CN102573916B - 靶向cd138的免疫偶联物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包括施用靶向CD138的免疫偶联物来对抗疾病的方法和治疗方案。将所述免疫偶联物作为唯一活性成分、作为治疗方案的一部分或作为抗癌组合产品的一部分来使用。

Description

靶向CD138的免疫偶联物的应用
技术领域
本发明涉及方法和治疗方案，特别是用于人受试者的方法和治疗方案，所述方法和治疗方案包括施用以表达CD138的细胞为靶标而设计的免疫偶联物。本发明还涉及抗癌组合产品、包含所述抗癌组合产品的药物组合物及其在治疗具有表达CD138的靶细胞的癌中的应用。本发明特别涉及抗癌组合产品，与使用不具有该组合产品全部组分的治疗相比，所述抗癌组合产品在治疗中显示出协同作用或其他未预料到的加合效应。
背景技术
CD138作为细胞外基质的受体，在多发性骨髓瘤(MM)细胞上过表达，并且已显示其影响MM细胞的发育和/或增殖。仅举几例，CD138还在卵巢癌、宫颈癌(Numa等，2002)、子宫内膜癌(Choi等，2007)、肾癌、胆囊、膀胱移行细胞癌、胃癌(Wiksten等，2008)、前列腺腺癌(Zellweger等，2003)、乳癌(mammary carcinoma)(Loussouarn等，2008)、非小细胞肺癌(Shah等，2004)、鳞状细胞肺癌(Toyoshima等，2001)的细胞、结肠癌细胞和霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤的细胞、结肠直肠癌(Hashimoto等，2008)、肝癌(Li等，2005)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、胰腺(Conejo等，2000)和头颈癌(Anttonen等，1999)的细胞上表达。
将本文中用来阐明本发明特别是用来提供关于实施的附加细节的出版物和其他资料(包括专利)通过引用方式并入。简便起见，在下文中通过作者和日期来引用这些出版物，并且/或将这些出版物按作者的字母顺序列于所附的参考文献部分中。
Tassone等(2004)报道了鼠IgG1抗体B-B4与在MM细胞表面上表达的CD138抗原的优异结合。Tassone还报道了针对多发性骨髓瘤细胞的免疫偶联物B-B4-DM1的高细胞毒活性，所述免疫偶联物包含作为效应物分子的类美登醇(maytansinoid)DM1(另见美国专利公布20070183971)。
Ikeda等(2008和2009)报道了基于B-B4的免疫偶联物BT062的有前景的体外结果和对异种移植模型的结果。
虽然Tassone等和Ikeda等为提供对MM的有效治疗和提供在此治疗中可采用的物质组合物做出了贡献，但本领域中仍然存在多种需求。
特别是仍存在如下需求：为包括与CD138的表达相关的浆细胞增生性病症(例如MM)在内的与CD138的表达相关的疾病提供适合的治疗方案。更特别的是仍然需要这样的治疗方案：所述治疗方案通过仅采用一定可耐受量的免疫偶联物并且/或通过将免疫偶联物与已知可有效应对所讨论的病症的细胞毒剂组合，从而确保使针对也表达CD138的非肿瘤细胞的毒性保持在临床可接受的水平。还需要减少对用来减轻疾病其他症状的药物的需要的治疗方案。
在某些实施方式中，本发明满足了这些需求中一种或多种需求，并满足了本领域的其他需求，对技术人员而言，在获悉以下公开内容后，这将变得更加显而易见。
发明内容
通过本文所述的用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，本发明满足了一种或多种上述需求。
在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者特别是人受试者施用有效量的、优选为可耐受量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含
至少一种靶向试剂，例如以表达CD138的细胞为靶标的工程靶向抗体，
和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物。
优选的是，所述工程靶向抗体的至少一部分优选赋予IgG4同型的性质，或作为另一选择，本文所述的任何其他免疫偶联物。
在另一个实施方式中，本发明是用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的免疫偶联物，
其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中所述免疫偶联物以有效量施用，并且其中所述有效量是可耐受量。
此外，在此实施方式中，本发明是免疫偶联物在制造用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的药物中的应用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中所述免疫偶联物以有效量施用，并且其中所述有效量是可耐受量。
优选以5mg/m2～200mg/m2的量或其药代动力学等价量将所述免疫偶联物施用至受试者。
另一个优选实施方式是免疫偶联物和治疗不良副作用的试剂的组合制剂，以便在与表达CD138的靶细胞相关的疾病的治疗中进行同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中，在单独施用所述免疫偶联物时，将以5mg/m2～200mg/m2的所述免疫偶联物的药代动力学等价量来施用所述免疫偶联物。
此外，该另一个优选实施方式是免疫偶联物和治疗不良副作用的试剂在制造组合制剂中的应用，以便在与表达CD138的靶细胞相关的疾病的治疗中进行同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中，在单独施用所述免疫偶联物时，将以5mg/m2～200mg/m2的所述免疫偶联物的药代动力学等价量来施用所述免疫偶联物。
特别而言，施用至受试者的免疫偶联物的量可以从5mg/m2或10mg/m2至小于160mg/m2，优选至150mg/m2、140mg/m2、130mg/m2或120mg/m2。
在首次施用结束后0～2小时，所述免疫偶联物在受试者血浆中的最大浓度可以小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的50％、优选小于40％、更优选小于30％、再优选小于20％或甚至小于10％。
可以施用所述免疫偶联物至少4次，并且在每次所述施用结束后0～2小时，所述免疫偶联物在受试者血浆中的最大浓度可以小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的55％、优选小于50％、更优选小于40％、再优选小于30％、小于20％或甚至小于10％。
所述最大浓度对10mg/m2而言可以小于3μg/ml；对20mg/m2而言可以小于8μg/ml；对40mg/m2而言可以小于15μg/ml；对80mg/m2而言可以小于25μg/ml；对120mg/m2而言可以小于30μg/ml。
在首次施用结束后0～2小时，第4次应用后的免疫偶联物在受试者血浆中的最大浓度可以小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的55％、优选小于50％、更优选小于40％、再优选小于30％、小于20％或甚至小于10％。
所述最大浓度对20mg/m2而言可以小于14μg/ml；对40mg/m2而言可以小于15μg/ml；或对80mg/m2而言可以小于25μg/ml。可以静脉内施用所述免疫偶联物。可以将所述免疫偶联物以重复的单剂量静脉内施用，并且在任何施用结束后0～2小时，所述免疫偶联物在受试者血浆中的最大浓度可以小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的55％、小于50％或小于40％。稳定疾病(stable disease)可保持至少4、5、6、7、8、9、10个治疗周期(即至少12、15、18、21、24、27、30周)。在20mg/m2时可以使至少稳定的疾病的状态保持5、6、7、8、9或10个治疗周期，并且可选的是，在任何施用结束后0～2小时，所述免疫偶联物在受试者血浆中的最大浓度可以小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的55％、小于50％或小于40％。在某些情况下，在至多8个治疗周期后，可以观察到轻微响应。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要此治疗的受试者(优选为人受试者)施用有效量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含：
至少一种靶向细胞表面所表达的CD138的靶向试剂，
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中，按下述剂量施用所述免疫偶联物：
所述剂量、优选重复的单剂量为不超过约10、20、30、40、80、90、100或120mg/m2，
平均每日剂量约400μg/m2～约6mg/m2，包括约500μg/m2、约1mg/m2、约2mg/m2、约3mg/m2、约4mg/m2，和/或
平均每周剂量为约3mg/m2～约40mg/m2，包括约5mg/m2、约10mg/m2、约15mg/m2、约20mg/m2、约25mg/m2、约30mg/m2或约35mg/m2。
本文所述的方法可以保持稳定疾病约20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、210或更多天，和/或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个治疗周期，每个治疗周期为约3周。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要此治疗的受试者(优选为人受试者)施用有效量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含：
至少一种靶向细胞表面所表达的CD138的靶向试剂，
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
其中，在所述受试者中，所述CD138在所述靶细胞上和非靶细胞上表达；其中，所述施用导致了中等或缓慢的血浆清除，并且其中所述非靶细胞特别是上皮细胞基本不受影响。
当与治疗不良副作用的试剂组合施用时，所施用的所述有效量可以小于200mg/m2或小于200mg/m2的药代动力学等价量，并且其中，所述施用可以在所述受试者中引起响应，优选在小于40、30、20、15、10、9、8、7、6、5小时后在所述受试者中引起响应。
所述有效量可以高于120mg/m2。
所述CD138在靶细胞和非靶细胞(例如，上皮细胞)上的所述表达水平可以相似。
可以将所述有效量作为例如单剂量、重复的单剂量或者以多剂量方式施用
可以以多剂量施用所述有效量，其中，每次施用后的cmax值高于理论cmax值的55％。
所述疾病可能涉及骨痛和/或骨并发症，并且本发明的所述免疫偶联物或抗癌组合产品的所述施用可以减少所述骨痛和/或骨并发症，优选减少至可接受的水平。可以停止施用减轻骨痛和/或骨并发症的药物，或将其从通常施用的基准水平减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。基准水平是针对待治疗症状而通常推荐的水平，并可以从药物所附带的使用说明中确定，或为施用疼痛药物领域中的技术人员所知。
例如，可以将通常以每四周90mg施用的双膦酸盐(例如帕米膦酸钠)或通常以每月一次4mg的剂量施用的唑来膦酸(Terpos等，2009)减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(或采用与这种减少对应的更长的时间间隔)或者完全取消。
所述施用还可以优选在首次施用后在所述受试者中产生至少稳定疾病、轻微响应或部分响应的FLC或M-蛋白水平。
所述免疫偶联物可以包含针对CD138的抗原结合区(ABR)和另外的抗体区，其中，所述另外的抗体区的至少一部分可以为人抗体并且可以赋予所述IgG4同型性质。
所述免疫偶联物可以包含nBT062或与nBT062具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的靶向抗体，或者可以对应于BT062。
受试者可以是人受试者。
所述方法可以基本由施用包含所述免疫偶联物和药物可接受的载剂的药物组合物构成，其中，所述组合物的活性成分可以基本由所述免疫偶联物组成。
本文所述的任何方法都可以产生可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个治疗周期或更久的稳定疾病、响应、特别是轻微响应、部分响应、非常好的部分响应、严格完全响应或完全响应，其中，每个所述治疗周期包含约3周，且在每个所述治疗周期的第1天施用所述免疫偶联物。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：
(i)鉴定与表达CD138的靶细胞相关的所述疾病，例如多发性骨髓瘤，并且所述疾病对用一种或多种细胞毒剂、免疫调节剂例如来那度胺(lenalidomide)和/或蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(bortezomib)进行的治疗没有响应或响应较差；和
(ii)向所述受试者施用、优选以静脉内方式施用有效量的本文指定的免疫偶联物，在单独施用所述免疫偶联物时其剂量小于200mg/m2，或者在与用于治疗副作用(包括潜在副作用)的试剂一起施用时，其中所述的有效量是200mg/m2的药代动力学等价量，
其中，所述受试者对用一种或多种细胞毒剂、免疫调节剂例如来那度胺(lenalidomide)和/或蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(bortezomib)进行的治疗没有响应或响应较差，并且其中，所述疾病得到治疗。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：向需要此治疗的受试者施用有效量的本文指定的免疫偶联物，其中，所述受试者显示出高水平的sCD138，例如高于50ng/ml、高于60ng/ml、高于70ng/ml、高于80ng/ml、高于100ng/ml、高于150ng/ml、高于200ng/ml、高于300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500ng/ml，其中，低至20mg/m2或低至40mg/m2的量有效产生响应，例如轻微响应。所述响应可以是所述免疫偶联物的选择性结合的结果。所述受试者对用一种或多种细胞毒剂、免疫调节剂例如来那度胺(lenalidomide)和/或蛋白酶体抑制剂例如硼替佐米(bortezomib)进行的治疗可能没有响应或响应较差。
工程靶向抗体可以包含针对CD138的抗原结合区(ABR)和另外的抗体区，其中，所述另外的抗体区的至少一部分属于人抗体并且赋予所述IgG4同型性质。
所述疾病可以是多发性骨髓瘤，特别是复发性(relapsed)或难治性(refractory)多发性骨髓瘤。
在靶细胞上表达CD138的所述疾病还可以选自由肾细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、肝癌、结肠直肠癌、结肠癌、鳞状细胞癌、肺癌(特别是鳞状细胞肺癌)、非霍奇金淋巴瘤、胸腺癌、子宫癌、泌尿器官癌(urinary carcinoma)或卵巢癌组成的组。
在优选实施方式中，免疫偶联物均一地靶向表达CD138的靶细胞。
在某些实施方式中，本发明的工程靶向抗体可以
(i)基本由非人抗体的针对CD138的抗原结合区(ABR)构成，或
(ii)包含针对CD138的抗原结合区(ABR)和另外的抗体区，其中，所述抗原结合区属于人抗体，并且其中所述另外的抗体区的至少一部分属于人抗体。
所述ABR可以分别包含：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基99～111的重链可变区CDR3，和
(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基89～97的轻链可变区CDR3。
所述ABR还可以分别包含：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基31～35和51～68的重链可变区CDR1和CDR2，和/或
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基24～34和50～56的轻链可变区CDR1和CDR2。
所述另外的抗体区可以分别包含下述(a)和/或(b)以及其突变：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基123～448，
(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基108～214，
且所述突变
(i)保持或降低所述工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性，且/或
(ii)使所述工程靶向抗体稳定。
所述抗体可以包含与SEQ ID NO：2具有至少约70％、更优选80％、85％或90％的序列同一性的轻链和与SEQ ID NO：1具有至少约70％、更优选80％、85％或90％的序列同一性的重链，并且包含上文具体说明的抗原结合区。
效应物分子可以通过连接物与所述工程靶向抗体连接。该连接物可以包含二硫键。效应物分子(例如DM4)可能在靶向抗体和效应物分子间提供空间位阻。效应物分子可以是至少一种类美登醇(例如，DM1、DM3或DM4)、紫杉烷或CC1065，或其类似物。
免疫偶联物可以以小于150％、140％、130％、120％、110％、100％、90％、80％、70％、60％或50％的靶向差异(targeting variation)结合CD138。
在本文公开的方法的某些实施方式中，免疫偶联物可以包含：
靶向CD138的靶向试剂，该靶向试剂包含
分离的多肽，所述分离的多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中，所述免疫球蛋白重链或其一部分与SEQ ID NO：1具有至少70％的序列同一性。所述免疫球蛋白重链或其所述一部分的恒定区可以是IgG4同型的恒定区。
免疫偶联物的靶向试剂可以包含与SEQ ID NO：2具有至少约70％的序列同一性的轻链序列。免疫偶联物的靶向试剂还可以包含与SEQ ID NO：1具有至少约70％的序列同一性的重链序列。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含：用于抑制、推迟和/或防止肿瘤生长和/或肿瘤细胞扩散的本文指定的任何免疫偶联物，和一种或多种药物可接受的赋形剂。
所述药物组合物可以包含本文指定的细胞毒剂。
本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒包含：在单独容器中的一种或多种剂型的所述药物组合物，和在单独容器中的使用说明，用来说明如何将所述一种或多种剂型(例如，作为重复的单剂量或本文讨论的其他治疗方案)施用至有需要的受试者特别是人受试者中。
特别而言，在本发明的一个方面，对本文公开的任何免疫偶联物的施用对于获益于该施用的受试者(特别是人受试者)或该受试者的细胞进行。还可以将免疫偶联物用于制造治疗此类病症的药物。
本发明还提供用于治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病的免疫偶联物，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；其中，所述受试者对用包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂在内的一种或多种细胞毒剂进行的治疗没有响应或响应较差；
并且，其中将5mg/m2～200mg/m2的量的免疫偶联物施用、优选以静脉内方式施用至受试者。
此外，本发明提供免疫偶联物在制造用于治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病的药物中的应用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，其中，所述受试者对用包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂在内的一种或多种细胞毒剂进行的治疗没有响应或响应较差；
并且其中，将5mg/m2～200mg/m2的量的免疫偶联物施用、优选以静脉内方式施用至受试者。
本发明还提供免疫偶联物和治疗不良副作用的试剂的组合制剂，以便在治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病时进行同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
其中，所述受试者对用包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂在内的一种或多种细胞毒剂进行的治疗没有响应或响应较差，并且其中，在单独施用免疫偶联物时，将5mg/m2～200mg/m2的药代动力学等价量的免疫偶联物施用、优选以静脉内方式施用至受试者。
此外，本发明提供免疫偶联物和治疗不良副作用的试剂在制备组合制剂中的应用，以便在治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病时进行同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
其中，所述受试者对用包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂在内的一种或多种细胞毒剂进行的治疗没有响应或响应较差，并且其中，在单独施用免疫偶联物时，将5mg/m2～200mg/m2的药代动力学等价量的免疫偶联物施用、优选以静脉内方式施用至受试者。
此外，本发明提供用于治疗患者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病的免疫偶联物，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
其中，所述患者显示出其血浆中的高于50ng/ml的sCD138水平；
并且其中，优选施用可有效提供至少轻微响应的量的免疫偶联物。
本发明还提供免疫偶联物在制造用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的药物中的应用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
其中，所述患者显示出其血浆中的高于50ng/ml的sCD138水平；
并且其中，优选施用可有效提供至少轻微响应的量的免疫偶联物。
在优选实施方式中，将以至少20mg/m2、更优选至少40mg/m2的量将来施用免疫偶联物。
在优选实施方式中，患者所显示的血浆中的sCD138的水平超过60ng/ml、超过70ng/ml、超过80ng/ml、超过100ng/ml、超过150ng/ml、超过200ng/ml或者超过300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500ng/ml。
本发明还涉及抗癌组合产品，其包含：
至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
其中
(a)所述组合产品的协同率(synergy ratio)大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4，或
(b)所述组合产品的协同率约为1且所述效应物分子和所述细胞毒剂具有干扰性作用模式；
并且其中，所述抗癌组合产品是药物组合物或包含至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物的单独容器的试剂盒。
细胞毒剂可以是：蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂或抗血管生成剂、DNA烷基化剂，或其中两种以上的混合物。
细胞毒剂可以是硼替佐米(bortezomib)、沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、美法仑(melphalan)或其中两种以上的混合物。
所述抗癌组合产品的效应物分子和细胞毒剂可以具有干扰性作用模式，其中，这些作用模式优选包括抑制微管或诱导细胞周期停滞(美法仑、硼替佐米和来那度胺或沙立度胺是诱导细胞周期停滞的细胞毒剂)。作为另外一种选择，它们可以具有非干扰性作用模式。
如果所述抗癌组合产品是药物组合物的一部分，该药物组合物可以包含至少一种药物可接受的赋形剂。
所述抗癌组合产品还可以是试剂盒的一部分，在该试剂盒中，至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物储存在单独的容器中。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：向有需要的患者施用有效量的本文所述的抗癌组合产品或包含至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物的抗癌组合产品，所述免疫偶联物包含以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂和至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，并且其中所述免疫偶联物克服了患者抵抗所述细胞毒剂的难治性表型。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的患者施用有效量的本文所讨论的抗癌组合产品，并且其中，所述免疫偶联物克服了难治性表型。
本发明还涉及用于治疗与表达CD138的靶细胞相关的非浆细胞增生性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者或向所述非浆细胞增生性疾病的细胞施用有效量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含
至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
其中，在所述受试者中，所述CD138以相似的水平在所述靶细胞和非靶细胞上表达；或者，其中，在所述受试者中，所述CD138在所述靶细胞上的表达水平小于表达CD138的所述非靶细胞的表达水平。
表达CD138的所述非靶细胞可以是上皮细胞。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的非浆细胞增生性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者或向所述非浆细胞增生性疾病的细胞施用有效量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含
至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
其中，所述疾病的靶细胞在24小时、2天、3天、4天、5天、6天期间脱落CD138。
所述疾病可以是乳癌。
本发明还提供至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物的组合制剂，以便在受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病的治疗中同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述至少一种效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；
并且其中，所述受试者具有难治性表型。
