CN101952315B - 靶向cd138的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人类小鼠嵌合抗体，所述嵌合抗体基本上保留其小鼠对应物的抗原结合区，并且展示出改进的对抗原的结合亲和力和/或对靶细胞的更均匀结合。

Description

靶向CD138的试剂及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年12月26日提交的美国临时申请61/016,630的权益，本文通过参考并入其全部内容。
技术领域
本发明涉及用于改进的抗原CD138用靶向剂以及包含所述靶向剂的组合物和它们的使用方法。
背景技术
作为细胞外基质的受体的CD138在多发性骨髓瘤(MM)细胞上过表达，并且已经表现出影响MM细胞发育和/或增殖。举例而言，CD138还在卵巢癌、肾癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)的细胞上表达。
在此用于说明本发明，特别是提供关于实施的额外详细说明的出版物和包括专利等的其它材料，均通过参考并入。方便起见，所述出版物在下文中按照作者和日期引用，和/或按照所附目录中的作者依照字母顺序列出。
Tassone等(2004)已经报道了鼠IgG1抗体B-B4对在MM细胞表面上表达的CD138抗原的良好结合。Tassone还报道了包含类美登素(maytansinoid)DM1作为效应分子的免疫缀合物B-B4-DM1对多发性骨髓瘤细胞的高细胞毒性活性(还参见美国专利公开20070183971)。
仍然存在对靶向剂、特别是基于B-B4而缺乏与B-B4有关的某些性质和/或功能的靶向抗体的需要。此类靶向抗体可以包含一种或多种人类抗体的抗体区。特别是存在对基于B-B4的嵌合抗体的需要，该嵌合抗体与B-B4一样有效地结合CD138，但是可以施用于人类而无显著的副作用。还存在对结合亲和力超过B-B4的结合亲和力的靶向剂的需要。还存在对于相对于其小鼠对应物显示一个或多个有利的性质的此类基于B-B4的靶向剂的需要。这些性质包括改进的抗原结合、特别是与表达CD138的肿瘤细胞和其辅助细胞的结合，以及更均匀的结合。
发明内容
本发明涉及一种用于均匀地结合CD138的方法，所述方法包括：
提供基因工程靶向抗体，其中所述基因工程靶向抗体包含
抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和
另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，和
对表达CD138的细胞施用所述基因工程靶向抗体，
其中所述基因工程靶向抗体均匀地与所述表达CD138的细胞上表达的CD138结合。
本发明还涉及一种分离的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重链或其部分与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性，其中包含所述免疫球蛋白重链或其部分的靶向剂靶向CD138。
所述免疫球蛋白重链或其部分可以与SEQ ID NO：1的残基31～35、残基51～68和残基99～111具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性，并且所述靶向剂可以为基因工程靶向抗体。
所述免疫球蛋白重链或其部分的恒定区可以为IgG4同型的恒定区。
所述靶向剂可以为小鼠人类嵌合抗体。
所述靶向剂或基因工程靶向抗体可以为人源化抗体。
所述分离的多肽可以还包含免疫球蛋白轻链或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链或其部分与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
所述分离的多肽可以还包含免疫球蛋白轻链或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链或其部分与SEQ ID NO：2的残基24～34、残基50～56和残基89～97具有至少75％、至少85％、至少95％或至少97％序列同一性。
所述免疫球蛋白重链可以与SEQ ID NO：1的序列相同。
所述免疫球蛋白轻链可以与SEQ ID NO：2的序列相同。
本发明还涉及一种识别CD138的基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体包含：
抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和
另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体，其中所述基因工程靶向抗体
(a)以比所述非人类抗体的结合亲和力更高的结合亲和力与CD138结合；和/或
(b)提供表达CD138的细胞与CD138的均匀结合。
所述另外的抗体区可以为至少一个包含出自人类抗体的重链恒定区或其一部分的恒定区，并且其中所述基因工程抗体出自IgG4同型。
所述基因工程靶向抗体可以为嵌合抗体，并且所述非人类抗体可以为B-B4。
所述基因工程靶向抗体可以为人源化抗体，并且所述非人类抗体可以为B-B4。
所述重链可以与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
所述基因工程靶向抗体可以包含至少一个轻链，其中所述轻链与SEQ ID NO：2具有至少约70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
所述重链可以与SEQ ID NO：1的残基31～35、残基51～68和/或残基99～111具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性。所述轻链与SEQ ID NO：2的残基24～34、残基50～56和/或残基89～97具有至少75％、至少85％、至少95％、至少97％或100％序列同一性。
所述另外的抗体区可以分别包含：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸残基123～448，和/或
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基108～214，以及其突变体，所述(a)和/或(b)及其突变体维持或降低所述基因工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性、和/或稳定所述基因工程靶向抗体。
所述另外的抗体区可以为人类抗体的重链恒定区。
所述基因工程靶向抗体与CD138结合的靶向差异可以小于150％、小于140％、小于130％、小于120％、小于110％、小于100％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％或小于50％。
所述重链可以与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
所述基因工程靶向抗体可以包含至少一个轻链，其中所述轻链与SEQ ID NO：2具有至少约70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性。
所述重链可以与SEQ ID NO：1的残基31～35、残基51～68和残基99～111具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％序列同一性。
所述轻链与SEQ ID NO：2的残基24～34、残基50～56和残基89～97具有至少75％、至少85％、至少95％、至少97％或至少100％序列同一性。
本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含所述基因工程靶向抗体和药物可接受载剂，或者所述药物组合物基本上由所述基因工程靶向抗体和药物可接受载剂组成。
产生所述基因工程靶向抗体的杂交瘤也是本发明的一部分。
本发明还包括基于抗体的测试，所述测试包含所述基因工程靶向抗体。
本发明提供用于医学的本文所述的基因工程靶向抗体。特别地，所述基因工程靶向抗体包含：
抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和
另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体。
更特别地，所述基因工程靶向抗体用于靶向肿瘤细胞的治疗。
本发明还提供本文所述基因工程靶向抗体在用于靶向肿瘤细胞的药物制备中的应用，所述基因工程靶向抗体包含：
抗CD138抗原结合区，其中所述抗原结合区出自非人类抗体，和
另外的抗体区，其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体。
更特别地，在本发明的这些医学应用中，对具有表达CD138的细胞的个体施用所述基因工程靶向抗体。此外，所述基因工程靶向抗体能够均匀地与在所述表达CD138的细胞上表达的CD138相结合。
附图说明
图1提供连接有效应分子的nBT062的示意图。
图2为BT062的化学示意图。
图3显示安丝菌素P-3向美登醇的转换(简化起见省略立体化学)。
图4显示DM4的代表性合成图。
图5为抗体缀合(nBT062至DM4)的示意图。
图6显示对nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1、nBT062-SMCC-DM1和nBT062抗体与OPM-2细胞的结合的分析。将不同浓度的nBT062和缀合物给予所述细胞，并通过FACS分析测定平均荧光。
图7(A)～(D)描述nBT062-DMx缀合物对MOLP-8(CD138+)和BJAB(CD138-)细胞的体外细胞毒性。在平底板中培养所述细胞，并且与指定浓度的免疫缀合物一起温育5天。加入WST试剂，过3个小时估算细胞活力。在(D)中，在存在或不存在阻断抗体(1μM nBT062)时分析nBT062-SPDB-DM4的细胞毒性活性。
图8显示用(A)PBS、(B)nBT062抗体、(C)游离DM4或(D)非靶向缀合物huC242-DM4处理的个体小鼠，在用MOLP-8肿瘤细胞接种后随时间(天)推移的肿瘤体积。
图9显示用(A)PBS、(B)nBT062-SPDB-DM4、(C)B-B4-SPP-DM1或(D)nBT062-SPP-DM1处理的个体小鼠，在用MOLP-8肿瘤细胞接种后随时间(天)的肿瘤体积。
图10描述CB.17SCID小鼠中MOLP-8人类多发性骨髓瘤异种移植物，在接种后随时间(天)的平均肿瘤体积(+/-SD)。
图11A和B显示在SCID小鼠的大体积(bulky)MOLP-8肿瘤模型中，nBT062-DMx针对CD138+MOLP-8肿瘤细胞的抗肿瘤活性。对于各组，肿瘤体积以平均值(+/-SD)给出。
具体实施方式
本发明涉及靶向剂，特别是涉及CD138靶向抗体，更特别的是涉及基因工程CD138靶向抗体。包含所述靶向剂的免疫缀合物允许将效应分子输送至靶点，并允许效应分子在靶细胞、组织和器官中、其上或其附近的位点特异性释放。所述效应分子可以通过在靶点处从免疫缀合物的靶向剂部分切割/分离而激活。
可以对需要治疗性治疗的受试对象或分离自需要治疗性治疗的此类受试对象的细胞施用本发明的抗体和/或包含其的免疫缀合物。可以通过在靶细胞、组织或器官中、其上或其附近切割/分离而从所述免疫缀合物释放效应分子。
在一个实例中，将抗体nBT062用于色谱测试。提供了经福尔马林固定、石蜡包埋的患者组织。添加作为一抗的抗体nBT062，且组织的表面表达的CD138与抗体结合。添加检测抗体以与nBT062结合。在最后步骤中，确定包含色素原的检测抗体的这种结合。抗体nBT062用于鉴定造血细胞中的人类浆细胞，由此允许诊断各种恶性血液病。该方法还允许追踪特定癌症的进展。当使用nBT062时，与其小鼠对应物相反，观察到由于与Fc受体的交叉反应性降低而导致的非特异性检测的降低。
