MX2008012146A - Anticuerpos anti-receptor 1 de factor de crecimiento tipo insulina (igf-1r) y uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos anti-receptor 1 de factor de crecimiento tipo insulina (igf-1r) y uso de los mismos.

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Ellen Garber
Stephen Demarest
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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos que se unen al receptor 1 del factor de crecimiento tipo insulina (IGF-1R) y usos de los mismos, en particular en el diagnóstico y tratamiento de cáncer. Se proporcionan anticuerpos monoclonales humanos y murinos específicos que inhiben las rutas de proliferación tumoral y pro-supervicencia mediadas por IGF-1R, y variantes, fragmentos y derivados de los mismos. También se proporcionan anticuerpos monoclonales humanos y murinos, específicos que bloquean la capacidad de los ligandos, el factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) y el factor 2 de crecimiento tipo insulina (IGF-2) de unirse a IGF-1R, así como fragmentos, variantes y derivados de estos anticuerpos. La invención también incluye polinucleótidos que codifican para los polipéptidos anteriores o fragmentos, variantes o derivados de los mismos, así como vectores y células hospedadoras que comprenden estos polinucleótidos. La invención incluye además métodos para diagnosticar y tratar cáncer usando los anticuerpos de la invención.

Description

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR 1 DE FACTOR DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA (IGF-IR) Y USO DE LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios estudios epidemiológicos han mostrado que los niveles en circulación mayores que los normales de IGF-1 están asociados con riesgo incrementado para varios cánceres comunes, incluyendo de mama (Hankinson et al, Lancet 1998.351:1393-6), de próstata (Chan et al, Science, 1998. 279:563-6), de pulmón (Yu et al, J. Nati. Cáncer Inst. 1999. 91:151-6) y colorrectal (Ma et al, J. Nati. Cáncer Inst. 1999. 91:620-5). También se ha mostrado que niveles elevados en circulación de IGF-2 están asociados con riesgo incrementado de cáncer endometrial (Jonathan et al, Cáncer Biomarker Se Prevention. 2004. 13:748-52). Por el contrario, se observó correlación inversa con niveles elevados de una de las proteínas de unión a IGF, la IGF-BP3, y riesgo de cáncer. Adicionalmente , también se han encontrado niveles J. Cáncer. 1993. 351:1393-6; Jonathan et al, Cáncer Biomarker & Prevention. 2004. 13:748-52). El sistema de IGF juega un papel importante en la regulación de la proliferación, diferenciación, apoptosis y transformación celular (Jones et al, Endocrinology Rev. 1995. 16:3-34). El sistema de IGF comprende dos tipos de receptores no relacionados, el receptor 1 de factor de crecimiento tipo REF. : 196262 insulina (IGF-1R; CD221) y receptor 2 de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-2R; CD222); dos ligandos, factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1 e IGF-2); varias proteínas de unión a IGF (IGFBP-1 a IGFBP-6) . Además, un gran grupo de IGFBP-proteasas (por ejemplo, caspasas, metaloproteinasas , antígeno específico de próstata) hidrolizan IGFBP unido a IGF para liberar IGF libre, que entonces interactúan con IGF-1R e IGF-2R. El sistema de IGF también está íntimamente conectado a insulina y receptor de insulina (InsR) (Moschos et al. Oncology 2002. 63:317-32; Baserga et al., Int J. Cáncer. 2003. 107:873-77; Pollak et al., Nature Reviews Cáncer. 2004. 4:505-516) . En una célula cancerígena, las tirosina-cinasas (TK) del receptor juegan un papel importante en la conexión del microambiente tumoral extra-celular a las rutas de señalización intracelulares que controlan diversas funciones celulares, tal como, ciclos de división celular, supervivencia, apoptosis, expresión génica, arquitectura citoesquelética, adhesión celular, y migración celular. puesto que están bien entendidos los mecanismos que controlan la señalización celular, se pueden desarrollar estrategias terapéuticas que interrumpan una o más de estas funciones celulares al seleccionar como objetivo a nivel de unión de ligando, la expresión/reciclado del receptor, la activación del receptor y las proteínas comprendidas en los eventos de señalización (Hanahan y Weinberg, Cell 2000. 100:57-70). El receptor de factor de crecimiento tipo insulina, tipo I (IGF-1R, CD221) corresponde a la familia de tirosina-cinasas de receptor (RTK) , (Ullrich et al., Cell. 1990., 61:203-12). El IGF-1R se expresa ampliamente y sus ligandos, IGF-1 e IGF-2 juegan un papel significativo en el desarrollo pre- y post-natal, sensibilidad a hormona de crecimiento, transformación celular, supervivencia y se ha implicado en la adquisición de un fenotipo tumoral invasivo y metastásico (Baserga, Cell. 1994. 79:927-30; Baserga et al., Exp. Cell Res. 1999. 253:1-6, Baserga et al., Int J. Cáncer. 2003. 107:873-77). Los estudios inmunohistoquimicos han mostrado que un número de tumores humanos expresan mayores niveles de IGF-1R. La arquitectura molecular de IGF-1R comprende, dos subunidades a extra-celulares (130-135 kD) y dos subunidades ß periféricas de membrana (95 kD) que contienen el dominio de cinasa, catalítico, citoplasmático . El IGF-1R tal como el receptor de insulina (InsR), difiere de otros miembros de la familia de RTK al tener estructuras diméricas covalentes (a2ß2). Estructuralmente, el IGF-1R está altamente relacionado a InsR (Pierre De Meyts y Whittaker, Nature Reviews Drug Discovery. 2002, 1: 769-83). El IGF-1R contiene 84 % de identidad de secuencia a InsR en el dominio de cinasa, en tanto que la yuxta-membrana y las regiones c-terminales comparten 61 % y 44 % de identidad de secuencia, respectivamente (Ulrich et al., EMBO J., 1986, 5:2503-12; Blakesley et al., Cytokine Growth Factor Rev., 1996. 7:153-56) . El IGF-1 y el IGF-2 son los dos ligandos activadores de IGF-1R. La unión de IGF-1 e IGF-2 a la cadena a induce cambios conformacionales que dan por resultado auto-fosforilación de cada ß-cadena en residuos específicos de tirosina, convirtiendo el receptor del estado no fosforilado al estado activo. La activación de los tres residuos de tirosina en el asa de activación (residuos de Tyr en 1131, 1135 y 1136) del dominio de cinasa conduce a un incremento en la actividad catalítica que activa el reconocimiento molecular y la fosforilación de los substratos tal como IRS-1 y las proteínas adaptadoras Shc. La activación de estos sustratos conduce a la fosforilación de proteínas adicionales comprendidas en la cascada de señalización de la supervivencia (PI3K, AKT, TOR, S6) y/o proliferación (proteína-cinasa activada por mitógeno, p42/p44) (Pollak et al., Nature Reviews Cáncer. 2004. 4:505-516; Baserga et al., Biochem Biophys Act . 1997. 1332 : F105-F126; Baserga et al, Int. J. Cáncer. 2003. 107 : 873-77) . A pesar del alto grado de homología entre IGF-1R e InsR, la evidencia sugiere que los dos receptores tienen distintos papeles biológicos; el InsR es un regulador clave de las funciones fisiológicas tal como transporte de glucosa y biosintesis de glicógeno y grasa, en tanto que el IGF-1R es un potente regulador del crecimiento y diferenciación celular. En contraste a InsR, el IGF-1R se expresa de manera ubicua en tejidos donde juega un papel en el crecimiento de tejido, bajo el control de la hormona de crecimiento (GH) , que modula IGF-1. Aunque se ha mostrado que la activación de IGF-1R promueve el crecimiento celular normal, la evidencia experimental sugiere que el IGF-1R no es un requerimiento absoluto (Baserga et al, Exp Cell Res. 1999. 253:1-6; Baserga et al, Int. J. Cáncer. 2003. 107:873-77). Los IGF juegan un papel crucial en la regulación de la proliferación, diferenciación y apoptosis celular. La inhibición de la señalización mediada por IGF-1R se ha mostrado que reduce la velocidad de crecimiento tumoral, incrementa la apoptosis, incrementa la aniquilación de tumores por quimioterapia y otras terapias de objetivo molecular (revisado en Pollak et al., Nature Reviews Cáncer. 2004. 4:505-516; Zhang et al., Breast Cáncer Res. 2000. 21:170-75; Chakravarti et al, Cáncer Res. 2002. 62:200-07). Los planteamientos experimentales entendidos para inhibir la función de IGF-1R en tumores ha proporcionado éxito alentador, pero limitado, y sus efectividades en el tratamiento de cáncer aún se van a determinar en lo clínico. Los planteamientos experimentales incluyen; anticuerpos a IGF-1R (Kull et al., J. Biol. Chem. 1983, 258:6561-66; Kalebic et al., Cáncer Res. 1994. 54:5531-4), anticuerpos neutralizantes a IGF-1 o IGF-2 (Fang et al, Mol. Cáncer Therapy. 2006. 5:114-20; Miyamoto et al, Clin. Cáncer Res. 2005, 11:3494-502), inhibidores de tirosina-cinasa de molécula pequeña (Garcia-Escheverria et al, Cáncer Cell. 2004. 5:231-9; Scotlandi et al, Cáncer Res. 2005. 65:3868-76), oligonucleótidos anti-sentido (Shapiro et al, J. Clin. Invest. 1994. 94:1235-42; Wraight et al. Nature Biotech. 2000. 18:521-26; Scotlandi et al, Cáncer Gene Therapy. 2002. 9:296-07), mutantes negativos dominantes de IGF-1R (Prager et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 1994, 91:2181-85; Kalebic et al., Int. J. Cáncer 1998. 76:223-7; Scotlandi et al., Int. J. Cáncer. 2002:101:11-6), análogos de ligando de IGF ( Pietrzkowski et al, Mol. Cell. Biol. 1992. 12:3883-89), proteínas de unión a IGF recombinantes (Yee et al. Cell Growth Differ. 1994. 5:73-77; Van Den Berg et al, Eur. J. Cáncer. 1997, 33:1108-1113; Jerome et al, AACR 2004, Abstract # 5334), antagonistas de la hormona de liberación de GH, GHRH (Szereday et al, Cáncer Res. 2003. 63:7913-19; Letsh et al, Proc Nati. Acad. Sci. EUA. 2003. 100:1250-55) y GH (Kopchick et al, 2002, Endocr. Rev. 23, 623-46) . La capacidad de un anticuerpo para inhibir la función de IGF-1R se demostró primero con un anticuerpo monoclonal ( -IR3) de ratón que selecciona como objetivo un epitopo desconocido en la subunidad a de IGF-IR (Kull et al., J. Biol. Chem. 1983, 258:6561-66). De manera subsiguiente, se ha mostrado que otros anticuerpos desarrollados a la subunidad a de IGF-IR inhibe la función de IGF-IR a grados variables en diferentes modelos de cáncer experimental (Maloney et al. Cáncer Res. 2003. 63:5073-83; Burtrum et al, Cáncer Res. 2003, 63:8912-21; Sachdev D et al, Cáncer Res. 2003. 63, 627-35; Cohén et al, Clin. Cáncer Res. 2005. 11:3065-74; Goetsch et al, Intl. J. Cáncer. 2005. 113:316-28. Lu et al, J. Biol. Chem. 2004. 280:19665-72). En una célula cancerígena, además de la señalización de pro-supervivencia y proliferativa, también se ha mostrado que la activación de IGF-IR está comprendida en la motilidad e invasión (Ress et al., Oncogene 2001. 20:490-00, Nolan et al, Int. J. Cáncer. 1997. 72:828-34, Stracke et al, J. Biol. Chem. 1989. 264:21544-49; Jackson et al, Oncogene, 2001. 20:7318-25) . Se ha mostrado que las células tumorales producen uno o más de los componentes del sistema de IGF (IGF-1, IGF-2, IGF-IR, IGF-2R e IGF-BP) . Aunque los estudios in vitro han indicado que los tumores pueden producir IGF-1 o IGF-2, los estudios de traducción indican que IGF-2 es el IGF más pertinente y comúnmente expresado en los tumores. Esto es debido a la pérdida de impresión (LOI) del alelo silenciado de IGF-2 en el tumor por alteraciones epigenéticas , que dan por resultado la expresión bialélica del gen de IGF-2 (Fienberg et al., Nat. Rev. Cáncer 2004. 4:143-53; Giovannucci et al, Horm. Metab. Res. 2003. 35:694-04; De Souza et al, FASEB J. et al, 1997. 11:60-7). Esto a su vez da por resultado suministro incrementado de IGF-2 a células de cáncer y al microambiente que soporta el crecimiento tumoral. Los tumores sensibles a IGF-1R reciben señales de activación de receptor de IGF-1 de la circulación (producidas por hígado) e IGF-2 del tumor, y de esta manera los planteamientos que tienen como objetivo interrumpir la actividad biológica mediada tanto por IGF-1 como por IGF-2 deben proporcionar una mejor respuesta anti-tumoral . Por lo tanto, los métodos de anticuerpos anti-IGF-lR que bloquean de manera efectiva las funciones biológicas mediadas tanto por IGF-1 como por IGF-2 pueden proporcionar una eficiencia mejorada con respecto a otros planteamientos que no bloquean de manera eficiente las funciones biológicas de la señalización de IGF-1R mediada tanto por IGF-1 como por IGF-2 en el microambiente tumoral. Con respecto a la seguridad, el IGF-1R se expresa de manera ubicua y de esta manera los anticuerpos que se seleccionan como objetivo IGF-1R deben tener mínimas o ningunas funciones efectoras para evitar toxicidades que resulten de las actividades de ADCC y de CDC en tejidos normales. Una posibilidad de desarrollar estos anticuerpos es tener la forma no glicosilada de la región Fe gamma 4 humana, que no media las funciones de ADCC o de CDC. El IGF-1R está comprendido en la transformación celular mediada por oncogen. La activación de IGF/IGF-1R medía la señalización mitogénica y de pro-supervivencia en células de cáncer. La activación de IGF-1R también promueve la motilidad y metástasis celular. El IGF-1R se sobre-expresa en muchos cánceres. Los individuos con niveles en circulación de IGF mayores que lo normal tienen riesgo incrementado de desarrollar cáncer. Los niveles incrementados en plasma de IGF 1 y 2 se encuentran en muchos pacientes con cáncer. Los tumores humanos producen IGF-2 como un factor de crecimiento autocrino. La inhibición del crecimiento tumoral se ha demostrado como agente individual en combinación con agentes quimioterapéuticos y biológicos. Permanece la necesidad en la técnica de anticuerpos de IGF-1R con diferentes o mejoradas características de unión, seguridad y eficiencia para el tratamiento de varias enfermedades neoplásicas incluyendo cáncer y metástasis de los mismos .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el papel importante del sistema de IGF en la regulación de la proliferación, diferenciación, apoptosis y transformación celular. En particular, el receptor del factor de crecimiento tipo insulina tipo I (IGF-IR) y sus ligandos, IGF-1 e IGF-2, juega un papel significativo en el desarrollo pre- y post-natal, sensibilidad a hormona de crecimiento, transformación celular, supervivencia, y se ha implicado en la adquisición de un fenotipo tumoral invasivo y metastásico. La invención se refiere en general a anticuerpos de IGF-IR, fragmentos de unión a antigeno o derivados de los mismos. Ciertos anticuerpos de IGF-IR y fragmentos de unión a antigeno inhiben la función de IGF-IR o bloquean las funciones biológicas de la señalización de IGF-IR mediada por IGF-1 e IGF-2. Adicionalmente , la invención se refiere en general a métodos para tratar varias enfermedades neoplásicas incluyendo cáncer y metástasis, asi como varias enfermedades, trastornos, o lesiones hiperproliferativas asociadas con señalización de IGF-IR. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une de manera especifica al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, 12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde el anticuerpo o fragmento inhiben de manera competitiva un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8 de la unión a IGF-R1. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio de unión a antigeno idéntico a aquél de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-Rl, donde la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-Rl, donde la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-Rl, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto por 20 ó menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto por 20 ó menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos, seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos, seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH y la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-Rl, donde la VH y la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende, respectivamente, secuencias de aminoácidos idénticas, excepto por 20 ó menos sustituciones conservadoras de aminoácidos cada una, a secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH y la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región 1 determinante de complementariedad de cadena pesada de Kabat (VH-CDR1), idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64. En una modalidad adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de complementariedad de cadena pesada de Kabat (VH-CDR2), idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 65. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 65. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región 3 determinante de complementariedad de cadena pesada de Kabat (VH-CDR3), idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 66. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 66. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región 1 determinante de complementariedad de cadena ligera de Kabat (VL-CDR1), idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, y SEQ ID NO: 119. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, y SEQ ID NO: 119. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región 2 determinante de complementariedad de cadena ligera de Kabat (VL-CDR2), idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, y SEQ ID NO: 120. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, y SEQ ID NO: 120.
En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región 3 determinante de complementariedad de cadena ligera de Kabat (VL-CDR3), idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, y SEQ ID NO: 121. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, y SEQ ID NO: 121. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 5, 6, y 7; SEQ ID NOs: 10, 11, y 12; SEQ ID NOs : 15, 16, y 17; SEQ ID NOs: 21, 22, y 23; SEQ ID NOs: 27, 28, y 29; SEQ ID NOs: 33, 34, y 35; SEQ ID NOs: 39, 40, y 41; SEQ ID NOs: 44, 45, y 46; SEQ ID NOs: 49, 50, y 51; SEQ ID NOs: 54, 55, y 56; SEQ ID NOs: 59, 60, y 61; y SEQ ID NOs: 64, 65, y 66, excepto por una, dos, tres, o cuatro sustituciones de aminoácidos en al menos una de las VH-CDR. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 5, 6, y 7; SEQ ID NOs: 10, 11, y 12; SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; SEQ ID NOs: 21, 22, y 23; SEQ ID NOs: 27, 28, y 29; SEQ ID NOs: 33, 34, y 35; SEQ ID NOs: 39, 40, y 41; SEQ ID NOs: 44, 45, y 46; SEQ ID NOs: 49, 50, y 51; SEQ ID NOs: 54, 55, y 56; SEQ ID NOs: 59, 60, y 61; y SEQ ID NOs: 64, 65, y 66. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, y VL-CDR3 seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 69, 70, y 71; SEQ ID NOs: 74, 75, y 76; SEQ ID NOs: 79, 80, y 81; SEQ ID NOs: 84, 85, y 86; SEQ ID NOs: 89, 90, y 91; SEQ ID NOs: 94, 95, y 96; SEQ ID NOs: 99, 100, y 101; SEQ ID NOs: 104, 105, y 106; SEQ ID NOs: 109, 110, y 111; SEQ ID NOs: 114, 115, y 116; y SEQ ID NOs: 119, 120, y 121, excepto por uno, dos, tres, o cuatro sustituciones de aminoácidos en al menos una de las VL-CDR.
En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, donde la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, y VL-CDR3 seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 69, 70, y 71; SEQ ID NOs: 74, 75, y 76; SEQ ID NOs : 79, 80, y 81; SEQ ID NOs: 84, 85, y 86; SEQ ID NOs: 89, 90, y 91; SEQ ID NOs: 94, 95, y 96; SEQ ID NOs: 99, 100, y 101; SEQ ID NOs: 104, 105, y 106; SEQ ID NOs: 109, 110, y 111; SEQ ID NOs: 114, 115, y 116; y SEQ ID NOs: 119, 120, y 121. En varias modalidades de los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, las regiones de estructura alterna de VH y/o las regiones de estructura alterna de VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, se unen a un epitopo lineal o un epitopo de conformación no lineal. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, son multivalentes , y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, son multiespecificos . En modalidades adicionales, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos son biespecificos . En varias modalidades de los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos, los dominios variables de cadena pesada y ligera son completamente humanos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04. En varias modalidades de los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, los dominios variables de cadena pesada y ligera son murinos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En varias modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos están humanizados. En varias modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos son quiméricos. En varias modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos están primatizados . En varias modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos son completamente humanos.
En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos son fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)2, o fragmentos Fv. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente son anticuerpos de cadena individual. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos comprenden regiones constantes de cadena ligera, seleccionados del grupo que consiste de una región constante kappa humana y una región constante lambda humana. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos comprenden una región constante de cadena pesada o un fragmento de la misma. En modalidades adicionales, la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es IgG4 humana. En ciertas modalidades diferentes, la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación . En modalidades adicionales, las mutaciones de IgG4 comprenden S241P y T318A, usando el sistema de numeración de Kabat . En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de la misma se unen de manera especifica a un polipéptido de IGF-Rl o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-Rl, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) que es menos que la KD para el anticuerpo monoclonal de referencia.
En modalidades adicionales, la constante de disociación (KD) no es mayor que 5 x 1CT2 M, 1CT2 M, 5 x 10"3 M, 10~3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 1CT5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10" 7 M, 5 x 10~8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 10~9 M, 5 x 10"10 M, 1CT10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 M, 1CT12 M, 5 x 10"13 M, 10~13 M, 5 x 10~14 M, 10"14 M, 5 x 10~15 M, o 10"15 M. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos se unen de manera preferencial a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-R1 murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IGF-R1 de primate no humano, o fragmento del mismo. En ciertas modalidades diferentes, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, se unen a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, y también se unen a un polipéptido de IGF-R1 de primate no humano o fragmento del mismo. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos se unen a IGF-R1 expresado en la superficie de una célula. En modalidades adicionales, la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral, o una célula metastásica. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos bloquean la unión del factor de crecimiento de insulina a IGF-R1. En algunas modalidades adicionales, el factor de crecimiento de insulina es factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1) o factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2). En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos bloquean tanto IGF-1 como IGF-2 de la unión a IGF-R1. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos que inhiben la proliferación celular mediada por IGF-R1, la fosforilación de IGF-R1 mediada por IGF-1 o IGF-2, el crecimiento de células tumorales o la internalización de IGF-R1. En modalidades adicionales, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos comprenden además un polipéptido heterólogo fusionado a los mismos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos se conjugan a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, un agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, una modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG), y una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes. En modalidades adicionales, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, una biotoxina, una toxina enzimáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos. En modalidades adicionales, la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente , una marca radioactiva, o una combinación de dos o más de cualquiera de estas marcas detectables. En modalidades adicionales, la invención incluye composiciones que comprenden los anticuerpos descritos anteriormente o fragmentos de los mismos, y un portador. Ciertas modalidades de la invención incluyen un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de VH de anticuerpo, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido de VH se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de VH se optimiza para expresión incrementada sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH. En modalidades adicionales, la optimización comprende la identificación y remoción de los sitios donadores de empalme y aceptadores de empalme y/o la optimización del uso de codones para las células que expresan el polipéptido. En modalidades adicionales, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 57, y SEQ ID NO: 62. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de VL se optimiza para expresión incrementada sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL . En modalidades adicionales, la optimización comprende la identificación y remoción de sitios donadores de empalme y aceptadores de empalme y/o la optimización del uso de codones para las células que expresan el polinucleótido . En modalidades adicionales, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112, y SEQ ID NO: 117. En ciertas modalidades diferentes, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VH de anticuerpo, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH es idéntica, excepto por 20 ó menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:' 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63; y donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido de VH se une de manera especifica a IGF-R1. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL es idéntica, excepto por 20 ó menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica a IGF-Rl . En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VH-CDRl se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDRl se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 65; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VH-CDR2 se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 65. En modalidades, adicionales, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 66; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VH-CDR3 se une de manera especifica a IGF-Rl . En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 66. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, y SEQ ID NO: 119; y donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VL-CDR1 se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114, y SEQ ID NO: 119. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, y SEQ ID NO: 120; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VL-CDR2 se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115, y SEQ ID NO: 120.
En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleotido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, y SEQ ID NO: 121; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, la secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, y SEQ ID NO: 121. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VH de anticuerpo, donde el polipéptido de VH comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOs : 5, 6, y 7; SEQ ID NOs : 10, 11, y 12; SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; SEQ ID NOs: 21, 22, y 23; SEQ ID NOs: 27, 28, y 29; SEQ ID NOs: 33, 34, y 35; SEQ ID NOs: 39, 40, y 41; SEQ ID NOs: 44, 45, y 46; SEQ ID NOs: 49, 50, y 51; SEQ ID NOs: 54, 55, y 56; SEQ ID NOs: 59, 60, y 61; y SEQ ID NOs: 64, 65, y 66; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-R1. En algunas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, en donde el polipéptido de VL comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 69, 70, y 71; SEQ ID NOs: 74, 75, y 76; SEQ ID NOs: 79, 80, y 81; SEQ ID NOs: 84, 85, y 86; SEQ ID NOs: 89, 90, y 91; SEQ ID NOs: 94, 95, y 96; SEQ ID NOs: 99, 100, y 101; SEQ ID NOs: 104, 105, y 106; SEQ ID NOs: 109, 110, y 111; SEQ ID NOs: 114, 115, y 116; y SEQ ID NOs: 119, 120, y 121; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende la VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-R1. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos anteriormente comprenden además un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VH de anticuerpo o al polipéptido de VL de anticuerpo. En ciertas modalidades diferentes, los polinucleótidos descritos anteriormente comprenden además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CHl fusionado al polipéptido de VH, que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CH2 al polipéptido de VH, que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CH3 al polipéptido de VH, o que codifica para una región de articulación de cadena pesada fusionada al polipéptido de VH . En modalidades adicionales, la región constante de cadena pesada es IgG4 humana. En ciertas modalidades diferentes, la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación . En modalidades adicionales, las mutaciones de IgG4 comprenden S241P y T318A, usando el sistema de numeración de Kabat . En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos anteriormente comprenden un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena ligera fusionado al polipéptido de VL. En modalidades adicionales, la región constante de cadena ligera es kappa humana. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende un polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera especifica al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
En otras varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende un polipéptido codificado por el ácido nucleico inhibe de manera competitiva un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de 13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, las regiones de estructura alterna del polipéptido de VH o el polipéptido de VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, la invención proporciona un anticuerpo o fragmentos de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico, que se une a un epitopo lineal o un epitopo conformacional no lineal. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmentos de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es multivalente, y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras.
En ciertas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es multiespecifico . En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es biespecifico . En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son completamente humanos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04. En ciertas modalidades diferentes de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son murinos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquéllos de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico está humanizado. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico está primatizado. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es quimérico. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es completamente humano. En varias modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es un fragmento Fab, un fragmento Fab ' , un fragmento F(ab)2, o un fragmento Fv. En ciertas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es un anticuerpo de cadena individual. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera especifica a un polipéptido de IGF-R1 o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-R1, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10~2 M, 10~2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 , 5 x 10~4 M, 10"4 M, 5 x 1CT5 M, 10"5 M, 5 x 10~6 M, 10"6 M, 5 x 10~7 M, 10~7 M, 5 x 10"8 M, 10~8 , 5 x 10"9 M, 10~9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10~12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 1CT15 M, o 10"15 M. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-R1 murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IGF-R1 de primate no humano, o fragmento del mismo. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, y también se une a un polipéptido de IGF- Rl de primate no humano o fragmento del mismo. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a IGF-R1 expresado en la superficie de una célula. En modalidades adicionales, la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral, o una célula metastásica. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico bloquea la unión del factor de crecimiento de insulina a IGF-R1. En modalidades adicionales, el factor de crecimiento de insulina es el factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1) o el factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2). En ciertas modalidades diferentes del polinucleótido descrito anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo bloquea la unión tanto IGF-1 como de IGF-2 a IGF-R1. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico inhibe la proliferación celular mediada por IGF-R1, inhibe la fosforilación de IGF-R1 mediada por IGF-1 o IGF-2, inhibe el crecimiento de células tumorales o inhibe la internalización de IGF-R1. En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos anteriormente comprenden además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo. En algunas modalidades de los polinucleótidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, un agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, un modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterologo o fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG), y una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes. En modalidades adicionales, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, una biotoxina, una toxina enzimáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos. En ciertas modalidades diferentes, la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente, una marca radioactiva, o una combinación de dos o más de cualquiera de estas marcas detectables . En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. En ciertas modalidades diferentes, la invención proporciona vectores que comprenden los polinucleótidos descritos anteriormente. En modalidades adicionales, los polinucleótidos se asocian de manera operable con un promotor. En modalidades adicionales, la invención proporciona células hospedadoras que comprenden estos vectores. En modalidades adicionales, la invención proporciona vectores donde el polinucleótido está asociado de manera operable con un promotor . En modalidades adicionales, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector que comprende los polinucleótidos descritos anteriormente, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo. En modalidades adicionales, la invención proporciona un polipéptido aislado producido por el método descrito anteriormente . En algunas modalidades, la invención proporciona polipéptidos aislados codificados por los polinucleótidos descritos anteriormente. En modalidades adicionales de los polipéptidos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo que comprende el polipéptido se une de manera especifica a IGF-1R. Otras modalidades incluyen el anticuerpo aislado o fragmento del mismo que comprende los polipéptidos descritos anteriormente . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido codificante de VH aislado y un polinucleótido codificante de VL aislado, donde el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprenden ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se unen de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprenden ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118. En ciertas modalidades diferentes, la invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido codificante de VH aislado y un polinucleótido codificante de VL aislado, donde el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprenden ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas, excepto por al menos 20 sustituciones conservadoras de aminoácidos, a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se unen de manera especifica a IGF-R1. En modalidades adicionales, el polinucleótido codificante de VH codifica para un polipéptido de VH que comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOs : 5, 6, y 7; SEQ ID NOs : 10, 11, y 12; SEQ ID NOs: 15, 16, y 17; SEQ ID NOs: 21, 22, y 23; SEQ ID NOs: 27, 28, y 29; SEQ ID NOs: 33, 34, y 35; SEQ ID NOs: 39, 40, y 41; SEQ ID NOs: 44, 45, y 46; SEQ ID NOs: 49, 50, y.51; SEQ ID NOs: 54, 55, y 56; SEQ ID NOs: 59, 60, y 61; y SEQ ID NOs : 64, 65, y 66; en donde el polinucleótido codificante de VL codifica para un polipéptido de VL que comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, y VL-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NOs: 69, 70, y 71; SEQ ID NOs: 74, 75, y 76; SEQ ID NOs: 79, 80, y 81; SEQ ID NOs: 84, 85, y 86; SEQ ID NOs: 89, 90, y 91; SEQ ID NOs: 94, 95, y 96; SEQ ID NOs: 99, 100, y 101; SEQ ID NOs: 104, 105, y 106; SEQ ID NOs: 109, 110, y 111; SEQ ID NOs: 114, 115, y 116; y SEQ ID NOs: 119, 120, y 121; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se unen de manera especifica a IGF-R1. En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VH de anticuerpo.
En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VL comprende además un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VL de anticuerpo. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CH1 fusionado al polipéptido de VH, comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CH2 fusionado al polipéptido de VH, comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena pesada CH3 fusionado al polipéptido de VH, o comprende además un ácido nucleico que codifica para una región de articulación de cadena pesada fusionada al polipéptido de VH . En modalidades adicionales, la región constante de cadena pesada es IgG4 humana. En ciertas modalidades diferentes, la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación . En modalidades adicionales, las mutaciones de IgG4 comprenden S241P y T318A, usando el sistema de numeración de Kabat. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VL comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena ligera fusionado al polipéptido de VL. En modalidades adicionales, la región constante de cadena ligera es kappa humana. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleotidos codificantes de VH y VL se unen de manera especifica al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de 13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o como un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleotidos codificantes de VH y VL se inhiben de manera competitiva a un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, 12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8 de la unión a IGF-R1. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, las regiones de estructura alterna de los polipéptidos de VH y VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos.
En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se unen a un epitopo lineal o un epitopo conformacional no lineal. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es multivalente, y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es multiespecifico . En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es biespecifico . En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son completamente humanos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04.
En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son murinos. En modalidades adicionales, los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquéllos de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico está humanizado. En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico está primatizado. En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es quimérico. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es completamente humano.
En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab)2, o un fragmento Fv. En ciertas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es un anticuerpo de cadena individual. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera especifica a un polipéptido de IGF-R1 o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-R1, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor de 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10~6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10~8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 10~9 , 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10~12 M, 10~12 M, 5 x 10~13 , 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M, o 10~15 M . En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-R1 murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IGF-R1 de primate no humano o fragmento del mismo. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a un polipéptido de IGF-R1 humano o fragmento del mismo, y también se une a un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o fragmento del mismo. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a IGF-R1 expresado en la superficie de una célula. En modalidades adicionales, la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral o una célula metastásica. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico bloquea la unión del factor de crecimiento de insulina a IGF-R1. En modalidades adicionales, el factor de crecimiento de insulina es factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1) o factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2) . En ciertas modalidades diferentes de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo bloquea la unión de IGF-1 y de IGF-2 a IGF-R1. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico inhibe la proliferación celular mediada por IGF-R1, inhibe la fosforilación de IGF-R1 mediada por IGR-1 ó IGF-2, inhibe el crecimiento de células tumorales o inhibe la internali zación de IGF-R1. En algunas modalidades, las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VH, el polinucleótido codificante de VL, o ambos polinucleótidos codificantes de VH y VL, comprenden además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo. En algunas modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, un modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG) , y una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes. En modalidades adicionales, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, una biotoxina, una toxina enziraáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos. En ciertas modalidades diferentes, la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quicioluminiscente , una marca bioluminiscente, una marca radioactiva, o una combinación de dos o más de cualquiera de estas marcas detectables. En algunas de las modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el polinucleótido codificante de VH está contenido en un primer vector y el polinucleótido codificante de VL está contenido en un segundo vector. En modalidades adicionales, el polinucleótido codificante de VH está asociado de manera operable con un primer promotor y el polinucleótido codificante de VL está asociado de manera operable con un segundo promotor. En ciertas modalidades diferentes, el primero y segundo promotores son copias del mismo promotor. En modalidades adicionales, el primero y segundo promotores no son idénticos. En varias modalidades de las composiciones descritas anteriormente, el primer vector y el segundo vector están contenidos en una célula hospedadora individual.
En ciertas modalidades diferentes de las composiciones descritas anteriormente, el primer vector y el segundo vector están contenidos en células hospedadoras separadas . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, que comprende cultivar las células hospedadoras descritas anteriormente, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo. En otras modalidades, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, que comprende co-cultivar células hospedadoras separadas, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo. En modalidades adicionales del método descrito anteriormente, la invención proporciona combinar los polipéptidos codificantes de VH y VL, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, producido por los métodos descritos anteriormente . En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones, donde el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL están en el mismo vector, asi como los vectores en el mismo.
En varias modalidades de los vectores descritos anteriormente, el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL están cada uno asociados de manera operable con un promotor. En varias modalidades de los vectores descritos anteriormente, el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL se fusionan en cuadro, se co-transcriben de un promotor individual operablemente asociado con este, y se co-traducen en un anticuerpo de carrera individual o fragmento de unión a antigeno del mismo. En varias modalidades de los vectores descritos anteriormente, el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL se co-transcriben de un promotor individual operablemente asociado con este, pero se traducen de manera separada. En modalidades adicionales, los vectores comprenden además una secuencia de IRES colocada entre el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL. En ciertas modalidades diferentes, el polinucleótido que codifica para una VH y el polinucleótido que codifica para una VL se transcriben de manera separada, cada uno que se asocia de manera operable con un promotor separado.- En modalidades adicionales, los promotores separados son copias del mismo promotor o los promotores separados no son idénticos. En algunas modalidades, la invención proporciona células hospedadoras que comprenden los vectores descritos anteriormente . En otras modalidades, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, que comprende cultivar las células hospedadoras descritas anteriormente, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, producido por los métodos descritos anteriormente . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un animal, que comprende administrar a un animal en necesidad de tratamiento una composición que comprende: a) un anticuerpo aislado o fragmento como se describe anteriormente; y b) un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades adicionales, la enfermedad o trastorno hiperproliferativo se selecciona del grupo que consiste de cáncer, un neoplasma, un tumor, una malignidad, o una metástasis de los mismos. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo se une de manera especifica a IGF-1R expresado en la superficie de una célula maligna. En modalidades adicionales, la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a la célula maligna da por resultado la inhibición de crecimiento de la célula maligna. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la unión de IGF a la célula maligna. En modalidades adicionales, el IGF es IGF-1 ó IGF-2. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe IGF-1 de la unión a la célula maligna pero no inhibe IGF-2. En ciertas modalidades diferentes, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe IGF-2 de la unión a la célula maligna pero no inhibe IGF-1. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo promueve la internalización de IGF-1R en la célula maligna. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la fosforilación de IGF-1R o inhibe la proliferación de células tumorales. En modalidades adicionales, la proliferación de células tumorales se inhibe a través de la prevención o retardo del crecimiento metastásico. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la migración de células tumorales. En modalidades adicionales, la proliferación de células tumorales se inhibe a través de la prevención o retardo de la propagación tumoral a tejidos adyacentes . En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el trastorno o enfermedad hiperproliferativa es un neoplasma localizado en la (el): próstata, colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándula suprarrenal, glándula paratiroide, glándula pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides, ojo, cabeza, cuello, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, vaso, región toráxica, o tractor urogenital. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, la enfermedad hiperproliferativa es cáncer, el cáncer seleccionado del grupo que consiste de: cáncer de células escamosas epiteliales, melanoma, leucemia, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides, y cáncer de cabeza y cuello. En modalidades adicionales, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de estómago, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer ovárico y cáncer prostático. En varias modalidades de los métodos descritos anteriormente, el animal es un mamífero. En modalidades adicionales, el mamífero es un humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras la-lb.- Actividad de unión de Fab específicos de IGF-1R. Figura la - Unión de anticuerpos Fab anti-IGFIR purificados a proteína de IGFIR-his y IGF1R-Fc recombinante por ELISA. Figura Ib - Unión de los anticuerpos Fab anti-IGFIR purificados a IGF-1R humano expresado en 3T3 por citometría de flujo. Figura 2. -Actividad de unión de los FAB a IGF-1R expresado en células MCF-7. Figuras 3a-3b.- Los Fab anti-IGF-lR inhibieron la fosforilación inducida por IGF-1 (Figura 3a) e IGF-2 (Figura 3b) en células MCF7. Figuras 4a-4b.- Unión de los anticuerpos de fragmento Fab de IGF-1R a IGR-1R soluble (Figura 4a) e INSR (Figura 4b) por ELISA. Figuras 5a-5bb.- La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de las versiones originales y modificadas de las cadenas de VH y VL de M13-C06, M14-G11, M14-C03 y M14-B01. La Figura 5a (SEQ ID NO: 13) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M13-C06 de cadena pesada. La Figura 5b (SEQ ID NO: 77) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M13-C06 de cadena ligera. La Figura 5c (SEQ ID NO: 14) muestra la secuencia de aminoácidos de M13-C06 de cadena pesada. La Figura 5d (SEQ ID NO: 78) muestra la secuencia de aminoácidos de M13-C06 de cadena ligera. La Figura 5e (SEQ ID NO:25) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-C03 de cadena pesada. La Figura 5f (SEQ ID NO: 87) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-C03 de cadena ligera. La Figura 5g (SEQ ID NO:26) muestra la secuencia de aminoácidos de M14-C03 de cadena pesada. La Figura 5h (SEQ ID NO: 88) muestra la secuencia de aminoácidos de M14-C03 de cadena ligera. La Figura 5i (SEQ ID NO: 31) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-G11 de cadena pesada. La Figura 5j (SEQ ID NO: 92) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-G11 de cadena ligera. La Figura 5k (SEQ ID NO: 32) muestra la secuencia de aminoácidos de M14-Gll de cadena pesada. La Figura 51 (SEQ ID NO: 93) muestra la secuencia de M14-G11 de cadena ligera. La Figura 5m (SEQ ID NO: 19) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-B01 de cadena pesada. La Figura 5n (SEQ ID NO: 82) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-B01 de cadena ligera. La Figura 5o (SEQ ID NO:20) muestra la secuencia de aminoácidos de 14-B01 de cadena pesada. La Figura 5p (SEQ ID NO: 83) muestra la secuencia de M14-B01 de cadena ligera. La Figura 5q (SEQ ID NO: 18) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M13-C06 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5r (SEQ ID NO: 14) muestra la secuencia de aminoácidos de M13-C06 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5s (SEQ ID NO: 30) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-C03 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5t (SEQ ID NO: 26) muestra la secuencia de aminoácidos de 14-C03 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5u (SEQ ID NO: 36) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-G11 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5v (SEQ ID NO: 32) muestra la secuencia de aminoácidos de M14-G11 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5w (SEQ ID NO:24) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de M14-B01 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5x (SEQ ID NO:20) muestra la secuencia de aminoácidos de M14-B01 de cadena pesada optimizada por secuencia. La Figura 5y (SEQ ID NO: 153) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de dominio constante de cadena ligera. La Figura 5z (SEQ ID NO: 154) muestra la secuencia de aminoácidos de dominio constante de cadena ligera. La Figura 5aa (SEQ ID NO: 155) muestra la secuencia de ADN de hebra individual de dominios constantes de agly.IgG4.P de cadena pesada. La Figura 5bb (SEQ ID NO: 156) muestra la secuencia de aminoácidos de dominios constantes de aglyIgG4. P de cadena pesada. Figura 6: Análisis por SDA-PAGE no reducido y reducido de versiones de G4. P.agly de anticuerpos de M13-C06 y M14-03 completamente humanos. Figuras 7a-7b: La actividad de unión de las versiones G4. P (Figura 7a) y G4.P.agly (Figura 7b) completamente humanas de anticuerpos anti-IGF-lR como se determina por ELISA. Figuras 8a-8b: La unión de anticuerpos completamente humanos a IGF-1R expresado en células MCF-7 (Figura 8a), IGF-1R/3T3 (Figura 8b) se determinó por citometria de flujo. La EC50 de unión en MCF-7 varió entre 2.7-12 x 10-10 nM. Figuras 9a-9b: La actividad de las versiones G4 de anticuerpos completamente humanos para bloquear la unión de IGF-1 (Figura 9a) e IGF-2 (Figura 9b) a IGF-1R se determinó por un RIA. Figuras 10a-10c: Figura 10a.- Inhibición de proliferación de células tumorales H-23 en respuesta a IGF-1 por versiones G4 de anticuerpos completamente humanos; Figura 10b.- Inhibición de proliferación de células tumorales H-23 en respuesta a IGF-2 por versiones G4 de anticuerpos completamente humanos; Figura 10c- Inhibición de proliferación de células tumorales Calu-6 en respuesta a IGF-1 por versiones G4 de anticuerpos completamente humanos. Figuras lla-llb: Inhibición de la fosforilación de receptor accionada por IGF-1 (Figura lia) e IGF-2 (Figura 11b) por los anticuerpos M13. C06. G4. P . agly, M1 . C03. G4. P . agly y M14.G11.P. Figuras 12a-12b: Se ha mostrado la inhibición de la señalización en la dirección 3' por M13. C06. G . P . agly . (Figura 12a), Phospho Akt (Thr308) y Akt total en las filas superior y de fondo, respectivamente. Figura 12b.- Top Phospho p44/42 MAPK y total p44/42 MAPK mostrado en filas superior y de fondo, respectivamente. Figuras 13a-13c: Internalización de IGF-1R por anticuerpos anti-IGF-lR humanos. La internalización de IGF-1R por el anticuerpo M13-C06. G . P . agly (Figura 13a) se observó en el tiempo 0, 15 y 60 minutos por microscopía focal. El clon 24-31 del anticuerpo anti-IGF-lR de ratón fue el control positivo (Figura 13b) y el anticuerpo 7F2 de ratón y un anticuerpo G4. P humano, IDEC-151. G4. P, fueron los controles negativos correspondidos por isotipo (Figura 13c) para el experimento . Figuras 14a-14f: Inhibición de crecimientos de células tumorales mediado por IGF-1 por mAb de IGF-1R (Figura 14a) H23; (Figura 14b) Calu-6; (Figura 14c) Panc-1; (Figura 14d) BxPC3; (Figura 14e) MaPaCa; y (Figura 14f) Colo205. Las barras muestran las medias y la SD (desviación estándar) . Figura 15: Inhibición de proliferación accionada por IGF-1 e IGF-2 de células H-23 por anticuerpos anti-IGF-lR. Figura 16: Inhibición de proliferación de células BxPC3 (accionada con IGF-1 e IGF-2 humano recombinante ) por el anticuerpo M13-C06. G4. P . agly . Figura 17: Inhibición de proliferación de células NCI-H23 (accionada por IGF-1 e IGF-2 humano recombinante) por el anticuerpo M13-C06. G4. P . agly . Figura 18: Inhibición de proliferación de células A549 (accionada por IGF-1 e IGF-2 humano recombinante ) por anticuerpo M13-C06. G4. P . agly . Figura 19: Inhibición de fosforilación inducida por IGF-1 e IGF-2 de Akt en la secuencia de aminoácidos Ser473 por un anticuerpo de IGF-IR completamente humano. Figura 20: Anticuerpo M13. C06. G4. P . agly completamente humano exhibe inhibición dependiente de la dosis in vivo de crecimiento tumoral en un modelo de cáncer pancreático . Figura 21: Anticuerpo M13. C06. G4. P . agly completamente humano exhibe inhibición dependiente de dosis in vivo de crecimiento tumoral en un modelo de cáncer pulmonar. Figura 22: Anticuerpo M13.C06.G4. P.agly completamente humano administrado en combinación con gemcitabina exhibe eficiencia incrementada al inhibir el crecimiento tumoral. Figura 23: Anticuerpo M13. C06. G4. P . agly completamente humano se une a IGF-IR expresado en una linea celular establecida de fibroblastos de cynomolgus. Figura 24: Análisis de unión por competición cruzada de epitopos de unión al anticuerpo de IGF-IR. Figura 25: Co-inmunoprecipitación de IRS-1 y p85 (subunidad reguladora de PI3K) demuestra inhibición mediada por M13-C06. G4. P . agly de transducción de señales de IGF-IR. Figuras 26a-26b: Inmunoprecipitación de IGF-IR e INSR en células mamiferas demuestra unión del anticuerpo M13. C06. G4. P . agly a IGF-IR pero no a receptor de insulina. Se detectaron proteínas de IGF-IR e INSR por análisis de inmunotransferencia (transferencia Western) con anti-IR de humano de ratón (Figura 26a) o anti-IGF-lR humano de ratón (Figura 26b) . Figuras 27a-27b: Mediciones de afinidad de unión relativa de Fab de M13-C06 para (Figura 27a) hIGF-lR-Fc y (Figura 27b) mIGF-lR-Fc. Las escalas de los ejes x e y son idénticas para (Figura 27a) y (Figura 27b). Los residuos para los ajustes de unión se muestran en el fondo de cada panel para indicar la aplicabilidad del modelo de unión de 1:1 al determinar las afinidades relativas de M13-C06 para cada receptor . Figuras 28a-28d: Ejemplos de la unión del anticuerpo M13.C06 a los controles hIGF-lR-Fc y mIGF-lR-Fc en el ensayo de SPR en comparación a la unión de anticuerpo a las proteínas mutantes de IGF-IR SD006 (positivo a la unión) y SD015 (negativo a la unión) . Figuras 29a-29c: Representaciones estructurales de IGF-IR e INSR: Figura 29a.- Diagrama esquemático de la estructura de IGF-IR. Figura 29a.- FnIII-2 contiene la estructura de asa que se procesa proteolíticamente in vivo como se muestra en el diagrama. La región transmembrana se muestra en un aza helicoidal que atraviesa una vista esquemática de una bicapa de fosfolipido. La ubicación del sitio de unión de IGF-l/IGF-2 dentro de IGF-1R se muestra por una estrella. Se ha demostrado que solo una molécula de IGF-l/IGF-2 se une a cada molécula heterodimérica de IGF-1R. Figuras 29b-29c - Epitopo de unión de IGF-1R de M13-C06 correlacionado a la superficie de la estructura del INSR homólogo. El epitopo de unión de IGF-1R de M13-C06 se modeló en base a la estructura cristalina de INSR altamente homogénea. Figura 29b.- Representación superficial de la estructura de INSR con las posiciones de residuos de aminoácidos que corresponden a las posiciones homologas de V462-H464 en IGF-1R (es decir L472-K474 en INSR) están sombreadas en negro. Los primeros tres dominios que corresponden a IGF-1R (es decir, L1-CR-L2) (tal como se incluyen en la construcción IGF-IR ( 1-462 ) -Fe truncada descrita en la presente) se sombrean en gris. Figura 29c-Representación superficial de la estructura de INSR con aquellos residuos que disponen del área superficial a solvente y que están dentro de un radio de 14 Á (angstrom) (o radio de 28 Á (angstrom)) de los residuos que corresponden a 462-464 de IGF-IR (es decir 472-474 de INSR) se sombrea en negro. Los residuos que corresponden a los aminoácidos 462-464 de IGF-IR se sombrean en gris para indicar el área superficial experimentalmente confirmada del epitopo propuesto. Figuras 30a-30b: Análisis de inmunotransferencia (transferencia Western) de la expresión de IGF-IR in vivo en tumores de ratón tratados con el anticuerpo MI 3. C06. G . P . agly . Figura 31: Actividad anti-tumor in vivo de M13-CO 6. G4. P . agly en tumores generados de un tumor de colon humano primario . Figura 32: Actividad anti-tumo in vivo de M13-C06. G . . agly en tumores generados de células de carcinoma de mama (MCF-7) . Figura 33: Anticuerpo M13-C06 no exhibe actividad de ADCC in vitro.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones Se va señalar que el término "un" ó "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "un anticuerpo de IGF-IR", se entiende que representa uno o más anticuerpos de IGF-IR. Como tal, los términos "un" (o "una"), "uno o más", y "al menos uno" se pueden usar de manera indistinta en la presente. Como se usa en la presente, el término "polipéptido" se propone que abarque un "polipéptido" individual asi como "polipéptidos" plurales, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) linealmente enlazados por enlaces de amida (también conocidos como enlaces de péptidos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud especifica del producto. De esta manera, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos", o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadena de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, de manera indistinta con cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también se propone que se refiera a los productos de modificaciones de post-expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica , o modificación por aminoácidos que no se presentan de manera natural. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante , pero no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico detectada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química . Un polipéptido de la invención puede ser de un tamaño de aproximadamente 3 ó más, de 5 ó más, de 10 ó más, de 20 o más, de 25 ó más, de 50 ó más, de 75 ó más, de 100 ó más, de 200 ó más, de 500 ó más, de 1, 000 ó más, o de 2,000 ó más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente tienen esta estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se refieren como plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, pero en cambio pueden adoptar un número grande de diferentes conformaciones, y se refieren como no plegados. Como se usa en la presente, el término glicoproteina se refiere a una proteina acoplada a al menos una porción de carbohidrato que se une a la proteina mediante una cadena lateral que contiene oxigeno o que contiene nitrógeno de un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de serina o una residuo de asparagina. Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo, se propone un polipéptido que no está en su ambiente natural. No se requiere nivel particular de purificación. Por ejemplo, se puede remover un polipéptido aislado de su ambiente nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas recombinantemente producidos expresados en células hospedadoras se consideran aislados para propósitos de la invención, como son polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado, o purificado de manera parcial o sustancial por cualquier técnica adecuada. También se incluyen como polipéptidos de la presente invención fragmentos, derivados, análogos, o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. El término "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refiera a anticuerpos de IGF-1R o polipéptidos de anticuerpo de la presente invención incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos algunas de las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo o polipéptido nativo correspondiente. Los fragmentos de polipéptido de la presente invención incluyen fragmentos proteolíticos , así como fragmentos de supresión, además de los fragmentos de anticuerpo específicos analizados en otra parte de la presente. Las variantes de los anticuerpos de IGF-1R y los polipéptidos de anticuerpo de la presente invención incluyen fragmentos como se define anteriormente, y también polipéptidos con secuencias alteradas de aminoácidos debido a sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden presentarse de manera natural o no se presentan de manera natural. Se pueden producir variantes que no se presentan de manera natural usando técnicas de mutagénesis conocidas. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, supresiones o adiciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos. Los derivados de anticuerpos de IGF-IR y polipéptidos de anticuerpo de la presente invención, son polipéptidos que se han alterado para exhibir características adicionales no encontradas en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también se pueden referir en la presente como "análogos de polipéptido" . Como se usa en la presente, un "derivado" de un anticuerpo de IGF-1R o polipéptido de anticuerpo se refiere a un polipéptido o sujeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. También incluidos como "derivados" están aquellos polipéptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que se presentan de manera natural de los veinte aminoácidos normales. Por ejemplo se puede sustituir 4-hidroxiprolina por prolina; se puede sustituir 5-hidroxilisina por lisina; se puede sustituir 3-metilhistidina por histidina: se puede sustituir homoserina por serina; y se puede sustituir ornitina por lisina. El término "polinucleótido" se propone que abarque ácido nucleico singular así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN de plásmido (ADNp) . Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como el encontrado en ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a cualquiera o cualesquiera de los segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico "aislado" o polinucleótido se propone una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica por un anticuerpo de IGF-1R contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Los ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterologas o polinucleótidos purificados (de manera parcial o sustancial) en solución. Las moléculas de ARN, aisladas, incluyen transcriptos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos aislados o los ácidos nucleicos de acuerdo a la presente invención incluyen además estas moléculas producidas de manera sintética. Además, los polinucleótidos o un ácido nucleico pueden ser o pueden incluir un alimento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma, o un terminador de trascripción. Como se usa en la presente, un "región codificante" es una porción de ácidos nucleicos que consiste de codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de detención" (TAG, TGA ó TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, pero cualquier secuencia de flanqueo, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales , intrones, y similares, no son parte de una región codificante o región de codificación. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes de la presente invención en una construcción individual de polinucleótidos, por ejemplo, en un vector individual, o en construcciones separadas de polinucleótidos , por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Adicionalmente , cualquier vector puede contener una región codificante única, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector individual puede codificar de manera separada para una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido, o ácido nucleico de la invención puede codificar para regiones codificantes heterólogas , ya sea fusionadas o no fusionadas a un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de IGF-IR, o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tal como péptido de señal secretoria o un dominio funcional heterólogo. En ciertas modalidades, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN . En el caso de ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido puede incluir normalmente un promotor y/o otros elementos de control de transcripción y traducción asociado de manera operable con una o más regiones codificantes. Una asociación operable es cuando una acción codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de una manera tal para colocar la expresión del producto génico bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tal como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con estas) están "operablemente asociadas" si la inducción de la función promotora da por resultado la transcripción del ARNm que codifica para el producto génico deseado y si la naturaleza de enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión del producto génico o para interferir con la capacidad de la plantilla de ADN para que se transcriba. De esta manera, una región promotora se asociará de manera operable con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido si el promotor fue capaz de afectar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor especifico de la célula que dirige transcripción sustancial del ADN sólo en células predeterminadas. Otros elementos de control de transcripción, además del promotor, por ejemplo, intensificadores , operadores, represores y señales de terminación de transcripción, se pueden asociar de manera operable con el polinucleótido para dirigir la transcripción especifica de la célula. Se describen en la presente promotores adecuados y otras regiones de control de transcripción . Se conocen por aquellos expertos en la técnica una variedad de regiones de control de transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de transcripción que funcionan en células de vertebrados, tal como, pero no limitado a, segmentos promotores e intensificadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, en unión con el intron-A) , virus 40 simiesco (el promotor temprano) , y retrovirus (tal como virus de sarcoma de Rous). Otras regiones de control de transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrados tal como actina, proteina de choque térmico, hormona de crecimiento bovino y ß-globina de conejo, asi como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucarióticas . Las regiones de control de transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores e intensificadores específicos del residuo así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas ) . De manera similar, se conocen por aquellos expertos en la técnica una variedad de elementos de control de traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosoma, codones de terminación e inicio de traducción, y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio de entrada a ribosoma interno, o IRES, también referido como una secuencia de CITE) . En otras modalidades, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en la forma de ARN mensajero (ARNm) . Las regiones codificantes de polinucleótido y ácido nucleico de la presente invención se pueden asociar con regiones codificantes adicionales que codifican para péptidos secretorios o de señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. De acuerdo a la hipótesis de señal, las proteínas segregadas por células mamíferas tienen un péptido de señal o secuencia guía secretoria que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Aquellos expertos en la técnica están consientes que los polipéptidos segregados por células de vertebrados tienen en general un péptido de señal fusionado al N-término del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o de "longitud completa" para producir una forma segregada o "madura" del polipéptido. En ciertas modalidades, el péptido de señal nativo, por ejemplo, un péptido de señal de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, se usa, o un derivado funcional de esta secuencia que retiene la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que está asociado de manera operable con este. De manera alternativa, una péptido de señal de mamífero heterólogo, o derivado funcional del mismo, se pueden usar, por ejemplo, la secuencia guía tipo silvestre se puede sustituir con la secuencia guía del activador de plasminógeno de tejido (TPA) humano o ß-glucuronidasa de ratón.
La presente invención se refiere a ciertos anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antigeno, variantes o derivados de los mismos. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de tamaño completo tal como Anticuerpos que se presentan de manera natural, el término "anticuerpo de IGF-1R" abarca anticuerpos de tamaño completo así como fragmentos de unión a antígeno, variantes, análogos, o derivados de estos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos que se presentan de manera natural o moléculas de inmunoglobulina o moléculas de anticuerpo, manejadas, o fragmentos que se unen a antígeno de una manera similar a las moléculas de anticuerpo . Los términos "anticuerpo" y "inmunoglobulina" se usan de manera indistinta en la presente. Un anticuerpo o inmunoglobulina comprende al menos el dominio variable de una cadena pasada, y normalmente comprende al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de inmunoglobulina en sistemas de vertebrados están relativamente bien entendidas. Ver, por ejemplo Harlow et al., Antibodies; A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). Como se analizará en más detalle más adelante, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptido que se pueden distinguir de forma bioquímica. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (?, µ, a, d, e) con algunas subclases entre estos (por ejemplo ?1-?4) . Es la naturaleza de esta cadena lo que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgG ó IgE, respectivamente. Las subclases (isotipos) de inmunoglobulina por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, etc., están bien caracterizadas y se conoce que confieren especiali zación funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles al experto en la técnica en vista de la presente descripción, y por consiguiente, están dentro del alcance de la presente invención. Todas las clases de inmunoglobulina están claramente dentro del alcance de la presente invención, el siguiente análisis se dirigirá en general a la clase de IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, una molécula de inmunoglobulina normal comprende dos polipéptidos idénticos de cadena ligera de peso molecular aproximadamente de 23,00 Daltons, y dos polipéptidos idénticos de cadena pesada de peso molecular de 53,000-70,000. Las cuatro cadenas se unen típicamente por enlaces de disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras se asocian a las cadenas pesadas iniciando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lambda (?, ?) . Cada clase de cadena pesada se puede unir con ya sea una cadena libera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras o pesadas se unen covalentemente entre si, y las porciones de "extremidad" de las dos cadenas pesadas se unen entre si por enlaces covalentes de disulfuro o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea por hibridomas, células B o células hospedadoras genéticamente manejadas. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos corren desde un N-término en los extremos bifurcados de la configuración en Y al C-término en el fondo de cada cadena. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan de manera funcional. A este respecto, se apreciará que los dominios variables tanto de las porciones de cadena ligera (VL) como de cadena pesada (VH) determinan el reconocimiento y especificidad a antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (CH1, CH2 ó CH3) confieren propiedades biológicas importantes tal como secreción, movilidad transplacenta, unión a receptor Fe, unión a complemento, y similar. Por convención, la numeración de los dominios de región constante se incrementa conforme llegan a estar más distantes del sitio de unión a antígeno o del amino-término del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y en la porción C-terminal es una región constante; los dominios de CH3 y CL comprenden realmente el carboxi-término de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Como se indica anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca de manera selectiva y se una de manera especifica a epitopos en los antigenos. Es decir, el dominio de VL y el dominio de VH, o el subconjunto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antigeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternaria forma el sitio de unión a antigeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. De manera más especifica, el sitio de unión a antigeno se define por tres CDR en cada una de las cadenas de VH y VL. En algunos casos, por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de camélidos o manejadas en base o inmunoglobulinas de camélidos, una molécula completa de inmunoglobulina puede consistir sólo de cadenas pesadas sin cadenas ligeras. Ver, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993). En anticuerpos que se presentan de manera natural, las seis "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antigeno son secuencias no contiguas, cortas de aminoácidos que se colocan de manera especifica para formar el dominio de unión a antigeno conforme el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los aminoácidos en los dominios de unión a antigeno, referidas como regiones de "estructura alterna", muestran menos variabilidad inter-molecular . Las regiones de estructura alterna adoptan en su mayor parte una conformación de ß-hoja y las CDR forman asas que se conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de ß-hoja. De esta manera, las regiones de estructura alterna actúan para formar un núcleo molecular que proporciona la colocación de las CDR en la orientación correcta por interacciones inter-cadena, no covalentes. El dominio de unión a antigeno formado por las CDR colocadas define una superficie complementaria al epitopo en el antigeno inmunorreactivo . Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epitopo cognado. Los aminoácidos que comprenden la CDR y las regiones de estructura alterna, respectivamente, se pueden identificar fácilmente de cualquier región variable de cadena pesada o ligera, determinada, o algún experto en la técnica, puesto que se han definido de forma precisa (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), que se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades). En el caso donde hay dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta dentro de la técnica, la definición del término como se usa en la presente se propone que incluya todos estos significados a menos que se declare de manera especifica lo contrario. Un ejemplo especifico es el uso del término "región determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación a antigeno, no contiguos, encontrados dentro de la región variable de los polipéptidos tanto de cadena pesada como ligera. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dept . of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que se incorporan en la presente como referencia, donde las definiciones incluyen traslape o subconjuntos de residuos de aminoácidos en comparación entre si. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variante del mismo se propone que esté dentro del alcance del término como se define y usa en la presente. Los residuos de aminoácido apropiados que abarcan las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen más adelante en la Tabla I como una comparación. Los números exactos de residuo que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Aquellos expertos en la técnica pueden determinar por rutina que residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del anticuerpo.
