KR101725170B1 - Ｃｄ１３８을 표적으로 하는 면역접합체의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환을 치유하기 위해 CD138을 표적으로 하는 면역접합체의 투여를 포함하는 방법 및 치료 요법에 관한 것이다. 면역접합체는 단독 활성 성분으로서, 치료 요법의 일부분으로서, 또는 항암 조합물의 일부분으로서 사용된다.

Description

ＣＤ１３８을 표적으로 하는 면역접합체의 용도{USES OF IMMUNOCONJUGATES TARGETING CD138}
본 발명은 CD138을 발현하는 세포를 표적으로 할 수 있도록 설계된 면역접합체의 투여를 포함하는, 특히 인간 개체에 적용되는 방법 및 치료 요법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항암 조합물, 이를 포함하는 약학 조성물, 및 CD138을 발현하는 표적 세포를 포함하는 암의 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 특히, 상기 조합물을 모두 사용하지는 않는 치료법에 비해 상승적인 효과 또는 그외 예측하지 못한 상가적인 효과를 나타내는, 항암 조합물에 관한 것이다.
CD138은 세포외 매트릭스의 수용체로서 작용하는 것으로서, 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 세포에서 과다 발현되며, MM 세포의 발생 및/또는 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, CD138은 몇몇 예로서 자궁암, 경부암(Numa et al., 2002), 자궁 내막암(Choi et al., 2007), 신장암, 담낭암, 방광 이행 세포암(transitional cell bladder carcinoma), 위암(Wiksten et al. 2008), 전립선 선암(Zellweger et al., 2003), 유방암(Loussouarn et al., 2008), 비-소세포 폐암(Shah et al., 2004), 편평 세포 폐암(Toyoshima et al., 2001), 대장암 세포, 호지킨스 림프종, 비-호지킨스 림프종, 결장직장암(Hashimoto et al, 2008), 간암(Li et al., 2005), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 췌장암(Conejo et al., 2000), 및 두경부암(Anttonen et al., 1999)에서 발현되고 있다.
본 발명을 설명하기 위해, 특히 실시에 대한 부가적인 상세한 내용을 제공하기 위해, 본원에서 인용되는 특허 등의 공개 문헌 및 그외 자료들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 편의상, 공개 문헌들은 후술하는 명세서에서 저자 및 발행일로 언급되거나, 및/또는 첨부된 참고문헌 목록에 저자의 알파벳 순으로 열거된다.
타손 등(2004)은 MM 세포의 표면에서 발현되는 CD138 항원에 대한 뮤라인 IgG1 항체 B-B4의 우수한 결합성을 보고하였다. 또한, Tassone 등은, 다발성 골수종 세포에 대한 작동자(effector) 분자로서 마이탄시노이드 DM1을 포함하는, 면역접합체 B-B4-DM1의 우수한 세포독성 활성을 보고하였다(미국 특허 공개번호 20070183971).
이케다 등(2008 및 2009)은 B-B4를 기본으로 한 면역접합체 BT062를 이용하여 시험관내에서 기대할만한 결과와 이종 모델에서의 결과를 보고하였다.
타손 등과 이케다 등은 MM의 효과적인 치료법 및 그러한 치료에 사용될 수 있는 물질의 조성물을 제공하는데 기여하였지만, 당해 기술 분야에서는 아직 다수의 과제들이 남아 있는 실정이다.
MM과 같이, CD138 발현과 관련있는 형질세포 증식성 장애 등의, CD138 발현과 관련있는 질환에 대한 적합한 치료 요법이 특히 요구되고 있다. 특히, 면역접합체는 단지 특정한 허용치로 사용하거나, 및/또는 면역접합체를 대상 장애에 대해 유효한 것으로 공지된 세포독성제와 조합함으로써, CD138을 발현하는 비-종양 세포에 대해 임상적으로 허용가능한 수준으로 유지되는 독성을 부여하는 치료 요법이 요구되고 있다. 또한, 질병의 다른 증상들을 완화시키기 위해 사용되는 약제의 수요를 줄이는 치료 요법이 요구되고 있다.
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본 발명은, 특정 구현예에서, 상기한 필요성 뿐만 아니라, 하기 언급된 내용을 통해 당해 기술 분야의 당업자에게 보다 명확해지게 될 당해 분야에서 요구되는 그외 요구들을 충족시킨다.
본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질환을 치료하기 위한 본원에 기술된 방법에 의해 전술한 한가지 이상의 요구들을 충족시킨다.
본 발명은, 일 구현예에서,
필요한 개체, 특히 인간 개체에게,
하나 이상의 표적 물질, 예컨대 CD138 발현 세포를 표적으로 하는 조작된 표적 항체와 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 작동자 분자가 상기 표적 물질에 기능적으로 부착되어 형성된 면역접합체를, 유효량으로, 바람직하게는 허용량으로 투여하는 단계를 포함하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 조작된 표적 항체에서 적어도 일부분은 바람직하게는 IgG4 이소형 특성, 또는 다른 예로 본원에 기술된 임의의 다른 면역접합체를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질환을 치료하기 위한 면역접합체로서,
상기 면역접합체는,
(i) CD138 발현 세포를 표적으로 하는, 하나 이상의 표적 물질; 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 상기 면역 접합체를 형성하며, 상기 면역접합체는 유효량으로 투여되며, 상기 유효량은 허용량이다.
부가적으로, 일 구현예에서, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 면역접합체의 용도에 관한 것으로, 상기 면역접합체는,
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며, 상기 면역접합체는 유효량으로 투여되며, 상기 유효량은 허용량이다.
면역접합체는 바람직하게는 개체에게 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 양으로 또는 이의 약동학적 등가로 투여된다.
다른 바람직한 구현예는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료에서 동시, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한, 면역접합체 및 부작용 치료 물질의 조합 조제물로서,
상기 면역접합체는,
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 형성된 면역접합체이며, 상기 표적 물질은 단독 투여시 면역접합체의 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 약동학적 등가인 양으로 투여된다.
부가적으로, 이러한 부가적인 바람직한 구현예는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료에 동시, 별개 또는 순차적으로 이용하기 위한 조합 조제물의 제조에 있어서의, 면역접합체 및 부작용 치료 물질의 용도에 관한 것으로,
상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 형성된 면역접합체이며, 상기 면역접합체는 단독 투여시 면역접합체의 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 약동학적 등가인 양으로 투여된다.
특히, 면역접합체는 5 mg/m2 또는 10 mg/m2 - 160 mg/m2 미만, 바람직하게는 - 150 mg/m2, 140 mg/m2, 130 mg/m2 또는 120 mg/m2 미만의 양으로 개체에게 투여될 수 있다.
1차 투여 후 0 내지 2시간 동안의 개체 혈장내 면역접합체의 최고 농도는, 상기 면역접합체의 이론적인 최고 농도의 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 더 바람직하게는 30% 미만, 심지어 더 바람직하게는 20% 미만, 또는 심지어 10% 미만일 수 있다.
면역접합체는 4번 이상 투여할 수 있으며, 상기 각 투여 후 0 내지 2시간 동안의 개체 혈장내 면역접합체의 최고 농도는 상기 면역접합체의 이론적인 최고 농도의 55% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 40% 미만, 보다 더 바람직하게는 30% 미만, 20% 미만 또는 심지어 10% 미만일 수 있다.
상기 최고 농도는 10 mg/m2의 경우 3 ㎍/ml 미만; 20 mg/m2의 경우 8 ㎍/ml 미만; 40 mg/m2의 경우 15 ㎍/ml 미만; 80 mg/m2의 경우 25 ㎍/ml 미만; 120 mg/m2의 경우 30 ㎍/ml 미만일 수 있다.
1차 투여 후 0-2시간 사이의, 개체 혈장내 4차 적용 후 면역접합체의 최고 농도는, 상기 면역접합체의 이론적 최고 농도의 55% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 더 바람직하게는 40% 미만, 보다 더 바람직하게는 30% 미만, 20% 미만 또는 심지어 10% 미만일 수 있다.
상기 최고 농도는 20 mg/m2의 경우 14 ㎍/ml 미만, 40 mg/m2의 경우 15 ㎍/ml 미만, 또는 80 mg/m2의 경우 25 ㎍/ml 미만일 수 있다. 면역접합체는 정맥내로 투여될 수 있다. 면역접합체는 반복되는 단회 투약(repeated single dose)으로 정맥내로 투여될 수 있으며, 임의의 투여 후 0 내지 2시간 사이의 개체 혈장내 면역접합체의 최고 농도는 상기 면역접합체의 이론적 최고 농도의 55% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 더 바람직하게는 40% 미만일 수 있다. 안정적인 질환 상태는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10번의 치료 사이클(적어도 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30주 동안) 동안 유지될 수 있다. 한가지 이상의 안정적인 질환 상태는 20 mg/m2에서의 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회의 치료 사이클 동안에 유지될 수 있으며, 선택적으로, 임의의 투여 종료 후 0 내지 2시간 사이의 개체 혈장내 면역접합체의 최고 농도는 상기 면역접합체에 대한 이론적인 최고 농도의 55% 미만, 50% 미만 또는 40% 미만일 수 있다. 특정 예에서, 마이너 반응(minor response)은 최대 8번의 치료 사이클 이후에 관찰할 수 있다.
또한, 본 발명은, 치료가 필요한 개체, 바람직하게는 인간 개체에게,
CD138을 발현하는 표적 세포 표면에 대한 하나 이상의 표적 물질과 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며, 상기 표적 물질이 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 형성된 면역접합체를,
유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질환의 치료 방법에 관한 것으로,
상기 면역접합체는,
약 10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 또는 120 mg/m2 이하의 용량, 바람직하게는 반복되는 단회 투약으로,
평균 1일 용량 약 400 ㎍/m2 - 약 6 mg/m2, 예컨대 약 500 ㎍/m2, 약 1 mg/m2, 약 2 mg/m2, 약 3 mg/m2, 약 4 mg/m2, 및/또는
평균 주당 용량 약 3 mg/m2 - 약 40 mg/m2, 예컨대 약 5 mg/m2, 약 10 mg/m2, 약 15 mg/m2, 약 20 mg/m2, 약 25 mg/m2, 약 30 mg/m2 또는 약 35 mg/m2의 용량으로 투여된다.
본원에서 언급되는 방법은, 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 210일 이상의 기간 동안, 및/또는 각 3주로 구성된, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 이상의 치료 사이클 동안에 안정적인 질환 상태를 유지할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료가 필요한 개체, 바람직하게는, 인간 개체에게 면역접합체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료 방법에 관한 것으로,
상기 면역접합체는 CD138을 발현하는 표적 세포 표면에 대한 하나 이상의 표적 물질과 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 상기 면역접합체를 형성하며,
상기 CD138은, 상기 개체에서, 상기 표적 세포 및 비표적 세포 상에서 발현되며, 상기 투여에 의해 중도의 또는 느린 혈장 소거가 초래되며, 상기 비표적 세포, 특히 상피 세포는 실질적으로 영향을 받지 않는다.
투여되는 유효량은, 부작용 치료 물질과 조합하여 투여하는 경우, 200 mg/m2 미만이거나, 또는 200 mg/m2의 약동학적 등가 보다 낮을 수 있으며, 상기 투여시, 상기 개체에서 40시간 미만, 30시간 미만, 20시간 미만, 15시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만 이내에, 바람직하게는 반응이 발생할 수 있다.
상기 유효량은 120 mg/m2 보다 높을 수도 있다.
상기 CD138의 표적 세포 및 비표적 세포(예, 상피 세포) 상에서의 발현 수준은 비슷할 수 있다,
상기 유효량은 단회 용량, 단회 반복 용량 또는 다중 용량으로서 투여할 수 있다.
상기 유효량은 다중 용량으로 투여할 수 있으며, 이때 각 투여 후의 Cmax는 이론적 Cmax 수치의 55% 보다 높다.
질병은 골 통증 및/또는 골 합병증과 관련있을 수 있으며, 상기 면역접합체 또는 본 발명에 따른 항암 조합의 투여는 상기 골 통증 및/또는 골 합병증을 바람직하게는 허용가능한 수준으로 낮출 수 있다. 골 통증 및/또는 골 합병증을 완화하기 위한 약제의 투여는, 중지될 수 있거나, 또는 통상적으로 투여되는 기본 수준으로부터 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%까지 감량될 수 있다. 기본 수준은 치료할 증상에 대해 일반적으로 권고되는 수준이며, 통증 약제 투여 분야의 당업자에게 공지되어 있거나 또는 약제에 수반된 사용 설명서에서 확인할 수 있다.
예컨대, 바이포스포네이트, 예컨대 통상적으로 매 4주 마다 90 mg으로 투여되는 파미드로네이트, 또는 통상적으로 매 1달 주기로 4 mg의 용량으로 투여되는 졸레드로인산(Terpos et al., 2009)은, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% (또는 이러한 감소에 해당되는 보다 넓은 시간 간격으로)으로 줄일 수 있거나, 또는 생략할 수 있다.
또한, 상기 투여로 인해, 바람직하게는 1차 투여 후, 상기 개체에서 적어도 안정적인 질병 상태, 마이너 반응 또는 부분 반응에 해당되는 FLC 또는 M-단백질 수준이 형성될 수 있다.
상기 면역접합체는 CD138에 대한 항원 결합 영역(ABR) 및 추가적인 항체 영역을 포함할 수 있으며, 상기 추가적인 항체 영역에서 적어도 일부분은 인간 항체 유래일 수 있으며, 상기 IgG4 이소형 특성을 제공할 수 있다.
상기 면역접합체는 nBT062나, 또는 nBT062와의 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%인 표적 항체를 포함할 수 있으며, 또는 BT062에 부합될 수 있다.
개체는 인간 개체일 수 있다.
본 방법은 상기 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 투여 단계로 필수적으로 구성될 수 있으며, 상기 조성물의 활성 성분은 기본적으로 상기 면역접합체로 필수적으로 구성될 수 있다.
본원에 기술된 방법들 중 임의의 방법은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상의 치료 사이클 동안에 지속가능한, 안정적인 질병 상태, 반응, 특히 마이너 반응, 부분 반응, 매우 양호한 부분 반응, 엄격한 완전 반응 또는 완전 반응을 유발할 수 있으며, 이때 상기 치료 사이클들은 각각 각 치료 사이클의 1일에 상기 면역접합체를 투여하는 방식으로 약 3주로 구성된다.
또한. 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질병의 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(i) 상기 질환을, 하나 이상의 세포독성제, 레날리도마이드와 같은 면역조절제 및/또는 보르테조밉과 같은 프로테오좀 저해제를 이용한 치료에 대해, 다발성 골수종 등의 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있지만 무반응인 것으로, 또는 반응성이 불량한 것으로 식별하는 단계;
(ii) 상기 개체에게, 본원에 명시된 면역접합체를 유효량으로, 상기 면역접합체를 단독 투여하는 경우에는 200 mg/m2 미만의 용량으로, 또는 잠재적인 부작용을 비롯한 부작용의 치료 물질과 함께 투여하는 경우에는 200 mg/m2의 약동학적 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함하며,
상기 개체는 하나 이상의 세포독성제, 레날리도마이드와 같은 면역조절제 및/또는 보르테조밉과 같은 프로테오좀 저해제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 반응성이 불량하며, 상기 질환은 치료된다.
또한, 본 발명은, 치료가 요구되며, 50 ng/ml 이상, 60 ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 80 ng/ml 이상, 100 ng/ml 이상, 150 ng/ml 이상, 200 ng/ml 이상, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ng/ml 이상 등의, sCD138을 높은 수준으로 나타내는 개체에게, 본원에 명시된 면역접합체를, 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련있는 질병의 치료 방법을 제공하며, 이때 20 mg/m2 또는 40 mg/m2 정도의 낮은 용량은 마이너 반응 등의 반응을 발생시킨다. 상기 반응은 면역접합체의 선택적인 결합으로 발생할 수 있다. 상기 개체는 세포독성제, 레나리도마이드와 같은 면역조절제 및/또는 보르테조밉 등의 프로테오좀 저해제를 이용한 치료에 대해, 무반응이거나 반응성이 불량할 수 있다.
조작된 표적 항체는 CD138에 대한 항원 결합 영역(ABR) 및 추가적인 항체 영역을 포함할 수 있으며, 상기 추가적인 항체 영역의 적어도 일부분은 인간 항체의 것이며, 상기 IG4 이소형 특성을 제공한다.
질환은 다발성 골수종, 특히 재발성 또는 불응성 다발성 골수종일 수 있다.
또한, 표적 세포 상에 CD138을 발현하는 상기 질환은, 신장 세포암, 자궁내막 암, 경부암, 전립선 선암종, 췌장암, 위암, 방광암, 유방암, 간암, 결장직장암, 대장암, 편평 세포암, 폐암, 특히 편평 세포 폐암, 비-호지킨 림프종, 흉선암, 자궁암, 요로암(urinary carcinoma) 또는 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 면역접합체는 CD138을 발현하는 표적 세포를 균일하게 표적으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조작된 표적 항체는
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역(ABR)으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) 항원 결합 영역이 비-인간 항체의 것인, CD138에 대한 항원 결합 영역(ABR)으로 필수적으로 구성될 수 있으며,
그리고, 적어도 일부분이 인간 항체의 것인, 추가적인 항체 영역을 포함할 수 있다.
상기 ABR는,
(a) 서열번호 1의 아미노산 잔기 99 - 111번을 포함하는, 중쇄 가변부 CDR3, 및
(b) 서열번호 2의 아미노산 잔기 89 - 97번을 포함하는, 경쇄 가변부 CDR3를 각각 포함할 수 있다.
상기 ABR은, 추가로,
(a) 서열번호 1의 아미노산 잔기 31-35 및 51-68을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1 및 CDR2, 및/또는
(b) 서열번호 2의 아미노산 잔기 24-34 및 50-56을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1 및 CDR2를 각각 포함할 수 있다.
상기 추가적인 항체 영역은,
(a) 서열번호 1의 아미노산 잔기 123 - 448, 및/또는
(b) 서열번호 2의 아미노산 잔기 108 - 214, 각각과,
(i) 조작된 표적 항체의, 항원-의존적인 세포독성 및/또는 보체-의존적인 세포독성을 유지하거나 또는 낮추거나, 및/또는
(ii) 상기 조작된 표적 항체를 안정화하는, 이들의 돌연변이를 포함할 수 있다.
항체는, 서열번호 2와의 서열 동일성이 약 70% 이상, 더 바람직하게는 80%, 85% 또는 90%인 경쇄, 및 서열번호 1과의 서열 동일성이 약 70% 이상, 더 바람직하게는 80%, 85% 또는 90%인 중쇄를 포함할 수 있다.
상기 작동자 분자는 링커를 통해 상기 조작된 표적 항체에 부착될 수 있다. 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 작동자 분자(예, DM4)는 표적 항체와 작동자 분자 간의 입체 간섭(sterical hindrance)을 제공할 수 있다. 작동자 분자는 하나 이상의 마이탄시노이드(예, DM1, DM3 또는 DM4), 탁산(taxane) 또는 CC1065, 또는 이의 유사체일 수 있다.
면역접합체는 CD138에 결합할 수 있으며, 표적성의 편차는 150% 미만, 140% 미만, 130% 미만, 120% 미만, 110% 미만, 100% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만 또는 50% 미만이다.
면역접합체는, 본 발명의 특정 구현예에서, CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며, 상기 표적 물질은 면역글로불린의 중쇄 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부는 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부의 불변부는 IgG4 이소형 불변부일 수 있다.
면역접합체의 표적 물질은 서열번호 2과의 서열 동일성이 약 70% 이상인 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 또한, 면역접합체의 표적 물질은 서열번호 1과의 서열 동일성이 약 70% 이상의 중쇄 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파의 저해, 지연 및/또는 예방을 위한, 본원에 기술된 면역접합체들 중 임의의 것, 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
약학 조성물은 본원에 기술된 세포독성제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 분리된 용기내에, 하나 이상의 투약 형태의 약학 조성물, 및 분리된 용기내에, 이를 필요로 하는 개체에게, 특히 인간 개체에게, 본원에 논의된 단회 투약 반복 또는 그외 치료 요법으로서 하나 이상의 투약 형태를 투여하는 방법에 대한 설명서를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 일측면에서, 본원에 기술된 면역접합체들 중 임의의 것은, 이러한 투여가 유익한 개체 또는 이러한 개체의 세포, 특히 인간 개체 또는 개체의 세포에 투여된다. 또한, 면역접합체는 이러한 장애의 치료용 약제 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환을 개체에서 치료하기 위한 면역접합체를 제공하며,
상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며, 상기 개체는 면역조절제 및/또는 프로테오좀 저해제 등의, 1종 이상의 세포독성제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 반응성이 불량하며,
상기 면역접합체는 개체에게 바람직하게는 정맥내로 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 양으로 투여된다.
부가적으로, 본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환을 개체에서 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 면역접합체의 용도를 제공하며,
여기서 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며, 상기 개체는 면역조절제 및/또는 프로테오좀 저해제 등의 1종 이상의 세포독성제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 또는 반응성이 불량하며,
상기 면역접합체는 개체에게 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 양으로 바람직하게는 정맥내로 투여된다.
또한, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환을 개체에서 치료하는데 있어 동시, 별도 또는 순차적으로 사용하기 위한, 면역접합체와 부작용 치료 물질의 조합 조제물을 제공하며,
이때, 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 개체는 면역조절제 및/또는 프로테오좀 저해제 등의 1종 이상의 세포독성제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 또는 반응성이 불량하며, 상기 면역접합체는 개체에게 단독 투여시 면역접합체 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 약동학적 등가로, 바람직하게는 정맥내로 투여된다.
아울러, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질병을 개체에서 치료하는데 있어, 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 조합된 조제물의 제조에 있어서의, 면역접합체 및 부작용 치료 물질의 용도를 제공하며,
이때 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 개체는 면역조절제 및/또는 프로테오좀 저해제 등의 1종 이상의 세포독성제를 이용한 치료에 대해 무반응이거나 또는 반응성이 불량하며, 상기 면역접합체는 개체에게 단독 투여시 면역접합체 5 mg/m2 - 200 mg/m2의 약동학적 등가로 바람직하게는 정맥내로 투여된다.
부가적으로, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질병을 환자에서 치료하기 위한 면역접합체를 제공하며,
이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 환자는 50 ng/ml 이상의 sCD138 혈장 농도를 나타내며,
상기 면역접합체는 적어도 마이너 반응 이상을 제공하기 위한 유효량으로 투여되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한, 면역접합체의 용도를 제공하며,
이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하며,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 환자는 50 ng/ml 이상의 sCD138 혈장 농도를 나타내며,
상기 면역접합체는 적어도 마이너 반응 이상을 제공하기 위한 유효량으로 투여되는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 면역접합체는 20 mg/m2 이상, 더 바람직하게는 40 mg/m2 이상의 양으로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 환자의 혈장내에서 나타나는 sCD138의 수준은 60 ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 80 ng/ml 이상, 100 ng/ml 이상, 150 ng/ml 이상, 200 ng/ml, 또는 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상, 700 이상, 800 이상, 900 이상, 1000 이상, 1100 이상, 1200 이상, 1300 이상, 1400 이상 또는 1500 ng/ml 이상이다.
또한, 본 발명은, 1종 이상의 세포독성제; 및 CD138 발현 세포를 표적으로 하는 표적 물질과 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 물질이 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 형성된, 1종 이상의 면역접합체를 포함하는, 항암 조합물에 관한 것으로,
(a) 상기 조합물의 상승 효과 비율(synergy ratio)은 1 이상, 1.1 이상, 1.2 이상, 1.3 이상, 1.4 이상이거나, 또는
(b) 상기 조합물의 상승 효과 비율은 약 1이며, 상기 작동자 분자와 상기 세포독성제는 작용 간섭 모드(interfering mode of action)를 가지며,
상기 항암 조합물은 1종 이상의 세포독성제와 1종 이상의 면역접합체를 개별 용기에 포함하는, 약학 조성물 또는 키트이다.
세포독성제는 프로테오좀 저해제, 면역조절제, 항-혈관신생제, DNA 알킬화제 또는 이들 2 이상의 혼합물일 수 있다.
세포독성제는 보르테조밉, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 멜팔란 또는 이들 2 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 항암 조합물의 작동자 분자 및 세포독성제는 작용 간섭 모드를 가질 수 있으며, 이러한 작용 모드는 바람직하게는 마이크로튜불린의 저해 또는 세포 주기 정지 유도(멜팔란, 보르테조밉 및 레날리도마이드 또는 탈리도마이드는 세포 주기 정지를 유도하는 세포독성제임)를 포함한다. 다른 예로, 이는 작용 비-간섭 모드(non-interfering modes of action)를 가질 수 있다.
항암 조합물이 약학 조성물의 일부인 경우, 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 항암 조합물이, 1종 이상의 세포독성제와 1종 이상의 면역접합체를 개별 용기에 보관하는 키트의 일부일 수 있다.
또한, 본 발명은,
본원에 언급된 항암 조합물, 또는
1종 이상의 세포독성제; 및 CD138 발현 세포를 표적으로 하는 표적 물질 및 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 물질이 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 형성된 면역접합체를 포함하는, 항암 조합물을,
유효량으로 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 면역접합체가 상기 세포독성제에 대한 환자의 불응성 표현형을 치유(overcome)하는 것을 특징으로 하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 환자에게 본원에 기술된 항암 조합물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며, 면역접합체가 불응성 표현형을 치유하는 것을 특징으로 하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 물질이 기능적으로 상기 작동자 분자에 부착되어 형성된 면역접합체를, 유효량으로, 비-형질세포 증식성 질환의 세포나 또는 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 비-형질세포 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것으로,
상기 CD138은, 상기 개체에서 상기 표적 세포 및 비-표적 세포 상에서 비슷한 수준으로 발현되거나, 또는 상기 개체에서 CD138을 발현하는 비-표적 세포 보다 낮은 수준으로 상기 표적 세포 상에서 발현된다.
상기 CD138을 발현하는 비-표적 세포는 상피 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은,
CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
하나 이상의 작동자 분자를 포함하는 면역접합체로서, 상기 표적 물질이 기능적으로 상기 작동자 분자에 부착되어 형성된 면역접합체를, 유효량으로 비-형질세포 증식성 질환의 세포 또는 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 비-형질세포 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 질환의 표적 세포는 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일간 CD138을 셰딩(shedding)한다.
상기 질환은 유방암일 수 있다.
본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질병을 개체에서 치료하는데 있어 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 1종 이상의 세포독성제와 1종 이상의 면역접합체의 조합 조제물을 추가로 제공하며,
이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 하나 이상의 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 개체는 불응성 표현형을 가진다.
추가적으로, 본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 질병을 개체에서 치료하는데 있어 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한, 조합 조제물의 제조에 있어서의, 1종 이상의 세포독성제 및 1종 이상의 면역접합체의 용도를 제공하며,
이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 하나 이상의 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 개체는 불응성 표현형을 가진다.
바람직한 구현예에서, 1종 이상의 세포독성제와 1종 이상의 면역접합체의 조합은, 1 이상, 1.1 이상, 1.2 이상, 1.3 이상 또는 1.4 이상의 상승 효과 비율을 가진다. 다른 예로, 1종 이상의 세포독성제와 1종 이상의 면역접합체의 조합은 약 1의 상승 효과 비율을 가지며, 작동자 분자와 세포독성제는 중첩되는 작용 모드를 가진다.
추가적인 측면에서, 본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 개체에서 비-형질세포 증식성 질환 치료용 면역접합체를 제공하며, 이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며,
상기 개체에서, CD138은 비-표적 세포에서 발현되는 CD138 수준에 상응(등가)하거나 그 미만인 수준으로 표적 세포 상에서 발현된다.
또한, 본 발명은, CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 비-형질세포 증식성 질환을 개체에서 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 면역접합체의 용도를 제공하며, 이때, 상기 면역접합체는
(i) CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
(ii) 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되,
상기 표적 물질은 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 면역접합체를 형성하며, 상기 개체에서 CD138은 비-표적 세포 상에서 발현되는 CD138 수준에 상응(등가)하거나 그 미만인 수준으로 표적 세포 상에서 발현된다.
또한, 본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 비-형질세포 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것으로,
이를 필요로 하는 개체나 또는 상기 비-형질세포 증식성 질환의 세포에 면역접합체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하며,
상기 면역접합체는
CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 물질, 및
하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 물질이 기능적으로 상기 작동자 분자에 부착되어 형성된 면역접합체이며, 상기 면역접합체는 고형 종양의 관해(remission)를 유도한다.
이러한 관해는, 상기 종양의 재-증식이 없는 시간 간격을 수반하는 관해일 수 있다(완전 관해). 이 시간 간격은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 반년, 1년 또는 그 이상일 수 있다.
고형 종양은 췌장암 또는 유방암일 수 있다.
질병은 신장 세포암, 자궁 내막암, 경부암, 전립선 선암종, 췌장암, 위암, 방광암, 유방암, 간암, 결장직장암, 대장암, 편평 세포 암종, 폐암, 특히 편평 세포 폐암, 비호지킨 림프종, 흉선암, 자궁암, 요로암 또는 난소암일 수 있다.
고형 종양은, 에스트로겐 수용체 음성 및/또는 프로게스테론 수용체 음성인, 유방암일 수 있다.
도 1은 작동자 분자가 부착된 nBT062를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 BT062의 화학식을 도시한 것이다.
도 3은 안사미톡신 P-3의 마이탄시놀로의 변환을 나타낸 것이다(입체화학은 단순화를 위해 생략함).
도 4는 CD4의 대표적인 합성 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 항체 접합(DM4에 nBT062)을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 OPM-2 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 및 nBT062 항체의 결합을 분석한 것이다. 다양한 농도의 nBT062 및 접합체를 세포에 제공하여, 평균 형광을 FACS 분석으로 측정하였다.
도 7(A)-(D)는 MOLP-8 (CD138+) 및 BJAB (CD138-) 세포에 대한 nBT062-DMx 접합체의 시험관내 세포독성을 나타낸 것이다. 세포를 바닥이 평평한 플레이트에서 배양하고, 5일간 기재된 농도의 면역접합체와 함께 인큐베이션하였다. WST 시약을 추가의 3시간 동안 첨가하여, 세포 생존성을 측정하였다. (D)에서, nBT062-SPDB-DM4의 세포독성 활성을 블록킹 항체(1 μM nBT062)의 존재 또는 부재하에 분석하였다.
도 8은 MOLP-8 종양 세포 접종 후 시간(일) 경과에 따른 (A) PBS, (B) nBT062 항체, (C) 유리형 DM4 또는 (D) 비-표적성 접합체 huC242-DM4 처리한 각 마우스에서의 종양 체적을 나타낸 것이다.
도 9는 MOLP-8 종양 세포 접종 후 시간(일) 경과에 따른 (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 또는 (D) nBT062-SPP-DM1을 처리한 각 마우스에서의 종양 체적을 나타낸 것이다.
도 10은 CB.17 SCID 마우스에서의 MOLP-8 인간 다발성 골수종 이종이식체의 접종 후 시간(일) 경과에 따른 평균 종양 체적(+/- SD)을 나타낸 것이다.
도 11A 및 B는 SCID 마우스에서 벌키 MOLP-8 종양 모델의 CD138+ MOLP-8 종양 세포에 대한 nBT062-DMx의 항-종양 활성을 나타낸 것이다. 각 군에서 종양 체적은 평균(+/- SD)으로 나타내었다.
도 12는 SCIDhu/INA-6 모델에서 인간 골수 환경내 다발성 골수종에 대한 nBT062 함유성 DMx 접합체의 항-종양 효능을 나타낸 그래프이다. 다발성 골수종 세포(shuIL-6R)에 의해 생산되는 가용성 인간 IL-6 수용체를 종양 하중(tumor burden)의 인디케이터로 사용하였다. ▲: nBT062-SPP-DM1, ■: nBT062-SPDB-DM4; ◆: 비히클 대조군.
도 13은 시험관내 nBT062-SPDB-DM4 매개 방관자(bystander)의 사멸을 나타낸 것이다. CD138 양성 OPM2 세포 및 CD138 음성 Namawla 세포를 여러가지 농도의 nBT062-SPDB-DM4와 함께 인큐베이션하였고, 세포 생활성을 측정하였다. OD450 값은 세포 생존성 측정치이다.
도 14는 BT062의 단회 주입시의 이종이식 마우스 모델의 종양 증식을 나타낸 것이다. 별표(*)로 표시된 용량은 결합된 DM4의 분자량을 기초로 한다.
도 15는 BT062 대 대조군 처리한 마우스에서의 이종이식 췌장암의 완전관해를 나타낸 것이다.
도 16은 BT062 대 대조군 처리한 마우스에서의 이종이식 유방암의 완전 관해를 나타낸 것이다.
도 17은 40 mg/m2 - 120 mg/m2 범위의 용량의 신속한 혈장내 소거를 나타낸 것이며, 용량 160 mg/m2의 본원에 기술된 보다 높은 용량에서는 예측된 값에 가까운 혈장 소거를 나타낸다.
도 18은 BT062 혈장 프로파일을 동일 용량으로 처리한 원숭이과 비교한 것이다. 비교를 통해, 낮은 용량에서의 신속한 혈장 소거는 이용가능한 동물 모델로부터 예측할 수 있으며, 인간에게 특이적일 수 있다는 것이 명확해진다.
도 19는 이론적인 Cmax 수치와 비교하여 BT062의 측정된 Cmax를 나타낸 것이다.
도 20 및 21는 몇번의 치료 사이클 동안에 Cmax 수치가 일반적으로 유사함을 나타낸 것이다.
도 22는 신속한 혈장 소거가 가용성 CD138에 의해 야기되는 완충 작용으로 인한 것이 아님을 명확하게 보여준다.
도 23은 명시된 치료 사이클의 진행시 투여된 여러가지 BT062 용량을 이용한 인간 개체에서의 치료 차트를 도시한 것으로, 각 치료 사이클는 21일이며, 각 용량은 각 주기의 1일에 투여된다.
도 24는 3주 간격으로 20 mg/m2 복용 환자에서 측정한, 뇨 M-단백질 수치를 나타낸 것이다. -5일부터 205일 까지를 나타낸다.
도 25는 3주 간격으로 40 mg/m2 복용 환자에서 측정한, 혈청 M-단백질 수치를 나타낸 것이다. -21일부터 119일 까지를 나타낸다.
도 26은 3주 간격으로 160 mg/m2 복용 환자에서 측정한, 카파 FLC 수치를 나타낸 것이다. -21일부터 101일 까지를 나타낸다.
도 27은 20 mg/m2 코호트 환자의 BT062 혈장 농도를 나타낸 것이다.
도 28은 이종이식 마우스 모델에서 평균 종양 체적(TV)에 대한 병용 치료의 효과를 나타낸 것이다. 그 결과는, BT062와 레날리도마이드의 조합물의 효과이다.
도 29는 이종이식 마우스 모델에서 평균 종양 체적(TV)에 대한 병용 치료 효과를 나타낸 것이다. 그 결과는, BT062와 VELCADE의 조합물의 효과이다.
도 30은 이종이식 마우스 모델에서 평균 종양 체적(TV)에 대한 병용 치료의 효과를 나타낸 것이다. 그 결과는, BT062 및 멜팔란의 조합물의 효과이다.
본 발명은, 필요로 하는 개체에게, 특히 인간 개체(환자)에게, 본원의 CD138 표적 물질을 포함하는 면역접합체의 투여, 및 면역접합체의 표적 부위로의 작동자 분자(들)의 전달, 및 표적 부위, 특히 표적 세포, 조직 및/또는 장기에서 또는 내에서 작동자(들) 분자의 방출에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 그러한 CD138 표적 물질과 표적 물질에 부착된 강력한 작동자 분자를 포함하는, 면역접합체에 관한 것이다. 작동자 분자는, 표적 부위에서 또는 내에서 면역접합체의 일부인 표적 물질로부터의 절단 및/또는 해리에 의해 활성화된다. 면역접합체는 단독으로, 또는 세포독성제를 포함한 항암 조합물의 일부분으로서 투여될 수 있으며, 상기 세포독성제로는 프로테오좀 저해제(예, 보르테조밉), 면역조절제/항-혈관신생제(예, 탈리도마이드 또는 레나리도마이드), DNA 알킬화제(예, 멜팔란) 또는 코르티코스테로이드(예, 덱사메타손)가 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 상기 항암 조합물은 단일 요법에서 단독으로 사용되는 면역접합체, 단일 요법에서 단독으로 사용되는 세포독성제 또는 양자에 비해 암 치료 효과에 상승적인 효과나 예상하지 못했던 상가적인 효과를 가진다.
본 발명에 따른 면역접합체는 치료가 필요한 개체나 치료가 필요한 개체로부터 분리된 세포에 투여할 수 있다. 작동자 분자 또는 분자들은 표적 세포, 조직 및/또는 장기에서 또는 내에서의 절단/해리에 의해 면역접합체로부터 분리될 수 있다.