在第二实例中，提供nBT062抗体和包含nBT062抗体和作为效应分子的至少一种高细胞毒性药物或免疫毒素的免疫缀合物，并且将其施用于患有癌症的患者。在该实例中，有效量的nBT062保护表达CD138的非肿瘤细胞免受稍后对患者静脉内施用的治疗有效量的免疫缀合物的作用，从而使该免疫缀合物在癌细胞中富集。通过外部手段使所述效应分子从所述抗体靶释放，从而诱导癌细胞中的细胞死亡或连续的细胞周期停滞。
CD138或粘结蛋白聚糖-1(syndecan-1)(也称SYND1；SYNDECAN；SDC；SCD1；CD138抗原，SwissProt登录号：P18827人类)为一种膜糖蛋白，最初记载其存在于源自上皮的细胞上，随后发现于造血细胞上(Sanderson，1989)。CD138具有长的细胞外结构域，该细胞外结构域与可溶性分子(例如生长因子EGF、FGF、HGF)和不溶性分子(例如细胞外基质成分胶原蛋白和纤连蛋白)通过硫酸乙酰肝素链结合(Langford，1998；Yang，2007)，并且充当细胞外基质的受体。CD138还通过由粘附细胞表达的肝素结合分子来介导细胞与细胞的粘着。已经显示CD138起骨髓瘤细胞的生长因子的共受体的作用(Bisping，2006)。血浆细胞分化的研究表明，CD138也必须被视为一种分化抗原(Bataille，2006)。
在恶性造血中，CD138在大多数的以下细胞上高度表达：MM细胞、卵巢癌、肾癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)(Horvathova，1995)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)(Seftalioglu，2003(a)；Seftalioglu，2003(b))、实体组织肉瘤、结肠癌以及表达CD138的其它恶性血液病和实体瘤的细胞(Carbone等，1999；Sebestyen等，1999；Han等，2004；Charnaux等，2004；O’Connell等，2004；Oroszh和Kopper，2001)。
已经对CD138表达显示为阳性的其它癌症为多种卵巢腺癌、膀胱移行细胞癌、肾透明细胞癌、肺鳞状细胞癌、乳腺癌和子宫癌(参见，例如，Davies等，2004；Barbareschi等，2003；Mennerich等，2004；Anttonen等，2001；Wijdenes，2002)。
在正常人类造血腔中，CD138表达局限于血浆细胞(Wijdenes，1996；Chilosi，1999)，并且CD138不在外周血淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和红细胞上表达。特别地，CD34+干细胞和祖细胞(progenitor cell)不表达CD138，并且抗CD138 mAb不影响造血干细胞培养物中集落形成单位的数量(Wijdenes，1996)。在非造血腔中，CD138主要在肺、肝、皮肤、肾和肠内的单层上皮和复层上皮上表达。在内皮细胞上仅看到弱的染色(Bernfield，1992；Vooijs，1996)。据报道，CD138以多态性形式存在于人类淋巴瘤细胞中(Gattei，1999)。
已经报道单克隆抗体B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1.BB.210、2Q1484、5F7、104-9、281-2，特别是B-B4对CD138有特异性。其中B-B4、1D4和MI15既识别CD138的完整分子也识别其核心蛋白，并且据显示识别相同或密切相关的表位(Gattei，1999)。此前的研究报道，B-B4不识别可溶性CD138，但仅识别膜结合形式的CD138(Wijdenes，2002)。
B-B4，一种鼠IgG1mAb，与人类粘结蛋白聚糖-1(CD138)上的核心蛋白的90～95位残基之间的线性表位结合(Wijdenes，1996；Dore，1998)。与CD138的表达模式一致，据显示B-B4与血浆细胞系RPMI8226强烈地反应，但不与内皮细胞反应。同样与CD138的表达模式一致，B-B4还与上皮细胞系A431(源自角质形成细胞)和HepG2(源自肝细胞)反应。免疫毒素B-B4-皂草素对血浆细胞系RPMI8226也是高度毒性的，事实上比游离皂草素的毒性明显更强。然而，从两个受测的上皮细胞系看出，B-B4-皂草素仅对细胞系A431显示毒性，但在集落形成测试中皂草素对A431细胞的生长晕未显示出抑制作用(Vooijs，1996)。其它研究者报道了MM相关抗原抗肿瘤缺少特异性(Couturier，1999)。
在本发明的背景下，抗体“基本上由特定成分组成”是指抗体由指定的成分和任何不会在实质上影响所述抗体的基本特性的其它材料或成分组成。
本发明使用术语“肿瘤细胞”来包括癌细胞以及可能形成或可能不形成实体瘤的部分的癌前细胞。
本发明的“靶向剂”能够与由靶细胞表达的分子相连，并且包括肽和非肽类。特别地，本发明的靶向剂包括靶向抗体和非免疫球蛋白靶向分子，所述非免疫球蛋白靶向分子可以基于包括但不限于AFFILIN分子、ANTICALINS和AFFIBODIES的非免疫球蛋白蛋白。非免疫球蛋白靶向分子还包括非肽靶向分子(例如靶向DNA和RNA寡核苷酸(适体))，以及生理学配体，特别是所关注的抗原的配体，例如CD138。
本发明的“靶向抗体”为天然抗体或基于天然抗体，或通过合成或通过基因工程而产生，并且与目的细胞(靶细胞)上的抗原结合。本发明的靶向抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、或抗体片段。所述靶向抗体可以被基因工程化以便例如提高其与靶细胞的亲和力(Ross，2003)，或减少其免疫原性。所述靶向抗体可以与包括效应分子的脂质体制剂相连(Carter，2003)。抗体片段包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段以及双链抗体(diabody)；结构域抗体(domain antibody)(dAb)(Ward，1989；美国专利6,005,079)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在单链可变片段抗体(scFv)中，重链和轻链(VH和VL)可以通过短的氨基酸连接子连接，所述连接子具有例如(Gly4Ser)n的序列并且具有足够的柔性而使两个结构域能装配成功能性抗原结合袋。添加各种信号序列可以使得靶向抗体具有更精确的靶向性。添加轻链恒定区(CL)可以允许经由二硫键的二聚化，从而提供更高的稳定性和亲合力。如果可获得针对所关注的靶标的mAb，可以通过RT-PCR获得用于构建scFv的可变区，所述RT-PCR从提取自亲本杂交瘤的mRNA克隆出该可变区。作为另一种选择，所述scFv可以通过噬菌体展示技术从头产生(Smith，2001)。如本文所用，当参照靶向抗体使用时，术语“功能片段”是指能够特异性结合抗原的靶向抗体的一部分，所述抗原与所参照的抗体特异性地结合。本发明的双特异性抗体可以例如具有对靶组织有反应性的至少一条臂，以及对连接子部分有反应性的一条臂(美国专利公开20020006379)。本发明的双特异性抗体还可以与靶细胞上的超过一种抗原结合(Carter，2003)。本发明的抗体可以通过例如引入半胱氨酸残基来引入巯基来修饰(Olafsen，2004)。
根据本发明，所述靶向抗体可以源自任何来源，并且可以为但不限于骆驼抗体、小鼠抗体、嵌合人类/小鼠抗体或嵌合人类/猴抗体，特别是例如nBT062等的嵌合人类/小鼠抗体。
人源化抗体为含有源自人类抗体和源自非人类抗体的序列的抗体，其也在本发明范围内。用于将抗体人源化的合适方法包括CDR移植(互补决定区移植)(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利5,530,101；和5,585,089)、表面修饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan，199；Studnicka等，1994；Roguska等，1994)、链改组(chain shuffling)(美国专利5,565,332)以及DeImmunosationTM(Biovation，LTD)。在CDR移植中，将来自例如mAb B-B4等的小鼠互补决定区(CDR)移植至人类可变框架，然后将该人类可变框架与人类恒定区连接，从而形成人类B-B4抗体(hB-B4)。现在已经将几种通过CDR-移植人源化的抗体用于临床，包括MYLOTARG(Sievers等，2001)和HECEPTIN(Pegram等，1998)。
表面重塑技术使用分子模塑、统计分析和诱变的组合来将抗体可变区的非CDR表面改变成与靶标宿主的已知抗体表面类似。在例如美国专利5,639,641中公开了用于将抗体表面重塑的策略和方法，以及用于降低不同宿主内抗体免疫原性的其它方法。可以通过包括噬菌体展示方法的本领域已知的各种方法来制备人类抗体。还参见美国专利4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；以及国际专利申请公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
经受任何非天然修饰的靶向抗体，例如，嵌合人类/小鼠抗体或嵌合人类/猴抗体、人源化抗体或经基因工程化以便例如提高与靶细胞的亲和力或减少其免疫原性的抗体，以及抗体片段、特别是已经经受任何非天然修饰的此类靶向抗体的功能片段、双链抗体；结构域抗体；线性抗体；单链抗体分子；和多特异性抗体在本文也称为基因工程靶向抗体。
嵌合抗体保留非人类抗体(例如它们所基于的小鼠抗体)的抗体结合区(ABR或Fab区)，同时可以由例如人类抗体提供任何恒定区。通常，抗体恒定区的嵌合和/或交换不会影响抗体的亲和力，这是因为有助于抗原结合的抗体区不受交换的影响。在本发明的优选实施方式中，本发明的基因工程抗体，特别是嵌合的抗体可以比其所基于的对应各非人类抗体具有更高的结合亲和力(通过KD值表达)。具体地，nBT062抗体和基于该抗体的抗体可以比小鼠B-B4具有更高的抗体亲和力。在本发明的另一实施方式中，包含这些基因工程抗体/嵌合抗体的免疫缀合物也显示出这种更高的抗体亲和力。在某些实施方式中这些免疫缀合物也可以显示其它有利性质，例如比其含有B-B4的对应物使肿瘤负荷降低得更多。在优选实施方式中，基因工程化、特别是嵌合的靶向抗体显示出特征为解离常数KD(nM)小于1.6、小于1.5或为1.4或约小于1.4的结合亲和力，而其小鼠对应物的特征在于解离常数KD(nM)为约1.6或大于1.6。优选包含靶向抗体等靶向剂的免疫缀合物的特征在于，解离常数KD(nM)小于2.6、小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.2、小于2.1、小于2.0、小于1.9或为约1.9，而包含小鼠对应物抗体的免疫缀合物的特征可以在于解离常数KD(nM)为约2.6或大于2.6(比较表3、材料和方法)。
也可以使用完全人类抗体。可以通过噬菌体展示方法筛选这些抗体，其中CD138或其抗原性决定子用于选择性地与表达例如B-B4可变区的噬菌体结合(参见，Krebs，2001)。有利的是，该方法可以与亲和突变技术联合，来提高抗体的亲和力。本文涉及的所有抗体为分离的抗体。