此外，本发明提供至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物在制备组合制剂中的应用，以便在受试者的与表达CD138的靶细胞相关的疾病的治疗中同时、单独或依次使用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述至少一种效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，并且其中，所述受试者具有难治性表型。
在一个优选实施方式中，至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物的组合产品的协同率大于1、大于11、大于1.2、大于1.3或大于1.4。另一选择是，至少一种细胞毒剂和至少一种免疫偶联物的组合产品的协同率约为1并且所述效应物分子和所述细胞毒剂具有重叠的作用模式。
另一方面，本发明提供用于治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的非浆细胞增生性疾病的免疫偶联物，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
并且其中，在所述受试者中CD138在靶细胞上的表达水平与CD138在非靶细胞上的表达水平相似(相等)或更低。
本发明还提供免疫偶联物在制造用于治疗受试者的与表达CD138的靶细胞相关的非浆细胞增生性疾病的药物中的应用，其中，所述免疫偶联物包含：
(i)至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
(ii)至少一种效应物分子，
其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，并且其中，在所述受试者中CD138在靶细胞上的表达水平与CD138在非靶细胞上的表达水平相似(相等)或更低。
本发明还涉及治疗与表达CD138的靶细胞相关的非浆细胞增生性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者或向所述非浆细胞增生性疾病的细胞施用有效量的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含
至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向试剂，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向试剂功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物；其中，免疫偶联物诱导实体瘤的消退(remission)。
该消退可以是随后有一段所述肿瘤不发生重新生长的时间间隔的消退(完全消退)。该时间间隔可以大于1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、半年或1年或更久。
所述实体瘤可以是胰腺癌或乳癌。
所述疾病可以是肾细胞癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、肝癌、结肠直肠癌、结肠癌、鳞状细胞癌、肺癌(特别是鳞状细胞肺癌)、非霍奇金淋巴瘤、胸腺癌、子宫癌、泌尿器官癌或卵巢癌。
所述实体瘤可以是乳癌，其呈现雌激素受体阴性和/或孕酮受体阴性。
附图说明
图1提供了连接有效应物分子的nBT062的示意性描绘图。
图2是BT062的化学描绘图。
图3显示了安丝菌素P-3(ansamitocin P-3)向美登醇的转变(简洁起见，略去了立体化学)。
图4是DM4的代表性合成方案。
图5是抗体偶联(nBT062与DM4)的示意性描绘图。
图6显示了对nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1、nBT062-SMCC-DM1和nBT062抗体与OPM-2细胞的结合的分析。将不同浓度的nBT062抗体和偶联物给予细胞并通过FACS分析测量了平均荧光。
图7A～7D描绘了nBT062-DMx偶联物对MOLP-8(CD138+)细胞和BJAB(CD138-)细胞的体外细胞毒作用。在平底平板中培养细胞并使之与所示浓度的免疫偶联物温育5天。添加WST试剂并再持续3小时，从而评估细胞活力。在D中，分析了在封闭性抗体存在(1μMnBT062)或不存在时nBT062-SPDB-DM4的细胞毒活性。
图8显示了在接种MOLP-8肿瘤细胞后用(A)PBS、(B)nBT062抗体、(C)游离DM4或(D)非靶向性偶联物huC242-DM4处理的各小鼠的肿瘤体积随时间(天)的变化。
图9显示了在接种MOLP-8肿瘤细胞后用(A)PBS、(B)nBT062-SPDB-DM4、(C)B-B4-SPP-DM1或(D)nBT062-SPP-DM1处理的各小鼠的肿瘤体积随时间(天)的变化。
图10描绘了接种后的CB.17SCID小鼠中的MOLP-8人多发性骨髓瘤异种移植物的平均肿瘤体积(+/-SD)随时间(天)的变化。
图11A和11B显示了在SCID小鼠的巨大MOLP-8肿瘤模型中，nBT062-DMx针对CD138+MOLP-8肿瘤细胞的抗肿瘤活性。将每组的肿瘤体积作为平平均值(+/-SD)给出。
图12是反映含有nBT062的DMx偶联物在SCIDhu/INA-6模型中对人骨髓环境中的多发性骨髓瘤细胞的抗肿瘤功效的图。使用了多发性骨髓瘤细胞所产生的可溶性人IL-6受体(shuIL-6R)作为肿瘤负荷的指示物。三角形：nBT062-SPP-DM1，方形：nBT062SPDB-DM4；菱形：载质对照。
图13显示了nBT062-SPDB-DM4所介导的体外旁观者杀伤(bystander killing)。将CD138阳性的OPM2细胞和CD138阴性的Namawla细胞与不同浓度的nBT062-SPDB-DM4进行培养，并测量细胞活力。OD450值代表细胞活性的量度。
图14显示了在单独注射BT062后异种移植小鼠模型中的肿瘤生长曲线。用星号(*)标记的剂量是基于所连接的DM4的分子量。
图15显示了相对于对照，用BT062处理的小鼠中的异种移植胰腺癌的完全消退。
图16显示了相对于对照，用BT062处理的小鼠中的异种移植乳癌的完全消退。
图17图示了对40mg/m2～120mg/m2的剂量的快速的血浆清除，而此处的160mg/m2的剂量所表明的更高剂量则显示出更接近于预期值的血浆清除。
图18对BT062的血浆特性和用相同剂量处理过的猴的血浆特性进行了比较。该比较表明低剂量时的快速血浆清除不能从可用的动物模型外推得到，并且看来对人有特异性。
图19显示了与理论cmax值相比较的测得的BT062的cmax值。
图20和图21显示出Cmax值在若干治疗周期中通常是相似的。
图22明确了并不能将快速血浆清除归因于可溶性CD138所引起的缓冲效应。
图23绘出了在所示治疗周期的进程中施用不同剂量的BT062的人受试者的治疗图表，其中每个治疗周期持续21天且在每个周期的第1天施用相应的剂量。
图24显示了以三周为间隔接受20mg/m2的患者的测得的尿M蛋白水平。显示了第-5天至第205天。
图25显示了以三周为间隔接受40mg/m2的患者的测得的血清M蛋白水平。显示了第-21天至第119天。
图26显示了以三周为间隔接受160mg/m2的患者的测得的κFLC水平。显示了第-21天至第101天。
图27显示了20mg/m2组患者中的BT062的血浆浓度。
图28显示了在异种移植小鼠模型中组合疗法对肿瘤体积(TV)中值的效果。结果显示了BT062与来那度胺的组合产品的效果。
图29显示了在异种移植小鼠模型中组合疗法对肿瘤体积(TV)中值的效果。结果显示了BT062与VELCADE的组合产品的效果。
图30显示了在异种移植小鼠模型中组合疗法对肿瘤体积(TV)中值的效果。结果显示了BT062与美法仑的组合产品的效果。
具体实施方式
本发明涉及向有需要的受试者特别是人受试者(患者)施用本文所述的包含CD138靶向试剂的免疫偶联物，并且涉及将该免疫偶联物的效应物分子递送至靶位并在靶位处或在靶位中释放效应物分子，所述靶位特别是靶细胞、组织和/或器官。更特别的是，本发明涉及包含此类CD138靶向试剂和与所述靶向试剂连接的强力效应物分子的免疫偶联物。在靶位处或在靶位中效应物分子可以通过免疫偶联物的切割和/或与免疫偶联物的靶向试剂部分解离得到激活。所述免疫偶联物可以单独施用，也可以作为抗癌组合产品的一部分来施用，所述抗癌组合产品包含细胞毒剂，所述细胞毒剂例如但不限于蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、免疫调节剂/抗血管生成剂(例如，沙立度胺或来那度胺)、DNA烷基化剂(例如，美法仑)或皮质激素类(例如，地塞米松)，其中，在治疗癌症时，与单一疗法中单独使用的免疫偶联物和/或单一疗法中单独使用的细胞毒剂相比，所述抗癌组合产品具有协同效应或未预料到的加合效应。
可以将本发明的免疫偶联物施用至有治疗需要的受试者或施用至从所述有治疗需要的受试者分离出的细胞。在靶细胞、组织和/或器官处或者在靶细胞、组织和/或器官中，通过切割/解离可以从免疫偶联物释放出效应物分子。
在一个实施例中，免疫偶联物BT062通过nBT062抗体来靶向表达CD138的细胞，并且包含作为效应物分子的DM4；将80mg/m2的量的所述免疫偶联物作为重复的单剂量向复发性/难治性多发性骨髓瘤患者施用4次，其中，每个治疗周期的长度为21天，且在每周期的第一天施用该周期的唯一剂量。在此实施例中，将所述免疫偶联物静脉内施用至患者中，从而使其在肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞处可以更好地聚集。对BT062的血浆浓度的测量显示出，在起始测量阶段(施用结束后至多2小时)BT062的cmax值明显小于理论计算值且未观察到不良副作用，这表示BT062聚集在肿瘤靶标处而不是随机地结合靶标CD138和非靶标CD138。可以排除sCD138造成的“缓冲效应”(见图20)。
在另一个实施例中，每次将20mg/m2的量的免疫偶联物BT062作为重复的单剂量向复发性/难治性多发性骨髓瘤患者施用10次，其中，每个治疗周期的长度为21天，且在周期的第一天施用该周期的唯一剂量。在此实施例中，将所述免疫偶联物静脉内施用于患者，从而使其能够在肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞处更好地聚集。未提供使效应物分子从免疫偶联物上释放的其他手段。10个治疗周期得到了良好的耐受，且在这些治疗周期内至少可以实现稳定疾病。
在另一个实施例中，将160mg/m2的量的免疫偶联物BT062作为重复的单剂量向复发性多发性骨髓瘤患者施用4次，其中，每个治疗周期的长度为21天，且在周期的第一天施用该周期的唯一剂量。在此实施例中，将所述免疫偶联物静脉内施用于患者，从而使其能够在肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞处更好地聚集。在此浓度下，血浆清除仍然小于理论cmax，但并未达到用更低剂量时所观察到的程度。然而，仅在单次治疗之后，就可以观察到血清FLC水平的强烈下降。在第2、3和4次治疗后，可以观察到部分响应。
在某些治疗方案中，由于在施用免疫偶联物时减轻了患者的疼痛，可以中止施用减轻疼痛和/或骨并发症的药物。因此，避免了与这些药物(包括双膦酸盐和其他骨质疏松症药物)相关的副作用，例如下颚骨坏死。
在又一个实施例中，将120mg/m2的量的免疫偶联物BT062与每日口服剂量为10mg的免疫调节剂来那度胺一起作为重复的单剂量向复发性多发性骨髓瘤患者共同施用4次，其中，每个治疗周期的长度为21天，且在周期的第一天施用该周期的唯一剂量。在此实施例中，将所述免疫偶联物静脉内施用至患者中，从而使其能够在肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞处更好地聚集。
在另一个实施例中，将免疫偶联物BT062作为重复的单剂量向胰腺肿瘤患者施用，其中，每个治疗周期的长度为21天，且在周期的第一天施用该周期的唯一剂量。在此实施例中，将所述免疫偶联物静脉内施用至患者中，从而使其能够在肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞处更好地聚集。
CD138或多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)(又称YND1、SYNDECAN、SDC、SCD1、CD138抗原，SwissProt登录号：P18827human)是膜糖蛋白，最初被描述为存在于源于上皮的细胞上，随后在造血细胞上发现(Sanderson，1989)。CD138具有长的细胞外结构域，该结构域通过硫酸乙酰肝素链(Langford，1998；Yang，2007)与可溶分子(例如，生长因子EGF、FGF、HGF)和不可溶分子(例如，细胞外基质组分胶原和纤维连接蛋白)结合，且充当细胞外基质的受体。通过黏附细胞所表达的肝素结合分子，CD138还介导细胞与细胞的粘附。已显示，CD138具有作为骨髓瘤细胞的生长因子的共受体的作用(Bisping，2006)。对浆细胞分化的研究显示，还必须认为CD138是分化抗原(Bataille，2006)。
在恶性造血中，CD138在大部分MM细胞、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌的细胞和霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)(Horvathova，1995)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)(Seftalioglu，2003(a)；Seftalioglu，2003(b))、实体组织肉瘤、结肠癌以及其他表达CD138的血液恶性肿瘤和实体瘤(Carbone等，1999；Sebestyen等，1999；Han等，2004；Charnaux等，2004；O’Connell等，2004；Orosz和Kopper，2001)的细胞上高度表达。CD138的表达还与不同类型的胃肠恶性肿瘤有关(Conejo等，2000)。如表1所示，存在与CD138的表达/过表达相关的多种致瘤细胞系。
表1：不同细胞系上的CD138表达。就MM而言，据显示，对BT062的敏感性与CD138的更高表达相关(RFI＝相对荧光指数)。
例如，所观察到的乳腺癌细胞系和胰腺癌细胞系的敏感性远小于MM细胞系的敏感性。但是，如实验部分所述，在使用了来自乳腺癌患者和胰腺癌患者的细胞的异种移植小鼠模型中，所获得的结果与相似的MM异种移植模型中的结果相比不仅可比较，而且明显更好。在这两种情况下最终可以获得完全消退，但相似的MM模型却显示出肿瘤生长的明显延迟而非完全消退。
虽然在胰腺癌中早期和晚期肿瘤之间的多配体蛋白聚糖-1的mRNA表达没有表现差别，但是在乳癌中，已报道弱IHC染色或无IHC染色反映出CD138可以随时间的推移而丧失。已报道了CD138表达的丧失，并通常将其与表达迁移相关联，即在周边基质上重新表达(Loussouarn，2008)。因此可以预期，CD138靶向试剂的靶标会随时间而减少。
已显示CD138表达阳性的其他癌症是多种卵巢腺癌、移行细胞膀胱癌、肾透明细胞癌、鳞状细胞肺癌；和子宫癌(参见例如Davies，2004；Barbareschi等，2003；Mennerich等，2004；Anttonen等，2001；Wijdenes，2002)。
对活动性(有症状的)多发性骨髓瘤和相关的浆细胞增生性病症的治疗作为可以通过本发明的免疫偶联物来治疗的疾病的实例。
本文所用的浆细胞增生性病症意思是浆细胞和/或血液的病症，例如MGUS、SMM、活动性(有症状的)MM、氏巨球蛋白血症、孤立性浆细胞瘤(solitaryplasmacytoma)、系统性AL淀粉样变性和POEMS综合征。
多发性骨髓瘤(MM)是指浆细胞的恶性增殖，通常起源于骨髓，主要累及患者的骨骼，并且呈现出由于特定受累部位和血浆蛋白形成中的异常导致的临床特征。该病况的特征通常在于：位于各种骨(尤其是头骨)的髓中的、引起可触知的骨肿胀的多个弥漫性灶或者异常或恶性浆细胞的结状积累物，且偶尔在骨骼外部位。在进行放射学检查时，骨损伤可能具有特征性的“穿凿(punched out)”表象。骨髓瘤中所涉及的细胞通常在血清和尿中产生异常蛋白和/或异常的蛋白水平。该疾病通常从意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)发展为郁积型多发性骨髓瘤(SMM)直至活动性多发性骨髓瘤(MM)。这些病况的症状不同，但包括高血钙、肾功能不全、疲劳、贫血、骨痛、自发性骨折、感染频率升高或感染持续时间延长、或者异常的尿色或气味。当本发明述及多发性骨髓瘤时，其是指(MGUS)、郁积型多发性骨髓瘤(SMM)和活动性多发性骨髓瘤(MM)以及可以最终发展为活动性MM的其他的浆细胞恶性增生。
MGUS是MM的临床良性先兆病况，比MM更常见，其出现在1％的超过50岁的人群中和3％的超过70岁的人群中(Greipp和Lust，1995)。重要的是将MGUS患者和MM患者区分开，因为可以安全地观察MGUS患者而无需采取治疗。
然而，在长期的随访过程中，在241位MGUS患者中，有59位患者(24.5％)继续发展了MM或相关病症(参见Kyle等，1993)。
术语丙种球蛋白病(gammapathy)是指患者的免疫球蛋白合成的原发障碍。
单克隆丙种球蛋白病是指通常与淋巴细胞或浆细胞的单一克隆(其通常作为单一峰在血清蛋白电泳(SPEP)上可见)的增殖相关的一组病症中的任何一种，其特征是在患者的血清或尿中存在单克隆免疫球蛋白。
已报道，在老年人中，郁积型(Smoldering)MM(SMM)在有症状的多发性骨髓瘤发作之前出现。通常认为郁积型多发性骨髓瘤是MGUS的晚期；甚至在进展时，郁积型多发性骨髓瘤所演化成的多发性骨髓瘤也通常缺乏溶骨性损伤或有症状的多发性骨髓瘤的其他主要特征。
MM的临床症状包括贫血、高血钙、肾功能不全和溶解性骨损伤。下表2中提供了在该疾病从意义未定的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undeterminedsignificance，MGUS)发展为郁积型多发性骨髓瘤(SMM)直至活动性多发性骨髓瘤(MM)时该疾病的进程和严重程度的区别特征。该表还总结了检测、诊断和监控这些病况的方法。这些症状和技术对本领域的技术人员而言是熟悉的。
在临床上，通常通过患者骨髓中的恶性浆细胞增生来识别活动性多发性骨髓瘤(MM)。这些赘生性浆细胞产生免疫球蛋白，且演化自B淋巴细胞。通过电泳测试，可以检测出患者血清和/或尿中的由浆细胞产生的免疫球蛋白。
如表2所示，对血清M蛋白的测量是评估不同时期的MM的重要工具。
“M蛋白”是指通常显示为电泳凝胶上的窄条带或免疫电泳中的异常弧的单克隆蛋白。其代表同源免疫球蛋白的增殖，所述同源免疫球蛋白是由源自单个共同细胞的克隆细胞产生的，例如，以单一类别或亚类的重链和单一类型的轻链为特征的单克隆免疫球蛋白(亦称为M尖峰(M-spike)，更广泛地称为副蛋白(paraprotein))。
“血清蛋白电泳”(SPE或SPEP)和“免疫固定电泳”(IFE)可以检测包括多发性骨髓瘤(MM)在内的若干种浆细胞增生性病症中所产生的单克隆免疫球蛋白。在所有人中，至多61％的这些发现不与临床症状相关，从而使得可以诊断意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。然而，SPE和IFE并不会检测出所有的单克隆免疫球蛋白，特别是仅分泌轻链的时候。
那些“游离轻链分子”(FLC)包括λ轻链和κ轻链。浆细胞产生五个重链类型中的一种以及λ和κ分子之一。通常，与重链合成相比，约有40％的过量游离轻链产生。除了完整免疫球蛋白分子外，浆细胞还分泌游离轻链(FLC，λ或κ)，并且血清轻链水平由相对合成率(κ＞λ)和肾排泄(κ＞λ)决定。当存在单克隆免疫球蛋白时，κ∶λ比可以高于或小于正常范围，取决于相关FLC的类别。FLC的血清半衰期是2～6小时，相比之下，IgA的是5天，IgM的是6天，而IgG的是21天。因此，测量血清FLC水平使得远比测量完整免疫球蛋白更快地评估肿瘤对疗法的响应。同样地，对血清FLC的测量使得可以更早地检测到复发。
非浆细胞增生性疾病也与CD138的表达有关。
胰腺癌
主要病例包括外分泌型。这些外分泌癌的大部分都是导管腺癌(此外，更加罕见的亚型包括囊瘤、腺泡细胞瘤和肉瘤)。内分泌胰腺癌是产生激素的肿瘤。
原位癌是指早期癌，在该期间其局限于其所始于的细胞层。在乳腺癌中，原位是指癌细胞仍局限于导管(原位导管癌)或小叶(原位小叶癌)。其尚未生长至更深的乳腺组织中或扩散至身体的其他器官，有时将其称为非侵袭性或侵袭前期乳腺癌。
侵袭性(浸润性)癌
胰腺的外分泌细胞和内分泌细胞形成类型完全不同的肿瘤。
外分泌肿瘤
此类肿瘤是迄今为止最常见的胰腺癌类型，且多数胰腺外分泌肿瘤是恶性的。外分泌胰腺癌中约95％是腺癌(腺癌是始于腺细胞的癌)。这些癌通常始于胰导管中，但其有时是从制造胰酶的细胞发展而来(腺泡细胞癌)。
外分泌胰导管癌的较不常见的类型包括腺鳞癌、鳞状细胞癌和巨大细胞癌。
内分泌肿瘤
内分泌胰腺肿瘤并不常见。作为一个群体，还将其称为胰腺神经内分泌肿瘤(NET)，或有时称为胰岛细胞肿瘤。胰岛细胞肿瘤有几种亚型。根据其所始于的制造激素的细胞的类型来命名每种亚型。
用来描述外分泌胰腺癌的分期的主要系统是美国癌症联合委员会(AJCC)的TNM系统，由美国癌症协会(ACS)提供。用于分期的TNM系统包含3条关键信息：
T描述了原发瘤的尺寸，以厘米(cm)测量，且描述了癌是否已在胰腺内扩散或扩散到了附近器官。在TX、T0、T1、T2、T3和T4间加以区别，其中数字越大，表明疾病越晚期。
N描述了向附近(区域性的)淋巴结的扩散。N的类别包括NX、N0和N1。
M表示癌是否已转移(扩散)至身体的其他器官。(胰腺癌扩散的最常见部位是肝、肺和腹膜——消化器官周围的空间。)M的类别包括MX、M0和M1。
在确定了T、N和M的类别后，将此信息组合以指定分期，即被称作时期划分的过程。
0期(Tis，N0，M0)：肿瘤局限于胰导管细胞的顶层，且并未侵袭更深的组织。其并未扩散至胰腺外部。有时将这些肿瘤称为原位胰腺癌或胰腺上皮内瘤变III(PanInIII)。
IA期(T1，N0，M0)：肿瘤局限于胰腺，且尺寸小于2cm。其并未扩散至附近的淋巴结或远距离部位。
IB期(T2，N0，M0)：肿瘤局限于胰腺，且尺寸大于2cm。其并未扩散至附近的淋巴结或远距离部位。
IIA期(T3，N0，M0)：肿瘤正在生长到胰腺外部但未进入大血管。其并未扩散至附近的淋巴结或远距离部位。
IIB期(T1～3，N1，M0)：肿瘤局限于胰腺或者正在生长到胰腺外部但未进入附近的大血管或主神经。其已扩散至附近的淋巴结但未至远距离部位。
III期(T4，任何N，M0)：肿瘤正在生长到胰腺外部进入附近的大血管或主神经。其可能已经或尚未扩散到附近的淋巴结。其并未扩散至远距离部位。
IV期(任何T，任何N，M1)：癌已扩散至远距离部位。
虽然并非正式属于TNM系统，其他因素在确定预后(前景)中也是重要的。有时将癌症级别(在显微镜下观察时，细胞的异常程度)以等级G1～G4排列，其中G1癌看上去最像正常细胞且具有最佳前景。
对于接受外科手术的患者，另一个重要因素是切除的程度——是否移除了肿瘤的全部。有时将该因素以等级R0(移除了目视可见的和显微镜下可见的全部肿瘤)～R2(未能除去一些目视可见的肿瘤)排列。
从实践角度讲，在不进行外科手术的情况下，通常不能准确确定癌已扩散了多远。这也是医生经常使用更简单的分期系统的原因，该系统根据是否可能通过外科手术来移除癌症而对癌症进行分组。将这些组称为可切除的、局部晚期的(不可切除的)和转移的。这些术语可以用来描述外分泌胰腺癌和内分泌胰腺癌。
可切除的：如果癌仅在胰腺中(或刚好扩散至胰腺外)并且外科医生能够移除整个肿瘤，则称其为可切除的。
局部晚期的(不可切除的)：如果癌尚未扩散至远距离器官但仍不能用外科手术来完全移除，则称其为局部晚期的。不能移除癌的原因通常是其有太多部分存在于附近的血管中。
转移的：当癌已扩散至远距离器官时，称其为转移的。仍可以进行外科手术，但其目标将是减轻症状而不是治愈癌症。
对胰腺神经内分泌癌的分期并不像外分泌胰腺癌那样。而是将统计数据分解为不同的时期：局部的(仅在胰腺中)、区域的(扩散至附近的淋巴结或组织)和远距离的(扩散至远距离部位，例如肝)。
通过在显微镜下的癌细胞的外貌来对膀胱肿瘤进行分组。
移行细胞癌(亦称泌尿道上皮癌)是到目前为止最常见的膀胱癌类型。此组内还有亚型。根据细胞形状和其是否倾向于扩散和侵袭至其他器官，来命名这些亚型。(如果其可能生长至膀胱壁内深处，则称其为侵袭性的，如果不可能，则其为非侵袭性的。)根据显微镜下细胞的外貌，对这些肿瘤进行等级划分。如果细胞看上去更像正常细胞，则将该癌称为低等级癌。当细胞看上去非常异常，则癌是高等级的。低等级癌倾向于更缓慢地生长，且其后果优于高等级癌。
该定义中还包括：鳞状细胞癌(不常见；通常是侵袭性的)；腺癌(不常见；几乎都是侵袭性的)；小细胞(罕见)。
该定义中还包括其他罕见的膀胱癌。
还将膀胱癌分期为：
0a期(Ta，N0，M0)：
癌是非侵袭性的乳头状癌。其已经向膀胱的中空中心生长但尚未生长至膀胱壁的肌肉或结缔组织中。其并未扩散至淋巴结或远距离部位。
0is期(Tis，N0，M0)：
癌是扁平的非侵袭性癌，亦称作扁平原位癌(CIS)。癌仅在膀胱内衬层中生长。其既未向膀胱的中空部分向内生长也未侵袭膀胱壁的肌肉或结缔组织。其并未扩散至淋巴结或远距离部位。
I期(T1，N0，M0)：
癌已生长至膀胱内衬层下的结缔组织层中，且未生长至膀胱壁的厚肌肉层中。癌并未扩散至淋巴结或远距离部位。
II期(T2，N0，M0)：
癌已生长至膀胱壁的厚肌肉层中，但其并未完全穿过肌肉而到达膀胱周围的脂肪组织层。癌并未扩散至淋巴结或远距离部位。
III期(T3或T4a，N0，M0)：
癌已完全通过膀胱而生长至膀胱周围的脂肪组织层中(T3)。其可能已经扩散至前列腺、子宫或阴道(T4a)。其未向骨盆或腹壁中生长。癌并未扩散至淋巴结或远距离部位。
IV期(T4b，N0，M0)或(任何T，N1～3，M0)或(任何T，任何N，M1)：
癌已通过膀胱壁而扩散至骨盆或腹壁(T4b)且/或已扩散至淋巴结(N1～3)且/或已扩散至诸如骨、肝或肺等远距离部位(M1)。
胆囊癌的类型
超过9成(即，超过90％)的胆囊癌是腺癌。腺癌是始于具有腺样性质的细胞的癌，这种细胞排列在身体的多种内表面和外表面(包括消化系统内部)。
值得特别提及的胆囊腺癌类型被称作乳头状腺癌，或只称作乳头状癌。其为在显微镜下观察时其细胞以手指样的伸出物形式排列的胆囊癌。通常，乳头状癌不太可能生长至肝或附近的淋巴结中。其倾向于具有比多数其他类型的胆囊腺癌更好的预后(前景)。在所有胆囊癌中，约有6％是乳头状腺癌。
存在能够发展为胆囊癌的其他类型的癌，例如腺鳞癌、鳞状细胞癌和小细胞癌，但这些并不常见。
胆囊癌的以下时期是根据AJCC的TNM系统来区分的：
0期：Tis，N0，M0：仅在胆囊的上皮层中存在小癌。其并未扩散至胆囊外部。
IA期：T1(a或b)，N0，M0：肿瘤生长至固有层(lamina propria)(T1a)或肌肉层(T1b)。其并未扩散至胆囊外部。
IB期：T2，N0，M0：肿瘤生长至肌周纤维组织。其并未扩散至胆囊外部。
IIA期：T3，N0，M0：肿瘤通过浆膜层延伸和/或直接生长至肝和/或另一种附近结构中。其并未扩散至淋巴结或远离胆囊的组织或器官。
IIB期：T1～T3，N1，M0：除了胆囊中的任何生长外，肿瘤已扩散至附近的淋巴结(N1)。其并未扩散至远离胆囊的组织或器官。
III期：T4，任何N，M0：肿瘤侵袭进入肝内的主血管，或已到达多于一个的除肝脏以外的附近器官。其可能已经或尚未扩散至淋巴结。其并未扩散至远离胆囊的组织或器官。
IV期：任何T，任何N，M1：肿瘤已扩散至远离胆囊的组织或器官。
乳癌
腺癌通常是指始于腺组织(即制造并分泌物质的组织)的癌类型。对于乳腺癌的情况，乳房的导管和小叶是腺组织，因此始于这些区域的癌通常称作腺癌。乳腺癌有若干类型，但其中一些相当罕见。在一些情况下，单个乳腺肿瘤可以具有这些类型的组合或具有侵袭性癌和原位癌的混合。
原位导管癌(DCIS；亦称管内癌)是最常见的非侵袭性乳腺癌类型。
侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)是最常见的乳腺癌类型。侵袭性(浸润性)导管癌(IDC)始于乳房的乳通道(导管)、突破导管壁并生长至乳房的脂肪组织中。就此而言，其可能能够通过淋巴系统和血流扩散(转移)至身体的其他部分。约8成(即，约80％)的侵袭性乳腺癌是浸润性导管癌。IDC患者显示出CD138的表达(Loussouarn等，2008)。
