる。標的組織に送られた後、 解離してＳＭを放出する。したがって治療は、生理的分配系に似ている６ＳＭ− Ｃ，ＩＧＦ−ｎ及び他のソマトメジン様ポリペプチドの治療及び酪農業の用途に は、少なくとも１つのヒトソマトメジン様ポリペプチドと少なくとも１つの担体 タンパク質サブユニットの組成物によって成功することができる。１つ又はそれ 以上の担体タンパク質サブユニットと１つ又はそれ以上のＳＭとからなる組成物 は、閉経後の骨粗しよう症、他の形態の骨粗しよう症及び１；トＧＨ欠損症のよ うな疾患の治療と、創傷の治療と、動物の成長の向上に有用である。かような組 成物は、ＳＭを骨＠織６−送り、骨の増殖を刺激するのに使用される。担体タン パク質すブユニットーＳＭ複合体からＳＭが解離ずＳと、骨芽細胞を刺激して閉 経後の骨粗しよう症の場合に骨形成を増大し１、補てつ関節の多孔質のマトリッ クスに充満して補てつ具を安定化し、未結合の骨折部の治癒を促進する。

またソマトメジン様ポリペプチドと結合できる少なくとも１つの担体タンパク質 サブユニット又はその医薬として許容される塩、及び医薬として許容される担体 の存効量からなる治療様組成物と、かような組成物を用いる治療法は、自然治癒 の機構若しくは応答が生物学的に活性なソマトメジンが調節されたレベルで存在 することを必要とする傷害若しくは疾病を治療するのに有用である。例えば、か ような組成物は、自然の生理的応答が創傷部位に内因性ＳＭが存在することを必 要とする創傷の治癒に有用である。担体タンパク質サブユニットの有効量は、内 因性の生物学的に活性なソマトメジンの半減期を延長するのに充分な量である。

少なくとも１つの担体タンパク質サブユニットとＳＭ−Ｃの組成物は、酪農業で の有効な生物分解性の成長促進剤として使用することができる。現在、抗生物質 とステロイド剤は、商業上重要な動物成長促進剤である。これら両者には重大な 健康上の問題があるから、新しい薬剤がめられており、特に生物分解性のものが 要望されている。ＧＨが研究されている。

が、しかしＳＭ−Ｃ−担体タンパク質サブユニット複合体の方がはるかに有効で ある。というのは、ＳＭ−ＣがＧＨの成長促進作用の直接のメディエータだから である。ＳＭ−Ｃは糖尿病誘発性でもなく、脂肪分解性でもない。同じ理由が閉 経後の骨粗しよう症にあてはまるので、ＳＭ−Ｃは、担体タンパク質サブユニッ トを含有する組成物で投与されなければならない。

これらのすべての理由から、担体タンパク質様活性に必要なタンパク質構造を決 定しようとする多くの試みがなされてきた。しかしこの発明の担体タンパク質サ ブユニットは同定され単離されたことはなく、純粋な形態で単離されたこともな い。

この発明の他の態様は、（ａ）ｐ）ｌが約４．５〜７．５の水溶液に可溶性のＣ ｏｈｎ画分ＩＶ−１の部分を、架橋デキストランのスルホプロピル誘導体の吸着 剤のクロマトグラフィに付して、ｐＨを増大していく水溶液で連続溶離を行い、 ら）ソマトメジン結合活性を含有する段階（ａ）から得た画分のｐＨが約４．０ より低い酸性溶液を段階（ａ）と同じ吸着剤のクロマトグラフィに付してその通 過画分を集めるか、又は段階（ａ）で得た両分を、硫酸アンモニウム約１０％の 中性溶液から吸着させることによって、アガロースのフェニル誘導体のクロマト グラフィに付して、はぼ中性のｐＨのもとで、約０．５Ｍチオシアン酸ナトリウ ム溶液で溶離し、（Ｃ）ソマトメジン結合活性を有する段階（ｂ）からの画分を ゲル濾過法のクロマトグラフィに付して、酸性水溶液で溶離し、（ｄ）ソマトメ ジン結合活性を有する段階（Ｃ）から得た両分を、はぼ中性のｐＨのもとで吸着 させることによって、実質的に純粋なソマトメジン−Ｃに架橋させた固体支持体 のクロマトグラフィに付して、酸性水溶液で溶離し、次いで（ｅ）ソマトメジン 結合活性を有する段階（ｄ）で得た画分を逆相高性能液体クロマトグラフィに付 することからなる、ヒト血漿からヒト担体タンパク質サブユニットを製造する方 法である。

組換えＤＮＡと担体タンパク質様ポリペプチドまたこの発明には、担体タンパク 質様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、組換えＤＮＡ分子、ベクター、宿主 を、確認、同定及び単離すること、並びに担体タンパク質様ポリペプチド、即ち 担体タンパク質のソマトメジン調節活性を示しソマトメジン様ポリペプチドに結 合できるポリペプチドの産生にこれらの分子、ベクター宿主を用いる方法が含ま れる。この発明によって、治療用と診断用の組成物及び方法に用いる担体タンパ ク質様ポリペプチドを得ることができる。この発明によれば、これらのポリペプ チドを、従来利用できなかった方法で多量に製造できる。またこの発明には、特 にこれらポリペプチドの、より好ましくは、ヒト血漿中に天然に存在する他のポ リペプチドを全く含有していないものを製造することが含まれる。

上記開示から明らかなように、この発明のＤＮＡ分子と組換えＤＮＡ分子は、適 切な宿主中で、担体タンパク質様ポリペプチドの発現を指向することができる遺 伝子をもっている。また適切な宿主内でこれらのＤＮＡ分子及び組換えＤＮＡ分 子を複製することによって、これらポリペプチドをコードする遺伝子を大量に製 造することができる。したがって、これらのポリペプチド遺伝子の分子構造と特 性は容易に決定できる。これらポリペプチドと分子は、宿主内で産生されるとき 、又は適切な修飾の後、組成物と、これらの生成物自体の製造法を改良する方法 と、治療と診断の組成物と方法に用いる方法に有用である。

この発明の基本的な態様は、担体タンパク質ポリペプチド、即ち担体タンパク質 のソマトメジン調節活性を示しソマトメジン様ポリペプチドに結合できるポリペ プチドをコードする遺伝子からなるＤＮＡ分子を提供するものである。かような りＮＡ分子は、全ヒトゲノムではないようにして単離された。かようなりＮＡ分 子はイントロンを含有しない方が好ましい。またかようなりＮＡ分子は、ヒトゲ ノムによってコードされている他のポリペプチドをコードする遺伝子を特に含有 していないものが好ましい。かような遺伝子は、分子量が自然のグリコジル化に よって生成する形態で測定される場合、約４０．０００〜５０、０００ダルトン 若しくはこれより低い分子量を有するポリペプチドをコードするのが好ましい。

かような遺伝子は、担体タンパク質のソマトメジン調節活性とより好ましくは担 体タンパク質のソマトメジン−Ｃ調節活性を示すポリペプチドをコードする。ま たこのような遺伝子は、ソマトメジン様ポリペプチドに結合しうる担体タンパク 質サブユニット、より好ましくはソマトメジン−Ｃに結合しうる担体タンパク質 サブユニットである担体タンパク質様ポリペプチドをコードする。

またこの発明は、担体タンパク質を産生ずる細胞若しくは組織に見出されるｍＲ ＮＡからｃＤＮＡ分子を製造し、どのｃＤＮＡ分子が、図４のＤＮＡ配列に基づ いた１つ又はそれ以上の標識をつけたポリヌクレオチドプローブと雑種形成を行 うかを決定し、雑種形成したｃＤＮＡ分子を分析し、次いで担体タンパク質様ポ リペプチドをコードする遺伝子を有するＤＮＡ分子を得ることからなるＤＮＡ分 子の製造方法を提供するものである。この工程において、その遺伝子を有するＤ ＮＡ分子は、他のｃＤＮＡ分子、合成りＮＡ分子、又は組換えＤＮＡ分子と雑種 を形成する１つ又はそれ以上のｃＤＮＡ分子を連結することによって得られる。

前記プローブに雑種形成するｃＤＮＡ分子は、ヒト肝臓遺伝子ライブラリー、ヒ ト繊維芽細胞遺伝子ライブラリー、ヒト胎盤ライブラリー、及びヒトの内皮のラ イブラリーで構成されている群から選択されたｃＤＮＡ分子である。その方法に おいて、標識をつけたポリヌクレオチドのプローブは図２８に示すＤＮＡ配列を もっている。またこの発明には、その方法で製造されるＤＮＡ分子と、その方法 で得られるＤＮＡ分子によってコードされる担体タンパク質様ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ分子とが含まれる。

またこの発明は、担体タンパク質様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と選択 的に雑種を形成するＤＮＡＮＡ分子Ｐ　、　ＬＯＰｏ、７０、　ＬＯＰ　Ｏ，７ ７、ＬＣＰ　２．３　、　ＬＣＰ　２．５　、　ＰＣＰ　１，８　及びＦＣＰ２ ．５のいずれか１つのＤＮＡ配列のすべて若しくは一部を有するオリゴメクレオ チドブローブを提供するものである。

さらに、この発明のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子のＬＣＰ　０．７０ＳＬＣＰＯ９ ７７、ＬＯＰ　２．３　、ＬＣＰ　２．５　、ＦＣＰ　１．８及びＦＣＰ２．５ からなる群、ＤＮＡ分子のＬＣＰ　Ｏ，７０、ＬＣＰ　Ｏ，７７、ＬＣＰ　２． ３　、ＬＣＰ　２−５、ｐｃｐ　ｉ、ａ及びＦＣＰ２．５のいずれか１つと雑種 を形成し、担体タンパク質様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、並びに前記 ＤＮＡ分子のいずれか１つによってコードされるポリペプチドをコードするＤＮ Ａ分子から選択される。好ましいＤＮＡ分子は、ＬＣＰ２．３の担体タンパク質 関連部分であるＤＮＡ分子を含有している。他の組換えＤＮＡ分子は、ＬＣＰ２ ．３の担体タンパク質関連部分であるＤＮＡ分子と、ＬＣＰ２．３の前記の部分 でコードされるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子とを含有している。

さらに、この発明のＤＮＡ分子は、図４のアミノ酸−１〜２９０の配列、図４の アミノ酸１〜２９０の配列、又は図４のアミノ酸２７〜２９０の配列を有するポ リペプチドをコードする遺伝子を含有している。またＤＮＡ分子は、図４のアミ ノ酸２７〜２９０有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有している。

またＤＮＡ分子はアミノ酸２７〜２９０の配列を有し、かつ宿主によって認識さ れる分泌、シグナル若しくはその外の前駆物質の配列を構成し、アミノ酸２７に 先行するアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有し ている。

これらのＤＮＡ分子は、かようなりＮＡ分子が、操作によって、発現制御配列に 連結されている組換えＤＮＡ分子を構築するのに用いられる。好ましくはかよう な組換えＤＮＡ分子は、ベクター若しくはビヒクルを構成している。この発明は 、かようなりＮＡ分子をベクターに導入することからなるベクターの製造方法を 提供するものである。その方法には、そのＤＮＡ分子の発現を制御及び調節する ために、前記ベクターに発現制御配列を導入する付加工程が含まれている。その 発現制御系は、Ｌａｃ系、吐糸、ｔａｃ系、区系、Ｔ７系、ファージλの主要オ ペレーターとプロモーターの領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、５Ｖ−４ ０の制御配列、アクチン系、メタロチオネイン系、ＬＴＲ（レトロウィルスのプ ロモーターを含有する長い末端の繰返し）系、並びに遺伝子、真核細胞若しくは 原核細胞及びそのウィルス及びその結合体の発現を制御する他の配列である。

この発明の組換えＤＮＡ分子とベクターは、宿主中で担体タンパク質様ポリペプ チドを産生ずることができる。またこの発明には、これらの組換えＤＮＡ分子若 しくはベクターの少なくとも１つで形質転換される宿主が含まれる。形質転換さ れる宿主は、イー・コリ（Ｂ、　ｃｏｌｔ）　、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ −ｏｍｏｎａｓ）　、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ）　、バシラスーステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌＵＳ）の菌株、他の細菌、酵母、真菌、動物、昆虫若しく は植物の宿主及びヒトの組繊細胞である。

この発明は、適切な宿主をかような組換えＤＮＡ分子若しくはベクターで形質転 換し、次いでその宿主を培養して前記のポリペプチドを製造する段階からなる担 体タンパク質様ポリペプチドの製造方法を提供するものである。この方法には、 前記ポリペプチドを集める追加の段階が含まれている方が好ましい。この方法に おいて、宿主は、イー・コリ、シュード植物の宿主及びヒトの組繊細胞である。

またかようなポリペプチドの製造方法は、かような組換えＤＮＡ分子若しくはベ クターで形質転換された宿主を培養する段階で構成されている。

またこの発明は、上記の組換えＤＮＡ分子若しくはベクターによって、発現につ いてコードされているポリペプチドを提供するものである。

また、この発明は、ソマトメジン様ポリペプチドに結合しうる担体タンパク質サ ブユニット以外の特に純粋な担体タンパク質様ポリペプチドを提供するものであ る。かような特に純粋なポリペプチドは、ヒト血清中に天然に存在している物質 を特に含有していない方が好ましい。かようなポリペプチドは、成熟した担体タ ンパク質様ポリペプチドである。かような成熟したポリペプチドは、分泌、シグ ナル若しくは他の前駆物質の配列を構成するアミノ酸残基が削除されているポリ ペプチドである。

この発明は、図４のアミノ酸−１〜２９０の配列を有する特に純粋なポリペプチ ドを提供するものである。

またこの発明は、図４のアミノ酸１〜２９０の配列を有する特に純粋なポリペプ チドを提供するものである。この発明には、アミノ酸２７〜２９０の配列と、ア ミノ酸２７より先行するメチオニン残基を有するポリペプチドが含まれる。さら にこの発明は、図４のアミノ酸２７〜２９０の配列を有する特に純粋なポリペプ チドを提供するものである。

この発明には、ポリペプチドが担体タンパク質様ポリペプチドのままで残ってい る限りは、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が付加されるか又は削除されるか又 は取替えられている配列２７〜２９０を有するポリペプチドが含まれる。

この発明には、図４のアミノ酸−１〜２９０の配列を有するポリペプチド、及び その配列の一部と、担体タンパク質のソマトメジン調節活性とを有し、ソマトメ ジン様ポリペプチドに結合しうるポリペプチドが含まれる。

