MX2010007101A - Metodos y agentes para mejorar el reconocimiento de celulas de tumor que expresan cd138. - Google Patents

Metodos y agentes para mejorar el reconocimiento de celulas de tumor que expresan cd138.

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Christoph Bruecher
Benjamin Daelken
Christoph Uherek
Teru Hideshima
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Abstract

Se describen inmunoconjugados que tienen especificidad para CD138 que reducen la adhesión de células tumorales que expresan CD138 a las células del estroma y métodos para utilizarlos. Esta adhesión reducida torna a las células tumorales no sólo susceptibles a los inmunoconjugados, sino también a otros agentes en particular a agentes citotóxicos.

Description

MÉTODOS Y AGENTES PARA MEJORAR EL RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS DE TUMOR QUE EXPRESAN CD138 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de inmunocon ugados contra el antígeno CD138 y con composiciones que comprende los inmunoconjugados para reducir la adhesión de las células del estroma a células blanco con expresión de CD138 y, de esa manera, tratar de manera más efectiva estados de enfermedad en las que intervienen las células con expresión de. CD138.
ANTECEDENTES CD138, que actúa como receptor para la matriz extracelular, está sobreexpresado en las células de mieloma múltiple (MM) y se ha demostrado que influye el desarrollo y/o proliferación de células MM. CD138 también se expresa en células de carcinoma de ovario, carcinoma renal, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, células de carcinoma de colon y células de linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica (CLL)-, para nombrar sólo unas pocas.
Las publicaciones y demás materiales, incluyendo patentes, utilizadas e la presente para ilustrar la invención y, es particular, para ofrecer más detalles con respecto a la práctica, se incorporan a la presente como referencia. Para mayor conveniencia, las publicaciones se citan en el texto siguiente por su autor y fecha y/o están enumeradas alfabéticamente por autor en la bibliografía adjunta.
Tassone et al. (2004) han dado a conocer la excelente unión del anticuerpo B-B4 de IgGl murina al antígeno CD138 expresado' en la superficie de las células MM. Tassone también informó sobre la elevada actividad citotóxica del inmunoconjugado B-B4-DM1, que comprende el maitansinoide DM1 como molécula efectora contra múltiples células de mieloma (ver también la Publ. de Patente de los Estados Unidos 20070183971) .
Tassone también demostró que este conjugado de B-B4 era eficaz, incluso en el microambiente de la médula ósea, que induce en las células de mieloma múltiple (MM) resistencia a numerosas drogas administradas comúnmente a los pacientes, incluyendo, por ejemplo, dexametasona . Los inmunoconjugados de Tassone pudieron destruir con eficacia lasa células de tumores de MM en el ambiente del estroma de la médula ósea.
Si bien Tassone et al. han contribuido a la producción de un tratamiento eficaz del MM y de una composición de materia que se puede emplear en ese tratamiento, subsiste en la técnica un número de necesidades.
Subsiste la necesidad de tratamientos mejorados que utilicen inmunoconj ugados basados en B-B . También existe la necesidad de tratamientos efectivos que empleen inmunoconjugados basados en B-B4 que exhiban una o más propiedades ventajosas. Las propiedades del inmunoconj ugado incluyen preferentemente unión al antigeno mejorada, matanza mejorada de las células tumorales que comprenden, especialmente, células tumorales con expresión de CD138 y células accesorias de las mismas o una unión más homogénea al blanco aunque, en particular, la capacidad de combatir con más eficacia los estados de enfermedad asociados con las células que expresan CD138.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método para reducir la adhesión de las células del estroma a células tumorales con expresión de CD138 en las células tumorales de un sujeto que lo necesita, que comprende: administrar a dichas células tumorales un inmunoconj ugado que toma como blanco a dichas células tumorales con expresión de CD138, especialmente un inmunoconjugado que contenga un ligante escindible y un efector de acuerdo con lo descripto en la presente, en una cantidad efectiva para disminuir la adhesión de las células del estroma a las células tumorales que expresan CD138 y, optativamente, administrar a dichas células tumorales otro agente citotóxico en una cantidad suficiente para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales .
La adhesión se puede reducir por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o más y/o puede dar lugar a la mitigación de la fármaco resistencia mediada por la adhesión, que incluye la fármaco resistencia mediada por la adhesión contra un agente citotóxico adicional (que no es uno de los inmunocon ugados antes mencionados) y donde dicho agente citotóxico adicional es administrado en una cantidad suficiente para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales. El inmunoconj ugado. y este o estos agentes citotóxicos pueden ser administrados en forma consecutiva, donde la administración del agente citotóxico puede seguir a la administración del inmunoconjugado o estos pueden ser administrados en forma conjunta.
El inmunocon ugado de la presente invención comprende, en particular, (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado y (b) una molécula efecLora, donde dicho inmunoconjugado se dirige de manera homogénea a las células blanco con expresión de CD138.
El anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado de la presente invención puede (i) consistir esencialmente en la región de unión al antigeno (ABR) contra CD138 de un anticuerpo no humano, o (ii) comprender una región de unión al antigeno (ABR) contra CD138, donde dicha región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano y otra región del anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha otra región del anticuerpo es de un anticuerpo humano.
La ABR puede comprender: (a) la CDR3 de la región variable de cadena pesada que comprende los residuos aminoácidos 99 a 111 de SEC ID NO: (b) la CDR3 de la región variable de cadena liviana que comprende los residuos aminoácidos 89 a 97 de SEC ID NO: 2, respectivamente.
La ABR puede comprender además: (a) CDR1 y CDR2 de región variable de cadena pesada que comprenden los residuos aminoácidos 31 a 35 y 51 a 68 de SEC ID NO: 1, y/o (b) CDR1 y CDR2 de región variable de cadena liviana que comprenden los residuos aminoácidos 24 a 34 y 50 a 56 de SEC ID NO: 2, respectivamente.
La otra región del anticuerpo puede comprender: (a) los residuos aminoácidos 123 a 448 de SEC ID NO: 1, y/o (b) los residuos aminoácidos 108 a 214 de SEC ID NO: 2, respectivamente y mutaciones de los mismos que (i) mantienen o reducen la citotoxicidad dependiente del anticuerpo y/o complementan la citotoxicidad dependiente del complemento del anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado y/o (ii) estabilizan el anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado.
La molécula efectora puede estar acoplada a dicho anticuerpo de direccionamiento al blanco por medio de un ligante. El ligante puede comprender un enlace de disulfuro. La molécula efectora (por ejemplo, DM4) puede producir un impedimento estérico entre el anticuerpo de direccionamiento al blanco y la molécula efectora. La molécula efectora puede ser por lo menos un maitansinoide (por ejemplo, DM1, DM3 o DM4) taxano o un CC1065, o un análogo de los mismos.
El inmunoconj ugado se puede unir a CD138 con una variación de localización del blanco de menos de 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% o 50%.
La presente invención se refiere asimismo a un inmunoconj ugado que comprende: un agente de direccionamiento al blanco que se dirige al CD138, que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1. Una región constante de dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma puede ser una región constante del isotipo IgG4.
La presente invención se refiere asimismo a un método para el tratamiento del en un sujeto, que comprende: producir uno o más inmunocon ugados especificados en la presente y administrar a dicho sujeto dicho inmunoconj ugado en una cantidad efectiva para tratar el mieloma múltiple.
El agente de direccionamiento al blanco del inmunoconj ugado puede comprender una secuencia de cadena liviana que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 2. El agente de direccionamiento al blanco del inmunocon ugado puede comprender asimismo una secuencia de cadena pesada que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
La presente invención se refiere asimismo a un método para la administración de fármacos mediada por inmunoconj ugados que comprende: producir uno o más inmunoconjugados especificados en la presente y administrar dicho inmunoconj ugado en una cantidad terapéuticamente efectiva, donde dicho isotipo de IgG4 mitiga la ADCC, citotoxicidad dependiente del complemento, y/o el direccionamiento al blanco mediado por Fe del FcR hepático .
La presente invención se refiere asimismo a un método para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales en un cultivo celular que comprende administrar a dicho cultivo celular un cultivo de células tumorales, en una cantidad efectiva para inhibir, retardar y/o prevenir, de uno o más de los inmunoconjugado aqui especificados. La cantidad efectiva puede inducir la muerte celular o la detención del ciclo celular continuo en las células tumorales que expresan CD138 y, optativamente, células auxiliares que o expresan CD138, en particular células tumorales del estroma. Se pueden obtener células de dicho cultivo celular de un paciente con cáncer y, tras la administración de dicha cantidad efectiva de dicho inmunoconj ugado, se pueden reimplantar las células de dicho cultivo celular en dicho paciente con cáncer.
La presente invención se refiere asimismo a un método para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la propagación de las células tumorales de ese tumor en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dicho paciente por lo menos uno o más de los inmunoconj ugados antes especificados en un una cantidad efectiva para inhibir o reducir el desarrollo de dicho tumor y/o la propagación de dichas células tumorales, donde dicho inmunoconj ugado inhibe, retarda o previene el desarrollo y/o propagación de dichas células tumorales .
La molécula efectora de dicho inmunoconj ugado ( s ) puede ser una toxina, una enzima citotóxica, una droga citotóxica de bajo peso molecular, un agente formador de poros, un modificador de la respuesta biológica, una enzima activadora de profármacos, un anticuerpo, citoquina o radionúclido .
Los inmunoconjugados de la presente invención se pueden administrar en una dosis única de 5 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2, optativamente a intervalos horarios, diarios, semanales o combinaciones de los mismos.
Los regímenes de dosis múltiples, que incluyen regímenes horarios, diarios y semanales, son parte de la presente invención e incluyen, en particular, la administración a intervalos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 horas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas.
La presente invención se refiere asimismo a un método para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor y/o la propagación de células de tumores malignos en un paciente que lo necesita, que comprende (a) administrar a dicho paciente uno o más. agentes citotóxicos y/o radiación en una cantidad efectiva para reducir la carga tumoral y (b) administrar a dicho paciente por lo menos uno de los inmunoconj ugados aquí especificados en una cantidad efectiva para inhibir, retardar o prevenir el desarrollo de un tumor y/o la propagación de las células tumorales, donde dicho inmunoconjugado inhibe, retarda o previene el desarrollo y/o propagación de las células tumorales que comprenden células que expresan CD138.
El agente citotóxico de cualquiera de las modalidades de la presente invención puede ser, específicamente, mefalán, vincristina, doxorubicinaa, dexametasona, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, cisplatino, talidomida, prednisona, talidomida, bortezomib, lenalidomida, sorafenib, romidepsina o combinaciones de los mismos, o puede basarse en un anticuerpo.
La presente invención se refiere asimismo a un método para el tratamiento de un sujeto que presenta una condición que mejoraría con la supresión de la supervivencia de las células de mieloma, método que comprende: (a) producir por lo menos uno de cualquiera de los inmunoconj ugados aquí especificados y (b) administrar el inmunoconj ugado al sujeto para reducir selectivamente la supervivencia o el desarrollo de dichas células de mieloma de dicho sujeto.
La presente invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los inmunoconj ugados aquí especificados para la inhibición, retardo y/o prevención del desarrollo de tumores y/o la propagación de las células tumorales, y uno o más excipientes aceptables para uso farmacéutico.
La composición farmacéutica puede incluir los agentes citotóxicos detallados en la presente.
La presente invención se refiere asimismo a un kit que comprende, en recipientes separados, composiciones farmacéuticas para usar en combinación para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de tumores y/o la propagación de las células tumorales, donde un recipiente comprende una cantidad efectiva de la composición farmacéutica antes citada y donde un recipiente separado comprende una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un agente, preferentemente un agente citotóxico, para la inhibición, retardo y/o prevención del desarrollo de tumores y/o la propagación de células tumorales y uno o más excipientes aceptables para uso farmacéutico.
La presente invención se refiere asimismo a un método para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la propagación de las células tumorales de dicho tumor en un sujeto que lo necesite, que comprende (a) producir un inmunoconjugado que comprende: un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado contra CD138 acoplado a una molécula efectora por medio de un ligante escindible, donde dicha molécula efectora está estéricamente impedida y (b) administrar a dicho sujeto el' inmunoconj ugado de (a) en una cantidad suficiente para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de dicho tumor y/o la propagación de dichas' células tumorales, donde dicho inmunoconj ugado de (a) produce una actividad inhibitoria del desarrollo de un tumor que excede la de su contraparte no impedida en aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40% o más.
Una actividad inhibitoria del desarrollo de un tumor que excede la de su contraparte no impedida que comprende un ligante no escindible puede superar la actividad inhibitoria del desarrollo de un tumor de su contraparte no impedida que comprende un ligante escindible, por ejemplo por lo menos aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, hasta aproximadamente 15%.
Dicho anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado contra CD138 puede consistir esencialmente en la región de unión al antigeno contra CDdl38 de un anticuerpo no humano o puede comprender una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo no humano y otra región del anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha otra región del anticuerpo es de un anticuerpo humano.
Dicho ligante escindible puede comprender un enlace de disulfuro. La molécula efectora puede ser DM4. El inmunoconjugado puede ser parte de una composición farmacéutica y puede ser administrado al sujeto en por lo menos una dosis en una cantidad de aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2.
La presente invención presenta un inmunoconjugado para usar como medicamento, donde el inmunoconjugado comprende: (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado (i) que consiste esencialmente en la región de unión al antigeno contra la CD138 de un anticuerpo no humano o (ii) que comprende una región de unión al antigeno contra la CD138, donde dicha región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha región adicional del anticuerpo es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une de manera homogénea a CD138.
La presente invención da a conocer otro inmunoconjugado para usar como medicamento, que comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
Específicamente, en un aspecto' de la presente invención, el inmunoconjugado descripto en el párrafo anterior está destinado al uso en el tratamiento del mieloma múltiple. En particular, el inmunoconjugado se puede utilizar para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del mieloma múltiple.
La presente invención presenta además un inmunoconj ugado para usar en la administración de fármacos mediada por inmunoco ugados a un paciente, especialmente ara la mitigación de la ADCC, citotoxicidad dependiente del complemento, y/o el direccionamiento al blanco mediado por Fe del FcR hepático, donde el inmunoconjugado comprende un agente de direccionamiento al blanco que se dirige a CD138, que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, y donde una región constante de dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma es una región constante del isotipo IgG4.
La presente invención presenta asimismo células tumorales para usar en el tratamiento del cáncer en un paciente cuyas células tumorales han sido tratadas en cultivo con un inmunoconjugado que comprende: (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado (i) que consiste esencialmente en una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo humano o (ii) que comprende una región de unión al antigeno contra CD138, donde dicha región de unión al antígeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha región de un anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une de manera homogénea a CD138.
La presente invención presenta asimismo células tumorales para usar en el tratamiento del cáncer en un paciente, donde las células tumorales han sido tratadas en cultivo celular con un inmunoconjugado que comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
La presente invención da a conocer un inmunoconjugado para usar con el propósito de inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la propagación de las células tumorales de dicho tumor en un paciente, donde el inmunoconjugado comprende : (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado (i) que consiste esencialmente en una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo no humano o (ii) que comprende una región de unión al antigeno contra CD138, donde dicha región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha otra región de anticuerpo es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une a CD138 de manera homogénea .
Por otro lado, la presente invención da a conocer un inmunoconjugado para usar con el propósito de inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la propagación de las células tumorales de dicho tumor en un paciente, donde el inmunoconjugado comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
Más aun, la presente invención da a conocer un medicamento que comprende un inmunoconjugado y una o más drogas contra el cáncer en forma de preparación combinada para el uso simultáneo, separado o sucesivo en el tratamiento de células tumorales que comprenden células que expresan CD138, donde el inmunoconj ugado comprende: (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado (i) que consiste esencialmente en una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo no humano o (ii) que comprende una región de' unión al antigeno contra CD138, donde dicha región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha otra región de un anticuerpo es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une a CD138 de manera homogénea, y donde dicha una o más drogas contra el cáncer tienen la capacidad de reducir la carga tumoral.
Por otro lado, la presente invención da a conocer un medicamento que comprende un inmunoconjugado y una o más drogas contra el cáncer en forma de preparación combinada para el uso simultáneo, separado o sucesivo en el tratamiento de las células tumorales que comprenden células que expresa CD138, donde el inmunoconj ugado comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende . una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, y donde dicha una o más drogas contra el cáncer tienen la capacidad de reducir la carga tumoral.
En otro aspecto del uso de acuerdo con los párrafos anteriores, la preparación combinada se ha de administrar a un paciente que ha sido tratado con radiación.
En un aspecto alternativo, la presente invención da a conocer el uso de un inmunoconjugado para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de células tumorales en un paciente que comprenden células que expresan CD138, donde el inmunoconjugado comprende: (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado (i) que consiste esencialmente en una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo no humano, o (ii) que comprende una región de unión al antigeno contra CD138, donde dicha una región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha otra región de un anticuerpo es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une a CD138 de manera homogénea, y donde el medicamento es para ser administrado a un paciente tratado con radiación para reducir la carga tumoral.
Por añadidura, la presente invención presenta el uso de un inmunocon ugado para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de las células tumorales en un paciente que comprenden células con expresión de CD138, donde el inmunoconj ugado comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1, y donde el medicamento es para ser administrado a un paciente tratado con radiación para reducir la carga tumoral .
En los párrafos que anteceden, el medicamento tiene la capacidad de inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor y/o la propagación de las células de tumores malignos en un paciente.
Además, la presente invención da a conocer un inmunoconj ugado para la supresión de la supervivencia de las células de mieloma en un individuo, donde el inmunoconjugado comprende: (a) un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado · (i) que consiste esencialmente en una región de unión al antigeno contra CD138 de un anticuerpo no humano, o (ii) que comprende una región de unión al antigeno contra CD138, donde dicha región de unión al antigeno es de un anticuerpo no humano, otra región de un anticuerpo, donde por lo menos parte de dicha región de anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano y (b) una molécula efectora, donde dicho inmunoconjugado se une a CD138 de manera homogénea .
Más aun, la presente invención da a conocer un inmunoconj ugado para la supresión de la supervivencia de las células de mieloma en un individuo en el cual el inmunoconj ugado comprende: un agente de direccionamiento al blanco dirigido a CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, donde dicha cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
En los dos párrafos anteriores, el inmunoconjugado tiene la capacidad, específicamente, de reducir la sobrevida o el desarrollo de dichas células de mieloma en el individuo.
Además, la presente invención presenta un inmunoconjugado para usar con el fin de inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la propagación de las células tumorales de dicho tumor en un sujeto, donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado contra CD138 acoplado a una molécula efectora a través de un ligante escindible, donde dicha molécula efectora está estéricamente impedida.
En el párrafo anterior, el inmunocon ugado es, especialmente, apto para dar lugar a una actividad inhibitoria del desarrollo tumoral que excede a la de su contraparte no impedida en aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40% o más.
La presente invención presenta asimismo un agente de direccionamiento a CD138 para usar en un método para reducir la adhesión de las células del estroma a células tumorales que expresan CD138 en las células tumorales de un suj eto .
La presente invención presenta además un medicamento que comprende un agente de direccionamiento a CD138 y otro agente, tal como un inmunocon ugado de direccionamiento al blanco o un agente citostático, en forma de preparación combinada para el uso simultáneo (coadministración) , separado o sucesivo en un método para reducir la adhesión de las células del estroma a células que expresan CD138 en las células tumorales de un sujeto.
En el párrafo anterior, la preparación combinada tiene capacidad, específicamente, para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales en un su eto .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 presenta una representación esquemática de nBT062 con moléculas efectoras acopladas.
La FIG. 2 es una representación química de BT062.
La FIG. 3 ilustra la conversión de la ansamitocina P-3 a maitansinol (se omite la estereoquímica para simplificar) .
La FIG. 4 ilustra un esquema de síntesis representativa de DM .
La FIG. 5 es una representación esquemática de una conjugación a un anticuerpo (nBT062 a DM4).
LA FIG. 6 ilustra un análisis de la unión de los anticuerpos nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-DMl, nBT062-SMCC-DM1 y nBT062 a las células OPM-2. Se administraron concentraciones diferentes de nBT062 y conjugados a las células y se midió la fluorescencia media mediante análisis de FACS.
Las FIG. 7 (A) - (D) ilustran la citotoxicidad ir¡ vitro de los conjugados nBT062-DMx hacia las células MOLP-8 (CD138+) y BJAB (CD138") . Se cultivaron las células en placas de fondo plano y se las incubó con las concentraciones indicadas de los inmunoconjugados por espacio de 5 días. Se agregó reactivo WST durante 3 horas más para evaluar la viabilidad celular. En (D) se analizó la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4 en presencia o ausencia del anticuerpo bloqueante (nBT062 1 µ?) .
La FIG. 8 ilustra volúmenes tumorales correspondientes a ratones individuales tratados con (A) PBS, (B) anticuerpo nBT062, (C) DM4 libre o (D) conjugado huC242-DM4 no direccionador en el tiempo (dias) post-inoculación con células tumorales MOLP-8.
La FIG. 9 ilustra volúmenes tumorales correspondientes a ratones individuales tratados con (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 o (D) nBTO 62-SPP-DM1 en el tiempo (dias) post-inoculación con células tumorales MOLP-8.
La FIG. 10 ilustra el volumen medio de los tumores (+/- SD) de xenoinjertos de mieloma múltiple humano MOLP-8 en ratones CB.17 SCID en el tiempo (dias) post-inoculación.
Las FIGS . 11A y B ilustran la actividad antitumoral nBT062-DMx contra células tumorales MOLP-8 CD138+ en un modelo de tumor voluminoso MOLP-8 en ratones SCID. El volumen tumoral se expresa en términos de media (+/- SD) correspondiente a cada grupo.
La FIG. 12 es un gráfico que refleja la eficacia antitumoral de conjugados de DMx con contenido de nBT062 en el modelo SCIDhu/INA-6 hacia las células de mieloma múltiple en el ambiente de la médula ósea humana. Se utilizó el Receptor de IL-6 soluble humana producido por células de mieloma múltiple (shuIL-6R) como indicador de la carga tumoral. Triángulo: nBT062-SPP-DMl , Cuadrado: nBT062-SPDB-DM4; Rombo: control de vehículo.