在一个实施方式中，未缀合形式的靶向抗体被中等或较弱地内化。在37℃温育3小时后，中等内化构成约30％～约75％的抗体内化，弱内在化包含约0.01％～最大约30％内在化。在另一优选实施方式中，所述靶向抗体结合CD138，例如抗体B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1.BB.210、2Q1484、5F7、104-9、281-2，特别是B-B4。通过将SP02/0骨髓瘤细胞与Balb/c小鼠的脾细胞杂交产生的杂交瘤细胞，已经于2007年12月11日保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1，D-38124Braunschweig。这些表达B-B4的杂交瘤细胞的识别号为DSM ACC2874。在另一实施方式中，所述靶向抗体基本上不结合非细胞表面表达的CD138。在本发明的背景下，当特异性抗体的名称与术语“靶向抗体”结合，例如“nBT062靶向抗体”时，这是指该靶向抗体具有抗体nBT062的结合特异性。如果说靶向抗体“基于”一种特异性抗体，这是指该靶向抗体具有该抗体的结合特异性，但可以采用与靶向抗体的上述描述一致的任何形式。在本发明的背景下，当特异性抗原的名称与术语“靶向抗体”结合(例如“CD138靶向抗体”)时，这是指该靶向抗体具有对CD138的结合特异性。在本发明的背景下，如果例如描述靶向抗体“选择性地”进行某事，例如“选择性地靶向细胞表面表达的CD138”，或对某事是“选择性的”，这是指在所提供的实例的情况下，与任何其它抗原相比，对细胞表面表达的CD138存在显著的选择性(即，对CD138阳性细胞比对于CD138阴性细胞更高的亲和力)。由于该选择性，显著减少甚至避免了给定环境中不利的副作用。
本发明的“非免疫球蛋白靶向分子”包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。将包括在该定义中的小的非免疫球蛋白蛋白设计成对特别是表面表达的CD138具有特异性亲和力。这些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子，例如具有相对低分子量(例如10kDa～20kDa)的Affilin分子。合适的支架包括例如γ晶体。这些分子在其自然状态对靶标分子无特异性结合活性。通过对蛋白表面经由溶剂暴露的氨基酸的局部限定随机化而进行基因工程化，形成全新的结合位点。由此将此前的非结合蛋白转变成特异性结合蛋白。可以将此类分子特异地设计成结合例如CD138等的靶标，并允许特异性输送一种或多种效应分子(参见，www.scilproteins.com的scil Proteins GmbH，2004)。另一种非免疫球蛋白靶向分子源自脂钙蛋白(lipocalin)，并且包括例如ANTICALINS，所述ANTICALINS与免疫球蛋白在结构上具有某种程度的相似性。然而脂钙蛋白由具有160～180个氨基酸残基的单链多肽构成。可以将脂钙蛋白的结合袋改造以便以高亲和力和特异性来识别所关注分子(参见，例如，Beste等，1999)。人工细菌受体(例如商标为Affibody(Affibody AB)的受体)也在本发明范围内。这些人工细菌受体分子为较小的简单蛋白，并且可以由基于蛋白A(金黄色葡萄球菌)的一种IgG结合结构域的支架的三螺旋束构成。这些分子具有与许多免疫球蛋白类似的结合性质，但是明显更小，分子量通常不超过10kDa，并且相对稳定。合适的人工细菌受体分子例如美国专利5,831,012；6,534,628和6,740,734中所述。
本发明的“效应分子”为如下的分子或衍生物或其类似物：所述分子连接至靶向剂、特别是靶向抗体和/或基因工程靶向抗体，并且对靶细胞发挥所期望的作用，例如凋亡、或另一类型的细胞死亡、或连续的细胞周期停滞。本发明的效应分子包括在靶细胞中能够发挥所期望作用的分子，并且包括，但不限于，毒素、药物(特别是低分子量细胞毒性药物)、放射性核素、生物响应修饰剂、成孔剂、核糖核酸酶、具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联的蛋白、细胞毒性酶、前药激活酶、反义寡核苷酸、抗体或细胞因子以及其功能衍生物或类似物/片段。毒素可以包括细菌性毒素，例如但不限于白喉毒素或外毒素A；植物毒素，例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联的蛋白包括但不限于粒酶B、粒酶A、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、截短的Bid(tBid)、Bax和Bak。
在优选实施方式中，所述效应子增加免疫缀合物的内部效应子输送，尤其当免疫缀合物的靶向抗体所基于的抗体的天然形式可被较弱地内化时。在另一优选实施方式中，所述效应子的天然形式是非选择性的。在某些实施方式中，当处于天然形式时，所述效应子具有高度的非选择性毒性，包括系统毒性。本发明效应分子的“天然形式”为在与靶向剂连接而形成免疫缀合物之前的效应分子。在另一优选实施方式中，与靶向剂缀合后基本上消除了效应分子的非选择性毒性。在另一优选实施方式中，当到达靶细胞时，所述效应分子在靶细胞中引起死亡或连续的细胞周期停滞。本发明的药物效应分子包括但不限于如下的药物：包括例如充当微管蛋白聚合的抑制剂的小型高细胞毒性药物(例如类美登素类、多拉司他汀(dolastatins)、奥雷司他汀(auristatin)和念珠藻环肽(cryptophycin))的药物；DNA烷基化剂，如CC-1065类似物或衍生物(美国专利5,475,092；5,585,499；6,716,821)和倍癌霉素(duocarmycin)；烯二炔类(enediyne)抗生物例如卡里奇霉素(calicheamicin)和埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及强效类紫杉烷(taxoid)(紫杉烷)药物(Payne，2003)。特别优选类美登素类和卡里奇霉素类。效应子类美登素包括任何来源的类美登素，包括但不限于合成的美登醇和美登醇类似物和衍生物。多柔比星、道诺霉素、甲氨蝶呤、长春碱、新制癌菌素、大分子霉素、三亚胺醌(trenimon)和α-鹅膏菌素(amanitin)为本发明范围内的一些其它效应分子。作为效应分子的反义DNA分子也在本发明范围内。当特定药物或药物种类的名称与术语“效应子”或“效应分子”结合时，是指基于该特定药物或药物种类的本发明的免疫缀合物的效应子。
美登素是最初源自埃塞俄比亚灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)的一种天然产物(Remillard，1975；美国专利3,896,111)。该药物抑制微管蛋白聚合，从而导致阻断有丝分裂和细胞死亡(Remillard，1975；Bhattacharyya，1977；Kupchan，1978)。美登素的细胞毒性比临床使用的影响微管蛋白聚合的抗癌药(例如长春花生物碱类或紫杉醇)高200～1000倍。然而，美登素的临床试验表明，其由于高系统毒性而缺少治疗窗。美登素和类美登素类是高度细胞毒性的，但是其在癌症治疗中的临床应用受其严重的系统性副作用限制，该副作用主要归因于其对肿瘤的不良选择性。使用美登素的临床试验显示出对中枢神经系统和胃肠系统的严重副作用。
类美登素类也已经从其它植物、包括滑桃树(Trewia nudiflora)的种子组织分离出(美国专利4,418,064)。
某些微生物也产生类美登素类，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。
本发明还涉及任何来源的类美登素，包括合成的美登醇和美登醇类似物，其公开于例如美国专利4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,371,533、4,424,219和4,151,042中。
在一个优选实施方式中，类美登素为含巯基的类美登素，并且更优选根据Chari等的美国专利6,333,410或Chari等(Chari，1992)中公开的方法产生。
在本发明的背景下，DM-1(N2-脱乙酰基-N2-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素)为一种优选的效应分子。DM1比美登素的细胞毒性高3倍～10倍，并且通过借助于二硫键将其连接至针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体而已被转化成前药。某些此类缀合物(有时称为“肿瘤激活的前药”(TAP))在血液腔中无细胞毒性，因为它们在与靶细胞连接时被激活而内化，由此释放药物(，2001)。已经开发出几种抗体-DM1缀合物(Payne，2003)，并且在临床试验中评价。例如，在结直肠癌患者中huC242-DM1治疗被良好耐受，不会诱导任何可检测的免疫响应，并且具有长循环时间(Tolcher，2003)。
其它特别优选的类美登素包含含有空间位阻巯基键的侧链，该类美登素例如但不限于类美登素N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素(也称为“DM3”)和N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)美登素(也称为“DM4”)。DM4的合成如图3和图4所示并且在本文其它部分有所描述。DM4与DM1和DM3的不同之处在于其在αC处携带有甲基。当将DM4经由连接子(具体为但不限于包含二硫键的连接子)连接至例如nBT062等靶向剂时，会导致空间位阻。携带有空间位阻巯基的各种类美登素(拥有一个或两个取代基、特别是烷基取代基，例如DM4的甲基取代基)公开于2004年11月25日公布的美国专利申请2004/0235840，本文通过参考并入其全部内容。如Goldmahker等在美国专利公开2006/0233814中所报道，一旦在靶标处释放药物，此类空间位阻诱导游离药物的烷基化(例如，甲基化)。烷基化可以增加该药物的稳定性，从而提供所谓的旁观者效应。然而，本领域技术人员将意识到，当将效应子经由连接子连接至靶向剂时，其它包含处在导致空间位阻的位置的例如烷基等取代基的效应分子也是本发明的一部分。优选的是，这种位阻诱导游离药物的化学修饰(例如烷基化)从而增加其总体稳定性，这使得该药物在表达CD138的肿瘤细胞中不仅诱导细胞死亡或连续的细胞周期停滞，而且在必要时还影响例如支持或保护肿瘤免受药物影响且通常不表达CD138的辅助细胞(特别是肿瘤基质的细胞和肿瘤血管的细胞)以致减少或丧失其支持或保护功能。
还特别优选DNA烷基化剂作为效应分子，并且所述DNA烷基化剂包括但不限于CC-1065类似物或衍生物。CC-1065为分离自泽耳链霉菌(Streptomyces zelensis)的培养物的强效抗肿瘤抗生物，并且在体外已经显示出特殊的细胞毒性(美国专利4,169,888)。例如美国专利5,475,092、5,585,499和5,739,350所述的CC-1065类似物或衍生物落在本发明范围内。本领域技术人员会容易地意识到，美国专利5,846,545所述的修饰的CC-1065类似物或衍生物，和例如美国专利6,756,397所述的CC-1065类似物或衍生物的前药也在本发明范围内。在本发明的某些实施方式中，CC-1065类似物或衍生物可以如美国专利6,534,660中所述而合成。
作为优选效应分子的另一组化合物为紫杉烷，特别是高强效紫衫烷和含有巯基或二硫基的紫杉烷。紫杉烷为抑制微管蛋白解聚从而导致维管组装和细胞死亡速率增加的有丝分裂纺锤体毒剂。在本发明范围内的紫杉烷公开于例如美国专利6,436,931、6,340,701、6,706,708和美国专利公开20040087649、20040024049和20030004210中。其它紫杉烷公开于例如美国专利6,002,023、美国专利5,998,656、美国专利5,892,063、美国专利5,763,477、美国专利5,705,508、美国专利5,703,247和美国专利5,367,086。本领域技术人员可以理解，PEG化(PEGylated)的紫杉烷(例如描述于美国专利6,596,757中的紫杉烷)也在本发明范围内。