일 예로, 면역접합체 BT062는 CD138을 발현하는 세포를 nBT062 항체를 통해 표적하며, 작동자 분자로서 DM4를 포함하는 것으로서, 이는 재발성/불응성 다발성 골수종 환자에게 반복되는 단회 투약으로서 80 mg/m2의 양으로 4번 투여되며, 각 치료 사이클의 기간은 21일이며, 사이클 당 1회로 주기의 1일에 투여된다. 이러한 예에서, 면역접합체는 종양 세포에 및/또는 내에 보다 잘 모일 수 있도록 환자에게 정맥내 투여된다. BT062의 혈장 농도 측정에서, 초기 측정 단계에서(투여 후 최대 2시간) BT062의 Cmax 값은 이론적으로 계산된 수치 보다 현저하게 낮지만, 부작용은 관찰되지 않는 것으로 나타나, BT062가 무작위적으로 표적 또는 비-표적 CD138에 부착하기 보다는 종양 표적에만 모이게 됨을 시사한다. sCD138로부터 발생되는 "완충 효과"를 제외시킬 수 있었다(도 20 참조).
다른 예로, 면역접합체 BT062는 재발성/불응성 다발성 골수종 환자에게 반복되는 단회 투약으로서 20 mg/m2의 양으로 10번 투여되며, 각 치료 사이클의 기간은 21일이며, 사이클 당 1회로 주기의 1일에 투여된다. 이러한 예에서, 면역접합체는 종양 세포에 및/또는 내에 보다 잘 모일 수 있도록 환자에게 정맥내 투여된다. 면역접합체로부터 작동자 분자를 분리하기 위한 추가적인 수단은 제공하지 않는다. 10번의 치료 사이클는 잘 허용되며, 이러한 치료 사이클들로 적어도 안정적인 질병 상태를 달성할 수 있었다.
다른 예에서, 면역접합체 BT062는 재발성 다발성 골수종 환자에게 반복되는 단회 투약으로서 160 mg/m2의 양으로 4번 투여되며, 각 치료 사이클의 기간은 21일이며, 사이클 당 1회로 주기의 1일에 투여된다. 이러한 예에서, 면역접합체는 종양 세포에 및/또는 내에 보다 잘 모일 수 있도록 환자에게 정맥내 투여된다. 이러한 농도에서, 혈장 소거는 여전히 이론적 Cmax 미만이나, 더 높은 용량에서 관찰되는 수준은 아니다. 그러나, 혈청 FLC 수준의 큰 폭의 감소는 단순 단일 처리 후에 관찰할 수 있다. 부분 반응은 2차, 3차 및 4차 처리 후에 관찰할 수 있다.
특정 치료 요법에서, 통증 및/또는 골 합병증을 완화하는 약제의 투여는, 환자의 통증이 면역접합체의 투여시에 사라지기 때문에, 중지한다. 그 결과, 이러한 약제(비스포르포네이트 및 그외 골다공증 약물 포함)와 관련된 부작용, 예컨대 jar의 골괴사가 방지된다.
또다른 예에서, 면역접합체 BT062는 재발성 다발성 골수종 환자에게 반복되는 단일 용량으로서 면역조절제 레날리도마이드의 1일 경구 용량 10 mg과 함께 120 mg/m2의 양으로 4번 병용-투여되며, 각 치료 사이클의 기간은 21일이며, 사이클 당 1회로 주기의 1일에 투여된다. 이러한 예에서, 면역접합체는 종양 세포에 및/또는 내에 보다 잘 모일 수 있도록 환자에게 정맥내 투여된다.
다른 예로, 면역접합체 BT062는 반복되는 단일 용량으로서 췌장암을 앓고 환자에게 투여되며, 각 치료 사이클의 기간은 21일이며, 사이클 당 1회로 주기의 1일에 투여된다. 이러한 예에서, 면역접합체는 종양 세포에 및/또는 내에 보다 잘 모일 수 있도록 환자에게 정맥내 투여된다.
CD138 또는 신데칸-1(syndecan-1)(또한 SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; CD138 ANTIGEN, SwissProt accession number: P18827 human로 언급됨)은, 본래 상피 기원의 세포 상에 존재하는 것으로 기술되었으나, 이후에 조혈 세포 상에서도 발견된, 막 당단백질이다(Sanderson, 1989). CD138은 가용성 분자(예, 성장 인자들 EGF, FGF, HGF) 및 불용성 분자(예, 세포외 매트릭스 성분들인 콜라겐 및 파이브로넥틴)에 헤파란 설페이트 체인을 통해 결합하여(Langford, 1998; Yang, 2007), 세포외 매트릭스에 대한 수용체로서 작용하는, 긴 세포외 도메인을 가지고 있다. 또한, CD138은 부착 세포에 의해 발현된 헤파린-결합 분자를 통해 세포 대 세포의 접착을 매개한다. CD138은 골수종 세포의 성장 인자들에 대한 공동-수용체로서의 기능을 가지고 있는 것으로 확인되고 있다(Bisping, 2006). 형질세포 분화에 대한 연구에서, CD138이 또한 분화 항원으로서 간주하여야 함이 밝혔다 (Bataille, 2006).
악성 조혈 과정에서, CD138은 MM 세포, 난소암 세포, 신장암 세포, 담낭암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 호지킨 림프종 세포, 비-호지킨 림프종 세포, 만성 림프성 백혈병(CLL)(Horvathova, 1995), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수모구성 백혈병(AML) (Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b)), 고형 조직 육종, 대장암 뿐만 아니라 CD138을 발현하는 그외 조혈 악성종 및 고형 종양의 대부분에서 많이 발현된다(Carbone et al., 1999; Sebestyen et al.,1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al.,2004; Orosz and Kopper, 2001). CD138의 발현은 또한 다른 유형의 위장 악성 종양과도 관련있다(Conejo et al., 2000). 표 1에 나타낸 바와 같이, CD138 발현/과다발현과 관련있는 다수의 종양성 세포주들이 있다.
여러가지 세포주에서의 CD138의 발현. MM의 경우, BT062에 대한 민감성이 보다 높은 CD138 발현과 상호 관련있는 것으로 확인됨(RFI= 상대적인 형광 인덱스).
세포주 기원 민감성 CD138 발현
IC50 (nM) RFI* 수용체/세포
NCI-H929 MM 0.38 502 788,752
PC-3 전립선암 0.79 541 195,671
U266 MM 1.59 617 782,987
MOLP-2 MM 1.78 425 161,064
SK-BR-3 유방암 2.72 485 444,350
LNCaP 전립선암 7.39 179 23,388
CAPAN-2 췌장암 15.51 328 n. d.
PANC-1 췌장암 36.38 34 18,085
T47D 유방암 89.28 217 42,264
Jurkat T세포 림프종 39.00 n. d. 0
예컨대, 유방암 세포주 및 췌장암 세포주에서 관찰된 민감성은 실질적으로 MM 세포주에 비해 낮았다. 그렇지만, 실험 섹션에서 기술한 바와 같이, 유방암 및 췌장암 환자 유래의 세포를 이용한 이종이식 마우스 모델에서, 상응하는 MM 이종이식 모델과 비교하여, 상응할 뿐만 아니라 상당히 우수한 결과가 수득되었다. 이들 2가지 경우에서, 완전 관해를 최종적으로 달성할 수 있었지만, 유사한 MM 모델에서는 종양 증식의 현저한 지연은 관찰되었지만 완전한 관해는 아니었다.
췌장암에서, 초기 종양과 진행성 종양에서의 신데칸-1 mRNA 발현에는 차이가 없는 것으로 나타났지만, 유방암에서는, 약하거나 결여된 IHC 염색으로 확인되는 바와 같이 경시적으로 CD138이 없어질 수 있다는 것이 보고되었다. CD138의 발현 상실이 보고되었으며, 대개 발현의 변동(shift), 즉, 주변 기질 상에서의 새로운 발현과 상호 관련있었다(Loussouarn, 2008). 그 결과, 경시적으로 CD138 표적 물질에 대한 몇가지 표적들을 예측할 수 있다.
CD138 발현이 양성인 것으로 확인된 기타 암으로는, 다수의, 난소 선암종, 방광 이행성 세포암, 신장 투명 세포암, 편평 세포 폐암; 및 자궁암 등이 있다(예로 Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002를 참조함).
활성(증후가 있는) 다발성 골수종 및 관련된 형질세포 증식성 장애의 치료는 본 발명의 면역접합체를 통해 치료할 수 있는 질환의 예로서 제공될 것이다.
본원에서 형질세포 증식성 장애는 형질세포(plasma cell) 및/또는 MGUS, SMM, Active (symptomatic) MM, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 독립성 골수종(solitary plasmacytoma), 전신성 AL 아밀로돕시스 및 POEMS 증후군 등의 조혈성 장애를 의미한다.
다발성 골수종(MM)은 전형적으로 골수에서 기원하며, 주로 환자의 골격근에서 이루어지며, 침범된 특정 부위에 기인한 임상적인 특성과 혈장 단백질들의 형성에서의 비정상성이 나타나는, 형질세포의 악성 증식을 지칭한다. 이 질환은 일반적으로, 골과 때로는 골격근 이외의 부위에서의 명백한 부종을 야기하는, 다양한 골수(특히 두개골의 골수)내 비정상적인 또는 악성 형질세포의 다수의 미만성 국소(foci) 또는 결정(nodular) 축적이 특징적이다. 방사선 검사에서, 골 병변에는 "펀치-아웃"된 특징적인 외양이 있을 수 있다. 골수종 함유된 세포들은 전형적으로 비정상적인 단백질을 생산하거나 및/또는 혈청 및 뇨에서 비정상적인 단백질 수준을 형성한다. 질환은, 전형적으로, 유의성이 미결정된 단일클론 감마글로불린 병증(MGUS: monoclonal gammopathy of undetermined significance)에서 무증상 다발성 골수종(SMM: smoldering multiple myeloma), 그리고 활성형 다발성 골수종(MM)으로 전개된다. 이러한 질환의 증상들은 다양하지만, 고칼슘혈증, 신부전(renal insufficiency), 피로, 빈혈, 골 통증, 자연 골절, 감염 횟수 또는 지속 기간 증가, 또는 뇨 색상 또는 냄새 이상이 있을 수 있다. 본 발명이 다발성 골수종을 지칭하는 경우, 이는 유의성 미정의 단일클론 감마글로불린 병증(MGUS), 무증상 다발성 골수종(SMM) 및 활성형 다발성 골수종(MM), 뿐만 아니라 궁극적으로 활성형 MM으로 전개될 수 있는 형질세포의 그외 악성 증식을 지칭한다.
MGUS,는 MM의 전에 나타나는 임상적으로 양성인 질환 상태로, MM 보다 발생 빈도가 높으며, 50대 이상의 집단에서의 발병률은 1%이고, 70대 이상의 집단에서의 발병률은 3%이다(Greipp and Lust, 1995). MGUS 환자에서는 치료적 수단 없이도 안전적인 것으로 관찰될 수 있기 때문에, MGUS 환자를 MM 환자로부터 구분하는 것이 중요하다.
그러나, MGUS 환자 241명에 대한 장기간의 추적 기간 동안에, 59명의 환자(24.5%)가 MM 또는 관련 장애로 발전되었다(Kyle et al., 1993).
용어 감마글로불린 병증은 환자의 면역글로불린 합성에서의 일차적인 교란(primary disturbance)을 의미한다.
단일클론 감마글로불린 병증은 림프계 세포 또는 형질세포의 단일 클론의 증식(정상적으로 혈청 단백질 전기영동(SPEP) 상에서 단일 피크로서 가시화 가능함)과 전형적으로 관련되어 있으며, 환자의 혈청 또는 뇨내 단일클론 면역글로불린의 존재가 특징적인, 일군의 임의의 장애를 지칭한다.
무증상 MM(SMM)은 노년층에서의 유증상성 다발성 골수종이 개시되기 전에 앞서 나타나는 것으로 보고되고 있다. 무증상 다발성 골수종은 흔히 MGUS의 진행된 단계로서 간주되고 있며, 심지어 진행시에도, 무증상 다발성 골수종에서 발전된 다발성 골수종에는 일반적으로 골 용해성 병변 또는 그외 유증상성 다발성 골수종의 기본적인 특징들이 결여되어 있다.
MM의 임상 증상들은 빈혈, 고칼슘혈증, 신부전 및 용해성 골 병변이다. 질병은 유의성 미정의 단일클론성 감마글로불린 병증(MGUS)에서 무증상 다발성 골수종(SMM)으로 다시 다발성 골수종(MM)으로 진행됨에 따라 질병의 추이와 중증도에 대한 구분은 아래 표 2에 나타낸다. 이 표에는 또한 이러한 질병 상태의 검출, 진단 및 모니터링 방법을 종합하여 나타내었다. 이러한 증상과 기법들은 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
MM, SMM 또는 MGUS의 임상 특징 비교
특징 MM SMM MGUS
골수 형질세포 >=10% >=10% <10%
혈청 M-단백질 >=3 g/dL >=3 g/dL <3 g/dL
Bence-Jones >=1 g/24 h <1 g/24 h <1 g/24 h
뇨내 단백질 o o o
빈혈 일반적으로 존재함 가능성 있음 없음
고칼슘혈증, 신부전 존재할 수 있음 없음 없음
용해성 골 병변 일반적으로 존재함 없음 없음
MM = 다발성 골수종
SMM = 무증상 다발성 골수종
MGUS = 유의성 미정의 단일클론성 감마글로불린 병증
다발성 골수종의 중증도 및 임상적인 특징에 의해 단계 분류
질병 진행 단계
단계 I (활성 MM)
상대적으로 적은 수의 암 세포가 신체 전체에 퍼짐. 혈중 적혈구 세포의 수와 칼슘 양은 정상임. 뼈에서는 종양(형질세포종)은 발견되지 않음. 혈액 또는 뇨내 M-단백질의 양은 극히 적음. 질병의 증상은 없을 수 있음.
단계 II (활성 MM)
적정 수의 암 세포가 신체 전체에서 발견됨
단계 III (활성 MM)
상대적으로 많은 수의 암 세포가 신체 전체에 퍼져 있음. 하기 중 하나 이상의 증상이 있을 수 있음:
적혈구 수 감소로, 빈혈 유발
골 손상으로 인해 혈중 칼슘 양이 매우 높음
4종 이상의 골 종양(형질세포종)이 발견됨.
혈액과 뇨에서 M-단백질이 고농도로 확인됨
MM의 임상적인 특징
고칼슘혈증
신부전
빈혈
단일클론성 단백질:
SPEP (혈청 단백질 전기영동)
SPIEP (혈청 단백질 면역전기영동)
뇨 단백질 면역전기영동(Bence - Jones 단백질)
MM의 진단
골수 내 형질세포 >10%, 또는 생검 또는 형질세포종 상에서의 응집
단일클론 단백질:
혈청 M-단백질 >3 g/dl 또는
뇨내 M-단백질
활성형 다발성 골수종(MM)은 전형적으로 환자의 골수에서의 악성 형질세포의 증식으로 임상적으로 확인되고 있다. 이러한 신생물성 형질세포는 면역글로불린을 생산하며, B-림프구로부터 발생된다. 형질세포에 의해 생산된 면역글로불린은 환자의 혈액 혈청 및/또는 뇨에서 전기영동 검사에 의해 검출할 수 있다.
표 2에서 언급한 바와 같이, 혈청 M-단백질의 측정은 MM의 여러가지 단계를 분석하는 중요한 수단이다.
"M-단백질"은 전기영동 겔에 가느다란 밴드 또는 면역전기영동에서의 이상한 호 형태로 통상적으로 가시화되는 단일클론 단백질이다. 이는, 하나의 공통 세포(common cell)로부터 기원하는 클론 세포에 의해 생산되는 동질적인(homogenous) 면역글로불린, 예컨대 단일 클래스 및 서브클래스의 중쇄와 단일 타입의 경쇄가 특징인 단일클론 면역글로불린의 증식을 표시한다(또한, M-스파이트, 보다 광의적으로는 파라단백질로도 지칭됨).
"혈청 단백질 전기영동" (SPE 또는 SPEP) 및 "면역고정 전기영동" (IFE)으로 다발성 골수종(MM)을 비롯한 몇가지 형질세포 증식성 장애에서 생산되는, 단일클론 면역글로불린을 검출할 수 있다. 개체 집단에서 이러한 검출 결과의 최대 61%에서는 임상적인 증상과 관련이 없어, 유의성 미정의 모노감마글로불린 병증(MGUS)으로 진단할 수 있다. 그러나, SPE와 IFE는 모든 단일클론 면역글로불린을, 특히 경쇄만 분비된 경우에는 검출하지 못한다.
이러한 "유리형 결핍 분자(free light chain molecule)" (FLC)는 λ 및 κ 경쇄를 포함한다. 형질세포는 κ 또는 λ 분자와 함께 5개의 중쇄 유형들 중 한가지를 생산한다. 중쇄 합성 대비 유리형 경쇄의 생산율은 통상 약 40%를 초과한다. 형질세포는 무손상(intact) 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 유리형 경쇄(FLC, κ 또는 λ)를 방출하며, 혈청내 경쇄 수준은 합성(κ>λ)과 신장에서의 배출(κ>λ)의 상대적인 비에 의해 결정된다. 단일클론 면역글로불린의 존재하는 경우, κ:λ 비는 포함된 FLC의 클래스에 따라, 정상 범위 보다 높거나 낮을 수 있다. FLC의 혈청내 반감기는 2-6시간인데 반해, IgA는 5일, IgM은 6일, IgG는 21일이다. 따라서, 혈청내 FLC 농도 측정은 무손상 면역글로불린을 측정하는 것 보다는 치료법에 대한 종양 반응성 평가를 보다 더 신속하게 할 수 있다. 이처럼, 혈청내 FLC 측정으로 재발을 조기 검출할 수 있다.
비-형질세포 증식성 질환 역시 CD138 발현과 관련있다.
췌장암
대부분의 경우 외분비 타입이다. 이러한 외분비형 암 대부분은 관 선암( ductal adenocarcinoma)이다(추가로 드물게는 서브타입은 낭성 종양, 선포 세포의 종양 및 육종을 포함함). 췌장의 내분비형 암은 호르몬 생산성 종양이다.
인 시츄 암은 이것이 시작된 곳의 세포 층으로 한정된 경우 암의 초기 단계를 지칭한다. 유방암의 경우, 인 시츄는 암 세포가 관(인 시츄 유관 산피내암) 또는 소엽(인 시츄 유소엽암)으로 한정되어 있는 것을 의미한다. 이는 유방의 더 깊은 조직까지 증식하거나 또는 신체의 다른 장기로 전파되지 않은, 때로는 비-침습성 또는 프리-침습성 유방암으로도 지칭된다.
침습성(침윤성) 암.
췌장의 외분비 세포 및 내분비 세포는 완전히 다른 타입의 종양을 형성한다.
외분비형 종양
지금까지 췌장암에서 가장 일반적인 타입이며, 대부분의 췌장 외분비형 종양은 악성이다. 외분비형 췌장암의 약 95%는 선암종(선암종은 선세포에서 시작되는 암임)이다. 이러한 암은 일반적으로 췌장의 관에서 시작되지만, 때로는 췌장 효소를 만드는 세포에서 발생되기도 한다(선포 세포 암종).
외분비형 췌도암에서 발생율이 조금 낮은 타입으로는 선편평 암종, 편평 세포 암종 및 자이언트 세포 암종이 있다.
내분비형 종양
내분비 췌장암은 드물다. 그룹으로서, 이는 췌장 신경내분비 종양(NET: neuroendocrine tumor)으로 또는 때로는 섬 세포 종양으로 알려져 있다. 섬세포 종양에도 몇가지 서브타입들이 존재한다. 각각은 시작되는 호르몬-생성 세포의 타입에 따라 명명된다.
외분비 췌장암의 단계를 설명하는데 사용되는 주요 체계는 미국 암 학회(ACS)가 제공하는 미국 합동 암 위원회(AJCC)의 TNM 체계이다. 이 TNM 체계에서는 단계 구분을 위해 3가지 주된 정보를 이용한다:
T는 센티미터(cm) 단위로 측정한 원발성 종양(들)의 크기를 나타내며, 암이 췌장내에 퍼지거나 또는 근처 장기로 퍼졌는지를 나타낸다. 구별은 TX, T0, T1, T2, T3 및 T4로 하며, 숫자가 높을수록 질환이 진행되었음을 나타낸다.
N은 근처(국부적) 림프절로 전파되었음을 나타낸다. N 카테고리로는 NX, NO 및 N1이 있다.
M은 암이 신체의 다른 장기로 전이(전파)되었는지를 표시한다. (췌장암이 전파되는 대부분의 공통된 부위는 간, 폐 및 복막 - 소화기관 주변 공간임). M 카테고리로는 MX, M0 및 M1이 있다.
T, N 및 M 카테고리를 결정한 후, 이 정보를 조합하여, 병기 분류로 불리우는 과정인 병기(stage)를 정한다.
0기 (Tis, N0, M0): 종양이 췌도 세포의 상부층으로 국한되어 있고, 보다 깊은 조직으로 침입되지 않았음. 웨장 외부로 퍼지지 않았음. 이러한 종양은 때로는 인 시츄 췌장암 또는 췌장 상피내 종양(PanIn III)이라고도 한다.
IA기 (T1, N0, M0): 종양이 췌장으로 국한되며, 크기는 2 cm 미만임. 근처 림프절 또는 원격 전이는 없음.
IB기 (T2, N0, M0): 종양이 췌장으로 국한되며, 크기는 2 cm 보다 큼. 근처 림프절 또는 원격 전이는 없음.
IIA기 (T3, N0, M0): 종양이 췌장 외부로 증식되었지만 큰 혈관으로 전파되지 않았음. 근처 림프절 또는 원격 전이는 없음.
IIB기 (T1-3, N1, M0): 종양이 췌장으로 국한되거나 또는 췌장 외부로 증식되지만, 근처 큰 혈관이나 주요 신경으로 전파되지 않았음. 근처 림프절까지 퍼졌으나, 원격 전이는 없음.
III기(T4, 모든 N, M0): 종양이 췌장 외부로 증식되어 근처 큰 혈관이나 주요 신경까지 퍼짐. 근처 림프절까지 퍼지거나 퍼지지 않았을 수 있음. 원격 전이는 없음.
IV기 (모든 T, 모든 N, M1): 암이 원격 전이됨.
TNM 체계에 공식적인 부분은 아니지만, 다른 인자들도 예후(전망) 결정에 중요하다. 암의 단계(현미경 하에 세포의 이상성을 살펴보는 방법)는 때로는 G1에서 G4로도 나타내는데, G1은 암이 거의 겅상 세포와 비슷하게 보이며 예후가 양호하다.
수술을 받은 환자의 경우, 보다 중요한 인자는 종양 전체가 제거되었는지 아닌지인 절제 정도이다. 이는, 때로 R0(가시적이고 현미경으로 관찰되는 종양이 모두 제거됨) 내지 R2(일부 가시적인 종양은 제거할 수 없었음)로 기재된다.
현실적인 관점에서, 암이 어느 정도까지 퍼졌는지는 대개 수술하지 않고는 정확하게 확인할 수 없다. 이는, 의사들이 대개 보다 단순한 병기 분류 체계, 즉 종양을 수술로 제거할 수 있는지 여부를 기초로 암을 그룹으로 분류하는 방법을 사용하는 이유이다. 이들 그룹은 수술 가능, 국소 진행성(수술 불가능) 및 전이이다. 이 용어들은 외분비형과 내분비형 췌장암 둘다를 설명하는데 사용할 수 있다.
수술 가능: 암이 췌장에만 있다면(또는 약간 근거리로만 퍼졌다면), 외과의는 종양 전체를 제거할 수 있으며, 이를 수술가능이라한다.
국소 진행성 (수술 불가능): 암이 원격 장기로 퍼지지 않았지만, 수술로는 완전하게 제거할 수 있는 경우로, 이를 국소 진행성이라 한다. 종종, 암을 제거할 수 없는 이유는 근처 혈관에 다량 존재하기 때문이다.
전이: 암이 원격 장기로 퍼졌을 때를 전이라고 한다. 수술을 수행할 수도 있지만, 목적은 증상 완화이지 암 치유가 아니다.
신경내분비 췌장암은 외분비형 췌장암 처럼 병기가 분류되지 않는다. 대신, 통계 자료에 따라 여러가진 병기로 분류된다: 국소(오직 췌장), 국지적(근처 림프절 또는 조직으로 퍼짐) 및 원격(멀리 떨어져 있는 부위 예컨대 간으로 퍼짐).
방광암은 현미경에서 암세포를 관찰한 결과로 분류한다.
이행 세포 암종(Transitional cell carcinoma)(또한, 요로상피 암종이라고도 함)이 지금까지 가장 흔한 방광암이다. 이 그룹에도 서브타입들이 있다. 이들은 세포의 형태에 따라, 그리고 다른 장기로 퍼져 침투되는 양상에 따라 명명된다. (이들이 방광내 심부로 증식된 것이 틀림없다면 침습성이라고 하며, 그렇지 않다면 비-침습성이라 함). 이들 종양은 현미경에서의 관찰되는 세포에 따라 병기로 분류된다. 세포가 정상과 매우 비슷하게 보이면, 그 암은 저-등급 암이다. 세포가 매우 비정상적으로 보이면, 그 암은 고-등급이다. 등급이 낮을수록 보다 천천히 증식하는 경향이 있으며, 높은 등급의 암 보다 결과가 우수하다.
또한, 편평 세포 암종(드문 형: 통상 침습성); 선암종(드문 형: 거의 대부분이 침습성); 소세포(희귀)도 정의에 포함된다.
그외 드문 방광암들도 본 정의에 포함된다.
방광암도 병기 분류된다:
0a기 (Ta, N0, M0): 암은 비침습성 유두암임. 방광의 홀 센터쪽으로 증식하지만 방광벽의 근육 또는 연결 조직까지 침범되지 않았음. 림프절 또는 원격 전이되지 않았음.
0is기 (Tis, N0, M0): 암은 평평하고 비침습성의 암으로, 또한 편평 암종 인 시츄(CIS)라고도 함. 암은 방광의 라이닝 층까지 침범됨. 방광의 홀 부분 내부로는 침범되지 않았고, 방광벽의 근육 또는 연결 조직까지 퍼지지 않았음. 림프절 또는 원격 전이되지 않았음.
I기 (T1, N0, M0): 암이 방광의 라이닝층 아래 결합조직까지 침범되었으나, 방광벽의 얇은 근육층까지는 퍼지지 않았음. 암이 림프절 또는 원격 전이되지 않았음.
II기 (T2, N0, M0): 암이 방광벽의 얇은 근육층까지 침범하였지만, 근육을 완전히 통과하여 방광을 둘러싸고 있는 지방 조직에까지는 퍼지지 않았음. 암이 림프절 또는 원격 전이되지 않았음.
III 기(T3 또는 T4a, N0, M0): 암이 완전히 방광을 거쳐 방광을 둘러싸고 있는 지방 조직층까지 침범됨(T3). 전린섭, 자궁 또는 질에 침범하였을 수 있음(T4a). 골반벽 또는 복벽으로 침범되지 않음. 암이 림프절 또는 원격 전이되지 않았음
IV기 (T4b, N0, M0) 또는 (모든 T, N 1 - 3, M0) 또는 (모든 T, 모든 N, M1): 암이 방광벽을 지나 복벽 또는 골반벽까지 퍼졌거나(T4b) 및/또는 림프절(N1-3) 및/또는 골, 간 또는 폐 등의 원격 부위로 전이됨(M1).
담낭암의 종류
담낭암 10건 중 9건 이상이 선암종이다. 선암종은 체내 많은 내표면 및 외표면의 안에 라이닝되어 있는(소화계 내부 포함), 샘세포와 유사한 특성을 가지고 있는 세포에서 시작되는 암이다.
특별히 언급할 만한 담낭 선암종의 한가지 종류는 유두형 선암종(papillary adenocarcinoma) 또는 간단히 유암종(papillary cancer)이다. 이들 암은 현미경으로 검경하였을 때 손가락 처럼 융기 형태로 세포가 정렬되어 있는 담낭암이다. 일반적으로, 유암종은 거의 간이나 근처 림프절까지 전이되지 않는다. 이 암은 대부분의 다른 담낭 선암종에 비해 예후(결과)라 우수한 편이다. 담낭암의 약 6%가 유두형 선암종이다.
선편평상피암, 편평상피암 및 소세포 암종 등의 방광암에서 발전될 수 있는 그외 암 종류가 있지만, 발병율은 드물다.
담낭암의 병기를 분류한 후, AJCC의 TNM 체계를 기준으로 구분한다:
0기: Tis, N0, M0: 담낭의 상피층에만 소형 암이 있음. 담낭 외부로 퍼지지 않았음.
IA기: T1(a 또는 b), N0, M0: 종양이 점막 고유층(lamina propria) (T1a)또는 근육층(T1b)까지 침범함. 담낭의 외부로는 퍼지지 않았음.
IB기: T2, N0, M0: 종양이 근육 주변 섬유 조직까지 침범함. 담낭의 외부로는 퍼지지 않았음.
IIA기: T3, N0, M0: 종양이 장막층을 통과하여 퍼지거나 및/또는 직접 간 및/또는 다른 근처 구조물에 침범되었음. 림프절이나 담낭에서 멀리 떨어져 있는 조직이나 장기로 퍼지지 않았음.
IIB기: T1 - T3, N1, M0: 종양이 담낭에서의 증식된 모든 형태와 더불어, 근처 림프절까지 전이됨(N1). 담낭에서 멀리 떨어져 있는 조직이나 장기로는 전이되지 않았음.
III기: T4, 임의의 N, M0: 종양이 주요 혈관에 침범하였고, 이를 통해 간까지 침범하거나 또는 간 이외의 2곳 이상의 근처 장기에 침범하였음. 림프절에 전이되거나 전이되지 않았을 수 있음. 담낭에서 멀리 떨어져 있는 조직이나 장기에는 전이되지 않았음.
IV기: 모든 T, 모든 N, M1: 종양이 담낭에서 멀리 떨어져 있는 조직이나 장기까지 전이됨.
유방암
선암은 일반적으로 선조직(물질을 생산하며 분비하는 조직)에서 시작되는 유형의 암이다. 유방암에서, 유관 및 소엽이 선조직이므로, 이 부위에서 시작되는 암을 보통 선암이라고 한다. 유방암도 몇가지 유형이 있지만, 일부는 매우 희귀하다. 일부 경우, 하나의 유방 종양이 이러한 유형들의 조합을 가지거나 또는 침습성 암과 인 시츄 암의 혼합을 포함할 수 있다.
유관상피내암(DCIS: ductal carcinoma in situ, 또한 상피내 내관성 암종이라고도 함)은 비침습성 유방암의 가장 일반적인 유형이다.
침습성(또는 침윤성) 유관상피암(IDC)은 유방암의 가장 흔한 유형이다. 침습성(또는 침윤성) 유관상피암(IDC)은 유방의 모유 이동로(유관)에서 시작되며, 유관의 벽을 파괴하여, 유방의 지방 조직까지 침범한다. 이 지점에서, 림프계 및 혈류를 통해 체내 다른 부위로 퍼(전이)질 수도 있다. 침습성 유방암 10종 중 약 8종은 침윤성 유관상피암이다. IDC 환자에서 CD138의 발현이 확인되었다(Loussouarn et al., 2008).
트리플-네거티브 유방암은 세포에 에스트로겐 수용체와 프로게스테론 수용체가 없으며, 그 표면에 과잉의 HER2 단백질을 가지고 있지 않는, 유방암(통상 침습성 유관상피암)이다. 트리플-네거티브 유방암은 다른 대부분의 유방암 유형들에 비해 보다 신속하게 증식하여 퍼지는 경향이 있다. 종양 세포에는 특정 수용체가 결여되어 있기 때문에, HER2를 표적으로 하는 호르몬 요법 또는 약물들은 이들 암에 대해 유효하지 않다(화학요법은 필요에 따라 여전히 유용할 수 있음).
용어 "유방암"에 포함되는 일부 다른 유방암으로는 염증성 유방암, 수질 암종(medullary carcinoma), 이형성 암종(metaplastic carcinoma), 점액성 암종(mucinous carcinoma), 관 암종(tubular carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 선상낭포암(adenoid cystic carcinoma)(선낭성암종(adenocystic carcinoma)), 엽상 종양( phyllodes tumor)이 있다.
표준적인 암 치료법은 수술, 방사선 요법 또는 화학요법이다. 호르몬 치료도 때로 사용된다. 호르몬 치료는 전신 요법의 형태이다. 대부분은 신보강제 치료제로서 사용할 수도 있지만, 수술 후에 암 재발 위험성을 감소시키는데 도움이 되기 위한 보강 요법으로서 사용된다. 또한, 치료 후 재발되거나 퍼진 암을 치료하는데에도 사용된다. 에스트로겐은 에스트로겐 수용체(ER-양성 암) 및/또는 프로게스테론 수용체(PR-양성 암)를 포함하는, 유방암 3건 중 약 2건의 증식을 촉진시킨다. 이 때문에, 에스트로겐 작용을 차단하거나 또는 에스트로겐 수준을 낮추는 몇가지 방법을, ER-양성인 유방암과 PR-양성인 유방암을 치료하는데 사용하고 있다. 그러나, 호르몬 요법은 ER 또는 PR이 결여된 환자에게는 효과가 없다.
또한, 유방암은 다음과 같은 병기 분류 체계를 따른다:
0기: 비전형적인 세포는 유관 또는 소엽의 외부, 모유 생산 기관, 주변 유방조직으로 퍼지지 않았음. 상피내암종(carcinoma in situ)을 참조하여, 2가지 타입으로 분류된다: 치료 가능성 및 생존성이 매우 높은 최초기 암인 "유관상피내암종"(DCIS) 및 암은 아니지만, 유방암 발병 위험성이 높은 군으로 동정되는 지표가 확인되는 "소엽상피내암종"(LCIS).
I기: 암이 2 cm(약 1 인치) 이상의 크기가 아니며, 주변 림프절 또는 유방암 외부로 전이되지 않았음.
II기: 이 병기는 종양의 크기에 따라, 그리고 림프절로 퍼졌는지 여부에 따라 2개의 카테고리로 분류됨:
II A기의 유방암 - 종양의 크기는 2 cm 미만이며, 최대 3개의 겨드랑이 보조 림프절에 전이되었음. 또는, 종양이 2 cm 보다 큰 크기로 증식되었지만, 5 cm 이하이며, 주변 림프절로 전이되지 않았음.
II B기의 유방암 - 종양이 2 내지 5 cm 크기로 증식되었고, 최대 3개의 겨드랑이 보조 림프절에 전이되었음. 또는, 종양이 5 cm 이상이지만 주변 림프절로는 전이되지 않았음.
III기: 이 병기는 2개의 카테고리로 분류됨:
III A기의 유방암 - 종양의 크기가 2 cm 이상이, 5 cm 이하이며, 최대 9개의 겨드랑이 보조 림프절에 전이됨.
III B기의 유방암 - 암이 피부, 흉벽, 늑골, 근육 또는 흉벽내 또는 쇄골 위의 림프절 등의 유방 근처 조직으로 전이됨.
IV기: 본 병기에서는, 암이 간, 폐, 뇌, 골격계 또는 쇄골 근처 림프절 등의 다른 장기나 조직까지 전이됨.
폐암
4가지 유형의 신경내분비 폐 종양, 즉, 대세포 신경내분비폐암종(large cell neuroendocrine carcinoma), 비정형 유암종(atypical carcinoid tumor), 정형적인 유암종(typical carcinoid tumor) 및 소세포 폐암이 있다.
유암종 종양은 미만성 신경내분비계의 세포에서 시작되는 종양이다. 정형적 및 비정형 유암종 종양은 현미경 검경에서 다르게 관찰된다. 정형적인 유암종은 느리게 증식하며, 매우 드물게 폐 외부로 전이되며, 10개의 폐 유암종 중 약 9개가 정형적인 유암종이다.
치료 목적에서, 폐암은, 매우 다르게 치료되는 2가지 유형들, 즉 소세포 폐암(SCLC) 및 비-소세포 폐암(NSCLC)으로 구분된다. 암에 2가지 유형의 특징들을 모두 가지고 있는 경우에는, 혼성 소세포/대세포 암으로 칭한다.
전체 폐암의 약 10% 내지 15%는 소세포 유형이다. SCLC의 다른 이름은 귀리 세포 암종(oat cell carcinoma) 및 소세포 미분화된 암종(small cell undifferentiated carcinoma)이다.
이러한 암은 대개 가슴 중앙 근처의 기관지에서 시작된다. 암 세포는 작지만, 빠르게 분열하여 큰 종양을 형성하여, 림프절과 체내 전역의 다른 장기로 퍼진다. 수술은 매우 드물며, 드물게 이루어지며, 치료제 투여만 이루어진다. 치료제로는 광범위로 퍼진 질병을 사멸시키기 위한 약물 등의 세포독성제를 포함한다.
NSCLC에는, 3가지 유형, 즉 편평 세포 암종; 선암종; 대세포(미분화된) 암종이 있다.
소세포 폐암의 병기 분류
소세포 폐암의 병기 분류에 사용되는 체계는 AJCC(American Joint Committee on Cancer) 체계이다. 병기는 로마 숫자로 0 -IV(0 - 4)로 기재된다. 일부 병기들은 다시 A과 B로 분류된다. 대개, 숫자가 낮을 수록 암 전파 정도는 낮아진다. 숫자가 IV(4)기와 같이 높을수록, 더욱 진행된 암을 의미한다.
편평 세포 암종(두경부암)에 대해서도 I - IV기등 의 대표적인 병기 분류 체계가 개발되었다. I기 암은 작고, 국소적이며, 보통 치료가능하며, II기 및 III기의 암은 전형적으로 국소 진행된 암이거나, 및/또는 국소 림프절까지 전이되었으며, IV기는 보통 전이(신체의 원위로 전이됨)되었고 통상 수술 불가능하다.
