ES2527871T3

ES2527871T3 - Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana

Info

Publication number: ES2527871T3
Application number: ES04775941.0T
Authority: ES
Inventors: Dale L. Ludwig
Original assignee: ImClone LLC
Current assignee: ImClone LLC
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-05-03
Publication date: 2015-02-02
Anticipated expiration: 2024-05-03
Also published as: US20080025990A1; US20100158920A1; EP2365001A3; US7638605B2; JP2011184440A; CA2524305A1; WO2005016970A2; JP2007535895A; JP5638988B2; US7968093B2; WO2005016970A3; EP1622942B1; EP1622942A2; EP2365001A2; CA2524305C

Abstract

Un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) que tiene al menos una propiedad seleccionada de (i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR; (ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; (iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y (iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos; y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3; y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.

Description

Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana. La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. 60/467.177 presentada el 1 de mayo de 2003. 5 Antecedentes El receptor del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-IR) es un receptor tirosina cinasa transmembrana ubicuo que es esencial para que el crecimiento y el desarrollo fetal y posnatal sean normales. El IGF-IR puede estimular la proliferación celular, la diferenciación celular, cambios en el tamaño de la célula, y proteger a las células de la apoptosis. También se ha considerado casi obligatorio para la transformación celular (recapitulación en Adams et al., 10 Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-93 (2000); Baserga, Oncogene 19:5574-81 (2000)). El IGF-IR se localiza en la superficie celular de la mayoría de los tipos de células y sirve como molécula de señalización para los factores de crecimiento IGF-I e IGF-II (en conjunto denominados en el presente documento IGF). El IGF-IR también se une a la insulina, aunque con una afinidad tres órdenes de magnitud menores que con la que se une a IGF. El IGF-IR es un heterotetrámero preformado que contiene dos cadenas alfa y dos beta unidas covalentemente por puentes disulfuro. 15 Las subunidades del receptor se sintetizan como parte de una cadena polipeptídica sencilla de 180 kd, que después se procesa proteolíticamente en las subunidades alfa (130 kd) y beta (95 kd). Toda la cadena alfa es extracelular y contiene el lugar de unión al ligando. La cadena beta procesa el dominio transmembrana, el dominio tirosina cinasa y una extensión en C-terminal que es necesaria para la diferenciación y la transformación celulares, pero es innecesaria para la señalización de mitógenos y la protección frente a la apoptosis. 20 El IGF-IR es muy similar al receptor de la insulina (IR), en particular dentro de la secuencia de la cadena beta (homología del 70 %). Debido a esta homología, en estudios recientes se ha demostrado que estos receptores pueden formar híbridos que contienen un dímero IR y un dímero IGF-IR (Pandini et al., Clin. Conc. Res. 5:1935-19 (1999)). La formación de híbridos se produce en células tanto normales como transformadas y el contenido en híbrido depende de la concentración de los dos receptores homodiméricos (IR e IGF-IR) dentro de la célula. En un 25 estudio de 39 muestras de cáncer de mama, aunque tanto IR como IGF-IR estaban sobreexpresados en todas las muestras tumorales, el contenido en receptor híbrido superó de forma consistente los niveles de ambos homoreceptores aproximadamente 3 veces (Pandini et al., Clin. Canc. Res. 5:1935-44 (1999)). Aunque los receptores híbridos están compuestos por pares de IR e IGF-IR, los híbridos se unen de forma selectiva a los IGF, con una afinidad similar a la de IGF-IR, y solo se unen débilmente a la insulina ((Siddle y Soos, The IGF System. 30 Humana Press. pp. 199-225. 1999). Por tanto, estos híbridos se pueden unir a los IGF y transducen las señales en células normales y transformadas. Un segundo receptor de IGF, el IGF-IIR, o receptor de manosa-6-fosfato (M6P), también se une al ligando IGF-II con una afinidad elevada, pero carece de actividad tirosina cinasa (Oates et al., Breast Cancer Res. Treat. 47:269-81 (1998)). Debido a que da lugar a la degradación de IGF-II, se considera un sumidero para IGF-II, siendo un 35 antagonista de los efectos estimulantes del crecimiento de este ligando. La pérdida de IGF-IIR en las células tumorales puede aumentar el potencial crecimiento mediante la liberación de su efecto antagonista sobre la unión de IGF-II con el IGF-R (Byrd et al., J. Biol. Chem. 274:24408-16 (1999)). La expresión endocrina de IGF-I está regulada principalmente por hormonas de crecimiento y se produce en el hígado, pero pruebas recientes sugieren que muchos otros tipos de tejido también son capaces de expresar IGF-I. 40 Por tanto, este ligando está sometido a regulación endocrina y paracrina, así como autocrina en el caso de muchos tipos de células tumorales (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)). Se han identificado seis proteínas de unión a IGF (IGFBP) con afinidades de unión específica por los IGF en suero (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)). Los IGFBP pueden potenciar o inhibir la acción de los IGF, determinado por las estructuras moleculares de las proteínas de unión como resultado de las modificaciones 45 postraduccionales. Sus papeles principales son el transporte de IGF, protección de IGF frente a la degradación proteolítica y la regulación de la interacción de los IGF con IGF-R. Solo aproximadamente el 1 % del IGF-I en suero está presente como ligando libre y el resto está asociado con IGFBP (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)). Tras la unión del ligandos (IGF), el IGF-IR sufre autofosforilación en los residuos de tirosina conservados dentro del 50 dominio catalítico de la cadena beta. La posterior fosforilación de los residuos de tirosina adicionales dentro de la cadena beta proporciona sitios de anclaje para el reclutamiento de las moléculas aguas abajo cruciales en la cascada de señalización. Las rutas principales de la transducción de la señal del IGF son proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK) y fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) (revisado en Blakesley et al., En: The IGF System Humana Press 143-163 (1999)). La ruta del MAPK es principalmente responsable de la señal mitogénica provocada 55 tras la estimulación de los IGF y la PI3K es responsable de la inducción dependiente de IGF de procesos antiapoptóticos o de supervivencia. Un papel clave de la señalización de IGF-IR es su función antiapoptótica o de supervivencia. El IGF-IR activado señala el PI3K y la fosforilación aguas debajo de Akt, o la proteína cinasa B. Akt puede bloquear con eficacia a través de fosforilación moléculas tales como BAD, que son esenciales para el inicio de la muerte celular programada, e inhibir el inicio de la apoptosis (Datta et al., Cell 91:231-41 (1997)). La apoptosis es un importante mecanismo celular que es crucial para los procesos de desarrollo normal (Oppenheim, Annu. Rev. Neurosci. 14:453-501 (1991)). Es un mecanismo clave para efectuar la eliminación de células muy dañadas y reducir la potencial 5 persistencia de las lesiones mutagénicas que pueden estimular la tumorigénesis. Con este fin, se ha demostrado que la activación de la señalización de IGF puede estimular la formación de tumores espontáneos en un modelo de ratón transgénico (DiGiovanni et al., Cancer Res. 60:1561-70 (2000)). Adicionalmente, la sobreexpresión de IGF puede rescatar células de la muerte celular inducida por quimioterapia puede ser un importante factor en la resistencia a fármacos de células tumorales (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999)). En 10 consecuencia, se ha demostrado que la modulación de la vía de señalización del IGF aumenta la sensibilidad de las células tumorales a los agentes quimoterapéuticos (Benini et al., Clinical Cancer Res. 7:1790-97 (2001)). En un gran número de estudios de investigación y clínicos se ha implicado al IGF-IR y sus ligandos (IGF) en el desarrollo, mantenimiento y progresión del cáncer. En las células tumorales, la sobreexpresión del receptor, a menudo junto con la sobreexpresión de ligandos de IGF, conduce a la potenciación de estas señales y, como 15 resultado, a un aumento de la proliferación y supervivencia celular. Se ha demostrado que IGF-I and IGF-II son fuertes mitógenos para una amplia variedad de líneas de células cancerosas que incluyen cáncer de próstata (Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80 (2001); Hellawell et al., Cancer Res. 62:2942-50 (2002)), de mama (Gooch et al., Breast Cancer Res. Treat. 56:1-10 (1999)), pulmonar, de colon (Hassan y Macaulay, Ann. Oncol. 13:349-56 (2002)), de estómago, leucemia, de páncreas, de cerebro, mieloma (Ge y Rudikoff, Blood 96:2856-61 20 (2000), melanoma (All-Ericsson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1-8 (2002)), y de ovarios (revisado en: Macaulay, Br. J. Cancer 65:311-20 (1990)) y su efecto está mediado a través del IGF-IR. Niveles circulantes altos de IGF-I en suero se han asociado con un incremento del riesgo de cáncer de mama, de próstata y de colon (Pollak, Eur. J. Cancer 36:1224-28 (2000)). En un modelo de ratón de cáncer de colon, los incrementos de los niveles de IGF-I circulantes condujeron in vivo a un incremento significativo de la incidencia del crecimiento de los tumores y de 25 metástasis Wu et al., Cancer Res. 62: 1030-35 (2002)). Se ha demostrado que la expresión constitutiva de IGF-1 en células basales epidérmicas de ratones transgénicos estimula la formación espontánea de tumores (DiGiovanni et al., Cancer Res. 60:1561-1570 (2000); Bol et al., Oncogene 14:1725-1734 (1997)). La sobreexpresión de IGF-II en las líneas celulares y tumores se produce con una frecuencia elevada y puede ser el resultado de la pérdida de impresión genómica del gen del IGF-II (Yaginuma et al., Oncology 54:502-7 (1997)). La sobreexpresión de 30 receptores se ha demostrado en muchos tipos de tumores humanos, incluyendo de pulmón Quinn et al., J. Biol. Chem. 271:11477-83 (1996)), de mama (Cullen et al., Cancer Res. 50: 48-53 (1990); Peyrat y Bonneterre, Cancer Res. 22:59-67 (1992); Lee y Yee, Biomed. Pharmacother. 49:415-21 (1995)), sarcoma (van Valen et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 118:269-75 (1992); Scotlandi et al., Cancer Res. 56:4570-74 (1996)), de próstata (Nickerson et al., Cancer Res. 61:6276-80 (2001)), y de colon (Hassan y Macaulay, Ann. Oncol. 13:349-56 (2002)). Además, se ha 35 demostrado que las células cancerosas altamente metastásicas poseen una expresión más alta de IGF-II and IGF-IR que las células tumorales que son menos propensas a metastatizar (Guerra et al., Int. J. Cancer 65:812-20 (1996)). Un papel crucial del A IGF-IR en la proliferación y transformación celular se demostró en experimentos de fibroblastos de ratón con deficiencia en IFG-IR. Estas células primarias crecen a velocidades significativamente reducidas en el medio de cultivo con 10 % de suero y no transforman por diversos oncogenes, incluyendo SV40 40 Large T (Sell et al., Mol. Cell. Biol. 3604-12 (1994)). Recientemente se ha demostrado que la resistencia al fármaco herceptina en algunas formas de cáncer de mama puede deberse a la activación de la señalización de IGF-IR en dichos cánceres (Lu et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1852-57 (2001)). La sobreexpresión o activación de IGF-IR puede no solo ser un determinante importante en la tumorigenicidad sino también en la resistencia a los fármacos en las células tumorales. 45 La activación del sistema IGF también se ha implicado en varias afecciones patológicas además del cáncer, incluida la acromegalia (Drange y Melmed. En: The IGF System. Humana Press. 699-720 (1999)), la neovascularización de la retina (Smith et al., Nature Med. 12:1390-95 (1999)), y la psoriasis (Wraight et al., Nature Biotech. 18:521-26 (2000)). En el último estudio, una preparación de oligonucleótidos antisentido dirigidos al IGF-IR fue eficaz en la inhibición significativa de la hiperproliferación de células epidérmicas en injertos de piel psoriásica humana en un 50 modelo de ratón, lo que sugiere que las terapias anti-IGF-IR pueden ser un tratamiento eficaz para este trastorno crónico. Se han desarrollado varias estrategias para inhibir la ruta de señalización de IGF-IR en las células. Los oligonucleótidos antisentido han sido eficaces en modelos de ratón in vitro y experimentales, como se ha mostrado anteriormente para la psoriasis. Además, se han generado péptidos inhibidores dirigidos a IFG-IR que poseen 55 actividad antiproliferativa in vitro e in vivo (Pietrzkowski et al., Cancer Res. 52:6447-51 (1992); Haylor et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11:2027-35 (2000)). Se ha demostrado que una secuencia peptídica sintética del extremo C del IGF-IR induce apoptosis e inhibe significativamente el crecimiento tumoral (Reiss et al., J. Cell. Phys. 181:124-35 (1999)). También se han generado varios mutantes negativos dominantes del IGF-IR que, tras la sobreexpresión en las líneas de células tumorales, compiten con el IGF-IR salvaje por el ligando e inhiben con eficacia el crecimiento de 60 células tumorales in vitro e in vivo (Scotlandi et al., Int. J. Cancer 101:11-6 (2002); Seely et al., BMC Cancer 2:15 (2002)). Adicionalmente, también se ha demostrado que una forma soluble del IGF-IR inhibe el crecimiento tumoral in vivo (D'Ambrosio et al., Cancer Res. 56:4013-20 (1996)). Asimismo, se ha demostrado que los anticuerpos dirigidos contra el IGF-IR humano inhiben la proliferación de células tumorales in vitro y la tumorigénesis in vivo, incluyendo líneas celulares derivadas de cáncer de mama (Artega y Osborne, Cancer Res. 49:6237-41 (1989)), osteosarcoma de Ewing (Scotlandi et al., Cancer Res. 58:4127-31 (1998)), y melanoma (Furlanetto et al., Cancer Res. 53:2522-26 (1993)). Los anticuerpos son terapéuticas atractivas principalmente porque 1) pueden poseer una elevada selectividad por un antígeno proteico particular, 2) son capaces de exhibir una elevada afinidad de unión al 5 antígeno, 3) poseen semividas prolongadas in vivo y, dado que son productos inmunitarios naturales, deben 4) exhibir una toxicidad in vivo baja (Park y Smolen. En: Advances in Protein Chemistry. Academic Press. pp:360-421 (2001)). Los anticuerpos derivados de fuentes no humanas, por ejemplo,: de ratón, pueden efectuar una respuesta inmunológica dirigida contra el anticuerpo terapéutico, tras repetidas aplicaciones, de modo que se neutraliza la eficacia del anticuerpo. Los anticuerpos completamente humanos ofrecen el mayor potencial de éxito como 10 terapéuticas humanas ya que probablemente serían menos inmunogénicos que los anticuerpos murinos o quiméricos en seres humanos, de un modo similar a los anticuerpos inmunorespondedores de origen natural. El documento WO 02/053596 divulga anticuerpos y proteínas de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente al receptor del factor I de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR). Existe la necesidad de desarrollar anticuerpos monoclonales humanos anti-IGF-IR para uso terapéutico. 15 Sumario de la invención La invención proporciona anticuerpos humanos aislados y fragmentos de los mismos que se unen específicamente al receptor de IGF-I humano. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, los anticuerpos tienen al menos una propiedad seleccionada de (i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR, (ii) neutraliza la activación de IGF-IR por IGF-I o IGF-II, (iii) reduce el receptor de superficie de IGF-IR en al menos un 80 %; y (iv) se une a IGF-IR 20 con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10 M o menos y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 14 en VHCDR1, la SEC ID Nº 6 en VHCDR2 y la SEC ID Nº 18 en VHCDR3; y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 26 en VLCDR1, la SEC ID Nº 28 en VLCDR2 y la SEC ID Nº 30 en VLCDR3. 25 Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene una región variable en la cadena pesada de SEC ID Nº 2 y una región variable en la cadena ligera de la SEC ID Nº 10. Más preferentemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención tiene todas las propiedades indicadas anteriormente. En una realización más preferida, un anticuerpo de la invención reduce el receptor de la superficie de IGF-IR en al 30 menos un 85 % y, más preferentemente, en al menos un 90 %. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se une preferentemente a IGF-IR con una Kd de aproximadamente 5 x 10-11 M o inferior. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención inhibe preferentemente la fosforilación de un sustrato aguas debajo de IGF-IR. El sustrato aguas abajo se puede seleccionar de MAPK, Akt y IRS-2. La 35 fosforilación se inhibe en aproximadamente un 50 % o más. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención estimula la regresión tumoral in vivo, y, en particular, cuando se administra con un agente antineoplásico. El dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con la presente invenció tiene, preferentemente, una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 2. 40 El dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con la presente invenció tiene, preferentemente, una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 10. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 45 De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona un conjugado que comprende el a composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención unido a un agente citotóxico o un marcador. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona una composición terapéutica eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales humanas que expresan IGF-IR y estimular la regresión de los tumores 50 que expresan IGF-IR, en la que la composición comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención. La composición terapéutica puede además comprender un agente antineoplásico. El agente antineoplásico puede ser un inhibidor de la topoisomerasa I o la tipoisomerasa II. Preferentemente, el agente antineoplásico se selecciona de irinotecán, camptotecán y etopósido. 55 De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo. El trastorno proliferativo se puede seleccionar de acromegalia, neovascularización de la retina y psoriasis. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento in vitro de inhibición del crecimiento de una célula que expresa IGF-IR, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz 5 del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. El procedimiento puede además comprender poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente antineoplásico. A este respecto, el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II y se puede seleccionar de irinotecán, camptotecán y etopósido. De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo o fragmento de 10 anticuerpo de la presente invención para su uso en la reducción y/o prevención del crecimiento tumoral o la estimulación de la regresión tumoral. Preferentemente, el uso comprende además administrar una cantidad eficaz de un agente antineoplásico. El agente antineoplásico es, preferentemente, un inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II y se selecciona de irinotecán, camptotecán y etopósido. 15 El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se usa preferentemente para reducir o prevenir el crecimiento tumoral en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma. De acuerdo con un aspecto adicional más de la presente invención se proporciona un inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso en la reducción o prevención del crecimiento de un tumor que expresa IGF-IR o 20 estimulación de la regresión de un tumor que expresa IGF-IR en combinación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al IGF-IR y tiene al menos una propiedad seleccionada de:

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II;

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y 25

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3; y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3. 30 Preferentemente, el inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II se selecciona de irinotecán, camptotecán y etopósido. El inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II de la presente invención se usa preferentemente para reducir o prevenir el crecimiento tumoral en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma. 35 Los anticuerpos de la invención usados solos o en combinación con un agente antineoplásico son útiles para tratar enfermedades neoplásicas y trastornos hiperproliferativos. La invención proporciona polinucleótidos que codifican los anticuerpos o fragmentos de los mismos, vectores de expresión que comprenden las secuencias polinucleotídicas y células huésped para su expresión. Adicionalmente, la invención proporciona composiciones farmacéuticas y procedimientos de diagnóstico y 40 terapéuticos para el tratamiento de tumores y enfermedades hiperproliferativas. Los procedimientos pueden comprender además la administración de un agente o tratamiento anti-neoplásico. Breve descripción de las figuras La Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada 2F8. La Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada 2F8. Las CDR 45 están en negrita y subrayadas. La Figura 3 representa la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada 2F8 completa (subrayado: secuencia señal secretora; cursiva: región constante de IgG1). La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 2F8 completa (subrayado: secuencia señal secretora; negrita: CDR; cursiva; región constante de IgG1). La Figura 5 representa la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena ligera 2F8. La Figura 6 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera 2F8. Las CDR 5 están en negrita y subrayadas. La Figura 7 representa la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera 2F8 completa (subrayado: secuencia señal secretora; cursiva: región constante de IgG1). La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 2F8 completa (subrayado: secuencia señal secretora; negrita: CDR; cursiva; región constante de IgG1). 10 La Figura 9 representa la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la cadena ligera A12. La Figura 10 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera A12. Las CDR están en negrita y subrayadas. La Figura 11 representa la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera A12 completa (subrayado: secuencia señal secretora; cursiva: región constante de IgG1). 15 La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera A12 completa (subrayado: secuencia señal secretora; negrita: CDR; cursiva; región constante de IgG1). La Figura 13 representa las secuencias de CDR de VH and VL de los anticuerpos 2F8 y A12. Las diferencias entre las CDR de VL están subrayadas. La Figura 14 representa la homología entre las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena 20 ligera de 2F8 y A12. Las diferencias de las secuencias están en recuadros y las CDR están subrayadas. La Figura 15 muestra los resultados de un ensayo que mide la capacidad de los anticuerpos 2F8 y A12 para bloquear la unión de IGF-I a al IGF-IR soluble inmovilizado. Se analizaron los anticuerpos A12 que tienen regiones constantes en la cadena ligera kappa o lambda. La Figura 16 muestra los resultados de un ensayo que mide la capacidad de los anticuerpos 2F8 y A12 (cadena 25 ligera lambda) para bloquear la unión de IGF-I a las células MCF7. La Figura 17 muestra los resultados de un ensayo que mide la capacidad de los anticuerpos 2F8 y A12 para bloquear la unión de la insulina a las células ZR75-I. La Figura 18 muestra el efecto del anticuerpo sobre A12 sobre la incorporación de 3 H-timidina en un ensayo de mitogénesis. Figura 18A: células de cáncer de mama MCF7; Figura 18B: células de cáncer de páncreas BxPC-3; 30 Figura 18C: células de cáncer de colon HT-29. La Figura 19 muestra la inhibición de la fosforilación del receptor mediada por IGF-I. Panel A: Inhibición en células de cáncer de mama MCF7 por los anticuerpos A12 y 2F8. Panel B: Inhibición en células HT-29 de cáncer colorrectal y células de cáncer de páncreas BxPC-3 por el anticuerpo A12. La Figura 20 muestra la inhibición de la fosforilación mediada por IGF-I de las moléculas efectoras aguas abajo 35 por los anticuerpos A12 y 2F8. Panel A: Inhibición de la fosforilación de MAPK; Panel B: Inhibición de la fosforilación de Akt. La Figura 21 muestra la unión de anticuerpo A12 a líneas celulares positivas y negativas para IGF-IR humano y murino. MCF7: células de cáncer de mama humano; R-: fibroblastos de embrión de ratón; HEL: células de leucemia humana; pulmón de Lewis: células de carcinoma de pulmón de ratón. 40 La figura 22 muestra la internalización del receptor- El panel A muestra la internalización del anticuerpo A12 marcado después de la unión a IGF-IR en las células MCF7. El panel B muestra el agotamiento de la superficie celular asociada IGF-IR. El panel C muestra la degradación del IGF-IR celular total después del tratamiento prolongado con A12. La Figura 23 muestra la inhibición del crecimiento del carcinoma de colon humano HT-29 en ratones atímicos por 45 el anticuerpo y CPT-11 (irinotecán) de forma individual o en combinación. La Figura 24 muestra el efecto del anticuerpo sobre A12 el crecimiento del tumor colorrectal humano HT-29 en ratones atímicos. La Figura 25 muestra el efecto del anticuerpo sobre A12 el crecimiento de cáncer de mama humano MCF7 en ratones atímicos. La Figura 26 muestra la inhibición de xenoinjertos de cáncer de páncreas BxPC-3 en ratones atímicos por el anticuerpo A12, gemcitabina o CPT-11 (irinotecán) de forma individual o en combinación. La Figura 27 muestra la inhibición de xenoinjertos de cáncer colorrectal HT-29 en ratones atímicos por el anticuerpo A12, paclitaxel o CPT-11 (irinotecán) de forma individual o en combinación. 5 Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de los mismos específicos para receptor del factor de de crecimiento de tipo insulina (IGF-IR), así como secuencias de polinucleótidos aislados o purificados que codifican los anticuerpos. En ciertas realizaciones de la invención, se proporcionan anticuerpos humanos. Los anticuerpos también se pueden utilizar en combinación con otros agentes químicos y biológicos, incluyendo, entre otros, agentes 10 antineoplásicos y/o agentes que son inhibidores de otros receptores o sustratos de receptores que median en el crecimiento celular. La invención se refiere además a agentes antineoplásicos que son inhibidores de la función de la topoisomerasa. La elección de tales agentes es ventajosa para su uso en procedimientos terapéuticos en combinación con anticuerpos que son específicos para IGF-IR. Los anticuerpos de la presente invención son, preferentemente, humanos y se pueden usar para tratar 15 enfermedades neoplásicas, incluidos tumores sólidos y no sólidos, y para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. Las cadenas individuales pueden plegarse en dominios que tienen tamaños (110-125 aminoácidos) y estructuras similares, pero diferentes funciones. La cadena ligera puede comprender un dominio variable (VL) y/o un dominio contaste (CL). La cadena pesada puede también comprender un dominio variable (VH) y/o, en función de la clase o el isotipo de anticuerpo, tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH 2, CH3 y CH4). En 20 seres humanos, los isotipos son IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y la IgA y la IgG además se dividen en subclases o subtipos (IgA1-2 e IgG1-4). En general, los dominios variables muestran una considerable variabilidad de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo al otro, en particular en la localización del sitio de unión al antígeno. Tres regiones, denominadas regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR), se encuentran en cada VL y VH, 25 soportadas por regiones menos variables denominadas regiones marco. La porción de un anticuerpo constituida por los dominios VL y VH se denomina Fv (fragmento variable) y constituye el sitio de unión al antígeno. La Fv de una cadena (scFv) es un fragmento de anticuerpo que contiene un dominio VL y un dominio VH en una cadena polipeptídica, en la que el extremo N de un dominio y el extremo C del otro dominio están unidos por un enlazador flexible (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.946.778 (Ladner y col.); el 30 documento WO 88/09344, (Huston y col.). El documento WO 92/01047 (McCafferty y col.) describe la expresión de los fragmentos scFv sobre la superficie de paquetes de expresión genética recombinantes solubles, tales como bacteriófagos. Los enlazadores peptídicos usados para producir los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser péptidos flexibles seleccionados para garantizar que se produce el plegamiento tridimensional adecuado y la asociación de los 35 dominios de VL y VH. En general, el enlazador tiene de 10 a 50 residuos de aminoácidos. Preferentemente, el enlazador tiene de 10 a 30 residuos aminoácidos. Más preferentemente, el enlazador tiene de 12 a 30 residuos aminoácidos. Más preferentemente es un enlazador de 15 a 25 residuos aminoácidos. Un ejemplo no limitante de dichos péptidos enlazadores incluye (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEC ID Nº 33). Fab (Fragmento de unión a antígeno) se refiere a los fragmentos del anticuerpo que consisten en los dominios VL-CL 40 y VH-CH1. Tal fragmento generado por la digestión de un anticuerpo entero con papaína no conserva la región bisagra del anticuerpo a través de la cual normalmente están unidas dos cadenas pesadas. El fragmento es monovalente y simplemente se denomina Fab. Alternativamente, la digestión con pepsina da como resultado un fragmento que conserva la región bisagra. Tal fragmento con enlaces disulfuro intercatenarios intactos que unen dos cadenas pesadas es divalente y se conoce como F(ab')2. Un Fab' monovalente se produce cuando los enlaces 45 disulfuro de un fragmento F(ab')2. se reducen (y las cadenas pesadas se separan). Debido a que son divalentes, los anticuerpos intactos y los fragmentos F(ab')2 tienen una mayor avidez por el antígeno que el los fragmentos Fab o Fab' monovalentes. El documento WO 92/01047 (McCafferty y col.) describe la expresión de los fragmentos Fab sobre la superficie de paquetes de expresión genética recombinantes solubles, tales como bacteriófagos. El Fc (fragmento de cristalización) es la designación de la porción o fragmento de un anticuerpo que consiste en los 50 dominios constantes de la cadena pesada emparejados. En un anticuerpo IgG, por ejemplo, el Fc consiste en los dominios CH2 and CH3 de la cadena pesada. El Fc de un anticuerpo IgA o IgM comprende además un dominio CH4. El Fc está asociado con la unión al receptor de Fc, la activación de la citotoxicidad mediada por complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Para anticuerpos tales como IgA e IgM, que son complejos de múltiples proteínas similares a IgG, la formación de complejos requiere los dominios constantes de Fc. 55 Por último, la región bisagra separa las porciones Fab y Fc del anticuerpo, lo que proporciona movilidad de los Fab uno respecto de otro y respecto al Fc, además de incluir múltiples puentes disulfuro para el enlace covalente de las dos cadenas pesadas. Se han desarrollado formatos de anticuerpos que conservan especificidad de unión, pero que tienen otras características que pueden ser deseables, incluso para ejemplo, biespecificidad, multivalencia (más de dos sitios de unión), tamaño compacto (por ejemplo, dominios de unión solos). Los anticuerpos de cadena sencilla carecen de parte o de todos los dominios constantes de todos los anticuerpos a 5 partir de los cuales derivan. Por tanto, se pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos enteros. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla tienen a carecer de determinadas interacciones indeseadas entre las regiones constantes de las cadenas pesadas y otros moléculas biológicas. Adicionalmente, los anticuerpos de cadena sencilla son considerablemente más pequeños que los anticuerpos enteros y pueden tener una permeabilidad mayor que los anticuerpos enteros, lo que permite que los anticuerpos de cadena sencilla se 10 localicen y se unan a los sitios de unión al antígeno diana con mayor eficacia. Además, el tamaño relativamente pequeña de los anticuerpos de cadena sencilla hace que sea menos probable que provoquen en un receptor una respuesta inmunitaria indeseada que los anticuerpos enteros. Los anticuerpos de múltiples cadenas en los que cada cadena tiene un dominio VH y uno VL unidos covalentemente por un primer enlazador peptídico pueden estar unidos covalentemente por al menos uno o más enlazadores 15 peptídicos para formar anticuerpos de una cadena multivalentes, que pueden se monoespecíficos o multiespecíficos. Cada cadena de un anticuerpo de una cadena multivalente incluye un fragmento de la región variable de la cadena ligera y un fragmento de la región variable de la cadena pesada, y está unido por un enlazador peptídico a al menos otra cadena. El enlazador peptídico está compuesto por al menos quince residuos de aminoácidos. El número máximo de residuos de aminoácidos es de aproximadamente cien. 20 Dos anticuerpos de cadena sencilla se pueden combinar para formar un diacuerpo, también conocido como dímero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de unión, y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio VH conectado a un dominio VL. Los dominios están conectados con enlazadores lo bastante cortos para prevenir el emparejamiento entre los dominios en la misma cadena, de modo que se fuerza el emparejamiento a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y 25 crear dos sitios de unión al antígeno. Tres anticuerpos de cadena sencilla se pueden combinar para formar triacuerpos, también conocidos como trímeros trivalentes. Los triacuerpos se construyen con el extremo aminoácido de un dominio VL o VH directamente condensado al extremo carboxilo de un dominio VL o VH, es decir sin ninguna secuencia enlazadora. El triacuerpo tiene tres cabezas Fv con los polipéptidos dispuestos de un modo cíclico y de cabeza a cola. Una conformación 30 posible del triacuerpo es planar con los tres sitios de unión localizados en un plano en un ángulo de 120 grados uno de otro. Los triacuerpos pueden ser monoespecificos, biespecíficos o triespecíficos. Por tanto, los anticuerpos de la invención y fragmentos de los mismos incluyen, entre otros, anticuerpos de origen natural, fragmentos bivalentes tales como (Fab’)2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos de una cadena, Fv de una cadena (scFv), anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos multivalentes de una cadena, 35 diacuerpos , triacuerpos y similares, que se unen específicamente a los antígenos. Los anticuerpos de la presente invención, y particularmente los dominios variables de los mismos, pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, el procedimiento inmunológico descrito por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975) y Campbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory 40 Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); así como por los procedimientos de ADN recombinante tal como el descrito por Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989). Los anticuerpos también se pueden obtener a partir de bibliotecas de expresión en fagos que llevan combinaciones de los dominios VH y VL dominios en forma de scFv o Fab. Los dominios VH y VL pueden estar codificados por nucleótidos que son sintéticos, parcialmente sintéticos o de origen natural. En ciertas realizaciones 45 se pueden preferir las bibliotecas de expresión en fagos que llevan fragmentos de anticuerpos humanos. Otras fuentes de anticuerpos humanos son ratones transgénicos modificados genéticamente para expresar genes de inmunoglobulina humana. Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir escindiendo un anticuerpo entero o expresando ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar mediante procedimientos descritos por Lamoyi y 50 col., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) y por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab’)2. Dichos fragmentos pueden también contener anticuerpos con la región variable del fragmento de una cadena, es decir scFv, diacuerpos u otros fragmentos de anticuerpo. Los procedimientos de producir dichos equivalentes funcionales se divulgan en la solicitud de PCT WO 93/21319, la solicitud de patente europea nº EP 239.400; la solicitud de PCT WO 89/09622; la solicitud de patente 55 europea 338.745; y la solicitud de patente europea EP 332.424. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de la presente invención son específicos para IGF-IR. La especificidad del anticuerpo se refiere al reconocimiento selectivo del anticuerpo para un epítopo particular de un antígeno. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de la presente invención pueden ser por ejemplo, monoespecíficos o biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos (BsAb) son anticuerpos que tienen dos especificidades o sitios de unión a antígeno diferentes. Cuando un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epítopos reconocidos se pueden asociar con un solo antígeno o con más de un antígeno. Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos, o fragmentos de los mismos, que se unen a dos antígenos diferentes, con al menos una especificidad por IGF-IR. 5 La especificidad de los presentes anticuerpos, o fragmentos de los mismos, por el IGF-IR se puede determinar en base a la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio, por la disociación de un antígeno con un anticuerpo (Kd), mide la fuerza de la unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al anticuerpo. La avidez es la medida de la fuerza de la unión entre un anticuerpo y su antígeno. La avidez está relacionada con la afinidad entre un epítopo con su sitio de unión a antígeno en el anticuerpo y la valencia del 10 anticuerpo, que hace referencia al número de sitios de unión al antígeno específicos de un epítopo concreto. Los anticuerpos normalmente se unen con una constante de disociación (Kd) de 10-5 a 10-11 litros/mol. Cualquier Kd superior a 10-4 litros/mol generalmente se considera que indica unión inespecífica. Cuando menor es el valor de la Kd, mayor es la fuerza de la unión entre un determinante antigénico y el sitio de unión del anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, también incluyen aquéllos para los que las 15 características de unión se han mejorado mediante mutación directa, procedimientos de maduración de la afinidad, expresión e fagos o reordenamiento de cadenas. La afinidad y la especificidad se pueden mejorar o modificar a través de mutaciones de CDR y/o residuos de FW y detección selectiva de sitios de unión a antígeno que tienen la características deseadas (véase, por ejemplo, Yang y col., J. Mol. Biol. (1995), 254: 392 - 403). Un modo es aleatorizar los residuos individuales o combinaciones de residuos de modo que, e una población de, por otro lado, 20 sitios de unión a antígeno idénticos, cuyas subpoblaciones de dos a veinte aminoácidos se encuentran en posiciones concretas. Como alternativas, se pueden inducir mutaciones en un una amplia gama de residuos mediante procedimientos de PCR de tendencia a error (véase, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) 226: 889 - 96). En otro ejemplo, los vectores de expresión en fagos que contienen genes de la región variable de la cadena pesada y ligera se pueden propagar en las cepas mutadoras de E. coli (véase, por ejemplo, Low y col., J. 25 Mol. Biol., (1996) 250: 359 - 68). Estos procedimientos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por el experto en la técnica. Equivalentes de los anticuerpos, o fragmentos de os mismos, de la presente invención incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos IGF-IR de longitud completa. En el presente documento se define sustancialmente 30 la misma secuencia de aminoácidos como una secuencia con una homología de al menos un 70 %, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % con otra secuencia de aminoácidos, determinado mediante el procedimiento de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 2444 - 8). Una sustitución conservadora de aminoácidos se define como un cambio en la composición de los aminoácidos 35 cambiando uno o dos aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína, o fragmento de los mismos. La sustitución es de aminoácidos con propiedades generalmente similares (p. ej., ácidos, básicos, aromáticos, de tamaño, de carga positiva o negativa, con polaridad, sin polaridad) de modo que las sustituciones no alteran sustancialmente las características del péptido, polipéptido o proteína (p. ej., la carga, el punto isoléctrico, la afinidad, la avidez, la conformación, la solubilidad) o la actividad. Las sustituciones típicas que se pueden realizar para tal sustitución 40 conservadora de aminoácidos pueden estar entre los grupos de aminoácidos de la siguiente manera: glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L) e isoleucina (I); ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); alanina (A), serina (S) y treonina (T); e histidina (H), lisina (K) y arginina (R); 45 asparagina (N) y glutamina (Q); fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden realizarse en, por ejemplo, las regiones que flanquean las regiones hipervariables responsables principalmente de las características de unión selectivas y / o específica de la molécula, así como otras partes de la molécula, por ejemplo, el casete de la cadena pesada variable. 50 Cada dominio de los anticuerpos de la presente invención puede ser un anticuerpo completo con el dominio variable de la cadena pesada o ligera o puede ser un equivalente funcional o un mutante o derivado de un dominio de origen natural o un dominio sintético construido, por ejemplo, in vitro usando una técnica tal como una descrita en el documento WO 93/11236 (Griffiths et al.). Por ejemplo, es posible unir los dominios correspondientes a los dominios variables del anticuerpo, que carecen de al menos un aminoácido. El rasgo característico importante es la capacidad 55 de cada dominio para asociarse con un dominio complementario para formar un sitio de unión al antígeno. De acuerdo con lo anterior, no debe interpretarse que los términos fragmento variable de cadena pesada excluyen las variantes que no tienen un efecto material sobre la especificidad. En una realización preferida, los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención son anticuerpos humanos que exhiben una o más de las siguientes propiedades. 1) los anticuerpos se unen al dominio externo del IGF-IR e inhiben la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR. La inhibición se puede determinar mediante, por ejemplo, un ensayo de unión directa usando receptor purificado o unido a la 5 membrana. En esta realización, los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, se unen preferentemente al IGF-IR con al menos la misma fuerza que los ligandos naturales del IGF-IR (IGF-I e IGF-II). 2) Los anticuerpos neutralizan el IGF-IR. La unión del ligando, por ejemplo IGF-I o IGF-II, a un dominio extracelular externo del IGF-IR estimula la autofosforilación de la subunidad beta y la fosforilación de los sustratos de IFG-IR, incluyendo MAPK, Akt e IRS-1. 10 La neutralización de of IGF-IR incluye la inhibición, disminución, inactivación y/o alteración de una o más de estas actividades, normalmente asociadas con la transducción de señal. Además, esto incluye la inhibición de heterodímeros de IGF-IR /IR, así como homodímeros de IGF-IR. Por tanto, la neutralización del IGF-IR tiene varios efectos, incluidos inhibición, disminución, inactivación y/o alteración del crecimiento (proliferación y diferenciación), angiogénesis (reclutamiento de los vasos sanguíneos, invasión y metástasis) y motilidad celular y metástasis 15 (adhesión y capacidad de invasión de las células). Una medida de la neutralización del IGF-IR es la inhibición de la actividad tirosina cinasa del receptor. La inhibición de la actividad tirosina cinasa se puede determinar usando procedimientos bien conocidos; por ejemplo midiendo el nivel de autofosforilación del receptor de la quinasa recombinante y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. Por tanto, los ensayos de fosforilación son útiles en la determinación de anticuerpos neutralizantes en el 20 contexto de la presente invención. La fosforilación se puede detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo específico de la fosfotirosina en un ensayo ELISA o en una transferencia de tipo Western Algunos ensayos para la actividad tirosina quinasa se describen en Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433 - 44 (1997) y Batley y col., Life Sci. 62:143 - 50 (1998). Los anticuerpos de la invención producen una disminución en la fosforilación de la tirosina del IGF-IR de al menos aproximadamente un 75%, preferentemente al menos aproximadamente un 85% y, más 25 preferentemente, al menos aproximadamente un 90% en las células que responden al ligando. Otra medida de neutralización del IGF-IR es la inhibición de la fosforilación de los sustratos cadena debajo de IGF-IR. De acuerdo con esto se puede medir el nivel de fosforilación de MAPK, Akt, o IRS-1. La disminución de la fosforilación del sustrato es de al menos aproximadamente un 50 %, preferentemente al menos aproximadamente un 65 %, más preferentemente de al menos aproximadamente un 80%. 30 Además, se pueden usar procedimientos para la detección de la expresión de proteínas para determinar la neutralización del IGF-IR , en los que la actividad tirosina cinasa de la IGF-IR. Estos procedimientos incluyen imunohistoquímica (IHQ) para la detección de la expresión de proteínas, hibridación con fluorescencia in situ (FISH) para la detección de la amplificación génica, ensayos de unión competitiva con radioligando, técnicas de transferencia en matriz sólida, tales como transferencias Northern y Southern, reacción en cadena de la polimerasa 35 con transcriptasa inversa (RT-PCR) y ELISA. Véase, por ejemplo, Grandis y col., Cancer, 78:128 - 492 (1996); Shimizu y col., Japan J. Cancer Res., 85:567 - 71(1994); Sauter y col., Am. J. Path., 148:104753 (1996); Collins, Glia, 15:28996 (1995); Radinsky y col., Clin. Cancer Res. 1:19 - 31 (1995); Petrides y col., Cancer Res. 50:393439 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res. 17:441926 (1997); Wikstrand y col., Cancer Res. 55:3140 - 48 (1995). También se pueden usar ensayos in vivo para determinar la neutralización del IGF-IR. Por ejemplo, mediante 40 ensayos con mitógenos se puede observar inhibición de la tirosina cinasa del receptor usando líneas celulares estimuladas con el ligando del receptor en presencia y ausencia de inhibidor. Por ejemplo, se pueden usar células MCF7 (Colección Americana de CULTIVOS Tipo (ATCC), Rockville, MD) estimuladas con IGF-I o IGF-II para investigar la inhibición del IGF-IR. Otro procedimiento implica analizar la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan IGF-IR o células transfectadas para expresar IGF-IR. También se puede observar inhibición 45 usando modelos tumorales, por ejemplo células tumorales humanas inyectadas en un ratón. La presente invención no está limitada por ningún mecanismo concreto de neutralización del IGF-IR. Los anticuerpos anti-IGF-IR de la presente invención se pueden unir externamente al receptor del EGF de la superficie celular, bloquear la unión del ligando (p. ej., IGF-I o IGF-II) y la posterior transducción de la señal medida por la tirosina cinasa asociada al receptor y prevenir la fosforilación del IGF-IR y otras proteínas cadena abajo en la cascada de la 50 transducción de señal. 3) Los anticuerpos modulan por disminución el IGF-IR. La cantidad de IGF-IR presente sobre la superficie de una célula depende de la producción, internalización y degradación de la proteína receptora. La cantidad de IGF-IR presente sobre superficie de una célula se puede medir de forma indirecta detectando internalización del receptor o una molécula unida al receptor. Por ejemplo, la internalización del receptor se puede medir poniendo en contacto 55 células que expresan IGF-IR con un anticuerpo marcado. Después, el anticuerpo unido a membrana se raspa, recoge y cuenta. El anticuerpo internalizado se determina lisando las células y detectando el marcador en los lisados. Otro modo es medir directamente la cantidad del receptor presente sobre la célula siguiendo el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR u otra sustancia, por ejemplo mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia de células teñidas para la expresión en superficie del IGF-IR. Las células teñidas se incuban a 37ºC y la intensidad de fluorescencia se mide en el tiempo. Como control, parte de la población teñida se puede incubar a 4ºC (condiciones bajo las cuales se detiene la internalización del receptor). 5 Como se describe en los ejemplos, el IGF-IR de la superficie celular se puede detectar y medir usando un anticuerpo diferente que sea específico de IGF-IR y que no bloquea ni compite con la unión del anticuerpo que se está analizando. (Burtrum, y col., Cancer Res. 63:891221 (2003)) El tratamiento de una célula que expresa IGF-IR con un anticuerpo de la invención tienen como resultado la reducción del IGF-IR en la superficie celular. En una realización preferida, la reducción es de al menos aproximadamente un 70%, más preferentemente al menos aproximadamente 10 un 80% e incluso más preferentemente al menos al menos aproximadamente un 90% en respuesta al tratamiento con un anticuerpo de la invención. Se puede observar una disminución significativa en tan solo cuatro horas. Otra medida de la modulación por disminución es la reducción de la proteína receptora total presente en una célula y releja la degradación de los receptores internos. De acuerdo con lo anterior, el tratamiento de células (en particular células cancerosas) con anticuerpos de la invención tiene como resultado una reducción del IGF-IR celular total. En 15 una realización preferida, la reducción es de al menos aproximadamente un 70%, más preferentemente de al menos aproximadamente un 80% e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente un 90%. Los anticuerpos de la invención se unen al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10 M o menor, preferentemente de aproximadamente 1 x 10-10 M o menor y, más preferentemente de aproximadamente 3 x 10-11 M o menor. 20 En una realización de la invención, los anticuerpos inhiben el crecimiento del tumor. Por ejemplo, se pueden establecer tumores de xenoinjerto subcutáneos mediante inyección de células de una línea celular de cáncer en un ratón inmunodeficiente. Después, los ratones se tratan mediante inyección intraperitoneal de anticuerpos, por ejemplo, cada tres días, y el tamaño del tumor se mide a intervalos regulares. En comparación con las inyecciones de control, los anticuerpos de la invención inhiben el crecimiento del tumor. En una realización preferida, un 25 anticuerpo de la invención estimula la regresión del tumor cuando se combina con un agente antineoplásico. Adicionalmente, como se ilustra más adelante, en una realización más preferida, los anticuerpos de la invención que estimulan la regresión del tumor cuando se usa en monoterapia. Con estimulación de la regresión del tumor se entiende que la administración de una cantidad eficaz de anticuerpo, o una cantidad eficaz de una combinación de un anticuerpo y un agente neoplásico tiene como resultado una reducción del tamaño o la necrosis del tumor. En 30 una realización preferida de la invención, la regresión del tumor se puede observar y continuar durante un período de al menos aproximadamente 20 días, más preferiblemente al menos aproximadamente 40 días, más preferiblemente al menos aproximadamente 60 días. La regresión del tumor se puede medir como un promedio de un grupo de sujetos sometidos a un régimen de tratamiento particular, o se puede medir mediante el número de sujetos en un grupo de tratamiento en el que los tumores remiten. 35 Los anticuerpos preferidos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, son anticuerpos humanos que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco y / o seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID Nº 14, SEC ID Nº1 6, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 22, SEC ID Nº 24, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 28 y SEC ID Nº 30. Preferentemente, los anticuerpos (o fragmentos del mismo) de la presente invención tienen CDR de las SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 16 and SEC ID Nº 18. Como alternativa y también 40 preferentemente, los presentes anticuerpos, o fragmentos de los mismos, tienen CDR de SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 22 and SEC ID Nº 24. Como alternativa, y también preferentemente, los presentes anticuerpos, o fragmentos de los mismos, tienen CDR de SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 28 and SEC ID Nº 30. Las secuencias de aminoácidos de las CDR se exponen más adelante en la Tabla 1. TABLA 1 45