三阴性乳腺癌描述了其细胞缺乏雌激素受体和孕酮受体并且在其表面上没有过量的HER2蛋白的乳腺癌(通常是侵袭性导管癌)。相比多数其他类型的乳腺癌，三阴性乳腺癌倾向于更快速地生长和扩散。由于该肿瘤细胞缺乏这些确定的受体，激素疗法和靶向HER2的药物都不能有效抵抗这些癌(但是如有需要仍然可以使用化疗)。
在术语“乳癌”范围内的其他乳腺癌是炎性乳腺癌、髓样癌、化生性癌、黏液癌、管状癌、乳头状癌、腺样囊性癌(囊性腺样癌)、叶状肿瘤。
外科手术、放射或化疗组成了标准癌症疗法。有时采用激素疗法。激素疗法是全身性疗法形式。将其最常用作辅助疗法来帮助降低外科手术后癌症重现的风险，但也可以将其作为新辅助治疗来使用。还使用其来治疗已经在治疗后复发或已扩散的癌症。雌激素促进约2/3的乳腺癌的生长，所述乳腺癌包含雌激素受体(ER阳性癌)和/或孕酮受体(PR阳性癌)。因此，以使用了阻断雌激素效果或降低雌激素水平的若干方法来治疗ER阳性和PR阳性乳腺癌。然而，激素疗法对缺乏ER或PR的患者无效。
乳癌还遵从以下分期系统：
0期：非典型的细胞未扩散至导管或小叶(产乳器官)外部而进入周边的乳房组织。关于原位癌，将其分类为两种类型：“原位导管癌”(DCIS)，其为高度可治且非致命的极早期癌；和“原位小叶癌”(LCIS)，其并非癌，而是鉴定女性具有升高的发展乳腺癌的风险的指示征。
I期：癌不大于2厘米(约1英寸)且尚未扩散至周边的淋巴结或乳房外部。
II期：根据肿瘤的尺寸和其是否已扩散至淋巴结，将该时期划分为两类：
IIA期乳腺癌——肿瘤小于2厘米并且已扩散至最多3个腋下淋巴结。或者，肿瘤已生长到大于2厘米，但不大于5厘米，且尚未扩散至周边淋巴结。
IIB期乳腺癌——肿瘤已生长到2～5厘米并且已扩散至最多3个腋下淋巴结。或者，肿瘤大于5厘米，且尚未扩散至周边淋巴结。
III期：此时期也划分为两类：
IIIA期乳腺癌——肿瘤大于2厘米但小于5厘米，并且已扩散至最多9个腋下淋巴结。
IIIB期乳腺癌——癌已扩散至乳房附近的组织，包括皮肤、胸壁、肋骨、肌肉或者胸壁中或锁骨上的淋巴结。
IV期：此时，癌已扩散至其他器官或组织，例如肝、肺、脑、骨骼系统或锁骨附近的淋巴结。
肺癌
存在4种类型的神经内分泌肺肿瘤，即：大细胞神经内分泌癌、非典型类癌瘤、典型类癌瘤和小细胞肺癌。
类癌瘤是始于弥散神经内分泌系统的细胞的肿瘤。典型和非典型的类癌瘤在显微镜下看上去不同。典型类癌生长缓慢且仅在极少情况下扩散到肺外部，约9成(即，约90％)的肺类癌是典型类癌。
出于治疗目的，区分出了治疗方式非常不同的两种主要肺癌类型，即小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。如果癌同时具有两种类型的特征，则称其为混合型小细胞/大细胞癌。
在所有肺癌中，约有10％～15％是小细胞型。SCLC的其他名称是燕麦细胞癌和小细胞未分化癌。
该癌经常始于胸部中心附近的支气管中。虽然癌细胞小，但其可以快速分裂、形成大肿瘤并扩散至淋巴结和遍布全身的其他器官。极少选用外科手术，外科手术也从来不是所施予的唯一治疗。治疗包括细胞毒剂，例如消除该广泛传播的疾病的药物。
存在三种亚型的NSCLC，即鳞状细胞癌、腺癌、大细胞(未分化)癌。
非小细胞肺癌的分期
用来对非小细胞肺癌分期的系统是AJCC(美国癌症联合委员会)的系统。使用罗马数字0～IV(0～4)来描述各时期。将一些时期进一步划分为A和B。规则是，数字越小，癌的扩散程度越低。数字越大，例如IV期(4期)，意味着癌症越晚期。
还为鳞状细胞癌(头颈癌)开发了包括I期～IV期的相应的分期系统。I期癌症是小的、局部的且通常可治愈的，II期和III期癌症通常是局部晚期的且/或已扩散至局部淋巴结，而IV期癌症通常是转移的(已扩散至远距离的身体部分)且通常认为是不能手术的。
本发明情况下的治疗包括：防止或减缓进展、稳定疾病状态、消退疾病或改善与表达CD138的细胞相关的病症的一种或多种症状。治疗因此包括防止或减缓严重程度的升高或消退病症。对于MM的情况，通常仅有II期或III期活动性MM的患者接受初级治疗(最初仅以3～6个月的间隔观察I期患者或SMM患者)，本发明的治疗不仅包括对例如任何活动性时期的MM的治疗，而且包括对出现在以传统方式治疗的疾病状态之前的疾病状态形式的治疗。治疗还特别包括防止从一种疾病状态进展为下一种：对于MM的情况，这可以是例如从MGUS进展为SMM，或从SMM进展为活动性MM的I期或MM的其他期。对于外分泌胰腺癌的情况，例如，从I期进展到II期，其包括在此时期内由AJCC所建立的类别反映出的任何恶化，例如从IA到IB。然而，该术语还包括保持现状，例如保持稳定疾病和如下文所讨论的在受治疗的患者体内引发某种响应。如果患者显示出尤其是一种或多种以下情况的可观察减少和/或可测量减少或者消失，则患者也得到了成功的“治疗”，所述情况为：癌细胞数量的减少或癌细胞消失；肿瘤尺寸减小；对癌细胞浸润至周边器官包括癌扩散至软组织和骨的抑制(即，减缓至某种程度，且优选终止)；对肿瘤迁移的抑制(即，减缓至某种程度，且优选终止)；对肿瘤生长的某种程度的抑制；和/或与特定癌症相关的一种或多种症状在某种程度上的缓解；降低的患病率和死亡率；和生活质量问题的改进。通常，对于MM的情况，通过测量患者血清和/或尿中的M蛋白水平和/或测量患者血清和/或尿中的FLC水平，可以监控某种治疗对患者疾病状态的效果。对于与表达CD138的细胞相关的其他病症的情况，测量其他参数来评估本发明的治疗的效果。CRP是用于临床癌症监控的非特异性炎症参数。仅举几例，对于胰腺癌，可以测量的相关参数是CA 19-9(糖类抗原19.9，经常在胰腺癌中增多的肿瘤标志物)、胆红素或C-反应蛋白。此外，可以使用诸如超声波扫描术、CT、MRT等成像手段。在头颈癌中，使用了依赖于肿瘤类型的生物标志物(例如，针对鳞状细胞癌的SCC，针对Merkel细胞的NSE，CEA)；在乳腺癌中，可以使用CA 15-3Her2的表达和钙粘素的表达来作为标志物，同时通过诸如神经元特异性烯醇化酶(NSE)等血清标志物来监控治疗。
在诊断有症状的受试者的病况时，可以将膀胱肿瘤抗原(BTA)和NMP22测试与膀胱镜检(使用细的发光管在膀胱内进行观察)一起使用。这些测试还用来随访一些治疗后的患者，不过仍然推荐膀胱镜检和尿细胞学(使用显微镜来寻找尿中的癌细胞)作为用于诊断和随访的标准测试。在膀胱镜检之间，经常使用BTA和NMP22测试。正常值可以使得减少膀胱镜检的实施频率。然而，这些测试不能代替尿细胞学和膀胱镜检。
对于晚期膀胱癌，用于其他癌症的一些标志物(例如CEA、CA 125、CA 19-9和TPA)可能增多，并且可以用来在治疗过程中和治疗后随访患者。对于肺癌，不存在确定的标志物，CEA或NSE可能会增多。
已知诸如骨髓瘤细胞或乳癌细胞等肿瘤细胞可脱落CD138。表面CD138的丧失与骨髓瘤的较差预后相关。在诸如头颈癌或肺癌等其他肿瘤学适应征中还检测到了高水平的可溶CD138(Anttonen等，1999)。表面多配体蛋白聚糖-1的丧失与EMT(上皮间叶细胞转化)相关，该过程描述了恶性细胞转化为分化程度更低或差的细胞，且该转化与侵袭和转移期有关。这在例如转移的乳腺癌中有所报道(Loussouarn等，2008)。
药剂的有效量，特别是本发明的免疫偶联物或包含免疫偶联物的药物组合物的有效量，是指对“治疗”受试者特别是人受试者(患者)的疾病或病症所需的量。对于癌症的情况，例如MM，药剂的有效量可以减少癌细胞数量、减小肿瘤尺寸、抑制(即，减缓至某种程度，优选终止)癌细胞浸润至周边器官、抑制(即，减缓至某种程度，优选终止)肿瘤转移、在某种程度上抑制肿瘤生长、且/或在某种程度上缓解与该癌症相关的一种或多种症状。参见本文对“治疗”的定义。
“药代动力学等价量”，例如200mg/m2的“药代动力学等价量”是指免疫偶联物的下述量：在将所述免疫偶联物与用于治疗不良副作用(实际包括潜在的不良副作用)的试剂组合施用(包括共施用)时，所述免疫偶联物的量所导致的药代动力学与用200mg/m2的剂量时所观察到的相等，其中所述不良副作用主要作用于同样表达CD138的非靶细胞。这些等价量可以略小于200或略高于200，视另一试剂而定。包括例如小于160mg/m2、小于170mg/m2、小于180mg/m2、小于190mg/m2、小于210mg/m2、小于220mg/m2、小于230mg/m2和小于240mg/m2的有效量。例如，本领域的技术人员会预料到，与皮质激素类或抗生素的共施用会使免疫偶联物的剂量略微更高，甚至在对皮肤有副作用的情况下，但这是本领域技术人员能够容易确定的。
为了评估施用药物(此处为免疫偶联物)的成功程度(其产生功能性响应的能力，即，其功效)，区分了对施用的不同“响应”。
对于MM和其他浆细胞增生性疾病，将响应区分如下：
术语完全响应(CR)是指：对血清和尿的免疫固定阴性，且任何软组织浆细胞瘤消失，并且骨髓中的浆细胞小于5％。
术语严格完全响应(sCR)是指上文定义的CR，并且：具有正常的FLC比，且根据免疫组化或免疫荧光，骨髓中不存在无性繁殖细胞。
术语非常好的部分响应(VGPR)是指：血清和尿的M组分可通过免疫固定来检测到，但在电泳上检测不到；或者，血清M组分的减少90％以上或更多，且尿M组分小于100mg/24小时。
术语部分响应(PR)是指：血清M组分的减少超过50％，且24小时尿M蛋白减少90％以上或减少至小于200mg/24小时；如果血清和尿的M蛋白不可测量，则需要用相关(involved)FLC水平和非相关(uninvolved)FLC水平间的差值降低50％以上来代替M蛋白标准；如果血清和尿的M蛋白不可测量且血清游离轻链测定也不可测量，则需要用骨髓浆细胞减少50％以上来代替M蛋白标准，只要基线百分比(baseline percentage)大于30％即可；除上述标准以外，如果存在于基线处，则还要求软组织浆细胞瘤的尺寸减少50％以上(Durie等，2006)。
有关复发性/难治性骨髓瘤患者的术语轻微响应(MR)在本发明范围内是指：血清M蛋白的减少25％至49％，且24小时尿M蛋白减少50％～89％，其仍超过200mg/24小时；除上述标准外，如果存在于基线处，还要求软组织浆细胞瘤的尺寸减少程度为25％～49％；而且，溶解性骨损伤的尺寸和数量都没有增加(压缩骨折的出现并不排除响应)。
然而，虽然未被正式归类，响应还包括血清FLC水平下降至少30％、优选至少40％或50％。这在不能测量M蛋白的情况下特别重要。
对于本发明的浆细胞增生性疾病，术语稳定疾病(SD)是指不符合CR、VGPR、PR或进展性疾病的标准的情况，其中术语进展性疾病(PD)是指下述参数中的任何一个或多个从最低响应值升高25％：
-血清M组分(绝对增加必须≥0.5g/100ml)和/或
-尿M组分(绝对增加必须≥200mg/24小时)和/或
-仅在血清和尿M蛋白水平不可测量的患者中：相关FLC水平和不相关FLC水平间的差异(绝对增加必须大于100mg/l)
-骨髓浆细胞百分比(绝对百分比必须≥10％)
-新生骨损伤或软组织浆细胞瘤的确定发展，或现有骨损伤或软组织浆细胞瘤的尺寸的确定增加
-仅能够归因于浆细胞增生性病症的高血钙症的发展(校正后的血清钙高于11.5mg/100ml)。
术语复发性骨髓瘤在本文中是指受试者的活动性MM的一种形式，其中，所述受试者曾接受至少一种在先治疗方案，且其不符合复发性/难治性骨髓瘤的标准。
术语难治性骨髓瘤通常是指：在即使实施了治疗浆细胞的数量也在持续增多时的疾病状态，即，在进行评估时已证明，该疾病状态是对所实施的治疗方案不接受的疾病。
术语复发性/难治性骨髓瘤在本文中是指：在进行补救治疗(salvage therapy)时的疾病复发，或在最近一次治疗60天内发生的进展。
术语难治性表型包括任何类型的难治性骨髓瘤，即难治性骨髓瘤和复发性/难治性骨髓瘤。
术语复发性或难治性骨髓瘤覆盖了复发性骨髓瘤、难治性骨髓瘤和复发性/难治性骨髓瘤。
在下文更详细讨论的临床研究中，在进入所述研究前，受试者已接受了用至少一种免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂疗法进行的治疗，且该治疗已失败。如果受试者在采用他或她的先前方案时经历了进展性疾病(PD)，则将疾病考虑为治疗难治性的。
有关SMM患者的术语“进展为”例如“活动性MM”，在本发明的情况中是指：进展证据，所述进展基于针对MM的进展性疾病的IMWG(国际骨髓瘤工作组)标准；和据认为与潜在的无性繁殖浆细胞增生性病症有关的以下一种或多种：新生软组织浆细胞瘤或骨损伤的发展、高血钙(＞11mg/100ml)、血红蛋白减少2g/100ml以上和血清肌酸酐水平≥2mg/100ml(Kyle和Rajkumar，2009)。
多发性骨髓瘤的发病机理涉及骨髓瘤细胞通过细胞表面的粘附分子与骨髓基质细胞(BMSC)以及细胞外基质(ECM)的结合。该结合触发并因此可被认为最终负责引起多发性骨髓瘤细胞生长、抗药性、MM细胞在骨髓环境中的迁移(Munshi等，2008)。特别而言，多发性骨髓瘤细胞通过针对I型胶原的多配体蛋白聚糖-1(CD138)与ECM粘附，该粘附诱导了基质金属蛋白酶1的表达，从而促进了骨的重吸收和肿瘤侵袭(Hideshima等，2007)。多发性骨髓瘤细胞和骨髓微环境间的相互作用导致激活了多向性增生性和抗凋亡的级联。
对于多发性骨髓瘤患者，以及对于患有与骨痛相关的其他疾病的患者，存在多种支持性治疗来治疗该症状与其它症状。适合的药物包括可以延缓骨损伤的双膦酸盐(例如氨羟二磷酸二钠、唑来膦酸)。已证明这些试剂能够减少骨溶性骨损伤并防止骨折(Ludwig等，2007)。其主要通过静脉来给药，从而降低骨并发症(如骨折)的风险并降低异常高的血钙水平(高血钙症)。数据显示，双膦酸盐减少与MM相关的骨痛。如果骨较弱或破裂的话，患者还可以接受外科手术。
在一个实施方式中，免疫偶联物使骨痛和/或骨并发症(例如骨坏死)减少，特别是减少至可接受的水平。减少至可接受水平特别包括能够中断施用可减轻这些疼痛或以减少所述骨并发症为目的的药物。通常施用诸如氨羟二磷酸二钠(pamidronate)、唑来膦酸和氯膦酸盐(clodronate)等双膦酸盐来减轻MM患者的骨并发症(例如骨坏死)并由此减轻与所述并发症相关的骨痛。常见的双膦酸盐包括：用于口服施用的FOSOMAX、BONIVA、ACTONEL、DIDRONEL和SKELID，和用于静脉内的施用的BONEFOS、AREDIA和ZOMETA。
本发明的骨痛和/或骨并发症的减少可以使得施用至患者的镇痛药的量减少和/或使得为对抗那些并发症而施用的任何药物的量减少。所述减少可以是：(i)相对于之前施用的量减少，在所述之前时所述患者曾接受过(a)与本发明的治疗不同的、对引起骨痛和/或骨并发症的所述病症的治疗或(b)不曾接受过治疗；或(ii)相对于施用至患有同一疾病且处于疾病的大约相同时期的另一患者的量减少。这种减少优选为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％的减少，且优选是药物施用的完全终止。当后者得以实现时，即，当因为单独施用了本发明的免疫偶联物或施用了作为本发明的抗癌组合产品的一部分的本发明的免疫偶联物而使患者不再主动要求任何抗骨痛和/或骨并发症的药物时，即认为所述免疫偶联物的施用已使骨痛和/或骨并发症减少至可接受的水平。因此，为减轻骨痛和/或骨并发症而施用的药物所产生的不良副作用得到了减少或消除。
在多发性骨髓瘤细胞归巢至骨髓基质室后，多发性骨髓瘤细胞与BMSC间的粘附使具有血管生成活性和促进肿瘤生长活性的多种细胞因子上调，例如，白细胞介素-6(IL-6)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)(Hideshima等，2007)。由这些细胞因子引发的信号传导级联最终导致了MM细胞对常规治疗的抗性(Anderson等，2000；Hideshima等，2006)。
在正常的人的造血室中，CD138的表达限于浆细胞(Wijdenes，1996；Chilosi，1999)，且CD138不在外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红细胞上表达。特别而言，CD34+干细胞和祖细胞不表达CD138，且抗CD138的mAb并不影响造血干细胞培养物中的集落形成单位的数量(Wijdenes，1996)。在非造血室中，CD138主要在肺、肝、皮肤、肾和肠的单层和复层上皮细胞上表达。在内皮细胞上仅看到弱染色(Bernfield，1992；Vooijs，1996)。已报道CD138在人淋巴瘤细胞中以多态形式存在(Gattei，1999)。
已报道单克隆抗体B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1.BB.210、2Q1484、5F7、104-9、281-2，特别是B-B4，对CD138有特异性。其中B-B4、1D4和MI15既识别CD138的完整分子又识别其核心蛋白，并且据显示可识别相同或紧密相关的表位(Gattei，1999)。先前的研究报道，B-B4并不识别可溶性CD138，而是仅识别膜结合形式的CD138(Wijdenes，2002)。
最初的抗CD138抗体是由Diaclone SAS(法国)开发的，即鼠亲代MabB-B4，其系使用标准杂交瘤技术用人多发性骨髓瘤细胞系U266进行免疫化而产生的(Clement，1995；Wijdenes，1996)。B-B4与人多配体蛋白聚糖-1(CD138)上的核心蛋白残基90～93间的线状表位结合(Wijdenes，1996；Dore，1998)。与CD138的表达模式相符，已显示B-B4可与浆细胞系PRMI8226强烈反应，但不与内皮细胞反应。另外与CD138的表达模式相符的是，B-B4还与上皮细胞系A431(源自角化细胞)和HepG2(源自肝细胞)反应。免疫毒素B-B4-皂草素(saporin)也对浆细胞系PRMI8226具有高毒性，事实上其毒性明显高于游离的皂草素。然而，从所测试的两种上皮细胞系看，B-B4-皂草素仅对细胞系A431显示出毒性，虽然在无性系形成测定中B-B4-皂草素未显示出对A431细胞的生长物的抑制效果(Vooijs，1996)。其他研究者报道了MM相关抗原缺乏针对肿瘤的特异性(Couturier，1999)。
与类美登醇DM1共价连接的B-B4显示出对多发性骨髓瘤细胞系和细胞的选择性细胞毒性，以及在SCID小鼠的人多发性骨髓瘤异种移植模型中的抗癌活性(Tassone，2004)。
本发明使用术语肿瘤细胞来包括癌细胞以及可能会或不会构成实体瘤一部分的癌前期细胞。
本发明的靶向试剂能够与靶细胞所表达的分子联结，且包括肽和非肽。特别的是，本发明的靶向试剂包括靶向抗体和非免疫球蛋白靶向分子，所述非免疫球蛋白靶向分子可以基于非免疫球蛋白蛋白，非免疫球蛋白蛋白包括但不限于分子、和非免疫球蛋白靶向分子还包括非肽靶向分子，例如靶向性的DNA和RNA寡核苷酸(适体)，还有生理配体，特别是所讨论的抗原(例如CD138)的配体。
本发明的靶向抗体是天然抗体或基于天然抗体，或者以合成手段或通过遗传工程制得的，其与感兴趣的一种或多种细胞(靶细胞)上的抗原结合。本发明的靶向抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段。可以改造靶向抗体，从而例如提高其对靶细胞的亲和力(Ross，2003)或降低其免疫原性。可以将靶向抗体连接至包含效应物分子的脂质体制剂(Carter，2001)。抗体片段包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合区或可变区。本发明的抗体片段的实例包括：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，还有微型双功能抗体(diabody)；结构域抗体(dAb)(Ward，1989；美国专利第6,005,079号)；线状抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。在单链可变区片段抗体(scFv)中，可以通过含有例如序列(甘氨酸4丝氨酸)n的短氨基酸连接物来连接重链和轻链(VH和VL)，所述短氨基酸连接物具有足够的柔性来使两个结构域装配成具有功能的抗原结合口袋。增加各种信号序列可以使得靶向抗体进行更精确的靶向。增加轻链恒定区(CL)可以使得通过二硫键发生二聚体化，从而得到提高的稳定性和亲合力。如果可以获得针对感兴趣的靶标的mAb，则可以通过RT-PCR来获得用于构建scFv的各种区，其中，所述RT-PCT从提取自亲代杂交瘤的mRNA克隆出可变区。另一选择是，可以通过噬菌体展示技术从新产生scFv(Smith，2001)。本文所用的术语“功能性片段”，当用来描述靶向抗体时，意在指所述靶向抗体的部分，所述部分能够与所描述的抗体所特异性结合的抗原特异性地结合。本发明的双特异性抗体可以例如具有至少一个针对靶组织有反应性的臂和一个针对连接物部分有反应性的臂(美国专利公布20020006379)。本发明的双特异性抗体还可以结合靶细胞上的多于一个抗原(Carter，2001)。可以对本发明的抗体进行修饰，例如通过引入半胱氨酸残基来引入巯基的修饰(Olafsen，2004)。
根据本发明，靶向抗体可以源自任何来源，并且可以是但不限于骆驼抗体、鼠抗体、嵌合人/小鼠抗体或嵌合人/猴抗体，特别是嵌合人/小鼠抗体，例如nBT062。
人源化抗体是包含源自人抗体的序列和源自非人抗体的序列的抗体，其也在本发明的范围内。使抗体人源化的适合方法包括CDR移植(互补决定区移植)(EP0239400；WO 91/09967；美国专利第5,530,101和5,585,089号)、饰面(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 0592106；EP 0519596；Padlan，1991；Studnicka等，1994；Roguska等，1994)、链改组(美国专利第5,565,332号)和DeImmunosationTM(Biovation，LTD)。在CDR移植中，将小鼠互补决定区(CDR)，例如来自mAb B-B4的小鼠互补决定区(CDR)移植到人可变区框架中，随后将其与人恒定区接合，从而产生人B-B4抗体(hB-B4)。通过CDR移植而人源化的若干抗体现已进入临床应用，包括MYLOTARG(Sievers等，2001)和HECEPTIN(Pegram等，1998)。
表面重塑技术使用分子建模、统计分析和诱变的组合来修改抗体可变区的非CDR表面，从而使该表面模拟靶宿主的已知抗体的表面。在例如美国专利第5,639,641号中，公开了抗体表面重塑的策略和方法以及用于降低抗体在不同宿主中的免疫原性的其他方法。可以通过包括噬菌体展示法在内的本领域的多种已知方法来制造人抗体。另外参见美国专利第4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318号；和国际专利申请公布WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
本文中将下述物称为工程靶向抗体：已受到任何非天然修饰的靶向抗体，例如嵌合人/小鼠抗体或嵌合人/猴抗体，人源化抗体或经改造可以例如提高其对靶细胞的亲和力或降低其免疫原性的抗体，还有抗体片段，尤其是此类已受到任何非天然修饰的靶向抗体的功能性片段，微型双功能抗体；结构域抗体；线状抗体；单链抗体分子；和多特异性抗体。
嵌合抗体保持了非人抗体(例如，其所基于的鼠抗体)的抗体结合区域(ABR或Fab区)，而任何恒定区可以由例如人抗体来提供。通常，嵌合和/或抗体的恒定区交换不会影响抗体的亲和力，因为参与抗原结合的抗体区域不受此交换的影响。在本发明的优选实施方式中，本发明的工程抗体，特别是嵌合抗体，其结合亲和力(由KD值表示)可以高于其所基于的相应非人抗体。特别的是，nBT062抗体及基于其的抗体的抗体亲和力可以高于鼠B-B24。
在本发明另一个优选实施方式中，包含这些工程抗体/嵌合抗体的免疫偶联物也显示出此更高的抗体亲和力。在某些实施方式中，这些免疫偶联物还可以显示出其他有利性质，例如肿瘤负荷的降低程度比包含B-B4的其对应免疫偶联物的更高。在优选实施方式中，工程靶向抗体特别是嵌合靶向抗体显示出以小于1.6、小于1.5或者约1.4或小于1.4的解离常数KD(nM)为特征的结合亲和力，而与其鼠对应物的抗体亲和力以约1.6或大于1.6的解离常数KD(nM)为特征。包含靶向试剂(例如靶向抗体)的免疫偶联物可以以优选小于2.6、小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.2、小于2.1、小于2.0、小于1.9或约1.9的解离常数KD(nM)为特征，而包含鼠对应抗体的免疫偶联物可以以约2.6或大于2.6的解离常数KD(nM)为特征(比较表9，材料和方法)。
基础抗体分子是双功能结构，其中可变区结合抗原，同时剩余的恒定区可以引发不依赖于抗原的应答。抗体的主要类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是通过恒定区来确定的。这些类别可以进一步划分为亚类(同型)。例如，IgG类别具有4个同型，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，这些同型是通过恒定区来确定的。在各种人抗体类别中，仅人IgG1、IgG2、IgG3和IgM已知可以有效地激活补体系统。虽然恒定区不构成抗原结合部位，恒定区和铰链区的构造可以对分子赋予区段性的柔性，该柔性使得该分子可以与抗原结合。
不同的IgG同型可以结合诸如单核细胞、B细胞核NK细胞等细胞上的Fc受体，从而激活细胞以使之释放细胞因子。不同的同型还可以激活补体，从而导致局部或全身性的炎症。特别的是，不同的IgG同型可以以不同的程度结合FcγR。FcγR是属于Ig超家族的一组表面糖蛋白，其主要在白细胞上表达。FcγR糖蛋白分为三个类别，即FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。IgG1、IgG2和IgG3与各种这些FcγR糖蛋白类别牢固结合，而IgG4却显示出弱得多的结合。特别的是，IgG4是FcγRI的中等结合物，其引起相对低的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或甚至不引起ADCC，并且不结合FcγRIIIA或FcγRIIA。IgG4是抑制性受体FcγRIIB的弱结合物。此外，IgG4仅介导微弱的补体结合或不介导补体结合(complement fixation)，且仅介导微弱的补体依赖性细胞毒性(CDC)或不介导CDC。在本发明的情况下，可以具体采用IgG4来防止Fc介导的对肝FcR的靶向，这是因为IgG4不显示与LSEC(肝窦状隙内皮细胞)上的FcγRII的相互作用，不显示或显示出微弱的与Kupffer细胞(巨噬细胞)上的FcγRI-III的相互作用，且不显示与肝NK细胞上的FcγRIII的相互作用。进一步减少任何CDC的某些突变也是本发明的一部分。例如，已显示位于位置327、位置330和位置331处的IgG4残基可减少ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(Amour，1999；Shields，2001)。使抗体稳定的更多突变之一也是本发明的一部分(在本文中亦称其为“稳定化突变”)。这些突变特别包括IgG4的CH2区中的亮氨酸至谷氨酸的突变和IgG4铰链核心中的丝氨酸至脯氨酸的交换。在本发明的某些实施方式中，这些突变使半分子的量减少到了小于10％、小于5％且优选到小于2％或1％。此外，如此稳定化的抗体的体内半衰期可以提高若干天，包括1天、2天、3天、4天或多于5天(Schuurman，1999)。
当本发明述及包含赋予IgG4同型性质的工程靶向抗体的免疫偶联物时，其意思是，该工程靶向抗体显示的与表达Fc受体的细胞的亲和力比IgG1同型抗体显著降低。优选由明显有别于ABR的另外的抗体区来赋予这些性质，其中，所述另外的抗体区在人抗体的全部或部分中。结果是，与用IgG1同型抗体所通常观察到的诱导CDC或ADCC的潜力相比，诱导CDC或ADCC的潜力显著降低(相对于其IgG1同型对应抗体降低超过90％)或完全失去。通过使用处于其未偶联形式的工程靶向抗体，可以在细胞类测定中测量该性质。CDC和ADCC可以通过不同的方法来测量，例如在Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)中公开的方法或GUAVA细胞毒性测定。对于包含至少一部分赋予IgG4同型性质的工程靶向抗体的免疫偶联物，其总体益处是对结合特异性的改进和降低的毒性。所得到的降低的与Fc受体的亲和力还提高了对肿瘤细胞的抗原特异性靶向，从而使针对CD138阴性的细胞的毒性降低。