본 발명의 내용에서, 치료는, CD138을 발현하는 세포와 관련된 장애의, 진행 예방 또는 서행, 질병 상태의 안정화, 질병의 회복, 또는 한가지 이상의 증상의 완화를 포함한다. 즉, 치료는 장애의 중증도 증가 예방 또는 서행, 또는 장애의 회복을 포함한다. MM의 경우, 일반적으로 II 또는 II기의 활성 MM인 환자들만 1차 요법(I기 환자 또는 SMM인 환자는 초기에는 3-6개월의 간격으로 관찰함)을 받는데, 본 발명에 따른 치료는, 예컨대 임의의 활성형 병기의 MM의 치료 뿐만 아니라 전통적으로 치료되는 질환 상태 이전의 질환 상태의 치료를 포함한다. 특히, 치료는 또한 어떤 질병 상태에서 그 다음 상태: MM의 경우에, 이는, 예컨대 MGUS에서 SMM으로, 또는 SMM에서 활성형의 MM I기 또는 MM의 다른 단계로의 진행의 예방을 포함한다. 외분비형 췌장암의 경우, 예컨대 I기에서 II기로의 진행, AJCC에 의해 확립된 병기들에 포함되는 카테고리에 의해 반영되는 바와 같이, 예컨대 IA -> IB와 같은, 임의의 악화가 포함된다. 그러나, 이 용어는 안정적인 질환 유지 등의 현상 유지, 및 후술되는 바와 같이, 치료받은 환자에서의 특정 반응 도출을 포함한다. 또한, 환자에서, 특히 하기: 암 세포의 수 감소 또는 암 세포의 부재; 종양 크기 감소; 연조직 및 뼈로의 암 전이 등의, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 저해(즉, 어느 수준까지의 서행 및 바람직하게는 중지); 종양 전이의 저해(즉, 어느 수준까지의 서행 및 바람직하게는 중지); 종양 증식의 어느 수준까지의 저해; 및/또는 특정 암과 관련된 한가지 이상의 증상의 어느 수준까지의 경감; 이환률 및 사망률의 감소, 및 삶의 품질 개선 - 중 한가지 이상이 관찰가능하거나/하고 측정가능한 수준으로 없어지거나 감소되었다면, 이 환자는 성공적으로 "치료된"것이다. 일반적으로, 환자의 질환 상태에 대한 특정 치료의 효능을, MM의 경우에, 환자의 혈청 및/또는 뇨내 M-단백질 수준, 및/또는 환자의 혈청 및/또는 뇨내 FLC의 수준을 측정함으로써, 모니터링할 수 있다. CD138을 발현하는 세포와 관련된 그외 장애의 경우에, 본 발명에 따른 치료의 효능을 평가하기 위해 다른 파라미터를 측정한다. CRP는 임상적인 암의 모니터링에 대한 비특이적인 염증 파라미터이다. 췌장암의 경우, 단순히 몇몇을 지칭하기 위해, 측정할 수 있는 해당 파라미터로는 CA 19-9 (탄수화물 항원 19.9, 종종 췌장암에서 증가되는 종양 마커임), 빌리루빈(bilirubin) 또는 C-반응성 단백질이 있다. 아울러, 소노그래프, CT, MRT 등의 영상화 방법도 사용된다. 두경부암의 경우, 종양 타입에 의존적인 바이오마커들이 사용되며 (예, 편평 세포 암종의 경우 SCC, 메르켈 세포의 경우 NSE, CEA); 유방암의 경우, CA 15-3Her2 발현 및 카드헤린(Cadherin) 발현이 마커로서 이용될 수 있지만, 치료는 신경 특이 에놀라제(NSE) 등의 혈청 마커로 모니터링할 수 있다.
증상을 보이는 개체에서, 질병을 진단하는데, 방광 종양 항원(BTA) 및 NMP22 검사를 방광경 검사(방광내를 보기 위한 가늘고 빛이 발사되는 관을 이용함)와 함께 실시할 수 있다. 또한, 방광경 검사와 뇨 세포검사(현미경을 이용한 뇨내 암 세포 관찰)가 여전히 진단 및 추적에 표준적인 검사로서 권고되고 있지만, 상기한 검사들도 치료 후 일부 환자 추적에 이용되고 있다. BTA 및 NMP22 검사는 흔히 방광경 검사 사이에 이용된다. 정상 수치가 나타나면 방광경 검사를 보다 적은 횟수로 수행할 수 있다. 그러나, 이러한 검사가 뇨 세포검사와 방광경 검사를 대체할 순 없다.
진행성 방광암에서는, CEA, CA 125, CA 19-9 및 TPA 등의 다른 암에 사용되는 마커들 중 일부가 증가하므로, 치료 중과 치료 후에 환자를 추적하는데 사용할 수 있다. 폐암에서는 확립된 마커가 없으며, CEA나 NSE가 증가할 수도 있다.
골수종 세포 또는 유방 암종 세포 등의 종양 세포들은 CD138을 셰딩(shedding)하는 것으로 알려져 있다. 표면 CD138의 소실(loss)은 골수종에서의 예후 불량과 상관성이 있다. 또한, 두경부암 또는 폐암 등의 다른 종양 증상들에서도 가용성 CD138가 고농도로 검출되었다(Anttonen et al. 1999). 표면의 신데칸-1의 소실은 EMT (상피 간엽 이행(epithelial mesenchymal transition)과 상관성이 있는데, 상기 프로세스는 악성 세포의 침습성 및 전이성 단계와 관련된 덜 또는 불충분하게 분화된 세포로의 변환을 지칭한다. 이는, 예컨대 전이성 유방암의 경우에 대해 보고되어 있다 (Loussouarn et al., 2008).
제제, 특히 면역접합체, 또는 본 발명에 따른 면역접합체를 포함하는 약학 조성물의 유효량은, 개체, 특히 인간 개체(환자)에서의 질환 또는 장애 "치료"에 필요한 양이다. MM 등의 암의 경우, 제제의 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 암의 크기를 축소할 수 있거나; 암 세포의 말초 장기로의 침윤을 저해(즉, 어느 수준으로의 서행, 바람직하게는 정지)할 수 있거나; 종양 전이를 저해(즉, 어느 수준으로의 서행, 바람직하게는 정지)할 수 있거나; 및/또는 암과 관련된 한가지 이상의 증상을 어느 정도로 경감시킬 수 있다. 본원의 "치료" 정의 부분을 참조하라.
예컨대 200 mg/m2의 "약동학적 등가"는, 면역접합체를 조합 투여하였을 때, 예컨대 일차적으로 CD138을 발현하는 비-표적 세포에 대한 잠재적인 부작용 등의, 실제 치료용 물질과 공동-투여하였을 때, 200 mg/m2의 용량에서 관찰되는 동일한 약동성을 발생시키는, 면역접합체의 양을 의미한다. 이러한 등가는 다른 물질에 따라 200 보다 다소 작거나 또는 200 보다 클 수 있다. 예컨대, 160 미만, 170 미만, 180 미만, 190 미만, 210 미만, 220 미만, 230 미만, 및 240 mg/m2 미만의 유효량이 포함된다. 예컨대, 당해 기술 분야의 당업자는, 코르티코스테로이드 또는 항생제와의 공동-투여시, 피부에 부작용을 발생시키는 경우에서도 면역접합체를 약간 고용량의 사용이 가능함을 예상할 것이며, 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 확인할 수 있다.
약물, 본원에서는 면역접합체(이의 기능적인 반응을 발생시키는 능력, 즉 효능)의 투여의 성공을 평가하기 위해, 투여에 대한 여러가지 "반응들"을 구분한다.
MM 및 그외 형질세포 증식성 질환의 경우, 반응들은 다음과 같이 구분한다:
용어 완전 반응(CR)은 혈청과 뇨에서의 면역고정(immunofixation) 음성과 골수내 임의의 연조직 형질세포종의 소멸 및 형질세포 <5%을 의미함;
용어 엄격한 완전 반응(sCR)은 전술한 CR + 면역조직화학 또는 면역형광에서의 골수내 클론 세포의 부재를 의미함;
용어 매우 양호한 부분 반응(VGPR)은 면역고정에서는 혈청과 뇨에서 M-성분이 검출되지만 전기영동에서는 검출되지 않거나, 또는 혈청 M-성분의 대폭 감소 + 뇨내 M-성분/24시간 <100 mg을 의미함;
용어 부분 반응(PR)은 24시간 당 혈청 M 단백질 >50% -감소 및 24h-뇨 M 단백질의 >90% 또는 <200 mg/24 h 감소를 의미하며, 만일 뇨 M 단 백질을 측정할 수 없다면, M 단백질 기준 대신 FLC 수치가 포함된 경우와 미포함 경우 간의 차이 >50% 감소 요건이 요구되며, 만일 혈청과 뇨에서 M 단백질을 측정할 수 없고 혈청내 유리형 경쇄 분석 또한 불가능하다면, M 단백질 대신, 골수 형질세포의 >50% 감소 요건이 요구되며, 상기한 기준 외에도, 베이스라인으로 존재하는 경우, 연조직 형질세포종의 크기 >50% 감소 요건도 요구된다(Durie et al., 2006).
용어 마이너 반응(MR)은 본 발명에서 재발성/불응성 골수종 환자와 관련하여, 혈청 M 단백질의 >25% - <49% 감소와 200 mg/24h을 초과하는 24h 뇨 M 단백질의 50-89% 감소를 의미하며, 상기한 범위 외에도, 베이스라인으로 존재한다면, 연조직 형질세포종의 크기 25-49% 감소도 요구되며, 용해성 골 병변의 크기 또는 수의 증가가 없어야 한다(압박 골절 발생은 반응에 고려되지 않는다).
그러나, 공식적으로 분류되지 않지만, 반응에는 혈청내 FLC 수준의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상 또는 50% 이상 감소가 포함된다. 이는 특히 M-단백질을 측정할 수 없는 경우에 유의하다.
용어 안정적인 질환(SD)는, 본 발명의 형질세포 증식성 질환 측면에서, CR, VGPR, PR 또는 진행성 질환에 대한 기준에 해당되지 않는 것을 지칭하며, 용어 진행성 질환(PD)는 아래 사항들 중 임의의 한가지 이상에서, 최소 반응으로부터 25% 증가를 의미한다:
- 혈청내 M-성분(절대 증가는 > 0.5g/100 ml이어야 함) 및/또는
- 뇨내 M-성분(절대 증가는 24시간 당 > 200 mg이어야 함) 및/또는
- 혈청과 뇨에서 M-단백질 수준을 측정할 수 없는 환자에 한함: FLC 수준 포함 및 미포함 경우 간의 차이(절대 증가는 > 100 mg/l이어야 함)
- 골수내 형질세포 비율(절대%는 >10%이어야 함)
- 새로운 골 병변 또는 연조직 형질세포종의 한정된 발생 또는 기존 골 병변이나 연조직 형질세포종 크기의 한정된 증가
- 오로지 형질세포 증식성 장애가 원인일 수 있는 고칼슐혈증 발생(혈청내 칼슘 보정치 >11.5 mg/100 ml).
용어 재발성 골수종은 한번 이상의 이전 치료 요법을 시술받았지만, 재발성/불응성 골수종의 기준에는 충족되지 않는, 개체의 활성형 MM 형태를 지칭한다.
용어 불응성 골수종은 일반적으로 형질세포의 수가 심지어 치료를 받고 있음에도 불구하고 계속 증가하며, 즉 평가시 투여받은 치료 요법에 불응성인 것으로 입증된, 질환 상태를 의미한다.
용어 재발성/불응성 골수종은 본원에서 구조 요법 중이나 또는 최근 요법 후 60일 이내에 질환의 재발을 의미한다.
용어 불응성 표현형은 모든 타입의 불응성 골수종, 즉 불응성 및 재발성/불응성 골수종을 포함한다.
용어 재발성 또는 불응성 골수종은 재발성, 불응성 및 재발성/불응성 골수종을 망라한다.
하기에서 보다 상세하게 논의되는 임상 실험에서는, 실험을 착수하기 전에는 실패했던, 개체에게 1종 이상의 면역접합체 및 프로테오좀 저해제를 처리하였다. 개체가 이전 요법에서 진행성 질환(PD)으로 진행되었다면, 질병은 치료 불응성으로 간주하였다.
용어 "으로의 진행", 예컨대 SMM 환자와 관련하여 "활성형 MM"으로의 진행은, 본 발명에서, MM 에서 진행성 질환에 대한 IMWG(국제 골수종 연구 그룹) 기준을 토대로 한 진행의 징후 및 기본적인 클론 형질세포 증식성 장애와 관련있는 다음과 같은 한가지 이상의 특징: 새로운 연조직 형질세포종 또는 골 병변의 발생, 고칼슘혈증(>11mg/100 ml), =2g/100 ml의 헤모글로빈 감소, 및 혈청 크레아티닌 수치 >2mg/100 ml. (Kyle & Rajkumar, 2009)을 의미한다.
다발성 골수종의 병인은 세포-표면 접착 분자를 통한 골수종 세포의 골수 기질 세포(BMSC) 뿐만 아니라 세포외 기질(ECM)과의 결합성과 연계된다. 이러한 결합이 촉발시켜, 즉 다발성 골수종 세포의 증식, 약물 내성 및 골수 환경으로의 MM 세포의 이동에 원인이 될 수 있다(Munshi et al. 2008). 특히, 신데칸-1(CD138)을 통해 골수종 세포가 ECM에, I형 콜라겐에 접착하게 되면, 매트릭스 메탈로프로테나제 1의 발현이 유발되며, 따라서 골 흡수와 종양 침습이 촉진된다(Hideshima et al. 2007). 다발성 골수종 세포와 골수 미세환경 간의 상호작용으로 다면 발현성의 증식성 및 항-세포자살 케스케이드의 활성화가 이루어진다.
다발성 골수종 환자와, 또한 골 통증과 관련있는 다른 질환을 앓고 있는 환자의 경우, 이러한 질환과 그외 증상들을 치료하기 위한 다수의 보조적인 치료제들이 있다. 적절한 약제로는, 비스포스포네이트(예, 파미드로네이트, 졸레드론산)가 있는데, 이것은 골 손상을 늦출 수 있다. 이러한 제제들은 골용해성 골 병변을 감소시키고 골절을 예방할 수 있는 것으로 확인되었다 (Ludwig et al., 2007). 이것은 골절과 유사한 골 합병증 위험성을 줄이고 혈중 비정상적으로 높은 칼슘 수치(고칼슘혈증)를 떨어뜨리기 위해, 대부분 정맥을 통해 제공된다. 데이타에 따르면, 비스포스포네이트는 MM과 관련된 골 통증을 완화시키는 것으로 시사되었다. 또한, 환자는 뼈가 약하거나 골절된다는 수술 받을 수 있다.
일 구현예에서, 면역접합체는 골괴사 등의 골 합병증 및/또는 골 통증을 감소, 특히 허용가능한 수준으로 감소시킨다. 허용가능한 수준으로의 감소는 특히 이러한 통증을 경감시키고 상기 골 합병증 감소가 목적인, 약제의 투여를 정지시킬 수 있는 능력을 수반한다. 파미드로네이트, 졸리드론산 및 클로드로네이트 등의 비스포스포네이트는 일반적으로 MM 환자에서의 골괴사 등의 골 합병증을 완화시켜, 상기 합병증과 관련있는 골 통증을 완화시키기 위해 투여된다. 경구용의 통상적인 비스포스포네이트로는 FOSOMAX, BONIVA, ACTONEL, DIDRONEL 및 SKELID가 있으며, 정맥내 투여용으로는 BONEFOS, AREDIA 및 ZOMETA가 있다.
본 발명에 따른 골 통증 및/또는 골 합병증 감소로, 환자에게 투여할 항-통증 약제의 양 및/또는 합병증을 방지하기 위해 투여되는 임의의 약제의 양을 줄일 수 있다. 이러한 감소는, (i) 개체가 (a) 본 발명에 따른 치료제와는 다른, 골 통증 및/또는 골 합병증을 유발하는 질환의 치료를 받은 경우 또는 (b) 치료를 받지 않은 경우, 기존 투여되는 양에 상대적이거나, 또는 (ii) 동일한 질환을 앓고 있으며 거의 동일한 질환 단계인 다른 환자에게 투여되는 양에 상대적일 수 있다. 이러한 감소는 바람직하게는 약 10%, 약 20% , 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 감소이며, 바람직하게는 약제 투여의 완전한 중지이다. 후자가 달성되면, 즉 본 발명에 따른 면역접합체를 단독으로 또는 본 발명에 따른 항암 조합의 일부로서 투여한 결과로서, 환자에게 개인적으로 골 통증 및/또는 골 합병증에 대한 어떠한 약제 투여도 필요하지 않게 된 경우, 상기한 면역접합체의 투여가 골 통증 및/또는 골 합병증을 허용가능한 수준으로 낮추었다고 한다. 그 결과, 골 통증 및/또는 골 합병증을 완화하기 위해 투여되는 약제 투여로 인한 부작용들은 감소되거나 없어져야 한다.
골수 기질 구획으로 다발성 골수종 세포가 회귀한 후, 다발성 골수종 세포와 BMSC 간의 접착은 인터루킨-6(IL-6) 및 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)과 같은 혈관신생과 종양 증식을 촉진시키는 작용을 가지고 있는, 다수의 사이토카인들을 상향 조절한다(Hideshima et al. 2007). 이들 사이토카인에 의해 시작되는 시그널링 케스케이드는 궁극적으로 기존 치료제에 내성인 MM 세포에서 이루어진다(Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006).
정상적인 인간 조혈 구획내에서, CD138 발현은 형질세포에 국한되며(Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), CD138은 말초 혈액 림프구, 단핵구, 과립구 및 적혈구 상에서는 발현되지 않는다. 특히, CD34+ 줄기 세포 및 선조 세포는 CD138을 발현하지 않으며, 항-CD138 mAb는 조혈 줄기 세포 배양시 콜로니 형성 단위의 수에 영향을 주지 않는다(Wijdenes, 1996). 비-조혈 구획에서는, CD138은 주로 폐, 간, 피부, 신장 및 장내 단순하고 층화된 상피 상에서 발현된다. 내피 세포 상에서는 약한 염색만 확인되었다(Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). CD138은 인간 림프종 세포에서 다형성 형태들에도 존재하는 것으로 보고되었다(Gattei, 1999).
단일클론 항체들인 B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, 특히 B-B4는 CD138에 특이적인 것으로 보고되었다. 이들 중에서, CD138의 무손상 분자와 코어 단백질 둘다에 의해 인지되는, B-B4, 1D4 및 MI15는, 동일하거나 또는 매우 관련성이 높은 에피토프 중 하나를 인지하는 것으로 확인되었다(Gattei, 1999). 이전의 연구들에서, B-B4는 가용성 CD138이 아닌 막 결합된 형태의 CD138만 인지하는 것으로 보고되었다(Wijdenes, 2002).
최초의 항-CD138 항체는 Diaclone SAS (Besancon, France) 사에서 표준 하이브리도마 기법을 이용하여 인간 다발성 골수종 세포주 U266을 이용한 면역화에 의해 뮤라인 모 Mab B-B4로 제작되었다(Clement,1995; Wijdenes, 1996). B-B4는 인간 신데칸-1(CD138) 상의 코어 단백질의 잔기 90-93 사이의 선형 에피토프에 결합한다(Wijdenes, 1996; Dore, 1998). B-B4는, CD138의 발현 패턴과 일치되게, 형질세포주 RPMI8226에서 강하게 반응하지만, 내피 세포와는 반응하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, CD138의 발현 패턴과 일치되게, B-B4는 상피 세포주 A431(각질세포로부터 유래) 및 HepG2(간세포 유래)와도 반응한다. 면역독소 B-B4-사포린은 또한 형질세포주 RPMI8226에 대해 강한 독성을 나타내며, 실제 유리형 사포린 보다 독성이 훨씬 더 강하다. 그러나, B-B4-사포린은 집락형성 분석법(clonogenic assay)에서 A431 세포의 생장을 저해하는 효과가 없는 것으로 나타났지만, 테스트한 2종의 상피 세포주에서, B-B4-사포린은 세포주 A431에만 독성을 나타내었다(Vooijs, 1996). 다른 연구자들도 종양에 대한 MM-관련 항원의 특이성 결여에 대해 보고하였다(Couturier, 1999).
마이탄시노이드 DM1에 공유 결합된 B-B4는 다발성 골수종 세포주 및 세포들에 대해 선택적인 세포독성과 인간 다발성 골수종 이종이식 모델로서 SCID 마우스에서 항암 활성을 나타내었다(Tassone, 2004).
본 발명에서는, 암 세포 뿐만 아니라 고형 종양의 일부를 형성하거나 형성하지 않을 수 있는 전-암성 세포를 포괄하는 것으로 용어 종양 세포를 사용한다.
본 발명에 따른 표적 물질은 표적 세포에 의해 발현되는 분자와 조합할 수 있으며, 펩타이드 및 비-펩타이드를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 표적 물질은 표적 항체 및 비-면역글로불린 단백질을 기본으로 할 수 있는 비-면역글로불린 표적 분자를 포함하며, 그 예로는, AFFILIN® 분자, ANTICALINS® 및 AFFIBODIES®가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 비-면역글로불린 표적 분자는 또한 표적 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(앱타머)와 같은 비-펩타이드성 표적 분자, 또한 생리학적 리간드, 특히 대상 항원의 리간드, 예컨대 CD138을 포함한다.
본 발명에 따른 표적 항체는 천연 항체이거나 천연 항체를 기초로 하거나, 또는 합성에 의해 또는 유전자 조작에 의해 제조되며, 대상 세포 또는 세포들(표적 세포(들)) 상에서 항원에 결합한다. 본 발명에 따른 표적 항체로는, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이 항체(예, 2 특이성 항체) 또는 항체 단편을 포함한다. 상기 표적 항체는, 예컨대 표적 세포에 대한 이의 친화성을 개선시키거나(Ross, 2003) 또는 이의 면역원성이 줄어들도록 조작할 수 있다. 표적 항체는 작동자 분자 등의 리포좀 제형에 부착될 수 있다(Carter, 2001). 항체 단편은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합부 또는 가변성 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 있으며, 또한, 2가 항체(diabody); 도메인 항체(dAb) (Ward, 1989; 미국 특허 6,005,079); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이 항체가 있다. 단쇄 가변 단편 항체(scFv)에서, 중쇄 및 경쇄(VH 및 VL)는, 예컨대 2개의 도메인이 기능성 항원 결합 포켓을 조합하는데 충분한 유연성을 지닌 서열 (글리신4세린)n의, 짧은 아미노산 링커에 의해 연결될 수 있다. 다양한 신호 서열의 부가는 표적 항체의 더욱 정확한 표적화를 가능하게 할 수 있다. 경쇄 불변 영역(CL)의 부가는 이황화 결합을 통한 이량화를 가능하게 하여, 안정성 및 항원항체 결합력(avidity)을 증가시킬 수 있다. scFv를 구축함에 있어서의 가변 영역은, 표적 대상에 대한 mAb를 이용가능하다면, 모 하이브리도마로부터 추출한 mRNA로부터 가변 영역을 클로닝하는 RT-PCR에 의해 수득할 수 있다. 또는, scFv는 파지 디스플레이 기법에 의해 새롭게 제조할 수 있다(Smith, 2001). 본원에서, 용어 "기능적 단편"은 표적 항체에 대해 사용되는 경우, 언급한 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 표적 항체의 일부분을 의미한다. 본 발명에 따른 2중 특이 항체는, 예컨대 표적 조직에 대해 반응성인 하나 이상의 팔(arm)과 링커 모이어티에 반응하는 팔을 가질 수 있다(미국 특허 공개번호 20020006379). 또한, 본 발명에 따른 2중 특이 항체는 표적 세포 상에서 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다(Carter, 2001). 본 발명에 따른 항체는, 예컨대 티올 기를 도입하기 위해 시스테인 잔기를 도입함으로써 변형시킬 수 있다(Olafsen, 2004).
본 발명에서, 표적 항체는 임의의 소스로부터 유래될 수 있으며, 낙타 항체, 뮤라인 항체, 인간/마우스 키메라 항체 또는 인간/원숭이 키메라 항체, 특히 nBT062와 같은 인간/마우스 키메라 항체일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
인간화 항체는 인간-항체와 비-인간 항체로부터 유래된 서열을 포함하는 항체이며, 또한 이는 본 발명의 범위에 포함된다. 항체를 인간화하는 적합한 방법으로는 CDR-그래프팅(상보성 결정 영역 그래프팅)(EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특허 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565,332) 및 DeImmunosationTM(Biovation, LTD)이 있다. CDR-그래프팅에서, 예컨대 mAb B-B4로부터 마우스 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 가변 프래임워크에 그래프팅한 다음, 인간 불변 영역과 연결하여, 인간 B-B4 항체(hB-B4)를 제조한다. CDR-그래프팅에 의해 인간화된 몇가지 항체들이 현재 임상적으로 사용되고 있으며, 그 예로는 MYLOTARG (Sievers et al., 2001) 및 HECEPTIN (Pegram et al, 1998)이 있다.
재표면화 기법은 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이 유발을 조합 사용하여, 표적 숙주의 공지 항체들의 표면과 비슷하도록 항체 가변 영역의 비-CDR 표면을 변형시킨다. 항체 재표면화 전략 및 방법들과, 그외 여러가지 숙주내에서의 항체 면역원성을 낮추기 위한 방법들이, 예컨대 미국 특허 5,639,641에 기술되어 있다. 인간 항체는, 파지 디스플레이 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법들로 제조할 수 있다. 또한, 미국 특허 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 국제 특허 출원 공개번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.
인간/마우스 키메라 항체 또는 인간/원숭이 키메라 항체, 인간화 항체 또는 예컨대 표적 세포에 대한 친화성을 개선시키거나 또는 면역원성을 낮추도록 조작된 항체, 또한 항체 단편, 특히, 임의의 비-자연적 변형을 겪은 표적 항체의 기능적 단편, 2가 항체; 도메인 항체; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 다중 특이 항체와 같이 임의의 비-자연적인 변형을 거친 표적 항체는, 본원에서 조작된 표적 항체로 언급된다.
키메라 항체는 기본이 되는 비-인간 항체, 예컨대 뮤라인 항체의 항체 결합 영역(ABR 또는 Fab 영역)을 유지하지만, 임의의 불변 영역은 예컨대 인간 항체에 의해 제공될 수 있다. 통상적으로, 항체의 키메라화 및/또는 불변 영역의 교체는, 항원 결합에 기여하는 항체의 영역이 이러한 교체에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 항체의 친화성에 영향이 없을 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조작된, 특히 키메라화된 항체는 기본이 되는 해당 비-인간 항체 보다 결합 친화성(KD 값으로 표시됨)이 더 높을 것이다. 특히, nBT062 항체 및 이를 기반으로 한 항체들은 뮤라인 B-B4 보다 항체 친화성이 더 높을 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 이러한 조작된/키메라 항체를 포함하는 면역접합체는 또한 항체 결합성이 더 높다. 또한, 이들 면역접합체는 임의의 구현예에서, B-B4를 함유하는 대응체 보다 더 높은 종양 크기 감소율 등의 다른 유리한 특징들을 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조작된, 특히 키메라 표적 항체는 해리 상수 KD (nM)가 1.6 미만, 1.5 미만, 또는 1.4 이하인 결합 친화성을 나타내지만, 이의 뮤라인 대응체의 해리 상수 KD (nM)는 약 1.6 이상이다. 표적 항체와 같은 표적 물질을 포함하는 면역접합체는 해리 상수 KD (nM)가 2.6 미만, 2.5 미만, 2.4 미만, 2.3 미만, 2.2 미만, 2.1 미만, 2.0 미만일 수 있으며, 약 1.9 이하가 바람직하지만, 뮤라인 대응체 항체를 포함하는 면역접합체의 해리 상수 KD (nM)는 약 2.6이상 (표 9, 재료 및 방법)일 수 있다.
기본 항체 분자는, 가변 영역이 항원에 결합하고, 나머지 불변 영역이 항원 독립적인 반응을 도출할 수 있는, 2중 기능성의 구조체이다. 항체의 주 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM은 불변 영역에 의해 결정된다. 이러한 클래스는 서브클래스(이소타입)로 추가로 분류될 수 있다. 예컨대, IgG 클래스에는 불변 영역에 의해 결정되는 4가지 이소타입, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있다. 다양한 인간 항체 클래스들 중에서, 오직 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM만 보체 시스템을 효율적으로 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 불변 영역은 항원 결합 부위를 형성하진 않지만, 불변 영역과 힌지 영역의 배열이 항원과의 결합을 가능하게 하는 분절 유연성을 분자에게 부여할 수 있다.
여러가지 IgG 이소타입들이 단핵구, B 세포 및 NK 세포와 같은 세포 상에서 Fc 수용체에 결합하며, 그로 인해 세포가 사이토카인을 분비하도록 활성화시킬 수 있다. 또한, 여러가지 이소타입들은 보체를 활성화하여, 국소 또는 전신 염증 반응을 유도할 수 있다. 특히, 여러가지 IgG 이소타입들이 다양한 수준으로 FcγR에 결합할 수 있다. FcγR은 Ig 슈퍼패밀리에 속하는 표면 당단백질의 일종으로, 주로 백혈구에서 발현된다. FcγR 당단백질은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 지칭되는 3가지 클래스로 분류된다. IgG1, IgG2 및 IgG3는 다양한 이들 FcγR 당단백질 클래스에 강하게 결합하고, IgG4는 훨씬 약하게 결합한다. 특히, IgG4는 FcγRI의 중간 결합자로서, 상대적으로 낮거나 또는 심지어 없는 ADCC(항체 의존적인 세포성 세포독성)를 유발하며, FcγRIIIA 또는 FcγRIIA에 결합하지 않는다. 또한, IgG4는 저해 수용체인 FcγRIIB의 약한 결합자이다. 또한, IgG4는 오직 약한 보체 고정(complement fixation)을 매개하거나 매개하지 않으며, 약한 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 매개하거나 매개하지 않는다. 본 발명에서, IgG4는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cell) 상에서 FcRγII와의 상호작용을 나타내지 않고, Kupffer 세포(대식 세포) 상에서 FcRγI-III와 상호작용하지 않거나 약하며, 간의 NK 세포 상에서 FcRγIII와 상호작용하지 않기 때문에, IgG4를 간 FcR의 Fc-매개 표적화를 방지하기 위해 특히 사용할 수 있다. 임의의 CDC를 더욱 감소시키는 특정 돌연변이도 본 발명의 일부분이다. 예컨대, IgG4의 327, 330 및 331 위치의 잔기들은 ADCC(항체 의존적인 세포성 세포독성) 및 CDC(Amour, 1999; Shields, 2001)를 감소시키는 것으로 확인되었다. 항체를 안정화하는 많은 돌연변이들도 본 발명의 일부분이다(또한, 본원에서는 "안정화 돌연변이"라 함). 이러한 돌연변이로는, 특히, IgG4의 CH2 영역내 루신에서 글루탐산으로의 돌연변이와 IgG4 힌지 코어내에서의 세린에서 프롤린으로의 치환 돌연변이가 있다. 이러한 돌연변이는, 본 발명의 특정 구현예에서, 반-분자(half-molecule)의 양을 10% 미만, 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만 또는 1% 미만으로 낮춘다. 또한, 이렇게 안정화된 항체의 생체내 반감기는 1, 2, 3, 4 또는 5일 이상 등의 수일 길어질 것이다(Schuurman, 1999).
본 발명에서 IgG4 이소형 특징들을 부여하는 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체를 언급하는 경우, 상기 조작된 표적 항체는 IgG1 이소형의 항체들의 친화성에 비해 Fc 수용체 발현 세포에 대해 상당히 감소된 친화성을 나타냄을 의미한다. 이러한 특징들은 바람직하게는 ABR과는 구분되는, 추가적인 항체 영역에 의해 부여되며, 상기 추가적인 항체 영역은 인간 항체의 전부 또는 일부분이다. 그 결과로 IgG1 이소타입 항체를 이용한 경우에 통상적으로 관찰되는 CDC 또는 ADCC를 유도하는 잠재력과 비교하여, CDC 또는 ADCC를 유도하는 잠재력이, 상당히 감소(IgG1 이소타입 카운터파트에 비해 90% 이상)되거나 또는 완전히 결여된다. 이러한 특성은 조작된 표적 항체를 이의 비접합된 형태로 이용함으로써 세포 기반의 분석에서 측정할 수 있다. CDC 및 ADCC는 Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)에 기술된 방법 또는 구아바 세포 독성 분석 등의 여러가지 방법들을 통해 측정할 수 있다. IgG4 이소형 특성을 부여하는 조작된 표적 항체의 적어도 일부를 포함하는 면역접합체의 전체적인 이점은, 결합 특이성 개선과 독성 감소이다. 또한, Fc 수용체에 대한 친화성 감소로 인해, 종양 세포의 항원-특이적인 표적화가 개선되고 그에 따라 CD138 음성 세포에 대한 독성 감소가 이루어진다.
본원에 기술된 표적 항체 등의 표적 물질은 또한, 항원, 특히 CD138에 대한 이의 결합 친화성 측면에서 기술되거나 명시될 수 있다. 표적 항체와 같은 표적 물질의 바람직한 결합 친화성은, 해리 상수 KD (nM) 1.6 미만, 1.5 미만 또는 1.4 이하로 특정화된다. 표적 항체 등의 표적 물질을 포함하는 면역접합체의 경우, 해리 상수 KD (nM)는 1.6 미만, 1.5 미만 또는 2.5 미만, 2.4 미만, 2.3 미만, 2.2 미만, 2.1 미만, 2.0 미만, 또는 약 1.9 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항원 결합 영역(ABR)은 사용되는 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 타입에 따라 바뀔 것이다. 천연 항체 및 대부분의 키메라 항체와 인간화 항체의 경우, 항원 결합 영역은 경쇄와, 중쇄의 첫번째 2개의 도메인으로 구성된다. 그러나, 경쇄가 없는 중쇄 항체의 경우, 항원 결합 영역은, 예컨대 중쇄의 첫번째 2개의 도메인으로만 이루어질 수 것이며, 단일 폴리펩타이드 체인에서 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 조합된, 단쇄 항체(ScFv)의 경우에는, ABR은 단지 하나의 폴리펩타이드 분자에 의해 제공된다. FAB 단편은 일반적으로 파파인 절단에 의해 수득되며, 하나의 경쇄와 중쇄의 일부를 가지고 있으므로, 하나의 항원 조합부만 있는 ABR을 포함한다. 한편, 2가 항체는 2개의 항원-결합 영역이 있는 소형 항체 단편이다. 그러나, 본 발명에서, 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 항원 결합 영역은 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 결합 특이성을 주로 결정하는 임의 영역이다.
ABR 또는 다른 표적 항체 영역이, "임의 항체의" 예컨대 인간 또는 비-인간 항체의 것으로 칭해지는 경우, 이는 본원에서, ABR이 대응되는 천연 ABR과 동일하거나 또는 그것을 기초로 함을 의미한다. 천연 ARB의 결합 특이성을 가지고 있다면, ABR은 천연 ABR을 기초로 하는 것이다. 그러나, 이러한 ARB는, 예컨대 점 돌연변이, 부가, 결손 또는 번역 후 수정, 예컨대 당화를 포함할 수도 있다. 이러한 ABR은 특히 천연 ABR의 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
nBT062 (도 1 참조)는 마우스 인간 키메라 IgG4 mAb, 즉 B-B4의 키메라 버전이다. 이 B-B4의 키메라 버전은 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키고, CD138에 대한 B-B4의 항체 결합 영역의 기능성을 유지하도록 제조되었다. 놀랍게도, 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체를 이용하여 수득한 결과들은 훨씬 더 균일하였다(결과의 편차가 줄어듬). nBT062의 제조 프로토콜은 하기에 명시되어 있다. nBT062를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포는 2007년 12월 11일에 D-38124 브라운슈바이크 마셰로데르 베그에 소재한 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁하였다. 이의 식별 번호는 DSM ACC2875이다. B-B4를 기반으로 한 CD138 특이적인 키메라 항체는 본원에서 통상 c-B-B4로 칭한다.
중쇄 및 경쇄 둘다의 아미노산 서열은 nBT062에 대한 뉴클레오티드 서열의 번역으로부터 예측하였다. 중쇄 및 경쇄로 예측되는 아미노산 서열은 표 3에 나타낸다. 예상 가변 영역은 굵은 체로 나타내고, CDR 예상 부분은 밑줄을 그었다.
nBT062의 예상되는 아미노산 서열
- nBT062 중쇄 예상 서열 (서열번호1):
1 QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS NYWIE WVKQR PGHGLEWIGE
51 ILPGTGRTIY NEKFKGKA TF TADISSNTVQ MQLSSLTSED SAVYYCAR RD
101 YYGNFYYAMD Y WGQGTSVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)

C-말단의 라이신은 클립핑(clipping)되는 경향이 있으며, 다소 불완전한 클립핑으로 인해 어느 정도는 존재할 수 있다. 괄호내 (K)는 서열번호 1의 일부분이 아니다.