本发明的卡里奇霉素效应分子包括γ1I、N-乙酰基卡里奇霉素和卡里奇霉素的其它衍生物。卡里奇霉素以序列特异性方式与DNA的小槽结合，进而重排并使自由基暴露，从而引起双链DNA的断裂，进而导致细胞凋亡和死亡。可用于本发明背景下的卡里奇霉素效应分子的一个实例描述于美国专利5,053,394中。
本发明的免疫缀合物包含至少一种靶向剂(特别是靶向抗体，例如基因工程靶向抗体)和一种效应分子。所述免疫缀合物可以包含例如用于稳定化的其他分子。对于免疫缀合物，术语“缀合物”通常用于定义靶向剂与一种或多种效应分子的有效结合，并不旨在仅指任一类有效结合，特别是不限于化学“缀合”。只要所述靶向剂能够与靶点结合，并且连接的效应子(特别是当输送至靶点时)如预期地充分起作用，任何连接模式都是适合的。本发明的缀合方法包括但不限于在将效应分子和/或靶向抗体事先修饰或未事先修饰时将效应分子直接连接至靶向抗体，或经由连接子连接。连接子可以在功能上分类成例如：酸不稳定性连接子、光不稳定性连接子、酶可切割连接子，例如可以被肽酶切割的连接子。在本发明许多实施方式中优选可切割连接子。可以在细胞环境、特别是细胞内环境中存在的条件下切割此类可切割连接子，当切割时所述环境对药物释放无有害作用。如存在于特定的细胞内区室的pH4～5等低pH会切割酸不稳定连接子，而光不稳定连接子可以通过例如红外光切割。然而，优选被大多数细胞中存在的生理条件切割或者在该生理条件下切割的连接子，本文将之称为生理性可切割连接子。因此，在本发明许多实施方式中优选二硫键连接子。这些连接子可通过能在生理条件下发生的二硫键交换而切割。优选的异双官能二硫键连接子包括但不限于N-丁二酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如Carlsson等(1978))、N-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见，例如美国专利号4,563,304)、N-丁二酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如CAS登记号341498-08-6)、N-丁二酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)(参见，例如Yoshitake等，(1979))和N-丁二酰亚胺基4-甲基-4-[2-(5-硝基吡啶基)二硫代]戊酸酯(SMNP)(参见，例如美国专利号4,563,304)。用于本发明组合物的最优选的连接子分子为SPP、SMCC和SPDB。
其它合适的连接子可以包括“非可切割性”键，例如但不限于磺酸丁二酰亚胺基马来酰亚胺基甲基环己烷甲酸酯(SMCC)，其为能够将化合物与含SH化合物连接的异双官能连接子。双官能连接子分子和异双官能连接子分子，例如针对糖的异双官能连接子分子(例如S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼(TPCH))，也在本发明范围内(Vogel，2004)。例如类美登素等效应分子可以经由两步反应法缀合至靶向抗体，所述两步反应法包括：第一步，将靶向抗体用交联剂(例如N-丁二酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))修饰，以向所述靶向抗体引入二硫代吡啶基。在第二步中，可以将具有巯基的反应性类美登素(例如DM1)加入经修饰的抗体，从而引起在所述经修饰的抗体中硫代吡啶基的置换和二硫键连接的细胞毒性类美登素/抗体缀合物的产生(美国专利5,208,020)。然而，一步缀合法，例如在Chari等的美国专利公开20030055226中描述的方法，也在本发明范围内。在本发明的一种实施方式中，将同类或不同类的多种效应分子与靶向抗体相连。
可以经由例如美国专利6,716,821中所述的PEG连接基团，将CC-1065类似物或衍生物缀合至所述靶向剂。
卡里奇霉素可以经由连接子缀合至靶向抗体(美国专利5,877,296和美国专利5,773,001)，或根据美国专利5,712,374和美国专利5,714,586中公开的缀合方法缀合至靶向抗体。用于制备卡里奇霉素缀合物的另一优选方法记载于美国专利公开20040082764。本发明的免疫缀合物可以采用重组融合蛋白的形式。
术语“序列同一性”是指对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常，比对所述序列，从而获得最高量级的匹配。“同一性”本身在本领域具有公知的含义，并且可以使用已公开的技术计算(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.编，M Stockton Press，New York，1991)。尽管存在许多测定两个多核苷酸或多肽序列之间同一性的方法，术语“同一性”对本领域技术人员而言是公知的(Carillo，H.& Lipton，D.，SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
任何特定的核酸分子是否与例如nBT062核酸序列或其一部分具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，可以如下常规确定：使用已知的计算机程序例如DNAsis软件(Hitachi Software，San Bruno，Calif.)进行初始序列比对，然后使用ESEE3.0版DNA/蛋白质序列软件(cabottrog.mbb.sfu.ca)进行多重序列比对。
氨基酸序列是否与例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其一部分具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，96％、97％、98％或99％的同一性，能够使用已知的计算机程序例如BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix用第8版，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)而常规地确定。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法，来寻找两个序列之间同源性最高的片段。
当使用DNAsis、ESEE、BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与本发明的参照序列具有例如95％同一性时，将参数设置如下：在参照核酸或氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，允许同源性中间隔(gap)至多为参照序列中核苷酸总数的5％。
在本发明的背景下，如果提及与特定序列的残基组合的序列同一性，则该序列同一性涉及所指定的所有残基的总和。
基本抗体分子为双官能结构，其中可变区与抗原结合，而剩下的恒定区可以引起非抗原依赖性响应。大多数抗体类型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)由恒定区确定。这些类型可以进一步分成亚类(同型)。例如，IgG类具有四种同型，即根据恒定区确定的IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。各种人类抗体类型中，已知仅人类IgG1、IgG2、IgG3和IgM有效地激活补体系统。尽管恒定区不形成抗原结合位点，恒定区和铰链区的排布可以对所述分子赋予片段柔性，这使其可与抗原结合。
不同的IgG同型能够与例如单核细胞、B细胞和NK细胞等细胞上的Fc受体结合，从而激活细胞以释放细胞因子。不同的同型还可以激活补体，导致局部或系统性炎症。特别是，不同的IgG同型可以以不同的程度结合FcγR。FcγR为一组属于Ig超家族的表面糖蛋白，主要在白细胞上表达。将FcγR糖蛋白分成三类，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。尽管IgG1、IgG2和IgG3与各种此类FcγR糖蛋白强烈地结合，IgG4显示出弱得多的结合。具体而言，IgG4为FcγRI的中间体结合剂，其产生相对低的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)甚至不产生ADCC，并且不与FcγRIIIA或FcγRIIA结合。IgG4也是FcγRIIB的弱结合剂，所述FcγRIIB为抑制性受体。此外，IgG4仅介导微弱的补体固定或不介导补体固定，具有微弱的补体依赖性细胞毒性(CDC)或不具有CDC。在本发明的背景下，IgG4可以具体用于预防Fc介导的肝FcR靶向，这是因为其没有显示出与LSEC(肝窦状内皮细胞)上的FcRγII的相互作用，还显示出与Kupffer细胞(巨噬细胞)上的FcRγI～III无相互作用或具有弱相互作用，并且与肝NK细胞上的FcRγIII无相互作用。进一步降低任何CDC的某些突变也是本发明的一部分。例如在327、330和331位的IgG4残基显示出ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和CDC的降低(Amour，1999；Shields，2001)。使抗体稳定化的多种突变之一也是本发明的一部分(本文也称为“稳定化突变”)。这些突变特别包括IgG4的CH2区中的亮氨酸突变成谷氨酸，和IgG4铰链核心中的丝氨酸交换为脯氨酸。在本发明的某些实施方式中，这些突变使半分子(half-molecule)的量减少至小于10％、小于5％且优选小于2％或1％。此外，如此稳定化的抗体的体内半衰期可以增加几天，包括1天、2天、3天、4天和超过5天(Schuurman，1999)。
本文所述的包括靶向抗体、特别是基因工程靶向抗体等靶向剂，还可以根据它们与抗原、特别是CD138的结合亲和力来描述或说明。例如靶向抗体、特别是基因工程靶向抗体等靶向剂的优选结合亲和力的特征在于，解离常数KD(nM)小于1.6、小于1.5或约为1.4或小于1.4。对于包含如靶向抗体等所述靶向剂的免疫缀合物而言，解离常数KD(nM)优选小于1.6、小于1.5或小于2.5、小于2.4、小于2.3、小于2.2、小于2.1、小于2.0、小于1.9或约为1.9。
本发明的抗原结合区(ABR)会基于所用的靶向抗体或基因工程靶向抗体的类型而变化。在天然存在的抗体中和在大多数嵌合抗体和人源化抗体中，抗原结合区由重链的前两个结构域和轻链组成。然而，在没有轻链的重链抗体中，抗原结合区仅由例如重链的前两个结构域组成，而在将抗体分子的轻链和重链可变区合并于单个多肽链中的轻链抗体(ScFv)中时，ABR仅由一个多肽分子提供。FAB片段通常通过木瓜蛋白酶消化而获得，并且具有一条轻链和重链的一部分，因此包含仅具有一个抗原结合位点的ABR。另一方面，双链抗体为具有两个抗原结合区的小的抗体片段。然而，在本发明的背景下，靶向抗体或基因工程靶向抗体的抗原结合区为任何主要决定靶向抗体或基因工程靶向抗体的结合特异性的区域。
如果据称ABR或另一靶向抗体区“出自某种抗体”，例如人类或非人类抗体，这是指在本发明的背景下ABR或者与相应的天然存在的ABR相同，或者基于该相应的天然存在的ABR。如果ABR具有天然存在的ABR的结合特异性，则该ABR基于天然存在的ABR。然而，此类ABR可以包含例如点突变、添加、缺失或例如糖基化等翻译后修饰。特别地，此类ABR可以与天然存在的ABR的序列具有超过70％、超过80％、超过90％、优选超过95％、超过98％或超过99％的序列同一性。