对于本文公开的包括靶向抗体在内的靶向试剂，还可以就其与抗原特别是与CD138的结合亲和力来对其进行描述或说明。靶向试剂(如靶向抗体)的优选结合亲和力的特征为小于1.6、小于1.5或者约1.4或小于1.4的解离常数KD(nM)。对于包含所述靶向试剂(如靶向抗体)的免疫偶联物，解离常数KD(nM)优选小于1.6、小于1.5或小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.2、小于2.1、小于2.0、小于1.9或约为1.9。
本发明的抗原结合区(ABR)将根据所采用的靶向抗体或工程靶向抗体的类型而有所不同。在天然存在的抗体中以及多数嵌合和人源化抗体中，抗原结合区是由重链的前2个结构域和轻链构成的。然而，在不含轻链的重链抗体中，抗原结合区将仅由例如重链的前2个结构域构成，而在将抗体分子的轻链和重链可变结构域组合在单多肽链中的单链抗体(ScFv)中，ABR仅由一条多肽分子提供。FAB片段通常通过木瓜蛋白酶消化来获得，且具有一条轻链和部分重链，因此包含仅具有一个抗原组合部位的ABR。另一方面，微型双功能抗体是具有两个抗原结合区的小抗体片段。然而，在本发明的情况下，靶向抗体或工程靶向抗体的抗原结合区是主要决定该靶向抗体或工程靶向抗体的结合特异性的任何区域。
如果称ABR或另一靶向抗体区“属于某个抗体”，例如人或非人抗体，其在本发明的情况下意思是ABR与对应的天然存在的ABR相同或基于对应的天然存在的ABR。如果ABR具有天然存在的ABR的结合特异性，则该ABR基于天然存在的ABR。然而，这种ABR可以包含例如点突变、添加、缺失或翻译后修饰(例如糖基化)。特别而言，这种ABR与天然存在的ABR序列可以具有超过70％、超过80％、超过90％、优选超过95％、超过98％或超过99％的序列同一性。
nBT062(另见图1)是鼠人嵌合IgG4mAb，即嵌合版本的B-B4。制造该嵌合版本的B-B4是为了降低HAMA(人抗小鼠抗体)应答，同时保持针对CD138的B-B4的抗体结合区域的功能性。令人惊奇的是，使用包含此工程靶向抗体的免疫偶联物而获得的结果要均一得多(减小了结果间的差异)。下文详述了制造nBT062的操作规程。表达nBT062的中华仓鼠卵巢细胞已于2007年12月11日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1，D-38124Braunschweig)。保藏号为DSM ACC2875。基于B-B4的CD138特异性嵌合抗体在本文中通常称作c-B-B4。
已经从对nBT062的核苷酸序列的翻译中预测了重链和轻链的氨基酸序列。将重链和轻链的预测氨基酸序列示于表3中。预测的可变区为粗体，预测的CDR有下划线。
表3：nBT062的预测的氨基酸序列
-nBT062重链预测序列(SEQ ID NO：1)：
1
51
101ASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)
C端赖氨酸易于收到剪切，并可能因某种程度的不完全剪切而存在。括号中的(K)并10不是SEQ ID NO：1的一部分。
-nBT062轻链预测序列(SEQ ID NO：2)：
1
51
101RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201LSSPVTKSFN RGEC
表4显示了对Krabat和Chothia的一般CDR定义和预测的nBT062的CDR的比较。
还可以使用完全人抗体。可以通过噬菌体展示方法来选择这些抗体，其中使用了CD138或其抗原决定簇来选择性地结合表达例如B-B4可变区的噬菌体(参见Krebs，2001)。将该方法有利地与亲和力成熟技术组合，从而提高抗体的亲和力。本文所述的所有抗体是分离的抗体(参见美国专利公布20090175863)。
在一个实施方式中，处于未偶联形式的靶向抗体的内化程度中等或较差。于37℃温育3小时后，中等内化为约30％～约75％的全部抗体内化，较差内化为约0.01％至最多约30％的内化。在另一个优选实施方式中，靶向抗体结合CD138，例如，抗体B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1.BB.210、2Q1484、5F7、104-9、281-2，特别是B-B4。通过使SP02/0骨髓瘤细胞与Balb/c小鼠脾细胞杂交而产生的杂交瘤细胞已于2007年12月11日保藏于DSMZ-德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1，D-38124Braunschweig)。这些表达B-B4的杂交瘤细胞的保藏号为DSMACC2874。在另一个实施方式中，靶向抗体基本不与非细胞表面所表达的CD138结合。当在本发明的情况下将特定抗体的名称与术语“靶向抗体”组合时，例如“nBT062靶向抗体”，其意思是该靶向抗体具有抗体nBT062的结合特异性。如果称靶向抗体是“基于”特定抗体，其意思是该靶向抗体具有该抗体的结合特异性，但可以采取与以上对靶向抗体的描述相符的任何形式。当在本发明的情况下将特定抗原的名称与术语“靶向抗体”组合时，例如“CD138靶向抗体”，其意思是该靶向抗体具有针对CD138的结合特异性。如果在本发明的情况下，举例而言，称靶向抗体“选择性地”作某事(例如，“选择性地靶向细胞表面所表达的CD138”)或对某物有“选择性”，其意思是，在所提供的实例情况下，与细胞表面所表达的任何其他抗原相比，对细胞表面所表达的CD138有显著的选择性(即，对CD138阳性细胞的亲和力高于CD138阴性细胞)。由于此选择性，可以大幅度减少或甚至避免指定环境中的不良副作用。
本发明的“非免疫球蛋白靶向分子”包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。该定义中所包括的非免疫球蛋白小蛋白经设计而对特别是表面所表达的CD138具有特异亲和力。这些非免疫球蛋白小蛋白包括基于框架(scaffold)的工程分子，例如分子，其分子量较低，例如10kDa～20kDa。适合的框架包括例如γ晶型。这些分子在其天然状态时对靶分子没有特异的结合活性。通过对暴露于溶剂的氨基酸进行局部限定的随机化来改造蛋白表面，从而产生了全新的结合部位。由此将之前的非结合性蛋白转化成了特异性的结合蛋白。此类分子可以经特定设计而结合靶标(例如CD138)且使得可以对一种或多种效应物分子进行特定递送(参见www.scilproteins.com上的scil ProteinsGmbH，2004)。另一类非免疫球蛋白靶向分子源自脂质运载蛋白(lipocalin)，且包括例如其在结构上与免疫球蛋白有些类似。然而，脂质运载蛋白由具有160～180个氨基酸残基的单多肽链构成。可以将脂质运载蛋白的结合口袋重新塑形，从而使之以更高的亲和力和特异性识别感兴趣的分子(参见例如Beste等，1999)。人造细菌受体，例如以商标市售的那些(AffibodyAB)，也在本发明的范围内。这些人造细菌受体分子是小的简单蛋白，并且可以由三螺旋束构成，所述三螺旋束基于蛋白A(金黄色葡萄球菌)的一个IgG结合结构域的框架。这些分子具有与多种免疫球蛋白相似的结合性质，但要更小多，其分子量通常不超过10kDa，并且也比较稳定。适合的人造细菌受体分子在例如美国专利第5,831,012、6,534,628和6,740,734号中有所描述。
其他“非免疫球蛋白靶向分子”是所讨论的抗原的生理配体。CD138的生理配体例如包括但不限于：ADAMTS4(聚蛋白多糖酶-1(aggrecanase-1))、抗凝血酶-3、bFGF、组织蛋白酶G、CCL5(RANTES)、CCL7、CCL11、CCL17、CD44、胶原蛋白(1型胶原蛋白、2型胶原蛋白、3型胶原蛋白、4型胶原蛋白、5型胶原蛋白、6型胶原蛋白)、CXCL1、弹性蛋白酶、gp120、HGF[肝细胞生长因子]、层粘附蛋白-1、层粘附蛋白-2、层粘附蛋白-5、中期因子(midkine)、MMP-7、中性粒细胞弹性蛋白酶和多效蛋白(pleiotrophin)(HBNF、HBGF-8)。非肽靶向分子包括但不限于结合CD138的DNA和RNA寡核苷酸(适体)。
本发明的“效应物分子”是分子或其衍生物或类似物，其结合至靶向试剂(特别是靶向抗体和/或工程靶向抗体)并产生所需的效应，例如，凋亡或其他类型的细胞死亡，或对靶细胞的持续细胞周期停滞。本发明的效应物分子包括能够在靶细胞中产生所需效应的分子，且包括但不限于细胞毒性药物，包括低分子量的细胞毒性药物(分子量小于1500Da、优选小于1400Da、小于1200Da、小于1000Da、小于800Da、小于700Da、小于600Da、小于500Da、小于300Da，但通常大于120Da)。根据本发明，这些细胞毒性药物通常是非蛋白质的生物细胞毒性药物，并且包含另一细胞毒性药物或在施用时诱导另一细胞毒性药物的产生，所述另一细胞毒性药物具有至少5个碳原子、10个碳原子、优选多于12个碳原子、经常多于20个碳原子且有时多于30、40或50个碳原子，且通常具有至少一个环结构，例如苯环，该环结构如苯环经常具有取代基。然而，经常相互连接的环结构是这些分子的一部分。这些非蛋白质的生物细胞毒性药物可以嵌入DNA中(DNA嵌入剂)或使DNA烷基化，抑制微管形成，是有丝分裂抑制剂、DNA结构完整性所涉及的酶(例如组蛋白脱乙酰基)的抑制剂或对细胞至关重要的酶的抑制剂，且引起对细胞代谢的破坏。还可以将效应物分类为放射性核素、生物响应修饰剂、成孔剂(pore-forming agent)、核糖核酸酶、具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联蛋白、反义寡核苷酸、抗代谢剂、抗氧化性物质、抗体或细胞因子以及其功能性衍生物或类似物/片段。
毒素可以包括：细菌毒素，例如但不限于白喉毒素或外毒素A；植物毒素，例如但不限于蓖麻毒素、其他生物碱和多酚；真菌毒素，例如α鹅膏蕈碱或更具体为蝇蕈毒素和鬼笔毒素。毒素可以不仅源自细菌，还可以源自真菌、植物、脊椎动物和无脊椎动物，所有这些毒素都可以以遗传手段或化学手段来进行修饰。此外，毒素还可以是环境毒素，例如但不限于甲基汞。效应物分子可以是蛋白，例如那些具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联蛋白，包括但不限于粒酶(granzyme)B、粒酶A、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、截短的Bid(tBid)、Bax和Bak。毒素还可以是海兔毒素(dolastoxin)10和海兔毒素15，其为从海洋海兔截尾海兔(Dolabella auricularia)中分离出的小肽，且已显示其与微管蛋白相互作用。
表5提供了可以作为效应物分子的低分子量细胞毒性药物的实例。
在优选实施方式中，特别是当免疫偶联物的靶向抗体所基于的抗体的天然形式可内化性较差时，效应物分子提高免疫偶联物的内部效应物递送。在另一个优选实施方式中，效应物在处于其原生形式时是非选择性的。在某些实施方式中，效应物在处于其原生形式时具有较高的非选择性毒性，包括全身性毒性。本发明的效应物分子的“原生形式”是在连接到靶向试剂以形成免疫偶联物之前的效应物分子。在另一个优选实施方式中，效应物分子的非选择性毒性在与靶向试剂偶联时基本消失。在又一个优选实施方式中，效应物分子在到达靶细胞时在靶细胞中引起细胞死亡或细胞周期停滞(包括持续的细胞周期停滞)。
本发明的效应物分子包括但不限于抗肿瘤试剂，特别是下文定义的细胞内化疗剂。
低分子量细胞毒性药物(分子量见上)可以优选是抗有丝分裂剂，更特别而言，是影响微管蛋白的试剂，其包括微管蛋白聚合的抑制剂，例如类美登醇、海兔毒素(及衍生物，如奥瑞斯汀(auristatin))和羧酚肽(crytophycin)，以及强力的紫杉类化合物(紫杉烷)药物(Payne，2003)。小分子高细胞毒性药物的定义中还包括其他微管蛋白干扰剂，例如埃博霉素(epothilone)类(例如，伊沙匹隆(ixabepilone))，和秋水仙碱衍生物(下文进一步讨论了微管蛋白干扰剂)。
效应物分子类美登醇包括具有任何来源的类美登醇，包括但不限于合成的美登醇和美登醇的类似物及衍生物。
美登素是最初源自埃塞俄比亚灌木美登木(Maytenus serrata)的天然产物(Remillard，1975；美国专利第3,896,111号)。该药物抑制微管蛋白聚合，导致有丝分裂阻断和细胞死亡(Remillard，1975；Bhattacharyya，1977；Kupchan，1978)。美登素的细胞毒性比临床使用的影响微管蛋白聚合的抗癌药物(例如长春花生物碱和紫杉酚(taxol))的细胞毒性高200～1000倍。然而，美登素的临床试验表明其因较高全身性毒性而缺乏治疗前景。美登素和类美登醇具有高细胞毒性，但是，其严重的全身性副作用极大地限制了其在癌症治疗中的临床应用，该副作用主要由于其对肿瘤的较差选择性。用美登素进行的临床试验显示出对中枢神经系统和胃肠系统的严重不良作用。
已经从包括滑桃树(Trewia nudiflora)种子组织在内的其他植物中分离出了类美登醇(美国专利第4,418,064号)。
某些微生物也产生类美登醇，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。
本发明涉及具有任何来源的类美登醇，包括以下专利所公开的合成美登醇和美登醇类似物：例如，美国专利第4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,371,533、4,424,219和4,151,042号。
在优选实施方式中，类美登醇是含巯基的类美登醇，且更优选根据Chari等的美国专利第6,333,410号或Chari等(Chari，1992)中所公开的方法来制造。
在本发明的情况下，DM-1(N2-去乙酰基-N2-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)是优选的效应物分子。DM1的细胞毒性比美登素大3～10倍，并且已通过用二硫键将DM1连接到针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体上而将DM1转变成了前药。这些偶联物(有时称作“肿瘤激活的前药”(TAP))中的某些在血液隔室中并无细胞毒性，这是因为其在与靶细胞联结并被内化时得到激活，从而释放药物(2001)。已开发了若干种抗体-DM1偶联物(Payne，2003)，且已在临床试验中对其进行了评估。例如，对结肠直肠癌患者的huC242-DM1治疗得到了良好的耐受，不诱导任何可检测的免疫应答，且循环时间长(Tolcher，2003)。
其他特别优选的类美登醇包含具有空间位阻的巯基键的侧链，例如但不限于类美登醇N2′-去乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素，亦称作“DM3”，和N2′-去乙酰基-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素，亦称作“DM4”。DM4的合成示于图3和图4中，并且在本文别处有所描述。DM4与DM1和DM3的不同之处在于DM4在其αC上带有甲基。这在DM4通过连接物(特别是，但不限于，包含二硫键的连接物)连接到靶向试剂(例如nBT062)上时造成了空间位阻。美国专利公布2004/0235840(公布于2004年11月25日，并通过引用将其完整地并入本文)公开了带有空间位置受阻的巯基的多种的类美登醇(具有一个或两个取代基，特别是烷基取代基，例如DM4的甲基取代基)。DM3和DM4的与硫原子相邻的碳原子上的烷基(例如甲基)所带来的空间位阻可以影响免疫偶联物的细胞内切割速率。可变的烷基单元因此可以影响体外和体内的效力、功效和安全性/毒性。
据Goldmahker等在美国专利公布2006/0233814中的报道，一旦药物在其靶标处得到释放，这种位阻会诱导游离药物的烷基化(例如，甲基化)。该烷基化可以提高药物的稳定性，从而使得所谓的旁观者效应可以出现。然而，本领域的技术人员将意识到，含有位于当用连接物将效应物连接到靶向试剂上时会造成空间位阻的位置上的取代基(例如烷基)的其他效应物分子也是本发明的一部分(美国专利公布2004/0235840)。优选的是，该位阻诱导化学修饰(例如游离药物的烷基化)来提高其总体稳定性，这使得该药物不仅可以在表达CD138的肿瘤细胞中诱导细胞死亡或持续的细胞周期停滞，而且还可以可选地影响例如通常不表达CD138的辅助细胞，例如支持或保护肿瘤不受药物影响的辅助细胞(特别是肿瘤基质和肿瘤脉管系统的细胞)，从而使其支持或保护功能减弱或丧失。
在I期和II期临床试验中评估了美登素，该临床试验由美国国家癌症中心(NCI)依IND#11,857(于1975年9月19日提交至FDA)而资助。在血液恶性肿瘤患者中观察到了完全响应和部分响应，在患有广谱实体瘤的患者中观察到了部分响应(Blum和Kahlert，1978；Issell和Crooke，1978；Chabner等，1978；Eagan等，1978；Cabanillas等，1978)。但是却注意到了明显的毒性，包括恶心、呕吐、腹泻、肝功能检测升高、嗜睡和外周神经病(参见美登素IND#11,857，年度报告，1984年2月；Blum和Kahlert，1978；Issell和Crooke，1978；Chabner等，1978)。毒性效果阻止了进一步的开发。
一类微管蛋白干扰剂包括紫杉烷(Payne 2003)，尤其是高效力的紫杉烷和包含巯基或二硫化物基团的紫杉烷。紫杉烷是有丝分裂纺锤体毒，其抑制微管蛋白的解聚，导致微管装配速率升高和细胞死亡。在例如美国专利第6,436,931、6,340,701、6,706,708号和美国专利公布20040087649、20040024049和20030004210中，公开了本发明范围内的紫杉烷。在例如美国专利第6,002,023号、美国专利第5,998,656号、美国专利第5,892,063号、美国专利第5,763,477号、美国专利第5,705,508号、美国专利第5,703,247号和美国专利第5,367,086号中，公开了其他紫杉烷。本领域技术人员将意识到，PEG基化的紫杉烷(例如美国专利第6,596,757号中描述的那些)也在本发明的范围内。
本发明包括影响DNA的其他效应物分子，更特别的是，嵌入试剂，例如蒽环类及衍生物(道诺霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)、多柔比星(doxorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星()pirarubicin、佐柔比星(zorubicin))，和蒽二酮类，例如链霉素衍生的物质(放线菌素、丝裂霉素、博来霉素、放线菌素A(aactinomycin))或安吖啶。
效应物分子可以是更特别的DNA烷基化剂，例如，且更特别是氮芥及类似物(例如环磷酰胺、美法仑、雌氮芥)、烷基磺酸酯、亚硝基脲、环乙亚胺、肼、乙烯亚胺以及诸如三亚胺醌(Trenimon)和二溴甘露醇(甘露醇类似物)等其他物质。特别的是，优选的DNA烷基化剂是CC-1065类似物或衍生物(美国专利第5,475,092、5,585,499、6,716,821号)和倍癌霉素(duocarmycin)。
CC-1065是强力的抗肿瘤抗生素，其分离自泽耳链霉菌(Streptomyceszelensis)，且已在体外显示出其具有突出的细胞毒性(美国专利第4,169,888号)。本发明的范围内还包括例如美国专利第5,475,092、5,585,499、5,739,350号中所描述的CC-1065类似物或衍生物。本领域技术人员将容易地意识到，美国专利第5,846,545号中所描述的经修饰的CC-1065类似物或衍生物，和例如美国专利第6,756,397号中所描述的CC-1065类似物或衍生物的前药，也在本发明的范围内。在本发明的某些实施方式中，可以例如按照美国专利第6,534,660号中的描述来合成CC-1065类似物或衍生物。
还包括了其他DNA烷基化效应物分子，例如铂类物质(如，卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、三铂(triplatin)、沙铂(satraplatin))。
在影响DNA的效应物分子中，还包括了拓扑异构酶I和II的抑制剂，例如喜树属(Camptotheca)来源的物质(贝洛替康(belotecan)、拓扑替康(topotecan))和鬼臼毒素及衍生物(依托泊苷、替尼泊苷)。
影响DNA的效应物分子的其他亚类包括抗代谢物，例如叶酸类似物(氨甲喋呤，已知是二氢叶酸还原酶抑制剂)或氨基蝶呤。还包括干扰嘌呤或嘧啶代谢的代谢物，特别是腺苷脱氨酶抑制剂(喷司他丁(pentostatin))或卤化的/核糖核苷酸还原酶抑制剂(克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine))、硫代嘌呤和噻唑呋林。其他抗代谢物包括DNA聚合酶抑制剂(阿糖胞苷)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(吉西他滨)和低甲基化剂(阿扎胞苷、丁西他滨)和核糖核苷酸还原酶抑制剂。更常见的还包括DNA交联物质，例如顺铂。
本发明的效应物分子可以是抗肿瘤抗生素，其定义为修饰或损伤DNA的效应物分子，包括烯二炔抗生素，例如卡奇霉素(calicheamicin，其包括例如γ1I，N-乙酰基卡奇霉素和卡奇霉素的其他衍生物)。卡奇霉素以序列特异性方式结合DNA的小沟，发生重排并露出自由基，从而导致双链DNA的断裂，进而导致细胞凋亡和死亡。美国专利第5,053,394号中描述了在本发明的情况下可以使用的卡奇霉素效应物分子的一个实例。该化合物与单克隆抗体一起用于免疫偶联物中，且公布为吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)和伊珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)。
烯二炔的亚组包括色素蛋白埃斯培拉霉素(esperamycin)和新制癌菌素。特别而言，曲贝替定(Trabectedin)，其也被归为DNA损伤剂类别，称作抗肿瘤抗生素。曲贝替定引起DNA骨架断裂，其可以分离自海鞘(亦称其为海鞘素(ecteinascidin)743或ET-743)，由ZELITA和JOHNSON&JOHNSON以品牌名YONDELIS销售。
另一组优选效应物分子是诸如但不限于影响细胞代谢的毒素等物质。特别而言，酶抑制剂(例如但不限于：Olaprib或更优选的蛋白酶体(例如硼替佐米)和蛋白激酶抑制剂，或脂肪氧合酶抑制剂(例如马索罗酚))是本发明的一部分。还包括受体拮抗剂，例如但不限于内皮素A受体拮抗剂(例如阿曲生坦(atrasentan))或性类固醇(例如干扰雌酮代谢的睾内酯)。另外包括了与雌激素受体相互作用的物质，例如植物衍生的多酚，例如但不限于被称作植物雌激素的类异黄酮、芪、水飞蓟素、苯丙素苷(phenylpropanoid glycoside)。
还适合作为效应物分子的是影响细胞代谢的物质，例如用于光动力疗法或放射疗法的物质，包括但不限于卟啉衍生物(例如δ-氨基乙酰丙酸)。乙丙昔罗(efaproxiral)是放射致敏剂，其通过降低血红蛋白-氧亲和力来提高氧水平。还包括类维生素A(第一、第二和第三代)，特别是维甲酸(ATRA)，即全反式视黄酸，用来治疗急性早幼粒细胞白血病(APML)，由ROCHE针对此适应征以品牌名VESANOID销售。类维生素A是在化学上与维生素A相关的一类化合物，其发挥多种功能，例如激活肿瘤抑制基因。目前，其用来治疗皮肤癌和炎性皮肤病症。
在另一优选实施方式中，效应物分子可以影响信号传导途径，例如但不限于钙信号传导。实例是三氧化二砷或氯化三甲基锡，其中后者是具有较高毒性的有机锡化合物。
本发明还包括影响抗药性机制的效应物分子，其可以包括例如抗多药物抗性(anti-multidrug resistance activity)(通过P-糖蛋白抑制)。二环杂芳族化合物及衍生物可以作为非限制性实例。
另一个效应物分子类别可以包括干扰凋亡信号传导途径的物质或更特别为蛋白，包括但不限于反义寡核苷酸，更特别为寡脱氧核苷酸，例如Oblimersen (INN，商品名Genasense；亦称Augmerosen和bcl-2反义寡脱氧核苷酸G3139)，其为实际上作为对若干类型癌症(包括慢性淋巴白血病、B细胞淋巴瘤和乳腺癌)的可能的治疗而被研究的反义寡脱氧核糖核苷酸。已提出，该化合物可以通过阻断Bcl-2的产生并通过使癌细胞对化疗更敏感而杀死癌细胞。可以作为效应物分子的另一类诱导凋亡的物质包括植物多酚，例如但不限于水飞蓟素，其能够干扰细胞周期调节因子和参与凋亡的蛋白。
其他效应物分子可以包括酶，例如但不限于天门冬酰胺酶或具有抗肿瘤活性的其他酶。
本发明的药物-效应物分子还可以是抗原生动物药物，例如米替福新。
在另一个实施方式中，效应物分子可以是植物多酚，例如但不限于补骨脂素及其羟基代谢物。
具有一种上述抗肿瘤活性(例如，诱导凋亡、细胞周期停滞)或其他活性(例如清除自由基、金属螯合活性、雌激素受体干扰活性、抗氧化剂、干扰药物代谢酶)的植物多酚，例如，类黄酮、鞣质(原花色素)、芪类物质、类姜黄素和木脂体也是可能的效应物分子。更具体而言，能够作为具有抗氧化和细胞保护性质的金属螯合物而嵌入DNA的补骨脂素及其羟基代谢物是优选的效应物分子。特别优选的是白藜芦醇及多羟基化的衍生物，以及类黄酮，例如儿茶素和表儿茶素，更具体为表没食子儿茶素3-没食子酸酯，其可以充当抗氧化剂。
对效应物分子根据其机制进行宽泛分类也是可行的：
抗肿瘤药和免疫调节剂(ATC码L01)特别是“细胞内化疗剂”
ATC：解剖学治疗学化学分类系统(WHO)
1)抗有丝分裂剂或影响微管的分子(微管蛋白结合剂)，例如长春花生物碱及类似物(长春花生物碱(长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛、长春瑞滨)和紫杉烷(紫杉醇、Larotaxel、紫杉萜))多拉司他汀(及衍生物，例如奥瑞斯汀)和羧酚肽，美登素和秋水仙碱衍生物，埃博霉素(例如伊沙匹隆)。
2)影响DNA复制
a)嵌入试剂，例如蒽环类(道诺霉素、戊柔比星、多柔比星、阿柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、佐柔比星)，和蒽二酮类，例如链霉素衍生的物质(放线菌素、丝裂霉素、博来霉素、放线菌素D)或安吖啶，
b)烷基化剂，例如氮芥、亚硝基脲、烷基磺酸酯、环乙亚胺、肼(甲基苄肼)、三氮烯、环氧化物、乙烯亚胺、六甲蜜胺、二溴甘露醇、倍癌霉素及类似物/立体异构体、三亚胺醌、雌氮芥、CC-1065，
c)烷基化样试剂，例如铂(例如，卡铂、奈达铂、奥沙利铂、四硝酸三铂、沙铂)，
d)拓扑异构酶I特异性抑制剂，例如喜树属物质(贝洛替康、拓扑替康)，
e)拓扑异构酶II特异性抑制剂，例如鬼臼毒素及衍生物(依托泊苷、替尼泊苷)，
f)通过干扰下述物而影响DNA/RNA合成的抗代谢物：
-叶酸，例如二氢叶酸还原酶抑制剂(例如氨甲喋呤、氨基蝶呤)、胸苷酸合成酶抑制剂，
-嘌呤，例如腺苷脱氨酶抑制剂(喷司他丁)、卤化的/核糖核苷酸还原酶抑制剂(克拉屈滨、氯法拉滨)、硫代嘌呤、噻唑呋林，
-嘧啶，例如DNA聚合酶抑制剂(阿糖胞苷)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(吉西他滨)、低甲基化剂(阿扎胞苷、丁西他滨)，
-脱氧核糖核苷酸，例如核糖核苷酸还原酶抑制剂羟基尿素，
g)其他DNA交联剂，例如铂类化合物(例如顺铂)，
3)其他DNA干扰物质，例如，诸如爱萨霉素A(Elsamicin A)等“抗肿瘤/细胞毒性抗生素”，诸如CC-1065等其他抗生素，以及抗生素亚类，如细菌来源的烯二炔卡奇霉素或色素蛋白烯二炔埃斯培拉霉素(esperamicin)(极具毒性的DNA剪接剂)或新制癌菌素(新制癌菌素抗生素组的其他成员是巨毛霉素、放线菌黄质、可达菌素(kedarcidin)和马杜肽菌素(maduropeptin))或曲贝替定(DNA骨架断裂)，
4)影响细胞代谢的毒素，例如HSP90抑制剂、氯尼达明(Lonidamide)(抑制呼吸和糖酵解，从而导致细胞ATP减少)
a)酶抑制剂，例如Olaprib(PARP抑制剂)、CDK抑制剂(Alvocidib)、蛋白酶体(硼替佐米)、蛋白激酶抑制剂、马索罗酚(脂肪氧合酶抑制剂)，
b)受体拮抗剂，例如马桑苷(甘氨酸受体拮抗剂(植物毒素))、阿曲生坦、类维生素X受体(贝沙罗汀)、诸如睾内酯等性类固醇、雌激素受体干扰物质，
c)光敏剂或用于光动力疗法的其他化合物(卟吩姆钠(Porfirmer Sodium))、卟啉衍生物(例如δ-氨基乙酰丙酸)，
d)放射致敏剂，例如乙丙昔罗，其通过降低血红蛋白-氧亲和力来提高氧水平，
e)影响信号传导途径(例如，Ca2+信号传导)的物质，例如，三氧化二砷和氯化三甲基锡，
f)干扰代谢的其他物质，例如类维生素及衍生物维甲酸(ATRA)，