またこの発明は、担体タンパク質の天然のグリコジル化を欠く担体タンパク質様 ポリペプチドを提供するものである。

またこの発明は、前記の少なくともひとつの担体タンパク質様ポリペプチド若し くはその医薬として許容される塩及び医薬として許容される担体の有効量からな り、先端巨大症におけるソマトメジン−Ｃの作用を阻害し、糖尿病網膜症におい て網膜の血管と繊維組織の増殖を阻害し、長身小児の成長を阻害し、ケロイドＩ Ｉ痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出症において眼の眼窩内の組織の増殖を阻害し 、又はヒト若しくは動物の創傷の治癒を刺激する治療用組成物である。この発明 には、前記組成物の有効量を投与することからなり、ソマトメジン依存性癌の増 殖を阻害し、先端巨大症におけるソマトメジン−Ｃの作用を阻害し、糖尿病網膜 症において網膜の血管と繊維組織の増殖を阻害し、長身小児の成長を阻害し、ケ ロイド廠痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出症において眼の眼窩内の組織の増殖を 阻害し、又はヒト若しくは動物の創傷の治癒を刺激する方法が含まれる。

またこの発明には、少なくとも１つのソマトメジン様ポリペプチドと実質的に複 合した前記の少なくとも１つの担体タンパク質様ポリペプチドを含有する組成物 が含まれる。かような組成物は、かような組成物の有効量からなり、ヒトの骨粗 しよう症を治療し、骨の増殖を刺激し、動物の成長を刺激し、ヒトと動物の創傷 の治療を刺激し、又は成長ホルモン欠損症の患者の成長を刺激するのに用いる治 療用組成物に使用される。又かような組成物は、かような組成物の有効量を投与 することからなる前記症状の治療方法に用いられる。

この発明は、発現制御配列に連結された前記担体タンパク質様ポリペプチドをコ ードする遺伝子を含有するＤＮＡ分子と、発現制御配列に操作で連結されたソマ トメジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ分子とを有する組 換えＤＮＡ分子を提供するものである。宿主は、少な（とも１つの上記組換えＤ ＮＡ分子で形質転換されて、両種のポリペプチドを産生できるようになる。

また単一のベクターが、前記の少な（とも１つの担体タンパク質様ポリペプチド をコードするＤＮＡ分子と、発現制御配列に各々操作で連結されたソマトメジン 様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子とを含有するように構築される。宿主は このようなベクターで形質転換される。担体タンパク質様ポリペプチドとソマト メジン様ポリペプチドの複合体からなる組成物の製造方法には、適切な宿主をか ようなベクターで形質転換し、前記宿主を培養して山記ポリペプチドを製造する ことが含まれる。その方法にはポリペプチドを集める追加の段階を含めてもよい 。その方法は、かようなベクターで形質転換された宿主を単に培養することで構 成されていてもよい。

またかような組成物の製造方法には、前記の担体タンパク質様ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ分子を有する少なくとも１つの組換えＤＮＡ分子若しくはベクタ ーで適切な宿主を形質転換し、かような宿主を、ソマトメジン様ポリペプチドを コードするＤＮＡ分子を有する少なくとも１つの組換えＤＮＡ分子若しくはベク ターで共形質転換しくｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ）　、次いでかような宿 主を培養して、両種のポリペプチドを産生させることが含まれる。またこの発明 には、かような各種類の組換えＤＮＡ分子若しくはベクターの少な（とも１つで 形質転換された宿主が含まれる。

最後にかようなポリペプチドに対するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体 が製造される。またこの発明のポリペプチドは、そのポリペプチドと複合したソ マトメジンを、未結合のソマトメジンから分離することからなるヒトの体液中の 遊離ソマトメジンの濃度の測定法に使用できる。

図面の簡単な説明 図１は、約１５．０００ダルトンの分子量を存するヒト担体タンパク質サブユニ ットのＮ末端の４２のアミノ酸残基の配列を示す。さらにトリプシン断片のＴ１ 、Ｔ６、Ｔ７、ＴＩ’及びＴＩＯのＮ末端の配列を示す。

図２ａは、図１に示すサブユニットのＮ−末端の５７のアミノ酸の配列と、プロ ーブとして用いるよう設計された、アミノ酸２９−４４をコードするオリゴヌク レオチドとを示す。このオリゴヌクレオチドは４８ｍａｒと呼ぶ。

図２ｂは、１８１ｂｐの合成りＮＡのタンパク質とＤＮＡ配列と、その対応する タンパク質の配列を示す。

図３ａは、図２８のプローブと雑種を形成したＤＮＡ挿入断片しＣＰｏ、７０と ＬＣＰ　Ｏ，７７の大きさと制限部位、及びこれらＤＮＡ挿入断片ＬＣＰ　Ｏ， ７０とＬＣＰ　Ｏ，７７のＤＮＡ配列を有するプローブと雑種を形成したＤＮＡ 挿入断片ＬＣＰ２．３の大きさと制限部位を示す。

図３ｂはＬＣＰ２．３の配列を決定する方法を示す。

図４は、ＤＮＡ分子ＬＣＰ２Ｊのコーディング鎖のヌクレオチド配列と、それが コードするポリペプチドの２９１のアミノ酸のアミノ酸配列とを示す。　“Ｃ” はシスティン又は半シスチン残基を示す。

図５は、イー・コリ細胞内で発現させるのに用いる、ｐＫＫ２３３−２に挿入さ れた２６４のアミノ酸を有するヒト担体タンパク質様ポリペプチドの遺伝子を含 有するベクターｐＤＪ４２１９の機能・部分制限地図を示す。

図６は、適切な宿主を形質転換するために用いられ、培養すると担体タンパク質 様ポリペプチドを産生ずるベクターに用いられる各種の組換えＤＮＡ分子の製造 方法を示す。

図７は、ＣＯＳ細胞内で発現させるのに用いる、ｐＳＶＬ誘導体ｐＤＪ４２１０ に挿入された成熟担体タンパク質の最初の１２０のアミノ酸を有するヒト担体タ ンパク質様ポリペプチドの遺伝子を含有するベクターｐＤＪ４２１２の機能・部 分制限地図を示す。

図８は、ＣＨＯ細胞内で発現させるのに用いる、ｐＫＧ３２２６に挿入された２ ６４のアミノ酸を有するヒト担体タンパク質様ポリペプチドの遺伝子を含有する ベクターｐＫＧ４４０３の機能・部分制限地図を示す。

図９は、循環中のＳＭ−Ｃの半減期に対する１５ｋＤａの担体タンパク質サブユ ニットの作用を示す。

ソマトメジン結合活性の検定法 ソマトメジン結合活性は、リガンドとして、放射能標識をつけた”’［−ＳＭ　 （ＳＭ−Ｃ又はＩＧＰ−ＩＩ）を用いるタンパク質結合活性検定法で測定した。

結合したｌ！Ｉ［−８Ｍの量を標準製剤のそれと比較する。

標準物は、１０名の正常な提供者から得たヒト血清を集めたものをゲル濾過する ことによって調整した。血清３５ｍ１を４Ｎ酢酸３５ｍ　ｌに添加した。清澄に なった後、試料を、１Ｍ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−５０（５ｘ　１０ ０ｃｍ）　（分画範囲１．５００〜８０．０００）を用い流速８θａ＋１！／ｈ ｒのクロマトグラフィに付した。　”’［−ＳＭ−Ｃを用いて、全面分のソマト メジン結合活性を検定した。その結合活性はＫｄＯ〜０．４に現れた。これらの 両分を凍結乾燥し、１Ｍ酢酸に再溶解し、再度クロマトグラフィに付して結合Ｓ Ｍの全痕跡を除いた。最終の粉末を３５ｍ７の０、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０ に再溶解し、１００μｌづつに分けて一２６℃で貯蔵した。各結合活性の検定に 、この物質１本づつを、任意に１．ＯＵ／ｉ＋７の値を与えて対照物として使用 した。

この検定法はＺａｐｆ等が報告した方法であるじＳｅｒｕｍ　Ｌｅｖｅｌｓｏｆ 　ｔｈｅ　Ｉｎ５ｕＩｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＳＭ）　 ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｃａｒｒｉｅｒ″、Ａｃｔａ　Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、９５ 看、５０５〜５１７頁、１９８０年参照〕。例えば担体タンパク質サブユニット がまだＳＭと複合している場合、両者を、１Ｍ酢酸を用いるセファデックスＧ− ５０クロマトグラフイ（０，９ｘ　１１０Ｃ＋１１）によって分離した。次いで 、結合活性のピーク（Ｋｄ　ｌ　−０，４）部分を凍結乾燥し、検定緩衝液で再 構成し、試験した。結合ＳＭを含有していなかった試料について、その試料を検 定緩衝液に対し透析して直接試験するか、又は結合活性の濃度が低い場合はＯ， １Ｍ酢酸に対し透析し、凍結乾燥し、少量の検定緩衝液に溶解した。検定緩衝液 は、予め試験をして競合する活性体が含有されていないことを確認した０、２％ のヒト若しくはウシの血清アルブミンを含有する０、１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ ７，０緩衝液であった。ＳＭ−Ｃ若しくはＩＧＦ−■を５ｐｅｎｃｅｒの方法で ヨウ素化した（Ｇｒｅｃｒ、　Ｂ、Ｏ，、Ｂ、Ｍ、　５ｐｅ−ｎｃｅｒ等、”Ｓ ｅｒｕｍ　Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　Ｇ ｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉ ｔｈ　Ｐｉａｂｅｔｅｓ　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ　；Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉ ｔｈ　ｔｈｅ　Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ ’、Ａｍ、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、、２８７巻、７〜ｌＯ頁、１９８４年参照 ）。試料と標準物の連続希駅物（２倍若しくは４倍）を８回づつ検定した。検定 管には、１００μｉ７の”Ｊ−ＳＭ、　２０，０００ｃｐｍと２００μｌの試料 を入れた。室温において２時間インキュベートすることによって満足すべき結果 が得られたが、検定は４℃で１６時間行った。結合した＋　２１１−８Ｍを、炭 素抽出法で遊離物から分離した。２％の活性炭を含有する。１％ヒト（又はウシ ）アルブミンの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０の水冷溶液０．８ｍｆを添加し 、その試験管を４℃で１５’間遠心分離した。遠心分離後、上澄液を計数した。

結合したｃｐｍ値を線量の対数値に対してプロットしたが、未知物の濃度は１． ＯＵ／ｍＩ！の値を与えられた標準品の濃度に関連していた。結合の特異性は、 標識をつけていないＳＭの大過剰とともに試料をインキュベートすることによっ て測定した。

他のソマトメジン結合検定法 ドツト−プロット（Ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）検定法とウェスターン法もポリペプチド の存在をソマトメジン結合活性によって測定するのに使用することができる。

ドツトプロットの“Ｂｉｎｄｉｎ　Ｉｎ　Ｗｅｌｌｓ”法ニトロセルロース膜と ３−ＭＭ濾紙を最初に水中に入れ、次にＰＢＳ（１０ｍＭ　ＮａＰＯｉ、ｐＨ７ ，２、０，１５Ｍ　ＮａＣｆ）中に２０〜３０分間浸漬した。濾紙の上に膜を置 いて、両者をドツトプロット装置の上に置いた。ドツトプロット装置はメーカー （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の説明書にしたがって組立てて固定した。ドツトプロット装 置には９６個のウェルがあり、多数の試料を同時に処理するのに非常に便利であ る。ウェルを２００μｌのＰＢＳですすぐ。担体タンパク質様ポリペプチドをＰ ＢＳで希釈して適切な濃度にし、全体積を５０μｌ／ウエルにする。対照とブラ ンクのウェルには夫々、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を入れるか若しくはタン パク質なしにする。試料をウェルに入れ、膜を重力で通過させる。タンパク質の 膜への結合は３０〜６０分以内に完了する。

膜を２００μｉ／ウ工ル１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックし、この液を重力で３ ０分間流動させ、その際、膜を通じて減圧で″吸引（ｐｕｔ　１）’する。ウェ ルを、１００μ７のＴＢＳ（５０ｍＭ　トリス−ＨＣ４ｐＨ７，５，０，１５Ｍ 　ＮａＣｆ　）、０．１％ツイーン２０で３回洗浄する。　１２″Ｉ−ＳＭ−Ｃ （２０，０００〜２０Ｇ、０００ｃｐｍ）を５０μＪ　ＰＢＳ　／ウェル中に添 加する。装置をＰａｒａｆｉｌｍでしっかりと覆い、１．５〜２時間、４℃に保 持する。この段階でＳＭ−Ｃの担体タンパク質様ポリペプチドとの結合が行われ る。装置を分解し、膜を大量のＴＢＳ　；　ＴＢＳ　、０．１％ツイーン２０； 及びＴＢＳで洗浄する。

各洗浄はゆるやかに振盪しながら４℃で１５分間行う。膜を風乾し、増感スクリ ーン付きのコダックＸ−Ｏｍａｔ　ＡＲフィルムに−７０℃で１〜６時間露光さ せる。

ドットブｔｆｆットの”Ｂｉｎｄｆｎ　［ｎ　Ｂａｂ’法膜の前処理、ドツトプ ロット装置の組立て、及びタンパク質の膜への結合を上記と同様に行った。タン パク質を膜に結合させた後、ドツトプロット装置を分解し、膜を風乾した。

風乾した膜を皿にとり、ゆっくり振盪しながら４℃にて、次の溶液：ＴＢＳ＋３ ％ＮＰ４０で３０分間、ＴＢＳ＋１％ＢＳＡで１時間；　ＴＢＳ　＋　０．１％ ツイーン２０で１０分間洗浄する。得られた膜を、６〜１０ｍ１の結合溶液（Ｔ ＢＳ、１％ＢＳＡ　ＳＯ，１％ツイーン２０）の入ったバッグ内に入れる。’　 ”　’　Ｉ−ＳＭ−Ｃ（２〜２０ミリオンｃｐｍ）を添加し、ゆっくり振盪しな がら、４℃にて２時間又は−夜進行させる。この段階でＳＭ−Ｃが担体タンパク 質様ポリペプチドに結合する。その膜を、大量のＴＢＳ、　０．１％ツイーン２ ０で２回洗浄し、ＴＢＳだけで２回洗浄する。洗浄は各々１５分間づつ４℃でゆ っくり振盪しながら行う。膜を風乾し、増感スクリーン付きのコダックｘ−ｏｍ ａｔ　ＡＲフィルムに一７０℃で５〜１６時間露光させる。