La FIG. 13 ilustra la matanza de espectadoras mediada por nBT062-SPDB-DM4 in vitro. Se cultivaron células 0PM2 CD138 positivas y células Namawla CD138 negativas con nBT062-SPDB-DM4 en diferentes concentraciones y se midió la viabilidad celular. Los valores DO450 representan una medida de la viabilidad celular.
La FIG. 14 ilustra en (A) la expresión de CD138 por diferentes células de MM y en (B) un análisis microscópico de células DOX40 (panel superior) y células OPM1 (panel inferior)'. La expresión de CD138 aparece en el lado derecho y los ácidos nucleicos están expuestos a la izquierda.
La FIG. 15 (A) ilustra la citotoxicidad de nBT062- SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl hacia las células de MM al cabo de 40, 80 y 120 horas. La FIG. 15 (B) ilustra la viabilidad celular de las células de MM aisladas de tres -pacientes diferentes después del tratamiento con nBT062-SPDB-DM4 por espacio de 2 días. LA FIG. 15 (C) ilustra Células Mononucleares de Sangre- Periférica (PBMCs) obtenidas de 3 sujetos sanos, que fueron cultivadas con nBT062-SPDB-DM4 durante 72 h antes de determinar la viabilidad de las células.
La FIG. 16 (A) ilustra un análisis del ciclo celular en el cual se trataron las células 0PM1 con inmunoconj ugados por espacio de 0, 12 o 24 h y se analizaron los perfiles del ciclo celular por tinción de PI. En la FIG. 16 (B) Se cultivaron células OMP1 en presencia o ausencia de los inmunoconj ugados por espacio de 24, 48 o 72 h. Se evaluó el porcentaje de células apoptóticas mediante tinción y citometria de flujo del anticuerpo Apo 2.7. En la FIG. 16 (C) se cultivaron células OPM1 en presencia de 885 pg/ml de nBT062-SPDB-DM4 durante los periodos indicados (panel izquierdo) o con diferentes concentraciones de inmunoconj ugado (panel del centro) . El inhibidor de pan-caspasa zVAD-fmk bloqueó la escisión de caspasa -8,-9, y-3 y Poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) inducida por nBTO 62-SPDB-DM4 en células OPMl (panel derecho) .
La FIG. 17 ilustra en (A) a (C) el efecto de IL-6, IGF-1 y BMSCs sobre el desarrollo y sensibilidad de las células de MM hacia los inmunoconj ugados . La FIG. 17 (D) ilustra experimentos que utilizan Dexametasona en lugar del inmunoconj ugado . La FIG. 17 (E) ilustra los resultados del experimento de adhesión celular con co-culLivos de células tumorales y BMSCs en presencia o ausencia de los inmunoconj ugados .
LA FIG. 18 (A) ilustra un análisis de la expresión de GFP por las células 0PM1GFP. LA FIG. 18· (B) ilustra el efecto de nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-DMl o control con buffer sobre los tamaños de los tumores en grupos de SCID inyectados con 5xl06 células 0PM1GFP. LA FIG. 18 (C) nBT062-SPDB-DM4 amentó significativamente la supervivencia (P <0.0023, linea de guiones, n=5) en comparación con el grupo control tratado con vehículo solamente (línea plena; salina normal, n=5) . LA FIG. 18 (D) demuestra que nBT062-SPDB-DM4 induce la apoptosis in vivo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE DIVERSAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN La presente invención se · relaciona con inmunoconj ugados que comprenden agentes de direccionamiento a CD138 y la administración de la molécla o moléculas efectoras de los inmunoconj ugado a los sitios blanco y la liberación específica al sitio de la molécula o moléculas efectoras en o cerca de las células, tejidos y órganos blanco. Las molécula efectoras pueden ser activadas mediante la escisión/disociación de la porción de agente de direccionamiento al blanco del inmunoconj ugado en el sitio blanco. La presente invención se relaciona, en particular, con el uso de estos inmunoconj ugados ara combatir el desarrollo de tumores in vivo y con el uso de la capacidad de estos inraunoconjugado para anular o disminuir los mecanismos protectores encontrados en el microambiente de la médula ósea.
Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un sujeto que necesita tratamiento terapéutico o a células aisladas de dicho sujeto que necesita tratamiento terapéutico. La molécula o moléculas efectoras pueden ser liberadas del inmunoconjugado mediante escisión/disociación en o cerca de la célula, tejido u órgano blanco.
En un ejemplo, se administra el inmunoconjugado comprende el anticuerpo nBT062, que toma como objetivo las células que expresan CD138, y por lo menos una droga o toxina altamente citotóxica como molécula efectora, a un paciente con cáncer. En este ejemplo, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del inmunoconjugado por via endovenosa a un paciente de manera que se concentre en las células cancerosas. Posteriormente se libera la molécula o molecules efectoras del anticuerpo por medios naturales. Después o durante la escisión, se puede estabilizar la molécula efectora mediante alquilación y se la puede difundir a las células auxiliares circundantes tales como células del estroma que no expresan CD138.
En un segundo ejemplo, el inmunoconjugado comprende al anticuerpo nBT062, que toma como objetivo las células que expresan CD138, y por lo menos una droga o toxina altamente citotóxica como molécula efectora, además de por lo menos una droga o toxina altamente citotóxico como molécula efectora, y se administra un agente citotóxico adicional a un paciente con cáncer. En este ejemplo, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del inmunocon ugado y el agente citotóxico en forma consecutiva. Se administra primero el inmunoconjugado por via endovenosa a un paciente de manera que se concentre en las células cancerosas presentes en el microambiente de la médula ósea. El inmunoconj ugado anula sustancialmene la resistencia a los fármacos mediada por la adhesión de las células (CA -DR) y destruye una porción sustancial de las células tumorales que expresan CD138 en el microambiente de la médula ósea. Específicamente, la molécula omoléculas efectoras se liberan del anticuerpo por medios naturales y destruyen las células tumorales. El inmunoconj ugado previene, por lo menos en parte, la adhesión de las células tumorales a las células del estroma, parte de las cuales pueden resultar destruidas por la molécula efectora al difundirse. Al cabo de un período de tiempo de 12 horas se administra el agente citotóxico. El agente citotóxico, cuya actividad se reduce, por lo menos, por medio de CAM-DR, puede actuar sobre las células tumorales que no están asociadas a las células del estroma y destruye las células tumorales que expresan CD138, que han escapado a la acción del inmunoconjugado.
El CD138 o syndecan-1 (al que también se describe como SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; ANTÍGENO CD138, número de acceso SwissProt: P18827 humano) es una glucoproteina de membrana que en un principio se descubrió que estaba presente en las células de origen epitelial y posteriormente se lo encontró en las células hematopoyéticas (Sanderson, 1989) . CD138 tiene un largo dominio extracelular que se une a las moléculas solubles (por ejemplo, los factores de crecimiento EGF, FGF, HGF) y a moléculas to insolubles (por ejemplo, a los componente s de la matriz extracelulares colágeno y fibronectina) a través de las cadenas de sulfato de heparina (Langford, 1998; Yang, 2007) y actúa como receptor de la matriz extracelular. CD138 también media en la adhesión de célula con célula por medio de moléculas que se unen a la heparina expresadas por las células adherentes. Se ha demostrado que CD138 cumple una función como co-receptor para los factores de crecimiento de las células de mieloma (Bisping, 2006) . Los estudios de diferenciación de células plasmáticas demostraron que CD138 también debe ser considerado antigeno de diferenciación (Bataille, 2006) .
En ' la hematopoyesis maligna, CD138 se expresa abundamente en la mayoría de las células de MM, carcinoma de ovario, carcinoma renal, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, células de carcinoma de colon y células de linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemia linfocítica cróninca (CLL) , (Horvathova, 1995), leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia mieloblástica aguda (AML) ( Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b) ) , sarcomas de tejido sólido, sarcomas tisulares, carcinomas de colon, como asi también otras malignidades hematológicas y tumores sólidos que expresan CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al., 2004; Orosz and Kopper, 2001) .
Otros cánceres que han demostrado ser positivos para la expresión de CD138 son muchos adenocarcinomas ováricos, carcinomas de vesícula biliar de células transicionales , carcinomas renales de células claras, carcinomas de pulmón de células escamosas, carcinomas mamarios y cánceres uterinos (ver, por ejemplo, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).
En el compartimiento hematopoyético humano normal, la expresión de CD138 se limita a las células plasmáticas (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999) y CD138 no se expresa en los linfocitos, monocitos, granulocitos y de la sangre periférica y en los glóbulos rojos sanguíneos.
Específicamente, las células madre y progenitoras CD34+ no expresan CD138 y los mAbs anti-CD138 no afectan el número de unidades formadoras de colonias en los cultivos de células madre hematopoyéticas ( ijdenes, 1996) . En los compartimientos nno hematopoyét icos , CD138 se expresa principalmente en los epitelios simples y estratificados del interior del pulmón, hígado, piel, riñon e intestino. Sólo se observó una tinción tenue en las células endoteliáles (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996) . Se ha informado que CD138 existe en formas polimórficas en las células de linfoma (Gattei, 1999) .
Se ha informado que los anticuerpos monoclonales B-B4, BC/B-B4 , B-B2, DL-101, 1 D4 , MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, en particular B-B4, son específicos para CD138. De esos, B-B4, 1D4 y MI15 reconocieron tanto la molécula entera como la protéina núcleo de CD138 y se demostró que reconocían los mismos epítopes u otros estrechamente relacionados (Gattei, 1999) . Los estudios anteriores dieron a conocer que B-B4 no reconocía el CD138 soluble, sino sólo CD138 en forma unida a la membrana (Wijdenes, 2002) .
B-B4, un mAb de IgGl murina, se' une a un epítope lineal entre los residuos 90-95 de la proteína núcleo en el syndecan-1 humano (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998) . Coincidiendo con el patrón de expresión de CD138, se demostró que B-B4 reacciona fuertemente con la línea de células plasmáticas RPMI8226, anque no reacciona con las células endoteliales . También en consonancia con el patrón de expresión de CD138, B-B4 también reaccionó con las líneas de células epiteliales A431 (derivada de queratinocitos) y HepG2 (derivada de hepatocitos) . Una inmunotoxina B-B4-saporina también resultó altamente tóxica contra la línea de células plasmáticas RPMI8226, de hecho, fue considerablmente más tóxica que la saporina libre. Sin embargo, de las dos líneas de células epiteliales analizadas, la B-B4-saporina exhibió toxicidad sólo para la línea celular A431, si bien en un ensayo clonogénico la saporina ' B-B4 no exhibió efecto inhibitorio sobre el sobredesarrollo de células A431 (Vooijs, 1996) . Otros investigadores dieron a conocer la falta de especificidad de los antígenos asociados al MM contra tumores (Couturier, 1999) .
La expresión anticuerpo/inmunoconj ugado "que consiste esencialmente en" ciertos componentes se refiere, en el contexto de la presente invención, que el anticuerpo/inmunoconjugado consiste en los componentes especificados y calquier material o componente adicional que no afecte sustancialmente las características básicas del anticuerpo.
La presente invención utiliza el término "célula tumoral" para incluir células cancerosas asi como células precancerosas que pueden, o no, formar parte de un tumor sólido .
Un "agente de direccionamiento al blanco" puede, de acuerdo con la presente invención, asociarse a una molécula expresada por una célula blanco e incluye péptidos y no péptidos. En particular, los agentes de direccionamiento al blanco de acuerdo con la presente invención inclyen anticuerpos de direccionamiento al blanco y moléculas de direccionamiento al blanco no inmunoglobulina que se peden basar en proteínas no inmunoglobulinas , incluyendo, aunque no a modo de limitación, las moléculas AFFILIN®, ANTICALINS® y AFFIBODIES®. Las moléculas de direccionamiento al blanco no inmunoglobulina también incluyen moléculas de direccionamiento al blanco no peptídicás tales como ADN y ARN oligonucleótidos (aptámeros), aunque también ligandos' fisiológicos, en particular ligandos fisiológicos, especialmente ligandos del antigeno en cuestión, como por ejemplo CD138.
Un ^"anticuerpo de direccionamiento al blanco" de acuerdo con la presente invención es o se basa en un anticuerpo natural o se produce por medio de síntesis o por ingeniería genética y se une a un antígeno en una o más células (células blanco) de interés Un anticuerpo de direccionamiento al blanco de acuerdo con la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespecifico (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico) o un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo de direccionamiento al blanco puede ser modificado, por ejemplo, para mejorar su afinidad para las células blanco (Ross, 2003) o disminuir su inmunogenicidad . El anticuerpo de direccionamiento al blanco puede estar acoplado a una formulación de liposomas que incluye moléculas efectoras (Cárter, 2003) . Un fragmento de anticuerpo comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antigeno o variable del anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antigeno o variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente ' invención se incluyen los fragmentos Fab, Fa ' , F(ab')2 y Fv, aunque también diacuerpos, anticuerpos de dominio (dAb) (Ward, 1989; Patente de . los Estados Unidos 6.005.079); anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpos. En un anticuerpo del fragmento variable de cadena simple (scFv) , las cadenas pesada y liviana (VH y VL) pueden estar conectadas por un ligante de aminoácidos corto que tiene, por ejemplo, la secuencia (glicina4serina) n, que tiene suficiente flexibilidad para permitir que los dos dominios conformen un bolsillo de unión al antígenon funcional. La adición de diversas secuencias señal puede dar lugar al direccionamiento al blanco más preciso del anticuerpo de direccionamiento al blanco. La adición de la región constante de cadena liviana (CL) puede permitir la dimerización por medio de enlaces de disulfuro, otorgando mayor estabilidad y avidez. Las regiones variables para construir los scFv se pueden obtener, si se dispone de un mAb contra un objetivo de interés, por RT-PCR, que separa en los clones las regiones variables del ARN extraído del hibridoma original. Por otro lado, se puede generar el scFv de novo mediante tecnología de exhibición de fagos (Smith, 2001) . En el presente contexto, se utiliza el término "fragmento funcional", cuando se hace referencia a un anticuerpo direccional, para referirse a una porción del anticuerpo de direccionamiento ' al blanco que tiene capacidad para unirse específicamente a un antígeno al que se une el anticuerpo al que se hace referencia. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención puede tener, por ejemplo, por lo menos un brazo que es reactivo contra un tejido una porción ligante (Publicación de Patente de los Estados Unidos 20020006379) . Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención también puede ligarse a más de un antígeno en una célula blanco (Cárter, 2003) . Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser modificado, por ejemplo, mediante la introducción de residuos de cisteina para introducir grupos tiol (Olafsen, 2004).
De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo de direccionamiento al blanco puede ser obtenido de cualquier fuente, que puede consistir, aunque no a modo de limitación, en un anticuerpo de camello, un anticuerpo mrino, un anticuerpo quimérico humano/de ratón o un anticuerpo quimérico humano/de mono, especialmente un anticuerpo quimérico humano/de ratón tal como nBT062.
Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias derivadas de un anticuerpo humano y de un anticuerpo no humano y también están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos adecuados para humanizar anticuerpos inclyen el injerto de CDR (injerto de regiones determinantes de la complementariedad) (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patente de los Estados Unidoss 5.530.101 y 5.585.089), recubrimiento o reacabado superficial (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), reordenamiento de cadena (Patente de los Estados Unidos 5.565.332) y Delnmunosation™ (Biovation, LTD) . En el injerto de CDR, se injertan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del mAb B-B4, por ejemplo, en las regiones marco variables humanas, que luego se unen a las regiones constantes humanas para generar un anticuerpo B-B4 humano (hB-B4) . En la actalidad y varios anticuerpos humanizados por injerto de CDR para uso clínico, incluyendo MYLOTARG (Sievers et al., 2001) y HECEPTIN (Pegram et al, 1998).
La tecnología de reacabado superficial utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variables del anticuerpo para que se asemeje a las superficies de anticuerpos conocidos del huésped objetivo. Las estrategias y métodos para el reacabado superficial de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos contra un huésped diferente han sido descriptos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 5.639.641. Se pueden preparar anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, entre los que se incluyen métodos de exhibición de fagos. Ver, también las Patentes de los Estados Unidos 4.444.887. 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y las publicaciones de solicitud de patente internacional : WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 <y WO 91/10741.
En la presente se hace referencia a los anticuerpos de direccionamiento al blanco que han sufrido cualquier modificación no natural, como por ejemplo los anticuerpos quiméricos humano/de ratón o anticuerpos quiméricos humano/ de mono, anticuerpos humanizados o anticuerpos que son modificados para mejorar, por ejemplo, su afinidad por las células blanco o disminuir su inmunogenicidad, aunque también fragmentos de anticuerpos, en particular fragmentos funcionales de dichos anticuerpos de direccionamiento al blanco que han sufrido cualquier modificación no natural, diacuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecificos como anticuerpos direccionales modificados .
Los anticuerpos quimerizados mantienen la región de unión al antigeno (región ABR o Fab) del anticuerpo no humano, por ejemplo el anticuerpo murino en el cual se basan, en tanto que las regiones constantes posibles pueden ser aportadas, por ejemplo, por un anticuerpo humano. En general, la quimerización y/o intercambio de regiones constantes de un anticuerpo no afecta: la afinidad de un anticuerpo, puesto que las regiones del anticuerpo que contribuyen a la unión al antigeno no son afectadas por este intercambio. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo modificado, especialmente quimerizado de la presente invención, puede tener una afinidad de unión más elevada (como lo expresan los valores de KD) que el anticuerpo no humano respectivo en el que se basa. En particular, el anticuerpo nBT062 y los anticuerpos basados en el mismo pueden tener una afinidad de anticuerpo más elevada que el B-B4 murino. En otra modalidad preferida de la presente invención, los inmunoconjugados que comprenden esos anticuerpos modificados/quimerizados también exhiben esta mayor afinidad del anticuerpo. Estos inmunoconjugados también pueden exhibir, en ciertas modalidades, otras propiedades ventajosas, tales como una mayor reducción de la carga tumoral que sus contrapartes con contenido de B-B4. En una modalidad preferida, los anticuerpos de direccionamiento al blanco modificados, especialmente los anticuerpos direccionales quimerizados, exhiben afinidades de unión que se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) de menos de 1, 6, menos de 1,5 o aproximadamente o menos de 1,4, en tanto que sus contrapartes murinas se caracterizan . por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o más de 1,6. Los inmunoconjugados que comprenden agentes de direccionamiento al blanco tales como anticuerpos de direccionamiento al blanco se pueden caracterizar por constantes de disociación KD (nM) de menos de 2,6, menos de 2,5, menos de 2,4, menos de 2,3, menos de 2,2, menos de 2,1, menos de 2,0, menos de o aproximadamente 1..9 son preferibles, en tanto que los inmunocon ugados que comprenden la los anticuerpos de la contraparte murina se pueden caracterizar por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o más de 2,6 (compárese la Tabla 3, Materiales y Métodos) .
También se pueden utilizar anticuerpos completamente humanos. Esos anticuerpos pueden ser seleccionados por el enfoque de exhibición de fagos, en que se utiliza CD138 o un determinante antigénico del mismo para unirse selectivamente al fago que expresa, por ejemplo, las regiones variables de B-B4 (ver, Krebs, 2001) . Este enfoque se acopla ventajosamente a una técnica de maduración de afinidad para mejorar la afinidad del anticuerpo. Todos los anticuerpos a los que se hace referencia en la presente son anticuerpos aislados.
En una modalidad, el anticuerpo de direccionamiento al blanco es, en su forma no conjugada, moderadamente o escasamente internalizado. La internalización moderada constituye aproximadamente 30% a aproximadamente 75% de la internalización del anticuerpo, la escasa internalización constituye aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 30% de internalización al cabo de 3 horas de incubación a 37°C. En otra modalidad preferida, el anticuerpo de direccionamiento al blanco se une a CD138, por ejemplo, los anticuerpos B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2 en particular B-B4. Se han depositado células de hibridoma, generadas mediante la hibridación de células SP02/0 de mieloma con esplenocitos de ratones Balb/c en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder eg 1, D-38124 Braunschweig el 11 de diciembre de 2007. El número de identificación de estas células de hibridoma con expresión de B-B4 es DSM ACC2874. En otra modalidad, el anticuerpo de direccionamiento al blanco no se une sustancialmente a CD138 que no se expresa en la superficie celular Guando en el contexto de la presente invención se combina el nombre de un anticuerpo especifico con el término "anticuerpo de direccionamiento al blanco", como por ejemplo "anticuerpo de direccionamiento al blanco nBT062", esto significa que este anticuerpo de direccionamiento al blanco tiene la especificidad de unión del anticuerpo nBT062. Si se dice que un anticuerpo de direccionamiento al blanco "está basado" en un anticuerpo especificado, esto significa que este anticuerpo de direccionamiento al blanco tiene la especificidad de unión de este anticuerpo, pero que puede tomar cualquier forma que se adapte a la descripción de anticuerpo de direccionamiento al blanco que antecede. Cuando en el contexto de la presente invención se combina el nombre de un antigeno especifico con el término "anticuerpo de direccionamiento al blanco", como por ejemplo "anticuerpo de direccionamiento CD138" esto significa que este anticuerpo de direccionamiento al blanco tiene la especificidad de unión para CD138. Si, en el contexto de la presente invención se dice, por ejemplo, que un anticuerpo de direccionamiento al blanco hace algo "selectivamente", como por ejemplo que "que se dirige selectivamente al CD138 expresado en la superficie celular" o que es "selectivo" para algo, esto significa que hay una significativa selectividad (es decir, una mayor afinidad hacia las células CD138-positivas en comparación con las células CDl38-negativas ) , en el caso del ejemplo presentado, para CD138 expresado en la superficie de las células, en comparación con cualquier otro antigeno. Los efectos secundarios adversos en un ambiente dado se reducen significativamente o incluso se evitan en virtud de esta selectividad .