Cadena pesada (2F8/A12)

CDR1: SYAIS SEC ID Nº 14

CDR2: GIIPIFGTANYAQKFQG SEC ID Nº 16

CDR3: APLRFLEWSTQDHYYYYYMDV SEC ID Nº 18

Cadena ligera (2F8)

CDR1: QGDSLRSYYAS SEC ID Nº 20

CDR2: GKNNRPS SEC ID Nº 22

CDR3: NSRDNSDNRLI SEC ID Nº 24

Cadena ligera (A12)

CDR1: QGDSLRSYYAT SEC ID Nº 26

CDR2: GENKRPS SEC ID Nº 28

CDR3: KSRDGSGQHLV SEC ID Nº 30

En otras realizaciones, los presentes anticuerpos, o fragmentos de los mismos, pueden tener una región variable de la cadena pesada de SEC ID Nº 2 y/o una región variable de la cadena ligera seleccionada de las SEC ID Nº 6 o SEC ID Nº 10. El IMC-A12 es un anticuerpo particularmente preferido de la presente invención. Este anticuerpo tiene regiones estructurales de VH y VL (FW) además de CDR. El dominio variable VH de IMC-A12 (SEC ID Nº 2) tiene tres 5 CDR que corresponden a las SEC ID Nº 14, 16, and 18 y el dominio VL (SEC ID Nº 10) tiene tres CDR correspondientes a las SEC ID Nº 26, 28 y 30. IMC-2F8 es otro anticuerpo preferido de la presente invención. Este anticuerpo también tiene regiones marco de VH y VL (FW) y CDR. El dominio variable de VH de IMC-2F8 es idéntico al dominio variable de VH de IMC-A12. El dominio VL de IMC-2F8 (SEC ID Nº 6) tiene tres CDR correspondientes a las SEC ID Nº 20, 22 y 24. 10 En otra realización, los anticuerpos de la invención compiten por la unión a IGF-IR con IMC-A12 y/o IMC-2F8. Es decir, los anticuerpos se unen al mismo epítopo solapante o similar. La presente invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, descritos anteriormente. La invención incluye ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica uno, dos, tres, cuatro, cinco y / o las seis CDR como se expone en la Tabla 2. 15 TABLA 2

Cadena pesada (2F8/A12)

CDR1: agctatgcta tcagc SEC ID Nº 13

CDR2: SEC ID Nº 15

CDR3: SEC ID Nº 17

Cadena ligera (2F8)

CDR1: caaggagaca gcctcagaag ctattatgca agc SEC ID Nº 19

CDR2: ggtaaaaaca accggccctc a SEC ID Nº 21.

CDR3: aactcccggg acaacagtga taaccgtctg ata SEC ID Nº 23

Cadena ligera (A12)