ウェスターン法 担体タンパク質様ポリペプチドを含有するタンパク質の試料をポリアクリルアミ ド−５ＯＳゲルに加えて展開する。通常１２％のゲルが用いられるが、これは１ ０，０００〜７０．０００ダルトンのタンパク質を良好に分離できる。分離は電 気泳動法で行う。

次にゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜にプロットし、得られた膜を３７ ℃で５分間風乾燥する。結合タンパク質を含有するその膜を、ＴＢＳ＋３％ＮＰ ４０で４℃にて３０分間すすぐ。

膜の非特異的部分を１％ＢＳＡ含有ＴＢＳで４℃にて２時間ブロックする。膜を ＴＢＳ　＋　０．１％ツイーン２０で４℃にて１０分間すすぐ。膜を、６−１０ ｍ／ＴＢＳ　、１％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０＋５００，０００ｃｐｍ　” ’［−ＳＭ−Ｃの入ったバッグ中に入れることによって、　”’［−ＳＭ−Ｃで プローブする。膜を一夜４℃でゆつ（り振盪して、ＳＭ−Ｃと、膜に固定された 担体タンパク質様ポリペプチドとの結合を行う。得られた膜を、ＴＢＳ　＋　０ ．１％ツイーン２０で２回各々１５分間づつ、ＴＢＳで３回各々１５分面づつ洗 浄する。膜を風乾し、増感スクリーン付きコダックＸ−ＯｍａｔＡＲフィルムに 一７０℃にて５〜１６時間露光させる。

担体タンパク質サブユニットの血漿からの製造方法担体タンパク質サブユニット の製造の手順はＣｏｈｎ両分ＩＶ−１で開始した。これは、約１０％の血漿タン パク質と、もとの血漿担体タンパク質活性の４０％を含有するヒト血漿の画分で ある。それは黄緑色のペーストで、固形分が約３５％であり、固形分の大部分は 変性された不溶性のタンパク質と糖タンパク質である。このペーストは、１ｋｇ 当たり約Ｌｏｎｇの担体タンパク質を含有している。

下記の検定緩衝液はすべて、特にことわらない限り、次の酵素阻害剤を含有させ た。すなわち、１ミリモル（“ｍＭ”）のフェニルメチルスルホニルフルオリド （“ＰＭＳＦ″）、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（”ＮＢＭ”）　、及び１ｍ Ｍエチレンジアミン四酢酸（“ＢＤＴＡ”）である。担体タンパク質は固有のプ ロテアーゼ活性を有し、少なくともひとつの他の血漿プロテアーゼが、アフィニ ティークロマトグラフィの段階によって共精製（ｃｏ−ｐｕｒｉ−ｆ７）された ので酵素阻害剤は必須のものである。

実施例１ （ａ）イオン交換クロマトグラフィ 両分ｎ−ｉを１ｋｇのバッチで処理した。１ｋｇの画分］■−１を、酵素阻害剤 を含有する４０ｍＭ酢酸アンモニウム−酢酸溶液ｐＨ５，６５の１０１中に添加 し、−夜４℃で撹拌した。生成した懸濁液を遠心分離し、上澄み液を、１０．　 ＯＯＯＭＷ半透膜を用いる限外濾過法で約１１に濃縮した。

濃縮液全体を、４０−酢酸アンモニウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５，６５）で予め平 衡化した架橋デキストランのスルホプロピル誘導体（ＳＰ−セファデックス、フ ァーマシア社）を充填した４℃の１０Ｘ　２５ｃｍカラムに注入した。そのカラ ムを、まず５Ｉ！の同じ緩衝液で洗浄し、次いで１０ｆの５０ｍＭ酢酸アンモニ ウム（ｐＨ６，８）で洗浄し、最後に２１の５０ｍＭ酢酸アンモニウム−アンモ ニア（１）Ｈ９，６）で洗浄した。得られたｐＨ９，６の溶出液を集めて凍結乾 燥した。結合検定法で測定した、凍結乾燥物質のＳＭ結合活性の回収率は２０％ であった。これは約１０倍の精製度であった。

（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィＳＭ結合活性を育する凍結乾燥生成物を 、１０％硫酸アンモニウムと５０−トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン （“トリス″）−ヒドロクロリド（“トリス−ＨＣｌ″）　ｐＨ７，５とを含有 する緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対して透析して、フェニルアガロースカラム （フェニル−セファロース、ファーマシア社）に注入した。そのカラムをまず１ １の同じ緩衝液で溶離し、次に０．５Ｍのチオシアン酸ナトリウム（“Ｎａ５Ｃ Ｎ″）を含有する５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌｐｉ（７，５の２１で溶離し、最後 に５０ｍＭ　）リス（ｐＨ９，０）の２１で溶離した。溶出画分を集め、２８０ ｎＭでのＵＶ吸光度を測定し、結合検定法でＳＭ結合活性の試験を行った。

ＳＭ結合活性はＮａ５ＣＮ　ｉ１分に現れた。その両分を凍結乾燥し、蒸留水に 対して透析した。かなりの量の沈澱が現れ、上澄み液から分離した。この段階で は、２０倍の精製度で回収率が７０％であった。

（Ｃ）ゲル濾過 得られた上澄み液を凍結乾燥し、０．５Ｍ酢酸に溶解し、５．０００〜２３０． ０００の分画範囲を有する架橋デキストランゲル（セファデックスＧ−１５０、 ファーマシア）の２Ｘ１００カラムのクロマトグラフィに付した。ＳＭ結合活性 を有する両分を集めた。

ＳＭ結合活性の回収率は結合検定法で８０〜９０％であり、５倍の精製度であっ た。

（ｄ）アフィニティークロマトグラフィまずＳＭ−Ｃアフィニティーカラムを、 アガロースのヒドロキシスクシンイミジル誘導体（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１５、Ｂ ｔｏＲａｄ）に、ヒト血漿から予め精製して調整したＳＭ−Ｃ（Ｓｐｅｎｃｅｒ 、　Ｂ、Ｍ、編集、Ｉｎ５ｕｌｉｎ−Ｌｔｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ ／Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎｓ、　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅＧｒｕｙｔｅｒ　１９８３ 年の８１頁の５ｐｅｎｃｅｒ等の報告参照）をｐＨ８，０゜２５℃にて２時間か けて結合させて製造した。先の段階で得た、合した担体タンパク質函分を、０． １Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，０に対して透析し、ＳＭ−Ｃアフィニティカラム に注入した。同じ緩衝液の１５ｍ１で洗浄した後、ＳＭ結合活性体を１０ｍ１の ０．５Ｍ酢酸で溶離して凍結乾燥した。

得られたＳＭ結合活性体を、次に、分画範囲が４．０００〜９０．０００で、０ ．５Ｍ酢酸にて平衡化した可及デキストランゲル（セファデックスＧ−１００、 フエーマシア社）のクロマトグラフィに付した。ＳＭ結合検定法で判明した活性 を有する画分を凍結乾燥した。

（ｅｌ高性能液体クロマトグラフィ（“ＨＰＬＣ”）上記の凍結乾燥物質を、ブ チルシラン（Ｖｙｄａｋ　Ｃ４ＲＰ　（逆相）〕のカラムを用いるＨＰＬＣのク ロマトグラフィに付した。

ＳＭ結合活性体を、０９１％トリフルオロ酢酸（“ＴＰＡ”）によるアセトニト リル０〜６０％線状勾配液で溶離した。ＳＭ−Ｃ結合活性のシャープなピークが ３９％のアセトニトリルに出現し、これを集めた。このピークのＳＭ結合活性は 、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（“５ Ｏ３−ＰＡＧＩＥ”　）に付して銀染料（Ｂｉｏｒａｄ）で染色したところ単一 のバンドとして出現した。

単離した担体タンパク質サブユニットは、β−メルカプトエタノールの存在下の ５ＯＳ−ＰＡＧＥ！で約２６ｋＤａの分子量を示した。

担体タンパク質サブユニットの全収率は、もとの結合活性の４％であった。

この担体タンパク質サブユニットのＮ末端アミノ酸分子を、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌ ａｒとＨｏｏｄの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９１ 巻、４８６頁、１９８３年）で、自動化された気相配列決定装置（Ｂｅｃｋｍ− ａｎ　６３００）を用いて測定して、次の配列であることが分かった。

Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ− Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−。

ただし配列中のＲはシスティン又は半シスチンを示す。

この担体タンパク質サブユニットは”Ｊ−ＳＭ−Ｃと結合し、過ヨウ素酸シッフ （“ＰＡＳ″）で染色することによって、グリコジル化されていることが分かっ た。

（ａ）イオン交換クロマトグラフィ １ｋｇのＣｏｈｎ画分ＩＶ−１を、阻害剤（１ｍＭ　ＢＤＴＡ　、１　ｍＭ　Ｎ ＢＭ。

０、１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１　ｌａｇ／ｌアプロチニン）を含有する４０ｍＭ酢 酸アンモニウム−酢酸緩衝液ｐＨ５，６５の４１で、−夜４０℃にて抽出した。

得られたタンパク質溶液を９，０００Ｘｇで３０分間遠心分離し沈澱を上澄み液 から分離した。得られた沈澱を、４！の上記緩衝液で４時間再抽出した。両方の 抽出で得られた上澄み液をいっしょにした。

この上澄み液を、上記緩衝液で４℃にて平衡化したＳＰ−セファデックスカラム （２０００ｍ　ｆ樹脂）に注入した。注入後、Ａ８．。

が１．０以下に低下するまで、カラムを同じ緩衝液で洗浄した。

さらに、Ａ８．。が１．０以下になるまで、カラムを阻害剤を含有する５０ｍＭ 酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６，８で洗浄した。次にＳＭ結合活性体を、阻害剤 を含有する６０ｍＭ酢酸アンモニウム−アンモニア緩衝液ｐＨ９，６で溶離した 。最後に、カラムを、１．０ＭＮａＣＩＩを含有する６０ｍＭ酢酸アンモニウム −アンモニアｐＨ９，６で洗浄した。

１ｋｇのＣｏｈｎｌｒ分ＩＶ−１からの抽出物は、約５．０Ｏ０単位のＳＭ−結 合活性体を与えた。結合検定法で測定した結果、ｐＨ９，６の画分て、約７．５ ％の活性体が回収された。その画分の重量は約５．５ｇであった。

（ｂ）イオン交換クロマトグラフィ 上記のカラムから得たｐＨ９，６１［分を、阻害剤（０，１ｍＭ　８ＤＴＡ、Ｐ ＭＳＰ、　ＮＢＭ及び１　ｍｇ＃’アプロチニン）を含有する１Ｍ酢酸溶液の１ ３０ｍｆに溶解した。この溶液を、同じ緩衝溶液に対して、−夜４℃にて透析し 、同じ緩衝液で予め平衡化した５　Ｘ　４０ｃｍ５Ｐ−セファデックスカラムに 注入した。Ａｌｌ。が約０．２になるまでカラムを洗浄し、次に、阻害剤を含有 する６０ｍＭの酢酸アンモニウム−アンモニアｐＨ９，６で溶離した。ＳＭ結合 活性体は通過画分中にあり、その通過面分は４℃で蒸留水に対して一夜透析し、 いくらかの変性タンパク質を沈澱させたものである。透析後、沈澱を、９，００ ０Ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄み液を凍結乾燥した。可溶性通過画分中のＳ Ｍ結合活性体を定量的に回収し、一方ＳＭ−ＣをｐＨ９，６画分で回収した。

（ｅ）ゲル濾過 ＳＭ結合活性を有する画分の一部（０，３３ｇ）を次いで最少量の０、５Ｍ酢酸 溶液に溶解し、同じ条件で予め平衡化した２、５Ｘ１００ｃｍのセファデックス Ｇ−１００カラムに注入した。カラムを０．５Ｍ酢酸で溶離した。５　ｉｆづつ の画分のＡ。。とＳＭ結合活性を測定した。活性を示すこれらの画分を合して凍 結乾燥した。この段階での精製は５倍であり、ＳＭ結合活性体を定量的に回収し た。いくつかの試験では全物質を処理する必要があった。

（ｄ）アフィニティクロマトグラフィ 上記段階で得た結合活性を有する画分８０ｍｇを、阻害剤を含有する０、１Ｍリ ン酸緩衝液、　ｐＨ７，０の４０ｍ１に溶解し同じ緩衝液に約４時間透析した。

透析後、得られた溶液を８ｒｓｌのＳＭ−Ｃアフィニティ力ラムの樹脂と混合し た。その混合物を４℃で一夜ゆっ（り撹拌して結合を増大させた。得られた樹脂 を、カラムを通過させてタンパク質溶液から分離した。カラムをまず５０ｍ１の リン酸緩衝液で洗浄し、次に０．５Ｍの酢酸で溶離した。ＳＭ結合活性体（約１ ０単位）を真空遠心分離器（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、 　５ａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で乾燥した０（ｅ）ＨＰＬＣ 回収されたＳＭ結合活性体１０単位を１［Ｉｌｌの０．１％ＴＰＡ溶液に溶解し た。その試料をＶｙｄａｋ　ＣＪ　ＲＰカラムに注入した後、カラムを０〜６０ ％アセトニトリル勾配液で６０分間溶離した。

担体タンパク質のピークが約３９％のアセトニトリルに出現し、これを集めて凍 結乾燥した。ＳＭ結合活性体を定量的に回収したが、約１１（ａｕｇであった。

そのＳＭ結合活性体は、銀染色後、５ＯＳ−ＰＡＧＥ上に分子量が約１５ｋＤａ の単一バンドとして出現した。この実施例の全収率は約３％であった。

純粋な担体タンパク質サブユニットの比活性は４μｇ７単位と測定された（但し その１単位とは、上記のように、正常な１０名の男性と女性の集団から得た標準 血漿１　ｍｌ中の量である）。

Ｎ末端分子の決定については、ＳＭ結合活性体を、変性し、４Ｍグアニジン−〇 〇Ｉ　０．５Ｍトリス−ＨＣ１（ｐＨ８，６）及び０．７％β−メルカプトエタ ノールで一夜還元した。ヨードアセトアミドを溶液に添加した。反応を暗所で１ 時間行い、ＴＦＡを０．１％まで添加して反応を停止させた。得られた反応混合 物をＨＰＬＣカラムに注入し、前記のようにして、カルボキシアミドメチル化担 体タンパク質サブユニットを回収し、Ｎ末端分子分析に用いた。その分析結果は 、実施例１に記載したのと同じＮ末端アミノ酸分子を示した。