5)影响表观遗传学过程，例如HDAC抑制剂(例如帕比司他(Panobinostat)、伏立诺他(Vorinostat)、丙戊酸、MGCD0103(莫西司他(Mocetinostat))，这些目前处在临床开发阶段，针对皮肤T细胞淋巴瘤、急性骨髓白血病、霍奇金淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤)，
6)影响抗药性机制，例如抑制P-糖蛋白的二环杂芳族化合物，
7)诱导凋亡信号传导/机制的物质，包括蛋白以及反义寡脱氧核苷酸，如Oblimersen(商品名Genasense)等，
8)酶，例如天门冬酰胺酶，
9)抗原生动物药物，例如米替福新，
10)具有一种上述抗肿瘤活性(例如，诱导凋亡、细胞周期停滞)或另外的活性(例如清除自由基、金属螯合活性、雌激素受体干扰活性、抗氧化剂、干扰药物代谢酶)的植物多酚，例如，类黄酮、鞣质(原花色素)、芪类物质、类姜黄素和木脂体。更具体而言，补骨脂素及其羟基代谢物，白藜芦醇及多羟基化衍生物，类黄酮，例如儿茶素和表儿茶素，更具体为表没食子儿茶素3-没食子酸酯，
11)其他天然物质及衍生物，例如Eotoxin A、白喉毒素及其衍生物，其中，可以以化学手段或遗传手段来修饰所述衍生物。
还可以根据效应物分子所属的物质类别来对效应物分子进行分类，例如无机化合物、芳香化合物、金属类化合物、细胞代谢相关蛋白、酶、肽、寡核苷酸(例如反义核苷酸)、细菌毒素、植物衍生的毒素和多酚(例如鞣质)、类黄酮和香豆素以及类萜、生物碱、抗肿瘤抗生素(例如烯二炔抗生素)、霉菌毒素、来自无脊椎动物和脊椎动物的毒素、环境毒素。
本发明的免疫偶联物包含至少一种靶向试剂(特别是靶向抗体)和一种效应物分子。该免疫偶联物可以包含用于例如稳定化的其他分子。对于免疫偶联物，术语“偶联物”通常用来定义靶向试剂与一种或多种效应物分子的操作性联结，且并不试图仅指任何类型的操作性联结，特别不限于化学的“偶联”。只要靶向试剂能够结合靶位且所连接的效应物充分发挥所要求的功能(特别是在递送到靶位时)，任何连接模式都是适合的。本发明的偶联方法包括但不限于：在对效应物分子和/或靶向抗体进行或不进行预先修饰的情况下将效应物分子与靶向抗体直接连接，或者通过连接物来连接。可以在功能上将连接物分为例如：酸不稳定的、光不稳定的连接物，可酶切的连接物(例如可以通过肽酶来切割的连接物)。在本发明的多个实施方式中，优选可切割的连接物。可以在存在于细胞环境特别是细胞内环境中的且对经切割而释放出的药物没有不利效果的条件下切割此类可切割的连接物。诸如pH4或5等低pH，由于其存在于某些细胞内区室中，会切割酸不稳定的连接物，而通过例如红外光可以切割光不稳定的连接物。然而，优选的是在存在于多数细胞中的生理条件下切割的连接物或被该条件切割的连接物，且在本文中称其为生理可切割的连接物。因此，在本发明的多个实施方式中，优选二硫键连接物。通过可以在生理条件下发生的二硫键交换，可以切割这些连接物。优选的异双功能二硫键连接物包括但不限于：3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(参见例如Carlsson等，(1978))，4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)(参见例如美国专利第4,563,304号)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)(参见例如CAS登录号341498-08-6)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)(参见例如Yoshitake等，(1979))和4-甲基-4-[2-(5-硝基-吡啶基)-二硫代]戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SMNP)(参见例如美国专利第4,563,304号)。用于本发明组合物的最优选的连接物分子是SPP、SMCC和SPDB。
其他适合的连接物可以含有“不可切割的”键，例如但不限于马来酰亚胺甲基环己烷羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SMCC)，其是能够将化合物与含SH的化合物连接起来的异双功能连接物。双功能和异双功能连接物分子，例如糖类定向异双功能连接物分子(如S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼(TPCH))，也在本发明的范围内(Vogel，2004)。效应物分子，例如类美登醇，可以通过两个反应步骤的方法来与靶向抗体偶联，所述方法的第一步为：用交联试剂(例如吡啶基二硫代丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP))修饰所述靶向抗体，从而将二硫代吡啶基团引入所述靶向抗体。在第二步中，可以向经修饰的抗体添加具有巯基的反应性类美登醇(例如DM1)，从而将经修饰的抗体中的硫代吡啶基团置换掉，并且产生了由二硫键连接的具有细胞毒性的类美登醇/抗体偶联物(美国专利第5,208,020号)。然而，一步式偶联方法(例如Chari等的美国专利公布20030055226中所公开的方法)也在本发明的范围内。在本发明的一个实施方式中，将同一类或不同类的多个效应物分子连接至靶向抗体。如本文别处所讨论的，所采用的连接物的特性可以影响旁观者杀伤(Kovtun等，2006)。另见对图13的讨论。对于制备免疫偶联物的方法，另见专利第5,208,030、5,416,064、6,333,410、6,441,163、6,716,821、6,913,748、7,276,497号和美国申请2005/0169933号。
如美国专利第6,716,821号中所述，CC-1065类似物或衍生物可以通过例如PEG连接基团而与靶向试剂偶联。
通过连接物(美国专利第5,877,296号和美国专利第5,773,001号)或根据美国专利第5,712,374号和美国专利第5,714,586号中公开的偶联方法，可以将卡奇霉素偶联至靶向抗体。美国专利公布20040082764中公开了制备卡奇霉素偶联物的另一种优选方法。本发明的免疫偶联物可以采用重组融合蛋白的形式。
以带连接物或不带连接物的连接为形式的操作性联结在本文中称作“功能性连接”。
在本发明的情况下，基本上由某些成分构成的免疫偶联物意思是抗体/免疫偶联物由指定成分和不显著影响抗体基本特性的任何附加材料或成分构成。
图9在图9C和图9D中显示了包含鼠抗体BB4的免疫偶联物(BB4-SPP-DM1；图9C)和基于其的工程靶向抗体nBT062的免疫偶联物(nBT062-SPP-DM1；图9D)之间的靶向/结合的均一性差别。从这些图中可见，用包含工程靶向抗体的免疫偶联物获得的结果比用包含鼠抗体的免疫偶联物获得的结果要均一得多。这特别值得注意，因为BB4的抗体结合区在nBT062中并未被修饰。因此，包含鼠抗体的抗体结合区但不包含鼠抗体其他部分的免疫偶联物显示出了远超出本领域技术人员所预料到的结果的性质。
本发明的一些免疫偶联物具有空间位置受阻的效应物分子，并且包含可切割的连接物(HICL——受阻的免疫偶联物，可切割的连接物)。免疫偶联物的未受阻对应物(UI：未受阻的免疫偶联物)包含通过可切割连接物(CL)与效应物分子连接的针对CD138的工程靶向抗体，并且在本文中将其描述为UICL。UICL是包含工程靶向抗体但其中效应物分子的空间位置未受阻的与HICL的等同的免疫偶联物。HICL/UICL对的实例是BT062和nBT062-SPP-DM1。包含不可切割连接物的此类免疫偶联物的未受阻对应物(UINCL)是指包含工程靶向抗体的其中效应物分子的空间位置未受阻并且包含不可切割连接物的等同的免疫偶联物。对于BT062(nBT062-SPDB-DM4)，nBT062-SMCC-DM1可以构成包含不可切割连接物的此类未受阻对应物(UNICL)的实例。
免疫偶联物的抑制肿瘤生长的活性(＝肿瘤生长抑制活性)是相对量度。其描述了相对于最高性能的免疫偶联物(其活性设为100％)的活性的偶联物的肿瘤生长抑制活性。例如，如果将最高性能免疫偶联物(如BT062，其引起32天的肿瘤生长延迟(TGD))的活性设为100％，则例如nBT062-DM1(其显示出18天的肿瘤生长延迟(TGD))的活性计算如下：
肿瘤生长抑制活性＝
100×(TGDnBT062-DM1/TGDBT062)，
更一般地：
肿瘤生长抑制活性＝
100×(TGD样品/TGD参照物)。
表6提供了来自图11B所绘结果的适合实例：
TGD＊(天) ％活性＊＊
PBS 0 0
nBT062-SMCC-DM1 18 56
BT062 32 100
nBT062-SPP-DM1 13 40
表6：基于接受450μg/kg剂量的治疗组的针对SCID小鼠的MOLP-8肿瘤异种移植物的nBT062-DMx的肿瘤生长延迟(TGD)和％活性。
(*)以天数计的肿瘤生长延迟(TGD)是治疗组达到预定尺寸(160mm3)的平均时间(天)减去对照组达到该预定尺寸的平均时间(天)。
(**)肿瘤生长抑制活性＝100×(TGD样品/TGDBT062)。将BT062的活性定义为100％。
在表6提供的实例中，BT062提供了超出其未受阻对应物(nBT062-SPP-DM1)60％的抑制肿瘤生长的活性，和超出包含不可切割连接物的其未受阻对应免疫偶联物(nBT062-SMCC-DM1)44％的抑制肿瘤生长的活性。
如上文所讨论的，某些药物(例如类美登醇)虽然有效但毒性很高，其处于原生(即未偶联的)形式时会非选择性地毁坏细胞。将具有细胞毒性的类美登醇连接至抗体可以在药物达到靶细胞前使药物保持在非激活态(Lambert，2005)。若干种抗体-类美登醇偶联物已在进行临床开发。
用于治疗CD56阳性实体瘤(小细胞肺癌和神经内分泌癌)的IMGN901(huN901-DM1，BB-10901)已进行了I期和II期研究。在这些研究中，每6周连续4周施用IMGN901，且IMGN901通常得到了良好的耐受(Fossella等，2005；Lorigan等，2006；McCann等，2007；Carter和Senter，2008；Johnson等，2008)。该免疫偶联物的抗体部分，huN901，显示出了显著的CDC或ADCC活性。对同一免疫偶联物进行了治疗CD56阳性多发性骨髓瘤的研究。在I期研究中，每3周向使用成熟多发性骨髓瘤治疗已失败的CD56阳性多发性骨髓瘤患者连续2周施用IMGN901，该施用初步证明了安全性以及临床活性。据报道，18位患者已接受IMGN901(接受40、60、75、90、112和140mg/m2/周的患者各为3位)。据报道，初步PK结果表明了在剂量和观察到的最高血清浓度之间存在近似线性的关系。已观察到引人关注的临床活性具有可耐受安全性特性。使用欧洲骨髓移植标准，在3位经过大量预治疗的患者(接受60、90和112mg/m2/周的患者各为1位)中记录了确定的轻微响应(MR)。用60、90、112和140mg/m2/周的剂量时，报道了持久的稳定疾病(Chanan-Khan等，2007；Chanan-Khan等，2008)。另外，在实体瘤的I期研究中，也在对IMGN901进行研究。每3周，持续3天每天施用免疫偶联物。在小细胞肺癌、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)和其他实体瘤患者中，已注意到了初步的临床活性。正在进行剂量的逐步增加。
对MLN2704(huJ591-DM1)进行了治疗去势难治性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer)的研究(Milowsky等，2006；Brand和Tolcher，2006)。在进展性转移去势难治性前列腺癌患者中，MLN2704的I期试验研究了在每4周施用1次MLN2704时MLN2704的安全性特性、药代动力学、免疫原性和抗肿瘤活性。结果显示，可以安全地重复施用治疗剂量的MLN2704(Galsky等，2008)。用另一种DM1免疫偶联物(即靶向CD44v6的比伐单抗莫登素(bivatuzumab mertansine)，CD44v6在头颈癌和其他实体瘤上表达)进行了平行试验。在采用最密集的施用计划(每周施用)的临床试验中，与皮肤角化细胞上的CD44v6的结合在一位患者中介导了具有致命后果的严重皮肤毒性，其导致了比伐单抗莫登素的开发程序的终止(Tijink等，2006；Sauter等，2007；Rupp等，2007；Riechelmann等；2008)。
CD44v6不仅在各种癌细胞上表达，还在正常皮肤组织中表达，并且在此方面与CD138相似，CD138同样不仅在癌细胞上而且在正常皮肤组织中表达。令人惊奇的是，发现了BT062显示出临床功效，并且没有像比伐单抗莫登素所呈现的皮肤毒性那样的不可耐受的副作用。见图23，其显示，重复的最多160mg/m2的单剂量BT062至少导致了具有可控副作用的稳定疾病。绘于图23中的结果还显示，重复10次的20mg/m2单剂量(持续超过6个月的治疗)、重复5次的40mg/m2单剂量、重复5次的80mg/m2单剂量、重复6次的160mg/m2单剂量和首先1次200mg/m2单剂量随后为重复6次的160mg/m2单剂量(因此，总计量为1160mg/m2)得到了良好耐受(与003-005和002-012和002-011对应的患者仍在继续接受治疗)。
CD138还在正常血细胞和其他细胞上表达，例如上皮细胞，上皮细胞的毁坏会导致不可耐受的副作用。尽管如此，在图23中所绘的治疗方案中，直至120mg/m2也未发现对表达CD138的所有类型的非癌/非肿瘤细胞的剂量限制性毒性(dose limiting toxicity)，同时将此研究中的最大耐受剂量(MTD)确定为160mg/m2，且将最大施用剂量(MAD)确定为200mg/m2。未测试160mg/m2和200mg/m2之间的剂量。鉴于200mg/m2的剂量限制性毒性(DLT)，通常未给予更高的剂量。然而据观察，当随后用更低剂量(例如160mg/m2的剂量)进行施用时，上述DLT剂量仍是可接受的。针对表达CD138的非癌/非肿瘤细胞(表达CD138的非靶细胞)的临床非显著毒性在本文中是指针对此类细胞和相应器官的“临床可接受的毒性”或“可耐受的毒性”。相应的免疫偶联物施用量在本文中是指“可耐受量”。因此，在本发明的一个实施方式中，免疫偶联物对表达CD138的此类非靶细胞、特别是对表达CD138的上皮细胞展示出临床可接受的毒性，在异种移植小鼠模型中因人特异性而未利用BT062检测该毒性。
临床可接受的毒性包括发生最多至可控制或可耐受的水平的不良反应。不良反应的定义为与使用药物(此处为免疫偶联物)合理相关的不合需要的效果，其可能作为药物的药理作用的一部分而出现，或者就其出现而言可能是不可预测的。该定义并不包括在使用药物过程中所观察到的全部不良事件，而仅指有根据相信在药物和不良事件的出现之间有因果关系的那些。不良反应可以包括体征和症状、实验室参数的变化和重要身体功能的其他量度的变化，例如生命征和ECG。
如果说到施用，特别是以某个剂量施用化合物(例如免疫偶联物)对细胞，例如非靶细胞，特别是表达CD138的非靶细胞(非肿瘤细胞)“基本没有影响”，其意思是所述化合物与所述非靶细胞之间的任何相互作用都不造成不良反应或造成可控制/可耐受的不良反应。
进行了曲妥单抗的免疫偶联物形式(T-DM1)治疗过表达HER2的转移乳腺癌的I期研究，以研究每周施用或每3周施用一次的T-DM1的安全性和药代动力学。在两项研究中，与T-DM1有关的级别≥2的AE很少出现且可控制。在使用MTD或更低的剂量时观察到了目标肿瘤响应(Burris等，2006；Krop等，2007；Beeram等，2008；Holden等，2008)。已启动了II期研究，在该研究中对HER2阳性的转移乳腺癌每3周施用一次T-DM1(Beeram等，2008；Carter和Senter，2008；Holden等，2008)。正在进行针对二线HER2阳性转移乳腺癌的评估T-DM1的III期临床试验和针对一线、二线和三线HER2阳性转移乳腺癌的评估T-DM1的II期临床试验。对在进行赫赛汀类治疗(Herceptin-based treatment)时已发生进展的HER2阳性转移乳腺癌患者，计划进行与帕妥珠单抗组合的Ib期临床试验。已用比伐单抗莫登素完成了三个I期临床试验，比伐单抗莫登素是以在结肠直肠癌和表达C242的其他癌中发现的抗原为靶标的huC242抗体的DM1-偶联物。发现用每周施用和每3周施用一次的huC242-DM1进行的治疗是安全的且得到了耐受(Rowinsky等，2002；Tolcher等，2003；Helft等，2004)。
四项研究正在研究使用含巯基的DM4类美登醇(其也是BT062的成分)的免疫偶联物：
在患有表达Can-Ag的癌的受试者中，在I期研究中研究了比伐单抗莫登素的类似物，IMGN242(huC242-DM4)(Tolcher等，2006)。受试者每3周接受一次剂量为18mg/m2～297mg/m2的IMGN242的单IV输注。在其第二个治疗周期中以223mg/m2的剂量水平所治疗的6个受试者中，有2个遭受了剂量限制性毒性。168mg/m2水平的药物受到了良好耐受，且并未诱导任何可检测的抗体响应(Mita等，2007)。基于来自I期研究的最初安全性结果，启动了II研究，以针对治疗表达CanAg的胃癌来对168mg/m2的IMGN242进行评估(Sankhala等，2007)。在两个临床试验中用IMGN242对45位患者进行了治疗。基于安全性分析和全面的临床药代动力(pharmacokinetc，PK)/药效(pharmacodynamic，PD)分析，将II期研究修改为以126mg/m2的剂量治疗低血浆CanAg水平患者并以168mg/m2治疗高血浆CanAg水平患者(Qin等，2008)。
针对治疗患有CD33阳性急性骨髓白血病(AML)的受试者，还用偶联有DM4的huMy9-6抗体(AVE9633)进行了I期研究。该治疗方案由使用15mg/m2～260mg/m2的剂量每3周进行一次的IV输注组成。在单剂量研究中，未注意到相关的骨髓抑制或响应(Giles等，2006)。第二个I期研究用由28天周期中的第1天和第8天的IV输注组成的治疗方案来研究AVE9633，此I期研究也显示出AVE9633得到良好耐受，并且显示了抗白血病活性的证据，该证据包括具有持续至少4个月的完全响应(不足的血小板响应，依赖于输血)的1个受试者(Legrand等，2007)。另外两种DM4-免疫偶联物(SAR3419和BIIB015)已进入了I期临床试验。
此外，从其他免疫偶联物(例如靶向CD33的Mylotarg)已知，在低剂量时免疫偶联物的活性可能不足以治疗患者。通过例如施用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)来敏化表达CD33的靶细胞可以缓解此问题(Fianchi等，Annals of Oncology 200819(1)：128-134)。
以上研究说明，对不同的免疫偶联物特别是包含类美登醇(例如DM1或DM4)的免疫偶联物的响应区别很大。人受试者中的BT062试验在不同的稳定疾病剂量(特别是最多至160mg/m2的剂量)显示出针对表达CD138的非癌细胞的可耐受的毒性。
本文所述的免疫偶联物可以与细胞毒剂组合施用。本文中将这些组合称作抗癌组合产品。
目前，在临床试验中研究了特别是抗骨髓瘤药物的很多组合产品。使用组合产品的目的通常是：增强有效性，克服难治性表型(例如骨髓瘤细胞的难治性表型)，因使用更低浓度的组合产品配对成分中的一种而减少副作用，或其组合。例如，已显示出使用低剂量的来那度胺和低剂量的地塞米松可降低毒性(Rajkumar等，2010)。
尤其是在复发性或难治性多发性骨髓瘤患者中，正在研究和已经研究了若干种药物组合产品。
组合化疗剂的标准实例是长春新碱、地塞米松和多柔比星的三元组合产品(VAD方案)。
已将蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)与骨髓瘤药物(例如美法仑和泼尼松)进行了组合(VMP)。该组合产品导致了16％的完全响应率和89％的总体响应率(Mateos等，2006)。
已批准将硼替佐米与脂质体多柔比星组合用于复发性或难治性患者(Ning等，2007)。
在若干临床研究中研究了与地塞米松、美法仑、泼尼松和/或沙立度胺组合使用的硼替佐米。
在多发性骨髓瘤患者中，对与脂质体多柔比星、环磷酰胺和地塞米松组合的硼替佐米的研究也在进行中。目前正在研究含有伏立诺他的组合产品，其目的是使硼替佐米难治性患者对硼替佐米重新敏感。
口服施用的沙立度胺已与美法仑/泼尼松(MPT)(Facon等，2006)或者地塞米松或苯达莫司汀组合(等，2008)。
此外，与单独使用地塞米松相比，与地塞米松组合使用的免疫调节药物来那度胺导致了肿瘤进展时间延期和存活率升高(Weber等，2006)。在新诊断的患者中还已研究了与地塞米松组合的来那度胺(Rajkumar等，2005)以及来那度胺与美法仑/泼尼松的组合(RMP)(Palumbo等，2006)。
Lutz等的美国专利公布2010/0028346描述的某种免疫偶联物与化疗剂的协同效应。
在本文中，采用组合产品的一个目的是减少本发明的免疫偶联物的有效剂量，从而降低其副作用并开辟具有可接受副作用的新治疗途径。另一目的是减少先前采用的细胞毒剂(例如VELCADE或来那度胺)的有效剂量并优选降低这些试剂的副作用。类似的是，剂量积极结果(dosages Positive consequence)包括但不限于治疗延长、更高剂量、其他应用计划、对治疗的更好且更持久的响应。
通过使用本发明的免疫偶联物，可以使对诸如来那度胺、美法仑(研究进行中)等药物显示出难治性表型的患者再次敏感。
术语“细胞毒剂”包括“细胞毒性/癌药物”，其包括化疗剂，特别是通常在快速分裂的细胞中使用的化疗剂，即：
-烷基化剂，例如氮芥(例如美法仑、环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、尿嘧啶氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺)或亚硝基脲(例如，卡氮芥、洛莫司汀、链佐星)或烷基磺酸酯；
-烷基化样试剂，例如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂；或非经典烷基化剂，例如四嗪、氮烯唑胺、甲基苄肼、六甲蜜胺；
-蒽环类，例如多柔比星和脂质体多柔比星(DOXIL)；
-生物碱，例如长春新碱。
术语“细胞毒剂”还包括免疫调节药物(ImiD)，例如因其多向性免疫调节性质而在骨髓瘤治疗中使用的沙立度胺(或类似物)、来那度胺(CC-5013)、玻马利度胺(pomalidomide)、乙替咪(actimid)。它们通常通过抑制TNFα的产生而显示出抗炎活性，此外还显示出抗血管生成活性和免疫调节性质，例如T细胞共刺激和对调节性T细胞的影响(Quach等，2010)。
术语“细胞毒剂”还包括类固醇，例如但不限于地塞米松和泼尼松，还包括蛋白酶体抑制剂，例如在依赖于抑制促凋亡途径的赘生性细胞中诱导激活程序化细胞死亡的硼替佐米(VELCADE)或咔啡左咪(carfilzomib)。
其他强力的细胞毒剂包括：抑制酶拓扑异构酶II的依托泊苷；阿糖胞苷，当细胞周期停留在S期(DNA合成)时阿糖胞苷在进行转换时会损伤DNA并因此特别地影响快速分裂的细胞(例如癌细胞)。此外，诸如长春花生物碱、紫杉烷等微管抑制剂(如在上文的效应物分子篇幅中所述)也可以作为本发明的细胞毒剂。
该定义还包括：激酶抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)；或HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂，例如罗咪酯肽(romidepsin)；以及生长因子抑制剂，抗激素剂，抗血管生成剂，保心药，免疫刺激剂，免疫抑制剂，血管生成抑制剂，蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂。
该定义还包括抗体类细胞毒剂，抗体类细胞毒剂包括具有本领域认可的细胞毒性效果的免疫偶联物和抗体。抗CD40是优选的抗体。其他抗体包括但不限于例如AVASTIN(贝伐单抗)或MYELOMACIDE(米拉珠单抗(milatuzumab))。
沙罗度胺(Thalomide)(α-(N-苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺；沙立度胺)是免疫调节剂。沙立度胺的实验式是C13H10N2O4，且克分子量为258.2。沙立度胺的CAS编号为50-35-1。其看似具有多重作用，包括以各种方式抑制骨髓瘤细胞的生长和生存的能力，以及抑制新血管生长的能力。
来那度胺(REVLIMID)是沙立度胺的衍生物，其代表第二代免疫调节化合物(ImiD)，其最初是作为TNFα抑制剂被开发的。来那度胺的效果包括：生长停滞或凋亡，消除骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞的粘附，和调节促进骨髓瘤细胞的细胞生长、存活和抗药性的细胞因子(Morgan等，2006)。来那度胺对沙立度胺难治性患者有效。除了对免疫细胞的效果以外，已提示ImiD(例如来那度胺)会引起细胞周期停滞在G0/G1期。此外，认为ImiD使细胞粘附受体(VLA-4，VLA-5，CD138)下调(Quach等，2010)。
可以预期CD138的下调会减少任何CD138靶向试剂(例如BT062)与靶细胞的结合。
可以将蛋白酶体抑制剂进一步划分为以下亚组：
a)具有C端环氧酮结构的天然存在的肽衍生物，β-内酯衍生物，阿克拉霉素A，乳胞素(lactacystin)，clasto-乳胞素；和
b)合成抑制剂(包括经修饰的肽醛、α环氧酮结构、β环氧酮结构、乙烯基砜、硼酸残余物、频哪醇酯)。本发明优选的蛋白酶体抑制剂是硼替佐米(PS 341；VELCADE，见下文的讨论)。所提出的一种机制提示了蛋白酶体抑制可以防止促凋亡因子的降解，从而允许在依赖于抑制促凋亡途径的赘生性细胞中激活程序化细胞死亡。此外，硼替佐米引起G2/M细胞周期停滞(Wang等，2009)。因此，硼替佐米可能干扰作为本发明的免疫偶联物的一部分的抗有丝分裂剂，例如，干扰同样在该细胞周期阶段起作用的类美登醇DM4的效果。此外，参与凋亡的PARP(聚(ADP-核糖)聚合酶)切割也受到DM4和硼替佐米的影响。因此，包含抗有丝分裂剂的免疫偶联物与显示出硼替佐米特征的蛋白酶体抑制剂的组合不符合之前为获得协同效应而提出的一般原则(Takimoto等，2009)。
VELCADE(硼替佐米)是用来治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂。据信，VELCADE作用于骨髓瘤细胞，从而引起细胞死亡，和/或通过作用于骨微环境来间接抑制骨髓瘤细胞生长和生存。在不限于特定理论或作用模式的情况下，VELCADE因此破坏了正常的细胞过程，从而导致了促进凋亡的蛋白酶体抑制。
地塞米松是合成的糖皮质激素类固醇激素，其充当抗炎剂和免疫抑制剂。当施用至癌症患者时，地塞米松可以对抗癌症疗法的副作用。还可以单独给予地塞米松，或将其与其他抗癌剂(包括沙立度胺、来那度胺、硼替佐米、阿霉素或长春新碱)一起给予。
可以与BT062组合使用的治疗物质还包括免疫调节剂(例如，沙立度胺和来那度胺和玻马利度胺)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米和咔啡左咪)、类固醇(例如地塞米松)、烷基化剂和高剂量化疗、组合产品(例如，美法仑和泼尼松(MP)，长春新碱、多柔比星(阿霉素)和地塞米松(VAD))和双膦酸盐。
术语“与......组合”并不限于恰好同时的施用。相反，该术语涵盖了本发明的免疫偶联物与其他方案(例如放射疗法)或试剂(特别是上述细胞毒剂)在一定时间间隔内的依次施用，从而使其可以共同作用来提供益处(例如，活性升高，副作用减少)，其中，所述益处与仅使用本发明的免疫偶联物或者仅使用例如所述其他方案或试剂的治疗相比有所增加。优选的是，所述免疫偶联物和其他一种或多种试剂以加合方式作用，特别优选的是，它们以协同方式作用。适合的是，以对实现计划的目的有效的量来提供这些分子。熟练的医学从业者能够凭经验确定或通过考虑试剂的药代动力学和作用模式来确定每种治疗剂的适合剂量以及适合的施用时机和施用方法。本发明情况中所用的“共施用”是指与免疫偶联物同时施用，且经常以组合剂型施用。
协同效应是两种成分(例如免疫偶联物和细胞毒剂)的超过了严格加合效应的效应。下文进一步讨论的多种因素可以抵消这些协同效应。
协同性的计算方式如下(Yu等，2001；Gunaratnam等，2009)：
比率(r)＝预期FTV(组合)/观察到的FTV(组合)