CDR1: caaggagaca gcctcagaag ctattatgca acc SEC ID Nº 25

CDR2: ggtgaaaata agcggccctc a SEC ID Nº 27

CDR3: aaatctcggg atggcagtgg tcaacatctg gtg SEC ID Nº 29

Se puede preparar ADN que codifica anticuerpos humanos mediante recombinación de ADN que codifica las regiones constantes y las regiones variables humanas, aparte de las CDR, derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones de anticuerpo humano correspondientes y ADN que codifica las CDR derivadas de 20 ser humano (p ej., SEC ID Nº 13, 15 y 17 para las CDR del dominio variable de la cadena pesada y las SEC ID Nº 19, 21 y 23 o SEC ID Nº 25, 27 y 29 de las CDR del dominio variable de la cadena ligera). Otras fuentes adecuadas de ADN que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen cualquier célula, tal como hibridomas y esplenocitos que expresan al anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos se pueden usar por sí mismos como equivalentes de anticuerpos o se pueden recombinar en equivalentes, como se ha descrito 25 anteriormente. Las recombinaciones de ADN y otras técnicas descritas en esta sección pueden llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos. Otras fuentes de ADN son anticuerpos de cadena sencilla o Fab producidos de una biblioteca de expresión en fagos, como se conoce en la técnica. Adicionalmente, la presente invención proporciona vectores de expresión que contienen las secuencias polinucleotídicas descritas anteriormente unidas operablemente a una secuencia de expresión, un promotor y una 30 secuencia potenciadora. Se han desarrollado varios vectores de expresión para la síntesis eficaz del polipéptido de anticuerpo en sistemas procariotas, tales como bacterias, y eucariotas, incluidos, entre otros, sistemas de cultivo celular en levaduras y mamíferos. Los vectores de la presente invención pueden comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Se puede usar cualquier vector de expresión adecuado. Por ejemplo, los vectores de clonación procariotas incluyen plásmidos de E. coli, tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM y RP4. Los vectores procariotas también incluyen derivados de ADN de fago, tales como M13 y otros fagos de ADN monocatenario filamentoso. Un ejemplo de un vector útil en levaduras es el plásmido 2µ. Vectores adecuados para la expresión en células de mamífero incluyen derivados bien conocidos de SV40, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores 5 lanzadera derivadas de la combinación de vectores funcionales de mamífero, tales como los descritos anteriormente, y plásmidos funcionales y ADN de fago. En la técnica se conocen vectores de expresión eucariota adicionales (por ejemplo, P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327 - 41 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854 - 64 (1981); Kaufmann y Sharp, quot;Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary 10 DNA Gene,quot; J. Mol. Biol. 159: 601 - 21 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159: 601 - 64 (1982); Scahill et al., quot;Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells,quot; Proc. Nat’1 Acad. Sci. USA 80, 465459 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77: 4216 - 20, (1980). Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen al menos una secuencia de control de la 15 expresión que está unida operablemente a la secuencia de ADN o fragmento que se va a expresar. La secuencia control se inserta en el vector con el fin de controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonado. Ejemplos de secuencias de control de la expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema trc, las principales regiones de operador y promotor del fago lambda, la región control de la proteína de cubierta fd, los promotores glicolíticos de levadura, por ejemplo el promotor de la 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de la 20 fosfatasa ácida de levaduras, por ejemplo Pho5, los promotores de los factores de acoplamiento alfa de levaduras y los promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus y virus de simio, por ejemplo los promotores tempranos y tardíos o SV40 y las otras secuencias de las que se sabe que controlan la expresión de genes de células procarióticas y eucarióticas y sus virus, o combinaciones de las mismas. Cuando se desee expresar una construcción génica en levaduras, un gen de selección adecuado para usar en 25 levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7. Stinchcomb y col. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de daños en trpI en el genoma de la célula huésped levadura proporciona un ambiente eficaz para detectar transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las 30 cepas de levaduras deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plásmidos conocidos portadores del gen Leu2. La presente invención también proporciona células huésped recombinantes que contienen los vectores de expresión como se han descrito anteriormente. Los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar en líneas celulares distintas a los hibridomas. Se pueden usar ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica 35 un polipéptido de acuerdo con la invención, para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada. Las líneas celulares de preferencia concreta se seleccionan en base al nivel de expresión elevado, la expresión constitutiva de la proteína de interés y la contaminación mínima de las proteínas huésped. En la técnica se conocen bien líneas de células de mamífero disponibles como huéspedes e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas, tales como, entre otras, células NS0, células de ovario de cáncer chino (CHO), células de riñón de hámster neonato 40 (BHK) y muchas otras, incluyendo líneas celulares de origen linfoide tales como linfoma, mieloma o células de hibridoma. Células eucariotas adicionales adecuadas incluyen levaduras y otros hongos. Huéspedes procariotas útiles incluyen, por ejemplo, E. coli, tales como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis y Streptomyces. Estas células huésped recombinantes presentes se pueden usar para producir un anticuerpo, o fragmento del 45 mismo, cultivando las células en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo y purificando el anticuerpo o fragmento del mismo de la célula huésped o del medio que rodea a la célula huésped. Dirigir el anticuerpo expresado o fragmento para la secreción en las células huésped recombinantes se puede facilitar insertando una secuencia que codifica una señal o péptido líder secretor (véase Shokri y col., Appl Microbiol Biotechnol. 60: 654 – 64 (2003), Nielsen y col., Prot. Eng. 10:16 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 50 14:468390 (1986)) en el extremo 5’ del gen de interés que codifica el anticuerpo. Estos elementos de péptido líder secretor pueden derivar de secuencias procarióticas o eucarióticas. De acuerdo con esto se usan adecuadamente péptidos líderes secretores, siendo aminoácidos unidos al extremo N terminal de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido hacia fuera del citosol de la célula huésped y la secreción en el medio. Las células huésped transformadas se cultivan mediante procedimientos conocidos en la técnica en un medio líquido 55 que contiene fuentes asimilables de carbono (hidratos de carbono, tales como glucosa o lactosa), nitrógeno (aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares) y sales inorgánicas (sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio). El medio contiene además, por ejemplo, sustancias de estimulación del crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo hierro, cinc, manganeso y similares. 60 Otra realización para la preparación de anticuerpos en la presente invención es la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la invención en un animal transgénico que tiene insertada una porción sustancial del genoma productor de anticuerpo humano y se hace deficiente en la producción de anticuerpos endógenos. Los animales transgénicos incluyen, entre otros, ratones, cabras y conejos. Una realización adicional de la invención incluye la expresión del gen codificador del anticuerpo de en, por ejemplo, la glándula mamaria del 5 animal para la secreción del polipéptido durante la lactancia. Como se describe en los ejemplos siguientes, se pueden aislar anticuerpos anti-IGF-IR de alta afinidad de acuerdo con la presente invención a partir de una biblioteca de expresión en fagos de los genes de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera humanas. Por ejemplo, se puede obtener un dominio variable de la invención a partir de un linfocito de sangre periférica que contiene un gen reordenado de la región variable. Como alternativa se 10 pueden obtener porciones del dominio variable, tales como regiones CDR y FW, de diferentes secuencias humanas. Más del 90% de los clones recuperados después de tres rondas de selección son específicos de IGF-IR. Las afinidades de unión para IGF-IR de los Fab seleccionados pueden estar en el rango de nM, que es tan alta como muchos anticuerpos bivalentes monoclonales anti-IGF-IR producidos utilizando tecnología de hibridoma. Los anticuerpos, y fragmentos de de los mismos, de la presente invención se pueden obtener, por ejemplo, de 15 anticuerpos naturales o de bibliotecas de expresión en fagos de Fac o scFv. Los anticuerpos de dominio único se pueden obtener mediante la selección de un dominio VH o VL de un anticuerpo o hibridoma de origen natural, o se seleccionan de una biblioteca de dominios V H dominios o de una biblioteca de dominios V L. Se entiende que los residuos de aminoácidos que son determinantes principales de la unión de anticuerpos de dominio único pueden estar dentro de las CDR definidas por Kabat, pero pueden incluir también otros residuos, tales como, por ejemplo, 20 los residuos que de otro modo estarían enterrados en la interfaz VH -VL de un heterodímero VH -VL. Los anticuerpos de la presente invención también incluyen aquéllos para los que las características de unión se han mejorado mediante mutación directa, procedimientos de maduración de la afinidad, expresión e fagos o reordenamiento de cadenas. La afinidad y la especificidad se pueden mejorar o modificar a través de mutaciones de CDR y detección selectiva de sitios de unión a antígeno que tienen la características deseadas (véase, por ejemplo, 25 Yang y col., J. Mol. Biol., 254: 392 - 403 (1995)). Las CDR se mutan de diversos modos. Un modo es aleatorizar los residuos individuales o combinaciones de residuos de modo que, e una población de, por otro lado, sitios de unión a antígeno idénticos, los veinte aminoácidos se encuentran en posiciones concretas. Como alternativas, las mutaciones se inducen en un una amplia gama de residuos de CDR mediante procedimientos de PCR de tendencia a error (véase, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889 - 896 (1992)). Por ejemplo, los vectores de 30 expresión en fagos que contienen genes de la región variable de la cadena pesada y ligera se pueden propagar en las cepas mutadoras de E. coli (véase, por ejemplo, Low y col., J. Mol. Biol., 250: 359 - 368 (1996)). Estos procedimientos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por el experto en la técnica. La proteína usada para identificar los anticuerpos de unión a IGF-IR de la invención es, preferentemente, IGF-IR , y, 35 más preferentemente, es el dominio extracelular de IGF-IR. El dominio extracelular deI IGF-RI puede estar libre o conjugado con otra molécula. Los anticuerpos de la presente invención se pueden condensar a residuos de aminoácidos adicionales. Dichos residuos de aminoácidos pueden ser una cola peptídica, quizá para facilitar el aislamiento. También se contemplan otros residuos de aminoácidos para dirigir los anticuerpos a órganos o tejidos específicos. 40 En otro aspecto de la invención, los anticuerpos anti-IGF-IR o fragmentos de anticuerpos pueden unirse química o biosintéticamente a agentes antitumorales o agentes productores de señal detectable. Como se ilustra a continuación, los anticuerpos de la invención se internalizan eficazmente tras la unión a células portadoras de IGF-IR. Los agentes antitumorales unidos a un anticuerpo incluyen cualquier agente que destruye o daña un tumor a la que el anticuerpo se ha unido o en el entorno de la célula a la que el anticuerpo se ha unido. Por ejemplo, un agente 45 antitumoral es un agente tóxico tal como un agente quimioterapéutico o un radioisótopo. Los expertos en la técnica conocen los agentes quimioterapéuticos adecuados e incluyen antraciclinas (p. ej., daunomicina y doxorubicina), metotrexato vindesina neocarzinostatina, cis-platino, clorambucilo, citosina arabinósido, 5-fluorouridina, melfalán, ricina y caliqueamicina. Los agentes quimioterapéuticos se conjugan con el anticuerpo usando procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Hermentin y Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197 - 215(1988)). 50 Los agentes productores de señal detectable son útiles in vivo e in vitro para fines diagnósticos. El agente productor de señales produce una señal mensurable que se puede detectar por medios externos, por lo general la medición de la radiación electromagnética. En su mayor parte, el agente productor de señal es una enzima o cromóforo, o emite luz por fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Los cromóforos incluyen colorantes que absorben luz en la región ultravioleta o visible, y pueden ser sustratos o productos de degradación de reacciones catalizadas por 55 enzimas. La invención contempla adicionalmente anticuerpos anti-IGF-IR o fragmentos de anticuerpos de la invención a los que están unidos los restos diana o indicadores. Los restos diana son los primeros miembros de los pares de unión. Los agentes antitumorales, por ejemplo, están conjugados a los segundos miembros de dichos pares y, de este modo, están dirigidos al sitio en el que se une la proteína de unión a antígeno. Un ejemplo común de dicho par de 60 unión es avidina y biotina. En una realización preferida, la biotina se conjuga con una proteína de unión a antígeno de la invención, de este modo, proporciona una diana para un agente antitumoral u otro resto que está conjugado con avidina o estreptavidina. Como alternativa, la biotina u otro resto están unido a una proteína de unión a antígeno de la invención y se usa como indicador, por ejemplo en un sistema diagnóstico en el que un agente productor de señal detectable está conjugado a avidina o estreptavidina. 5 Los expertos en la técnica también conocen radioisótopos adecuados para usar como agentes antitumorales. Por ejemplo, se usan 131I o 211At. Estos isótopos se unen al anticuerpo usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Pedley et al., Br. J. Cancer 68, 69 - 73(1993)). Como alternativa, el agente antitumoral que se une al anticuerpo es una enzima que activa un profármaco. De este modo se administra un profármaco que permanece en su forma inactiva hasta que alcanza el sitio tumoral en el que se convierte es su forma de citotoxina una vez que se 10 administra el complejo de anticuerpo. En la práctica, el conjugado anticuerpo-enzima se administra al paciente y se deja localizar en la región del tejido que se va a tratar. Después, el profármaco se administra al paciente de un modo tal que se produce la conversión del fármaco citotóxico en la región del tejido que se va a tratar. Como alternativa, el agente antitumoral conjugado con el anticuerpo es una citocina, tale como interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El anticuerpo dirige la citocina al tumor de modo que la citocina participa en 15 el daño o la destrucción del tumor sin afectar a otros tejidos. La citocina se condensa con el anticuerpo a nivel de ADN usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Asimismo, la presente invención proporciona un procedimiento de tratar el crecimiento tumoral en un mamífero administrando al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente. La ruta de señalización de IGF-IR se ha demostrado extensamente que es un factor causal en el desarrollo de muchos tipos de 20 cáncer. Se ha demostrado que IGF-I and IGF-II son mitógenos fuertes para una amplia variedad de líneas celulares, incluyendo de próstata, de mama, de colon, de mieloma, de ovarios, de páncreas y de pulmón. Adicionalmente, se ha demostrado que las células de cáncer altamente metastásicas expresan niveles más altos de IGF-IR and IGF-II que las células tumorales menos propensas a metastatizar. Los tumores adecuados para su tratamiento de acuerdo con la presente invención expresan, preferentemente IGF-25 IR. Aunque no se pretende quedar ligado a mecanismo alguno, las enfermedades y afecciones que se pueden tratar o prevenir mediante los presentes procedimientos incluyen, por ejemplo, aquellos en los que la angiogénesis patogénica o el crecimiento tumoral se estimulan a través de un bucle paracrino y/o autocrino de IGF-IR. Por ejemplo, los tumores altamente metastásicos tienden a expresar tanto IGF-II como IGF-IR. En una realización de la invención, los anticuerpos anti-IGF-IR se pueden administrar en combinación con uno o 30 más de otros agentes antineoplásicos. Para ejemplos de terapias de combinación, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.217.866 (Schlessinger y col.). (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con agentes antineoplásicos; documento WO 99/60023 (Waksal y col. (anticuerpos anti-EGFR en combinación con radiación). Se puede usar cualquier agente antineoplásico adecuado, tal como un agente quimioterapéutico, radiación o combinaciones de los mismos. El agente antineoplásico puede ser un agente alquilante o un anti-metabolito. Ejemplos de agentes 35 alquilantes incluyen, entre otros, cisplatino, ciclofosfamida, melfalán y dacarbazina. Ejemplos de antimetabolitos incluyen, entre otros, doxorubicina, daunorubicina y paclitaxel, gemcitabina, e inhibidores de la topoisomerasa irinotecán (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, y topotecán (topoisomerasa I) y etopósido (VP-16) y tenipósido (VM-26) (topoisomerasa II). Cuando el agente anti-neoplásico es radiación, la fuente de la radiación puede ser externa (radioterapia con haz externo-EBRT) o interna (braquiterapia-BT) al paciente que se esté 40 tratando. La dosis del agente antineoplásico administrado depende de numerosos factores, incluidos, por ejemplo, el tipo de agentes, el tipo y gravedad del tumor que se esté tratando y la vía de administración del agente. No obstante, debe destacarse que la presente invención no está imitada a ninguna dosis concreta. Los agentes antineoplásicos que actualmente se conocen en la técnica o se están evaluando se pueden agrupar en diversas de estas clases, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de la mitosis, agentes alquilantes, anti-metabolitos, 45 antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de la topoisomerasa, agentes anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas y agentes antiangiogénesis. Entre estas clases, los datos notificados en el presente documento sugieren que los inhibidores de la topoisomerasa son particularmente eficaces cuando se utilizan en combinación con anticuerpos que se unen a IGF-IR. De acuerdo 50 con lo anterior, las realizaciones de la invención incluyen procedimientos en los que se administra un inhibidor de la topoisomerasa en combinación con un anticuerpo que se une a IGF-IR. Los inhibidores pueden ser inhibidores de la topoisomerasa I o de la topoisomerasa II. Los inhibidores de la topoisomerasa I incluyen irinotecán (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, topotecán. Los inhibidores de la topoisomerasa II incluyen etopósido (VP-16) y tenipósido (VM-26). En la actualidad se están evaluando otras sustancias con respecto