実施例３ 担体タンパク質サブユニットを、ゲル濾過法（Ｃ）によって実施例２と同様にし て精製した。ＳＭ結合活性を有する得られた試料の一部の３０ｍｇを０．１％Ｔ ＦＡ溶液に溶解し、分取Ｖｙｄａｋ　Ｃ４ＲＰカラムに注入した。そのカラムを Ｏ〜６０％アセトニトリル勾配液で６０分間溶離した。約３９％のアセトニトリ ルで溶離されたＳＭＭ合活性体を集め凍結乾燥した。ＳＭＭ合活性体を定量的に 回収した。

するトリス−グリシン緩衝液に再懸濁させ、５ＯＳ−ＰＡＧＥ（１２，５％ポリ アクリルアミド）で分離した。１５．２１．２６及び３０ｋＤａの担体タンパク 質サブユニットに対応するバンド（これらは各々ウェスタンプロットの標識をつ けたＳＭと結合している）をゲルから切取り、タンパク質をトリス−グリシン緩 衝液中に電気溶離を行った。各担体タンパク質サブユニットを凍結乾燥し、回収 率は定量的であった。

実施例４ 創傷の治癒を増大するＳＭ担担体タンパクセサブユニット抗力を測定するよう企 図した実験を次のように行った。６頭の麻酔をかけた３００ｇ体重雄Ｓｐｒａｇ ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの各々の、背中の４分円の各々に、Ｓｃｈｉｌｌｉｎ ｇ−Ｈｕｎｔワイヤメツシュを巻いたシリンダーを、皮下（Ｓ、　Ｃ，’）移植 した。内径が２０　Ｘ　５．８ｍｍで堆積が５２０μｌの円筒形チャンバーは、 ステンレス鋼ワイヤメツシュで作製した。−万端はワイヤメツシュでシールし、 他方端をシラスティックのディスクでシールした。移植後、創傷治癒の一般的な 進行が起こった。即ち、血管に血栓が生じ、次いで多形核白血球、マクロファー ジ及び繊維芽細胞がワイヤメツシュを通じて移動し、次に繊維増殖、コラーゲン 合成及び脈管形成が起こった。このプロセス中、中空のチャンバー内に集まった 創傷液をサンプリングするか、又はこの液に活性試薬を注射した（シラスティッ クのディスクを通じてＳ、　Ｃ，）。はとんどのものが移植後１７日で治癒が完 了した。

しかし中央の空洞は完全にはなくならなかった。

１５ｋＤａのＳＭ担担体タンパクセサブユニット、０．１％のウシアルブミンを 含有するＰＢＳ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７，４）に溶解した。創傷のチャンバーにこの溶液１００　μ／　（１，４μ ｇの１５ｋＤａの種を含有している）を１２時間毎に注射した。この量は、生物 学的に活性なソマトメジンの量のわずかに過剰な量にして、存在するソマトメジ ンの半減期を増大するように選択した。１７日後、創傷シリンダーを取出し、繊 維組織を、各シリンダーから注意深くかきおとした。１５ｋＤａの担体タンパク 質サブユニット物質を注入したシリンダーは、すべて、対照よりかなり大きい密 な繊維組織が充満していた。具体的に述べれば、１５ｋＤａの担体タンパク質サ ブユニットを含有する創傷チャンバーには１９．５±７　（ＳＤ）ｍｇのタンパ ク質が沈積し、一方、対照のチャンバーには７．０±１．６ｍｇが沈積した。Ｄ ＮＡ合成を担体タンパク質サブユニットを含有するチャンバーの方がはるかに大 きかった（対照の３８０±１５μｇに対して１１６０±２００μｇであった。） 同様に、ヒドロキシプロリンの濃度（コラーゲン合成の指標）は担体タンパク質 サブユニットを含有するチャンバーの方がはるかに高かった（対照の２７０μｇ に対して４６０μｇであった）。

これらの結果は、１５ｋＤａの担体タンパク質サブユニットを創傷チャンバーに 注射すると治癒速度が著しく増大することを証明している。

実施例５ 担体タンパク質サブユニットがＳＭ−Ｃの血漿半減期を増大することを示すため に動物実験を行った。Ｌ５ｋＤａのヒト担体タンパク質サブユニットは、ラット の血流に注射された精製ヒヒトＳＭ−Ｃの半減期を延長することが判明した。

’　”　［−ＳＭ−Ｃを１５ｋＤａの担体タンパク質サブユニットとともに、− 夜４℃にて、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２５，１５０１ＩＩ Ｍ塩化ナトリウム）中でインキュベートすることによって、担体タンパク質サブ ユニットとＩ　”　Ｉ−ＳＭ−Ｃとの複合体を製造した。その複合体を、ゲル濾 過法で、遊離の１″’　Ｉ−ＳＭ−Ｃから分離した。　ｌ”Ｉ−ＳＭ−Ｃの比活 性は６．７　ｘｌＯ’　ｃｐｍ／μｇであった。

ラット（約２００ｇ）に麻酔をかけ頚静脈にカテーテルを取付けた。注射する前 に、カテーテルとシリンジは、４％のＢＳＡ（ウシ血漿アルブミン）ですすいで 、タンパク質がプラスチックの表面に付着するのを防止した。４頭のラットにＢ ＳＡを、４頭のラットに２μｇの”Ｉ−ＳＭ−Ｃだけを、そして４頭のラットに は１５ｋＤａの担体タンパク質サブユニットを複合させた２μｇの１”［−ＳＭ −Ｃを夫々注入した。上記の複合体とＳＭ−Ｃは両者ともにＰＢＳ中にいれたも のを用いた。１頭のラットには、担体タンパク質サブユニットを複合させた１μ ｇのｒｘｓ（−８Ｍ−Ｃを注入した。血液試料（１００〜２００μりを、注入後 、多数の時点で採取した。血球は、直ちに、遠心分離によって血漿から分離した 。２５μｌの血漿部分を計数して、存在する１１６１−ＳＭ−Ｃの濃度を測定し 、１０μｍ部分を１５％ポリアクリルアミド−５ＯＳゲル上で試験してＳＭ−Ｃ のインテグリテイを測定した。

注射は２日間実施した。各午前中に、２頭のラットに複合体を注射し、２頭のラ ットにはＳＭ−Ｃだけを注射した。３日目に４頭の対照のラットにＢＳＡを注射 した。

この試験は、１５ｋＤａの担体タンパク質サブユニットが、循環中のＳＭ−Ｃの 半減期を著しく増大することを証明している。

同計数値のＳＭ−Ｃ（即ち１．３　ｘｌＯ’　ｃｐｍ／ｍｉラット血液）を、単 独又は担体タンパク質サブユニットと複合させて、ラットに投与した。図９に示 すように遊離のＳＭ−Ｃの大部分は、循環系から急速に除かれるが、一方担体タ ンパク質サブユニットは、ＳＭ−Ｃがこのように除去されるのを保護する〔１５ ％５ＯＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲルで試験した試料は 、　１２′Ｉの計数値はすべてＳＭ−Ｃのものであることを示した、即ち実験を 阻害する遊離の＋２″【は全く存在しない〕。

７．５分後に遊離ＳＭ−Ｃの残量が連続して出現したが、これはＳＭ−Ｃが不飽 和のラット担体タンパク質サブユニット分子を占有しているためである。明らか に、注射された全遊離ＳＭ−Ｃの３０％とさえ結合するのに充分な内因性担体タ ンパク質サブユニットは存在していなかった。ラット若しくはヒトには治療に有 用な内因性不飽和担体タンパク質サブユニットが充分に存在していないことには 留意すべきである。したがってＳＭ−Ｃはその担体タンパク質すブユニツ白；複 合させて投与しなければならない。

組換えＤＮＡと担体タンパク質様ポリペプチドタンパク質配列の情報に基づいた オリゴヌクレオチドプロセスの製造 担体タンパク質は、単離されてソマトメジンと結合できる性能を保持するサブユ ニットをもっており、そのサブユニットは、グリコジル化されている場合は約１ ５．２１．２６．３０及び４５ｋＤａの見掛けの分子量を有し、グリコジル化さ れていないか又はその外の復翻訳修飾を受けている場合はかなり低い分子嚢を有 している。このサブユニットのＮ末端配列が同じで各種のサブユニットが同じ単 −若しくは複数の遺伝子でコードされている場合は、担体タンパク質様ポリペプ チドをコードするＤＮＡを同定するために共通のＮ末端配列に基づいたプローブ を製造することができるはずである。担体タンパク質サブユニットは実施例２と 同様にして単離・精製され、５−１５として同定された。このタンパク質５−１ ５をカルボキシメチル化して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｇａｓ 　Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎ−ｃｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　４ ７０を用い、自動化されたエドマン分解法でＮ末端配列の分析を行った。最初の ４２のアミノ酸を図１に示す。

その上、サブユニット５−１５は、リシンがプロリンに続いて位置していない場 合、アルギニンとリジンの後の位置で特異的に分解させるプロテアーゼのトリプ シンで分解させた。具体的に述べれば、カルボキシメチル化５−１５を０．３Ｍ 炭酸水素ナトリウムｐＨ８，０中のトリプシンで消化した。トリプシン断片をＶ ｙｄａｋ　Ｃ４カラムを用いて逆相ＨＰＬＣによって分離した。精製断片を集め 、以下のようにして配列を決定した。またＴ−１、Ｔ−６、Ｔ−７、Ｔ−１′及 びＴ−１０と命名されたいくつかの上記トリプシン断片の配列を図１に示す。ア ミノ末端とトリプシン断片Ｔ−７との相同性から、サブユニット５−１５の最初 の５７のＮ末端アミノ酸が２つの未決定のアミノ酸を除いて決定され、図２８に 示した。

ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして役立つ多くの オリゴヌクレオチドを上記の分子から設計した。これらのプローブには、短い縮 重プローブと長いコドンでバイアスされたプローブが含まれる。Ｎ末端の５７ア ミノ酸分子の部分に対応する１つのオリゴヌクレオチドは４８ｍｅｒとして同定 され、図２ａに示した。

担体タンパク質ｍＲＮＡを含有するポリＡ”ＲＮＡを製造するための組織の選択 担体タンパク質の遺伝子を単離するのに利用される方法は、大量の担体タンパク 質を作る組織を同定し、その組織からｍＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡからｃＤ ＮＡライブラリーを構築し、オリゴヌクレオチドのプローブを用いて遺伝子をス クリーニングする方法である。期待されることは、濃縮されたｃＤＮＡライブラ リーが、おそらく１コピーしかもっていないゲノム（全ＤＮＡ）ライブラリーよ りも多くのコピー数のかような遺伝子を含有していることである。どの組織若し くは細胞の種類が、血漿中に見出されるタンパク質である担体タンパク質を作る のかを確認した文献情報は全（ない。繊維芽細胞が、大きいが特性を決定されて いないソマトメジン結合性タンパク質を少量産生することが報告されている（Ａ ｄａｍｓ等の前記文献）。しかしＳＭ−Ｃの大部分は肝臓で合成されることが知 られている。さらにＳＭ−Ｃは、繊維芽細胞と、心臓、骨、胎盤、及び腎臓のよ うな他の組織で合成される。それ故に、ＳＭ−Ｃと担体タンパク質が同じ組織で 合成されると推測して、肝臓の細胞と繊維芽細胞を、担体タンパク質をコードす るｍＲＮＡの２つの可能性のある起源として選択した。

かようなｍＲＮＡ％ＲＮＡの組織若しくは細胞系の起源を同定するため、い（人 ものヒトの肝臓からａ＋ＲＮＡ５ＲＮＡを単離して、担体タンパク質を合成する 性能について試験した。さらに、各種の繊維芽細胞系を、担体タンパク質を作る 性能について検定した。

全ＲＮＡとポリＡ０含有ＲＮＡを、標準の方法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ」、、 Ｐｒｙｚｂｙｌａ、　Ａ、Ｂ、、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、　、及びＲｕ ｔｔｅｒ、　Ｗ、Ｊ、、Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ、　１８巻、５２９４−５ ２９９頁、１９７９年、及びＩｖｅｒｓｅｎ。

Ｐ、　Ｌ、、Ｍａｔａ　Ｊ、Ｂ、及びＨｉｎｅｓ、　Ｒ，Ｎ、　、Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　、５巻、５２１−５２３頁、１９８７年参照）にしたがって、 各種の肝臓組織と繊維芽細胞から単離した。組織（例えば肝臓組織）又は細胞（ 例えば繊維芽細胞）を、ＧＩＴ緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、 ２０ｍＭ　ＢＤＴＡ　、　１００ｍＭ　トリス−ＨＣｆ　ｐＨ７，６）中でホモ ジネートした。破片を除き、ＲＮＡを含有する上澄み液を、２％の５ａｒｋｏｓ ｙｌ　（ラウリルサルコシン酸ナトリウム）と１％のβ−メルカプトエタノール 中に入れた。次いでこの混合物を、塩化セシウム勾配液を用いて遠心分離した。

ブレットをフェノールとクロロホルムに再懸濁させて抽出し、次いでエタノール で沈澱させた。ｍＲＮＡを示すポリＡ”ＲＮＡは、・全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセ ルロースカラムを通過させることによ巻、１４０８頁１９７２年参照）。得られ たポリＡ０含有ＲＮＡを、１０ｍＭ）リスｐＨ７，４，１ｍＭ　ＢＤＴＡ　、　 ０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）でカラムから溶離し、濃縮し、そ の後使用するために貯蔵した。肝臓のポリＡ”ＲＮＡはＨＩＯ及び旧４の名称が 与えられ、肝臓の試料から精製されたことを示し、繊維芽細胞のポリＡ”ＲＮＡ には、ＲＮＡの細胞起源を示す、コードネームＷ１３８、ＨＳ２７、ＭＲＣ５， ８３８７、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１をつけた。

翻訳製品用のＲＮＡの試験 ＨＩＯとＨ１４由来のヒト肝臓ポリＡ”ＲＮＡの一部を、標準の方法（Ｄａｖｉ ｓ、　Ｌ、Ｇ、等、’Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　１９８６ 年参照）にしたがって、ウサギ網状赤血球翻訳キットを用い、。Ｓ−メチオニン で生体外で翻訳シタ。タンハク質翻訳生成物をＲｏｂｅｒｔ　ＣＢａｘｔｅｒ（ ＲｏｙａｌＰｒｉｎｃｅ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、オーストラリア） から提供された抗体を使用し、（Ｄａｖｉｓの方法にしたがって）免疫沈澱させ た。