- nBT062 경쇄 예상 서열(서열번호 2):
1 DIQMTQSTSS LSASLGDRVT ISC SASQGIN NYLN WYQQKP DGTVELLIY Y
51 TSTLQS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIGTYYC QQ YSKLPRT FGG
101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC
카벳 및 코티아의 일반적인 CDR 정의와 BT062의 예상되는 CDR의 비교
카벳 CDR 정의 nBT062
경쇄 CDR1: 잔기 24-34 CDR1: 잔기 24-34
CDR2: 잔기 50-56 CDR2: 잔기 50-56
CDR3: 잔기 89-97 CDR3: 잔기 89-97

중쇄 CDR1: 잔기 31-35 CDR1: 잔기 31-35
CDR2: 잔기 50-56 CDR2: 잔기 51-68
CDR3: 잔기 95-102 CDR3: 잔기 99-111

코티아 CDR 정의 nBT062
경쇄 CDR1: 잔기 26-32 CDR1: 잔기 24-34
CDR2: 잔기 50-52 CDR2: 잔기 50-56
CDR3: 잔기 91-96 CDR3: 잔기 89-97

중쇄 CDR1: 잔기 26-32 CDR1: 잔기 31-35
CDR2: 잔기 52-56 CDR2: 잔기 51-68
CDR3: 잔기 96-101 CDR3: 잔기 99-111
완전한 인간 항체(fully human antibody)도 사용할 수 있다. 이러한 항체는 파지 디스플레이 방법에 의해 선별할 수 있는데, 이때 CD138 또는 이의 항원 결정기는 예컨대 B-B4 가변 영역을 발현하는 파지에 선택적으로 결합시키기 위해 이용된다(Krebs, 2001). 이러한 방법은 유익하게는 친화성 성숙 기법과 함께 사용하여, 항체의 친화성을 향상시킨다. 본원에 언급된 모든 항체는 분리된 항체이다 (미국 특허 공개번호 20090175863 참조).
일 구현예에서, 표적 항체는 비-접합된 형태일 경우, 중도 또는 불량 수준으로 내재화된다. 중도의 내재화는 37℃에서 3시간 인큐베이션한 후, 항체 약 30% 내지 약 75%가 내재화된 것이고, 불량한 내재화는 항체의 약 0.01% 내지 최대 약 30%가 내재화된 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 표적 항체, 예컨대 항체들 B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, 특히 B-B4는 CD138에 결합한다. SP02/0 골수종 세포를 Balb/c 마우스 비장 세포와 교잡하여 제조한, 하이브리도마 세포를 2007년 12월 11일에 D-38124 브라운슈바이크 마셰로데르 베그에 소재한 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁하였다. 이러한 B-B4 발현 하이브리도마 세포의 식별 번호는 DSM ACC2874이다. 다른 구현예에서, 표적 항체는 실질적으로 비-세포-표면 발현성 CD138에는 결합하지 않는다. 본 발명에서, 특정 항체의 명칭이 "nBT062 표적 항체"와 같이 용어 "표적 항체"와 조합되어 있으면, 이 표적 항체가 항체 nBT062의 결합 특이성을 가지고 있음을 의미한다. 만일 표적 항체가 명기한 항체에 "기본이 되는" 것으로 지칭되어 있다면, 이 표적 항체는 상기 항체의 결합 특이성을 가지며, 표적 항체에 대한 전술한 내용에 부합되는 어떠한 형태도 취할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 특정 항원의 명칭이 "CD138 표적 항체"와 같이 용어 "표적 항체"와 조합되어 있다면, 이 표적 항체가 CD138에 대한 결합 특이성이 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 예컨대 표적 항체를 "세포-표면에 발현된 CD138을 선택적으로 표적화하는"과 같이 무언가를 "선택적으로" 하거나, 또는 무언가에 대해 "선택적인" 것으로 언급되어 있다면, 이는, 제시된 예의 경우에서, 세포-표면에 발현된 CD138에 대해 임의의 다른 세포-표면에 발현된 항원에 비해 유의한 선택성(즉 CD138-음성 세포에 비해 CD138-양성 세포에 대해 더 강한 친화성)이 있음을 의미한다. 해당 조건에서의 부작용은 이의 선택성으로 인해 실질적으로 줄어들거나 방지될 수 있다.
"비-면역글로불린 표적 물질"은 본 발명에서 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 표적 분자 뿐만 아니라 비-펩타이드성 표적 분자를 포함한다. 이러한 정의에 포함되는 소형 비-면역글로불린 단백질은, 특히 표면에서 발현되는 CD138에 대해 특이적인 친화성을 가지도록 제작된다. 이러한 소형 비-면역글로불린 단백질은 10 kDa - 20 kDa과 같이 비교적 저분자량인, Affilin® 분자 등의 스캐폴드 기반의 조작된 분자를 포함한다. 적합한 스캐폴드로는, 예컨대 감마 결정을 포함한다. 이들 분자는, 천연 상태에서는, 표적 분자에 대한 특이적인 결합 활성이 없다. 용매 노출된 아미노산의 국소적으로 국한된 랜덤화를 통한 단백질 표면의 조작에 의해, 완전히 새로운 결합 부위가 만들어진다. 전자의 비-결합성 단백질은 이로써 특이적인 결합 단백질로 변형된다. 이러한 분자는 CD138과 같은 표적에 결합하도록 특이적으로 제작할 수 있으며, 하나 이상의 작동자 분자의 특이적인 전달을 가능하게 할 수 있다(scil Proteins GmbH at www.scilproteins.com, 2004). 비-면역글로불린 표적 분자의 다른 종류는 리포칼린으로부터 유래되며, 그 예로, 구조적으로 면역글로불린과 다소 비슷한 ANTICALINS®가 있다. 그러나, 리포칼린은 160 - 180개의 아미노산 잔기를 가진 폴리펩타이드 단쇄로 구성된다. 리포칼린의 결합 포켓은 대상 분자를 고친화적이고 고특이적으로 인지하도록, 형태가 바뀔 수 있다(예, Beste et al., 1999). 상표 Affibody®(Affibody AB)로 시판되는 것과 같은 인공 박테리아 수용체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 인공 박테리아 수용체 분자는 작고 단순한 단백질이며, 단백질 A(스타필로코커스 아우레우스)의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 한 3중-나선 번들로 구성될 수 있다. 이들 분자들은 다수의 면역글로불린과 비슷한 결합 특성을 가지고 있지만, 실질적으로 더 작고, 분자량은 대게 10 kDa을 넘지 않으며, 또한, 비교적 안정적이다. 적합한 인공 박테리아 수용체 분자는, 예컨대 미국 특허 5,831,012; 6,534,628 및 6,740,734에 기술되어 있다.
다른 "비-면역글로불린 표적 분자"는 대상 항원의 생리학적 리간드이다. CD138의 생리학적 리간드로는, 예컨대 ADAMTS4(어그레카나제-1), 항트롬빈-3, bFGF, 카텝신 G, CCL5 (RANTES), CCL7, CCL11, CCL17, CD44, 콜라겐(1형 콜라겐, 2형 콜라겐, 3형 콜라겐, 4형 콜라겐, 5형 콜라겐, 6형 콜라겐), CXCL1, 엘라스타제, gp120 , HGF [간세포 성장 인자], 라미닌-1, 라미닌-2, 라미닌-5, 미드카인(midkine), MMP-7, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase) 및 플레이오트로핀(pleiotrophin)(HBNF, HBGF-8)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 비-펩타이드성 표적 분자로는, CD-138에 결합하는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(앱타머)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"작동자 분자"는 본 발명에서 표적 물질, 특히 표적 항체 및/또는 조작된 표적 항체에 부착되며, 바람직한 효과, 예컨대 세포자살 또는 다른 타입의 세포 사멸 또는 표적 세포나 세포들의 연속적인 세포 주기 정지를 나타내는, 분자 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 본 발명에 따른 작동자 분자는 표적 세포에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 분자를 포함하며, 저분자량의 세포독성 약물(1500 Da 미만의 분자량, 바람직하게는 1400 미만, 1200 미만, 1000 미만, 800 미만, 700 미만, 600 미만, 500 미만, 300 미만이나, 일반적으로 120 Da 이상인 분자량) 등의 세포독성 약물을 비제한적인 예로서 포함한다. 이들 세포독성 약물은, 본원에서, 통상적으로 비-단백질성 생물학적 세포독성 약물이며, 투여시, 적어도 5 C 원자, 10 C 원자, 바람직하게는 12 C 원자 이상, 대게 20 C 원자 이상, 때로는 30, 40 또는 50 C 원자 이상, 통상적으로 벤젠고리와 같이, 대게 치환된, 1환 이상의 고리 구조인, 다른 세포독성 약물을 포함하거나 생산을 유도한다. 그러나, 대게 서로 연결된 고리 구조들도 이들 분자의 일부이다. 이들 비-단백질성 생물학적 세포독성 약물은 DNA(DNA 인터칼레이터)에 인터칼레이션하거나, DNA를 알킬화하거나, 마이크로튜불 형성을 저해하거나, 세포 분열 저해제이거나, 히스톤 데아세틸레이트와 같이 DNA 구조 보전성에 관여하는 효소의 저해제이거나, 또는 세포에 치명적이며 세포 대사를 교란시킬 수 있는 효소의 저해제일 수 있다. 또한, 작동자는 방사핵종, 생물 반응 변형제, 구멍-형성제, 리보뉴클레아제, 세포자살-유발 활성의 세포자살 시그널링 케스케이드의 단백질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-전이제, 항산화 물질, 항체 또는 사이토카인 뿐만 아니라 그것의 기능적 유도체 또는 유사체/단편으로 분류할 수 있다.
독소는 비제한적인 예로서 디프테리아 독소 또는 외독소 A와 같은 박테리아 독소, 비제한적인 예로서 리신과 같은 식물 독소, 그외 알칼로이드 및 폴리페놀, 미코톡신, 예컨대 알파 아마니틴 또는 보다 구체적으로 아마톡신 및 팔로톡신을 포함할 수 있다. 독소는 박테리아 기원의 독소 뿐만 아니라, 진균, 식물, 척추동물 및 무척추동물 기원의 것이며, 이들 모두 유전적으로 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 아울러, 독소는 또한, 비제한적인 예로서 메틸머큐리 등의 환경 독소일 수도 있다. 작동자 분자는 세포자살-유발 활성을 가진 세포자살 시그널링 케스케이드의 단백질, 비제한적인 예로서, 그란자임(Granzyme) B, 그란자임 A, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 절단형(truncated) Bid (tBid), Bax 및 Bak와 같은, 단백질일 수 있다. 또한, 독소는, 튜불린과의 상호작용이 입증된, 해양 군소 돌라벨라 아우리쿨라리아(Dolabella auricularia)로부터 분리된 작은 펩타이드인 돌라스타틴 10 및 12일 수 있다.
작동자 분자로서 제공될 수 있는 저분자량의 세포독성 약물의 예
작동자 분자량 (g/mol [Da]
독소루비신 564
다누루비신 528
빈블라스틴 811
독세탁셀 808
파클리탁셀 854
에포틸론 B 508
보리노스타트 264
네오카르지노스타틴 660
칼리케아미신 γ1 1368
에스페라미신 1342
메토트렉세이트 454
실리마린 성분들 482
마소프로콜 302
아미노레불린산 132
밀테포신 407
에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG) 459
프소랄렌 186
멜팔란 304
바람직한 구현예에서, 작동자 분자는, 특히 면역접합체의 표적 항체의 기본이 되는 항체의 천연 형태가 내재화가 불량할 경우에, 면역접합체의 내부 작동자 전달성을 높인다. 다른 바람직한 구현예에서, 작동자는 천연 형태(native form)에서는 비-선택적이다. 특정 구현예에서, 작동자는 천연 형태로 있을 때 전신 독성 등의 높은 비-선택적인 독성을 가진다. 본 발명의 작동자 분자의 "천연 형태"는 표적 물질에 부착되어 면역접합체를 형성하기 이전의 작동자 분자이다. 다른 바람직한 구현예에서, 작동자 분자의 비-선택적인 독성은 표적 물질에 접합시 실질적으로 없어진다. 다른 바람직한 구현예에서, 작동자 분자는 표적 세포에 도달하였을 때 표적 세포에 사멸 또는 계속적인 세포 주기 정지 등의 세포 주기 정지를 야기한다.
본 발명에 따른 작동자 분자는, 아래에서 기술된 항신생물제, 특히 세포내 화학요법제를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
저분자량의 세포독성 약물(상기 분자량 참조)은 바람직하게는 세포분열 저해제, 보다 구체적으로는, 마이탄시노이드, 돌라스타틴(및 아우리스타틴과 같은 유도체) 및 크리토피신과 같이 튜불린 중합 저해제 등의 튜불린 작용제 및 강력한 탁소이드(탁산) 약물일 수 있다(Payne, 2003). 작고 우수한 세포독성 약물에 대한 정의에는, 에포틸론(예, 이사베필론) 및 콜치신 유도체(튜불린 간섭제는 아래에서 추가로 논의됨)와 같이 기타 튜불린 간섭제도 포함된다.
마이탄시노이드인 작동자 분자는, 임의 기원의 마이탄시노이드를 포함하며, 비제한적인 예로서 합성 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체 및 유도체를 포함한다.
마이탄신은 에티오피아의 관목 마이테누스 세라타로부터 최초로 유래된 천연 산물이다(Remillard, 1975; 미국 특허 3,896,111). 이 약물은 튜불린 중합을 저해하여, 세포 유사 분열 차단 및 세포 사멸을 발생시킨다(Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). 마이탄신의 세포독성은 빈카 알카로이드 또는 탁솔과 같이 튜불린 중합에 작용하는 임상 사용중인 항암제 보다 200-1000배 높다. 그러나, 마이탄신에 대한 임상 연구에서, 이의 높은 전신 독성으로 인해 적정 약물 농도(therapeutic window)가 없는 것으로 나타났다. 마이탄신 및 마이탄시노이드는 세포독성이 높지만, 이의 암 요법에서의 임상적인 사용은 대게 종양에 대한 불량한 선택성으로 인한 심각한 전신 부작용으로 매우 제한되고 있다. 마이탄신을 이용한 임상 연구에서, 중추 신경계와 위장계에 심각한 부작용이 있는 것으로 나타났다.
또한, 마이탄시노이드는 트레비아 누디플로라(Trewia nudiflora)의 종자 조직 등의 다른 식물들에서도 분리되었다(미국 특허 4,418,064).
또한, 특정 미생물은 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르 등의 마이탄시노이드를 생산한다(미국 특허 4,151,042).
본 발명은 예컨대 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,371,533; 4,424,219 및 4,151,042에 개시된, 합성 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체 등의, 임의 기원의 마이탄시노이드와 관련있다.
바람직한 구현예에서, 마이탄시노이드는 티올-함유성 마이탄시노이드이고, 더 바람직하게는 Chari 등 또는 Chari 등(Chari, 1992)의 미국 특허 6,333,410에 기술된 방법에 따라 제조된다.
DM-1(N2-데아세틸-N2-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신)은 본 발명에서 바람직한 작동자 분자이다. DM1은 마이탄신 보다 세포 독성이 3 내지 10배 높으며, 이황화 결합(들)을 통해 종양-관련 항원에 대한 단일클론 항체에 연결시켜 프로드럭으로 변환된 것이다. 이러한 접합체들(때로는 "종양 활성화된 프로드럭"(TAP)) 중 일부는 표적 세포와 조합되어 내재화되면 활성화되어 약물로부터 분리되기 때문에, 혈액 성분에 세포 독성을 나타내지 않는다(Blattler, 2001). 수종의 항체-DM1 접합체들이 개발되었으며(Payne, 2003), 임상 실험을 거쳤다. 예컨대, 결장직장암 환자에서는 huC242-DM1 치료가 잘 받아들였지만, 어떠한 검출가능한 면역 반응을 유도하지 못하였으며, 순환 기간이 길었다(Tolcher, 2003).
그외 특히 바람직한 마이탄시노이드는 입체 방해하는 티올 결합을 함유하는 측쇄를 포함하며, 그 예로는 "DM3"으로도 불리우는 마이탄시노이드 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소페닐)마이탄신, 및 "DM4"으로 불리우는 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)마이탄신이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. DM4의 합성은 도 3과 4에 나타나 있으며, 명세서 도처에 기술되어 있다. DM4는 이의 αC에 메틸기를 가지고 있다는 점에서 DM1 및 DM3와 상이하다. 그 결과, DM4가 링커, 특히 비제한적인 예로서 이황화 결합을 포함하는 링커를 통해 nBT062와 같은 표적 물질에 부착되었을 때, 입체 방해를 형성한다. 입체적으로 방해가 되는 티올기를 가지고 있는 매우 다양한 마이탄시노이드들(1 또는 2개의 치환기, 특히 알킬 치환기, 예컨대 DM4의 메틸 치환기를 소유)이 2004년 11월 25일자로 공개된 미국 특허 공개번호 2004/0235840에 개시되었으며, 이 특허는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. DM3 및 DM4의 황 원자에 인접한 탄소 상의 메틸기와 같이 알킬기에 의해 생기는 입체 방해는 면역접합체의 세포내 절단율에 영향을 미칠 수 있다. 가변성 알킬 유닛은 따라서 시험관내 및 생체내에서 유효성, 효능 및 안전성/독성에 영향을 미칠 수 있다.
Goldmahker 등의 미국 특허 공개번호 2006/0233814에 보고된 바에 따르면, 약물이 그것의 표적으로부터 분리되면, 그러한 입체 방해는 유리형 약물의 알킬화(예, 메틸화)를 유도한다. 알킬화는 약물의 안정성을 증가시켜, 이른바 방관자 효과(bystander effect)를 허용할 수 있다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자에게 명확한 바와 같이, 링커를 통해 표적 물질에 작동자가 부착되었을 때 입체 방해를 형성하는 위치에, 알킬기와 같은 치환이 있는 포함된 다른 작동자 분자들도 본 발명의 일부이다(미국 특허 공개 2004/0235840). 바람직하게는, 이러한 방해는 유리형 약물의 알킬화와 같은 화학적 변형을 유도하여 전체 안전성을 증가시킴으로써, 약물이 CD138 발현 종양 세포에 대해 세포 사멸 또는 계속적인 세포 주기 정지를 유도할 수 있게 할 뿐만 아니라, 선택적으로 예컨대 종양을 지탱 또는 보호하는 부속 세포, 특히 종양 기질의 세포 및 통상적으로 CD138을 발현하지 않는 종양 혈관계의 세포가 약물로부터 영향을 받아 이의 지지 기능 또는 보호 기능을 감소 또는 없앨 수 있게 한다.
마이탄신은 국립 암 학회(NCI) IND #11,857 (submitted to FDA on September 19, 1975)로부터 지원을 받아 I기 및 II기 임상 실험을 통해 평가되었다. 완전 반응과 부분 반응 둘다가 조혈 악성 종양 환자에서 나타났으며, 넓은 범위의 고형 종양 환자들에서는 부분 반응이 나타났다(Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978, Eagan et al., 1978, Cabanillas et al., 1978). 그러나, 구역질, 구토, 설사, 간 기능검사 결과 상승, 권태감 및 말초 신경병증 등의 유의한 독성들이 기록되었다(Maytansine IND #11,857, Annual Report, February, 1984; Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978). 독성 효과로 인해 추가적인 개발은 이루어지지 못하였다.
튜불린 간섭제의 일종으로, 특히 매우 강력하며, 티올 또는 다이설파이드기를 함유하는, 탁산이 있다(Payne 2003). 탁산은 튜불린의 탈중합을 저해하여 마이크로튜불의 조합 및 세포 사멸 속도를 높이는, 유사 분열 방추체 독소이다. 본 발명의 범위에 포함되는 탁산은, 예컨대 미국 특허 6,436,931; 6,340,701; 6,706,708 및 미국 특허 공개번호 20040087649; 20040024049 및 20030004210에 기술되어 있다. 다른 탁산류들도, 예컨대 미국 특허 6,002,023, 미국 특허 5,998,656, 미국 특허 5,892,063, 미국 특허 5,763,477, 미국 특허 5,705,508, 미국 특허 5,703,247 및 미국 특허 5,367,086에 기술되어 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 미국 특허 6,596,757에 기술된 바와 같인 페길화된(PEGylated) 탁산도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명은, 추가로, DNA에 작용하는 작동자 분자, 보다 구체적으로는, 안트라사이클린 및 유도체(다우노루비신, 발루비신, 독소루비신, 아클라루비신, 에피루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 조루비신) 및 안트라세네디온, 예컨대 스트렙토마이세스 유래 물질(액티노마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 액티노마이신) 또는 암사크린 등의, 인터칼레이팅 물질을 포함한다.
작동자 분자는 보다 구체적으로 DNA 알킬화제일 수도 있고, 보다 구체적으로 나이트로겐 머스타드 및 유사체(예, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 데스트라무스틴), 알킬설포네이트, 니트로소유레아, 아지리딘, 하이드라진, 에틸렌 이민 및 그외 트레니몬 및 미토브로니톨(만니톨 유사체)와 같은 다른 물질일 수도 있다. 특히, 바람직한 DNA 알킬화제는 CC-1065 유사체 또는 유도체(미국 특허 5,475,092; 5,585,499; 6,716,821) 및 두오카르마이신이다.
CC-1065는 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양물로부터 분리된 강력한 항종양-항생제로서, 시험관내에서 예외적으로 세포독성인 것으로 확인되었다(미국 특허 4,169,888). 미국 특허 5,475,092, 5,585,499 및 5,739,350에 기술된 예컨대 CC-1065 유사체 또는 유도체는, 본 발명의 범위에 포함된다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 미국 특허 5,846,545에 따른 변형된 CC-1065 유사체 또는 유도체 및 예컨대 미국 특허 6,756,397에 기술된 CC-1065 유사체 또는 유도체의 프로드럭도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 특정 구현예에서, CC-1065 유사체 또는 유도체는 예컨대 미국 특허 6,534,660에 기술된 바와 같이 합성할 수 있다.
백금 기반의 물질과 같이, 그외 DNA 알킬화 작동자 분자들(예, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 트리플라틴, 사트라플라틴)도 추가로 포함된다.
DNA에 작용하는 작동자 분자들 중에서도, 토포아이소머라제 I 및 II 저해제, 예컨대 캄포테카 유래 물질(벨로테칸, 토포테칸) 및 포도필로톡신 및 유도체(에토포시드, 테니포시드)도 포함된다.
DNA에 작용하는 작동자 분자의 다른 서브클래스로는, 엽산 유사체(메토트렉세이트, 디하이드로폴레이트 리덕타제 저해제로 알려져 있음) 또는 아미노프테린과 같은 항대사제가 있다. 또한, 퓨린 또는 피리미딘 대사를 방해하는 대사제, 특히 아데노신 데아미나제 저해제(펜토스타틴) 또는 할로겐화된/리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제(클라드리빈, 클로파라빈), 티오퓨린 및 티아조푸린도 포함된다. 추가적인 항대사제로, DNA 중합효소 저해제(시트라빈), 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제(겜시타빈) 및 하이포메틸화제(아자시티딘, 데시타빈) 및 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제가 있다. 또한, 시스플라틴과 같이 DNA 가교제도 일반적으로 포함된다.
본 발명에 따른 작동자 분자는, 예컨대 감마 1I, N-아세틸 칼리케아미신 및 칼리케아미신의 그외 유도체를 포함하는 칼리케아마이신 등의 엔디인(enediyne) 을 비롯하여, DNA 변형 또는 손상시키는 작동자 분자로서 정의되는, 항종양 항생제일 수 있다. 칼리케아미신은 서열-특이적인 방식으로 DNA의 마이너 그로브에 결합하며, 재정렬 과정을 거쳐 이중 가닥 DNA의 파괴를 유도하는 자유 라디칼을 노출시킴으로써, 세포 자살 및 세포 사멸을 발생시킨다. 본 발명에 사용될 수 있는 칼리케아미신 작동자 분자의 예는 미국 특허 5,053,394에 기술되어 있다. 이 화합물은 겜투주맵 오조가마이신 및 이노투주맵 오조가마이신으로 공개된 단일클론 항체와의 면역접합체 형태로 사용된다.
엔디인의 서브그룹은 색소단백질(chromoprotein)인 에스퍼아미신(esperamycin) 및 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)으로 구성된다. 특히, 또한 DNA 손상제로서 분류되는, 트라벡테딘(Trabectedin)은, 항-종양 항생제로 칭해진다. 트라벡테딘은 DNA 벡본 절단을 야기하며, 멍게류(sea squirt)로부터 분리할 수 있으며(또한, 엑테인아시딘 743 또는 ET-743으로 알려져 있음), ZELITA와 JOHNSON & JOHNSON에서 상품명 YONDELIS로 시판되고 있다.
바람직한 작동자 분자의 다른 그룹은, 비제한적인 예로서 세포 대사에 작용하는 독소 등의 물질이다. 특히, 효소 저해제, 예컨대, 비제한적인 예로서, 올라프립(olaprib) 또는 보다 바람직한 프로테오좀(예, 보르테조밉) 및 단백질 키나제 저해제, 또는 마소프로콜과 같은 리폭시게나제 저해제도 본 발명의 일부분이다. 또한, 비제한적인 예로서, 엔도텔린 A 수용체 길항제(예, 아트라센탄)와 같은 수용체 길항제, 또는 에스트론 대사를 방해하는, 테스토락톤과 같은 성 스테로이드도 포함된다. 식물 유래 폴리페놀과 같은 에스트로겐 수용체 간섭제, 예컨대, 비제한적인 예로서, 이소플라보노이드, 스틸벤, 실리마린, 히토에스트로겐으로 언급되는 페닐프로파노이드 글리코시드도 추가로 포함된다.
또한, 광역학 치료 또는 방사선 치료에 사용되는 물질 등의, 세포 대사에 작용하는 물질도 작동자 분자로서 적합하며, 그 예로는, 비제한적인 예로서, 포르피린 유도체, 예컨대, 델타-아미노레불린산이 있다. 에파프록시랄(Efaproxiral)은, 헤모글로빈-산소 친화성을 낮춤으로써 산소 수준을 높이는, 방사선 민감제(radiosensitizer)이다. 추가로, 레티노이드(1세대, 2세대 및 3세대), 특히 트레티노인(ATRA)도 포함되며, 이들 모두 트랜스 레티노익산이며, 상품명 VESANOID으로 ROCHE가 이러한 처방용으로 판매하고 있는, 급성 전골수구성 백혈병(APML) 치료에 사용되고 있다. 레티노이드는, 예컨대 종양 억제자 유전자의 활성화와 같이 다양한 기능을 발휘하는, 비타민 A과 화학적으로 비슷한 일군의 화합물이다. 현재, 피부암과 염증성 피부 장애의 치료에 사용된다.
다른 바람직한 구현예에서, 작동자 분자는 비제한적인 예로서, 칼슘 시그널링 등의 시그널링 경로에 영향을 미칠 것이다. 그 예로는 비소 삼산화물 또는 트리메틸주석 클로라이드가 있으며, 트리메틸주석 클로라이드는 매우 독성이 높은 오가노주석 화합물이다.
또한, 본 발명은, 예컨대 항-다중 약제 내성 활성 (P-당단백질 저해를 통한)을 포함할 수 있는, 약물 내성 기전에 작용하는, 작동자 분자를 포함한다. 이환식 헤테로방향족 화합물 및 유도체들이 비제한적인 예일 수 있다.
다른 작동자 분자 클래스는 물질, 또는 보다 구체적으로, 세포자살 시그널링 경로를 간섭하는 단백질을 포함할 수 있으며, 그 예로는, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 구체적으로, 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종 및 유방암 등의 몇가지 타입의 암에 대한 가능한 치료제로서, 실제 연구된 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드인, 오블리머센(INN, 상표 Genasense; 또한 오그메로센(Augmerosen) 및 bcl-2 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 G3139로 알려져 있음)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 화합물은, Bcl-2의 생산 차단에 의해, 그리고 이를 화학요법에 보다 민감하게 함으로써, 암 세포를 사멸시킬 수 있는 것으로, 제시되고 있다. 작동자 분자로서 제공될 수 있는, 추가적인 세포자살 유도성 물질 클래스는, 비제한적인 예로서, 세포 주기 조절자와 세포자살에 관여하는 단백질을 간섭할 수 있는, 실리이마린(siliymarin)과 같은, 식물성 폴리페놀을 포함한다.
그외 작동자 분자는 비제한적인 예로서 아스파라기나제 등의 효소 또는 항신생물성 활성을 가진 효소를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약물-작동자 분자는 밀리테포신(Miltefosine) 등의 항-원생동물 약물일 수 있다.
다른 구현예에서, 작동자 분자는 비제한적인 예로서 프소랄렌(psoralen) 및 이의 하이드록시 대사산물과 같은, 식물성 폴리페놀일 수 있다.
전술한 항종양 활성들(예, 세포자살 유도, 세포 주기 정지) 또는 유리 라디칼 포착, 금속 킬레이팅 활성, 에스트로겐 수용체 간섭 활성, 항산화제, 약물 대사 효소 간섭과 같은 추가적인 활성을 가지고 있는, 플라보노이드, 탄닌(프로안토시아니딘), 스틸베노이드, 쿠르쿠미노이드 및 리그난과 같은 식물성 폴리페놀 역시 가능한 작동자 분자이다. 보다 구체적으로, 바람직한 작동자 분자는 항산화 및 세포보호 특성을 가진 금속 킬레이터로서 기능하여, DNA에 인터칼레이션할 수 있는, 프소랄렌과 이의 하이드록시 대사산물이다. 레세르바톨(reservatol) 및 폴리하이드록시화된 유사체, 및 플라보노이드, 예컨대 카테킨 및 에피카테킨, 보다 구체적으로, 에피갈로카테킨3-O 갈레이트가 특히 바람직하며, 이들은 항산화제로서 기능할 수 있다.
또한, 이들의 기전에 따라 작동자 분자의 광의의 분류도 가능하다:
항신생물제 및 면역조절제(ATC code L01), 특히 "세포내 화학치료제"
ATC: 해부 치료 화학적 분류 시스템 (WHO)
1) 세포분열 저해제, 또는 마이크로튜불에 작용하는 분자(투불린 결합제), 예컨대 빈카 알카로이드 및 유사체(빈카 알카로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈플루닌, 빈데신, 비노렐빈) 및 탁산(파클리탁셀, 라로탁셀, 도세탁셀), 돌라스타틴)(및 유도체, 예컨대 오리스타틴) 및 크리토피신, 마이탄신 및 콜히친 유도체, 에포틸론(예, 이사베필론)
2) DNA 복제에 작용하는 것
a) 인터칼레이팅 물질, 예를 들어, 안트라사이클린 (다우노루비신, 발루비신, 독소루비신, 아클라루비신, 에피루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 조루비신) 및 스트렙토마이신 유래 물질 등의 안트라센디온(액티노마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 닥티노마이신) 또는 암사크린
b) 알킬화제, 예를 들어, 니트로겐 머스타드, 니트로소유레아, 알킬설포네이트, 아지리딘, 히드라진(프로카르바진), 트리아젠, 에폭사이드, 에틸렌 이민, 알트레타민, 미토브로니톨, 두오카르마이신 및 유사체/입체이성체, 트레니몬, 에스트라무스틴, CC-1065
c) 알킬화-유사 물질, 예를 들어, 플라티늄(예, 카르보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 트리플라틴, 테트라니트레이트, 사트라플라틴)
d) 토포아이소머라제 I 특이 저해제, 예컨대 캄포테카(벨로케탄, 토포테칸)
e) 토포아이소머라제 II 특이 저해제, 예컨대 포도필로독신 및 유도체(에토포시드, 테니포시드)
f) 간섭하여 DNA/RNA 합성에 작용하는 항대사제
- 엽산, 예컨대, 디하이드로폴레이트 리덕타제 저해제(예, 아미노프테린, 메토트렉세이트), 티미딜레이트 신타제 저해제
- 퓨린, 예컨대, 아데노신 데아미나제 저해제(펜토스타틴), 할로겐화된/리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제(클라드리빈, 클로파라빈), 티오퓨린, 티아조푸린
- 피리미딘, 예컨대, DNA 중합효소 저해제(시타라빈), 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제(겜시타빈), 하이도메틸화제(아자시티딘, 데시타빈)
- 데옥시리보뉴클레오티드, 예컨대 리보뉴클레오티드 리덕타제 저해제 하이드록시카바미드
g) 기타 DNA 가교제, 예컨대 플라티늄 기반의 화합물 (예, 시스플라틴)
3) 그외 DNA 간섭 물질, 예를 들어, "항종양/세포독성 항생제", 예컨대 엘사마이신(Elsamicin) A, 다른 항생제, 예컨대 CC-1065, 및 항생제의 서브클래스, 예컨대 박테리아 유래 엔디인 칼리케아민 또는 색소단백질 엔디인 에스페라마이신(고도 독성의 DNA 스플라이싱제) 또는 네오카르지노스타틴(항생제의 네오카르지노스타틴 그룹의 다른 구성원으로는 마크로모마이신, 액티노산틴, 케드라시딘 및 마두로펩틴이 있음) 또는 트라벡테딘(DNA 벡본 절단)
4) 세포 대사에 작용하는 독소, 예컨대, HSP90 저해제, 로니다미드(Lonidamide) (호흡 및 당화 둘다의 저해로, 세포 ATP 감소가 유도됨)
a) 효소 저해제, 예를 들어, Olaprib (PARP 저해제), CDK 저해제 (Alvocidib), 프로테오좀 (Bortezomib), 단백질 키나제 저해제, 마소프로콜(Masoprocol) (리폭시에나제(Lipoxyenase) 저해제)
b) 수용체 길항제, 예컨대 투틴(tutin) (글리신 수용체 길항제(식물 독소), 아트라센탄(Atrasentan), 레티노이드 X 수용체 (벡사로텐(Bexarotene)), 성 스테로이드, 예컨대 테스토락톤(testolactone), 에스트로겐 수용체 간섭 물질
c) 광민감제 또는 광역학 요법용 그외 화합물 (포르퍼머 소듐(Porfirmer Sodium)), 포르피린 유도체, 예컨대 델타-아미노레불린산)
d) 방사선 민감제, 예컨대, 헤모글로빈-산소 친화성을 낮춤으로써 산소 수준을 높이는 에파프록시랄
e) 시그널링, 예컨대 Ca2+ 시그널링 경로에 작용하는 물질, 예컨대 비소 삼산화물 및 트리메틸주석 클로라이드
f) 대사를 간섭하는 그외 물질, 예컨대 레티노이드 및 유도체 트레티노인(Tretinoine) (ATRA)
5) HDAC 등의, 후성유전성 프로세스에 작용하는 물질(예, 피부 T-세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종 또는 여포성 림프종에 대해 현재 임상적인 개발 중인, 파노비노스타트(Panobinostat), 보리노스타트(Vorinostat), 발포르산(Valporic acid), MGCD0103 (모세티노스타트(Mocetinostat)),
6) 약물 내성 기전에 작용하는 물질, 예컨대 P-당단백질을 저해하는, 이환식 헤테로방향족 화합물,
7) 세포자살 시그널링/기전을 유발하는 물질, 단백질 및 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드, 예컨대 오블리머센(Oblimerse)(상표 Genasense)
8) 효소, 예컨대 아스파라기나제
9) 항-원생돌물 약물, 예컨대 밀테포신
10) 식물성 폴리페놀, 예컨대 전술한 항종양 활성들(예, 세포자살 유도, 세포 주기 정지) 또는 유리 라디칼 포착, 금속 킬레이팅 활성, 에스트로겐 수용체 간섭 활성, 항산화제, 약물 대사 효소 간섭과 같은 추가적인 활성을 가지고 있는, 플라보노이드, 탄닌(프로안토시아니딘), 스틸베노이드, 쿠르쿠미노이드 및 탄닌. 보다 구체적으로, 프소랄렌 및 이의 하이드록시 대사산물, 레세르바톨(reservatol) 및 폴리하이드록시화된 유도체, 플라보노이드, 예컨대 카테킨 및 에피카테킨, 특히 에피갈로카테킨 3-O 갈레이트
11) 그외 천연 물질 및 유도체, 예컨대 에톡신 A, 디프테리아 독소 및 이의 유도체로서, 유도체는 화학적으로 또는 유전적으로 변형될 수 있음.
또한, 작동자 분자는, 속하는 물질의 클래스에 따라, 예컨대 유기 화합물, 방향족 화합물, 금속계 화합물, 세포 대사 관련 단백질, 효소, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 뉴클레오티드, 박테리아 독소, 식물 유래 독소 및 폴리페놀, 예컨대 탄닌, 플라보노이드 및 쿠마린, 뿐만 아니라, 테르페노이드, 알카로이드, 항종양 항생제(예, 엔디인 항생제), 미코톡신, 무척추동물과 척추동물 유래 독소, 환경 독소로 분류할 수 있다.