a la actividad 55 inhibidora de la topoisomerasa y la eficacia como agentes antineoplásicos. En una realización preferida, el inhibidor de la topoisomerasa es irinotecán (CPT-11). Los anticuerpos usados en combinación son anticuerpos de la invención que se unen a IGF-IR y tienen al menos una de las propiedades siguientes: (i) inhiben la unión de IGF-I o IGF- II a IGF-IR; (ii) neutralizan la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; (iii) reducen el receptor de la superficie de IGF-IR y se unen al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 1 x 10-10 M o menos. En una realización más 60 preferida, los anticuerpos que se van a usar en combinación con un inhibidor de la topopisomerasa tienen las características de los anticuerpos humanos expuestos anteriormente. Los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención se pueden administrar con anticuerpos que neutralizan otros receptores implicados en el crecimiento tumoral o en la angiogénesis. En una realización de la invención, se usa un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con un antagonista del receptor que se une específicamente a EGFR. Particularmente preferidas son las proteínas de unión a antígeno que se unen al dominio extracelular de EGFR y bloquean la unión 5 de uno o más de sus ligandos y/o neutralizan la activación inducida por ligando de EGFR. Un antagonista de EGFR puede ser un anticuerpo que se une a EGFR o a un ligando de EGFR e inhibe la unión de EGFR a su ligando. Los ligandos del EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-α, anfiregulina, EGF de unión a la heparina (HB-EGF) y betacelulina. Se piensa que EGF y TGF-α son los principales ligandos endógenos que tienen como resultado la estimulación mediada por EGFR, aunque se ha demostrado que el TGF-α es más potente en la estimulación de la 10 angiogénesis. Debe apreciarse que el antagonista de EGFR se puede unir externamente a la porción extracelular de EGFR, que puede o no inhibir la unión del ligando, o internamente al dominio de la tirosina cinasa. Ejemplos de antagonistas del EGFR que se unen a EGFR incluyen, entre otros, moléculas biológicas, tales como anticuerpos (y equivalentes funcionales de los mismos) específicos de EGFR, y moléculas pequeñas, tales como inhibidores sintéticos de la cinasa que actúan directamente sobre el dominio citoplásmico del EGFR 15 Otro ejemplo de dicho receptor es VEGFR. En una realización de la presente invención se usa un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con un antagonista del VEGFR. En una realización de la invención, se usa un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con un antagonista del receptor que se une específicamente al receptor VEGFR-1/Flt-1. En otra realización se usa un anticuerpo anti-IGF-IR en combinación con un antagonista del receptor que se une específicamente al receptor VEGFR-2/KDR. Particularmente preferidas son las proteínas de unión a antígeno que se 20 unen al dominio extracelular de VEGFR-1 o VEGFR-2 y bloquean la unión por sus ligandos (VEGFR-2 es estimulado con más fuerza por VEGF; VEGFR-1 es estimulado con más fuerza por PlGF, pero también por VEGF) y/o neutralizan la activación inducida por ligando. Por ejemplo, IMC-1121 es un anticuerpo humano que se une y neutraliza el VEGFR-2 (documento WO 03/075840; Zhu). Otro ejemplo es el AcMo 6.12 que es un scFv que se une a VEGFR-1 soluble y expresado en la superficie de la célula. El ScFv 6.12 comprende los dominios VL y VH del 25 anticuerpo monoclonal de ratón AcMo 6.12. Una línea celular de hibridoma que produce el AcMo 6.12 se ha depositado en la ATCC número PTA-3344 según las disposiciones del Tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure y los reglamentos conforme al mismo (Tratado de Budapest). Otros ejemplos de receptores del factor de crecimiento implicados en la tumorigénesis son los receptores del factor 30 de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), el factor de crecimiento neural (NGFR) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). En una realización alternativa adicional el anticuerpo frente a IGF-IR se puede administrar en combinación con uno o más adyuvantes adecuados, tales como, por ejemplo, citoquinas (IL-10 and IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunitarios, tales como, entre otros, quimiocinas, antígeno asociados con tumores y péptidos. 35 Véase, por ejemplo, Larrivée y col., ant. No obstante, debe apreciarse que la administración de solo un anticuerpo anti-IGF-IR es suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor de un modo terapéuticamente eficaz. En una terapia de combinación, el anticuerpo anti-IGF-IR se administra antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente, así como cualquier combinación del mismo, es decir antes, durante y después o antes, durante y después de comenzar la terapia con el agente antineoplásico. Por ejemplo, el anticuerpo anti-IGF-IR se 40 puede administrar entre 1 y 30 días, preferentemente 3 y 20 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la radioterapia. En una realización preferida de la invención, la quimioterapia se administra de forma concurrente con, o, más preferentemente después, de la terapia con anticuerpos. En la presente invención, se puede usar cualquier procedimiento o vía para administrar anticuerpos anti-IGF-IR de la invención y, opcionalmente, para coadministrar agentes antineoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. Los 45 regímenes con agentes antineoplásicos usados de acuerdo con la invención incluyen cualquier régimen que se cree que es óptimamente adecuado para el tratamiento de la afección neoplásica del paciente. Diferentes neoplasias malignas pueden requerir el uso de anticuerpos antitumorales específicos y de agentes antineoplásicos específicos, que se determinará en base a cada paciente. Las vías de administración incluyen por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La dosis antagonista administrada depende de numerosos 50 factores, incluidos, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y gravedad del tumor que se esté tratando y la vía de administración de los antagonistas. No obstante, cabe destacar que la presente invención no está limitada a cualquier mecanismo o vía de administración concretos. Se debe observar que un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede administrar como conjugado, que se une específicamente al receptor y libera una carga letal tóxica tras la internalización del ligando-toxina. El conjugado 55 anticuerpo-fármaco/molécula pequeña se puede unir directamente entre sí o a través de un enlazador, péptido o no péptido. En otro aspecto de la invención, un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención se puede unir química o biosintéticamente a uno o más agentes antineoplásicos o antiangiogénicos.. La invención además contempla anticuerpos anti-IGF-IR a los que los restos diana o indicadores están unidos. Los restos diana son los primeros miembros de los pares de unión. Los agentes antineoplásicos, por ejemplo, están conjugados a los segundos miembros de dichos pares y, de este modo, están dirigidos al sitio en el que se une el anticuerpo anti-IGF-IR. Un ejemplo común de dicho par de unión es avidina y biotina. En una realización preferida, la biotina está conjugada a un anticuerpo anti-IGF-IR y, de este modo, proporciona una diana para un agente anti-5 neoplásico u otro resto, que está conjugado a avidina o estreptavidina. Como alternativa, la biotina u otro resto está unido a un anticuerpo anti-IGF-IR de la invención y se usa como indicador, por ejemplo en un sistema diagnóstico en el que un agente productor de señal detectable está conjugado a avidina o estreptavidina. Se entiende que los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención, cuando se usan en un mamífero con el fin de profilaxis o tratamiento, se administrarán en forma de una composición que además comprende un vehículo 10 farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Vehículos farmacéuticamente aceptables pueden también comprender cantidades minoritarias de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida de almacenamiento o la eficacia de las proteínas de unión. Las composiciones de la presente 15 invención se pueden, como se conoce bien en la técnica, formular de modo que proporcionen una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo tras la administración al mamífero. La presente invención también incluye kits para inhibir el crecimiento tumoral y/o la angiogénesis, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-IGF-IR humano. Los kits pueden además contener cualquier antagonista adecuado de, por ejemplo, otro receptor del factor de crecimiento implicado en la 20 tumorigénesis o la angiogénesis (p. ej.,EGFR, VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2, PDGFR, NGFR, FGFR, etc., como se ha descrito anteriormente). Como alternativa, o además, los kits de la presente invención pueden además comprender un agente antineoplásico. En el presente documento se han descrito ejemplos de agentes antineoplásicos adecuados en el contexto de la presente invención. Los kits de la presente invención pueden comprender además un adyuvante; anteriormente también se han descrito ejemplos. 25 Además, incluido en el alcance de la presente invención está el uso de los presentes anticuerpos in vivo e in vitro para procedimientos de investigación o diagnósticos, que son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos diagnósticos incluyen kits, que contienen anticuerpos de la presente invención. De acuerdo con esto, los presentes anticuerpos del receptor pueden usarse in vivo e in vitro para procedimientos de investigación, diagnósticos, profilácticos o de tratamiento, que son bien conocidos en la técnica. Por supuesto, cabe 30 entenderse y esperar que el experto en la técnica pueda realizar variaciones en los principios de la invención divulgados en el presente documento y se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de la presente invención. Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero no deben interpretarse como limitantes del 35 alcance de la invención de ningún modo. Se pueden obtener descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como los empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de genes que codifican polipéptidos en dichos vectores y plásmidos, la introducción de plásmidos en las células huésped y la expresión y la determinación de las mismas de genes y productos génicos a partir de numerosas publicaciones, incluida Sambrook, J. y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory 40 Press (1989); y Coligan, J. et al. (1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated. Selección y modificación genética de anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR humana Con el fin de aislar anticuerpos de alta afinidad al receptor de IGF-I humano, se utilizó la porción extracelular recombinante de IGF-IR humano para cribar un biblioteca de Fab en bacteriófagos humanos no expuestos anteriormente que contiene 3,7x1010 clones únicos (de Haard et al, J. Biol Chem 274:... 18218-30 (1999)). Los tubos 45 se revistieron con IGF-IR soluble (50 µg/ml) y se bloqueó con 3 % de leche/PBS a 37 grados durante 1 hora. Los fagos se prepararon cultivando un almacén de biblioteca hasta el cultivo en fase log, recatando con el fago colaborador M13K07 y amplificando durante la noche a 30 ºC en medio de cultivo 2YTAK que contiene selección de ampicilina y kanamicina. La preparación de fagos resultante se precipitó en 4 % de PEG/NaCl 0,5M y se resuspendió en 3 % de leche/PBS. Los receptores inmovilizados se incubaron después con la preparación de fagos 50 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, los tubos se lavaron 10 veces con PBST (PBS que contiene 0,1 % de Tween-20), seguido de 10 veces con PBS. El fago unido eluyó a TA durante 10 minutos con 1 ml de una solución recién preparada de trietilamina 100 mM. Los fagos eluidos se incubaron con 10 ml de células TG1 en fase medio-log a 37 ºC durante 30 minutos en equilibrio y 30 minutos en agitación. Las células TG1 infectadas se sedimentaron y se sembraron en varias placas 2YTAG grandes y se incubaron durante la noche a 30 ºC. Todas las colonias que 55 crecieron en las placas se rasparon en de 3 a 5 ml de medio 2YTA, se mezcló con glicerol (concentración final: 10 5), se alicuotó y se almacenó a -70 ºC. Para una segunda ronda de selección, se añadieron 100 µl de la reserva de fagos a 25 ml de medio 2YTAGy se cultivó hasta la fase medio-log. El cultivo se rescató con el fago colaborador M13K07, se amplificó, se precipitó y se usó para la selección siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, pero con una concentración reducida (5 µg/ml) de IGF-IR inmovilizado en tubos y aumentando el número de lavados 60 tras el proceso de unión. Se realizó un total de dos rondas de selección. Se escogieron clones TG1 individuales y se cultivaron a 37 ºC en placas de 96 pocillos y se rescataron con el fago colaborador M13K07 como se ha descrito anteriormente. La preparación del fago amplificada se bloqueó con 1/6 del volumen de 18 % de leche/PBS a TA durante 1hora y se añadió a placas de microtitulación de 96 pocillos Maxi-sorp (Nunc) revestidas con IGF-IR (1 µg/ml x 100 µl). Tras incubar a TA durante 1 hora, las placas se lavaron 3 veces con 5 PBST y se incubaron con un conjugado anti-fago M13-HRP de ratón (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Las placas se lavaron 5 veces, se añadió sustrato de TMB peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) y la absorbancia a 450 nm se leyó usando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A partir de 2 rondas de selección, el 80 % de los clones independientes fue positivo para la unión a IGF-IR. La diversidad de los clones de Fab anti-IGF-IR tras la segunda ronda de selección se analizó mediante un patrón de 10 digestión con enzimas de restricción (es decir, huella de ADN). El inserto génico de Fab de los clones individuales se amplificó mediante PCR usando cebadores: PUC 19 inverso (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'; SEC ID Nº 31) Y fdtet seq (5'-GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT-3'; SEC ID Nº 32) que son específicas de las secuencias que flanquean a las regiones únicas del gen Fab dentro del vector fago. Cada producto amplificado se digirió con una enzima de corte frecuente, BstN I, y se analizó en un gel de agarosa al 3 %. Se identificó un total de 25 patrones 15 distintos. Las secuencias de AND de clones representativos de cada patrón de digestión se determinaron mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. Los plásmidos de clones individuales que exhiben una unión positiva a IGF-IR y un perfil de ADN único se usaron para transformar un huésped de E. coli no supresor HB2151. La expresión de los fragmentos Fab en HB2151 se indujo cultivando las células en medio 2YTA que contiene isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG, Sigma) 20 a 30 ºC. Un extracto periplásmico de las células se preparó resuspendiendo el sedimento celular en Tris 5 mM (pH 7,5) que contiene sacarosa al 20 % (p/v), NaCl 200 mM, EDTA 1 mM y PMSF 0,1 mM, seguido de incubación a 4 ºC con suave agitación durante 1 hora. Tras la centrifugación a 15.000 rpm durante 15 minutos, la proteína Fab soluble se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad usando la columna de la Proteína G siguiendo el protocolo del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). 25 Los clones de Fab de unión candidatos se sometieron a detección selectiva según el bloqueo competitivo del ligando de IGF-I humano radiomarcado al IGF-IR inmovilizado (100 ng/pocillo) que revisten placas de 96 pocillos. Las preparaciones de Fab se diluyeron e incubaron con placas de IGF-IR durante 0,5 a 1 hora a temperatura ambiente en PBS/0,1 % de BSA Después se añadió 125I-IGF-I 40 pM y las placas se incubaron 90 minutos adicionales. Después, los pocillos e lavaron 3 veces con PBS/0,1 % BSA helado, se secaron y después se contaron en un 30 contador de centelleo gamma. Se seleccionaron los candidatos que exhibieron una inhibición superior al 30 % de la unión del ligando radiomarcado control en un ensayo de un punto y se determinaron los títulos de bloqueo in vitro Se identificaron cuatro clones. De estos, solo se mostró que un clon Fab 2F8 inhibía la unión al ligando en más del 50 %, con una CI50 de aproximadamente 200nM, y se seleccionó para la conversión en el formato de IgG1 de longitud completa. La secuencia de la región variable de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos traducida para 2F8 35 se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. La secuencia de AND y la secuencia polipeptídica traducida de la cadena pesada de 2F8 modificada como IgG1 de longitud completa se muestran en las Figuras 3 y 4, respectivamente. La secuenciación de Fab de 2F8 determinó que este Fab poseía una región constante de la cadena ligera lambda. La secuencia de AND y la secuencia de aminoácidos traducida de la cadena ligera 2F8 se muestran en las Figuras 5 40 y 6, respectivamente. Las secuencias para el formato de la cadena ligera lambda de longitud completa se muestran en las Figuras 7 y 8. El análisis cinético de unión se realizó en IgC 2F8 usando una unidad BIAcore. Se determine que este anticuerpo se une al IGF-IR con una afinidad de 0,5 -1 nM (0,5 - 1 x 10-9 M). Con el fin de mejorar la afinidad de este anticuerpo se generó un biblioteca de fagos de Fab de segunda generación en la que la cadena pesada de 2F8 estaba conservada y la cadena ligera se varió hasta una diversidad superior a 45 108 especies únicas. Este procedimiento se denomina barajado de la cadena ligera y se ha usado con éxito para madurar la afinidad de los anticuerpos seleccionados por un antígeno diana dado (Chames et al., J. Immunol. 169:1110 - 18 (2002)). Después, esta biblioteca se cribó para detector la unión al IGF-IR humano (10 µg/ml) siguiendo los procedimientos como se ha descrito anteriormente y el proceso de adsorción se repitió tres rondas adicionales con una concentración de IGF-IR reducida (2 µg/ml) para el enriquecimiento de los Fab de unión de alta 50 afinidad. Se analizaron siete clones tras la cuarta ronda. Los 7 contenían la misma secuencia de ADN y el mismo perfil de digestión de restricción. El único Fab aislado se designó A12 y se mostró que poseía una región constante de la cadena ligera lambda. La secuencia de AND de la cadena ligera se muestra en la Figura 9 y la secuencia de aminoácidos en la Figura 10. La secuencia de la cadena ligera lambda completa y la secuencia polipeptídica traducida se muestran en las Figuras 11 y 12, respectivamente. La comparación de la secuencia de aminoácidos de 55 las cadenas ligeras de 2F8 y A12 determinó que las dos regiones variables diferían en un total de 11 aminoácidos (consúltense las Figuras 13 y 14). Nueve de los cambios estaban presentes en las regiones CDR, estando la mayoría (6 residuos de aminoácidos) dentro de la CDR3. Una comparación de las afinidades de los dos anticuerpos (IgG completa) por el IGF-IR humano y su actividad de bloqueo de su ligando se muestra en la Tabla 3. Los resultados de la unión se determinaron mediante ELISA de 60 IGF-IR humano y representan la concentración del anticuerpo titulado necesario para alcanzar una unión del 50% respecto a la saturación. Los resultados del bloqueo representan el nivel de anticuerpos necesario para inhibir la unión del 50% del ligando 125I-IGF-I al IGF-IR humano inmovilizado. La afinidad se determinó mediante análisis BIAcore según las especificaciones del fabricante (Pharmacia BIACORE 3000). El IGF-IR soluble se inmovilizó sobre los chips de sensores y se determinó la cinética de unión al anticuerpo. 5