なおこの抗体は、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｊル０等“Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｉｎｓ ｔ　Ａｃ１ｄ−Ｓｔａｂｌｅ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　・”、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　ｆ！ｎ ｄｏｃｒｉｎｏ１．　Ｍｅｔａｂ、　、２６１１！、７９９−８０１頁、１９８ ５年の方法にしたがって調製されたものである。その抗体は、ヒト血清から得ら れるいわゆる酸安定性サブユニットを含有する物質に対する抗体である。免疫沈 澱させたタンパク質を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析した。

抗担体タンパク質サブユニット抗体と特異的に反応する、約６８．０００．４３ ，０００．３９．０００．及び３２．０００ダルトンのタンパク質バンドが同定 された。対照の血清ではタンパク質は沈澱しなかったが、これは対照の血清が抗 担体タンパク質サブユニット抗体を含有していなかったからである。この結果は 、担体タンパク質が肝臓で作られており、肝臓ｍＲＮＡで作られたｃＤＮＡライ ブラリーは、担体タンパク質遺伝子を含有しているはずであることを示している 。

いくかの繊維芽細胞系も担体タンパク質を製造する性能について試験した。例え ば、Ｗ１３８胚様繊維芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｒｙ−ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎｏ、　ＣＣＬ−７５）は１０％ウシ胎児血清を含有 するＤＭＢＭ−Ｐ１２培地中、７０〜８０％の集密度まで増殖した。

細胞を血清なしの培地に移して７２時間インキュベートした。

培養物の上澄み液を収穫し、ＴＣＡ沈澱法又は遠心分離法で濃縮した。試料を５ Ｍ４ｅｓｔｅｒｎ分析法に付した所（ＳＯＳ−ＰＡＧＥの工程は非還元条件下で 実施している）　、１１３８細胞が合成され、この細胞は、大きさが２５．００ ０〜４５．０００ダルトンの範囲にあるＳＭ−Ｃに結合しうる少なくとも４つの タンパク質を分泌することを示した。これらのタンパク質のうち約４０．０００ ダルトンのタンパク質（還元性５ＤＳ−ＰＡＧＢによる）も、抗拒体タンパク質 サブユニット抗体によって特異的に認識された。この実験において、血清なし培 地でのＷ１３８細胞の７２時間の培養はｌ５Ｓ−システィンを添加して行った。

タンパク質は、抗拒体タンパク質サブユニット抗体で免疫沈澱させて、還元性条 件下で５ＤＳ−ＰＡＧＢによって分析した。

抗拒体タンパク質サブユニット抗体に認識されかつＳＭ−Ｃが結合した担体タン パク質サブユニットをコードする他の細胞系としては、ＨＳ２７　（ヒト繊維芽 細胞）　、ＭＲＣ５（ヒト繊維芽細胞’）　、８３８７　（ヒト繊維肉腫）及び ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌）が挙げられる。他の繊維芽細胞系から単離さ れるポリＡ”ＲＮＡも担体タンパク質をコードすると考えられる。

これらの起源から得られるポリＡ”ＲＮＡ生成物は非常に多数の異なるｍＲＮＡ を含有するということを認識すべきである。

担体タンパク質若しくは担体タンパク質サブユニットに対して特異的なｍＲＮＡ を除いて、他のｍＲＮＡは望ましくない汚染物である。あいにく、これらの汚染 物のＲＮＡは、後のこの発明のクローン化工程を通じて担体タンパク質サブユニ ットｍＲＮＡと同様に挙動する。それ故にそれらがポリＡ”ＲＮＡ中に存在する と、結局、多数の望ましくない細菌のクローンが製造され、これらのクローンは 担体タンパク質以外のポリペプチドをコードする遺伝子をもっている。この汚染 があると、所望の担体タンパク質ハイブリッドクローンを単離する際に複雑なス クリーニング上の問題が起こる。担体タンパク質の場合、スクリーニング問題は 、所望のクローンを同定するためにスクリーニングプローブとして作用する担体 タンパク質ｍＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はその部分る充分に精製された試料がない ので、一層悪化している。唯一の入手しうるプローブは、限定されたＮ末端タン パク質分子の情報に基づいたものであった。それ故に、担体タンパク質のクロー ンのスクリーニング工程は非常に時間がかかり困難である。さらに、担体タンパ ク質クローン自体のご（小パーセントしか、生物学的若しくは免疫学的に活性な 形で担体タンパク質様ポリペプチドを発現しないので、活性クローンの単離は困 難なスクリーニング工程である。

担体タンパク質のｃＤＮＡを含有する二重鎖ｃＤＮＡの合成ボＩＪＡ”ＲＮＡを 含有する担体タンパク質ｍＲＮＡを、特にＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎが報告 しているように、鋳型のように使用して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製造した 。ｃＤＮＡのライブラリーを、潜在的な担体タンパク質様ポリペプチドをコード することが分かったｍＲＮＡから作製した。そのラインはλベクターｇｔｌＯに 構築したが、他のベクターＣＮ、ｔｌｆλｇｔｌｌ　（Ｙｏｕｎｇ　Ｒ，Ａ、と ＤａｖｉｓＲ，Ｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８０巻、１１９４−１１９８頁、１９８３年）〕にも構築することができる。

二重鎖ＣＤＮＡは特にＧｕ−ｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｇｕｂｌ、ｅｒ、　 Ｕ、とＨｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、Ｊ、、ＧｅｎｅＳ２５巻、２６３〜２６９頁、１ ９８３年）によって作製した。この方法では、第一の連鎖ｃＤＮＡが、ポリＡ” ＲＮＡをコピーするためＭｏ１ｏｎｅｙ逆転写酵素を用いて合成された。以下の ラインにはランダムに初回抗原刺激を受けた（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）ヒ ト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＨＩ３）　、２つのオリゴｄＴで初回抗原刺激を 受けたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＨＩ３　、ＨＩＯ／Ｈ１４（ＨＩＯとＨ Ｉ３のブール）〕及びオリゴｄＴで初回抗原刺激をうけたヒト胎児繊維芽細胞ラ イン（ＨＩ３８）が含まれる。ランダムプライマー（ｐｄ（Ｎ）＊）とオリゴｄ Ｔ　（ｐＴ＋□−１）プライマーはファーマシア社から入手した。第二の連鎖は ＲＮＡ５ｅＨとＤＮＡボリトラーゼＩの組合わせを用いて製造した。

得られたｃＤＮＡ集団は、実際には、ポリＡ′″ＲＮＡ中に存在した各種のｍＲ ＮＡから生成するｃＤＮＡの複雑な混合物である。その上、Ｍｏ１ｏｎｅｙ逆転 写酵素により早期に終結されるので、多くのｃＤＮＡがポリＡ”ｍＲＮＡの各種 ｍＲＮＡの不完全なコピーである。

二重鎖ｃＤＮＡのクローン化 広範囲の宿主・ビヒクルの組合わせがこの発明にしたがって製造された二重鎖ｃ ＤＮＡをクローン化若しくは発現するのに用いられる。例えば、有用なりローン 化ビヒクル若しくは発現ビヒクルは次のような染色体、非染色体及び合成りＮＡ 分子のセグメントで構成されている。即ちＳＶ４０の各種公知の誘導体と公知の 細菌プラスミド（例えばｃｏｌＥｌ　、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及び その誘導体を含むイー・コリ（Ｅ！、　ｃｏｌｉ）由来のプラスミド）；広い宿 主域のプラスミド例えばＲＰ４　；ファージＤＮＡ例えばファージλの多数の誘 導体（例えばＮＭ９８９）及び他のＤＮＡファージ例えばＭ２Ｓと艷壁迭−重鎮 ＤＮＡファージ−並びにプラスミドとファージＤＮＡの組合わせに由来するベク ター例えばファージＤＮＡを利用するために修飾されたプラスミド：若しくは他 の発現制御分子；または２μプラスミド若しくはその誘導体のような酵母プラス ミドである。有用なりローン化宿主若しくは発現宿主には、次のものが含まれる 。即ち、細菌宿主〔例えばイ・コリＨＢＩＯＩ　、イー・コリＸ１７７６、−ｒ ニニ”ｊ！ＪＸ２２８２　、イー：ｌ１ＭＲＣＩ、　イー　−：１ＩＩＪＬＢ３ ９２　、イー・＋１ＪＣ６００、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ）の菌株、二乞乏菌〕　；酵母などの真菌；動物、昆虫、又は植物の細胞が含 まれる。勿論、すべての宿主／ベクターの組合わせが等しく有効なわけではない 。当該技術分野の熟練者であれば、本願に記載された原理を適切に検討して、こ の発明の範囲を逸脱することなく、宿主・ビヒクルの組合わせを特定して選択す ることができる。

さらに、特定な各クローン化ビヒクル若しくは発現ビヒクル内で、二重鎖ＤＮＡ を挿入する各種の部位を選択することができる。これらの部位は通常その部位を 切断する制限エンドヌクレアーゼで命名されている。これらの部位は、当該技術 分野の熟練者によく知られている。この発明に有用なりローン化若しくは発現の ビヒクルは選択されたＤＮＡ断片を挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位 をもっている必要がないことは勿論理解すべきである。かわりに、ビヒクルは外 の手段によってＤＮＡ断片に接続することができる。

クローン化若しくは発現のビヒクル若しくはベクターと、特に、選択されたＤＮ Ａ断片を接続して組換えＤＮＡ分子を形成するその中の選択された部位は、種々 の因子によって決定される。例えば特定の制限酵素に感受性の部位の数、発現さ れるタンパク質の大きさ、宿主細胞酵素によるタンパク質分解反応にたいする所 望のタンパク質の感受性、精製によって除去することが困難で、宿主細胞タンパ ク質によって発現されるタンパク質の汚染若しくは結合、ベクター分子に対する 開始コドンと終止コドンの位置のような発現の特性、及び当該技術分野の熟練者 に知られているその外の因子である。ベクターと、特定の遺伝子の挿入部位はこ れらの因子の釣合いによって決定され、すべての選択が与えられた場合に等しく 有効であるわけではない。

異種のＤＮＡをクローン化ビヒクル若しくは発現ベクターに挿入して組換えＤＮ Ａ分子を作製するいくつもの方法が当該技術分野では公知であるが、この発明に よって初期のクローン化を行うのに好ましい方法は、λｇｔｌＯのＥｃｏＲＩに よる消化である。次にまず８ｃｏＲ［リンカ−をｃＤＮＡ分子に負荷した後、二 重鎖ｃＤＮＡを上記のλｇｔｌＯに連結する。得られた組換えＩＩＮＡ分子はク ローン化ベクター中の選択された位置に挿入遺伝子をもっている。

勿論、ＤＮＡ分子をクローン化若しくは発現のビヒクルに挿入して組換えＤＮＡ 分子を形成させるその他の公知の方法は、この発明に等しく有用である。これら の方法には、例えばｄＡ−ｄＴ　トレイリング（ｔｒａｉｌｉｎｇ）法、直接連 結法、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼとポリメラーゼがリンクされた修復反 応とこれに続く連結反応、又はＤＮＡポリメラーゼと適切な一重鎖鋳型と連結反 応によるＤＮＡストラントノ延長法が含まれる。

勿論、クローン化ビヒクルの選択された部位に挿入されるｃＤＮＡ断片のヌクレ オチド分子には、所望のポリペプチドをコードする実際の遺伝子の一部ではない ポリペプチドが含まれるか、又は所望のタンパク質の完全な遺伝子の断片だけが 含まれているということは理解すべきである。最終的にどのようなりＮＡ分子が 挿入されても、形質転換された宿主が、担体タンパク質の、ソマトメジン調節生 物活性を有し、ソマトメジン様ポリペプチドに結合しうるポリペプチドを産生ず るか、又はＤＮＡ分子自体が、かような生物活性と結合活性を有するポリペプチ ドを産生ずるのに有用なりＮＡ分子を含有するクローンを選択する雑種形成プロ ーブとしそ有用であることだけが要求される。

異種の遺伝子を含有するクローン化ビヒクル若しくは発現ベクターは、宿主が担 体タンパク質様ポリペプチドを発現できるように宿主を形質転換するのに用いら れる。適切な宿主の選択も、当該技術分野で知られている多くの因子で制御され ている。これらの因子には、例えば選択されたベクターとの適合性、ハイブリッ ドプラスミドがコードするタンパク質の毒性、所望のタンパク質回収の容易さ、 発現特性、安全性及び経費が含まれる。すべての宿主が特定の組換えＤＮＡ分子 のクローン化若しくは発現に等しく有効なわけではないということを理解した上 で、上記因子の釣合いをとらねばならない。

この合成法で、好ましい初期のクローン化ビヒクルはλｇｔＭａｆｌｉａｔｉ！ ｌ、　Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾ＬａｂｏｒａｔｏｒＭ ａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ−ｂｏｒ、　ＮＹ　、　１９８２年、及び Ｄａｖｉｓ、　Ｌ、Ｇ、等、“Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　（Ｂｌｓｅｖｉｅｒ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　ＮＹ 、　１９８６年（Ｐｒｏｍｅｇａ）を連結した。

アニーリングした後得られるハイブリッドＤＮＡは、勿論、異なる組換えＤＮＡ 分子と、ＤＮＡ分子が挿入されていないいくつかのクローン化ビヒクルの大きな 混合物である。しかし各組換えＤＮＡ分子は一〇ｃｏＲ１部位にｃＤＮＡセグメ ントを含有している。かようなｃＤＮＡセグメントは各々、ひとつの遺伝子又は その断片を含有している。ｃＤＮＡ断片のごく少数だけが担体タンパク質又はそ の一部をコードしている。その大部分は他のタンパク質の１つ若しくはその一部 をコードし、そのｍＲＮＡはこの発明の方法で用いられるポリＡ“ＲＮＡの一部 であったものである。また、先に作製したライブラリーのクローンはいずれも担 体タンパク質様ポリペプチドを発現できないこともありうるということを理解す べきである。あるいはそれらはかようなりローンをスクリーニングし同定するの にだけ有用である。

ｃＤＮＡ挿入断片を有する、得られたλＤＮＡベクターを、λフアージ詰込みキ ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてλファージに詰込させ、濃厚培地プレー ト（例えばＬＢ）にプレートした。ファージプラークが目視できるまで、プレー トを３７℃でインキュベートした。

そのファージプラーク（クローン）は、肝臓から得たポリＡ”ＲＮＡの混合物の 種々の大きさの完全もしくは部分的なコピーを示す各種の組換えＤＮＡ分子を含 有している。これらのプラークの大部分は、各々、単一の組換えＤＮＡ分子を含 有している。しかし、これらの組換えＤＮＡ分子のご（少数だけが担体タンパク 質に関連している。したがってこのクローンはスクリーニングして、担体タンパ ク質に関連するクローンを他のクローンから選択しなければならない。