De acuerdo con la presente invención, las "moléculas de direccionamiento al blanco no inmunoglobulinicas" incluyen moléculas de direccionamiento al blanco derivadas de proteínas no inmunoglobulina, asi como moléculas de direccionamiento al blanco no peptídicas. Las pequeñas proteínas no inmunogloblínicas que incluye esta definición están diseñadas para tener afinidades específicas para, especialmente, CD138 expresado en la superficie. Estas pequeñas proteínas no inmunoglobulinicas incluyen moléculas modificadas basadas en el andamiaje tales como las moléculas Affilin® que tienen un peso molecular relativamente bajo tal como entre 10 kDa y 20 kDa. Los andamiajes apropiados incluyen, por ejemplo, gamma cristalino. Estas moléculas no tienen, en su estado natural, ninguna actividad de unión especifica hacia las moléculas blanco. Al modificar las superficies de la proteina por medio de aleatorización definida localmente de aminoácidos expuestos a solventes, se generan sitios de unión completamente nuevos. De esa manera, las proteínas que anteriormente no se unían se transforman en proteínas de unión específica. Dichas moléculas pueden ser específicamente diseñadas para unirse a un blanco, como por ejemplo CD138, y dar lugar a la administración específica de una o más moléculas efectoras (ver scil Proteins GmbH at www.scilproteins.com, 2004). Otro tipo de moléculas de direccionamiento al blanco no inmnoglobulínicas es el que se obtiene de lipocalinas e incluyen, por ejemplo, ANTICALINS®, que se asemejan en cierto grado, en estructura, a lasa inmunoglobulinas . Sin embargo, las lipocalinas están compuestas por una sola cadena peptídica de una única cadena polipeptídica con 160 a 180 residuos aminoácidos. El bolsillo de unión de las lipocalinas puede ser reformado para reconocer una molécula de interés con alta afinidad y especificidad (ver, por ejemplo, Beste et al., 1999). Los receptores bacterianos artificiales tales como los comercializados bajo la denominación comercial Affibody (Affibody AB) también están dentro del alcance de la presente invención. Estas moléculas receptoras bacterianas artificiales son proteínas sencillas pequeñas y pueden estar compuestas por un cúmulo de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de unión a IgG de la Proteína A (Staphylococcus aureus). Estas moléculas tienen propiedades de unión similares a las de muchas inmunoglobulinas, aunque de tamaño sustancíalmente menor, con un peso molecular que con frecuencia no es mayor que lOkDa y también son comparativamente estables. Las moléculas receptoras bacterianas artificiales han sido descriptas, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 5.831.012; 6.534.628 y 6,740,734.
Otras "moléculas de direccionamiento al blanco no inmunoglobulínicos" son ligandos fisiológicos del antígeno en cuestión. Los ligandos fisiológicos · de CD138 incluyen, por ejemplo, aunque no a modo de limitación, ADAMTS4 ( agrecanasa-1 ) , antitrombina-3 , bFGF, catepsina G, CCL5 (RANTES) , CCL7, CCL11, CCL17, CD44, colágenos (colágeno tipo 1, colágeno tipo 2, colágeno tipo 3, colágeno tipo 4, colágeno tipo 5, colágeno tipo 6), CXCL1, elastasa, gpl20 , HGF [factor de crecimiento de hepatocitos] , laminina-1, laminina-2, laminina-5, midquina, MMP-7, elastasa neutrofílica y pleiotrofina (HBNF, HBGF-8) . Entre las moléculas de direccionamiento al blanco no peptídicas se incluyen, aunque no a modo de limitación, oligonucleótidos de ADN o ARN que se unen a CD138 (aptámeros) .
Una "molécula efectora" de acuerdo con la presente invención es una molécula o un derivado o análogo de la misma, que está acoplada a un agente de direccionamiento al blanco, en particular un anticuerpo de direccionamiento al blanco y/o un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado, y que ejerce un efecto pretendido, por ejemplo apoptosis, u otro tipo de muerte celular, o una detención del ciclo celular continuo en la célula o células blanco. Las moléculas efectoras de acuerdo- con la presente invención incluyen moléculas que pueden -ejercer los efectos pretendidos en una célula blanco e incluyen, aunque no a modo de limitación, toxinas, drogas, en particular drogas citotóxicas de bajo peso molecular, radionúclidos , modificadores de la respuesta biológica, agentes formadores de poros, ribonucleasas, proteínas de cascadas de señalización apoptótica con actividades inductores de la apoptosis, enzimas citotóxicas, enzimas activadoras de profármacos, oligonucleótidos antisentido, anticuerpos o citoquinas, como así también derivados funcionales o análogos/fragmentos de los mismos. Las toxinas pueden incluir toxinas bacterianas tales como, aunque no a modo de limitación, la toxina de la difteria o Exotoxina A, toxinas vegetales tales como, aunque no a modo de limitación, Ricino. Las proteínas de cascadas de señalización apoptótica con actividades inductoras de la apoptosis incluyen, aunque no a modo de limitación, Granzima B, Granzima A, Caspasa-3, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Bid truncada (tBid) , Bax y Bak.
En una modalidad preferida, la efectora aumenta la administración efectora interna del inmunoconjugado, en particular cuando la forma natural del anticuerpo en el cual se basa el anticuerpo de direccionamiento al blanco es poco internalizable . En otra modalidad preferida la efectora es no selectiva en su estado nativo. En ciertas modalidades, la efectora tiene alta toxicidad no selectiva, incluyendo toxicidad sistémica, cuando se encuentra en su forma nativa. La "forma nativa" de una molécula efectora de la presente invención es una molécula efectora antes de unirse al agente de direccionamiento al blanco para formar un inmunoconjugado. En otra modalidad preferida, la toxicidad no selectiva de la molécula efectora se elimina sustancialmente tras la conjugación al agente de direccionamiento al blanco. En otra modalidad preferida, la molécula efectora causa, al alcanzar una célula blanco, la muerte o la deteción del ciclo celular continuo en la célula blanco. Una droga-molécula efectora de acuerdo con la presente invención incluye, aunque no a modo de limitación, una droga que incluye, por ejemplo, pequeñas drogas altamente citotóxicas que actúan como inhibidoras de la polimerización de tubulina tales como maitansinoides , dolastatinas , auristatina y criptoficina ; agentes alquilantes del ADN tales como análogos o derivados de CC-1065 (Patentes de los Estados Unidos 5.475.092; 5.585.499; 6.716.821) y duocarmicina ; antibióticos de enediina tales como caliqueamicina y esperamicina y potentes drogas taxoides (taxano) (Payne, 2003) . ' Son especialmente preferidos los maitansinoides y caliqueamicinas. Un efector maitansinoide incluye maitansinoides de cualquier origen, incluyendo, aunque no a modo de limitación, maitansinol sintético y análogos y derivados de maitansinol. Doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarzinostatina , macromicina, trenimon y cx-amanitina son algunas otras moléculas efectoras dentro del alcance de la presente invención. También están dentro del alcance de la presente invención las moléculas de ADN antisentido como moléculas efectoras. Cuando en la presente se combina el nombre, por ejemplo, de una droga o clase de drogas especifica con el término "efector" o "molécula efectora", se hace referencia a un efector de un inmunoconj ugado de acuerdo con la presente invención que est basado en la droga o clase de drogas especificada.
La maitansina es un producto derivado originariamente del arbusto etiope Maytenus serrata (Remillard, 1975; Patente de los Estados Unidos 3.896.111). Esta droga inhibe la polimerización de la tubulina, dando lugar al bloqueo mitótico y a la muerte celular (Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). La citotoxicidad de la maitansina es 200-1000 veces más elevada que la de las drogas contra el cáncer en uso clínico que afectan la polimerización de la tubulina, como por ejemplo los alcaloides de la vinca o taxol. Sin embargo, los ensayos clínicos de la maitansina indicaron que carecía de una ventana terapéutica debido a su alta toxicidad sistémica La maitansina y los maitansinoides son altamente citotóxicos, aunque en su uso clínico en la terapia contra el cáncer se ha limitado consideerablemente debido a sus severos efectos secundarios atribuidos, principalmente, a su baja selectividad por los tumores. Los ensayos clínicos con maitansina exhibieron serios efectos adversos sobre el sistema nervioso central y el sistema gastrointestinal.
También se han aislado maitansinoides de otras plantas, inclyendo tejido seminal de Trewia nudiflora (Patente de los Estados Unidos 4.418.064) Ciertos microbios también producen maitansinoides tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol (Patente de los Estados Unidos 4.151.042).
La presente invención se refiere a maitansinoides de cualquier origen, incluyendo maitansinol sintético y análogos de maitansinol que han sido descriptos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos 4.137.230 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650 4.362.663; 4.364.866; 4.371.533; 4.424.219 y 4.151.042.
En una modalidad preferida, el maitansinoide es un maitansinoide con contenido de tiol y se produce, más preferentemente, de acuerdo con los procesos descriptos en la Patente de los Estados Unidos 6.333.410 concedida a Chari et al o en el trabajo de Chari et al. (Chari, 1992) .
DM-1 -desacetil-N2- ( 3-mercapto-l-oxopropil ) maitansina) es una molécula efectora preferida en el contexto de la presente invención. DM1 es 3 a 10 veces más citotóxica que a maitansina, y se la ha convertido en profármaco ligándola por medio de uno o más enlaces de disulfuro a un anticuerpo monoclonal¦ dirigido hacia un antígeno asociado a tumores. Algunos de estos conjugados (en ocasiones denominados "profármacos activados por tumores" (TAP) ) no son citotóxicos en el compartimiento sanguíneo, puesto que se activan al asociarse con una célula blanco y se internalizan, liberando así el fármaco (Blattler, 2001) . Se hann desarrollado varios conjugados anticuerpo-DMl (Payne, 2003), y se los ha evaluado en ensayos cínicos. Por ejemplo, el tratamiento con huC242-DMl en pacientes con cáncer colorrectal fue bien tolerado, no indujo respuesta inmune detectable alguna y tuvo un periodo de circulación prolongado (Tolcher, 2003) .
Otros maitansinoides especialmente preferidos comprenden una cadena secundaria que contiene un enlace tiol estéricamente impedido como por ejemplo, aunque no a modo de limitación, los maitansinoides N2' -desacetil- N2' - (4-mercapto-l-oxopentil) -maitansina, a la que también se denomina "DM3," y N2' -desacetil- N2'- (4-metil-4-mercapto-l-oxopentil ) -maitansina, a la que también se denomina "DM4." La síntesis de DM4 es la ilustrada en las FIGS . 3 y 4 y ha sido descripta en otra parte de la presente. La DM4 difiere de DM1 y DM3 en que acarrea grupos metilo en su aC . Esto da lugar a un impedimento estérico cuando DM4 está acoplada por medio de un ligante específico que incluye, aunque no a modo de limitación, un ligante que comprende un enlace de disulfuró, con un agente de direccionamiento al blanco tal como nBT062. Se describe una amplia variedad de maitansinoides que acarrean un grupo tiol estéricamente impedido (que posee uno o dos sustituyentes, en especial sustituyentes alquilo, tales como sustituyentes metilo de DM4) en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2004/0235840, publicada el 25 de Nov. , 2004, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. El impedimento estérico conferido por grupos alquilo tales como grupos metilo en el carbono adyacente al átomo de azufre de DM3 y DM4 puede afectar el índice de escisión intracelular del inmunoconj ugado . La unidad alquilo variable puede afectar, por lo tanto, la potencia, eficacia y seguridad/toxicidad tanto in vitro como in vivo.
Como han dado a conocer Goldmahker et al. en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2006/0233814, dicho impedimento induce la alquilación (por ejemplo, la metilación) de la droga libre, una vez liberada la droga en su objetivo. La alquilación puede incrementar la estabilidad del fármaco, dando lugar al denominado efecto espectador. Sin embargo, como podrá apreciar la persona con capacitación en la técnica, otras moléculas efectoras que comprenden sustituyentes tales como grupos alquilo en posiciones que dan lugar a un impedimento estérico cuando el efector está acoplado a un agente de direccionamiento al blanco por medio de un ligante son parte de la presente invención (Publicación de Patente de los Estados Unidos 2004/0235840) . De preferencia, este impedimento induce una modificación química tal como alquilación de la droga libre para incrementar su estabilidad general, lo que permite que la droga no sólo induzca la muerte celular o la detención del ciclo celular continuo en las células tumorales que expresan CD138 aunque, optativamente, también afectan a las células auxiliares que, por ejemplo, sostienen o protegen a los tumores de las drogas, especialmente las células del estroma tumoral y la vasculatura tumoral y que por lo general no expresan CD138 para que se reduzca o se pierda su función de soporte o protección.
Los agentes de alquilación del ADN también son especialmente preferidos como moléculas efectoras e incluyen, aunque no a modo de limitación, análogos o derivados de CC-1065. CC-1065 es un potente antibiótico-antitumoral aislado de cultivos de Streptomyces zelensis y se ha demostrado que es excepcionalmente citotóxico in vitro (Patente de los Estados Unidos 4.169.888) . Dentro del alcance de la presente invención se encuentran, por ejemplo, los análogos o derivados de CC-1065 adescriptos en las Patentes de los Estados Unidos 5.475.092, 5.585.499 y 5.739.350. Como sabrá apreciar la persona con capacitacón en la materia, los a CC-1065 modificados descriptos en la Patente de los Estados Unidos 5.846.545 y los profármacos de análogos o derivados de CC-1065 descriptos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 6.756.397 también están dentro del alcance de la presente invención. En ciertas modalidades, los análogos o derivados de CC-1065 se pueden sintetizar, por ejemplo, de acuerdo con lo descripto en la Patente de los Estados Unidos 6.534.660.
Otro grupo de compuestos que constituyen moléculas efectoras preferidas son los taxanos, especialmente los de gran potencia y los que contienen grupos tiol o disulfuro. Los taxanos son venenos del huso mitótico que inhiben la despolimerización de la tubulina, para dar lugar a un aumento de la velocidad de ensamble de microtúbulos y muerte celular. Los taxanos que están dentro del alcance de la presente invención son, por ejemplo, los descriptos en las Patentes de los Estados Unidos 6.436.931; 6.340.701; 6.706.708 y en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos 20040087649; 20040024049 y 20030004210. Otros taxanos han sido descriptos, por ejemplo, nen la Patente de los Estados Unidos 6.002.023, Patente de los Estados Unidos 5.998.656, Patente de los Estados Unidos 5.892.063, Patente de los Estados Unidos 5.763.477, Patente de los Estados Unidos 5.705.508, Patente de los Estados Unidos 5.703.247 y Patente de los Estados Unidos 5.367.086. Como sabrá apreciar la persona con capacitación en la materia, los taxanos PEGilados tales como los descriptos en la Patente de los Estados Unidos 6.596.757 también están dentro del alcance de la presente invención.
Las moléculas efectoras de caliqueamicina de acuerdo con la presente invención incluyen gamma II, N-acetil caliqueamicina y otros derivados de caliqueamicina. La caliqueamicina se une, en forma especifica de la secuencia, al surco menor del ADN, sufre el rearreglo y expone los radicales libres, llevando a la rotura del ADN bicatenario, dando lugar a la apoptosis y muerte celular. Un ejemplo de molécula efectora de caliqueamicina que se puede utilizar en el contexto de la presente invención es el descripto en la Patente de los Estados Unidos 5.053.394.
Un inmunoconj ugado de acuerdo con la presente invención comprende por lo menos un agente de direccionamiento al blanco, en particular un anticuerpo de direccionamiento al blanco y una molécula efectora. El inmunoconj ugado podría comprender otras moléculas, por ejemplo para la estabilización. En' el caso de los inmunoconjugados, el término "conjugado" se utiliza generalmente para definir la asociación operativa del agente de direccionamiento al blanco con una o más molécula efectoras y no se pretende que se refiera únicamente a cualquier tipo de asociación operativa y no se limita particularmente a la "conjugación" química. Siempre que el a agente de direccionamiento al blanco se pueda unir al sitio blanco y que el efector acoplado funcione suficientemente de la manera pretendida, especialmente cuando se lo administra al sitio blanco, cualquier modo de acople es adecuado. Los métodos de conjugación de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque no a modo de limitación, el acoplamiento directo de la molécula efectora al anticuerpo de direccionamiento al blanco, con o sin modificación previa de la molécula efectora y/o del nticuerpo de direccionamiento al blanco o el acoplamiento por medio de ligantes. Los ligantes se pueden categorizar funcionalmente en, por ejemplo, ligantes lábiles en ácido, ligantes fotolábiles, ligantes escindibles por enzimas, como los ligantes que pueden ser escindidos por peptidasa. Los ligantes escindibles son los ppreferidos en muchas modalidades de la presente invención. Dichos ligantes escindibles se pueden escindir en las condiciones presentes en el ambiente celular, en particular un ambiente intracelular y no tienen efecto deletéreo sobre la droga liberada con la escisión. Los bajos pH, como por ejemplo pH 4 a 5, que pueden existir en ciertos departamentos intracelulares escinden los ligantes ácido-lábiles, en tanto que los ligantes fotolábiles se pueden escindir, por ejemplo, por la luz infrarroja. Sin embargo, son preferibles los ligantes que se escinden por/en las condiciones fisiológicas presentes en la mayoría de las células y en la presente se los denomina ligantes fisiológicamente escindibles. En consecuencia, los ligantes de disulfuro son los preferidos en muchas modalidades de la presente invención. Estos ligantes se escinden merced al intercambio de disulfuro, que puede tener lugar en condiciones fisiológicas, Los ligantes de disulfuro heterobifuncionales preferidos incluyen, aunque no a modo de limitación, N-succinimidil 3- ( 2-piridilditio ) propionato (SPDP) (ver, por ejemplo, Carlsson et al. (1978)), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.563.304), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) (ver, por ejemplo, número de registro CAS 341498-08-6), N-succinimidil 4- (N-rnaleimidometil ) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC) (ver, por ejemplo, Yoshitake et al., (1979)), y N-succinimidil 4-metil-4- [2- ( 5-nitro-piridil) -ditio] pentanoato (SMNP) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4.563.304). Las moléculas ligantes preferidas para usar e la composición de la presente invención son SPP, SMCC y SPDB.
Otros ligantes adecuados pueden incluir enlaces "no escindibles" tales como, aunque no a modo de limitación, Sulfosuccinimidil maleimidometil ciclohexan carboxilato (SMCC) , que es un ligante heterobifuncional con capacidad para igar compuestos con compuestos con contenido de SH. Las moléculas ligantes bifuntionales y heterobifuncionales , tales como las moléculas ligantes heterobifuncionales dirigidas a los hidratos de carbono, como por ejemplo S-(2-tiopiridil) -L-cisteina hidrazida (TPCH) , también están dentro del alcance de la presente invención (Vogel, 2004). La molécula efectora, como por ejemplo un maitansinoide, puede estar conjugada al anticuerpo de direccionamiento al blanco por medio de un proceso de dos pasos de reacción, que incluye, como primer paso, la modificación del anticuerpo de direccionamiento al blanco con un reactivo de entrecruzamiento tal como N-succinimidil piridilditiopropionato (SPDP) para introducir grupos ditiopiridilo en el anticuerpo de direccionamiento al blanco. En un segundo paso, se pueden agregar grupos ditiopiridilo al anticuerpo de direccionamiento al blanco. En un segundo paso, se puede agregar un maitansinoide reactivo que contiene un grupo tiol, tal como DM1, al anticuerpo modificado, para dar lugar al desplazamiento de los grupos tiopiridilo en el anticuerpo modificado y a la producción de un conjugado maitansinoide citotóxico/anticuerpo ligado por disulfuro (Patente de los Estados Unidos 5.208.020). Sin embargo, los procesos de conjugación en un paso tales como el descripto en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 20030055226 concedida a Chari et al también están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad de la presente invención se acoplan múltiples moléculas efectoras del mismo tipo o de tipos diferentes a un anticuerpo de direccionamiento al blanco. Como se: señalara en otro párrafo de la presente, la natraleza de los ligantes empleados puede influir sobre la matanza de espectadoras (Kovtun et al., 2006). Ver asimismo la discusión de la Fig. 13.
Los análogos y derivados de CC-1065 se pueden conjugar al agente de direccionamiento al blanco por medio, por ejemplo, de grupos ligantes PEG de acuerdo con lo descripto en la Patente de los Estados Unidos 6.716.821.
Las caliqueamicinas se pueden conjugar a los anticuerpos de direccionamiento al blanco por medio de ligantes (Patente de los Estados Unidos 5.877.296 y Patente de los Estados Unidos 5.773.001) o de acuerdo con los métodos de conjugación descriptos en la Patente de los Estados Unidos 5.712.374 y la Patente de los Estados Unidos 5.714.586. Otro método preferido para la preparación de conjugados de caliqueamicina es el descripto en la Publicación de Patente de los Estados Unidos 20040082764. Los inmunoconjugados de la presente invención pueden tomar la forma de proteínas de fusión recombinantes.
El término "agentes citotóxicos" comprende "drigas citotóxicas/para el cáncer" que incluyen otros agentes quimioterapéuticos tales como melfalan, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina y doxorubicina liposómica (DOXIL) , ciclofosfamida, etopósido, citarabina y cisplatino, corticosteroides tales como prendisona y dexametasona y agentes tales como talidomida, bortezomib, lenalidomida, aunque también inhibidores de la quinása tales como sorafenib o inhibidores de la HDAC (histona desacetilasa ) tales como romidepsina, como así también agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores , agentes inmunoestimuladores, agentes inmunosupresores, inhibidores de la angiogénesis , inhibidores de la proteina tirosina quinasa (PTK) . También se incluyen en esta definición los agentes citotóxicos basados en anticuerpos que tienen efecto citotóxico reconocido en la técnica. Anti-CD40 es un anticuerpo preferido. Otros anticuerpos incluyen, por ejemplo aunque no a modo de limitación, AVASTIN (bevacizuab) o MYELOMACIDE (milatuzumab) .
La TALOMTDA (a- (N-ftalimido) glutarimida ; taliomida), es un agente inmunomodulado . La fórmula empírica de la talidomida es C13Hio 204 y el peso molecular en gramos es 258,2. El número del CAS de la talidomida es 50-35-1. Parece tener múltiples acciones, incluyendo la capacidad para inhibir el crecimiento y supervivencia de las células de mieloma de diversas maneras y e inhibir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos.
VELCADE es un inhibidor del proteasoma utilizado para el tratamiento del mieloma múltiple. Se cree que VELCADE actúa sobre las células de mieloma causando la muerte celular y/o actúa indirectamente inhibiendo el desarrollo de las células de mieloma actuando sobre el microambiente óseo. Sin limitarse a teoría o modo de acción alguno, VELCADE altera de esa manera los procesos celulares normales, dando lugar a la inhibición del proteasoma que promueve la aopotosis.
REVLIMID es un agente inmunomodulador . Se cree que REVLIMID afecta múltiples vías en las células de mieloma, induciendo asi la apoptosis, inhibiendo el crecimiento de las células de mieloma, inhibiendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , de ese modo inhibiendo la angiogénesis, y redciendo la adhesión de las células de mieloma a las células del estroma de la médula ósea.