FTV：分数肿瘤体积＝平均肿瘤体积(测试)/平均肿瘤体积(对照)
比率＞1则认为有协同性，而r＜1则表示小于加合。
比率(r)在大于1时还被称为“协同比”。
活性等级是对组合效果的另一种测量。该等级基于Log10细胞杀伤。
Log10细胞杀伤＝(T-C)/Td×3.32
其中，(T-C)或肿瘤生长延迟是治疗组(T)和对照组(C)的肿瘤达到预定尺寸(600mm3)所需的时间的中值(天)。Td是肿瘤倍增时间，其基于对照小鼠中的肿瘤体积中值；而3.32是每log细胞生长的细胞倍增数(Bissery等，1991)。大于2.8的Log10细胞杀伤表明所述组合具有高活性，2.0～2.8的log10细胞杀伤表明所述组合非常有活性，1.3～1.9的log10细胞杀伤表明所述组合有活性，0.7～1.2的log10细胞杀伤表明所述组合具有中等活性，小于0.7的log10细胞杀伤表明所述组合无活性。
对药物组合产品配对成分的选择
已发展了用于设计组合化疗方案的一套规则(Takimoto，2006)。遵循这些规则，通常会提高特定组合实现组合化疗相对于单试剂治疗的三种最重要的理论优势中的至少一种的机会，其中所述三种最重要的理论优势为：
1.)通过使用具有非干扰性剂量限制性毒性的试剂，使细胞杀伤最大化，同时使宿主毒性最小化；
2.)提高抗肿瘤细胞的药物活性的范围，其中所述肿瘤细胞对特定类型的疗法有内源抗性；和
3.)防止或减缓具有新抗性的肿瘤细胞的发展。
在选择用于组合化疗方案的试剂时，建议考虑的原则包括：
a)选择已知作为单一试剂诱导完全消退的药物，
b)应组合选择具有不同的作用模式的药物和具有加合或协同细胞毒性效应的药物，
c)选择具有不同的剂量限制性毒性的药物，
d)选择具有不同的抗性模式的药物，从而使交叉抗性最小化。
此外，应当以药物的最佳剂量和计划来施用药物(e)，并且应当以一致的间隔来进行施用，而无治疗期应当尽可能短，以考虑正常组织的恢复(f)(Takimoto等，2009)。
协同效应或仅加合效应可以被多种因素抵消：例如，通过例如相互结合，抗癌组合产品的成分可以使彼此失活。此外，抗癌组合产品的一种成分可以干扰另一种成分的作用模式。例如，来那度胺使诸如CD138等细胞粘附受体下调，CD138是本发明的免疫偶联物的靶标(Quach等，2010)。蛋白酶体抑制剂硼替佐米引起G2/M细胞周期停滞(Wang等，2009)，其还受到抗有丝分裂剂的影响。因此，如果免疫偶联物的效应物分子是类美登醇，其与硼替佐米会具有共同的作用靶标，这被认为是不利的。
已在癌症疗法中广泛使用的本发明的细胞毒剂的剂量、施用途径和推荐用法是本领域已知的，且已在例如Physician′s Desk Reference(PDR)等文献中有所描述。PDR公开了已用于治疗各种癌症的试剂的剂量。这些细胞毒剂的有效的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病的程度和本领域的技术医师所熟悉的其他因素，并且可以由医师来确定。2006年版的Physician′s Desk Reference(PDR)公开了沙立度胺(第979～983页)、VELCADE(第2102～2106页)和美法仑(第976～979页)的作用机制和优选的治疗剂量及给药计划。本领域技术人员可以参阅PDR，使用一种或多种以下参数，来确定可以根据本发明的教导而使用的化疗剂和偶联物的给药方案和剂量。所述参数包括：
1.综合索引，依照a)制造商b)产品(使用公司名称或有商标的药物名)c)类别索引(例如，“蛋白酶体抑制剂”、“DNA烷基化剂”、“美法仑”等)d)通用/化学索引(非商标的一般药物名称)。
2.药物的彩色图像
3.产品信息，与FDA标签相符，包括a)化学信息b)功能/作用c)适应征和禁忌症d)试验研究、副作用、警告。
本领域技术人员会意识到，免疫偶联物的优选工程靶向抗体部分nBT062的氨基酸序列可以发生变化而不失去抗体部分的靶向CD138的功能性。在抗原结合区(ABR)的重链可变区CD3包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基99～111并且轻链可变区CDR3包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基89～97时，尤其如此。有利的是，还分别保留了抗原结合区(ABR)的包含SEQ IDNO：1的氨基酸残基31～35和51～68的重链可变区CDR1和CDR2，和/或(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基24～34和50～56的轻链可变区CDR1和CDR2。
术语“序列同一性”是指对核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的量度。通常，对序列进行比对以获得排序最高的匹配。“同一性”本身在本领域中具有公认的意义且可以使用公开的技术来计算得到。(参见例如，Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M Stockton Press，NewYork，1991)。存在测量两个多核苷酸序列或多肽序列间的同一性的多种方法，术语“同一性”对技术人员而言是公知的(Carillo，H.和Lipton，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
通过常规使用已知计算机程序，例如用于起始序列比对的DNAsis软件(HitachiSoftware，San Bruno，Calif.)和随后的用于多序列比对的ESEE 3.0版DNA/蛋白序列软件(cabot@trog.mbb.sfu.ca)，可以确定任何特定核酸分子与例如nBT062的核酸序列或其部分的同一性是否为至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
通过常规使用已知计算机程序，例如BESTFIT程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package，8版，适用于Unix，Genetics Computer Group，University ResearchPark，575Science Drive，Madison，Wis.53711)，可以确定氨基酸序列与例如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或者其部分的同一性是否为至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法来找出两个序列间的最佳同源性区段。
当使用DNAsis、ESEE、BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定序列与本发明的参照序列的同一性是否为例如95％时，设定参数以使得：在参照核酸序列或氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许占参照序列中的核苷酸总数最多5％的同源性空位。
如果在本发明的情况下述及与特定序列的残基组合间的某一序列同一性，则该序列同一性涉及所有指定残基的总和。
如上文所讨论的，BT062是包含靶向CD138的嵌合抗体nBT062的免疫偶联物，其中nBT062通过连接物(此处为SPDB)与抑制细胞生长的类美登醇衍生物DM4连接。图1和图2提供了BT062的化学描绘图。包含nBT062和类美登醇效应物分子的免疫偶联物通常特征在于其连接物和类美登醇效应物，例如，nBT062-SMCC-DM1是包含nBT062、SMCC(含有硫酯键的“不可切割”的连接物)和作为效应物的DM1的免疫偶联物。更常见的是，还可以将包含nBT062和效应物分子的免疫偶联物描述为nBT062-连接物-效应物，或只描述为nBT062-效应物(nBT062N，其中N是本文所述的任何效应物，另见美国专利公布20090232810)。
在一个实施方式中，BT062结合CD138阳性的多发性骨髓瘤细胞。一旦靶细胞将免疫偶联物内化和/或释放，DM4就从靶向分子释放出，从而恢复其原有的DM4细胞毒性效力。因此，BT062提供了靶向型抗体有效载荷(TAP)，其中，在细胞毒性药物到达/内化进表达CD138的靶细胞前，DM4与nBT062的功能性连接使细胞毒性药物保持失活。
研究BT062在本文所讨论的多发性骨髓瘤细胞和动物模型中的细胞毒性的非临床研究的数据表明，在鼠模型中得到良好耐受的剂量的BT062具有非常显著的抗骨髓瘤活性。
对复发性或复发性/难治性多发性骨髓瘤患者正在进行开放式、剂量递增、重复单剂量的I期研究。
可以通过任何途径来施用本文公开的免疫偶联物，包括静脉内、胃肠外、口服、肌肉内、鞘内或作为气溶胶。递送模式将视所需的效果而定。技术人员将容易知晓本发明的特定治疗的最佳施用途径。适合的剂量将取决于施用途径和所指征的治疗，并且可以由技术人员根据目前的治疗规程来容易地确定。
包含本发明的免疫偶联物和/或任何其他细胞毒剂作为活性成分的药物组合物可以根据常规的药物配制技术来制备。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版(1985，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。通常，将有效量的活性成分与药物可接受的载剂相混合。载剂可以采用多种形式，视施用所需的制剂形式而定，例如，静脉内、口服、胃肠外、鞘内、透皮或通过气溶胶。
本发明的抗癌组合产品可以优选为药物组合物形式或为在不同容器中包含抗癌组合产品的成分的试剂盒形式。经常将试剂盒的成分以相互组合的方式施用，它们通常以组合剂型或以单独剂型共施用。此类试剂盒还可以包含例如其他成分、用于施用成分或组合产品的器件、用于合并成分的器件和/或如何使用并施用成分的说明。
对于口服施用，可以将免疫偶联物和/或细胞毒剂配制成固体或液体制剂，例如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、溶融性剂(melt)、粉末、悬浮液或乳液。在制备口服剂型的组合物时，可以采用任何常见的药物介质，例如：用于口服液体制剂(例如悬浮液、酏剂和溶液的水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂和悬浮剂等；或者，用于口服固体制剂(例如粉末、胶囊和片剂)的诸如淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂等载剂。片剂和胶囊因其易于施用而代表最有利的口服单位剂型，在此情况下显然采用固体药物载剂。如有需要，通过标准技术可以使片剂具有糖衣或肠溶衣。活性试剂必须稳定，从而可以通过胃肠道。如有必要，可以使用用于稳定通过的适合的试剂，其可以包括文献中描述的磷脂或卵磷脂衍生物，以及脂质体、微粒(包括微球体和大球体(macrosphere))。
对于肠胃外施用，可以将免疫偶联物和/或细胞毒剂溶解在药物载剂中，并作为溶液或悬浮液来施用。适合的载剂的说明性实例为：水、盐水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇，或者动物油、植物油或合成的油。载剂还可以包含其他成分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂和缓冲剂等。在用未偶联的靶向试剂和/或免疫偶联物和/或细胞毒剂进行脑室内施用或鞘内施用时，还可以将其溶解在脑脊髓液中。
可以将施用至受试者的剂量指定为该受试者(包括人和非人动物)单位表面积上的量。可以向所述受试者使用所述剂量，其中所述剂量的量优选为但不限于约5mg/m2～约300mg/m2，包括约10mg/m2、约20mg/m2、约40mg/m2、约50mg/m2、约60mg/m2、约80mg/m2、约100mg/m2、约120mg/m2、约140mg/m2、约150mg/m2、约160mg/m2和约200mg/m2。免疫偶联物适合在一个时刻或在一系列治疗中施用。在多剂量方案中，这些量可以每天施用一次、每周施用一次或每两周施用一次。用单一高剂量来加载剂量，或者用以较短间隔依次施用的多个较低剂量来加载剂量并随后以更长的时间间隔加载剂量构成了本发明的优选实施方式。在优选实施方式中，针对受试者来调整剂量的施用时机，从而使得在第二次治疗和/或任何后续治疗前已过去足够长的时间，以使先前的剂量已基本代谢，但存在于受试者系统中的免疫偶联物的量仍然抑制、推迟和/或防止肿瘤生长。典型的“重复的单剂量”方案包括每3周施用一次剂量为约10、20、40、60、80、100、120、140、160、180或200mg/m2的免疫偶联物。另一选择是，在例如160mg/m2的起始高剂量后，可以保持例如每1、2或3周约20mg/m2的剂量。本领域技术人员可以容易地确定其他组合产品。然而，其他剂量方案可以是有用的。通过已知的技术和测定容易监视该治疗的进展。剂量可以有所不同，并取决于：其施用是否是出于预防性或治疗性目的、任何先前的疗程、患者的临床史、患者的疾病状态、患者的肿瘤负荷、患者的遗传倾向性、患者的伴行疾病、接受第一次治疗时的疾病时期和对靶向试剂/免疫偶联物的响应、患者经受的副作用和主治医师的判断。
在一个实施方式中，本发明涉及伴有快速血浆清除的低剂量施用方案；在另一个实施方式中，本发明涉及用于施用本文所述的免疫偶联物的未伴有快速血浆清除的低剂量施用方案。第一种方案在给定的三周间隔(周期)中提供通常小于160mg/m2、优选不超过约120mg/m2、不超过约100mg/m2、不超过约80mg/m2、包括不超过约40mg/m2、更优选不超过约20mg/m2、再优选不超过约10mg/m2。10mg/m2～120mg/m2的范围相当于约475μg/m2～约5.71mg/m2的平均每日剂量，或约3.33mg/m2～约40mg/m2的平均每周剂量。因此，约400μg/m2～约5.71mg/m2的平均每日剂量，包括约500μg/m2、约1mg/m2、约2mg/m2和约3mg/m2、4mg/m2、5mg/m2的平均每日剂量，是本发明的一部分；而且约3mg/m2～约40mg/m2的平均每周剂量，包括约5mg/m2、约10mg/m2、约15mg/m2、约20mg/m2、约25mg/m2、30mg/m2或35mg/m2的平均每周剂量，也是本发明的一部分。该低剂量施用方案在早期消除阶段(即，从施用直到施用完成后2小时过程中的任何时间)伴有快速血浆清除。使该低剂量施用方案与其他低剂量方案有区别的是快速血浆清除，由在该时期测得的优选小于理论cmax的55％、50％、40％、30％的cmax来定义所述快速血浆清除。低剂量施用方案在更高水平时伴有较慢的快速血浆清除，即超过理论cmax值的55％、通常60％、70％、80％或90％的血浆清除，在本文中称其为中等血浆清除(等于或大于理论cmax值的55％但小于理论cmax值的80％)或缓慢血浆清除(等于或大于理论cmax值的80％)。对于这些清除，令人惊奇的发现是，虽然免疫偶联物在血浆中的浓度相对较高，但这些施用方案仍带有可耐受的毒性。这与下述事实不符：表达CD138的非靶细胞(例如，非任何治疗的靶标的生命器官(如上皮)的细胞)上的CD138表达水平也相对较高(用CD138抗体BB4进行的免疫组化分析显示，上皮对此抗体的反应性与MM患者浆细胞的相似(美国专利公布20070183971))。在免疫组化分析中产生相等评分(例如，上述实例中的+++)的靶细胞和非靶细胞上的CD138表达水平在本文中被称为相似的表达水平，并且是本发明的一部分。在替代性实施方式中，靶细胞上的表达水平实际上始终小于上皮上的表达水平(例如，与上皮的+++相比，为+或++)。一些肿瘤靶细胞显示出混合型表达水平，例如，一些细胞的表达水平为++而一些的表达水平为+++。代表性数量的细胞(例如100个随机取样的细胞)的平平均值将确定所讨论的这些肿瘤靶细胞是否符合表达水平与上皮的相似或相比更低这一定义。这些治疗方案在给定的3周间隔(周期)中通常大于120mg/m2但小于200mg/m2，其相当于约5.71mg/m2～约9.52mg/m2的平均每日剂量或约40mg/m2～约66.67mg/m2的平均每周剂量。
对于患者001-006，值得注意的是，该患者仅在治疗终止后具有疾病进展，从而反映了施用BT062的功效(图25)。
重复的单剂量是指施用顺序，其中，认为在一次施用之后进行的施用独立于该在先施用。因此，在本文中，可以认为每次施用后的受试者血液中的免疫偶联物水平是相等的。每次施用免疫偶联物时，预期在血液中最初存在相等水平的免疫偶联物。
根据免疫偶联物的同型(对BT062情况，为IgG4)的理论计算出的半衰期来定义重复的单剂量中的“单剂量”之间的施用间隔。
通常，治疗性抗体的半衰期主要取决于抗体特性/其结构特征(例如，与Fc受体的结合)和靶标。例如，Fc部分与新生儿受体FcRn的结合亲和力影响半衰期。通过与核内体中的FcRn结合，抗体从溶酶体降解中被解救出，并且再循环至循环中，从而延长了半衰期。对于IgG4，已报道半衰期为15.6(+/-4.5)天(Alyanakian等，2003；Salfeld等，2007)。在本文述及的研究中，已选择了施用间隔为3周的“重复的单剂量”。然而，对于重复的单剂量而言，替代性的间隔为约3周，约4周，以及约5周或约6周。对于3周的而言，述及“约”是指+/-96小时，而对于4～6周的情况，述及“约”是指+/-120小时。
容易通过已知的技术和测定来监视治疗的进展。剂量可以有所变化，并取决于但不限于：其施用是否是出于预防性或治疗性目的、任何先前的疗程、患者的临床史、患者的疾病状态、患者的肿瘤负荷、患者的遗传倾向性、患者的伴发疾病、接受第一次治疗时的疾病阶段和对靶向试剂/免疫偶联物的响应、患者经受的副作用和主治医师的判断。
低剂量方案的优点很多。然而，可能最显著的优点是使产生不良副作用的风险最小化。虽然免疫偶联物通常可以对靶细胞和正常细胞进行灵敏的区分，从而使得毒副作用比多数常规化疗药物的更少，但是很多免疫偶联物仍然未完全摆脱副作用。尽管具有突出的靶向性，兴趣抗原通常还在非癌细胞上表达，而这些非癌细胞在治疗过程中的毁坏将产生不良副作用。对于CD138，该抗原特别地在上皮细胞上表达。此外，免疫偶联物可能在体内受到与靶细胞中或靶细胞处的进程无关的加工，一定百分比的效应物分子可能在远离靶细胞的位置得到释放，从而产生毒副作用。
令人惊奇的是，已显示本发明的免疫偶联物在低剂量时有效，并同时显示出临床可接受的毒性。本发明的低剂量是指最多200mg/m2的剂量。在最多至少120mg/m2的剂量、但在小于160mg/m2的剂量的任何情况时，所测试的本发明的免疫偶联物还在人受试者中显示出快速血浆清除。
表7和表8显示了所观察到的清除。
n.a.无数据
表7：输注结束后的血浆浓度，和从已接受单剂量/重复的单剂量的BT062的患者获得的血浆中的BT062的有效cmax平均值(第1和第4周期)。在21天的周期中进行的重复的剂量施用。Cmax值是在输注后0～2小时获得的。施用周期：第1周期：第1天；第2周期：第22天；第3周期：第43天；第四周期：第64天，等等。
n.a.无数据
n：患者数
表8：从已接受单剂量/重复的单剂量的BT062的患者获得的血浆中的BT062的有效cmax平均值(第1和第4周期)。在21天的周期中进行的重复的剂量施用。最大值是在注射后的前2小时内获得的。Cmax值是在输注后0～2小时获得的。用占理论计算的cmax的百分数来指示有效cmax。施用周期：第1周期：第1天；第2周期：第22天；第3周期：第43天；第四周期：第64天，等等。
根据以下假定参数计算理论cmax：
患者体表面积 1.9m2
患者重量 70kg
患者 40ml/kg
虽然证明BT062在所治疗的人受试者血浆中的半衰期明显小于在食蟹猴中观察到的血浆半衰期(数天)和在人离体血浆中观察到的血浆半衰期(14天)，但是免疫偶联物仍然在人受试者中显示出功效，甚至在进行低至20mg/m2的施用时也显示出功效。这一事实表示，存在使功效提高的加速的对肿瘤的靶向及肿瘤细胞的结合。本发明的免疫偶联物的这一性质可能是抗体/靶向分子的IgG4同型的结果。
如上文所提到的，在早期消除阶段(输注过程中和输注后约0～2小时)观察到了从所治疗的MM患者的血浆中的异常的快速清除，随后是在最多120mg/m2的剂量水平时的通常正常的末期消除阶段，而在接受160mg/m2和200mg/m2剂量(3位患者)的全部4位患者中观察到了更常见的清除特性，不过该清除仍然小于理论cmax值。此外，对于在早期消除阶段中显示出快速血浆清除的施用方案(例如，20、40、80和120mg/m2)，不仅观察到了早期消除阶段的快速血浆清除，而且观察到了响应(尿M蛋白的减少)，包括以在重复的单剂量后变现为尿M蛋白减少超过50％的响应(图24)。
图17阐明了对40mg/m2～120mg/m2的剂量的快速的血浆清除，而如此处的160mg/m2所表明的更高剂量则显示出与理论值更加接近的血浆清除。关于在20mg/m2的剂量时观察到的血浆清除，见图27。图18对BT062的血浆特性和用相似的剂量处理过的猴的血浆特性进行了比较。该比较表明低剂量时的快速血浆清除不能从可获得的动物模型推导得到，并且看似对人有特异性。图22表明快速血浆清除并不能归因于可溶性CD138所引起的缓冲效应。图19显示了与理论cmax值相比的BT062的测得cmax值。
在更高的剂量(例如160mg/m2，然而所述更高的剂量与其他免疫偶联物的施用方案相比是相对低的剂量)时，末期清除特性更接近于正常，即更接近于理论cmax值。然而，在恰好进行单次施用后，可以观察到血清中FLC的快速减少，这种快速减少在第2、第3和第4次施用后的部分响应中有所表现(图26)。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及低剂量施用方案，例如重复的单剂量方案，其中，观察到了响应，优选至少为MR，优选为VGPR、CR、sCR或PR。
本发明还涉及低剂量治疗方案，例如重复的单剂量施用方案，其中，在多个治疗周期中实现了稳定疾病，并持续超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19周或20、30、40、50、60、70、80、90、100周或更多周。
类似物和衍生物
治疗剂(例如细胞毒剂)领域的技术人员容易理解的是，可以对本文所述的每个此类试剂进行修饰，所得到的化合物仍然保留起始化合物的特异性和/或活性。技术人员还将理解的是，可以使用多种这些化合物来替代本文所述的治疗剂。因此，本发明的治疗剂包括本文所述的化合物的类似物和衍生物。
出于说明免疫偶联物用途的目的，现将给出并说明一些非限制性应用。
材料和方法
嵌合抗体的构建(cB-B4：nBT062)
B-B4
在这些实验中使用了之前表征过的鼠抗体B-B4(Wijdenes等，Br J Haematol.，94(1996)，318)。
B-B4和cB-B4/nBT062的克隆和表达
按照教科书中(例如在Sambrook；Molecular Cloning，A Laboratory Manual；第二版，(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA中)的详细描述，或在使用试剂盒时按照制造商的说明书的推荐，实施了标准重组DNA技术。使用标准PCR方法进行了对小鼠可变区的PCR克隆和修饰。使用了在相应的结果部分中所示的引物。
cB-B4/nBT062的表达
通过胰蛋白酶处理和离心，收集了在补充有10％FCS、580μg/ml L-谷氨酰胺、50单位/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素的DMEM中培养的指数生长期COS细胞，并在PBS中进行洗涤。将细胞重悬于PBS中，使最终浓度为1×107个细胞/ml。将700μg的COS细胞悬浮液转移至Gene Pulser比色杯中，并且与重链和κ轻链表达载体DNA(各10μg或13μg Supervector)混合。使用Bio-Rad Gene Pulser于1900V、25μF对细胞进行电穿孔。将转化后的细胞在补充有10％的无丙种球蛋白FBS、580μg/ml L-谷氨酰胺、50单位/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素的DMEM中培养72小时，随后收集含有抗体的细胞培养物上清液。
用来测量cB-B4/nBT062的表达水平的捕获ELISA
用100μl等分量的0.4μg/ml山羊抗人IgG抗体PBS稀释液包被96孔平板(4℃，过夜)。用200μl/孔的洗涤缓冲液(PBS+0.1％Tween-20)洗涤平板3次。用含0.2％BSA、0.02％Tween-20的PBS封闭孔，随后添加200μl的包含所分泌的抗体的细胞培养物上清液(于37℃温育1小时)。用洗涤缓冲液洗涤孔6次，随后用山羊抗人κ轻链过氧化物酶偶联物检测已结合的抗体。
从细胞培养物上清液中纯化cB-B4/nBT062
依照制造商的推荐，使用蛋白A ImmunoPure Plus试剂盒(Pierce，Rockford，IL)从已转化的COS7细胞上清液中纯化出cB-B4抗体。
cB-B4的结合和竞争测定
考虑到在结果部分中所描述的变化，依照制造商的推荐，使用Diaclone(France)sCD138试剂盒分析了B-B4和cB-B4与CD138的结合活性。
RNA制备和cDNA合成
使杂交瘤B-B4细胞生长，并依照制造商的操作规程，用Qiagen Midi试剂盒(Hilden，Germany)处理细胞以分离出RNA。依照制造商的操作规程，使用AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)的第一链合成试剂盒对约5μgB-B4RNA进行逆转录以产生B-B4cDNA。
B-B4免疫球蛋白cDNA的克隆
使用IgH引物MHV7(5′-ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG-3′)[SEQ ID NO：3]和IgG1恒定区引物MHCG1(5′-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3′)[SEQ ID NO：4]，通过PCR来扩增免疫球蛋白重链(IgH)的cDNA。类似地，使用三种不同的Igκ引物MKV2(5′-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3′)[SEQID NO：5]、MKV4(5′-ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3′)[SEQ IDNO：6]和MKV9(5′-ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3′)[SEQ ID NO：7]，且每个都与引物MKC(5′-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3′)[SEQ ID NO：8]组合，来扩增免疫球蛋白轻链(IgL)。根据制造商的说明，使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，将所有扩增产物都直接与pCR2.1-TOPO载体连接。
在LB-氨苄青霉素-Xgal琼脂平板上选择转染有连接后的pCR2.1载体构建体的大肠杆菌TOP10细菌(Invitrogen)。将单个白色菌落接种至小规模的培养基中，过夜生长，并根据制造商的说明使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒分离出质粒。
cDNA序列的确定
使用BigDye Termination v3.0Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(ABI，Foster City，CA)来对质粒进行测序。使用在GeneAmp9600PCR仪上循环的1210引物和1233引物，对每个选择的质粒进行双向测序。在ABI毛细管测序仪上完成了电泳序列分析。
重复进行RT-PCR、克隆和DNA序列分析的完整循环，从而为每条免疫球蛋白链获得了三组完全独立的序列信息。
B-B4 Vκ DNA序列
第1条链的合成在三个独立的反应中进行。根据制造商的说明，将通过使用引物MKC和MKV2(序列见上)而产生的PCR产物连接至pCR2.1-TOPO载体中。对来自每个独立的RT-PCR反应组的克隆进行双向测序。用MKV2引物获得的产物的序列与源自诸如MOPC-21、SP2和Ag8等骨髓瘤融合伴侣(Carroll等，Mol Immunol.，25(1988)，991；Cabilly等，Gene，40(1985)；157)的非表达性κ转录本高度相似，并因此将该产物忽略。