在本发明的背景下，靶向剂(例如靶向抗体，特别是包含靶向抗体的免疫缀合物)的均匀靶向(homogenous targeting)是对与用该靶向剂获得所述靶向的期望结果相关的差异的量度。在本发明的某些实施方式中，所期望的结果通过与靶标的简单结合而获得。即，例如，其中某种靶向剂提供抵抗随后结合的防护的实施方式的情况。然而，靶向剂的均匀性(homogeneity)可以通过例如包含所述靶向剂的免疫缀合物的效力而容易地估算。例如，所述免疫缀合物针对例如CD138等肿瘤抗原(该肿瘤抗原包含旨在破坏肿瘤细胞和/或使肿瘤生长停滞的效应子)的效力可以通过包含表达CD138抗原的细胞的肿瘤的生长抑制程度而确定。此类免疫缀合物可以在其效力方面显示出较高的差异。例如，有时其可以以高效力使肿瘤生长停滞，但其它时候该效力很难超过对照的效力。另一方面，免疫缀合物在效力方面的较低差异，显示出免疫缀合物和/或靶向剂分别一致地提供所期望的结果。一种靶向均匀性定量方法为计算靶向差异(targeting variation)。在包含某种靶向剂的免疫缀合物使肿瘤生长停滞的情况下，靶向差异可以如下计算：首先确定肿瘤达到预定体积(例如300mm3)的时间。优选地，选择预定体积从而使在达到所述预定体积之前和之后的任何肿瘤生长均以大致相同的速率稳定地增加。在对于一组受试对象已经确定所述时间后，计算受试对象组(例如，SCID小鼠或显示均匀肿瘤生长的另一合适的模型)中这些时间的平均值(Tm)。然后将Tm与观察值相关联，所述观察值获自显示出最低靶向效力并因此与达到所述预定体积所需时间(Tf)最少的肿瘤相关的组内受试对象，并在另一方面，获自显示出最高靶向效力并因此与达到所述预定体积所需时间(Ts)最多的肿瘤有关的组内受试对象，所述相关性通过根据下式计算预定体积的靶向差异而获得：
靶向差异[％]＝Ts-Tf/Tm×100
在一个优选实施方式中，本发明的基因工程靶向抗体的靶向差异小于150％、小于140％、小于130％、小于120％、小于110％、小于100％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％或小于50％，在某些实施方式中甚至小于45％。优选地，所述靶向差异为约10％～约150％，优选约10％～约100％、约10％～约80％、约10％～约70％、约10％～约60％、约10％～约50％。
靶向的均匀性(本文还称为对特定抗原的结合均匀性)还可以通过其它手段(例如确定肿瘤生长延迟)而定量。另外，本领域技术人员易于理解，特定尺寸的肿瘤体积仅仅是一个可以基于其而确定靶向差异的参数。根据所期望的结果，可以使用其它参数，包括时间(例如根据肿瘤生长延迟的时间)或结合百分比(％)。本领域技术人员能够容易地确定这些其它参数。
nBT062(也参见图1)为小鼠人类嵌合IgG4 mAb，为B-B4的一种嵌合形式。创造该嵌合形式的B-B4来降低HAMA(人类抗小鼠抗体)响应，同时维持B-B4的抗体结合区对CD138的功能。令人惊奇的是，发现该嵌合抗体相对于B-B4展示出改善的结合亲和力。还令人惊奇的是，该嵌合抗体与均匀靶向有关，而均匀靶向在使用所述抗体或包含该抗体的免疫缀合物时减小了所获结果中的差异。以下描述用于产生nBT062的方案。表达nBT062的中国仓鼠卵巢细胞已经于2007年12月11日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1，D-38124 Braunschweig。识别号为DSM ACC2875。基于B-B4的CD138特异性嵌合抗体在本文通称为c-B-B4。
已从nBT062用核苷酸序列的翻译物预测了重链和轻链的氨基酸序列。重链和轻链的预测氨基酸序列如表1所示。预测的可变区用粗体标出，预测的CDR用下划线标出。
表1.nBT062的预测的氨基酸序列
nBT062重链预测序列(SEQ ID NO：1)：
C端赖氨酸易于剪切，并且可以由于不完全切割而在某种程度上存在且不是SEQ ID NO：1的一部分。
nBT062轻链预测序列(SEQ ID NO：2)：
表2显示Krabat和Chothia的一般CDR定义与对于BT062预测的CDR的比较。
BT062为一种包含靶向CD138的嵌合抗体nBT062的免疫缀合物，所述嵌合抗体nBT062经由连接子(此处为SPDB)连接至细胞生长抑制性类美登素衍生物DM4。BT062的化学式在图1和2中提供。包含nBT062和类美登素效应分子的免疫缀合物经常根据它们的连接子和类美登素效应子来表征，例如nBT062-SMCC-DM1为包含nBT062、SMCC(一种“非可切割”连接子，含有硫酯键)和作为效应子的DM1的免疫缀合物。更通常的是，含有nBT062和效应分子的免疫缀合物还可以描述为nBT062-连接子-效应子或仅描述为nBT062-效应子(nBT062N，其中N为本文所述的任何效应子)。
本文提到包含抗CD138的基因工程靶向抗体(该抗体经由可切割连接子(CL)连接至效应分子)的免疫缀合物的无位阻对应物(UI：无位阻免疫缀合物)，在此称为UICL，UICL与其中所述效应分子具有空间位阻但含有可切割连接子的免疫缀合物(HICL)相反。UICL为一种与包含基因工程靶向抗体的然而其中所述效应分子不是空间位阻的HICL等效的免疫缀合物。一对HICL/UICL的实例为BT062和nBT062-SPP-DM1。此类包含非可切割连接子的免疫缀合物的无位阻对应物(UINCL)，是指包含基因工程靶向抗体的等效免疫缀合物，在该等效免疫缀合物中效应分子不是空间位阻性的并且包含非可切割连接子。对于BT062而言，nBT062-SMCC-DM1会组成此类包含非可切割连接子的无位阻对应物的实例。
免疫缀合物的抑制肿瘤生长的活性(＝肿瘤生长抑制活性)是一个相对量度。其描述一种缀合物相对于最高性能的免疫缀合物(其活性设定为100％)的活性的肿瘤生长抑制活性。例如，如果将最高性能的免疫缀合物(假设为引起32天的肿瘤生长延迟(TGD)的BT062)的活性设定为100％，如下计算例如nBT062-DM1(其显示18天的肿瘤生长延迟(TGD))的活性：
肿瘤生长抑制活性＝100×(TGDnBT062-DM1/TGDBT062)，
更通常的：
肿瘤生长抑制活性＝100×(TGD样品/TGD对照)。
表3提供来自图11B中所述结果的合适实例：
  TGD*(天)   ％活性**
  PBS   0   0
  nBT062-SMCC-DM1   18   56
  BT062   32   100
  nBT062-SPP-DM1   13   40
表3：基于接受450μg/kg剂量的治疗组的抵抗SCID小鼠中的MOLP-8肿瘤异种移植物的nBT062-DMx的肿瘤生长延迟(TGD)和％活性。
(*)肿瘤生长延迟(TGD)(以天为单位)，为治疗组达到预定尺寸(160mm3)的平均时间(以天为单位)减去对照组达到该预定尺寸的平均时间。
(**)肿瘤生长抑制活性＝100×(TGDSample/TGDBT062)。将BT062的活性定义为100％。
在表2提供的实例中，BT062提供的肿瘤生长抑制活性比其无位阻对应物(nBT062-SPP-DM1)的活性高出60％，并且肿瘤生长抑制活性比其包含非可切割连接子的无位阻对应免疫缀合物(nBT062-SMCC-DM1)的活性高出44％。
此前报道了免疫缀合物中的可切割连接子提供所谓的旁观者效应。Goldmahker等(美国专利公开2006/0233814)也描述了在从靶向剂切割的情况下，当对效应分子进行进一步修饰、特别是烷基化时，旁观者效应特别明显。Goldmahker等也指出UICL比相应的UINCL显示出更好的TGD，该事实也归因于称作旁观者效应的原因(参见，例如美国专利公开2006/0233814的图6)。
此处，令人惊奇的发现高的单剂量方案(250μg/kg)中的UICL实际上没有比UINCL显示出任何更好的结果。事实上，在此类方案的UICL中观察到的TGD(以天为单位)实际上低于UINCL。随着剂量增加(450μg/kg)，该观察结果变得更明显。总之，在单剂量实验以及多剂量实验(未示出)中，HICL以出乎意料的程度胜过UICL。此外，在更高剂量下UINCL出人意料地胜过UICL。
本文所述的靶向剂(特别是靶向抗体)和/或免疫缀合物可以通过任何途径施用，包括静脉内施用、胃肠外施用、口服施用、肌内施用、鞘内施用或作为气雾剂施用。输送模式取决于所期望的效果。根据本发明本领域技术人员易于了解对于特定的治疗的最佳施用途径。合适的剂量取决于施用途径和指定的治疗，并且考虑到当前的治疗策略可由本领域技术人员容易地确定。
可以根据常规的药物配混技术制备含有未缀合的靶向剂和本发明免疫缀合物作为活性成分的药物组合物。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版(1985，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。典型地，将有效量的活性成分与药物可接受载体混合。根据所期望用于施用(例如静脉内、口服、胃肠外、鞘内、透皮或作为气雾剂)的剂型，所述载体可以采用各种形式。
对于口服施用，可以将所述靶向剂和/或免疫缀合物配成固体或液体制剂，例如胶囊剂、丸剂、片剂、锭剂、熔融剂(melts)、粉剂、悬浮剂或乳化剂。在制备口服剂型的组合物中，可以使用任何常用的药物介质，例如在口服液体制剂(例如悬浮剂、酏剂和溶液剂)的情况下使用水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂和助悬剂等；或在口服固体制剂(例如粉末剂、胶囊剂和片剂)的情况下使用载体例如淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂等载剂。由于易于施用，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在该情况下显然使用固体药物载剂。必要时，可以通过标准技术将片剂包覆糖衣或肠溶衣。活性剂必须稳定，以便通过胃肠道。必要时，可以使用适用于稳定通过的试剂，此类试剂可以包括在文献中描述的磷脂或卵磷脂衍生物，以及脂质体、微粒(包括微球体和巨球体(macrosphere))。
对于胃肠外施用，可以将所述靶向剂和/或免疫缀合物溶解于药物载剂，并且作为溶液剂或悬浮剂施用。例举的合适的载体为水、盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、右旋葡萄糖溶液、果糖溶液、乙醇、或者动物油、植物油或源自合成的油。所述载剂还可以含有其它成分，例如防腐剂、助悬剂、增溶剂和缓冲剂等。当在脑室内或鞘内施用未缀合的靶向剂和/或免疫缀合物时，还可将它们溶于脑脊液中。
施用至受试对象的剂量可以根据受试对象(包括人类以及非人类动物)表面积而指定。施用至此类受试对象的剂量可以优选但不限于约5mg/m2～约300mg/m2的量，包括约20mg/m2、约50mg/m2、约100mg/m2、约150mg/m2、约200mg/m2和约250mg/m2。可以一次性合适地施用所述靶向剂/免疫缀合物，或将其在一系列的治疗中施用。在多次剂量方案中，可以将这些量每天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次地施用。具有单次高剂量的负荷剂量，或作为另一种选择的施用一次较低剂量之后不久施用另一次较低剂量、继以较长的时间间隔施用的剂量，构成了本发明的优选实施方式。在优选实施方式中，针对受试对象调整给药时机，以使在第二次和/或任何后续治疗之前经过足够的时间，从而使此前的剂量已经基本代谢，但是在受试对象的系统中存在的免疫缀合物的量仍然抑制、延迟和/或预防肿瘤生长。示例性的“反复单剂量”方案包括每三周一次施用起始剂量为约200mg/m2的免疫缀合物。作为另一种选择，高起始剂量之后可以进行每两周一次的维持剂量，维持剂量为约150μg/m2。然而，也可使用其它给药方案。通过已知技术和测试易于监测该治疗的进展。剂量可以根据它们是否为了预防或治疗目的而施用、任何之前治疗的疗程、患者的临床史和对靶向剂/免疫缀合物的响应、以及主治医师的判断而变化。