La Dexametasona es una hormona esferoide glucocorticoide sintética que actúa como antiinflamatorio e inmunosupresor . Cuando se la administra a pacientes con cáncer, la dexametasona puede contrarrestar los efectos secundarios de la terapia del cáncer. La dexametasona puede ser administrada asimismo sola o junto con otros agentes anticancerosos, incluyendo talidomida, adriamicina o vincristina .
El término "en combinación con" no se limita a la administración exactamente al mismo tiempo. Por el contrario, el término abarca la administración del inmunoconjugado de la presente invención y otro régimen (por ejemplo radioterapia) o agente, especialmente los agentes citotóxicos a los que se hiciera referencia anteriormente, en un orden y dentro de un intervalo de tiempo tal que puedan actuar juntos para conferir un beneficio que se incrementa en comparación con el tratamiento con sólo el inmunoconj ugado de la presente invención o bien, por ejemplo, el otro u otros agentes. Es preferible que el inmunoconj ugado y el otro u otros agentes actúen de manera aditiva y es especialmente preferible que actúen en forma sinérgica. Dichas moléculas se dan adecuadamente en cantidades que sean: efectivas para el propósito propuesto. El profesional médico capacitado-puede determinar empíricamente, o tomando en cuenta la farmacocinética y los modos de acción de los agentes, la o las dosis apropiadas de cada agente terapéutico, como asi también los momentos y métodos de administración. En el contexto- de la presente invención, se utiliza la expresión "coadministración" para referirse a la administración al mismo tiempo que el inmunocon ugado, con frecuencia en una forma de dosificación combinada.
El término "identidad de secuencia" se refiere a una medida de la identidad de las secuencias nucleotidicas o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de manera que se obtenga el apareamiento de más alto orden. El términino "identidad" per se, tiene el significado reconocido en la técnica y se la puede calcular utilizando técnicas publicadas. (ver, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M . , and Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence. Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Si bien exite un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es muy conocido por los técnicos capacitados (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Se una molécula especifica de ácido nucleico es por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de nBT062, o una parte de la misma, se puede detemrinar de manera convencional utilizando programas de computación tales como el software DNAsis software (Hitachi Software, San Bruno, Calif.) para el alineamiento incial de secencias seguido por el softare de secuencias de ADN/proteicas ESEE versión 3.0 (cabot@trog . mbb . sfu . ca) para alineamientos múltiples.
Si la secuencia de aminoácidos es por lo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, o parte de las mismas, se puede detemrinar de manera convencional utilizando programas de computación tales como el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), pare encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias .
Cuando se utiliza DNAsis, ESEE, BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia específica es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, se establecen los parámetros de tal manera que se calcule el porcentaje de identidad e la longitd total de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de referencia y que se dé lugar a brechas de homología de hasta 5 % del número total de ncleótidos en la secuencia de referencia .
Si, en el contexto de la presente invención, se hace referencia a una determinada identidad de secuencia con una combinación de residuos de una secuencia específica, esta identidad de secuencia se relaciona con la suma de todos los residuos especificados.
La molécula de anticuerpo básica es una estructura bifuncional en la cual las regioines variables se unen al antigeno en tanto que las regiones constantes restantes pupeden suscitar respuestas independientes del antigeno. Las clasis principales de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, están determinadas por las regiones constantes. Estas clases se pueden dividir a su vez en subclases (isotipos) . Por ejemplo, la calse IgG tiene cuatro isotipos, es decir, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4 que son determinados por las regiones constantes. De las diversas clases de anticuerpos humanos, se sabe que sólo la IgGl, IgG2, IgG3 e IgM humanas activan con efectividad el sistema de complementos. Mientras las regiones constantes no forman los sitios de unión al antigeno, la disposición de las regiones consantes y región bisagra pueden conferir flexibilidad de segmentos a la molécla, lo que permite que se una al antigeno.
Diferentes isotipos de IgG se pueden unir a los receptores Fe en células tales como monocitos, células B y células NK, para activar asi a las céllas para liberar citoquinas . Diferentes isotipos peden activar también los compementos, dando lugar a la inflamación local o sistémica. Específicamente, los isotipos de IgG diferentes se pueden unir a FcyR en diferentes grados. Las FcyRs son un grupo de glucoproteínas superficiales que pertenecen a la superfamilia de las Ig y se expresan principalmente en leucocitos. Las glucoproteinas FcvR se dividen en tres clases designadas FcyRI (CD64), FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16) . Si bien IgGl, IgG2 e IgG3 se unen con fuerza a una variedad de estas clases de glucoproteinas FcyR, IgG4 exhibe una unión mucho más tenue. Específicamente, la IgG4 es una fijadora intermediaria de of FcyRI, lo que da lugar a una ADCC (citotoxicidad celular dependiente del complemento) relativamente escasa o incluso ausente, y no se une a FcyRIIIA ni a FcyRIIA. La IgG4 también es una fijadora débil de FcyRIIB, que es un receptor inhibitorio. Más aun, IgG4 media en una fijación débil o ausente del complemento y una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) sólo débil o ausente. En el contexto de la presente invención, se puede emplear específicamente IgG4 para prevenir el direccionamiento al blanco a un blanco mediado por Fe del FcR hepático, ya que no exhibe interacción con FcRylI en las LSECs (células endoteliales sinusoides hepáticas) , poca o ninguna interacción con FcRyl-III en las células de Kupffer (macrófagos) y ninguna interacción con FcRylII en las células NK hepáticas. Ciertas mutaciones que reducen aun más la CDC también son parte de la presente invención. Por ejemplo, se demostró que los residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 reducen la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos) y la CDC (Amour, 1999; Shields, 2001) . Una o más mutaciones que estabilizan el anticuerpo también son parte de la presente invención (a las que en la presente se hace referencia como "mutaciones estabilizadoras") . Esas mutaciones inclyen, en particular, mtaciones leucina-a-ácido glutámico en la región CH2 de IgG4 e intercambios serina-por-prolina e el núcleo bisagra de IgG . Estas mutaciones redcen, en ciertas modalidades de la presente invención, la cantidad de medias moléculas a menos de 10%, menos de 5% y preferentemente menos de 2% o 1%. Más an, la vida media in vivo de los anticuerpos asi estabilizados se puede incrementar varios dias, incluyendo 1, 2, 3, 4 o más de 5 dias (Schuurman, 1999) .
Los agentes de direccionamiento al blanco, incluyendo los anticuerpos de direccionamiento al blanco descriptos en la presente también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión al antigeno, especialmente a CD138. Las afinidades de unión preferidas de los agentes de direccionamiento al blancos tales como anticuerpos de direccionamiento al blanco se caracterizan por constantes d disociación KD (nM) de menos de 1,6, menos de 1,5 o aproximadamente o menos de 1,4. En el caso de los inmunoconj ugados que comprenden dichos agentes de direccionamiento al blanco tales como anticuerpos de direccionamiento al blanco, son preferibles las constantes de disociación KD (nM) de menos de 1,6, menos de 1,5 or menos de 2,5, menos de 2,4, menos de 2,3, menos de 2,2, menos de 2,1, menos de 2,0, menos de or aproximadamente 1,9.
Una región de unión al antigeno (ABR) de acuerdo con la presente invención varia sobre la base del tipo de anticuerpo de direccionamiento al blanco o anticuerpo de direciconamiento diseñado empleado. En un anticuerpo de origen natral y en la mayoría de los anticuerpos quiméricos o humanizados, la región de unión al antigeno está constituida por una cadena liviana y los primeros dos dominios' de una cadena pesada. Sin embargo, en un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas livianas, la región de unión al antígeno está compuesta por, por ejemplo, los primeros dos dominios de la cadena pesada solamente, en tanto que los anticuerpos de cadena simple (ScFv) , que combinan en · una sola cadena polipeptídica los dominios variables de cadena liviana y cadena pesada de una molécula de anticuerpo, la ABR es aportada' por sólo una molécula de polipéptido. Los fragmentos FAB se obtienen habitualmente mediante digestión con papaína y tienen una cadena liviana y parte de una cadena pesada y, por consiguiente, comprenden una ABR con sólo un sitio de combinación con el antígeno. Por otra parte, los diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpos con dos regiones de unión al antígeno. En el contexto de la presente invención, no obstante, una región de unión al antigeno de un anticuerpo de direccionamiento al blanco o un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado es cualquier región que determine principalmente la especificidad de unión del nticuerpo de direccionamiento al blanco o un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado.
Si se dice que una ABR u otra región del anticuerpo de direccionamiento al blanco es "de un determinado anticuerpo", por ejemplo un anticuerpo humano o no humano, esto significa, en el contexto de la presente invención, que la ABR es idéntica a una ABR correspondiente de origen natural o que se basa en la misma. Una ABR se basa en una ABR de origen natural si tiene la especificidad de unión de la ABR de origen natural. Sin embargo, ese tipo de ABR puede comprender, por ejemplo, mutuaciones puntuales, adiciones, deleciones o modificaciones postranslacionales tales como glucosilación . Dicha ABR puede tener, especialmente, más de 70%, más de 80%, más de 90%, preferentemente más de 95%, más de 98% o más de 99% de identidad de secuencia con la secuencia de la ABR de origen natural .
El direccionamiento al blanco homogéneo de un agente de direccionamiento al blanco tal como un anticuerpo de direccionamiento al blanco, en especial un inmunocon ugado que comprende el mismo, en el contexto de la presente invención, es una medida de la varianza asociada con la obtención del resultado pretendido de dicho direccionamiento al blanco con un agente de direccionamiento al blanco. En ciertas modalidades de la presente invención, se obtiene el resultado pretendido mediante simple unión al blanco. Este es el caso, por ejemplo, en las modalidades en las cuales un determinado agente de direccionamiento al blanco otorga un escudo contra una unión posterior. Sin embargo, se puede evaluar fácilmente la homogeneidad de un agente de direccionamiento al blanco, por ejemplo por medio de la eficicacia de un inmunoconjugado que comprende dicho agente de direccionamiento al blanco. Por ejemplo, la eficacia de dicho inmunoconjugado contra un antigeno tumoral tal como CD138, que comprende un efector destinado el desarrollo de un tumor, se puede determinar según el grado de supresión del crecimiento de un tumor que comprende células que expresan, el antigeno CD138. Ese tipo de inmunoconjugado puede exhibir una elevada varianza de su eficacia. Por ejemplo, puede detener el crecimiento del tumor, en ocasiones, con alta eficacia, pero otras veces con una eficacia que escasamente excede la eficacia del control. Una varianza baja en la eficacia de un inmunoconjugado, por otra parte, demuestra que el inmunoconjugado y/o el agente de direccionaraiento al blanco, respectivamente, producen en forma constante el resultado pretendido. Una manera de cuantificar la homogeneidad de direccionamiento al blanco consiste en calcular la variación del direccionamiento al blanco. En el contexto del desarrollo de tumores detenido por un inmunoconj ugado que comprende un determinado agente de direccionamiento al blanco, se puede calcular la variación de direciconamiento determinando, en primer lugar, el tiempo que ha de transcurrir hasta que un tumor alcance un volumen predeterminado, por ejemplo de 300mm3. De preferencia, el volumen predeterminado es eleggido de manera que el desarrollo del tumor antes y después de alcanzar dicho volumen predeterminado se incremente de manera estable aproximadamente a la misma velocidad. Una vez que se ha determinado ese lapso correspondiente a un número de sjetos, se calcula la media de estos lapsos (Tm) del grupo de sujetos (por ejemplo, ratones SCID u otro modelo adecuado que exhiba crecimiento homogéneo de los tumores) . A continuación se correlaciona la Tm con las observaciones realizadas en los sujetos del grupo, que demuestra que la eficacia mínima de direciconamiento y, por consiguiente, que está asociada con tumores que necesitan la menor cantidad de tiempo (Tf) para alcanzar dicho volumen predeterminado y, por otro lado, el sujeto del grupo que exhibe la mayor eficacia de direccionamiento al blanco y por consiguiente, está asociado con los tumores que más tiempo requieren (T3) para alcanzar dicho volumen predeterminado calculando la variación de direccionamiento al blanco para el volumen predeterminado de acuerdo con la siguiente fórmula: VARIACIÓN DE DIRECCIONAMIENTO AL BLANCO [%] = Ts-Tf/Tm x 100 En una modalidad preferida, la variación de direccionamiento al blanco del inmunocon ugado que comprende el anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado de la presente invención es de menos de 150%, menos de 140%, menos de 130%, menos de 120%, menos de 110%, menos de 100%, menos de 90%, menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, o menos de 50% y, en ciertas modalidades, incluso menos de 45%. De preferencia, la variación de direccionamiento al blanco es de entre aproximadamente 10% y aproximadamente 150%, preferentemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 100%, aproximadamente 10% y aproximadamente 80%, aproximadamente 10% y aproximadamente 70%, aproximadamente 10% y aproximadamente 60%, aproximadamente 10% y aproximadamente 50%.
También se puede cuantificar la homogeneidad de direccionamiento al blanco por otros medios tales como la determinación del retardo de crecimiento del tumor. Además, como puede apreciar fácilmente la persona capacitada en la materia, el volumen tumoral de un determinado tamaño sólo es un parámetro basado en el cual se puede determinar el retardo del crecimiento de los tumores. Además, ede apreciar fácilmente la persona capacitada en la materia, el volumen tumoral de un determinado tamaño sólo es un parámetro basado en el cual se puede determinar la variación de direccionamiento al blanco. Dependiendo del resultado pretendido, se pueden emplear otros parámetros incluyen el tiempo (por ejemplo, la medición del retardo del crecimiento del tumor) o el % de unión. La persona con capacitación en la material puede determinar fácilmente esos otros parámetros.
La FIG. 9 ilustra en (C) y (D) las diferencias de homogeneidad de direccionamiento al blanco/unión entre los inmunoconjugados que comprende el anticuerpo murino BB4 (BB4-SPP-DM1; FIG. 9C) y el anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado nBT062 (nBT062-SPP-DMl; FIG. 9D) basado en el mismo. Como se puede apreciar en estos gráficos, los resultados obtenidos con el inmunoconj ugado que comprende el anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado son sustancialmente más homogéneos que los. obtenidos con los inmunoconjugados que comprendem anticuerpo murino. Esto es particularmente notable, puesto que la región de unión al anticuerpo de BB4 no fue modificada en nBT062. Por consiguiente, los inmunoconjugado que comprenden la región de unión al anticuerpo del anticuerpo murino, pero no otras partes del anticuerpo murino, exhibieron proiedades que excedieron en mucho los resultados que habría esperado una persona con capacitación en la técnica. nBT062 (ver también la FIG. 1) es un mAb de IgG4 quimérico humano murino, una versión quimerizada de B-B4. Ésta versión quimerizada de B-B4 fue creada para reducir la respuesta al HAMA (Anticuerpo Anti-Ratón Humano) , manteniendo al mismo tiempo la funcionalidad de la región de unión al anticuerpo de B-B4 para CD138. Sorprendentemente, los resultados obtenidos utilizando un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado fueron mucho más homogéneos (se redujo la varianza de los resultados) . El protocoló para la producción de nBT062 está detallado a continuación. Las células de ovarios de hámster chino que expresan nBT062 han sido depositadas en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig el 11 de diciembre de 2007. El número de identificación es DSM ACC2875. En el presente contexto se hace referencia a un anticuerpo quimérico esecifico para basado en B-B4, en forma genérica, como C-B-B4.
Se ha predicho la secuencia de aminoácidos correspondiente a ambas cadenas, pesada y liviana, según la traducción de la secuencia de nucleótidos de nBT062. Las secuencias de aminoácidoss predicha para la cadena pesada y la cadena liviana están consignadas en la Tabla 1. Las regiones variables predichas están en negrita, las CDR están subrayadas.
Tabla 1. Secuencia de Aminoácidos Estimada correspondiente a nBT062 - secuencia estimada de la cadena pesada de nBT062 h (SEC ID NO: 1) : 1 QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS NY IEWVKQR PGHGLE IGE 51 ILPGTGRTIY NEKFKGKATF TADISSNTVQ MQLSSLTSED SAVYYCARRD 101 YYGNFYYAMD YWGQGTSVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTC VVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSQUEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG (K) La lisina C-terminal es proclive a cortarse y podría estar presente debido al corte incompleto en cierto grado. La (K) entre paréntesis no es parte de SEC ID NO: 1. - secuencia estimada de la cadena de nBT062 (SEC ID NO: 2) : 1 DIQMTQSTSS LSASLGDRVT ISCSASQGIN NYLNWYQQKP DGTVELLIYY 51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIGTYYCQQ YSKLPRTFGG 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC La Tabla 2. ilustra una comparación de las definiciones generales de CDR de Krabat y Chothia y las CDRs previstas para BT062 Definición de CDR de Kabat nBT062 Cadena liviana CDR1: residuos 24-34 CDR1 : residuos 24-34 CDR2: residuos 50-56 CDR2: residuos 50-56 CDR3: residuos 89-97 CDR3: residuos 89-97 Cadena pesada CDR1: residuos 31-35 CDR1 : residuos 31-35 CDR2: residuos 50-56 CDR2 : residuos 51-68 CDR3: residuos 95-102 CDR3: residuos 99-111 Definición de CDR de Chothia nBT062 Cadena liviana CDR1: residuos 26-32 CDR1 : residuos 24-34 CDR2: residuos 50-52 CDR2 : residuos 50-56 CDR3: residuos 91-96 CDR3 : residuos 89-97 Cadena pesada CDR1: residuos 26-32 CDR1 : residuos 31-35 CDR2: residuos 52-56 CDR2 : residuos 51-68 CDR3: residuos 96-101 CDR3: residuos 99-111 BT062 es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de direccionamiento a CD138 nBT062 que está acoplado por medio de un ligante, en este caso SPDB, al derivado maitansinoide citostático DM4. En las FIGS . 1 y 2 se presenta la representación química de BT062. Los Inmunoconjugados que comprenden nBT062 y una molécula efectora maitansinoide se caracterizan con frecuencia en térmninos de su ligante y efector maitansinoide, por ejemplo nBT062-SMCC-D l , es un inmunoconj ugado que comprende nBT062, S CC (un ligando "no escindióle" que conreiene un enlace tioéster) y DM1 como efectora. En términos más genéricos, también se puede describir a un inmunoconj ugado con contenido de nBT062 y una molécula efectora como nBT062-ligante-efector o sólo nBT062-efector (nBT062N, donde N es cualquier efector descripto en la presente .
En la presente se hace referencia a una contraparte no impedida (UI: inmunoconj ugado no impedido) d eun inmunoco jugado que comprende un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado contra CD138 acoplado a una molécula efectora a través de un ligante escindible (CL) y se lo describe en la presente como UICL, que se contrapone a un inmunoconjugado en el cual dicha molécula efectora está estéricamente impedida y contiene un ligante escindible (HICL -inmunoconjugado impedido, ligante escindible) . El UICL es un inmunoconjugado equivalente al HICL que comprende un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado en el cual la molécula efectora, sin embargo, no está estéricamente impedida. Entre los ejemplos de pares de HICL/UICL se cuentan BT062 y nBT062-SPP-DMl . Una contraparte no impedida de ese tipo de inmunoconjugado que comprende un ligante no escindible (UINCL) se refiere al inmunoconjugado equivalente que comprende un anticuerpo de direccionamiento al blanco diseñado en 'el cual la molécula efectora no tiene impedimento esférico y comprende un ligante no escindible. En el caso de BT062, nB O 62—SMCC-DM1 constituirla un ejemplo de dicha contraparte no impedida que comprende un ligante no escindible (UNICL) .
Una · actividad inhibitoria del crecimiento de tumores (^actividad inhibitoria del desarrollo de tumores) de un inmunoconjugado es una medida relativa. Describe la actividad inhibitoria del desarrollo de tumores de un conjugado con respecto a la actividad del inmunoconjugado más eficiente cuya actividad se considera de 100%. Por ejemplo, si la actividad del inmunoconjugado de mayor eficiencia, digamos BT062, que casa un retardo del crecimiento del tumor (TGD) de 32 días, se considera que es de 100%, se calcula la actividad, por ejemplo, de nBT062-DM1, que exhibe un retardo del crecimiento de tumores (TGD) de 18 días de la siguiente manera: Actividad Inhibitoria del Desarrollo de Tumores = = ÍOOX (TGDnBT062-DMl/TGDBT062) ; en términos más genéricos: Actividad Inhibitoria del Desarrollo de Tumores = = IOOX (TGDMuestra/TGDReferencia) · La Tabla 3 presenta ejemplos adecuados según los resultados ilustrados en la Fig. 11B: Tabla 3: Retardo del crecimiento de tumores (TGD) y el % de Actividad de nBT062-DMx contra xenoinjertos de tumores MOLP-8 en ratones SCID basados en grupos de tratamiento que recibieron dosis de 450 µg/kg.
(*) Retardo del crecimiento de tumores (TGD) en términos de media de tiempo en días por grupo de tratamiento hasta alcanzar un tamaño predeterminado (160 mm ) menos la media de tiempo correspondiente al grupo control hasta alcanzar el tamaño predeterminado.
(**) Actividad inhibitoria del desarrollo de tumores =100x (TGDMUestra/TGDBT062) . Se define que la actividad de BT062 es de 100%.
En el ejemplo presentado e la Tabla 2, BT062 produce un crecimiento de la actividad inhibitoria de tumores que excede a la de su contraparte no impedida (nBT062-SPP-D l ) en 60%, y un crecimiento de la actividad inhibitoria de tumores que excede a la de su inmunoconjugado contraparte no impedido que comprende un a ligante no escindible (nBT062-SMCC-DMl) en 44%.
Ya se ha dado a conocer que un ligante escindible de por ejemplo, los inmunoconjugados huC242-maitansinoide puede producir un efecto denominado espectador. Goldmahker et al. (Publicación de Patente de los Estados Unidos 2006/0233814) también describen que el efecto espectador es particularmente acentado cando se somete a la molécula efectora a más modificación, especialmente alquilación, tras la escisión del agente de direccionamiento al blanco. Goldmahker et al. demostraron asimismo que UICL exhibía mejor TGD que el UINCL consiguiente (ver, por ejemplo, la Fig. 6 de la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2006/0233814) .