Tabla 3. Características de unión al anticuerpo

Anticuerpo: Unión (DE50) Bloqueo (CE50) Afinidad

2F8: 2,0 nM 3 - 6 nM KD = 6,5 x 10-10

Kon = 2,8 x 105

Koff = 1,8 x 10-4

A12: 0,3 nM 0,6 - 1nM KD = 4,1 x 10-11

Kon = 7,2 x 105

Koff = 3,0 x 10-5

Los cambios de los anticuerpos producidos en la cadena ligera de 2F8 para generar el anticuerpo A12 efectuaron una afinidad significativamente más alta de A12 por IGF-IR que 2F8. Al mismo tiempo, este aumento efectuó una capacidad mayor de unión de A12 por el receptor, como se determina mediante ELISA, y al menos un aumento de tres veces en la actividad de bloqueo del ligando para el receptor inmovilizado. La Figura 15 muestra una titulación 10 representativa de los dos anticuerpos anti-IGF-IR en el ensayo de bloqueo del receptor. La actividad de A12 permaneció igual, independientemente de si la cadena ligera se había modificado con una región constante de clase lambda o kappa humana. El anticuerpo A12 modificado con una cadena ligera de clase lambda de utilizó en todos los procedimientos posteriores. En este ensayo, A12 inhibió la unión del IGF-I radiomarcado al IGF-IR en mayor medida que la competencia con el ligando frío. La actividad de 2F8 fue comparable a la competencia con el ligando 15 frío. Esto es consistente con las afinidades relativas de los dos anticuerpos (véase la Tabla 3) y el IGF-I (0,5-1 nM). Modificación por ingeniería y expresión de anticuerpos IgG1 IGF-IR completamente humanos para los clones de Fab Las secuencias de ADN que codifican los genes de las cadenas pesada y ligera de los Fab 2F8 y A12 se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el kit Boerhinger Mannheim Expand de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores directos e inversos contenían secuencias para sitios de 20 endonucleasa de restricción para la clonación en vectores de expresión de mamíferos. El vector receptor para la cadena pesada contenía toda la secuencia de ADNc de la región constante gamma 1 humana, flanqueada por un promotor eucariota fuerte y una secuencia de poliadenilación en 3’. Las secuencias de la cadena ligera lambda de longitud completa para 2F8 o A12 se clonaron cada una en un segundo vector que posee solo los elementos reguladores eucariotas para la expresión en células de mamífero. En este vector también hay presente un marcador 25 seleccionable para la selección de los integrantes estables de ADN después de la transfección del plásmido en células de mamífero. Los cebadores directos también se modificaron con secuencias que codifican una fuerte secuencia de péptido señal de mamífero para la secreción adecuada del anticuerpo expresado. Tras la identificación de secuencias génicas de inmunoglobulina adecuadamente clonadas se secuenciaron los ADN y se analizó la expresión en una transfección transitoria. La transfección transitoria se realizó en la línea celular de primate COS7 30 utilizando lipofección, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A las 24 o 48 horas después de la transfección, se detectó la expresión de anticuerpo IgG completo en el sobrenadante del cultivo acondicionado mediante ELISA de unión a Fc anti-humano. Se prepararon placas de ELISA (96 pocillos) por recubrimiento con 100 ng / pocillo de un anticuerpo policlonal específico de Fc antihumano de cabra (Sigma) y se bloquearon con 5% de leche / PBS durante la noche a 4 ° C. Después, las placas se lavaron 5 veces con PBS. Se añadió sobrenadante 35 acondicionado a los pocillos y se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se detectó con un anticuerpo de cadena ligera lambda-HRP de cabra anti- humano (Sigma) y se visualizó con reactivos de TMB y el lector de microplacas como se ha descrito en lo que antecede. La preparación a gran escala de anticuerpos anti-IGF-IR se logró mediante transfección transitoria a gran escala en células COS, mediante ampliación del procedimiento de lipofección o mediante transfección estable en una célula huésped adecuada tal como una línea 40 celular de mieloma de ratón (NSO, Sp2 / 0) o una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). El plásmido que codifica los anticuerpos anti-IGF-IR se transfectó en células huésped mediante electroporación y se seleccionó en medio de selección de fármaco adecuado durante aproximadamente dos semanas. Las colonias seleccionadas de forma estable se seleccionaron para detectar la expresión de anticuerpos mediante ELISA anti-Fc y los clones positivos se expandieron en medio de cultivo celular libre de suero. La producción de anticuerpos a partir de células 45 transfectadas de manera estable se realizó en un cultivo en suspensión en matraces de agitación o biorreactores durante un período de hasta dos semanas. El anticuerpo generado por una transfección transitoria o estable se purificó por cromatografía de afinidad ProA (Harlow y Lane. Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press. 1988), se eluyó en una solución salina tamponada neutra, y se cuantificó. Determinación de la actividad de bloqueo del ligando de los anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR sobre células tumorales humanas Después, los anticuerpos anti-IGF-IR se analizaron para determinar el bloqueo del ligando radiomarcado en IGF-IR nativo sobre células tumorales humanas. Las condiciones de ensayo se realizaron según Arteaga y Osborne (Cancer Res. 49:6237 - 41 (1989)), con modificaciones menores. Las células de cáncer de mama humano MCF7 se 5 sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante la noche. Las monocapas subconfluentes se lavaron 2-3 veces en tampón de unión (medio Iscove / 0,1% de BSA) y el anticuerpo se añadió en tampón de unión de unión. Después de una breve incubación con el anticuerpo a temperatura ambiente, a cada pocillo se añadió 125I-IGF-I 40 pM (aproximadamente 40.000 cpm/pocillo) y se incubaron durante una hora adicional con agitación suave. Después, los pocillos se lavaron tres veces con PBS / 0,1 % BSA helado. Las monocapas s e lisaron después con200 µl de 10 NaOH 0,5N y se contaron en un contador gamma. Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 16. En células tumorales humanas, el anticuerpo A12 inhibió la unión del ligando al IGF-IR con una CI50 de3 nM (0,45 µg/ml). Esta fue ligeramente menor que la actividad inhibidora del ligandos IGF-I frío (CI50 = 1 nM), per mejor que la actividad inhibidora del IGF-II frío (ci50 = 9 nM). Las diferencias observadas para los dos ligandos de IGF probablemente se puedan atribuir a la cinética de unión más lenta de IGF-II por IGF-IR que el ligando IGF-I (Jansson 15 et al., J. Biol. Chem. 272:8189 - 97 (1997). Se determinó que la CI50 para el anticuerpo 2F8 era 30 nM (4,5 µg/ml). Después, se determine la actividad de bloqueo del ligandos IGF-I del anticuerpo A12 en varios tipos de tumores humanos diferentes, Los resultados se muestran en la Tabla 4.El anticuerpo A12 fue eficaz en la unión al IGF-IR celular endógeno y en la inhibición de la unión del ligando a una serie de tipos de tumores humanos, incluyendo líneas celulares de tejido de mama, páncreas y colorrectal. 20

Tabla 4. Actividad inhibidora del anticuerpo A12 sobre la unión de IGF-I a diferentes tipos de tumores humanos

Línea celular: Tipo de célula CI50 de bloqueo

MCF7: mama 3 nM

T47D: mama 6 nM

OV90: ovarios 6 nM

BXPC3: pancreático 20 nM

HPAC: pancreático 10 nM

HT-29: colorrectal 10 nM

SK-ES1: sarcoma de Ewing 2 nM

: mieloma 20 nM

El IGF-IR comparte una considerable homología con el receptor de la insulina (IR). Para determinar si los anticuerpos anti-IGF-IR eran específicos de este IGF-IR y no bloqueaban la unión a la insulina se realizó un ensayo de bloqueo a base de células con células de cáncer de mama ZR-75i humanas. Debido a que la insulina puede unirse a IGF-IR, aunque con una afinidad tres órdenes de magnitud menor que para el IR, se utilizó la línea de 25 cáncer de mama humano ZR-75I que posee una mayor proporción de IR a IGF-IR en comparación con las células MCF7. Mediante el uso de esta línea, se razonó que la unión de la insulina a las células a la insulina sería más indicativa de unión a IR específica. El ensayo se realizó como se ha descrito anteriormente para las células MCF7 y los resultados mostrados en la Figura 17. Aunque la insulina fría fue capaz de valorar la unión de la insulina radiomarcada las células, ni 2F8 ni la alta afinidad del anticuerpo A12 bloqueaba la unión de la insulina, incluso a 30 una concentración de 200 nM de anticuerpo, consistente con la unión selectiva de estos anticuerpos a IGF-IR IR y no a IR. Inhibición mediada por anticuerpos de la mitogénesis celular dependiente de ligando Con el fin de determinar si el bloqueo de la unión de IGF-I unión a IGF-IR inhibe la proliferación celular, se realizó un ensayo mitogénico en células de cáncer de mama MCF7, células de cáncer pancreático BxPC-3 y células de cáncer 35 de colon HT-29. El ensayo se realizó de acuerdo con (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2181 - 85 (1994), con algunas modificaciones. Las células se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a 5.000-10.000 células / pocillo y se dejó que se adhirieran durante la noche. El medio se reemplazó después con medio definido sin suero y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las células se incubaron después con IGF-I con o sin anticuerpo A12 y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Después se añadió [3H] timidina 0,25 µCi a cada pocillo y se incubó durante 5 40 horas a 37 ° C. El sobrenadante se aspiró y las células se suspendieron mediante tripsinización durante 5 minutos. Las células se recogieron después sobre un filtro y se lavaron tres veces con agua, usando un recolector de células. Después de secar, el filtro se procesó para leer en un contador de centelleo. Los resultados se muestran en las Figuras 18 A, B y C (MCF7, BxPC-3 y HT-29, respectivamente). Los puntos de datos de IGF-I muestran la titulación del ligando para determinar la cantidad necesaria para lograr la máxima respuesta mitogénica . En la medición de la 45 actividad del anticuerpo A12 sobre varios tipos de células de cáncer, se añadió IGF-I a una concentración de 5 nM y el anticuerpo se tituló desde 200 nM a 0,05 nM. El anticuerpo A12 inhibió la mitogénesis de MCF7 en respuesta al ligando IGF-I de una forma dependiente de la dosis, con una CI50 de 6 nM. El anticuerpo A12 se analizó después para determinar la inhibición mitogénica en varias líneas de células tumorales humanas adicionales y los resultados se muestran en Tabla 5. El anticuerpo A12 fue eficaz en la inhibición de la 5 mitogénesis mediada por el ligando IGF-I de una variedad de líneas celulares de tumores humanos, incluyendo cáncer de mama, cáncer colorrectal, y mieloma múltiple.