본 발명에 따른 면역접합체는, 하나 이상의 표적 물질, 특히 표적 항체 및 하나의 작동자 분자를 포함한다. 상기 면역접합체는 예컨대 안정화를 위한 추가 분자를 포함할 수도 있다. 면역접합체에서, 용어 "접합체"는 통상적으로 하나 이상의 작동자 분자와 표적 물질의 작동가능한 조합을 나타내는 것이며, 어떠한 타입의 작동가능한 조립만을 지칭하는 의도는 아니며, 특히 화학적 "접합"으로만 한정되지 않는다. 표적 물질이 표적 부위에 결합할 수 있고 부착된 작동자가 의도한 대로 충분히 기능할 수 있는 한, 특히 표적 부위로 전달되는 한, 모든 부착 형태가 적합할 것이다. 본 발명에 따른 접합 방법으로는, 작동자 분자와 표적 항체의, 작동자 분자 및/또는 표적 항체의 사전 변형없이 또는 사전 변형을 포함한, 직접 부착, 또는 링커를 통한 부착이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 링커는, 예컨대 산 취약성(acid labile), 광분해성 링커, 효소 절단성 링커, 예컨대 펩티다제에 의해 절단할 수 있는 링커로 기능적으로 분류할 수 있다. 본 발명의 다수의 구현예에서, 절단성 링커가 바람직하다. 이러한 절단성 링커는, 세포 환경, 특히 절단시 떨어져 나오는 약물에 유해한 효과를 가지지 않는, 세포내 환경에 존재하는 조건 하에서 절단할 수 있다. 임의의 세포내 구역에서 존재하는 것과 같은, pH 4-5 등의 낮은 pH에서는, 산 취약성 링커가 절단될 것이며, 광분해성 링커는 예컨대 적외선으로 절단될 것이다. 그러나, 대부분의 세포에 존재하는 생리학적 조건에 의해/조건 하에 절단되는 링커가 바람직하며, 본원에서는 생리학적으로 절단가능한 링커로 지칭된다. 즉, 다이설파이드 링커가 본 발명의 다수의 구현예들에서 바람직하다. 이들 링커는 생리 조건 하에서 이루어질 수 있는 다이설파이드 교환을 통해 절단가능할 수 있다. 바람직한 이종 2중 기능의 다이설파이드 링커로는, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) (예, Carlsson et al.(1978)), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB) (예, 미국 특허 4,563,304), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP) (예, CAS Registry number 341498-08-6), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) (예, Yoshitake et al., (1979)), 및 N-숙신이미딜 4-메틸-4-[2-(5-니트로-피리딜)-디티오]펜타노에이트(SMNP) (예, 미국 특허 4,563,304)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에 사용하기 가장 바람직한 링커 분자는 SPP, SMCC, 및 SPDB이다.
다른 적합한 링커로는, 비제한적으로, SH-함유성 화합물과 화합물을 연결할 수 있는 이종 2중 기능의 링커인, 설포숙신이미딜 말레이미도메틸 사이클로헥산 카르복실레이트(SMCC)와 같은 "절단불가능한" 결합을 포함할 수도 있다. 2중 기능성 및 이종 2중 기능성 링커 분자, 예컨대, 카르보하이드레이트-유도된 이종 2중 기능성 링커 분자, 예컨대 S-(2-티오피리딜)-L-시스테인 하이드라지드(TPCH) 역시 본 발명의 범위에 포함된다(Vogel, 2004). 마이탄시노이드와 같은 작동자 분자는 2 단계 반응 프로세스를 통해 표적 항체에 접합할 수 있으며, 제1 단계는, N-숙신이미딜 피리딜디티오프로피오네이트(SPDP)와 같은 가교 시약을 이용하여 표적 항체에 디티오피리딜 기를 도입하여 표적 항체를 변형하는 단계이다. 제2 단계에서는, 티올기를 가진 반응성 마이탄시노이드, 예컨대 DM1을 변형된 항체에 부가함으로써, 상기 변형된 항체에 티오피리딜기를 치환하고, 이황화-연결된 세포독성 마이탄시노이드/항체 접합체를 만든다(미국 특허 5,208,020). 그러나, Chari의 미국 특허 공개번호 20030055226에 기술된 방법과 같은 한-단계 접합 방법도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 일 구현예에서, 동일하거나 상이한 종류의 복수의 작동자 분자들을 표적 항체에 부착시킨다. 본원의 도처에 기술된 바와 같이, 사용되는 링커의 특성은 방관자 사멸에 영향을 미칠 수 있다(Kovtun et al., 2006). 또한, 미국 특허 5,208,030; 5,416,064; 6,333,410; 6,441,163; 6,716,821; 6,913,748; 7,276,497 및 미국 출원 2005/0169933을 면역접합체 제조 방법에 대해 참조한다.
미국 특허 6,716,821에 기술된 바와 같이, CC-1065 유사체 또는 유도체를, 예컨대 PEG 연결기를 통해 표적 물질에 접합시킬 수 있다.
칼리케아미신을 링커를 통해(미국 특허 5,877,296 및 미국 특허 5,773,001) 또는 미국 특허 5,712,374 및 미국 특허 5,714,586에 기술된 접합 방법에 따라 표적 항체에 접합시킬 수 있다. 미국 특허 공개번호 20040082764에 칼리케아미신 접합체를 제조하는 다른 바람직한 방법이 기술되어 있다. 본 발명의 면역접합체는 재조합 융합 단백질의 형태를 취할 수 있다.
링커가 이용된 또는 이용되지 않는 부착 형태로의 기능적인 조합을, 본원에서는 "기능적 부착"이라고 지칭한다.
특정 성분들로 필수적으로 구성된 면역접합체는, 본원에서, 항체/면역접합체가 명시된 성분과 항체의 기본적인 특성에 현저한 영향을 미치지 않는 추가적인 물질 또는 성분들로 이루어져 있음을 의미한다.
도 9는 (C) 및 (D)에서, 뮤라인 항체 BB4 (BB4-SPP-DM1; 도 9C)를 포함하는 면역접합체와, 이에 의거한 조작된 표적 항체 nBT062 (nBT062-SPP-DM1; 도 9D) 간의 표적성/결합성의 동질성(homogenity) 차이를 보여준다. 이러한 도에서 알 수 있는 바와 같이, 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체로 수득되는 결과는, 실질적으로, 뮤라인 항체를 포함하는 면역접합체로 수득되는 결과 보다 더 균일하다. 이는, BB4의 항체 결합부가 nBT062에서 변형되지 않았기 때문에, 특히 주목할만하다. 즉, 뮤라인 항체의 항체 결합부를 포함하나 뮤라인 항체의 다른 부분들은 포함되지 않은 면역접합체는, 당해 분야의 당업자가 예상하는 결과를 훨씬 웃도는, 특성을 나타내었다.
본 발명의 면역접합체들 중 일부는 입체적으로 방해를 받는 작동자 분자를 포함하며 절단성 링커를 포함하는, 면역접합체(HICL - 방해가 있는 면역접합체, 절단성 링커)를 포함한다. CD138에 대한 조작된 표적 항체를 절단가능한 링커(CL)를 통해 작동자 분자에 부착된 형태로 포함하는 면역접합체의 방해가 없는 카운터파트(UI: 방해받지 않는 면역접합체)를, UICL로 본원에서 기재된다. UICL은, 조작된 표적 항체를 포함하나 작동자 분자가 입체적으로 방해를 받지 않는 HICL와 등가의 면역접합체이다. 한쌍의 HICL/UICL의 예는 BT062 및 nBT062-SPP-DM1이다. 비절단성 링커를 포함하는 이러한 면역접합체의 방해가 없는 카운터파트(UINCL)는, 작동자 분자가 입체적으로 방해를 받지 않고 비-절단성 링커를 포함하는, 조작된 표적 항체를 포함하는 등가의 면역접합체를 의미한다. BT062 (nBT062-SPDB-DM4)의 경우, nBT062-SMCC-DM1은 비-절단성 링커를 포함하는 상기한 방해받지 않는 카운터파트(UNICL)의 일 예일 것이다.
면역접합체의 종양 증식의 저해 활성(= 종양 증식 저해 활성)은 상대 평가이다. 이는, 활성 100%로 설정된 면역접합체의 최고 수행 활성에 대한 접합체의 상대적인 종양 증식 저해 활성을 나타낸다. 예컨대, 32일간의 종양 증식 지연(TGD)을 야기하는, 접합체, 즉 BT062의 최고 수행 활성이 100%로 설정되어 있다면, 예컨대, 18일의 종양 증식 지연(TGD)을 보이는 nBT062-DM1의 활성은 하기와 같이 계산한다:
종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGDnBT062-DM1 / TGDBT062),
보다 일반적으로는:
종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGD샘플 / TGD기준).
표 6에 도 11B에 나타낸 결과에 대한 적합한 예를 제공한다.
치료군에 450 ㎍/kg을 투여한 SCID 마우스에서 MOLP-8 종양 이종이식에 대한 nBT062-DMx의 종양 증식 지연(TGD) 및 활성 %.
TGD* (일) 활성% **
PBS 0 0
nBT062-SMCC-DM1 18 56
BT062 32 100
nBT062-SPP-DM1 13 40
(*) 대조군에서 미리 정한 크기가 되는데 걸리는 평균 시간 - 치료군에서 미리 정한 크기(160 mm3)가 되는데 걸리는 평균 시간으로서, 수일간의 종양 증식 지연(TGD).
(**) 종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGD샘플 / TGDBT062). BT062의 활성은 100%로 정해짐.
표 6에 제시된 예에서, BT062는 방해가 없는 카운터파트(nBT062-SPP-DM1)의 활성 보다 60% 높은 종양 증식 저해 활성과, 비절단성 링커를 포함하는 방해가 없는 카운터파트 면역접합체(nBT062-SMCC-DM1)의 활성 보다 44% 높은 종양 증식 저해 활성을 제공한다.
전술한 바와 같이, 마이탄시노이드와 같은 특정 약물은, 효과적이지만 독성이 높아, 이의 천연적인, 즉 비-접합된 형태에서는 세포를 비특이적으로 파괴시킨다. 항체에 세포독성 마이탄시노이드를 연결시켜, 표적 세포에 도달할 때까지, 약물을 비활성 상태로 유지시킬 수 있다(Lambert 2005). 몇가지 마이탄시노이드 접합체들이 임상 개발 중에 있다.
CD56-양성의 고형 종양(소세포 폐암 및 신경분비성 암) 치료에 대해, IMGN901 (huN901-DM1, BB-10901)을 이용한 I상 및 II상 연구들이 수행되었다. 이러한 연구들에서 IMGN901을 6주 마다 연속 4주간 투여하였는데, 일반적으로 잘 허용되었다(Fossella et al., 2005, Lorigan et al., 2006, McCann et al., 2007, Carter and Senter, 2008, Johnson et al. 2008). 면역접합체의 항체 부분, huN901은 현저한 CDC 또는 ADCC 활성을 보인다. CD56-양성의 다발성 골수종의 치료에 대해 동일한 면역접합체를 조사하였다. I상에서, 3주 마다 연속 2주간 IMGN901을, 확립된 다발성 골수종 치료에 실패한, CD56-양성의 다발성 골수종 환자에게 투여하였는데, 임상적인 활성 뿐만 아니라 안전성에 대한 예비 조사 결과가 확인되었다. 18명의 환자들에게 IMGN901 (환자 3명에게, 각각 40, 60, 75, 90, 112, 및 140 mg/m2/week)을 투여한 것으로 기록되었다. PK의 예비 결과는, 투약과 관찰되는 최고 혈청 농도 간의 대략적인 선형적인 관계를 나타내는 것으로 보고되었다. 흥미로운 임상적인 활성이 허용가능한 안전성 프로파일과 함께 관찰되었다. 확인된 마이너 반응(MR)은, 유럽 골수 이식 기준 하에, 3명의 과다 사전 처리한 환자(환자 1명 당 60, 90, 및 112 mg/m2/week)들에서 확인되었다. 항구적인 안정적인 질병 상태는 투여량 60, 90, 112 및 140 mg/m2/week에서 확인되었다(Chanan-Khan et al., 2007, Chanan-Khan et al., 2008). 또한, IMGN901도 고형 종양에 대한 I상 연구가 수행 중에 있다. 면역접합체를 3주 마다 3일간 매일 투여한다. 예비 임상 활성이 소세포 폐암, 메르켈 세포 암종 및 그외 고형 종양을 가진 환자들에서 기록되었다. 계속 용량을 늘려가고 있다.
MLN2704 (huJ591-DM1)는 거세-내성 전립선 암 치료에 대해 조사되었다 (Milowsky et al., 2006, Brand and Tolcher 2006). MLN2704의 I 상 실험으로, 진행성의 전이성 거세-내성 전립선암 환자를 대상으로, 4주 마다 한번 투여하였을 때, MLN2704의 안전성 프로파일, 약동학성, 면역원성 및 항종양 활성을 평가하였다. 치료 용량의 MLN2704를 반복적인 주성분으로서 안전하게 투여할 수 있다는 결과가 확인되었다(Galsky et al., 2008). 유사한 실험을 다른 DM1-면역접합체, 즉 두경부암과 그외 고형 종양 상에서 발현되는, CD44v6을 표적으로 하는 비바투주맵 머탄신으로 수행하였다. 고도의 투약 설계(매주 투여)로 수행한 임상 실험에서, 피부 케라티노사이트 상의 CD44v6에 결합하여, 환자에 치명적인 결과를 초래하는 심각한 피부 독성을 매개하였으며, 이는 비바투주맵 머탄신의 개발 프로그램의 종료로 이어졌다(Tijink et al., 2006, Sauter et al., 2007, Rupp et al., 2007, Riechelmann et al., 2008).
CD44v6는, 다양한 암 세포에서 뿐만 아니라 정상적인 피부 조직에서도 발현되며, 암 세포 뿐만 아니라 정상 피부 조직에서도 발현된다는 점에서 CD138과 비슷한 점이 있다. 놀랍게도, BT062가 비바투주맵 머탄신에서 확인되는 바와 같이 유사한 피부 독성인 허용하기 어려운 부작용이 없이 임상적인 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다. BT062를 최대 160 mg/m2의 단회 투여를 반복한 경우 적어도 안정적인 질환 상태가 유도되며 부작용도 조처가능한 수준임을 보여주는 도 23을 참조한다. 도 23에 도시된 결과는, 또한, 20 mg/m2의 단회 투여 10회 반복(6개월 이상 처리), 40mg/m2의 단회 투여 5회 반복, 80 mg/m2의 단회 투여 5회 반복, 160 mg/m2의 단회 투여 6회 반복, 및 200 mg/m2의 단회 투여후 160 mg/m2의 단회 투여 6회 반복(그래서 총 투여량 1160 mg/m2)가 충분히 허용되었음을 보여준다(환자 003-005, 002-012, 및 002-011은 아직 진행 중임).
또한, CD138은 정상적인 혈액 세포와, 상피 등의 다른 세포 상에서도 발현되는데, 이것이 파괴되면 허용불가한 부작용이 발생될 것이다. 이와 관계없이, CD138을 발현하는 비-암/비-종양 세포에 대한, 임의 유형의 용량 제한 독성(dose limiting toxicity)이 도 23에 도시한 최대 120 mg/m2의 치료 요법에서 나타났으며, 본 실험에서 최대 허용 용량(MTD)는 160 mg/m2로 결정되었고, 최대 투여 용량(MAD)은 200 mg/m2로 측정되었다. 160 mg/m2과 200 mg/m2 사이의 용량은 조사하지 않았다. 더 높은 용량은 일반적으로 200 mg/m2의 용량 제한 독성(DLT) 측면에서 제공되지 않았다. 그러나, DLT 용량은 160 mg/m2와 같이 후속적으로 보다 낮은 용량으로 투여하였을 때에는 여전히 허용되는 것으로 관찰되었다. CD138을 발현하는 비-암/비-종양 세포(CD138을 발현하는 비-표적 세포)에 대한 임상적으로 유의하지 않은 독성은, 본원에서, 이들 세포와 해당되는 장기(들)에 대한 "임상적으로 허용가능한 독성" 또는 "허용가능한 독성"을 의미한다. 투여되는 면역접합체의 개개 용량은, 본원에서 "허용가능한 양"을 의미한다. 즉, 본 발명의 일 구현예에서, 면역접합체는 CD138을 발현하는 비-표적 세포, 특히, 인간 특이성으로 인해 마우스 이종이식 모델에서는 BT062로 검출되지 않는, CD138을 발현하는 상피 세포에 대한 임상적으로 허용가능한 수준의 독성을 나타낸다.
임상적으로 허용가능한 독성은, 최고 수준으로 조처가능하거나 허용가능한 수준의 유해한 반응의 발생을 포함한다. 유해한 반응은, 약물의 약리학적 작용의 일부분으로서 발생하거나 또는 발생시 예측불가능할 수 있는, 약물, 본원에서는 면역접합체의 사용과 당연히 관련있는, 바람직하지 않은 효능으로서 정의된다. 이 정의에는 약물을 사용하는 동안에 관찰되는 모든 부작용들이 포함되는 것이 아니며, 약물과 부작용 현상 간의 인과 관계가 있다고 생각되는 어떠한 근거가 있는 경우로만 포함된다. 유해한 반응은 신호 및 증상, 실험 파라미터의 변동 및 생명 신호 및 ECG와 같이 주요 신체 기능에 대한 다른 평가의 변동을 포함할 수 있다.
비-표적 세포, 특히 CD138을 발현하는 비-표적 세포(비-종양 세포) 등의 세포가, 투여, 특히 면역접합체와 같은 화합물의 특정 용량 투여에 의해 "실질적으로 영향을 받지 않는다"고 칭해진다면, 이들 화합물이 상기한 비-표적 세포와 갖는 어떠한 상호작용에 의해, 유해한 반응이 발생되지 않거나, 또는 조처가능한/허용가능한 수준에서 유해한 반응이 발생됨을 의미한다.
HER을 과다 발현하는 전이성 유방암을 치료하기 위한, 트라스투주맵을 면역접합체 형태(T-DM1)로 사용한 I상 연구를 수행하여, T-DM1의 매주 투여시 또는 3주마다 1회 투여시의 안전성과 약동학적 특성을 조사하였다. 2가지 실험에서, AE 등급 ≥ 2는, T-DM1이 드물고 조처가능하다는 것이다. 객관적인 종양 반응은 MTD나 그 미만의 용량에서 관찰되었다(Burris et. al., 2006, Krop et al., 2007, Beeram et al., 2008, Holden et al., 2008). HER2-양성의 전이성 유방암에, 3주 마다 1회 투여하는, T-DM1에 대한 II상 실험이 시작되었다(Beeram et al., 2008, Carter and Senter, 2008, Holden et al., 2008). 2번째 세포주인 HER2-양성의 전이성 유방암에 대한 T-DM1의 III상 임상 시험과, 제1, 제2 및 제3 세포주인 HER2-양성의 전이성 유방암에 대한 T-DM1의 II상 임상 시험 평가가 진행중에 있다. 헤르셉틴을 기본으로한 치료를 진행중에 있는, HER2-양성의 전이성 유방암에 대한, 퍼투주맵과의 조합 투여에 대한 Ib 상 임상 시험이 계획되고 있다. 결장직장암과 그외 C242를 발현하는 암 상에서 발견되는 항원을 표적으로 하는, huC242 항체의 DM1-접합체인, 칸투주맵 머탄신을 이용한, 3번의 I상 임상 실험이 완료되었다. huC242-DM1을 매주 투여하는 치료와, 3주마다 1회 투여하는 치료는 안전하고 허용적인 것으로 확인되었다(Rowinsky et al., 2002, Tolcher et al., 2003, Helft et al., 2004).
또한, BT062의 구성 요소인, 티올-함유성 DM4 마이탄시노이드를 이용한 면역접합체에 대해, 4가지의 실험들이 진행중에 있다:
칸투주맵 머탄신의 유사체인 IMGN242 (huC242-DM4)는, CanAg를 발현하는 암에 걸린 개체를 대상으로 I상 실험을 수행하였다(Tolcher et al., 2006). IMGN242를 3주 마다 1회로 단회 IV 주입으로 18 - 297　mg/m2의 용량으로 개체에게 투여하였다. 용량 제한 독성은 2차 치료 사이클 동안에 223　mg/m2의 용량 수준으로 투여받은 개체 6명 중 2명에서 나타났다. 약물은 168　mg/m2의 수준에서 허용성이 우수하였으며, 어떠한 검출가능한 항체 반응을 유발하지 않았다(Mita et al., 2007). I 상 실험의 처음 안전성 결과를 기초로, CanAg를 발현하는 위암 세포 치료에 대해 IMGN242를 용량 168 mg/m2에서 평가 착수하였다(Sankhala et al., 2007). 환자 40명에게 IMGN242를 2가지 임상 실험으로 처방하고 있다. 안전성과 철저한 임상적인 약동학(PK)/약력학(PD) 분석을 토대로, II 상 실험을, 혈장내 CanAg 수준이 낮은 환자에게 126 mg/m2을 투여하고 혈장내 CanAg 수준이 높은 환자에게 168 mg/m2를 투여하는 것으로 수정하였다(Qin et al. 2008).
또한, CD33-양성인 급성 골수성 백혈구(AML) 환자에 대한 치료 실험으로, DM4가 접합된 huMy9-6 항체(AVE9633)의 I상 실험이 이루어졌다. 치료 계획은 15 - 260　mg/m2의 용량 범위로, 3주마다 1회씩 IV 주입하는 것이었다. 단회 투약 실험에서, 관련된 골수억제 또는 반응은 나타나지 않았다(Giles et al., 2006). AVE9633을 28일 주기에서 1일과 8일에 IV 주입하는 것으로 구성된 치료 계획으로 2차 I상 실험을 진행하였고, 여기서 AVE9633이 충분히 허용된다는 것이 확인되었고, 4달 이상 지속되는 완전 반응(불충분한 혈소판 반응, 주입 의존적)을 보인 개체 1명을 포함하여 항백혈경 활성의 증거가 확인되었다(Legrand et al., 2007). 2가지의 다른 DM4-면역접합체들(SAR3419 및 BIIB015)도 I상 임상 실험에 착수하였다.
또한, CD33을 표적으로 하는 밀로타르그(Mylotarg) 등의, 다른 면역접합체들을 통해, 면역접합체의 활성이 저용량에서는 환자를 치료하는데 충분하지 않을 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 문제는, 예컨대 CD33을 발현하는 표적 세포를 민감하게 자극하기 위해 재조합 인간 과립세포 콜로니-자극 인자(rhG-CSF)를 투여함으로써, 해결된다(Fianchi et al., Annals of Oncology 2008 19(1):128-134).
전술한 실험들에서, 여러가지 면역접합체, 특하 마이탄시노이드(예, DM1 또는 DM4)를 포함하는 면역접합체에 대한 반응이 매우 다른 것으로 나타났다. 인간 개체를 대상으로 한 BT062 실험에서, 여러가지 안정적인 질병 상태 용량(stable disease dose), 특히, 최대 160 mg/m2의 용량에서, CD138을 발현하는 비-암 세포에 대한 허용가능한 수준의 독성이 확인되었다.
본원의 면역접합체는 세포독성제와 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 조합을 본원에서는 항암 조합이라고 칭한다.
현재, 많은 조합, 특히 항-골수종 약물들이 임상 실험 중에 있다. 조합 사용의 목적은 통상적으로 예컨대 골수종 세포의 불응 표현형을 치유하기 위한 효능 강화이거나, 또는 조합 파트너들 중 하나 또는 그 조합을 낮은 농도로 사용함에 따른 부작용 감소이다. 예컨대 저용량의 레날리도마이드 + 저용량의 덱사메탄손의 사용시, 독성이 감소됨이 입증되었다(Rajkumar et al., 2010).
특히 재발성 또는 불응성 다발성 골수종 환자를 대상으로, 몇가지 약물 조합이 실험 중에 있으며, 조사되었다.
조합된 화학치료제의 대표적인 예는, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 독소루비신으로 구성된 트리플 조합이다(VAD Regimen).
보르테조밉과 같은 프로테오좀 저해제는 멜팔란 및 프레드니손 등의 골수종 약물과 조합된다(VMP). 이 조합으로 인한 완전 반응의 발생율은 16%이고 전체 반응율은 89%에 달한다 (Mateos et al., 2006).
또한, 보르테조밉은 재발성 또는 불응성 환자를 대상으로 리포좀 독소루빈신과의 조합 사용에 대해 승인되었다(Ning et al., 2007).
보르테조밉은 덱사메타손, 멜팔란, 프레드니손 및/또는 탈리도마이드와 조합 사용에 대해 몇건의 임상 실험 중에 있다.
또한, 보르테조밉은 리포좀 독소루비신, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손과 조합하여, 다발성 골수종 환자를 대상으로 실험 중에 있다. 보리노스타트와의 조합도 현재 보르테조밉에 불응성인 환자를 보르테조밉에 대해 다시 민감해지게 하고자 하는 목적으로 실험 중에 있다.
경구로 투여되는 달리도마이드는 멜팔란/프레드니손(MPT) (Facon et al., 2006) 또는 덱사메타손 또는 벤다무스틴(Ponisch et al., 2008)과 조합 사용되었다.
아울러, 덱사메타손과 조합 사용되는, 면역조절 약물인 레날리도마이드는, 데사메탄손 단독 사용시와 비교하여 종양 진행을 지연시키고 생존율을 높이는 결과를 보여주었다(Weber et al., 2006). 또한 레날리도마이드와 덱사메타손의 조합은 신규 진단받은 환자에서 실험되었으며(Rajkumar et al., 2005), 멜팔란/프레드니손의 조합(RMP)도 조사되었다(Palumbo et al., 2006)
Lutz 등의 미국 특허 공개번호 2010/0028346은 화학치료제를 함유한 특정 면역접합체의 상승적인 효과를 기술하고 있다.
본원에서, 조합을 사용하는 목적은 본 발명의 면역접합체의 유효량 감소, 그것의 부작용 약화 및 허용가능한 수준의 부작용으로 가진 새로운 치료제를 개발할 수 있는 기회의 제공이다. 다른 목적은, 벨카드 또는 레날리도마이드 등의 이전에 사용된 세포독성제의 유효량을 낮추고, 바람직하게는 이들 물질의 부작용을 낮추는 것이다. 마찬가지로, 투여량의 긍정적인 성과는, 비제한적인 예로서, 치료 연장, 보다 높은 용량, 그외 적용 계획, 우수하고 보다 지속적인 치료 반응이다.
레날리도마이드, 멜팔란(실험 중) 등의 약물에 대해 불응 표현형을 나타내는 환자는 본 발명에 따른 면역접합체를 사용함으로써 다시 민감하게 할 수도 있다.
용어 "세포독성은 화학치료제, 특히 빠르게 분영하는 세포에 통상 사용되는 화학치료제를 비롯하여 "세포독성/암 약물"을 포함하며, 즉 하기 물질들이 있다:
- 알킬화제, 예를 들어, 니트로겐 머스타드(예, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 우라머스틴, 클로람부실, 이포스파미드), 또는 니트로소우레아(예, 카르머스틴, 로머스틴, 스트렙토족신) 또는 알킬설포네이트;
- 알킬화제, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴; 또는 비-고전적인 알킬화제, 예컨대 테트라진, 다카르비진, 프로카르바진, 알트레타민;
- 알트라사이클린, 예컨데 옥소루비신 및 리포좀 독소루비신(DOXIL)
- 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴.
용어 "세포독성제"는 또한, 다면발현성의 면역조절 특성 측면에서, 골수종 치료를 위해 사용되는, 탈리도마이드(또는 유사체), 레날리도마이드(CC-5013), 포말리도마이드, 액티마이드와 같은 면역조절 약물(ImiD)을 포함한다. 이것은 통상적으로 TNF 알파 생산 저해에 의해 항-염증 활성을 나타내며, 아울러 항-혈관신생활성과 T-세포 공동-자극등의 면역조절 특성을 보이며, 조절성 T-세포에 영향을 미친다(Quach et al., 2010).
용어 "세포독성제"는 또한 비제한적인 예로서 덱사메타손 및 프레드니손과 같은 스테로이드 뿐만 아니라, 프로-세포자살 경로의 억제에 의존적인 신생물 세포에서 프로그램된 세포 사멸의 활성화를 유도하는, 보르테조밉(VELCADE) 또는 카르필조밉 등의 프로테오좀 저해제를 포함한다.
추가적인 강력한 세포독성제로는, 토포아이소머라제 II를 저해하는 에토포시드, 변환시 세포주기를 S기(DNA의 합성)로 유지되었을 때 DNA를 손상시켜, 특히 암 세포 등의 빠르게 분열하는 세포에 작용하는, 시타라빈을 포함한다. 아울러, 빈카 알칼로이드, 탁산(작동자 분자에 대한 상기 내용 참조) 등의 마이크로튜불 저해제도 본 발명에 따른 세포독성제로 사용할 수 있다.
또한, 소라페닙과 같은 키나제 저해제, 또는 로미뎁신과 같은 HDAC(히스톤 탈아세틸화 효소) 저해제, 뿐만 아니라, 성장 저해제, 항-호르몬제, 항-혈관신생제, 심보호제, 면역자극제, 면역억제제, 혈관신생 저해제, 단백질 티로신 키나제(PTK) 저해제도, 상기한 정의에 포함된다.
또한, 이러한 정의에, 당해 기술 분야에서 인정되는 세포 독성 효과를 가지는 면역접합체 및 항체 등의 항체 기반의 세포독성 물질도 포함된다. 항-CD40이 바람직한 항체이다. 그외 항체로는, 예컨대 AVASTIN (bevacizuab) 또는 MYELOMACIDE (milatuzumab)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
탈로미드(α-(N-프탈리미도)글루타리미드; 탈리오미드)는 면역조절제이다. 탈리도마이드의 실험식은 C13H10N2O4이며, 그람 분자량은 258.2이다. 탈리도마이드의 CAS 번호는 50-35-1이다. 이 화합물은, 다양한 방식으로 골소종 세포의 증식 및 생존을 저해하는 능력 및 신생 혈관의 증식을 저해하는 능력 등의 복수의 작용을 가지는 것으로 보인다.
레날리도마이드(REVLIMID)는 TNF 알파의 저해제로서 초기에 개발된 면역조절 화합물(ImiD)의 제2 세대인 탈리도마이드의 유도체이다. 레날리도미드의 효능은 증식 정지 또는 세포자살, 골수 기질 세포에 대한 골수종 세포의 접착 저지 및 세포 증식 생존 및 골수종 세포의 내성을 촉진시키는 사이토카인의 조절이다(Morgan et al., 2006). 레날리도마이드는 탈리도마이드에 불응성인 환자에게 유효하다. 면역 세포에 대한 효능 외에도, 레날리도마이드 등의 ImiD는 G0/G1기로의 세포 주기 정지를 유발하는 것으로 추측되었다. 또한, ImiD는 세포 접착 수용체(VLA-4, VLA-5, CD138)를 하향 조절하는 것으로 추측된다(Quach et al., 2010).
CD138의 하향조절은 표적 세포에 Bt062 등의 임의의 CD138 표적 물질의 결합 감소를 야기하는 것으로 예상된다.
프로테오좀 저해제는 다시 서브그룹들로 분류할 수 있다:
a) C-말단 에폭시 케톤 구조를 가지고 있는, 천연적으로 형성되는 펩타이드 유도체들, 베타-락톤 유도체, 아클라시노마이신A, 락타시스틴, 클라스톨락타시스틴; 및
b) 합성 저해제(변형된 펩타이드 알데하이드, 알파, 베타 에폭시케톤 구조체, 비닐 설폰, 붕산 잔기들, 피나콜에스테르). 본 발명의 바람직한 프로테오좀 저해제는 보르테조밉(PS 341; VELCADE, 하기 내용 참조)이다. 제안된 기전들 중 한가지 기전은, 프로테오좀 저해로, 프로-세포자살 경로의 억제에 의존적인 신생물 세포에서의 프로그램화된 세포 사멸의 활성화를 허용하는, 프로-세포자살 인자의 분해를 방지할 수 있다는 것이다. 또한, 보르테노밉은 G2/M 세포 주기 정지를 야기한다(Wang et al., 2009). 따라서, 보르테조밉은, 상기한 세포 주기 단계에서도 작용하는, 마이탄시노이드 DM4의 효능을 가지고 있는 본 발명의 면역접합체의 일부분인 세포분열 저해제를 간섭할 것이다. 아울러, 세포자살시 발생하는 PARP (폴리(ADP-리보스)중합효소)의 절단은, 또한 DM4와 보르테조밉 양자에 영향을 받는다. 즉, 세포분열 저해제를 포함하는 면역접합체와 보르테조밉 특징을 나타내는 프로테오좀 저해제의 조합은, 상승적인 효과를 수득하기 위한 이전에 기술된 포괄적인 지침을 따르지 않는다(Takimoto et al, 2009).
벨카드(Velcade)는 다발성 골수종 치료에 사용되는 프로테오좀 저해제이다. 벨카드는 골수종 세포에 세포 사멸을 야기하는 것으로 작용하거나 및/또는 골 미세환경에 작용함으로써 골수종 세포 증식 및 생존을 저해하도록 간접적으로 작용하는 것으로 생각된다. 특정 이론 또는 작용 방식으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 벨카드는 정상적인 세포 프로세스를 파괴하여, 세포자살을 촉진시키는 프로테오좀 저해를 형성시킨다.
덱사메타손은 항염증 및 면역억제제로서 작용하는 합성 글루코코르티코이드 스테로이드 호르몬이다. 덱사메타손은, 암 환자에게 투여시, 암 치료법의 부작용을 중화할 수 있다. 또한, 덱사메타손은 단독으로 또는 탈리도마이드, 레날리도마이드, 보르테조밉, 아드리아미신 또는 빈크리스틴 등의 다른 항암제와 함께 제공될 수 있다.
또한, BT062와 조합하여 사용할 수 있는, 치료용 물질은, 면역조절제(예, 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드), 프로테오좀 저해제(예, 보르테조밉 및 카르필조밉), 스테로이드(예, 덱사메타손), 알킬화제 및 고용량 화학요법, 조합(예, 멜팔란+프레드니손(MP), 빈크리스틴, 독소루비신(아드리아미신) 및 엑사메타손(VAD)) 및 비스포르포네이트를 포함한다.
용어 "와 조합하여"는 정확히 동시 투여로 한정되지 않는다. 대신, 상기 용어는 본 발명의 면역접합체와 다른 요법(예, 방사능 요법) 또는 물질, 특히 상기에서 언급된 세포독성제의, 순차적인, 및 이들이 서로 작용하여 본 발명의 면역접합체나 예컨대 다른 물질 또는 물질들 중 한가지만 단독으로 사용하여 치료하였을 때와 비교하여 증가된 유익성(예, 활성 증가, 부작용 감소)을 제공할 수 있는 시간 간격으로 투여하는 것을 포함한다. 면역접합체 및 다른 물질이나 물질들은 상가적으로(additively) 작용하는 것이 바람직하며, 상승적으로 작용하는 것이 더 바람직하다. 이런 분자들은 의도한 목적에 유효한 양으로 적절하게 제공된다. 숙련된 의료 실무자들은 실험을 통해 또는 물질의 약동학 및 작용 방식을 고려함으로써, 각 치료 물질의 적정 용량 및 용량들과, 적합한 투약 시기 및 방법을 결정할 수 있다. 본원에서, "병용-투여"는 면역접합체와 동시에, 대개 조합된 투약 형태로의 투여를 의미한다.
상승적인 효과, 즉 면역접합체와 세포독성제 등의 2가지 성분의 효과로, 엄격한 상가적인 효과를 초과한다. 이러한 상승적인 효과는 추가로 후술되는 다수의 인자들에 의해 약화될 수도 있다.
상승 작용은 다음과 같이 계산한다(Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):
RATIO (r) = 예상되는 FTV (조합)/관찰되는 FTV (조합)
FTV: 부분 종양 부피(Fractional tumor volume) = 평균 종양 체적(실험군)/평균 종양 체적(대조군)
비율 > 1이면 상승적인 것으로 보고, r < 1이면 상가적 효과 미만이다.
비율(r)이 1 보다 높으면 본원에서는 "상승 효과 비율(SYNERGY RATIO)"로 언급된다.
활성 등급은 조합의 효능에 대한 평가치이다. 이 등급은 Log10 세포 사멸을 근거로 한다
Log 10 세포 사멸 = (T-C) / T d x 3.32
상기에서, (T-C) 또는 종양 증식 지역은 치료군(T)과 대조군(C) 종양이 미리 정해진 크기(600 mm3)가 되는데 소요되는 평균 시간(일)이다. Td는 대조군 마우스에서의 평균 종양 체적을 기초로 한 종양 더블링 시간이며, 3.32는 세포 더블링 수/log 세포증식(log of cell growth)이다(Bissery et al., 1991). Log10 세포 사멸이 2.8 보다 크면, 조합이 매우 고활성임을 의미하며, log10 세포 사멸 2.0 - 2.8은 조합이 고활성이며, log10 세포 사멸 1.3 - 1.9은 조합이 활성이며, log10 세포 사멸 0.7 - 1.2은 조합이 중간 수준의 활성이며, log10 세포 사멸 0.7 미만은 조합이 비활성임을 의미한다.
약물 조합 파트너의 선택
조합 화학치료 요법 설계를 위한 가이드라인 세트가 개발되었다(Takimoto, 2006). 이러한 가이드라인에 따르면, 일반적으로, 특정 조합으로 단일 제제 요법 이상으로 조합 화학요법의 가장 중요한 이론적 이점 3가지 중 적어도 1가지를 구현시킬 가능성을 높일 수 있을 것이다:
1.) 비간섭성 용량-제한 독성을 보이는 제제를 이용함으로써 숙주에 대한 독성을 최소화하면서 세포 사멸은 최대화;
2.) 특정 유형의 요법에 내인성 내성을 보이는 종양 세포에 대한 약물 활성 수준의 증가; 및
3.) 새로운 내성 종양 세포의 발생 예방 또는 늦춤.