担体タンパク質ｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングするいくつかの方 法がある。これらの方法には、ｌ？ＮＡ選択雑種形成法、ディファレンシャル雑 種形成法、合成プローブによる雑種形成法、又は所望のタンパク質を産生ずるク ローンを、免疫学的若しくは生物学的検定法でスクリーニングする方法が含まれ る。本願発明の発明者等は、合成プローブによる雑種形成法が、最も便利で、初 代クローンのスクリーニングには有望な方法なので、これを選んだ。

組換えＤＮＡ分子と、この分子で形質転換された細菌培養物とは、プローブによ る雑種形成法で同定されるが、完全な担体タンパク質ｃＤＮＡ分子を含有してい るとか、又はそのＤＮＡ分子が実際に担体タンパク質をコードするか若しくはク ローンが担体タンパク質様ポリペプチドを発現できるようにするという保証はな い。しかし組換えＤＮＡ分子は、担体タンパク質サブユニットのｍＲＮＡのコー ディング分子に対して相補的な広範囲のヌクレオチド分子を含有することは確か である。それ故に、組換えＤＮＡ分子は、他の組換えＤＮＡ分子とこれで形質転 換れたクローンを迅速にスクリーニングして、標準の若しくは完全な担体タンパ ク質サブユニットヌクレオチドのコーディング分子を含有する別のセットのクロ ーンを同定するプローブの起源として少なくとも使うことができる。これらのク ローンは、次に、担体タンパク質の生物活性と結合活性を示すポリペプチドの可 能性のある発現について直接分析される。一層重要なのは、これらハイブリッド プラスミドの挿入ＤＮＡ断片のヌクレオチド分子とそのアミノ酸翻訳生成物は通 常の手段を用いて測定することができ、そのＤＮＡ分子は、適切な発現ベクター を構築するのに使用され、そのベクターによって、このベクターで形質転換され た適切な宿主内で担体タンパク質様ポリペプチドが合成できるということである 。

オリゴヌクレオチドプローブの雑種形成ファージｃＤＮＡライブラリーを工ニ・ ユニと混合し、ＬＢ　（濃厚培地）プレートにプレートした。このプレートを、 ファージのプラークが目視可能になるまで３７℃でインキュベートした。各プラ ークは、ｃＤＮＡ挿入断片を含有する独得のλｇｔｌＯファージのクローンを示 す。約５０万〜１００万のファージプラークが実験毎に分析された。

標準の方法（ＤａｖｉｓとＭａｎｉａｔｉｓ）を用いて、これらプラークのファ ージＤＮＡをプレートからニトロセルロースフィルター（細孔直径が０．４５Ｈ ｏ　、　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ１社又はＭｉ１１ｉｐｏ ｒｅ社）に移して、分析を行った。したがってフィルターのＤＮＡパターンはプ レートのプラークのパターンのレプリカであった。ファージＤＮＡ内に含有され ている挿入断片をプローブと雑種形成させて同定した後、フィルターは、プレー トと単離されたファージを対応させることができる。

オリゴヌクレオチドプローブ、４８の塩基で構成された４８ｍａｒ（図２８に示 す）を、ランダムに初回抗原刺激を受けたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーＨ１４ をスクリーニングするのに使用した。

そのプローブは、担体タンパク質サブユニット５−１５のアミノ酸Ａｆａ（２９ ）からＬｅｕ（４４）までをフードするヌクレオチドにまたがっている分子に相 当するものであった。この単一のオリゴヌクレオチドは、ヒトコドンに対するバ イアスが最大になるように設計した。

雑種形成の条件は、前記４８塩基のプローブ（４８ｍａｒ）を、胎盤由来のヒト ゲノムＤＮＡのサザーンプロットと、各種の緊縮皮下でアミノ酸Ｇｆ　ｙ（１） からＴｙｒ（５７）まで（図２ｂニ示す）をコードする１８１ｂｐの合成りＮＡ のサザーンプロットとに結合させることによって決定した。雑種形成のための最 終の条件は、最小のバックグランドで遺伝子の同定を行える条件であるが、４０ ％ホルムアミド、５　Ｘ５ＳＰ８　（０，９Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭりん酸 ナトリウムｐＨ７，４，５ｍＭ　ＢＤＴＡ）、４２℃であった。

ランダムに初回抗原刺激をうけた旧４ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー由来の７フ ージブラークのレプリカをもっているニトロセルロースフィルターを、上記雑種 形成条件を用いて”Ｐの標識を付けた４８ｍａｒと雑種を形成させた。雑種形成 は通常−夜実施し、フィルターはオートラジオグラフィにかける前に、０，１　 ｘＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７，０ ）　、０．１％ＳＤＳ中、４５〜５０℃で数回すすいだ。

４８ｍａｒと強く雑種形成したＤＮＡをオートラジオグラフィで同定し、対応す るファージプラークを単離した。ファージのもとのブレーティングは高密度で行 ったから、ブレーティングとスクリーニングの第二の段階は単一のプラークを単 離することが要求された。またスクリーニングのこの第２段階で、最初に単離さ れたファージプラークが実際に４８ｍａｒと雑種を形成することが確認された。

シングルプラークをプレートから取出し、７．−ジをファージ緩衝液（１００ｍ Ｍ　ＮａＣｆ、１０ｍＭＭｇ５Ｏ，，５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５、０，０１％ ゼラチン）に溶離させた。細菌を遠心分離法で除いた後、これらのファージの貯 蔵品は４℃に保持した。ファージＤＮＡを精製し特性を決定したｃ　工ｓ　、標 準の方法（Ｍ、ｔｌｆＭａｎｉａｔｉｓの方法）にしたがって挿入断片（大きさ ）を測定するためＢｃｏＲＩのような制限エンドヌクレアーゼで制限した〕。挿 入断片は、標準法を用い、ｐＢＲ３２２若しくはｐＧＢＭのようなより小さなプ ラスミドに、−も曵［？［部位で、しばしばサブクローン化した。

陽性プラークの数を同定した（４８／スクリーニングされた６００、０００のプ ラーク）。これらのうち９個をさらに分析するために選択した。これらのクロー ンのうち２個（ｃＬｃＰ　Ｏ，７０とｃＬＣＰ　Ｏ，７７と命名する）は、大き さが約７００〜８００ｂｐで４８ｅ「のプローブで最も強い結合性を示したが、 配列決定を行う前に、より小さな断片に切断した。

４８ｍａｒと雑種形成する断片は初期の配列決定候補であるが、以下のようにし て同定した。ｃＤＮＡ挿入断片ＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰ　０１７７を制限エン ドヌクレアーゼＨａｅＩＩ［で切断した。これらの断片を、アガロースゲル電気 泳動法で分離し、ニトロセルロース膜に移転させ、１２ｐ標識４８＋ｎｅｒプロ ーブでプローブした。

Ｈａｅｌｌ［断片をプローブしたとき、１つの断片だけが４８ｍａｒと結合した 。この９０ｂｐの断片はクローンＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰ　Ｏ，７７の両方に 存在していた。この断片を単離して、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、等Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、７４巻、５４６３頁、１９７７年の方法にした がって配列を決定した。ＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰ　Ｏ，７７の両方の９０ｂｐ 断片のＤＮＡ分子は、次に示す、担体タンパク質サブユニット５−１５、即ちＧ ｌ　ｎ（２３）からＧｆ！　ｕ（５０）までまたがるアミノ酸配列に正確に一致 した。上の列は担体タンパク質サブユニット５−１５の最初の５７のアミノ酸を 示し、下の列は８４ｂｐのＨａｅ　ｍ断片の翻訳を示す。１つのノンマツチ（ｎ ｏｎ−ｍａｔｃｈ）は、４５位のアミノ酸が同定されていなかったためである。

ＤＮＡ分子分析の結果それはトレオニン（Ｔ）と同定した。

ＧＡＳＳＡＧ　ＬＧＰＶＶＲＣＥＰＣＤＡＲＡ　ＬＡ　ＱＣＡＰＰＰＡ　Ｖ　Ｃ Ａ　ＥＬ　ＶＲＥＰ　ＧＣＧＣＣＬＸｅＡＬ　５ＥＧＱＰＸf　Ｉ　Ｙ ＱＣＡＰＰＰＡＶＣＡＥＬＶＲＥＰＧＣＧＣＣＬＴＣＡＬＳＢこれらのクローン はｃＬＣＰ　Ｏ，７０及びｃＬＣＰ　Ｏ，７７と命名され：その組換えＤＮＡ分 子はλｇｔｌＯ：　ＬＣＰ　Ｏ，７０及びλｇｔｌＯ：　ＬＣＰＯ０７７と命名 され、そのＤＮＡ挿入断片はＬＣＰ　Ｏ，７０及びＬＯＰ　Ｏ，７７と命名され た。この命名法は、そのクローンと組換えＤＮＡ分子が、肝臓ｃＤＮＡから単離 された、担体タンパク質に関連するｃＤＮＡを含有するファージλｇｔｌＯで構 成されていることを示す。

挿入断片ＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰｏ、７７は大きさと制限部位が類似している ことが分かった。挿入断片ＬＣＰ０．７０とＬＣＰｏ、７７は夫々的７００ｂｐ と７７０ｂｐである。ＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＯＰ　０．７７の制限地図を図３ａ に示す。ＬＯＰ　０．７０としＣＰｏ、７７挿入断片のＩＩＮＡ配列は、−重鎖 と二重鎖のジデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７４巻、５４６３頁、１９７７ 年）で得たが、図４に示す配列に含まれており、夫々スクレオチド１−６９９と ７−７６９である。アミノ末端に加えて、トリプシン断片ＴＩ’とＴＩＯがこれ らクローンのＤＮＡ分子と一致した。ＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰ　Ｏ，７７は、 夫々１７．５５８と２０．３２０ダルトルのタンパク質をコードするのに充分に 大きなものである。したがって、全５−１５分子をコードするのに必要な情報は これらの挿入断片に含まれている。

しＣＰｏ、７０とＬＣＰ　０．７７とにクロス雑種形成させることによる、担体 タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するクローンの同定 上記のようにして単離したクローンｃＬｃＰ　Ｏ，７０とｃＬＣＰ　Ｏ，７７の 組換えＤＮＡ分子とＤＮＡ挿入断片を、ｃＤＮＡで先に調製したりローンのライ ブラリーを、ファージプラークと雑種形成させることによってスクリーニングす るのに使用した。この方法によれば、ＬＣＰ　０．７０で作った放射性プローブ を、ニトロセルロースフィルターに固定した組換えファージのＤＮＡと雑種形成 させることによって、関連クローンを迅速に同定することができる。

ＬＢプレートから移したファージプラークに相当するファージＤＮＡを含有する ニトロセルロースフィルターを次のようにして調製した。

７００ｂｐのＬＣＰ　Ｏ，７０又は７７０ｂｐのＬＣＰ　Ｏ，７７の一シ辺Ｒ１ 制限断片を、ヒト肝臓のランダムに初回抗原刺激を受けたｃＤＮＡライブラリー Ｈ１４、ヒト肝臓のオリゴｄＴで初回抗原刺激を受けたｃＤＮＡライブラリーＨ ＩＯ／Ｈｉ４及びヒト胎児繊維芽細胞オリゴｄＴで初回抗原刺激を受けたｃＤＮ ＡライブラリーＷ１３８をスクリーニングするのに使用した。またこれらのプロ ーブは、担体タンパク質をコードする他の組織白米のＲＮＡを用いて構築された 他のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのにも使用できた。

さらにこれらのプローブはゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使用で きた。

そのプローブ断片（ＬＣＰ　Ｏ，７０若しくはＬＣＰ　Ｏ，７７）を、組換えＤ ＮＡ分子のＥｃｏＲＩ消化生成物を約１％のアガロースゲル中で電気泳動を行い （挿入断片をクローン化ビヒクルから分離するため）、次いでＤＢ８１ペーパー に電気溶離させて精製した。

次に特異的な断片を濃縮し、　“ニックトランスレーション法“の標準法で、” Ｐの標識をつけた。

上記プローブと、ｃＤＮＡクローンを含有するニトロセルロースフィルターとの 雑種形成は、特に以下のようにして行った。

オリゴｄｔで初回抗原刺激を受けたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーＨＩＯ／８１ ４由来の約５００．０００のクローンと、オリゴｄＴで初回抗原刺激を受けたヒ ト胎児繊維細胞ｃＤＮＡライブラリーＷ１３８由来の約ｓｏｏ、　ｏｏｏのクロ ーンをスクリーニングした。

Ｗ１３８繊維芽細胞ライブラリー中の陽性シグナルの頻度は約０．１％であった 。一方肝臓ライブラリー内の頻度は０．０１〜０、０２％にすぎなかった。陽性 クローンを、プラークで精製し、制限地図を作製し配列分析を行って担体タンパ ク質ｃＤＮＡを含有する他のクローンを同定することによって特性を決定した。

クローンは、−重鎖及び二重鎖の配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）を用いて配列を決 定した。

２、３ｋｂの挿入断片（ｃＬＣＰ　２．３）を含有するクローンを、全長の担体 タンパク質様のもののコーディング配列を含有する、ヒト肝臓のオリゴｄＴで初 回抗原刺激を受けたｃＤＮＡライブラリーＨＩＯ／Ｈ１４から単離した。夫々１ ．８ｋｂの挿入断片（ｃＦｃＰ　１．８）と２−５ｋｂの挿入断片（ｃＦＣＰ　 ２．５）を含有するクローンを、Ｗ２Ｂ５の繊維芽細胞オリゴｄＴで初回抗原刺 激を受けたｃＤＮＡライブラリーから単離した。これらクローンのＤＮＡ配列分 析結果（４図）は、両者とも全担体タンパク質様ポリペプチドコーディング配列 を含有していることを示した。コードされたタンパク質は、２７番アミノ酸（８ １番のヌクレオチド）リーダー＋２６４番アミノ酸（７９２番ヌクレオチド）成 熟コーディング領域で構成されている。肝臓と繊維芽細胞のクローンは、共にコ ーディング領域中に、特に同じヌクレオチド配列を示している。

肝臓クローンのうちの１つは、５位のアミノ酸のＡＬＡの代わりにＧＬＹをコー ドしている（但し１位は成熟タンパク質の最初のアミノ酸である）。この多菫性 は、Ｃｏｈｎ画分ｔＶ−ｔから精製された担体タンパク質サブユニットに観察さ れたものに一致する。