Sin embargo, la efectividad general de los inmunoconjugados HICL/UICL/UINCL parece diferir de inmunocon ugado a inmunoconj ugado y/o de blanco a blanco. Por ejemplo, el HICL trastuzumab-SPP-DM4 fue claramente superado en eficiencia en cuanto a su capacidad para reducir el tamaño de los tumores por el UINCL trastuzumab -SMCC-DM1, en tanto que la eficiencia del inmunoconj ugado UICL trastuzumab -SPP-DM1 se asemejó sustancialmente al HICL correspondiente (ver la Publicación de Patente de los Estados Unidos 2008/0171040 concedida a Eberts et al.), determinando así que los resultados obtenidos estén en función del inmunocon ugado y el blanco.
La Fig. 11 A ilustra que el HICL superó en eficiencia al UICL y al UNICL; también se encontró con sorpresa que un UICL, en un régimen de dosificación única elevada (250 g/kg) no exhibía, en realidad, resultados mejores que el UINCL. De hecho, el TGD en días observado en un UICL en ese tipo- de régimen fue en realidad inferior al del UNICL. Esta observación se acentuó aun más con un aumento de la dosis (450pg/kg). En sma, como se illustra en la Fig. 11A, el HICL superó en eficiencia al UICL enn los experimentos con dosis únicas en un grado inesperado. En consonancia con estos resultados, en los experimentos de dosis repetidas, el HICL superó considerablemente en eficiencia al UNICL, y los resultados de este último solo excedían marginalmente a los del control. Además, el UICL fue superado en eficiencia por el UINCL en dosis más elevadas.
Se ha responsabilizado a la adhesión de las células de mieloma múltiple a las células del estroma, en particular a las células del estroma de la médula ósea, por la farmacorresistencia mediada por la adhesión (CA -DR) que se ha observado en los pacientes con mieloma múltiple. En ciertas modalidades, los inmunocon ugados de la presente invención pueden mitigar la CAM-DR. En particular, en ciertas modalidades de la presente invención, esta adhesión de reduce mediante la administración del inmunoconj ugado a dichas células de mieloma múltiple, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o más. Como se ilustra en la Fig. 17E, en particular el UICL y el HICL pudieron inhibir la adhesión . de las células de mieloma múltiple a las BMSCs (células del estroma de la médula ósea) en muestras en las cuales sólo se trataron las células del estroma (como así también en las muestras en las cuales no se trataron las células del estroma), en tanto que la contraparte UINCL no tuvo este efecto. Estos resultados sugieren que el efecto de reducción de la adhesión depende de la natraleza del ligante del inmunconjugado, siendo preferible un ligante escindible que permite que la molécula efectora se disocie más fácilmente. El hecho de que se previene, por lo menos en parte, que las células de mieloma múltiple se adhieran a las BMSCs también las torna más fácilmente accesibles a otros agentes citotóxicos, incluyendo los que habitualmente se inhiben por la acción, por lo menos con eficiencia total, sobre las células de mieloma múltiple como resultado de la CAM-DR. Por consiguiente, la administración del inmunoconjugado se combina preferentemente con una administración simultánea o consecutiva del agente citotóxico. Los intervalos de tiempo entre la administración del inmunoco jugado y el agente citotóxico puede comprender de 12 horas a 6 dias, includyendo 12 horas, 24 horas, 2, 3, 4 o 5 dias.
Los inmunoconjugados descriptos en la presente pueden ser administrados por cualquier vía, inclyendo la via endovenosa, parenteral oral, intramuscular, intratecal o en forma de aerosol. El modo de adminisración depende del efecto pretendido. Un profesional capacitado sabrá determinar fácilmente la mejor via de administración para un tratamiento especifico de acuerdo con la presente invención. La dosis apropiada depende de la vía de administración y del tratamiento indicado, y puede ser fácilmente determinada por un profesional capacitado en vista de los protocolos de tratamiento actuales.
Se pueden preparar composiciones farmacéuticas que contienen el inmunoconjugado de la presente invención y/o cualquier otro agente citotóxico como ingredientes activos de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Ed. (1985, ack Publishing Co . , Easton, Pa . ) . Por lo general, se mezclan las cantidades efectivas de los ingredientes activos con un vehículo aceptable para uso farmacéutico. El vehículo puede asumir una amplia variedad de formas,- dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo endovenosa, oral, parenteral, intratecal, transdérmica o en aerosol.
En el caso de la administración oral, se pueden conjugar' con el inmunoconjugado y/o agente citotóxico preparaciones sólidas o líquidas tales como cápsulas, pildoras, comprimidos, pastillas, caramelos para disolver, polvos, suspensiones o emulsiones. En la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales, como por ejemplo agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes, agentes suspensores y demás, como en el caso de las preparaciones liquidas (como por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones) o vehículos tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y demás en el caso de las preparaciones sólidas orales (como -por ejemplo polvos, cápsulas' y comprimidos). Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y cápsulas representan la forma de unidad de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso, como es obvio, se eplean vehículos farmacéuticos sólidos. Si resulta conveniente, los comprimidoss pueden estar revestidos con azúcar o con revestimiento entérico por técnicas normales. El agente activo debe ser estable para el paso a través del tracto gastrointestinal. En caso de ser necesario, se pueden utilizar agentes adecuados para el paso estable, que pueden incluir fosfolípidos o derivados de lecitina descriptos en la literatra, como así también liposomas, micropartículas (incluyendo microesferas o macroesferas ) .
En el caso de la administración parenteral, el the inmunoconj ugado y/o agente citotóxico puede estar disuelto en un vehículo farmacéutico y administrado en forma de solución o de suspensión. Entre los vehículos adecados ilustrativos se cuentan agua, solución salina, solución buffer de fosfato (PBS), soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, etanol o aceites de origen animal, vegetal o sintético. El vehículo puede contener además otros ingredientes, como por ejemplo conservantes, agentes de suspensión, agentes solubilizantes , buffers y demás. Cuando se está administrando el agente de direccionamiento al blanco sin conjugar y/o inmunoconj ugado y/o agente citotóxico por vía intracerebroventricular o intratecal, también se los puede disolver en fluido cerebroespinal.
Las dosis administradas a un sujeto pueden ser especificadas como cantidad, por área superficial del sujeto (que incluye humanos y también animales no humanos. La dosis puede ser administrada a ese sujeto en cantidades, preferentemente, aunque no exclusivamente, de aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2 , incluyendo de aproximadamente 20mg/m2, aproximadamente 50mg/m2, aproximadamente 100mg/m2, aproximadamente 150mg/m2, aproximadamente 200mg/m2 y aproximadamente 250mg/m2. En ciertas modalidades, en las cuales se administra el inmunoconj ugado en combinación con un agente citotóxico, la dosis del inmunoconj ugado puede ser más baja. Los inmunoconj ugados se administran adecuadamente en una vez o en el curso de una serie de tratmientos. En un régimen de múltiples dosis, estas cantidades pueden ser administradas una vez por día, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas o vez cada seis semanas. Las dosis de carga con una sola dosis elevada o, por otro lado, dosis más bajas que se administran con poco tiempo entre las mismas seguidas por dosis administradas a intervalos más prolongados constituyen una modalidad preferida de la presente invención. En una modalidad preferida, el tiempo de administración de las dosis a un sujeto se ajusta de maanera que haya transcurrido un lapso suficiente antes de un segundo y/o cualquier tratamiento subsiguiente, de manera que la dosis anterior se haya metabolizado sustancialmente, pero que la cantidad del inmunoconjugado presente en el organismo del paciente siga inhibiendo, retardando y/o previniendo el desrrollo de un tumor. Un régimen de "dosis única repetida" ilstrativao comprende la administración de una dosis inicial del inmunoconjugado de aproximadamente 200mg/m2 una vez cada tres semanas. Por otro lado, a una dosis inicial elevada le puede seguir una dosis de mantenimiento bisemanal de aproximadamente 150 g/m2. Sin embargo, pueden ser de utilidad otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia es fácilmente monintoreado por técnicas y análisis conocidos. La dosificación puede variar dependiendo de si se la administra con fines preventivos o terapéuticos , del curso de cualquier terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al agente de direccionamiento al blanco/inmunocon ugado, y del criterio del facultativo a cargo.
En una modalidad, se administra el inmunoconjugado con uno o más agentes citotóxicos adicionales, que es eficiente para el tratamiento de la misma enfermedad pero que, al ser administrado sin el inmunoconjugado, con frecuencia es de efectividad limitada en vista del CAM-DR; por ejemplo se puede administrar un inmunoconjugado específico para CD138 en combinación con dexametasona . En particular, se administra dexametasona a un paciente que lo necesita, en una cantidad efectiva dos horas después de la administración del inmunoconj ugado .
Por consiguiente, el inmunoconj ugado de la presente invención también puede ser administrado específicamente en regímenes de tratamiento con altas dosis de quimioterapia (preferentemente, melfalan, melfalan/prednisona (MP) , vincristina/doxorubicina/dexametasona (VAD) , doxorubicina liposómica /vincristina, dexametasona (DVd) , ciclofosfamida , etopósido/dexametasona/citarabina , cisplatino (EDAP)), transplantes de células madre (por ejemplo, transplante de células madre autólogas o transplante de células madre alogénicas, y/o transplante de células madre minialogénicas (no ·. mieloablativas ) ) , esteroides, (por ejemplo, corticoesteroides, dexametasona, talidomida/dexametasona, prednisona, melfalan/prednisona) , terapia de soporte (por ejemplo, bisfosfonatos , factores de crecimiento, antibióticos, inmunoglobulina endovenosa, radioterapia en bajas dosis y/o intervenciones ortopédicas) , THALOMID (talidomida, Celgene) , VELCADE (bortezomib, Millennium) , y/o REVLIMID ( lenalidomida) (Chelgene Corporation) y/ otros tratamientos del mieloma múltiple, incluyendo terapia de radiación.
Si se administra un inmunoconj ugado de la presente invención en combinación con un agente citotóxico, con frecuencia se mantienen las dosis y regímenes citados. Sin embargo, si se coadministra el inmunconjugate y el agente citotóxico, en ciertas modalidades son preferibles dosis bajas de cada uno de estos componentes terapéuticos. En ese caso, se puede administrar el inmunoconj ugado en dosis de aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 100 mg/m2, incluyendo de aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 50 mg/m2, en tanto que el agente citotóxico es administrado en la dosis recomendada cando se lo administra solo.
Los datos experimentales obtenidos en los experimentos basados en cultivo celular (Fig. 7) y en ratones (Figs. 8 a 11), fueron confirmados además con experimentos que también confirmaron estos hallazgos.
La patogénesis del mieloma múltiple implica la unión de las células de mieloma, por medio de moléculas de adhesión a la superficie celular, no sólo a las células del estroma de la médula ósea (BMSCs) sino también en la matriz extracelular (ECM) . Esta unión dispara, y por consiguiente se la puede considerar responsable en última instancia, el desarrollo de las células de mieloma múltiple, fármacorresistencia y la migración de las células de MM en el medio de la médula ósea (Munshi et al. 2008) . En particular, la adhesión de las células de mieloma múltiple al ECM a través de syndecan-1 (CD138) al colágeno tipo I induce la expresión de la metaloproteinasa de matriz 1, promoviendo asi la resorción del hueso y la invasión por el tumor (Hideshima et al. 2007). Las interacciones entre las células de mieloma múltiple y el microambiente de la médula ósea dan lugar a la activación de una cascada pleiotrópica proliferátiva y antiapoptotica.
Después del anidamiento de las células de mieloma múltiple en el compartimiento del estroma de la médula ósea, la adhesión entre las células de mieloma múltiple y las BMSCs regula a más muchas citoquinas como interleuquina-6 (IL-6) y el factor de crecimiento insulinico 1 (IGF-1) que tienen actividades angiogénicas y promotoras del crecimiento de tumores (Hideshima et al. 2007). Las cascadas de señalización iniciadas por estas citoquinas eventualmente dan lugar a la resistencia de las células MM a las terapias convencionales (Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006) .
La eficacia in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 contra céulas tumorales CD138 positivas en presencia de de la médula ósea humana fue analizada en un modelo de ratón y los resultados de este análisis están expuestos en la Fig. 12. La Figure ilustra que tanto HICL como UICL dan buen resultado en este ambiente. El aumento del nivel de shulL-6R que, en este modelo, se puede utilizar como parámetro del crecimiento de las células de MM, fue suprimido por estos conjugados.
De acuerdo con la presente invención, se trata el MM de la siguiente manera, con el uso de BT062 como ejemplo. Este ejemplo no pretende limitar la presente invención de manera alguna, y un técnico capacidado puede determinar fácilmente otros sistemas basados en inmunoconj ugados o nBT062 que están dentro del alcance de la presente invención y otros regímenes de tratamiento que se podrían utilizar para el tratamiento de enfermedades tales como el MM.
Debido a la expresión selectiva de CD138 en las células de MM del paciente a través de las células accesibles del torrente sanguíneo, la especificidad de nBT062 y la estabilidad de BT062 en el torrente sanguíneo, BT062 elimina la toxicidad sistémica de DM4 y ofrece la oportunidad de dirigir la administración de DM4-molécula (s) efectora(s). Los inmunoconj ugados de la presente invención otorgan un medio para la administración eficaz de las moléculas efectoras a los sitios celulares, en que las moléculas efectoras pueden ser liberadas de los inmunoconjugados .
Se administra uno o más agentes . citotóxicos en las formas de dosificación y de acuerdo con protocolos de tratamiento establecidos para estos agentes citotóxicos, a un individuo a quien también se trata con un inmunoconj ugado de la presente invención.
En particular, se somete a un paciente a un régimen de tratamiento utilizando una dosis apropiada de BT062, por ejemplo, 100mg/m2 de acuerdo con la presente invención a ciertos intervalos, por ejemplo en un principio diariamente y luego en forma semana. Doce horas después de cada tratamiento con inmunoco ugado, también se trata al paciente con melfalan, por ejemplo, mediante la administración al paciente de una dosis oral de acuerdo con las indicaciones del fabricante (por ejemplo una gragea comercializada bajo la marca ALKERAN) .
De acuerdo con la presente invención, también se pueden tratar, en particular, tumores sólidos de la manera siguiente utilizando BT062 como ejemplo. Este ejemplo no tiene por fin limitar la presente invención de manera alguna y un profesional capacitado podria determinar fácilmente otros inmunoconj ugados de la presente invención otros regímenes de tratamiento que se podrían utilizar para el tratamiento de los tumores sólidos. En primer lugar se trata el tumor para reducir el tamaño del tumor, por ejemplo en forma radioactiva. La administración posterior de BT062, seguida por una dosis de un agente citotóxico, por ejemplo en forma de gragea de ALKERAN, ofrece un medio sumamente eficaz para eliminar las células cancerosas residuales. La administración del inmunoconjugado permite el direccionamiento específico al blanco de estas células residuales y liberación de las moléculas efectoras en el sitio objetivo. El inmunocon ugado no sólo anula o disminuye el CAM-DR con respecto a su propia actividad, sino que debido al hecho de que inbhibe la adhesión de las células de mieloma múltiple a las células del estroma, el inmunocon ugado también anula o disminuye el CAM-DR de otros agentes citotóxicos. La elevada eficacia del inmunoconj ugado da lugar, en las modalidades preferidas, a un régimen de dosis únicas.
La presente invención se describe en forma más detallada con referencia a los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a título ilustrativo y no tienen por fin limitar la invención de manera alguna. Se utilizan técnicas corrientes muy conocidos en la técnica o las técnicas específicamente descriptas a continuación.
Materiales y Métodos Construcción de Anticuerpos Quiméricos (cB-B4: nBT062) B-B4 En estos experimentos se utilizó el anticuerpo B-B4 murino antes caracterizado (Wijdenes et al., Br J Haematol:, 94 (1996), 318) .
Clonación y expresión de B-B4 y cB-B4 / nBT062 Se llevaron a cabo técnicas de ADN recombinante standard de acuerdo con lo descripto en detalle en los libros de texto, por ejemplo en el de J. Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2a Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, o¦ de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en los casos en que se utilizaron kits. Se llevó a cabo la clonación por PCR y modificación de las regiones variables de ratón utilizando metodología standard de PCR. Se utilizaron los cebadores indicados en la respectiva sección de resultados.
Expresión de cB-B4 / nBT062 Se cosecharon células COS en crecimiento exponencial, cultivadas en DMEM suplementado con FCS al 10 %, 580 g/ml de L-glutamina, 50 Unidades/ml depenicilina y 50 µg/ml de estreptomicina mediante tripsinación y centrifugación y se las lavó en PBS . Se resuspendieron las células en PBS a una concentración final de lxlO7 células/ml. Se transfirieron 700 µ? de suspensión de células COS a una cubeta de Gene Pulser y se las mezcó con ADN vector de expresón de cadea pesada y cadena liviana kappa (10 µg de cada una o 13 µg de Supervector) . Se electroporaron las células a 1900 V, 25 ? usando un Pulsador de Genes a Bio-Rad. Se cultivaron las células transformadas en DMEM suplementado con 10 % de FBS libre de gamma globulina, 580 µg/ml de L-glutamina, 50 Unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina por espacio de 72 h antes de cosechar los sobrenadantes del cultivo celular con contenido de anticuerpos.
ELISA de captura para medir los niveles de expresión de CB-B4 / ???062 Se revistieron placas de 96 pocilios con alícuotas de 100 µ? de 0,4 µg/ml de anticuerpo Ig de cabra anti-humano diluido en PBS (4°C, de un día para otro). Se lavaron las placas tres veces con 200 µ?/buffer de lavado de los pocilios (PBS+ T een-20 al 0,1%). Se bloquearon los pocilios con BSA al 20 %, Tween-20 al 0,02 % en PBS, antes de la adición de 200 µ? de los sobrenadantes del cultivo celular que contenia el anticuerpo secretado (incubación a 37 °C por espacio de una hora) . Se lavaron los pocilios seis veces con buffer de lavado antes de la detección del anticuerpo unido con conjugado de peroxidasa de cabra antihumano de cadena liviana kappa.
Purificación de cB-B4 / nBT062 de los sobrenadantes del cultivo celular Se purificó el anticuerpo cB-B4 a partir de los sobrenadantes de células COS 7 transformadas utilizando el kit de Proteina A ? InmunoPure Plus (Pierce, Rockford, IL) , de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de unión de cB-B4 y competencia Se realizó el análisis de la actividad de unión de B- B4 y CB-B4 a CD138 utilizando el kit sCD138 de Diaclone (Besancon, Francia) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, teniendo en cuenta los cambios descriptos en la sección de resultados.
Preparación del ARN y síntesis del ADNc Se cultivaron células B-B4 de hibridoma y se las procesó utilizando el kit Midi de Qiagen (Hilden, Alemania) para aislar ARN siguiendo el protocolo del fabricante Se sometió a aproximadamente 5 \ig de ARN de B-B4 RNA a transcripción inversa para producir ADNc de B-B4 usando el kit de síntesis de la hebra de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) siguiendo el protocolo del fabricante.
Clonación del ADNc de inmunogloblina B-B4 Se amplificó el ADNc de la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) por PCR usando el cebador de IgH MHV7 (5 ' -ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG-3 ' ) [SEC ID NO: 3] y el cebador de la región constante de IgGl MHCGl ( 5 ' -CAGTGGATA-GACAGATGGGGG-3 ' ) [SEC ID NO: 4]. De modo similar, se amplificó la cadena liviana de innmunoglobulina (IgL) empleando los tres cebadores diferentes de IgK MKV2 (5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3 ' ) [SEC ID NO: 5], MKV4 (5 ' -ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3 ' ) [SEC ID NO: 6] y MKV9 ( 5 ' -ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3 ' ) [SEC ID NO: 7], cada uno de ellos en combinación con el cebador MKC (5'-ACTG-GATGGTGGGAAGATGG-3 ' ) [SEC ID NO: 8]. Todos los productos de la amplificacón fueron directamente ligados con el vector pCR2.1-TOPO utilizando el kit de clonación TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Se seleccionaron bacterias E. coli TOP10 (Invitrogen) transformadas con las construcciones de vector pCR2.1 ligadas en placas de agar LB-ampicilina-Xgal agar. Se inocularon cultivos en pequeña escala con colonias blancas únicas, se los cultivó durante y se aislaron los plásmidos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Determinación de la secuencia de ADNc Se secuenciaron los plásmidos tillando el Kit de Secenciación BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction (ABI, Foster City, CA) . Se secuenció cada plásmido seleccionado en ambas direcciones utilizando los cebadores 1210 y 1233 ciclados en una máquina de PCR GeneAmp9600. Se realizó el análisis electroforético de secuencias en un secuenciador capilar ABI.
Se repitió el ciclo completo de RT-PCR, clonación y análisis de secuencias de ADN para obtener tres series completamente idependientes de información de secuencia por cada cadena de inmunoglobulina .
Secuencia de ADN de B-B4 VK Se realizaron síntesis de la hebra en tres reacciones independientes. Los productos de PCR generados mediante el uso de los cebadores MKC y MKV2 (secuencias presentadas anteriormente) fueron ligados en vectores pCR2.1-TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secenciaron clones de cada serie independiente de reacciones de RT-PCR en ambas direcciones. La secuencia del producto con cebador MKV2 fue muy similar a las transcripciones kappa estériles originados en la asociada de fusión de mieloma tal como MOPC-21, SP2 y Ag8 (Carroll et al., Mol Inmunol., 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157) y por lo menos se la desechó.
Los ' productos de PCR que utilizaban M C con los cebadores MKV4 y MKV9 eran similares entre si y diferian sólo en las posiciones vacilantes dentro del cebador de la secuencia líder.
Secuencia de ADN de B-B4 VH Se realizó la síntesis de la hebra en tres reacciones independientes y se clonaron y secenciaron los productos de PCR del producto de la primera hebra. Se secuenciaron cinco clones de cada primera hebra.