조합 화학요법 요법에 사용하기 위한 물질의 선택시 고려할 권고되는 원칙은 다음과 같다:
a) 단일 물질로서 완전한 관해를 유도하는 것으로 공지된 약물의 선택,
b) 상가적인 또는 상승적인 세포독성 효과를 가지며 상이한 작용 방식을 가진 약물의 선택은 피해야 함,
c) 용량 제한 독성이 다른 약물의 선택,
d) 교차 내성을 최소화하기 위한, 다른 내성 패턴을 가진 약물의 선택.
또한, 약물은 그것의 최적 용량과 계획(e)으로 투여되어야 하며, 투여는 일정한 간격으로 수행되어야 하지만, (f)치료가 없는 기간은 정상 조직의 회복이 가능할 정도로 짧아야 한다(Takimoto et al, 2009).
상승 효과 또는 단순히 상가 효과는 여러가지 인자들에 의해 약화될 수 있다: 예컨대, 항암 조합의 구성 성분들이 예컨대 서로 결합함으로써 서로를 불활성화시킬 수 있다. 또한, 항암 조합의 한가지 성분이 다른 성분의 작용 모드를 방해할 수도 있다. 예를 들어, 레날리도마이드는 본 발명의 면역접합체의 표적인 CD138과 같은 세포 접착 수용체를 하향 조절한다(Quach et al., 2010). 프로테아좀 저해제인 보르테조밉은 G2/M 세포 주기를 정지시키는데, 이는 세포분열 저해제에 의해서도 영향을 받는다(Wang et al., 2009). 즉, 면역접합체의 작동자 분자가 마이탄시노이드인 경우, 보르테조밉과 표적으로 공유할 것이므로, 좋지 않은 것으로 보인다.
암 치료에 널리 사용되는, 본 발명에 따른 세포독성제의 용량, 투여 경로 및 권고되는 용법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 의료인을 위한 참조서(PDR: Physician's Desk Reference)와 같은 문헌 등에 기술되어 있다. PDR에는 다양한 암의 치료에 사용되고 있는 물질의 용량이 기재되어 있다. 유효한 이들 세포독성제의 투약 요법과 용량은 치료중인 개개 암, 질병의 수준 및 당해 기술 분야의 의사에게 자명한 그외 인자들에 따라 결정될 것이며, 의사가 정할 수 있다.의료인을 위한 참조서(PDR) 2006년도 판에는, 탈리도마이드 (p 979-983), 벨카드 (p 2102-2106) 및 멜팔란(p 976-979)에 대한 작용 기전과 바람직한 처리 용량 및 투약 스케줄이 기재되어 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 PDR을 하나 이상의 파라미터들을 이용하여 검토하여, 본 발명의 내용에 따라 사용될 수 있는 화학요법제 및 접합체의 투약 요법과 용량을 정할 수 있다:
1. a) 제조사, b) 제품(회사 또는 약물의 상표명), c) 카테고리 인덱스(예, "프로테아좀 저해제", "DNA 알킬화제", "멜팔란" 등), d) 일반적인/화학적인 인덱스(상품명이 아닌 약물의 일반명.
2. 약제의 색 이미지
3. FDA 표시 요건에 부합되는 상품의 정보, a) 화학적 정보, b) 기능/작용, c) 처방 증상 & 금기. d) 임상 연구, 부작용, 경고가 포함됨.
당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 면역접합체 nBT062의 바람직한 조작된 표적 항체 부분의 아미노산 서열은, CD138을 표적으로 하는 항체 부분의 기능이 없어지지 않은 범위내에서 변경될 수 있다. 특히, 항원 결합부(ARB)에서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 99-111을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 89-97을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3인 경우에도 적용된다. 유익하게는, 항원 결합부(ABR)에는 각각 서열번호 1의 아미노산 잔기 31-35 및 51-68을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1 및 CDR2, 및/또는 (b) 서열번호 2의 아미노산 잔기 24-34 및 50-56을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1 및 CDR2가 유지된다.
용어 "서열 동일성"은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 동일성 수치이다. 일반적으로, 서열을 순서 매치가 가장 많이 되도록 정렬한다. "동일성"은 자체적으로 당해 기술 분야에서 인정되는 의미를 가지며, 공개된 기법들을 이용하여 계산할 수 있다(예, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열들 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법들이 존재하며, 용어 "동일성"은 당업자들에게 잘 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
임의의 특정한 핵산 분자가, 예컨대 nBT062 핵산 서열 또는 이의 일부와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일한지는, 일차 서열 정렬을 위해 DNAsis 소프트웨어(Hitachi Software, San Bruno, Calif.)와 같은 공지의 컴퓨터 프로그램과, 다중 서열 정렬을 위한 ESEE 버전 3.0 DNA/단백질 서열 소프트웨어(cabot@trog.mbb.sfu.ca)에 의해 편리하게 측정할 수 있다.
아미노산 서열이 예컨대 서열번호 1 또는 2나, 또는 이의 일부와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는, BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 편리하게 결정할 수 있다. BESTFIT는 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여, 2개의 서열 간의 최상의 상동성 세그먼트를 찾아낸다.
DNAsis, ESEE, BESTFIT 또는 그외 기타 서열 정렬 프로그램을 이용하여, 특정 서열이, 예컨대 본 발명에 따른 참조 서열과 95% 동일한지를 결정하고자 하는 경우, 동일성%가 참조 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 계산되고, 기준 서열에서 뉴클레오티드 총 수에 최대 5%의 상동성 갭이 허용되도록, 파라미터를 설정한다.
만일, 본원에서, 특정 서열의 잔기들의 조합과 특정한 서열 동일성이 언급된 경우, 이러한 서열 동일성은 명시한 잔기들의 총 수에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, BT062는 링커, 본원에서는 SPDB를 통해 세포 증식 억제성 마이탄시노이드 유도체 DM4가 부착되어 있으며, CD138을 표적으로 하는 키메라 항체 nBT062를 포함하는 면역접합체이다. 도 1 및 2에 BT062를 화학적으로 나타내었다. nBT062 및 마이탄시노이드 작동자 분자를 포함하는 면역접합체는 흔히 이의 링커 및 마이탄시노이드 작동자 측면에서 특정화되며, 예컨대 nBT062-SMCC-DM1은, nBT062, SMCC(티오에스테르 결합을 포함하는 "비절단성" 링커) 및 작동자로서 DM1을 포함하는 면역접합체이다. 보다 일반적으로, nBT062 및 작동자 분자를 포함하는 면역접합체는 또한, nBT062-링커-작동자 또는 간단하게 nBT062-작동자(nBT062N, N은 본원에 기술된 임의의 작동자임)로도 기재할 수 있다(미국 특허 공개번호 20090232810).
일 구현예에서, BT062는 CD138-양성의 다발성 골수종 세포에 결합한다. 표적 세포에 내재화되거나 및/또는 면역접합체를 분비하면, DM4가 표적 분자로부터 분리되고, 그에 따라 DM4의 본래의 세포독성 효능이 복원된다. 따라서, BT062는 표적 항체 페이로드(TAP: targeted antibody payload)를 제공하게 되는데, DM4의 nBT062에 대한 기능적 부착은 이것이 CD138을 발현하는 표적 세포에 도달/내재화될 때까지 세포독성 약물은 불활성인 상태로 유지시킨다.
본원에서 논의되는 다발성 골수종 세포와 동물 모델에서의 BT062의 세포독성을 조사한 비임상 실험의 결과 데이타에 따르면, BT062는 뮤라인 모델에서 충분히 허용되는 용량에서 매우 유의한 항골수종 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
I상의 오픈-라벨, 용량 증가, 반복적인 단회 투약 실험을 재발성 또는 재발성/불응성 다발성 골수종 환자를 대상으로 수행 중에 있다.
본원에 기술된 면역접합체는, 정맥내, 비경구, 경구, 근육내, 강내(intrathecal) 또는 에어로졸 등의 임의 경로로 투여할 수 있다. 전달 방식은 원하는 효과에 따라 결정될 것이다. 당업자는 본 발명에서 특정 치료제의 최상의 투여 경로를 쉽게 알 것이다. 적합한 투여량은 투여 경로 및 처방된 치료제에 따라 결정될 것이며, 현행 치료 프로토콜에 비추어 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 면역접합체 및/또는 임의의 다른 세포독성제를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물은, 통상적인 약학 컴파운딩 기법에 따라 제조할 수 있다. 예로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa.)를 참조한다. 전형적으로, 유효량의 활성 성분을 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합할 수 있다. 담체는 투여에 적합한 조제 형태에 따른 매우 다양한 형태, 예컨대 정맥내, 경구, 비경구, 강내, 경피 또는 에어로졸 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 항암 조합물은 바람직하게는 약학 조성물 형태이거나 또는 다른 용기에 항암 조합물의 성분들이 든 키트 형태일 수 있다. 키트의 성분들은 일반적으로 서로 조합하여 투여되며, 흔히 조합된 투약 형태로 또는 별개의 투약 형태로 병용-투여된다. 또한, 이러한 키트들은, 예컨대 다른 성분들, 구성 또는 조합물을 투여하기 위한 장치, 성분들을 조합하기 위한 장치 및/또는 성분들의 사용 및 투약법에 대한 설명서를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 면역접합체 및/또는 세포독성제를 캡슐제, 환제, 정제, 로젠제, 용해제(melts), 산제, 현탁제 또는 유화제 등의 고형 또는 액체 조제물로 제형화할 수 있다. 경구 투약 형태로 조성물을 조제하는 경우, 예컨대, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향제, 보존제, 착색제, 현탁제 등의 일반적인 임의의 약학 매질을 경구 액제 조제물(예, 현탁제, 엘릭시르제 및 용액제)의 경우에 사용할 수 있거나, 또는 경구 고형 조제물(예, 산제, 캡슐제 및 정제)의 경우에는 전분, 당, 희석제, 과립제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 이의 투여 용이성으로 인해, 고형 약학 담체가 분명히 사용되는 경우, 정제 및 캡슐제가 가장 높은 경구 투약 단위 형태이다. 원하는 경우, 표준 기법에 의해 정제를 당 코팅하거나 장-코딩할 수 있다. 활성 물질은 위장관을 통과할 수 있도록 안정적이어야 한다. 필요에 따라, 안정적인 통과에 적합한 물질을 사용할 수 있는데, 문헌에 기재된 인지질 또는 렉시틴 유도체 뿐만 아니라 리포좀, 미세입자(마이크로스피어 및 마크로스피어 포함)를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위해, 면역접합체 및/또는 세포독성제를 약학 담체에 용해하고, 용액 또는 현탁액으로 투여할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 물, 염수, 포스페이트 완충 용액(PBS), 덱스트로스 용액, 프럭토스 용액, 에탄올 또는 동물성 오일, 식물성 오일 또는 합성 오일이 있다. 또한, 담체는 다른 성분, 예컨대, 보존제, 현탁제, 가용제, 완충제 등을 포함할 수 있다. 비접합성 표적 물질 및/또는 면역접합체 및/또는 세포독성제를 뇌실내 또는 강내 투여하는 경우, 이는 또한 뇌축수액에 용해할 수도 있다.
개체에게 투여되는 투여량은 개체(인간 및 인간을 제외한 동물 포함)의 체표면 당 양으로 명시할 수 있다. 투여량은 상기 개체에게 양으로, 바람직하게는 비제한적인 예로서 약 10 mg/m2, 약 20 mg/m2, 약 40 mg/m2, 약 50 mg/m2, 약 60 mg/m2, 약 80 mg/m2, 약 100 mg/m2, 약 120 mg/m2, 약 140 mg/m2, 약 150 mg/m2, 약 160 mg/m2 및 약 200mg/m2으로 투여할 수 있다. 면역접합체는 한번에 또는 일련의 치료 기간 동안에 적절하게 투여된다. 다중 투약 요법에서, 이러한 양을 매일 1회, 매주 1회, 2주에 1회로 투여할 수 있다. 1회 고투여량으로의 투약, 또는 다른 예로, 장기간의 간격에 맞춘 투여량으로 투여한 후 잠시 후에 투여되는 낮은 투여량으로의 투약이 본 발명의 바람직한 구현예이다. 바람직한 구현예에서, 투약 시기는, 2차 투약 및/또는 임의의 이후 치리 전에 충분한 시간이 지나, 앞서 투여한 투여량이 실질적으로 대사되었지만, 개체 시스템에 존재하는 면역접합체의 양이, 종양 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하도록, 개체에 따라 조절된다. 예시적으로 "단일 투약 반족(repeated single dose)" 요법은 3주마다 약 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 또는 200 mg/m2의 면역접합체 투여량을 투여하는 것이다. 다른 예로, 초기 고투약(high initial dose), 예컨대 160 mg/m2 후, 매주, 2주 또는 3주의 유지 용량, 예컨대 약 20 mg/m2을 투여할 수 있다. 다른 조합도 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 정할 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법들도 사용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 공지 기법과 분석으로 쉽게 모니터링할 수 있다. 투여량은 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 선행된 임의 요법의 코스, 환자의 임상 병력, 환자의 질병 상태, 환자의 종양 크기(load), 환자의 유전적 기질, 환자의 수반 질환, 1차 처리시의 질환 상태 및 표적 물질/면역접합체에 대한 반응, 환자가 겪는 부작용 및 주치의의 판단에 따라 변경될 수 있다.
본 발명은, 본원에 기술된 바와 같은 면역접합체를 투여하기 위한 , 일 구현예에서, 혈장 소거가 신속한 저용량 투여 요법에 관한 것이며, 다른 구현예에서는 혈장 소거가 신속하지 않은 저용량 투여 요법에 관한 것이다. 1차 요법은 일반적으로 3주 간격(주기)으로 160 mg/m2 이하, 바람직하게는 약 120 mg/m2 이하, 약 100 mg/m2 이하, 약 80 mg/m2 이하, 예컨대, 약 40 mg/m2 이하, 더 바람직하게는 약 20 mg/m2 이하, 보다 더 바람직하게는 약 10 mg/m2 이하를 제공한다. 10 mg/m2 - 120 mg/m2 범위는 평균 1일 용량 약 475 ㎍/m2 - 약 5.71 mg/m2, 또는 평균 매주 용량 약 3.33 mg/m2 - 약 40 mg/m2이다. 즉, 평균 1일 용량 약 400 ㎍/m2 - 약 5.71 mg/m2, 예컨대 약 500 ㎍/m2, 약 1 mg/m2, 약 2 mg/m2 및 약 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2은 본 발명의 일부이며, 그래서 평균 매주 용량은 약 3 mg/m2 - 약 40 mg/m2, 예컨대 약 5 mg/m2, 약 10 mg/m2, 약 15 mg/m2, 약 20 mg/m2, 약 25 mg/m2, 30 mg/m2 또는 35 mg/m2이다. 이러한 저용량 투여 스케줄은 초기 제거 단계에서 신속한 혈장 소거와 관련있으며, 즉, 투여 후 최대 2시간 동안 임의 시간에 완료된다. 다른 저용량 요법을 상기 저용량 투여 요법과 구분하는 것은 신속한 혈장 소거인데, 이것은 그 기간 동안 측정된 Cmax로 정의되며, 바람직하게는 이론적 Cmax의 55% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 또는 30% 미만이다.
저용량 투여 요법은, 보다 높은 수준에서, 보다 덜 신속한 혈장 소거, 즉 이론적 Cmax의 55% 초과, 대게는 60%, 70% 80% 또는 90%를 초과하는 혈장 소거를 수반하며, 이를 본원에서는 중도(이론적 Cmax의 50% 이상 - <80%) 또는 느린 혈장 소거(이론적 Cmax의 80% 이상)로 지칭한다. 이러한 소거에서, 놀랍게도, 혈장내 면역접합체의 상대적으로 높은 농도에도 불구하고, 이러한 투여 요법들이 여전히 허용가능한 수준의 독성이라는 것을 확인하였다. 이는, CD138을 발현하는 표적 세포, 예컨대 임의의 치료에 표적이 아닌 상피와 같은 생명에 중요한 장기의 세포 상에서의 CD138의 발현 수준도 상대적으로 CD138가 높다는 점 때문이다(CD138 항체인 BB4를 이용한 면역조직화학 분석에서, 상기에 대한 이 항체의 반응성은 MM 환자의 형질세포의 것과 일치되는 것으로 나타남(미국 특허 공개번호 20070183971)). 면역조직화학적 분석에서 동일한 수치를 나타낸(예, 상기 예에서와 같이 +3), 표적 세포와 비표적 세포 상의 CD138의 발현 수준을 본원에서는 상응하는 발현 수준(comparable expression level)이라고 지칭하며, 이는 본 발명의 일부이다. 다른 구현예에서, 표적 세포 상에서의 발현 수준은 실제적으로 일관되게 상피의 수준 보다 낮았다(예, +1, +2 vs. 상피의 경우 +3). 일부 종양 표적 세포들은 혼성된 발현 수준, 예컨대, 일부 세포는 +2의 발현 수준을 보인 반면 일부는 +3의 발현 수준을 보였다. 예를 들어 평균 수의 세포(예, 100개의 임의 샘플링한 세포)를, 이들 대상 종양 표적 세포가 상피와 필적되거나 또는 미만의 발현 수준을 가지는 정의에 포함되는 지를 결정한다. 이들 치료 요법들은, 통상적으로, 주어진 3주 간격(주기)으로 120 mg/m2 초과 내지 200 mg/m2 미만이며, 이는 1일 용량 약 5.71 mg/m2 - 약 9.52 mg/m2 또는 평균 매주 용량 약 40 mg/m2 - 약 66,67 mg/ m2로 변환된다.
환자 001-006의 경우, 이 환자는 BT062 투여 효능을 반영하는, 치료 종결 후에만 질환이 진행되는 경향이 뚜렷하게 나타났다(도 25).
단회 투약 반복은, 투여한 다음 투여하는 것이 앞선 투여와는 독립적으로 것으로 간주되는, 투여의 배열을 의미한다. 즉, 본원에서, 개체 혈중 면역접합체의 수준은 각 투여 후에 동일한 것으로 간주될 수 있다. 각 시기에 면역접합체가 투여되며, 처음과 동량의 면역접합체가 혈중에 존재되는 것으로 예상된다.
단회 투약 반복에서 "단회 투약"의 투여 간격은 BT062의 경우에, 면역접합체의 이소형 IgG4의 이론적으로 계산된 반감기에 따라 정해진다.
일반적으로, 치료 항체의 반감기는 주로 항체 특징/이의 구조 특징(예, Fc 수용체에 대한 결합성) 및 표적에 좌우된다. 예컨대, Fc 파트의 신생(neonatal) 수용체 FcRn에 대한 결합 친화성은 반감기에 영향을 미친다. 엔도좀내에서 FcRn에 결합함으로써, 항체는 리소좀 분해로부터 벗어나 다시 순환되어 반감기가 연장된다. IgG4의 경우, 반감기는 15.6 (+/- 4.5)일인 것으로 보고되었다(Alyanakian et al., 2003; Salfeld et al., 2007). 본원에서 참조한 실험에서, "단회 투약 반복"은 3주의 간격으로 투여하는 것을 선택하였다. 그러나, 약 3주, 약 4주, 또한 약 5주 또는 약 6주도 단회 투약 반복의 또다른 간격이다. 3주에서 +/- 96시간과, 4주 내지 6주에서 +/- 120 시간이라는 문맥에서 "약"도 포함된다.
치료법의 진행은 공지의 기법 및 분석으로 쉽게 모니터링한다. 투여량은 특히 이것이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 것인지, 임의의 이전 치료법의 코스, 환자의 임상적인 병력, 환자의 질병 상태, 환자의 종양 크기, 환자의 유전적 소인, 환자의 수반되는 질환들, 1차 치료시의 질환 등급 및 표적 물질/면역접합체에 대한 반응, 환자가 경험한 부작용 및 주치의의 판단에 따라 변경될 수 있다.
저용량 요법의 이점은 매우 많다. 그러나, 가장 가능성있는 중대한 이점은 부작용 위험성의 최소화이다. 면역접합체는 일반적으로 표적 세포와 정상 세포를 세심하게 구별할 수 있어, 대부분의 기존 화학치료 약물 보다 독성 부작용이 낮지만, 대다수의 면역접합체들은 여전히 부작용을 완벽하게 없애지 못하였다. 월등한 표적성에도 불구하고, 대상 항원은 일반적으로 치료 동안에 파괴되면 부작용을 유발할 수 있는 비-암 세포 상에서도 발현된다. CD138의 경우, 항원은 특히 상피 세포 상에서 발현된다. 또한, 면역접합체는 표적 세포에서 또는 내에서 가공과 무관한 체내에서 가공될 수 있으며, 작동자 분자의 일정 비율은 표적 세포로부터 멀리 떨어진 위치에서 방출되어 독성 부작용을 유도하게 될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 면역접합체는 저용량에서 유효하지만 임상적으로 허용가능한 수준의 독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 본 발명에서 저용량은 최대 - 200 mg/m2의 투여량을 의미한다. 최대 적어도 120 mg/m2의 투여량, 그러나 임의 경우에서는 160 mg/m2 미만의 투여량에서, 본 발명의 테스트한 면역접합체들은 인간 개체에서 신속한 혈장 소거를 나타내었다. 표 7과 8은 소거 관찰 결과를 나타낸다.
단회 투약/단회 투약 반복으로 BT062(사이클 1 및 사이클 4)를 투여받은 환자에서 수득한 혈장에서의, 주입 완료 후 혈장 농도 및 BT062의 유효 Cmax 평균값. 반복 투약은 21일 주기. Cmax 값은 주입 후 0시간 내지 2시간에 수득하였다. 투여 사이클: 사이클 1: 1일, 사이클 2: 22일; 사이클 3: 43일, 사이클 4: 64일 등.
BT062 투여량
(mg/m 2 ) 		BT062 (㎍/ml)의 인간 혈장 농도
이론적 cmax 유효 cmax
(사이클 1) 평균 (최소; 최고) 		유효 cmax (사이클 4) 평균(최소; 최고)
10 7 1.11 n.a.
20 14 2.9
(1.66; 4.44)		 7.06
(6.79; 7.34)
40 27 4.31
(0.97; 9.86)		 2.51
(1.02; 3.68)
80 54 18.8
(13.4; 23.6)		 14.2
(7.4; 21)
120 81 21.4
(15.1; 28.7)		 n.a.
160 109 81.2
(73.7; 85.5)		 77.4
200 136 82.0
(68.0; 102.4)		 n.a.
n.a. 데이타 입수 불가
단회 투약/단회 투약 반복으로 BT062(사이클 1 및 사이클 4)를 투여받은 환자에서 수득한 혈장에서의, BT062의 유효 Cmax 평균값. 반복 투약은 21일 주기. 최고값은 주입 후 첫 2시간 이내에 수득되었다. Cmax 값은 주입 후 0시간 내지 2시간에 수득하였다. 유효 Cmax는 이론적으로 계산한 Camx의 %이다. 투여 사이클: 사이클 1: 1일, 사이클 2: 22일; 사이클 3: 43일, 사이클 4: 64일 등.
BT062 투여량 (mg/m 2 ) BT062 (㎍/ml)의 인간 혈장내 농도
이론 cmax 유효 cmax
(사이클 1) 		이론 cmax (n)의 % 유효 cmax
(사이클 4) 		이론
cmax (n)의 %
10 7 1.1 15% (3) n.a. n.a.
20 14 2.9 20% (4) 7.06 49% (2)
40 27 4.31 16% (3) 2.51 9% (3)
80 54 18.8 34% (3) 14.2 26% (2)
120 81 21.4 26.5% (3) n.a. n.a.
160 109 81.2 74.5% (4) 77.4 71% (1)
200 136 82.0 60% (3) n.a. n.a
n.a. 데이타 입수 불가
n: 환자의 수
이론 cmax는 하기 추정 파라미터에 따라 계산하였다:
환자의 체표면적 1.9 m2
환자의 체중 70 Kg
환자 40 ml/kg
((투여된 용량 x 표면적) / 체중 ) / 혈장 부피
치료받은 인간 개체의 혈장에서의 BT062의 반감기는 시노몰구스 원숭이(일)와 생체외 인간 혈장(14일)에서 관찰되는 혈장 반감기 보다 현저하게 낮은 것으로 입증되었지만, 면역접합체는 여전히 인간 개체에, 심지어 20 mg/m2 만큼이나 적게 투여하였을 때에도 유효한 것으로 나타났다. 이러한 사실은, 촉진된 종양 표적성과 종양 세포 결합성을 시사하며, 이로써 효능이 증가된다. 본 발명의 면역접합체의 이러한 특성은 IgG4 이소형의 항체/표적 분자로 인한 것임에 틀림없는 것으로 보인다.
전술한 바와 같이, 치료받은 MM 환자의 혈장에서의 특이한 신속한 소거는, 투여량 수치 최대 120 mg/m2에서 초기 제거기(주입하는 동안과 주입 후 약 0 내지 2시간)와 이후 일반적으로 정상 종료 제거기에서 관찰된 반면, 보다 전형적인 소거 프로파일은 환자 4명 모두에서 160 mg/m2 및 200 mg/m2 용량 (환자 3명)에서 관찰되었지만, 여전히 소거는 이론 Cmax 값 보다 낮았다. 또한, 초기 제거기에 신속한 혈장 소거를 보인 투여 요법에서(예, 20, 40, 80 및 120 mg/m2), 초기 제거기의 신속한 혈장 소거 뿐만 아니라, 단회 투약 반복 후 50% 이상 뇨 M-단백질 감소로 그 자신을 드러내는 반응 등의, 반응(뇨 M-단백질의 감소)도 관찰되었다(도 24).
도 17은 40 mg/m2 - 120 mg/m2의 투여량 범위에서의 신속한 혈장 소거와, 본원에 기술된 더 높은 용량 160 mg/m2에서는 이론적 수치와 근접한 혈장 소거를 보임을 나타낸 것이다. 투여량 20 mg/m2에서 관찰되는 혈장 소거에 대해서는 도 27을 참조한다. 도 18은 BT062 혈장 프로파일을 비슷한 용량으로 처리한 원숭이와 비교한 것이다. 비교로, 저용량에서의 신속한 혈장 소거는 이용가능한 동물 모델로부터 유추 불가할 수 있으며, 인간에게 특이적인 것으로 나타난다는 것이 명확해졌다. 도 22는 신속한 혈장 소거가 가용성 CD138에 의해 야기되는 완충 효과로 인한 것일 수 없음을 나타낸 것이다. 도 19는 BT062의 Cmax 측정값을 Cmax 이론 수치와 비교한 것이다.
다른 면역접합체의 투여 계획 대비 상대적으로 낮은 용량이지만, 더 높은 용량, 예컨대 160 mg/m2에서, 말기 소거 프로파일은 이론적 Cmax 값에 근접한 정상에 더 가까웠다. 그러나, 혈청내 FLC의 신속한 감소는, 단지 한번 투여한 후에 관찰할 수 있었으며, 2차, 3차 및 4차 투여 후 부분 반응으로 드러났다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 단회 투약 반복 요법 등의 저용량 투여 요법에 관한 것으로, 반응은 바람직하게는 적어도 MR, 바람직하게는 VGPR, CR, sCR 또는 PR에서 관찰된다.
또한, 본 발명은, 단회 투약 반복 투여 요법 등의 저용량 치료 요법에 관한 것으로, 이때 안정적인 질환은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 주 또는 그 이상 지속되는, 다중 치료 사이클 동안에 달성된다.
유사체 및 유도체
세포독성제 등의 치료제 분야의 당업자는, 본원에 기술된 물질들이 출발 화합물의 특이성 및/또는 활성이 제조되는 화합물에서도 여전히 유지되는 방식으로 변형할 수 있음은, 쉽게 이해할 것이다. 또한, 당업자는, 이들 화합물들 대부분이 본원에 기술되 치료제 대신 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 치료제는 본원에 기술되 화합물의 유사체 및 유도체를 포함한다.
면역접합체의 사용에 대한 예시를 위해, 일부 비제한적인 용도를 이제 제공하며 설명한다.
재료 및 방법
키메라 항체의 제조(cB-B4: nBT062)
B-B4
기존에 특정화된 뮤라인 항체 B-B4(Wijdenes et al., Br J Haematol., 94 (1996), 318)를 본 실험들에 사용하였다.
B-B4 및 cB-B4 / nBT062의 클로닝 및 발현
표준적인 재조합 DNA 기법들은 텍스트북, 예컨대 J.　Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA에 상세하게 기술되거나 또는 키트를 사용하는 경우에는 제조사의 지침서에 권고된 바와 같이 수행하였다. 마우스 가변 영역의 PCR-클로닝과 수정은 표준 PCR 방법으로 수행하였다. 프라이머는 각 사용 결과 섹션에 나타내었다.
cB-B4 / nBT062의 발현
10% FCS, 580　㎍/ml L-글루타민, 50　Units/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양한, 기하급수적으로 증식 중인 COS 세포를 트립신 처리 및 원심분리에 의해 수확하고, PBS로 헹구었다. 세포를 최종 농도 1x107 cells/ml로 PBS에 재현탁하였다. COS 세포 현탁액 700 ㎕를 Gene Pulser 큐벳에 옮기고, 중쇄 및 카파 경쇄 발현 벡터 DNA(각각 10 ㎍ 또는 슈퍼벡터 13 ㎍)와 혼합하였다. 세포에 Bio-Rad Gene Pulser를 이용하여 1900 V 및 25 μF로 전기충격을 가하였다. 형질전환된 세포를, 10% 감마-글루불린 무첨가 FBS, 580 ㎍/ml L-글루타민, 50 Units/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 72시간 배양한 후, 항체가 함유된 세포 배양 상층액을 회수하였다.
cB-B4 / nBT062의 발현 수준을 측정하기 위한 포착 ELISA
PBS로 희석한 0.4 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG 항체 100 ㎕으로, 96 웰 플레이트를 피복하였다(4℃, 밤새). 플레이트를 200 ㎕/well 세정 완충액(PBS+0.1% Tween-20)으로 3번 세정하였다. 그런 후, 웰을 PBS 중의 0.2% BSA, 0.02% Tween-20로 블록킹하고, 분비된 항체가 함유된 세포배양 상층액 200 ㎕을 첨가하였다(37℃에서 1시간 인큐베이션). 웰을 세정 완충액으로 6번 세정한 후, 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 접합체를 이용하여 결합된 항체를 검출하였다.
세포 배양 상층액에서의 cB-B4 / nBT062의 정제
Protein A ImmunoPure Plus kit (Pierce, Rockford, IL)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여, 형질전환된 CDS 7 세포의 상층액으로부터 cB-B4 항체를 정제하였다.
cB-B4 결합 및 경쟁적 분석
CD138에 대한 B-B4 및 cB-B4의 결합 활성 분석은, Diaclone (Besancon, France) sCD138 키트를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 수행하였고, 결과 섹션에 기술된 변화를 검토하였다.
RNA 준비 및 cDNA 합성
하이브리도마 B-B4 세포를 배양하고, Qiagen Midi 키트(Hilden, Germany)로 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 아머샴 바이오사이언스(Piscataway, NJ)의 제1 가닥 합성 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 약 5 ㎍의 B-B4 RNA로부터 역전사를 수행하여, B-B4 cDNA를 합성하였다.
B-B4 면역글로불린 cDNA 클로닝
면역글로불린 중쇄(IgH) cDNA를, IgH 프라이머 MHV7 (5'-ATGG-GCATC-AAGATGG-AGTCA-CAGA-CCC-AGG-3') [서열번호 3] 및 IgG1 불변 영역 프라이머 MHCG1 (5'-CAG-TGGATA-GACAGAT-GGG-GG-3') [서열번호 4]를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 마찬가지로, 면역글로불린 경쇄(IgL)를, 3가지 다른 Igκ 프라이머들 MKV2 (5'-ATG-GAGACA-GACA-CACTC-CTGC-TATGGG-TG-3') [서열번호 5], MKV4 (5'-ATG-AGGGCCC-CTGCTCA-GTTTTTT-GGCT-TCTTG-3') [서열번호 6] 및 MKV9 (5'-ATGG-TATCCAC-ACCTCA-GTTC-CTTG-3') [서열번호 7]를 각각 프라이머 MKC (5'-ACTG-GATGGTGGGA-AGATGG-3') [서열번호 8]과 조합 사용하여, 증폭하였다. 모든 증폭 산물들을 TOPO-TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 제조사의 지침에 따라 사용하여, pCR2.1-TOPO 벡터에 직접 삽입하였다.
상기 연결한 pCR2.1 벡터 구조체로 형질전환된 E.　coli TOP10 박테리아(Invitrogen)를 LB-암피실린-Xgal 아가 플레이트에서 선별하였다. 하나의 백색 콜로니로 소규모 배양을 수행하고, 밤새 배양한 다음, QIAprep Spin Miniprep 키트를 제조사의 지침에 따라 사용하여 플라스미드를 분리하였다.
cDNA 서열 결정
BigDye 터미네이션 v3.0 사이클 시퀀싱 레디 반응 키트(ABI, Foster City, CA)를 이용하여 플라스미드의 서열을 분석하였다. 각 선별한 플라스미드는 GeneAmp9600 PCR 장치에서 프라이머 1210 및 1233을 이용한 사이클링을 수행하여, 양쪽 방향으로 서열 분석하였다. 전기영동 서열 분석을 ABI 캐필러리 시퀀서에서 수행하였다.
RT-PCR의 전체 사이클, 클로닝 및 DNA 서열 분석을 반복 실시하여, 각 면역글로불린 쇄에 대한 3가지의 완전히 독립적인 서열 정보 세트를 수득하였다.
B-B4 Vκ DNA 서열
제1 가닥 합성을 3번의 독립적인 반응으로 수행하였다. 프라이머 MKC 및 MKV2(서열은 상기에 나타냄)로 제조한 PCR 산물을 제조사의 지침에 따라 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 각각의 독립적인 RT-PCR 반응으로부터 수득한 클론을 양방향으로 서열분석하였다. MKV2-프라이머로 제조한 산물의 서열이, MOPC-21, SP2 및 Ag8 (Carroll et al., Mol Immunol., 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157)과 같은 골수종 융합 파트너로부터 기원하는 스테릴(sterile) 카파 전사체와 매우 비슷하였고, 그래서 이를 무시하였다.
MKV4 및 MKV9 프라이머를 MKC와 함께 사용한 PCR 산물들은 서로 비슷하였지만, 리더 서열 프라이머 내부의 워블(wobble) 위치만 달랐다.
B-B4 VH DNA 서열
3번의 독립적인 반응으로 제1 가닥을 합성하였고, PCR 산물을 클로닝하고, 각각의 제1 가닥 산물의 서열을 분석하였다. 5개의 클론들에서, 각각의 제1 가닥을 서열분석하였다.
키메라 cB-B4 발현 벡터의 구축
키메라 발현 벡터의 구축에는, BamHI 제한효소 부위 및 Kozak 서열이 선행되는, VH 및 Vκ에 적합한 리더 서열의 부가를 수반한다. Kozak 보존 부위 서열(consensus sequence)은 가변 영역 서열의 효율적인 번역에 중요하다. 이것은 리보솜이 번역을 시작할 수 있는 정확한 AUG 코돈을 명시하고 있으며, 대부분의 중요한 하나의 염기는 AUG 시작에서 상류 -3 위치에 있는 아데닌(또는 드물게는 구아닌)이다. 리더 서열은 Kabat 데이타베이스(Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991)에서 가장 비슷한 서열로 선택한다. 이러한 부가 서열은, 정방향(For) 프라이머들(둘다 5'-AG-AGAAG-CTTGC-CGCCACC-AT-GAT-T-GCCTCTG-CTCAGTT-CCTTGGT-CTCC-3' [서열번호 9] 서열을 가짐; 제한효소 부위는 밑줄친 부분이고, Kozak 서열은 굵은 체로 표시됨) 내부에 코딩된다. 또한, 키메라 발현 벡터의 구축에는, B-B4의 J 영역의 3' 말단과 인접하는, 최대 천연 ApaI 제한효소 부위까지, 인간 감마 불변 영역의 5' 단편 도입을 포함하며, 경쇄의 경우에는, 스플라이스 공여부위와 HindIII 부위의 부가를 포함한다. 상기 스플라이스 공여부위의 서열은 적절한 불변 영역에 가변 영역을 인-프래임으로 정확하게 부착하고, 따라서 V:C 인트론을 스플라이싱하는데 중요하다. 카파 인트론 + CK는 B-B4 Vκ 서열의 하류 발현 구조체에 코딩된다. 마찬가지로, 감마-4 CH는 B-B4 VH 서열의 하류 발현 구조체에 코딩된다.
B-B4 VH 및 Vκ 유전자들을 먼저 조심스럽게 분석하여, 임의의 원하지 않는 스플라이스 공여 부위, 스플라이스 수여 부위(splice acceptor), Kozak 서열과 기능성 전체 항체의 서브클로닝 및/또는 발현을 나중에 방해하게 되는 임의의 기타 서브-클로닝 제한효소 부위의 존재를 확인하였다. Vκ 서열에서 원하지 않는 HindIII 부위가 발견되었으며, 이는 아미노산 서열에 변화를 주지않으면서 PCR을 통한 부위-특이적인 돌연변이에 의해 반드시 제거하여야 한다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머들 BT03 (5'-CAACA-GTA-TAGTA-AGCTC-CCTC-GGACG-TTCG-GTGG-3') [서열번호 10] 및 BT04 (5'-CC-ACC-GAACG-TCCGA-GGGAGC-TTACT-ATACTG-TTG-3') [서열번호 11]를 사용하였고, Stratagene (La Jolla, CA)의 신속변경 돌연변이유발 키트 프로토콜에 따라 돌연변이 유발을 수행하였다.