Tabla 5. Actividad de inhibición del anticuerpo A12 sobre la mitogénesis de diferentes líneas celulares tumorales humanas

Línea celular: Tipo de célula CI50

MCF7: mama 6 nM

T47D: mama 7 nM

BT474: mama 5 nM

BXPC3: pancreático 2 nM

HT-29: colorrectal 6 nM

SK-ES1: sarcoma de Ewing 10 nM

: mieloma 5 nM

Inhibición mediada por anticuerpos de la fosforilación del receptor dirigida por IGF-I y la señalización aguas abajo Para visualizar el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-IGF-IR en la señalización de IGF-I se realizó un análisis de 10 la autofosforilación y la fosforilación de la molécula efectora aguas abajo en la presencia o ausencia del anticuerpo o A12 o 2F8. La línea celular de cáncer de mama humana MCF7 se seleccionó para su uso debido a su alta densidad de IGF-IR. Las células se sembraron en placas de cultivo de 10 cm de 6 pocillos y se cultivaron hasta confluencia del 70-80 %. Las monocapas se lavaron dos veces en PBS y se cultivaron durante la noche en medio definido libre de suero. Después se añadió el anticuerpo anti-IGF-IR en medio libre de suero fresco (100 nM-10 nM) y las células 15 se incubaron 30 minutos antes de la adición de ligando (10 nM). Las células se incubaron con el ligando durante 10 minutos, después introdujeron en hielo y se lavaron con PBS helado. Las células se lisaron mediante la adición de solución de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, Na3VO4 0,5 mM, 1 µg / ml de leupeptina, 1 µg / ml de pepstatina, y 1 µg / ml de aprotinina) y las células se rasparon en un tubo de centrífuga y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos. Después, el lisado se aclaró mediante centrifugación a 20 4 ° C. A continuación, el IGF-IR se inmunoprecipitó (IP) a partir del lisado. El anticuerpo 3B7 (Santa Cruz) o A12 a 1 µg/ml se incubaron con 400 µl de lisado durante la noche a 4 ºC. Después, los complejos inmunitarios se precipitaron mediante la adición de perlas de ProA-sefarosa durante 2 horas a 4 ºC, se sedimentaron y se lavaron 3 veces con tampón de lisis. Los IP unidos a las esferas de ProA se rasparon en tampón de carrera en gel desnaturalizante. El lisado o IP se procesaron para electroforesis en gel desnaturalizante y se pasaron por un gel de 25 acrilamida al 4-12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa o nylon mediante transferencia Western de acuerdo con Towbin et al. (Biotechnology 24:145 - 9 (1992)). Proteína fosforilada en tirosina se detectó en la mancha utilizando un anticuerpo anti-p-tirosina (Cell Signaling #9411) y un anticuerpo secundario anti-ratón-HRP. El IGF-IR se detectó con anticuerpo monoclonal C-20 (Santa Cruz). Para la fosforilación de Akt, la fosfo-Akt se detectó con anticuerpo # 559029 y la Akt total, con # 559028 (BD Pharmingen). Para la fosforilación de MAPK, el fosfo-p44 / 42 30 se detectó con # 9101 y p44/42 total/ 42 con # 9102 (Cell Signaling Tech.). Las bandas se visualizaron con el reactivo ECL en la película de rayos-X. Como se muestra en la Figura 19 A, l auto-fosforilación del IGF-IR en las células MCF7 se detuvo después de la privación de suero, y la adición de 2F8 o A12 solos no indujo la fosforilación del receptor, lo que demuestra una falta de actividad agonista detectable. Tras la adición de 10 nM de IGF-I, la fosforilación de IGF-IR se indujo fuertemente. 35 El anticuerpo 2F8 efectuó una reducción de aproximadamente el 50 % en la fosforilación de IGF-IR, mientras que el anticuerpo A12 de alta afinidad casi completamente bloqueó la fosforilación. Del mismo modo, el anticuerpo A12 inhibió la auto-fosforilación de IGF-IR en células HT-29 de cáncer colorrectal y BxPC-3 de cáncer de páncreas (Fig. 19B). La señalización efectora aguas abajo en respuesta a IGF-I también se inhibió mediante los anticuerpos anti-IGF -IR 40 (Fig. 20). La fosforilación de MAPK se inhibió considerablemente por acción tanto de 2F8 como de A12. . La fosforilación de la molécula de anti-apoptótica Akt fue menos sensible al bloqueo por el anticuerpo anti-IGF-IR con 2F8. Solo se efectuó una ligera reducción de la fosforilación de Akt. A12 inhibió significativamente la fosforilación de Akt, incluso a una concentración de 10 nM. El anticuerpo A12 era igualmente competentes en la inmunoprecipitación del IGF-IR solubilizado como el anticuerpo 3B7 comercial, pero A12 no fue capaz de detectar IGF-IR 45 desnaturalizado inmovilizado en membranas de nylon después de la transferencia de tipo western. Análisis de la unión por FAC del anticuerpo monoclonal A12 a las líneas de células tumorales. Dado que A12 fue capaz de inmunoprecipitar el IGF-IR endógeno, los inventores se interesaron en determinar si A12 también podría usarse como anticuerpo de detección de células activadas por fluorescencia (FACS). Líneas celulares de tumores humanos se cultivaron, se rasparon en PBS enfriado en hielo, y se contaron. El anticuerpo 5 primario, A12 (0,5 μg), se añadió a aproximadamente 5 millones de células en 250 µl de PBS / 5% de FBS y se incubaron en hielo durante 1 hora. Después, las células se diluyeron hasta 3 ml en PBS / FBS al 5%, se sedimentaron y se aspiró el sobrenadante. Después se añadió el fragmento F(ab)2 de IgG anti-humana de cabra marcada con ficoeritrina (PE) secundaria en 250 µl PBS/5 % de FBS a 1:200 y se incubó en hielo durante 60 minutos. A continuación, las células se diluyeron de Nuevo y se sedimentaron, como antes, después se 10 resuspendieron en 500 µl de PBS/5 % de FBS. A continuación, el análisis FACS se realizó en una unidad Epics XL (Coulter). , Como se muestra en la Fig. 21, el anticuerpo A12 cambió totalmente la línea celular de cáncer de mama humano MCF7 y la leucemia humana línea celular HEL. Fibroblastos DE embrión de ratón negativos para IGF-IR (células R) (obtenidos a partir de R. Baserga, Thomas Jefferson University, Filadelfia, PA) sirvieron como control negativo. A12 no pudo unirse a estas células, indicativo de la especificidad de unión del anticuerpo por el IGF-IR. No 15 obstante, A12 sí se unió y desplazó parcialmente la línea de células tumorales de ratón de carcinoma de pulmón de Lewis, lo que sugiere que este anticuerpo IGF-IR anti-humano posee cierta reactividad cruzada para el IGF-IR de ratón. Internalización del receptor de IGF-I tras la unión del anticuerpo A12 Se ha demostrado que el anticuerpo A12 se une al IGF-IR nativo sobre células tumorales humanas con alta afinidad. 20 El anticuerpo A12 se marcó con yodo radioactivo con 125 yodo usando esferas de YODO (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Las células del cáncer de mama humano MCF7 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante la noche hasta un 50% de confluencia. Se añadió un microgramo de 125 I-A12 a cada pocillo y se incubó a 37 ° C o se mantuvo en hielo a 4 ° C. Las placas se incubaron durante 30 minutos, 90 minutos, o 180 minutos y cada punto de tiempo se realizó por triplicado. El cultivo a 4 ° C se mantuvo durante 180 minutos. En cada 25 punto de tiempo, los pocillos se lavaron 1x con PBS, después se destilaron durante 5 minutos con glicina 100mM -HCl, urea 2 M, pH 2,5. El material raspado, que representa el anticuerpo unido a la membrana, se mantuvo en hielo para el recuento. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS y las células se solubilizaron con NaOH 1N/ 1% de TritonX100. La fracción solubilizada representó el anticuerpo internalizado. Las fracciones raspadas y solubilizados se leyeron en un contador gamma y se representaron con la desviación estándar. Como se muestra en la Fig. 22, el 30 nivel de radiactividad internalizada aumentó con el tiempo en las células cultivadas a 37 ° C, mientras que poca captación se observó en células mantenidas a 4 ° C, en las que el transporte de membrana debe estar muy retrasado. Esto demostró que, tras la unión a IGF-IR, el anticuerpo A12 se internaliza rápidamente, lo que conduce potencialmente a una depleción del receptor unido a la superficie. La densidad del receptor de la superficie IGF-IR se determinó mediante FACS. Las células MCF 7 adherentes se 35 trataron durante 4 horas con anticuerpo A12 50 nM de de IGF-I a 37 ° C. Las células se lavaron en PBS enfriado con hielo / 5% de BSA dos veces, y 1 x I0 6 células se dividieron en partes alícuotas a tubos de tinción y se colocaron en hielo. Después, un anticuerpo monoclonal de ratón no bloqueante específico de IGF-IR alfa-polipéptido (Ab-1, NeoMarkers, Fremont, CA), se incubó con las células a 4 ° C durante 2 horas. Después de lavados con PBS / BSA, las células se incubaron con anti-IgG de ratón. Después de lavar con PBS/BSA, las células se analizaron mediante 40 ensayo de clasificación celular activada por fluorescencia usando citómetro de flujo FACSvantage SE (BD Bioscience). Como se muestra en la Fig. 22b, la exposición a A12 resultó en una reducción significativa en la intensidad de fluorescencia de las células MCF7, indicativo de una modulación por disminución del receptor de la debido a la internalización. La relación calculada entre la intensidad media de fluorescencia media indicó una reducción en la tinción de superficie de IGF-IR del 90% después de la incubación con A12. Este desplazamiento no 45 se observó cuando las células se incubaron con A12 a 4 ° C, coherente con un proceso de internalización del receptor mediada por anticuerpos dependiente de la energía. La exposición de las células a IGF-I no causó un cambio significativo en la intensidad de fluorescencia del IGF-IR de superficie, en consonancia con el análisis de transferencia de tipo Western que muestra poco efecto de ligando sobre la degradación del IGF-IR. El IGF-IR celular total se determinó en células HT-29 y BxPC-3 en respuesta al tratamiento con IGF-I o A12. Como 50 se muestra en la Fig. 22c, la adición de IGF-I a los cultivos en crecimiento no tuvo ningún efecto sobre la expresión de IGF-IR. En contraste, la adición de anticuerpo A12 resultó en una intensa disminución de los niveles de IGF-IR en las células después de 3-6 horas. Inhibición del crecimiento de los tumores colorrectales humanos, solos o en combinación con irinotecán (CPT-11). Los inventores estaban interesados en determinar si los anticuerpos anti-IGF-IR eran capaces de inhibir el 55 crecimiento de tumores humanos in vivo en un modelo de xenoinjerto de ratón atímico. Los tumores se indujeron ratones atómicos (nu / nu) de 3 – 4 semanas de edad mediante inyección subcutánea de 2-3 millones de células de cáncer colorrectal HT-29 humanas viables en medio de cultivo celular. Se dejó que los tumores se establecieran y se inició el tratamiento con el anticuerpo cuando el volumen del tumor alcanzó 200 mm 3. En diez animales se inyectaron células tumorales por grupo de tratamiento. El anticuerpo se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) cada tres 60 días a 1 mg o 0,5 mg en 0,5 ml de TBS. El fármaco irinotecán (CPT-11) (LKT Laboratorios) se inyectó i.p. (100 mg / kg) una vez a la semana durante cuatro semanas desde el inicio del tratamiento con el anticuerpo. Los animales de control recibieron un anticuerpo de tipo IgG humano irrelevante de clase equivalente. Los tumores se midieron a intervalos regulares usando compás Vernier, se realizaron mediciones de la altura, anchura, y la longitud y se calcularon para determinar el volumen total del tumor. El estudio se terminó cuando los tumores control alcanzaron 5 3000 mm3. Como se muestra en la Fig. 23, las dosis del anticuerpo 2F8 a 0,5 mg o 1 mg cada tres días efectuaron una inhibición significativa (P lt;0,05) del crecimiento tumoral en este modelo. No hubo diferencia estadística entre los tamaños de los tumores de los grupos tratados con 0,5 o 1 mg de 2F8 y las respuestas fueron similares a las del tratamiento con CPT-11 solo. Cuando se administró 2F8 y CPT-11 juntos, la combinación dio como resultado una mayor inhibición del crecimiento del tumor (72% de disminución), lo que demuestra que la terapia anti-IGF-IR podría 10 potenciar la actividad anti-tumoral del agente quimioterapéutico CPT-11 sobre el crecimiento tumoral. Actividad antitumoral del anticuerpo A12 sobre tumores colorrectales humanos in vivo. El anticuerpo A12 posee un afinidad 10 veces mayor por el IGF-IR que el anticuerpo 2F8. Dado que se observó una inhibición tumoral significativa in vivo con el anticuerpo 2F8, los inventores investigaron la actividad de A12 sobre el crecimiento de la línea de cáncer colorrectal humana HT-29 en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los tumores se 15 indujeron como se ha descrito anteriormente y se estableció tratamiento con anticuerpos en once tumores (tamaño de 200 mm3). Después, el tratamiento con anticuerpo se administró a una concentración de 1 mg, 100 µg, o 10 µg cada tres días durante todo el experimento. Se usaron diez animales por grupo de tratamiento y los animales control recibieron un anticuerpo control de tipo UgG de clase equivalente. Como se muestra en la Fig. 24, el anticuerpo A12 efectuó una reducción del 74% en el crecimiento del tumor en comparación con el control (P lt;0,05). Esto demostró 20 que A12 era eficaz como una sola terapéutica en la inhibición deL crecimiento del tumor colorrectal en este modelo de xenoinjerto. En este experimento se observó un claro efecto de respuesta a la dosis. También se observó una actividad antitumoral con una dosis de 100 µg de A12. Actividad del anticuerpo A12 sobre el cáncer de mama humano in vivo en un modelo tumoral de xenoinjerto El anticuerpo A12 exhibió una fuerte actividad inhibidora sobre la estimulación mitogénica dependiente de IGF y la 25 proliferación de las células MCF7 in vitro. Con el fin de evaluar su actividad sobre el crecimiento del tumor MCF7 in vivo, se utilizó un modelo de tumor de xenoinjerto de ratón. Las células MCF7 se aislaron originalmente de un tumor humano dependiente de estrógenos y requieren estrógeno añadido exógenamente para el mantenimiento y el crecimiento in vivo. En ratones desnudos se implantaron gránulos de de estrógeno biodegradables (0,72mg de 17-β-estradiol / gránulo, liberación de 60 días). Además, en el momento de la inyección subcutánea de células tumorales, 30 también se inyectó en los ratones por vía subcutánea en el flanco derecho 0,5 mg de estradiol en una suspensión de 50 µl de aceite de semilla de sésamo. Se dejó que los tumores se es establecieran a un tamaño de aproximadamente 150 mm3 antes de iniciar el tratamiento con anticuerpos. El anticuerpo se inyectó a dosis de 1 mg, 100 µg, y 10 µg, cada tres días y continuó durante todo el experimento. A los 29 días, el tratamiento de los animales con 1 mg de A12 produjo una reducción del 89% en el crecimiento tumoral (Fig. 25). Fue evidente un crecimiento 35 mínimo para los tumores establecidos en este grupo de tratamiento. Se observó una respuesta dependiente de la dosis para los tratamientos con A12 en este modelo. El estudio demostró que A12 era eficaz para reducir significativamente el crecimiento de una línea celular de cáncer de mama humano in vivo. Además, con el tratamiento con el anticuerpo solo A 1 mg / dosis se observó la regresión del tumor y continuó hasta el final del estudio (50 días). 40 Eficacia de A12 en combinaciones con CPT-11 o gemcitabina en xenoinjertos de carcinoma pancreático BxPC-3 En ratones atímicos nu / nu se inyectó por vía subcutánea 2 x 106 de células de carcinoma de páncreas humano BxPC-3 mezcladas 1: 1 con Matrigel. Veinte días más tarde, cuando los tumores alcanzaron 200-300mm3 , los ratones fueron aleatorizados y divididos en grupos de tratamiento: 1) control de TBS; 2) AcMo A12 a 1 mg / dosis, 3 veces a la semana; 3) 1 mg de irinotecán, una vez cada 7 días; 4) AcMo A12 + irinotecán; 5) 2,5 mg de gemcitabina, 45 una vez cada 7 días; 6) AcMo A12 + gemcitabina. Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal. Las medidas de los tumores se registraron dos veces a la semana utilizando la fórmula: Volumen = (π/6) l x w2. El día 18 se sacrificó a tres animales por grupo y los tumores se reseccionaron para su evaluación histológica media. El tratamiento y las mediciones de los tumores continuaron en los animales restantes hasta el día 44 con la 50 excepción del grupo TBS. Este grupo de control fue sacrificado el día 37 debido a la ulceración del tumor y necrosis. Al final del estudio se registraron las medidas del tumor final, se sacrificó a los animales y en cuatro por grupo se extirparon los tumores para su evaluación histológica de punto final. Los tumores BxPC-3 eran muy sensibles al AcMo A12 y 2 de ocho animales sufrieron regresiones parciales de los tumores después cinco semanas de tratamiento. La respuesta de los tumores BxPC-3 a irinotecán o a gemcitabina 55 de forma individual fue comparable a la del anticuerpo, pero no hubo regresiones tumorales. El anticuerpo A12, cuando se combinó con irinotecán o gemcitabina fue más eficaz que cualquier agente de forma individual (Fig. 26), siendo irinotecán + AcMo A12 la combinación más eficaz. Para la combinación de A12 e irinotecán, tres de los nueve animales presentaron regresiones tumorales parciales. Sin embargo, no se produjeron regresiones tumorales entre los animales que recibieron irinotecán. (Tabla 5). 60 Tabla 5. Inhibición del crecimiento de xenoinjertos BxPC-3 AcMo A12 irinotecán AcMo A12 + irinotecán Gemcitabina AcMo A12 + Gemcitabina Día T/C % Regresiones* T/C % Regresiones T/C % Regresiones T/C % Regresiones T/C % Regresiones 19 57 2 / 12 52 0 / 12 40 3 / 12 68 0 / 11 44 0 / 12 23 49 2 / 9 45 0 / 8 32 3 / 9 65 0 / 8 42 1 / 9 26 40 2 / 9 35 0 / 8 26 3 / 9 58 0 / 8 37 1 / 9 30 40 2 / 8 34 0 / 8 22 3 / 9 56 0 / 8 36 1 / 9 32 39 2 / 8 34 0 / 8 19 3 / 9 48 0 / 8 31 1 / 9 37 30 2 / 8 26 0 / 8 15 3 / 9 37 0 / 8 24 1 / 9 41 - 2 / 8 - 0 / 7 - 3 / 8 0 / 8 - 1 / 8 44 - 2 / 8 - 0 / 7 - 3 / 8 0 / 7 - 0 / 6 T/C % es la inhibición del crecimiento tumoral con respecto al control *regresiones definidas como volúmenes tumorales individuales lt; día 1 del tratamiento Eficacia de A12 en combinación con CPT-11 o paclitaxel en xenoinjertos de cáncer colorrectal HT-29 En ratones hembra atímicos nu / nu se inyectaron por vía subcutánea una suspensión de células de carcinoma de colon humano HT-29 a 5 x 106 células en 0,4 ml mezclados a 1: 1 con Matrigel. Cuando los tumores alcanzaron ~ 200 mm 3, se aleatorizó a los ratones y se les dividió en grupos de tratamiento: 1) control de TBS; 2) AcMo A12 a 1 mg / dosis, 3 veces a la semana; 3) 2 mg de irinotecán, una vez cada 7 días; 4) AcMo A12 + irinotecán; 5121 µg de 5 paclitaxel en 0,2 ml una vez cada 7 días; 6) AcMo A12 + paclitaxel. Todos los tratamientos se administraron mediante inyección intraperitoneal. El tratamiento continuó durante seis semanas y las medidas de los tumores se registraron dos veces a la semana utilizando la fórmula: Volumen = (π/6) l x w2. El día 21 se sacrificó a cuatro animales por grupo y los tumores se reseccionaron para su evaluación histológica. El tratamiento y las mediciones de los tumores continuaron en los 10 animales restantes hasta el día 40. En ese momento se registraron mediciones tumorales finales, se sacrificó a los animales y en cuatro se extirparon los tumores para la evaluación histológica de punto final. El AcMO A12, CPT-11, o paclitaxel en monoterapia inhibieron significativamente (p lt;0,02) el crecimiento de los xenoinjertos de HT-29 en comparación con el grupo de control TBS (Fig. 27). La terapia de combinación del AcMo A12 con CPT-11 o paclitaxel mostró una inhibición significativa (p lt;0,003) en el crecimiento tumoral en comparación 15 con cualquiera de los tratamientos por separado. No se observaron regresiones tumorales en los grupos de terapia individual. Los tumores de control in situ parecían muy vascularizados el día 22 como lo hicieron los grupos de terapia única el día 40. Sin embargo, la terapia de combinación con CPT-11 + AcMo A12 resultó en regresiones tumorales parciales en seis de los ocho animales, y la terapia de combinación con paclitaxel y AcMo A12 tuvo como resultado regresiones en tres de los ocho animales. 20