Construcción de vectores de expresión quiméricos cB-B4 La construcción de los vectores de expresión quiméricos conlleva la adición de una secuencia líder adecuada a la VH y VK, precedida por un sitio de restricción Bamñl y una secuencia de Kozak. La secuencia Kozak consensual es crucial para la traducción eficiente de la secuencia de regiones variables. Define el codón AUG correcto del cual un ribosoma puede dar comienzo a la traducción y la base más critica de todas es la adenina (o menos preferentemente, una guanina) en la posición -3, secuencia arriba del comienzo AUG. Se selecciona la secuencia líder como la secuencia más similar de la base de datos Kabat (Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991). Estas adiciones están codificadas dentro de los cebadores directos (For) (donde ambos cebadores tienen la secuencia 51 -AGAGAAGCTTGCCGCCACC-ATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3 ' [SEC ID NO: 9] ; el sitio de restricción está subrayado; la secuencia Kozak está en negrita) . Más aun, la construcción de los vectores de expresión quiméricos conlleva la introducción de un fragmento 5' de la región constante gammal humana, hasta un sitio de restricción Apal natural, contigua al extremo 3' de la región J de B-B4 y, en el caso de la cadena liviana, la adición de un sitio donador de corte y empalme y el sitio HindlII . La secuencia donadora de corte y empalme es importante para la anexión correcta en marco de la región variable a su región constante apropiada, separando así al intrón V:C. El intrón kappa + CK son codificados en la construcción de expresión secuencia abajo de la secuencia VK de B-B4. Del mismo modo, la CH gamma 4 es codificada en la construcción de expresión secuencia abajo con respecto a la secuencia de VH de B-B4 VH.
Se analizaron primero, meticulosamente, los genes VH y VK B-B4 para identificar cualquier sitio perjudicial posible donador de empalme, sitios aceptores de empalme, secuencias Kozak, para detectar la presencia de cualquier sitio de restricción de subclonación extra, que más tarde podría interferir con la subclonación y/o expresión del anticuerpo entero funcional. Se encontró un sitio HindIII perjudicial en la secuencia VK que fue necesariamente eliminado por mutagénesis de sitio específico por PCR sin cambiar la secuencia de aminoácidos. Para estas reacciones, se utilizaron los cebadores oligonucleótidos BT03 (5'-CAACAGTATAGTA-AGCTC-CCTC-GGACG-TTCG-GTGG-31 ) [SEC ID NO: 10] y BT04 (5 ' -CC-ACC-GAACG-TCCGA-GGGAGC-TTACT-ATACTG-TTG-3' ) [SEC ID NO: 11] y se ejecutó la mutagénesis de acuerdo con el protocolo del kit de Mutagénesis Quickchange de Stratagene (La Jolla, CA) .
Cebadores de quimerización de cadena Kappa Se alineó la secuencia líder de VK de B-B4, independiente de la secuencia del cebador de PCR, con secuencias líderes murinas de la base de datos Kabat. El apareamiento más cercano para la líder VH de B-B4 VH fue VK-10 ARS-A (Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085) . Se predice que esta secuencia líder es cortada correctamente por el algoritmo SignalP (Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). Los cebadores CBB4Kfor (ver lo anterior) y g2258 (5 ' -CGCG-GGATC-CACTCA-CGTTTGA-TTTCCAGC-TTGGT-GCCTCC-3' [SEC ID NO: 12]; El sitio de restricción está subrayado) fueron diseñados para genera un producto de PCR que contiene la líder completa, la región VK de B-B4 y sitios de restricción terminales ííindIII y BamHI, para la clonación en el vector de expresión pKNlOO. El cebador directo CBB4K introduce un sitio de restricción HindIII, un sitio de iniciación de la traducción Kozak y la secuencia líder VK-10 ARS-A. El cebador inverso g2258 introduce un sitio donador de corte y empalme y un sitio de restricción BamHI. Se clonó el fragmento así obtenido en los sitios de restricción fíindIII/BainHI de pKNlOO.
Cebadores de quimerización de cadena pesada Se alineó la secuencia líder no ambigua de VH B-B4, independiente de la secuencia del cebador de PCR con las secuencias líder murinas en la base de datos Kabat . El apareamiento más cercano para la líder VK B-B4 fue VH17-1A (Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214). Se predice que esta secuencia líder se corta correctamente merced al algoritmo SignalP. Se diseñaron los cebadores cBB4Hfor (ver lo anterior)^ y g22949 ( 5 ' -CGATGGGCCCT-TGGTG-GAGGC-TGAGGA- GACGGTG-ACTGA-GGTTCC-3 ' [SEC ID NO: 13]; El sitio de restricción está subrayado) para generar un producto de PCR que contiene la líder VH17-1A, la región VH B-B4, y los sitios de restricción terminales HindlII y Apal, para la clonación en el vector de expresión pG4D200. El cebador directo cBBHFor introduce un sitio de restricción HindlII, un sitio de iniciación de la traducción Kozak y la secuencia líder VH17-1A. El cebador inverso g22949 introduce el extremo 5' de la región C gamma4 y un sitio de restricción Apal natural. Se clonó el fragmento obtenido en los sitios de restricción HindlII /Apal de pG4D200, dando lugar al vector pG4D200cBB4.
Producción del anticuerpo cBB4 Se descongeló un vial de células COS 7 y se las cultivó en D EM suplementario con suero del clon fetal al 10 % con antibióticos. Una semana más tarde, se electroporaron las células (0,7 mi a razón de 107 células/ml) con pG4D200cBB4 más pKNl00cBB4 (10 iq de ADN cada uno) o sin ADN . Se cultivaron las células en 8 mi de medio de cultivo por espacio de 4 días. Se repitió la electroporación siete veces.
Detección del anticuerpo quimérico Se utilizó un ELISA sándwich para medir las concentraciones de anticuerpos en sobrenadantes de COS 7. Las células COS 7 transformadas en forma transitoria secretaron aproximadamente 6956 ng/ml de anticuerpo (no se presentan datos) .
Actividad de unión de cB-B4 Para analizar la actividad de unión de CB-B4 en los sobrenadantes de cultivo de COS 7, se utilizó el kit Diaclone sCD138, un ELISA sándwich de fase sólida. Se aplicó sobre los pocilios de las tiras microtitladoras provistas de un anticuerpo monoclonal especifico para sCD138. Durante la primera incubación, se incubó simultáneamente sCD138 y el anticuerpo B-B4 biotinilado (bio-B-B4) junto con una serie de diluciones de anticuerpo de ensayo sin marcar (B-B4 o cB-B4).
Se redujeron las concentraciones de bio-B-B4 en este ensayo para obtener la competencia con bajas concentraciones de anticuerpo sin marcar (de lo contrario la concentración de cB-B4 en los sobrenadantes del cultivo de células COS 7 era demasiado baja para obtener una competencia suficiente) . Los resultados de este ensayo revelan que ambos anticuerpos tienen la misma especificidad por CD138 (no se presentan datos) .
Purificación de cB-B4 Se purificó B-B4 de los sobrenadantes del cultivo de células COS 7 utilizando el kit de Proteina A InmunoPure Plus (Pierce), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (no se presentan datos) .
Determinación de la KD: Comparación nBT062/ BB4 Purificación de CD138 soluble Se purificó el antigeno CD138 soluble del sobrenadante de cultivo de células U-266 por FPLC usando una columna "HiTrap NHS-HP activado " de 1 mi acoplado a B-B . Se cargó el sobrenadante de cultivo celular en PBS-Buffer pH 7,4 en la columna y más tarde en el antigeno CD138 se eluyó con tri-etilamina 50 mM pH 11 en fracciones de 2 mi. Se neutralizó inmediatamente el CD138 eluido con 375 µ? de Tris-HCl 1 M, pH 3, para prevenir los daños estructurales y/o funcionales.
Biotinilación de CD138 Se utilizó sulfo-NHS-LC (Pierce) para marcar CD138. La biotinas activadas por NHS reaccionan de manera eficiente con grupos amino primarios como residuos lisina en buffers a pH 7-9 para formar enlaces amidicos estables.
Para la biotinilación de CD138, se desalaron 50 µ? de CD138 empleando columnas giratorias de proteína (Pierce) . Se disolvió el reactivo de biotinilación (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotina, Pierce) en H20 desionizada helada hasta una concentración final de 0,5 mg/ml. Se mezcló el reactivo de biotinilación y la solución de reactivo de captura con un exceso molar de 12 veces de reactivo de biotinilación en comparación con el reactivo de captura (50 pmol CD138 a 600 pmol de reactivo de biotinilación) y se lo incubó durante 1 h a temperatura ambiente, agitando suavemente el vial. Se separó el reactivo de biotinilación no unido utilizando columnas de desalado de proteínas.
Inmovilización de bCD!38 El chip sensor (SENSOR CHIP SA, BIACORE AB) usado en el ensayo BIACORE está destinado a fijar moléculas biotiniladas para el análisis de interacción en sistemas BIACORE. La superficie consiste en una matriz de dextrano carboximetilada preinmovilizada con estreptavidina y lista para la captura a alta afinidad de los ligandos biotinilados . La inmovilización de bCDl38 fue ejecutada en un SENSOR CHIP SA usando un índice de flujo de 10 µ?/min mediante inyección manual. Se acondicionó la superficie del chip con tres inyecciones consecutivas de 1 minuto de NaCl 1 M en NaOH 50 m . A continuación se inyectó el CD138 biotinilado durante 1 minuto.
Determinación de la KD de Diferentes Anticuerpos empleando BIACORE El software de BIACORE C utiliza máscaras predefinidas, asi llamadas "Wizards" (asistentes, guias) para diferentes experimentos en los que sólo se pueden cambiar ciertas opciones. Como el BIACORE C había sido desarrollado originariamente para medir concentraciones, no hay un asistente diseñado para llevar a cabo las mediciones de afinidad. Sin embargo, con la configuración adecuada, se podría utilizar el asistente para la "unión no específica" par medir las constantes de tasa de afinidad y, por lo tanto se los utilizó para la determinación de las KD. Con este asistente, se midieron dos células' de flujo y se fijó la fase de disociación en 90 s realizando la "Regeneración 1" con el buffer de corrida BIACORE. La "Regeneración 2", que es equivalente a la regeneración real, se llevó a cabo con Glicina-HCl 10 mM a pH 2,5. Después de este paso, el ligando CD138 estaba una vez más en su estado competente para la unión. Durante todo el procedimiento se utilizó HBS-EP como buffer de corrida y de dilución. Para determinar la unión de los diferentes anticuerpos (~150 kDa) a CD138, se analizó la asociación y la disociación en diferentes concentraciones (100, 50, 25 12,5, 6,25 y 3,13 nM) . Se determinaron las constantes de equilibrio de disociación calculando las constantes de velocidad la y kd. Posteriormente, se calcularon los valores KD de los analitos or el cociente de kd y ka con el software BIAevaluation . os resultados están expuestos en la Tabla 4.
Afinidad Anticuerpo KD (nM) KD media (nM) 1,4 nBT062 1,4 1,4 +/- 0,06 1,5 1,7 B-B4 1,7 1,6 +/- 0,06 1, 6 1,9 nBT062-SPDB-DM4 1,9 1,9 +/- 0,00 1,9 2, 6 B-B4-SPP-DM1 2,7 2,6 +/- 0,06 2,6 Tabla 4: Análisis comparativo de los valores KD de nBT062 y B-B4. Se consignan las desviaciones standard correspondientes a los valores medios de KD.
Discusión Se calcularon los valores medios de KD correspondientes a cada anticuerpo de tres experimentos independientes. Los resultados demuestran que, en todas las mediciones, nBT062 exhibe valores KD ligeramente reducidos en comparación con B-B4 (los valores medios de KD fueron 1,4 y 1,6 nM, respectivamente) .
Preparación de los Inmunoconjugados nBT062-DMl y huC242-DMl Se sintetizó el maitansinoide DM1 con contenido de tiol a partir del producto de la fermentación microbiana ansamitocina P-3, de acuerdo con lo descripto anteriormente por Chari (Chari et al., Cáncer Res. 1 (1992), 127). La preparación de C242 humanizado (huC242) (Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) ha sido descripta anteriormente. Se prepararon conjugados anticuerpo-droga de acuerdo con lo descripto anteriormente (Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618) . Un promedio de 3,5 moléculas de DM1 se ligaron por molécula de anticuerpo. nBT062-DM4 BT062 es un conjugado anticuerpo-droga compuesto por la droga citotóxica maitansinoide DM4, ligada mediante enlaces de disulfuro a través de un ligante al anticuerpo monoclonal quimerizado nBT062. Los maitansinoides son ant imitóticos que inhiben la polimerización de la tubulina y el ensamble de los microtúbulos (Remillard et al., Science 189 (1977), 1002) . En las FIGS . 1 y 2 se ilustran representaciones químicas y esquemáticas de BT062 (nBT062-DM4) .
Síntesis de DM4 El DM4 se prepara a partir del derivado my conocido maitansinol (Kupchan et al., J. Med. Chem. , 21 (1978), 31) . El maitansinol se prepara mediante escisión reductiva de la porción éster del producto de la fermentación microbiano, ansatocina P3, con hidruro de litio y trimetoxialuminio (ver la FIG. 3) .
El DM4 se sintetiza mediante acilación del maitansinol con N-metil-N- ( 4-metiditiopentanoil ) -L-alanina (cadena secundaria de DM4) en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y ' cloruro de zinc para dar el maitansinoide con contenido de disulfuro DM4-SMe. El DM4-SMe se reduce con ditiotreitol (DTT) para dar el maitansinoide DM4 deseado con contenido de tiol (ver la FIG. 4 por el diagrama de flujo de proceso de DM4 ) .
Inmunoconjugado BT062 El procedimiento para la preparación de nBT062-DM4 está esbozado en la FIG. 5. El anticuerpo nBT062 se modifica . con N-succinimidil-4- (2-piridilditio) butirato (ligante SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo . Se mezcla DM4 con el anticuerpo modificado en una concentración superior a los equivalentes de grupos ditiopiridilo. El conjugado BT062 se forma mediante la reacción de intercambio de disulfuro entre el grupo tiol de DM4 y los grupos ditiopiridilo introducidos en el anticuerpo por medio del ligante. La purificación por cromatografía y diafiltración separa los reactivos de bajo peso molecular (DM4) y los productos de la reacción (tiopiridina) , como así también agregados del anticuerpo conjugado, para producir la sustancia farmacéutica en masa.
Análisis de FACS y ensayos de citotoxicidad de WST Análisis de FACS Las células OPM-2 son líneas celulares de leucemia plasmática que exhiben alta expresión de CD138. Se incubaron células OPM-2 con nBT062, nBT062-SPDB-DM , nBT062-SPP-DMl o nBT062-SMCC-DMl en diferentes concentraciones (indicadas en la FIG. 6) . Se lavaron las células y se detectó el anticuerpo unido a CD138 o conjugados utilizando un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia en el análisis de FACS. Se representó la fluorescencia media medida en estos experimentos contra la concentración del anticuerpo.
Ensayo de Viabilidad Celular Se sembraron células MOLP-8 CD138+ en placas de fondo plano a razón de 3000 células/pocilio. Se sembraron células control CD138" BJAB a razón de 1000 células/pocilio. Se trataron las células con nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-DMl o nBT062-SMCC-DMl en diferentes concentraciones (indicadas en la FIG. 7) por espacio de cinco días. Se agregó reactivo WST (agua-sal de tetrazolio soluble, ROCHE) para medir la viabilidad celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ROCHE) . Se incubó el reactivo por espacio de 7,5 h en células MOLP-8 células y por espacio de 2 h en las células BJAB. Se calculó la fracción de células supervivientes basándose en las densidades ópticas medidas en un lector de microplacas utilizando procedimientos standard.
Discusión La unión de nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-D l, nBT062-SMCC-DM1 o nBT062 fue analizada por FACS . Se incubaron las células blanco OPM-2 CD138+ con nBT062 o los inmunoconj ugados y se detectaron las moléculas unidas a las células utilizando un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia. En la FIG. 6, se trazan las fluorescencias medias como medida de la cantidad de anticuerpo unido a las células contra diferentes concentraciones del anticuerpo o el conjugado. Los resultados demuestran que nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DMl y nBTO 62-SMCC-DM1 exhiben características de unión muy similares. Además, los resultados sugieren con fuerza que las características de unión del anticuerpo sin conjugar no resulta afectada por las toxinas conjugadas.
En los ensayos de viabilidad celular se analizó la actividad citotóxica del anticuerpo contra las células blanco MOLP-8 CD138+ y contra las células control de linfoblastoma CD138" BJAB B. Se sembraron ambas líneas celulares en placas de fondo plano y se las incubó con concentraciones crecientes de los inmunoconj ugados . Se utilizó el anticuerpo sin conjugar como control. Se analizó la actividad citotóxica cinco días después de la adición de los inmunoconjugados utilizando el reactivo WST para medir la viabilidad celular. En la FIG. 7 (A) -(C), se representa la fracción de células supervivientes con respecto a las células control tratadas con control de vehículo contra concentraciones crecientes del inmunocon ugado . Los resultados demuestran que la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4, nBTO 62-SPP-DM1 y nBT062-SMCC-DMl contra las células MOLP-8 es muy similar. Como se esperaba, las células control CD138- BJAB no fueron muertas por los inmunoconjugados, indicando que todos los inmunoconjugados actúan por medio de la unión a específica de las células a CD138. En los experimentos de competencia, en los cuales se preincubaron las células MOLP-8 con un exceso molar de nBT062 sin conjugar. La preincubación bloqueó sustancialmente la citotoxicidad de nBT062-SPDB-DM4 , produciendo más evidencia de que los inmunoconjugados matan las células por medio de la unión específica a CD138 en la superficie de las células (FIG. 7 (D) ) .
Experimentos de xenoinjerto de ratón Para evaluar la importancia del direccionamiento a CD138 de la actividad antitumoral de los conjugados anticuerpo-maitansinoide de una versión quimérica humana del anticuerpo B-B4, nBT062, se realizaron experimentos de xenoinjerto en ratones. Se prepararon dos versiones de los conjuqados nBT062 maitansinoide que pueden diferir en la estabilidad química de sus ligamientos de disulfuro (nBT062-SPP-DMl y nBT062-SPDB-DM4 ) . Se comparo la actividad antitumoral de estos conjugados anticuerpo-droga con la actividad del conjugado B-B4-SPP-DM1 (que comprende el anticuerpo parental murino) , como así también e maitansinoide libre sin conjugar (DM4), nBT062 nativo sin modificar, y un conjugado no direccional (irrelevante) IgGl-maitansinoide . Se evaluaron los conjugados en un modelo de xenoinjerto CD138-positivo (MOLP-8) de mieloma múltiple humano en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (S'CID) .
En estos ratones, se establecieron los tumores subcutáneos (ratones hembra CB.17 SCID) mediante inoculaciones de suspensiones de células MOLP-8. El tratamiento con una sola inyección de bolo endovenoso se llevó a cabo cuando los tumores alcanzaron volúmenes promedio de 113 mm3. Se monitorearon los cambios de volumen de los tumores y el peso corporal dos veces por semana. Los experimentos se llevaron a cabo en un lapso de 68 días después de la inoculación de los tumores.
Experimentos con Xenoinjerto en ratones ? Ratones Se Obtuvieron ratones hembra CB.17 SCID de cinco semanas de edad, , de Charle River Laboratories.
Líneas celulares de tumores Humanos MOLP-8, una línea celular de mieloma múltiple humano, fue provista por la ATCC. Las células MOLP-8, que expresan el antígeno CD138 en su superficie celular y desarrollan tumores de xenoinjerto en ratones SCID, fueron mantenidas en medio RPMI-1640 suplementado con L-glutamina 4 mM (Biowhittaker , Walkersville, MD) , 10% de suero fetal bovino (Hyclone, Logan, Utah) y 1% de estreptomicina/penicilina, a 37 °C en atmósfera humectada que contenía 5% de CO2.
PARTE I Desarrollo de Tumores en ratones Se inoculó cada ratón con lxlO7 células MOLP-8 por vía subcutánea en la zona debajo del hombro derecho. El volumen total fue de 0,2 mi por ratón, donde la relación de medio libre de suero a matrigel (BD Bioscience, Bedford, ??) era de 1/1 (v/v) . Antes del tratamiento, se monitorearon los tumores de xenoinjerto diariamente y se los dejó afirmar.
El volumen tumoral llegó a aproximadamente 113 mm3 aproximadamente 11 días después de la inoculación de células tumorales. La tasa de aceptación de tumores de los ratones CB.17 SCID fue de 100%.
Once días después de la inoculación de células tumorales, se seleccionaron 42 ratones basándose en los volúmenes tumorales y pesos corporales. El volumen de los tumores estuvo en el rango de 68,2 a 135,9 mm3. Se dividió aleatoriamente a los cuarenta y dos ratones en siete grupos (A-G) de seis animales cada uno sobre la base del volumen de los tumores.
Cada uno de los seis ratones del Grupo A recibió 200 µ? de PBS como control de vehículo. Cada ratón del grupo B recibió 13,8 mg/kg de anticuerpo desnudo nBT062. Esta dosis es equivalente a la cantidad de componente anticuerpo nBT062 en 250 g/kg de maitansinoide ligado. La relación de peso molecular de los maitansinoides al anticuerpo nBT062 en un conjugado es de aproximadamente 1/55. Cada ratón del Grupo C recibió 250 pg/kg de DM4. Cada ratón del Grupo D recibió 250 µg/kg de huC242-DM4. Los ratones de los grupos E, F y G -recibieron 250 ug/kg de nBT062-SPDB-DM4 , B-B4-SPP-DM1 y nBT062-SPP-DMl cada uno, respectivamente.
Se administraron todos los agentes por via endovenosa en forma de inyección única de bolo a través de una vena lateral del rabo con una jeringa de 1 mi equipada con una aguja calibre 27 de 1/2 pulgada (1,27 cm) . Con anterioridad a la administración, se diluyeron las soluciones maestras del anticuerpo nBT062, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl con PBS estéril a concentraciones de 2 mg/ml, 28,1 µg/ml y 28,1 g/ml, respectivamente, de manera que el volumen inyectado por cada ratón fuera de entre 120-220 µ? .