카파 쇄 키메라 제조용 프라이머
PCR 프라이머 서열과 독립적인, 명백한 B-B4 Vκ 리더 서열을 Kabat 데이타베이스에서 뮤라인 리더 서열과 정렬하였다. B-B4 VH 리더와 매칭율이 가장 높은 VK-10 ARS-A(Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085)이었다. 이 리더 서열은 시그널P 알고리즘에 의해 정확하게 절단되는 것으로 추정된다(Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). 프라이머 CBB4Kfor (상기에 언급됨) 및 g2258(5'-CGCG-GGATC-CACTCA-CGTTTGA-TTTCCAGC-TTGGT-GCCTCC-3' [서열번호 12]; 제한효소 부위는 밑줄 침)을, 이 전체 리더 B-B4 Vκ 영역과, pKN100 발현 벡터에 클로닝하기 위한 HindIII 및 BamHI 말단 제한효소 부위가 포함된, PCR 산물을 제조하도록 설계하였다. 정방향 프라이머, CBB4K는 HindIII 제한효소 부위, Kozak 번역 개시부 및 VK-10 ARS-A 리더 서열을 도입하였다. 역방향 프라이머 g2258은 스플라이스 공여 부위와 BamHI 제한효소 부위를 도입시킨다. 제조되는 단편은 pKN100의 HindIII/BamHI 제한효소 부위에 클로닝하였다.
중쇄 키메라 제조용 프라이머
PCR 프라이머 서열과 무관한, 분명한 B-B4 VH 리더 서열을 Kabat 데이타베이스에서 뮤라인 리더 서열과 정렬하였다. B-B4 VK 리더와 매칭율이 가장 높은 VH17-1A(Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214)이었다. 이 리더 서열은 시그널P 알고리즘에 의해 정확하게 절단되는 것으로 추정된다. 프라이머 cBB4Hfor(상기에서 언급됨) 및 g22949 (5'-CGAT-GGGCCCT-TGGTG-GAGGC-TGAGGA-GACGGTG-ACTGA-GGTTCC-3' [서열번호 13]; 제한효소 부위는 밑줄 침)을, VH17-1A 리더, B-B4 VH 영역과, pG4D200 발현 벡터에 클로닝하기 위한 HindIII 및 ApaI 말단 제한효소 부위가 포함된, PCR 산물을 제조하도록 설계하였다. 정방향 프라이머 cBBHFor는 HindIII 제한효소 부위, Kozak 번역 개시부 및 VH17-1A 리더 서열을 도입시킨다. 역방향 프라이머 g22949는 감마4 C 영역의 5' 말단과 천연 ApaI 제한효소 부위를 도입시킨다. 제조되는 단편은 pG4D200의 HindIII/ApaI 제한효소 부위에 클로닝하여, 벡터 pG4D200cBB4를 제조하였다.
cBB4 항체 생산
COS 7 세포 바이얼 1개를 녹이고, 10% Fetal clone I 혈청과 항생제가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 1주일 후, 세포(0.7 ml, 107 세포/ml)에 pG4D200cBB4 + pKN100cBB4(각각 DNA 10 ㎍)을 전기충격으로 도입하거나, DNA 없이 전기충격을 가하였다. 그런 후, 세포를 8 ml 배양 배지에 도말하여, 4일간 배양하였다. 전기충격은 수차례 반복하였다.
키메라 항체의 검출
샌드위치 ELISA를 사용하여, COD 7 상층액내 항체 농도를 측정하였다. 일시적으로 형질전환된 COS 7 세포에서 약 6956 ng/ml 항체가 분비되었다(데이타 미기재).
cB-B4의 결합 활성
COS 7 배양 상층액의 cB-B4의 결합 활성을 분석하기 위해, Diaclone sCD138 키트, 고상 샌드위치 ELISA를 사용하였다. sCD138에 특이적인 단일클론 항체를 제공되는 마이크로타이터 스트립의 웰에 코팅하였다. 1차 인큐베이션하는 동안에, sCD138 및 바이오틴화된 B-B4 (bio-B-B4) 항체를 비표지 테스트 항체(B-B4 또는 cB-B4)의 연속 희석물과 함께 동시에 인큐베이션하였다.
이 분석에서 bio-B-B4의 농도를, 낮은 농도의 비표지 항체와의 경쟁을 위해, 낮추었다(그렇지 않으면, COS 7 세포 배양 상층물내 cB-B4 농도는 충분한 경쟁을 형성하기에는 매우 낮았다). 이러한 분석의 결과로, 2가지 항체들이 CD138에 동일한 특이성을 가지는 것으로 확인되었다(데이타 미기재).
cB-B4의 정제
키메라 B-B4를, 단백질 A 이뮤노퓨어 플러스 키트(Pierce)를 제조사의 권고에 따라 수행하여 COS 7 세포 상층액으로부터 정제하였다(데이타 미기재).
K D -결정: 비교 nBT062/ BB4
가용성 CD138의 정제
U-266 세포 배양 상층액으로부터 가용성 CD138 항원을 B-B4와 커플링된 1 ml "HiTrap NHS-활성화된 HP" 컬럼을 이용한 FPLC에 의해 정제하였다. 세포 배양 상층액을 PBS 완충액(pH7.4) 중에 컬럼에 주입하고, 이후 CD138 항원 상에서 50 mM 트리에틸아민(pH11)으로 2 mL 분획으로 용출시켰다. 용출된 CD138을 즉시 375 ㎕ 1 M Tris-HCl, pH 3으로 중화하여, 구조 및/또는 기능적 손상을 방지하였다.
CD138 바이오틴화
설포-NHS-LC (Pierce)를 이용하여 CD138을 표지하였다. NHS-활성화된 바이오틴은 pH 7-9에서 라이신 잔기와 같이 1급 아미노기와 효과적으로 반응하여, 안정적인 결합을 형성한다.
CD138의 바이오틴화를 위해, CD138 50 ㎕을 단백질 탈염 스핀 컬럼(Pierce)을 이용하여 탈염하였다. 바이오틴화 시약(EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce)을 빙냉한 탈이온수에 최종 농도 0.5 mg/mL로 용해하였다. 바이오틴화 시약과 포착 용액을 포착 시약 보다 바이오틴화 시약이 12배 몰 높은 비율로 혼합하고(50 pmol CD138 : 600 pmol 바이오틴화 시약), 바이얼을 서서히 흔들면서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 바이오틴화 시약을 단백질 탈염 컬럼을 이용하여 제거하였다.
bCD138의 고정
BIACORE 분석에 사용되는 센서칩(SENSOR CHIP SA, BIACORE AB)을, BIACORE 시스템에서 상호작용 분석에서 바이오틴화된 분자에 결합하도록 제작하였다. 표면은, 스트렙타비딘이 미리 고정되어 있는 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 구성되며, 바이오틴화된 리간드의 고-친화성 포착용으로 준비하였다. bCD138의 고정화는, 매뉴얼 주입에 의해 유속 10　㎕/min으로 센서칩 상에서 수행하였다. 칩의 표면에, 50 mM NaOH 중의 1 M NaCl을 1분간 계속 주입하는 과정을 3번 수행하였다. 그 후, 바이오틴화된 CD138을 1분간 주입하였다.
K D - BIACORE를 이용한 여러가지 항체들의 결정
BIACORE C의 소프트웨어는, 오직 특정 세팅만 바꿀 수 있는 여러가지 실험들에 대한 미리 정해진 마스크, 이른바 "위저드"를 이용한다. BIACORE C는 본래 농도를 측정하기 위해 개발되었기 때문에, 친화성 측정을 수행하기 위해 설계된 위저드는 없다. 그러나, 적합한 세팅으로, "비특이적 결합" 위저드를 사용하여, 친화성 비율 상수를 측정할 수 있으며, 따라서 이를 KD-수치로 사용하였다. 이 위저드로, 2개의 플로우 셀을 측정하였고, BIACORE 런닝 완충액으로 "재생 1"을 수행함으로써, 해리 상을 90s로 설정하였다. "재생 2"는 실제 재생과 등가로, 10 mM 글리신-HCl pH 2.5로 수행하였다. 이 단계 후, 리간드 CD138을 다시 결합 경쟁적인 상태로 두었다. 전체 과정에서, HBS-EP를 런닝 완충액 및 희석 완충액으로서 사용하였다. 여러가지 항체(~150 kDa)의 CD138 결합을 측정하기 위해, 조합 및 해리를 여러가지 농도(100, 50, 25 12.5, 6.25 및 3.13 nM)에서 분석하였다. 해리 평형 상수는, 속도 상수 ka 및 kd를 계산하여 정하였다. 그 후에, 분석물의 KD-수치를 BIAevaluation 소프트웨어로 kd 및 ka 지수로 계산하였다. 결과는 표 9에 나타낸다.
nBT062 및 B-B4의 KD 수치의 비교 분석. 평균 KD 수치에 대한 표준 편차를 나타내었다.
항체 친화성
KD (nM) 평균 KD (nM)
nBT062 1.4
1.4
1.5		 1.4 +/- 0.06
B-B4 1.7
1.7
1.6		 1.6 +/- 0.06
nBT062-SPDB-DM4 1.9
1.9
1.9		 1.9 +/- 0.00
B-B4-SPP-DM1 2.6
2.7
2.6		 2.6 +/- 0.06
고찰
각 항체에 대한 평균 KD 수치를 3번의 독립적인 실험들에서 계산하였다. 그 결과, nBT062는 모든 측정 결과들에서 B-B4에 비해 KD 수치가 약간 감소된 것으로 나타났다(평균 KD 수치는 각각 1.4 및 1.6 nM임).
면역접합체의 제조
nBT062-DM1 및 huC242-DM1
기존에 Chari (Chari et al., Cancer Res. 1 (1992), 127)에 언급된 바와 같이, 티올-함유성 마이탄시노이드 DM1을 미생물 발효 산물 안사미톡신 P-3으로부터 합성하였다. 인간화 C242 (huC242)의 제조(Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) 방법은 종래에 개시되어 있다. 항체-약물 접합체를, 종래 방법과 같이 제조하였다(Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). 항체 분자 당 평균 3.5개의 DM1 분자가 연결되었다.
nBT062-DM4
BT062는 링커를 통한 이황화 결합을 통해 nBT062 키메라 단일클론 항체에 연결된, 세포독성 마이탄시노이드 약물, DM4로 구성된다. 마이탄시노이드는 튜불린 중합과 마이크로튜불 조합을 저해하는 세포 분열 저해제이다(Remillard et al., Science 189 (1977), 1002). BT062 (nBT062-DM4)은 도 1 및 2에 화학적 및 도식적으로 나타낸다.
DM4 합성
DM4는 잘 알려져 있는 유도체 마이탄시놀로부터 제조된다(Kupchan et al., J. Med. Chem., 21 (1978), 31). 마이탄시놀은, 리튬 트리메톡시알루미늄 하이드라이드를 이용한 미생물 발효 산물 안사미톡신 P3의 에스테르 모이어티의 환원적 절단에 의해 제조된다(도 3).
DM4는 디사이클로헥실카보디미드(DCC) 및 아연 클로라이드의 존재 하에, N-메틸-N-(4-메틸디티오펜타노일)-L-알라닌(DM4 측쇄)로 마이탄시놀을 아실화하여, 이황화물-함유성 마이탄시노이드 DM4-SMe를 제공함으로써, 합성한다. DM4-SMe는 디티오트레이톨(DTT)로 환원시켜, 원하는 티올-함유성 마이탄시노이드 DM4를 제공한다(DM4 프로세스 플로우 다이어그램은 도 4를 참조함).
면역접합체 BT062
nBT062-DM4의 제조 과정은 도 5에 개략적으로 나타낸다. nBT062 항체를, N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부티레이트(SPDB 링커)로 변형시켜, 디티오피리딜기를 도입한다. DM4를 상기 변형된 항체와 디티오피리딜기의 당량 보다 높은 농도로 혼합한다. DM4의 티올기와 링커를 통해 항체에 도입된 디티오피리딜기 간의 이황화 교환 반응에 의해 BT062 접합체를 만든다. 크로마토그래피 및 정용여과에 의한 정제를 통해, 저분자량 반응물(DM4)와 반응 산물(티오피리딘), 뿐만 아니라 접합된 항체의 응집물을 제거하여, 벌크 약물 성분을 제조한다.
FACS 분석 및 WST 세포독성 분석
FACS 분석
OPM-2 세포는 CD138을 고도로 발현하는 것으로 나타난 형질세포 백혈병 세포주이다. OPM-2 세포를 여러가지 농도(도 6에 기재된 농도)로 nBT062, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 nBT062-SMCC-DM1과 인큐베이션하였다. 세포를 헹구고, 형광-표지된 2차 항체를 이용한 FACS 분석으로 CD138-결합 항체 또는 접합체를 검출하였다. 이 실험에서, 평균 형광 측정값을 항체 농도에 대해 그래프를 작성하였다.
세포 생존 분석
CD138+ MOLP-8 세포를 바닥이 평평한 플레이트에 웰당 세포 3000개로 접종하였다. CD138- BJAB 대조군 세포는 웰당 세포 1000개로 접종하였다. 세포에 다양한 농도로(도 7에 기재된 농도) nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 nBT062-SMCC-DM1을 5일간 처리하였다. WST 시약(수용성 테트라졸륨 염, ROCHE)을 첨가하여, 제조사(ROCHE)의 지침에 따라 세포 생존성을 측정하였다. 시약은 MOLP-8 세포에서 7.5시간 인큐베이션하고, BJAB 세포에서는 2시간 인큐베이션하였다. 생존 세포의 분획은, 표준 과정을 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 측정되는 광학 밀도를 기초로 계산하였다.
고찰
FACS에 의해 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 또는 nBT062의 결합을 분석하였다. 표적 세포로서 CD138+ OPM-2를 nBT062 또는 면역접합체와 인큐베이션하였고, 세포-결합된 분자를 형광-표지된 2차 항체로 검출하였다. 도 6에서, 세포 결합된 항체의 양의 측정 값으로서의 평균 형광을 여러가지 항체 또는 접합체 농도에 대해 그래프를 작성하였다. 그 결과, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SMCC-DM1이 매우 비슷한 결합 특징을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 그 결과, 비접합 항체의 결합 특징들은 접합된 독소에 의해 영향을 받지 않는다는 것이, 강하게 시사되었다.
세포 생존성 분석에서, CD138+ MOLP-8 표적 세포 및 CD138- BJAB B-림프모구종(lymphoblastoma) 대조군 세포에 대한 항체의 세포독성 활성을 분석하였다. 상기 2종의 세포주 모두 바닥이 평평한 플레이트에 접종하고, 면역접합체를 증가된 농도로 첨가하여 인큐베이션하였다. 비접합 항체를 대조군으로 사용하였다. 세포 생존성을 측정하기 위해, WST 시약을 이용함으로써 면역접합체를 첨가한지 5일째에 세포독성 활성을 분석하였다. 도 7(A)-(C)에서, 비히클 대조군으로 처리한 대조군 세포 대비 생존 세포의 비를 면역접합체 농도 증가에 따라 그래프로 작성하였다. 그 결과, MOLP-8 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SMCC-DM1의 세포독성 활성은 매우 비슷한 것으로 나타났다. 예상한 것처럼, CD138- BJAB 대조군 세포는 면역접합체에 의해 사멸되지 않았으며, 이는 면역접합체 모두 CD138에 대한 세포 특이적인 결합을 통해 작용함을 의미한다. 경쟁적인 실험에서, MOLP-8 세포를 더 많은 몰량의 비접합 nBT062와 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션은 nBT062-SPDB-DM4의 세포독성을 실질적으로 차단시켜, 세포 표면상에서의 CD138에 대한 특이적인 결합을 통해 면역접합체가 세포를 사멸시킨다는 또다른 증거를 제공해준다(도 7 (D)).
이종이식 마우스 실험
B-B4 항체, nBT062의 인간 키메라 버전의 항체-마이탄시노이드 접합체의 항종양 활성에 대한 CD138 표적화의 중요성을 평가하기 위해, 이종 마우스 실험을 수행하였다. 2가지 버전의 nBT062-마이탄시노이드 접합체를 제조하였으며, 이는 이황화 결합의 화학적 안정성에 차이가 있을 수 있다(nBT062-SPP-DM1 및nBT062-SPDB-DM4). 이들 항체-약물 접합체의 항종양 활성을 B-B4-SPP-DM1 접합체(뮤라인 모 항체 포함), 뿐만 아니라 비접합된 유리형 마이탄시노이드(DM4), 천연 비변형 nBT062 항체 및 비-표적성(무관련) IgG1-마이탄시노이드 접합체의 활성과 비교하였다. 중증의 조합형 면역결핍(SCID) 마우스에서 인간 다발성 골수종의 CD138-양성 이종이식 모델(MOLP-8)에 대해 접합체를 평가하였다.
이들 마우스에서, MOLP-8 세포 현탁물의 접종에 의해 피하 종양을 확립하였다(암컷 CB.17 SCID 마우스). 1회 볼루스 정맥내 주사 처리를, 종양 크기가 평균 113 mm3이 되면 수행하였다. 종양 크기 변화 및 체중 변화를 1주일에 2번 모니터링하였다. 종양 세포를 접종한 후 68일간 실험을 수행하였다.
이종이식 마우스 실험 A
마우스
5주령의 암컷 CB.17 SCID 마우스를 찰스 리버 레보레이토리스에서 입수하였다.
인간 종양 세포주
인간 다발성 골수종 세포주인 MOLP-8을 ATCC로부터 입수하였다. 세포 표면 상에 CD138을 발현하며, SCID 마우스에서 이종이식 종양을 형성하는, MOLP-8 세포를, 4 mM L-글루타민(Biowhittaker, Walkersville, MD), 10% 소태아 혈청(Hyclone, Logan, Utah) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린이 함유된 RPMI-1640 배지 중에, 37℃ 및 5% CO2의 습윤 대기에서 유지시켰다.
파트 I
마우스에서의 종양 증식
각각의 마우스의 우측 어깨 아래의 부분에 1x107 MOLP-8 세포를 피하로 접종하였다. 총 부피는 마우스 당 0.2 ml이고, 이의 혈청 무첨가 배지 : 마트리젤(BD Bioscience, Bedford, MA)의 비율은 1/1 (v/v)이다. 치료하기 전에, 이종이식 종양을 매일 모니터링하고, 확립되게 두었다. 종양 세포를 접종하고 약 11일 후에 종양 크기는 약 113 mm3이 되었다. CB.17 SCID 마우스의 종양 형성율은 100%였다.
종양 세포를 접종한 지 11일째에, 마우스 42마리를 종양 크기와 체중을 기준으로 선택하였다. 종양 크기는 68.2 내지 135.9 mm3이었다. 42마리를 무작위로 종양 크기를 각각 기존으로 6마리로 구성된 7개의 군(A-G)으로 나누었다.
그룹 A의 6마리 각각에는 비히클 대조군으로서 PBS 200 ㎕를 제공하였다. 그룹 B의 각 마우스에는 nBT062 네이키드 항체 13.8 mg/kg을 제공하였다. 이 투여량은 연결된 마이탄시노이드 250 ㎍/kg 중의 nBT062 항체 성분의 양과 동일하다. 접합체에서의 마이탄시노이드 대 nBT062 항체의 분자량 비율은 약 1/55이다. 그룹 C의 각 마우스에는 DM4 250 ㎍/kg을 제공하였다. 그룹 D의 각 마우스에는 huC242-DM4 250 ㎍/kg을 제공하였다. 그룹 E, F 및 G의 각 마우스에는, 각각 nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 및 nBT062-SPP-DM1을 250 ㎍/kg으로 제공하였다.
모든 물질들은 27 게이지 ½인치 바늘이 장착된 1 ml 주사기로 외측 고리 정맥을 통해 1회 볼루스 주사로 정맥내 투여하였다. 투여하기 전에, nBT062 항체, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 스톡 용액을 무균 PBS로 농도 2 mg/ml, 28.1 ㎍/ml 및 28.1 ㎍/ml로 각각 희석하여, 각 마우스에 대한 주사 부피를 120-220 ㎕가 되게 하였다.
파트 II
제2 실험 세트에서, MOLP-8 세포(마우스 당 세포 수 1.5x107)를 혈청 무첨가 배지 및 마트리겔의 50:50 혼합물에 현탁하고, 이를 우측 어깨 아래 부위에 100 ㎕로 피하 주사하였다. 세포 주사 후, 11일째에 종양 크기는 약 80 mm3가 되었고, 대조군의 평균은 25일째에 약 750 mm3이었다. 종양 크기 배가 시간은 4.58일로 추산되었다. 대조군(n=6)의 각 마우스에 무균 PBS 0.2 ml를 외측 꼬리 정맥(i.v.)에 볼루스 주사로 투여하였다. 모든 처리 용량은 접합된 마이탄시노이드를 기준으로 하였다. 9가지의 그룹(n=6)에, nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4, 또는 nBT062-SPP-DM1을 각각 450, 250 및 100 ㎍/kg의 용량으로 1회 정맥내 주사로 처리하였다. 다른 그룹(n=6)에는 반복 투여로(5주간 매주) nBT062-SMCC-DM1을 250 ㎍/kg로 투여하였다. 마우스는 LabCat 프로그램을 이용하여 종양 크기로 11개의 그룹(n=6)으로 무작위 분류하였다. 종양 크기는 40.0 내지 152.5 mm3이었다. 마우스의 개별 체중을 기준으로 용량을 정하였다.
종양 크기는 1주일에 2번씩 LabCat 시스템(Tumor Measurement and Tracking, Innovative Programming Associated, Inc., Princeton, NJ)으로 3차원으로 측정하였다. 종양 크기는 Tomayko et al., Cancer Chemother. Pharmacol, 24 (1989)에 기술된 방법에 따라 mm3로 계산하였다:
부피 = 길이 x 폭 x 높이 x ½
Bissery et al., Cancer Res., 51 (1991)에 언급된 식으로 Log10 세포 사멸을 계산하였다:
Log 10 세포 사멸 = (T-C) / T d x 3.32
상기 식에서, (T-C) 또는 종양 증식 지연은, 미리 결정된 크기(600 mm3)에 도달하는데 필요한 치료군(T) 및 대조군(C)의 평균 시간(일)이다. Td는 종양 크기 배가 시간이며, 대조군 마우스의 평균 종양 크기를 기준으로 하며, 3.32는 세포 증식 log 당 세포 배가 횟수이다.
결과
각 마우스에서의 종양 증식은 도 8 및 9에 나타낸다. 각 그룹에서의 평균(+/- SD) 종양 증식은 도 10에 나타낸다.
PBS-처리 동물에서의 종양 증식과 비교하여, nBT062 항체 처리, 비접합 유리형 DM4 처리 또는 관련없는 비-표적 접합체 huC242-DM4 처리는 종양 증식에 어떠한 유의한 저해를 나타내지 않았다.
3가지 CD138-표적 접합체들인, nBT062-SPDB-DM4, B-B4-PP-DM1 및 nBT062-SPP-DM1은 모두 투여량 250 ㎍/kg에서 종양 증식을 상당히 지연시켰다. 처리군에서 측정한 평균 종양 크기를 기준으로, DM4 접합체 nBT062-SPDB-DM4가 가장 활성이 높았으며, nBT062-SPP-DM1 접합체는 뮤라인 대응체인 B-B4-SPP-DM1과 비교하여 활성이 약간 높았다(도 10). 개별 마우스로부터 수득한 결과는, 또한, B-B4-SPP-DM1으로 수득한 항종양 활성이 훨씬 더 비균질적이었고, 따라서 nBT062-SPP-DM1 처리한 마우스에서 측정한 것 보다 속성을 단정하기 더 어려웠다. 항종양 활성의 균일성 측면에서는, 표적 항체로서 nBT062를 이용하는 다른 접합체 nBT062-SPDB-DM4가 nBT062-SPP-DM1과 비슷하게 작용하였다.
모든 처리군에서는 체중 감소가 관찰되지 않아, 처리가 잘 허용됨을 보여주었다.
고찰
3가지의 CD138-표적 접합체에 대한 실험 동물 분석 결과를 통해, 항종양 활성에서의 표적화된 전달 중요성이 입증되었다. 인간 키메라 nBT062 및 뮤라인 B-B4 항체의 마이탄시노이드 접합체들은 log 세포 사멸에 의해 측정되는 바와 같이 현저한 활성을 보였지만, 비접합 DM4, 비변형된 천연 huBT062 항체 또는 비-표적 대조군 접합체(huC242-DM4)로 처리시의 종양 증식에 유의한 효과가 없었다.
인간 키메라 항체 nBT062-SPP-DM1로부터 제조한 면역접합체는, 이것의 뮤라인 대응체인 B-B4-SPP-DM1으로 제조한 접합체 보다 약간 높은 항종양 활성을 나타내었다. 또한, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SPDB-DM4 처리시 B-B4-SPP-DM1 처리시와 비교하여 개별 마우스에서 보다 균일한 반응들을 나타내었다. B-B4-SPP-DM1의 우수한 결합 편차는, 접종 후 시간(일) 경과에 따른 CB.17 SCID 마우스에서의 MOLP-8 인간 다발성 골수종 이종이식의 평균 종양 크기(+/- SD) 측정에서, 실제 nBT062-SPP-DM1 보다 B-B4-SPP-DM1에서 상대적으로 우수한 결과가 나타난 것을 설명해주었다(데이타 미기재). 표적 항체로서 nBT062를 이용하는 면역접합체의 이러한 특징은 접합체의 치료적 사용에 특히 유익할 것으로 보인다.
마지막으로, SCID 마우스의 MOLP-8 이종이식 모델에 1회 iv 투여한 후, 마이탄시노이드 접합체의 효능이 가장 우수한 것은 nBT062-SPDB-DM4이었다.
방관자 사멸(세포 생존성 분석)
CD138+ OPM2 세포와 CD138- Namalwa 세포를 둥근 바닥 플레이트에 개별 웰이나 또는 공동 배양으로 접종하였다. 세포에, 1x10-8 - 1x10-9 M의 농도로 nBT062-SPDB-DM4를 처리하였다. WST 시약(수용성 테트라졸륨염, ROCHE)을 제조사의 지침(ROCHE)에 따라 사용하여, 생존 세포의 비율을 검출하였다. 세포의 생존율은, 표준 절차에 따라 마이크로플레이트 리더에서 측정한 광학 밀도를 기초로 계산하였다.
고찰
nBT062-SPDB-DM4 처리시 다발성 골수종 세포에 매우 근접해 있는(둥근 바닥 웰에 존재함) 비-표적 세포의 방관자 사멸을, CD138-양성 OPM2 세포를 CD138-음성의 Namawla 세포와 공동 배양하는 시험관내 실험에서 분석하였다(도 13). 일반적으로, CD138-양성 세포는 nBT062-SPDB-DM4에 의해 효과적으로 사멸되지만, CD138-음성 세포는 접합체에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 둥근 바닥 웰에서의 공동 배양시, nBT062-SPDB-DM4는 항원-양성 세포에 매우 근접해 있는 항원-음성 세포도 사멸시켰다(이를 종종 방관자 사멸이라고 함). Kovtun 등(2006)은, 마이탄시노이드 접합체에 의해 매개되는 방관자 사멸은 단지 항원-양성 세포에 매우 근접한 경우에만 발생한다고 하였다. Kovtun 등(2006)은, 또한, 면역접합체의 링커의 중요성도 논의하였으며, 상기 논문은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 생체내에서, 방관자 사멸은, 1) CD138을 비균일하게 발현하는 종양 세포의 박멸, 2) 종양 기질 세포의 사멸에 의한 종양 미세환경의 파괴, 및 3) CD138-음성 nBT062-SPDB-DM4-내성 세포의 선택 방지에 기여할 수 있다.
면역접합체의 활성이 종양에서 비균일한 양상으로 발현되는 표적 항원에 의해 영향을 받는다면, 방관자 효과는 특히 중요하다. 이러한 경우라면, 종양의 개개 세포는, 적어도, 해당 면역접합체에 의한 상기 세포의 효과적인 직접 표적화 및 사멸을 허용하는 양이 아닌 양으로 항원을 발현한다. CD138-양성 세포와 공동 배양시 CD138-음성 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4의 항종양 효능은, 표적 세포의 존재가, 적합한 조건 하에서, 비-표적 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4의 세포독성 활성에 영향을 미친다는 것을, 명확하게 표명하였다.
이종이식 마우스 실험 B
본 실험 세트에서, 85마리의 마우스의 우측 어깨에 MOLP-8 세포(1.5x107 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 종양 발생율은 100%였다. 평균 종양 크기 약 80　mm3의 벌키한 MOLP-8 종양을 가지고 있는 66마리의 SCID 마우스를 11개의 치료군(n=6)으로 무작위로 나누었다. 마우스에, 3가지 접합체(nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 또는 nBT062-SPP-DM1) 중 한가지를 1회 투여량으로 처리하였다. 추가적인 군에는 매주 nBT062-SMCC-DM1을 5회 투여하고, 대조군에는 PBS를 1회 투여하였다. 평균 종양 크기는 도 11A에 나타내었다.
용량 반응을 각 접합체에 대해 확립하였다. PBS 처리 동물의 경우, 25일에 평균 종양 체적은 750 mm3가 되었다. 대조군 종양 증식의 log-선형 플롯 상에서의 베스트-피트 선형 회귀 곡선 피팅에 의해 결정된 종양 배가 시간은 4.58일이었다. nBT062-SPDB-DM4 450 ㎍/kg 처리한 동물에서 최대 log 세포 사멸(LCK=2.89)이 확인되었으며, 그 다음은 nBT062-SMCC-DM1을 250 ㎍/kg으로 매주 투여한 동물(LCK=2.1; 표 10)이었다. 두넷의 다중 비교 테스트를 수행한 ANOVA 반복 측정에 의한 처리군들의 평균 종양 증식 곡선 비교를 통해, PBS 대조군과 450 ㎍/kg nBT062-SPDB-DM4 (p<0.01), 250 ㎍/kg nBT062-SPDB-DM4 (p<0.05)와 5주간 매주 250 ㎍/kg으로 투여한 nBT062-SMCC-DM1 (p<0.05) 간에 유의한 차이가 확인되었다. 접종 후 85일까지 종양의 부분 감소가 나타난, 450 ㎍/kg으로 nBT062-SPDB-DM4를 투여한 동물을 제외하고, 모든 처리군에서 부분 또는 완전한 종양 감소는 없었다.
여러가지 투약 계획으로 여러가지 nBT062-DMx 접합체의 항종양 활성을 측정한 결과로서 Log 세포 사멸(LCK) 수치. LCK 수치 계산에 대한 정보는 재료 및 방법 섹션을 참조함.
테스트 물질 투여량(㎍/kg) LCK 투약
PBS 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 450 0.85 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 250 0.53 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 100 0 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 450 2.89 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 250 1.05 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 100 0.39 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 450 0.8 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 250 0.39 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 100 0.2 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 250 2.1 5주간 매주 투여
골수 환경에서의 nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 생체내 효과
인간 태아 골 임플란트를 가지고 있는 SCID 마우스의 제조
인간 태아의 긴 뼈(인간 태아 골 칩)를 기존에 기술된 바와 같이 CB17 SCID-마우스의 상체에 이식하고(Urashima et al., 1997), 이를 인간 MM 세포의 BM 세포로의 회귀를 위한 마우스 모델로 제공하였다.
치료 요법(SCID-hu/INA-6 마우스)
뼈 이식 후 4주째에, 최종 부피 100 ㎕ RPMI-1640 세포 배양 배지 중의 2.5x106개의 INA-6 세포를, 상기 SCID-hu 마우스의 인간 골수강에 직접 주사하였다. INA-6 세포에 의해 분비되는 가용성 인간 IL-6 수용체(shuIL-6R)의 농도 증가를 MM 세포 증식 및 질병 부하(disease burden)에 대한 파라미터로 이용하였다.
INA-6 세포를 주사하고 약 4주 후에 마우스에서 측정가능한 수준의 혈청 shuIL-6R이 형성되었고, 그 후 꼬리 정맥 주사를 통해 7주간 매주 접합체 0.176 mg 또는 비히클 대조군을 투여하였다. 각 처리 후, 혈액 샘플을 수집하여, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 shuIL-6R 수준을 측정하였다. 결과는 도 12에 나타낸다.
고찰
인터루킨 6(IL-6)는 다발성 골수종 세포의 증식 및 생존 인자이다. INA-6는 IL-6-의존적인 인간 골수종 세포주이며, 또한 골수 기질 세포(BMSC)의 증식에 필요하다. INA-6 세포주는 가용성 IL-6 수용체(shuIL-6R)를 생산한다. shuIL-6R 농도 증가는 MM 세포 증식 및 질병 부담의 파라미터로서 사용할 수 있다.
따라서, sCID-hu/INA-6 마우스는 이의 정상적인 골수 환경에서 증식하는 다발성 골수종 세포 모델로서 제공된다. 인간 골수와 직접 상호작용하는 상기 모델의 종양 세포는, 종양 세포 증식이 기질 세포의 존재에 의해서 촉진된다는 점에서 환자의 상태와 매우 유사하다. INA-6 세포가 가용성 인간 인터루킨-6 수용체(shuIL-6R)를 분비하기 때문에, 이 단백질의 혈청 농도를 이들 마우스내 종양 세포 하중 평가치로 사용할 수 있다. nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 생체내 효능을 이러한 조건에서 테스트하였다.
7주간 매주 nBT062-SPDB-DM4 또는 nBT062-SPP-DM1을 정맥내 투여로 SCIDhu/INA-6 마우스에 처리하면, 대조군 대비 혈청내 shuIL-6R 농도 감소에 의해 검출되는 바와 같이 효과적으로 종양 감소를 유도하므로, 이는, 환자의 실제 상황을 반영하는 인간 골수 환경에서도 접합체가 우수한 효능이 있다는 것을 의미한다(도 12).
마우스에서의 투여량
적절한 용량을 정하기 위해, 종양이 평균 종양 체적 80 mm3가 되었을 때, BT062를 (DM1 농도 기준) 100, 250 및 450 ㎍/kg의 용량으로 단회 투여하였다(도 14). 용량은 접합된 DM4의 농도로서 기록하였다(1 ㎍ DM4 = 항체 단백질 약 55 ㎍). 항-종양 효능은 용량-의존적이었으며, 테스트한 최고 용량(450 ㎍/kg)에서 log 세포 사멸(LCK) 2.9가 나타났다(또한 표 10과 비교). 실험 진행에서 체중이 증가한 동물을 통해, 치료제가 마우스에 독성이 아닌 것이 시사되었다.
도 14는 마우스에서의 1차 유효량 250 ㎍/kg이 상응하는 인간 용량 166 mg/m2로 변환됨을 나타낸다.
인디케이터: 췌장암/유방암 및 그외 암종 - 이종이식 모델
일반적인 실험 설정
CD138 발현 분석(종양 조직 마이크로어레이 상에서의 면역조직화학적 분석)에서, 후보 종양들을 원발성 종양 콜렉션, 즉 환자 유래 종양들로부터 선택하였다. 피하 이식 및 종양 확립(유도 시간 30일) 후, 면역접합체 BT062를 마이탄시노이드 DM4 2가지 농도, 450　㎍/kg 및 250　㎍/kg(각각은 연결된 DM4의 분자량 기준임 (DM4 1 mg이 항체 52 mg에 접합됨, 이는 총 분량 53 mg에 해당됨); 450 ㎍/kg DM4 = 23.850 ㎍) 정맥내로 주입하였다. 면역접합체를 10주간(췌장 종양 이식된 마우스의 처리군) 및 5주간(유방 종양 이식된 마우스 군) 매주 투여하였다.
실시예 1: 췌장암
췌장 종양 조직(PAXF 736 (Kuesters et al., 2006)을 NMRI 마우스에 이식(양측)하였다. 이식된 종양은 환자의 원발성 췌장 암종(덜 분화됨, 침윤성 선암종(외분비형 암종))으로부터 기원하였다. 부작용은 관찰되지 않았다. 이 환자의 종양은 면역조직화학 실험에 의해 CD138 고발현 조직으로 식별되었다. 그러나, CD138은 유세포 측정의 표면 염색에 의해 종양원성 세포주 상에서 결정한 바와 같이, 다발성 골수종 환자에서의 골수종성 형질세포에 상응하는 수준으로는 발현되지 않았다.
종양의 크기가 약 6-8 mm 직경(최소 5 mm)에 도달한 후, BT062 처리를 시작하였다. 종양의 직경을 일주일에 2번 측정하였다. 종양 체적은 식: a*b*b/2 ("a"는 최장 축이고, "b"는 이의 수직 축)으로 계산하였다. 비히클 대조군 대비 실험군에서의 종양 체적 저해를, 상대적인 종양 체적 평균의 비율(T/C)로서 계산하였다.
개별 일의 종양 저해(T/c %)는 대조군 대비 테스트군의 평균 RTV(상대적인 종양 체적) 수치의 비율 x 100%로 계산하였다.
T/C (일 x) = (실험군의 일x의 상대적인 종양 체적 평균 / 대조군의 일x의 상대적인 종양 체적 평균) x 100%
종양 체적은 매주 BT062 투여에 따라 현저하게 감소시킬 수 있었다. 도 28에서 볼 수 있는 바와 같이, 용량 의존적인 부분 및 완전 관해는 종양 이식 후 28일에 수득할 수 있었고, 용량 13.25 mg/kg에서는, 종양 이식 후 35일에는 완전 관해를 수득할 수 있었다. 특히, 52일 후, 양쪽 투여 요법 군의 모든 마우스들이 여전히 살아있었고(8/8), 대조군 hd 마우스 8마리는 1로 감소되었다. T/C 수치 < 10%은 완전 관해(CR)를 의미한다(Bissery et al., 1991). 이 기준에 따라, 양 치료군에서 CR이 달성되었는데, 이는 BT062에 의해 달성된 완전 관해를 반영하였다.