ＬＯＰ　０．７０若しくはＬＣＰｏ、７７をプローブとして用いる、Ｗ１３８ヒ ト胎児繊維芽細胞ＲＮＡ　、ヒト肝臓ＲＮＡ　ＨＩＯ／Ｈ１４、ヒト胎盤ＲＮＡ 及びマカック属サルの肝臓ＲＮＡをノザーン分析した結果、担体タンパク質ｍＲ ＮＡは大きさが約２．０００〜２．５００塩基であることが分かった。したがっ て、２．２〜２．４ｋｂのクローンは、恐ら（これらＲＮＡに相当する全長のｃ ＤＮＡを示すものであろう。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法（Ｓａｉｋｉ　Ｒ，に、等、５ｃｉｅｎ ｃｅ　。

２３９＠、４８３〜４９１頁、１９８８年）によって、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブ ラリーとクローンｃＬＣＰ　２．３を分析した結果は、ｃＬＣＰ　２．３が３′ の非翻訳領域中に約２００ｂｐの小さな欠落があることを示唆している。実際に 、細菌、２．５ｋｂ挿入断片（ｃＬｃＰ　２．５）を含有するクローンが肝臓ｃ ＤＮＡライブラリーから単離された。

この挿入断片（ＬＣＰ　２．５）は、１０６３の主■部位と１２７０の」１部位 との間の２００ｂｐの“挿入”を除いてしＣＰ２．３と同じである（図３ｂ）。

ＬＣＰ２．５はＦｅＦ２．５と明らかに類似している。

上記のような、クローンＬＣＰ　Ｏ，７０とＬＣＰ　Ｏ，７７のＤＮＡ挿入断片 を用いて行うクローンスクリーニング法は、組換えＤＮＡ法、合成法、天然起源 若しくはその組合わせから生成するＤＮＡ分子を含有するその外のクローン、及 び単−若しくは多重の、塩基置換、挿入、逆位、若しくは欠落を含む突然変異に よる上記ＤＮＡ分子のいずれかに関連するＤＮＡ分子を含有するクローンに、等 しくうま（利用できることは勿論明らかなことである。それ故に、かようなりＮ Ａ分子とその同定法もこの発明に含まれる。また、上記のＤＮＡ分子ではスクリ ーニングされなかったが、そのヌクレオチドの配列の結果から、上記ＤＮＡ分子 によってコードされるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子もこの発明に含まれ ると理解されるべきである。

その上に、ヒト担体タンパク質様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と、非ヒ ト起源由来の担体タンパク質をコードするＤＮＡ分子との間に相同性が予想され るので、この発明のＤＮＡ分子は、これらの非ヒト担体タンパク質をコードする ＤＮＡの選別と、治療組成物と治療法に用いるこれら非ヒト担体タンパク質のク ローン化と発現に有用である。結局、この発明のＤＮＡ分子、又はそれから調製 若しくは誘導したオリゴヌクレオチドは、担体タンパク質若しくは担体タンパク 質サブユニットではない担体タンパク質様ポリペプチドをコードする他のＤＮＡ 分子を選別するのに利用できる。これらの分子とポリペプチドもこの発明の一部 である。

担体タンパク質の活性を示すポリペプチドの発現担体タンパク質様ポリペプチド をコードするＤＮＡ分子を発現させることによるポリペプチドの製造は、イー・ コリと哺乳類の細胞で行った。

遺伝子のシグナル配列がプレプロインシュリンに対するそれによって置換されて いる担体タンパク質遺伝子の全コーディング領域を含有するＤＮＡ断片を、発現 ベクターｐＫＫ２３３−２（ファーマシア社）に連結した。このベクターは、− ３５歴シグナルが１ａｃ−１０領域から１７塩基の距離（共通距離）のところに 位置する１−ｚ　ａｃ融合プロモーターをもっている。

ｆａｃオペレーター配列が存在すると、ＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チ オガラクトピラノシド）を培地に添加することによって、このプロモーターから の発現が誘発される。その上に、このベクターはｌ　ａｃＺリポソーム結合部位 を含有している。

担体タンパク質遺伝子のｔｔＳコーディング配列に融合されたプレプロインシュ リンシグナル配列を含有する挿入断片（１）ＤＪ４２１．９）は、以下の方法（ 図５に示す）で作ることができる。その開始ＡＴＧがＮｃｏ　Ｉ制限部位内に含 有されているプレプロインシュリンシグナル配列を合成した。そのシグナル配列 に、Ｓａｃ　１部位を通じて、成熟担体タンパク質の最初の４つのアミノ酸をコ ードするヌクレオチドＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧが続いている。したがって図５ に示すＮｃｏｌ　／　Ｓａｃ［断片を生成させることができた。この断片を、ま た図５に示す、担体タンパク質のコーディング配列の残りの部分を含有するＳａ ｃ！　／Ｘｈｏｌ断片に連結した。Ｘｈｏ１部位は、翻訳終止部位をこえて８５ ｂｐのところに位置しているが、標準の方法を用いて、旧ｎｄＩ［リンカ−を付 加することによって、Ｈｉｎｄｌ［部位に予め変換し、てあった。プレプロイン シュリンシグナル配列と担体タンパク質コーディング領域とをもっている、得ら れた一Ｎｅｏ　［／肛皿旦断片をｐＫＫ２３３−２の」臼１部位とＨｉｎｄｌｌ ［部位に挿入した。［ＰＴＧで誘発された、イー・コリ中のこの構造の発現によ って、２５．０００〜３０．０００ダルトンのタンパク質が得られ、抗拒体タン パク質抗体に結合するその性能によって同定された。

発現は１Ｓ−システィンの存在下で行った。ＪＰＴＧで誘発して２時間後に、細 胞抽出物（細胞質と細胞周辺腔）を抗拒体タンパク質抗体で免疫沈澱させて、５ ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。担体タンパク質の、ＩＰＩＧによって誘発される性能 が照明された。というのは、［ＰＴＧによる誘発なしで増殖された、上記の構造 を有する細胞は、はんのごくわずかな量の２５．０００〜３０．０００ダルトン のタンパク質しか発現しなかったからである。ｐＫＫ２３３−２だけを試験した 対照の試料は、上記の大きさの範囲のタンパク質を全く示さなかった。

部分担体タンパク質様配列の、ＣＯ３細胞内での発現ｐＤＪ４２０９とｐＤＪ４ ２１１由来の挿入断片（図６に示す）を、哺乳類発現ベクターｐｓｖｔ、若しく はｐＤＪ４２１０　（ファマシア社）のユニークＸｂａ　１部位に連結した。ｐ ＳＶＬはＳＶ４０の後期プロモーター、イントロン及びポリアデニル化部位をも っている。またｐｓＶＬハ、ＳＶ４０　トｐＢＲ３２２（７）複Ｉｌ！開始点も もッテイル。Ｉ］ＤＪ４２１０はｐＳＶＬと似ているが、ｘＢＲ３２２の代わり にｐＵｃｌ、９の複数開始点をもっている。

これらの挿入断片は各々、部分担体タンパク質遺伝子、具体的にいえば、成熟配 列の最初の１２０のコドンと、これに続いて、読取り枠を終結する合成配列（５ ’−ＣＴＣＴＡＧＡＧ・・３′）とをもっている。各々以下のような異なる制御 領域をもっている。

ｐＤＪ４２０９は、ＢｅｏＲ１部位からストレッチしている全５′非翻訳領域（ １１４のヌクレオチド）をもっているが、予め漁１部に変換されである。またｐ ＤＪ４２０９は担体タンパク質シグナル配列も含有している。ｐｓＶＬに含有さ れているｐＤＪ４２０９　ＸｂａＩ断片はｐＤＪ４２０７と呼称する。

ｐＤＪ４２１１は、４４のヌクレオチドの５′非翻訳領域と担体タンパク質シグ ナル配列を含有している。ｐＤＪ４２１０に含有されているｐＤＪ４２１１　Ｘ 厘Ｉ断片は、ｐＤＪ４２１２と呼ばれ、図７に示しである。

部分担体タンパク質遺伝子を含有するベクターを、ＣＯ８細胞（欠陥ＳＶ４０で 形質転換されたサル細胞）に移入させ、一過性の発現を測定した。細胞はＤＭＥ Ｍ−Ｆ１２中で増殖させた。タンパク質にｇａｓ−システィンで標識をつけた。

培地を集め、抗拒体タンパク質抗体で免疫沈澱させ、５Ｏ３−ＰＡＧＥに付した 。

ｐＤＪ４２１２とｐＤＪ４２０７を用いる発現の試験によって、約１４．０００ ダルトンと約１６．０００ダルトンの２つのタンパク質を得た。これらのタンパ ク質の発現はｐＤＪ４２０７よりもｐＤＪ４２ｉ２の方が大きかった。

全長の担体タンパク質様配列のＣＨＯ細胞における発現全担体タンパク質遺伝子 ＋５′と３′の非翻訳領域（夫々１１４と７００のヌクレオチド）を含有するＬ ＣＰ　２．３の１．６６ｋｂ［ＥｃｏＲＩ／　ＨｉｎｄＩ［［断片を、β−アク チンプロモーター（スタンホード大学の認可を受けた）と、哺乳類細胞中での発 現に必要な他の機能とをもっている哺乳類発現ベクターｐＫＧ３２２６に挿入し た。得られたベクターをｐＫＧ４４０３と呼称し図８に示す。

ｐＫＧ４４０３を用いてＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質転換 し、安定して形質転換された細胞系を薬剤選択法によって得た。形質転換された ＣＨＯのプール由来の血清のないよう調整された培地を、″Ｓ−標識生成物の免 疫沈澱法と、ＳＭ−Ｃウェスタン法での”’ｒ−３Ｍ−Ｃに結合する性能とによ って、担体タンパク質様ポリペプチドの発現について分析した。免疫沈澱によっ て検出するために、細胞を、１０％のウシ胎児血清で補充したＤＭＢＭ−Ｆ１２ 中で８０％の集密度まで増殖させ、血清なしの培地に移し、１時間システィンを 供給せず、続いて一夜、″Ｓ−システィンで標識を付けた。その培地を、抗拒体 タンパク質サブユニット抗体で免疫沈澱させ、得られたタンパク質を、還元条件 下、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。３７．０００と３９．０００ダルトンの担体 タンパク質様ポリペプチドが特異的に同定された。ＳＭ−Ｃ結合製を検出するた め、＊清なしに調整された培地（標識がついていない）を、形質転換プールを接 種して４８時間後に集め、非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。そのタン パク質をそのゲルからニトロセルロースフィルターに移し、”Ｊ−３Ｍ−Ｃでプ ローブした。４３．０００ダルトンを４５．０００ダルトンの２つの新規の担体 タンパク質様ポリペプチドが観察された。Ｃ）１０細胞に内在する２８．０００ ダルトンのタンパク質は、形質転換されていない対照ＣＨＯブールのみならず形 質転換されたプールにも検出された。大きさの差異（３７，０００と３９．００ ０対４３、０００と４５．０００）は、恐らく、５Ｏ８−ＰＡＧＥが還元条件下 かまたは非還元条件下で行ったことが原因であろう。

ＬＣＰ２．３のこの遺伝子は、単−若しくは多重の、塩基置換、欠落、挿入若し くは逆位を含む突然変異のような遺伝子の修飾が、遺伝子にまだ起こっていない か、又は遺伝子の特性若しくはその遺伝子から発現されるポリペプチドの特性を 修飾するのに続いて採用されないという可能性がある。またこの遺伝子は、図４ に示すものに比べて生理的に類似しているが構造がわずかに異なる遺伝子若しく はポリペプチドをもたらすことになる多重性を排除しない。

勿論、通常の方法でポリＡ”ＲＮＡ由来のクローン化されたｃＤＮＡが５′−末 端ヌクレオチドを欠き、人工的な分子さえ含有していることは理解されるべきで ある。

図４に示すポリペプチドの構造は、勿論、１傅酵素との相互反応によって起こる ポリペプチドの修飾はいずれも、例えばグリコジル化を考慮していない。それ故 に、図４に示すアミノ酸分子は、生体内に産生される担体タンパク質と同一でな いことは理解されなければならない。

担体タンパク質活性をコードする染色体遺伝子が細菌宿主内では発現できないの は、これらの介在分子がかような宿主によって適正に処理されないからであると はいえ、染色体遺伝子は、恐らく、真核宿主中に担体タンパク質様ポリペプチド を産生ずる場合に非常に重要であろう。なおこの真核宿主のなかでは、ヒトの、 非コーディング領域、イントロン及びコーディング領域が、高レベルで発現させ て、生成物を適正に処理して生物学的に活性の担体タンパク質様ポリペプチドに するのに重要である。

タンパク質の産生レベルは３つの主要因そで支配される。

即ち、細胞内のその遺伝のコピーの数、これら遺伝のコピーが転クシされる効率 、及びそれらが翻訳される効率である。、転Ｓ　’：　悶ａ−１（両者で発現を 構成している）の効率は、さらに、所９ヴの５〜ディング分〕゛・の訂記通常位 置するヌクレぢヂド分子・６：依存している。：：、！Ｎらのアク１．７・オ丁 −ド分子、即ち発現制御分子は、ＲＮＡ　：ｆεす／ラーゼが相互に作用して転 写を開始（２゜（″ハＪモ・−クー分子−）、リボソー・ノ５、が＋ｎＲＮＡ　 （転写反応の生成物）と結合し相−９−に作用１．て翻訳を開始する位置を決定 −ダる。。

か、３、′ｊ・なジ）現ｊ１４御４０でかすべで、等し、５い効率で機能ず、ｓ 　ｔｌ＝Ｆではろｌ、ｌ、、ｉ、　！７たＩ゛パーて、灰中のタンパク質の特異 的なコーフ゛イ゛・グ分子−を、その隣ｊＱヌ；↑レオチド分子から５）離１、 代わりｊ、゛、そのツー４インフ分：ｉ′−を・他の公知の発現、制置分子に融 合・ト已で、）へ１２ヘルの発現を促進す１５ことが有利であＳ１１、。

れか達６：されたならば、新しく設”Ｊ［・１￥れたＩ′ｌＮＡ　ｉ、；　、細 胞内の遺伝子コピーの数を増大してさらに発現タンパク質の収量を改善するため に、高いコピー数のプラスミド又はバクテリオファージ誘導体に挿入できる。