Tabla 1. Definiciones de CDR 1 Numeración de todas las definiciones de CDR en la Tabla 1 es de acuerdo con las conversiones de numeración expuestas por Kabat et al. (ver más adelante) . Kabat et al., también definió un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar de manera inambigua este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin fiarse de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se usa en la presente, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., U.S. Dept . of Healt and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) . A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones especificas de residuo de aminoácido en un anticuerpo de IGF- IR o fragmento de un antigeno, variante, o derivado del mismo de la presente invención están de acuerdo al sistema de numeración de Kabat . En especies de camélidos, la región variable de cadena pesada, referida como VHH, forma el dominio completo de unión a antigeno. Las diferencias principales entre las regiones variables de VHH de camélido y aquellas derivadas de anticuerpos convencionales (VH) incluyen (a) aminoácidos más hidrófobos en la superficie de contacto de cadena ligera de VH en comparación a la región correspondiente en VHH, (b) una CDR3 más larga en VHH, y (c) la frecuente ocurrencia de un enlace de disulfuro entre CDR1 y CDR3 en VHH. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales , monoclonales , multiespecificos , humanos, humanizados, primatizados , quiméricos, anticuerpos de cadena individual, fragmentos de unión a epitopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab' ) 2> Fd, Fv, Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, Fv enlazados a disulfuro (sdFv) , fragmentos que comprenden ya sea un dominio de VL ó VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id a anticuerpos de IGF-IR descritos en la presente) . Se conocen en la técnica las moléculas de ScFv y se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,892,019. Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY) , de cualquier clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de moléculas de inmunoglobulina . Los fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de cadena individual, pueden comprender las regiones variables solas o en combinación con la totalidad a una porción de lo siguiente: región de articulación, dominios de CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos de unión a antigeno que comprenden también cualquier combinación de regiones variables con una región de articulación, dominios de CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos de la presente invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. De manera preferente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, de conejo, de cabra, de cobayo, de camello, de llama, de caballo o de pollo. En otra modalidad, la región variable puede ser de origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones) . Como se usa en la presente, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas, o que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe infra y, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,939,598, por Kucherlapati et al. Como se usa en la presente, el término "porción de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina . Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un domino de CH1, un dominio de articulación (por ejemplo, región de articulación superior, intermedia y/o inferior) , un dominio de CH2, un dominio de CH3, o una variante o fragmento del mismo. Por ejemplo, un polipéptido de unión para el uso en la invención puede comprender una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH1; una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH1, al menos una porción de un dominio de articulación, y un dominio de CH2; una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH1 y un dominio de CH3; una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH1, al menos una porción de un dominio de articulación, y un dominio de CH3, o una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH1, al menos una porción de un dominio de articulación, un dominio de CH2, y un dominio de CH3. En otra modalidad, un polipéptido de la invención comprende una cadena de polipéptido que comprende un dominio de CH3. Además, un polipéptido de unión para el uso en la invención puede carecer de al menos una porción de dominio de CH2 (por ejemplo, todo o una parte de un dominio de CH2). Como se expone anteriormente, se entenderá por un experto en la técnica que estos dominios (por ejemplo, las porciones de cadena pesada) se pueden modificar tal que varían de la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina que se presenta de manera natural. En ciertos anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, o variantes o derivados de los mismos descritos en la presente, las porciones de cadena pesada de una cadena de polipéptido de un multímero son idénticas a aquellas en una segunda cadena de polipéptido del multímero. De manera alternativa, los monómeros que contienen la porción de cadena pesada de la invención no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un diferente sitio de unión a objetivo, que forma, por ejemplo, un anticuerpo biespecí fico . Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para el uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente se pueden derivar de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio de CH1 derivado de una molécula de IgGl y una región de articulación derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprende una región de articulación derivada, en parte, de una molécula de IgGl, y en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una articulación quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG . Como se usa en la presente, el término "porción de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina . De manera preferente, la porción de cadena ligera comprende al menos uno de un dominio de VL o CL. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antigeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente se pueden describir o especificar en términos de los epitopos o porciones de un antigeno, por ejemplo, un polipéptido objetivo (IGF-1R) que reconocen o se unen de manera especifica. La porción de un polipéptido objetivo que interactúa de manera especifica con el dominio de unión a antigeno de un anticuerpo es un "epitopo", o un "determinante antigénico". Un polipéptido objetivo puede comprender un epitopo individual, pero comprende típicamente al menos dos epitopos, y puede incluir cualquier número de epitopos, dependiendo del tamaño, conformación, y el tipo de antígeno. Adicionalmente , se debe señalar que un "epitopo" en un polipéptido objetivo puede ser o incluir elementos no de polipéptido, por ejemplo, un "epitopo" puede incluir una cadena lateral de carbohidrato" . El tamaño mínimo de un epitopo de péptido o polipéptido para un anticuerpo se piensa que es de aproximadamente de cuatro a cinco aminoácidos. De manera preferente, los epitopos de péptido o polipéptido contienen al menos siete, de manera preferente al menos nueve y de manera más preferente entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos. Puesto que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epitopo no necesitan estar contiguos, y en algunos casos, aún no pueden estar en la misma cadena de péptido. En la presente invención, el epitopo de péptido o polipéptido reconocido por los anticuerpos de IGF-lr de la presente invención contienen una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, de manera más preferente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos contiguos o no contiguos de IGF-1R. Por "se une de manera especifica", se quiere decir en general un anticuerpo se une a un epitopo mediante su dominio de unión a antigeno, y que la unión conlleva alguna complementariedad de entre el dominio de unión a antigeno y el epitopo. De acuerdo a esta definición, un anticuerpo que dice que "se une de manera especifica" a un epitopo cuando se une a este epitopo, mediante su dominio de unión a antigeno más fácilmente que cuando se uniría a un epitopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" como se usa en la presente para calificar la afinidad relativa por la cual un cierto anticuerpo se une a un cierto epitopo. Por ejemplo se puede juzgar que el anticuerpo "A" tiene una mayor especificidad para un epitopo determinado que el anticuerpo "B", o el anticuerpo "B" se puede decir que se une al epitopo "C" con una mayor especificidad que la que tiene para el epitopo "D" relacionado. Por "se une de manera preferencial" , se quiere decir que el anticuerpo se une de manera especifica a un epitopo más fácilmente que lo que se uniría a un epitopo relacionado, similar, homólogo o análogo. De esta manera, un anticuerpo que "se une de manera preferencial" a un epitopo determinado se unirá más probablemente a ese epitopo que a un epitopo no relacionado, aunque este anticuerpo pueda reaccionar de manera cruzada con el epitopo relacionado. A manera de ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epitopo de manera preferencial que se une a este primer epitopo con una constante disociación (KD) que es menor de la KD del anticuerpo para el segundo epitopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer antígeno de manera preferencial que se une al primer epitopo con una afinidad que está al menos en un orden de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epitopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epitopo de manera preferencial que se une al primer epitopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la KD del anticuerpo para el segundo epitopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epitopo de manera preferencial si se une al primer epitopo con una constante de disociación (K (disociación) ) que es menor que la k (disociación) del anticuerpo para el segundo epitopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epitopo de manera preferencial si se une al primer epitopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la K (disociación) del anticuerpo para el segundo epitopo. En otro ejemplo no limitante, se puede considerar que un anticuerpo se une a un primer epitopo de manera preferencial si se une al primer epitopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k (disociación) del anticuerpo para el segundo epitopo. Un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado descrito en la presente se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una constante de disociación ( k (disociación) ) de menos de o igual a 5 X 10~2 seg-1, 10"2 seg-1, 5 X 10"3 seg-1 ó 10~3 seg-1. De manera más preferente, se puede decir que un anticuerpo de la invención se une a un polipéptido objetivo descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una constante de disociación ( k (disociación) ) menor o igual a 5 X 10~4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 X 10"5 seg"1 ó 10~5 seg"1 5 X 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 X 10"7 seg"1 ó 10"7 seg"1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado descrito en la presente se puede decir que se une a un polipéptido objetivo descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una constante de asociación ( k (asociación) ) mayor que o igual a 103 M"1 seg"1, 5 X 10"3 M"1 seg"1, 10"4 M"1 seg"1, ó 5 x 10"4 M"1 seg"1. De manera más preferente, un anticuerpo de la invención se puede decir que él se une a un polipéptido objetivo descrito en la presente o un fragmento o variante del mismo con una constante de asociación ( k (asociación) ) mayor que o igual a 105 M"1 seg" 1, 5 X 10"5 M"1 seg"1, 10"6 M"1 seg"1, ó 5 X 106 M"1 seg"1 ó 107 M"1 seg"1. Se dice que un anticuerpo inhibe de manera competitiva a la unión de un anticuerpo de referencia a un epitopo determinado si se une de manera preferencial a este epitopo al grado que bloquea, en algún grado, la unión del anticuerpo de referencia al epitopo. Se puede determinar la inhibición competitiva por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos de ELISA de competición. Se puede decir que un anticuerpo inhibe de manera competitiva la unión del anticuerpo de referencia a un epitopo determinado por al menos 90 %, al menos 80 %, al menos 70 %, al menos 60 %, o al menos 50 %. Como se usa en la presente, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epitopo individual con la CDR de una molécula de inmunoglobulina . Ver, por ejemplo., Harlow et al., ANtibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) en páginas 27-28. Como se usa en la presente, el término "avidez" se refiere a la estabilidad total del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antigeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antigeno. Ver, por ejemplo, Harlow en páginas 29-34. La avidez se relaciona tanto a la afinidad de las moléculas individuales de inmunoglobulina en la población con epitopos específicos, y también a las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epitopo altamente repetitiva, tal como un polímero, será una de alta avidez. Los anticuerpos de IGF-1R de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específica para un antígeno, de reaccionar con un segundo antigeno; una medida de la relación entre dos diferentes sustancias antigénicas. De esta manera, un anticuerpo es de reactividad cruzada si se une a un epítopo diferente del que indujo su formación. El epítopo de reactividad cruzada contiene en general muchas de las mismas características estructurales complementarias como el epítopo inductor, y en algunos casos, puede ajustarse realmente mejor que el original . Por ejemplo, ciertos anticuerpos tienen algún grado de reactividad, ya que se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 %, y al menos 50 % de identidad (como se calcula usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) a un epítopo de referencia. Se puede decir que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 65 %, menos de 60 %, menos de 55 % y menos de 50 % de identidad (como se calcula usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) a un epítopo de referencia. Se puede juzgar a un anticuerpo como "altamente específico" para un cierto epítopo, sino se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de este epítopo . Los anticuerpos de IGF-1R o fragmentos de unión a antigenos, o variantes o derivados de los mismos de la invención también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor que 5 x 10~2M, 10"2 M, 5 x 1CT3 M, 10~3 , 5 X 10~4 M, 10~4M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 1CT6 M, 10"6 M, 5 x 1(G7 M, 10~7 M, 5 x 10~8M, 10"8 M, 5 x 10~9M, 10~9 M, 5 x 10"10M, 10"10 M, 5 x 10_11M, 10"nM, 5 x 10" 12 M, 10"12M, 5 x 10~13 M, 10~13M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M, ó 10"15 M. Los anticuerpos de IGF-1R o fragmentos de unión a antigeno, variantes o derivados de los mismos de la invención pueden ser "multiespecificos" , por ejemplo, biespecificos , triespecificos o de mayor multiespecificidad, significando que reconoce y se une a dos o más epitopos preferentes presentes en uno o más antigenos diferentes (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo. De esta manera, si un anticuerpo de IGF-1R es "monoespecífico" o "multiespecifico", por ejemplo, "biespecifico" se refiere al número de epitopos diferentes con los cuales reacciona un polipéptido de unión. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para diferentes epitopos de un polipéptido objetivo descrito en la presente o pueden ser específicos para un polipéptido objetivo así como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o un material de soporte sólido. Como se usa en la presente "valencia" se refiere al número de dominios potenciales de unión, por ejemplo, dominios de unión a antigeno, presentes en un anticuerpo de IGF-1R, de polipéptido o anticuerpo de unión. Cada dominio de unión se une de manera especifica a un epitopo. Cuando un anticuerpo de IGF-1R, polipéptidos de unión o anticuerpo comprende más de un dominio de unión, cada dominio de unión puede unirse de manera especifica al mismo epitopo, para un anticuerpo con dos dominios de unión, llamado "monoespecifico bivalente", o a diferentes epitopos, para un anticuerpo con dos dominios de unión, llamado "biespecifico bivalente". También, un anticuerpo puede ser biespecifico y bivalente para cada especificidad (llamados "anticuerpos tetravalentes biespecificos" ) . En otra modalidad, se pueden elaborar minicuerpos tetravalentes o anticuerpos suprimidos de dominio. Los anticuerpos bivalentes biespecificos, y métodos para elaborarlos, se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,731,168; 5,808,706; 5,821,333; y Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2003/020734 y 2002/0155537, las descripciones de todas las cuales se incorporan como referencia en la presente. Los anticuerpos tetravalentes biespecificos, y los métodos para elaborarlos se describen, por ejemplo, en O 02/096948 y WO 00/44788, las descripciones de ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia: Ver en general, publicaciones PCT, WO 93/17715; O 92/08802; O 91/00360; O 92/05793; Tutt et al., J. Immunol . 147:60-69 (1991); Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648;, 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992) . Como se indica anteriormente, las estructuras de subunidad y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las varias clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Como se usa en la presente, el término "dominio de VH" incluye el dominio variable amino-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio de CH1" incluye el primer dominio de región constante (más amino-terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio de CH1 esta adyacente al dominio de VH y es amino-terminal a la región de articulación de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina . Como se usa en la presente, el término "dominio de CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo de aproximadamente el residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo usando esquemas convencionales de numeración (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración de EU; ver Kabat EA et al. op. cit. El dominio de CH2 es único ya que no está cercanamente apareado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-enlazadas se interponen entre los dos dominios de CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Está bien documentado que el dominio de CH3 se extiende desde el dominio de CH2 a la C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos. Como se usa en la presente, el término "región de articulación" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio de CH1 al dominio de CH2. Esta región de articulación comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo de este modo que las dos regiones de unión a antigeno N-terminales se muevan de manera más independiente. Las regiones de articulación se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios de articulación superior, intermedio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)). Como se usa en la presente, el término "enlace de disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteina comprende un grupo tiol que puede formar un enlace de disulfuro o un puente de disulfuro con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG que se presentan de forma natural, las regiones de CH1 y CL se enlazan por un enlace de disulfuro y las dos cadenas pesadas se enlazan por dos enlaces de disulfuro en posiciones que corresponden a 239 y 242 usando el sistema de numeración de Kabat (posición 226 ó 229, sistema de numeración de EU) . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" será mantenido para querer decir cualquier anticuerpo en donde la región o sitio inmunorreactivo se extiende o deriva en una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, parcial o modificada de acuerdo con la presente invención) se extiende de una segunda especie. En modalidades preferidas, la región o sitio de unión a objetivo será de una fuente no humana (por ejemplo de ratón o primate) y la región constante es humana. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo creado por ingeniería" se refiere a un anticuerpo en el cual la región variable en ya sea la cadena pesada y ligera o ambas se altera por al menos reemplazo parcial de una o más CDR de un anticuerpo de especificidad conocida, y si es necesario, por el reemplazo parcial de la región de estructura alterna y el cambio de secuencia. Aunque las CDR se pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o aun subclase como el anticuerpo del cual se derivan las regiones de estructura alterna, se contempla que las CDR se derivarán de un anticuerpo de diferente clase y de manera preferente de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo creado por ingeniería en el cual una o más CDR "donadoras" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injertan en una región de estructura alterna de cadena pesada o ligera humana se refiere en la presente como un "anticuerpo humanizado". No puede ser necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la región variable donadora para transferir la capacidad de unión a antigeno de un dominio variable a otro. Más bien, sólo puede ser necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión a objetivo. Dadas las explicaciones expuestas en, por ejemplo, las Patente de los Estados Unidos Nos. 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, y 6,180,370, están a bien dentro de la competencia de aquellos expertos en la técnica, ya sea al llevar a cabo experimentación de rutina o por pruebas de ensayo y error el obtener un anticuerpo humanizado o creado por ingeniería funcional . Como se usa en la presente, el término "polipéptido apropiadamente plegado" incluye polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos de IGF-1R) en los cuales todos los dominios funcionales que comprenden el polipéptido son distintamente activos. Como se usa en la presente, el término "polipéptido inapropiadamente plegado" incluye polipéptidos en los cuales al menos uno de los dominios funcionales del polipéptido no es activo. En una modalidad, un polipéptido apropiadamente plegado comprende cadenas de polipéptido enlazadas por al menos un enlace de disulfuro, y por el contrario, un polipéptido inapropiadamente plegado comprende cadenas de polipéptido no enlazadas por al menos un enlace de disulfuro. Como se usa en la presente, el término "creado por ingeniería" incluye manipulación de ácido nucleico o moléculas de polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo por técnicas recombinantes , síntesis peptídica in vitro, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de esta técnica ) . Como se usa en la presente, los términos "enlazado", "fusionado" ó "fusión" se usan de manera indistinta. Estos términos se refieren a la unión conjunta de dos o más elementos o componentes, por cualquier medio que incluye conjugación química o medio recombinante . Una "función encuadro" se refiere a la unión de dos o más cuadros de lectura abiertos (ORF) de polinucleótidos para formar un ORF más largo continuo, de una manera que mantiene el cuadro de lectura de traducción correcto de los ORF originales. De esta manera, una proteína de fusión recombinante es una proteína individual que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no son de naturaleza unida) . Aunque el cuadro de lectura de esta manera se haga continuo a todo lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados, por ejemplo, por una secuencia ligadora en cuadro. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican para las CDR de una región variable de inmunoglobulina se pueden fusionar, en cuadro, pero se separan por un polinucleótido que codifica para al menos una región de estructura alterna de inmunoglobulina o regiones de CDR adicionales, en tanto que las CDR "fusionada" se co-traducen como parte de un polipéptido continuo. En el contexto de los polipéptidos , una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en una dirección amino- a carboxi-terminal en la cual los residuos que son vecinos entre si en la secuencia están contiguos en la estructura primaria del polipéptido. El término "expresión" como se usa en la presente se refiere a un proceso por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un ARN o polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, sin limitación, interrupción génica así como tanto expresión transiente como expresión estable. Se incluye sin limitación, trascripción del gen en ARN mensajero (ARNm) , ARN de transferencia (ARNt ) , ARN de horquilla, pequeño (ARNsh) , ARN de interferencia, pequeño (ARNsi) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de ese ARNm en polipéptido ( s ) . Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico" . Como se usa en la presente, un producto génico puede ser ya sea un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por trascripción de un gen, o un polipéptido que se traduce de un trascripto. Los productos génicos descritos en la presente incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones post-transcripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones post-transduccionales, por ejemplo, metilación, glicosilación, la adición de lipidos, asociación con otras subunidades de proteina, escisión proteolitica , y similares. Como se usa en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o retrasar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el desarrollo o propagación de cáncer. Los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeorando) de la enfermedad, retraso o atraso del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongando supervivencia en comparación a la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquéllos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la condición o trastorno así como aquellos propensos a tener la condición o trastorno a aquellos en los cuales se va a prevenir la condición o trastorno. Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se quiere decir cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para quien se desea el diagnóstico, prognosis o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja, y animales de zoológicos, deportivos o mascotas tal como perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, y demás. Como se usa en la presente, las frases tal como "un sujeto que se beneficiaría de la administración de una molécula de unión" y "un animal en necesidad de tratamiento" incluye sujetos, tal como sujetos mamíferos, quienes se beneficiarían de la administración de una molécula de unión, usada, por ejemplo, para detección de un antígeno reconocido por una molécula de unión (por ejemplo, por un procedimiento de diagnóstico) y/o del tratamiento, es decir, paliación o prevención de una enfermedad tal como cáncer, con una molécula de unión que se une de manera específica a una proteína objetivo determinada. Como se describe en más detalle en la presente, la molécula de unión se puede usar en forma no conjugada o se puede conjugar, por ejemplo, a un fármaco, profármaco o un isótopo. Por "trastorno o enfermedad hiperproliferativa" se quiere decir todo el crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, incluyendo todas las células transformadas y tejidos y todas las células y tejidos cancerígenos. Las enfermedades o trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a, lesiones precancerígenas , crecimiento celular anormal, tumores benignos, tumores malignos, y "cáncer". En ciertas modalidades de la presente invención, el trastorno o enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, la lesión precancerígena , crecimiento celular anormal, tumor benigno, tumor maligno, o "cáncer" comprende células que expresan, sobre-expresan, o expresan anormalmente IGF-R1. Los ejemplos adicionales de enfermedades, trastornos y/o condiciones hiperproliferativas incluyen, pero no se limitan a neoplasmas, ya sea benignos o malignos, localizados en la (el) : próstata, colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides , pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides) , ojo, cabeza y cuello, nervios (centrales y periféricos), sistema linfático, pélvico, piel, tejido blando, bazo, torácico, y tracto urogenital. Estos neoplasmas, en ciertas modalidades, expresa, sobre-expresan, o expresan anormalmente IGF-R1. Otros trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia , trastornos linfoproliferativos , paraproteinemias , púrpura, sarcoidosis, Síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis , y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, localizada en un sistema de órganos listado anteriormente. En ciertas modalidades de la presente invención, las enfermedades comprenden células que expresan, sobre-expresan, expresan anormalmente IGF-R1. Como se usa en la presente, los términos "tumor" o "tejido tumoral" se refieren a una masa anormal de tejido que resulta de división celular excesiva, en ciertos casos tejido que comprende células que expresan, sobre-expresan, o expresan anormalmente IGF-R1. Un tumor o tejido tumoral comprende "células tumorales" que son células neoplásicas con propiedades de crecimiento anormal y ninguna función corporal útil. Los tumores, tejido tumoral y células tumorales pueden ser benignos o malignos. Un tumor o tejido de tumor también puede comprender "células no tumorales asociadas a tumor", por ejemplo, células vasculares que forman vasos sanguíneos para suministrar el tumor o tejido tumoral. Las células no tumorales se pueden inducir para que se repliquen y desarrollen por las células tumorales, por ejemplo, la inducción de angiogénesis en un tumor o tejido tumoral. Como se usa en la presente, el término "malignidad" se refiere a un tumor no benigno o un cáncer. Como se usa en la presente, el término "cáncer" connota un tipo de enfermedad hiperproliferativa que incluye una malignidad caracterizada por crecimiento celular desregulado o no controlado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia o malignidades linfoides. Se señalan más adelante más ejemplos particulares de estos cánceres, e incluyen: cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer pulmonar que incluye cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer endometrial o carcinoma uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, asi como cáncer de cabeza y cuello. El término "cáncer" incluye células o tumores malignos primarios (por ejemplo, aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto diferente del sitio de la malignidad o tumor original) y células o tumores malignos secundarios (por ejemplo, aquellos que surgen de metástasis, la migración de células malignas o células tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original). Los cánceres conductores a métodos de tratamiento de la presente invención comprenden células que expresa, sobre-expresan, o expresan anormalmente IGF-R1. Otros ejemplos se cánceres o malignidades incluyen, pero no se limitan a: Leucemia Linfoblástica Aguda de Infancia, Leucemia Linfoblástica Aguda, Leucemia Linfocitica Aguda, Leucemia Mieloide Aguda, Carcinoma Adrenocortical , Cáncer Hepatocelular de Adulto (Primario), Cáncer de Hígado de Adulto (Primario), Leucemia Linfocitica Aguda de Adulto, Leucemia Mieloide Aguda de Adulto, Enfermedad de Hodgkin de Adulto, Linfoma de Hodgkin de Adulto, Leucemia Linfocitica de Adulto, Linfoma No de Hodgkin de Adulto, Cáncer Hepático Primario de Adulto, Sarcoma de Tejido Blando de Adulto, Linfoma Relacionada a SIDA, Malignidades Relacionadas a SIDA, Cáncer Anal, Astrocitoma, Cáncer de Conductos Biliares, Cáncer de Vejiga, Cáncer Óseo, Glioma de Tallo Cerebral, Tumores Cerebrales, Cáncer de Mama, Cáncer de la Pelvis y Uretra Renal, Linfoma del Sistema Nervioso Central (Primario), Linfoma del Sistema Nervioso Central, Astrocitoma Cerebelar, Astrocitoma Cerebral, Cáncer Cervical, Cáncer Hepatocelular de Infancia (Primario), Cáncer Hepático de Infancia (Primario), Leucemia Linfoblástica Aguda de Infancia, Leucemia Mieloide Aguda de Infancia, Glioma de Tallo Cerebral de Infancia, Astrocitoma Cerebelar De Infancia, Astrocitoma Cerebral de Infancia, Tumores de Células Germinales Extracranial de Infancia, Enfermedad de Hodgkin de Infancia, Linfoma de Hodgkin de Infancia, Glioma de Ruta Visual e Hipotalámico de Infancia, Leucemia Linfoblástica de Infancia, Meduloblastoma de Infancia, Linfoma No de Hodgkin de Infancia, Tumores Neuroectodérmicos Primarios Supratentoriales y Pineales de Infancia, Cáncer Hepático Primario de Infancia, Rabdomiosarcoma de Infancia, Sarcoma de Tejido Blando de Infancia, Glioma Hipotalámico y de Ruta Visual de Infancia, Leucemia Linfocitica Crónica, Leucemia Mielógena Crónica, Cáncer de Colon, Linfoma de Células T Cutáneo, Carcinoma de Células de Islotes Pancreáticos Endocrino, Cáncer Endometrial, Ependimoma, Cáncer Epitelial, Cáncer Esofágico, Sarcoma de Ewing y Tumores Relacionados, Cáncer Pancreático Exocrino, Tumor de Células Germinales Extracranial, Tumor de Células Germinales Extragonadal , Cáncer de Conductos Biliares Extrahepático, Cáncer de Ojo, Cáncer de Mama de Mujer, Enfermedad de Gaucher, Cáncer de Vesícula Biliar, Cáncer Gástrico, Tumor Carcinoide Gastrointestinal, Tumores Gastrointestinales, Tumores de Células Germinales, Tumor Trofoblástico Gestacional, Leucemia de Células Pilosas, Cáncer de Cabeza y Cuello, Cáncer Hepatocelular , Enfermedad de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin, Hipergammaglobulinemia, Cáncer Hipofaríngeo, Canceres Intestinales, Melanoma Infraocular, Carcinoma de Células de Islotes, Cáncer Pancreático de Células de Islotes, Sarcoma de Kaposi, Cáncer de Riñon, Cáncer Laríngeo, Cáncer de Labios y Cavidad Oral, Cáncer de Hígado, Cáncer de Pulmón, Trastornos Linfoproliferativos , Macroglobulinemia , Cáncer de Mama de Varón, Mesotelioma Maligno, Timoma Maligno, Meduloblastoma , Melanoma, Mesotelioma, Cáncer de Cuello Escamoso Primario Oculto Metastásico, Cáncer de Cuello Escamoso Primario Metastásico, Cáncer de Cuello Escamoso Metastásico, Mieloma Múltiple, Mieloma Múltiple/Neoplasma de Células de Plasma, Síndrome Mielodisplástico, Leucemia Mielógena, Leucemia Mieloide, Trastornos Mieloproliferativos , Cáncer de Cavidad Nasal y Senos Paranasales, Cáncer Nasofaríngeo, Neuroblastoma , Linfoma No de Hodgkin Durante Embarazo, Cáncer de Piel No de Melanoma, Cáncer de Pulmón De Células No Pequeñas, Cáncer de Cuello Escamoso Metastásico Primario Oculto, Cáncer Orofaríngeo, Sarcoma Fibroso Osteo/Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno, Osteosarcoma/Histiocitoma Fibroso Maligno de Hueso, Cáncer Epitelial Ovárico, Tumor de Células Germinales de Ovario, Tumor Potencial Maligno Bajo Ovárico, Cáncer Pancreático, Paraproteinemias , Púrpura, Cáncer Paratiroideo, Cáncer de Pene, Feocromocitoma Tumor de Pituitaria, Neoplasma de Células de Plasma/Mieloma Múltiple, Linfoma del Sistema Nervioso Central Primario, Cáncer de Hígado Primario, Cáncer de Próstata, Cáncer Rectal, Cáncer de Células Renales, Cáncer de Uréter y Pelvis Renal, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma , Cáncer de Glándulas Salivales, Sarcomas de Sarcoidosis, Síndrome de Sezary, Cáncer de Piel, Cáncer Pulmonar de Células Pequeñas, Cáncer de Intestino Delgado, Sarcoma de Tejido Blando, Cáncer de Cuello Escamoso, Cáncer de Estómago, Tumores Pineales y Neuroectodérmicos Primitivos Supratentoriales , Linfoma de Células T, Cáncer de Testículo, Timoma, Cáncer de Tiroides, Cáncer de Células de Transición de la Pelvis y Uréter Renal, Cáncer de Pelvis Y Uréter Renal de Transición, Tumores Trofoblásticos , Cáncer de Células de Pelvis Renal y Uréter, Cáncer Uretral, Cáncer Uterino, Sarcoma Uterino, Cáncer Vaginal, Glioma Hipotalámico y de Ruta Visual, Cáncer Vulvar, acroglobulinemia de Waldenstrom, Tumor de ilm, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa , además de neoplasia, localizada en un sistema de órganos listado anteriormente . El método de la presente invención se puede usar para tratar condiciones pre-malignas y para impedir el progreso de un estado neoplástico o maligno, incluyendo pero no limitado a aquellos trastornos descritos anteriormente. Estos usos se indican en condiciones conocidas o sospechosas de preceder el progreso a la neoplasia o cáncer, en particular, donde el crecimiento de células no neoplásicas que consiste de hiperplasia, metaplasia, o más particularmente, displasia, se ha presentado (para revisión de estas condiciones de crecimiento anormal, ver Robbins y Angelí, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia , pp. 68-79 (1976). Estas condiciones en las cuales las células empiezan a expresar, sobre-expresar o expresar anormalmente IGF-R1, son particularmente tratables por los métodos de la presente invención. La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada, que comprende un incremento en el número celular en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o en la función. Los trastornos hiperplásticos que se pueden tratar por el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia de nodulos linfáticos, mediastinal, angiofolicular , hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia melanocitica atipica, hiperplasia de células básales, hiperplasia de nodulos linfáticos gigantes, benigna, hiperplasia de cemento, hiperplasia suprarrenal congénita, hiperplasia sebosa congénita, hiperplasia quistica, hiperplasia quistica de la mama, hiperplasia de dentadura, hiperplasia ductal, hiperplasia endometrial, hiperplasia fibromuscular , hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar intravascular , hiperplasia nodular de próstata, hiperplasia regenerativa nodular, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperplasia sebosa senil, e hiperplasia verrugosa.
La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en la cual un tipo de célula adulta o completamente diferenciada sustituye otro tipo de célula adulta. Los trastornos metaplásticos que se pueden tratar por el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, metaplasia mieloide agnogénica, metaplasia apócrina, metaplasia atipica, metaplasia autoparenquimatosa , metaplasia de tejido conectivo, metaplasia epitelial, metaplasia intestinal, anemia metaplástica , osificación metaplástica, pólipos metaplásticos, metaplasia mieloide, metaplasia mieloide primaria, metaplasia mieloide secundaria, metaplasia escamosa, metaplasia escamosa de saco amniótico, y metaplasia mieloide sintomática. Frecuentemente, la displasia es un precursor de cáncer, y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplástico, que comprende una pérdida en la uniformidad de células individuales y en la orientación arquitectónica de las células. Las células displásticas tienen frecuentemente núcleos profundamente teñidos, anormalmente grandes, y exhiben pleomorfismo . La displasia se presenta de forma característica donde existe irritación o inflamación crónica. Los trastornos displásticos que se pueden tratar por el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, displasia ectodérmica anhidrótica, displasia anterofacial , displasia torácica asfixiante, displasia atriodigital , displasia brocopulmonar , displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocranial , displasia ectodérmica congénita, displasia craniodiafisiaria, displasia craniocarpotarsal , displasia craniometafisiaria, displasia de la dentina, displasia diafisiaria, displasia ectodérmica, displasia de esmalte, displasia encéfalo-oftálmica, epifisiálisis hemimelia de displasia, epifisiálisis múltiple de displasia, epifisiálisis punctata de displasia, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital , displasia fibrosa familiar de quijadas, displasia plegada blanca familiar, displasia fibromuscular, displasia fibrosa de hueso, displasia ósea florida, displasia renal-retinal hereditaria, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica , displasia timica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial, displasia metafisiaria , displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica , displasia mucoepitelial , displasia epifisiaria múltiple, displasia oculoauriculovertebral , displasia oculodentodigital , displasia oculovertebral , displasia odontogénica , displasia oftalmomandibulomélica, displasia cemental periapical, displasia fibrosa poliostótica , displasia espondiloepifisiaria pseudoacondroplástica , displasia retinal, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisial, y displasia ventriculorradial . Los trastornos pre-neoplásticos adicionales que se pueden tratar por el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos disproliferativos benignos (por ejemplo, tumores benignos, condiciones fibrocisticas, hipertrofia de tejido, pólipos intestinales, pólipos de colon, y displasia esofágica) , leucoplaquia, queratosas, enfermedad de Bowen, piel de granjero, queilitis solar, y queratosis solar. En modalidades preferidas, el método de la invención se usa para inhibir el crecimiento, progreso y/o metástasis de cánceres, en particular aquellos listados anteriormente. Las enfermedades, trastornos, y/o condiciones hiperproliferativas, adicionales, incluyen, pero no se limitan a, progreso y/o metástasis de malignidades y trastornos relacionados tal como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocitica aguda (incluyendo mieloblástica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica, y eritroleucemia) ) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocitica (granulocitica) crónica y leucemia linfocitica crónica) ) , policitemia vera, linfornas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin) , mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tal como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénica, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embriónico, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma .
II. IGF-R1 Receptor-1 de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-R1) que se presenta de manera natural. El IGF-R1 es una glicoproteína de membrana, plasmática, heterotetramérica compuesta de dos subunidades a (130 kDa cada una) y dos subunidades ß (90 kDa cada una) enlazadas por enlaces de disulfuro. Massagué, J. y Czech, M.P. J. Biol. Chem. 257:5038-5045 (1992). El IGF-R1 también se conoce en la técnica por los nombres CD221 y JTK13. La secuencia de ácido nucleico del ARNm de IGF-R1 humano está disponible bajo el número de acceso en GenBank NM_000875, y se presenta en la presente como SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO:1 >gi111068002Iref |NM_000875.2 | receptor de factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGFR1) , de Homo sapiens, ARNm TTTTTTTTTTTTTTGAGAAAGGGAATTTCATCCCAAATAA CCCCGACCTCGC GTGGGGGCTCCTG TTCTCTCCGCCGCGCTCTCGCTCTGGCCGACGAGTGGAGAAAT CTGCGGGCCAGGCLATCGACATCCGCAACGACTATCAGCAGCTGAAGCGCCTGGAGAACTGCACGGTGATC GAGGGCTACCTCCACATCCTGCTCATCTCCAAGGCCGAGGACTACCGCAGCTACCGCTTCCCCAAGCTCA CGGTCATTACCGAGTACTTGCTGCTGT CCGAGTXX3CTGGCCTCGAGAGCCTCGGAGACCTCTTCCCCAA CCTC¾CGGTCATCCGCGGCTGGAAAC C TCTACAACTACGCCCTGGTCATCTTCGAGATGACCAATCTC AAGGATATTGGGCTTTACAACCTGAGGAACATTACTCGGGGGGCCATCAGGATTGAGAAAAATGCTGACC TCTGTTACCTCTCCA rGTGGACTGGTCCC GATCCTGGATGCGGTGTCCAATAACTACAT GTGGGGAA TAAGCCCCCAAAGGAATGTGGGGACCTGTGTCCAGGGACCATGGAGGAGAAGCCGATGTGTGAGAAGACC ACCATC-AACAATGAGTACAACTACCGCTGC GGACCACAAACCGCTGCCAGAAAATGTGCCCAAGCACGT GTGGGAAGCGGGCGTGCACCGAGAACAATGAGTGCTGCCACCCCGAGTGCCTGGGCAGCTGCAGCGCGCC TGACAACGACACGGCCTGTGTAGCTTGCCGCCACTACTACTATCCCGGTGTCTGTGTGCCTGCCTGCCCG CCCAACACCTACAGGTTTGAGGGCTGGCGCTGTGTGGACCGTGACTTCTGCGCCAACATCCTCAGCGCCG AGAGCAGCGACTCCGAGGGGTT GTGATCCACGACGGCGAGTGCATGCAGGAGTGCCCCTCGGGCTTCAT CCGCAACGGCAGCCAGAGCATGTACTGCATCCCTTGTGAAGGTCCTTGCCCGAAGGTCTGTGAGGAAGAA AAGAAAACAAAGACCATTGATTCTGTTACTTCTGCTCAGATGCTCCAAGGATGCACCATCTTCAAGGGCA AITTGCTCATTAACATCCGACGGGGGAATAACATTGCTTCAGAGCTGGAGAACTTCATGGGGCTCATCGA GGTGGTGACGGGC ACGTGAAGATCCGCCATTCTCATGCCTTGGTCTCCTTGTCCTTCCTAAAAAACCTT C JCCTCATCCTAGGAGAGGAGCAGCTAGAAGGGAATTACrrCCTTCTACGTCCTCGACAACCAGAACTTGC AGCAACTGTGGGACTGGGACCACCGCAACCTGACCATCAAAGCAGGGAAAATGTACTTTGCTTTCAATCC CAAATTATGTGTTTCCGAAATTTACCGCATGGAGGAAGTGACGGGGACTAAAGGGCGCCAAAGCAAAGGG GACATAAACACCAGGAACAACGGGGAGAGAGCCTCCTGTGAAAGTGACGTCCTGCATTTCACCTCCACCA CCACGTCGAAGAATCGCATCATCATAACCTGGCACCGGTACCGGCCCCCTGACTACAGGGATCTCATCAG CTTCACCGTT ACTACAAGGAAGCACCCTTTAAGAATGTCACAGAGTATGATGGGCAGGATGCCTGCGGC CCAACAGCTGGAACA GGTGGACGTGGACCTCCCGCCCAACAAGGACGTGGAGCCCGGCATCTTACTAC ATGGGCTGAAGCCCTGGACTCAGTACGCCGTTTACGTCAAGGCTGTGACCCTCACCATGG GGAGAACGA CC_ATATCCGTGGGGCCAAGAGTGAGATCTTGTACATTCGCACCAATGCTTC~A^ GACGT CTTTCAGCATCGAACTCCTCTTCTCAGTTAATCGTGAAGTGGAACCCTCCCTCTCTGCCCAACG GCAACCTGAGTTACTACAT GTGCGCTGGCAGCGGCAGCCTCAGGACGGCTACCTTTACCGGCACAATTA CTGCTCCAAAGACAAAATCCCCATCAGGAAGTATGCCGACGGCACCATCGACATTGAGGAGGTCACAGAG AACCCCAAGACTGAGGTGTGTGGTGGGGAGAAAGGGCCTTGCTGCGCCTGCCCCAAAACTGAAGCCGAGA AGCAGGCCGAGAAGGAGGAGGCTGAATACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTGCACAACTCCATCTTCGT GCCCAGACCTGAAAGGAAGCGGAGAGATGTCATGCAAGTGGCCAACACCACCATGTCCAGCCGAAGCAGG AACACC^CGGCCGCAGACACCTACAACATCACCGACCCGGAAGAGCTGGAGACAGAGTACCCTrTTCTTTG AGAGCAGAGTGGATAACAAGGAGAGAACTGTCATTTCTAACCTTCGGCC TCACATTGTACCGCATCGA TATCCACAGCTGCAACCACGAGGCTGAGAAGC GGGCTGCAGCGCCTCCAACTTCGTCTTTGCAAGGAC ATGCCCGCAGAAGGAGCAGATGACATTCCTGGGCCAGTGACCTGGGAGCCAAGGCCTGAAAACTCCATCT T TAAAG GGCCGGAACC1¾AGAATCCCAATGGA GA TCTAATGTATGAAATAAAATACGGATCACA AGTTGAGGATCAGCGAGAATGTG GTCCAGACAGGAATACAGGAAGTATGGAGGGGCCAAGCTAAACCGG CTAAACCCGGGGAACTACACAGCCCGGATTCAGGCCACATCTC CTCTGGGAATGGGTCGTGGACAGATC CTGTGTTCTTC A GTCCAGGCCAAAACAGGATATGAAAACTTCATCCATC GATCATCGCTCTGCCCGT CGCTGTCCTGTTGATCGTGGGAGGGTTGGTGATTATGCTGTACGTCTTCCATAGAAAGAGAAATAACAGC AGGCTGGGGAATGGAGTGCTGTATGCCTCTGTOAACCCGGAGTACTTCAGCGCTGCTGATGTGTACGTTC CTGATGAGTGGGAGGTGGCTCGGGAGAAGATCACCATGAGCCGGGAACTTGGGCAGGGGTCGTTTGGGAT GGTCTATGAAGGAGTTGCCAAGGGTGTGGTGAAAGATGAACCTGAAACCAGAGTGGCCATTAAAACAGTG AACGAGGCCGCAAGCATGCGTGAGAGGATTGAGT TCTCAACGAAGCTTC GTGATGAAGGAGT CAAT GTCACCATGTGGTGCGATTGCTGGGTGTGGTGTCCCAAGGCCAGCCAACACTGGTCATCATGGAACTGAT GACACGGGGCGATCTCAAAAGTTATCTCCGGTCTCTGAGGCCAGAAATGGAGAATAATCCAGTCCTAGCA CCTCCAAGCCTGAGCAAGATGATTCAGATGGCCGGAGAGATTGCAGACGGCATGGCATACCTCAACGCCA ATAAGTTCGTCCACAGAGACCTTGCTGCCCGGAATTGCATGGTAGCCGAAGATTTCACAGTCAAAATCGG AGAT TTGGTATGACGCGAGATATCTATGAGACAGACTATTACCGGAAAGGAGGCAAAGGGCTGCTGCCC GTGCGCTGGATGTC CCTGAGTCCC CAAGGATGGAGTCTTCACCACT ACTCGGACGTCTGGTCCTTCG GGGTCGTCC CTGGGAGATCGCCACACTGGCCX3AGCAGCCC ACCAGGGCTTGTCCAACGAGCAAGTCCT TCGCTTCGTCATGGAGGGCGGCCTTCTGGACAAGCCAGACAACTGTCCTCACATGCTGTTTGAACTGATG CGCATGTGCTGGCAGTATAACCCCAAGATGAGGCCTTCCTTCCTGGAGATCATCAGCAGCATCAAAGAGG AGATGGAGCCTGGCTTCCGGGAGGTCTCCTTCTACTACAGCGAGGAGAACAAGCTGCCCGAGCCGGAGGA GCTGGACCTGGAGCCAGAGAACATGGAGAGCGTCCCCC GGACCCCTCGGCCTCCTCGTCC CCCTGCCA CTJCCCGACAGACACTCAGQACACAAGGCCGAGAACGGCCCCGGCC nSGGGTGCTGGTCCTCCGCGCCA GCTTCGACGAGAGACAGCCTTACGCCCACATGAACGGGGGCOSCAAGAACGAGCGGGCCTTGCCGCTGCC CCAGTCT CGACCTGCTGATCCTTGGATCCTGAATCTGTGCAAACAGTAACGTGTGCGCACGCGCAGCGG GGTGGGGGGGGAGAGAGAGTTTTAAC-AATCCATTCACAAGCCTCCTGTACC CAGTGGATCTTCAGTTCT GCCCTTGCTGCCCGCGGGAGACAGCTTCTCTGC.AGTAAAACACATTO CAAGCAGCTTTTTATTCCCTGCCC-AAACCCTTAACTGACATGGGCCTT AAGAACCTTAATGACAACACT TAATAGCAACAGAGCACTTGAGAACCAGTCTCCTCACTCTGTCCCITGTCCTTCCCnS T rcCCTTTCTC TCTCCTCTCTGCTTC^TAACGGAAAAATAATTGCCACAAG^ AGGAAGTGGCTGTCCCTGTGGCCCCATCCAACCACTGTACACACCCGCCTGACACCGTGGGTCATTACAA AAAAAC-ACGTGGAGATGGAAATTTTTACCTTTATCTTTCAC CCATCGTTCATCCAAGGCTGTTACCATTTTAACGCTGCCTA^ CATCGGCCCGGCGCTGATTCCTCGTGTCCGGAGGCATGGG GAGCATGGCAGCTGGTTGCTCCATTTGAG AGACACGCTGGCGACACACTCCGTCCATCCGACTGCCCCTGCTGTGCTGCTCAAGGCCACAGGCACACAG GTCTCLATTGCTTCTGACTAGAT ATTATTTX-GGGGAAC GGACACAATAGGTCTT CTCTCAGTGAAGGT GGGGAGAAGCTGAACCGGC La secuencia del polipéptido precursor está disponible bajo el número de acceso en GenBank NP_000866, y se presenta en la presente como SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO:2 >gi | 4557665 | ref | NP_000866.11 precursor de receptor de factor 1 de crecimiento tipo insulina [Homo sapiens] MKSGSGGGSPTSLWGLLFLSAALSLWPTSGEICGPGIDIRTOYC^ RSYRFPlOiTVITEYLLLFRVAGLESLGDLFPNLTVIRGWKLFYNYALVIFEMT LKDIGLYNLRNITRGA IRIEKNADLCYLSTTOWSLILDAVSNNYIVGNKPPKEC^^ CQKMCPSTCGKRACTE NECCHPECLGSCSAPDNDTACVACRHYYYAGVCVPACPPN YRFEGW TORD FCANILSAESSDSEGFVIHDGECMQECPSGFI NGSQSMYCI CEGPCPKVCEEEKKTKTIDSVTSAQML QGCTIFKG LLINZRRGNNXASELENFMGLIE\ArrGYV IRHSHAIjVSLSFI- NLRLILGEEQLEG YSF YVLDNQNLO^LWDWDHRNbTIKAGKMYFAF PKIjCVSEIYRMEEVTGT GRQSKGDINTPJTOGERASCES DVLHFTSTTTSKNRIIITWHRYRPPDYTOLISFlVYYKEAPFKt^EYDGQD^^ DVEPGILLHGLKPWTQYAVYVKAVTLTMVE DHIRGAKSEILYIRTNASVPSIPLDVLSASNSSSQLIVK WNPPSLPNGNLSYYIVRWQRQPQDGYLYRHNYCSKD IPIRKYAXKSTIDIEEArENPK EVCGGEKGPCC ACP TEAEKQAEKEEAEYRKVFENFLH SIFVPRPERKRRDV QVANTTMSSRSRN^ LETEYPFFESRVDN ERTVISNLRPFTLYRIDIHSCNHEAEK]^CSASNFVFART PAEGADDIPGP\mí EPRPENSIFLKWPEPENPNGLILMYEI YGSQVEDQRECVSRQEYRKYGGAKL RLNPGNYTARIQATSL SGNGS TDPVFFWQAKTGYENFIHLIIALPVAVLLIVGGLVIMLYVFHRKRNNSRLGNGVLYASVNPEY FSAADVYVPDEWEVAREKITMSRELGQGSFGMVYEGVAKGVVKDEPETRVAIKTVNEAASM^ ASVMKEFNCHHVVRLLGWSQGQPTLVIMEI-MTRGDLK^ DGMAYLNA KFVHRDI.AARNCMVAEDFTVKIGDFGMT TYSDV SFGVVLWEIATIiAEQPYO/SLSNEQVLRFVMEGGLLDKPDNCPD LFELMRMCWQYNPKMRPSFL EIISSIKEE EPGETlEVSFYYSEE KLPEPEELDLEPENMESVPIiDPSASSSSLPLPDRHSGHKAEIIGPG PGVLVLRASFDERQPYAHMNGGRK ERALPLPQSSTC Los aminoácidos 1 a 30 de SEQ ID NO: 2 se reporta que codifican para el péptido de señal de IGF-R1, los aminoácidos 31 a 740 de SEQ I D NO : 2 se reporta que codi f ican para la subunidad a de IGF-R1 , y se reporta que los aminoácidos 741 a 1367 de SEQ I D NO : 2 codif ican para la subunidad ß de IGF-R1 . Éstas y otras características de IGF- Rl humano reportadas en la entrada de GenBank NP_000866 se presentan en la Tabla 2 .
Tabla 2 SEQ ID NO: 2 Característica (de NP_000866) 1 a 30 Péptido de señal 31 a 740 Cadena de receptor alfa de factor 1 de crecimiento tipo insulina 51 a 161 Dominio de receptor L 230 a 277 Repeticiones tipo furina 372 a 467 Dominio de receptor L 494 a 606 Dominio de fibronectina tipo 3 611 a >655 Dominio de fibronectina tipo 3 741 a 1367 Receptor beta de factor 1 de crecimiento tipo insulina 835 a 924 Dominio de fibronectina tipo 3 931 a 955 Región transmembrana 973 fosforilación 980 fosforilación 991 a 1268 Tirosina-cinasa, dominio catalítico 1161 Fosforilación 1165 Fosforilación 1166 Fosforilación La presente invención también se refiere a anticuerpos de IGF-R1, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos que se unen de manera especifica, preferencial o de forma competitiva a proteínas de IGF-R1 no humano, por ejemplo, IGF-R1 de roedores o primates no humanos. El IGF-R1 se expresa en un gran número de células tumorales, incluyendo, pero no limitado a ciertos de los siguientes: tumores de vejiga (Hum. Pathol. 34:803 (2003)); tumores de cerebro (Clinical Cáncer Res. 8:1822 (2002)); tumores de mama (Eur. J. Cáncer 30:307 (1994) y Hum Pathol. 36:448-449 (2005)); tumores de colon, por ejemplo, adenocarcinomas , metástasis, y adenomas (Human Pathol. 30:1128 (1999), Virchows. Are. 443:139 (2003), y Clinical Cáncer Res. 10:843 (2004)); tumores gástricos (Clin. Exp. Metástasis 21:755 (2004)); tumores de riñon, por ejemplo, RCC de células claras, de cromófobos y papilar (Am. J. Clin. Pathol. 122:931-937 (2004)); tumores de pulmón (Hum. Pathol. 34:803-808 (2003) y J. Cáncer Res. Clinical Oncol. 119:665-668 (1993)); tumores de ovario (Hum. Pathol. 34:803-808 (2003)); tumores pancreáticos, por ejemplo, adenocarcinoma ductal (Digestive Diseases. Sci. 48:1972-1978 (2003) y Clinical Cáncer Res. 11:3233-3242 (2005)); y tumores de próstata (Cáncer Res. 62:2942-2950 (2002) ) .
III. Anticuerpos de IGF-Rl En una modalidad, la presente invención se refiere a anticuerpos de IGF-Rl, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos. Por ejemplo, la presente invención incluye al menos los dominios de unión a antigeno de ciertos anticuerpos monoclonales , y fragmentos, variantes, y derivados de los mismos mostrados en las Tablas 3 y 4. La Tabla 3 lista las regiones Fab humanas anti-IGF-Rl humano identificadas de una biblioteca de visualización en fagos y varias propiedades de unión de los anticuerpos, descritos en más detalle en los ejemplos. La Tabla 4 lista anticuerpos monoclonales murinos anti-IGF-Rl humano identificado por tecnología de hibridoma, y varias propiedades de unión de los anticuerpos, descrito en más detalle en los ej emplos .
Tabla 3: Propiedades funcionales de Fab específicas de IGF-Rl Fab unión por ELISA unión por FACS bloqueo de inhibición de IGF fosforilación de IGF- Rl IGF-R1- IGF-R1- InsR IGF-Rl CF-7 IGF- IGF-2 IGF-1 IGF-2 His Fc 3T3 EC50nM 1 Fab unión por ELISA unión por FACS bloqueo de inhibición de IGF fosforilación de IGF- Rl IGF-R1- IGF-R1- InsR IGF-R1 MCF-7 IGF- IGF-2 IGF-1 IGF-2 His Fc 3T3 EC50nM 1 1 M13- + +++ +++ 8.8 + ++ ++ ++ C06 2 M14- ++ +++ +++ 39.8 ++ ++ + +++ Gll 3 M14- ++ +++ +++ 25.4 + ++ ++ C03 4 M14- +++ +++ +++ 29.4 ++ ++ ++ ++ BOl M12- +++ +++ +++ 7.4 ++ ++ + E01 6 M12- + ++ ++ 25.0 + + + + G04 pTy-IGF-Rl >30%@0.1ug/ml bloqueo de ligando >30%@0.1ug/ml >30&@lug/nü >30%@lug/ml >30%@10ug/n >30%@10ug/ml X3D 2x bkg ELISA @0.1ug/ml XD 2x bkg@lug/ml XDD 2x bkg @10ug/ml Tabla 4: Propiedades funcionales de anticuerpos monoclonales murinos ' MCF-1 = célula cancerígena de mama; H-23 y Calu-6 = células de cáncer de pulmón; Panc-1 = células de cáncer pancreático; Colo205 = células de cáncer de colon. pTy-IGF-Rl Bloqueo de *Inhibición de Inhibición de ligando Ki67 ( CF-7) proliferación >30%@0. lug/ml +++ >40%@0. ^g/ml +++ >50%@0.01µ?/p?1 ++++ >30%@0. ??µ?/p?? >30%@1µ?/G?1 ++ >40%@^/ml ++ >50%@0. ?µ?/p?? +++ >30%@0. l g/ml >30%@lC^g/ml + >40%@10µ?/p?1 + >50%@^g/ml ++ >30%@lµg/ml >50%@10µg/rta + >30%@lC^g/ml Se depositaron líneas de ovario de hámster chino que expresan el anticuerpo de longitud completa de M13-C06 y M14- C03 con la American Type Culture Collection ("ATCC") el 28 de Marzo de 2006, y se les dio los Números de Depósito de ATCC, PTA-7444 y PTA-7445, respectivamente. Se depositaron líneas de células de ovario de hámster chino que expresan el fragmento de anticuerpo Fab, M14-G11, con la American Type Culture Collection ("ATCC") el 29 de Agosto de 2006, y se les dio el Número de Depósito de ATCC, PTA-7855. Se depositaron lineas de células de hibridoma que expresan anticuerpos humanos de longitud completa P2A7.3E11, 20C8.3B8, y P1A2.2B11 con la ATCC el 28 de Marzo de 2006, el 13 de Junio de 2006, y el 28 de Marzo de 2006, respectivamente, y se les dio los Números de Depósito de ATCC, PTA-7458, PTA-7732, y PTA-7457, respectivamente. Se depositaron lineas de células de hibridoma que expresan los anticuerpos humanos de longitud completa 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8 con la ATCC el 28 de Marzo de 2006, el 11 de Julio de 2006, y el 11 de Julio de 2006, respectivamente, y se les dio los Números de Depósito de ATCC, PTA-7456, PTA-7730, y PTA-7731, respectivamente. Ver, la Tabla de Depósito de ATCC (posterior) para correlación de anticuerpos y lineas celulares depositadas. La ATCC se localiza en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA. Los depósitos de ATCC se hicieron de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente. Ciertas modalidades de la invención se depositaron con la American Type Culture Collection como se muestra en la siguiente Tabla ("Tabla de de depósito de ATCC") .
Tabla de Depósito de ATCC Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) Nombre de la linea Fecha de Linea celular Anticuerpo celular ("como se depósito referida en la producido : indica en la (número de presente como: recepción de depósito depósito de de ATCC") : ATCC) "Ovario de Hámster 28 de marzo, M13-C06 M13- Chino (CHO) : C06- de 2006 (PTA- C06.G4. agly 40B5; CHO DG44Biogen 7444) Idee EA03.14.06" "Ovario de Hámster 28 de marzo de M14-C03 M14- Chino (CHO) : C03-2 2006 (PTA- C03.G4.P.agly CHO DG44Biogen Idee 7445) DA 03.14.06" "Linea de células de 29 de agosto M14-G11 M14-G11.G4. P ovario de hámster de 2006 (PTA- agly chino: células G1170 7855) 8e6 08.09.2006" Hibridomas Nombre de la linea Fecha de Línea celular Isotipo de celular ("como se depósito referida en la anticuerpo indica en la ( número de presente como: recepción de depósito depósito de de ATCC") : ATCC) "Hibridoma 28 de marzo de P2A7.3E11 IgG2a/k 8P2A7.3D11" 2006 (PTA- 7458) "Linea de células de 13 de junio de 20C8.3B8 IgGl/k hibridoma : 7.20C8.3B8" 2006 (PTA- 7732) Hibridomas "Hibridoma : 28 de marzo de P1A2.2B11 IgG2b/k 5. P1A2.2B11" 2006 (PTA- 7457) "Hibridoma : 28 de marzo de 20D8.24B11 IgGl/k 7.20D8.24.B11" 2006 (PTA- 7456) "Linea de Células de 11 de julio de P1E2.3B12 lgG2b/k Hibridoma 2006 (PTA- 9. P1E2.3B12" 7730) "Linea de Células de 11 de julio de P1G10.2B8 IgGl/k Hibridoma : 2006 (PTA- 5P1G10.2B8" 7731) Como se usa en la presente, el término "dominio de unión a antigeno" incluye un sitio que se une de manera especifica a un epitopo en un antigeno (por ejemplo un epitopo de IGF-1R) . El dominio de unión a antigeno de un anticuerpo incluye típicamente al menos una porción de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una porción de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. El sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. La presente invención se refiere más específicamente a un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados de los mismos, donde el anticuerpo de de IGF-1R se une de manera específica al mismo epítopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y 12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. La invención se refiere además a una anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivados de los mismos, donde el anticuerpo de IGF-1R inhibe de manera competitiva un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04 o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12 y P1G10.2B8 de la unión a IGF-1R. La invención también se refiere a un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado de los mismos, donde el anticuerpo de IGF-1R comprende un dominio de unión a antígeno idéntico a aquél de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y 12-G04, o un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12 y P1G10.2B8. Son bien conocidos en la técnica los métodos para elaborar los anticuerpos y se describen en la presente. Una vez que los anticuerpos a varios fragmentos de, o al IGF-1R de longitud completa sin la secuencia de señal, se han producido, la determinación de que aminoácidos, o epitopo de IGF-1R al cual se une el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno se puede determinar por protocolos de correlación de epitopos como se describe en la presente asi como métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA de intercalación de doble anticuerpo como se describe "Chapter 11 - Inmunology", Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., v.2, John Wiley & Sons, Inc. (1996)). Los protocolos de correlación de epitopos adicionales se pueden encontrar en Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey: Humana Press (1996), que se incorporan ambos en la presente como referencia en sus totalidades. La correlación de epitopos también se puede realizar por medios comercialmente disponibles (es decir ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin) ) . Adicionalmente , los anticuerpos producidos que se unen a cualquier porción de IGF-1R entonces se pueden seleccionar por su capacidad para actuar como un antagonista de IGF-1R, por ejemplo, para inhibir la unión del factor de crecimiento de insulina, por ejemplo, IGF-1, IGF-2, o tanto IGF-1 como IGF-2 a IGF-1R, para promover la internalización de IGF-1R, para inhibir la fosforilación de IGF-1R, para inhibir la fosforilación en la dirección 3', por ejemplo de Akt o p42/44 MAPK, o para inhibir la proliferación, motilidad o metástasis de células tumorales. Los anticuerpos se pueden seleccionar para estas y otras propiedades de acuerdo a métodos descritos en detalle en los Ejemplos. Otras funciones de los anticuerpos de la presente invención se pueden probar usando otros ensayos como se describe en los Ejemplos en la presente . En otras modalidades, la presente invención incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado de los mismos que se une de manera especifica o de manera preferencial a al menos un epitopo de IGF-1R, donde el epitopo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de al menos aproximadamente cuatro a cinco aminoácidos de SEQ ID No. 2, al menos siete, al menos nueve, o entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos SEQ ID No. 2. Los aminoácidos de un epitopo determinado de SEQ ID No. 2 como se describe pueden estar, pero no necesitan estar, contiguos o son lineales. En ciertas modalidades, al menos un epitopo de IGF-1R comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un epitopo no lineal formado por el dominio extracelular IGF-IR como se expresa en la superficie de una célula o como un fragmento soluble, por ejemplo, fusionado a una región Fe de IgG. De esta manera, en ciertas modalidades al menos un epitopo de IGF-IR comprende, consiste esencialmente, o consiste de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID No: 2, donde los aminoácidos no contiguos forman un epitopo a través del plegado de proteina . En otras modalidades, la presente invención incluye un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado de los mismos que se unen de manera especifica o preferencial a al menos un epitopo de IGF-IR, donde el epitopo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, además de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID No. 2 como se describe anteriormente, y una porción adicional que modifica la proteina, por ejemplo, una porción de carbohidratos se puede incluir tal que el anticuerpo de IGF-IR se una con mayor afinidad a la proteina objetivo modificada que lo que hace a una versión no modificada de la proteina. De manera alternativa, el anticuerpo de IGF-IR no se une para nada a la versión no modificada de la proteína objetivo. En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado de los mismos que se une de manera específica a un polipéptido de IGF-IR o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-IR, con una afinidad caracterizada por una constante disociación (KD) que es menor que la KD para un anticuerpo monoclonal determinado de referencia. En ciertas modalidades, un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo de la invención se une de manera específica a al menos un epítopo de IGF-IR o fragmento o variante descrito anteriormente, es decir, se une a este epítopo más fácilmente que lo que se uniría a un epítopo no relacionado, o aleatorio; se une de manera preferencial a al menos un epítopo de IGF-IR o fragmento o variante descrito anteriormente, es decir, se una a este epítopo más fácilmente que lo que se uniría a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo; inhibe de manera competitiva la unión de un anticuerpo de referencia que se une por sí mismo de manera específica o preferencial a un cierto epítopo de IGF-IR o fragmento o variante descrito anteriormente; o se une a al menos un epítopo de IGF-IR o fragmento o variante descrito anteriormente con una afinidad caracterizada por una constante disociación KD de menos de aproximadamente 5 X 10 "2M, aproximadamente 10 ~2M, aproximadamente 5 X 10 "3M, aproximadamente 10 ~3M, aproximadamente 5 X 10 "4M, aproximadamente 10 "M, aproximadamente 5 X 10 "5M, aproximadamente 10 "5M, aproximadamente 5 X 10 ~6M, aproximadamente 10 "6M, aproximadamente 5 X 10 "7M, aproximadamente 10 "7M, aproximadamente 5 X 10 "8M, aproximadamente 10 "8M, aproximadamente 5 X 10 "9M, aproximadamente 10 "9M, aproximadamente 5 X 10" 10M, aproximadamente 10" 10M, aproximadamente 5 X 10"nM, aproximadamente 10"nM, aproximadamente 5 X 10" 12M, aproximadamente 10" 12M, aproximadamente 5 X 10" 13 , aproximadamente 10" 13M, aproximadamente 5 X 10" 14M, aproximadamente 10" 14M, aproximadamente 5 x 10" "15M, aproximadamente 10 15 En un aspecto particular, el anticuerpo o fragmento del mismo se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-IR humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-IR murino o fragmento del mismo. En otro aspecto particular, el anticuerpo o fragmento del mismo se une de manera preferencial a uno o más polipéptidos de IGF-IR o fragmentos de los mismos, por ejemplo, uno o más polipéptidos de IGF-IR de mamífero, pero no se une a polipéptidos del receptor de insulina (InsR) . En tanto que no se una por teoría, se conoce que los polipéptidos de receptor de insulina tienen alguna similitud de secuencia con los polipéptidos de IGF-IR, y anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con InsR pueden producir efectos secundarios indeseados in vivo, por ejemplo, interferencia con el metabolismo de glucosa. Como se usa en el contexto de las constantes de disociación de unión a anticuerpo, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos utilizados para medir la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de la instrumentación usada, el error estándar basado en el número de muestras medidas, y el error de redondeo, el término "aproximadamente 10"12M" puede incluir, por ejemplo, desde 0.05 M a 0.005 M. En modalidades especificas, un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo de la invención se une a polipéptido de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación ( k (disociación) ) de menos de o igual a 5 x 10~2 seg"1, 10"2 seg" 1, 5 x 10~3 seg"1 o 10~3 seg-1. De manera alternativa, un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante o derivado del mismo de la invención se une a polipéptidos de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación ( k (disociación) ) de menos de o igual a 5 x 10"4 seg"1, 10"4 seg"1, 5 x 10"5 seg"1, o 10"5 seg"1 5 x 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 x 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1.