PA TE II En una segunda serie de experimentos, se inyectaron células MOLP-8 (l,5xl07 células por ratón), suspendidas en una mezcla 50:50 de medio libre de suero y matrigel por vía subcutánea en la zona debajo del hombro derecho en 100 µ?. Los volúmenes tumorales llegaron a aproximadamente 80 mm3 el día 11 y la media de los controles fue de aproximadamente 750 mm3 el día 25 después de la inoculación de las células. Se estimó que el tiempo transcurrido hasta la duplicación del tumor era de 4,58 días. Cada ratón del grupo control (n=6) recibió 0,2 mi de PBS estéril administrado en una vena lateral del rabo (i.v) en una inyección de bolo. Se estimó que el tiempo hasta la duplicación del tumor era de 4,58 dias. Todas las dosis del tratamiento se basaron en el maitansinoide conjugado. Nueve grupos (n=6) fueron tratados con una sola inyección endovenosa de nBT062-SMCC-D l, nBT062-SPDB-DM , o nBT062-SPP-DM1, en cada caso en dosis de 450, 250 y 100 g/kg. Un grupo adicional (n=6) recibió 250 pg/kg de nBT062-SMCC-DMl en una dosificación repetida (con frecuencia semanal durante cinco semanas) . Se dividieron los ratones al azar en once grupos (n=6) por volumen tumoral utilizando el Programa LabCat . Los tamaños de los tumores fluctuaban entre 40,0 y 152,5 mm3. Se dosificó a los ratones basándose en el peso corporal individual.
Se midió el tamaño de los tumores dos veces por semana en tres dimensiones empleando el Sistema LabCat (Tumor Measurement and Tracking, Innovative Programming Associated, Inc., Princeton, NJ) . Se calculó el volumen de los tumores en mm3 utilizando la metodología descripta por Tomayko et al., Cáncer Chemother. Pharmacol, 24 (1989), 148: Volumen= Longitud x Ancho x Altura Se calculó la matanza celular Logio con la fórmula descripta por Bissery et al., Cáncer Res., 51 (1991), 4845: Matanza celular Log: donde (T-C) o retardo del desarrollo del tumor es la media en días necesaria para que los tumores del grupo de tratamiento (T) y del grupo control (C) alcancen un tamaño predeterminado (600 mm3) . Td es el tiempo de duplicación del tumor, sobre la base del volumen tumoral medio en los ratones control y 3,32 es el número de duplicaciones celulares por el crecimiento celular logarítmico.
Resultados En las FIGS . 8 y 9 se ilustra el desarrollo de los tumores en los ratones individuales. En la FIG. 10 Se ilustra la media (+/- SD) del desarrollo de los tumores por cada grupo.
En comparación con el desarrollo de tumores en los animales tratados con PBS, el tratamiento con el anticuerpo nBT062, DM4 libre sin conjugar o el conjugado irrelevante no direccional huC2'42-DM4 no casó inhibición significativa alguna del desarrollo de los tumores.
Los tres conjugados dirigidos a CD138, nBT062-SPDB-DM4, B-B4 -SPP-DM1 y nBT062-SPP-DMl, en una dosis de 250 g/kg, causaron un acentuado retardo en el crecimiento de los tumores . Basándose en los volúmenes medios de los tumores en los grupos de tratamiento, el conjugado de DM4 nBT062-SPDB-DM4 fue el más activo, en tanto que el conjugado nBT062-SPP-DMl exhibió una actividad ligeramente incrementada en comparación con su contraparte murina B-B4- SPP-DMl (FIG. 10) . Los resultados obtenidos en ratones individuales demuestran, además, que la actividad antitumoral obtenida con B-B4-SPP-DM1 es más heterogénea y, por lo tanto, más previsible que es medida en los ratones tratados con nBT062-SPP-DMl . En términos de la homogeneidad de la actividad antitumoral, el otro conjugado que utiliza nBT062 como anticuerpo de direccionamiento al blanco nBT062-SPDB-DM4 se comportó de manera similar a nBT062-SPP-DM1.
No se observó reducción alguna del peso corporal en ningún grupo de tratamiento, lo que sugirió que los tratamientos eran bien tolerados.
Discusión Los resultados del análisis de los tres conjugados dirigidos a CD138 en animales experimentales demuestran la importancia de la administración dirigida al blanco para la actividad antitumoral. Si bien los conjugados maitansinoides de los anticuerpos quiméricos humanos nBT062 y los · anticuerpos murinos B-B4 exhiben actividad considerable medida según la matanza celular logarítmica, no hubo impacto significativo sobre el desarrollo de los tumores por el DM4 sin conjugar, el anticuerpo huBT062 nativo sin modificar ni un conjugado control no direccional (huC242-DM4) .
El inmunoconjugado preparado con el anticuerpo quimérico humano, nBT062-SPP-DMl, produjo una actividad antitumoral ligeramente más elevada que el conjugado preparado a partir de su contraparte murina, B-B4-SPP-DM1. Además, el tratamiento con nBT062-SPP-DMl y nBTO 62-SPDB-DM4 dio lugar a respuestas más homogéneas en los ratones individuales, en comparación con el tratamiento con B-B4-SPP-DM1. La elevada variación de unión de B-B4-SPP-DM1 fue la razón por la que la medición de la mediana de volumen tumoral (+/- SD) de los xenoinjertos de mieloma múltiple humano MOLP-8 en ratones CB.17 SCID en el tiempo (días) post-inoculación en realidad dieron lugar a resultados relativamente mejores con B-B4-SPP-D 1 que con nBT062~SPP- DM1 (no se ilustran datos) . Esta característica de los inmunoconjugados usando nBT062 como anticuerpo de direccionamiento al blanco parece ser ventajosa, especialmente en el caso del uso terapéutico de los conjugados.
Por último, el más potente de los conjugados maitansinoides , después de una administración única iv en los modelos de xenoinjerto MOLP-8 en ratones SCID, fue nBT062-SPDB-DM4.
Matanza de Espectadoras (ensayo de viabilidad celular) Se sembraron células OPM2 CD138+ y células Namalwa CD138" en placas de fondo redondo en pocilios separados, o bien en cocultivo. Se trató a las células con nBT062-SPDB-DM4 en concentraciones en el rango de lxlO-8 a lxlO-9 M. Se detectó la fracción de células viables utilizando reactivo WST (agua-sal de tetrazolio soluble, ROCHE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ROCHE) . Se calculó la fracción de células supervivientes sobre la base de las densidades ópticas medidas en un lector de microplacas utilizando procedimientos standard.
Discusión Se analizó la matanza de espectadoras de células no blanco en estrecha proximidad (presentes en los pocilios de fondo redondo) con las células de mieloma múltiple tras el tratamiento con nBT062-SPDB-DM4 en un estudio in vitro en el cual se cultivaron células 0PM2 CD138-positivas en cocultivo con células Namawla CD138-negativas (FIG. 13) . En general, mientras las células CDl38-positivas son muertas con eficacia por nBT062-SPDB-DM4 , las células CD138-negativas no fueron afectadas por el conjugado. En el cocultivo en los pocilios de fondo redondo, sin embargo, nBT062-SPDB-DM4 también mató las células antigeno negativas en estrecha proximidad con las células antigeno-positivas (un efecto al que con frecuencia se denomina matanza de espectadoras). Kovtun et al. (2006) comentaron que la matanza de espectadoras mediada por los conjugados maitansinoides tiene lugar en estrecha proximidad con las células antigeno-positivas. Kovtun et al. (2006), que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, también describe la importancia del ligante del inmunoconj ugado . In vivo, la matanza de espectadoras puede contribuir a 1) la erradicación de las células tumorales que expresan CD138 de manera heterogénea, 2) la destrucción del microambiente del tumor por el exterminio de las células del estroma y 3) la prevención de la selección de células CD138-negativas nBT062-SPDB-DM4-resistentes .
El efecto espectador es de particular importancia si la actividad de un inmunoconj ugado es afectada por un antígeno blanco que se expresa en tumores en forma heterogénea. Si este es el caso, una célula específica de un tumor no expresa el antígeno en una cantidad que pueda exhibir permitir el direccionamiento directo al blanco y la muerte de dicha célula, o no lo hace en absoluto, por el inmunoconjugado respectivo. La eficacia antitumoral de nBT062-SPDB-DM4 en las células CD138-negativas en cocultivo con células CD138-positivas aclaró que la presencia de las células blanco influye, en las circunstancias apropiadas, en la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4 hacia las células rio blanco.
Experimentos con xenoinjertos de ratón B En esta serie de experimentos, se inocularon ochenta y cinco ratones con células OLP-8 (1.5xl07 células/ratón) por vía subcutánea en el hombro derecho. El coeficiente de establecimiento de los tumores fue de 100 %. Se asignaron al azar a sesenta y seis ratones SCID con tumores MOLP-8 voluminosos con un volumen medio de tumor de aproximadamente 80 mm3 a once grupos de tratamiento (n=6) . Se trató a los ratones con una dosis única de uno de los tres conjugados (nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 o nBT062- SPP-DM1) . Un grupo adicional recibió cinco dosis semanales de nBT062-SMCC-D l y un grupo control' recibió una dosis única de PBS . Los volúmenes medios de los tumores están expuestos en la FIG. 11A. Se estableció una respuesta a la dosis por cada conjugado. Se alcanzó una mediana de volumen de los tumores de 750 mm3 en los animales tratados con PBS el día 25. El tiempo hasta la duplicación del tumor determinado por el mejor ajuste de la curva de regresión lineal en un trazado lineal logarítmico del desarrollo de tumor control fue de 4,58 días. Los animales tratados con nBT062-SPDB-DM4 a razón de 450 g/kg tuvieron la matanza celular logarítmica más elevada (LCK=2,89), seguidos por los animales tratados con nBT062-SMCC-DMl a una dosificación semanal de 250 g/kg (LCK=2,1; ver la Tabla 5) . La comparación de las curvas de crecimiento medio de los tumores para los grupos de tratamiento por medidas repetidas ANOVA gue realiza la Prueba Comparativa de Dunnett demostraron una diferencia significativa diferencia entre el grupo control con PBS y 450 g/kg de nBT062-SPDB-DM4 (p<0.01), 250 pg/kg de nBT062-SPDB-DM4 (p<0.05) y cinco dosis semanales de 250 g/kg de nBT062- SMCC-DM1 (p<0.05). No se produjo regresión alguna, parcial o total de los tumores en ninguno de los grupos de tratamiento, a excepción de un animal que recibió 450 pg/kg de nBT062-SPDB-DM , que tuvo una regresión parcial del tumor hasta el día 85 después de la inoculación.
Tabla 5. Valores de matanza logarítmica de células (LCK) como medida de la actividad antitumoral de diferentes conjugados nBT062-DMx en diferentes esquemas de dosificación. Remitirse a la sección de Materiales y Métodos para recabar información sobre el cálculo de los valores LCK.
Material de Dosis (pg/kg) LCK Dosificación ensayo PBS dosis única nBT062-SMCC- 450 0,85 dosis única DM1 nBT062-SMCC- 250 0, 53 dosis única DM1 nBT062-SMCC- 100 0 dosis única DM1 nBT062-SPDB- 450 2,89 dosis única DM4 nBT062-SPDB- 250 1, 05 dosis única DM4 nBT062-SPDB- 100 0, 39 dosis única DM4 nBT062-SPP- 450 0, 8 dosis única DM1 nBT062-SPP- 250 0,39 dosis única DM1 nBT062-SPP- 100 0, 2 dosis única DM1 nBT062-SMCC- 250 2,1 Cada semana DM1 durante 5 semanas Eficacia in vivo de nB 062-SPDB-DM4 y nBTO62-SPP-DMl en el ambiente de la médula ósea Preparación de ratones SCID con implantes de hueso fetal humano Se implantaron huesos largos fetales humanos (astillas de hueso fetal humano) en la parte superior del cuerpo de ratones CB17 SCID (SCID-hu) de acuerdo con lo descripto anteriormente (Urashima et al., 1997) y de esa manera se dio origen a un modelo de ratón para el alojamiento de células de MM en células BM.
Régimen de tratamiento (ratones SCID-hu/INA-6) 4 semanas después del implante óseo, se inyectaron 2,5xl06 células INA-6 en un volumen final de 100 µ? de medio de cultivo celular RPMI-1640 directamente en la cavidad de la médula ósea en los ratones SCID-hu antes descriptos. Se utilizó un aumento de los niveles del receptor de IL-6 humano soluble (shuIL-6R) , que es liberado por las células INA-6, como parámetro del desarrollo de las células de MM y la carga de enfermedad.
Los ratones desarrollaron shuIL-6R sérico mensurable aproximadamente 4 semanas después de la inyección de células INA-6 y luego recibieron 0,176 mg de conjugado o control de vehículo por inyección en la vena caudal cada semana por espacio de 7 semanas. Después del tratamiento, se recogieron muestras de sangre y se las midió para determinar los niveles de shuIL-6R mediante un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN) . Los resultados están ilustrados en la Fig. 12.
Discusión La interleuquina 6 (IL-6) es un factor de crecimiento y supervivencia para las células de mieloma múltiple. La INA-6 es una línea de células de mieloma humano dependiente de IL-6, que también requiere la proliferación de las células del estroma de la médula ósea (BMSC) . Las líneas celulares INA-6 producen receptor de IL-6 soluble (shuIL- 6R) . Se puede utilizar un aumento de los nieles de shuIL-6R como parámetro del desarrollo de las células de MM y la carga de la enfermedad.
Por consiguiente, los ratones sCID-hu/INA-6 ofrecen un modelo para las células de mieloma múltiple que crecen en el ambiente normal de su médula ósea. Las células tumorales de este modelo, que interactúan directamente con la médula ósea humana, se asemejan estrechamente a la situación de los pacientes, en la cual también se promueve el desarrollo de las células tumorales por la presencia de las células del estroma. Como las células INA-6 liberan el receptor de interleuquina-6 humano soluble (shuIL-6R) , se pueden utilizar las. concentraciones séricas de esta proteina como medida de la carga de células tumorales en estos ratones. Se analizó la potencia in vivo de nBTO 62-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl en este ambiente.
El tratamiento de los ratones SCIDhu/???-ß con administraciones semanales i.v. de nBTO 62-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DMl por espacio de siete semanas indujo una regresión eficiente de los tumores, detectada por un descenso de los niveles séricos de shuIL-6R con respecto al control, indicando una buena eficacia de los conjugados incluso en el ambiente de la médula ósea humana, lo que refleja la situación relevante en los pacientes (Fig. 12).
Análisis de la eficacia de nBT062-SMCC-D l , nBT062-SPDB-D 4 y nBT062-SPP-DMl in vitro y en animales experimentales in vivo .
Materiales y Métodos Cultivo Celular Las lineas celulares de MM humano sensibles a Dex (MM.1S) y resistentes (MM.1R) fueron amablemente provistas por el Dr. Steven Rosen (Northwestern University, Chicago, IL) . Se obtuvieron las lineas de células de MM humano RPMI8226 y U266 de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) . Las células resistentes a la doxorubicina (Dox) (RPMI-Dox40) y resistentes al Melfalan (LR5) fueron amablemente provistas por el Dr. William Dalton (Lee Moffitt Cáncer Center, Tampa, FL) . Las células de leucemia de células plasmáticas 0PM1 y OPM2 fueron amablemente provistas por el Dr. Edward Thompson (University of Texas Medical Branch, Galveston) .
Todas las lineas celulares de MM y del estroma de la médula ósea (BM) fueron cultivadas en la modificación de Dulbecco del Medio Eagle DMEM (Sigma) que contenia 10% de suero fetal bovino, L-glutamina 2 mM (Life Technologies) , 100 U/ml de penicilina y 100 Ag/ml de estreptomicina (Life Technologies). Se procesaron las muestras recogidas de voluntarios sanos con gradientes de Ficoll Paque para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) . Se obtuvieron células de MM y BM de los pacientes de las muestras de BM después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y la aprobación por la Junta de Verificación Institucional del Dana-Farber Cáncer Institute (Boston, ??) . Se separaron las células mononucleares BM utilizando la sedimentación por densidad con Ficoll Paque y se purificaron las células plasmáticas (>95% de CD138+) mediante selección positiva con microperlas magnéticas de separación celular anti-CD138 ( iltenyi Biotec Auburn, CA) . Se purificaron las células tumorales de las BM de los pacientes con MM utilizando el sistema de selección negativa RosetteSep (StemCell Technologies , Vancouver , BC, Canadá) , de acuerdo con lo descripto anteriormente (Hideshima, 2001 ) . Se aplicó el cocktail de anticuerpos RosetteSep a las muestras de Médula ósea. Se entrecruzaron las células CD138 negativas con glóbulos rojos sanguíneos (en roseta) con reactivos RosetteSep, y se las incubó por espacio de 20 minutos a temperatura ambiente, antes de la separación por centrifugación a la densidad Ficoll.
Ensayo de inhibición del desarrollo y proliferación Se evaluó el efecto inhibitorio del desarrollo de nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM , nBT062-SPP-DMl y Dexametasona sobre el desarrollo de las lineas celulares de MM, PBMCs, y BMSCs en los ensayos MTT midiendo la metabolización de la tintura bromuro de 3- (4, 5- dimetiltiazol-2-il ) -2 , 5-difenil tetra-sodio (MTT; Chemicon International, Temecula, CA) , de acuerdo con lo descripto anteriormente (Hideshima, 2003) .
Efecto de nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl sobre el desarrollo de las células M en la BM Para evaluar el efecto estimulador- del crecimiento de las células BM sobre la sensibilidad de las células de MM hacia los inmunoconjugados, se cultivaron células MM (2xl04 células/pocilio) por espacio de 48 h con células del estroma de la médula ósea (BMSCs, lxlO4 células/pocilio) en placas de 96 pocilios (Costar, Cambridge, A) , en presencia o ausencia de la droga. SE midió la síntesis de ADN por captación de [3H] -timidina ( Perkin-Elmer , Boston, MA) . Se agregó [ 3H] -timidina (0,5 µ^?/???????) durante las últimas 8 horas del experimento. Todos los experimentos se llevaron a cabo por duplicado.
Análisis del ciclo celular Se incubaron células MM (lxlO6 células) por espacio de 48 horas en presencia o ausencia de los inmunoconj ugados , se las lavó con salina con buffer de fosfato (PBS) , se las permeabilizó mediante exposición durante 30 minutos a etanol al 70 % a -20°C, se las incubó con yoduro de propidio (PI) (50 pg/ml) en 0,5 mi de PBS que contenia 20 U/ml de RNAse A (Roche Diagnostics) por espacio de 30 minutos a temperatura ambiente. Se analizó el contenido de ADN utilizando un citómetro de flujo.
Inmunofluorescencia Se fijaron las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio en acetona absoluta fria por espacio de 10 min, se las lavó con PBS y se las bloqueó durante 60 min con FBS al 5 % en PBS. Seguidamente se incubaron los portaobjetos con anticuerpo anti-CD138 (scl2765, Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA) por espacio de 24 h a 4°C. Las células fueron lavadas una vez más con PBS e incubadas con IgG anti-ratón de cabra marcada por fluorescencia por espacio de 1 h a 4°C y analizadas utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon E800 de acuerdo con lo descripto anteriormente (Ikeda, 2005; Kiziltepe, 2007) .
Modelo de xenoinjerto de MM humano positivo para la proteina verde fluorescente autofluorescente (GFP) y modelo murino de xenoinjerto de MM humano.
Se transfectaron células OPMl con proteina fluorescente verde (0P 1GFP) usando un vector lentiviral de acuerdo con lo descripto anteriormente (Zufferey, 1998) . Se adquirieron ratones CB17 SCID (de 48-54 dias de edad) a Charles River Laboratories (Wilmington, MA) . Se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal del Dana-Farber Cáncer Institute. Se inocularon los ratones por vía subcutánea en el flanco derecho con 5xl06 células MM 0PM1GFP en 100 µ? de RPMI-1640. Cuando se pudieron palpar los tumores, se asignó los ratones al grupo de tratamiento que recibía 176 µ?/tß??? sobre la base del peso molecular del conjugado, una vez por semana durante 4 semanas por inyección en la vena caudal lateral y 5 ratones fueron asignados al grupo control que recibía vehículo solo. Se realizaron mediciones con calibre de los mayores diámetros perpendiculares de los tumores día por medio para estimar el volumen de los tumores empleando la siguiente fórmula que representa el volumen 3D de una elipse:: 4/3 x (ancho/ 2) 2 x (longitud/2) . Se dio muerte a los animales cuando los tumores alcanzaron los 2 cm o si los ratones parecían moribundos. Se evaluó la sobrevida desde el primer día del tratamiento hasta la muerte. Se evaluó el desarrollo de los tumores utilizando mediciones con calibre desde el primer día del tratamiento hasta el día de en que se les dio muerte, que fue el día 10 en el caso de los controles y el día 21 en el caso del grupo de tratamiento con BT062-SPDB- DM4. Se monitorearon los ratones mediante imágenes de fluorescencia de cuerpo entero utilizando un Sistema de Luz Brillante Illumatool Bright Light LT-9900 (Lightools Research, Encinitas, CA) , después de un rasurado cutáneo del área del tumor. Se tomaron imágenes con una cámara digital Canon IXY 700. Se capturaron imágenes del análisis ex vivo de los tumores con un microscopio LEICA DM IL conectado a una cámara LEICA DFC300 FX a aproximadamente 40u/0,60 (Leica, Heidelberg, Alemania).
Detección de células apoptoticas Se lavaron células MM (lxlO6) con PBS y se las incubó en presencia o ausencia de los inmunoconj ugados . Se tiñeron las células apoptoticas con el anticuerpo Apo 2.7 conjugado a PE (7A6, Beckman Coulter, Inc.) . Se analizaron las células por citometria de flujo en un citómetro de flujo Epics (Beckman Coulter, Inc.) usando el software RXP Cytomics.
Transferencia Western Se cultivaron células MM en presencia o ausencia de nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DMl o BT062-SPP-DM1 , se Las cosechó, lavó y lisó utilizando el buffer de ensayo de radioinmuno precipitación (RIPA) que contenia Na3V04 2 mM, NaF5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 5 mg/ml de inhibidor de la proteasa completo, de acuerdo con lo descripto anteriormente (Yasui, 2005; Hayashi, 2002). se sometió a los Usados de células enteras (20 yg por franja) a separación por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) , se las transfirió a membranas de Nitrocelulosa Pura (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se las inmunotransfirió con anticuerpos contra poli-ADP (adenosin difosfato) -ribosa polimerasa (PARP) , caspasa-8, caspasa-3, caspasa-9, AKT, y fosfo (Ser 473) Akt (Señalización celular) , como asi también anticuerpos anti-tubulina y anti-CD138 (Santa Cruz Biotechnology) .