使用MKC与MKV4和MKV9引物的PCR产物彼此相似，且仅在前导序列引物内的摆动位置(wobble position)上有区别。
B-B4VHDNA序列
在三个独立的反应中进行第1条链的合成，对来自每个第1条链产物的PCR产物克隆并测序。对来自每个第1条链的5个克隆进行了测序。
嵌合cB-B4表达载体的构建
嵌合表达载体的构建需要将适合的前导序列添加到VH和Vκ上，其上游是BamHI限制性位点和Kozak序列。Kozak共有序列对可变区序列的高效翻译而言非常重要。其界定了正确的AUG密码子，使核糖体可以从该密码子开始进行翻译，而且，最关键的单碱基是位于该AUG起始密码子上游-3位置的腺嘌呤(或次优选的鸟嘌呤)。前导序列选择Kabat数据库(Kabat等，NIHNational Technical Information Service，1991)中最相似的序列。在正向(For)引物(两条引物都具有序列5′-AGAGAAGCT GATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3′[SEQ ID NO：9]；下划线标出了限制性位点；Kozak序列为粗体)内编码了这些添加物。此外，嵌合表达载体的构建引入了人γ1恒定区的5′端到天然ApaI限制性位点的片段，并与B-B4的J区3′末端相邻，并且在轻链中添加剪接供体位点和HindIII位点。剪接供体序列对于可变区与其适当的恒定区的正确框内连接从而剪掉V:C内含子是重要的。在表达构建体中，在B-B4Vκ序列下游编码了κ内含子+CK。类似的是，在表达构建体中，在B-B4VH序列下游编码了γ-4CH。
首先仔细分析了B-B4VH和Vκ基因来鉴定出任何不需要的剪接供体位点、剪接受体位点、Kozak序列和会随后干扰功能性全抗体的亚克隆和/或表达的任何额外的亚克隆限制性位点的存在。在Vκ序列中发现了不需要的HindIII位点，在不改变氨基酸序列的情况下，利用定点诱变通过PCR来必要地除去了该位点。对于此反应，使用了寡核苷酸引物BT03(5′-CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3′)[SEQ ID NO：10]和BT04(5′-CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG-3′)[SEQ ID NO：11]，并且根据Stratagene(LaJolla，CA)Quickchange Mutagenesis试剂盒操作规程进行了诱变。
κ链嵌合引物
将独立于PCR引物序列的确定无疑的B-B4Vκ前导序列与Kabat数据库中的鼠前导序列进行比对。B-B4VH前导的最接近的匹配是VK-10ARS-A(Sanz等，PNAS，84(1987)，1085)。经SignalP算法(Nielsen等，Protein Eng，10(1997)；1)预测，该前导序列可正确切割。设计了引物CBB4Kfor(见上)和g2258(5′-CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3′[SEQ IDNO：12]；下划线标出了限制性位点)来产生包含此完整前导、B-B4Vκ区和HindIII及BamHI末端限制性位点的PCR产物，用于克隆至pKN100表达载体中。正向引物CBB4K引入了HindIII限制性位点、Kozak翻译起始位点和VK-10ARS-A前导序列。反向引物g2258引入了剪接供体位点和BamHI限制性位点。将得到的片段克隆至pKN100的HindIII/BamHI限制性位点中。
重链嵌合引物
将独立于PCR引物序列的确定无疑的B-B4VH前导序列与Kabat数据库中的鼠前导序列进行比对。B-B4VK前导的最接近的匹配是VH17-1A(Sun等，PNAS，84(1987)，214)。经SignalP算法预测，该前导序列可正确切割。设计了引物cBB4Hfor(见上)和g22949(5′-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3′[SEQID NO：13]；下划线标出了限制性位点)来产生包含VH17-1A前导、B-B4VH区和HindIII及ApaI末端限制性位点的PCR产物，用于克隆至pG4D200表达载体中。正向引物cBBHFor引入了HindIII限制性位点、Kozak翻译起始位点和VH17-1A前导序列。反向引物g22949引入了5′末端的γ4C区和天然ApaI限制性位点。将得到的片段克隆至pG4D200的HindIII/ApaI限制性位点中，从而得到pG4D200cBB4。
cBB4抗体的产生
将一小瓶COS 7细胞解冻并使之在补充有带有抗生素的10％的Fetal clone I血清的DMEM中生长。一周后，以pG4D200cBB4+pKN100cBB4(各10μgDNA)或无DNA对细胞(0.7ml，107个细胞/ml)进行电穿孔。将细胞铺板接种至8ml生长培养基中，生长4天。电穿孔重复进行了7次。
嵌合抗体的检测
使用了夹心ELISA来测量COS 7上清液中的抗体浓度。瞬时转染的COS 7细胞分泌了约6956ng/ml的抗体(数据未示出)。
cB-B4的结合活性
为了测定COS 7培养物上清液中的cB-B4的结合活性，使用了Diaclone sCD138试剂盒，其为固相夹心ELISA。已经用对sCD138有特异性的单克隆抗体包被了所提供的微滴定带(microtiter strip)的孔。在首次温育时，将sCD138和生物素化的B-B4(bio-B-B4)抗体同时与无标记的测试抗体(B-B4或cB-B4)的连续稀释液一起温育。
在此测定中，已降低了bio-B-B4的浓度，以获得与低浓度无标记抗体的竞争(不同的是，COS 7细胞培养物上清液中的cB-B4浓度过低以致不能获得足够的竞争)。该测定的结果揭示，两种抗体对CD138具有相同的特异性(数据未示出)。
cB-B4的纯化
依照制造商的推荐，使用蛋白AImmunoPure Plus试剂盒(Pierce)从COS 7细胞上清液中纯化出嵌合B-B4(数据未示出)。
KD的确定：nBT062/BB4的比较
可溶性CD138的纯化
使用1ml缀合有B-B4的“HiTrap NHS-activated HP”柱，通过FPLC从U-266细胞培养物上清液中纯化出了可溶性CD138抗原。将pH 7.4的PBS缓冲液中的细胞培养物上清液加载到柱上，随后用pH 11的50mM三乙胺将CD138抗原洗脱至2ml的级分(fraction)中。立即用375μl 1M Tris-HCl(pH 3)中和洗脱出的CD138，以防止结构破坏和/或功能破坏。
CD138的生物素化
使用了Sulfo-NHS-LC(Pierce)来标记CD138。NHS激活的生物素与伯氨基(如赖氨酸残基)在pH 7～9的缓冲液中高效反应，从而形成稳定的酰胺键。
对于CD138的生物素化，使用蛋白脱盐离心柱(Pierce)来使50μl的CD138脱盐。将生物素化试剂(EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin，Pierce)溶解在冰冷却的去离子水中，至0.5mg/ml的最终浓度。将生物素化试剂和捕获试剂溶液混合，使生物素化试剂与捕获试剂相比为12倍的摩尔过量(50pmol CD138：600pmol生物素化试剂)，并在轻柔摇动小瓶的同时于室温温育1小时。使用蛋白脱盐柱除去未结合的生物素化试剂。
bCD138的固定
BIACORE测定中所使用的传感器芯片(SENSOR CHIP SA，BIACORE AB)经设计可以结合生物素化分子，以进行BIACORE系统中的相互作用分析。表面由预先固定有链霉亲和素且准备以高亲和力捕获生物素化配体的羧甲基化右旋糖酐基质构成。通过人工注射，使用10μl/分钟的流速在SENSOR CHIP SA上进行bCD138的固定。用50mM NaOH中的1M NaCl连续进行三次1分钟的注射，从而使芯片表片得到调整处理。随后用生物素化的CD138注射1分钟。
使用BIA CORE来确定不同抗体的KD
BIACORE C的软件使用预定的掩码(mask)，即用于不同实验的所谓“向导(Wizard)”，其中仅可改变某些设定。由于最初BIACORE C是为了测量浓度而开发，所以没有设计用来进行亲和力测量的向导。然而，使用适当的设定，用于“非特异性结合”的向导可以用来测量亲和力速率常数并因此用来确定KD。用该向导测量了两个流动单元(flow cell)，并且通过用BIACORE运行缓冲液执行“Regeneration 1”来将解离期设为90秒。用10mM pH2.5的甘氨酸-HCl执行了等同于真实再生的“Regeneration2”。该步骤之后，配体CD138再次处于其结合感受状态。在整个程序中，使用HBS-EP作为运行和稀释缓冲液。为了确定不同抗体(～150kDa)与CD138的结合，分析了不同浓度(100、50、25、12.5、6.25和3.13nM)时的结合与解离。通过计算速率常数ka和kd，确定了解离平衡常数。随后，用BIAevaluation软件通过kd和ka的商来计算分析物的KD值。其结果示于表9中。
表9：对nBT062和B-B4的KD值的对比分析。对平均KD值，给出了标准偏差。
讨论
从三个独立实验中计算出了每种抗体的平均KD值。结果显示，在所有测量中，nBT062显示出比B-B4略低的KD值(平均KD值分别为1.4nM和1.6nM)。
免疫偶联物的制备
nBT062-DM1和huC242-DM1
如Chari之前所述(Chari等，Cancer Res.1(1992)，127)，由微生物发酵产物安丝菌素P-3合成了含巯基的类美登醇DM1。之前已描述了人源化C242(huC242)的制备(Roguska等，PNAS，91(1994)，969)。按以前的描述(Liu等，PNAS，93(1996)，8618)制备了抗体-药物偶联物。平均每个抗体分子连接了3.5个DM1分子。
nBT062-DM4
BT062是抗体-药物偶联物，其由通过连接物与nBT062嵌合单克隆抗体经由二硫键而连接的具有细胞毒性的类美登醇药物DM4构成。类美登醇是抑制微管蛋白聚合和微管装配的抗有丝分裂剂(Remillard等，Science 189(1977)，1002)。BT062(nBT062-DM4)的示意性化学描绘图示于图1和图2中。
DM4的合成
从公知的衍生物美登醇制备了DM4(Kupchan等，J.Med.Chem.，21(1978)，31)。通过用氢化三甲氧基铝锂对微生物发酵产物安丝菌素P3的酯部分进行还原性切割，制备了美登醇(见图3)。
DM4是通过以下方式合成的：在二环己基碳二亚胺(DCC)和氯化锌存在下，用N-甲基-N-(4-甲基二硫代戊酰基)-L-丙氨酸(DM4侧链)酰化美登醇，得到含二硫键的类美登醇DM4-SMe。用二硫苏糖醇(DTT)还原DM4-SMe，得到所需的含巯基的类美登醇DM4(DM4的加工流程图见图4)。
免疫偶联物BT062
图5中概要描绘了nBT062-DM4的制备程序。用4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB连接物)修饰nBT062抗体，从而引入二硫代吡啶基团。将DM4与经修饰的抗体混合，其中抗体的浓度含有过量的二硫代吡啶基团当量。DM4的巯基和通过连接物引入抗体内的二硫代吡啶基团之间发生二硫键交换反应，从而形成BT062偶联物。通过层析和渗滤进行纯化，除去了低分子量的反应物(DM4)和反应产物(硫代吡啶)以及经偶联的抗体的聚集物，从而产生了大量的药物物质。
FACS分析和WST细胞毒性测定
FACS分析
OPM-2细胞是显示出高度表达CD138的浆细胞白血病细胞系。将OPM-2细胞与不同浓度的nBT062、nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1或nBT062-SMCC-DM1温育(如图6所示)。洗涤细胞，并在FACS分析中使用带荧光标记的二抗检测已结合CD138的抗体或偶联物。用在这些实验中测得的平均荧光对抗体浓度进行作图。
细胞活力测定
在平底平板中以3000个细胞/孔接种CD138+MOLP-8细胞。以1000个细胞/孔接种CD138-BJAB对照细胞。用不同浓度的nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1或nBT062-SMCC-DM1(如图7所示)处理细胞5天。根据制造商的说明(ROCHE)，添加WST试剂(水溶性四唑盐，ROCHE)来测量细胞活力。将该试剂在MOLP-8细胞上温育7.5小时，而在BJAB细胞上温育2小时。根据使用标准程序在微孔板读取仪中测得的光密度，计算了存活的细胞的分数。
讨论
通过FACS分析了nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1、nBT062-SMCC-DM1或nBT062的结合。将作为靶细胞的CD138+OPM-2细胞与nBT062或免疫偶联物温育，并使用带荧光标记的二抗检测已结合细胞的分子。在图6中，用平均荧光对不同抗体浓度或偶联物浓度进行作图，平均荧光是已结合细胞的抗体的量的量度。结果显示，nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1和nBT062-SMCC-DM1显示出非常相似的结合特性。此外，该结果强烈暗示，未偶联的抗体的结合特性不受所偶联的毒素的影响。
在细胞活力测定中，分析了抗体针对CD138+MOLP-8靶细胞和针对CD138-BJAB B淋巴母细胞瘤对照细胞的细胞毒性活性。将两种细胞系接种到平底平板中，并且与浓度逐步升高的免疫偶联物温育。使用未偶联的抗体作为对照。添加免疫偶联物后5天，使用用来测量细胞活力的WST试剂分析了细胞毒性活性。在图7A～7C中，用存活细胞相对于经载质对照处理的对照细胞的分数对逐步升高的免疫偶联物浓度进行了作图。结果显示，nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1和nBT062-SMCC-DM1针对MOLP-8细胞的细胞毒性活性非常相似。如所预期的，免疫偶联物并不杀伤CD138-BJAB对照细胞，这表明所有的免疫偶联物都通过与CD138的细胞特异性结合来发挥作用。在竞争实验中，将MOLP-8细胞与摩尔过量的未偶联的nBT062预温育。预温育基本封闭了nBT062-SPDB-DM4的细胞毒性，从而提供了进一步的证据证明免疫偶联物通过与细胞表面上的CD138的特异性结合来杀伤细胞(图7D)。
异种移植小鼠实验
为了评估CD138靶向性对人嵌合版B-B4抗体(即nBT062)的抗体-类美登醇偶联物的抗肿瘤活性的重要性，进行了异种移植小鼠实验。制备了两个版本的nBT062-类美登醇偶联物，这两个版本(nBT062-SPP-DM1和nBT062-SPDB-DM4)可能在其二硫键的化学稳定性方面有差别。将这些抗体-药物偶联物的抗肿瘤活性与B-B4-SPP-DM1偶联物(包含鼠亲本抗体)以及未偶联的游离类美登醇(DM4)、原生的未修饰的nBT062抗体和非靶向性(不相关的)IgG1-类美登醇偶联物的活性进行了比较。在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中的CD138阳性人多发性骨髓瘤异种移植模型(MOLP-8)中，对偶联物进行了评估。
在这些小鼠中，通过用MOLP-8细胞悬浮液进行接种，从而建立了皮下肿瘤(雌性CB.17SCID小鼠)。当肿瘤体积到达平均113mm3时，用单推注静脉注射进行治疗。每周对肿瘤体积变化和体重变化进行2次监测。在接种肿瘤细胞后的68天中进行了实验。
异种移植小鼠实验A
小鼠
5周龄的雌性CB.17SCID小鼠获自Charles River Laboratories。
人肿瘤细胞系
人多发性骨髓瘤细胞系MOLP-8由ATCC供应。将细胞表面表达CD138抗原并在SCID小鼠中发展异种移植肿瘤的MOLP-8细胞在含有5％CO2的潮湿气氛中，于37℃维持在补充有4mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker，Walkersville，MD)、10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)和1％链霉素/青霉素的RPMI-1640培养基中。
第I部分
小鼠中的肿瘤生长
将1×107个MOLP-8细胞皮下接种至每只小鼠的右肩下方区域。总体积为0.2ml/小鼠，其中，无血清培养基与基质胶(matrigel，BD Bioscience，Bedford，MA)之比为1/1(v/v)。在治疗前，每天监视异种移植肿瘤，并使其成形。接种肿瘤细胞后约11天，肿瘤体积达到了约113mm3。CB.17SCID小鼠的肿瘤携带率为100％。
接种肿瘤细胞后11天，根据肿瘤体积和体重选择了42只小鼠。肿瘤体积为68.2mm3～135.9mm3。根据肿瘤体积，将该42只小鼠随机分为7组(A～G)，每组6只动物。
A组中的6只小鼠每只都接受了200μl PBS作为载质对照。B组中的每只小鼠都接受13.8mg/kg的nBT062裸抗体。该剂量等同于以250μg/kg的所连接的类美登醇计的BT062抗体成分量。偶联物分子中的类美登醇与nBT062抗体的分子量比约为1/55。C组中的每只小鼠都接受250μg/kg的DM4。D组中的每只小鼠都接受250μg/kg的huC242-DM4。E组、F组和G组中的小鼠分别接受BT062-SPDB-DM4、B-B4-SPP-DM1和nBT062-SPP-DM1(每只接受250μg/kg)。
将所有试剂都作为单推注注射来进行皮下施用，其中，用配有27号(27gauge)的1/2英寸针头的1ml注射器通过尾静脉进行注射。在施用前，用无菌PBS将nBT062抗体、nBT062-SPDB-DM4和nBT062-SPP-DM1的储备溶液分别稀释至2mg/ml、28.1μg/ml和28.1μg/ml的浓度，从而使每只小鼠的注射体积为120μl～220μl。
第II部分
在第二组实验中，将100μl悬浮于无血清培养基和基质胶的50∶50混合物中的MOLP-8细胞(1.5×107个细胞/小鼠)皮下注射至右肩下方区域中。接种细胞后，肿瘤体积在第11天达到约80mm3，而对照的平均值在第25天为约750mm3。经估算，肿瘤倍增时间为4.58天。对照组(n＝6)中的每只小鼠接受了以推注注射方式施用至尾静脉(i.v.)的0.2ml无菌PBS。所有治疗剂量都基于所偶联的类美登醇。用单次静脉内注射的nBT062-SMCC-DM1、nBT062-SPDB-DM4或nBT062-SPP-DM1(各自的剂量为450μg/kg、250μg/kg和100μg/kg)对9个组(n＝6)进行治疗。另外的一组(n＝6)以重复的给药方式(共5周，每周一次)接受了250μg/kg的nBT062-SMCC-DM1。使用LabCat程序根据肿瘤体积将小鼠随机分为11组(n＝6)。肿瘤体积为40.0mm3～152.5mm3。根据个体体重来对小鼠进行定量给药。
使用LabCat系统(Tumor Measurement and Tracking，Innovative ProgrammingAssociated，Inc.，Princeton，NJ)，每周在三个维度上测量肿瘤尺寸2次。使用Tomayko等描述的方法(Tomayko等，1989)计算出以mm3计的肿瘤体积：
体积＝长×宽×高×1/2
用Bissery等描述的公式(Bissery等，1991)计算出Log10细胞杀伤
Log10细胞杀伤＝(T-C)/Td ×3.32
其中，(T-C)或肿瘤生长延迟是治疗组(T)和对照组(C)达到预定尺寸(600mm3)所需的时间中值(天)。Td是肿瘤倍增时间，基于对照小鼠中的肿瘤体积中值；而3.32是每log细胞生长的细胞倍增数量。
结果
个体小鼠中的肿瘤生长示于图8和图9中。每组的平均(+/-SD)肿瘤生长示于图10中。
与经PBS治疗的动物中的肿瘤生长相比，用nBT062抗体、未偶联的游离DM4或不相关的非靶向性偶联物huC242-DM4进行的治疗未引起对肿瘤生长的任何显著抑制。
剂量为250μg/kg的全部三种CD138靶向偶联物，即nBT062-SPDB-DM4、B-B4-SPP-DM1和nBT062-SPP-DM1，都造成了肿瘤生长的明显延迟。根据在治疗组中测得的平均肿瘤体积，DM4偶联物nBT062-SPDB-DM4的活性最高，而nBT062-SPP-DM1偶联物显示出相比其鼠对应物B-B4-SPP-DM1略微升高的活性(图10)。在个体小鼠中获得的结果还显示出，用B-B4-SPP-DM1获得的抗肿瘤活性与用nBT062-SPP-DM1治疗的小鼠中的该量度相比更不均一并因此更不可预测。就抗肿瘤活性的均一性而言，使用nBT062作为靶向抗体的另一种偶联物nBT062-SPDB-DM4与nBT062-SPP-DM 1表现相似。
在任何治疗组中都未观察到体重减少，这表示该治疗得到了良好耐受。
讨论
对实验动物中的三种CD138靶向偶联物的分析结果展示了靶向递送对抗肿瘤活性的重要性。人嵌合nBT062抗体和鼠B-B4抗体的类美登醇偶联物显示出了通过log细胞杀伤测得的显著活性，而用未偶联的DM4、未修饰的原生huBT062抗体或非靶向性对照偶联物(huC242-DM4)进行的治疗对肿瘤生长没有显著影响。
从人嵌合抗体制备的免疫偶联物nBT062-SPP-DM1产生了比从其鼠对应物制备的偶联物B-B4-SPP-DM1略高的抗肿瘤活性。此外，与用B-B4-SPP-DM1进行的治疗相比，用nBT062-SPP-DM1和nBT062-SPDB-DM4进行的治疗在个体小鼠中产生了更均一的响应。B-B4-SPP-DM1的高结合变化解释了接种后随时间的推移(天数)对CB.17SCID小鼠中MOLP-8人多发性骨髓瘤异种移植物的肿瘤体积中值(+/-SD)进行的测量实际上为B-B4-SPP-DM1提供了与nBT062-SPP-DM1相比相对更好的结果(数据未示出)。使用nBT062作为靶向抗体的免疫偶联物的这一特征似乎对偶联物的治疗用途尤其有益。
最后，在SCID小鼠中的MOLP-8异种移植模型中进行了单iv施用后，最有效力的类美登醇偶联物是nBT062-SPDB-DM4。
旁观者杀伤(细胞活力测定)
将CD138+OPM2细胞和CD138-Namalwa细胞在单独的孔中或以共培养形式接种到圆底平板中。用浓度为1×10-8M～1×10-9M的nBT062-SPDB-DM4处理细胞。根据制造商的说明(ROCHE)，使用WST试剂(水溶性四唑盐，ROCHE)来测量活细胞的分数。根据使用标准程序在微孔板读取仪中测得的光密度，计算出存活的细胞的分数。
讨论
在体外研究中，分析了在进行nBT062-SPDB-DM4处理时对与多发性骨髓瘤细胞紧邻的非靶细胞(存在于圆底孔中)的旁观者杀伤，其中，以与CD138阴性的Namawla细胞共培养的方式培养了CD138阳性的OPM2细胞(图13)。通常，nBT062-SPDB-DM4高效地杀伤CD138阳性细胞，而CD138阴性细胞则不受偶联物的影响。然而，在圆底孔中的共培养物中，nBT062-SPDB-DM4还杀伤了与抗原阳性细胞紧邻的抗原阴性细胞(即，通常被称为旁观者杀伤的效应)。Kovtun等(2006)讨论到，由类美登醇偶联物介导的旁观者杀伤仅在与抗原阳性细胞紧邻处发生。Kovtun等(2006)(通过引用将其完整地并入本文)还讨论了免疫偶联物的连接物的重要性。在体内，旁观者杀伤可以有助于：1)根除以异质方式表达CD138的肿瘤细胞，2)通过杀伤肿瘤基质细胞来毁坏肿瘤微环境，和3)防止对CD138阴性的对nBT062-SPDB-DM4有抗性的细胞的选择。
如果以异质方式在肿瘤中表达的靶抗原破坏了免疫偶联物的活性，旁观者效应就特别重要。如果是这样，则肿瘤的特定细胞即使表达抗原，其表达量也不会有效使得相应的免疫偶联物直接靶向并杀伤所述细胞。nBT062-SPDB-DM4对与CD138阳性细胞共培养的CD138阴性细胞的抗肿瘤功效表明，在适当的环境下，靶细胞的存在会影响nBT062-SPDB-DM4对非靶细胞的细胞毒性活性。
异种移植小鼠实验B
在该组实验中，将MOLP-8细胞皮下接种至85只小鼠的右肩中(15×107个细胞/小鼠)。肿瘤携带率为100％。将携带平均肿瘤体积为约80mm3的大MOLP-8肿瘤的66只SCID小鼠随机分为11个治疗组(n＝6)。用单剂量的三种偶联物之一(nBT062-SMCC-DM1、nBT062-SPDB-DM4或nBT062-SPP-DM1)治疗小鼠。另外一组每周接受5个剂量的nBT062-SMCC-DM1，而对照组接受了单剂量的PBS。平均肿瘤体积示于图11A中。对各偶联物建立剂量响应。在第25天，在经PBS处理的动物中，肿瘤体积中值达到了750mm3。借助于在对照肿瘤生长的log-线性图上拟合的最佳拟合线性回归曲线，确定了肿瘤倍增时间为4.58天。用450μg/kg的nBT062-SPDB-DM4治疗的动物具有最高的log细胞杀伤(LCK＝2.89)，其次是每周用250μg/kg剂量的nBT062-SMCC-DM1治疗的动物(LCK＝2.1，见表10)。通过重复测量方差分析(repeated measures ANOVA)(其执行Dunnett氏多重比较测试)对治疗组的平均肿瘤生长曲线进行的比较显示了PBS对照组与450μg/kg nBT062-SPDB-DM4间的显著差异(p＜0.01)、与250μg/kg nBT062-SPDB-DM4间的显著差异(p＜0.05)和与每周5次250μg/kg剂量的nBT062-SMCC-DM1间的显著差异(p＜0.05)。除了接受450μg/kg nBT062-SPDB-DM4的一只动物，在任何治疗组中都没有出现部分或完全的肿瘤消退，该只动物直至接种后第85天都具有部分肿瘤消退。
表10：作为不同定量给药方案中的不同的nBT062-DMx偶联物的抗肿瘤活性的量度的Log细胞杀伤(LCK)值。关于计算LCK值的信息，参考材料与方法部分。
骨髓环境中的nBT062-SPDB-DM4和nBT062-SPP-DM1的体内功效
具有人胎骨植入物的SCID小鼠的制备
按之前的描述(Urashima等，1997)将人胎长骨(人胎骨片)植入CB17SCID小鼠(SCID-hu)的上身中，并因此在小鼠中提供了使人MM细胞回归至人BM细胞的模型。
治疗方案(SCID-hu/INA-6小鼠)
在植入骨后4周，将最终体积为100μl的RPMI-1640细胞培养基中的2.5×106个INA-6细胞直接注射至上述SCID-hu小鼠的人骨髓腔中。使用INA-6细胞所释放的可溶人IL-6受体(shuIL-6R)的水平升高来作为MM细胞生长和疾病负荷的参数。
在注射INA-6细胞后约4周，小鼠发展出可测量的血清shuIL-6R，并随后在7周内每周通过尾静脉注射接受0.176mg偶联物或载质对照。每次治疗后，收集血样并通过酶联免疫吸附测定(ELISA，R&D Systems，Minneapolis，MN)来测试血样中的shuIL-6R水平。结果绘于图12中。
讨论
白细胞介素6(IL-6)是多发性骨髓瘤细胞的生长和生存因子。INA-6是依赖IL-6的人骨髓瘤细胞系，其还需要骨髓基质细胞(BMSC)来进行增殖。INA-6细胞系产生可溶性IL-6受体(shuIL-6R)。可以使用shuIL-6R的水平升高来作为MM细胞生长和疾病负荷的参数。
因此，SCID-hu/INA-6小鼠提供了使多发性骨髓瘤细胞在其正常骨髓环境中生长的模型。该模型中的肿瘤细胞与人骨髓直接相互作用，与患者中的情形非常相似，其中肿瘤细胞的生长同样由基质细胞的存在来促进。由于INA-6细胞释放可溶性人白细胞介素-6受体(shuIL-6R)，可以使用该蛋白的血清浓度来作为这些小鼠中的肿瘤细胞载荷的量度。在此环境中测试了nBT062-SPDB-DM4和nBT062-SPP-DM1的体内效力。
持续7周每周通过i.v.施用nBT062-SPDB-DM4或nBT062-SPP-DM1来治疗SCIDhu/INA-6小鼠，该治疗引起了通过血清shuIL-6R水平相对于对照的降低而检测到的高效肿瘤消退，从而表明偶联物甚至在人骨髓环境中都具有良好的功效，这反映了患者中的相关情形(图12)。
小鼠中的剂量
为了确定有关剂量，当肿瘤达到80mm3的平均肿瘤体积时，向小鼠单次施用剂量为100μg/kg、250μg/kg和450μg/kg(基于DM4浓度)的BT062(图14)。将剂量报告为所偶联的DM4的浓度(1μgDM4等价于约55μg抗体蛋白)。抗肿瘤功效是剂量依赖性的，且所测试的最高剂量(450μg/kg)导致了2.9的log细胞杀伤(LCK)(另外参照表10)。在该研究的整个过程中，动物增加了体重，这表明该治疗对小鼠无毒性。
图14表明250μg/kg为小鼠中的第一个有效剂量，该剂量相当于166mg/m2的相似的人剂量。
指示物：胰腺癌/乳癌和其他癌-异种移植模型
总体实验设定