根据本发明，使用nBT062和BT062作为实例，如下处理MM。该实例并非旨在以任何方式限制本发明，并且技术人员可以容易地确定属于本发明范围内的其它免疫缀合物和基于nBT062的系统，以及可用于治疗例如MM等疾病的其它治疗方案。
由于CD138在患者MM细胞上和在经由血流可及细胞上的选择性表达、nBT062的特异性和血流中nBT062的稳定性，BT062消除DM4的系统性毒性，并且提供靶向输送DM4-效应分子的机会。nBT062剂量的施用对于保护低CD138表达阳性的非肿瘤细胞抵抗BT062结合这些细胞、优选抵抗其破坏是有利的，而本发明的免疫缀合物提供将效应分子有效施用至细胞位点的手段，在该细胞位点处效应分子能够从免疫缀合物释放。该靶向输送和释放对于治疗多发性骨髓瘤提供了显著的进步，而目前的化学治疗法对于治疗多发性骨髓瘤有时提供不完全的缓解。
通过参考以下实施例进一步描述本发明，提供这些实施例的目的在于示例说明而并非旨在以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。
材料和方法
嵌合抗体构建(cB-B4：nBT062)
B-B4
将此前所表征的小鼠抗体B-B4(Wijdenes等，Br J Haematol.，94(1996)，318)用于这些实验中。
B-B4和cB-B4/nBT062的克隆和表达
如例如J.Sambrook；Molecular Cloning，实验室手册；第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA等教课中中所详述，或在使用试剂盒的情况下如制造商说明书所推荐，进行标准重组DNA技术。使用标准PCR方法进行小鼠可变区的PCR克隆和修饰。使用了在各结果部分中指定的引物。
cB-B4/nBT062的表达
通过胰蛋白酶消化和离心收获在DMEM(补充有10％FCS、580μg/mlL-谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素)中培养的指数生长的COS细胞、并将其在PBS中洗涤。将细胞重悬于PBS中至终浓度1×107细胞/ml。将700μl的COS细胞悬浮液转移至Gene Pulser皿中，并与重链和κ轻链表达载体DNA(各10μg或13μg超级载体(Supervector))混合。使用Bio-Rad Gene Pulser将细胞在1900V、25μF电穿孔。在补充有10％无γ-球蛋白的FBS、580μg/ml L-谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中培养转移的细胞72h，然后收获含有抗体的细胞培养上清液。
测定cB-B4/nBT062表达水平的捕获ELISA(capture ELISA)
用在PBS中稀释的0.4μg/ml山羊抗人IgG抗体的100μl等分试样涂布96孔板(4℃过夜)。用200μl/孔洗涤缓冲液(PBS+0.1％Tween-20)洗涤板3次。用在PBS中的0.2％BSA、0.02％Tween-20将孔封闭(在37℃温育1小时)，其后添加200μl含有所分泌抗体的细胞培养上清液。用洗涤缓冲液将孔洗涤6次，然后检测具有山羊抗人κ轻链过氧化物酶缀合物的结合抗体。
来自细胞培养上清液的cB-B4/nBT062的纯化
使用Protein A ImmunoPure Plus试剂盒(Pierce，Rockford，IL)，根据制造商推荐从经转化的COS 7细胞中纯化cB-B4抗体。
cB-B4结合和竞争测试
使用Diaclone(法国)sCD138试剂盒，根据制造商推荐，考虑在结果部分所述的变化，进行B-B4和cB-B4与CD138的结合活性的分析。
RNA制备和cDNA合成
使杂交瘤B-B4细胞生长并使用Qiagen Midi试剂盒(Hilden，德国)按照制造商的程序处理，以分离RNA。使用Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)第1链合成试剂盒，按照制造商的程序，将约5μg的B-B4RNA进行逆转录以产生B-B4cDNA。
B-B4免疫球蛋白cDNA的克隆
使用IgH引物MHV7(5′-ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGA-CCCAGG-3′)[SEQ ID NO：3]和IgG1恒定区引物MHCG1(5′-CAG-TGGATAGACAGATGGGGG-3′)[SEQ ID NO：4]，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA。类似地，使用三种不同的Igκ引物MKV2(5′-ATG-GAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3′)[SEQ ID NO：5]、MKV4(5′-ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3′)[SEQ ID NO：6]和MKV9(5′-ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3′)[SEQ ID NO：7]，并且每个引物都与引物MKC(5′-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3′)[SEQ ID NO：8]组合，以扩增免疫球蛋白轻链(IgL)。使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根据制造商说明，将所有扩增产物直接与pCR2.1-TOPO载体连接。
在LB-氨苄青霉素-Xgal琼脂板上筛选用经连接的pCR2.1载体构建体转化的大肠杆菌(E.coli)TOP 10细菌(Invitrogen)。将小规模培养物用单独的白色集落接种，生长过夜，并使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒根据制造商说明分离质粒。
cDNA序列确定
使用BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(ABI，Foster City，CA)将质粒测序。使用在GeneAmp9600 PCR仪上循环的1210和1233引物将每个所选质粒进行双向测序。在ABI毛细管测序仪上完成电泳序列分析。
反复进行完整的RT-PCR、克隆和DNA序列分析的循环，以获得各免疫球蛋白链的三个完全独立的序列信息组。
B-B4VκDNA序列
在三个独立反应中进行第1链合成。根据制造商说明，将通过使用引物MKC和MKV2(序列于上文中给出)产生的PCR产物连接至pCR2.1-TOPO载体。将来自各独立RT-PCR反应组的克隆体双向测序。以MKV2为引物的产物序列与源自MOPC-21、SP2和Ag8等骨髓瘤融合伴侣的不育κ转录物高度相似(Carroll等，Mol Immunol.，25(1988)，991；Cabilly等，Gene，40(1985)；157)，因此将其忽视。
使用MKC连同MKV4和MKV9引物的PCR产物相互类似，区别仅在于前导序列引物内的摆动位置(wobble position)。
B-B4VH DNA序列
在三个独立反应中进行第1链合成，从各第1链产物中将PCR产物克隆和测序。对来自各第1链的5个克隆体进行测序。
嵌合cB-B4表达载体的构建
嵌合表达载体的构建需要向VH和Vκ添加合适的前导序列，该前导序列位于BamHI限制位点和Kozak序列之后。Kozak共享序列(consensussequence)对于可变区序列的有效翻译至关重要。它定义了正确的AUG密码子(核糖体能从其开始翻译)，并且最重要的单个关键碱基为位于AUG起点上游的3位处的腺嘌呤(或次佳地，鸟嘌呤)。该前导序列被选作Kabat数据库中最相似的序列(Kabat等，NIH National TechnicalInformation Service，1991)。所述添加序列在正向(For)引物(都具有序列5′-AGAGAAGCTTGCCGCCACCATGATTGCCTCTGCTCAGTT-CCTTGGTCTCC-3′[SEQ ID NO：9]；限制位点用下划线标出；Kozak序列为粗体)内编码。此外，嵌合表达载体的构建需要将人类γ1恒定区的5′片段导入天然ApaI限制性位点的上游并与B-B4的J区的3′末端相邻，而对于轻链而言，需要添加剪接供体位点和HindIII位点。该剪接供体序列对于将可变区在框架内正确连接至其合适的恒定区从而剪接下V:C内含子而言是重要的。κ内含子+CK在B-B4Vκ序列下游的表达构建体中编码。类似地，γ-4CH在B-B4VH序列下游的表达构建体中编码。
首先仔细地分析B-B4VH和Vκ基因，以鉴定任何不合需要的剪接供体位点、剪接受体位点、Kozak序列，以及鉴定此后会干扰功能性全抗体的亚克隆和/或表达的任何额外的亚克隆限制位点的存在。在Vκ序列中发现不合需要的HindIII位点，需要在不改变氨基酸序列的情况下利用PCR通过定点突变技术将其除去。对于该反应，使用寡核苷酸引物BT03(5′-CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3′)[SEQ IDNO：10]和BT04(5′-CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTG-TTG-3′)[SEQ ID NO：11]，根据Stratagene(La Jolla，CA)QuickchangeMutagenesis试剂盒程序进行诱变。
κ链嵌合引物
将不依赖于PCR引物序列的不引起歧义(non-ambiguous)的B-B4Vκ前导序列与Kabat数据库中的小鼠前导序列比对。对于B-B4VH前导序列最接近的匹配是VK-10 ARS-A(Sanz等，PNAS，84(1987)，1085)。据SignalP算法预测该前导序列会被正确地切割(Nielsen等，Protein Eng，10(1997)；1)。设计引物CBB4Kfor(参见上文)和g2258(5′-CGCGGGATC-CACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3′[SEQ ID NO：12]；限制位点用下划线标出)，从而产生含有该完全前导序列、B-B4Vκ区和HindIII以及BamHI末端限制位点的PCR产物，以克隆至pKN100表达载体内。正向引物CBB4K导入HindIII限制位点、Kozak翻译起始位点和VK-10ARS-A前导序列。反向引物g2258导入剪接供体位点和BamHI限制性位点。将所得的片段克隆至pKN100的HindIII/BamHI限制位点。
重链嵌合引物
将不依赖于PCR引物序列的不引起歧义的B-B4 VH前导序列与Kabat数据库中的小鼠前导序列比对。B-B4VK前导序列的最接近匹配为VH17-1A(Sun等，PNAS，84(1987)，214)。据SignalP算法预测该前导序列会被正确地切割。设计引物CBB4Kfor(参见上文)和g22949(5′-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGA-GGTTCC-3′[SEQ ID NO：13]；限制位点用下划线标出)，从而产生含有VH17-1A前导序列、B-B4VH区和末端HindIII以及ApaI限制位点的PCR产物，以克隆至pG4D200表达载体内。正向引物cBBHFor导入HindIII限制位点、Kozak翻译起始位点和VH17-1A前导序列。反向引物g22949导入γ4C区的5′末端和天然ApaI限制位点。将所得的片段克隆至pG4D200的HindIII/ApaI限制位点，产生载体pG4D200cBB4。
cBB4抗体的产生