En otras modalidades, un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante o derivado del mismo de la invención se une a polipéptidos de IGF-1R o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de asociación ( k (asociación) ) de más de o igual a 103 M"1 seg"1, 5 x 103 M'1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 x 104 M"1 seg-1. De manera alternativa, un anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado de los mismos de la invención se une a polipéptidos de IGF-1R o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de asociación ( k (asociación) ) de más de o igual a 105 M"1 seg"1, 5 x 105 M"1 seg"1, 106 M"1 seg"1, o 5 x 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1. En varias modalidades, un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante o derivado del mismo como se describe en la presente es un antagonista de la actividad de IGF-1R. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la unión de un anticuerpo de IGF-1R antagonista a IGF-1R como se expresa en una célula tumoral inhibe la unión del factor de crecimiento de insulina, por ejemplo, IGF-1, IGF-2, o tanto IGF-1 como IGF-2 a IGF-1R, promueve la internalización de IGF-1R inhibiendo de este modo su capacidad de transducción de señales, inhibe la fosforilación de IGF-1R, inhibe la fosforilación de moléculas en la dirección 3' en la ruta de transducción de señal, por ejemplo, Akt o p42/44 MAPK, o inhibe la proliferación , motilidad o metástasis de células tumorales . A menos que se señale de forma especifica, como se usa en la presente, un "fragmento del mismo" en referencia a un anticuerpo se refiere a un fragmento de unión a anticuerpo, es decir, una porción del anticuerpo que se une de manera especifica al antigeno. En una modalidad, un anticuerpo de IGF-IR, por ejemplo, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de IGF-IR, biespecifico, por ejemplo, un anticuerpo biespecifico, minicuerpo, anticuerpo suprimido en dominio, o proteina de fusión que tiene especificidad de unión para más de un epitopo, por ejemplo, más de un antigeno o más de un epitopo en el mismo antigeno. En una modalidad, un anticuerpo de IGF-IR biespecifico tiene al menos un dominio de unión especifico para al menos un epitopo en un polipéptido objetivo descrito en la presente, por ejemplo, IGF-IR. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR biespecifico tiene al menos un dominio de unión especifico para un epitopo en un polipéptido objetivo y al menos un dominio de unión a objetivo especifico para un fármaco o toxina. En aún otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR biespecifico tiene al menos un dominio de unión especifico para un epitopo en un polipéptido objetivo descrito en la presente, y al menos un dominio de unión especifico para un profármaco. Un anticuerpo de IGF-IR biespecifico puede ser un anticuerpo tetravalente que tiene dos dominios de unión a objetivo específicos para un epitopo de un polipéptido objetivo descrito en la presente y dos dominios de unión a objetivo específicos para un segundo objetivo. De esta manera, un anticuerpo de IGF-IR biespecífico tetravalente puede ser bivalente para cada especificidad. Los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención, como se conoce por aquéllos expertos en la técnica, pueden comprender una región constante que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente de Cl de complemento a una región constante de anticuerpo puede activar el sistema de complemento. La activación de complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos celulares. La activación de complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar comprendida en la hipersensibilidad autoinmunitaria . Además, los anticuerpos unidos a receptores en varias células mediante la región Fe, con un sitio de unión a receptor Fe en la región Fe de anticuerpo que se une a un receptor Fe (FcR) en una célula. Hay varios receptores Fe que son específicos para diferentes clases de anticuerpo, incluyendo IgG (receptores gamma), IgE (receptores epsilon) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión del anticuerpo a los receptores Fe en las superficies celulares activa varias respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen engullición y destrucción de partículas revestidas con anticuerpo, depuración de complejos inmunitarios , lisis de células objetivo revestidas con anticuerpo por células aniquiladoras (llamada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo, o ADCC) , liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de producción de inmunoglobulinas . Por consiguiente, ciertas modalidades de la invención incluyen un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo, en el cual al menos una fracción de uno o más de los dominios de región constante se han suprimido o alterado de otro modo para proporcionar características bioquímicas deseadas tal como funciones efectoras reducidas, la capacidad para dimerizar de manera no covalente, capacidad incrementada para localizarse en el sitio de un tumor, vida media reducida en suero, o vida media incrementada en suero en comparación con un anticuerpo no alterado, completo de aproximadamente la misma inmunogenicidad . Por ejemplo, ciertas modalidades para el uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente son anticuerpos suprimidos en dominio que comprenden una cadena de polipéptido similar a una cadena pesada de inmunoglobulina , pero que carecen de al menos una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado se suprimirá, por ejemplo, todo o parte del dominio de CH2 se suprimirá. En otras modalidades, ciertos anticuerpos para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente tienen regiones constantes, por ejemplo una región constante de cadena pesada de IgG4, que se altera para eliminar la glicosilación, referido en otra parte de la presente como anticuerpos "agly". En tanto que no se une por teoría, se cree que los anticuerpos "agly" pueden tener un perfil mejorado de seguridad y estabilidad in vivo. En ciertos anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos descritos en la presente, la porción Fe se puede mutar para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas. Por ejemplo, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fe del anticuerpo modificado en circulación, incrementando de este modo la localización del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de región constante consistentes con la presente invención moderen la unión del complemento y de esta manera reduzcan la vida media en suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar enlaces de disulfuro o porciones de oligosacáridos que permitan la localización mejorada de vida a especificidad incrementada del antígeno o flexibilidad incrementada del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tal como localización tumoral, biodistribución y vida media en suero, se pueden medir fácilmente y cuantificar usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin experimentación indebida. Las formas modificadas de los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden elaborar de anticuerpos de origen o precursores completos usando técnicas conocidas. Se analizan en más detalle en la presente las técnicas de ej emplo . En ciertas modalidades tanto en las regiones variables como constantes de los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos son completamente humanos. Los anticuerpos completamente humanos se pueden elaborar usando técnicas que se conocen en la técnica y como se describe en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos completamente humanos contra un antígeno específico se pueden preparar al administrar el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir estos anticuerpos en respuesta a estímulo antigénico, pero cuyo locus endógeno se ha deshabilitado. Las técnicas de ejemplo que se pueden usar para elaborar estos anticuerpos se describen en las patentes de los Estados Unidos números 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140. Se conocen otras técnicas. Los anticuerpos completamente humanos se pueden producir igualmente por varias tecnologías de visualización, por ejemplo, sistemas de visualización en fagos u otros sistemas de visualización viral, como se describe en más detalle en otra parte de la presente. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden elaborar o manufacturar usando técnicas que se conocen. En ciertas modalidades, las moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas se "producen de manera recombinante" , es decir, se producen usando tecnología de ADN recombinante. Las técnicas de ejemplo para elaborar las moléculas de anticuerpo o fragmentos de las mismas se analizan en más detalle en otra parte de la presente. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo tal que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una de manera específica a su epítopo cognado. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpo que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolitica , enlace a un ligando celular u otra proteina, etcétera. Cualquiera de las modificaciones químicas numerosas se puede llevar a cabo por técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina , etcétera. Adicionalmente , el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. En ciertas modalidades, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención no producirán una respuesta inmunitaria perjudicial en el animal que se va a tratar, por ejemplo, en un humano. En una modalidad, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se modifican para reducir su inmunogenidad usando técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden humanizar, primatizar, desinmunizar, o se pueden elaborar anticuerpos quiméricos. Estos tipos de anticuerpos se derivan de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo murino o de primate, que retiene o retiene sustancialmente las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo de origen, pero que es menos inmunogénico en humanos. Esto se puede lograr por varios métodos, que incluyen (a) insertar los dominios variables no humanos completos en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos; (b) injertar al menos una parte de una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) no humanas en regiones constantes y de estructura alterna humanas con o sin retención de residuos de estructura alterna, críticos; o (c) transplantar los dominios variables no humanos completos, pero "cubriéndolos" con una sección tipo humana por reemplazo de los residuos de superficie. Estos métodos se describen en Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), y patentes de los Estados Unidos números 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 y 6,190,370, todo de los cuales se incorporan de este modo como referencia en su totalidad. También se puede usar la des-inmunización para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Como se usa en la presente, el término "des-inmunización" incluye alteración de un anticuerpo para modificar epítopos de células T (ver por ejemplo, W09852976A1, WO0034317A2) . Por ejemplo, se analizan las secuencias de VH y VL el anticuerpo de inicio y un "mapa" de epítopos de células T humanas de cada región V que muestra la ubicación de los epítopos con relación a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y otros residuos claves dentro de la secuencia. Los epítopos de células T individuales del mapa de epítopos de células T se analizan a fin de identificar sustituciones alternativas de aminoácidos con un bajo riesgo de alterar la actividad del anticuerpo final. Un intervalo de secuencias de VH y VL alternativas se diseñan las cuales comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan de manera subsiguiente en una variedad de polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos, para el uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente, que entonces se prueban para la función. Típicamente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes de cadena pesada y ligera completos que comprenden las regiones V modificada y C humana entonces se clonan en vectores de expresión y los plásmidos subsiguientes se introducen en las líneas celulares para la producción del anticuerpo completo. Los anticuerpos entonces se comparan en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados, y se identifica la variante óptima. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden generar por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Se pueden producir anticuerpos policlonales a un antígeno de interés por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo de IGF-1R, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecífico del mismo, se puede administrar a varios animales hospedadores que incluyen, pero no se limitan a, conejos, ratones, ratas, pollos, hámsteres, cabras, burros, etcétera, para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Se pueden usar varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica , dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen pero no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tal como hidróxido de aluminio, sustancias activas en la superficie tal como lisolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol , y adyuvantes humanos potencialmente útiles tal como BCG (bacilo de Calmette-Guerin ) y Corynebacterium parvum. Estos adyuvantes son bien conocidos en la técnica. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas que incluyen el uso de técnicas de hibridoma, recombinante y de visualización en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo se pueden producir anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma que incluyen aquéllas conocidas en la técnicas y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerlong Ket al., in: Monoclonal Antibodies and t-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981) (estas referencias incorporadas como referencia en sus totalidades) . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente no se limita a anticuerpo producidos a través de tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon individual, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al método por el cual se produce. De esta manera, el término "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando ratones de supresión de IGF-1R para incrementar las regiones de reconocimiento de epítopo. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas que incluyen el uso de tecnología de hibridoma y recombinante y de visualización en fagos como se describe en otra parte de la presente. Usando protocolos reconocidos en la técnica, en un ejemplo, se formulan anticuerpos de mamíferos por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno pertinente (por ejemplo, IGF-1R purificado o extractos celulares que comprenden IGF-1R) y un adyuvante. Esta inmunización produce típicamente una respuesta inmunitaria que comprende la producción de anticuerpos reactivos a antígeno de esplenocitos o linfocitos activados. En tanto que los anticuerpos resultantes se pueden recolectar del suero del animal para proporcionar preparaciones policlonales , frecuentemente es deseable aislar los linfocitos individuales del bazo, nodulos linfáticos o sangre periférica para proporcionar preparaciones homogéneas de anticuerpos monoclonales (MAb) . De manera preferente, los linfocitos se obtienen del bazo. En este proceso bien conocido (Kohler et al., Nature 256:495 (1975)) los linfocitos de una vida relativamente corta, o mortales, de un mamífero que se han inyectado con antígenos se fusionan con una línea de células tumorales inmortales (por ejemplo, una línea de células de mieloma) , produciendo de esta manera células híbridas o "hibridomas" que son tanto inmortales como capaces de producir el anticuerpo genéticamente codificado de la célula B. Los híbridos resultantes se segregan en cepas genéticas individuales por selección, dilución y recrecimiento con cada cepa individual que comprende genes específicos para la formación de un anticuerpo individual. Producción de anticuerpos que son homogéneos contra un antígeno deseado, en referencia a su paternidad genética pura, se llaman "monoclonales". Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembren y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene de manera preferente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de células de mieloma, parentales, no fusionadas. Aquéllos expertos en la técnica apreciarán que los reactivos, líneas celulares y medios para la formación, selección y crecimiento de hibridomas están comercialmente disponibles de varias fuentes y están bien establecidos los protocolos estandarizados. En general, el medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se valora para producción de anticuerpos monoclonales contra el antigeno deseado. De manera preferente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por ensayos in vitro tal como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) . Después de que las células de hibridoma se identifica que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos normales (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies an Practice, Academia Press, pp 59-103 (1986)). Adicionalmente , se apreciará que los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero por procedimientos convencionales de purificación, tal como por ejemplo, cromatografía de proteína A, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Se pueden generar fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos, por técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden producir los fragmentos Fab y F(ab' ) 2 manera recombinante o por escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tal como papaina (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentas F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio de CHl de la cadena pesada. Aquéllos expertos en la técnica también apreciarán que también se pueden derivar anticuerpos codificantes de ADN o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, sitios de unión a antigeno) de bibliotecas de anticuerpos, tal como bibliotecas de visualización en fagos. En particular, este fago se puede utilizar para visualizar dominios de unión a antigeno expresados de un repertorio o biblioteca de anticuerpos de combinación (por ejemplo, humana o murina) . El fago que expresa un dominio de unión a antigeno que se une al antigeno de interés se puede seleccionar o identificar con antigeno, por ejemplo, usando antigeno marcado o antigeno unido o capturado a una superficie o cuenta sólida. El fago usado en estos métodos es típicamente fago filamentoso que incluye los dominios de unión fd y M13 expresados del fago con Fab, Fv OE DAB (región Fv individual de cadenas ligera o pesada) o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con disulfuro fusionados de manera recombinante a ya sea la proteína del gen III o gen VIII de fago. Se exponen métodos de ejemplo, a manera de ejemplo, en EP 368, 684 Bl; patente de los Estados Unido número 5,969,108, Hoogenboom, H.R. and Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al., Nat. Med. 8:801 (2002); Huie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 98:2682 (2001); Lui et al . , J. Mol. Biol. 315:1063 (2002), cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Varias publicaciones (por ejemplo Marks et al., Bio/'Technology 10:779-783 (1992)) han descrito la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad por trasposición de cadena, asi como infección de combinación y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos grandes. En otra modalidad, se puede usar visuali zación ribosomal para reemplazar el bacteriófago como la plataforma de visualización (ver, por ejemplo Hanes et al., Nat. Biotechnol . 18:1287 (2000); ilson et al., Proc. Nati. Acad, Sci. EUA 98:3750 (2001); o Irving et al., J. Immunol Methods 248:31 (2001)). En aún otra modalidad, se pueden seleccionar bibliotecas de superficie celular para anticuerpos (Boder et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97:1071 (2000); Daugherty et al., J. Immunol Methods 243:211 (2000)). Estos procedimientos proporcionan alternativas a técnicas tradicionales de hibridoma para el aislamiento y clonación subsiguiente de anticuerpos monoclonales. En métodos de visualización en fago, los dominios de anticuerpos funcionales se visualizan en la superficie de partículas de fago que tienen las secuencias de polinucleótido que las codifican. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican para las regiones VH y VL se amplifican o aislan de otro modo de bibliotecas de ADNc de animal (por ejemplo, bibliotecas de ADNc humano o murino de tejidos linfoides) o bibliotecas de ADNc sintético. En ciertas modalidades, el ADN que codifica para las regiones de VH y VL se une conjuntamente por un ligador scFv por PCR y se clonan en un vector de fagómido (por ejemplo, pCANTAB6 o pComb 3 HSS) . El vector se electropora en E. coli y el E. coli se infecta con un fago auxiliar. El fago usado en estos métodos es típicamente fago filamentoso que incluye fd y 13 y las regiones de VH o VL usualmente se fusionan de manera recombinante a ya sea el gen III o gen VIII de fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de interés (es decir, un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo) se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie o cuenta sólida. Los ejemplos adicionales de métodos de visualización en fago que se pueden usar para elaborar los anticuerpos incluyen aquéllos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1994); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eut . J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Solicitud PCT número PCT/GB91/01134 ; publicaciones PCT WO 90/02809; O 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de los Estados Unidos números ,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección en fago, las regiones codificantes de anticuerpo del fago se pueden aislar y usar para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpo humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antigeno, deseado, y expresar, en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levadura y bacteria. Por ejemplo, también se pueden emplear técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab ' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tal como aquéllos descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12 ( 6) : 864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (las referencias incorporadas como referencias en sus totalidades) . Los ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fv de cadena individual y anticuerpos incluyen aquéllos . descritos en las patentes de los Estados Unidos números 4, 946, 778 y 5, 258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988). Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes especies animales, tal como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); patentes de los Estados Unidos números 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397, que se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de un anticuerpo de especie no humana que se une al antigeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana en regiones de estructura alterna de una molécula de inmunoglobulina humana. Frecuentemente, los residuos de estructura alterna en las regiones de estructura alterna humanas se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, de manera preferente para mejorar, la unión a antigeno. Estas sustituciones de la estructura alterna se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de estructura alterna para identificar residuos de estructura alterna importantes para la unión a antigeno y comparación de secuencia para identificar residuos inusuales de estructura alterna en posiciones particulares (ver, por ejemplo, Queen et al., patente de los Estados Unidos número 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que se incorpora en la presente como referencia en sus totalidades. Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas que incluyen, por ejemplo injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT O 91/09967; patentes de los Estados Unidos números 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), enchapado o remodelado superficial (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)); y transposición de cadena (patente de los Estados Unidos número 5,565,332). Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Se pueden elaborar anticuerpos humanos por una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de visualización en fago descritos anteriormente que usan bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver también, patentes de los Estados Unidos números 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. También se pueden producir anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se pueden introducir los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana, al azar o por recombinación homologa en células madre embriónicas de ratón. De manera alternativa, se puede introducir la región variable, la región constante y la región de diversidad, humanas, en células madre embriónicas de ratón además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón se pueden volver no funcionales de manera separada o de manera simultánea con la introducción de locus de inmunoglobulina humana o recombinación homologa. En particular, la supresión homocigosa de la región de JH impide la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embriónicas modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos entonces se cruzan para producir descendencia homocigótica que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antigeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido objetivo deseado. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno a partir de los ratones transgénicos , inmunizados, usando tecnología convencional de hibridoma. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se rearreglan durante la diferenciación de células B, y subsiguientemente sufren cambio de clase y mutación somática. De esta manera, usando esta técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para un análisis detallado de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir estos anticuerpos, ver, por ejemplo, publicaciones PCT WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; patentes de los Estados Unidos números 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; y 5,939,598, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Además, las compañías tal como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) y GenPharm (San José, Calif.) se pueden contratar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a aquella descrita anteriormente . Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado se pueden generar usando una técnica referida como "selección guiada". En este planteamiento, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epitopo. (Jespers et al., Bio/'Technology 12:899-903 (1988). Ver también patente de los Estados Unidos número 5,565,332). Adicionalmente, los anticuerpos para seleccionar como objetivo los polipéptidos de la invención se pueden utilizar, a su vez, para generar anticuerpos anti-idiotipo que "imitan" los polipéptidos objetivo usando técnicas bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444 (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147 ( 8 ): 2429-2 38 (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a o inhiben competitivamente la multimeri zación del polipéptido y/o la unión de un polipéptido de la invención a un ligando, se pueden usar para generar anti-idiotipos que "imitan" el dominio de unión y/o multimeri zación del polipéptido, y como consecuencia, se unen a y neutralizan el polipéptido y/o su ligando. Estos anti-idiotipos o fragmentos Fab neutralizantes de estos anti-idiotipos se pueden usar en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando del polipéptido. Por ejemplo, estos anticuerpos anti-idiotípicos se pueden usar para unirse a un polipéptido objetivo deseado y/o para unir sus ligandos/receptores, y bloquear de este modo su actividad biológica . En otra modalidad, el ADN que codifica para anticuerpos monoclonales deseados se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas tal como, pero no limitado a, células de E. coli, células COS simiescas, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producen de otro modo inmunoglobulinas . De manera más particular, el ADN aislado (que puede ser sintético como se describe en la presente) se puede usar para clonar secuencias de región constante y variable para la manufactura de anticuerpos como se describe en Newman et al., patente de los Estados Unidos número 5,658,570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorpora en la presente como referencia. Esencialmente, esto conlleva a la extracción de ARN de las células seleccionadas, conversión a ADNc, y amplificación por PCR usando cebadores específicos de Ig. Los cebadores adecuados para este propósito también se describen en la patente de los Estados Unidos número 5,658,570. Como se analizará en más detalle más adelante, se pueden cultivar células transformadas que expresen el anticuerpo deseado, en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la inmunoglobulina . En una modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos una CDR de cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos dos CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos tres CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos cuatro CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos cinco CDR de una o más moléculas de anticuerpo. En otra modalidad, un anticuerpo de IGF-IR de la invención comprende al menos seis CDR de una o más moléculas de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo de ejemplo que comprenden al menos una CDR que se puede incluir en los presentes anticuerpos de IGF-IR se describen en la presente. En una modalidad específica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera se pueden inspeccionar para identificar las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) por métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por comparación a secuencias conocidas de aminoácidos de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Usando técnicas de ADN recombinante de rutina, se pueden insertar una o más de las CDR dentro de las regiones de estructura alterna, en, por ejemplo, regiones de estructura alterna humanas para inmunizar un anticuerpo no humano. Las regiones de estructura alterna pueden ser regiones de estructura alterna de consenso que se presentan de manera natural, y de manera preferente, regiones de estructura alterna humanas (ver, por ejemplo, Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:451-419 (1998) para un listado de regiones de estructura alterna humana). De manera preferente, el polinucleótido generado por la combinación de las regiones de estructura alterna y las CDR codifica para un anticuerpo que se une de manera especifica a al menos un epitopo de un polipéptido deseado, por ejemplo, IGF-1R. De manera preferente, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones de estructura alterna, y de manera preferente, las sustituciones de aminoácidos mejorar la unión del anticuerpo a su antigeno. Adicionalmente , estos métodos se pueden usar para elaborar sustituciones o supresiones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteina de región variable que participan en un enlace de disulfuro intra-cadena para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces de disulfuro intra-cadena . Se abarcan por la presente invención otras alteraciones al polinucleótido y están dentro de la habilidad de la técnica. Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) al empalmar genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad apropiada a antigeno junto con genes de una molécula de anticuerpo de humano de actividad biológica apropiada. Como se usa en la presente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tal como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados. De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (patente de los Estados Unidos número 4,694,778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883 (1988); y Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena individual. Los anticuerpos de cadena individual se forman al enlazar los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, que da por resultado un anticuerpo de cadena individual. También se pueden usar técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)). Aún otras modalidades de la presente invención comprenden la generación de anticuerpos humanos o sustancialmente humanos en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son incapaces de producción endógena de inmunoglobulina (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos números 6,075,181; 5,939,598; 5,591,669; y 5,589,369, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia). Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo es ratones mutantes de linea germinal y quiméricos da por resultado inhibición completa de producción endógena de anticuerpos. La transferencia de un arreglo de gen de inmunoglobulina humana a un ratón mutante de linea germinal dará por resultado la producción de anticuerpos humanos en la estimulación con el antigeno. Otros medios preferidos para generar anticuerpos humanos usando ratones SCID se describen en la patente de los Estados Unidos número 5,811,524 que se incorpora en la presente como referencia. Se apreciará que el material genético asociado con estos anticuerpos humanos también se puede aislar y manipular como se describe en la presente . Aún otro medio altamente eficiente para generar anticuerpos recombinantes se describe por Newman, Biotechnology 10: 1455-1460 (1992). De manera especifica, esta técnica da por resultado la generación de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes de humano. Esta referencia se incorpora como referencia en su totalidad en la presente. Además, esta técnica se describe en las patentes comúnmente asignadas de Estados Unidos números 5,658,570; 5,693,780; y 5,756,096, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. En otra modalidad, se pueden seleccionar linfocitos por micromanipulación y los genes variables se aislan. Por ejemplo, se pueden- aislar células mononucleares de sangre periférica de un mamífero inmunizado y cultivar durante aproximadamente 7 días in vitro. Los cultivos se seleccionan para IgG específicas que cumplan los criterios de selección. Se pueden aislar células de concavidades positivas. Las células B que producen Ig individual se pueden aislar por FACS o al identificarlas en un ensayo de placa hemolítica mediado por complemento. Las células B que producen Ig se pueden micromanipular en un tubo y los genes de VH y VL se pueden amplificar usando, por ejemplo, RT-PCR. Los genes de VH y VL se pueden clonar en un vector de expresión de anticuerpo y transfectar en células (por ejemplo, células eucarióticas o procarióticas ) para expresión. De manera alternativa, se pueden seleccionar líneas de células que producen anticuerpo y cultivar usando técnicas bien conocidos por los expertos. Estas técnicas se describen en una variedad de manuales de laboratorio y publicaciones primarias. A este respecto, se describen técnicas adecuadas para el uso en la invención como se describe más adelante en Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds . , Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991) que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo los complementos. Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o de manera preferente, por técnicas de expresión recombinante como se describe en la presente. En una modalidad, un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la invención comprende una región constante sintética en donde se suprimen de manera parcial o completa uno o más dominios ("anticuerpos suprimidos de dominio"). En ciertas modalidades, los anticuerpos modificados compatibles comprenderán construcciones o variantes suprimidas de dominio, en donde se ha removido el dominio completo de CH2 (construcciones ?0?2). Para otras modalidades, se puede sustituir un péptido conectador corto por el dominio suprimido para proporcionar flexibilidad y libertad de movimiento para la región variable. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que estas construcciones son particularmente preferidas debido a las propiedades reguladoras del dominio de CH2 en la velocidad catabólica del anticuerpo. Se pueden derivar construcciones suprimidas de dominio usando un vector que codifica para un dominio constante humano de IgGi (ver, por ejemplo, WO 02/060955A2 y WO 02/096948A2) . Este vector se maneja para suprimir el dominio de CH2 y proporcionar un vector sintético que expresa una región constante de IgGi suprimida de dominio. En ciertas modalidades, los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención son minicuerpos. Se pueden elaborar minicuerpos usando los métodos descritos en la técnica (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos número 5,837,821 o WO 94/09817A1) . En una modalidad, un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo de la invención comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene supresión o sustitución de unos pocos o aún un solo aminoácido en tanto que permite asociación entre las subunidades monoméricas. Por ejemplo, la mutación de un aminoácido individual en áreas seleccionadas del dominio de CH2 puede ser suficiente para reducir de forma sustancial la unión de Fe e incrementar de este modo la localización del tumor. De manera similar, puede ser deseable suprimir simplemente aquella parte de uno o más dominios de región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, unión a complemento) que se va a modular. Estas supresiones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) en tanto que dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el presente dominio de región constante. Además, como se alude anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden ser sintéticas a través de la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos, lo que mejora el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión a Fe) en tanto que mantiene sustancialmente la configuración y perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Aún otras modalidades comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tal como la función efectora o proporcionar más unión a citotoxina o carbohidrato. En estas modalidades, puede ser deseable insertar o replicar secuencias específicas derivadas de dominios seleccionados de región constante . La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, variantes (incluyendo derivados) de moléculas de anticuerpo (por ejemplo, las regiones de VH y/o las regiones de VL) descritas en la presente, anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen de manera inmunoespecifica a un polipéptido de IGF-1R o fragmento o variante del mismo. Se pueden usar técnicas normales conocidas por aquellos expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo de IGF-1R, incluyendo, pero no limitado a, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que da por resultado sustituciones de aminoácidos. De manera preferente, las variantes (incluyendo derivados) codifican para menos de 50 sustituciones de aminoácidos, menos de 40 sustituciones de aminoácidos, menos de 30 sustituciones de aminoácidos, menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos, con relación a la región de VH de referencia, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, región de VL, VL-CDR1, VL-CDR2, o VL-CDR3. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales con cadenas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptofano, histidina). De manera alternativa, se pueden introducir mutaciones de manera aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para la actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad (por ejemplo, la capacidad para unirse a un polipéptido de IGF-1R) . Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en las regiones de estructura alterna o sólo en las regiones de CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser imperceptibles o mutaciones sustitutivas neutrales, es decir, que no tienen, o tienen poco, efecto en la capacidad del anticuerpo para unirse al antigeno, en realidad algunas de estas mutaciones no alteran en absoluto la secuencia de aminoácidos. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones, o para mejorar la producción de anticuerpos de hibridoma. Las regiones codificantes optimizadas por codones que codifican para los anticuerpos de IGF-1R de la presente invención se describen en otra parte de la presente. De manera alternativa, las mutaciones sustitutivas no neutrales pueden alterar la capacidad del anticuerpo para unirse al antigeno. La ubicación de la mayoría de las mutaciones sustitutivas neutrales e imperceptibles probablemente va a estar en las regiones de estructura alterna, en tanto que la ubicación de la mayoría de las mutaciones sustitutivas no neutrales probablemente va a estar en la CDR, aunque esto no es un requerimiento absoluto. Un experto en la técnica será capaz de diseñar y probar moléculas mutantes con las propiedades deseadas tal como ninguna alternación en la actividad de unión a antígeno o alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión a antígeno o cambio en la especificidad de anticuerpo). Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar por rutina y la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ejemplo, la capacidad para unirse de manera inmunoespecífica a al menos un epítopo de un polipéptido de IGF-1R) se puede determinar usando técnicas descritas en la presente o por técnicas rutinariamente modificadoras conocidas en la técnica.
IV. Polinucleót idos que codifican para anticuerpos de IGF-IR La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos IGF-IR, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención. En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleót ido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina, donde al menos una de las CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada son al menos 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VH-CDRl, VH-CDR2, o VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos de IGF-IR monoclonales descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones de VH-CDRl, VH-CDR2, y VH-CDR3 de la VH son al menos 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VH-CDRl, VH-CDR2, y VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos de IGF-IR monoclonales descritos en la presente. De esta manera, de acuerdo a esta modalidad una región variable de cadena pesada de la invención tiene secuencias de polipéptido de VH-CDRl, VH-CDR2, o VH-CDR3 relacionadas a las secuencias de polipéptido mostradas en la Tabla 5: Tabla 5: Secuencias* de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y CDR3 de referencia GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCT KYTMH TGTTCAGCCTGGTGGT CTTTACGTCTTTCTT (SBQ GCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTAC NO: 10) G (! ACTATGCATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA ID ID| AGGTTTGGAGTGGGTT CTTCTATCGTTTCTT NO: 11) |NO:12) CTGGTGGCTGGACTGATTATGCTGACTCCGTT AAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTC TAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCT TAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GCGAGAGATCGGAGTATAGCAGCAGCTGGTAC CGGTTGGTCTGTGAGTTTTGTGGACTGGTTCG ACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCAAGC (SBQ ID ???ß) EVQLLESGGGL.VQPGGSLRI.Í5CAASGFTFSKY tTMHWVRQAPGKGLEWVSSIVSSGGWTDYADSVi (GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDRSIAAAGTGWSVSFVD FDPWGQGTLVTV ISS ID NO: 9) 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN/PP ( VH-CDR 1. VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 ' VH-CDR2, y VH-CDR3 subrayado) Í113-C06 GAGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCT[ YRMQ IGISPSGGT [WSGGSGYA )ptim¡zado GGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT (SEQ IDjTWYADSVK [FDI (SBOl GCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCATTTAC -15) G (SBoJlD CGTATGCAGTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAA ID NO:17) GGGGCTGGAGTGGGTTTCCGGTATCTCTCCCT NOtl6) CTGGTGGCACGACGTGGTATGCTGACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTC CAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGATACTGCAGTGTACTACTGC GCCAGATGGTCCGGGGGCTCCGGATACGCCTT CGACATCTGGGGACAGGGAACCATGGTCACCG TCTCAAGC (SBQ ID NO.18) EVQLLESGGGLVQPGOSLRLSCAASGFTFSIY RMOWVRQAPGKGLEWVSGISPSGGTTWYADSV I8RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWSGGSGYAFD WGQGTMVTVSS (SBQ ID NO: 14) 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH, l'N/l'l' (VH-CDR 1. VH CDR1 VH CD 2 VH C 3 ' VH-CDR2, y VH-CDR3 subrayado) ' Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN/PP (VH-CDR I . (VH CDR1 N7H CDR2 tVH CDR3 VH-CDR2. y VH-CDR3 subrayado) M14-C03 C3AGGTCCAGCTGTTGGAGTCCGGCGGTGGCCT YM S pttSPSGGL pGARGYGM •Optimizado 3GTGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT (SEQ IDTTWYADSVK v (SBQj 3CGCAGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAAGTAC HO: 27 ) (SKQjID ATGATGTCTTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGAAA ¡NOt29) GGGGCTGGAGTGGGTTTCCTATATCTCTCCCT ÍHO:28) CTGGTGGCCTGACGTGGTATGCTGACTCCGTO AAGGGCCGGTTCACAATCTCCAGAGACAATTC CAAGAACACTCTGTACCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGATACTGCAGTGTACTACTGC GCCAGAGATGGGGCTAGAGGATACGGAATGGAl CGTCTGGGGACAGGGAACCACCGTCACCGTCT CAAGC (SBQ ID NOi30) BVQLLBSGGGLVQPGGSLRLSCAASGPTFSKY MMS VRQAPGKQLEWVSY SPSGGLTWYADSV RGRFT SRDNSXNTLYLQMNSURAKDTAVYYC ARD8ARGYGMDV GQOTTVTVSS (SBQ ID NOt26) 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH. PÑ/PP (VH-CDR I . VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VH-CDR2. y VH-CDR3 subrayado) M14-G11 GAAGTTCAATTGT AGAGTCTGGTGGCGGTCT tJYPMY RISSSGGR DRWSRSAA rGTTC-AGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTC (SEQ IDrVYADSVK EYGLGGY GCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAATTAC NO:33) ? (SBQ (SEQ ID CCTATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAA XO NO:35> 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN/PP (VH-CDR I, VH CDR1 VH CDR2 VE CDR3 VH-CDR2, y VH-CDR3 subrayado) I20C8.3B8 SACGTCCAACTGCAGGAGTCTGGACCTGACCTlSGYSWH (YIHYSGGT SGYGYRSA GGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCT (SEQ ID NYNPSLKS [YYFDY GCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTjWO 44) (SBQ ID (SBQ ID rATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGG |NO:45) [NO: 46) ftAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACT A.CAGTGGTGGCACTAACTACAACCCATCTCTC AAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATC CAAGAACCAGTTCTTCCTCCAGTTGAATTCTG rGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGT GCAAGATCGGGGTACGGCTACAGGAGTGCGTAi CTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGTCTCCTCA (SBQ ID NO: 2) DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGl YSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSL1 SRISITRDTS NQFFLQLNSVTTEDTATYYC ARSGYGYRSAYYFDY GQGTTVTVSS (SEQ ID NCH43) 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH, PÑPP (VH-CDRI, VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 ' VH-CDR2. y VH-CDR3 subrayado) 1 Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN PP (VH-CDR 1 , VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VH-CDR2, y VH-CDR3 subrayado) P1G10.2B8 CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGACCT NHGMN MINTNTGE PLYYRNGR SAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCT (SBQ ID PTYADDFK !ÍFDV SCAAGGCTTC GGGTATACC CACAAACCAT NO: 59) 3 (SBQ (SBQ ID SGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAA ID WOt61) 3GATTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCA MO:60) ACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTC AAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTC TGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACC TCAAAAATGAGGACACXJGCTACATATTTCTGT GCAAGTCCCCTCTACTATAGGAACGGGCGATA CT CGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCA CCGTCTCC (SEQ ID NO: 57) QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNH GMNWVKQAPGKDLKWMGWINTNTGEPTYADDF KGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC ASPLYYRNGRYFD GAGTTVTVSS (SBQ XD NO: 58) * Determinado por el sistema de Kabat (ver supra) . N = secuencia de nucleótidos, P = secuencias de polipéptido. Como se conoce en la técnica, "identidad de secuencia" entre dos polipéptidos o dos polinucleótidos se determina al comparar la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de un polipéptido o polinucleótido a la secuencia de un segundo polipéptido o polinucleótido . Cuando se analiza en la presente, si cualquier polipéptido particular es al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idéntico a otros polipéptidos se puede determinar usando métodos y programas de computadora/software conocidos en la técnica tal como, pero no limitado a, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95 % idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo a la presente invención, los parámetros se ajustan, por supuesto, tal que el porcentaje de identidad se calcule con respecto a la longitud completa de la secuencia de polipéptidos de referencia y que se permitan separaciones en la homología de hasta 5 % del número total de aminoácidos en la secuencia de referencia. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de manera específica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de VH se altera sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada de este modo. Por ejemplo, la secuencia se puede alterar para uso mejorado de codones en una especie determinada, para remover sitios de empalme, o para remover sitios de enzimas de restricción. Las optimizaciones de secuencia tal como éstas se describen en los ejemplos y son bien conocidas y se llevan a cabo por rutina por aquellos expertos en la técnica. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina en la cual las regiones de VH-CDRl, VH-CDR2, y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VH-CDRl, VH-CDR2, y VH-CDR3 mostrados en la Tabla 5. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14- C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, o inhibirá competitivamente este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 1CT2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 1CT3 M, 5 x 10" M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10~5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10~7 , 5 x 10~8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 , 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10~n M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10~13 M, 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M, o 10"15 M . En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una región variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina, donde al menos una de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de la VL-CDR de la región variable de cadena ligera son al menos 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idénticas a secuencias de aminoácidos de VL-CDRl, VL-CDR2, o VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos de IGF-1R monoclonales descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones de VL-CDRl, VL-CDR2, y VL-CDR3 de la VL son al menos 80 %, 85, 90 %, o 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VL-CDRl, VL- CDR2, y VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos de IGF-1R monoclonales descritos en la presente. De esta manera, de acuerdo a esta modalidad, una región variable de cadena ligera de la invención tiene secuencias de polipéptido de VL-CDRl, VL-CDR2, o VL-CDR3 relacionadas a las secuencias de polipéptido mostradas en la Tabla 6.
Tabla 6: Secuencias* de aminoácidos de VL-CDRl, VL-CDR2, y VL- CDR3 de referencia Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN PP(VH-CI)R 1. <TL CDR1 VJj CDR2 Vli CDR3 VH-CDR2, y VH-C R3 subrayado) ACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCClRASQSINGY PVTSSLQS QQSYSTPP TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT[LN (SBQ (SBQ ID rr (SBQ CACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACGGC|ID NO-.74) |NO:75) ELD rACT AAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGA NO: 76) AAGCCCCTAACCTCCTGATCTACGCTACATC CAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTC AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATT CACTC TCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTT rGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGT ACCCCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAl AGCTGGAGATCAAA (SBQ ID NO (72) DIQMTQSPLSLSASVGDRVTITCRASQSING [YLNWYQQKPGKAPNLLIYATSSLQSGVPSRF BGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYS ITPPYTFGQGTKLEIK (SBQ ID NO: 73) IM13-C06 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCpASRDI NY |DASSLQT ¡QQFDSLPH TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATLN (SBQ (SBQ ID h (SBQ CACTTGCCAGGCGAGTCGGGACATTAGAAAC ID NO: 79) tNO.80) TATTTAAATTGGTATCAACAAAAACCAGGGA NO ! 81) AAGCCCCGAAGCTCCTGATCTACGATGCATC CAGTTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTC GGTGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTTAGTT TCACCATCGGCAGCCTGCAGCCTGAAGATAT rGCAACATATTACTGTCAACAGTTTGATAGT CTCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAAC TGGAGATCAAA (SÉQ ID NOi77) DIQMTQSPLSLSASVGD VTITCQASRDIR | YLN YQQKPGKAPKLLIYDASSLQTGVPSRFl GGSGSG DFSF IGSLQPEDIATYYCOOFDS LPHTFGOGTKLEIK (SBQ ID NO:78) M14-B01 GACATCCAGATGACCCAGTTTCCAGCCACCCtRASQSVMRN IGASKRAT HQRSTWPL rGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCT LA (SBQ (SBQ ID GT (SBQ CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATGAGG ID NO: 84 ) lNO.85) ID AACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCC NO:86) AGCCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATC CAAAAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGCCTTCACTC TCACCATCAGCAACCTAGAGCCTGAAGAT T TGCAGTTTATTACTGTCACCAACGTAGCACC TGGCCTCTGGGGACTTTCGGCGCTGGGACCAl AACTG AGGCCAAA (SBQ ID NOt82) DIQMTQFPATLSVSPGBRATLSCRASOSVMRl NIAWYQQKPGQPPRLLIYGASKRATGI ARF SGSGSGTAFTLTISNLEPEDFAVYYCHORST WPLGTFGPGTKLEAK (SBQ ID NO: 83) Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN/1>I'(VH-CDR 1. VI, CDR1 VT, CDR2 VL CDR3 VH-CD 2, y VH-CDR3 subrayado) JM14-G11 bACATCCAGATGAeCCAGTCTCCAGACTCCCjKSSQSVLYS (LASTRES IQQYYSTWT rTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATISNN NYLA l(SBQ ID I(SEQ ID Anticuerpo SECUENCIA de VH. PN/PP(VH-CDR I . VL CDR1 VL CDR2 VT, CDR3 VH-CDR2. y VI I-CDR3 subrayado) P2A7.3E11 SAAGTTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCGCCAlSASSTLSSN ¡RTSULAS IQQGSSIPL TGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTAT [YLH (SBQ (SEQ ID (SEQ CACCTGCAGTGCCAGCTCAACTTTAAGTTCC ID NO:99) toO s 100) ID AATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAG 0:101) GATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGAC ATCCAATCTGGCCTCTGGAGTCCCAGGTCGC TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACT CTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGA TGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGT AGTATACCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCA AGCTGGAOCTGAAG (SBQ ID NO: 7) EWLTQSPTAMAASPGEKITITCSASSTIJSS NYLHWYQQ PGFSPKLLIYRTSNIASGVPG FSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGS SI LTPGAGTKLEL (SEQ ID NO: 98) P1A2.2B11 GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCRASQDISNY rSRLHS IQQGKTLPW TATCTGCCTCTCTGGGAGACAGÁGTCACCAT LN (SBQ (SBQ ID G (SBQ CAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAAT ID [NO: 110) ID TATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATG NO) :>109) NO! 111) BAACTATTAAACTCCTGATCTACTACACATC AAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTC rCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATTT rGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAAAACG CTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGC rGGAAATCAAA (SBQ ID NO: 107) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISN YLNWYQQKPDGTI LI.IYYTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKT LPWTFGGGTKLEI (SBQ ID NO: 108) Anticuerpo SECUENCIA de VH, PN/1>P(VH-CDR 1. V CDR1 VI. CDR2 VL CDR3 VH-CDR2, y VH-CDR3 subrayado) |20D8.24B11 | MISMA COMO 20C8 CP1G10.2B8 |GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCC|RASQDISNY fTSRLH IQQGKTLPW rTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATtLN (SBQ (SBQ ID G (SBQ CAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAATID [NO: 115) ID rATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATG sll4) NO 1116) GATCTGTTAAACTCCTGATCTAC ACACATC AAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTC rCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATAT rGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGAAAGACG CTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGC TGGAAATCAAA (SBQ ID NO: 112) DIQ TQT SSLSASLiGDRVTISCRASQDISN YLNWYQQKPDGSVKLLIYYTSRLHSGVPSRF SGSGSGTDYSIiTISNLEQEDIATYFCQQGKT LPWTFGGGTKLEI (SBQ ID NO: 113) * Determinado por el sistema de Kabat (ver supra) . PN = secuencia de nucleótidos, PP = secuencias de polipéptido. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una región variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina en la cual las regiones de VL-CDRl, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VL-CDRl, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Tabla 6. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una región variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina en la cual las regiones de VL-CDRl, VL-CDR2 y VL-CDR3 se codifican por secuencias de nucleótidos que son idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican para los grupos de VL-CDRl, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Tabla 6. En ciertas modalidades, un anticuerpo fragmento de unión a antigeno que comprende la VL codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, MI 4-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, o inhibirá de manera competitiva este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 1(G2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 M, 1CT3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 1CT5 M, 1CT5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10"11 M, 5 x 10~12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10"14 M, 5 x 10~15 M ó 10"15 M. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una VH al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido de VH de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58 y 63. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencialmente a IGF-1R. En otro aspecto, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VH que tiene una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58 y 63. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH codificada por el polinucleótido se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para VH al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 8, 13, 18, 19, 24, 25, 30, 31, 36, 37, 42, 47, 52, 57 y 62. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH codificada por estos polinucleótidos tiene de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En otro aspecto, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia de ácido nucleico y que codifica para una VH de la invención, donde la secuencia de aminoácidos de la VH se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53 y 63. La presente invención incluye además un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia de un ácido nucleico que codifica para una VH de la invención, donde la secuencia del ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID Nos: 3, 8, 13, 18, 19, 24, 25, 30, 31, 36, 37, 42, 47, 52, 57 y 62. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH purificada por estos polinucleótidos se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, o inhibirá competitivamente este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R, o inhibirá de manera competitiva este anticuerpo monoclonal de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VH codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 1CT3 M, 10~3 , 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 1CT5 M, 5 x 1CT6 M, 10"6 M, 5 x 1CT7 M, 10~7 M, 5 x 10~8 M, 10~8 M, 5 x 10"9 M, 10~9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x ?G11 M, 10"11 M, 5 x 10"12 , 10~12 M, 5 x 10"13 M, 10~13 M, 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M ó 10~15 M. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para una VL al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntica a una secuencia de polipéptido de VL de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113 y 118. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un ácido nucleico que codifica para VL al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 67, 72, 77, 82, 87, 92, 97, 102, 107, 112 y 117. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VL codificada por estos polinucleótidos se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En otro aspecto, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VL que tiene una secuencia de polipéptido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113 y 118. La presente invención incluye además un polinucleótido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VL de la invención, donde la secuencia del ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 67, 72, 77, 82, 87, 92, 97, 102, 107, 112 y 117. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VL codificada por estos polinucleótidos se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12 y P1G10.2B8, o inhibirá competitivamente este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una VL codificada por uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10~2 M, 10~2 M, 5 x 10"3 M, 10"3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 10"5 M, 10"5 M, 5 x 10~6 M, 10"6 M, 5 x 10~7 M, 10"7 M, 5 x 10-8 M, 10~8 M, 5 x 10~9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10"11 M, 10~n M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M ó 10"15 M. Cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente puede incluir además ácidos nucleicos adicionales, que codifican, por ejemplo, para un péptido de señal para secreción directa del péptido codificado, regiones constantes de anticuerpo como se describe en la presente, u otros polipéptidos heterólogos como se describe en la presente . También, como se describe en más detalle en otra parte de la presente, la presente invención incluye composiciones que comprenden los polinucleótidos que comprenden uno o más de los polinucleótidos descritos anteriormente. En una modalidad, la invención incluye composiciones que comprenden un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en donde el primer polinucleótido codifica para un polipéptido de VH como se describe en la presente y en donde el segundo polinucleótido codifica para un polipéptido de VL como se describe en la presente. De manera especifica, una composición que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un polinucleótido de VH y un polinucleótido de VL, en donde el polinucleótido de VH y el polinucleótido de VL codifican para polipéptidos, respectivamente al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idénticos a las secuencias de aminoácidos de polipéptido de VL y VL de referencia seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4 y 68, 8 y 73, 14 y 78, 20 y 83, 26 y 88, 32 y 93, 38 y 98, 43 y 103, 48 y 108, 53 y 103, 58 y 113 y 63 y 118. O de manera alternativa, una composición que comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un polinucleótido de VH, y un polinucleótido de VL al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntico, respectivamente, a secuencias de ácido nucleico de VL y VL de referencia seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3 y 67, 8 y 72, 13 y 77, 18 y 77, 19 y 82, 24 y 82, 25 y 87, 30 y 87, 31 y 92, 36 y 92, 37 y 97, 42 y 102, 47 y 107, 58 y 102, 57 y 112, y 63 y 117. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprend la VH y VL codificada por los polinucleótidos en estas composiciones se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. La presente invención también incluye fragmentos de los polinucleótidos de la invención, como se describe en otra parte. Adicionalmente , los polinucleótidos que codifican para polipéptidos de fusión, fragmentos Fab, y otros derivados, como se describe en la presente, también se contemplan por la invención . Los polinucleótidos se pueden producir o elaborar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo se conoce, se puede montar un polinucleótido que codifique para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo como se describe en Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que comprende, de forma concisa la síntesis de oligonucleótidos de traslape que contienen porciones de la secuencia que codifica para el anticuerpo, fijando y ligando estos oligonucleótidos, y luego por amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR. De manera alternativa, un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo, se puede generar de ácido nucleico de una fuente adecuada. Si no está disponible un clon que contenga un ácido nucleico que codifique para un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, se puede sintetizar de forma química u obtener de una. fuente adecuada un ácido nucleico que codifique para el anticuerpo (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, una biblioteca de ADNc generada de, o ácido nucleico, de manera preferente poli A+ARN, aislada de, cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo u otro anticuerpo de IGF-1R, tal como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) por amplificación de PCR usando cebadores sintéticos hibridi zables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia génica particular para identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica para el anticuerpo u otro anticuerpo de IGF-1R. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR entonces se pueden clonar en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la técnica. Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo, se puede manipular su secuencia de nucleótidos usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) y Ausubel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998), que se incorporan ambos como referencia en la presente en sus totalidades), para generar anticuerpos que tienen una diferente secuencia de aminoácidos, por ejemplo para crear sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos. Un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de IGF-IR, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo se puede componer de cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica para el anticuerpo de IGF-IR, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo se puede componer de ADN de hebra individual y doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra individual y doble, ARN de hebra individual y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de hebra individual y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de hebra individual, y de manera más típica, de doble hebra o una mezcla de regiones de hebra individual y de doble hebra. Además, un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo se puede componer de regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo, también puede contener una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como inosina. Se pueden hacer una variedad de modificaciones al ADN y ARN; de esta manera, "polinucleótido" abarca formas modificadas de manera química, enzimáticamente o de manera metabólica. Un polinucleótido aislado que codifica para una variante no natural de un polipéptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de cadena pesada o porción de cadena ligera de inmunoglobulina) se puede crear al introducir una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la inmunoglobulina tal que se introduzcan en la proteina codificada una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Se pueden introducir mutaciones por técnicas normales, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. De manera preferente, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos no esenciales de aminoácidos.
V. Polipéptidos de Anticuerpo de IGF-IR La presente invención se refiere adicionalmente a polipéptidos aislados que constituyen los anticuerpos de IGF-IR, y polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos. Los anticuerpos de IGF-IR de la presente invención comprenden polipéptidos, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que codifican para regiones de unión a antigeno especificas de IGF-IR derivadas de moléculas de inmunoglobulina. Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivada de" una proteina designada se refiere al origen del polipéptido que tiene una cierta secuencia de aminoácidos. En ciertos casos, el polipéptido o secuencia de aminoácidos que se deriva de un polipéptido de inicio particular o secuencia de aminoácidos tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a aquella de la secuencia de inicio, o una porción de la misma, en donde la porción consiste de al menos 10-20 aminoácidos, al menos 20-30 aminoácidos, al menos 30-50 aminoácidos, o que es identificable de otro modo por un experto en la técnica como que tiene su origen en la secuencia de inicio. En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina , donde al menos una de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada o al menos dos de las VH-CDR de la región variable de cadena pesada son al menos 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 ó VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos de IGF-IR monoclonales descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de la VH son al menos 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 de cadena pesada de referencia de los anticuerpos monoclonales de IGF-IR descritos en la presente. De esta manera, de acuerdo a esta modalidad, una región variable de cadena pesada de la invención tiene secuencias de polipéptido de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 relacionadas a los grupos mostrados en la Tabla 5, supra. En tanto que la Tabla 5 muestra las VH-CDR definidas por el sistema de Kabat, también se incluyen en la presente invención otras definiciones de CDR, por ejemplo, VH-CDR definidas por el sistema de Chothia.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH se une de manera especifica preferencial a IGF-1R. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina en la cual las regiones de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Tabla 5. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VH) de cadena pesada de inmunoglobulina en la cual las regiones de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 mostrados en la Tabla 5, excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones de aminoácido en cualquiera de las VH-CDR. En CDR más grandes, por ejemplo, VH-CDR3, se pueden hacer sustituciones adicionales en la CDR, en tanto que una VH que comprende la VH-CDR se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son conservadoras. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VH se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un polipéptido de VH al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos de polipéptido de VH de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58 y 63. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VH une de manera especifica o preferencialmente a IGF-1R. En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un polipéptido de VH seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 9, 14, 20, 26, 32, 38, 43, 48, 53, 58 y 63. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VH se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de uno o más de los polipéptidos de VH descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, 14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, o inhibirá de manera competitiva este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de uno o más de los polipéptidos de VH descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 1CT3 M, 10~3 M, 5 x 10~4 M, 10~4 M, 5 x 1CT5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 10"7 M, 10"7 M, 5 x 10"8 M, 10"8 M, 5 x 10~9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10~10 M, 5 x 10~n M, 1CT11 M, 5 x 10"12 M, 10~12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 , 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 10~15 M ó 10"15 M . En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VL) de cadena ligera de inmunoglobulina , donde al menos una de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera o al menos dos de las VL-CDR de la región variable de cadena ligera son al menos 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 ó VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos monoclonales de IGF-IR descritos en la presente. De manera alternativa, las regiones de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de la VL son al menos 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 de cadena ligera de referencia de los anticuerpos de IGF-IR monoclonales descritos en la presente. De esta manera, de acuerdo a esta modalidad, una región variable de cadena ligera de la invención tiene secuencias de polipéptido de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 relacionadas a los polipéptidos mostrados en la Tabla 6, supra . En tanto que la Tabla 6 muestra las VL-CDR definidas por el sistema de Kabat, también se incluyen en la presente invención otras definiciones de CDR, por ejemplo, las VL-CDR definidas por el sistema de Chothia. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VL) de cadena pesada de inmunoglobulina en la cual las regiones de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Tabla 6. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado, que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de una región variable (VL) de cadena pesada de inmunoglobulina en la cual las regiones de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 tienen secuencias de polipéptido que son idénticas a los grupos de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 mostrados en la Tabla 6, excepto por una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones de aminoácido en cualquier VL-CDR. En CDR más grandes, se pueden hacer sustituciones adicionales a las VL-CDR3, en tanto que una VL que comprende la VL-CDR se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En ciertas modalidades, son conservadoras las sustituciones de aminoácidos. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende la VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR. En una modalidad adicional, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un polipéptido de VL al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idéntico a una secuencia de polipéptido de VL de referencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113 y 118. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-IR.
En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de un polipéptido de VL seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 68, 73, 78, 83, 88, 93, 98, 103, 108, 113 y 118. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende el polipéptido de VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, uno o más de los polipéptidos de VL descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12 y P1G10.2B8, o inhibirá de manera competitivamente este anticuerpo monoclonal o fragmento de la unión a IGF-1R. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de uno o más de los polipéptidos de VL descritos anteriormente se une de manera especifica o preferencial a un polipéptido de IGF-1R o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-1R, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 1CT2 M, 10~2 M, 5 x 10~3 M, 10"3 M, 5 x 10~4 M, 10"4 M, 5 x 1CT5 M, 10~5 M, 5 x 1CT6 M, 10"6 M, 5 x 10~7 M, 10"7 M, 5 x 1CT8 M, 10"8 M, 5 x 1CT9 M, 10"9 M, 5 x 10"10 M, 10"10 M, 5 x 10-11 M, 10~u M, 5 x 10~12 M, 10"12 M, 5 x 10~13 M, 10~13 M, 5 x 10"14 M, 10"14 M, 5 x 10"15 M ó 10"15 M. En otras modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo comprende, consiste esencialmente de o consiste de un polipéptido de VH, y un polipéptido de VL, donde el polipéptido de VH y el polipéptido de VL, respectivamente son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ó 100 % idénticos a las secuencias de aminoácidos de polinucleótidos de VL y VL de referencia seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 4 y 68, 8 y 73, 14 y 78, 20 y 83, 26 y 88, 32 y 93, 38 y 98, 43 y 103, 48 y 108, 53 y 103, 58 y 113, y 63 y 118. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno que comprende estos polipéptidos de VH-VL se une de manera especifica o preferencial a IGF-1R. Cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente puede incluir además polipéptidos adicionales, por ejemplo, un péptido de señal para dirigir la secreción del polipéptido codificado, regiones constantes de anticuerpo como se describe en la presente, u otros polipéptidos heterólogos como se describe en la presente. Adicionalmente , los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de polipéptido como se describe en otra parte de la presente. Adicionalmente , los polipéptidos de la invención incluyen polipéptido de fusión, fragmentos Fab, y otros derivados, como se describe en la presente. También, como se describe en más detalle en otra parte de la presente, la presente invención incluye composiciones que comprenden los polipéptidos descritos anteriormente . También se entenderá por un experto en la técnica que los polipéptidos del anticuerpo de IgF-lR como se describe en la presente se puede modificar tal que varíen en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión que se presenta de manera natural del cual se derivaron. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de aminoácido derivado de una proteína designada puede ser similar, por ejemplo, tener un cierto por ciento de identidad a la secuencia de inicio, por ejemplo, puede ser 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ó 95 % idéntica a la secuencia de inicio. Adicionalmente, se pueden hacer las sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos o aminoácidos que conducen a sustituciones o cambios conservadores en regiones "no esenciales" de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivada de una proteína designada puede ser idéntica a la secuencia de inicio excepto por una o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales. Un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivado de una proteina designada puede ser idéntica a la secuencia de inicio excepto por una o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte o más sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales. En otras modalidades, un polipéptido o secuencia de aminoácido derivada de la proteina designada puede ser idéntica a la secuencia de inicio excepto por dos o menos, tres o menos, cuatro o menos, cinco o menos, seis o menos, siete o menos, ocho o menos, nueve o menos, diez o menos, quince o menos, o veinte o menos sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales. En ciertas modalidades, un polipéptido o secuencia de aminoácidos derivada y una proteina designada tiene de uno a cinco, de uno a diez, de uno a quince, o de uno a veinte sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos individuales con relación a la secuencia de inicio . Ciertos polipéptidos de anticuerpo de IGF-1R de la presente invención comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos de humano. Sin embargo, ciertos polipéptidos de anticuerpo de IGF-1R comprenden uno o más aminoácidos contiguos derivados de otras especies mamíferas. Por ejemplo, un anticuerpo de IGF-1R de la presente invención puede incluir una porción de cadena pesada de primate, porción de articulación, o región de unión a antigeno. En otro ejemplo, se pueden presentar uno o más aminoácidos derivados de murino en un polipéptido de anticuerpo no murino, por ejemplo, en un sitio de unión a antigeno de un anticuerpo de IGF-1R. En otro ejemplo, el sitio de unión a antigeno de un anticuerpo de IGF-1R es completamente murino. En ciertas aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos específicos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o análogos de los mismos se diseñan para no ser inmunogénicos en el animal al cual se administra el anticuerpo. En ciertas modalidades, un polipéptido de anticuerpo de IGF-1R comprende una secuencia de aminoácidos o una o más porciones normalmente no asociadas con un anticuerpo. Las modificaciones de ejemplo se describen en más detalle más adelante. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo fv de cadena individual de la invención puede comprender una secuencia ligadora flexible, o se puede modificar para adicionar una porción funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco, una toxina, o una marca o marbete) . Un polipéptido de anticuerpo de IGF-1R de la invención puede comprender, consistir esencialmente de, o consistir de una proteina de fusión. Las proteínas de fusión son moléculas quiméricas que comprenden, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina con al menos un sitio de unión a objetivo, y al menos una porción heteróloga, es decir, una porción con la cual no está enlazada de manera natural en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos pueden existir normalmente en proteínas separadas que se pongan conjuntamente en el polipéptido de fusión o pueden existir normalmente en la misma proteína pero se colocan en un nuevo arreglo en el polipéptido de fusión. Se pueden crear proteínas de fusión, por ejemplo, por síntesis química, o al crear y traducir un polinucleótido en el cual las regiones de péptido se codifican en la relación deseada. El término "heterologo" como se aplica a un polinucleótido o un polipéptido, significa que el polinucleótido o polipéptido se deriva de una entidad distinta de aquella del resto de la entidad a la cual se está comparando. Por ejemplo, como se usa en la presente, un "polipéptido heterologo" que se va a fusionar a un anticuerpo de IGF-1R, o un fragmento de unión a antígeno, variante, o análogo del mismo se deriva de un polipéptido no de inmunoglobulina de la misma especie, o un polipéptido de inmunoglobulina o no de inmunoglobulina de una especie diferente.
Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo, cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptofano, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácidos no esencial en un polipéptido de inmunoglobulina se reemplaza de manera preferente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. En otra modalidad, se puede reemplazar una cadena de aminoácidos con una cadena estructuralmente similar que difiera en el orden y/o composición de los miembros de la familia de la cadena lateral. De manera alternativa, en otra modalidad, se pueden introducir al azar mutaciones junto con toda o parte de la secuencia codificante de inmunoglobulina, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden incorporar en los anticuerpos de IGF-1R para el uso en los métodos de diagnóstico y trastorno descritos en la presente y seleccionados por su capacidad para unirse al antigeno deseado, por ejemplo, IGF-1R.
VI. Proteínas de Fusión y Conjugados de Anticuerpo Como se analiza en más detalle en otra parte de la presente, los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención, se pueden fusionar adicionalmente de manera recombinante a un polipéptido heterologo en el N- o C-término o conjugar de manera química (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de IGF-1R específicos de IGF-1R se pueden fusionar o conjugar de manera recombinante a moléculas útiles como marcas en ensayos de detección y moléculas efectoras tal como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos, o toxinas. Ver, por ejemplo, publicaciones PCT O 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente de los Estados Unidos Número 5,314,995; y EP 396, 387. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo tal que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una a IGF-1R. por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolitica, enlace a un ligando celular u otra proteina, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden componer de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos genéticamente codificados. Los anticuerpos específicos de IGF-1R se pueden modificar por procesos naturales, tal como procesamiento post-transduccional , o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Estas modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en literatura de búsqueda voluminosa. Las modificaciones pueden presentarse en otra parte en el anticuerpo específico de IGF-1R, que incluye la estructura principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y el término amino o carboxilo, o en porciones tal como carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los mismos o variados grados en varios sitios en un anticuerpo determinado específico de IGF-1R. También, un anticuerpo determinado específico de IGF-1R puede contener muchos tipos de modificaciones. Los anticuerpos específicos de IGF-1R pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los anticuerpos específicos de IGF-1R, cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales de post-traducción o se puede elaborar por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol , reticulación, ciclización, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, tratamiento con yodo, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas, mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, y ubiquitinación . (Ver, por ejemplo, Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, V. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, Págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)). La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo, y un polipéptido heterologo. El polipéptido heterologo al cual se fusiona el anticuerpo puede ser útil para función o es útil para selección como objetivo de las células que expresan el polipéptido de IGF-1R. En una modalidad, una proteína de fusión de la invención comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera o más de las regiones de VH de un anticuerpo de la invención o la secuencia de aminoácidos de cualquiera o más de las regiones de VL de un anticuerpo de la invención o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterologa. En otra modalidad, una proteína de fusión para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera, dos, tres de las VH-CDR de un anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmentos, variantes, o derivados del mismo, o la secuencia de aminoácidos de cualquiera, dos, tres de las VL-CDR de un anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmentos, variantes, o derivados del mismo, y una secuencia de polipéptido heteróloga. En una modalidad, la proteina de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una VH-CDR3 de un anticuerpo especifico de IGF-1R de la presente invención, o fragmento, derivado, o variante del mismo, y una secuencia de polipéptido heterologo, proteina de fusión que se une de manera especifica a al menos un epitopo de IGF-1R. En otra modalidad, una proteina de fusión comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos una región de VH de un anticuerpo especifico de IGF-1R de la invención y la secuencia de aminoácidos de al menos una región de VL de un anticuerpo especifico de IGF-1R de la invención o fragmentos, derivados o variantes de los mismos, y una secuencia de polipéptido heteróloga. De manera preferente, las regiones de VH y VL de la proteina de fusión corresponden a un anticuerpo de fuente individual (o fragmento scFv o Fab) que se une de manera especifica a al menos un epitopo de IGF- IR. En aún otra modalidad, una proteina de fusión para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera, dos, tres o más de las VH-CDR de un anticuerpo especifico de IGF-1R y la secuencia de aminoácidos de cualquiera, dos, tres o más de las VL-CDR de un anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmentos o variantes de los mismos, y una secuencia de polipéptido heteróloga. De manera preferente, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más de las VH-CDR(s) o de VL-CDR (s) que corresponden a un anticuerpo de fuente individual (o fragmento scFc o Fab) de la invención. También se abarcan por la invención las moléculas de ácido nucleico que codifican para estas proteínas de fusión. Las proteínas de fusión de ejemplo reportadas en la literatura incluyen fusiones del receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capón et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissi et al., DNA Cell Biol . EUA 9:347-353 (1990); y Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990)); L-selectina (receptor de Homing) ( atson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); y Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Scí. EUA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol . 27:2883-2886 (1991); y Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); y receptor a de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)). Como se analiza en otra parte de la presente, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar a polipéptidos heterólogos para incrementar la vida media in vivo de los polipéptidos o para el uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, se puede conjugar PEG a los anticuerpos de IGF-IR de la invención para incrementar su vida media in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. In Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); o Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002). Además, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tal como un péptido para facilitar su purificación o detección. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina , tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteina de fusión. Otras marcas peptidicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la marca "HA", que corresponde a un epitopo derivado de la proteina de hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y la marca "flag". Las proteínas de fusión se pueden preparar usando métodos que son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Números 5,116,964 y 5,225,538). El sitio preciso en el cual se hace la fusión se puede seleccionar de manera empírica para optimizar la secreción o características de unión de la proteína de fusión. El ADN que codifica para la proteína de fusión entonces se transfecta en una célula hospedadora para expresión. Los anticuerpos IGF-1R de la presente invención se pueden usar en forma no conjugada o se pueden conjugar a al menos una de una variedad de moléculas, por ejemplo, para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección del objetivo, o para formar imágenes o para terapias del paciente. Los anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden marcar o conjugar ya sea antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación.
En particular, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden conjugar a agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de respuesta biológica, agentes farmacéuticos, o PEG. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los conjugados también se pueden montar usando una variedad de técnicas que dependen del agente seleccionado que se va a conjugar. Por ejemplo, se preparan conjugados con biotina, por ejemplo, al hacer reaccionar un polipéptido de unión con un éster activado de biotina tal como el éster de N-hidroxisuccinimida de biotina. De manera similar, los conjugados con un marcador fluorescente se pueden preparar en la presencia de un agente de acoplamiento, por ejemplo, aquellos listados en la presente, o por reacción con un isotiocianato, de manera preferente fluoresceína-isotiocianato . Los conjugados de los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se preparan de una manera análoga. La presente invención abarca además anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos de IGF-IR se pueden usar para diagnóstico, por ejemplo, para monitorizar el desarrollo o progreso de una enfermedad neurológica como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficiencia de un tratamiento y/o régimen de prevención determinado. Se puede facilitar la detección al acoplar el anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, metales que emiten positrones que usan varias tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,741,900 para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para el uso como diagnósticos de acuerdo a la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa , o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos adecuados de grupos protésicos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina ; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína , rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina , cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, iIn o "Te. Un anticuerpo de IGF-IR, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo también se puede marcar de manera detectable al acoplarlo a un compuesto quimioluminiscente . La presencia del anticuerpo de IGF-IR marcado de manera quimioluminiscente entonces de determina al detectar la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. Una de las maneras en la cual un anticuerpo de IGF-IR, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo se puede marcar de manera detectable es al enlazar el mismo a una enzima y usar el producto enlazado en un inmunoensayo de enzima (EIA) (Voller, A. , "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) " Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol . 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, Fia., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981) . La enzima, que se une al anticuerpo de IGF-IR reaccionará con un sustrato apropiado, de manera preferente un sustrato cromogénico, de una manera tal para producir una porción química que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotométricos , fluorimétricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de manera detectable del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato-deshidrogenasa , nucleasa estafilococal , isomerasa delta-5-esteroide , alcohol-deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa , triosa-fosfato-isomerasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa , glucosa-oxidasa, beta-galactosidasa , ribonucleasa , ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa . Adicionalmente , la detección se puede lograr por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede lograr por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con normas similarmente preparadas . También se puede lograr la detección usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos . Por ejemplo, al marcar de manera radioactiva el anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antígeno, variante, o derivado del mismo, es posible detectar el anticuerpo a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques , The Endocrine Society, (Marzo, 1986)), que se incorpora en la presente como referencia. El isótopo radioactivo se puede detectar por medios que incluyen, pero no se limitan a, un contador gamma, un contador de escintilación, o autorradiografia . Un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo también se puede marcar de manera detectable usando metales emisores de fluorescencia tal como 152Eu, u otros de la serie de lantánido. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando grupos queladores metálicos tal como ácido dietilentriaminapentacético (DTPA) o ácido etilendiaminatetra-acético (EDTA) . Son bien conocidas las técnica para conjugar varias porciones a un anticuerpo de IGF-1R, o fragmento de unión a antigeno, variante, o derivado del mismo, ver, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp . 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.)/ Academic Press pp. 303-16 (1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). En particular, las moléculas de unión, por ejemplo, los polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente se pueden conjugar a citotoxinas (tal como radioisótopos, fármacos citotóxicos, o toxinas), agentes terapéuticos, agentes citostáticos, toxinas biológicas, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de respuesta biológica, agentes farmacéuticos, ligandos inmunológicamente activos (por ejemplo, linfocinas u otros anticuerpos en donde la molécula resultante se une tanto a la célula neoplásica como a la célula efectora tal como una célula T) , o PEG. En otra modalidad, una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecífico del mismo para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente se pueden conjugar a una molécula que disminuye la vascularización de tumores. En otras modalidades, las composiciones descritas pueden comprender moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos acoplados a fármacos o profármacos. Aún otras modalidades de la presente invención comprenden el uso de moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos conjugados a las biotoxinas específicas o sus fragmentos citotóxicos tal como ricino, gelonina, exotoxinas de pseudomonas o toxina de difteria. La selección de qué molécula de unión conjugada o no conjugada se use, dependerá del tipo y etapa de cáncer, uso de tratamiento adjunto (por ejemplo, quimioterapia o radiación externa) y condición del paciente. Se apreciará que un experto en la técnica puede hacer fácilmente esta selección en vista de las enseñanzas en la presente. Se apreciará que, en estudios anteriores, los anticuerpos anti-tumor marcados con isótopos se han usado de manera exitosa para destruir células en tumores sólidos así como linfornas/leucemias en modelos de animales, y en algunos casos en humanos. Los radioisótopos de ejemplo incluyen: 90Y, 125I, 131I, 123I, U1ln, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, y 188Re . Los radionúclidos actúan al producir radiación ionizante que provoca múltiples rupturas de hebra en el ADN nuclear, conduciendo a muerte celular. Los isótopos usados para producir conjugados terapéuticos producen típicamente partículas a o ß de alta energía que tienen una corta longitud de rutas. Estos radionúclidos aniquilan células a las cuales están en proximidad cercana, por ejemplo células neoplásicas a las cuales el conjugado se ha unido o se ha metido. Tiene poco efecto o ningún efecto en células no localizadas o no ubicadas. Los radionúclidos son esencialmente no inmunogénicos . Con respecto al uso de conjugados radiomarcados en unión con la presente invención, las moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos se pueden marcar de manera directa (tal como a través de tratamiento con yodo) o se pueden marcar indirectamente a través del uso de un agente quelador. Como se usa en la presente, las frases "marcación indirecta" y "planteamiento de marcación indirecta" significan ambas que un agente quelador se une covalentemente a una molécula de unión y al menos un radionúclido se asocia con el agente quelador o de quelación. Estos agentes queladores se refieren típicamente como agentes queladores bifuncionales puesto que se unen tanto al polipéptido como al radioisótopo. Los agentes queladores particularmente preferidos comprenden derivados de ácido 1-isotiocicmatobencil-3-metildioteleno-triaminopenta-acético ("MX-DTPA") y ácido ciclohexil-dietilentriamina-penta-acético ( "CHX-DTPA" ) . Otros agentes queladores comprenden derivados de P-DOTA y EDTA. Los radionúclidos particularmente preferidos para marcación indirecta incluyen ???? y 90Y . Como se usa en la presente, las frases "marcación directa" y "planteamiento de marcación directa" significan ambas que un radionúclido se une de manera covalente de forma directa a un polipéptido (típicamente mediante un residuo de aminoácidos). De manera más específica, estas tecnologías de enlace incluyen marcación aleatoria y marcación dirigida al sitio. En este último caso, la marcación se dirige a sitios específicos en el polipéptido, tal como los residuos de azúcar N-enlazados presentes sólo en la porción Fe de los conjugados. Adicionalmente , son compatibles varias técnicas de marcación directa y protocolos, con la presente invención. Por ejemplo, se pueden preparar polipéptidos marcados con Tecnecio-99 por procesos de intercambio de ligando, al reducir pertecnato (Tc04~) con una solución de iones estannosos, quelando el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicando los polipéptidos de unión a esta columna, o por técnicas de marcación por lotes, por ejemplo, al incubar pertecnato, un agente reductor tal como SnCl2, una solución amortiguadora tal como una solución de ftalato de sodio-potasio, y los anticuerpos. En cualquier caso, son bien conocidos en la técnica los radionúclidos preferidos para marcar directamente los anticuerpos, y un radionúclido particularmente preferido para marcación directa es 131I unido covalentemente mediante residuos de tirosina. Las moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente se pueden derivar, por ejemplo, con yoduro de sodio o potasio radioactivo y un agente oxidante químico, tal como hipoclorito de sodio, cloramina T o similar, o un agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidasa , glucosa-oxidasa y glucosa. Se conocen en la técnica, patentes que se relacionan a queladores y conjugados de queladores. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 4,831,175 de Gansow se refiere a quelatos de ácido dietilentriaminapenta-acético poli-sustituido y conjugados de proteína que contienen los mismos, y métodos para su preparación. Las Patentes de los Estados Unidos Números 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, 5,434,287 y 5,124,471 de Gansow también se refieren a quelatos de DTPA poli-sustituidos. Estas patentes se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades. Otros ejemplos de queladores metálicos compatibles son ácido etilendiaminatetra-acético (EDTA) , ácido dietilentriaminapenta-acético (DPTA), 1 , 4 , 8 , 11-tetra-azatetradecano, ácido 1 , 4 , 8 , 11-tetra-azatetradecano-l , , 8 , 11-tetra-acético, ácido l-oxa-4 , 7 , 12 , 15-tetra-azaheptadecano-4 , 7 , 12 , 15-tetra-acético, o similares. Es particularmente preferido ciclohexil-DTPA o CHX-DTPA y se ejemplifica de forma extensiva más adelante. Aún otros queladores compatibles, incluyendo aquellos que se van a descubrir, se pueden discernir fácilmente por el experto y están claramente dentro del alcance de la presente invención. Los queladores compatibles, incluyendo el quelador bifuncional especifico usado para facilitar la quelación, Patentes de los Estados Unidos Números 6,682,134, 6,399,061, y 5,843,439, incorporadas en la presente como referencias en sus totalidades, se seleccionan de manera preferente para proporcionar alta afinidad para metales trivalentes, exhiben relaciones incrementadas de tumor a no tumor y disminuyen la captación ósea asi como mayor retención in vivo del radionúclido en sitios objetivo, es decir, sitios de tumor de linfoma de células B. Sin embargo, otros queladores bifuncionales que pueden poseer o no todas estas características, se conocen en la técnica y también son benéficos en la terapia tumoral. También se apreciará que, de acuerdo con las enseñanzas en la presente, se pueden conjugar moléculas de unión a las diferentes radiomarcas para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Para este fin, las Patentes de los Estados Unidos Números 6,682,134, 6,399,061, y 5,843,439, mencionadas anteriormente describen conjugados terapéuticos radiomarcados para "formación de imágenes" de diagnóstico de tumores antes de la administración del anticuerpo terapéutico. El conjugado "In2B8" comprende un anticuerpo monoclonal murino, 2B8, especifico al antigeno CD20 humano, que se une a inIn mediante un quelador bifuncional, es decir, MX-DTPA (ácido dietilentriaminapenta-acético) , que comprende una mezcla 1:1 de 1-isotiocianatobencil-3-metil-DTPA y l-metil-3-isotiocianatobencil-DTPA . Es particularmente preferido inIn como un radionúclido de diagnóstico debido a que entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mCi se puede administrar de manera segura sin toxicidad detectable; y los datos de la formación de imágenes son en general predictivos de la distribución del anticuerpo 90Y-marcado subsiguiente. La mayoría de los estudios de formación de imágenes utiliza el anticuerpo marcado con niIn 5 mCi, debido a que esta dosis es tanto segura como tiene eficiencia incrementada en formación de imágenes en comparación con dosis menores, con formación óptima de imágenes que se presenta en de tres a seis días después de la administración del anticuerpo. Ver, por ejemplo, Murray J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985) y Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985). Como se indica anteriormente, son aplicables una variedad de radionúclidos de la presente invención y aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente qué radionúclido es más apropiado bajo varias circunstancias. Por ejemplo, 131I es un radionúclido bien conocido usado para inmunoterapia dirigida a objetivo. Sin embargo, la utilidad clínica de 131I se puede limitar por varios factores que incluyen: vida media física de ocho días; deshalogenación de anticuerpo de tratamiento con yodo tanto en la sangre como en sitios tumorales; y características de emisión (por ejemplo, gran componente gamma) que pueden ser sub-óptimas para el depósito localizado de dosis en el tumor. Con el advenimiento de agentes queladores superiores, la oportunidad para unir grupos queladores metálicos a proteínas ha incrementado las oportunidades de utilizar otros radionúclidos tal como 1:L1In y 90Y . El 90Y proporciona varios beneficios para utilización en aplicaciones radioinmunoterapéuticas : la vida media de 64 horas de 90Y es suficientemente prolongada para permitir la acumulación de anticuerpo por el tumor, y de manera diferente a por ejemplo 131I, el 90Y es un beta-emisor puro de alta energía sin irradiación gamma acompañante en su descomposición, con un intervalo en tejido de 100 a 1,000 diámetros de célula. Adicionalmente, la cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración a pacientes no hospitalizados de anticuerpos marcados con 90Y. Adicionalmente, no se requiere la internalización del anticuerpo marcado para la aniquilación celular, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para células tumorales adyacentes que carecen de la molécula objetivo. Agentes preferidos adicionales para conjugación a moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos son fármacos citotóxicos, particularmente aquellos que se usan para terapia de cáncer. Como se usa en la presente, "un agente citotóxico o citotoxina" significa cualquier agente que sea perjudicial al crecimiento y proliferación de células y pueda actuar para reducir, inhibir o destruir una célula o malignidad. Las citotoxinas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, radionúclidos , biotoxinas, toxinas enzimáticamente activas, agentes terapéuticos citostáticos o citotóxicos, profármacos, ligandos inmunológicamente activos y modificadores de respuesta biológica tal como citocinas. Cualquier citotoxina que actúe para retardar o alentar el crecimiento de células inmunorreactivas o células malignas está dentro del alcance de la presente invención. Las citotoxinas de ejemplo incluyen, en general, agentes citostáticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos , agentes anti-proliferativos, agentes de unión a tubulina, hormonas y antagonistas de hormonas, y similares. Los citostáticos de ejemplo que son compatibles con la presente invención incluyen sustancias de alquilación, tal como mecloretamina , trietilenfosforamida , ciclofosfamida , ifosfamida, clorambucilo, busulfano, melfalano o triazicuona, también compuestos de nitrosourea, tal como carmustina, lomustina, o semustina. Otras clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, la familia maytansinoide de fármacos. Otras clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, la familia de antraciclina de fármacos, los fármacos de vinca per vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de pteridina de fármacos, diynenos, y las podofilotoxinas . Los miembros particularmente útiles de estas clases incluyen, por ejemplo, adriamicina, carminomicina, daunorrubicina (daunomicina) , doxorrubicina , aminopterina , metotrexato, metopterina, mitramicina, estreptonigrina , diclorometotrexato, mitomicina C, actinomicina D, porfiromicina , 5-fluorouracilo, floxuridina, ftorafur, 6-mercaptopurina , citarabina, citosina-arabinósido, podofilotoxina , o derivados de podofilotoxina tal como etopósido o fosfato de etopósido, melfalano, vinglastina, vincristina, leurosidina, vindesina, leurosina y similares. Aún otras citotoxinas que son compatibles con las enseñanzas en la presente incluyen taxol, taxano, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, tenopósido, colquicina, dihidroxi-antracina-diona , mitoxantrona , procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Las hormonas y antagonistas de hormona, tal como corticosteroides , por ejemplo, prednisona, progestinas, por ejemplo, hidroxiprogesterona o medroprogesterona , estrógenos, por ejemplo, dietilestilbestrol, antiestrógenos , por ejemplo, tamoxifeno, andrógenos, por ejemplo, testosterona , e inhibidores de aromatasa, por ejemplo, aminoglutetimida también son compatibles con las enseñanzas en la presente. Un experto en la técnica puede hacer modificaciones químicos al compuesto deseado a fin de hacer reacciones de ese compuesto, más convenientes para los propósitos de preparar conjugados de la invención . Un ejemplo de citotoxinas parcialmente preferidas comprende miembros o derivados de la familia de enediyna de antibióticos anti-tumor, que incluyen caliqueamicina , esperamicinas o dinemicinas. Estas toxinas son extremadamente potentes y actúan al escindir el ADN nuclear, conduciendo a muerte celular. Diferente de las toxinas de proteína que se pueden escindir in vivo para dar muchos fragmentos polipeptídicos inactivos pero inmunogénicos , y las toxinas tal como caliqueamicina, esperamicinas y otras enediynas son moléculas pequeñas que son esencialmente no inmunogénicas . Estas toxinas no peptídicas se enlazan químicamente a los dímeros o tetrámeros por técnicas que se han usado anteriormente para marcar anticuerpos monoclonales y otras moléculas. Estas tecnologías de enlace incluyen enlace específico del sitio mediante los residuos de azúcar N-enlazados presentes sólo en la porción Fe de las construcciones. Estos métodos de enlace dirigidos al sitio tienen la ventaja de reducir los posibles efectos de enlace en las propiedades de unión de las construcciones. Como se alude anteriormente, las citotoxinas compatibles para preparación de los conjugados pueden comprender un profármaco. Como se usa en la presente, el término "profármaco" se refiere a una forma de precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico a células tumorales en comparación al fármaco de origen y es capaz de ser activado de manera enzimática o convertido en la forma de origen más activa. Los profármacos compatibles con la invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos que contienen ß-lactamas, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, y 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir al fármaco libre citotóxicamente más activo. Los ejemplos adicionales de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para el uso en la presente invención comprenden aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Entre otras citotoxinas, se apreciará que las moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente también se pueden asociar con o conjugar a una biotoxina tal como subunidad A de ricino, abrina, toxina de difteria, botulinio, cianginosinas , saxitoxina, shigatoxina, tétanos, tetrodotoxina , tricoteceno, verrucologeno o una enzima tóxica. De manera preferente, estas construcciones se harán usando técnicas de ingeniería genética que permiten la expresión directa de la construcción de anticuerpo-toxina. Otros modificadores de respuesta biológica se pueden asociar con las moléculas de unión, por ejemplo, moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente comprenden citocinas tal como linfocinas e interferones . En vista de la presente descripción, se piensa que un experto en la técnica puede formar fácilmente estas construcciones usando técnicas convencionales . Otra clase de citotoxinas compatibles que se puede usar en asociación con o conjugar a las moléculas de unión descritas, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos, son fármacos radiosensibilizadores que se pueden dirigir de manera efectiva a células tumorales o inmunorreactivas . Estos fármacos mejoran la sensibilidad a la radiación ionizante, incrementando de este modo la eficiencia de la radioterapia. Un conjugado de anticuerpo internalizado por la célula de tumor distribuirá el radiosensibili zador más cerca al núcleo donde será máxima la radiosensibilización . Las moléculas de unión enlazadas al radiosensibilizador no unido de la invención se depurarán más rápidamente de la sangre, colocando el agente radiosensibilizador restante en el tumor objetivo y proporcionando mínima captación en tejidos normales. Después de la depuración rápida de la sangre, se administrará radioterapia adjunta en una de tres maneras: 1) radiación externa con haz dirigida específicamente al tumor, 2) radioactividad implantada directamente del tumor, o 3) radioinmunoterapia sistémica con el mismo anticuerpo de selección de objetivo. Una variación potencialmente atractiva de este planteamiento será la unión de un radioisótopo terapéutico al inmunoconj ugado radiosensibili zado, proporcionando de este modo la conveniencia de administrar al paciente un solo fármaco. En ciertas modalidades, se puede conjugar una porción que mejora la estabilidad o eficiencia de una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecífico del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, se puede conjugar PEG a las moléculas de unión de la invención para incrementar su vida media in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. In Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); o Weir et al., Bioche . Soc. Transactions 30:512 (2002) . La presente invención abarca además el uso de moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos conjugados a un agente de diagnóstico o terapéutico. Las moléculas de unión se pueden usar de forma de diagnóstico para monitorizar, por ejemplo, el desarrollo o progreso de un tumor como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficiencia de un régimen de prevención y/o tratamiento determinado. Se puede facilitar la detección al acoplar la molécula de unión, por ejemplo, el polipéptido de unión, por ejemplo, el anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecí fico del mismo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, metales que emiten positrones usando varias tomografías de emisión de positrones, y iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Número 4,741,900 para iones metálicos que se pueden conjugar a anticuerpos para el uso como diagnósticos de acuerdo a la presente invención. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos adecuados de grupos protésicos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina ; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceina , isotiocianato de fluoresceina , rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina ; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125I, 131I, ??? o "Te. Una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo especifico de IGF-1R o fragmento inmunoespecifico del mismo también se puede marcar de manera detectable al acoplarlo a un compuesto quimioluminiscente . La presencia de la molécula de unión marcada de forma quimioluminiscente entonces de determina al detectar la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. Una de las maneras en las cuales una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico de IGF-1R, o fragmento inmunoespecifico del mismo se puede marcar de manera detectable es al enlazar la misma a una molécula y usando el producto enlazado en un inmunoensayo de enzima (EIA) (Voller, A. , "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) " Microbiological Associates Quarterly Publication, alkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, Fia., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981) . La enzima, que se une a la molécula de unión reaccionará con un sustrato apropiado, de manera preferente un sustrato cromogénico, de una manera tal para producir una porción química que se puede detectar, por ejemplo, por medios espectrofotométricos , fluorimétricos o visuales. Las enzimas que se pueden usar para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, malato-deshidrogenasa, nucleasa estafilococal , isomerasa delta-5-esteroide, alcohol-deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato, deshidrogenasa , triosa-fosfato-isomerasa , peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa , glucosa-oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa , glucoamilasa y acetilcolinesterasa . Adicionalmente , la detección se puede lograr por métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. También se puede lograr la detección por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con normas similarmente preparadas. También se puede lograr la detección usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos . Por ejemplo, al marcar de manera radioactiva la molécula de unión, por ejemplo, el polipéptido de unión, por ejemplo, el anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmento inmunoespecifico del mismo, es posible detectar antigenos de cáncer a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques , The Endocrine Society, (Marzo, 1986) ) , que se incorpora en la presente como referencia. El isótopo radioactivo se puede detectar por medios que incluyen, pero no se limitan a, un contador gamma, un contador de escintilación, o autorradiografia . Una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmento inmunoespecifico del mismo también se puede marcar de manera detectable usando metales emisores de fluorescencia tal como 152Eu, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales se pueden unir al anticuerpo usando grupos queladores metálicos tal como ácido dietilentriaminapentacético (DTPA) o ácido etilendiaminatetra-acético (EDTA) .
Las técnicas para conjugar varias porciones a una molécula de unión, por ejemplo, polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo especifico de IGF-1R, o fragmento inmunoespecifico del mismo, son bien conocidas, por ejemplo, ver Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ) , pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2nd Ed. ) , Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Citotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp . 303-16 (1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
VII. Expresión de Polipéptidos de Anticuerpo Como es bien conocido, se puede aislar el ARN de las células de hibridoma originales o de otras células transformadas por técnicas normales, tal como extracción con isotiocianato de guanidinio y precipitación seguido por centrifugación o cromatografía. Donde es deseable, se puede aislar el ARNm del ARN total por técnicas normales tal como cromatografía en oligo-dT-celulosa . Son familiares las técnicas adecuadas. En una modalidad, los ADNc que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se pueden elaborar, ya sea de manera simultánea o separada, usando transcriptasa inversa o ADN-polimerasa de acuerdo con métodos bien conocidos. Se puede iniciar la PCR por cebadores de consenso de región constante o por cebadores más específicos en base a las secuencias de aminoácidos o de ADN de cadena pesada y ligera publicadas. Como se analiza anteriormente, también se puede usar PCR para aislar clones de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada de anticuerpos. En este caso, las bibliotecas se pueden seleccionar por cebadores de consenso o sondas homologas más grandes, tal como sondas de región constante de ratón. El ADN, típicamente el ADN de plásmido, se puede aislar de las células usando técnicas conocidas, se correlacionan por restricción y se secuencian de acuerdo con técnicas normales bien conocidas expuestas en detalle, por ejemplo, en las referencias anteriores que se relacionan a técnicas de ADN recombinante . Por supuesto, el ADN puede ser sintético de acuerdo a la presente invención en cualquier punto durante el proceso de aislamiento o análisis subsiguiente . Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención, los polinucleótidos que codifican para los anticuerpos de IGF-1R se insertan típicamente en un vector de expresión para introducción en células hospedadoras que se pueden usar para producir la cantidad deseada de anticuerpo de IGF-1R. La expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se une a una molécula objetivo descrita en la presente, por ejemplo, IGF-1R, requiere construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica para una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción de los mismos (que contiene de manera preferente el dominio variable de cadena pesada o ligera) , de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas. De esta manera, se describen en la presente métodos para preparar una proteína al expresar un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifican para el anticuerpo. Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de anticuerpo y señales de control de transducción y trascripción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación sintética in vivo. La invención, proporciona de esta manera vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, enlazado de manera operable a un promotor. Estos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante y la molécula de anticuerpo (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036; y Patente de los Estados Unidos No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo se puede clonar en este vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa. La célula hospedadora se puede co-transfectar con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica para un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica para un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. De manera alternativa, se puede usar un vector único que codifica tanto para polipéptidos de cadena pesada como ligera. En estas situaciones, la cadena ligera se coloca de manera ventajosa antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o AND genómico. El término "vector" o "vector de expresión" se usa en la presente para querer decir vectores usados de acuerdo con la presente invención como un vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula hospedadora . Como se conoce por aquellos expertos en la técnica, estos vectores se pueden seleccionar fácilmente del grupo que consiste de plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente invención comprenderán marcador de selección, sitios apropiados de restricción para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad para entrar y/o replicarse en células eucarióticas o procarióticas . Para los propósitos de esta invención, se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tal como virus de papiloma bovino, virus de polioma, adenovirus, virus de vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros comprenden el uso de sistemas policistrónicos con sitios internos de unión a ribosomas. Adicionalmente , las células que tienen integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar al introducir uno o más marcadores que permitan la selección de células hospedadoras transíectadas . El marcador puede proporcionar prototrofia a un hospedador auxotrófico, resistencia a biocida (por ejemplo antibióticos) o resistencia a metales pesados tal como cobre. El gen marcador seleccionable ya sea se puede enlazar directamente a las secuencias de ADN que se van a expresar, o introducir en la misma célula por co-transfección . También se pueden necesitar elementos adicionales para síntesis óptima del ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señal, secuencias de empalme, así como promotores trascripcionales , intensificadores , y señales de terminación. En modalidades particularmente preferidas, los genes clonados de región variable se insertan en un vector de expresión junto con los genes de región constante de cadena pesada y ligera (preferentemente humanos) sintéticos como se describe anteriormente. En una modalidad, esto se efectúa usando un vector de expresión patentado de Biogen IDEC, Inc., referido como NEOSPLA (descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,159,730). Este vector contiene el promotor/intensificador de citomegalovirus , el promotor principal de beta-globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino, exon 1 y exon 2 de neomicina-fosfotransferasa , y el gen de dihidrofoliato-reductasa y la secuencia guia. Este vector se ha encontrado que da por resultado muy alto nivel de expresión de anticuerpos en la incorporación de genes de región variable y constante, transfección en células CHO, seguido por selección en medio que contiene G418 y amplificación de metotrexato. Por ejemplo, cualquier vector de expresión que sea capaz de producir la expresión en células eucarióticas se puede usar en la presente invención. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a los plásmidos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, y pZeoSV2 (disponible de Invitrogen, San Diego, CA) , y plásmido pCI (disponible de Promega, Madison, WI). En general, la selección de grandes números de células transformadas para aquellos que expresan niveles adecuadamente altos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina es experimentación de rutina que se puede llevar a cabo, por ejemplo, por sistemas robóticas. También se enseñan sistemas de vector en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,736,137 y 5,658,570 cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Este sistema proporciona altos niveles de expresión, por ejemplo, < 30 pg/célula/dia . Otros sistemas de vector de ejemplo se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,413,777. En otras modalidades preferidas, los anticuerpos de IGF-IR, o fragmentos de unión a antigeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención se pueden expresar usando construcciones policistrónicas tal como aquellas descritas en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003-0157641 Al, presentada el 18 de Noviembre de 2002 e incorporada en la presente en su totalidad. En estos sistemas de expresión novedosos, se pueden producir múltiples productos génicos de interés tal como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a partir de una construcción policistrónica única. Estos sistemas usan de manera ventajosa un sitio interno de entrada a ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de anticuerpos de IGF-IR, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-IR o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de células hospedadoras eucarióticas . Secuencias de IRES compatibles se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,193,980 que también se incorporan en la presente. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que estos sistemas de expresión se pueden usar para producir de manera efectiva el intervalo completo de anticuerpos de IGF-IR descritos en la presente solicitud. De manera más general, una vez que se ha preparado el vector o secuencia de ADN que codifica para una subunidad monomérica del anticuerpo de IGF-IR, el vector de expresión se puede introducir en la célula hospedadora apropiada. La introducción del plásmido en la célula hospedadora se puede lograr por varias técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, transfección (que incluyen electroforesis y electroporacion) , fusión de protoplastos , precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN envuelto, microinyección, infección con virus intactos. Ver, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodríguez y Denhardt, Eds., Butterworths , Boston, Mass., Chapter 24.2, pp . 470-472 (1988). Típicamente, la introducción del plásmido en el hospedador es mediante electroporacion. Las células hospedadoras que tienen la construcción de expresión se cultivan bajo condiciones apropiadas a la producción de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, y se valoran para síntesis de proteína de cadena pesada y/o ligera. Las técnicas de ensayo de ejemplo incluyen ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) ; radioinmunoensayo (RIA) , o análisis clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunohistoquímica y similar . El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transíectadas entonces se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo para el uso en los métodos descritos en la presente. De esta manera, la invención incluye células hospedadoras que contienen un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, enlazado de manera operable a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican para tanto las cadenas pesada como ligera se pueden co-expresar en la célula hospedadora para expresión de la molécula completa de inmunoglobulina , como se detalla más adelante. Como se usa en la presente, "células hospedadoras" se refiere a células que tienen vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican para al menos un gen heterólogo. En descripciones de procesos para aislamiento de anticuerpos de hospedadores recombinantes , los términos "célula" y "cultivo celular" se usan de manera indistinta para denotar la fuente del anticuerpo a menos que se especifique claramente de otro modo. En otras palabras, la recuperación del polipéptido de las "células" puede significar ya sea de células enteras centrifugadas, o del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en hospedador para expresar moléculas de anticuerpo para el uso en los métodos descritos en la presente. Estos sistemas de expresión en hospedador representan vehículos por los cuales se pueden producir y purificar de manera subsiguiente las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresan una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estas incluyen pero no se limitan a microorganismos tal como bacterias (por ejemplo E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; levadura (por ejemplo Saccharomyces , Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene secuencias codificantes de anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que tienen construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneina ) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K de virus de vaccinia). De manera preferente, las células bacterianas tal como Escherichia coli, y de manera más preferente, células eucarióticas , especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante entera, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero tal como células de ovario de hámster Chino (CHO) , en unión con un vector tal como el elemento promotor génico temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión efectivo para anticuerpo (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990) ) . La línea de células hospedadoras usada para la expresión de proteína frecuentemente es de origen mamífero; aquellos expertos en la técnica se acreditan con la capacidad para determinar preferencialmente líneas de células hospedadoras particulares que son mejor adecuadas para el producto génico deseado que se va a expresar en la presente. Las líneas de células hospedadoras de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, CHO (de Ovario de Hámster Chino), DG44 y DUXB11 (líneas de Ovario de Hámster Chino, DHFR menos) , HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñon de mono), COS (un derivado de CVI con el antígeno T de SV40), VERY, BHK (riñon de hámster neonato), DCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hámster Chino) BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (linea de riñon de hámster), SP2/0 (mieloma de ratón), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-lclBPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñon humano). Son particularmente preferidas las células CHO. Las lineas de células hospedadoras típicamente están disponibles de servicios comerciales, de la American Tissue Culture Collection o de literatura publicada. Además, se puede elegir una cepa de célula hospedadora que modula la expresión de secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la manera especificada deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación ) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de proteína puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tiene mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-transduccional y modificación de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y procesamiento correcto de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden usar células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento correcto del trascripto primario, para la glicosilación y para la fosforilación del producto génico. Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden manejar líneas de células que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, se pueden transformar células hospedadoras con ADN controlado por elementos apropiados de control de expresión (por ejemplo, promotor, intensificador , secuencias, terminadores de trascripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células manejadas se cultiven durante 1-2 días en un medio enriquecido, y entonces se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y se cultivan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede usar de manera ventajosa para manejar líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. Se pueden usar varios sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a gen de timidita-cinasa de virus de herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sel EUA 48:202 (1992)), y de adenina-fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 1980) se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, se puede usar la resistencia anti-metabolito como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato ( igler et al., Nati. Acad. Sci EUA 77:357 (1980); OHare et al, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia a aminoglicósido G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, An . Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);, TIB TECH 11 ( 5 ) : 155-215 (Mayo, 1993); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades. Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden incrementar por amplificación con vector (para una revisión, ver Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mam alian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia con el gen de anticuerpo, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)). La producción in vitro permite el aumento en escala para dar mayores cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para cultivo de células de mamífero bajo condiciones de cultivo de tejido se conocen en la técnica e incluyen cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor aerotransportado o en un reactor agitado continuo, o un cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas , o microcuentas de agarosa o cartuchos de cerámica. Si es necesario y/o deseado, las soluciones de los polipéptidos se pueden purificar por los métodos cromatográficos habituales, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa o (cromatografía de inmuno) afinidad, por ejemplo, después de la biosíntesis preferencial de un polipéptido de región de articulación sintético o antes de o subsecuente al paso de cromatografía de HIC descrito en la presente . Los genes que codifican para anticuerpos de IGF-1R, o fragmentos de unión a antígeno, variantes, o derivados de los mismos de la invención también se pueden expresar en células no mamíferas tal como células de bacterias o insecto o levadura o planta. Las bacterias que toman fácilmente virus nucleicos incluyen miembros de la familia enterobacteriaceae, tal como las cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus ; Streptococcus, y Haemophilus influenzae. Adicionalmente se apreciará que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos heterólogos llegan a ser típicamente partes de cuerpos de inclusión. Los polipéptidos heterólogos se deben aislar, purificar y luego montar en moléculas funcionales. Cuando se desean formas tetravalentes de anticuerpos, las subunidades entonces se auto-montan en anticuerpos tetravalentes (WO02/096948A2) . En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de manera ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso propuesto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de esta proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de los altos niveles de los productos de proteina de fusión que se purifican fácilmente. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el cual la secuencia codificante de anticuerpo se puede ligar de manera individual en el vector en cuadro con la región codificante de lacZ de modo que se produzca una proteina de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol . Chem . 24:5503-5509 (1989)); y similares. También se pueden usar vectores de pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutationa-S-transferasa (GST) . En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente de células lisadas por adsorción y unión a cuentas de glutationa-agarosa o matriz seguidos por elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de trombina o factor Xa-proteasa de modo que el producto génico objetivo clonado se pueda liberar de la porción de GST. Además de las procariotas, también se pueden usar microbios eucarióticos . Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de cervecero, es el más comúnmente usado entre los microorganismos eucarióticos aunque están comúnmente disponibles varias cepas diferentes, por ejemplo, Pichia pastoris .
Para la expresión en Saccharomyces , el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) se usa comúnmente. Este plásmido contiene ya el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión de trpl como una característica del genoma de célula hospedadora de levadura entonces proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptófano . En un sistema de insecto, se usa típicamente virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpo se puede clonar de manera individual en las regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocar bajo control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina). Una vez que se ha expresado de manera recombinante una molécula de anticuerpo de la invención, se puede purificar con cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antigeno especifico después de la Proteina A, y cromatografía de columna de selección por tamaño) , centrifugación, solubilidad diferencial, o cualquier otra técnica normal para la purificación de proteínas. De manera alternativa, en la US 2002 0123057 Al se describe un método preferido para incrementar la afinidad de los anticuerpos de la invención.
VIII. Métodos de Tratamiento que Usan Anticuerpos Terapéuticos Específicos de IGF-1R o Fragmentos Inmunoespecí fieos de los Mismos Una modalidad de la presente invención proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno interproliferativo, por ejemplo, cáncer, una malignidad, un tumor, o una metástasis del mismo, en un animal que padece de esta enfermedad o está predispuesto a contraer esta enfermedad, el método que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de administrar a un animal una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento imunoespecífico del mismo, que se une a IGF-1R o una variante de IGF-1R. Los anticuerpos adecuados incluyen todos los anticuerpos y fragmentos específicos de antígeno del mismo descritos en la presente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica al mismo epítopo de IGF-1R como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de 13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, donde el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe de manera competitiva un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8, de la unión a IGF-1R, o un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo que se une de manera especifica IGF-1R, donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio de unión a antigeno idéntico a aquel de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención que se une de manera especifica a IGF-1R o una variante del mismo inhibe uno o más factores de crecimiento de insulina, por ejemplo, IGF-1, IGF-2 o tanto IGF-1 como IGF-1 de la unión a IGF-1R. En otras modalidades, un anticuerpo de la presente invención que se une de manera especifica a IGF-1R o una variante del mismo inhibe la fosforilación de IGF-1R en la unión de uno o más factores de crecimiento de insulina. En una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención que se une de manera especifica a IGF-1R o una variante del mismo expresado en una célula, en particular, una célula tumoral, inhibe la fosforilación de moléculas de transducción de señal en la dirección 3' comprendidas en la proliferación, motilidad y/o metástasis celular. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a Akt y p42/44 MAPK. En una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención que se une de manera especifica a IGF-1R o una variante del mismo expresado en una célula, promueve la internalización de IGF-1R expresado en superficie, limitando su variabilidad para interactuar con IGF. En aún una modalidad adicional, un anticuerpo de la presente invención que se une de manera especifica a IGF-1R o una variante del mismo expresado en una célula, en particular, una célula tumoral, inhibe la proliferación, motilidad y/o metástasis celular. Un anticuerpo de la presente invención que se une específicamente a IGF-1R o una variante del mismo, que se va a usar en los métodos de tratamiento descritos en la presente se puede preparar y usar como un agente terapéutico que detiene, reduce, previene o inhibe las actividades celulares comprendidas en la hiperproliferación celular, por ejemplo, actividades celulares que inducen el patrón alterado anormal de vascularización que frecuentemente está asociado con enfermedades o trastornos hiperproliferativos . Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales , quiméricos o humanizados, y fragmentos de anticuerpos que se unen de manera especifica a proteínas asociadas a tumor tal como IGF-1R. Los anticuerpos pueden ser monovalentes, bivalentes, polivalentes, o anticuerpos bifuncionales , y los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab F(ab')2, y Fv. Los anticuerpos terapéuticos de acuerdo a la invención se pueden usar en forma no marcada o no conjugada, o se pueden acoplar o enlazar a porciones citotóxicas tal como radiomarcas y citotoxinas bioquímicas para producir agentes que ejercen efectos terapéuticos. En ciertas modalidades, un anticuerpo, o fragmento inmunoespecifico del mismo de la invención incluye un dominio de unión a antígeno. Un dominio de unión a antígeno se forma por regiones variables de anticuerpo que varía de un anticuerpo a otro. Los anticuerpos que se presentan de manera natural comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno, es decir, son al menos bivalentes. Como se usa en la presente, el término "dominio de unión a antigeno" incluye un sitio que se une de manera especifica a un epitopo en un antigeno (por ejemplo, una superficie celular o antigeno soluble) . El dominio de unión a antigeno de unión a anticuerpo incluye típicamente al menos una porción de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una porción de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. El sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. La presente invención proporciona métodos para tratar varios trastornos hiperproliferativos , por ejemplo, al inhibir el crecimiento tumoral, en un mamífero, que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de administrar al mamífero una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica o preferencial a IGF-R1, por ejemplo, IGF-R1 humano. La presente invención se refiere de manera más específica a un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, inhibir o prevenir la formación de tumor, crecimiento tumoral, invasión tumoral, y/o formación de metástasis, en un animal, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un humano, que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de administrar a un animal en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento inmuoespecí fico del mismo, que tiene de manera especifica o preferencial a uno o más epitopos de IGF-1R. En otras modalidades, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa , por ejemplo, inhibir la formación de tumor, crecimiento tumoral, invasión tumoral, y/o formación de metástasis en un animal, por ejemplo, en un paciente humano, donde el método comprende administrar a un animal en necesidad de este tratamiento una cantidad efectiva de una composición que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de, además de un portador farmacéuticamente aceptable, un anticuerpo, o fragmento inmunoespecifico del mismo, que se une de manera especifica a al menos un epitopo de IGF-1R, donde el epitopo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de al menos aproximadamente cuatro o cinco aminoácidos de SEQ ID NO: 2, al menos siete, al menos nueve, o entre al menos aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos de un epitopo determinado de SEQ ID NO: 2 como se describe pueden ser, pero no necesitan ser, contiguos. En ciertas modalidades, el por lo menos un epitopo de IGF-1R, comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un epitopo no lineal formado por el dominio extracelular de IGF-1R como se expresa en la superficie de una célula. De esta manera, en ciertas modalidades el por lo menos un epitopo de IGF-1R comprende, consiste esencialmente de, o consiste de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30, o al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ó 100 aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID NO: 2, donde los aminoácidos no contiguos forman un epitopo a través del plegado de la proteina. En otras modalidades, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa , por ejemplo, inhibiendo la formación de tumor, crecimiento tumoral, invasión tumoral, y/o formación de metástasis en un animal, por ejemplo, un paciente humano, en donde el método comprende administrar a un animal en necesidad de este tratamiento una cantidad efectiva de una composición que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de, además de un portador farmacéuticamente aceptable, un anticuerpo, o fragmento inmunoespecifico del mismo, que se une de manera especifica a al menos un epitopo de IGF-1R, donde el epitopo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, además de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más aminoácidos contiguos o no contiguos de SEQ ID NO: 2 como se describe anteriormente, y una porción adicional que modifica la proteina, por ejemplo, una porción de carbohidrato se puede incluir tal que la molécula de unión se une con mayor afinidad a la proteina objetivo modificada que es de lo que lo hace a una versión no modificada de la proteina. De manera alternativa, la molécula de unión no se une a la versión no modificada de la proteina objetivo para nada. De manera más especifica, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer en un humano, que comprende administrar a un humano en necesidad de este tratamiento una composición que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo especifico de IGF-1R o fragmento inmunoespecifico del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable. Los tipos de cáncer que se van a tratar incluyen, pero no se limitan a, cáncer de estómago, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer ovárico, y cáncer de próstata. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento del mismo se une de manera especifica a al menos un epitopo de IGF-1R o fragmento o variante descrito anteriormente, es decir, se une a este epitopo más fácilmente que lo que se media a un epitopo no relacionado, o aleatorio; se une de manera preferencial a al menos un epitopo de IGF-1R o fragmento o variante descrito anteriormente, es decir, se une a este epitopo más fácilmente que lo que se uniría a un epitopo relacionado, similar, homólogo o análogo; se inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia que por sí mismo se une de manera específica o preferencial a un cierto epítopo de IGF-1R o fragmento o variante descrito anteriormente; o se une a al menos un epitopo de IGF-1R o fragmento o variante descrito anteriormente por una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) de menos de aproximadamente 5 X 10 "2 M, aproximadamente 10"2 M, aproximadamente 5 X 10 -3 M, aproximadamente 10"3 M, aproximadamente 5 X 10 -4 M, aproximadamente 10"4 M, aproximadamente 5 X 10 -5 M, aproximadamente 10"5 M, aproximadamente 5 X 10 -6 M, aproximadamente 10"6 M, aproximadamente 5 X 10 -7 M, aproximadamente 10"7 M, aproximadamente 5 X 10 -8 M, aproximadamente 10"8 M, aproximadamente 5 X 10 -9 M, aproximadamente 10"9 M, aproximadamente 5 X 10" 10 , aproximadamente 10"10 M, aproximadamente 5 X 10" 11 M, aproximadamente 10"11 M, aproximadamente 5 X 10" 12 M, aproximadamente 10"12 M, aproximadamente 5 X 10" 13 M, aproximadamente 10"13 M, aproximadamente 5 X 10" 14 M, aproximadamente 10"14 M, aproximadamente 5 x 10" ¦15 M Ó aproximadamente 10 15 M, . Como se usa en el contexto de las constantes de disociación de la unión del anticuerpo, el término "aproximadamente" permite el grado de variación inherente en los métodos utilizados para medir la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, dependiendo del nivel de precisión de la instrumentación usada, el error estándar en base al número de muestras medidas, y el error de redondeo, el término "aproximadamente 10"2 M" debe incluir, por ejemplo, de 0.05 M a 0.005 M. En ciertas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención reaccionan de manera cruzada con proteínas de IGF-IR de otras especies de las cuales se formulan, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-IR humano también se une a IGF-IR de primate y/o IGF-IR murino. Otros anticuerpos adecuados o fragmentos de los mismos de la presente invención incluyen aquellos que son altamente específicos a la especie. En modalidades específicas, los anticuerpos o fragmentos inmunogénicos de los mismos descritos en la presente se unen a polipéptidos de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación ( k (disociación) ) de menos de o igual a 5 x 10"2 seg"1, 10~2 seg" 1, 5 x 10"3 seg"1 o 10~3 seg-1. Otros anticuerpos o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente se unen a polipéptidos de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de disociación ( k (disociación) ) de menos de o igual a 5 x 10"4 seg-1, 10"4 seg"1, 5 x 10~5 seg"1, o 10"5 seg"1 5 x 10"6 seg"1, 10"6 seg"1, 5 x 10"7 seg"1 o 10"7 seg"1. En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos inmunogénicos de los mismos descritos en la presente se unen a polipéptidos de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de asociación ( k (asociación) ) de mas de o igual a 103 M"1 seg"1, 5 x 103 M"1 seg"1, 104 M"1 seg"1 o 5 x 104 M"1 seg"1. Otros anticuerpos o fragmentos inmunoespecificos de los mismos para el uso en los métodos de diagnóstico y de tratamiento descritos en la presente tienen a polipéptidos de IGF-IR o fragmentos o variantes de los mismos con una constante de asociación ( k ( asociación ) ) mayor que o igual a 105 M"1 seg"1, 5 x 105 M"1 seg"1, 106 M'1 seg"1, o 5 x 106 M"1 seg"1 o 107 M"1 seg"1. En varias modalidades, una o más moléculas de unión como se describe anteriormente es un antagonista de la actividad de IGF-IR, por ejemplo, la unión de un antagonista de anticuerpo de IGF-IR a IGF-IR como se expresa en una célula tumoral inhibe la unión del factor de crecimiento de insulina, por ejemplo IGF-1, IGF-2, o tanto IGF-1 como IGF-2 a IGF-IR, promueve la internali zación de IGF-IR inhibiendo de este modo su capacidad de transducción de señales, inhibe la fosforilación de IGF-IR, inhibe la fosforilación de moléculas en etapas posteriores de la ruta de transducción de señales, por ejemplo, Akt o p42/44 MAPK, o inhiben la proliferación, motilidad o metástasis de células tumorales.
IX. Métodos de Diagnóstico o Pronóstico Usando Moléculas de Unión Especificas de IGF-IR y Ensayos de Amplificación de Ácidos Nucleicos Los anticuerpos específicos de IGF-IR, o fragmentos, derivados, o análogos de los mismos, se pueden usar para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar, o monitorizar enfermedades, trastornos y/o condiciones asociadas con la expresión y/o actividad anormal de IGF-IR. La expresión de IGF-IR se incrementa en tejido tumoral y otras condiciones neoplásicas. Los anticuerpos específicos de IGF-IR o fragmentos de los mismos, son útiles para diagnóstico, tratamiento, prevención y/o prognosis de trastornos hiperproliferativos en mamíferos, preferentemente humanos. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a, cáncer, neoplasmas, tumores y/o como se describe en otra parte de la presente, esencialmente cánceres asociados con IGF-IR tal como cáncer de estómago, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Por ejemplo, como se describe en la presente, la expresión de IGFF-1R se asocia con al menos tejidos tumorales de estómago, renales, de cerebro, de vejiga, de colon, de pulmón, de mama, pancreáticos, de ovario y de próstata. Por consiguiente, los anticuerpos (y fragmentos de anticuerpo) dirigidos contra IGF-IR se pueden usar para detectar tejidos particulares que expresan niveles incrementados de IGF-IR. Estos ensayos y diagnósticos se pueden realizar in vivo o in vítro, tal como por ejemplo, en muestras sanguíneas, tejidos de biopsia o tejido de autopsia.
De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de cánceres y otros trastornos hiperproliferativos , que comprende medir el nivel de expresión de la proteina de IGF-IR o transcripto en tejido u otras células o fluido corporal de un individuo y comparar el nivel medido de expresión con niveles de expresión de IGF-IR normales en tejido normal o fluido corporal normal, por lo que un incremento en el nivel de expresión en comparación a la norma es indicativo de un trastorno. Una modalidad proporciona un método para detectar la presencia de células hiperproliferativas anormales, por ejemplo, células precancerigenas o cancerígenas, en una muestra de fluido o tejido, que comprende valorar la expresión de IGF-IR en muestras de tejido o fluido corporal de un individuo y comparar la presencia o nivel de expresión de IGF-IR en la muestra con la presencia a nivel de expresión de IGF-IR en un panel de muestras normales de tejido o fluido corporal, donde la detección de la expresión de IGF-IR o un incremento en la expresión de IGF-IR con respecto a las normas es indicativo de crecimiento celular hiperproliferativo anormal . De manera más específica, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de células hiperproliferativas anormales en un fluido corporal o muestra de tejido, que comprende (a) valorar la expresión de IGF-IR en muestras de tejido o fluido corporal de un individuo usando anticuerpos específicos de IGF-IR o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención, y (b) comparar la presencia o nivel de la expresión de IGF-IR en la muestra con la presencia o nivel de expresión de IGF-IR en un panel de muestras normales de tejido o fluido corporal, por lo que la detección de la expresión de IGF-IR o un incremento en la expresión de IGF-IR con respecto a las normas es indicativo de crecimiento celular hiperproliferativo anormal. Con respecto a cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de proteína de IGF-IR en tejido de biopsia de un individuo puede indicar la presencia de un tumor u otro crecimiento maligno, puede indicar una predisposición para el desarrollo de estas malignidades o tumores, puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Una diagnóstico más definitiva de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo de manera temprana previniendo de este modo el desarrollo o progreso adicional del cáncer. Los anticuerpos específicos de IGF-IR de la presente invención se pueden usar para valorar niveles de proteína en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por aquéllos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell Biol . 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar expresión de proteina incluyen inmunoensayos , tal como el ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) . Se conocen en la técnica marcas adecuadas de ensayos de anticuerpos e incluyen marcas de enzimas, tal como glucosa, oxidasa; radioisótopos, tal como yodo (125I, 121D, carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H) , indio (112In) , y tecnecio (99Tc) ; marcas luminescentes , tal como luminol; y marcas fluorescentes, tal como fluoresceina y rodamina, y biotina. Se describen ensayos adecuados en más detalle en otra parte de la presente. Una aspecto de la invención ' es un método para la detección o diagnóstico in vivo de una enfermedad o trastorno hiperproliferativo asociada con expresión anormal de IGF-1R en un animal, de manera preferente un mamífero y de manera más preferente un humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo de manera parenteral, subcutáneamente o de forma intraperitonial ) a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo marcado, o fragmento del mismo, de la presente invención, que se une de manera específica a IGF-1R; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula de unión marcada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto donde se expresa IGF-1R (y para que la molécula marcada no unida se depure a nivel de fondo) ; c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar la molécula marcada en el sujeto, tal que la detección de la molécula marcada por arriba del nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno particular asociado con la expresión anormal de IGF-1R. Se puede determinar el nivel del fondo por varios métodos que incluyen comparar la cantidad de molécula marcada detectada a un valor normal anteriormente determinado para un sistema particular . Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de porción de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada variará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicuries ver, por ejemplo 99Tc. La molécula de unión marcada, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, entonces se acumulará de manera preferencial en la ubicación de las células que contienen la proteina especifica. La formación de imágenes de tumor in vivo se describe en S. . Burchiel et al., " Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds . , Masson Publishing Inc. (1982) .
Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de marca usada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula marcada se concentre preferencialmente en sitios en el sujeto y para que la molécula marcada no unida se depure a nivel de fondo es de 6 a 48 horas o de 6 a 24 o de 6 a 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 7 a 10 días. Se puede detectar la presencia de la molécula marcada del paciente usando métodos conocidos en la técnica para la exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo de marca usada. Los expertos serán capaces de determinar el método apropiado para detectar una marca particular. Los métodos y dispositivos que se pueden usar en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no se limitan a, tomografia computarizada, (CT) , de exploración corporal completa tal como tomografia de emisión de positrones (PET), formación de imágenes por resonancia magnético (MRI), y sonografia . En una modalidad especifica, la molécula de unión se marca con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a radiación (Thurston et al., patente de los Estados Unidos número 5,441,050). En otra modalidad, la molécula de unión se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploración sensible a fluorescencia. En otra modalidad, la molécula de unión se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente usando tomografia de emisión de positrones. En aún otra modalidad, la molécula de unión se marca con una marca paramagnética y se detecta en un paciente usando formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Las marcas de anticuerpo o marcadores para formación de imágenes in vivo de la expresión de IGF-1R incluyen aquéllas detectables por radiografía de rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR) , MRI, exploración de CAT o formación de imágenes por resonancia de giro electrónico (ESR) . Para radiografía por rayos X, las marcas adecuadas incluyen radioisótopos tal como bario o cesio que emiten radiación detectable pero no abiertamente peligrosa al sujeto. Los marcadores adecuados para NMR y ESR incluyen aquéllos con un giro característico detectable, tal como deuterio, que se puede incorporar en el anticuerpo por marcación de nutrientes para el hibridoma pertinente. Donde se use formación de imágenes in vivo para detectar niveles mejorados de la expresión de IGF-1R para diagnóstico en humanos, puede ser preferible usar anticuerpos humanos o anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados" como se describe en otra parte de la presente. En una modalidad relacionada a aquéllas descritas anteriormente, el monitoreo de una enfermedad o trastorno ya diagnosticado se lleva a cabo al repetir cualquiera de los métodos para diagnosticar la enfermedad o trastorno, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etcétera. Donde se haya hecho ya una diagnóstico de un trastorno, incluyendo el diagnóstico de un tumor de acuerdo a métodos convencionales, los métodos de detección como se describen en la presente son útiles como un indicador de pronóstico, por lo que los pacientes que continúan exhibiendo expresión mejorada de IGF-1R experimentarán un resultado clínico peor con relación a pacientes cuyo nivel de expresión disminuya cerca del nivel normal. Por "valorar el nivel de expresión del polipéptido de IGF-1R asociado a tumor" se propone medir o estimar de manera cualitativa o cuantitativa el nivel de polipéptido de IGF-1R en una primera muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo al determinar o estimar el nivel absoluto de proteína) o de manera relativa (por ejemplo el comparar al nivel de polipéptido asociado a cáncer en una segunda muestra biológica). De manera preferente, el nivel de expresión del polipéptido de IGF-1R en la primera muestra biológica se mide o estima y compara un nivel normal de polipéptido de IGF-1R, la norma que se toma de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el trastorno o que se determina al promediar niveles de una población de individuos que no tienen el trastorno. Como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce el nivel "normal" de polipéptido de IGF-IR, se puede usar de manera repetida como una norma para comparación. Por "muestra biológica" se propone cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, linea celular, cultivo de tejido, u otra fuente de células que expresan potencialmente IGF-IR. Como se indica, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tal como suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal), y otras fuentes de tejido que contienen células que expresan potencialmente IGF-IR. Son bien conocidos en la técnica los métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mamíferos. En una modalidad adicional, los anticuerpos, o fragmentos inmunoespecífieos de los anticuerpos dirigidos a un epítopo conformacional de IGF-IR se pueden usar para detectar de manera cuantitativa o cualitativa la presencia de productos génicos de IGF-IR o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos. Esto se puede lograr, por ejemplo, por técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo fluorescentemente marcado acoplado con detección microscópica por luz, detección citométrica de flujo o detección fluorimétrica . Los canceres que se pueden diagnosticar, y/o pronosticar usando los métodos descritos anteriormente incluyen pero no se limitan a, cáncer de estómago, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de ovario y cáncer de próstata.