い（つもの発現制御分子が上記のように採用される。これリポソーム相互作用分 子（シャイン・ダルガルノ分子のような分子を含む）、イー・コリのトリプトフ ァンシンテターゼ系（“ｔｒｐ系”）の対応する分子、ファージλの主要なオペ レーターとプロモーターの領域（ＯｃＰ＋、と０　＊　Ｐ　ａ　）　、Ｔ７ＲＮ Ａポリメラーゼにしか認識されないバクテリオファージエフプロモーター、繊維 状−重鎖ＤＮＡファージの制御領域、ＳＶ４０の初期と後期のブロモ−クー、ア クチンプロモーター、レトロウィルスの長い末端繰返し部に位置するプロモータ ー、又は真咳細胞若しくは原核細胞及びそれらのウィルス又はその組合せの遺伝 子の発現を制御するその外の分子が含まれる。それ故Ｕ−５遮切な宿主内での特 定のポリペプチドの産生を改善す、Ｓためδこ、そのポリペプチドをコー　ドす る遺伝子を、従来ど４６す６：ＡｔＪ製しで、その前者の発現制御分子の近くで 、又は仙記、の改善された発現制御分ｉ′−の１つの制御下で、組換えＤＮＡ分 子に挿入される。このような方法は当該技術分野で公知である。。

翻訳の効率を改善するその外の方法には、開始コドンの前に、、４ｅ？的若しく は酵濃Ｃ作らオ］たオリゴヌクレオチドを挿入する方法がある。、″パの方法に ｊ、。って、−Ｍ適切な−・−次機迫１ヒ二次構造の伝令ＲＮＡ尽−得る、二と ができる。さらに具体的Ｕ４べろと、分子は、ＡｔＪ（：開始コニ滲、が、へ丁 ビンの頂部若し５くは４１％の一重鎖蒙域の容易に接近できる位＃（即ち一次構 造でマスクさ第１ていない位Ｋ）に生成Ｖるように設計ｒる１丁とができる。ま た前記のシャイン・ダルガルノセグヌントの位置とで、）了も同様に最適化する ことができる。伝令ｉ？Ｎ　Ａ、の−膜構造（折たたみ構造）の重要性が証明さ れでいる。

所望の生成物の細胞収率のさらなる増大は、細胞内で利用できる遺伝ｒ−の数を 増やすことにより７″きまる。これば、担体タンバケ質様遺伝Ｔの挿入によって （その転写と翻訳の制御要素のあるなしにかかわらず）、高コピー数プラスミド 又は温度でコピー数が制御されるプラスミド（即ぢ、プラスミドのコピー数が温 度を上昇させると増大するような突然変異部分を有するプラスミド）内で達成す ることができる。

あるいは、遺伝子量の増大は、例えば、さきに記載された方法で設計された絹、 換えＤＮＡを等厚性バクテリオファージに挿入して（最も簡単にはそのプラスミ ドを制限酵素で消化して行う）、１つの線状分子を作ることによって達成され、 次いでこの線状分子は制限ファージλクロニングビヒクルと混合され、ＤＮＡ　 リガーゼとともにインキュベートすることによってその組換えＤＮＡ分子が産生 される。次に所望の組換えファージが従来どおりに選択され、宿主菌株のイー・ コリを溶原化するのに利用される。

それ故、この発明の挿入ＤＮＡは、さきに述べたような他の発現ベクター、及び 先に述べたような各種の宿主に用いられるこれらのベクターに挿入されて、担体 タンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現が改善されることは理解され るべきである。

またこの発明によって製造される担体タンパク質様ポリペプチドの生物活性は、 この発明のＩＩＮＡ分子を使って、哺乳石細胞系を形質転換しその系で遺伝子を 発現させることによフて改善することができる。このような哺乳系は公知であ／ ：１１゜かような系の１つは、０皿　（チャイニーズハムスター卵巣）（口１（ ｐｎ）細胞系であり、この系では遺伝子の発現はノトトレギセー）　（ＭＴＸ） ｉ：よ〕で増やされる。これらの発現系はグリコ〉゛す・化５ケンバグ質を産生 ずることができる。かような細胞は、担体タンパク質様遺伝子のコピー数を大き く増大するよう誘導することができる。

また担体タンパク質様ポリペプチドは、融合タンパク質の形態（例えば分泌を指 向する真核若しくは原核のＮ末端セグメントに連結された形！り、プロ担体タン パク質様ポリペプチドの形態帽巳厘、分泌時に切断できる担体タンパク質シグナ ル分子のすべて若しくは一部で出発する形Ｉ！り、又は成熟担体タンパク質様ポ リペプチドとして（発現と分泌中の初期のメチオニンを含む外来性アミノ酸の分 解によって）、又はｆ　−ｍｅ　を担体タンパク質様ポリペプチドの形態が製造 できることは理解されるべきである。この発明の特に有用な１つのポリペプチド は、容易に分解されるアミノ酸、又はアミノ末端に接続される一連のアミノ酸を 有する成熟担体様ポリペプチドである。このような構造によって、そのタンパク 質は適切な宿主中で合成することができ（その宿主には成熟担体タンパク質サブ ユニットには存在しない開始シグナルが必要であるカリ、次いで余分のアミノ酸 が切断されて成熟担体タンパク質サブユニットが産生される。

担体タンパク質サブユニット又は担体タンパク質様ポリペプチドを、治療様に、 ソマトメジン様分子と組合わせて使用しなければならない場合、２つの分子を、 同じ細胞内、好ましくは哺乳類細胞内に共産生（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｅ）させて もよい。両方の遺伝子を含有するベクターで共形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒ ｍ）してもよく、両方のタンパク質を発現する安定な細胞系を選択してもよい。

したがって、担体タンパク質様ポリペプチドとソマトメジン様ポリペプチドの両 者を含有する複合体を産生ずるには、唯一の発酵・精製方式が必要である。

これらの異なる形態のポリペプチドの収率は、上記のいずれかの方法若しくはそ の組合わせによって改善することができる。この発明のＤＮＡ分子に用いられる コドンのいくつか若しくはすべでの異なるコドンは置換することができる。これ らの置換されたコドンは、置換されたコドンがコードするアミノ酸と同一のアミ ノ酸をコードするが、ポリペプチドが一層高い収率で得られる。あるいは、１つ のコドン又はコドンの組合わせを置換して、アミノ酸を置換するか、又は担体タ ンパク質様ポリペプチドを長くするか若しくは短くすることによって、ポリペプ チドの特性を有用な状態に変化させることができる（例えは安定性が増大し、溶 解性が増大し、治療活性が増大する）。

結局、この発明の組換えＤＮＡ分子で産生されるポリペプチドの活性は、この発 明の範囲を逸脱することなく、公知の手段によって、この発明のＤＮＡ分子又は ポリペプチドを断片化するか、収縮するか、又は誘導体化することによって改善 することができる。

この発明の発明者等は、この発明のいくつかの実施態様を記載したが、これらの 実施態様を変更して、この発明の方法と組成物を利用する他の実施態様を提供す ることができることは明らかである。この発明の範囲は実例として提供した特定 の実施態様ではな（て以下の特許請求の範囲によって定義される。

ＧＬＮ−ＰＲＯ−＋　１−ＧＬＴ−ＩＬＥ−ＴＴＲＬ皿 ２５　ＧＬＹ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＳＥＲ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−Ｇｕｔ−ＡＬＡ（Ｒ Ｇ−ＰＲＯ−ＬＥｔｌ−ＧＬＮ−＾ＬＡ−ＬＥυ−ＬＥυ−ＬＥｔｌ　−ＧＬＮ 父 ＦＩＱ、ユ ん ＦＩＬＺｂ。

ＦＩＧ、、４゜ （ｌ　ＯＦ　３） あ ２！５ ｖｕｎ ＦＩＧ、Ｊ。

ＬＣＰ　（１７０ ＦＩＧ、Ｊ。

ＦＩＬ７゜ 国際調査報告 ［Ｇｉ　！−（ＰＣ）ＲＭ　ＰＣＴ／Ｉ！ＳＡ／２１０）Ｉｎｔｅｒｎａｔ＋ｏ ｎａｌ＾ｐｐｌ＋ｃａＬ＋ｏｎＮｏ、ＰＣ丁／ＵＳ８９Ｉ０５７９１ＣｏＭｌｎ ｕ＃ｄ　ｏＩＩ　＾ＴＴＡＣ１４ＮεＮＴ　Ａ　ロナ　Ｐａｒｔ　ν１．．　！ ｅｃｏｎｍ　Ｐａｑｅ。

Ｉｎｔ＊ｒｎａｔ＋ｏＩ′１ａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ、ＰＣＴ／ｕｓｌ ｌ！１０５７９１

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．担体タンパク質様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ分子。
2. ２．遺伝子がイントロンを含有していない請求項１記載のＤＮＡ分子。
3. ３．ＤＮＡ分子が、ヒトゲノムによってコードされる他のポリペプチドをコード する遺伝子を特に含有していない請求項１記載のＤＮＡ分子。
4. ４．グリコシル化反応で得られる形態で測定した場合に、約４０，０００〜５０ ，０００ダルトン以下の分子量を有するポリペプチドを、遺伝子がコードする請 求項１記載のＤＮＡ分子。
5. ５．担体タンパク質を産生する細胞又はは組織に見出されるｍＲＮＡからｃＤＮ Ａ分子を製造し、どのｃＤＮＡ分子が、図４のＤＮＡ配列に基づいた１つ以上の 標識付きポリヌクレオチドプローブと雑種を形成するかを決定し、雑種を形成し たｃＤＮＡ分子を分析し、次いで担体タンパク質様ポリペプチドをコードする遺 伝子を有するＤＮＡ分子を得ることからなるＤＮＡ分子の製造方法。
6. ６．請求項５の方法で得ることができるＤＮＡ分子と、請求項５の方法で得るこ とができるＤＮＡ分子でコードされている担体タンパク質様ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ分子。
7. ７．ＤＮＡ分子ＬＣＰ０．７０、ＬＣＰ０．７７、ＬＣＰ２．３、ＬＣＰ２．５ 、ＦＣＰ１．８及びＦＣＰ２．５；ＤＮＡ分子ＬＣＰ０．７０、ＬＣＰ０．７７ 、ＬＣＰ２．３、ＬＣＰ２．５、ＦＣＰ１．８及びＦＣＰ２．５のいずれか１つ と雑種を形成し、かつ担体タンパク質様ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子； 及び前記ＤＮＡ分子のいずれか１つによってコードされるポリペプチドをコード するＤＮＡ分子からなる群から選択されるＤＮＡ分子。
8. ８．図４の−１〜２９０のアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードする遺 伝子を含有するＤＮＡ分子。
9. ９．図４の２７〜２９０のアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードする遺 伝子を含有するＤＮＡ分子。
10. １０．図４の２７〜２９０のアミノ酸の配列を有し、かつアミノ酸２７より先行 するメチオニン残基を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ 分子。
11. １１．発現制御配列に操作して連結された請求項１〜４と６〜１０のいずれか１ つに記載のＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡ分子。
12. １２．請求項１１に記載の少なくとも１つの組換えＤＮＡ分子で形質転換された 宿主。
13. １３．請求項１２の宿主を培養して前記ポリペプチドを製造することからなる、 担体タンパク質様ポリペプチドの製造方法。
14. １４．請求項１１に記載の組換えＤＮＡ分子を含有するベクター。
15. １５．請求項１４の少なくとも１つのベクターで形質転換された宿主。
16. １６．請求項１４に記載のベクターで形質転換された宿主を培養して前記ポリペ プチドを製造することからなる、担体タンパク質様ポリペプチドの製造方法。
17. １７．ソマトメジン様ポリペプチドと結合しうる担体タンパク質サブユニット以 外の特に純粋な担体タンパク質様ポリペプチド。
18. １８．担体タンパク質の天然のグリコシル化を欠いている担体タンパク質様ポリ ペプチド。
19. １９．ヒト血清中に天然に存在する物質を、特に含有していない請求項１８記載 のポリペプチド。
20. ２０．図４のアミノ酸２７〜２９０の配列を有する特に純粋なポリペプチド、か つアミノ酸２７より先行するメチオニン残基を有する上記のポリペプチド。
21. ２１．１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を、付加するか、欠失させるか又は置換 し、そのポリペプチドが担体タンパク質ポリペプチドを構成する請求項２０記載 のポリペプチド。
22. ２２．図４の−２〜２９０のアミノ酸の配列を有するポリペプチドと、その配列 の一部を有し担体タンパク質様ポリペプチドを構成するポリペプチドとからなる 群から選択されるポリペプチド。
23. ２３．請求項１７〜２２のいずれか１つに記載のポリペプチドからなる群から選 択される少なくとも１つのポリペプチド若しくはその医薬として許容される塩及 び医薬として許容される担体の、先端巨大症におけるソマトメジン−Ｃの作用を 阻害し、糖尿病性網膜症の網膜血管と繊維状組織の増殖を阻害し、長身小児の成 長を阻害し、ケロイド■痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出症の眼窩内の組織の増 殖を阻害し、又はヒト若しくは動物の創傷の治療を刺激するのに有効な量を含有 する治療用組成物。
24. ２４．請求項２３の組成物の有効量を投与することからなる、ソマトメジン依存 性癌の増殖を阻害し、先端巨大症におけるソマトメジン−Ｃの作用を阻害し、糖 尿病性網膜症の網膜血管と繊維状組織の増殖を阻害し、長身小児の成長を阻害し 、ケロイド■痕の増殖を阻害し、悪性眼球突出症の眼窩内の組織の増殖を阻害し 、又はヒト若しくは動物の創傷の治癒を刺激する方法。
25. ２５．少なくとも１つのソマトメジン用ポリペプチドと実質的に複合している請 求項１７〜２２のいずれか１つに記載のポリペプチドからなる群から選択される 少なくとも１つのポリペプチドを含有する組成物。
26. ２６．請求項２５の組成物の、ヒトの骨粗しよう症を治療し、青の増殖を刺激し 、動物の成長を刺激し、ヒトと動物の創傷の治療を刺激し、成長ホルモン欠損症 の患者の成長を刺激するのに有効な量を含有する治療用組成物。
27. ２７．請求項２６の組成物の有効量を投与することからなる，ヒトの骨粗しよう 症を治療し、骨の増殖を刺激し、動物の成長を刺激し、ヒトと動物の創傷の治療 を刺激し、成長ホルモン欠損症の患者の成長を刺激する方法。
28. ２８．請求項１７のポリペプチドに対するモノクローナル抗体とポリクローナル 抗体。
29. ２９．請求項１７のポリペプチドと複合したソマトメジンを未結合のソマトメジ ンから分離することからなるヒト体液中の遊離ソマトメジンの濃度を測定する方 法。