특히, 치료하지 않은 관찰 단계에서, 종양 재증식은 검출되지 않아, 이 모델의 완전한 치유가 확인되었다.
췌장암 이종이식 마우스 모델의 종양 체적
상대적인 종양 체적 (%) 53일: 평균 (±) 범위 T/C (%)
대조군 2055 2055
BT062-DM4;
13.25 mg/kg
0 (±1.0)
0 - 3.5
0.0
BT062-DM4;
23.85 mg/kg
0 (±0.01)
0 - 0.1
0.0
실시예 2: 유방암
NMRI (nude) 마우스에 환자의 원발성 유방 종양(CD138에 강한 양성으로서 IHC 분석을 통해 확인됨)을 (양측) 이식하였다. 유방 암종 피부 전이를 M1 단계에서 취하였다. 이것은 헤르셉틴(중강 수준의 발현을 포이는 낮은 Her2)에 반응하지 않는 종양이었다. 종양은 에스트로겐 수용체에 음성이었고, 프로게스테론 수용체에 음성이었다. 이식할 종양은 IHC 염색 결과에 따라 선정하였다(BR062에 의해 검출된, 강력하고 균질적인 CD138 발현, 트리플 음성(호르몬 수용체인 에스트로겐과 프로게스테론의 발현 음성); Her2 발현 수치 2 이하(이는 헤르셉틴 비반응성으로 간주됨)).
종양의 크기가 약 6-8 mm 직경(최소 5 mm)에 도달한 후, BT062 처리를 시작하였다. 종양의 직경을 일주일에 2번 측정하였다. 종양 체적은 식: a*b*b/2 ("a"는 최장 축이고, "b"는 이의 수직 축)으로 계산하였다. 비히클 대조군 대비 실험군에서의 종양 체적 저해를, 상대적인 종양 체적 평균의 비율(T/C)로서 계산하였다.
종양 체적은 매주 BT062 투여에 따라 현저하게 감소시킬 수 있었다. 용량 의존적인 부분 및 완전 관해가 관찰되었다. 면역접합체는 허용성이 우수하였고, 각 주입 후 체중에 영향을 미치지 않았다. T/C 수치 < 10%은 양쪽 처리군에서 관찰되었는데, 이는 BT062의 투여에 의해 달성되는 완전 관해를 반영한다. 도 YYY에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-종양 효과(즉, 완전 관해)는 21일 후에 달성되었는데, 이는 BT062에 대한 신속한 반응을 생각해 볼 수 있다. 췌장암 모델과 비교하여, 처리 기간을 반으로(10주 대신 5주) 줄일 수 있었고, 저용량 13.25 mg/kg을 4 mg/kg으로 감소시켜, 비슷한 효과, 즉 완전 관해 및 종양 재증식 비발생을 달성할 수 있었다. IHC 분석에서 CD138 발현 수준이 비슷하였기 때문에, 유방 암종에 대한 보다 짧은 기간의 처리는 예상되지 않았다. 따라서, CD138 발현 수준으로부터 처리 기간에 대한 일반적인 권고치를 유추할 수 없다. 21일 후, 양쪽 처리 군 뿐만 아니라 대조군 모두 마우스가 여전히 살아있었다. 치료제를 처리하지 않는 관찰 기간에(면역접합체 마지막 투여 후 39일째), 종양의 재증식은 검출되지 않아, 완전 치유가 확인되었다.
유방 암종 이종이식 마우스 모델에서의 종양 체적
상대적인 종양 체적(%) 평균 (21일) 범위 T/C
대조군 (PBS) 533 (± 149.5) 339 - 878
BT062-DM4;
13.25 mg/kg/4 mg/kg		 0 (± 0.02) 0 - 0.1 0.0
BT062-DM4;
23.85 mg/kg		 0 (± 1.75) 0 - 6.6 0.0
유방 암종 세포 대 상피 세포 상에서의 CD138 발현
FFPE 조직 샘플 염색 스코어(막)
0.25 ㎍/mL 0.05 ㎍/mL
유방, 종양
전이, -061909-13		 3 Homo 2-3 Homo
유방, 종양
미확인, -061909-12		 2-3 Homo 1-2 Hetero
유방, 종양
전이, -061909-09		 3 Hetero 2 Focal
유방, 종양
원발성, -111904-4		 3 Hetero 1-3 Hetero
유방, 종양
원발성, -111904-1		 3 Hetero 1 Hetero
정상 피부 샘플 1 3 Homo 3 Homo
정상 피부 샘플 1 3 Homo 3 Homo
실시예 3: 방광암
NMRI (nude) 마우스에 방광 종양(IHC 분석을 통해 CD138 강력한 +로 확인됨), 즉 이행 세포 암종을 이식하였다.
종양의 크기가 5 mm 이상이 된 후, BT062 처리를 시작하였다. 종양의 직경을 일주일에 2번 측정하였다. 종양 체적은 식: a*b*b/2 ("a"는 최장 축이고, "b"는 이의 수직 축)으로 계산하였다. 비히클 대조군 대비 실험군에서의 종양 체적 저해를, 상대적인 종양 체적 평균의 비율(T/C)로서 계산하였다.
종양 체적은 매주 BT062 투여에 따라 현저하게 감소됨을 확인하였다. 임의의 용량 의존적인 부분 및 완전 관해를 추적한다.
실시예 4: 폐암
NMRI(nude) 마우스에 폐 암종(IHC 분석을 통해 CD138 강력한 +로 확인됨)을 이식하였다.
종양의 크기가 5 mm 이상이 된 후, BT062 처리를 시작하였다. 종양의 직경을 일주일에 2번 측정하였다. 종양 체적은 식: a*b*b/2 ("a"는 최장 축이고, "b"는 이의 수직 축)으로 계산하였다. 비히클 대조군 대비 실험군에서의 종양 체적 저해를, 상대적인 종양 체적 평균의 비율(T/C)로서 계산하였다.
종양 체적은 매주 BT062 투여에 따라 현저하게 감소됨을 확인하였다. 임의의 용량 의존적인 부분 및 완전 관해를 추적한다.
전임상 독성 실험
이종이식 마우스 모델은, 본 발명의 면역접합체가 마우스의 암 모델에서 유효한지를 보는데 탁월하다. 그러나, 이러한 모델에는 CD138의 적절한 내재적인 발현이 결여되어 있기 때문에, 독성 실험에 신뢰할 수 있는 모델로서 제공할 수 없으며, 따라서 본 발명의 면역접합체의 허용가능한 양을 충분히 결정하는데 이용할 수 없다.
또한, 시노몰구스 및 레수스 원숭이들에서, BT062가 임의의 CD138-관련 항원에 결합하는 것으로 확인되지 않았지만, 현재에는 공지된 BT062의 독성 실험에 가장 적합한 동물 종이다. 따라서, 예상된 바와 같이, 마우스와 원숭이에서, BT062의 독성 프로파일은 접합체의 세포독성 성분(DM4)의 비-표적화된 효과로 인한 것일 것이다.
단회-투약 독성 실험은 시노몰구스 원숭이와 CD-1 마우스에서 GLP 요건들을 총족시키면서 수행하였다. 이러한 실험은 심각한 독성을 야기하며 동물에서 부작용이 없(거나 최소)는 양을 확인하고, 인간에서의 잠재적인 독성을 확인하고, BT062의 단회 볼루스 주입을 이용한 I상 임상 실험에서 안전한 개시 용량을 동정하도록, 설계하였다.
급성 마우스 독성 실험
단회 투약 독성 실험은 60-255 mg/m2 (20-85 mg/kg)의 범위의 용량을 단회 볼루스 IV 주사에 의해 마우스에 BT062를 투여함으로써 수행하였다.
마우스에서 BT062의 최고 비-중증 독성 용량(HNSTD: highest non-severely toxic dose)은 45 mg/kg (135 mg/m2)이었고, STD10 추산치는 57 mg/kg (171 mg/m2)이었다.
급성 원숭이 독성 실험
단회 투약 독성 실험은 48-336 mg/m2 (4-28 mg/kg)의 범위의 용량을 IV 투여하는 BT062를 이용하여 시노몰루스 원숭이를 대상으로 수행하였다.
시노몰루스 원숭이에서의 BT062의 HNSTD는 12 mg/kg (144 mg/m2)이었다.
BT062를 이용한 인간 실험
본원에서, 인간 개체들은 저용량 요법에 잘 반응하였다. 이는, (MYLOTARG와 비교하여) 표적 세포 상의 CD138의 정성 또는 정량적 발현에 잠재적인 편차를 벌충하는, 임의의 부가적인 치료가 없는 경우에서도 동일하였다. 마우스 모델에서, BT062가 마우스에서 잘 허용되는 용량에서 매우 유의한 항골수종 활성을 가지는 것으로, 입증되었고, 효능은 상대적으로 고용량에서 상당히 우수하였는데(도 14 참조), 매우 다양한 비-종양 세포 상에 CD138을 발현하는 인간 개체에게 더 높은 용량이 어떤 식으로 허용되는 지는 의문이다.
I 상 연구 실험
이 실험은, 효능 검사(양호 및 불량) 및 재발성 또는 재발성/불응성 다발성 골수종 환자의 치료에 있어서의 BT062의 MTD(최대 허용량)를 결정하기 위해, 수행된다.
지금까지, 26명의 환자를 모집하였다. 환자 26명 중 11명 이상이 4번 이상의 치료 사이클 시술에서 나타난 바와 같이 질병 진행이 감소되는 경험을 하였고, 환자 4명은 여전히 치료 중에 있다. 이 실험은 여러 부위에서 수행하며, 3 또는 4명의 환자로 구성된 그룹들에게 대략 1-10회 치료 사이클로 여러가지 용량 수준을 처리한다(10 mg/m2, 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2, 120 mg/m2, 160 mg/m2, 200 mg/m2)(도 23 참조). 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 바와 같이, 더 많은 횟수의 치료 사이클도 가능하며, 본 발명의 범위에, 10 - 50, 10 - 100, 10 - 200 또는 이상도 포함된다.
상대적으로 낮은 용량 수준, 즉 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2 및 120 mg/m2에서, 질병 진행이 감소되었고, 21일로 이루어진 치료 사이클 10회 동안 20 mg/m2 용량 수준을 2차 처리한 한명의 환자에서는 질병이 진행되지 않았다. 도 23을 참조하며, 도 23의 환자 샘플 001-001, 003-001, 002-002, 002-003, 002-004, 003-003, 001-005, 001-006, 001-008, 001-009, 004-001, 001-011, 004-002 및 001-012에서, 마이너 반응과 부분 반응이 관찰되는 등의, 안정적인 질환 상태와 반응에도 불구하고, 질병은 궁극적으로 진행되는 것으로 관찰되었다. 환자 샘플 001-006에서는 투여량을 유지시켰다.
이러한 용량 수준에서, 전술한 바와 같이(표 7 및 8), 혈장에서의 신속한 BT062 소거도 관찰되었다. 이러한 저용량 투여 계획의 일부 약동학 프로파일을 도 17에 나타낸다. 인간에서의 BT062 혈장 프로파일과 원숭이를 비교한 결과를 도 18에 나타낸다. 좌측 그래프는 120 mg/m2에서의 편차가 있지만, 우측(160 mg/m2)에서는 편차가 상당히 적었다.
또한, 160 mg/m2 및 200 mg/m2의 용량으로 투여하였다. 용량 160 mg/m2는 MTD로 확인되었고, 이 그룹에서의 실험을 확장시켰다. 용량 200 mg/m2는 MAD로 확인되었다. 동량 제한 독성(DLT)을 NCI CTCAE v3.0 (August 09, 2006, http://ctep.cancer.gov)에 따른 등급을 이용하여 정하였다. 실험에서 특이적인 DLT 기준을 아래에 열거한다:
비혈액
- 모든 등급의 탈모증은 DLT로 간주되지 않음
- 최적의 구토 억제제a에도 불구하고, 3일 보다 길게 등급 3-4의 구역질 및 구토의 지속
- 최적의 항설사제a에도 불구하고, 3일 보다 길게 등급 3-4의 설사가 지속됨
a. 최적 항설사제 및 구토억제제는 각 조사자가 정하였다.
혈액
- 5일 보다 길게 4 등급의 호중구감소증 지속.
- 4시간 간격으로 2회 연속 측정에서, 101 ℉ 이상의 온도를 나타내명 3등급 이상의 호중구감소증
- 4등급의 혈소판 감소증
- 수혈과 혈소판 수혈이 필요한, 3등급 이상의 혈소판 감소증
- 3등급의 호중구감소증, 3등급의 혈소판 감소증은 DCL로 간주되지 않음.
모든 이상 반응(AE)들은 NCI-CTCAE v3.0에 따라 평가하였다.
NCI-CTCAE v3.0에 없는 AE는, 기준에 따라 조사자가 중증도를 평가하였다. 1 등급(경도)이 치료 필요성이 최소이거나 없으며 환자의 1일 활동을 방해하지 않는 것이고, 2 등급(중도)은 낮은 수준의 불편성을 야기하거나 또는 치료학적 평가에 관여하는 것인, 1 등급 및 2등급은 수용가능한 수준이다. 중도의 이상 발생은 개체의 기능성에 다소의 간섭을 야기할 수 있다.
BT062에 대한 3 등급(고도) 및 4 등급(치명적)의 AE는 수용가능하지 않은 것으로 간주하였고, 실험 특이적인 DLT 기준에 의해 정해지지 않는다면 DLT로서 정하였다.
환자 샘플 003-005, 002-012, 및 002-011은 현재 여전히 실험에 참여하고 있다.
환자 샘플 002-003, 001-002 및 002-008은 제외시켰다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 10 mg/m2, 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2, 120 mg/m2, 160 mg/m2, 200 mg/m2의 단회 투약 반복 요법을 21일 마다, 즉 1일, 22일 42일, 64일, 85일, 106일 등에 수행하였다. 질병을 의사의 혈액, 임상 증상 및 임상 화학적 평가 뿐만 아니라 환자 혈청 및 뇨내 M-단백질 수준 (g/dL)과 환자의 혈청내 유리형 경쇄(FLC) 수준을 경시적으로 측정하여, 모니터링하고 할 것이다.
면역글로불린 평가
IgG 서브그룹의 측정 등의 Ig 항체의 양을 스크리닝에서 분석하였다.
M-단백질 정량화 및 혈청내 유리형 경쇄 분석
처음에, 치료 반응을 치료 사이클 1-3회의 1일에, 면역전기영동(IEP) 및 면역고정 전기영동(IFE)을 이용하여 혈청과 24시간 뇨 채집물로부터 평가하였다. 3번의 치료 사이클과 그 이후에, 다음 처리 사이클을 개시하기 전에 반응을 분석하기 위해 이용할 수 있는 결과를 위해, 15일 진찰시에 M-단백질 정량을 수행하였다. 일반적인 정량적인 면역글로불린 평가는 M-단백질 정량화와 함께 수행하였다.
혈청 샘플을 이용하여 FLC 분석을 수행하여, M-단백질을 검출할 수 없는 다발성 골수종(비분비형/올리고분비형 골수종) 개체를 조사하였고, 치료에 대한 초기 반응을 검출하였다. 따라서, 혈청 FLC 분석을 치료 사이클 1의 1일, 2일 3일 및 8일에, 사이클 4의 2일, 3일, 8일 및 15일에, 또한 그외 모든 처리 사이클들에서는 1일, 8일 및 15일째에 수행하였다. M-단백질 및 FLC를 스크리닝시와 종료 방문시에 분석하였다. 사이클 1의 1일의 평가 결과를 베이스라인 수치로 사용하였다.
선택한 환자에서의 뇨/혈청 M-단백질 및 혈청 FLC 측정에 대한 관찰 결과
용량 mg/m 2 도 뇨/혈청 M-단백질 측정 및 FLC 측정
20 도 24 - 뇨의 M-단백질은 약 17주 동안 3차 처리 후 감소하였고, 9차 처리 후 증가되었음
- 마이너 반응에서의 M-단백질 척도는 8차 처리 후에 도달함
- 뇨내 M-단백질 수준이 베이스라인으로부터 50% 이상, 42일부터는(3차 처리) 75% 이상 감소됨
- 사이클 10회 후에는 질병이 진행됨
- 혈청내 M-단백질 0,06 내지 0,1 g/dL (측정불가한 것으로 정의됨)
40 도 25 - 14주간 안정적인 질병 상태임
- 1차 처리 후 혈청내 M-단백질이 감소되고, 14주 동안 안정화됨
- 사이클 6의 개시(105일)시에 처리를 중지한 후, 질환이 진행됨
- 뇨내 M-단백질은 스크리닝시 0에서 최대 약 16 mg/24h으로 증가됨(측정 불가한것으로 정의됨)
160 도 26 - 혈청 FLC 수준은 -21일에서 처리 1일 전까지의 스크리닝 기간 동안에 증가됨
- 혈청 FLC 수준은 1차 처리 후에 즉시 감소되고, 8일째에는 이미 25% 감소 수준에 근접하였음
- 베이스라인 비교에서, FLC 수준은 1차 사이클 동안에 약 40% 감소하였고, 2차, 3차 및 4차 처리 후에는 50% 이상 감소되었음
- 부분 반응에 대한 FLC 척도가 매우 초기에 달성되었음
- 4차 처리 사이클 종료 후 질병이 진행됨
- 혈청 M-단백질은 측정불가 = 0; 뇨 M-단백질은 베이스라인에서의 140 mg/24h에서 2차 처리전까지 120 mg/24h로 감소됨(측정 불가로 정의됨) => 비-분비성 골수종
혈장으로부터 BT062 및 DM4의 측정
BT062의 IV 투여 후 단회 용량 PK 특성을 평가하기 위해, 1차 치료 사이클 동안 막대한 혈장 샘플링을 수행하였다. 동일한 평가는 4차 치료 사이클에서도 수행하였다. 또한, 혈장 샘플을 모든 그외 처리 사이클의 1일 및 8일째, 그리고 종료 방문 및 추적 방문시에 소량 취하였다.
Shed CD138 및 HAPA의 측정
sCD138 수준과 항종양 활성 간의 잠재적인 상관성을 조사하기 위해, shed/가용성 CD138 (sCD138)의 수준을, 모든 투약전(pre-dose) 혈장 샘플에서 평가하였다. 또한, 이러한 측정으로, Cmax 예상치 보다 낮은 수치는 BT062 투여 전 존재하는 sCD138의 양에 의존되지 않는다는 것을 결정할 수 있었다(도 22). 각각의 처리 사이클의 1일의 투약전 혈장 샘플과 종료 방문 및 추적 방문시의 투약전 혈장 샘플을, BT062에 대한 체액성 반응(약물 산물)의 존재를 인간 항산물 항체(HAPA)의 평가에 의해 조사하였다.
Shed CD138의 관찰 결과
골수종 환자에서, 고농도의 sCD138이 관찰될 수 있으며, 골수종 환자의 예후 인자일 것이다(Maisnar et al., 2005).
MGUS 및 MM 환자에서는 가용성 CD138의 수준이 높고, 베타2-마이크로글로불린의 수치가 높으며, 골수내 형질세포의 함량이 증가될 수 있다 (Aref et al., 2003).
가용성 CD138을 측정하기 위해 키트를 사용하였다. 놀랍게도, 환자 003-003에 대한 BT062 20 mg/m2에서, 이 환자자는 처리 전에 고수준의 sCD138을 나타내었음에도 불구하고, 뇨M-단백질 수준과 관련하여 마이너 반응이 나타나는 것으로 확인되었다.
가용성(s) CD138 수치는 여러 개체들에서 측정하였다.
환자 003-003 (용량 20 mg/m2)에서 고수준의 sCD138이 확인되었다. 그러나, 이 환자의 M-단백질 수준에 대해서는 마이너 반응이 나타났다.
개체 sCD138 (ng/mL)
002-003 61.3
001-002 196
002-004 56.7
003-003 2583
평균 724.1
조합 실험
가능성있는 항-골수종 후보 약물들을 세포주에서의 BT062에 대한 조합 파트너로서 조사하였다.
세포주 실험
이종이식 마우스 모델에서의 조합 실험을 세포주 실험 전에 수행하였다. 여러가지 세포주에서의 상승 효과 측정은, 평균 효능 분석을 이용하여 Chou and Tallay (1984)에 따라 수행하였다. 여기에서, 각 약물과 각 세포주에 대한 세포독성 효능에 대한 IC50 값을 계산한 다음, 각 약물 쌍에 대한 IC50 비율을 측정하였다. 그런 후, 세포를 이들 약물 혼합물 또는 단독 약물 중 어느 한가지의 연속 희석물에 노출시켰다. 실험 데이타를 CompuSyn software (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ)를 이용하여 분석하였다. 각각의 독립적인 실험의 조합 인덱스(CI)를 각각 계산하고 기록하였다. 분석에서, CI <1, =1 및 >1은 각각 상승 효과, 상가 효과 및 길항 효과이다. T.C. Chou (CompuSyn. User's guide, 2004)의 분류에 따라, 방법의 저자, 상승 효과 및 길항 효과의 범위는 아래와 같다:
조합 인덱스 설명
< 0.1 매우 강력한 상승 효과
0.1-0.3 강력한 상승 효과
0.3-0.7 상승 효과
0.7-0.85 낮은 상승 효과
0.85-0.9 매우 낮은 상승 효과
0.9-1.1 거의 상가 효과
1.1-1.2 매우 낮은 길항 효과
1.2-1.45 낮은 길항 효과
1.45-3.3 길항 효과
3.3-10 강력한 길항 효과
> 10 매우 강력한 길항 효과
Chou and Talalay (1984)의 방법에 따라 세포주에서 수득한 상승적인 결과 추산
세포 RPMI 8226 MOLP8 U266
보르테조밉 상가 효과 매우 낮은 길항 효과 길항 효과
탈리도마이드 상가 효과 - 상승 효과 상가 효과 - 매우 낮은 길항 효과 길항 효과
레날리도마이드 상승 효과 상가 효과 - 상승 효과 매우 낮은 내지 낮은 길항 효과
멜팔란 상가 효과 - 상승 효과 매우 내지 낮은 길항 효과 상가 효과 - 매우 낮은 상승 효과
덱사메타손 미 결정 상가 효과 상가 효과
본 실시예에서, MOLP 8 세포주이 BT062와, 보르테조밉, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 멜팔란 및 덱사메타손의 조합을 사용하였다.
탈리도마이드 또는 보르테조밉과의 조합은, 상승 효과도 상가 효과도 없었으며, 오히려 길항 효과가 있었다. 이들 세포 배양 실험과는 대조적으로, 보르테조밉과의 조합은 하기 기술한 이종이식 모델에서 상승적인 효과가 있었다.
가능성 있는 항골수종 후보 약물은 MOLP8 인간 다발성 골수종 세포를 이용한 이종이식 실험에서 BT062에 대한 조합 파트너로서 분석하였다.
실시예 1
BT062 및 레날리도마이드를 이용한 조합 치료의 항골수종 효과
암컷 SCID 마우스에, MOLP 8 인간 골수종 세포를 피하 접종하였다. BT062를 단독으로 또는 레날리도마이드와 조합한 처리를 종양 접종 후 11일째에 시작하였다. BT062는 단독으로, 또는 100 mg/kg으로 투여하는 레날리도마이드와의 조합으로, 100 ㎍, 200 ㎍ 및 400 ㎍의 농도로 1일 - 5일 및 8일 - 12일에 복막내 투여하였다. 동일한 스케줄과 투여 경로를 이용하여 PBS(Phosphate buffered saline) 투여 군을 대조군으로 하였다. 종양 증식은 종양 크기를 측정하여 모니터링하고, 식: 길이 x 폭 x 높이 x ½로 10일, 14일, 18일 및 21일에 계산하였다.
상승 효과는 다음과 같이 계산하였다(Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):
RATIO (r) = 예상되는 FTV (조합)/관찰되는 FTV (조합)
FTV: 부분 종양 부피(Fractional tumor volume) = 평균 종양 체적(실험군)/평균 종양 체적(대조군)
비율 > 1이면 상승적인 것으로 보고, r < 1이면 상가적 효과 미만이다.
비율(r)이 1 보다 높으면 본원에서는 "상승효과 비율(SYNERGY RATIO)"로 언급된다.
표 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 상승 효과는 BT062 농도 200 ㎍ 및 400㎍에서 28일 후에 관찰되었다.
MOLP 8 이종이식에서의 부분 종양 부피. BT062 단독 및 레날리도마이드와의 조합하여, 여러가지 농도로, 종양이 있는 이종이식체에 투여하였다. FTV는 상대적인 종양 체적이다. 상승적인 효과는 예상되는 FTV 대 관찰되는 FTV의 비율로 정해된다. 비율 >1은 상승 효과를 의미함.
일 BT062 100 레날리도마이드 BT062 100 + Len (관찰 결과) BT062 100 + Len(예상 결과) 비 (exp/obs)
10 0,93 1,00 0,97 0,93 0,96
14 0,75 0,82 0,59 0,61 1,04
17 0,52 0,45 0,23 0,23 1,02
21 0,53 0,42 0,19 0,22 1,19
24 0,44 0,55 0,18 0,24 1,30
28 0,33 0,46 0,17 0,15 0,90
BT062 200 레날리도마이드 BT062 200 + Len (관찰 결과) BT062 200 + Len(예상 결과) 비 (exp/obs)
10 1,02 1,00 1,00 1,02 1,02
14 0,45 0,82 0,51 0,37 0,73
17 0,13 0,45 0,14 0,06 0,41
21 0,08 0,42 0,07 0,03 0,45
24 0,11 0,55 0,06 0,06 1,08
28 0,13 0,46 0,03 0,06 1,86
BT062 400 레날리도마이드 BT062 400 + Len (관찰 결과) BT062 400 + Len(예상 결과) 비 (exp/obs)
10 0,94 1,00 0,91 0,95 1,04
14 0,44 0,82 0,24 0,36 1,49
17 0,09 0,45 0,06 0,04 0,63
21 0,04 0,42 0,04 0,02 0,44
24 0,04 0,55 0,03 0,02 0,80
28 0,04 0,46 0,01 0,02 1,43
레날리도마이드 BT062 조합: 여러가지 용량에서의 효과
물질 용량/주입 총 용량 T/C (%) (17일) 관해 종양이 없는 생존체, 77일 결과
부분 완전
PBS (0.2 ml) - - 0/6 0/6 0/6 　
BT062 100 ㎍/kg 100 ㎍/kg 35 0/6 0/6 0/6 활성
BT062 200 ㎍/kg 200 ㎍/kg 14 0/6 0/6 0/6 활성
BT062 400 ㎍/kg 400 ㎍/kg 9 4/6 1/6 0/6 고활성
레날리도마이드 100 mg/kg 1g/kg 31 0/6 0/6 0/6 활성
BT062 100 ㎍/kg 100 ㎍/kg 19 0/6 0/6 0/6 활성
레날리도마이드 100 mg/kg 1g/kg
BT062 200 ㎍/kg 200 ㎍/kg 12 2/6 0/6 0/6 활성
레날리도마이드 100 mg/kg 1g/kg
BT062 400 ㎍/kg 400 ㎍/kg 6 5/6 4/6 0/6 고활성
레날리도마이드 100 mg/kg 1g/kg
도 28은 이종이식 마우스 모델에서 평균 종양 부피(TV)에 대한 조합 요법의 효능을 나타낸 것이다. 결과는 조합의 상가적인 효과를 보여준다. 상승 효과 비율은 표 16을 참조한다.
실시예 2
BT062 및 벨카드를 이용한 조합 요법의 항-골수종 효과
벨카드를 MOLP8 다발성 골수종 세포(IMGN Inc.)를 이용한 이종이식 실험에서 BT062에 대한 잠재적인 다발성 골수종 약물 조합 파트너로서 평가되었다. BT062 단독 또는 벨카드와 조합 처리는, 종양 이식 후 11일째에 개시하였다. BT062는 단독으로, 또는 1 mg/kg으로 투여하는 벨카드와의 조합으로, 100 ㎍, 200 ㎍ 및 400 ㎍의 농도로 1, 4, 8 및 11일에 사용하였다. 동일한 스케줄과 투여 경로를 이용하여 PBS(Phosphate buffered saline) 투여 군을 대조군으로 하였다. 종양 증식은 종양 크기를 측정하여 모니터링하고, 식: 길이 x 폭 x 높이 x ½로 10, 14, 17, 21, 24 및 28일에 각각 계산하였다.
상승 효과는 실시예 1의 조합 실험에서와 같이 계산하였다.
표 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 상승 효과는 모든 BT062 투약 요법에서의 25일에 벨카드와 BT062의 조합에서 관찰된다. R 값은 문헌에서 더 높게 보고되었다 (Yu et al., 2001).
벨카드와의 조합 치료
일 BT062 100 벨카드 BT062 100 + 벨카드 (관찰 결과) 예상치 비율 (exp/obs)
10 1,06 1,05 1,04 1,12 1,07
14 0,74 0,84 0,56 0,62 1,11
18 0,44 0,96 0,28 0,42 1,54
21 0,39 0,80 0,23 0,31 1,38
25 0,48 0,95 0,26 0,46 1,75
　
일 BT062 200 벨카드 BT062 200 + Vel (관찰 결과) 예상치 비율 (exp/obs)
10 1,02 1,05 1,07 1,12 1,07
14 0,52 0,84 0,45 0,44 0,98
18 0,13 0,96 0,10 0,12 1,19
21 0,10 0,80 0,05 0,08 1,47
25 0,10 0,95 0,04 0,09 2,09
　
일 BT062 400 벨카드 BT062 400 + Vel (관찰 결과) 예상치 상승효과 비율 (exp/obs)
10 1,09 1,05 1,04 1,15 1,10
14 0,45 0,84 0,43 0,38 0,88
18 0,08 0,96 0,09 0,08 0,89
21 0,05 0,80 0,04 0,04 0,98
25 0,04 0,95 0,02 0,03 1,36
부분 종양 부피(FTV)는 평균 종양 체적(실험군) / 상대적인 평균 종양 체적(대조군)이다. 비는 FTV 예상치(조합) 대 FTV 관찰 결과(관찰됨)이다. R이 > 1은 상승 효과, < 1은 상가 효과이다.
벨카드 조합. 벨카드 BT062 조합: 여러가지 용량에서의 효과
물질 용량/주입 치료일(TX 개시일 = 접종 후 10일) T/C (%) (T-C), 일 log 세포 사멸 관해 종양이 없는 생존체 결과
부분 완전
PBS (0.2 ml) 1일 - - - 0/6 0/6 0/6 　
BT062 100 ㎍/kg 1일 43 5,5 0,5 0/6 0/6 0/6 비활성
BT062 200 ㎍/kg 1일 11 14,5 1,3 1/6 0/6 0/6 활성
BT062 400 ㎍/kg 1일 7 31,5 2,8 4/6 2/6 0/6 고활성
벨카드 1 mg/kg 1, 4, 8, 11일 100 0,5 0,0 0/6 0/6 0/6 비활성
BT062 100 ㎍/kg 1일 20 10.5 0.9 1/6 0/6 0/6 활성
벨카드 1 mg/kg 1, 4, 8, 11일
BT062 200㎍/kg 1일 7 23.5 2.1 4/6 1/6 0/6 고활성
벨카드 1 mg/kg 1, 4, 8, 11일
BT062 400㎍/kg 1일 7 36.5 3.2 6/6 0/6 0/6 고활성
도 29는 이종이식 마우스 모델에서의 평균 종양 체적(TV)에 대한 조합 요법의 효과를 나타낸다. 그 결과, 사용 모델에서, 벨카드 단독 처리는 종양 체적에 효능이 없었다. BT062와의 조합은 상승적인 효과를 제공하였다. 상승 효과 비율에 대해 표 18을 참조한다.
실시예 3: BT062/멜팔란
RPMI 세포를 누드 마우스에 피하 이식하였다. 종양의 총 부피가 약 100 mm3이 되면 마우스를 무작위 분류하였다. BT062를 2가지 농도, 연결된 DM4의 분자량을 기초로 400　㎍/kg 및 100　㎍/kg으로 정맥내 주사하였다. PBS를 음성 대조군으로 사용하였다. 그룹 당, 각각에 하나의 종양을 가지고 있는(한쪽에만 이식) 마우스 8마리를 사용하였다. BT062를 매주 투여한 다음, BT062를 복막내 주사한 후, 1일에 멜팔란을 매주 1회로(3mg/kg) 투여하였다.
결과는 도 30에 나타낸다.
상기 기술된 내용에 대해, 당업자라면 다수의 그외 특징, 변형 및 개선을 자명하게 인지할 것이다. 이러한 그외 특징, 변형 및 개선은 따라서 본 발명의 일부로 간주되며, 본 발명의 범위는 본 발명의 개요 및 첨부된 청구항에 의해 결정된다.
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMACC2875 20071211 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSMACC2874 20071211
SEQUENCE LISTING <110> Biotest AG <110> ImmunoGen Inc <120> Uses of Immunoconjugates Targeting CD138 <130> 324215.WO/JND/CJS <150> US 61/176,069 <151> 2009-05-06 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nBT062 predicted heavy chain amino acid sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nBT062 predicted light chain amino acid sequence <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MHV7 <400> 3 atgggcatca agatggagtc acagacccag g 31 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MHCG1 <400> 4 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MKV2 <400> 5 atggagacag acacactcct gctatgggtg 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MKV4 <400> 6 atgagggccc ctgctcagtt ttttggcttc ttg 33 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MKV9 <400> 7 atggtatcca cacctcagtt ccttg 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MKC <400> 8 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 agagaagctt gccgccacca tgattgcctc tgctcagttc cttggtctcc 50 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BT03 <400> 10 caacagtata gtaagctccc tcggacgttc ggtgg 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BT04 <400> 11 ccaccgaacg tccgagggag cttactatac tgttg 35 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer g2258 <400> 12 cgcgggatcc actcacgttt gatttccagc ttggtgcctc c 41 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer g22949 <400> 13 cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttcc 45

Claims (54)

  1. CD138을 발현하는 표적 세포와 관련된 유방암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 유방암은 에스트로겐 수용체 음성, 프로게스테론 수용체 음성, 및 헤르셉틴 내성인 것이고,
    상기 약학 조성물은 면역접합체를 포함하고,
    상기 면역접합체는, CD138을 발현하는 세포를 표적으로 하는 하나 이상의 표적 항체 및 하나 이상의 작동자 분자를 포함하되, 상기 표적 항체가 상기 작동자 분자에 기능적으로 부착되어 상기 면역접합체를 형성하며,
    상기 표적 항체는 경쇄 및 중쇄를 포함하되, 경쇄의 가변영역은 서열번호 2의 아미노산 잔기 24 내지 34 (CDR1), 서열번호 2의 아미노산 잔기 50 내지 56 (CDR2) 및 서열번호 2의 아미노산 잔기 89 내지 97 (CDR3)을 포함하고, 중쇄의 가변영역은 서열번호 1의 아미노산 잔기 31 내지 35 (CDR1), 서열번호 1의 아미노산 잔기 51 내지 68 (CDR2) 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 99 내지 111 (CDR3)을 포함하고, 및
    상기 작동자 분자는 마이탄시노이드인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역접합체는 개체에게 5 mg/m2 내지 200 mg/m2의 양으로 투여하거나, 또는 5 mg/m2 내지 200 mg/m2의 약동학적 등가로 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역접합체는
    10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 또는 120 mg/m2 이하의 용량으로,
    평균 1일 용량으로서, 400 ㎍/m2 내지 6 mg/m2, 또는
    평균 주당 용량으로서, 3 mg/m2 내지 40 mg/m2으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 면역접합체는 개체에게 5 mg/m2 또는 10 mg/m2 내지 160 mg/m2 미만, 150 mg/m2 미만, 140 mg/m2 미만, 130 mg/m2 미만 또는 120 mg/m2 미만의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 CD138은, 환자에서, 표적 세포 및 비-표적 세포 상에서 발현되며,
    상기 면역접합체는 투여시 중간 속도로 또는 느리게 혈장에서 소거되며,
    CD138을 발현하는 상기 비-표적 세포는 실질적으로 영향을 받지 않는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD138을 발현하는 비-표적 세포가 상피 세포인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역접합체는 개체에게 단회 투약(single dose), 단회 투약 반복(repeated single dose) 또는 다중 투약(multiple doses)으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 면역접합체의 중쇄는 IgG4 이소형 불변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며, 상기 중쇄는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 122 를 가지는 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 2의 아미노산 1 내지 107 을 가지는 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 마이탄시노이드는 DM4 인, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄는 서열번호 1을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 2를 포함하고, 마이탄시노이드는 DM4 인, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 면역 접합체는 sCD138을 높은 수준으로 나타내는 환자에게 투여되고, 여기에서 sCD138의 높은 수준은 50 ng/ml 이상, 60 ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 80 ng/ml 이상, 100 ng/ml 이상, 150 ng/ml 이상, 200 ng/ml 이상, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 ng/ml 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 환자는 sCD138을 1000ng/ml 보다 높은 수준으로 나타내는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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