X. Inmunoensayos Los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente se pueden valorar para unión inmunoespecífica por cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tal como transferencias western, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas), inmunoensayos de "intercalación", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitación, reacciones de precipitación por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunoradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar unos pocos. Estos ensayos son de rutina y bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Se describen brevemente más adelante los inmunoensayos de ejemplo (pero no se proponen a manera de limitación) . Los protocolos de inmunoprecipitación comprenden en general lisis de una población de células en un amortiguador de lisis tal como amortiguador de RIPA (1 % de NP-40 o Tritón X-100, 1 % de desoxicolato de sodio, 0.1 % de SDS, NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M a pH 7.2, 1 % de Trasilol) complementado con inhibidores de fosfatasa y/o proteasa proteica (por ejemplo, EDTA, P SF, aprotinina, vanadato de sodio) , adicionar el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4°C, adicionar cuentas de proteina A y/o proteina G-sefarosa al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 4°C, lavar las cuentas en amortiguador de lisis y resuspender las cuentas en amortiguador de SDS/muestra. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antigeno particular se puede valorar por ejemplo por análisis de transferencia western. Un experto en la técnica reconocerá con respecto a los parámetros que se pueden modificar para incrementar la unión del anticuerpo a un antigeno y disminuir el fondo (pre-depuración de lisado celular con cuentas de sefarosa) . Para análisis adicional con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación, (por ejemplo Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994) en 10.16.1. En general, el análisis de transferencia Western comprende preparar muestras de proteína, electroforesis de las muestras de proteína en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE al 8 %-20 %, dependiendo del peso molecular del antígeno) , transferencia de la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa , PVDF o nylon, bloqueo de la membrana en solución bloqueadora (por ejemplo, PBS con BSA al 3 % o leche sin grasa), lavado de la membrana en amortiguador de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloqueo de la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluido en amortiguador de bloqueo, lavado de la membrana en amortiguador de lavado, bloqueo de la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano ) conjugado o un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidaso de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (por ejemplo, 32p o 1251) diluida en amortiguador de bloqueo, lavado de la membrana en amortiguador de lavado y detección de la presencia del antígeno. Un experto en la técnica estará enterado con respecto a los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para un análisis adicional con respecto a los protocolos de transferencia western, ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol . 1 (1994) en 10.8.1. Los ELISA comprenden preparar el antígeno, revestir la concavidad de una placa de microtitulo de 96 concavidades con el antigeno, adicionar el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) a la concavidad e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del antigeno. En los ELISA, el anticuerpo de interés no tiene que ser conyugado a un compuesto detectable; en cambio, un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado a un compuesto detectable se puede adicionar a la concavidad. Adicionalmente , en lugar de revestir la concavidad con el antigeno, el anticuerpo se puede revestir a la concavidad. En este caso, un segundo anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede adicionar después de la adición del antigeno de interés a la concavidad revestida. Un experto en la técnica estará enterado con respecto a los parámetros que se pueden modificar para incrementar la señal detectada asi como otras variaciones de los ELISA conocidos en al técnica. Para análisis adicional con respecto a ELISA, ver, por ejemplo Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol . 1 (1994) en 11.2.1. La afinidad de unión de un anticuerpo a un antigeno y la constante disociación de la interacción de anticuerpo-antigeno se puede determinar por ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antigeno marcado (por ejemplo 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en la presencia de cantidades crecientes del antigeno no marcado, y la detección del anticuerpo unido al antigeno marcado. La afinidad del anticuerpo de interés para un antigeno particular y las constantes de disociación de la unión se pueden determinar de los datos por análisis en gráficas de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo también se puede determinar usando radioinmunoensayos . En este caso, el antigeno se incuba con el anticuerpo de interés y se conjuga a un compuesto marcado (por ejemplo, 3H o 125I) en la presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no marcado. Adicionalmente, se pueden emplear de manera histológica anticuerpos específicos de IGF-1R como en ensayo de inmunofluorescencia, microscopía inmunoelectrónica o ensayos no inmunológicos , para la detección in situ de productos génicos del antígeno de cáncer o variantes conservadas o fragmentos peptídicos de los mismos. Se puede lograr la detección in situ al remover un espécimen histológico de un paciente, y al aplicarlo a un anticuerpo específico de IGF-1R marcado o fragmento del mismo, preferentemente aplicado al traslapar el anticuerpo marcado (o fragmento) sobre una muestra biológica. A través del uso de este procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de la proteína de IGF-1R, o variantes conservadas o fragmentos peptidicos, sino también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tal como procedimientos de tensión) que se pueden modificar a fin de lograr esta detección in situ. Los inmunoensayos y los no inmunoensayos para los productos génicos de IGF-1R o variantes conservadas o fragmentos peptidicos de los mismos comprenderán típicamente incubar una muestra, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recolectadas o Usados de células que se han incubado en cultivo celular, la presencia de un anticuerpo detectablemente marcado capaz de la unión a IGF-1R o variantes conservadas o fragmentos peptidicos de los mismos, y detectar el anticuerpo unido por cualquiera de varias técnicas bien conocidas en la técnica. La muestra biológica se puede poner en contacto con e inmovilizar sobre un soporte o portador de fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido que es capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte entonces se puede lavar con amortiguadores adecuados seguido por tratamiento con el anticuerpo específico de IGF-1R detectablemente marcado. El soporte de fase sólido entonces se puede lavar con el amortiguador una segunda vez para remover el anticuerpo no unido. Opcionalmente , el anticuerpo se marca de manera subsiguiente. La cantidad de marca unida en el soporte sólido entonces se puede detectar por medios convencionales. Por "soporte o portador de fase sólida" se propone cualquier soporte capaz de la unión a un antigeno o un anticuerpo. Los soportes soportadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno , polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas , gabros y magnetita. La naturaleza del portador puede ser ya sea soluble a algún grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en tanto que la molécula acoplada sea capaz de la unión a un antigeno o un anticuerpo. De esta manera, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una cuenta, o cilindrica, como en la superficie e interior de un tubo de prueba, o la superficie externa de una varilla. De manera alternativa, la superficie puede ser plana, tal como una hoja, tira de prueba, etcétera. Los soportes preferidos incluyen cuentas de poliestireno. Aquéllos expertos en la técnica conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión del anticuerpo o antigeno, o serán capaces de determinar los mismos para el uso de experimentación de rutina. La actividad de unión de un lote determinado de anticuerpo especifico de IGF-IR se puede determinar de acuerdo a métodos bien conocidos. Aquéllos expertos en al técnica serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas de ensayo para cada determinación al emplear experimentación de rutina. Hay una variedad de métodos disponibles para medir la afinidad de una interacción de anticuerpo-antigeno, pero relativamente pocos para determinar las constantes de velocidad. La mayoría de los métodos dependen ya sea de la marcación del anticuerpo o antígeno, lo que complica inevitablemente mediciones de rutina e introduce incertidumbres en las cantidades medidas. La resonancia de plasmón superficial (SPR) como se realiza en BIAcore ofrece varias ventajas con respecto a métodos convencionales para medir la afinidad de las interacciones de anticuerpo-antígeno; (i) ningún requerimiento para marcar ya sea el anticuerpo o antígeno; (ii) los anticuerpos no necesitan ser purificados por adelantado, se puede usar directamente el sobrenadante de cultivo celular; (iii) mediciones en tiempo real, que permiten la comparación semi-cuantitativa rápida de diferentes interacciones de anticuerpo inmunoclonales , se permiten y son suficientes para muchos propósitos de evaluación; (iv) se puede regenerar la superficie bioespecí fica de modo que una serie de anticuerpos monoclonales diferentes se pueden comparar fácilmente bajo condiciones idénticas; (v) los procedimientos analíticos están completamente automatizados, y se pueden realizar series extensivas de mediciones sin la intervención del usuario. BIAaplications Handbook, versión AB (reimpreso 1998), BIACORE code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versión AB (reimpreso 1998), BIACORE code No. BR-1001-84. Los estudios de unión basados en SPR requieren que un miembro de un par de unión se inmovilice en una superficie sensora, el compañero de unión inmovilizado se refiere como ligando. El compañero de unión en solución se refiere como el analito. En algunos casos, el ligando se une indirectamente a la superficie a través de la unión a otra molécula inmovilizada, que se refiere como la molécula de captura. La respuesta de SPR refleja un cambio en la concentración másica en la superficie del detector conforme el analito se une o disocia. En base a SPR, las mediciones y BIAcore en tiempo real monitorizan las interacciones directamente conforme ocurren. La técnica es bastante adecuada para la determinación de parámetros cinéticos. La clasificación por afinidad comparativa es extremadamente simple de realizar, y se pueden derivar constantes tanto cinéticas como de afinidad a partir de los datos de los sensogramas. Cuando se inyecta el analito en un impulso discreto a través de una superficie de ligando, el sensograma resultante se puede dividir en tres fases esenciales: (i) Asociación del analito con el ligando durante la inyección de la muestra; (ii) Equilibrio o estado estable durante la inyección de la muestra, donde la velocidad de unión del analito se equilibra por la disociación del complejo; (iii) Disociación del analito de la superficie durante el flujo del amortiguador . Las fases de asociación y disociación proporcionan información de la cinética de la interacción de analito-ligando (Ka y Kd, las velocidades de formación y disociación de complejo, kd/ka = KD) . La fase de equilibrio proporciona información de la afinidad de la interacción de analito-ligado (KD) . El software de de BIAevaluation proporciona capacidades comprensivas para el ajuste de la curva usando algoritmos tanto de integración numérica como de ajuste global. Con el análisis adecuado de los datos, se pueden obtener las constantes de afinidad y velocidad separadas para la interacción a partir de investigaciones de Biacore simples. El intervalo de afinidades medibles por esta técnica es muy amplio variando desde mM a pM. La especificidad de epitopo es una característica importante de un anticuerpo monoclonal . La correlación de epítopos con BIAcore, en contraste a técnicas convencionales usando métodos de radioinmunoensayo, de ELISA u otros de adsorción superficial, no requiere anticuerpos de marcación o purificados, y permite pruebas de especificidad de múltiples sitios usando una secuencia de varios anticuerpos monoclonales . Adicionalmente , se pueden procesar automáticamente grandes números de análisis. Los experimentos de unión en forma de pares prueban la capacidad de dos MAb para unirse simultáneamente al mismo antigeno. Los MAb dirigidos contra epitopos separados de unirán independientemente, en tanto que los MAb dirigidos contra epitopos idénticos o cercanamente relacionados interferirán con la unión entre si. Estos experimentos de unión con BIAcore son directos para llevar a cabo. Por ejemplo, se puede usar una molécula de captura para unir el primer Mab, seguido por la adición del antigeno y el segundo MAb, de manera secuencial. Los sensogramas revelarán: 1. cuanto del antigeno se une al primer MAB, 2. a que grado el segundo MAB se une al antigeno unido a superficie, 3. si el segundo MAb se une, ya sea revirtiendo el orden de la prueba en pares que altera el resultado. La inhibición peptidica es otra técnica usada para la correlación de epitopos. Este método puede complementar estudios de unión de anticuerpos en pares, y puede relacionar epitopos funcionales a características estructurales cuando se conoce la secuencia primaria del antígeno. Se prueban péptidos o fragmento de antígeno para la inhibición de la unión de diferentes MAb al antígeno inmovilizado. Los péptidos que interfieren con la unión de un MAb determinado se asumen que están estructuralmente relacionados al epitopo definido por ese MAB.
XI. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Administración Los métodos para preparar y administrar anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos a un sujeto en necesidad del mismo son bien conocidos o se determinan fácilmente por aquellos expertos en la técnica. La ruta de administración de la molécula de unión, por ejemplo, del polipéptido de unión, por ejemplo, el anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecí fico del mismo puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral como se usa en la presente incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial , intraperitoneal , intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. En tanto que estas formas de administración se contemplan claramente como que están dentro del alcance de la invención, una forma para administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Usualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de acetato, fosfato o citrato) , un agente tensioactivo (por ejemplo, polisorbato) , opcionalmente un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas en la presente, las moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos se pueden distribuir directamente al sitio de la población celular adversa, incrementando de este modo la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tal como aceite de oliva, y éteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio amortiguado. En la presente invención, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, amortiguador de fosfato 0.01-0.1 M y de manera preferente 0.05M o solución salina al 0.8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen soluciones de fosfato de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de nutrientes y fluidos, reabastecedores de electrolitos, tal como aquellos basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos tal como por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes queladores, y gases inertes y similares. De manera más particular, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En estos casos, la composición debe ser estéril o debe ser fluida al grado que exista fácil capacidad de manejo a jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y de manera preferente se conservará contra la acción contaminante de microorganismos, tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol liquido, y polietilenglicol liquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento de un tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y por uso de agentes tensioactivos . Las formulaciones adecuadas para el uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16th ed. (1980). La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios agentes antibacterianos y antifungoideos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes , tal como mannitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede dar al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. En cualquier caso, se pueden preparar soluciones inyectables estériles al incorporar un compuesto activo (por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un polipéptido de unión, por ejemplo, un anticuerpo especifico a IGF-1R o fragmento inmunoespecifico del mismo, por si mismo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en la presente, como se requiere, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan expresiones al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son, secado al vacío y secado por congelación, que produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución anteriormente filtrada estéril del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se rellenan en recipientes tal como ampolletas, bolsas, botellas, jeringas o frascos, y se sellan bajo condiciones asépticas de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente , las preparaciones se pueden envasar y vender en la forma de un equipo tal como aquellos descritos en la U.S.S.N. co-pendiente 09/259,337 (US-2002-0102208 Al), que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Estos artículos de manufactura tendrán de manera preferente etiquetas u hojas de inserción de envase que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar un sujeto que padece de, o esta predispuesto a trastornos autoinmunitarios neoplásticos. Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para tratamiento de trastornos hiperproliferativos como se describe en la presente varía dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Usualmente, el paciente es un humano pero también se pueden tratar mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos . Las dosis de tratamiento se pueden titular usando métodos de rutina conocidos por aquellos expertos en la técnica para optimizar la seguridad y eficiencia . Para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos con un anticuerpo o fragmento del mismo, la dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg y de manera más usual de 0.01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o de 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, de manera preferente al menos 1 mg/kg. También se proponen las dosis intermedias en los intervalos anteriores para que estén dentro del alcance de la invención. Los sujetos se pueden administrar tal como con dosis diarias, o en días alternativos, de manera semanal o de acuerdo a otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento de ejemplo conlleva a la administración de múltiples dosis durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes adicionales de tratamiento de ejemplo conllevan a la administración una vez por cada dos semanas o una vez por mes o una vez cada tres a seis meses. Los programas de dosis de ejemplo incluyen 1-10 mg/kg ó 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternativos o 60 mg/kg de manera semanal. En algunos métodos, se administran de manera simultánea dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, caso en el cual la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. Los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos descritos en la presente se pueden administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser de manera semanal, mensual o por año. Los intervalos pueden ser irregulares como se indica al medir los niveles sanguíneos del polipéptido efectivo o molécula objetivo en 1 paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración en plasma del polipéptido de 1-1000 µg/ml y en algunos métodos 25-300 µg ml. De manera alternativa, se pueden administrar moléculas de unión como una formulación de liberación sostenida, caso en el cual se requiere administración menos frecuente. Las dosis y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. La vida media de una molécula de unión también se puede prolongar mediante la fusión a un polipéptido o porción estable, por ejemplo, albúmina o PEG. En general, los anticuerpos humanizados muestran la vida media mas prolongada, seguido por anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. En una modalidad, las moléculas de unión de la invención se pueden administrar en forma conjugada. En otra modalidad, las moléculas de unión, por ejemplo, polipéptidos de unión, por ejemplo, anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos para el uso de los métodos descritos en la presente se pueden administrar múltiples veces en forma conjugada. En aun otra modalidad, las moléculas de unión de la invención se pueden administrar en una forma no conjugada, luego en forma conjugada, o viceversa. La dosis y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que comprenden anticuerpos o un coctel de los mismos se administran a un paciente no ya en el estado de enfermedad o en un estado de pre-enfermedad para mejorar la resistencia del paciente. Esta cantidad se define que es una "dosis profilácticamente efectiva". En este caso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud del paciente y de la inmunidad general, pero varían en general de 0.1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0.5 a 2.5 mg por dosis. Se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo prolongado de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, se requiere algunas veces una dosis relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpo por dosis, con dosis de 5 a 25 mg que se usan más comúnmente para redioinmunoconj ugados y mayores dosis para moléculas conjugadas de citotoxina-fármacos ) a intervalos relativamente cortos, hasta que se reduzca o termine el progreso de la enfermedad, y de manera preferente hasta que el paciente muestre mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar con un régimen profiláctico. En una modalidad se puede tratar un sujeto con una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecífico del mismo (por ejemplo, en un vector) . Las dosis para ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg, o 30-300 µg de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis. Se pueden administrar agentes terapéuticos por medios parenterales , tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales , intracraneales, intraperitoneales , intranasales o intramusculares para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. En algunos métodos, se inyectan directamente los agentes en un tejido particular donde se han acumulado células que expresan IGF-1R, por ejemplo, inyección intracraneal. Se prefieren inyección intramuscular o infusión intravenosa para la administración del anticuerpo. En algunos métodos, se inyectan directamente en el cráneo anticuerpos terapéuticos particulares. En algunos métodos, se administran anticuerpos como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo MedipadMR. Los anticuerpos de IGF-IR o fragmentos de los mismos de la invención se pueden administrar de manera opcional en combinación con otros agentes que son efectivos en el tratamiento del trastorno o condición en necesidad de tratamiento (por ejemplo, profiláctico o terapéutico). Las dosis de tratamiento, individual, efectivas (es decir, cantidades terapéuticamente efectivas) de los polipéptidos de unión marcados con 90Y varían de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, de manera más preferente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi . Las dosis ablativas no estrechas de tratamiento, individuales, efectivas de anticuerpos marcados con 131I varían de aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, de manera más preferente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi . Las dosis ablativas de tratamiento, individuales, efectivas (es decir, pueden requerir trasplante autólogo de médula ósea) de anticuerpos marcados con 131I y varían entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, de manera más preferente entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi . En unión con un anticuerpo quimérico, debido a la más prolongada vida media en circulación en comparación con los anticuerpos murinos, una dosis ablativa no estrecha de tratamiento, individual, efectiva de anticuerpos quiméricos marcados con yodo 131 varia entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, de manera más preferente menos de aproximadamente 30 MCi. Los criterios de formador de imágenes para, por ejemplo, la marca o marbete de ????, son típicamente menos de aproximadamente 5 mCi. En tanto que se ha obtenido bastante cantidad de experiencia clínica con 131i y 90Y, se conocen en la técnica otras radiomarcas y se han usado para propósitos similares. Se usan aun otros radioisótopos para formación de imágenes. Por ejemplo, los radioisótopos adicionales que son compatibles con el alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan a 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 2 5Ac, 211At y 213Bi . A este respecto, también son todos compatibles los emisores alfa, beta y gamma con la presente invención. Además, en vista de la presente descripción, se expone que un experto en la técnica puede determinar fácilmente que radionúclidos son compatibles con un curso seleccionado de tratamiento sin experimentación indebida. Para este fin, los radionúclidos adicionales que se han usado ya en diagnóstico clínica incluyen 125 -Ir, 123 -Ir, 99Te, a „si - como 1 ? tI„n. También se han marcado anticuerpos con una variedad de radionúclidos para uso potencial en inmunoterapia dirigida (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)). Estos radionúclidos incluyen 188Re y 186Re asi como 199Au y 67Cu a un menor grado. La Patente de los Estados Unidos No. 5,460,785 proporcionan datos adicionales con respecto a estos radioisótopos y se incorpora en la presente como referencia . Si o no los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente se usan en una forma conjugada o no conjugada, se apreciará que una ventaja principal de la presente invención es la capacidad de usar estas moléculas en pacientes mielosuprimidos , especialmente aquellos quienes están padeciendo, o se han sometido, a terapias adjuntas tal como radioterapia o quimioterapia. Es decir, el perfil de distribución benéfica (es decir, tiempo de residencia al suelo relativamente corto, alta afinidad de unión y localización mejorada) de las moléculas las hacen particularmente útiles para tratar pacientes que tienen reservas reducidas de médula roja y son sensibles a mielotoxicidad . A este respecto, el perfil de distribución única de las moléculas las hace muy efectivas para la administración de conjugados radiomarcados a pacientes con cáncer mielosuprimidos. Como tales, los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos descritos en la presente son útiles en una forma conjugada o no conjugada en pacientes que se han sometido anteriormente a terapias adjuntas tal como radiación de ases externos, o quimioterapia. En otras modalidades preferidas, las moléculas de unión, por ejemplo, los polipéptidos de unión, por ejemplo, los anticuerpos específicos a IFG-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos (nuevamente en una forma conjugada o no conjugada) se pueden usar en un régimen terapéutico combinado con agentes quimioterapéuticos . Aquellos expertos en la técnica apreciarán que estos regímenes terapéuticos pueden comprender la administración secuencial, simultánea, concurrente o co-extensiva de los anticuerpos descritos u otras moléculas de unión y uno o más agentes quimioterapéuticos. Las modalidades particularmente preferidas de este aspecto de la invención comprenderán la administración de un polipéptido radiomarcado de unión. En tanto que los anticuerpos específicos de IGF-IR o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos se pueden administrar como se describe inmediatamente antes, se debe enfatizar que en otras modalidades, se pueden administrar moléculas conjugadas y no conjugadas de unión a pacientes de otro modo saludables como un agente terapéutico de primera línea. En estas modalidades, las moléculas de unión se administran a pacientes que tienen reservas normales por promedio de médula roja y/o a pacientes que no tienen, o no están, sometiéndose a terapias adjuntas tal como variación de ases externos o quimioterapia. Sin embargo, como se analiza anteriormente, las modalidades seleccionadas de la invención comprenden la administración de anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos a pacientes mielosuprimidos o en combinación o unión con una o más terapias adjuntas tal como radioterapia o quimioterapia (es decir, un régimen terapéutico combinado) . Como se usa en la presente, la administración de anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos en unión o combinación con una terapia adjunta significa la administración o aplicación secuencial, simultánea, coextensiva, concurrente, concomitante o contemporánea de la terapia y moléculas de unión descritas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la administración o aplicación de los varios componentes del régimen terapéutico combinado se puede sincronizar para mejorar la efectividad total del tratamiento. Por ejemplo, se pueden administrar agentes quimioterapéuticos en cursos bien conocidos, normales, de tratamiento seguido en el espacio de pocas semanas por radioinmunoconj ugados descritos en la presente. Por el contrario, las moléculas de unión conjugadas a citotoxina se pueden administrar de manera intravenosa seguido por radiación de ases externos, localizada en tumor. En aún otras modalidades, se pueden administrar moléculas de unión concurrentemente con uno o más agentes quimioterapéuticos seleccionados en una inspección individual. Un experto (por ejemplo un oncólogo experimentado) será capaz de discernir fácilmente los regímenes terapéuticos combinados efectivos sin una experimentación indebida en base a la terapia adjunta seleccionada en las enseñanzas de la presente especificación. A este respecto, se apreciará que la combinación de una molécula de unión (con o sin citotoxina) y el agente quimioterapéutico se pueden administrar en cualquier orden y dentro de un cuadro de tiempo que proporcione un beneficio terapéutico al paciente. Es decir, el agente quimioterapéutico y un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecí fico del mismo, se pueden administrar en cualquier orden o de manera concurrente. En modalidades seleccionadas, los anticuerpos específicos de IGR-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención se administrarán a pacientes quienes se hayan sometido anteriormente a quimioterapia. En aun otras modalidades, los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención se administrarán de una manera sustancialmente simultánea o concurrente con el tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, al paciente se le puede dar la molécula unión en tanto que se somete a un curso de quimioterapia. En modalidades preferidas, la molécula de unión se administrará en el espacio de 1 año de cualquier agente quimioterapéutico o de cualquier tratamiento. En otras modalidades preferidas, el polipéptido se administrará en el espacio de 10, 8, 6, 4 ó 2 meses de cualquier agente quimioterapéutico o de cualquier tratamiento. En aun otras modalidades preferidas, la molécula de unión se administrará en el espacio de , 3, 2 ó 1 semana de cualquier agente quimioterapéutico o de cualquier tratamiento. En aun otras modalidades, la molécula de unión se administrará en el espacio de 5, 4, 3, 2 ó 1 día del agente quimioterapéutico seleccionado o de tratamiento seleccionado. Además, se apreciará que los dos agentes o tratamiento se pueden administrar al paciente en cuestión de horas o minutos (es decir, de una manera sustancialmente simultánea). Además, de acuerdo con la presente invención, un paciente mielosuprimido se debe mantener que significa cualquier paciente que exhiba cuentas sanguíneas disminuidas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que hay varios parámetros de cuenta sanguínea usados convencionalmente como indicadores clínicos de mielosupresión y se puede medir fácilmente el grado al cual se está presentando en un paciente la mielosupresión. Los ejemplos de mediciones de mielosupresión aceptadas en la técnica son la Cuenta Absoluta de Neutrófilos (ANC) o la cuenta de plaquetas. Esta mielosupresión o mieloablación parcial puede ser resultado de varios trastornos o enfermedades bioquímicas, y de manera más probable, como resultado de quimioterapia o radioterapia anterior. A este respecto, aquellos expertos en la técnica apreciarán que los pacientes quienes se han sometido a quimioterapia tradicional exhiben típicamente reservas reducidas de médula roja. Como se analiza anteriormente, estos sujetos frecuentemente no se pueden tratar usando niveles óptimos de citotoxina (es decir, radionúclidos ) debido a los efectos secundarios inaceptables tal como anemia o inmunosupresión que dan por resultado mortalidad o morbosidad incrementada . De manera más específica, los anticuerpos específicos de IGF-1R conjugados o no conjugados o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de la presente invención se pueden usar o tratar de manera efectiva pacientes que tienen ANC menores que aproximadamente 2000/mm3 o cuentas de plaquetas menores que aproximadamente 150,000/mm3. De manera más preferente, los anticuerpos específicos de IGR-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de la presente invención se pueden usar para tratar pacientes que tienen ANC de menos de aproximadamente 1500/mm3, menos de aproximadamente 1000/mm3 o de manera aún más preferente menos de aproximadamente 500/mm3. De manera similar, los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de la presente invención se pueden usar para tratar pacientes que tienen una cuenta de plaquetas de menos de aproximadamente 75,000/mm3, menos de aproximadamente 50,000 /mm3 o aún menos de aproximadamente 10,000/mm3. En un sentido más general, aquellos expertos en la técnica serán capaces fácilmente de determinar cuando un paciente está mielosuprimido usando guias y procedimientos implementados por el gobierno. Como se indica anteriormente, muchos pacientes mielosuprimidos se han sometido a cursos de tratamiento que incluyen quimioterapia, radioterapia de implante o radioterapia por ases externos. En el caso de esta última, una fuente de radiación externa es para irradiación local de una malignidad. Para métodos de implantación por radioterapia, los reactivos radioactivos se colocan quirúrgicamente dentro de la malignidad, irradiando de este modo de forma selectiva el sitio de enfermedad. En cualquier caso, se pueden usar anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de la presente invención para tratar trastornos en pacientes que exhiben mielosupresión a pesar de la causa. A este respecto, se apreciará fácilmente que los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención se pueden usar en unión o combinación con cualquier agente o agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, para proporcionar un régimen terapéutico combinado) que elimina, reduce, inhibe o controla el crecimiento de células neoplásicas in vivo. Como se analiza, estos pacientes frecuentemente dan por resultado la reducción de las reservas en médula roja. Esta reducción puede estar desbalanceada, en totalidad o en parte, por la mielotoxicidad disminuida de los componentes de la presente invención que permiten de manera ventajosa el tratamiento agresivo de neoplasias en estos pacientes. En otras modalidades, los inmunoconj ugados radiomarcados descritos en la presente se pueden usar de manera efectiva con radiosensibilizadores que incrementan la susceptibilidad de las células neoplásicas a radionúclidos . Por ejemplo, se pueden administrar compuestos radiosensibilizadores después de que han depurado en su mayor parte las moléculas radiomarcadas de unión de la corriente sanguínea pero aún permanece a niveles terapéuticamente efectivos en el sitio del tumor o tumores . Con respecto a estos aspectos de la invención, los agentes quimioterapéuticos de ejemplo que son compatibles con la presente invención incluyen agentes de alquilación, alcaloides de vinca per vinca (por ejemplo, vincristina y vinblastina ) , procarbazina , metotrexato y prednisona. La combinación de cuatro fármacos MOPP (mecletamina (mostaza de nitrógeno) , vincristina (Oncovina) , procarbazina y prednisona) es muy efectiva al tratar varios tipos de linfomas y comprende una modalidad preferida de la presente invención. En pacientes resistentes a MOPP, se puede usar ABVD (por ejemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina) , ChlVPP (clorombucilo, vinblastina, procarbazina y prednisona) , CABS (lomustina, doxorrubicina , bleomicina y estreptozotocina ) , MOPP más ABVD, MOPP más ABV (doxorrubicina, bleomicina y vinblastina) o BCVPP (carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina y prednisona) . Arnold S. Freedman y Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in Harrison' s Principies of Internal Medicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds . , 13th ed. 1994) y V. T. DeVita et al., (1997) y referencias citadas en los mismos para dosificación y programación normal. Estas terapias se pueden usar sin cambio, o alterar como se necesite para un paciente particular, en combinación con uno o más anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención. Los regímenes adicionales que son útiles en el contexto de la presente invención incluyen el uso de agentes alquilantes individuales tal como ciclofosfamida o ciclofosfamida o clorambucilo, o combinaciones tal como CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona) , CHOP (CVP y doxorrubicina) , C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona y procarbazina), CAP-BOP (CHOP más procarbazina y bleomicina) , m-BACOD (CHOP más metotrexato, bleomicina y leucovorina) ProMACE-MOPP (prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido y leucovorina más MOPP normal) , ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida , etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona de dosis fija, bleomicina y leucovorina). Aquellos expertos en la técnica serán capaces de determinar fácilmente las dosis de programaciones normales para cada uno de estos regímenes. También se ha combinado CHOP con bleomicina, metotrexato, procarbacina, mostaza de nitrógeno, citosina, arabinósido y etopósido. Otros agentes quimioterapéuticos compatibles incluye, pero no se limitan a, 2-clorodesoxiadenosina (2-CDA) , 2 ' -desoxicoformicina y fludarabina . Para pacientes con malignidades de grado intermedio y alto, quien falla en lograr remisión o caída, se usa terapia de salvamento. La terapia de salvamento emplea fármacos tal como citosina-arabinósido, cisplastina, carboplatina , etopósido e ifosfamida dados solos o en combinación. En formas agresivas o reincidentes de ciertos trastornos neoplásticos, frecuentemente se usan los siguientes protocolos. IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato y etopósido) , MIME (metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (dexametasona , citarabina de alta dosis, cisplatina) , ESHAP (etopósido, metilpredisolona , citarabina de alta dosis, cisplatina), CEPP(B) ( ciclofosfamida , etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP ( lomustatina, mitoxantrona , citarabina y prednisona) cada uno con proporciones de dosis y promociones de dosificación bien conocidas. La cantidad del agente quimioterapéutico que se va a usar en combinación con los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención puede variar por sujeto o se puede administrar de acuerdo a lo que se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents , in Goodman & Gilman's The Phermacological Basis of Therapeutics 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds . , 9th ed. (1996)). En otra modalidad, un anticuerpo específico de IGF-1R o fragmento inmunoespecífico del mismo de la presente invención se administra en unión con un compuesto biológico. Los compuestos biológicos útiles en el tratamiento de cánceres se conocen en la técnica y se puede administrar una molécula de unión de la invención, por ejemplo, en unión con estos productos biológicos conocidos. Por ejemplo, la FDA ha aprobado los siguientes productos biológicos para el tratamiento de cáncer de mama: HerceptinMR ( trastuzumab, Genentech Inc., South San Francisco, CA; un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene actividad anti-tumoral en cáncer de mama positivo a HER2); FaslodexMR ( fulvestrant , AstraZeneca Pharmaceuticals , LP, Wilmington, DE; un antagonista de receptor de estrógeno usado para tratar cáncer de mama) ; ArimidexMR ( anastrozole , AstraZeneca Phermaceuticals , LP; un inhibidor de aromatasa no estereoidal que bloquea la aromatasa, una enzima necesaria para elaborar estrógenos) ; AromasinMR (exemestane, Pfizer Inc., New York, NY; un inactivador de aromatasa esteroidal irreversible usada en el tratamiento de cáncer de mama); FemaraMR (letrazole, Novartis Pharmaceuticals , East Hanover, NJ; un inhibidor de aromatasa no esteroidal aprobado por la FDA para tratar cáncer de mama); y NolvadexMR (tamoxifen, AstraZeneca Pharmaceuticals, LP; un antiestrógeno no esteroidal aprobado por la FDA para tratar cáncer de mama) . Otros productos biológicos por los cuales se pueden combinar las moléculas de unión de la presente invención incluyen: AvastinaMR (bevacizumab, Genentech Inc.; la primera terapia aprobada por la FDA diseñada para inhibir angiogénesis ) ; y ZevalinMR (ibritumomab tiuxetan, Biogen Idee, Cambridge, MA; un anticuerpo monoclonal radiomarcado actualmente aprobado para el tratamiento de linfomas de células B) . Además, la FDA ha aprobado los siguientes productos biológicos para el tratamiento de cáncer colorectal: AvastinMR; ErbituxMR (cetuximab, ImClone Systems Inc., New York, NY., y Bristol-Myers Squibb, New York, NY; es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ) ; GleevecMR (imatinib mesylate; un inhibidor de proteina-cinasa ) ; y ErgamisolMR (clorhidrato de levamisol, Janssen Pharmaceutica Products, LP, Titusville, NJ; un inmunomodulador aprobado por la FDA en 1990 como un tratamiento adyuvante en combinación con 5-fluorouracilo después de la resección quirúrgica en pacientes con cáncer de colon Etapa C de Dukes) . Para uso en el tratamiento de Linfomas de Hodgkin las terapias actualmente aprobadas incluyen: BexxarMR (tositumomab y yodo 1-131 tositumomab, GlaxoSmithKline , Research Triangle Park, NC; un tratamiento de múltiples pasos que comprende un anticuerpo monoclonal de ratón (tositumomab) enlazado a una molécula radioactiva (yodo 1-131)); IntronMR A (interferon alfa-2b, Schering Corporation, Kenilworth NJ; un tipo de interferon aprobado para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin folicular en unión con quimioterapia de combinación que contiene antraciclina (por ejemplo, ciclofosfamida , doxorrubicina , vincristina y prednisona [CHOP])); RituxanMR (rituximab, Genentech Inc., South San Francisco, CA, y Biofen Idee, Cambridge, MA; un anticuerpo monoclonal aprobado para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin; OntakMR (denileukin diftitox, Ligand Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA; una proteina de fusión que consiste de un fragmento de la toxina de difteria genéticamente fusionado a interleucina-2 ) ; y ZevalinMR (ibritumomab tiuxetan, Biogen Idee; un anticuerpo monoclonal radiomarcado aprobado por la FDA para el tratamiento de linfomas no de Hodkin de células B) . Para el tratamiento de Leucemia, los productos biológicos de ejemplo que se pueden usar en combinación con las moléculas de unión de la presente invención incluyen GleevecMR; CampathMR 1H (alemtuzumab, Berlex Laboratories, Richmond, CA; un tipo de anticuerpo monoclonal usado en el tratamiento de leucemia linfocitica crónica). Además, se puede usar Genasense (oblimersen, Genta Corporation, Berkley Heighsts, NJ; una terapia antisentido de BCL-2 bajo el desarrollo para tratar leucemia (por ejemplo, sola o en combinación con uno o más fármacos de quimioterapia, tal como fludarabina y ciclofosfamida ) se puede administrar con las moléculas de unión reivindicadas. Para el tratamiento de cáncer de pulmón, los productos biológicos de ejemplo incluyen TarcevaMR (erlotinib HCL, OSI Pharmaceuticals Inc., erville, NY; una molécula pequeña diseñada para seleccionar como cultivo la ruta del receptor 1 de factor de crecimiento epidérmico humano (HERI)). Para el tratamiento de mieloma múltiple, los productos biológicos de ejemplo incluyen VelcadeMR Velcade (bortezomib, Millennium Pharmaceuticals, Cambridge MA; un inhibidor de proteasoma) . Los productos biológicos adicionales incluyen ThalidomidMR ( thalidomide , Clegene Corporation, Warren, NJ; un agente inmunomodulador y que parece tener acciones múltiples, incluyendo la capacidad para inhibir el crecimiento y supervivencia de células de mieloma y anti-angiogénesis ) . Otros productos biológicos de ejemplo incluyen el OBA IMC-C225, desarrollado por ImClone Systems, Inc., New York, NY. Como se analiza anteriormente, los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención, o recombinantes de los mismos, se pueden administrar en una cantidad farmacéuticamente efectiva para el tratamiento in vivo de trastornos hiperproliferativos mamíferos. A este respecto, se apreciará que los anticuerpos descritos se formularán para facilitar la administración y promueve la estabilidad del agente activo. De manera preferente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden un portador estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina fisiológica, amortiguadores no tóxicos, conservadores y similares. Para los propósitos de la presente invención, una cantidad farmacéuticamente efectiva de anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención, o recombinante de los mismos, conjugado o no conjugado a un agente terapéutico, debe mantenerse que significa una cantidad suficiente para lograr la unión efectiva a un objetivo y para lograr un beneficio, por ejemplo, para mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o para detectar una sustancia o una célula. En el caso de células tumorales, la molécula de unión será preferentemente capaz de interactuar con los antigenos inmunorreactivos seleccionados de células neoplásicas o inmunorreactivas, o en células no neoplásicas, por ejemplo, células vasculares asociadas con células neoplásicas, y proporcionar un incremento en la muerte de estas células. Por supuesto, las composiciones farmacéuticas de la presente en la invención se pueden administrar en dosis individuales o múltiples para proporcionar una dosis farmacéuticamente efectiva de la molécula de unión. Al mantenerse con el alcance de la presente descripción, los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecí fieos de los mismos de la presente invención se pueden administrar a un humano u otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico o profiláctico. Los anticuerpos específicos de IGF-1R o fragmentos inmunoespecífieos de los mismos de la presente invención se pueden administrar a este humano u otro animal en una forma de dosis convencional preparada al combinar el anticuerpo de la invención con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable de acuerdo a técnicas conocidas. Se reconocerá por un experto en la técnica que la forma y carácter del portador o diluyente farmacéuticamente aceptables se dicta por la cantidad de ingrediente activo con el cual se va a combinar, la ruta de administración y otras variables bien conocidas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán adicionalmente que un coctel que comprende una o más especies de las moléculas de unión de acuerdo a la presente invención puede probarse particularmente efectiva. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante , e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas explican completamente la literatura. Ver, por ejemplo Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), DNA Cloning, D.N. Glover ed., Volumes I and II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait ed., (1984); Mullís et al., Patente de los Estados Unidos No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames & S. J. Higgins eds . (1984); Transcription And Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); Culture Of Animal Cells, R. L. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc, , N.Y.; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller ay M.P. Calos eds . , Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols 154 y 155 (Wu et al, eds); Immunochemicals Methods In Cell And Molecular Biology, Mayer yd Walker, eds., Academic Press, London (1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. eir y C. C. Blackwell, eds, (1986); Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1985); y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John iley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) . Los principios generales de ingeniería de anticuerpos se exponen en Antibody Engineering, 2nd edition, C.A.K. Borrebaeck, Ed. , Oxford Univ. Press (1995). Los principios generales de ingeniería de proteína Protein Engineering, A Practical Approach, Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng. (1995) . Los principios generales de anticuerpos y unión antígeno-hapteno se exponen en: Nisonoff, A., Molecular Immunology, 2nd ed., Sinauer Associates, Sinderland, MA (1984); y Steward, M . ., Antibodies , Their Structure and Function , Chapman and Hall, New York, NY (1984). Adicionalmente , los métodos normales en inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente se siguen en general como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (eds), Basic and Clinical-Immunology (8th ed. ) , Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y ishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman y Co., New York (1980) . Los trabajos de referencia normales exponen principios generales de inmunología que incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein, J. , Immunology; The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R. , et al., eds., Monoclonal Atibodies, Hybridoma: A New Dimensión in Bílogical Analyses, Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" en Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13. Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby Immunology 4th ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, L. Brostoff, J. y Male D., Immunology 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A- . Abul, A. y Lichtman, A., Cellular and Molecular Immunology Ed. 5, Elsevier Health Sciences División (2005); Kontermann y Dubel, Antibody Engineering, Springer Verían (2001); Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow y Lañe, An tibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer Cold Spring Harbor Press (2003). Todas las referencias citadas anteriormente, así como todas las referencias citadas en la presente, se incorporan en la presente como referencia en sus totalidades.
Ej emplos Ejemplo 1 Selección de Fab Específicos de IGF-IR de Bibliotecas de Fagos Se usó el ectodominio de IGF-IR humano recombinante para seleccionar una biblioteca de Fab de fagómidos Cándidos humanos que contiene 3.5 x 1010 clones únicos (Hoet, R.M., et al. Nat Biotechnol . 23(3):344-8 (2005), ("Hoet et al.") que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Dos distintos brazos de visualización se siguieron usando proteína de IGF-lR-his e IGF1R-Fc biotinilada. Las proteínas se capturaron en cuentas magnéticas revestidas con estreptavidina antes de la incubación con la biblioteca de fagos. En el caso de IGF1R-Fc, se capturó un anticuerpo anti-Fc biotinilado en las cuentas magnéticas, seguido por lo capturado de una proteína de fusión Fe. Se realizaron las selecciones como se describe en Hoet et al. Después de 3 rondas de visualización, se removió el muñón del gen III de 479 bp por digestión con MIuI, y el vector se religó para la expresión de Fab soluble en células TG1. El análisis por ELISA de 920 clones del brazo de IGFlR-his biotinilado produjo 593 clones positivos, que contienen 33 secuencias únicas. El análisis por ELISA de 920 clones del brazo de IGF1R-Fc produjo 163 clones positivos, que contienen 12 secuencias únicas. El análisis de secuencia de todos los clones determinó 12 clones que se aislaron en ambos brazos de la estrategia de visualización . Los clones únicos se purificaron y se reconfirmó la unión al ectodominio de IGF-1R humano recombinante por ELISA asi como células 3T3 establemente transíectadas con IGF-1R humano de longitud completa (Figuras 1A y IB) . En base a los datos de unión, se seleccionaron para análisis adicional 6 de los 12 clones únicos aislados en ambos brazos.
Ejemplo 2 Actividad de Unión de los Fab a IGF-1R Expresado en Células Tumorales La capacidad de los Fab para unirse a IGF-1R tipo silvestre se determinó por citometria de flujo usando la linea de células tumorales CF-7. Las células MCF-7 (Adenocarcinoma de Mama Humano de NCI) se dividieron 24 horas antes del establecimiento del ensayo para obtener una monocapa confluente al 70 %. Por rutina, la linea de células MCF-7 se mantuvo dentro de 20 pasadas. Las células se levantaron con amortiguador de disociación celular (catálogo Gibco # 13151-014), se contaron, se lavaron y ajustaron a 1 x 106 células/ml y entonces se adicionó uno mi de células a cada tubo (tubo Falcon de 12 x 75 mm, catálogo # 352054) . Las células se sedimentaron y el sobrenadante se removió por centrifugación a 1200 rpm durante 5 minutos y entonces se adicionaron 100 µ? de anticuerpos diluidos al sedimento celular. Se probaron los Fab purificados a las concentraciones de inicio de ya sea 210 ó 60 µg/ml con diluciones 1:3 en amortiguador FACS, se bajaron a 0.001 µ?/???. El amortiguador FACS usado a todo lo largo del ensayo fue PBS (sin Ca++/Mg++) que contiene BSA al 1 % (catálogo Sigma # A-7906) y azida sódica 0.1 % (catálogo Sigma # S2002). Como un IR3 se encontró positivo, se usó un anticuerpo murino (Ab-1; Calbiochem #GR11L) . Se dejó que las muestras se incubaran en hielo durante 1 hora y 15 minutos luego se lavaron con 2 mi de amortiguador FACS y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se aspiró y se adicionaron 100 µ? del anticuerpo de detección secundaria a cada tubo correspondiente en el amortiguador FACS. Las muestras entonces se incubaron durante 30 minutos en hielo, en la oscuridad. Las células se lavaron como se describe anteriormente, luego, se re-suspendieron en 250 µ? de amortiguador FACS por tubo/muestra. Se detectaron los Fab unidos a célula usando el fragmento F(ab' ) 2 purificado por afinidad, conjugado a FITC, de cabra especifico anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Lab, catálogo # 109-096-006; usar a 5 µg/ml), en tanto que se detectó el anticuerpo de control murino positivo usando F(ab')2 de cabra conjugado a FITC, anti-IgG de ratón (H + L) (Jackson ImmunoResearch, catálogo # 115-096-062; usar a 5 µg/ml). Las células se tiñeron para la determinación de células vivas con solución de tinción de Yoduro de Propidio (PI para exclusión de células muertas; BD Pharmingen catálogo # 51-66211E o 556463; usar a 1:500 final en amortiguador FACS) . Las muestras se corrieron en el instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson) con 10,000 eventos vivos recolectados por muestra. El análisis de datos se realizó usando el software GraphPad Prism versión 4.0 {www.graphpad.com) (GraphPad Software, Inc., 11452 El Camino Real, #215, San Diego, CA 92130 EUA) . Una vez que se han corrido las muestras y se determina la media geométrica, se gráfica la concentración de anticuerpo (eje X) vs media geométrica (eje Y) en el loglO, usando el programa de gráficas (Graphpad Prism (Prism Graph) . Los conjuntos de datos entonces se transformaron (conjunto de datos de valor X = concentración de anticuerpo) a X = Log(X) y se grafican usando un ajuste a la curva de regresión no lineal, dosis-respuesta sigmoidal. Se generaron los valores de EC50 y los valores de R2 usando el software Prism Graph. Los 6 Fab mostraron buena actividad de unión a IGF-1R tipo silvestre expresado en células tumorales MCF-7 (Figura 2) . La EC50 de la unión varió entre 9 a 42 nM (Tabla 3) .
Ejemplo 3 Inhibición de Unión de Ligando a IGF-1R por Fab determinó la capacidad de los Fab para bloquear la unión de los ligandos de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R usando un radioinmunoensayo (RIA) . Ensayo de bloqueo de ligando (RIA) . Se compraron IGF-1 humano recombinante (Cat #291-G1), IGF-2 (Cat #292-G2), insulina (Cat # Custom02), receptor de insulina humana (Cat #1544-1R) de R&D Systems, Inc., Miniápolis, MN . Se compró insulina (Arg-Insulin, Cat #01-207) de Upstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY (ahora parte de illipore, Concord, MA (EUA) ) . Se compraron 125I-rhIGF-l (Cat #IM172), 125I-rhIGF-2 (Cat #IM238) y 125I-rhInsulina (Cat #IM166) de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . Se usaron anticuerpos específicos del fragmento de Fcy, de cabra anti-IgG humano AffiPure (Cat #109-005-098, Jackson ImmunoResearch , West Grove, PA) para captura de IGF-1R-Fc. Como el anticuerpo de detección, se usó HRP de cabra anti-IGF de ratón (Cat #1030-05, Southern Biotech Birmingham, AL) . Como controles positivos para el bloque de IGF-1 e IGF-2, se usaron, respectivamente, IR3 (Ab-1, Cat #GR11LSP5, Calbiochem, La Jolla, CA) y 1H7 (monoclonal de ratón específico a cadena a de IGF-1R, SC-461, IgGi Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, usaron anticuerpo específicos de a-subunidad de receptor de insulina humano, Clon 83-14, (Cat #AHR0221, Biosource International, Inc., Camarillo, CA) y el 47-9 (Cat #E55502M, Biodesign International, Saco, ME) como bloqueo de controles positivos de los experimentos de unión de insulina-receptor de insulina. Se produjo la proteína de fusión de IGF-1R-Fc recombinante en Biogen Idee (Cambridge, MA) . Como anticuerpos de control negativo de ratón correspondidos en isotipo, se usaron 2B8 (murino a-CD20.IgGi) y 2B8 mkm.G2a (murino a-CD20 MAb, IgG2a, Biogen Idee, Lote #NB3304-87, San Diego, CA) . El control negativo para Fab fue R001-1B proporcionado por Christilyn Graff (Biogen Idee, Cambridge, MA) . La PBS usada en los amortiguadores fue de BioWhittaker (Cat. #17-513F, Walkersville, MD) . Se revistió IGF-1R humano recombinante (versión marcada con Histidina) o IGF-1R-Fc en IMMULON2 Hb (alta unión) Removawell en tiras (Dynex Technologies, Inc., cat. #6302) diluidas con amortiguador de revestimiento de carbonato, pH 9.5 a una concentración de 250 ng/concavidad. Después de la incubación durante la noche a 4 C, las concavidades se lavaron tres veces con amortiguador de lavado (Tween 20 al 0.05 %/PBS), luego se bloquearon con amortiguador de bloqueo (3 % de BSA/PBS) durante una hora a temperatura ambiente. El amortiguador de bloqueo se removió y las concavidades se lavaron tres veces más. Se diluyeron las preparaciones de anticuerpo, Fab, o ligando a la concentración deseada con amortiguador de dilución (1 % de BSA/0.05 % de Tween 20/PBS) y se colocaron en placa a 50 µ? por concavidad en duplicado. Después de 45 minutos a temperatura ambiente, se adicionaron por concavidad 100,000 cpm de ya sea [1251] rhIGF-1 o [1251] rhIGF-2 en 50 µ? de amortiguador de dilución. Esto se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Las concavidades se lavaron nuevamente tres veces más y se dejó liquido libre después del último lavado. Las concavidades secadas con aire se contaron con el contador Gamma Isodata. De manera alternativa, se evaluaron las Fab por un ensayo modificado de captura, donde se capturó el IGF-IR-Fc usando anti-IgG humana inmovilizado a una placa. Se llevó a cabo la inmovilización por incubación durante la noche del anticuerpo especifico de fragmento Fcy de cabra anti-IgG humana (200 ng/concavidad) en amortiguador de revestimiento de carbonato. Las concavidades se lavaron, se bloquearon y se adicionaron por concavidad 250 ng de IGF-1R-Fc. La capacidad de 6 diferentes Fab para bloquear la unión de IGF-1 o IGF-2, o ambos ligandos, se muestra en la Tabla 3. Los 6 Fab superiores con diferente actividad de bloqueo se seleccionaron para análisis adicional.
Ejemplo 4 Fab Inhibieron Fosforilación de IGF-1R Mediada por IGF-1 e IGF-2 Lineas celulares: linea celular MCF-7 (NCI) de carcinoma de mama humano que expresa IGF1R se mantuvo a 37 °C y 5 % de C02 en MEM eagle (ATCC) que contiene 10 % de FBS , IX de aminoácidos no esenciales, L-glutamina 2mM, piruvato de sodio ImM y 1000U/ml de penicilina y estreptomicina. Las células se sub-cultivaron dos veces semanalmente para mantenimiento y ensayo, y se usaron con un máximo de 12 pasajes. Las células MCF-7 se colocaron en placa en 2 mi de medio de crecimiento a 2 x 105 a 4.0 x 105 células/concavidad en placas de 12 concavidades revestidas con Ploy-D-Lisina (BD Biosciences, #35-6470) y se cultivaron a 37°C, 5 % de C02. A 48 horas, el medio se removió y el suero celular se recolectó durante la noche a 37°C, 5 % de C02. Se removió el medio libre de suero y se adicionaron anticuerpos de control o de prueba a la concentración indicada en 350 µ? de medio fresco libre de suero y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, o de manera alternativa a 37°C. Los Fab se probaron con una concentración de 200 nM, 20 nM y 2 nM y los mAb se probaron a 67, 6.7 y 0.67 nM. El anticuerpo de control anti-IGF-1R usado fue aIR3 (EMD biosciences, Oncogene Research products, #D27249) . El IGF-1 humano recombinante a 13nM o IGF-2 a 27n (R & D Systems, #291-G1, #292-G2) se adicionó a las concavidades en 35 µ? de medio libre de suero y se incubó a 37°C durante 15 minutos. El ligando se incubó a temperatura ambiente para experimentos de anticuerpo a 37°C. Las células se lisaron en amortiguador de lisis celular IX (Cell Signal technologies , #9803) con PMSF lmM durante 1 hora a temperatura ambiente. Se adicionaron Usados celulares a placas de ELISA pre-revestidas con el anticuerpo de IGF-lRp (clon 1-2, Biosource International, #AHR0361) y se incubaron durante 2 horas. Después de lo cual, se lavaron las placas y se detectó el receptor fosforilado unido a placa con el anticuerpo 4G10 anti-fosfotirosina marcado con biotina (Catálogo #16-103, Upstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY (ahora parte de Millipore, Concord, MA (EUA) ) y estreptavidina-HRP (BD Pharmingen, #554066) . El ensayo se desarrolla por la adición de sustrato de TMB (Kierkegaard & Perry, #50-76-00) y el color se detuvo por la adición de H2S04-4 4N (LabChem, Cat #LC25830-1) . Se mide la densidad óptica a 450 nm usando un lector de placa de Molecular Devices y se calcula el por ciento de inhibición con respecto al control de ligando para cada muestra de anticuerpo-ligando. La Tabla 3 resume la inhibición de la fosforilación mediada por IGF-1 e IGF-2 de IGF-1R en células MCF-7 por Fab.
Se seleccionaron un total de 16 Fab de IGF-1R para inhibición de fosforilación de receptor por ELISA. Nueve anticuerpos mostraron respuesta positiva de "+" o mejor a una concentración de 200 nM contra IGF-1, IGF-2 o ambos. Estos anticuerpos se seleccionaron para aumentar en escala las cantidades y se probaron nuevamente para respuesta inhibitoria dependiente de dosis. En base a la capacidad para inhibir la unión de ligando y la fosforilación del receptor, se seleccionaron cuatro Fab como candidatos guias para la conversión del anticuerpo de longitud completa (ver, Ejemplo 6) . Las Figuras 3a y 3b, muestran la inhibición de la fosforilación de IGF-1R del material aumentado en escala de los 6 Fab superiores de IGF-1R.
Ejemplo 5 Especificidades y Afinidades de Unión a Anticuerpo para IGF-1R versus INSR Parte I: Análisis de unión de anticuerpo a IGF-1R soluble versus INSR soluble usando ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISA) Se realizaron ensayos de ELISA para determinar la unión especifica de los anticuerpos de fragmento Fab a IGF-1R soluble con respecto al receptor de insulina. Se revistieron placas con 10 µg/ml de rh-IGF-lR (R & D Systems, #305-GR) o rh-INSR (R & D Systems, #1544-IR) durante la noche y se bloquearon con 5 % de leche. Los anticuerpos se adicionaron en un intervalo de 2 µ?-0.2 nM para los Fab o 667-0.067 nM para MAb murinos en una dilución en serie 1:10 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectó el anticuerpo unido con kappa a-humana de cabra marcada con HRPO (Southern Biot echnology Associates, #2060-05) para los Fab y Fcy de IgG de a-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch, #115-035-164) para los MAb murinos. Se detuvo el desarrollo de color por la adición de H2SO4 4N, y se mide la densidad óptica a 450 nm usando un lector de placa de Molecular Devices y se generan las curvas de unión . Los Fab de IGF-1R no mostraron unión especifica al receptor soluble de insulina a ninguna concentración (Tabla 3) en tanto que, como se espera, mostraron buena unión a IGF-1R-Fc. Las Figuras 4a y 4b ilustran las curvas representativas de unión obtenidas con los Fab M14-B01, M14-C03 y M12-G04. Se observaron patrones similares de unión para M13-C06, 14-G11 y M12-E01 (datos no mostrados) .
Parte II: Análisis de Unión a Anticuerpo a IGF-1R Soluble versus INSR Soluble Usando Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) y Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia Resuelta en Tiempo (tr-FRET) Se compararon las afinidades de unión de los anticuerpos de M13-C06, M14-C03, y M14-G11 a IGF-1R humano soluble y ectodominios de receptor de insulina usando resonancia de plasmón superficial (Biacore) y transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en tiempo (tr-FRET) ; que demuestra además que el anticuerpo M13-C06 no exhibe significativa reactividad cruzada con el receptor de insulina, IGF-1R murino, o una versión truncada de IGF-1R humano (es decir, los residuos de aminoácido 1-462 de hIGF-lR que contienen sólo el primero y segundos dominios de repetición ricos en leucina así como el dominio de repetición rico en cisteína, pero carece de los tres dominios tipo III de fibronectina de IGF-1R.
Análisis por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) Se realizaron análisis de SPR usando un Biacore3000.
El instrumento se ajustó a 25°C y los ensayos se realizaron con amortiguador de corrida HBS-EP pH 7.2 comprado de Biacore (Biacore, Cat . No. BR-1001-88). Los anticuerpos completamente humanos, M13-C06, M14-C03, y M14-G11 se inmovilizaron a ~ 10,000 RU en superficies SensorChip grado de investigación de Biacore CM5 usando la norma química reactiva de NHS/EDC-amina de acuerdo a los protocolos suministrados por Biacore. Para inmovilización, los anticuerpos se diluyeron a 40 µ?/mL en un amortiguador de acetato 10 mM, pH 4.0. Para investigar la cinética relativa de la asociación y disociación de los ectodominios de longitud completa de IGF-1R humana (1-902)-Hisio (hIGF-lR-Hisio (R&D systems)) e INSR humano (28-956) -His10 (INSR (R&D systems)) a cada uno de los anticuerpos humanos, se inyectaron concentraciones crecientes de hIGF-lR-Hisi0 o INSR sobre las superficies sensorchip. La serie de concentraciones de hIGF-lR-Hisio varió de 1.0 nM a 250 nM en tanto que las concentraciones de INSR variaron de 1.0 nM a 2 µ?. Todas las superficies de anticuerpo se regeneraron de manera confiable con Glicina 100 mM, pH 2.0. Las regeneraciones repetidas no condujeron a pérdidas de actividad para ninguna de las superficies de anticuerpo. Las velocidades de flujo fueron 20 µ?/min. ("Hisio" denota una marca de histidina de 10 residuos en el C-término de las construcciones) .
Ensayo de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia Resuelta en Tiempo (tr-FRET) Se conjugaron de manera covalente hIGF-lR-Hisi0 y M13-C06 a Cy5 y un quelato de europio, respectivamente, usando química estándar de NHS de acuerdo a los protocolos del fabricante del tinte. Las diluciones en serie de varios competidores no marcados, solubles del receptor de ectodominio, (1) hIGF-lR-Hisi0, (2) IGF-1R humano (1-903)-FlagHisio (hIGF-lR-FlagHisi0, Biogen Idee), (3) IGF-1R humano (l-903)-Fc (hIGF-lR-Fc, Biogen Idee), (4) IGF-1R humano (1-462) -Fe (hIGF-lR (1-462) -Fe, Biogen Idee), (5) IGF-1R murino (1-903) -Fe (mIGF-lR-Fc, Biogen Idee) o (6) INSR, iniciando a 6.25 µg (50 µ? de 125 µg/ml de solución concentrada) se mezclaron con 0.1 µg de hIGFlR-Hisi0-Cy5 (25 µ? de 4 µg/ml de solución concentrada) y 0.075 µg de Eu-C06 (25 µ? de 3 µg/ml de solución concentrada) en placas de microtitulo de 96 concavidades (negras de Costar) . Los niveles de conjugación para hIGF-lR-Hisi0-Cy5 fueron 6.8:1 (Cy5 : IGF-1R-Hisi0) , y para Eu-C06 fueron 10.3:1 (Eu:C06) como se determina por la absorbancia de cada tinte con respecto a la concentración de proteina. El volumen total fue 100 µ? para cada muestra. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placa. Se llevaron a cabo mediciones de fluorescencia en un lector de placa fluorescente Wallac Víctor2 (Perkin Elmer) usando el protocolo LANCE con la longitud de onda de excitación a 340 nm y longitud de onda de emisión a 665 nm. Todas las construcciones se muestrearon con al menos dos réplicas. Todas las construcciones del ectodominio de receptor de IGF-1R, solubles, derivadas de Idee de Biogen se succionaron en vectores PV-90 de Biogen Idee para expresión en CHO usando la metodología descrita (Brezinsky et al., 2003). Cada receptor que contiene una marca de IgG-Fc C-terminal se purificó por afinidad usando un paso individual de proteína A-SEPHAROSA FFMR (GE Heathcare) como se describe anteriormente. Se purificó hIGF-lR-FlagHisio usando Ni2+-agarosa (Qiagen) como se describe anteriormente (Demarest et al., 2006).
Resultados : Los anticuerpos anti-IGF-lR completamente humanos, 13-C06, M14-C03, y M14-G11, se evaluaron para sus actividades de unión comparativa hacia las construcciones de ectodominio de INSR e IGF-1R solubles usando resonancia en el plasmón superficial (SPR) . Se inyectaron hIGF-lR-His10 e INSR sobre superficies inmovilizadas de anticuerpo usando protocolos idénticos. hIGF-lR-Hisio demostró unión a los tres anticuerpos anti-IGF-lR aún a la concentración más baja, 0.5 nM (datos no mostrados: concentraciones variaron de 1 a 250 nM y la fase de inyección de receptor fue 400-2200 segundos seguido por una fase de disociación de amortiguador y regeneración subsiguiente con glicina, pH 2.0). La unión de hIGF-lR-Hisio fue más fuerte para la superficie de M13-C06. En contraste, INSR demostró poca actividad hacia la superficie de M13-C06 aún a una concentración tan alta como receptor 2 µ? (>1000 veces que aquélla que se observó par la unión de IGF-14 {datos no mostrados: concentraciones variaron de 1.0 nM a 2 µ? y la fase de inyección de receptor fue 500-1000 segundos seguidos por una fase de disociación de amortiguador) . La superficie de M14-C03 y M14-G11 también demostró poca actividad de unión hacia INSR. Entonces, se determinaron las afinidades de las varias construcciones recombinantes de IGF-IR y de INSR para M13-C06 usando un ensayo de tr-FRET basado en competición. Se determinaron curvas de unión de mejor ajuste para todas las construcciones recombinantes de receptor (descritas más adelante) (datos no mostrados). Todos los datos se ajustaron a un modelo de unión de un sitio de lo cual se determinaron los valores correspondientes de IC50. Las tres construcciones de ectodominio de IGF-IR humano de longitud completa (hIGF-lR-Fc, hIGF-lR-Hisio, y hIGF-lR-FlagHis10) compitieron todas de una manera dependiente de la concentración con valores de IC50 de 2.9, 2.0, 5.2 µg/ml, respectivamente. La construcción de IGF-IR (1-462) -Fe humana truncada, la construcción de IGF-1R-Fc de ratón de longitud completa, y la construcción INSR-Hisi0 humana de longitud completa no inhibieron hIGF-lR-Hisi0 marcada con Cy5 a concentraciones 100 veces por arriba de la IC50 de las construcciones de IGF-IR humanas de longitud completa recombinantes, sugiriendo que estas construcciones anteriores no exhiben reactividad significativa de unión para M13-C06 en comparación a IGF-1R humano de longitud completa posterior .