Tabla 6. Inhibición del crecimiento de xenoinjertos HT-29

: AcMo A12 CPT-11 paclitaxel A12 + CPT-11 A12 + paclitaxel

Día: T/C % T/C % T/C % T/C % Regresiones* T/C % Regresiones





: 0 / 12 1 / 12





: 0 / 12 3 / 12





: 3 / 12 5 / 12





: 4 / 8 4 / 8





: 6 / 8 3 / 8





: 6 / 8 3 / 8





: 5 / 8 3 / 8





: 5 / 8 2 / 8





: 2 / 6 2 / 8

T/C % es la inhibición del crecimiento tumoral con respecto al control *Regresiones definidas como volúmenes tumorales individuales lt; día 1 del tratamiento

Se entiende y se espera que un experto en la técnica puede hacer variaciones en los principios de la invención descritos en el presente documento y se pretende incluir tales modificaciones han dentro del alcance de la presente invención. lt;110gt; ImClone Systems Incorporated 25 lt;120gt; Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina humana lt;130gt; 11245/53276 lt;140gt; pendiente de asignación lt;141gt; 2004-05-03 30 lt;150gt; 60/467.177 lt;151gt; 2003-05-01 lt;160gt; 33 lt;170gt; Microsoft Word 97 35 lt;210gt; 1 lt;211gt; 390 lt;212gt; ADNA lt;213gt; Humano lt;400gt; 1 5 lt;210gt; 2 lt;211gt; 130 lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Humana lt;400gt; 2 lt;210gt; 3 lt;211gt; 1440 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Humano lt;400gt; 3 lt;210gt; 4 lt;211gt; 479 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Humana lt;400gt; 4 lt;210gt; 5 lt;211gt; 327 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Humano lt;400gt; 5 10 lt;210gt; 6 lt;211gt; 109 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Humana lt;400gt; 6 10 lt;210gt; 7 lt;211gt; 702 lt;212gt; ADN 15 lt;213gt; Humano lt;400gt; 7 lt;210gt; 8 lt;211gt; 233 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Humana lt;400gt; 8 10 lt;210gt; 9 lt;211gt; 327 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Humano lt;400gt; 9 10 lt;210gt; 10 lt;211gt; 109 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Humana lt;400gt; 10 10 lt;210gt; 11 lt;211gt; 702 lt;212gt; ADN 15 lt;213gt; Humano lt;400gt; 11 lt;210gt; 12 lt;211gt; 233 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Humana lt;400gt; 12 10 lt;210gt; 13 lt;211gt; 15 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Humano lt;400gt; 13 10 lt;210gt; 14 lt;211gt; 5 lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Humana lt;400gt; 14 20 lt;210gt; 15 lt;211gt; 51 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano 5 lt;400gt; 15 10 lt;210gt; 16 lt;211gt; 17 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana 15 lt;400gt; 16 lt;210gt; 17 20 lt;211gt; 63 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano lt;400gt; 17 25 lt;210gt; 18 lt;211gt; 21 30 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana lt;400gt; 18 35 lt;210gt; 19 lt;211gt; 33 lt;212gt; ADN 40 lt;213gt; Humano lt;400gt; 19 5 lt;210gt; 20 lt;211gt; 11 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana 10 lt;400gt; 20 15 lt;210gt; 21 lt;211gt; 21 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano 20 lt;400gt; 21 lt;210gt; 22 25 lt;211gt; 7 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana lt;400gt; 22 30 lt;210gt; 23 lt;211gt; 33 35 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano lt;400gt; 23 40 lt;210gt; 24 lt;211gt; 11 lt;212gt; PRT 45 lt;213gt; Humana lt;400gt; 24 50 lt;210gt; 25 lt;211gt; 33 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano lt;400gt; 25 5 lt;210gt; 26 lt;211gt; 11 lt;212gt; PRT 10 lt;213gt; Humana lt;400gt; 26 15 lt;210gt; 27 lt;211gt; 21 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano 20 lt;400gt; 27 25 lt;210gt; 28 lt;211gt; 7 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana 30 lt;400gt; 28 lt;210gt; 29 35 lt;211gt; 33 lt;212gt; ADN lt;213gt; Humano lt;400gt; 29 40 lt;210gt; 30 45 lt;211gt; 11 lt;212gt; PRT lt;213gt; Humana lt;400gt; 30 50 lt;210gt; 31 lt;211gt; 23 lt;212gt;ADN lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt; 5 lt;223gt; cebador sintético lt;400gt; 31 10 lt;210gt; 32 lt;211gt; 21 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 15 lt;220gt; lt;223gt; cebador sintético lt;400gt; 32 20 lt;210gt; 33 lt;211gt; 15 25 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt; lt;223gt; enlazador peptídico 30 lt;400gt; 33

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-IR) que tiene al menos una propiedad seleccionada de

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; 5

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3; 10

y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.
2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una región variable en la cadena pesada de SEC ID Nº 2 y una región variable en la cadena ligera de la SEC ID Nº 10.
3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene todas las propiedades citadas. 15
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el IGF-IR de superficie en al menos aproximadamente 85 %.
5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el IGF-IR de superficie en al menos aproximadamente 90 %.
6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que se une al IGF-IR con una Kd de 20 aproximadamente 5 x 10-11 M o inferior.
7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que inhibe la fosforilación de un sustrato aguas abajo de IFG-IR.
8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 7, en el que el sustrato aguas abajo es seleccionado de MAPK, Akt, e IRS-2, y la fosforilación se inhibe en aproximadamente un 50 % o más. 25
9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que estimula la regresión del tumor in vivo.
10. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, que estimula la regresión del tumor in vivo cuando es administrado con un agente antineoplásico.
11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena pesada tiene una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 2. 30
12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera tiene una homología de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº 10.
13. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 35 1 a 12 ligado a un agente citotóxico.
15. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 ligado a un marcador.
16. Una composición terapéutica eficaz para inhibir el crecimiento de las células tumorales humanas que expresan IGF-IR y/o estimular la regresión de los tumores que expresan IGF-IR, en la que la composición comprende el 40 anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
17. La composición terapéutica de la reivindicación 16, que comprende además un agente anti-neoplásico.
18. La composición terapéutica de la reivindicación 17, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I o de la topoisomerasa II.
19. La composición terapéutica de la reivindicación 17, en la que el agente antineoplásico es seleccionado de 45 irinotecán, camptotecán y etopósido.
20. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo.
21. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el trastorno proliferativo es seleccionado de acromegalia, neovascularización en la retina y psoriasis.
22. Un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una célula que expresa IGF-IR, que comprende poner en 5 contacto la célula con una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
23. El procedimiento de la reivindicación 22, que además comprender poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente antineoplásico.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I 10 o de la topoisomerasa II.
25. El procedimiento de la reivindicación 23, en la que el agente antineoplásico es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.
26. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la reducción y/o prevención del crecimiento tumoral o la estimulación de la regresión tumoral. 15
27. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el uso comprende además administrar una cantidad eficaz de un agente antineoplásico.
28. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el agente antineoplásico es un inhibidor de la topoisomerasa I o de la topoisomerasa II.
29. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 27, en la que el agente 20 antineoplásico es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.
30. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma.
31. Un inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso en la reducción o prevención del 25 crecimiento de un tumor que expresa IGF-IR o estimulación de la regresión de un tumor que expresa IGF-IR en combinación con un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al IGF-IR y tiene al menos una propiedad seleccionada de:

(i) inhibe la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR;

(ii) neutraliza la activación de IGF-IR por el IGF-I o IGF-II; 30

(iii) reduce el receptor de la superficie IGF-IR en al menos un 80 %; y

(iv) se une al IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10M o menos;

y tiene una cadena pesada que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 14 en VHCDR1, SEC ID Nº 16 en VHCDR2, y SEC ID Nº 18 en VHCDR3;

y una cadena ligera que comprende CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 26 en VLCDR1, 35 SEC ID Nº 28 en VLCDR2, y SEC ID Nº 30 en VLCDR3.
32. El inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II es seleccionado de irinotecán, camptotecán y etopósido.
33. El inhibidor de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II para su uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el tumor es un tumor de mama, tumor colorrectal, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor de pulmón, tumor 40 de próstata, hueso o sarcoma de tejidos blandos o mieloma.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Figura 17

Figura 18A

Figura 18B

Figura 18C

Figura 19A

Figura 19B

Figura 20A

Figura 21

Figura 22A

Figura 22B

Figura 22C

Figura 23

Figura 24

Figura 25

Figura 26

Figura 27