将一瓶COS7细胞解冻，并在补充有10％ Fetal clone I血清以及抗生素的DMEM中生长。一周后，将细胞(0.7ml，107细胞/ml)与pG4D200cBB4加上pKN100cBB4(各10μg DNA)一起电穿孔，或不和DNA一起电穿孔。将这些细胞平板接种至8ml生长培养基中4天。重复电穿孔7次。
嵌合抗体的检测
将夹心ELISA用于测定COS 7上清液中的抗体浓度。瞬时转化的COS 7细胞分泌约6956ng/ml的抗体(数据未示出)。
cB-B4的结合活性
为了检测COS 7培养上清液中cB-B4的结合活性，使用DiaclonesCD138试剂盒，其是一种固相夹心ELISA。已将对sCD138特异的单克隆抗体涂布在所提供的微量滴定条的孔上。首次温育期间，将sCD138和生物素化的B-B4(bio-B-B4)抗体同时与未标记的测试抗体(B-B4或cB-B4)的连续稀释液一起温育。
为了获得与低浓度未标记抗体的竞争，降低该测试中bio-B-B4的浓度(否则cB-B4在COS 7细胞培养上清液中的浓度太低，不能获得足够的竞争)。来自该测试的结果表明，两种抗体对CD138具有相同的特异性(数据未示出)。
cB-B4的纯化
使用Protein A ImmunoPure Plus试剂盒(Pierce)，根据制造商推荐从COS 7细胞上清液中纯化嵌合cB-B4(数据未示出)。
KD确定：比较nBT062/BB4
可溶性CD138的纯化
使用1mL偶联有B-B4的“HiTrap NHS激活的HP”柱，通过FPLC纯化来自U-266细胞培养上清液的可溶性CD138抗原。将在pH7.4的PBS缓冲液中的细胞培养上清液加样至所述柱上，稍后用pH11的50mM三乙胺将CD138抗原洗脱至2mL的组分中。洗脱出的CD138立即用375μL的pH3的1M Tris-HCl中和，以防止结构和/或功能损害。
CD138的生物素化
Sulfo-NHS-LC(Pierce)用于标记CD138。在pH为7～9的缓冲液中NHS激活的生物素有效地与伯胺基(例如赖氨酸残基)反应，形成稳定的酰胺键。
为将CD138生物素化，使用蛋白脱盐离心柱(spin column)(Pierce)将50μl的CD138脱盐。将生物素化试剂(EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin，Pierce)溶于冰冷却的去离子H2O至最终浓度为0.5mg/mL。将生物素化试剂和捕获试剂溶液混合，生物素化试剂的摩尔数与捕获试剂相比过量12倍(50pmol CD138与600pmol生物素化试剂)，在室温下温育1h，同时轻轻地摇动小瓶。使用蛋白脱盐柱除去未结合的生物素化试剂。
bCD138的固定
将用于BIACORE测试的传感芯片(SENSOR CHIP SA，BIACOREAB)设计来与生物素化分子结合以便在BIACORE系统中进行相互作用分析。其表面由羧甲基化右旋葡萄糖苷基质构成，所述基质用抗生物素链霉亲和蛋白预先固定并且已准备好用于高亲和力捕获生物素化配体。利用10μL/分钟的流速通过手动注射在SENSOR CHIP SA上进行bCD138的固定。用三次连续的1分钟注射50mM NaOH中的1M NaCl调节该芯片表面条件。然后进行1分钟的生物素化CD138注射。
使用BIACORE确定不同抗体的KD
对于不同的实验，软件BIACORE使用预定义的掩膜(masks)，即所谓的“向导(Wizards)”，其中仅改变某些设定。由于最初开发BIACORE C来测定浓度，所以不存在设计用于进行亲和力测定的向导。然而，使用适当的设定，“非特异性结合”的向导可用于测定亲和速率常数并由此用于确定KD。使用该向导，通过执行“再生1(Regeneration 1)”用BIACORE运行缓冲液测定两种流动细胞，将解离相设定为90秒。使用pH2.5的10mM甘氨酸-HCl进行等效于实际再生的“再生2”。该步骤后，配体CD138再次处于其结合感受态。在整个过程中，HBS-EP被用作运行和稀释缓冲液。为了确定不同抗体(～150kDa)与CD138的结合，在不同浓度(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和3.13nM)分析结合和解离。通过计算速率常数ka和kd确定解离平衡常数。其后，使用BIAevaluation软件通过kd与ka之商来计算分析物的KD值。结果如表4所示。
表4：nBT062和B-B4的KD值的比较分析。对于平均KD值给出标准偏差。
讨论
从三个独立实验计算各抗体的平均KD值。结果表明，在所有测定中，与B-B4相比，nBT062显示稍低的KD值(平均KD值分别为1.6nM和1.4nM)。
免疫缀合物的制备
nBT062-DM1和huC242-DM1
如此前Chari(Chari等，Cancer Res.1(1992)，127)所述，从微生物发酵产物安丝菌素P-3合成含巯基类美登素DM1。此前对于人源化C242(huC242)的制备(Roguska等，PNAS，91(1994)，969)已有描述。如此前所述(Liu等，PNAS，93(1996)，8618)制备抗体-药物缀合物。每个抗体分子平均连接3.5个DM1分子。
nBT062-DM4
BT062为一种抗体-药物缀合物，其由经由二硫键通过连接子连接至nBT062嵌合单克隆抗体的细胞毒性类美登素药物DM4构成。类美登素为抗有丝分裂剂，其抑制微管蛋白聚合和微管组装(Remillard等，Science189(1977)，1002)。BT062(nBT062-DM4)的化学示意图如图1和2所示。
DM4的合成
从公知衍生物美登醇制备DM4(Kupchan等，J.Med.Chem.，21(1978)，31)。美登醇通过用氢化三甲氧基铝锂还原性裂解微生物发酵产物安丝菌素P3的酯部分而制备(参见图3)。
DM4如下合成：在二环己基碳二亚胺(DCC)和氯化锌的存在下用N-甲基-N-(4-甲基二硫代戊酰基)-L-丙氨酸(DM4侧链)乙酰化美登醇，获得含二硫键的类美登素DM4-SMe。用二硫代苏糖醇(DTT)还原DM4-SMe，以获得所期望的含巯基类美登素DM4(参见图4，DM4工艺流程图)。
免疫缀合物BT062
制备nBT062-DM4的过程如图5所概述。将nBT062抗体用N-丁二酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB连接子)修饰，以引入二硫代吡啶基。将DM4与经修饰的抗体混合，其浓度超过二硫代吡啶基的当量。BT062缀合物通过DM4的巯基和经由连接子引入所述抗体的二硫代吡啶基之间的二硫键交换反应而形成。通过色谱的纯化和渗滤除去低分子量反应物(DM4)和反应产物(硫代吡啶)以及缀合抗体的团聚体，从而产生原料药(bulk drug substance)。
FACS分析和WST细胞毒性检验
FACS分析
OPM-2细胞为显示高度表达CD138的血浆细胞白细胞系。将OPM-2细胞与不同浓度的nBT062、nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1或nBT062-SMCC-DM1一起温育(示于图6)。洗涤所述细胞，并且在FACS分析中使用荧光标记的二抗检测经CD138结合的抗体或缀合物。将在这些实验中测定的平均荧光相对于抗体浓度作图。
细胞活力测试
将CD138+MOLP-8细胞以3000细胞/孔接种于平底板中。将CD138-BJAB对照细胞以1000细胞/孔接种。将细胞用不同浓度的nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1或nBT062-SMCC-DM1处理(如图7所示)5天。添加WST试剂(水溶性四唑盐ROCHE)以便根据制造商说明(ROCHE)测定细胞活力。将该试剂在MOLP-8细胞上温育7.5小时，并在BJAB细胞上温育2小时。基于使用标准方法在微孔板读取器上测定的光密度计算存活细胞的分数。
讨论
通过FACS分析BT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1、nBT062-SMCC-DM1或nBT062的结合。作为靶细胞的CD138+OPM-2与nBT062或免疫缀合物一起温育，使用荧光标记的二抗检测细胞结合的分子。图6中，将作为细胞结合抗体的量的量度的平均荧光值相对于不同的抗体或缀合物浓度作图。结果表明，nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1和nBT062-SMCC-DM1显示非常相似的结合特性。此外，结果强烈地表明，未结合抗体的结合特性不受缀合毒素影响。
在细胞活力测试中，分析抗体对CD138+MOLP-8靶细胞和对CD138-BJAB B淋巴母细胞瘤对照细胞的细胞毒性活性。将两种细胞系都接种于平底板中，并与渐增浓度的免疫缀合物一起温育。未缀合抗体用作对照。为了测定细胞活力，通过使用WST试剂在添加免疫缀合物后5天分析细胞毒性活性。图7(A)～(C)中，将存活细胞相对于用运载剂对照处理的对照细胞的分数对于渐增浓度的免疫缀合物作图。结果表明，nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DM1和nBT062-SMCC-DM1对MOLP-8细胞的细胞毒性活性非常相似。正如预期，CD138-BJAB对照细胞未被免疫缀合物杀死，表明所有免疫缀合物经由与CD138的细胞特异性结合而起作用。在竞争实验中，MOLP-8细胞与过量摩尔数的未缀合nBT062一起预温育。预温育基本上阻断了nBT062-SPDB-DM4的细胞毒性，从而提供了进一步证据表明免疫缀合物经由与细胞表面上的CD138的特异性结合而杀死细胞(图7(D))。
异种移植物小鼠实验
为了评价CD138靶向对于人类嵌合形式的B-B4抗体(nBT062)的抗体-类美登素缀合物的抗肿瘤活性的重要性，进行异种移植物小鼠实验。制备两种形式的nBT062-类美登素缀合物(nBT062-SPP-DM1和nBT062-SPDB-DM4)，它们可能在其二硫键的化学稳定性上有所不同。将这些抗体-药物缀合物的抗肿瘤活性与B-B4-SPP-DM1缀合物(包含小鼠亲本抗体)、以及未缀合的游离类美登素(DM4)、天然未经修饰的nBT062抗体和非靶向(无关)IgG1-类美登素缀合物的活性进行比较。在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中的人类多发性骨髓瘤的CD138阳性异种移植物模型(MOLP-8)中评价缀合物。
在这些小鼠中，通过用MOLP-8细胞悬浮液接种建立皮下肿瘤(雌性CB.17SCID小鼠)。当肿瘤体积达到平均113mm3时，进行使用单次静脉内团注的治疗。每周两次监测肿瘤体积和体重的变化。肿瘤细胞接种后，实验进行了超过68天。
异种移植物小鼠实验A
小鼠
5周龄雌性CB.17 SCID小鼠获自Charles River Laboratories。
人类肿瘤细胞系
人类多发性骨髓瘤细胞系MOLP-8由ATCC提供。将在其细胞表面表达CD138抗原并且在SCID小鼠中发育异种移植肿瘤的MOLP-8细胞，保持在37℃、含有5％CO2的润湿气氛中的RPMI-1640培养基中，该培养基补充有4mM L-谷氨酰胺(Biowhittaker，Walkersville，MD)、10％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)和1％链霉素/青霉素。
第I部分
小鼠中的肿瘤生长
将1×107的MOLP-8细胞于皮下接种于每只小鼠右肩下的区域。总体积为0.2ml/小鼠，其中无血清培养基与基质胶(matrigel)(BDBioscience，Bedford，MA)的比为1/1(体积/体积)。处理前，每天监测异种移植物肿瘤，使其逐渐建立。接种肿瘤细胞后约11天，肿瘤体积达到约113mm3。CB.17SCID小鼠的肿瘤携带率为100％。