Parte III: Afinidad de Unión Relativa del Anticuerpo de M13-C06 para IGF-1R Humano Soluble versus urino Se compararon las afinidades de unión relativa de M13-C06 para IGF-1R murino versus humano. Se usó la resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar la afinidad de M13-C06 para IGF-1R-Fc murino e IGF-1R-Fc humano. Se realizaron los experimentos en un aparato Biacore 3000 a 25°C usando HBS-EP (Biacore, Cat. No. BR-1001-88) como el amortiguador de corrida. Se inmovilizó un anticuerpo anti-IgG-Fc humano (2C11 de Biogénesis, Cat. No. 5218-9850) a saturación en una superficie de chip Biacore CM5 (Cat. No. BR-1000-14) por inyección a 500 nM en amortiguador de HBS-EP. Se capturaron mIGF-lR-Fc o hIGF-lR-Fc en la superficie del chip al inyectar 40 µ?, de receptor 20 nM a 3 µ?,/p???. Después de la captura del receptor, se inyectaron 40 µ?. de Fab de M13-C06 a 3 µ??/p???. Se midió la disociación de Fab durante aproximadamente 27 minutos. Se diluyó en serie Fab de 25 a 0.4 nM para obtener curvas de unión cinética dependiente de la concentración. La regeneración del chip de superior entre cada serie de inyección se realizó usando inyecciones de 3 x µ?. de glicina 100 mM, pH 2.0 a 60 µ?,/p??. Cada curva se referenció doble usando (1) datos obtenidos de una superficie de chip CM5 desprovista del anticuerpo 2C11 anti-IgG, y (2) datos de una inyección primaria del receptor seguido por una inyección secundaria del amortiguador de HBS-EP. La serie de concentraciones de Fab de M13-C06 para cada receptor se ajustó al modelo de unión de 1:1 provisto dentro del software BiaEvaluation del fabricante. Para obtener la kd de la unión de M13-C06 a mIGF-lR-Fc, el experimento se repitió con Fab de M13-C06 a 25 nM y mIGF-lR-Fc a 20 nM con el único cambio en el protocolo original que es una extensión del periodo de disociación a tres horas.
Resultados : Se aplicó Fab de 13-C06 a superficies Biacore que contienen hIGF-lR-Fc o mIGF-lR-Fc para determinar la afinidad relativa del anticuerpo a las dos especies de receptor. La presencia de la marca de IgGl-Fc C-terminal da por resultado la multimerización adicional de las construcciones de receptor de IGF-IR-Fc (datos no mostrados); por lo tanto, los ajustes del modelo de unión proporcionan una medida de las afinidades relativas o aparentes de M13-C06 para cada receptor. La afinidad de Fab de M13-C06 para IGF-IR-Fc humano y murino se encontró que es 0.978 nM y 89.1 nM, respectivamente. La disminución por 100 veces en la unión a IGF-1R murino es fácilmente evidente cuando se comparan las Figuras 27a y 27b, que presentan las curvas de asociación y disociación, las constantes de velocidad cinética, y las constantes de disociación de equilibrio. La Figura 27a muestra las características de unión dependiente de la concentración de Fab de M13-C06 para IGF-1R humano ( ka (1/Ms) = 8.52e5 M"1 s"1; kd (1/s) = 8.33e-4 s"1; y, KD = 9.78e-10 M) . La Figura 27b muestra las características de unión de disociación y asociación lenta de M13-C06 para mIGF-lR-Fc ( ka (1/Ms) = 471 M"1 s"1; kd (1/s) = 4.20e-5 s"1; KD = 8.91e-8 M) . Debido a la disociación extremadamente lenta de Fab de M13-C06 de mi GF- IR- Fe , la constante de velocidad, kd, de disociación cinética, no se puede determinar usando el conjunto inicial de datos. Se realizó un segundo experimento usando un periodo de disociación de 3 horas para obtener la constante de velocidad de disociación, kd de 4.20e-5 s"1, que se usó para obtener la constante de disociación de equilibrio, KD, (descrita anteriormente) del conjunto original de datos. La presencia de la marca de IgGl-Fc C-terminal da por resultado la multimerizacion adicional de las construcciones del receptor de IGF-IR-Fc (datos no mostrados); por lo tanto, los ajustes del modelo de unión proporcionan una medida de las afinidades relativas o aparentes de M13-C06 para cada receptor.
Parte IV: Anticuerpo de Longitud Completa de M13-C06 se Une de Manera Especifica a IGF-IR pero no a INSR Expresado en Células de Mamífero Se expresaron de manera independiente IGF-IR recombinante y el receptor de insulina (IR) en células de mamífero (3T3 o CHO) . Las células se solubilizaron con Tritón X-100 al 1 % y el receptor se inmunoprecipitó con cuentas de proteína-A/G acopladas a un anticuerpo de control negativo (IDEC-151), el anticuerpo M13. C06. G . P . agly (C06) , anticuerpo M14-G11. G . P.agly (Gil), o un anticuerpo de INSR (a-IR) . Los complejos de anticuerpo/antígeno se liberaron de las cuentas por tratamiento ácido, se aplicaron geles de SDS-PAGE de Tris-Glicina y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa . Se realizó la detección usando anti-IR humana de ratón (Figura 26a) o anti-IGF-lR humano de ratón (Figura 26b) e IgG de a-ratón de cabra. Resultados: el anticuerpo M13. C06. G4. P . agly se une a IGF-IR pero no a INSR expresado en células mamíferas.
Ejemplo 6: Construcción de IgG anti-IGF-lR de Longitud Completa Se convirtieron cuatro Fab a la versión de IgG4. P.agly y se expresaron en células CHO. Las secuencias de ADN que codifican para cuatro Fab distintos a anti-IGF-lR, M13-C06 (Figuras 5a-5d) , M14-C03 (Figuras 5e-5h) , M14-G11 (Figuras 5i-51), y 14-B01 (Figuras 5m-5p) ) se seleccionaron de una biblioteca de fagos de anticuerpos humanos (Dyax Corp) por biovisualización contra una proteina de fusión de ectodominio de IGF-1R humano-Fc recombinante . Cada uno de los cuatro Fab anti-IGF-lR contuvo la estructura alterna de linea germinal de cadena pesada humana VH3-23 y fueron cadenas ligeras kappa . Las secuencias génicas de Fab se usaron para construir plásmidos de expresión que codifican para los anticuerpos anti-IGF-Rl de longitud completa usando el sistema de vector de expresión pV90AS para la producción de anticuerpos en células de mamífero. El pV90AS es un vector de expresión pV90 modificado, diseñado para generar dos trascriptos de un promotor individual a través de empalme alterno de un trascripto individual (Referencia: solicitud USPTO WO2005/089285) . El donador de empalme de CMV natural se empalma ya sea a un aceptador de empalme parcialmente descompuesto para generar un trascripto que codifica para cadena ligera de anticuerpo, o a un aceptador de empalme de CMV natural para generar el trascripto que codifica para cadena pesada de anticuerpo. El aceptador de empalme parcialmente descompuesto se ha creado por ingeniería para dar por resultado cantidades similares de trascriptos tanto de cadena pesada como ligera. Las regiones Variable (VL) y Constante (CL) de cadena ligera (SEQ ID NOs : 153 y 154, Figura 5y-5z) de cada Fab anti-IGF-lR (M13-C06; M14-C03; M14-G11 y M14-B01) se amplificaron por PCR. (Tabla 7) . El cebador de PCR IGF1R-FK de cadena ligera 5' incluyó un sitio de endonucleasa de restricción Sfi I seguido por secuencia que codifica para un péptido de señal de cadena ligera de inmunoglobulina MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 157) en cuadro a secuencias que corresponden al amino-término de la región de VL de acuerdo a los métodos descritos en Nakamura T, et al., Int J Immunopharmacol . 22:131-41 (2000), que se incorpora en la presente mediante referencia en su totalidad. Las cuatro secuencias maduras de cadena ligera de IGF1R maduras tienen amino-término idéntico. El cebador IGF1R-RK de PCR de cadena ligera 3' incluyó la secuencia que corresponde al carboxil-término de la región de CL y un sitio Ase I. El producto de PCR se purificó por electroforesis en gel de agarosa y extracción usando el protocolo de equipo de extracción en gel QIAquick (QUIAGEN CA) , se digirió con endonucleasas de restricción Sfi I y Ase I y se ligó con el vector pHLP025 digerido con Sfi I/Asc I (Holly Prentice) . El vector pHLP025 contiene sitios de endonucleasa de restricción Sfi I/Asc I para recibir la cadena ligera de anticuerpo (péptido de señal-VL-CL) como un fragmento de PCR digerido con Sfi I/Asc I además de la secuencia del sitio donador de empalme de CMV natural, una secuencia de sitio aceptador de empalme parcialmente descompuesta, y una secuencia de señal de poli A (Referencia: Solicitud USPTO WO 2005/089285) .
La región Variable (VH) de cadena pesada de cada Fab anti-IGF-lR (M13-C06; 14-C03; M14-G11 y M14-B01) se amplificó por PCR. El cebador de IGFIR-FH de PCR de VH de cadena pesada 5' incluyó un sitio de endonucleasa de restricción Neo I seguido por la secuencia que codifica para el péptido de señal de cadena pesada sintético MGWSLILLFLVAVATRVLS (SEQ ID NO: 122) en cuadro a secuencias que corresponden al amino-término de la región de VH como se describe anteriormente. El cebador IGFIR-RH de PCR de VH de cadena pesada 3 ' incluyó la secuencia que corresponde al carboxil-término de la región de VH y el sitio Sfi I. El producto de PCR se purificó por electroforesis en gel de agarosa y extracción usando el protocolo de equipo de extracción en gel QIAquick (QUIAGEN CA) , se digirió con las endonucleasas de restricción Neo I y Sfi I y se ligó con el vector pHLP029 (Holly Prentice) digerido con Neo I/Sfi I. El vector pHLP029 contiene los sitios Neo I/Sfi I para recibir la secuencia del péptido de señal-VH de anticuerpo como un fragmento de PCR digerido con Neo I/Sfi I además de la secuencia de señal de poli A de dirección 5', una secuencia de sitio aceptador de empalme de CMV natural, y una secuencia de señal de poli A de dirección 3' (Referencia: Solicitud USPTO WO2005/089285 ) . Las secuencias génicas que codifican para (sitio Sfi I-, péptido de señal de cadena ligera-, anti-VL y CL de IGF-IR) en pHLP025 y (péptido de señal de cadena pesada-, anti- IGF-1R VH-sitio Sfi I) en pHLP029 se montaron en un fragmento de ADN individual por amplificación por PCR a través de secuencias comunes de traslape presentes en ambos vectores usando los cebadores de PCR IGF1R-FK de cadena ligera 5' e IGF1R-RH de VH de cadena pesada 3' descritos anteriormente. El producto de PCR resultante se purificó por electroforesis en gel de agarosa y extracción usando un protocolo de equipo de Extracción en Gel QIAquick (QUIAGEN CA) , se digirió con la endonucleasa de restricción Sfi I y se ligó con el vector pXWU007 digerido con Dra III. De forma breve, se construyó primero pXWU007 al subclonar un fragmento de región constante de IgG4 humana de Age I/BamHI que contiene una mutación de S228P en la región de articulación de IgG4 y una mutación de T299A en el dominio CH2, sistema de numeración de EU (Kabat, E, Wu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS, Foeller, C: Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991) (SEQ ID NOs: 155 y 156, Figura 5aa-5bb) del plásmido pEAG1808 (proporcionado por Ellen Garber) en el vector pHLP028 digerido con Age I/BamHI. El pHLP028 es un vector de IgG4 pV90 modificado para contener el sitio Dra III para recibir el producto de PCR digerido con Sfi I individual descrito anteriormente (Referencia: Solicitud USPTO WO2005/089285) . El plásmido resultante produce el trascrito de precursor bi-cistrónico que en el empalme alternativo da por resultado los ARNm de cadena pesada y ligera de anticuerpo transduccionalmente activos en cantidades aproximadamente estequiométricas . Los vectores intermedios y de expresión para producir anticuerpos de IgG . P anti-IGF-lR humanos aglicosilados de longitud completa se muestran en la Tabla 8. Se confirmaron las secuencias correctas por análisis de secuencia de ADN . La expresión de los anticuerpos de longitud completa de los plásmidos pXWU020, pXWU022, pX U024, y pXWU025 en células de mamífero da por resultado la producción de anticuerpos de IgG4.P humanos aglicosilados estables.
Tabla 7. Oligonucleótidos para Amplificación por PCR de Dominios de Anticuerpos Humanos Los cebadores de PCR de cadena ligera 5' directos incluyen un sitio de endonucleasa de restricción Sfi I (subrayado) y la secuencia que codifica para el péptido de señal de cadena ligera; El cebador de PCR de cadena ligera 3' inverso incluye un sitio Ase I (subrayado) , El cebador de PCR variable de cadena pesada 5 ' directo incluye un sitio de endonucleasa de restricción Neo I (subrayado) y la secuencia que codifica para el péptido de señal de cadena pesada. El cebador de PCR variable de cadena pesada 3 ' inverso incluye un sitio de Sfi I (subrayado) .
Cebadores de LC IGF1R-FK 5 ' -CGAACAGGCCCAGCTGGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC AGCTCCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTG ACATCCAGATGACCCAG-3 ' (SEQ ID NO: 123) IGF1R-RK 5 ' -TCGCACGGCGCGCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3 ' (SEQ ID NO: 124) Cebadores de VH IGF1R-FH 5 ' -CGGCCACCATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGT TGCTACGCGTGTCCTGTCCGAAGTTCAATTGTTAGAG-3 ' (SEQ ID NO: 125) IGF1R-RH 5 ' -GGGATCGGCCAGCTGGGCCCCTTCGTTGAGGCGCTTGAGACGGTG AC-3 ' (SEQ ID NO: 126) Tabla 8.- Plásmidos intermedios y de expresión que codifican para los anticuerpos anti-IGF-lR Vector Composición Cadena (s) de de anticuerpo pX U008 pHLP025 + C03 L C03 VL-CL pXWUOlO pHLP025 + C06 L C06 VL-CL pXWU012 pHLP025 + Gil L Gil VL-CL pXWU013 pHLP025 + B01 L B01 VL-CL pXWU014 pHLP029 + C03 VH C03 VH pXWU016 pHLP029 + C06 VH C06 VH pXWU018 pHLP029 + Gil VH Gil VH Vector Composición Cadena (s) de de anticuerpo pXWU019 pHLP029 + B01 VH B01 VH pXWU020 pXWU007 + C03 L-VH C03 VL-CL + C03 VH-agly ?4. P pXWU022 pXWU007 + C06 L-VH C06 VL-CL + C06 VH-agly ?4. P pXWU024 pXWU007 + Gil L-VH Gil VL-CL + Gil VH-agly ?4. P pXWU025 pXWU007 + B01 L-VH B01 VL-CL + B01 VH-agly ?4. P Ejemplo 7 Construcción de IgG anti-IGF-lR de Longitud Completa para iu Expresión Mejorada en Células de Mamífero Para mejorar los rendimientos de expresión de anticuerpo y la calidad del producto, las secuencias génicas de VH originales de los Fab M13-C06; M14-C03; M14-G11 y M14- B01 anti-IGF-lR se modificaron. Primero, se analizaron las secuencias anti-IGF-lR para secuencias que contienen sitios de empalme putativos con programas públicos de reconocimiento de secuencia (www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html (The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850), www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html), (Martin G. Reese and Frank H. Eeckman, Lawrence Berkeley National Laboratory, Genome Informatics Group, 1 Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720; ver también, Reese MG, Eeckman, FH, Kulp, D. Haussler, D, 1997. "Improved Splice Site Detection in Genie". J Comp Biol 4(3), 311-23). Segundo, los codones en la región variable de cadena pesada de los Fab anti-IGF-lR se reemplazaron con codones que corresponden a las posiciones de Kabat idénticas de anticuerpos que se han expresado exitosamente en células CHO sin encontrar ningún cambio en la secuencia original de polipéptido de VH anti-IGF-lR. Este segundo paso remueve principalmente los sitios de empalme putativos pero un análisis adicional de sitios de empalme después del intercambio de codones sinónimos se realizó para reducir la probabilidad prevista de que se presente un sitio de empalme putativo. Los fragmentos de ADN que codifican para la guia de cadena pesada sintética en cuadro con secuencias de VH optimizadas por secuencia de los Fab M13-C06 (SEQ ID NO: 18, Figura 5q) , M14-C03 (SEQ ID NO: 30, Figura 5s), M14-G11 (SEQ ID NO: 36, Figura 5u) , y M14-B01 (SEQ ID NO: 24, Figura 5w) anti-IGF-lR se obtuvieron como secuencias de ADN de doble hebra químicamente sintetizadas de un proveedor comercial (Blue Heron Biotechnology, Inc. Bothell WA) . Los sitios de endonucleasa de restricción Neo I y Sfi I en 5 ' y 3' se incluyeron en los fragmentos sintetizados. Los fragmentos de la región de VH optimizados por secuencia anti-IGFIR guía se clonaron en el vector pHLP029 digerido con Neo I/Sfi I como se describe en el Ejemplo 6 anterior. La recombinación con las cadenas ligeras correspondientes apropiadas en pHLP025 y la clonación subsiguiente del fragmento individual en pXWU007 es como se describe en el Ejemplo 6 anterior. Las construcciones de expresión que producen los anticuerpos de IgG4. P anti-IGF-1R humanos aglicosilados de longitud completa optimizados por secuencia se muestran en la Tabla 9. Las secuencias correctas se confirmaron por análisis de secuencia de ADN . La expresión de anticuerpos de longitud completa de la serie de plásmidos pXWU029-pXWU032 en células mamiferas da por resultado la producción de anticuerpos IgG4. P humanos aglicosilados estables .
Tabla 9.- Plásmidos de Expresión Optimizados por Secuencia que Codifican para Anticuerpos anti-IGF-lR. Las Secuencias Optimizadas de Cadena Pesada se Preceden con una "m" .
Ejemplo 8 Expresión Transiente y Caracterización de Anticuerpos de IGF-1R Se usaron ADN de plásmidos para transformar células CHO DG44 para producción transiente de proteina de anticuerpos. Se combinaron 20 µg de ADN de plásmido con 4 x 106 células en un volumen de 0.4 mL de IX PBS . La mezcla se adicionó a una pipeta de 0.4 cm (BioRad) y se colocó en hielo durante 15 minutos. Las células se sometieron a electroforesis a 600 uF y 350 voltios con un electroporador Gene Pulser (BioRad) . Las células se colocaron en placa en un matraz T-25 que contiene el medio CHO-SSFM II más hipoxantina 100 uM y timidina 16 uM y se incubaron a 37° durante 4 días. Se recolectaron los sobrenadantes y se caracterizaron de manera bioquímica por transferencia Western y se probaron para la unión a antígeno por ELISA. De manera alternativa, los Fab seleccionados también se convirtieron a la versión de IgG4. P humana de longitud completa y se expresaron usando un diferente sistema de vector por un método descrito más adelante. Las secuencias de ADN que codifican para cinco anticuerpos Fab anti-IGFIR distintos, M12-E01, M12-G04, M13-C06, M14-C03, Y M14-G11 se transfirieron en vectores para la expresión de IgG4. P humana de longitud completa. Los cinco anticuerpos usaron el fragmento de línea germinal de cadena pesada humana VH3-23. La cadena pesada variable se removió del vector de expresión Fab soluble por digestión con enzimas de restricción Mfel y BstEII. El fragmento resultante se purificó por electroforesis en gel de agarosa usando el equipo de extracción en gel QIAquick (QUIAGEN CA) y se ligó en el vector pRR253 digerido con Mfel I'BstEII (Rachel Rennard) . El plásmido resultante contiene el péptido de señal de cadena pesada (MGWSCI ILFLVATATGAHS , SEQ ID NO: 127) seguido por las regiones constante y VH anti-IGFIR para IgG4.P humana. Cuatro de los cinco anticuerpos, M12-G04, M13-C06, M14-C03, y M14-G11, contienen cadenas ligeras kappa . La cadena ligera variable se amplificó por PCR con cebadores para introducir el sitio EcoRV 5' y un Bsgl 3' a la región variable. El fragmento de PCR resultante se purificó por electroforesis en gel de agarosa usando el equipo de extracción en gel QIAquick (QUIAGEN CA) y se ligó en el vector TOP02.1 TA (Invitrogen, CA) . La cadena ligera kappa variable se removió del vector TOPO por digestión con las enzimas de restricción EcoRV y Bsgl y se purificó. El fragmento se ligó en el vector pRR237 digerido con EcoRV/Bsgl, que contiene el péptido de señal de cadena ligera de inmunoglobulina (MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC, SEQ ID NO: 128) y el dominio kappa constante. El vector resultante se digirió con BamHI y Notl y el cásete de expresión completa (secuencia de señal, dominios kappa variable y constante) se purificó y ligó en pRR223 digerido con BamHI/Notl . El anticuerpo M12-E01 contiene una cadena ligera lambda. La cadena ligera variable se amplificó por PCR con cebadores para introducir un sitio Agel 5' de la región variable. El fragmento de PCR resultante se purificó por electroforesis en gel de agarosa usando el equipo de extracción en gel QIAquick (QUIAGEN CA) y se ligó en el vector T0P02.1 TA (Invitrogen, CA) . La cadena ligera lambda variable se removió del vector TOPO por digestión con las enzimas de restricción Agel y Avrll y se purificó. El fragmento se ligó en el vector pX347 digerido con Agel/Avrll (Xin Wang) , que contiene el péptido de señal de cadena ligera de inmunoglobulina (METDTLLLWVLLLWVPGSTG, SEQ ID NO: 129) y el dominio lambda constante. El vector resultante se digirió con Notl y el cásete de expresión completa (secuencia de señal, dominios lambda variable y constante) se purificó y ligó en pRR223 digerido con Notl. Se usó el ADN de plásmido para transfectar células 293E para expresión transiente de proteina de anticuerpo. Se t ra n s f e c t a r on 1.2 g de cada ADN de plásmido (pesado y ligero) en 2 x 106 células con el Protocolo de Transfección Effectene de Qiagen (Qiagen, CA) . Las células se incubaron a 37 °C durante 3 días. El sobrenadante se recolectó y el anticuerpo de longitud completa se confirmó tanto por transferencia Western como por métodos de ELISA. La capacidad de completa . IgG4. P para unirse a IGF-1R se confirmó por ELISA.
Ejemplo 9 Desarrollo de Linea de Células CHO productora de Anticuerpos Anti-IGF-1R Este ejemplo da una descripción detallada de la expresión del anticuerpo anti-IGF-lR que comprende el dominio de unión del anticuerpo kappa, agly gamma 4 (referido en la presente como "agly . IgG4. P" o "G4. P . agly" ) , modificado por articulación de longitud completa. Los otros Fab descritos en la presente, es decir, aquellos listados en la Tabla 3, se expresaron de una manera similar. Las regiones variables y constantes de M13-C06 son de origen de secuencia humana. Las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada completas se derivan de un Fab generado contra IGF-1R humano por la tecnología de visualización en fagos DYAX. Las regiones constantes de cadena ligera así como variables se sub-clonaron en un vector alterno de expresión de empalme. La configuración de empalme alterna enlaza la cadena ligera y pesada a través del uso de un donador de empalme individual con dos aceptadores de empalme donde cada aceptador de empalme genera un trascripto que codifica para una de las dos cadenas. El ADN del vector de expresión que codifica para los genes de inmunoglobulina se electroporó en células de ovario de hámster Chino independientes de insulina (CHO DG44 i ) . Se seleccionó un transfectoma de CHO (línea celular 40B5) para propósitos de producción.
El pX U007, un vector de expresión "vacío" contiene una región constante gamma 4 humana (cadena pesada) así como regiones de poliadenilación e intensificadores de promotor, separados, para la expresión génica en células mamíferas, pero no contiene dominios variables. Cuando se expresa y traduce, el polipéptido de cadena pesada contiene dos sustituciones de aminoácido, S228P y T299A, para reducir la formación de "medio anticuerpo" y eliminar la glicosilación N-enlazada, respectivamente . El ADN complementario de los dominios variable (VL) y constante (CL) correspondientes del gen de cadena ligera de M13-C06 y el dominio variable (VH) del gen de cadena pesada de M13-C06 se clonaron en el vector de expresión pXWU007. El vector pXWU007 contiene sitios de clonación para la inserción de los ADNc pesados variables y de cadena ligera completos, directamente en la dirección 5' de la región constante de cadena pesada humana. Además de los genes de Ig, este vector de expresión contiene un gen de dihidrofoliato-reductasa (DHFR) que se puede usar para selección de células de mamífero. El vector de expresión resultante entonces se transfectó en células CHO para iniciar la generación de las líneas celulares CHO (40B5) que segregan anti-IGF-lR. Se electroporó PX U022 en células CHO. Se usaron cebadores de PCR específicos de cadena ligera de inmunoglobulina para amplificar por PCR el ADNc de cadena ligera de Fab. La secuencia oligo especifica 5' incluyó el péptido de señal nativo de la cadena ligera de la molécula anti-CD23 de Biogen Idee. Los oligos 5' y 3' contienen las secuencias de restricción de endonucleasas de restricción Sfi I y Ase I, respectivamente, para sub-clonación en un vector intermedio (pHLP025) . El ADNc de VH se amplificó por PCR usando un oligo 5' que incluyó un péptido de señal de cadena pesada sintético. Los oligos 5' y 3' contienen las secuencias de restricción de endonucleasa de restricción Neo I y Sfi I, respectivamente, para subclonación en un vector intermedio (pHLP029) . Se empleó la PCR de traslape usando los oligos 5' de cadena ligera y 3' de VH y pHLP025 y pHLP029 como plantillas para combinar la cadena ligera y la región de VH como un segmento de ADNc. El producto resultante se sub—clonó en el sitio Dra III de pXWU007 creando de esta manera el vector de expresión de empalme, alterno, final, pXWU022. La configuración de empalme alterno genera dos trascriptos de un promotor individual a través de empalme alterno de un trascripto primario. El donador de empalme de CMV natural se empalma ya sea a un aceptador de empalme sub-óptimo para generar un trascripto que codifica para cadena ligera, o a un aceptador de empalme de CMV natural para generar el trascripto que codifica para cadena pesada. El aceptador de empalme sub- óptimo se ha diseñado para generar cantidades similares de ambos trascriptos. El vector de ADN (pXWU022) se preparó en amortiguador HEBS a una concentración de ~ 700 nq/µL antes de la electroporación a células CHO. Se realizaron cinco elect roporaciones usando varias concentraciones de ADN (15, 20, 30, 40 y 45 µq) . Cada concentración se hizo en una pipeta desechable de 0.4 cm (Invitrogen) que contiene 4 x 106 células CHO de fase logarítmica en 0.7 mi de amortiguador HEBS estéril y ADN en 0.1 mL de HEBS (volumen total de 0.8 mL) . Las células se conmocionaron usando un aparato de impulsos Bio-Rad Gene Pulser XCELL, ajustado a 290 voltios, 950 microfaradios . Las células conmocionadas entonces se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego se mezclaron con 10 mL de medio CHOM16 libre de insulina a temperatura ambiente, se centrifugaron (3 minutos a 1000 rmp) , y se aspiraron. Las células entonces se re-suspendieron en 12 mL del medio CHOM16 libre de insulina (temperatura ambiente) y se transfirieron a un matraz de cultivo de tejido T-75. Células y Medios: antes de la electroporación, las células CHO se cultivaron en medio libre de suero (CHOM24) con la adición de IX nucleósidos. El CHOM24 es una formulación de medios, interna, químicamente definida que no contiene ningún componente animal. Se realizó la selección por metotrexato en los medios químicamente definidos, CH0M16 y CHOM24 libres de nucleósidos . Después de la electroporación, se mezclaron 4 x 106 células CHO en un matraz T-75. La selección para la expresión de DHFR empezó inmediatamente conforme las células se inocularon en medio libre de nucleósido. Las células eventualmente se expandieron a matraces agitados de 125 mL en CHOM24 (~3 semanas) . Para aislar las líneas de células clónales, las mezclas estables transíectadas se diluyeron y colocaron en placa a una célula/concavidad en 200 µL de CHOM16 en cuatro placas de 96 concavidades. Las placas se mantuvieron a 36°C hasta que se seleccionaron por el título de anticuerpo. Se seleccionaron colonias de CHO para producción de inmunoglobulina al valorar los sobrenadantes celulares usando un ELISA específico para la cadena kappa humana (día 21 a 28 después de colocación en placa). El anticuerpo de captura usado en el ELISA fue un anti-IgG humana de cabra policlonal ( SouthernBiotech ) y el anticuerpo de detección fue un anti-kappa humana de cabra policlonal conjugado a peroxidasa de rábano (SouthernBiotech). Se expandieron las colonias que segregan la cantidad más alta de inmunoglobulina. Se valoró un total de 381 concavidades casi confluentes de las 1920 concavidades sembradas. De las 381 concavidades, 60 se expandieron para estudio adicional y de estas 60, 4 se seleccionaron para amplificación (15A7, 40B3, 40B5, 40F6) .
Ejemplo 10 Purificación y Caracterización de Anticuerpos Anti-IGF-1R IgG4.P.agly Completamente Humanos: El anticuerpo producido en células CHO se purificó y caracterizó por los métodos descritos más adelante. Captura en Proteina A: Se puso en pre-equilibrio la columna de Proteina A con IX PBS (amortiguador de equilibrio) a 100-150 cm/hr con tres volúmenes de columna. Se carga el sobrenadante a 150 cm/hr con un máximo de 10 mg de alGF-lR por mililitro de resina. Después de la carga, se lava la columna con 5 volúmenes de columna de amortiguador de equilibrio. Entonces, se eluye gradualmente en una dirección el flujo ascendente con glicina 100 mM, pH 3.0. Se recolectan las fracciones deseadas y se titulan a pH neutral con base Tris 2M. Se dializan las fracciones recolectadas contra IX PBS y se concentra el material para prepararlo para el paso de exclusión de tamaño. El paso de remoción de agregado en SUPERDEXMR 200 (Exclusión de Tamaño) comprendió el equilibrio de SUPERDEXMR 200 con IX PBS con 1.5 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 36 cm/hr seguido por carga de la proteina y recolección de las fracciones deseadas.
La prueba de identidad se realizó como sigue: 1) Análisis de masa intacta por espectrometría de masa donde se realizaron mediciones de masa molecular en un espectrómetro de masas por electrorrociado (ESI-MSD) . Antes del análisis, la muestra se redujo para remover los enlaces de disulfuro. El espectro de masa descompletado representa las masas de las cadenas pesada y ligera. 2) Se realizó el análisis de secuencia N-terminal por degradación de Edman usando un secuenciador de proteína de ABI equipado con un analizador de PTH en línea. Se identificaron las secuencias para los aminoácidos iniciales de la cadena ligera y la cadena pesada. 3) Correlación de péptidos con análisis espectrométrico de masa: se realizaron los mapas trípticos y/o peptídicos de EndoLysC para obtener la cobertura completa de secuencia por análisis de los datos de LC/MS generados de cada péptido. Además, se detectaron la determinación de sitios y las cantidades de oxidación y desamidación . Se realizó la prueba de pureza por; 1) SDS-PAGE o CE-SDS: Muestras reducidas y no reducidas, esta técnica se usa para medir la fragmentación, agregación e impureza de anticuerpos, 2) SEC-HPLC con técnica de LS y Rl se usó para medir la agregación y fragmentación y la dispersión de luz determina la masa molar de los componentes de la muestra. 3) Se usó el método de gel de SDS o IEF capilar para determinar el patrón de enfoque isoeléctrico y la distribución de pl de las isoformas de carga que pueden resultar de la heterogeneidad y/o desaminación C- y N- terminal. Finalmente, se midieron las concentraciones de endotoxinas por el método turbidométrico cinético de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) . La Figura 6 muestra el análisis de SDS-PAGE no reducido y reducido de las versiones G4.P.agly de los anticuerpos M13-C06 y M14-C03 completamente humanos. Tanto las versiones de G4. P como de G4.P.agly de los anticuerpos M13-C06, M14-C03, M14-B01, y MI 4 -Gil se produjeron. Se produjeron M12-E01 y M12-G04 como la versión de G4.P.
Ejemplo 11 Actividad de Unión de los Anticuerpos anti-IGF-lR Completamente Humanos La actividad de unión a IGF-1R soluble de las versiones G4.P.agly y G4. P de los anticuerpo probados por ELISA. La proteina de fusión de receptor de IGF-1 soluble (Biogen Idee) a 2.5 µg/ml en amortiguador de carbonato 0.025 M, pH 9.6, se revistió a 50 µ?/concavidad en una placa de 96 concavidades (IMMULON2 HB, Dynex Technologies, Inc., Cat. #3455) y se incubó durante la noche a 4°C. La placa se lavó con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Irvine Scientific, Cat#9240), pH 7.4 más Tween 20 al 0.025 % en Skan asher 300 (Skatron Instruments), se bloqueó con amortiguador que contiene leche sin grasa al 1 %, Tween 20 al 0.05 % en PBS, pH 7.4 , y luego se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, la placa se lavó con PBS más Tween 20 al 0.025 % en el Skan Washer 300. Para el ensayo, la placa revestida con el receptor de IGF-1 soluble se incubó entonces con los anticuerpos de control y de prueba de concentraciones variadas, se diluyó en leche sin grasa al 1 %, Tween 20 al 0.05 % en PBS a 50 µ?/concavidad . Después de la incubación de una hora a temperatura ambiente, la placa se lavó con PBS más Tween 20 al 0.025 % en el Skan Washer 300. Se adicionó una dilución de 2000 veces en leche sin grasa al 1 %, Tween 20 al 0.05 % en PBS de HRP anti-Kappa humana de cabra (Southern Biotech Cat#2060-05) a 50 µ?/concavidad para detectar el anticuerpo unido. La placa incubada durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó con PBS más Tween al 0.025 % 20 en el Skan Washer 300. La solución de TMB (KIRKEGAARD & PERRY LABS, INC. cat: 50-76-00) se adicionó a 100 µ?/concavidad, y la reacción se detuvo con 50 µ?/concavidad de H2S04 4N (LabChem, Cat#LC25830-l) después de dos minutos. La absorbancia se midió a 450 nm, fondo 540 nm para TMB usando el lector de placa Molecular Devices. Los datos se analizaron usando el paquete de software SOFTMAX PRO versión 4.3 LS (Molecular Devices Corp.).
Figura 7a muestra la unión dependiente de la concentración de la versión G4 de M13-C06, M14-C03, M14-G11, M12-E01 y M12-G04, en tanto que el anticuerpo de control, IDEC-151 (G4.P) nuevamente no mostró ninguna unión a IGF-IR. Fe. Figura 7b muestra la unión dependiente de la concentración de la versión G4.P.agly de M13-C06, M14-C03 y M14-B01 a IGF-IR.Fc soluble por ELISA. El anticuerpo G4. P de especificidad irrelevante (IDEC-151) usado como un control negativo no muestra ninguna unión a IGF-IR-Fc. La actividad de unión de anticuerpos humanos a IGF-1R tipo silvestre expresado en células tumorales se determinó por citometria de flujo. Se cultivaron las lineas de células tumorales MCF-7 y Calu-6 en Medio Eagle Esencial Minimo (ATCC, Cat#30-2003) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (Irvine Scientific, Cat#3000A) y 50 µ/ml de gentamicina (Gibco Invitrogen, Cat#15750-060) . Se cultivaron Panc-1, Colo-205, NCI-H23 y ZR-75 en RPMI-1640 (ATCC, Cat#30-2001) complementado con 10 % de FBS y 50 yg/ml de gentamicina. Se usó la solución de Tripsina-EDTA (Sigma, Cat#T4049) para remoción de células adherentes de los recipientes de cultivo. Las células se enjuagaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (Irvine Scientific Cat# 9240), pH 7.4, se tripsinaron y lavaron una vez en PBS y 10 % de FBS. Las células se ajustaron a 107 células/ml en amortiguador FACS (0.05 % de azida sódica, 2 % de FBS, 10 % de suero de cabra normal y 100 µq/ml de IgG de cabra normal en PBS) y se puso en hielo durante al menos 15 minutos. Los anticuerpos de control y de prueba se pusieron en alícuota en una placa Corning 3790. Las células a 50 µ? /concavidad se adicionaron a una placa Corning 3799. Los anticuerpos primarios de la placa Corning 3790 se adicionaron a 50 µ?/concavidad a las concavidades respectivas de la placa Corning 3799. Entonces, se incubaron las células (0.5 x 106 células/muestra) 45 minutos en hielo. Después de la incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rmp durante 4 minutos y luego los sobrenadantes se aspiraron. Las células se re-suspendieron a 150 µ? de amortiguador FACS. Las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 4 minutos y se aspiraron los sobrenadantes. Se adicionó a 100 µ?/concavidad una dilución de 750 veces en amortiguador FACS de RPE anti-IgG humana de cabra (Southern Biotech Cat#2040-09) . Entonces, se incubaron células (0.5 x 106 células/anticuerpo secundario) 45 minutos en hielo. Se adicionó una dilución de 500 veces en amortiguador FACS de 7AAD (Molecular Probes, Cat#A1310) a .50 µ?/concavidad y se incubó durante 5 minutos en hielo. Después de la incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 4 minutos y luego se aspiraron los sobrenadantes. Las células se re-suspendieron en 150 µ? de amortiguador FACS. Las placas se centrifugaron a 1500 rmp durante 4 minutos y los sobrenadantes se aspiraron. Las células se re-suspendieron en 100 µ?/concavidad de amortiguador FACS . Las células se transfirieron a tubos de FACS de 12 x 75 mm con 200 µ? de amortiguador FACS. Finalmente, las células se examinaron para intensidad de fluorescencia en un FACSCalibur usando el software CellQuest (ambos de Becton Dickinson) . Las Figuras 8 muestran la unión dependiente de la concentración de M13-C06. G4. P . agly, M14-C03. G4. P . agly y M14-G11.G4.P a IGF-1R expresado en células MCF-7 (Figura 8a). La especificidad de unión en la superficie celular de los anticuerpos se confirmó al probar la unión a los transfectantes de IGF-1R/3T3 y células de origen 3T3. Todos los anticuerpos guia mostraron la actividad especifica a 3T3 que expresan IGF-1R pero no a células 3T3 (Figura 8b) .
Ejemplo 12 Inhibición de Unión por Ligando de IGF-1R por Anticuerpos Completamente Humanos Se determinó la capacidad de las versiones G4.P.agly y G4. P de los anticuerpos humanos para bloquear la unión de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R-Fc soluble. Las versiones de IgG4 de M13-C06, M14-G11, M14-B01, M12-E01 y M12-G04 bloquearon tanto la unión de IGF-1 como de IGF-2 a IGF-IR, en tanto que M14-C03 sólo bloqueó IGF-2 (Figuras 9a y 9b) . La capacidad de bloqueo de ligando del anticuerpo anti-IGF-lR se determinó por un método de captura de RIA de fase sólida como se describe en el Ejemplo 3. De forma breve, los anticuerpos a concentraciones variadas se co-incubaron ( 100nM-0. OlnM) con 100,000 cpm de IGF-1 marcado con 125I, o 125I-IGF-2 en concavidades de una placa IMMULON2 de 96 concavidades, en donde se inmovilizó de forma previa (200ng/concavidad) el IGF-1R-Fc humano. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las concavidades se lavaron y contaron para reactividad unida por un Contador Gamma. Un control con anticuerpo negativo correspondido con isotipo, IDEC-151 (G4 humana) se usó. Se calculó el por ciento (%) de inhibición como = [1-(CPM promedio con Ab)/(CPM promedio con amortiguador) ] +100 %. El resultado demuestra que los anticuerpos completamente humanos M13-C06. G4. P, M 13-C06. G4. P . agly, M14-G11.G4.P, 14-Gll.G4.P.agly, M14 -B01. G4. P . agly, M12-E01. G4. P, y M12-G04.G4.P bloquean la unión tanto de IGF-I como de IGF-2 a IGF-IR, en tanto que los anticuerpo M14-C03.G4.P y M14-C03. G4. P. agly bloquean sólo la unión de IGF-2 a IGF-IR. Ver, Figuras 9a-9b.
Ejemplo 13 Inhibición del Crecimiento de Células Tumorales por Anticuerpos anti-IGF-lR Completamente Humanos Se probó la capacidad de los anticuerpos para bloquear el crecimiento de células tumorales impulsado por IGF-1 e IGF-2, usando un ensayo de viabilidad celular. Se compraron las lineas tumorales NCI-H23, Calu-6, Colo-205, Panc-1, BxPC-3 (ATCC) de ATCC . Las lineas celulares se cultivaron en medio de crecimiento completo que contiene RPMI-1640 (ATCC), suero bovino fetal al 10 % (Irvine Scientific Inc.), y 50 µ?/p?? de gentamicina (Gibco, Invitrogen) . Se usó la solución de tripsina-EDTA (Sigma) para remoción de células adherentes de recipientes de cultivo. La solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.2, fue de MediaTech Inc. Se compraron de Wallac Inc., las placas de fondo claro de 96 concavidades para ensayos luminiscentes. Las células cultivadas a monocapas de 80 % se, tripnizaron, lavaron, re-suspendieron y colocaron en placas de 96 concavidades en 200 µ? de medio de crecimiento al 2 % a 8 x 103 células/concavidad para células Colo-205 y 5 x 103 células/concavidad para células Calu-6, Panc-1 y BxPC-3.
Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con 100 µ? de medio libre de suero (SFM) , y se adicionaron 50 µ? de anticuerpos diluidos en serie a concentración de 4x. Después de otra hora de incubación a 37°C, se adicionaron 50 µ? de IGF-1 o IGF-2 a concentración de 4x y se incubó a 37°C hasta 48 horas para medir el crecimiento celular. Todos los tratamientos se hicieron en triplicado. Se midió el crecimiento celular usando el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CELL TITER-GLOMR (Promega, Madison, WI) . La mezcla 1:1 de reactivo y SFM se adicionó a 200 µ? /concavidad . Se detectó la luminiscencia en un lector de placas Wallac (Boston, MA) . Las varias versiones de IgG4 humana de los anticuerpos anti-IGF-lR exhibieron inhibición a proliferación celular activada por IGF-1 e IGF-2 en células H-23 (IGF-1 e IGF-2) Calu-6 (IGF-2) (Figuras 10A-10C) . Otras lineas celulares exhiben tendencias comparables (ver por Ejemplo 20) .
Ejemplo 14 Internalización de IGF-1R por Anticuerpos anti-IGF—IR Completamente Humanos Se sembraron células CF-7 a 50,000 células por concavidad en portaobjetos de cámara de 8 concavidades (portaobjetos de cultivo revestidos con Colágeno Tipo 1 de Becton Dickinson, BD BioCoatMR #354630) 48 horas antes de los procedimientos de tinción. Las células se mantuvieron rutinariamente por debajo de 20 pasadas. En el día de los procedimientos de tinción, se descartó el medio de cultivo de cada concavidad y se reemplazó con 500 µ? de amortiguador de incubación frío (MEM Eagle ATCC #30-2003 + 1 % de BSA) . Las células se lavaron 2X con este amortiguador durante 3 minutos en cada lavado. Entonces se adicionaron 250µ1 de cada mAb o anticuerpo G4.P.agly humano que se va a probar a la concavidad apropiada a una concentración de 10 µg/ml, se diluyó en el medio de incubación, y se incubó en hielo durante 1 hora. Se usó anticuerpo anti-IGF-lR humano, murino (Lab Vision/NeoMarkers, clon 24-31 cat# S-641) como un anticuerpo de control positivo para comparar el grado de internalización . Después de la incubación de 1 hora en hielo, el portaobjetos del tiempo cero (t = 0' ) se lavó 3X con 500µ1 de amortiguador de lavado frío (PBS + 1 % de BSA + 2 % de suero de Cabra) durante 3 minutos cada lavado (portaob etos se mantienen siembre en hielo) . El portaobjetos de t = 0 entonces se fijó con 500µ1 de paraformaldehido al 4 % (diluido con PBS de solución concentrada de 16 % ; E S#15710) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El portaobjetos de t = 0 entonces se lavó nuevamente 3X con amortiguador de lavado frió durante 3 minutos cada lavado, luego se dejó en hielo. Entre tanto, los portaobjetos restantes se pusieron en una incubadora a 37°C para sus puntos de tiempo designados (15 y 60 minutos) . Al final de su tiempo de incubación, cada portaobjetos siguió los mismos procedimientos como antes, lavados y fijación, y se pusieron en hielo. Todos los portaobjetos entonces se permeabilizaron con 200µ1 de amortiguador de permeabilización frió (Amortiguador de lavado + 0.5 % de Triton-X) durante 10 minutos en hielo. Todos los portaobjetos entonces se lavaron 3X con 500µ1 de amortiguador de lavado frío durante 3 minutos cada lavado. El anticuerpo secundario se preparó a una dilución de 1:1000 (anti-IgG de ratón de cabra AlexaFluor (H + L) , Molecular Probes #A11029 para los mAb y anti-IgG humana de cabra AlexaFluor 488 (H + L) , Molecular Probes #A11013 para anticuerpos G4 ) en amortiguador de lavado, después de un giro inicial del frasco de solución concentrada a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se adicionaron 250 µ? de amortiguador secundario diluido a cada concavidad y se incubó durante 40 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (cubierto) . Los portaobjetos nuevamente se lavaron 3X con 500µ1 de amortiguador de lavado frió. En el lavado final, el amortiguador se descartó y todas las concavidades se dejaron vacias. Las cámaras entonces se desmontaron del portaobjetos usando la herramienta proporcionada para el desmontaje, y se montaron los cubreobjetos con el medio de montaje Vectashield que contiene DAPI (Vector #H-1500, Hard SetMR) . Los portaobjetos se almacenaron a 4°C en la oscuridad durante la noche para permitir que seque el medio de montaje.
Las imágenes de los portaobjetos se tomaron con un microscopio confocal usando el programa LaserSharp 2000 (BioRad v5.2) y se representan como una fusión de componentes azules y verdes del promedio de Kalman 10. El M13-C06. G4. P . agly mostró rápida internali zación de IGF-1R en 60 minutos como se muestra en la Figura 13A. Tanto 14-C03. G4. P . agly como M14-G11.4P mostraron todos la propiedad de internalización similar al anticuerpo M13-C06. G4. P . agly (datos no mostrados) . Como se espera, el control positivo, clon 24-31, también internalizó el receptor en tanto que los controles negativos correspondidos con isotipo (7F2 de ratón y G4 humano, IDEC-152.G.P (anticuerpo privatizado) ) no se unieron ni se internalizaron (Figuras 13b-13c) . Además, se midió la velocidad de internalización del receptor por un método basado en FACS para ciertos anticuerpos monoclonales murinos. Las células MCF-7 cultivadas a monocapas confluentes de 70 % se dejaron en el matraz con el amortiguador de disociación celular (catálogo Gibco #13151-014) . Las células se re-suspendieron en el medio y se adicionaron 5 x 106 células en un tubo de 12 x 75mm (catálogo Falcon #352054), en donde cada tubo representa un diferente mAb que se va a probar. Se adicionaron 10 µ?/??? de mAb a su tubo correspondiente en amortiguador FACS 0.5 mi que no contiene azida (PBS + 1 % de BSA) asi como un tubo de control sin anticuerpo para medir el error experimental de internalización . Los tubos se incubaron en hielo durante 1 hora a 15 minutos, luego se lavaron y reconstituyeron en 1 mi de amortiguador FACS. Se removieron 100 µ? de cada muestra en una concavidad de una placa de fondo en u de 96 concavidades (NUNC#163320 ) mantenida en hielo para impedir la internalización y llamada tiempo cero (t = 0) . Esto se usó como un control unido a 100 % de Ab . Los tubos entonces se transfirieron a un baño de agua de 37°C y se removieron muestras de 100 µ? en el tiempo (t) = 5, 10, 20, 40 y 60 minutos (último cambio a 5, 10, 15, 30 y 60 minutos) y se colocaron en concavidades separadas de una placa de fondo en u de 96 concavidades en hielo. Una vez que se recolectaron todas las muestras, las placas se centrifugaron a 1200 rpm en una centrifuga a 4°C para sedimentar las células. El anticuerpo adicionado para detectar la internalización del receptor fue ya sea anti-CD221-PE (BD Pharmingen cat# 555999 - anti-IGF-lR; 10 µ/100 µ? muestra) para detectar los receptores que permanecen en la superficie celular, o anti-PE de ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch Lab cat#115-116-146; 5 µq/ml) para detectar el anticuerpo que permanece en la superficie celular. Se incubaron muestras 1 hora en amortiguador FACS que contiene 0.1 % de azida sódica, se lavaron XI, y se pusieron a un volumen final de 200 µ? en amortiguador FACS que contiene azida. Las muestras entonces se corrieron y recolectaron usando un arreglo FACS (BD) y se determinó la media geométrica. También se corrieron cuantas Quantibrite marcadas con PE (BD #340495) para cuantificar el número de moléculas de PE unidas a la superficie celular, donde la cuenta Quantibrite se corre en el mismo escenario FL2 como las muestras. El número de moléculas de PE unidas a la cuenta se da en su envase, permitiendo la cuantificación del número de moléculas de PE unidas a la superficie celular usando las medias geométricas de la muestra y de las cuentas. El ensayo FACS mostró que los anticuerpos monoclonales murinos probados promovieron la internalización de IGF-IR (datos no mostrados).
Ejemplo 15 Inhibición de Señalización Mediada por IGF-IR por Anticuerpos Completamente Humanos Parte I: Inhibición de Transducción de Señales en Células MCF-7 El efecto de los anticuerpos anti-IGF-lR humanos en la señalización de IGF-IR se evaluó usando células MCF-7 (células de adenocarcinoma de mama humano) . Se determinó como se describe en el Ejemplo 4 la capacidad de los anticuerpos para bloquear la fosforilación del receptor IGF-IR mediada por IGF-1 e IGF-2. Todas las versiones IgG4 de los anticuerpos completamente humanos mostraron buena inhibición (EC50 < 1 nM) e inhibieron la fosforilación de IGF-IR (Figuras lia y 11b) .
Para detectar el efecto de la señalización en etapas posteriores, se generaron Usados celulares como se describe en el Ejemplo 4. Para experimentos de señalización, se adicionaron anticuerpos de control y prueba después del agotamiento en suero a 100 nM, 15 nM, 5 nM y lnm en 350 µ? de medio freso libre de suero y se incubó durante 1 hora a 37°C. Se adicionó IGF-1 recombinante humano a 13 nM o IGF-II a 27 nM ( R & D Systems, #291-G1 y #292-G2) a concavidades en 35 µ? de medio libre de suero y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se Usaron y la muestra recuperada se preparó usando un gel de Bis-Tris al' 4-12 % y se inmovilizó en nitrocelulosa (Invitrogen Corp.). La ruta de señalización de IGF-1R se detectó con fosfo-Akt en el sitio Thr308 (Cell signaling Technologies, #4056) y phospho-p4 /42 MAPK en el sitio Thr202/Tyr204 (Cell signaling Technologies, #9101) y anti-IgG de conejo-HRP (Cell Signaling Technologies, #7071). Las bandas se visualizaron usando el reactivo luminol de ECL (Amersham Biosciences, #RPN2109) y autorradiografia . Cada transferencia se desprendió del anticuerpo y se re-sondeo respectivamente para Akt total (Cell signaling Technologies, #9272) o p44/42 MAPK total (Cell signaling Technologies, #9102) y anti-IgG de conejo-HRP. Las bandas se visualizaron usando el reactivo luminol de ECL y autorradiografia . Se determinó el efecto del anticuerpo en los eventos de señalización en etapas posteriores tal como fosforilación de Akt y MAPK. Los lisados celulares de la autofosforilación se inmunoprecipitaron con el conjugado de anticuerpo policlonal de IGF-IRp-agarosa (Santa Cruz Biotechnology, #SC-713) . La proteina de receptor operada se separó usando gel de Tris-Glicina al 4-12 % y se movilizó en nitrocelulosa (Invitrogen Corp.)- Se detectó el receptor con el sitio Tyrll31 anti-fosfo-IGF-lR (Cell Signaling Technologies, #3021) 0 anti-IGF-lRP (Santa Cruz Biotechnology, #SC-9038) y anti-IgG de conejo-HRP (Cell Signaling Technologies, #7071). Las bandas se visualizaron usando el reactivo luminol de ECL (Amersham Biosciences, #RPN2109) y autorradiografia . (Figuras 12a y 12b) . Las Figuras 12a y 12b muestran que M13. C06. G4. P . agly inhibió la fosforilación mediada por IGF-1 e IGF-2 de Akt y p42/44 MAPK de una manera dependiente de la dosis. En particular, el anticuerpo de IGF-1R M13-C06. G . P . agly inhibió la señalización de Akt inducida por ligando en células MCF7 a todas las concentraciones probadas (es decir, 1-100 nM) , como se demuestra por inhibición de fosforilación inducida por IGF- 1 e IGF-2 de Akt en el residuo de aminoácido Ser473 (Figura 19) . Se probaron anticuerpos de control a 100 nM, en tanto que se probó M13-C06. G4. P . agly a 100, 15, 5 y 1 nM. El anticuerpo IDEC-152, versión G4 humana de un anticuerpo de especificidad irrelevante, se usó como un control negativo. El anticuerpo IR3, un anticuerpo monoclonal murino a IGF-1R, se usó como un control positivo. Además, los anticuerpos de longitud completa M14-C03. G4. P. agly y M14.G11.G4.P también inhibieron la señalización actividad por IGF-1 e IGF-2 de la activación de Akt y p42/44 APK (datos no mostrados) .
Parte II: Inhibición de Transducción de Señales en Células A549, Calu-6 y H1299 Capacidad de M13-C06. G4. P . agly para desestabilizar la asociación del sustrato de receptor de insulina (IRS-1) con p85, la sub-unidad reguladora de fosfoinositida-3-cinasa (PI3K) se determinó en lineas de células tumorales por un ensayo de co-inmunoprecipitación . En particular, IRS-1 se une a la sub-unidad p85 de PI3K de una manera dependiente de IGF-1R en las lineas celulares NSCLC sensibles al anticuerpo M13-C06. G . P . agly . De esta manera, dos lineas de células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) A549 y H1299 (sensible a M13-C06. G . P . agly) y una linea de células NSCLC, Calu-6 (menos sensible a 13-C06. G4. P . agly) se cultivaron en la presencia de M13. C06. G4. P . agly o anticuerpo de control (IDEC-151) durante 24 horas. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-p85 y se sometieron a análisis de transferencia western con los anticuerpos anti-IRS-1 (transferencia superior) y anti-p85 (transferencia de fondo) (Figura 25). Para este ensayo, se compraron las células A549, Calu-6, y NCI-1299 de lineas celulares de tumor pulmonar humano de la ATCC y se mantuvieron en el medio RPMI 1640 que contiene 10 % de suero bovino fetal (FBS). Sembraron las células a 3 x 106 por caja en cajas de 100 mm, se cultivaron durante 24 horas, y luego se trataron con 100 nM de M13-C06. G4. P . agly o IDEC-151 (anticuerpo de control negativo correspondido en isotipo G . P humano) durante 24 horas en la presencia de 5 % de FBS. Se prepararon Usados celulares en amortiguador de lisis Tritón X-100 al 1 % de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA EUA) ) . Para la inmunoprecipitación, se adicionó el anticuerpo anti-p85 (Cat #06-649, Upstate Cell Signaling Solutions (ahora parte de Millipore, Concord, MA (EUA) al lisado (4 ug de anticuerpo con 1-2 mg de lisado) y se incubó a 4°C durante la noche. El inmunocomplej o entonces se capture al mezclar con cuentas de azarosa y proteina G durante 2 horas a 4°C. Los inmunoprecipitados se lavaron con amortiguador de lisis enfriado con hielo y se hirvieron en amortiguador de muestra 2x LDS (Dodecil Sulfato de Litio) antes de la separación por electroforesis en gel de Bis-Tris al 4-12 %, NuPAGEMR Novex (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA (EUA)), y transferencia a membranas de nitrocelulosa . Se compraron los anticuerpos IRS-I (Cat # 06-248, Upstate) y p85 (Cat # 06-649, Upstate) de Millipore y se realizó la inmunotransferencia de acuerdo a los protocolos del fabricante.
Resultado : El M13-C06. G4. P. agly inhibió la asociación de IRS-1 con la sub-unidad reguladora p85 de PI3K en la presencia de suero en las lineas de células A549 y H1299 pero no en Calu-6 ( Figura 25 ) .
Ejemplo 16 Reactividad Cruzada de Anticuerpo a IGF-1R de Primate no Humano Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-IGF-lR humano para reconocer el IGF-1R de primates no humanos. Primero, se sub-clonó IGF-1R de mono Rhesus y cynomolgus y se expresó en células CHO. Se determinó la unión de todos los anticuerpos por citometria de flujo y se confirmó por microscopía confocal. MI 3. C06. G . P . agly, M14. C03. G . P . agly y M14.G11.G4.P mostraron todos actividad de unión específica tanto a IGF-IR de Rhesus como de cynomolgus (datos no mostrados). Los estudios adicionales de reactividad cruzada de especie mostraron la unión de M14.G11.G4.P y M14. C03. G4. P . agly a células CHO que expresan IGF-IR murino (datos no mostrados) Además de IGF-IR de cynomolgus, el anticuerpo M13. C06. G4. P . agly también reacciona de forma cruzada con IGF- IR de macaco cynomolgus expresado en granulocitos y monocitos de esta especie. (Se demuestra la especificidad de unión por la capacidad de IGF-IR humano recombinante soluble para bloquear la unión del anticuerpo M13. C06. G . P . agly (datos no mostrados)). De manera similar, el anticuerpo M13. C06. G4. P. agly también se une a una linea de células de fibroblasto establecida de cynomolgus. (Ver Ejemplo 26, Figura 23) . Estos resultados indican que el macaco cynomolgus es una especie no roedora ideal en la cual se ha realizado la prueba de toxicidad. En contraste a los resultados con el receptor de IGF-IR en primates, el M13. C06. G4. P . agly no muestra reactividad cruzada a IGF-IR de rata o ratón expresado en células inmunitarias (granulocitos, monolitos, linfocitos) como se valora por análisis de FACS .
Ejemplo 17 Generación de Mab Murinos Específicos de IGF-IR Se generaron por tecnología de hibridoma normal anticuerpos monoclonales murinos específicos para IGF-IR humano. Se inmunizaron esplenocitos de ratones Balb/c con fibroblasto NIH 3T3 que expresa IGF-IR y se usó proteína de fusión de IGF-lR.Ig para fusión de células somáticas inducida por PEG. La Tabla 4 resume las propiedades de los anticuerpos monoclonales murinos anti-IGF-lR.
La capacidad de los anticuerpos murinos seleccionados para inhibir el crecimiento in vitro dependiente de IGF/IGF-1R de varias lineas tumorales humanas (Pulmón, H-23, Calu-6, Páncreas, BxPc-3, Panc-1, MiaPaCa y Colon Colo205) se midió por una proliferación como se describe en el Ejemplo 13. Las Figuras 14a-14F muestran los efectos inhibitorios dependientes de la concentración de anticuerpo de ocho de los anticuerpos murinos en el crecimiento de células tumorales en la presencia de IGF-1 a 100 ng/ml. La capacidad de los anticuerpos para bloquear el crecimiento de células tumorales activado por IGF-1 e IGF-2 se comparó usando la linea de células de tumor pulmonar NCI-H23. La Figura 15 da un ejemplo de los efectos inhibitorios de crecimiento vistos con tres de los Mab murinos (P2A7-3E11, 20C8-3E8, P1A2-2B11) y uno del anticuerpo completamente humano, MI 3- C06. G4. P . agly . Todos los ¦ anticuerpos mostraron inhibición de crecimiento tumoral activado por IGF-1 e IGF-2. Como IR3 de control positivo, se usó un anticuerpo anti-IGF-lR comercialmente disponible. La IgG de ratón (anti-IDectin, IgGl) y la versión gamma 4 humana del anticuerpo de IDEC-152 de especificidad irrelevante se usaron como controles correspondidos en isótopo para los experimentos.