根据CD138表达分析(对肿瘤组织微阵列的免疫组化分析)，从原发性肿瘤采集物(即，从源自患者的肿瘤)选出了候选肿瘤。在皮下移植和肿瘤成形(诱导期为30天)后，以两个不同浓度的类美登醇DM4静脉内注射免疫偶联物BT062，即450μg/kg和250μg/kg (各自基于所连接的DM4的分子量，1mg DM4与52mg抗体偶联，相当于总质量为53mg；450μg/kg DM4＝23.850μg)。持续10周(对于治疗植入了胰腺肿瘤的小鼠而言)和持续5周(对于植入了乳房肿瘤的小鼠而言)每周施用一次免疫偶联物。
实施例1：胰腺癌
将胰腺肿瘤组织(PAXF 736(Kuesters等，2006))植入NMRI小鼠中(双侧)。该植入的肿瘤源自患者的原发性胰腺癌(分化较差的，浸润性腺癌(外分泌癌))。未观察到副作用。经免疫组化研究鉴定，该患者的肿瘤为高度表达CD138的组织。然而，通过流式细胞术表面染色而在致瘤细胞系上检测到，CD138的表达并未达到与多发性骨髓瘤患者的骨髓瘤浆细胞相似的程度。
在肿瘤已达到直径约6mm～8mm(最小5mm)的尺寸后，开始用BT062进行治疗。一周两次测量了肿瘤直径。根据公式a×b×b/2来计算肿瘤体积，其中，“a”是最长轴，“b”是与a垂直的轴。测试组相对于载质对照组的肿瘤体积抑制计算为相对肿瘤体积中值比(T/C)。
将测试组相对于对照组的RTV(相对肿瘤体积)中值比乘以100％，从而计算出对应于特定天的肿瘤抑制(T/C(％))。
这种每周施用BT062可以显著减小肿瘤体积。在图28中可见，观察到了剂量依赖性的部分消退和完全消退。该图显示，当剂量为23.85mg/kg时，可以在植入肿瘤后28天取得完全消退，而当剂量为13.25mg/kg时，可以在植入肿瘤后35天取得完全消退。值得注意的是，52天后全部两个施用方案的所有小鼠都仍然活着(8/8)，而对照组的8只小鼠却已减少到了1只。小于10％的T/C值指征完全消退(CR)(Bissery等，1991)。据此标准，在全部两个治疗组中均实现了CR，这反映出通过BT062而实现的完全消退。
引人注意的是，在无治疗的观察阶段，未检测到肿瘤的再生长，从而确认了在此模型中的完全治愈。
表11：肿瘤体积为胰腺癌异种移植小鼠模型
实施例2：乳癌
将患者的原发性乳房肿瘤(通过IHC分析确定为CD138强阳性)植入NMRI(裸)小鼠中(双侧)。乳腺癌皮肤转移为M1期。其为不对赫赛汀产生响应的肿瘤(具有中等表达的低Her2)。该肿瘤呈雌激素受体阴性和孕酮受体阴性。根据IHC染色结果(通过BT062检测到的强的均一的CD138表达，三阴(激素受体雌激素和孕酮的阴性表达)；Her2表达评分为2以下(认为对赫赛汀无响应))选择了待植入的肿瘤。
在肿瘤已达到直径约6mm～8mm(最小5mm)的尺寸后，开始用BT062进行治疗。一周两次测量了肿瘤直径。根据公式a×b×b/2来计算肿瘤体积，其中，“a”是最长轴，“b”是与a垂直的轴。将测试组相对于载质对照组的肿瘤体积抑制计算为相对肿瘤体积中值比(T/C)。
每周施用一次BT062可以显著减小肿瘤体积。观察到了剂量依赖性的部分消退和完全消退。该免疫偶联物得到了良好的耐受，在每次注射后都对体重没有影响。在全部两个治疗组中都获得了小于10％的T/C值，这反映出通过施用BT062实现的完全消退。在图YYY中可以看到，在21天后实现了抗肿瘤效果(即，完全消退)，可以认为这是对BT062的快速响应。与胰腺模型相比，治疗持续时间可以减短一半(用5周代替10周)，并且将13.25mg/kg的低剂量减至4mg/kg来实现类似的效果，即完全消退和无肿瘤的再生长。并未预料到乳癌的更短治疗时间，这是因为在进行IHC分析时CD138表达水平是相似的。因此，关于对治疗持续时间的一般性推荐，不能从CD138表达水平中得出结论。21天后，全部两个治疗组以及对照组的所有小鼠都仍然活着。在无治疗的观察阶段(最后一次施用免疫偶联物后39天)，未检测到肿瘤的再生长，从而确认了完全治愈。
表12a：肿瘤体积为乳癌异种移植小鼠模型
表12b：乳癌细胞上相对于上皮细胞的CD138表达
实施例3：膀胱癌
将膀胱肿瘤(通过IHC分析确定为CD138强阳性)，即移行细胞癌，植入NMRI(裸)小鼠中。
在肿瘤已达到直径大于5mm的尺寸后，开始用BT062进行治疗。一周两次测量了肿瘤直径。根据公式a×b×b/2来计算肿瘤体积，其中，“a”是最长轴，“b”是与a垂直的轴。将测试组中相对于载质对照组的肿瘤体积抑制计算为相对肿瘤体积中值比(T/C)。
每周施用BT062来试图使肿瘤体积显著减小。对任何剂量依赖性的部分消退和完全消退进行追踪。
实施例4：肺癌
将肺癌(通过IHC分析确定为CD138强阳性)植入NMRI(裸)小鼠中。
在肿瘤已达到直径大于5mm的尺寸后，开始用BT062进行治疗。一周两次测量了肿瘤直径。根据公式a×b×b/2来计算肿瘤体积，其中，“a”是最长轴，“b”是与a垂直的轴。将测试组中相对于载质对照组的肿瘤体积抑制计算为相对肿瘤体积中值比(T/C)。
每周施用BT062来试图使肿瘤体积显著减小。对任何剂量依赖性的部分消退和完全消退进行追踪。
临证前毒性研究
异种移植小鼠模型非常适合用来确定本发明的免疫偶联物在小鼠所建立癌症模型环境中是否有效。然而，由于这些模型缺乏适当的固有CD138表达，其不能作为用于毒性研究的可靠模式，并因此不能用来完全确定本发明的免疫偶联物的可耐受量。
食蟹猴和恒河猴也未显示出BT062结合任何CD138相关抗原，但目前是用于BT062毒理学研究的已知最适合的动物物种。因此，预期小鼠和猴中的BT062毒性特征是由于偶联物的细胞毒性成分(DM4)的非靶向型效应。
在食蟹猴和CD-1小鼠中进行了满足GLP要求的单剂量毒性研究。这些研究经设计用来鉴定引起严重毒性的剂量和在动物中没有(或有最小限度的)不良作用的剂量，鉴定在人中的潜在毒性，并鉴定使用单推注输注BT062的I期临床试验中的安全起始剂量。
急性小鼠毒性研究
在小鼠中进行了单剂量毒性研究，其中通过单推注IV注射施用了剂量为60～255mg/m2(20～85mg/kg)的BT062。
BT062在小鼠中的最高非严重毒性剂量(HNSTD)是45mg/kg(135mg/m2)，其估算的STD10为57mg/kg(171mg/m2)。
急性猴毒性研究
在食蟹猴进行了单剂量毒性研究，其中IV施用了剂量为48～336mg/m2(4～28mg/kg)的BT062。
BT062在食蟹猴中的HNSTD是12mg/kg (144mg/m2)。
用BT062进行的人试验
在本发明的情况下，人受试者对低剂量方案响应良好。甚至在不存在会对靶细胞上的CD138表达的质和量进行补偿的任何附加治疗时也是如此(参照MYLOTARG)。小鼠模型显示出，在小鼠中得到良好耐受的剂量的BT062具有非常显著的抗骨髓瘤活性，而有效性在相对更高的剂量时明显更佳(见图14)，从而引起下述问题：在多种非肿瘤细胞上表达CD138的人受试者耐受多高的剂量。
I期研究
进行此研究是为了测试BT062在治疗复发性或复发性难治性多发性骨髓瘤患者时的效果(好与差)和确定MTD(最大耐受剂量)。
到现在为止，募集了26位患者。在26位患者中，至少有11位经历了通过至少接受第4个治疗周期而表现出的减弱的疾病进展，但有4位患者仍在接受治疗。该试验在不同部位进行，并且用不同的剂量水平(10mg/m2、20mg/m2、40mg/m2、80mg/m2、120mg/m2、160mg/m2、200mg/m2)对3患者和4患者组进行治疗，且治疗周期数为1～10之间的任意数(见图23)。本领域的技术人员将意识到，更多的治疗周期是可行的并且在本发明的范围内，例如10～50个、10～100个、10～200个或更多个。
用相对低的剂量水平(即20mg/m2、40mg/m2、80mg/m2和120mg/m2)减轻了疾病进展，其中接受20mg/m2的第二个剂量水平的一位患者在10个21天的治疗周期中未显示出疾病进展。见图23，其中，在患者样本001-001、003-001、002-002、002-003、002-004、003-003、001-005、001-006、001-008、001-009、004-001、001-011、004-002和001-012中观察到，疾病最终发生了进展，不过可以观察到稳定疾病和包括轻微响应和部分响应在内的响应。在患者样本001-006中，暂停了剂量。
在这些剂量水平上，如上所述(见表7和表8)，还观察到了BT062从血浆中的快速清除。这些低剂量施用方案的一些药代动力学特性示于图17中。图18中显示了对人和猴的BT062血浆特性的比较。左图显示了在120mg/m2时的差异，而右图(160mg/m2)中的那些则显示出明显更小得差异。
还施用了剂量160mg/m2和200mg/m2。经鉴定，160mg/m2的剂量为MTD并扩展了对此组的研究。经鉴定，200mg/m2的剂量为MAD。使用NCI CTCAE v3.0(2006年8月9日，http://ctep.cancer.gov)的等级划分，确定了剂量限制性毒性(DLT)。下文列出了研究特异性的DLT标准：
非血液学的
·任何等级的脱发都不认为是DLT
·尽管进行了最适的止吐药物治疗a但仍持续超过3天的3～4级恶心和呕吐。
·尽管进行了最适的止泻药物治疗a但仍持续超过3天的3～4级腹泻。
a.最适的止泻和止吐治疗由每位研究者来确定。
血液学的
·持续超过5天的4级中性粒细胞减少。
·3级或更高等级的中性粒细胞减少且间隔4小时两次连续确定的温度大于或等于101°F。
·4级血小板减少
·3级或更高等级的血小板减少，伴有出血现象且必须使用血小板输血。
·不认为3级中性粒细胞减少、3级血小板减少是DLT。
根据NCI-CTCAE v3.0来评估所有不良事件(AE)
对于未在NCI-CTCAE v3.0中列出的AE，由研究者根据这些标准来评估严重程度。仅1级和2级是可接受的，因此1级(温和)要求最小限度的治疗或不要求治疗，且不干扰患者的日常活动；2级(中等)导致低水平的不便或涉及到治疗性测量。中等事件可能引起对患者机能的一些干扰。
将据认为与BT062有关的3级(严重)和4级(威胁生命)的AE认为是不可接受的，且将其定义为DLT(如果研究特异性DLT标准未另作定义)。
患者样本003-005、002-012和002-011仍然一直参与此研究。
患者样本002-003、001-002和002-008则已退出。
如图23所示，每21天(即在第1天、第22天、第43天、第64天、第85天、第106天，并以此类推)进行10mg/m2、20mg/m2、40mg/m2、80mg/m2、120mg/m2、160mg/m2、200mg/m2的重复的单剂量方案。通过医师对血液学、临床症状和临床化学的评估，并通过随时间的推移测量患者的血清和尿中的M蛋白水平(g/dL)和患者血清中的游离轻链(FLC)水平，已在监视并将继续监视疾病。
免疫球蛋白评估
在筛选时分析Ig抗体的量，包括确定IgG亚类。
M蛋白的定量和血清游离轻链的测定
首先，在第1～3个治疗周期的第1天使用免疫电泳(IEP)和免疫固定电泳(IFE)对来自血清和24小时尿采集物中的M蛋白进行定量，从而评估对治疗的响应。对于第3个及后续的治疗周期，在第15天探访时进行M蛋白定量，从而可以获得用来在下一个治疗周期开始前评估响应的结果。一般性定量免疫球蛋白评估与M蛋白定量一起完成。
用血清样品来进行FLC测定，从而检查不具有可检测的M蛋白的多发性骨髓瘤受试者(非分泌型/低分泌型骨髓瘤)并使得可以检测到对治疗的早期响应。因此，在第1个治疗周期的第1、2、3和8天，在第4个周期的第2、3、8和15天，以及在全部其他周期的第1、8和15天，进行了血清FLC测定。在筛选时和在结束访查时分析了M蛋白和FLC。将第1周期第1天的评估作为基线值。
表13提供了对选定患者的尿/血清M蛋白和血清FLC测量做出的观察。
对来自血浆的BT062和DM4的确定
为了评估BT062的单剂量PK性质，在IV施用BT062后，在第1个治疗周期期间进行了大规模的血浆采样。在第4个治疗周期期间进行了相同的评估。在全部其他治疗周期的第1天和第8天，以及在进行结束访查和随访时，还以较小的规模获得血浆样品。
对脱落的CD138和HAPA的确定
针对脱落的/可溶性CD 138(sCD 138)水平，对所有给药前(pre-dose)血浆样品进行了评估，从而研究sCD138水平和抗肿瘤活性之间的潜在相关性。这些测量还可以确定：小于预期cmax的值并不依赖于在施用BT062前就存在的sCD138的量(见图22)。通过评估人抗产品抗体(human antiproduct antibody)(HAPA)，评估了来自每个治疗周期第1天和来自结束访查和随访的给药前血浆样品，以检测针对BT062(药物产品)的体液应答的存在。
所观察到的脱落的CD138的测量结果
在骨髓瘤患者中，可以观察到高水平的sCD138，其可能是骨髓瘤患者的预后指示(Maisnar等，2005)。
MGUS和MM的患者可能显示出高水平的可溶CD138，且伴有更高水平的β2-微球蛋白和骨髓中升高的浆细胞含量(Aref等，2003)。
使用试剂盒来确定可溶性CD138。令人惊奇的发现是，在患者003-003中用20mg/m2的BT062时，该患者就尿M蛋白水平而言显示出轻微响应，虽然该患者在治疗前显示出了高水平的sCD138。
在不同的受试者中确定了可溶性(s)CD138值。
受试者 sCD138(ng/mL)
002-003 61.3
001-002 196
002-004 56.7
003-003 2583
平均值 724.1
表14：患者003-003(剂量20mg/m2)显示出非常高的sCD138值。然而，该患者在M蛋白水平上取得了轻微响应。
组合研究
已对细胞系中作为BT062的组合配对成分的可能的抗骨髓瘤药物候选物进行了评估。
细胞系研究
在异种移植小鼠模型中组合研究之前进行了细胞系中的研究。使用中值效应分析(median effect analysis)，依照Chou和Tally(1984)，在不同的细胞系中进行了协同性确定。此处，计算了每种药物和每个细胞系的细胞毒性效果的IC50值，随后计算了每对药物的IC50比。随后使细胞暴露于这些药物混合物或单独药物的连续稀释液。使用CompuSyn软件(ComboSyn，Inc.，Paramus，NJ)分析了实验数据。分别计算并报告每个独立实验中的组合指数(CI)。在此分析中，小于1、等于1和大于1的CI分别表示协同性、加合性和拮抗性。根据该方法的作者T.C.Chou的分类(CompuSyn.用户手册，2004)，协同性和拮抗性的级别如下：
表15：对根据Chou和Tally(1984)的方法对在细胞系中获得的协同性结果的评估。
在此实例中，将MOLP 8细胞系用于BT062与硼替佐米、沙立度胺、来那度胺、美法仑和地塞米松的组合。
与沙立度胺或硼替佐米的组合，既未导致协同效应，也未导致加合效应，而是导致了拮抗效应。与这些细胞培养物研究相反，在下述异种移植模型中，与硼替佐米的组合具有协同性。
使用MOLP8人多发性骨髓瘤细胞，已对作为异种移植研究中的BT062的组合配对成分的可能的抗骨髓瘤药物候选物进行了评估。
实施例1
用BT062和来那度胺的组合疗法的抗骨髓瘤效果
用MOLP 8人骨髓瘤细胞对雌SCID小鼠进行皮下接种。在肿瘤接种后11天，开始了仅用BT062或用BT062与来那度胺的组合进行的治疗。使用了单独的或与来那度胺组合的浓度为100μg、200μg和400μg的BT062，其中，所述来那度胺在第1～5天和第8～12天以100mg/kg的剂量腹膜内给药。对照组动物接受了使用同样的施用计划和施用途径的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过测量肿瘤尺寸监视了肿瘤生长，计算公式为长×宽×高×1/2(确定于第10、14、18和21天)。
协同性的计算方式如下(Yu等，2001；Gunaratnam等，2009)：
比率(r)＝预期FTV(组合)/观察到的FTV(组合)
FTV：分数肿瘤体积＝平均肿瘤体积(测试)/平均肿瘤体积(对照)
比率＞1则认为有协同性，而r＜1则表示小于加合。
比率(r)在大于1时，在此被称为“协同比”。
从表15中可见，28天后在200μg和400μg的BT062浓度中观察到了协同性。
表16：MOLP 8异种移植物中的分数肿瘤体积。
已将不同浓度的BT062单独或与来那度胺组合施用到了具有肿瘤的异种移植物中。FTV表示相对肿瘤体积。使用预期FTV与所观察到的FTV的比率值来确定协同效应。大于1的比率表示协同性。
表17：来那度胺BT062组合：不同剂量时的效果。
图28显示了在异种移植小鼠模型中该组合疗法对肿瘤体积(TV)中值的效果。结果显示了该组合的加合效应。关于协同比，请参见表16。
实施例2
用BT062和VELCADE的组合疗法的抗骨髓瘤效果
在使用MOLP8多发性骨髓瘤细胞(IMGN Inc.)的异种移植研究中，对VELCADE作为BT062的潜在多发性骨髓瘤药物组合配对成分进行了评估。在植入肿瘤后11天，开始了仅用BT062或用BT062与VELCADE的组合进行的治疗。使用了单独的或与VELCADE组合的100μg、200μg和400μg浓度的BT062，其中，所述VELCADE在第1、4、8和11天以1mg/kg的剂量给药。对照组动物接受了使用同样的施用计划和施用途径的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过测量肿瘤尺寸监视了肿瘤生长，计算公式为长×宽×高×1/2(分别确定于第10、14、17、21、24和28天)。
如在组合研究的实施例1中，计算了协同性。
从表18中可见，在所有的BT062剂量方案中，在第25天在BT062与VELCADE的组合中观察到了协同性。文献中报道的R值甚至更高(Yu等，2001)。
表18：用VELCADE进行的组合治疗。
分数肿瘤体积(FTV)表示平均肿瘤体积(测试)/平均肿瘤体积(对照)。预期FTV(组合)与观察到的FTV(组合)的比率。大于1的比率值表示协同性，小于1的比率值表示加合效应。
VELCADE组合
表19：VELCADE BT062组合：不同剂量时的效果。
图29显示了在异种移植小鼠模型中该组合疗法对肿瘤体积(TV)中值的效果。结果显示，在所用的模型中，单独的VELCADE治疗对肿瘤体积没有效果。与BT062的组合提供了协同效应。关于协同比，请参见表18。
实施例3：BT062/美法仑
已将RPMI细胞皮下植入裸鼠中。当肿瘤达到约100mm3的总体积时，将小鼠随机分组。静脉内注射2个不同浓度的BT062，即400μg/kg和100μg/kg，每个都基于所连接的DM4的分子量。用PBS作为阴性对照。每组使用了8只各具有1个肿瘤(单侧植入)的小鼠。每周用BT062进行定量给药，随后在注射BT062后一天每周腹膜内施用一次美法仑(3mg/kg)。
结果示于图30中。
在获悉上述公开内容后，对技术人员而言很多其他特征、修改和改进将变得显而易见。因此将所述其他特征、修改和改进认为是本发明的一部分，其范围则通过对本发明的概括和所附权利要求来确定。
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Claims (42)

1.免疫偶联物在制造用于治疗患有癌症的人类患者的药物中的应用，所述癌症具有表达CD138的靶细胞，
其中，所述免疫偶联物包含
至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向抗体，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向抗体功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
其中所述免疫偶联物将以5mg/m2-200mg/m2患者体表面积的量或以5mg/m2-200mg/m2患者体表面积的药代动力学等价量施用至患者，
其中所述量是可耐受量，
其中所述靶向抗体由轻链和重链组成，其中所述轻链特征在于SEQ ID NO:2的氨基酸序列和所述重链特征在于SEQ ID NO:1的氨基酸序列,
其中所述癌症是复发性或难治性多发性骨髓瘤,
且其中至少一种效应物分子是DM4。
2.如权利要求1所述的应用，其中，在首次施用结束后0-2小时，所述免疫偶联物在患者血浆中的最大浓度小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的50％。
3.如权利要求1所述的应用，其中，在首次施用结束后0-2小时，所述免疫偶联物在患者血浆中的最大浓度小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的20％。
4.如权利要求2所述的应用，其中，所述免疫偶联物将施用至少4次，并且在每次所述施用结束后0-2小时，所述免疫偶联物在患者血浆中的最大浓度小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的55％。
5.如权利要求2所述的应用，其中，所述免疫偶联物将施用至少4次，并且在每次所述施用结束后0-2小时，所述免疫偶联物在患者血浆中的最大浓度小于所述免疫偶联物的理论最大浓度的30％。
6.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物将按不超过80mg/m2患者体表面积的剂量施用。
7.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物将按不超过90mg/m2患者体表面积的剂量施用。
8.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物将按不超过100mg/m2患者体表面积的剂量施用。
9.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物将按不超过120mg/m2患者体表面积的剂量施用。
10.如权利要求6-9任一项所述的应用，其中所述剂量为重复的单剂量。
11.如权利要求1所述的应用，其中，对患者将施用下述量的所述免疫偶联物，所述量为从5mg/m2患者体表面积至小于160mg/m2患者体表面积。
12.如权利要求1所述的应用，其中，对患者将施用下述量的所述免疫偶联物，所述量为从10mg/m2患者体表面积至小于160mg/m2患者体表面积。
13.如权利要求1所述的应用，其中，对患者将施用下述量的所述免疫偶联物，所述量为从10mg/m2患者体表面积至140mg/m2患者体表面积。
14.如权利要求1所述的应用，其中，对患者将施用下述量的所述免疫偶联物，所述量为从10mg/m2患者体表面积至120mg/m2患者体表面积。
15.如权利要求2所述的应用，其中，所述最大浓度对10mg/m2患者体表面积而言小于3μg/ml，对20mg/m2患者体表面积而言小于8μg/ml，对40mg/m2患者体表面积而言小于15μg/ml，对80mg/m2患者体表面积而言小于25μg/ml，对120mg/m2患者体表面积而言小于30μg/ml。
16.如权利要求4所述的应用，其中，所述最大浓度对20mg/m2患者体表面积而言小于14μg/ml，对40mg/m2患者体表面积而言小于15μg/ml，或对80mg/m2患者体表面积而言小于25μg/ml。
17.如权利要求1所述的应用，其中，在所述患者中，所述CD138在所述靶细胞上和非靶细胞上表达；其中，所述免疫偶联物对表达CD138的所述非靶细胞展示出临床可接受的毒性。
18.如权利要求17所述的应用，其中表达CD138的所述非靶细胞是上皮细胞。
19.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物对应于BT062。
20.如权利要求1所述的应用，其中，所述治疗基本由施用包含所述免疫偶联物和药物可接受的载剂的药物组合物构成，其中，所述组合物的活性成分基本由所述免疫偶联物组成。
21.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物将静脉内施用。
22.如权利要求21所述的应用，其中所述免疫偶联物将以重复的单剂量方式静脉内施用。
23.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者正在用至少一种细胞毒性剂治疗。
24.如权利要求23所述的应用，其中所述至少一种细胞毒性剂是硼替佐米、沙立度胺、玻马利度胺、来那度胺或美法仑。
25.如权利要求1所述的应用，其中，所述癌症带有骨痛和/或骨并发症，并且其中所述免疫偶联物的施用减少所述骨痛和/或骨并发症。
26.如权利要求25所述的应用，其中所述骨痛和/或骨并发症减少至可接受的水平。
27.如权利要求1所述的应用，其中，所述免疫偶联物用于治疗难治性表型。
28.如权利要求1所述的应用，其中，将所述癌症鉴定为对用包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂的一种或多种细胞毒剂的治疗没有响应；并且其中，所述的免疫偶联物以静脉内方式施用。
29.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者显示出高于50ng/ml的sCD138水平，且
其中所述免疫偶联物以低至20mg/m2患者体表面积或低至40mg/m2患者体表面积的量施用。
30.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者显示出高于100ng/ml的sCD138水平，且
其中所述免疫偶联物以低至20mg/m2患者体表面积或低至40mg/m2患者体表面积的量施用。
31.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者显示出高于500ng/ml的sCD138水平，且
其中所述免疫偶联物以低至20mg/m2患者体表面积或低至40mg/m2患者体表面积的量施用。
32.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者显示出高于1000ng/ml的sCD138水平，且
其中所述免疫偶联物以低至20mg/m2患者体表面积或低至40mg/m2患者体表面积的量施用。
33.如权利要求1所述的应用，其中，所述患者显示出高于1500ng/ml的sCD138水平，且
其中所述免疫偶联物以低至20mg/m2患者体表面积或低至40mg/m2患 者体表面积的量施用。
34.如权利要求29-33中任一项所述的应用，其中，所述响应是所述免疫偶联物的选择性结合的结果。
35.如权利要求29-33中任一项所述的应用，其中，所述患者对用细胞毒剂进行的治疗没有响应。
36.如权利要求35所述的应用，其中所述细胞毒剂包括免疫调节剂和/或蛋白酶体抑制剂。
37.如权利要求35所述的应用，其中所述细胞毒剂包括来那度胺和/或硼替佐米。
38.一种试剂盒，其包含一种或多种剂型的药物组合物及说明如何将所述一种或多种剂型施用至有需要的人受试者的使用说明，其中所述药物组合物和所述使用说明在单独的容器中；
其中所述药物组合物包含免疫偶联物，该免疫偶联物包含：
至少一种以表达CD138的细胞为靶标的靶向抗体，和
至少一种效应物分子，其中，所述靶向抗体功能性地与所述效应物分子连接而形成所述免疫偶联物，
其中所述靶向抗体由轻链和重链组成，其中所述轻链特征在于SEQ ID NO:2的氨基酸序列和所述重链特征在于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
其中所述免疫偶联物以5mg/m2-200mg/m2患者体表面积的量或以5mg/m2-200mg/m2患者体表面积的药代动力学等价量施用至受试者，
其中所述量是可耐受量，
其中所述使用说明指示上述治疗方案，
其中所述免疫偶联物施用于患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的患者,
且其中至少一种效应物分子是DM4。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述免疫偶联物对应于BT062。
40.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述免疫偶联物以10mg/m2患者体表面积至小于160mg/m2患者体表面积的量施用于所述受试者。
41.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述免疫偶联物施用于正在用至少一种细胞毒性剂治疗的患者。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其中所述至少一种细胞毒性剂是硼替佐米、沙立度胺、玻马利度胺、来那度胺或美法仑。
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