接种肿瘤细胞后11天，基于肿瘤体积和体重选择42只小鼠。肿瘤体积为68.2mm3～135.9mm3。基于肿瘤体积将42只小鼠随机分成7组(A～G)，每组6只动物。
组A中6只小鼠中每一只接受200μl PBS作为运载剂对照。组B中每只小鼠接受13.8mg/kg的nBT062裸抗体。该剂量等效于250μg/kg的连接类美登素中的nBT062抗体组分的量。缀合分子中类美登素与nBT062抗体的分子量之比约为1/55。组C中每只小鼠接受250μg/kg的DM4。组D中每只小鼠接受250μg/kg的huC242-DM4。组E、F和G中的小鼠每只分别接受250μg/kg的nBT062-SPDB-DM4、B-B4-SPP-DM1和nBT062-SPP-DM1。
使用配置有27号规格、1/2英寸针头的1ml注射器，通过横向尾静脉(lateral tail vein)以单次团注于静脉内施用所有试剂。施用前，将nBT062抗体、nBT062-SPDB-DM4和nBT062-SPP-DM1的母液用无菌PBS分别稀释至浓度2mg/ml、28.1μg/ml和28.1μg/ml，以使对于每只小鼠的注射体积为120μl～220μl。
第II部分
在第二组实验中，将悬浮于无血清培养基和基质胶的50∶50混合物中的MOLP-8细胞(1.5×107细胞每只小鼠)以100μl皮下注射于右肩下的区域。接种后，在第11天肿瘤体积达到约80mm3，而在第25天对照的平均值为约750mm3。肿瘤倍增时间经估算为4.58天。对照组(n＝6)中的每只小鼠接受0.2ml的无菌PBS，其以团注施用于横向尾静脉(静脉内)。所有处理剂量基于缀合的类美登素。9组(n＝6)用单次静脉内注射nBT062-SMCC-DM1、nBT062-SPDB-DM4或nBT062-SPP-DM1来处理，每种处理的剂量为450μg/kg、250μg/kg和100μg/kg。另一组(n＝6)以反复给药方式接受250μg/kg nBT062-SMCC-DM1(每周一次，持续5周)。使用LabCat Program根据肿瘤体积将小鼠随机分成11组(n＝6)。肿瘤体积为40.0mm3～152.5mm3。基于个体体重对小鼠给药。
使用LabCat System(Tumor Measurement and Tracking，InnovativeProgramming Associated，Inc.，Princeton，NJ)每周2次测定肿瘤的三维尺寸。使用Tomayko等，Cancer Chemother.Pharmacol，24(1989)，148中所述的方法计算肿瘤体积(单位为mm3)：
体积＝长×宽×高×1/2
使用Bissery等，Cancer Res.，51(1991)，4845中所述的公式计算Log10细胞杀伤：
Log10细胞杀伤＝(T-C)/Td×3.32
其中(T-C)或肿瘤生长延迟为处理组(T)和对照组(C)肿瘤达到预定体积(600mm3)所需天数的中值时间(median time)。Td为肿瘤倍增时间，基于对照小鼠中的平均肿瘤体积，并且3.32为每单位细胞生长对数的细胞倍增数。
结果
个体小鼠中的肿瘤生长如图8和图9所示。各组的平均值(+/-SD)如图10所示。
与PBS处理的动物中的肿瘤生长相比，用nBT062抗体、未缀合的游离DM4或无关的非靶向缀合物huC242-DM4处理不引起对肿瘤生长的任何显著抑制。
所有三种靶向CD138的缀合物，nBT062-SPDB-DM4、B-B4-SPP-DM1和nBT062-SPP-DM1在剂量为250μg/kg时都引起肿瘤生长的显著延迟。基于在处理组中测定的中值肿瘤体积，DM4缀合物nBT062-SPDB-DM4的活性最强，而nBT062-SPP-DM1与其小鼠对应物B-B4-SPP-DM1相比显示出活性稍微增加(图10)。另外，在个体小鼠中获得的结果显示，用B-B4-SPP-DM1获得的抗肿瘤活性更不均匀，因此比在用nBT062-SPP-DM1处理的小鼠中测定的活性更难预测。在抗肿瘤活性的均匀性方面，使用nBT062作为靶向抗体的另一缀合物nBT062-SPDB-DM4与nBT062-SPP-DM1表现相似。
在任何处理组中未观察到体重下降，表明该治疗耐受良好。
讨论
在实验动物中对三种靶向CD138的缀合物的分析结果证明靶向输送对于抗肿瘤活性的重要性。尽管人类嵌合nBT062和小鼠B-B4抗体的类美登素缀合物显示出显著活性(如对数细胞杀伤所测定)，用未缀合的DM4、未经修饰的天然huBT062抗体或非靶向对照缀合物(huC242-DM4)处理对肿瘤生长无显著影响。
从人类嵌合抗体制备的免疫缀合物nBT062-SPP-DM1比从其小鼠对应物制备的B-B4-SPP-DM1提供稍高的抗肿瘤活性。此外与用B-B4-SPP-DM1处理相比，用nBT062-SPP-DM1和nBT062-SPDB-DM4处理引起个体小鼠中更均匀的响应。B-B4-SPP-DM1的高结合变化说明，对于在接种后对CB.17SCID小鼠中的MOLP-8人类多发性骨髓瘤异种移植物的中值肿瘤体积(+/-SD)随时间推移(天数)的测定而言，实际上B-B4-SPP-DM1比nBT062-SPP-DM1提供了相对更好的结果(数据未示出)。使用nBT062作为靶向抗体的免疫缀合物的该特征似乎对于缀合物的治疗应用特别有益。
最后，对SCID小鼠中的MOLP-8异种移植物模型单次静脉内施用后，最强效的类美登素缀合物为nBT062-SPDB-DM4。
异种移植物小鼠实验B
在该组实验中，用MOLP-8细胞(1.5×107细胞/小鼠)皮下接种于85只小鼠的右肩。肿瘤携带率为100％。将携带平均肿瘤体积为约80mm3的大体积MOLP-8肿瘤的66只SCID小鼠随机地分成11个治疗组(n＝6)。用单剂量的三种缀合物(nBT062-SMCC-DM1、nBT062-SPDB-DM4或nBT062-SPP-DM1)中的一种治疗小鼠。额外的一组在5周中每周接受一次nBT062-SMCC-DM1给药，而对照组接受单剂量的PBS。平均肿瘤体积如图11A所示。对于各缀合物建立剂量响应曲线。在PBS治疗的动物中，中值肿瘤体积在第25天达到750mm3。根据在对照肿瘤生长的对数线性图上拟合的最佳拟合线性回归曲线测定的肿瘤倍增时间为4.58天。用450μg/kg的nBT062-SPDB-DM4治疗的动物具有最高的对数细胞杀伤(LCK＝2.89)，仅次于其的是用250μg/kg nBT062-SMCC-DM1每周一次用药治疗的动物(LCK＝2.1；参见表5)。通过反复测定进行Dunnett多重比较测试的ANOVA来比较治疗组平均肿瘤生长曲线，显示出PBS对照组与450μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p＜0.01)、250μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p＜0.05)和5周每周一次给药250μg/kg nBT062-SMCC-DM1(p＜0.05)之间的显著差异。在任何治疗组中未发生肿瘤的部分或全部消退，唯一例外是一只接受450μg/kg nBT062-SPDB-DM4的动物，其在接种后第85天肿瘤部分消退。
表5.不同给药方案中作为不同nBT062-DMx缀合物的抗肿瘤活性的量度的对数细胞杀伤(LCK)值。对于LCK值的计算方面的信息，参见材料和方法部分。
  测试材料   剂量(μg/kg)   LCK  给药
  PBS  单剂量
  nBT062-SMCC-DM1   450   0.85  单剂量
  nBT062-SMCC-DM1   250   0.53  单剂量
  nBT062-SMCC-DM1   100   0  单剂量
  nBT062-SPDB-DM4   450   2.89  单剂量
  nBT062-SPDB-DM4   250   1.05  单剂量
  nBT062-SPDB-DM4   100   0.39  单剂量
  nBT062-SPP-DM1   450   0.8  单剂量
  nBT062-SPP-DM1   250   0.39  单剂量
  nBT062-SPP-DM1   100   0.2  单剂量
  nBT062-SMCC-DM1   250   2.1  每周一次，持续5周
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Claims (13)

1.一种识别CD138的基因工程靶向抗体，所述基因工程靶向抗体包含重链和轻链，其中
(a)所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1中的氨基酸1-122所示，和
(b)所述轻链可变区序列如SEQ ID NO:2中的氨基酸1-107所示。
2.如权利要求1所述的基因工程靶向抗体，其中所述基因工程靶向抗体为IgG4同型抗体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的基因工程靶向抗体，其中所述抗体以比鼠B-B4抗体的结合亲和力更高的结合亲和力与CD138结合。
4.如权利要求1或权利要求2所述的基因工程靶向抗体，其中所述重链进一步包含如SEQ ID NO:1的氨基酸123-448所示的恒定区，其
(i)维持或降低所述基因工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性，和/或
(ii)稳定所述基因工程靶向抗体。
5.如权利要求1或2所述的基因工程靶向抗体，其中所述基因工程靶向抗体为嵌合人/小鼠抗体。
6.如权利要求1或2所述的基因工程靶向抗体，其中所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示和所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-6中任一项所述的基因工程靶向抗体和药物可接受载剂。
8.一种体外结合CD138的方法，包括
提供权利要求1-6中任一项所述的基因工程靶向抗体，和
对表达CD138的细胞施用所述基因工程靶向抗体，其中所述基因工程靶向抗体结合所述表达CD138的细胞上所表达的CD138。
9.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含免疫球蛋白重链的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白重链的可变区序列如SEQ ID NO:1的氨基酸1-122所示，其中所述免疫球蛋白重链的恒定区为IgG4同型的恒定区，和其中所述分离的多肽还包含免疫球蛋白轻链的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白轻链的可变区序列如SEQ ID NO:2的氨基酸1-107所示，并且其中当包含所述免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链时，所述分离的多肽构成靶向CD138的靶向抗体。
10.如权利要求9所述的分离的多肽，其中所述靶向抗体为小鼠/人嵌合抗体。
11.如权利要求9所述的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白重链与SEQ ID NO:1的序列相同。
12.如权利要求9或11所述的分离的多肽，其中所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:2的序列相同。
13.权利要求1-6中任一项所述的基因工程靶向抗体在制备药物中的应用，所述药物用于靶向具有表达CD138的细胞的个体中的肿瘤细胞的治疗，其中所述基因工程靶向抗体结合所述表达CD138的细胞上表达的CD138。
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