Ejemplo 18 Clonación de mAb anti-IGF-lR humano, murino Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de hibridoma P2A7.3E11 murino anti-IGF-lR El ARN celular total de células de hibridoma murino se preparó usando un mini equipo Qiagen RNeasy siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los ADNc que codifican para las regiones variables de las. cadenas pesadas y ligeras se clonaron por RT-PCR del ARN celular total usando el equipo de síntesis de ADNc de primera hebra de Pharmacia Biotech siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante usando hexámeros aleatorios para cebadura. La clonación y quimerización de los dominios variables de P2A7.3E11 se describirá en detalle como un ejemplo (se clonaron otros dominios variables de mAb y se quimerizaron por métodos similares, pero no se describirán en detalle por brevedad, puesto que se usaron técnicas normales de biología molecular familiares para aquéllos expertos en la ingeniería de anticuerpos) . La amplificación por PCR de los dominios variables de inmunoglobulina murina con secuencias de señal intactas, se usaron un cóctel de cebadores directos degenerados que hibridizan a múltiples secuencias de señal de la familia de genes de inmunoglobulina murina y un cebador retro individual específico para el extremo 5' del dominio constante murino como se describe en Current Protocols in Immunology (Wiley and Sons, 1999) . Las condiciones de PCR usando Taq-polimerasa Advantage de Clontech fueron: desnaturalización inicial durante 2 minutos a 94o, seguido por 30 ciclos de desnaturalización 1 minutos a 94o, fijación 1 minuto a 45o, y alargamiento 1 minuto a 74o. El dominio variable de cadena pesada P2A7 se amplificó con las siguientes cebadores: 5 ' GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT 3' (M=A/C, K=G/T, R=A/G, y S=C/G) (SEQ ID NO: 130) y 5 ' AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3' (R=A/G, y Y=C/T) . (SEQ IND NO: 131) . El dominio variable de cadena ligera de P2A7 con su secuencia de señal se amplificó con los siguientes cebadores: 5' GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCA GAT TTT CAG 3' (SEQ ID NO: 132) y 5' GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAG ATG GA 3'. (SEQ ID NO: 133). Los productos de PCR se purificaron en gel usando un equipo de extracción en gel Qiagen Qiaquick siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Los productos de PCR purificados se subclonaron en el vector pCR2.1T0P0 de Invitrogen usando su equipo de clonación TOPO siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se secuenciaron las inserciones de múltiples subclones independientes para protegerse contra los errores de PCR. Los análisis Blast de las secuencias de dominio variable confirmaron su identidad de inmunoglobulina . El dominio variable de cadena pesada de P2A7 es un miembro del subgrupo 11(A) murino. La secuencia del dominio variable de cadena pesada, maduro, ?2?7, con sus CDR subrayadas (con las CDR, regiones determinantes de complementariedad, en base a las designaciones de Kabat) se muestra a continuación: 1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE 51 IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI 101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSS (SEQ ID NO: 38) La región variable de cadena ligera de P2A7 es un miembro del subgrupo IV kappa murino. La secuencia del dominio variable de cadena ligera, madura de P2A7, con sus CDR subrayadas, se muestra a continuación: Insertar 1 EWLTQS TA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY 51 RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSI LTFG 101 AGTKLELK (SEQ ID NO: 98) Construcción y expresión de chP2A7 Los ADNc que codifican para las regiones variables de P2A7 murinas de las cadenas pesadas y ligeras se usaron para construir vectores para la expresión en quimeras murinas-humanas (chP2A7) en las cuales las regiones variables de muP2A7 se enlazaron a las regiones constantes kappa e IgG4 humanas. Para la construcción de la quimera de cadena pesada, un fragmento de Notl-BsmBI de 0.47 kb del subclon pCN363 de cadena pesada de P2A7 y el fragmento de BsmBI-Notl de 1.0 kb de pEAG1995 (un plásmido que contiene un ADNc de dominio constante de cadena pesada de huIgG4 variante de S228P/T299A (nomenclatura Kabat-EU) aglicosilado confirmado de secuencia, con el residuo de lisina C-terminal de IgG4 removido de forma genética) se subclonaron en la estructura de vector de Notl-linealizado de 6.1 kb fosfatizado de pV90 (un vector de expresión patentado de Biogen Idee basado en pUC confirmado en secuencia que contiene un marcador seleccionable dhfr activado por promotor temprano de SV40 en el cual se controla la expresión de genes heterologos por un promotor de CMV-IE y una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento humana) . La secuencia de ADNc de cadena pesada en el plásmido resultante pEAG2045 se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia del inserto de ADNc de cadena pesada de P2A7 quimérico (del ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TGA terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 134: 1 ATGGAATGGA GCTGTGTCAT GCTCTTCATC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCACTCCCAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTA GTGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGAAACAC ATTCACTGAC 151 TATGTTATAA ACTGGGTGAA GCAGAGAACT GGACAGGGCC TTGAGTGGAT 201 TGGAGAGATT TATCCTGGAA ATGAAAATAC TTATTACAAT GAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG 301 CAGCTCAGTA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT TC GTGCAAG 351 AGGGATTTAT TACTACGGTA GTAGGACGAG GACTATGGAC TACTGGGGTC 401 AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGATCTACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG 651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC GCGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAÁ CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 GCCACAAGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 1251 TCCCGTCCTC GATTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT 1401 GGGTTGA La secuencia de proteina de cadena pesada de chP2A7 madura prevista se muestra a continuación como SEQ ID NO: 135: 1 QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE 51 IYPGNE TYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI 101 YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSSLG 201 TKTY CNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP 251 KDTLMISRTP EVTCVWDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN 301 SAYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ 351 VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 401 LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG El dominio variable murino es los residuos 1-122, el dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana es los residuos 123-459. La sustitución de articulación de S228P designada por Kabat EU (para corregir la propensión de IgG4 para formar medios anticuerpos) es el residuo 231 anterior, en tanto que la sustitución T299A en CH2 para remover genéticamente la glicosilación N-enlazada es el residuo 302 en la secuencia anterior. Para la construcción de la quimera de cadena ligera, la cadena ligera de P2A7 amplificada por PCR se sometió a mutagénesis dirigida al sitio usando un equipo de mutagénesis STRATAGENE Quick-Change siguiendo el protocolo recomendado del fabricante, con los cebadores mutagénicos 5'CGC CAG TGT GCG GCC GCT GGA ATT CGC CCT TG 3' (SEQ ID NO: 136) y su complemento inverso, que introdujo un sitio Notl único 5' de la secuencia de señal de cadena pesada, y 5' GGA CCA AGC TGG AGC TGA AGC GTA CGG ATG CTG CAC CAA CTG TAT CC 3' (SEQ ID NO: 137) y su complemento inverso, que introdujo un sitio Bsi I único inmediatamente en la dirección 3' de la unión de dominio constante kappa/variable de cadena ligera. Se identificaron los plásmidos mutados por selección de los cambios introducidos de los sitios Notl y BsiWI. La secuencia de cadena ligera se confirmó por secuenciación de ADN . El fragmento de dominio variable de cadena ligera de Notl-BsiWI de 0.42 kb producido como antes, y el fragmento de BsiWI-Notl de 0.34 kb del plásmido pEAG1572, que contiene un ADNc de dominio constante de cadena ligera kappa anti-LTbr humanizado confirmado en secuencia se subclonaron en el sitio Notl del vector de expresión pEAG1256 (un vector de expresión basado en pUC confirmado en secuencia que contiene un marcador seleccionable neo activado por el promotor de fosfoglicerosinasa en el cual se controla la expresión de genes heterólogos por un promotor de CMV-IE y una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento humana). La secuencia de ADNc de cadena ligera en el plásmido resultante se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia de la inserción de ADNc de cadena ligera de P2A7 quimérica (del ATG iniciador de la secuencia de señal hasta el TAG terminador) se muestran a continuación (SEQ ID NO: 138): 1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTG CTGCTAATCA GTGTCACAGT 51 CATAGTGTCT AATGGAGAAG TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA ACCGCCATGG 101 CTGCATCTCC CGGGGAGAAG ATCACTATCA CCTGCAGTGC CAGCTCAACT 151 TTAAGTTCCA ATTACTTGCA TTGGTATCAG CAGAAGCCAG GATTCTCCCC 201 TAAACTCTTG ATTTATAGGA CATCCAATCT GGCCTCTGGA GTCCCAGGTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATTGGCACC 301 ATGGAGGCTG AAGATGTTGC CACTTACTAC TGCCAGCAGG GTAGTAGTAT 351 ACCGCTCACG TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAG CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTG TTAG La secuencia de proteina de cadena ligera de chP2A7 madura prevista se muestra a continuación (SEQ ID NO: 139): 1 EWLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY 51 RTS IiASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG 101 AGTKLELKRT VAAPSVFIFP SDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQWK 151 VDNAliQSQNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 201 GLSSPVTKSF NRGEC El dominio variable murino es los residuos 1-108 anteriores en tanto que el dominio constante kappa humano es los residuos 109-215 en la secuencia anterior. El vector de expresión de cadena pesada chP2A7 y el vector de expresión de cadena ligera chP2A7 se co-transfectaron en células 293-EBNA y las células transfectadas se probaron para secreción y afinidad de anticuerpo. Las células transfectadas con vector vacio e IgG4 de hu5c8-S228P/T299A (un mAb especifico de CD40L molecularmente clonado) se dieron como controles. El análisis de transferencia Western (desarrollado con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humano) de medio condicionado indicó que las células transfectadas con chP2A7 sintetizaron y segregaron de manera eficiente cadenas pesadas y ligeras. El análisis de FACS de las células de adenocarcinoraa mamario humano CF7 que expresan IGF-1R teñidas con medio condicionado de células transfectadas indicaron que el anticuerpo de chP2A7 se unió y produjo patrones de tinción similares a aquéllos de muP2A7, en tanto que el medio condicionado de células t r an s f e c t ada s en falso o trans f ectadas con hu5c8 fallaron en teñir las células MCF7 (detectadas con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humano conjugados con PE) . La titulación por dilución indicó que la tinción especifica con el medio condicionado que contiene mAb de chP2A7 demostró una respuesta a la dosis. Se co-transf ectaron células CHO con el vector de expresión de cadena pesada de chP2A7 para generar lineas estables que expresan mAb kappa de huIgG4 P2A7-aglicosilados quiméricos.
Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de hibridoma 20C8.3B8 murino anti-IGF-lR Se clonaron dominios variables de otros mAb anti-IGF-1R y se quimerizaron por técnicas normales de ADN recombinante similares a aquéllas descritas para el mAb de P2A7. La secuencia madura prevista del dominio variable de cadena pesada de mAb de 20C8.3B8, que corresponde al subgrupo 1(A) murino, se muestra a continuación con sus CDR subrayadas: 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGN LEWMG 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSK QFF LQLNSVTTED TATYYCARSG 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO: 43) La secuencia madura prevista del dominio variable de cadena ligera de 20C8, que corresponde al subgrupo III kappa murino, se muestra a continuación: 1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL 51 LIYLASNLES QVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY 101 TFGGGTKLEI K (SEQ ID NO: 103) Los vectores de expresión para los ADNc de cadena pesada y ligera de 20C8 quiméricos se construyeron como se describe anteriormente. La secuencia de ADNc de inmunoglobulina en los insertos de plásmidos se confirmó por secuenciación de ADN. La secuencia del inserto de ADNc de cadena pesada de 20C8 quiméricos (desde el ATG iniciador de la secuencia de señal hasta el TGA terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 140: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC 51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT 101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT 151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG 201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGG GGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA 251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC 301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG 351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG 401 GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC 451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG 501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCG GGAACT 551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC 601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT 651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA 701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC 751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG gol GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG 1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC 1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC 1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG 1401 TTGA La secuencia de proteína de cadena pesada de ch20C8 madura prevista se muestra a continuación como SEQ ID NO: 141: 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG 5x YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 AYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQ E NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG El dominio variable murino es los residuos 1-122, el dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana es los residuos 123-459. La secuencia del inserto de ADNc de cadena ligera de 20C8 quimérico (desde el ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TAG terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 142: 1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GTTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG 51 TTCCACTGGT GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT 101 CTCTGGGGCA GAGGGCCACC ATCTCATGCA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT 151 ACATCTGCCT ATAGTTATAT GCACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATC TTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGGTCCCTG 251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACAGTAGGGA 351 GCTTCCGTAT ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATC AAACGTACGG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAG La secuencia de proteína de cadena ligera de ch20C8 madura prevista se muestra a continuación como SEQ ID NO: 143: 1 DIVIiTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL 51 LIYIÍASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY 101 TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPRKAKV 151 QWKVDNAliQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC El dominio variable murino es los residuos 1-111 anterior, en tanto que el dominio constante kappa humano es los residuos 112-218 en la secuencia anterior.
El vector de expresión de cadena pesada de ch20C8 y el vector de expresión de cadena ligera de ch20C8 se co-transfectaron en células 293-EBNA y las células transfectadas se probaron para secreción y especificidad de anticuerpo. Células transfectadas con vector vacio y con IgG4 de hu5c8-S228P/T299A (un mAb especifico de CD40L molecularmente clonado) sirvieron como controles. El análisis por transferencia Western (desarrollado con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humanos ) de medio condicionado indicó que células transfectadas con ch20C8 sintetizaron y segregaron de manera eficiente cadenas pesadas y ligeras. El análisis de FACS de las células de adenocarcinoma mamario humano CF7 que expresan IGF-1R teñidas con medio condicionado de células transfectadas indicaron que el anticuerpo de ch20C8 se unió con una respuesta de dosis titulable, en tanto que el medio condicionado de células transfectadas en falso y con hu5c8 fallaron en teñir células MCF7 (detectadas con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humanos conjugados con PE) . Las células CHO se co-transfectaron con el vector de expresión de cadena pesada de ch20C8 y el vector de expresión de cadena ligera de ch20C8 para generar lineas estables que expresan mAb kappa de hu!gG4, 20C8-aglicosilado quimérico.
Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de mAb 20D8.24B11 anti-IGF-lR El mAb 20D8.24B11 parece ser un clon hermano de 20C8.3B8 (ambos se derivan de la fusión 7): que comparten una cadena ligera común y que tienen una cadena pesada, que difiere de aquélla de 20C8 por un residuo individual en FR4. La secuencia madura prevista del dominio variable de cadena pesada de mAb 20D8.24B11, que corresponde al subgrupo 1(A) murino, se muestra a continuación con sus CDR subrayadas: 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQL SVTTED TATYYCARSG 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SS (SEQ ID NO: 53) Una alineación de los dominios variables de cadena pesada de 20D8 (superior) y 20C8 (inferior), que resalta la diferencia conservadora individual que corresponde al residuo 109 de Kabat de FR4 (residuo 118 posterior) se muestra a continuación : 1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSQYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50 (SEQ ID NO: 53) I I I II M I I ! I M i l I N I I I I I M I II I I M I I M I I I I ! I I M I N I I 1 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTV GYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50 (SEQ ID NO-.43) 51 YIHYS8TNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100 (SEQ ID NO: 53) I M I M I I I I 11 M I M M 1111 M 111 II II 1111 M 11 I I M I I 1111 51 YIHYSGGTNYNPSIJKSRISITRDTS NQFFLQLNSV EDTATYYCARSG 100 (SEQ ID NO:43) 101 YGYRSAYYFD WGQGTTLTVSS 122 (SEQ ID NO:53) I I M M I M M M MI M M M 101 YGYRSAYYFDYWGQGTTVTVSS 122 (SEQ ID NO:43) Se construyo un vector de expresión para el ADNc de cadena pesada de 20D8 quimérico y la inserción de ADNc de cadena pesada en el plásmido pCN380 se confirmó por secuenciación de AD . La secuencia del inserto de ADNc de cadena pesada de 20D8 quimérico (del ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TGA terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 144: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC 51 CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCT 101 CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT 151 GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG 201 GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA 251 AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC 301 CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG 351 ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG 401 GGACCACGTT GACAGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCT C 451 CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG 501 CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT 551 CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC 601 TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT 651 GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA 701 AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC 751 CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCQCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG 1051 TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC 1101 ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAA GGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC 1251 CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG 1401 TTGA La secuencia de proteina de cadena pesada de ch20D8 madura prevista codificada por la secuencia anterior se muestra a continuación como SEQ ID NO: 145: 1 DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG 51 YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG 101 YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVWDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQF S 301 AYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSQEE TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG El dominio variable murino es los residuos 1-122, del dominio constante de cadena pesada de IgG4 de S228P/T299A humano es los residuos 123-458. La secuencia variable de cadena ligera de 20D8 es idéntica a aquélla de 20C8: favor de ver la información descrita anteriormente para 20C8.
Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de mAb P1G10.2B8 anti-IGF-lR La secuencia prevista del dominio variable de cadena pesada de P1G10 maduro se muestra a continuación como SEQ ID NO:58, con sus CDR subrayadas: 1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW 51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL 101 YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS S Parece que P1G10 corresponde al subgrupo II (A) de dominio variable de cadena pesada murino, pero con sólo 55 % de identidad a la secuencia de consenso pesada 11(A) . Se construyó un vector de expresión para el ADNc de cadena pesada de P1G10 quimérico y se confirmo por secuencia su inserto de ADNc. La secuencia del inserto de ADNc de cadena pesada de P1G10 quimérico (desde el ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TGA terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 146: 1 ATGGGTTGOA TCTGTATCTT TCTATTCTTG GTGGCAGCTG CCCAAAGTGC 51 CCAAGCACAG ATCCAGTTGG GCAGTCTGG ACCTGACCTG AAGAAGCCTG 101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAAAC 151 CATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGATT TAAAG GGAT 201 GGGCTGGATA AACACCAACA C GGAGAGCC AACATATGCT GATGACTTCA 251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG 301 CAGATCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG 351 TCCCCTCTAC TATAGGAACG GGCGATACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA 401 CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGATC TACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG 651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC 801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG 851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT 901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA 951 CAGCGCGTAC CGTG GGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC 1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA 1101 AGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA 1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 1251 CCTCGATTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA 1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTTG La secuencia de proteína de cadena pesada de chPIGlO madura prevista codificada por la secuencia anterior se muestra a continuación como SEQ ID NO: 147: 1 QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW 51 INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL 101 YYR GRYFDV WGAGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSSLGTK 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD 251 TLMISRTPEV TCVWDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNSA 301 YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY 351 TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 401 SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG El dominio variable murino es los residuos 1-1221, el dominio constante de cadena pesada de IgG4 de S228P/T299A humano es los residuos 122-457. La secuencia prevista del dominio variable de cadena ligera de P1G10 maduro, que corresponde al subgrupo V kappa murino, se muestra a continuación como SEQ ID NO: 113, con sus CDR subrayadas: i DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG 101 GTKLEIK Se construyó un vector de expresión para el ADNc de cadena ligera de P1G10 quimérico y se confirmó por secuencia su inserto de ADNc. La secuencia del inserto de ADNc de cadena ligera de P1G10 quimérico (desde el ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TAG terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 148 : 1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TGCCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTC GCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT 151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGATCTG TTAAACTCCT 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAAAGACGC TTCCGTGGAC 351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT 401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC 451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA 501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA 551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG 601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC 651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT 701 GTTAG La secuencia de proteina de cadena ligera de chPIGlO madura prevista codificada por la secuencia anterior se muestra a continuación como SEQ ID NO: 149: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC El dominio variable murino es los residuos 1-107 anteriores en tanto que el dominio constante kappa humano es los residuos 108-214 en la secuencia anterior. El vector de expresión de cadena pesada de chPIGlO y el vector de expresión de cadena ligera de chPIGlO se co-transfectaron en células 293-EBNA y las células transíectadas se probaron para la secreción y especificidad del anticuerpo (células transíectadas con vector vacio y con IgG4 de hu5c8-S228P/T299A (un mAb especifico de CD40L molecularmente clonado) sirvieron como controles). El análisis de transferencia Western (desarrollado con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humanos) de medio condicionado indicó que las células transíectadas con chPIGlO sintetizaron y segregaron de manera eficiente cadenas pesadas y ligeras. El análisis de FACS de células de adenocarcinoma mamario humano MCF7 que expresan IGF-1R teñidas con medio condicionado de células transíectadas indicaron que el anticuerpo de chPIGlO se unió con una respuesta de dosis titulable, en tanto que el medio condicionado de células transíectadas en falso o con hu5c8 fallaron en teñir células MCF7 (detectadas con anticuerpos de cadena pesada y ligera anti-humano conjugados con PE) . Las células CHO se co-transfectaron con el vector de expresión de cadena pesada chPIGlO y el vector de expresión de cadena ligera de chPIGlO para generar lineas estables que expresen mAb kappa de huIgG4 PIGlO-aglicosilado quimérico.
Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de mAb P1A2.2B11 anti-IGF-lR La secuencia prevista del dominio variable de cadena pesada de P1A2 maduro, que corresponde al subgrupo II (A) murino se muestra a continuación como SEQ ID NO: 48: 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW 51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY 101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS La cadena pesada de P1A2 es 92.6 % idéntica a aquélla de P1G10 (ambas se derivan de la fusión 5), con una diferencia de FR1, una diferencia de FR2, dos diferencias de CDR2, dos diferencias de FR3, dos diferencias de CDR3 y una diferencia de FR . La alineación de los dominios variables de cadena pesada de P1A2 (linea superior) y de P1G10 (linea inferior) se muestra a continuación: 1 QIQLVQSGPELK PGETVKISCKASGYTFTNHG^INWVKQAPGKGL·KWMGW 50 (SEQ ID NO: 8) I I M 1 M I MU I M IM M I I M MM M M I MI M l ll l l lil ilí 1 QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKDLKWMGW 50 (SEQ ID NO: 58) 51 .NTSTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTASYFCASPL 99 (SEQ ID NO:48) 11 - 1 í 1111111111111111 f 111 i I ? = I ) 11 1 - 19 111 51 INTN GEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNL NEDTA YFCASPL 100 (SEQ ID NO: 58) 100 YYMYGRYIDVWGAGTAVTVSS 120 (SEQ ID NO:48) I I I II M M I I ! M U I 101 YYRNGRYFDVWGAGTTVTVSS 121 (SEQ ID NO: 58) Se construye un vector de expresión para cadena pesada de P1A2 quimérica por los métodos descritos anteriormente. La secuencia prevista de la cadena pesada de chPlA2 codificada por ese plásmido (SEQ ID NO:150) es: 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW 51 NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY 101 YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT 201 YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSAY 301 RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT 351 LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 401 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG El dominio variable murino es los residuos 1-120, del dominio constante de cadena pesada de IgG4 de S228P/T299A humano es los residuos 121-456. La secuencia prevista del dominio variable de cadena ligera de P1A2 maduro, que corresponde al subgrupo V kappa murino, se muestra a continuación como SEQ ID NO: 108, con sus CDR subrayadas: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTI LLIYY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG 101 GTKLEIK La cadena ligera de P1A2 es 97.2 % idéntica a aquélla de P1G10 (ambas se derivan de la fusión 5) con dos diferencias de FR2 y una diferencia de FR3, pero que comparten CDR idénticas. La alineación de los dominios variables de cadena ligera de P1A2 (linea superior) y P1G10 (linea inferior) se muestra a continuación: 1 DIQ TQTTSSLSASLGDRVTISC ASQDISMYLNWYQQKPDGTIKLLIYY 50 (SEQ ID NO: 108) ¡lililí 1 DIQMTQTTSSLSASLQD VTISCRASQDISNYLNWYOQKPDGSV LLIYY 50 (SEQ ID NO: 113) 51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGG 100 (SEQ ID NO: 108) lililí lili lililí! I III II Mili! I II 51 TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGG 100 (SEQ ID NO: 113) 101 GTKLEIK 107 (SEQ ID NO: 108) Mlllll 101 GTKLEIK 107 (SEQ ID NO: 113) Se construyó un vector de expresión para el ADNc de cadena ligera de P1A2 quimérico y se confirmó por secuencia su inserto de ADNc. La secuencia del inserto de ADNc de cadena ligera de P1A2 quimérico (desde el ATG iniciador de secuencia de señal hasta el TAG terminador) se muestra a continuación como SEQ ID NO: 151: 1 ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGAGAC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTATCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACTCCT 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAAAACGC TTCCGTGGAC 351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT 401 CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC 451 TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA 501 GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA 551 CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG 601 CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC 651 CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT 701 GTTAG La secuencia de proteína de cadena ligera de chPlA2 madura prevista codificada por pCN379 se muestra a continuación como SEQ ID NO: 152: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQ P DGTIKL.LIYY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQW V 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDS D STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC El dominio variable murino es los residuos 1-107 anterior, en tanto que el dominio constante kappa humano es los residuos 108-214 en la secuencia anterior.
Clonación de regiones variables de inmunoglobulina de mAb P1E2.3B12 anti-IGF-lR Se lleva a cabo la clonación de los dominios variables de P1E2 por los métodos descritos anteriormente.
Ejemplo 19 Anticuerpos Fab de IGF-1R se Unen a IGF-1R Soluble con Alta Afinidad Método: La actividad de unión de Fab de M13-C06, M14-C03, y MI -Gil a IGF-1R soluble se midió usando resonancia de plasmón superficial. Se inmovilizó el anticuerpo PENTA-His biotinilado (Qiagen, Inc.) en un chip sensor revestido con estreptavidina . Se capturó el ectodominio de IGF-1R-His soluble/dimérico (R & D Systems, Inc.) en la superficie mediante al anticuerpo PENTA-His. Se realizaron inyecciones secundarias de los Fab de M13-C06, M14-C03, o M14-G11 (0.5 nM-1000 nM) . Las superficies se regeneraron con tres inyecciones cortas de acetato, pH 4.0. Resultados: El Fab de M13-C06 se unió a IGF-1R recombinante con mayor afinidad a KD = 1.3 nM, en tanto que el Fab de M14-G11 se unió con una KD = 4.0 nM, y el Fab de M14-C03 se unió con una KD = 4.9 nM (datos no mostrados) .
Ejemplo 20 Inhibición de Crecimiento de Células Tumorales Estimulado con IGF-1 e IGF-2 por Anticuerpos de IGF-IR Completamente Humanos. Método: El efecto del anticuerpo en el crecimiento tumoral se midió ín vitro usando un ensayo CELL TITER-GLOMR (Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Rd., Madison, WI 53711 EUA) . Se cultivaron células BxPC3 en FBS al 10 % que contienen medio de RPMI en placas tratadas con TC de fondo claro de 96 concavidades Wallac (8000 células/concavidad) . Después de 24 horas, se cambió el medio de cultivo para condiciones libres de suero y se adicionaron anticuerpos a diferentes concentraciones (100 nM, 10 nM, 1 nM, y 0.1 nM) . Después de 30 minutos de incubación, se adicionó IGF-1 o IGF-2 a 100 ng/ml. Las células se incubaron durante otras 48 horas hasta que se Usaron para determinar la cantidad de ATP presente usando el reactivo CELL TITER-GLOMR. Se calculó la inhibición como [ 1- (Ab-SFM) / ( IGF-SFM) ] x 100 %. Se usó un anticuerpo correspondido en isotipo, IDEC-151 (G4 humano) , como un control negativo. Resultados: Los anticuerpos completamente humanos M13-C06.G . P.agly, M14-G11.G4.P y M14-C03. G4. P . agly inhibieron la proliferación de células BxPC3 ( adenocarcinoma de páncreas humano) activada con IGF-1 e IGF-2 humano recombinante (Figura 16) . Se obtuvieron resultados similares de inhibición de crecimiento con estos anticuerpos contra proliferación celular activada con IGF-1 e IGF-2 humano recombinante en la linea de células de cáncer pulmonar humano NCI-H23 (Figura 17; anticuerpo M13-C06. G . P . agly ) y la linea de células de cáncer pulmonar humano A549 (Figura 18; anticuerpo M13-C06. G4. P. agly) . En las tres lineas células, M14-G11. G4. P . agly mostró resultados similares como la versión de M14.G11.G4.P (datos no mostrados).
Ejemplo 21 Detención del Ciclo Celular del Crecimiento de Células Tumorales in vitro por Anticuerpos de IGF-1R Completamente Humanos Método: Se valoró la capacidad de los anticuerpos de IGF-1R completamente humanos para detener el progreso del ciclo celular por análisis de FACS; monitorizando la incorporación de yoduro de propidio en células BxPC3 cultivadas. Se colocaron células BxPC3 (4 x 105 células/concavidad) en placas de 6 concavidades. Después de 24 horas, las células se cambiaron a medio libre de suero (SFM) durante las siguientes 24 horas. Luego, los anticuerpos de IGF-1R a una concentración final de 133.3 nM (20 microgramos/ml ) e IGF-1 a 200 ng/ml se adicionaron al medio. Después de 24 horas, las células se trataron con tripsina y se fijaron con etanol. El contenido de ADN se tiñó con yoduro de propidio (PI) antes del análisis de FACS. Se usó un anticuerpo correspondido con isotipo, IDEC-151 (G4 humano) , como un control negativo. Resultados: Los anticuerpos completamente humanos M13-C06.G . P.agly (Tabla 11), 14-G11-G4. P . agly, y M14- C03. G4. P . agly detuvieron las células tumorales BxPC3 a la fase G0/G1 del ciclo celular.
Tabla 11 Ejemplo 22 Inhibición in vivo de Crecimiento Tumoral en un Modelo de Cáncer Pancreático Métodos: La eficiencia in vivo de agente individual del anticuerpo M13. C06. G . P . agly se evaluó en un sistema de modelo de cáncer pancreático de xenoinjerto usando células BxPC3 (cáncer pancreático) . Se inocularon ratones CB17 SCID con 2 x 106 células y se monitori zaron para crecimiento tumoral. El volumen tumoral medio al inicio de la terapia fue -200 mm3. El anticuerpo I 3. C06. G . P . agly se administró de manera peritoneal (i.p.) a 60, 30 y 15 mg/kg administrado una vez por semana durante 5 semanas. Se administró un anticuerpo correspondido en isotipo, IDEC-151 (G4 humano) como un control negativo a 60 mg/kg una vez por semana durante 5 semanas. Los tumores se extrajeron a los intervalos indicados postinoculación (Figura 20) y se midió el volumen tumoral total. Resultados: El anticuerpo MI 3. C06. G4. P . agly completamente humano inhibió el crecimiento tumoral de una manera dependiente de la dosis (Figura 20). El anticuerpo demostró eficiencia de agente individual estadísticamente significativa a 60, 30 y 15 mg/kg administrado de manera semanal durante 5 semanas. Además, el anticuerpo fue eficaz a dosis tan bajas como 15 mg/kg administrados una vez por semana (Figura 20) .
Ejemplo 23 Inhibición in vivo de Crecimiento Tumoral en un Modelo de Cáncer Pulmonar Métodos: La eficiencia in vivo de agente individual del anticuerpo M13. C06. G . P . agly se evaluó en un sistema de modelo de cáncer pulmonar de xenoinjerto usando células A549 (cáncer pulmonar) . Se inocularon ratones CB17 SCID con 3-5 x 10s células y se monitorizó para crecimiento tumoral. El volumen tumoral medio al inicio de la terapia fue -150 mm3. Se administró el anticuerpo M13. C06. G4. P . agly de manera intraperitoneal (i.p.) a 30 y 15 mg/kg administrado dos veces por semana durante 4 semanas. Se administró un anticuerpo correspondido en isotipo, IDEC-151 (G4 humano) como un control negativo a 30 mg/kg. Los tumores se extrajeron a los niveles indicados post-inoculación (Figura 21) y se midió el volumen tumoral total. Resultados: El anticuerpo MI 3. C06. G . P . agly completamente humano inhibió el crecimiento tumoral de una manera dependiente de la dosis (Figura 21). El anticuerpo demostró eficacia de agente individual estadísticamente significativa a las dosis administradas de 30 y 15 mg/kg durante un periodo de 4 semanas (Figura 21). Los estudios adicionales realizados en este modelo mostraron que C06 es eficaz a dosis tan bajas como 7.5 mg/kg de inyecciones semanales (datos no mostrados).
Ejemplo 24 Inhibición in vivo de Crecimiento Tumoral Usando Terapia de Combinación Métodos: La eficiencia del anticuerpo M13. C06. G4. P . agly al inhibir el crecimiento tumoral en combinación con gemcitabina (un fármaco comúnmente usado para tratar cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pancreático, de vejiga y de mama) se probó en un modelo de xenoinjerto de BxPC3. La eficiencia del anticuerpo M 13. C 06. G 4. P . ag 1 y administrada de manera intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana a 30 mg/kg durante 7 semanas (datos no mostrados) o una vez por semana a 60 mg/kg durante 5 semanas (Figura 22) se evaluó en combinación con gemcitabina administrada de acuerdo a la norma actual de cuidado (es decir, 80 mg/kg cada 3 días durante 4 semanas) . Se administraron como controles negativos, gemcitabina sola, el anticuerpo M 13. C 06. G 4. P . a g 1 y solo, e inyecciones simuladas del vehículo de distribución solo. El volumen tumoral al inicio de la terapia fue aproximadamente 200 mi3. Resultados: El anticuerpo M 13 - C 06. G . P . a g 1 y y la gemcitabina como un agente individual (es decir, administrados solos) mostraron eficiencia similar. En combinación con gemcitabina, el anticuerpo MI 3. C06. G4. P . agly a 30 mg/kg en un programa de dos veces por semana (datos no mostrados) o 60 mg/kg en un programa semanal (Figura 22) mostró eficiencia aditiva en comparación a los tratamientos con agentes solos. Además, la combinación con 15 mg/kg también mostró eficiencia aditiva (datos no mostrados).
Ejemplo 25 Anticuerpos de IGF-IR Completamente Humanos se Unen a la Línea de Células de Fibroblastos de Macaco Cynomolgus Métodos: El anticuerpo M13. C06. G . P . agly se une a una línea de células de fibroblastos establecida de un macaco cynomolgus. La línea de células de fibroblasto se generó de una biopsia de piel. Se valoró la unión al anticuerpo al levantar las células de fibroblastos con amortiguador de disociación celular y al incubar con M13. C06. G . P . agly biotinilado durante 45 minutos a 4°C. Después del lavado de las células, se adicionó estreptavidina-PE y se incubó durante 30 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad. Las células entonces se lavaron y se adicionaron 200 ul de PBS fría seguido por fijación con 1 % de formaldehído y vórtice suave. Se valoró la unión al anticuerpo por análisis de FACS. Resultados: El anticuerpo M13-C06. G4. P . agly se une a IGF-IR expresado en la línea de células de fibroblastos de cynomolgus de una manera dependiente de la concentración (Figura 23) .
Ejemplo 26 Parte I: Resumen de Características Biológicas de Anticuerpo M13. C06. G4. P . agly Completamente Humano En las Tablas 11 y 12 se presentan las características biológicas valoradas para el anticuerpo M13. CO 6. G4. P . agly completamente humano. Estas características se determinan por métodos, experimentos, y ejemplos descritos en la presente y/o se pueden determinar por rutina mediante métodos y experimentos mostrados y realizados por aquellos expertos en la técnica.
Tabla 11 Características Biológicas del Anticuerpo M13. C06. G . P . agly (IgG4 humana, no glicosilada) Propiedades valoradas: Resultados obtenidos: Unión a IGF-IR (EC50)* Proteina de IGF-IR soluble: 4.22?10"?? IGF-IR de células tumorales: 2.2xlO~10M (afinidad Fab de M13.C06 para IGF-IR = 1.3 nM) IGF-1R de cynomolgus IGF-IR de cynomolgus/CHO = 4.7x10"10 M IGF-IR de rhesus IGF-IR de rhesus/CHO = 2.7xlO"10M Bloqueo de ligando (IC50nM) Bloqueo de IGF-1: 0.979nM Bloqueo de IGF-2: 0.525nM Inhibición de Fosforilación IGF-1 < 0.13nM estimulada con IGF-1 e IGF-2 de IGF- IGF-2 < 0.63nM IR (IC50 nM) Inhibición de fosforilación mediada Positivo para IGF-1 e IGF-2 a: por IGF-1 e IGF-2 de Akt (Thr308, > InM Ser 73) y pErk > InM Características Biológicas del Anticuerpo M13. C06. G4. P. agly (IgG4 humana, no glicosilada) Propiedades valoradas: Resultados obtenidos: Reducción de regulación de IGF-1R > 60% de regulación de (intemalización) expresión en 1 hora en células MCF-7 Inhibición in vitro de crecimiento de Inhibición observada lineas de células tumorales activado en -70% de lineas por IGF-1 e IGF-2 celulares (15 de 21 lineas celulares) Eficiencia in vivo de anticuerpo en Actividad en 3 modelos reducir tamaño de tumor: de ratón a dosis tan bajas como 7.5 mg/kg x 1 semana Vida Media en Suero del Anticuerpo M13. C06. G4. P. agly Se realizó un estudio farmacocinético (PK) en ratones que no tienen tumor usando 3 mg/kg del anticuerpo M13. C06. G4. P . agly (un nivel de dosis, inyecciones intraperitoneales ) en ratones SCID. El anticuerpo M13. C06. G4. P . agly en suero de ratones SCID se detectó usando ELISA específico de IgG. Se inmovilizó IgG de cabra antihumano (100 ng/concavidad) en placas immulon. Los sueros se titularon y triplicaron iniciando a 1:25 con diluciones en serie de dos veces. Se determinó la unión usando anti-Kappa humana-HRP de cabra. Los resultados de este estudio indican una vida media en suero de -11.5 días en este sistema de modelo de ratón (datos no mostrados) . Se valoraron las concentraciones en suero de M13. CO 6. G4. P . agly después de inyecciones intraperitoneales en animales que tienen tumor MCF-7 (anticuerpo a 30 ug/kg) y en animales que tienen el tumor BxPC3 (anticuerpo a 15 ug/kg) . Se midió mediante un ELISA la unión del anticuerpo M13. C06. G4. P. agly a anti-IgG humana de cabra (100 ng/concavidad) inmovilizada en 96 concavidades (IMMULON2 HB, Dynax Technologies, Inc., Cat. #3455). Se titularon curvas normales iniciando a 10 ug/ml con diluciones en serie de 3 veces. Se tituló el suero iniciando a diluciones de 1:25 con diluciones en serie de 2 veces. Se detectó el anticuerpo M13.C06.G4. P.agly usando anti-Kappa humana-HRP de cabra. Se usó el paquete de software SOFTMAX PRO versión 4.3 LS (Molecular Devices Corp.) para determinar las concentraciones de los anticuerpos. Se observaron las concentraciones en suero promedio como se muestra a continuación: Ratones que Tienen Tumor MCF-7 Puntos de Tiempo de Concentración Promedio en Sangrada (horas) Suero ^µq/m ) 0 0 2 213 6 253 12 189 24 224 48 137 Ratones que Tienen Tumor BxPC3 Puntos de Tiempo de Concentración Promedio en Sangrada (horas) Suero {µ?/t??,) 0 0 2 102 6 145 12 122 24 115 48 79 También se ha investigado la farmacocinética del anticuerpo M13.C06.G4. P.agly en monos cynomolgus después de inyecciones a dosis de 10 mg/kg y 25 mg/kg, donde la vida media en suero se observó que es -10 a 12 días (datos no mostrados) . Las Tablas 12 y 13 muestran inhibición dependiente de la dosis (por ciento de inhibición) del crecimiento celular in vitro observado para varias lineas de células tumorales de pulmón, páncreas y colon donde se adiciona el anticuerpo M13.C06.G . P. agly a medio de cultivo celular complementado con IGF-1 o IGF-2 (Tabla 12) o complementado con suero de becerro fetal al 10 % (FCS) o suero bovino fetal (FBS) (Tabla 13) .
Tabla 12: Tabla 13 Tipo de Línea Celular: 10 % de Suero en el Medio Célula Inhibición de crecimiento celular dependiente de la dosis con concentración creciente del anticuerpo M13.C06.G4. P.agly (% = por ciento inhibición de crecimiento; nM = concentración de anticuerpo) 0.2 nM 2 nM 20 nM 200 nM Pulmón NCI-H23 5% 12% 21% 47% A5 9 2% 12% 22% 41% Calu-6 0% 0% 0% 9% SK-MES-1 12% 10% 6% 7% Páncreas BXPC3 6% 3% 9% 26% Panc-1 6% 11% 12% 30% Capan-1 0% 0% 0% 0% Capan-2 41% 45% 47% 38% Colon Coló 205 0% 0% 11% 28% SW620 0% 4% 6% 20% HT-29 21% 21% 23% 37% WiDr 35% 45% 51% 57% Parte II: Mediciones de Afinidad de Anticuerpo Obj etivo : El objetivo fue medir la afinidad de unión de los anticuerpos de IGF-1R.
Métodos : Preparación de los Fab de M13-C06, M14-C03, y M14-G11 Se prepararon anticuerpos Fab de M13-C06, M14-C03, y M14-G11 por digestión con papaina inmovilizada (Pierce Cat . No. 20341) . La resina de papaina se lavó con fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0; EDTA 10 mM; cisteina 20 mM. Los anticuerpos se mezclaron con la resina de papaina en EDTA 500 mM, cisteina 100 mM, pH 7.0 y se digirieron durante tres horas en un baño de agua a 37 °C seguido por mezclado en un agitador de inversión durante la noche a temperatura ambiente. Se determinó cada digestión por cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC) . La resina se removió de la proteína digerida con un filtro de embudo de vidrio sinterizado y se lavó con acetato 20 mM; pH 5.0. El flujo de paso se recolectó y diluyó 10 veces con acetato 20 mM, pH 5.0.
Los fragmentos Fab se purificaron por cromatografía de intercambio catiónico S-SEPHAROSAMR usando un gradiente salino lineal. Se realizó la SEC analítica en las fracciones eluidas y las fracciones deseadas se mezclaron y dializaron en PBS . Los Fab se alquilaron de manera subsiguiente para inhibir la re-formación de disulfuros de articulación que dan por resultado la producción de (Fab) 2· Se llevó a cabo la alquilación al diluir Tris 1M; yodoacetato 200 mM, pH 8.5, 10 veces en las soluciones de Fab. Las mezclase incubaron en un agitador de inversión durante veinte minutos a temperatura ambiente seguido por diálisis exhaustiva en lxPBS. Se realizó la purificación final de cada Fab usando cromatografía preparativa de exclusión de tamaño.
Mediciones de Afinidad por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) Se realizaron todos los experimentos de resonancia del plasmón superficial (SPR) en un Biacore 3000 ajustado en 25°C usando HBS-EP (Biacore, Cat . No. BR-1001-88) como el amortiguador de la corrida. Se inmovilizó un anticuerpo anti-HisTag marcado con biotina (biotin-PENTA-His, Qiagen Cat. No. 34440) a saturación en una superficie de chip Biacore SA (Cat. No. BR-1000-32) por inyección a 500 nM en amortiguador de HBS-EP. Se capturó IGF-lR-10His (R & D Systems, Cat. No. 305-GR-050) humano recombinante en la superficie de biotina-PENTA-His al inyectar 20 de proteina 40 nM a 2 µL/min. Subsiguiente a las inyecciones de IGF-1R, se incrementaron las velocidades de flujo a 20 µ?,/????. Se realizó una segunda inyección de 130 µ?, de anticuerpo anti-IGF-lR, o Fab, para investigar las interacciones con el receptor. Cada anticuerpo y Fab se diluyó en serie de 64 nM a 0.5 nM para obtener curvas de unión cinéticas dependientes de la concentración. Cada serie de inyecciones se regeneró usando inyecciones de 3 x 10 µ?^ de acetato 10 mM; pH 4.0, a 20 µ?,/????. Cada curva se refirió doble usando (1) datos obtenidos de una superficie de estreptavidina desprovista de IGF-1R y (2) datos de una inyección primaria de IGF-1R seguidos por una inyección secundaria de amortiguador de HBS-EP. La serie de concentraciones para cada anticuerpo y Fab se ajustó al modelo de unión de 1:1 proporcionado dentro del software BiaEvaluation del fabricante.
Resultados Se probaron tres anticuerpos anti-IGF-lR recombinantes , M13-C06, M14-C03, y M14-G11, para la unión a IGF-1R usando resonancia de plasmón superficial como se describe anteriormente. Los tres anticuerpos demostraron fuerte unión al receptor. Se observó (datos no mostrados) una unión dependiente de la concentración de cada anticuerpo (64 nM diluido en serie a 0.5 nM) a IGF-1R humano recombinante inmovilizado. Las velocidades a las cuales se acumulan los anticuerpos en la superficie revestida con IGF-1R cuando se aplicaron a varias concentraciones asi como a las velocidades a las cuales se disocian durante las aplicaciones del amortiguador puro se investigaron al ajusfar los datos a un modelo de unión de 1:1. Se calcularon constantes de velocidades cinéticas aproximadas y constantes de disociación en equilibrio (Tabla 14) .
Tabla 14 Tabla 15 Para obtener afinidades discretas, se generaron fragmentos Fab de cada anticuerpo usando digestión con papaina como se describe anteriormente. Debido a la presencia de un sitio inhibidor de unión a antigeno, los Fab demostraron de manera uniforme unión monofásica y curvas de disociación cuando se aplicaron al receptor de IGF-1R de una manera idéntica como se describe para los anticuerpos de longitud completa (datos no mostrados) . Las afinidades de cada Fab para IGF-1R se proporcionan en la Tabla 15.
E emplo 27 Parte I: Anticuerpo M13. CP 6. G4. P . agly Tiene Características Únicas de Unión a Epítopo en Comparación a Otros Anticuerpos de IGF-1R Se realizó un estudio de unión a anticuerpo de competición cruzada para comparar los epítopos de unión al anticuerpo de IGF-1R de M13. C06. G4. P . agly y otros anticuerpos de IGF-1R. Ver Figura 24. Se analizaron anticuerpos competidores no marcados para su capacidad para competir de manera cruzada con cinco diferentes anticuerpos marcados para la unión a IGF-1R soluble. Los cinco anticuerpos marcados usados fueron M13. C06. G4. P . agly marcado con biotina ("Biotina-C06"), 14-G11 marcado con biotina ( "Biotina-Gll" ) , P1B10-1A10 marcado con zenon ("Zenon-O"), 20C8-3B4 marcado con zenon ("Zenon-M") , o anticuerpo de IR3 marcado con zenon ("Zenon-IR3") . Ver Figura 24. Se marcaron los anticuerpos con Biotina usando un equipo de Biotinilación de Pierce Chemical (#21335). Se realizó la marcación con Zenon usando equipo de marcación de IgG de ratón con Zenon de Molecular Probes (Z25000) . +++++ = competición de unión a anticuerpo con relación a si mismo (90-100 %) ++++ = 70-90 % de competición +++ = 50-70 % de competición ++ = 30-50 % de competición + = 10-30 % de competición +/- = 0-10 % de competición N/A = resultados no disponibles Los resultados de este análisis indican que los anticuerpos M13. C06. G . P . agly, y M1 . C06. G4. P. agly se unen a la misma o similar región de IGF-1R, que es distinto de todos los anticuerpos probados. En particular, sólo el anticuerpo M13. C06. G . P . agly marcado con biotina fue efectivamente competido de la unión a IGF-1R por M13. C06. G4. P . agly no marcado o por M14. C03. G . P . agly no marcado. También es notable que M13. C06. G4. P . agly no compite de forma cruzada con el anticuerpo IR3 bien estudiado. Por lo tanto, estos dos anticuerpos, en particular, se unen a diferentes epitopos de IGF-1R.
Parte II: M13-C06 Disminuye Alostéricamente la Afinidad de Unión de IGF-1 para IGF-1R Mediante la Unión a Anticuerpo a la Región N-terminal del Dominio de FnIII-1 Ob etivo : El objetivo fue aclarar el epitopo de unión del anticuerpo M13-C06 en IGF-1R y el mecanismo detrás de la inhibición de la unión de IGF-l/IGF-2 a IGF-1R.
Antecedentes : IGF-1R consiste de 6 dominios (Figura 29A) . Se ha publicado que las mutaciones en los primeros tres dominios de IGF-1R, denotados Ll (dominio 1 de repetición rico en leucina), CR (dominio de repetición rico en cisteina) , y L2, asi como una región de asa peptidica en el dominio 5 (FnIII-2, dominio 2 tipo III de fibronectina ) tiene un impacto negativo en la unión de IGF-1 e IGF-2 ( "Whittaker 2001; Sorensen 2004). Aquí, se demostró que el anticuerpo M13-C06 no bloquea la unión de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R al interactuar competitivamente con el sitio de unión al factor de crecimiento, pero en cambio se une a FnIII-1 e inhibe de manera alostérica la señalización de IGF-l/IGF-2. Se cree que FnIII-1 facilita la homodimerización del receptor de tanto IGF-1R e INSR (McKern 2006) y en la unión a ligando, transmite una señal de activación a través de la región transmembrana a los dominios de tirosina-cinasa C-terminales mediante un cambio de estructura cuaternaria. Los datos de este ejemplo sugieren que el anticuerpo M13-C06 inhibe cambios conformacionales inducidos por IGF-l/IGF-2 que conducen a la señalización del receptor en etapas posteriores.
Métodos : Experimentos de Unión de IGF-1/IGF-1R en la Presencia y Ausencia del Anticuerpo M13-C06 Se usaron varias construcciones para investigar la unión del anticuerpo/IGF-1 al receptor de IGF-1R o receptor de insulina: IGF-1R humano ( 1-902 ) -Hisio (denotado hIGF-lR-Hisi0, de R & D Systems), INSR humano ( 28-956 ) -Hisi0 (denotado INSR, de R & D Systems), IGF-1R humano (1-903) -Fe (denotado hIGF-lR-Fc, generado por Biogen Idee), IGF-1R humano (1-462) -Fe (denotado hIGF-lR ( 1-462 ) -Fe, generado por Biogen Idee), e IGF-1R murino (1-903) -Fe (denotado mIGF-lR-Fc, generado por Biogen Idee) . "Hisio" denota una marca de histidina de 10 residuos en el C-término de las construcciones. "Fe" denota una marca de IgGl humana_Fc C-terminal. Se compró IGF-1 humano de Millipore. La afinidad de IGF-1 para hIGF-lR-Hisio se determinó usando resonancia de plasmón superficial (SPR) . Un anticuerpo anti-HisTag marcado con biotina (biotin-PENTA-His , Qiagen Cat . No. 34440) se inmovilizó a saturación en una superficie de chip Biacore SA (Cat. No. BR-1000-32) por inyección a 500 nM en amortiguador de HBS-EP. Para cada sensograma, se capturó hIGF-lR-Hisio (descrito en el Ejemplo 5 (Parte II)) en la superficie de biotina-PENTA-His al inyectar 20 µ?, de proteina 40 nM a 2 µ?, /G?? ? . Una segunda inyección de 130 µ?, que contiene IGF-1 se realizó para investigar la interacción de la hormona de crecimiento con su receptor. Se diluyó en serie IGF-1 desde 64 nM a 0.125 nM para obtener curvas de unión cinética, dependientes de concentración. Cada serie de inyección se regeneró usando inyecciones de 3 x 10 µ?, de acetato 10 mM, pH 4.0, a 20 µ?,/p???. Cada curva se referenció doble usando (1) datos obtenidos de una superficie de estreptavidina desprovista de PENTA-His y (2) datos de una inyección primaria de hIGF-lR-Hisio seguidos por una inyección secundaria de amortiguador de HBS-EP. La serie de concentraciones para IGF- 1 se ajustó al modelo de unión de 1:1 proporcionado dentro del software BiaEvaluation del fabricante. Se obtuvieron dos conjuntos de datos, uno en la ausencia y otro en la presencia de M13-C06 400 nM en el amortiguador de corrida, el amortiguador de inyección de hIGF-lR-Hisi0, y el amortiguador de inyección de IGF-1.
Análisis de Transferencia Western y de Rebaja de los Complejos Ternarios de Anticuerpos IGF-1/IGF-1R/M13-C06 Se lavaron cuentas de Proteina A/G resuspendidas (300 µ?, Pierce Cat . No. 20422) con lxPBS y se mezclaron con 1.0 g de M13-C06 en un tubo Eppendorf de 1.5 mi en un agitador giratorio durante dos horas a temperatura ambiente. En un tubo separado, se mezclaron 12 µg de hIGF-lR-Hisio (R & D Systems) y 460 nm de IGF-1 humano (Chemicon International Cat. No. GF006) (relación de proteina : proteina 1:1) durante una hora a temperatura ambiente. La Proteina A/G con M13-C06 unido se lavó con PBS y se incubó con la mezcla de hIGF-lR-Hisio/IGF-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La Proteina A/G con la proteina unida se lavó con PBS seguido por elusión de la proteina unida con 300 µL de glicina 100 mM, pH 3.0. Para el control negativo, se omitió la adición de 12 µg de IGF-1R humano ( 1-902 ) -Hisio . Las proteínas eluidas se detectaron por transferencia Western con un anticuerpo anti-IGF-1 humano (anti-IGF-1 humano-Biotina de conejo, USBiological Cat. No. I7661-01B) y un anticuerpo anti-IGF-lR humano (IGF-IRa 1H7, Santa Cruz Biotechnology Cat. No. sc-461) como anticuerpos primarios seguidos por estreptavidina marcada con HRP (Southern Biotech Cat. No. 7100-05) y anti-IgG de ratón de cabra marcado con HRP (USBiological Cat. No. 11904-40J) como anticuerpos secundarios. Para demostrar la capacidad de IGF-1/IGF-1R/M13-C06 para formar un complejo ternario, las concentraciones del IGF-1 e IGF-1R usadas en este experimento estuvieron bien en exceso (>15 veces por arriba) los niveles fisiológicos normas de estas proteínas (particularmente, IGF-1 en el suero) así como la constante medida de disociación de equilibrio para IGF-1R/IGF-1. Ver, por ejemplo, Hankinson et al., 1997.
Construcción de IGF-1R ( 1-462 ) -Fe y Estudios de Unión a Anticuerpo Comparativos versus el Ectodominio de Receptor de Longitud Completa La construcción de los dominios de unión de IGF-l/IGF-2, L1-CR-L2 (residuos 1-462), de IGF-1R humano se publicaron anteriormente (McKern 1997). Utilizando esta información, se subclonaron los residuos 1-462 de IGF-1R humano (junto con la secuencia de señal N-terminal) en el mismo vector PV90 interno que se usó para producir el ectodominio humano de longitud completa (residuos 1-903, hlGF-ÍR-Fc) . La expresión en CHO se facilitó usando los métodos descritos anteriormente (Brezinsky 2003). La proteína se purificó de los sobrenadantes de CHO por paso sobre una proteína. Una columna de afinidad como se describe anteriormente para otras proteínas de fusión a Fe (Demarest 2006). La construcción de proteína se denota hIGF-lR ( 1-462 ) -Fe. La capacidad de los anticuerpos M13-C06, M14-C03, y 14-G11 para unirse a hIGF-lR ( 1-462 ) -Fe y la construcción de ectodominio de longitud completa, hIGF-lR-Fc, se determinó por SPR usando un Biacore3000. El instrumento se ajustó a 25°C y el amortiguador de corrida fue HBS-EP, pH 7.2 (Biacore, Cat . No. BR-1001-88). Los anticuerpos completamente humanos, M13-C06, M14-C03, y M14-G11, se inmovilizaron a -10,000 RU en superficies de Chip Sensor Grado de Investigación de Biacore CM5 (Cat. No. BR-1000-14) usando la química reactiva normal de NHS/EDC-amina de acuerdo a los protocolos suministrados por Biacore. Para la inmovilización, los anticuerpos se diluyeron a 40 µg/mL en un amortiguador de acetato 10 mM, pH 4.0. Para investigar la cinética relativa de la asociación y disociación de hIGF-lR-Fc y hIGF-lR ( 1-462 ) -Fe a cada uno de los anticuerpos humanos, se inyectaron concentraciones crecientes de cada construcción de receptor sobre las superficies de chip sensor. Las series de concentración de hIGF-lR-Fc variaron desde 1.0 nM a 100 nM en tanto que las series de concentración de hIGF-lR(l-462) -Fe variaron desde 1.0 nM a 2 µ?. Todas las superficies de los anticuerpos se regeneraron de manera confiable con glicina 100 mM, pH 2.0. Las regeneraciones repetidas no condujeron a pérdidas de actividad para ninguna de las superficies de anticuerpo. Las velocidades de flujo fueron 20 µ?/min.
Mutaciones de Correlación de Epítopos La elección de mutantes para sondear el epítopo del anticuerpo M13-C06 en IGF-1R se basó en la observación que la afinidad de unión de M13-C05 a IGF-1R de ratón se redujo de manera significativa o no fue detectable en experimentos de unión de Biacore y FRET (Ejemplo 5 (Parte III) ) . El IGF-1R de ratón y de humano comparten 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos el IGF-1R humano y el INSR humano comparten 57 % de identidad (73 % de similitud) . Se identificaron 33 residuos que difieren entre el IGF-1R de ratón y humano en el ectodominio (Tabla 16) . Se seleccionaron como objetivo veinte de estos residuos para mutación debido a que las posiciones homologas dentro del ectodominio de INSR se expusieron a solvente en base a la estructura cristalina reciente de INSR (pdb code 2 DTG , cKern 2006) . Se calcularon las áreas superficiales accesibles usando StrucTools (http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html) con un radio de sonda de 1.4 Á. Cuatro residuos adicionales no en la estructura de INSR también se eligieron para mutagénesis puesto que residen en la región de asa no estructurada del dominio FnIII-2 que se ha demostrado que es importante para la unión de IGF-l/IGF-2 ( hittaker 2001; Sorensen 2004) . La lista de las 24 mutaciones elegidas para el estudio de correlación de epitopos se muestran en la Tabla 17.
Tabla 16: Diferencias de Aminoácidos Entre IGF-IR de Humano y de Ratón. Se Determinó la Accesibilidad por Solvente de Cada Posición de Residuo en Base a la Estructura Públicamente Disponible del Ectodominio de INSR Homólogo. Los Residuos Mostrados en Negritas/Itálicas Expusieron más de 30 % de su Área Superficial a Solvente y se Mutageni zaron para Seleccionar el Epitopo de IGF-IR de M13-C06. Residuo IGF1R IGF1R de INSR IR pdb # % de # humano ratón humano accesibilidad con solvente 28 Y F H 32 33.3 125 V I I 131 0 156 M L A 163 73.9 188 T V I 195 89.3 210 S H S 217 56.1 211 A T Q 218 54 214 N D D 221 25.7 215 D N P 222 20.4 227 A T K 224 57.3 227 A K D 234 78.9 237 N G P 244 90.1 257 L P H 263 19.2 258 S N H 264 56.5 264 E D H 275 38.3 Residuo IGF1R IGF1R de INSR IR pdb # % de # humano ratón humano accesibilidad con solvente 211 G D ÍV 282 72.5 285 G S S 296 100 286 S T S 291 61.2 303 E G H 313 64.5 326 F L I 335 25.5 405 D N S 415 61.9 411 I V T 421 0.5 412 K J¾ T 422 34.1 413 A S Q 423 58.2 464 H R K 414 16.3 471 S W s 481 26.4 531 D £ Q 541 N/A 532 V G N 542 N/A 605 S T S 615 N/A 650 I 1 S N/A N/A 665 £ D INSERT N/A N/A 139 A F N/A N/A 141 L F P N/A N/A La biblioteca de correlación de epitopos de 24 mutantes se construyó al mutagenizar el plásmido PV-90 de hIGF-lR-Fc tipo silvestre usando el equipo de mutagénesis dirigido al sitio de Stratagene siguiendo los protocolos del fabricante. La incorporación de cada mutante (o doble mutante en el caso de los miembros de biblioteca SD004, SD011, SD014, SD016, y SD019) en el vector PV-90 se confirmó por una instalación interna de secuenciación de ADN . Los plásmidos se miniprepararon y maxiprepararon usando el equipo Miniprep de Qiagen y los Maxiequipos Libres de Endotoxina de Qiagen, respectivamente. Se transíectaron de manera transiente 200 µg de cada plásmido mutante en 100 mL de células T HEK293 a 2 x 106 células/mL usando el equipo de transfección PolyFect (Qiagen) para secreción de proteina soluble en los medios. Las células se cultivaron en DMEM ( IvrineScientific) , 10 % de FBS (suero bovino con baja concentración de IgG, Invitrogen, adicionalmente agotado de IgG bovina por paso sobre columna con 20 mL de proteina A) a 37 °C en una incubadora de CO2. Después de 7 días, se recolectaron los sobrenadantes que contienen cada mutante de IGF-1R-Fc por centrifugación a 1200 rpm y filtración a través de un filtro de 0.2 µ?t?. Cada mutante se purificó por afinidad por paso de los sobrenadantes sobre una columna de proteina A-Sepharose FF de 1.2 mL pre-equilibrada con 1XPBS. Los mutantes se eluyeron de la columna usando glicina 0.1 M, pH 3.0, neutralizada con Tris 1M, pH 8.5, Tween-80 al 0.1 %, y se concentraron a ~300 usando dispositivos centrífugos de concentración VivaSpin 6 M CO 30,000 (Sartorius, Cat. No. VS0521).
Análisis por Transferencia Western de mutantes de IGF-lR Muestras de hIGF-lR-Fc mutante se corrieron en geles de Tris-Glicina al 4-20 % (Invitrogen Cat. No. EC6028) usando la rainicelda Xcell Surelock (Invitrogen Cat. No. EI0001) siguiendo el protocolo normal del fabricante. Las muestras se transfirieron a nitrocelulosa usando el sistema de transferencia en seco iBlot (Invitrogen Cat. No. IB1001) y pilas de transferencia (Invitrogen Cat. No. IB3010-01 ó 3010-02) siguiendo el protocolo normal del fabricante. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4°C en 25 mi de PBST; 5 mg/ml de leche seca sin grasa. Después del bloqueo, las membranas se lavaron una vez con 25 mi de PBST durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-IGF-lRp primario (Santa Cruz Biotechnology Cat. No. sc-9038) a 1:100 en 10 mi de PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron subsiguientemente tres veces en 25 mi de PBST durante 5 minutos. Para la detección, las membranas se incubaron con un anticuerpo anti-IgG de conejo-Fc de cabra conjugado con HRP (US Biological Cat. No. I1904-40J) a una dilución 1:1000 en 10 mi de PBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces en 25 mi de PBST durante 5 minutos seguido por un lavado en 25 mi de PBST durante 20 minutos. Las bandas de proteina se detectaron usando el Sistema de Análisis de Transferencia Western Amersham ECL (GE Healthcare Cat. No. RPN2108) siguiendo el protocolo normal del fabricante.
Análisis Biacore de la Biblioteca de Mutantes IGF-IR-Fc Tanto mIGF-lR-Fc como hIGF-lR-Fc se unen con alta afinidad aparente a las superficies de chip sensor de M13-C06, M14-C03, y M14-G11 descritas anteriormente debido a su naturaleza altamente multivalente inducida por la incorporación de dos regiones homodiméricas separadas (IGF-1R e IGFl-Fc) . Para distinguir entre la real alta afinidad que une hIGF-lR-Fc a M13-C06 y la unión de baja afinidad de mlGF-ÍR-Fc a M13-C06, se capturaron las fusiones de receptor-Fc en la superficie de chip sensor de M13-c06 seguido por un evento de unión de Fab de M13-C06 soluble adicional. Las construcciones de receptor-Fc se capturaron en la superficie de chip de M13-C06 (preparada como se describe anteriormente) por inyección de 60 µL material concentrado purificado por afinidad a una velocidad de flujo de 1 µ?/min. Después, del término del paso de carga de receptor-Fc, se evaluaron las velocidades de flujo a 5 µ?/min. Se inyectaron concentraciones de Fab de M13-C06 de 10 nM, 3 nM, y 1 nM (50 µL) subsiguientes a la carga de cada construcción de receptor-Fc. Al final de cada sensograma, la velocidad de flujo se elevó a 30 µ?/min y la superficie de chip se regeneró por inyecciones de 2x10 µ? de glicina 0.1 M, pH 2.
Ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelta en tiempo (tr-FRET) para selección de mutante de IGF-1R-Fc Se mezclaron las diluciones en serie del receptor mutante, iniciando a 0.25-0.5 µg (25 µ? ) con 0.05 µg de IGF1R-Hisi0-Cy5 (12.5 µ?) y 0.00375 µg de Eu:C06 (12.5 µ?) en placas de microtítulo de 384 concavidades (blancas de Costar) . Los niveles de conjugación para IGF1R-Hisi0-Cy5 fueron Cy5:IGFlR-His10 6.8.1, y para Eu-C06 fueron Eu:C06 10.3:1. El volumen total fue 50 µ? para cada muestra. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placa. Se llevaron a cabo las mediciones de fluorescencia en un lector de placa fluorescente Wallac Víctor2 (Perkin Elmer) usando el protocolo LANCE con la longitud de onda de excitación a 340 nm y longitud de onda de emisión a 665 nm. Todos los datos se ajustaron al modelo de unión de un sitio del cual se determinaron los valores correspondientes de IC50.
Resultados La inhibición de la unión de IGF-1 y/o IGF-2 a hlGF-ÍR-Fc por M13-C06 se demostró como se describe anteriormente en el Ejemplo. Aún a condiciones saturantes, la mayoría de los anticuerpos no inhiben completamente la unión de IGF-1 o IGF-2 a hIGF-lR-Fc. Particularmente para M13-C06, se tiene como hipótesis que la inhibición de la unión a ligando debe ser no competitiva ni alostérica. Para probar esta hipótesis, se determinó la afinidad de IGF-1 para hIGF-lR-Hisi0 en la presencia o ausencia del anticuerpo M13-C06 400 nM (~ 4000 veces por arriba de la afinidad del anticuerpo para hIGF-lR-Hisio) . Usando SPR, se inmovilizó hIGF-lR-Hisi0 a superficies de chip usando un anticuerpo anti-Histag seguido por inyección de concentraciones crecientes de IGF-1 (hasta 64 nM) . La unión de IGF-1 a hIGF-lR-Hisio fue evidente en la ausencia y presencia de M13-C06 400 nM. {Datos no mostrados: Resonancia de plasmón superficial que demuestra la unión de IGF-1 a hlGF-ÍR-Hisio en la ausencia y presencia de M13-C06 400 nM. La fase de asociación de SPR estuvo entre 1400-1800 segundos en tanto que la fase de disociación estuvo entre 1800-3000 segundos. En la ausencia de M13-C06, IGF-1 se unión a hIGF-lR-Hisio con KD=17 nM (ka=2.4 x 10"5/M*s). En la presencia, de 400 nM M13-C06, IGF-1 se unión a hIGF-lR-Hisi0 con KD=59 nM (ka=7.1 x 10" 4/M*s) . La constante de velocidad de asociación cinética de la unión de IGF-1 a hIGF-lR-Hisi0 se redujo aproximadamente 3 veces en la presencia de M13-C06, sugiriendo que M13-C06 reduce de manera alostérica la afinidad del ligando para el receptor . Soportando la evidencia que M13-C06 no compite directamente con IGF-1 para la unión a hIGF-lR-Hisi0 se generó al realizar una co-inmunoprecipitación de hIGF-lR-Hisio e IGF-1 usando M13-C06 a concentraciones bien por arriba de las afinidades aparentes tanto de IGF-1 como de M13-C06 para hlGF-ÍR-Hisio. el análisis de transferencia Western demostró que ~70-100 % del material de IGF-1 mezclado con hIGF-lR-Hisi0 se rebajo con M13-C06, demostrando de este modo que el coacoplamiento de M13-C06 y IGF-1 con hIGF-lR-Hisio para formar el complejo ternario es posible (datos no mostrados). Estos resultados demuestran la naturaleza alostérica de la inhibición de M13-C06 de la unión de IGF-1 a concentraciones normales en suero de IGF-1 y sugiere que el sitio de unión de M13-C06 no se traslapa con la cavidad de unión a ligando de IGF-IR. Entonces, se investigó si M13-C06 se une a los dominios de unión a ligando putativos de IGF-IR (L1-CR-L2) . Se generó una versión truncada del receptor que contiene los tres dominios N-terminales (residuos 1-462) fusionados a una IgGl-Fc y se comparó su capacidad para unirse a M13-C06, M14-C03 y M14-G11 a aquella de la construcción de ectodominio de receptor de longitud completa, hIGF-lR-Fc, usando resonancia de plasmón superficial (SPR). MI 4 -Gil demostró unión equivalente a la versión truncada del receptor, en tanto que se redujo dramáticamente la unión de M13-C06 y M14-C03. {Datos no mostrados: los anticuerpos M13-C06, M14-C03, y M14-G11 inmovilizados en superficie se probaron para la unión a hIGF-lR ( 1-903 ) Fe y h I G F- 1 R ( 1 - 462 ) - Fe truncado a concentraciones que varían de 2 µ?; 100 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM, y 1 nM . La fase de asociación de SPR estuvo entre 480-960 en tanto que la fase de disociación estuvo entre 960-1170 segundos) . La unión residual fue evidente tanto para M13-06 y M14-C03; sin embargo, los datos sugieren que al menos una buena porción de los epítopos de estos anticuerpos reside en una región de IGF-1R fuera de los dominios de unión a ligando. Se utilizó el hecho que IGF-1R murino no se une al anticuerpo de M13-C06 para diseñar una biblioteca de mutaciones de ratón dentro de hIGF-lR-Fc para valorar la ubicación del sitio de unión de M13-C06 en IGF-1R. Las varias mutaciones en hIGF-lR probado se muestran en la Tabla 17. Se usó análisis de transferencia Western para confirmar la expresión de cada mutante de hIGF-lR-Fc y para desarrollar una curva normal para aproximar la concentración relativa de cada proteína mutante; usando hIGF-lR-Fc purificado como un control positivo (datos no mostrados).
Tabla 17: Efecto de mutaciones en unión de IGF-1R a M13-C06. SD015 se pone en negritas puesto que fue el único residuo en demostrar poca o ninguna unión a M13-C06 en los dos formatos de ensayo. ND = no determinado Número de Mutan es RUmax Valores de Mutación Individuales Relativa en IC50 ^g/ml) Biacore SD T Tipo 1.0 1.5 silvestre mIGFIR _ 0.0 >100 SD001 Y28A 0.6 1.0 SD002 M156A 1.2 0.3 SD003 T188F 1.0 0.2 SD004 S210H_A211Q 0.8 ND SD005 A217T 0.9 ND SD006 A227K 1.7 0.2 SD007 N237G 1.3 <0.1 SD008 S258F 1.5 <0.1 SD009 E264K 0.6 7.7 SD0010 G271D 0.8 0.1 SD0011 G285S_S286T 1.8 <0.1 SD0012 E303G 0.3 0.9 SD0013 D405K 0.7 <0.1 SD0014 412A_A413Q 0.6 <0.1 Número de Mutantes RUmax Valores de Mutación Individuales Relativa en IC50 ^g/ml) Biacore SD0015 H464E 0.04 >100 SD0016 D531Q_V532N 2.0 0.1 SD0017 I650S 2.0 0.2 ¦ SD0018 E665A 1.7 <0.1 SD0019 A739W I741F 1.9 0.2 Se usó SPR y tr-FRET para seleccionar mutaciones que inhiben la unión de IGF-1R-Fc a M13-C06. Excepto por el mutante de SD05, todas las construcciones mutantes de IGF-1R demostraron actividad de unión de M13-C05, o actividad de unión de Fab de M13-c06 en los experimentos de SPR. Ver: Figuras 28a-28d; Tabla 17; y, datos no mostrados (se usó análisis de unión competitiva para establecer curvas de unión para el desplazamiento de Eu- 13-C06 unido a IGF1R marcado con Cy5 al incrementar las concentraciones de hIGFIR-Fc no marcado (SDWT) , IGF1R-Fc de ratón ( IGF1R-Fc y construcciones de hIGFIR-Fc mutante . Hubo alguna desviación en los valores de IC50 determinados usando tr-FRET y concentraciones de unión relativa determinadas usando SPR debido a las variaciones naturales en la expresión y cuan t i f i cae i ón por transferencia Western; sin embargo, SD015 fue el único mutante en demostrar virtualmente ninguna actividad de unión hacia M13-C06 en ambos ensayos y paralelo a los resultados determinados para el control de mlGF-ÍR-Fc. Se localiza His464 2 aminoácidos C-terminal en la secuencia de aminoácidos primaria al C-término de la versión truncada de la construcción de hIGF-lR-Fc (es decir, hIGF-lR (1-462) -Fe) . La actividad de unión residual de M13-C06 a hIGF-lR truncado (1-462) sugiere que el epitopo de unión de 13-C06 abarca de manera mínima los residuos Va 1 62 - H i s 464. Probablemente, están comprendidos residuos adicionales en la interacción de unión de an t i cue rpo - ep í t opo puesto que la evidencia indica que el epitopo de M13-C06 es conformacionalmente dependiente. De manera notable, sin embargo, los residuos Val462 y His464 se predice que residen en la superficie exterior del dominio FnIII-1 (Figuras 29a-29c) . En un intento para caracterizar el grado del epitopo de M13-C06 (es decir, que los residuos periféricos a 462-464 son importantes para la unión y actividad del anticuerpo) , se tomó un planteamiento de modelado estructural. El IGF-1R humano e INSR humano comparten 57 % de identidad (73 % de similitud) y una estructura terciaria similar. Los análisis previos de la superficie de unión de an t i geno : an t i cue rpo de proteina de estructura cristalina de rayos X ah sugerido una superficie de unión promedio de 700 Á2 (ángstrom al cuadrado) con un radio aproximado de 14 Á desde el centro del epitopo de unión (Davies 1996) . Usando la estructura cristalina de rayos x del ectodominio homólogo de INSR (pdb code sDTG, (McKern 200) ) , se calcularon los residuos en la superficie del dominio FnIII-1 dentro de un radio de 14 Á de los residuos 462-464 al correlacionar los residuos V462 hasta H464 de IGF-1R a los residuos L472 y K474 de INSR. El corte de la distancia se aplicó para cualquier distancia de átomo a átomo dentro de 14 Á, en tanto que se calculó una distancia promedio de la distancia Ca a Ca de L472 y K474 a cada residuo dentro del parche de superficie. La distancia promedio calculada se lista como 14 Á para los residuos para los cuales la distancia de Ca a Ca fue mayor que 14 Á pero los cuales las cadenas laterales están dentro del corte de 14 Á. Los residuos de importancia probable para la actividad y unión de M13-C06 se listan en la Tabla 18.
Tabla 18. Residuos dentro de IGF-IR previstos como importantes para la actividad y unión de M13-C06. Los residuos 464 y 462 se ponen en cursivas puesto que representan el centro previsto del epitopo de unión de IGF-IR y los datos experimentales demuestran la importancia de estos residuos en la unión de M13-C06 Residuo Accesibilidad Residuo Distancia Distancia Distancia AA de de superficie AA de a 472 (Á) a 474 (Á) promedio IR # IGF1R, # (Ca a Ca) (Ca a Ca) (A) (2DTG) S437 0.477792 S 427 13.785 14 13.8925 E438 0.337716 E 428 14 14 14 E469 0.320544 E 459 9.95 14 11.975 N470 0.8196 S 460 6.29 12.42 9.355 E471 0.349164 D 461 3.79 9.57 6.68 £472 0.475107 V 462 6.25 6.25 K474 0.646513 H 464 6.25 14 10.125 S476 0.477792 T 466 12.45 6.43 9.44 Y477 0.524048 s 467 14 9.15 11.575 1478 0.5405 T 468 14 11.03 12.515 R479 0.362378 T 469 14 14 14 R488 0.375476 T 478 13.98 8.75 11.365 E490 0.37206 H 480 9.18 5.84 7.51 Y492 0.313493 Y 482 10.45 11.24 10.845 W493 0.87318 R 483 11.17 13.03 12.1 P495 0.824499 P 485 14 14 14 D496 1 D 486 14 14 14 E509 0.520884 E 499 14 14 14 Q513 0.515108 K 503 14 14 14 N514 0.68983 N 504 14 14 14 V515 0.644094 V 505 14 14 14 K544 0.865258 N 529 14 14 14 S545 0.699624 K 530 14 14 14 Q546 1 D 531 14 14 14 N547 0.87424 V 532 14 14 14 H548 0.406778 E 533 14 10.89 12.445 W551 0.523908 I 536 14 14 14 R577 0.41477 H 563 14 14 14 T578 0.43254 I 564 13.19 14 13.595 Y579 0.603591 R 565 9.54 14 11.77 K582 0.34027 K 568 5.54 8.98 7.26 D584 0.602475 E 570 7.01 7.4 7.205 1585 0.340515 I 571 10.79 10 10.395 1586 0.308085 L 572 13.04 10.49 11.765 Y587 0.580196 Y 573 14 13.65 13.825 El trabajo publicado ha mostrado que los anticuerpos que reconocen los residuos 440-586 pueden ser tanto inhibitorios como agonísticos a la unión de IGF-1 (Soos 1992; eynhanfar 2007). 44-586 representan todo de L2 y FnIII-1 con muchas superficies potenciales de no traslape accesibles a los anticuerpos anti-IGF-lR. El presente estudio es el primes estudio que estuvo conciente de donde se a correlacionado el epítopo inhibitorio de IGF-1R a un residuo particular. Se co-cristalizó une estructura reciente de INSR con al anticuerpo anti-INSR conocido que inhibe la unión de insulina a su receptor (Soos 1986; McKern 2006). El residuo homólogo a His464 de IGF-1R ( (K474 de INSR) es parte de la superficie de unión de este anticuerpo con INSR. Es posible que M13-C06 comparta un mecanismo inhibitorio similar para inhibir la unión de IGF-1 a IGF-1R como el anticuerpo anti-INSR antagonista .
E emplo 28 Anticuerpo M13. C06. G . P . agly localiza de manera efectiva in vivo células de tumor, inhibe la expresión de Ki67, y reduce la expresión de IGF-1R Anticuerpo M13. C06. G4. P. agly localiza de manera efectiva células de tumor in vivo. Métodos : Se inyectaron ratones Beige SCID con 2xl06 células MCF-7 (en matrigel) en la presencia de estrógeno (sedimento de 0.36 mg, liberación de 90 días (Innovative Research of America) ) . Se cultivaron los tumores a 300-500mm3, luego los ratones se inyectaron de manera intraperitoneal con 30 mg/kg de el anticuerpo M13. C06. G4. P. agly . Los ratones se sacrificaron y se removieron los tumores a las 2, 6, 12, 24 y 48 horas después de la inyección congelada en OCT y se seccionaron a ßµ?t? para análisis inmunohistoquimico (IHC). Se escindió un tumor sin inyección de anticuerpo como un control. Los tumores se congelaron en OCT y se seccionaron a ßµp? para IHC. El sustrato es el Vector VIP, una tinción púrpura. Se detectó el anticuerpo unido usando H+L IgG anti-humana de cabra (Human Elite ABC kit, Vetor Labs) en tumores tratados con M13. C06. G . P. agly o IDEC151 (anticuerpo de control negativo) . SE detectó la expresión de IGF-1R usando un Mab de a-IGF-lR (clon 24-31, NeoMarkers /Lab Vision) en tumores tratados con M13. C06. G4. P . agly o IDEC151. Se llevaron a cabo estudios similares en el modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático BxPC3. Resultados (datos no mostrados): Experimentos de eficiencia in vivo usando modelos de xenoinjerto de tumor de mama MCF-7 o pancreático BxPC3 revelaron que la inyección intraperitoneal de M13. C06. G4. P . agly fue efectiva en la inhibición de crecimiento de células tumorales a 30 y 15 mg/kg. Se realizó un experimento de curso de tiempo para estudiar la farmacodinámica de una dosis individual de M13. C06. G4. P . agly en ya sea ratones que tienen tumor de MCF-7 o BxPC3, respectivamente. M13. C06. G4. P . agly localizó tumores tan pronto como 6 horas después del tratamiento, con localización máxima a 48 horas como se determina por análisis inmunohistoquimico (IHC). La expresión de IGF-1R como se determina por análisis Western e IHC mostró pérdida significativa de IGF-1R en tumores tratados con M 13. C 06. G . P . a gl y 6 horas después del tratamiento, en tanto que pérdida casi completa de IGF-1R a 24 horas. No se observó cambio en tumores tratados con anticuerpo de control correspondido en isotipo. El análisis de los lisados tumorales para rutas de señalización reveló reducción transiente momentánea de Erk y Akt fosforilado en 2-12 horas.
Anticuerpo M13. C06. G4. P. agly inhibe la expresión de KÍ67 La tinción de Ki67 de tumores tratados con M13. C06. G4. P . agly también mostró un número reducido de células proliferantes en comparación a tumores tratados con anticuerpo de control (datos no mostrados) . Estos datos indican que M13. C06. G4. P . agly localiza de manera efectiva tumores in vivo, e inhibe el crecimiento tumoral al reducir la expresión de IGF-1R y por inhibición de la señalización mediada por IGF-1R.
M13. C06. G . P. agly reduce la expresión y degrada IGF-IR en tumores Se inraunotransfirió IGF-IR de lisados de tumores de ratón de SCID generados con células pancreáticas humanas (BxPC3; Figura 30a) y células de cáncer de mama (MCF-7; Figura 30b) . Los tumores se escindieron en puntos de tiempo designados después del tratamiento con M13. C06. G . P. agly o anticuerpo de control negativo de IDEC-151. Los tumores se congelaron a presión, se pulverizaron y Usaron. La concentración de proteina de los lisados de células tumorales se normalizó y se separó en gel NuPAGEMR al 4-12 % (Invitrogen Inc., SD, CA) . El gel se transfirió a filtro de celulosa, se sondeo con anti-IGF-lRp policlonal y se detectó por reacción enzimática con anticuerpo anti-peroxidasa de rábano de conejo. Los resultados muestran que 13. C06. G . P . agly dio por resultado reducción de la expresión y degradación de IGF-IR en comparación a anticuerpo de control negativo.
Ejemplo 29 Anticuerpo M13. CP 6. G . P . agly demuestra actividad anti-tumoral in vivo en una variedad de sistemas de modelo tumoral Además de la inhibición in vivo del crecimiento tumoral demostrado para M13. C06. G . P . agly en sistemas de modelo de pulmón y pancreático como se describe en los ejemplos anteriores, los siguientes experimentos demuestran adicionalmente la diversidad de los modelos de células tumorales en los cuales M13. C06. G4. P. agly exhibe actividad.
Actividad anti-tumoral de M13. CP 6. G4. P. agly en tumores generados con células de carcinoma pancreático MiaPaCa2 Se inocularon ratones SCID hembras en el flanco derecho con 2xl06 células de carcinoma pancreático (BD Biosciences ) /PBS en Matrigel al 50 %. Se dejó que los tumores alcanzan un volumen de 150mm3 (LxW2/2) y los ratones se clasificaron y dosificaron de manera intraperitoneal con el agente individual (anticuerpo solo) y tratamientos de combinación (anticuerpo M13. C06. G4. P . agly y gencitabina) la gencitabina sola (20mg/kg, Q4D x 3) y en combinación con Ml3.C06.G4.P.agly (30 mg/kg) asi como M13. C06. G4. P . agly solo (tanto a 15 mg/kg como 30 mg/kg; 1 x semana x 6) inhibió el crecimiento tumoral. Además de gencitabina, también se pueden probar y usar muchas otras terapias de combinación en unión con los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, las terapias de combinación de los compuestos en las siguientes categorías, para listar un pequeño muestro de ejemplo, se puede utilizar con los anticuerpos de la presente ¦ invención . Inhibidores de tirosina-cinasa de EGFR, por ejemplo: Tarceva (Erlotinib) Iressa (Gefitinib) Anticuerpote EGFR, por ejemplo: Erbitux (cetuximab) Victibix (panitumumab) Inhibidores de mTOR, por ejemplo: temsirolimus rapamicina y otros compuestos anti-cáncer, por ejemplo: Geevec (Imatinib) Sutent (Sunitinib) Sorafenib (Bay-439006) SAHA (inhibidor de HDAC) Inhibidores de HSP90 M200 (Volociximab) Actividad anti-tumoral de M13. C06. G4. P. agly en tumores generados con células derivadas de un adenocarcinoma primario de colon humano Se inocularon ratones SCID hembras en el flanco derecho con lmm3 de fragmentos de tumor de colon. El fragmento tumoral se derivó por paso en serie (5x) del tejido de tumor de colon obtenido después de recepción quirúrgica de un tumor de un paciente con adenocarcinoma de colon. Se dejó que los tumores alcanzaran un volumen de 150mm3 (Lx 2/2) y los ratones se clasificaron y dosificaron con los tratamientos indicados (n=6) (Figura 31). Los anticuerpos se dosificaron a 15 mg/kg o Mg/kg de manera intraperitoneal lx por semana. Resultados : M13. C06. G . P. agly inhibió de manera efectiva el crecimiento del tumor de colon primario (CT3) en ratones SCID (Figura 31) . Actividad anti-tumoral de M13. C06. G4. P. agly de tumores tratados con células de carcinoma de mama MCF-7 Se inocularon ratones Beige SCID hembras en el flanco derecho con 2xl06 células MCF-7 (dependientes de estrógeno) en Matrigel al 50 %/PBS. Se implantó un gránulo de estradiol en el flanco izquierdo 24 horas antes de la inoculación celular (0.36mg de estradiol en gránulo, liberación de 90 días (Innovative Research of America)). Se dejó que los tumores alcanzaran un volumen de 150mm3 (LxW2/2) y los ratones se clasificaron y dosificaron con los tratamientos indicados (n=10) (Figura 32). Se dosificaron intraperitonealmente lx/semana a los anticuerpos, en tanto que se dosificó Citrato de Tamoxifeno (Sigma Inc.), en aceite de cacahuate de forma subcutánea 5 veces por semana para cada régimen. Se realizó el análisis estadístico usando la prueba t de student apareada. Resultados : M13. C06. G . P . agly inhibió de manera efectiva el crecimiento de tumores de carcinoma de mama MCF-7 ( Figura 32 ) . Por supuesto, la eficiencia inhibidora tumoral de los anticuerpos de la invención también se puede probar fácilmente en numerosos tipos celulares diferentes de cáncer (tal como: las lineas H-1299, H460, H-23 de células de cáncer pulmonar; las lineas Colo205 y HT-29 de células de cáncer de colon; las lineas de células de cáncer pancreático tal como Panc-1; y, las lineas de células de cáncer de próstata tal como PC-3 por nombrar un pequeño muestreo de ejemplo) .
Ejemplo 30 Anticuerpo M13. C06. G . P . agly no exhibe actividad de ADCC in vi tro Método : Se purificaron células mononucleares de sangre periférica humana a partir de sangre entera heparinizada por separación en placa Ficoll normal. Las células se re-suspendieron en el medio RMPI1640 de GIBCOMR que contiene 10 % de FBS y 200 U/ml de IL-2 humana y se incubó durante la noche a 37°C. El siguiente día, las células se recolectaron y lavaron una vez en el medio de cultivo y se re-suspendieron a 1 X 107 células/ml. Se incubaron las células objetivo (MCF-7, células de carcinoma de mama) con ???µ?? de 51Cr, durante 1 hora a 37°C. Las células objetivo se lavaron una vez para remover el 51Cr no incorporado, y se colocaron en placa a un volumen de 1 x 104 células/concavidad. Las células objetivo se incubaron con 50 µ? de células efectoras y 50 µ? de anticuerpo. Se usó una relación de objetivo a efector de 1:50 a todo lo largo de los experimentos. Los controles incluidos se incubaron con y sin anticuerpos, estos incluyen M13. C06. G4. P . agly, Herceptina (control positivo) e IDEC-151 (control negativo, anticuerpo monoclonal de IGG1° quimérico de macaco/humano especifico a CD4) . Después de una incubación de 4 horas 37°C, los sobrenadantes se recolectaron y contaron en un contador gamm (Isodata Gamma Counter, Packard Instruments). El % de lisis se determinó usando el siguiente cálculo: % de lisis = [Liberación de Muestra (CPM) liberación espontánea (CPM) ] + [Liberación Máxima (CPM) liberación espontánea (CPM) ] x 100 %. Resultados : En contraste al control positivo de anticuerpo de Herceptina, los anticuerpos M13-C06 ni IDEC-151 exhibieron actividad de ADCC, indicando de este modo una carencia de la fusión efectora para estos anticuerpos finales ( Figura 33 ) .
Ejemplo 31 Tratamiento de cáncer humano usando anticuerpos anti-IGF-lR Este ejemplo describe métodos para tratar cáncer usando anticuerpos contra IGF-1R para seleccionar como objetivo células malignas, por ejemplo, células hiperproliferantes en las cuales se ha detectado la expresión de IGF-1R. En ciertas modalidades, el anticuerpo M13. C06. G4. P . agly (u otro anticuerpo de la presente invención) se purifica y formula con un vehículo farmacéutico adecuado para inyección. Un paciente humano con un trastorno hiperproliferativo se dosifica múltiples veces con el anticuerpo M13. C06. G4. P . agly (u otro anticuerpo de la presente invención) por infusión intravenosa a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, una vez por cada dos semanas o una vez por mes, durante al menos seis meses. También, los intervalos pueden ser irregulares como se indica al medir los indicadores de pronóstico en el paciente. Se pueden administrar los anticuerpos antes, concurrentes con, o después de los regímenes normales de radioterapia como se describe en la presente. El paciente se monitoriza para determinar si el tratamiento da por resultado una respuesta anti-tumoral , por ejemplo, en base a la regresión tumoral, a la reducción en los índices de nuevos tumores, a la menor expresión de antígeno tumoral, o a otros medios para evaluar la prognosis de la enfermedad.
Referencias Brezinsky, S. C. G., Chiang, G.G., Szilvasi, A., Mohán, S., Shapiro, R.I., MacLean, A., Sisk, W., y Thill, G. (2003) . "A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity . " J. Immunol. Methods 277: 141-155. Davies, D. R., y Cohén, G.H. (1996). " Interactions of protein antigens with antibodies." Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 93: 7-12. Demarest, S.J., Chen, G., immel, RE., Gustafson, D., Wu, J., Salbato, J. , Poland, J. , Short, J. , Hansen, G. (2006) Protein Engng. Des. Select. 19, 325-336. Demarest, S. J. , Hopp, J. , Chung, J. , Hathaway, K. , Mertsching, E., Cao, X., George, J. , Miatkowski, K., LaBarre, M.J., Shields, M . , y Kehry, M.R. (2006). "An intermedíate pH unfolding transition abrogates the ability of IgE to interact with its high affinity receptor FceRIa." J. Biol . Chem. 281: 30755-30767. Keynhanfar, M., Booker, G.W., Whittaker, J. , Wallace, J.C., y Forbes, B.E. (2007). "Precise mapping of an IGF-l-binding site on IGF-IR." Biochem. J. 401: 269-277. McKern, N. M . , Lawrence, M.C., Streltsov, V.A., Lou, M.-Z., Adams, T.E., Lovrecz, G.O., Elleman, T.C., Richards, K.M., Bentley, J.D., Pilling, P., Hoyne, P.A., Cartledge, K.A., Pham, T.M., Lewis, J.L., Sankovich, S.E., Stoichevska, V., Da Silva, E., Robinson, CP., Frenkel, M.J., Sparrow, L.G., Fernley, R.T., Epa, V.C., y ard, C. . (2006). "Structure of the insulin receptor ectodomain reveáis a folded-over conformation . " Nature 443: 218-221. McKern, N. M., Lou. M., Frenkel, M.J., Verkuylen, A., Bentley, J.D., Lovrecz, G.O., Ivancic, N., Elleman, T.C., Garrett, T.P.J., Cosgrove, L.J., y Ward, C.W. (1997). "Crystallization of the first three domains of the human insulin-like growth factor-1 receptor." Protein Sci . 6:2663-2666. Soos, M. A., Field, CE., Lammers, R. , Ullrich, A., Zhang, B., Roth, R.A., Andersen, A.S., Kjeldsen, T., Siddle, K. (1992). "A panel of monoclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor." J. Biol. Chem. 267: 12955-12963. Soos, M. A., Siddle, K., Barón, M.D., Heward, J.M., Luzio, J.P., Bellatin, J., y Lennox, E.S. (1986) . "Monoclonal antibodies reacting with múltiple epitopes on the human insulin receptor." Biochem. J. 235:199-208. Sorensen, H., Whittaker, L., Hinrichsen, J. , Groth, A., y Whittaker, J. (2004). "Mapping of the insulin-like growth factor II binding site of the Type I insulin-like growth factor receptor by alanine scanning mutagenesis . " FEBS Lett . 565: 19-22. Whittaker, J., Groth, A.V., Mynarcik, D.C., Pluzek, L., Gadsboll, V.L., y Whittaker, L.J. (2001). "Alanine scanning mutagenesis of a type 1 insulin-like growth factor receptor ligand binding site." J. Biol. Chem. 276: 43980- 43986. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (266)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica al mismo epitopo del receptor 1 de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-R1) como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  2. 2. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, que se une de manera especifica a IGF-R1, el anticuerpo o fragmento del mismo está caracterizado porque inhibe competitivamente un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, 14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8 de la unión a IGF-R1.
  3. 3. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a IGF-R1, el anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio de unión a antigeno idéntico a aquel de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  4. 4. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que cosiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63.
  5. 5. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que cosiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118.
  6. 6. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto por 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que cosiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63.
  7. 7. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos idéntica, excepto por 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que cosiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118.
  8. 8. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63.
  9. 9. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118.
  10. 10. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH y VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 118.
  11. 11. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH y VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos idénticas, excepto por 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos cada una, las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 118.
  12. 12. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une específicamente a IGF-R1, caracterizado porque la VH y VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprenden, respectivamente, secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 118.
  13. 13. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (VH-CDR1) de Kabat idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64.
  14. 14. Anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64.
  15. 15. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de complementariedad de cadena pesada (VH-CDR2) de Kabat idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65.
  16. 16. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65.
  17. 17. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de complementariedad de cadena pesada (VH-CDR3) de Kabat idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66.
  18. 18. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66.
  19. 19. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-Rl, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de complementariedad de cadena ligera (VL-CDR1) de Kabat idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 119.
  20. 20. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 119.
  21. 21. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de complementariedad de cadena ligera (VL-CDR2) de Kabat idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 120.
  22. 22. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 120.
  23. 23. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de complementariedad de cadena ligera (VL-CDR3) de Kabat idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121.
  24. 24. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121.
  25. 25. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 5, 6, y 7; SEQ ID Nos: 10, 11, y 12; SEQ ID Nos: 15, 16, y 17; SEQ ID Nos: 21, 22, y 23; SEQ ID Nos: 27, 28, y 29; SEQ ID Nos: 33, 34, y 35; SEQ ID Nos: 39, 40, y 41; SEQ ID Nos: 44, 45, y 46; SEQ ID Nos: 49, 50, y 51; SEQ ID Nos: 54, 55, y 56; SEQ ID Nos: 59, 60, y 61; y SEQ ID Nos: 64, 65, y 66, excepto por una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en al menos una de las VH-CDR.
  26. 26. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VH del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 5, 6, y 7; SEQ ID Nos: 10, 11, y 12; SEQ ID Nos: 15, 16, y 17; SEQ ID Nos: 21, 22, y 23; SEQ ID Nos: 27, 28, y 29; SEQ ID Nos: 33, 34, y 35; SEQ ID Nos: 39, 40, y 41; SEQ ID Nos: 44, 45, y 46; SEQ ID Nos: 49, 50, y 51; SEQ ID Nos: 54, 55, y 56; SEQ ID Nos: 59, 60, y 61; y SEQ ID Nos: 64, 65, y 66.
  27. 27. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, y VL-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 69, 70, y 71; SEQ ID Nos: 74, 75, y 76; SEQ ID Nos: 79, 80, y 81; SEQ ID Nos: 84, 85, y 86; SEQ ID Nos: 89, 90, y 91; SEQ ID Nos: 94, 95, y 96; SEQ ID Nos: 99, 100, y 101; SEQ ID Nos: 104, 105, y 106; SEQ ID Nos: 109, 110, y 111; SEQ ID Nos: 114, 115, y 116; y SEQ ID Nos: 119, 120, y 121 excepto por una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en al menos una de las VL-CDR.
  28. 28. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-R1, caracterizado porque la VL del anticuerpo o fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, y VL-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 69, 70, y 71; SEQ ID Nos: 74, 75, y 76; SEQ ID Nos: 79, 80, y 81; SEQ ID Nos: 84, 85, y 86; SEQ ID Nos: 89, 90, y 91; SEQ ID Nos: 94, 95, y 96; SEQ ID Nos: 99, 100, y 101; SEQ ID Nos: 104, 105, y 106; SEQ ID Nos: 109, 110, y 111; SEQ ID Nos: 114, 115, y 116; y SEQ ID Nos: 119, 120, y 121.
  29. 29. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque las regiones de estructura alterna de VH son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos.
  30. 30. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque las regiones de estructura alterna de VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos.
  31. 31. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracteri ado porque se une a un epitopo conformacional no lineal.
  32. 32. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende el residuo de aminoácido valina 462.
  33. 33. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende el residuo de aminoácido histidina 464.
  34. 34. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende los residuos de aminoácido, valina 462 e histidina 464.
  35. 35. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende un radio de superficie accesible a solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 angstroms del residuo valina 462.
  36. 36. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende un radio de superficie accesible a solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 angstroms del residuo histidina 464.
  37. 37. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende un radio de superficie accesible a solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 angstroms de los residuos valina 462 e histidina 464.
  38. 38. Anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo, caracterizado porque se une de manera especifica a un epitopo de IGF-R1 que comprende un radio de superficie accesible a solvente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 angstroms del centro de los residuos valina 462 e histidina 464 de IGF-1R humano.
  39. 39. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque se une a un epitopo lineal.
  40. 40. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, caracterizado porque es uno multivalente , y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras.
  41. 41. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, caracterizado porque es multiespecifico .
  42. 42. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque es biespecifico .
  43. 43. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, caracterizado porque es biespecifico
  44. 44. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesa y ligera son completamente humanos.
  45. 45. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04.
  46. 46. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son murinos .
  47. 47. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  48. 48. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43 y 46-47, caracterizado porque está humanizado.
  49. 49. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43 y 46-47, caracterizado porque es quimérico.
  50. 50. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43 y 46-47, caracterizado porque está primatizado.
  51. 51. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45, caracterizado porque es completamente humano.
  52. 52. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, caracterizado porque es un fragmento Fab.
  53. 53. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, caracterizado porque es un fragmento Fab' .
  54. 54. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, caracterizado porque es un fragmento F(ab)2.
  55. 55. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, caracterizado porque es un fragmento Fv.
  56. 56. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51, caracterizado porque es un anticuerpo de cadena individual.
  57. 57. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54 y 56, caracterizado porque comprende regiones constantes de cadena ligera seleccionadas del grupo que consiste de una región constante kappa humana y una región constante lambda humana.
  58. 58. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54 y 56, caracterizado porque comprende una región constante de cadena pesada o fragmento de la misma.
  59. 59. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la región constante de cadena pesada o fragmento de la misma es IgG4 humana .
  60. 60. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación .
  61. 61. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque las mutaciones comprenden S241P y T318A usado el sistema de numeración de Kabat .
  62. 62. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, caracterizado porque se une de manera especifica a un polipéptido de IGF-R1 o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-R1, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) que es menor que la KD para el anticuerpo monoclonal de referencia.
  63. 63. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62, caracterizado porque se une de manera específica a un polipéptido de IGF-R1 o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-R1, con una afinidad distinguida por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2 M, 10"2 M, 5 x 10"3 , 10"3 M, 5 x 1CT4 M, 10~4 M, 5 x 1CT5 M, 10"5 M, 5 x 10"6 M, 10"6 M, 5 x 1CT7 M, 10"7 M, 5 x 1(G8 M, 10"8 M, 5 x 10"9 M, 1(G9 M, 5 x 10~10 M, 1(G10 M, 5 x 10"11 M, ÍCT11 M, 5 x 10"12 M, 10"12 M, 5 x 10"13 M, 10"13 M, 5 x 10~14 M, 10~14 M, 5 x 10"15 M ó 10"15 M.
  64. 64. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 63, caracterizado porque la afinidad se distingue por una constante de disociación (KD) en el intervalo de aproximadamente 1 x 10"10 a aproximadamente 5 x ICT9 M.
  65. 65. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 64, caracterizado porque la afinidad se distingue por una constante de disociación (KD) seleccionada del grupo que consiste de: (a) aproximadamente 1.1 x 10~10 M; (b) aproximadamente 1.3 x ICT10 M; (c) aproximadamente 3.6 x 10"10 M; (d) aproximadamente 1.3 x 10~9 M; (e) aproximadamente 4.0 x 10"9 M; y, (f) aproximadamente 4.9 x 10~9 M.
  66. 66. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 65, caracterizado porque la afinidad se distingue por una constante de disociación (KD) seleccionada del grupo que consiste de: (a) 1.1 x 10"10 M; (b) 1.3 x 10"10 M; (c) 3.6 x 10~10 M; (d) 1.3 x 10~9 M; (e) 4.0 x 10"9 M; y (f ) 4.9 x 10~9 M.
  67. 67. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66, caracterizado porque se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-Rl murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o fragmento del mismo.
  68. 68. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66, caracterizado porque se une a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, y también se une a un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o un fragmento del mismo.
  69. 69. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 68, caracterizado porque se une a IGF-Rl expresado en la superficie de una célula .
  70. 70. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral, o una célula raetastásica.
  71. 71. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 70, caracterizado porque bloquea el factor de crecimiento de insulina de la unión a IGF-R1.
  72. 72. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el factor de crecimiento de insulina es factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1) .
  73. 73. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el factor de crecimiento de insulina es factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2) .
  74. 74. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque bloquea tanto IGF-1 como IGF-2 de la unión a IGF-R1.
  75. 75. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74, caracterizado porque inhibe la proliferación celular mediada por IGF-R1.
  76. 76. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 75, caracterizado porque inhibe la fosforilación de IGF-R1 mediada por IGF-1 o IGF-2.
  77. 77. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, caracterizado porque inhibe el crecimiento de células tumorales.
  78. 78. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 77, caracterizado porque inhibe la internalización de IGF-R1.
  79. 79. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 78, caracterizado porque comprende además un polipéptido heterólogo fusionado al mismo .
  80. 80. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 79, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, un modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG), y una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes.
  81. 81. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, una biotoxina, una toxina enzimáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos.
  82. 82. Anticuerpo o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente, una marca radioactiva, o una combinación de dos o más de cualquiera de las marcas detectables.
  83. 83. Composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 82, y un portador.
  84. 84. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VH de anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos de este polipéptido de VH es al menos 90 % idéntica ' a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende este polipéptido de VH se une de manera especifica a IGF-R1.
  85. 85. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63.
  86. 86. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 84 u 85, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de VH se optimiza para expresión incrementada sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VH.
  87. 87. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque la optimización comprende identificación y remoción de los sitios donadores de empalme y aceptadores de empalme.
  88. 88. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 86 u 87, caracterizado porque la optimización comprende la optimización del uso de codones para las células que expresan el polinucleótido.
  89. 89. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 88, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 62.
  90. 90. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos de este polipéptido de VL es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 118; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende este polipéptido de VL se une de manera especifica a IGF-R1.
  91. 91. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 118.
  92. 92. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 90 ó 91, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de VL se optimiza para expresión incrementada sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VL .
  93. 93. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la optimización comprende identificación y remoción de los sitios donadores de empalme y aceptadores de empalme.
  94. 94. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 92 ó 93, caracterizado porque la optimización comprende optimización del uso de codones para las células que expresan el polinucleótido.
  95. 95. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 94, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 117.
  96. 96. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VH de anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos de este polipéptido de VH es idéntica, excepto por 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácido, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, y SEQ ID NO: 63; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende este polipéptido de VH se une de manera específica a IGF-R1.
  97. 97. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos de este polipéptido de VL es idéntica, excepto por 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácido, a una secuencia de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 113, y SEQ ID NO: 118; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende este polipéptido de VL se une de manera especifica a IGF-R1.
  98. 98. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDRl idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDRl de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 64; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende esta VH-CDRl se une de manera específica a IGF-R1.
  99. 99. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR1 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 6 .
  100. 100. Polinucleótido asilado, caracterizado porque comprende una ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VH-CDR2 se une de manera especifica a IGF-R1.
  101. 101. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 65.
  102. 102. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VH-CDR3 se une de manera especifica a IGF-R1.
  103. 103. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VH-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 66.
  104. 104. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR1 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 119; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VL-CDRl se une de manera especifica a IGF-Rl .
  105. 105. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDRl se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 119.
  106. 106. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 idéntica, excepto por dos o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 120; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VL-CDR2 se une de manera especifica a IGF-Rl .
  107. 107. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 115 y SEQ ID NO: 120.
  108. 108. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 idéntica, excepto por cuatro o menos sustituciones de aminoácidos, a una secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-Rl .
  109. 109. Polinucleótido o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de VL-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 121.
  110. 110. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VH de anticuerpo, en donde este polipéptido de VH comprende las secuencias de aminoácidos de VH-CDRl, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 5, 6, y 7; SEQ ID Nos: 10, 11, y 12; SEQ ID Nos: 15, 16, y 17; SEQ ID Nos: 21, 22, y 23; SEQ ID Nos: 27, 28, y 29; SEQ ID Nos: 33, 34, y 35; SEQ ID Nos: 39, 40, y 41; SEQ ID Nos: 44, 45, y 46; SEQ ID Nos: 49, 50, y 51; SEQ ID Nos: 54, 55, y 56; SEQ ID Nos: 59, 60, y 61; y SEQ ID Nos: 64, 65, y 66, y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-Rl.
  111. 111. Polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de VL de anticuerpo, en donde el polipéptido de VL comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 69, 70, y 71, SEQ ID Nos: 74, 75, y 76, SEQ ID Nos: 79, 80, y 81, SEQ ID Nos: 84, 85, y 86, SEQ ID Nos: 89, 90, y 91, SEQ ID Nos: 94, 95, y 96, SEQ ID Nos: 99, 100, y 101, SEQ ID Nos: 104, 105, y 106, SEQ ID Nos: 109, 110, y 111, SEQ ID Nos: 114, 115, y 116, y SEQ ID Nos: 119, 120, y 121; y en donde un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende esta VL-CDR3 se une de manera especifica a IGF-Rl.
  112. 112. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 111, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VH de anticuerpo.
  113. 113. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 111, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VL de anticuerpo.
  114. 114. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 113, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH1 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH .
  115. 115. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 114, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH2 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH .
  116. 116. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 115, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH3 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH.
  117. 117. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 116, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para una región de articulación de cadena pesada fusionada al polipéptido de VH .
  118. 118. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 114 a 117, caracterizado porque la región constante de cadena pesada es IgG4 humana.
  119. 119. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación .
  120. 120. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque las mutaciones comprenden S241P y T318A usando el sistema de numeración de Kabat .
  121. 121. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 120, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena ligera fusionado al polipéptido de VL.
  122. 122. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado porque la región constante de cadena ligera es kappa humana.
  123. 123. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 122, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende un polipéptido codificado por el ácido nucleico se une de manera especifica al mismo epítopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-C11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2,2B11, 20D8.24B11, P1E2.3PB12 y P1G10.2B8.
  124. 124. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 123, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende un polipéptido codificado por el ácido nucleico inhibe competitivamente un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, 14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  125. 125. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 124, caracterizado porque las regiones de estructura alterna del polipéptido de VH son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos .
  126. 126. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 125, caracterizado porque las regiones de estructura alterna del polipéptido de VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos .
  127. 127. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 126, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a un epítopo lineal.
  128. 128. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 126, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a un epitopo conformacional no lineal.
  129. 129. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 128, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un multivalente , y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras.
  130. 130. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 129, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es multiespecifico.
  131. 131. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 130, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico es biespecifico .
  132. 132. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 131, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son completamente humanos.
  133. 133. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01, y M12-G04.
  134. 134. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 131, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son murinos.
  135. 135. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8.24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  136. 136. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 131 y 134 a 135, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico está humanizado.
  137. 137. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 131 y 134 a 135, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es quimérico.
  138. 138. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 131 y 134 a 135, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico está primatizado.
  139. 139. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 133, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es completamente humano.
  140. 140. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 139, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un fragmento de Fab.
  141. 141. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 139, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un fragmento de Fab' .
  142. 142. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 139, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un fragmento de F(ab)2.
  143. 143. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 139, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un fragmento de Fv.
  144. 144. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 139, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico es un anticuerpo de cadena individual.
  145. 145. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 144, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico se une de manera especifica a un polipéptido de IGF-R1 o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-R1, con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2, 10~2M, 5 x 10"3, 10"3M, 5 x 10"4, 10" M, 5 x 10"5, 10~5M, 5 x 10"6, 10"6M, 5 x 10~7, 10"7M, 5 x 10~8, 10~8M, 5 x 10~9, 1(G9?, 5 x 10~10, 10~10M, 5 x 10"11, 10~n , 5 x 10~12, 10~12M, 5 x 1CT13, 10~13M, 5 x 10~14, 10~1 M, 5 x 10~15, o 10" 152M.
  146. 146. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 145, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-Rl murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IFG-R1 de primate no humano o fragmento del mismo.
  147. 147. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 145, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico se une a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, y también se une a un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o fragmento del mismo.
  148. 148. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 147, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por el ácido nucleico se une a IGF-Rl expresado en la superficie de una célula.
  149. 149. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral, o una célula metastásica.
  150. 150. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 149, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico bloquea el factor de crecimiento de insulina de la unión a IGF-Rl .
  151. 151. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque el factor de crecimiento de insulina es factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1)
  152. 152. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque el factor de crecimiento de insulina es factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2)
  153. 153. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 150, caracterizado porque bloquea tanto IGF-1 como IGF-2 de la unión a IGF-Rl.
  154. 154. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 153, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico inhibe la proliferación celular mediada por IGF-Rl.
  155. 155. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 154, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico inhibe la fosforilación de IGF-1 ó IGF-2 mediada por IGF-1 o IGF-2.
  156. 156. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 155, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico inhibe el crecimiento de células tumorales.
  157. 157. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 156, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico inhibe la internalización de IGF-R1.
  158. 158. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 157, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo .
  159. 159. Polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 84 a 158, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende el polipéptido codificado por este ácido nucleico se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, un agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, un modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo o fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG), y una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes.
  160. 160. Polinucleotido de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido, una biotoxina, una toxina enzimáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos.
  161. 161. Polinucleotido de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca bioluminiscente , una marca radioactiva, o una combinación de dos o más de cualquiera de estas marcas detectables.
  162. 162. Composición, caracterizada porque comprende el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 161, y un portador.
  163. 163. Vector, caracterizado porque comprende el polinucleotido de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 161.
  164. 164. Vector de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el polinucleótido se asocia de manera operable con un promotor.
  165. 165. Célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de las reivindicaciones 163 ó 164.
  166. 166. Método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo, que se une específicamente a IGF-1R, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 165, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo .
  167. 167. Polipéptido aislado, caracterizado porque se produce por el método de la reivindicación 166.
  168. 168. Polipéptido aislado, caracterizado porque se codifica por el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 84 a 161.
  169. 169. Polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 168, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende el polipéptido se une de manera específica a IGF-1R.
  170. 170. Anticuerpo aislado o fragmento del mismo, caracterizado porque comprende el polipéptido de la reivindicación 168 ó 169.
  171. 171. Composición, caracterizada porque comprende un polinucleótido codificante de VH aislado y un polinucleótido codificante de VL aislado, en donde el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprenden ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a secuencias de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polipéptidos codificantes de VH y VL se unen de manera especifica a IGF-R1.
  172. 172. Composición de conformidad con la reivindicación 171, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprende ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118.
  173. 173. Composición, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH aislado y un polinucleótido codificante de VL aislado, en donde el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL, respectivamente, comprenden ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos idénticas, excepto por menos de 20 sustituciones conservadoras de aminoácidos, a las secuencias de aminoácidos de referencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 113; y SEQ ID NO: 63 y 118; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une de manera especifica a IGF-Rl.
  174. 174. Composición, caracterizada porque comprende un polinucleótido codificante de VH aislado y un polinucleótido codificante de VL aislado, en donde el polinucleótido codificante de VH codifica para un polipéptido de VH que comprende secuencias de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, 6 y 7; SEQ ID NO: 10, 11 y 12; SEQ ID NO: 15, 16 y 17; SEQ ID NO: 21, 22 y 23; SEQ ID NO: 27, 28 y 29; SEQ ID NO: 33, 34 y 35; SEQ ID NO: 39, 40 y 41; SEQ ID NO: 44, 45 y 46; SEQ ID NO: 49, 50 y 51; SEQ ID NO: 54, 55 y 56; SEQ ID NO: 59, 60 y 61; SEQ ID NO: 64, 65 y 66; en donde el polinucleótid'o codificante de VL codifica para un polipéptido de VL que comprende secuencias de aminoácido de VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 69, 70 y 71; SEQ ID NO: 74, 75 y 76; SEQ ID NO: 79, 80 y 81; SEQ ID NO: 84, 85 y 86; SEQ ID NO: 89, 90 y 91; SEQ ID NO: 94, 95 y 96; SEQ ID NO: 99, 100 y 101; SEQ ID NO: 104, 105 y 106; SEQ ID NO: 109, 110 y 111; SEQ ID NO: 114, 115 y 116; y SEQ ID NO: 119, 120 y 121; y en donde un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por estos polinucleótidos codificantes de VH y VL tiene de manera especifica a IGF-R1.
  175. 175. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171-174, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un péptido de señal fusionado al polipéptido de VH de anticuerpo.
  176. 176. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171-174, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VL comprende además un ácido nucleico que codifica por un péptido de señal fusionado al polipéptido de VL de anticuerpo.
  177. 177. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 176, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH1 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH .
  178. 178. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 177, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH2 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH .
  179. 179. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 178, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de CH3 de región constante de cadena pesada fusionado al polipéptido de VH .
  180. 180. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 179, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH comprende además un ácido nucleico que codifica para una región de articulación de cadena pesada fusionada a este polipéptido de VH .
  181. 181. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 177 a 180, caracterizada porque la región constante de cadena pesada es IgG4 humana.
  182. 182. Composición de conformidad con la reivindicación 181, caracterizada porque la IgG4 está mutagenizada para remover sitios de glicosilación .
  183. 183. Composición de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque las mutaciones comprenden S241P y T318A usando el sistema de numeración de Kabat .
  184. 184. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 183, caracterizada porque el polipéptido codificante de VL comprende además un ácido nucleico que codifica para un dominio de región constante de cadena ligera fusionado al polipéptido de VL.
  185. 185. Composición de conformidad con la reivindicación 174, caracterizada porque" la región constante de cadena ligera es kappa humana.
  186. 186. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 185, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une de manera especifica al mismo epitopo de IGF-R1 como un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2,2B11, 20D8,24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8.
  187. 187. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 185, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL inhiben competitivamente un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal de referencia seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, M14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04, o un anticuerpo monoclonal de referencia producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2,2B11, 20D8,24B11, P1E2.3B12, y P1G10.2B8 de la unión a IGF-R1.
  188. 188. Composición de conformidad con la reivindicación 171 a 187, caracterizada porque las regiones de estructura alterna de los polipéptidos de VH y VL son humanas, excepto por cinco o menos sustituciones de aminoácidos.
  189. 189. Composición de conformidad con la reivindicación 171 a 188, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une a un epitopo lineal.
  190. 190. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 188, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por estos polinucleótidos codificantes de VL y VH se une a un epitopo conformacional no lineal.
  191. 191. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 188, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es multivalente , y comprende al menos dos cadenas pesadas y al menos dos cadenas ligeras .
  192. 192. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 191, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es multiespecifico .
  193. 193. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 192, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es biespeci fico .
  194. 194. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 193, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son completamente humanos .
  195. 195. Composición de conformidad con la reivindicación 194, caracterizada porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un fragmento de anticuerpo Fab monoclonal seleccionado del grupo que consiste de M13-C06, 14-G11, M14-C03, M14-B01, M12-E01 y M12-G04.
  196. 196. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 193, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL comprende dominios variables de cadena pesada y ligera que son murinos.
  197. 197. Composición de conformidad con la reivindicación 196, caracterizada porque los dominios variables de cadena pesada y ligera son idénticos a aquellos de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de P2A7.3E11, 20C8.3B8, P1A2.2B11, 20D8,24B11, P1E2.3B12 y P1G10.2B8.
  198. 198. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 193 y 196 a 197, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL está humanizado.
  199. 199. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 193 y 196 a 197, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es quimérico.
  200. 200. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 193 y 196 a 197, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL está primatizada.
  201. 201. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 195, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos purificantes de VH y VL es completamente humano.
  202. 202. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 201, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es un fragmento Fab.
  203. 203. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 201, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es un fragmento Fab' .
  204. 204. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 201, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es un fragmento F(ab) 2.
  205. 205. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 201, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL es un fragmento Fv.
  206. 206. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 201, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VI es un anticuerpo de cadena individual.
  207. 207. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 206, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une de manera específica a un polipéptido de IGF-Rl o fragmento del mismo, o un polipéptido variante de IGF-Rl, con una afinidad distinguida por una constante de disociación (KD) no mayor que 5 x 10"2, 10"2M, 5 x 10"3, 10~3M, 5 x 10~4M, 5 x 10"5, 10"5M, 5 x 10"6, 10"6M, 5 x 10~7, 10~7M, 5 x 1(G8, 1(G8?, 5 x 10"9, 10"9M, 5 x 10~10, 10"10M, 5 x 10"11, 10~ M, 5 x 1(T12, 10"12M, 5 x 10~13, 10"13M, 5 x 10~14, 10~14 , 5 x 10"15, o 1CT15M.
  208. 208. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 207, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une de manera preferencial a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, con relación a un polipéptido de IGF-Rl murino o fragmento del mismo o un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o fragmento del mismo.
  209. 209. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 207, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une a un polipéptido de IGF-Rl humano o fragmento del mismo, y también se une a un polipéptido de IGF-Rl de primate no humano o fragmento del mismo.
  210. 210. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 209, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL se une a IGF-R1 expresado en la superficie de una célula.
  211. 211. Composición de conformidad con la reivindicación 210, caracterizada porque la célula es una célula maligna, una célula neoplásica, una célula tumoral, o una célula metastásica.
  212. 212. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 211, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL bloquea el factor de crecimiento de insulina de la unión a IGF-R1.
  213. 213. Composición de conformidad con la reivindicación 212, caracterizada porque el factor de crecimiento de insulina es factor 1 de crecimiento de insulina (IGF-1)
  214. 214. Composición de conformidad con la reivindicación 212, caracterizada porque el control de crecimiento de insulina es factor 2 de crecimiento de insulina (IGF-2)
  215. 215. Composición de conformidad con la reivindicación 212, caracterizada porque bloquea tanto a IGF-1 como IGF-2 de la unión a IGF-R1.
  216. 216. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 215, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL inhibe la proliferación la proliferación celular mediada por IGF-R1.
  217. 217. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 216, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL inhibe la fosforilación de IGF-1 mediada por IGF-1 o IGF-2.
  218. 218. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 217, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL inhibe el crecimiento de células tumorales.
  219. 219. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 218, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleótidos codificantes de VH y VL inhibe la internalización de IGF-R1.
  220. 220. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 219, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH, el polinucleótido codificante de VL o tanto el polinucleótido codificante de VH como de VL comprende además un ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo.
  221. 221. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 220, caracterizada porque un anticuerpo o fragmento del mismo codificado por los polinucleotidos codificantes de VH y VL se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste de agente citotóxico, un agente terapéutico, un agente citostático, una toxina biológica, un profármaco, un péptido, una proteina, una enzima, un virus, un lipido, un modificador de respuesta biológica, un agente farmacéutico, una linfocina, un anticuerpo heterólogo, o un fragmento del mismo, una marca detectable, polietilenglicol (PEG), o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes.
  222. 222. Composición de conformidad con la reivindicación 221, caracterizada porque el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de un radionúclido , una biotoxina, una toxina enzimáticamente activa, un agente terapéutico citostático o citotóxico, un profármaco, un ligando inmunológicamente activo, un modificador de respuesta biológica, o una combinación de dos o más de cualquiera de estos agentes citotóxicos.
  223. 223. Composición de conformidad con la reivindicación 221, caracterizada porque la marca detectable se selecciona del grupo que consiste de una enzima, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente , una marca bioluminiscente, una marca radioactiva, una combinación de dos o más de cualquiera de estas marcas detectables.
  224. 224. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 223, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH está contenido en un primer vector y el polinucleótido purificante de VL está contenido en un segundo vector.
  225. 225. Composición de conformidad con la reivindicación 224, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH está asociado de manera operable con un primer promotor y el polinucleótido codificante de VL está asociado de manera operable con un segundo promotor.
  226. 226. Composición de conformidad con la reivindicación 225, caracterizada porque el primero y segundo promotores son copias del mismo promotor.
  227. 227. Composición de conformidad con la reivindicación 225, caracterizada porque el primero y segundo promotores no son idénticos.
  228. 228. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicación 224 a 227, caracterizada porque el primer vector y el segundo vector están contenidos en una célula hospedadora individual.
  229. 229. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 224 y 227, caracterizada porque el primer vector y el segundo vector están contenidos en células hospedadoras separadas.
  230. 230. Método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-1R, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 228, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo.
  231. 231. Método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-1R, caracterizado porque comprende co-cultivar las células hospedadoras separadas de la reivindicación 229, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo.
  232. 232. Método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera específica a IGF-1R, caracterizado porque comprende cultivar de manera separada las células hospedadoras separadas de la reivindicación 229, combinar los polipéptidos codificantes de VH y VL, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo.
  233. 233. Anticuerpo o fragmento del mismo, que se une de manera específica a IGF-1R, caracterizado porque se produce por el método de cualquiera de las reivindicaciones 230 y 232.
  234. 234. Composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 171 a 223, caracterizada porque el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL están en el mismo vector.
  235. 235. Vector caracterizado porque es de conformidad con la reivindicación 234.
  236. 236. Vector de conformidad con la reivindicación 235, caracterizado porque el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL están asociados cada uno de manera operable como un promotor.
  237. 237. Vector de conformidad con la reivindicación 235, caracterizado porque el polinucleótido codificante de VH y polinucleótido codificante de VL se fusionan en cuadro, se co-transcriben de un promotor individual operablemente asociado con este, y se co-traducen en un anticuerpo de cadena individual o fragmento de unión a antigeno del mismo.
  238. 238. Vector de conformidad con la reivindicación 235, caracterizado porque el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL se co-transcriben de un promotor individual operablemente asociado con este, pero se traducen de manera separada.
  239. 239. Vector de conformidad con la reivindicación 238, caracterizado porque además comprende una secuencia de IRES colocada entre el polinucleótido codificante de VH y el polinucleótido codificante de VL .
  240. 240. Vector de conformidad con la reivindicación 235, caracterizado porque el polinucleótido que codifica para una VH y el polinucleótido que codifica para una VL se transcriben de manera separada, cada uno que se asocia de manera operable con un promotor separado.
  241. 241. Vector de conformidad con la reivindicación 240, caracterizado porque los promotores separados son copias del mismo promotor.
  242. 242. Vector de conformidad con la reivindicación 240, caracterizado porque los promotores separados no son idénticos .
  243. 243. Célula hospedadora, caracterizada porque comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 235 a 242.
  244. 244. Método para producir un anticuerpo o fragmento del mismo, que se une de manera especifica a IGF-1R, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 243, y recuperar el anticuerpo, o fragmento del mismo.
  245. 245. Anticuerpo o fragmento del mismo que se une de manera especifica a IGF-1R, caracterizado porque se produce por el método de la reivindicación 244.
  246. 246. Método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un animal, caracterizado porque comprende administrar a un animal en necesidad de tratamiento una composición que comprende: a) el anticuerpo aislado o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 82, 170, 233 y 245; y b) un portador farmacéuticamente aceptable.
  247. 247. Método de conformidad con la reivindicación 246, caracterizado porque la enfermedad o trastorno hiperproliferativo se selecciona del grupo que consiste de cáncer, un neoplasma, un tumor, una malignidad, o una metástasis del mismo.
  248. 248. Método de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo se une de manera especifica a IGF-1R expresado en la superficie de una célula maligna.
  249. 249. Método de conformidad con la reivindicación 248, caracterizado porque la unión del anticuerpo o fragmento del mismo a la célula maligna da por resultado la inhibición de crecimiento de la célula maligna.
  250. 250. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 249, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la unión de IGF a la célula maligna .
  251. 251. Método de conformidad con la reivindicación 250, caracterizado porque el IGF es IGF-1.
  252. 252. Método de conformidad con la reivindicación 250, caracterizado porque el IGF es IGF-2.
  253. 253. Método de conformidad con la reivindicación 250, caracterizado porque el IGF es IGF-1 e IGF-2.
  254. 254. Método de conformidad con la reivindicación 253, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe IGF-1 de la unión a la célula maligna pero no inhibe IGF-2.
  255. 255. Método de conformidad con la reivindicación 253, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe IGF-2 de la unión a la célula maligna pero no inhibe IGF-1.
  256. 256. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 249, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo promueve la internali zación de IGF-1R en la célula maligna.
  257. 257. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 249, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la fosforilación de IGF-1R.
  258. 258. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 249, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la proliferación de células tumorales .
  259. 259. Método de conformidad con la reivindicación 258, caracterizado porque la proliferación de células tumorales se inhibe a través de la prevención o retardo del crecimiento metastásico.
  260. 260. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 249, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la migración de células tumorales .
  261. 261. Método de conformidad con la reivindicación 258, caracterizado porque la proliferación de células tumorales se inhibe a través de la prevención o retardo de la propagación de tumor a tejidos adyacentes.
  262. 262. Método de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque la enfermedad o trastorno hiperproliferativo es un neoplasma localizado en el (la) : próstata, colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándula suprarrenal, glándula paratiroides , glándula pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides, ojo, cabeza, cuello, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, región torácica o tracto urogenital.
  263. 263. Método de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque la enfermedad hiperproliferativa es cáncer, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de: cáncer de células escamosas epiteliales, melanoma, leucemia, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello.
  264. 264. Método de conformidad con la reivindicación 263, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de estómago, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de ovario y cáncer de próstata.
  265. 265. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 246 a 264, caracterizado porque el animal es un mamífero.
  266. 266. Método de conformidad con la reivindicación 265, caracterizado porque el mamífero es un humano.
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