Ensayo de Adhesión Celular En una placa de 96 pocilios, se introdujeron con pipeta lxlO4 BMSCs en cada pocilio y se las incubó por espacio de 12 h en presencia o ausencia de los inmunoconj ugados a 37°C. Tras la incubación, se aplicaron células MM en presencia o ausencia de drogas a las BMSCs. Por lo tanto, se lavaron las células MM tres veces con PBS y se las resuspendió en medio RPMI sin suero a densidades celulares de 2xl05 células en 100 µ? en presencia o ausencia de drogas. Se corrió cada grupo de muestras por triplicado o cuadruplicado. Al cabo de 2 horas de cocultivo a 37 °C, se retiraron las células no adherentes con baja adhesión 'y el medio invirtiendo la placa. Seguidamente, se lavaron las células tres veces con PBS. Se cultivó el resto de las células en FBS al 10 % en medio RPMI en presencia de [3H] -timidina (0.5 µ??/???????, Perkin Elmer, Boston, 7, USA) durante 8 horas más, para medir la síntesis de ADN .
Análisis Estadístico Se determinó la significancia estadística de las diferencias observadas en cultivos tratados con inmunconjugado (IC) utilizando múltiples pruebas de comparación de Dunn. El nivel mínimo de significancia fue un valor P inferior a 0,5. En el caso de los experimentos in vivo, se compararon los volúmenes de los tumores utilizando el análisis de 1 paso de las pruebas de comparación múltiple Dunn. Se evaluó la sobrevida utilizando curvas de Kaplan-Meier y análisis de rangos logarítmicos .
Resultados Expresión de CD138 en líneas celulares MM Se analizaron los niveles de expresión de CD138 en líneas celulares de mieloma múltiple · por transferencia Western empleando lisados de células enteras de MM1.S, OPM1, OPM2, RP I8226, DOX40, M 1R, LR5 , y U266 (FIG. 14A) Como se puede ver en la FIG. 14A, MM1S y LR5 exhibieron expresión débil de CD138 y las células Dox40 son CD138 negativas. Las otras líneas celulares exhibieron altos niveles de expresión de CD138. Se demostró que CD138 se expresa en 7 de cada 8 (87,5%) líneas celulares de mieloma múltiple.
La FIG. 14B ilustra un análisis que utiliza tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para CD138. Se llevó a cabo el análisis microscópico de las células DOX40 (panel superior) y células OPMl (panel inferior) . La expresión de CD138 está representada a la izquierda y los ácidos nucleicos a la derecha. La FIG. 14B ilustra que las células DOX40 casi no exhiben expresión detectable de CD138. Por el contrario, las células OPMl exhibieron alta inmunorreactividad con CD138. nBT062-SMCC-D l, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl exhiben citotoxicidad selectiva para las lineas celulares CD138 positivas También se evaluó la eficacia de los conjugados anticuerpo CD138 maitansinoide en ensayos de viabilidad celular. Los inmunoconjugados nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB- DM4 y nBT062-SPP-DMl fueron analizados · para determinar su potencia citotóxica contra células CDl38-positivas (OPMl, RPMI8226), células con débil expresión de CD138 (MM1S) y células CD138-negativas (DOX40) , usando un ensayo basado en bromuro de 3- ( 4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio . (MTT) . La FIG. 15A ilustra las células OPMl (¦) , RPMI8226 (?) , DOX40 (?) y M1S células (?) expuestas a nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DMl , respectivamente. Se midió la sobrevida de las células en ensayos MTT . Se consignan las viabilidades celulares después de los tiempos de incubación indicados (40, 80, 120 h) en términos de % de viabilidad de los controles sin tratamiento .
El tratamiento de las células con nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl en concentraciones en el rango de 3 a 354 ng/ml indujo la inhibición del desarrollo en células CD138 positivas. Este efecto tuvo lugar en forma dependiente del tiempo y la dosis y fue más pronunciado al cabo de 120 h en las dos lineas celulares que expresaban altos niveles de CD138. En las mismas condiciones, casi no se pudo medir citotoxicidad alguna contra las células CD138 negativas DOX40 (FIG. 15A) . Es importante que los tres inmunoconj ugados también fueron citotóxicas contra células MM negativas derivadas de los pacientes en un rango de concentraciones de 111-442 ng/ml, medida después de un tiempo de incubación de 48 h (FIG. 15B) . La FIG. 15C ilustra PB Cs derivadas de 3 sujetos sanos que fueran cultivadas con nBT062-SPDB-DM4 por espacio de 72 h antes de determinar la viabilidad celular. La viabilidad de MM OPM1 tratadas en las mismas condiciones aparece como control (cuadrados cerrados) . Como se puede ver en la FIG. í3- 15C, los inmunoconjugados no indujeron efectos citotóxicos en las PBMCs (Células Mononucleares de Sangre Periférica) aisladas de 3 voluntarios sanos (FIG. 15C) . Estos resultados demuestran que nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl matan selectivamente las células MM CD138-positivas (Todos los datos consignados en esta figura representa promedios de triplicados. Las desviaciones standard están indicadas por las barras de error) . nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl inducen la detención del ciclo celular G2/M en células OPM1 Como el maitansinoide actúa suprimiendo la polimerización de microtúbulos , se ha demostrado ya que DM1 y DM4 inducen la detención del ciclo celular G2/M en células tumorales (Erickson, 2006) . Por consiguiente, se examinó él perfil del ciclo celular de las células OPM1 después del tratamiento con nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl . Se incubaron las células con los inmunoconj ugados por espacio de 0 a 72 horas, marcadas con PIf y se las analizó por citometria de. flujo. La FIG. 16A ilustra células OPM1 tratadas con los inmunoconjugados durante 0, 12 o 24 h y e análisis de los perfiles del ciclo celular por tinción con PI . Como se puede ver en la FIG. 16A, estos compuestos tuvieron efectos significativos sobre la proporción de células en la fase G2/M en comparación con las células sin tratar. La exposición de las células 0PM1 a nBT062-SPDB-DM4 indujo una respuesta más rápida y fuerte en comparación con las células tratadas con las otras dos drogas . nBT062-SPDB-DM4 induce la apoptosis en las células OPM1 ? continuación, se determinó si nBT062-SPDB-DM4 induce la apoptosis en las células blanco. FIG. 16B ilustra células 0PM1 cultivadas en presencia o ausencia de inmunoconjugados por espacio de 24, 48 o 72 h. Se evaluó el porcentaje de células apoptóticas mediante tinción del anticuerpo Apo 2.7 y análisis de citometria de flujo. Como se ilustra en la Fig. 16B, la tinción de las células con el anticuerpo Apo2.7 demostró la inducción de la apoptosis de las células tratadas con los inmunoconjugados .
La FIG. 16C ilustra células 0PM1 cultivadas en presencia de 885 g/ml de nBT062-SPDB-D 4 durante los lapsos indicados (panel izquierdo) o con diferentes concentraciones del inmunoconjugado (panel central). En esta Figura, FL indica bandas correspondientes a las formas de longitud total de las caspasas y PARP; CL indica bandas correspondientes a los productos de la escisión. Se preincubaron células 0PM1 con zVAD-fmk (50 pmol/l) por espacio de 60 minutos antes del tratamiento con nBT062- SPDB-DM4 por espacio de 24 h en las dosis indicadas. Se sometió a los lisados totales de las células a inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para caspasa-3, -8, -9, PARP, y tubulina. Como se puede apreciar en la FIG. 16C, el tratamiento de las células 0P 1 con nBT062-SPDB-DM4 indujo la escisión de la caspasa-8, -9, y -3 y PARP en forma dependiente de la dosis y el tiempo (panel izquierdo y central) . El inhibidor de pan-caspasa zVAD-fmk bloqueó la escisión de caspasa-3, -8, -9 y PARP inducida por nBT062-SPDB-DM4 en las células OPM1 (FIG. 16C, panel derecho) . Estos resultados indican que nBT062-SPDB-DM4 activa las caspasas e induce la apoptosis en las células blanco. nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl inhiben el efecto protector de las BMSCs En pacientes con mieloma múltiple, .el microambiente de la médula ósea induce el crecimiento, supervivencia y fármaco resistencia en las células MM por medio de por lo menos dos mecanismos diferentes: la adhesión de las células MM a la fibronectina confiere fármaco-resistencia mediada por la adhesión celular (CAM-DR) ; y citoquinas tales como interleuquina-6 (IL-6) y factor de crecimiento insulínico 1 (IGF-1) en el medio de la médula ósea inducen importantes cascadas de señalización que en última instancia median en la resistencia de las células MM a las terapias convencionales. Se analizó la citotoxicidad de los inmunoconj ugados contra las células MM en cocultivo con BMSCs en presencia de IL-6 o IL-6 o en presencia de células del estroma de la médula ósea (BMSCs) .
En las FIGS . 17A a 17C, OPM1 se cultivaron las células por espacio de 48 h con medios control (barras negras) o con concentraciones crecientes de nBT062-SPDB-DM : 55 ng/ml (barras de color gris oscuro; *), 111 ng/ml (barras grises; **), 221 ng/ml (barras gris claro; ***) , 442 ng/ml (barras gris muy claro; ****) 885 ng/ml (barras blancas; *****) . Se trataron las células de FIG. 17D por espacio de 72 h con medios control (barras negras) o con concentraciones crecientes de Dexametasona : 250 nM (barras grises: +) , 500 nM (barras gris claro; ++) , 1000 nM (barras blancas; +++) . IL-6 estuvo presente en algunos cultivos en concentraciones de 1 o 10 ng/ml (FIG. 17A) . Se utilizó IGF- 1 en concentraciones de 10 o 50 ng/ml .(FIG. 17B) . Ninguna de estas citoquinas indujo resistencia de las células a los inmunoconj ugados .
Para analizar la influencia del microambiente de la Bm en el desarrollo y resistencia de las OPMl a los inmunoconj ugados, se cultivaron las células en presencia o ausencia de BMSCs de acuerdo con lo descripto anteriormente.
El cocultivo de las células OMP1 en presencia o ausencia de BMSCs está expuesto en los paneles (C) t (D) de FIG. 17. En todos los experimentos, se determinó la síntesis de ADN midiendo la incorporación de [ 3H] -timidina durante las últimas 8 h del cultivo. La adherencia de las células 0MP1 a BMSCs desencadenó una captación incrementada de [3H] -timidina . Notablemente, la citotoxicidad de los inmunoconjugados no fue afectada por la presencia de BMSCs (FIG. 17C) . Por el contrario, la Dexametasona, que fue incluida como control, no pudo anular el efecto protector disparado' por las BMSC (FIG. 17D) . nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl inhiben la adherencia de las células MMls a las BMSCs Se analizó si los inmunoconjugados inhiben la adhesión de las células de mieloma múltiple a las BMSCs. Se cultivaron células MM1S, que expresan sólo niveles moderados de CD138 y demostraron sólo una débil sensibilidad hacia BT062 (FIG. 14A y FIG. 15A) con o sin nBT062-SMCC-DMl, nBTO 62-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DMl por espacio de 2 h (885 ng/ml) . Después de ese tratamiento, se cocultivaron las células MM1S con las BMSCs durante 2 horas más. En algunas muestras, también se trataron las BMSCs con los inmunocon ugados por espacio de 12 h (885 ng/ml) ames del cocultivo (tratamiento estroma) . Después de 3 lavados con PBS, se midió la adherencia de las células mediante captación de [3H] -timidina. La FIG. 17E ilustra las BMSCs cultivadas durante 24 horas en placas de fondo plano de 96 pocilios en presencia o ausencia de los inmunoconjugados . Se lavaron las BMSCs tres veces con PBS. Se aplicaron células MM1S que fueran incubadas durante 2 horas con los inmunoconjugados a las BMSCs. Se midió la síntesis de ADN mediante captación de [3H] -timidina .
Como se ilustra en la FIG. 17E, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl inhibieron la adhesión de las células de mieloma múltiple a las BMSCs en comparación con las muestras en las cuales se trataron sólo las células del estroma (3,6 veces y 2,5 veces, respectivamente). nBT062-SMCC-DM1 casi no exhibieron efectos sobre la adhesión celular. El resultado sugiere que nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 pueden alterar la adhesión de las células MM a las BMSCs y que estos inmunoco jugados también pueden anular la fármaco-resistencia mediada por la adhesión celular (CAM-DR) . nBT062-SPDB-DM4 inhibe el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto MM humano en ratones SCID Las actividades in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062- SPP-DM1 fueron determinadas en un modelo de xenoinjerto humano GFP-positivo en ratones SCID.
FIG. 18A ilustra un análisis de la expresión de GFP por las células OPMlGFP. Como se ilustra en la Figura, se pudo establecer un clon altamente fluorescente de las células de MM 0PM1 (0PM1GFP) y se examinó la actividad antitumoral de los inmunoconjugados con estas células en animales experimentales in vivo. En la FIG. 18B, se inyectaron 5 ratones por grupo con 5xl06 células 0PM1GFP. Se inocularon los ratones, por via subcutánea, con 5xl06 células 0PM1GFP en 100 µ? de medio RPMI-1640. El tratamiento con nBT062-SPDB-DM4 (cuadrados), nBT062-SPP-D l (triángulos) o control con buffer se inició una vez establecidos los tumores. Se determinaron los tamaños de los tumores por medición de calibre en serie de los diámetros perpendiculares. Las barras de error indican las desviaciones standard. Todos los ratones desarrollaron tumores mensurables 14 días después de la inyección de las células tumorales y a continuación se los asignó al azar para recibir tratamiento una vez por semana con nBT062- SPDB-D 4, nBT062-SPP-DMl o vehículo control (PBS) . Las mediciones en serie con calibre de los diámetros perpendiculares se realizaron día por medio para calcular el volumen de los tumores. El tratamiento de los ratones portadores de tumores con nBT062-SPDB-DM4 (176 µg/rató sobre la base del peso molecular del conjugado, una vez por semana durante 4 semanas) inhibió significativamente el desarrollo de tumores MM, en comparación con los animales control tratados con vehículo PBS (Prueba de comparaciones múltiples de Dunn; control vs . nBT062-SPDB-D 4 : P<0,01 Figura 16B) .
El conjugado nBT062-SPP-DMl fue menos efectivo que nBT062-SPDB-DM4 (Prueba de comparaciones múltiples de Dunn; nBT062-SPP-DMl- vs . BT062-SPDB-DM4 : P<0,05 Figura 5B) . Todos los ratones control tuvieron que ser sacrificados el día 19 después del comienzo del tratamiento debido al gran tamaño de los tumores. Utilizando las curvas de Kaplan-Meier y análisis de rangos logarítmicos, la OS' media fue de 13,6 días (intervalo de confianza de 95% [CI], 10-19 dias) en el grupo control contra 26 días (95% CI, 23-42 días) en los grupos tratados con nBT062-SPDB-DM4 , respectivamente (FIG. 5C) . Como se puede apreciar en la FIG. 18C, nBT062-SPDB-DM4 incrementó significativamente la supervivencia (P <0.0023, línea de guiones, n=5) en comparación con el grupo control tratado con vehículo únicamente (línea plena; salina normal, n=5) . Se sacrificaron los ratones y se extirparon los tumores de un ratón tratado con nBT062-SPDB-DM4 y un ratón control tratado con buffer para el análisis TUNEL. El análisis ex vivo de los tumores extirpados de los ratones portadores de 0PM1GFP arrojó apoptosis significativamente incrementada e los animales tratados con BT062 en comparación con los ratones control (FIG. 18D) . Por consiguiente, nBT062-SPDB-DM4 induce la apoptosis in vivo. Ninguno de los compuestos administrados exhibió influencia alguna sobre el peso corporal en este estudio.
Discusión Antes se demostró la actividad antitumoral selectiva de nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-D l contra células MM con expresión de CD138 in vitro y en animales experimentales in vivo. Utilizando análisis de inmunotransferencia e inmunofluorescencia, encontramos que la mayoría de las líneas celulares MM expresan CD138. Sin embargo, DOX40 no expresó la proteína CD138 y las células MM1S y LR5 exhibieron una débil expresión de la proteína. Las cinco restantes exhibieron altos niveles de expresión de CD138". Los inmunoconjugados nBT062-SMCC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 ¦ y nBT062-SPP-DMl exhibieron significativamente citotoxicidad contra las líneas celulares MM con /nBT062-SPDB-DM4 como el compuesto más potente de estos tres agentes. Las células OPM1 y RPMI8226, que expresan altos niveles de CD138 fueron más sensibles hacia los inmunoconjugados que las células MMls que expresan bajo CD138 o las células Dox40 CD138 negativas. Notablemente, estos agentes también son citotóxicos contra las células tumorales aisladas de pacientes que padecen MM Notablemente, no se observó citotoxicidad alguna contra las células mononucleares de sangre periférica o médula ósea de voluntarios sanos. Estos resultados sugieren que los inmunoconj ugados tienen actividad selectiva por el antigeno contra las células de tumores MM.
Se pudo demostrar que nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl inhiben la proliferación celular de las células MM mediante la inducción de la detención del ciclo de las células G2/M que lleva a la muerte celular apoptótica. Se pudo detectar la escisión de caspasa-3, -8, -9 y la caspasa-3 secuencia debajo de PARP en las células 0MP1 tratadas con los inmunocon ugados . Además, se incrementaron las células AP02.7 antigeno -positivas al cabo de veinticuatro horas con estas drogas.
Se había informado anteriormente que IL-6 desencadena la proliferación de las células de mieloma múltiple por medio de la activación de las cascadas de señalización de PI3-K/Ak , MEK/ERK y JAK2/STAT3. También se describió que IGF-1 también promueve la proliferación- y supervivencia de las células de mieloma múltiple utilizando las mismas vías. IL-6 protege contra la apoptosis inducida por dexametasona mediante la inducción de la señalización de PI3-K/Akt. Se examinó si la IL-6 e IGF-1 exógenas inhiben la citotoxicidad inducida por los inmunoconjugados en las células de mieloma múltiple. Si bien se notó una proliferación incrementada en las células tratadas con IL-6 o IGF-1, estas citoquinas no pudieron inhibir la apoptosis de las células 0MP1 inducida por nBT062-SPDB-DM4 , sugiriendo que estos agentes pueden anular los efectos protectores de estas citoquinas. Notablemente, los inmunoconjugados inhibieron el desarrollo y adherencia de las células MM1S a las BMSCs, confirmando aun más que peden anular la fármaco-resistencia mediada por la adhesión celular (CAM-DR) . En los animales experimentales, el nBT062-SPDB-DM4 indujo un retardo significativo del crecimiento de los xenoinjertos de M establecidos sin afectar los pesos corporales de los ratones.
Todos los conjugados analizados exhibieron elevada toxicidad contra las lineas celulares de MM y contra las células de MM primarias derivadas de los pacientes, en tanto que las células mononucleares de sangre periférica de voluntarios sanos no exhibieron sensibilidad alguna a los conjugados Los inmunoconj ugados específicos contra CD138 causaron la detención del ciclo celular G2/M e indujeron apoptosis en las células blanco, asociada con la escisión de caspasa- 8/-9/ y -3 y la escisión de la caspasa-3 secuencia abajo del PARP blanco. Notablemente, la interleuquina-6, el factor de crecimiento insulínico 1 o la presencia de células del estroma de la médula ósea no protegieron a las células M contra la citotoxicidad mediada por los inmunoconj ugados .
El conjugado nBT062-SPDB-DM4 inhibió significativamente el desarrollo de tumores MM (p<0,01) y la sobrevida prolongada de los ratones.
Se apreciará que los métodos y composiciones de la presente invención se peden incorporar en la forma de una variedad de modalidades, sólo algunas : de las cuales han sido descriptas en la presente. Una persona con capacitación en la técnica considerará evidente que existen otras modalidades que no se apartan del espíritu de la presente ' invención. Por consiguiente, las modalidades descriptas son ilustrativas y no se las debe considerar restrictivas .
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Claims (18)

REIVINDICACIONES Habiendo asi especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:
1. Un método para reducir la adhesión de las células del estroma a células tumorales que expresan CD138 en las células tumorales de un sujeto que lo necesita, que comprende: administrar a dichas células tumorales un inmunocoñ ugado que toma como blanco a dichas células tumorales con expresión de CD138 en una cantidad efectiva para reducir- la adhesión de las células del estroma a las células tumorales con expresión de CD138, optativamente administrar a dichas células tumorales otro agente citotóxico en una cantidad suficiente para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales .
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho inmunocoñjugado comprende una molécula efectora y un agente de direccionamiento al blanco, en el cual dicha molécula ' efectora y dicho agente de direccionamiento al blanco están acoplados entre si por medio de un ligante escindible.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el ligante escindible contiene un enlace de disulfuro.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual el ligante es SPP o SPDB.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual la adhesión se reduce por lo menos aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o más.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual dicha adhesión reducida da lugar a una mitigación de la fármaco-resistencia mediada por la adhesión celular.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual se reduce la fármaco-resistencia mediada por la adhesión celular contra otro agente citotóxico que no es dicho inmunconj ugado y donde dicho agente citotóxico adicional se administra en una cantidad suficiente para inhibir, retardar y/o prevenir el desarrollo de las células tumorales .
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicho agente citotóxico es mefalan, vincristina, doxorubicina , dexametasona , ciclofosfamida, etopósido, citarabina, cisplatino, talidomida, prednisona, talidomida, bortezomíb, lenalidomida, sorafenib, romidepsina o combinaciones de los mismos.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual el agente citotóxico se basa en anticuerpos.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual dicha molécula efectora está estéricamente impedida .
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual la molécula efectora es por lo menos un maitansinoide, taxano o un a CC1065, o un análogo de los mismos .
12. 1 método de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual la molécula efectora es por lo menos un maitansinoide tal como DM1, DM3 o DM4.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual dicha molécula efectora es DM4.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual dicho agente de direccionamiento al blanco del inmunconj ugado comprende: una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de una inmunoglobulina o parte de la misma, en la cual dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 1.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual el inmunoconj ugado y el agente citotóxico son administrados en forma consecutiva, donde la administración del agente citotóxico es posterior a la administración del inmunoco j ugado .
16. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual el inmunoconjugado y el agente citotóxico son coadministrados .
17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 7 a 9, en el cual dicho sujeto es un paciente con cáncer que sufre una de las siguientes: mieloma múltiple, carcinoma de ovario, carcinoma renal, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, células de carcinoma de colon y células de linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia mieloblástica aguda (AML) , sarcomas de tejido sólido o carcinoma de colon.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicho paciente padece mieloma múltiple.
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