CN111542596A - 产生工程化细胞的治疗性组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本提供了用于基因工程化T细胞，如CD4+T细胞以便在细胞疗法中使用的方法。在一些方面，所提供的方法包括用于以下的一个或多个步骤：在刺激条件下孵育所述细胞、通过转导或转染将重组多肽引入所述细胞以及在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞。在一些方面，所述孵育和/或所述培育是在重组IL‑2存在下进行。在一些方面，所提供的方法是一种以高成功率产生基因工程化T细胞的有效、可靠手段。

Description

产生工程化细胞的治疗性组合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优选权：2017年11月1日提交的标题为“产生工程化细胞的治疗性组合物的方法(PROCESS FOR GENERATING THERAPEUTIC COMPOSITIONS OFENGINEERED CELLS)”的美国临时申请号62/580,409、2017年12月8日提交的标题为“产生工程化细胞的治疗性组合物的方法(PROCESS FOR GENERATING THERAPEUTIC COMPOSITIONSOF ENGINEERED CELLS)”的美国临时申请号62/596,771和2018年8月22日提交的标题为“产生工程化细胞的治疗性组合物的方法(PROCESS FOR GENERATING THERAPEUTICCOMPOSITIONS OF ENGINEERED CELLS)”的美国临时申请号62/721,603，出于所有目的将所述申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。所述序列表作为2018年10月31日创建的标题为735042013240SeqList.txt的文件提供，其大小为35,994字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本提供了用于基因工程化T细胞，如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞以便在细胞疗法中使用的方法。在一些方面，所提供的方法包括用于以下的一个或多个步骤：在刺激条件下孵育所述细胞、通过转导或转染将重组多肽引入所述细胞以及在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞。在一些方面，所述孵育和/或所述培育是在重组IL-2存在下进行。在一些方面，所提供的方法是一种以高成功率产生基因工程化T细胞的有效、可靠手段。
背景技术
多种细胞疗法方法可用于治疗疾病和病症。细胞疗法方法包括涉及用重组受体(如嵌合抗原受体)基因工程化的免疫细胞(如T细胞)的方法。需要用于制造和/或工程化此类细胞疗法的改进方法，包括提供更有效的方法和/或改进的细胞组合物产品。提供了满足此类需求的方法、试剂盒和制品。
发明内容
在一些方面提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)在刺激条件下孵育含有针对CD4+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生含有工程化T细胞的工程化组合物。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在一些实施方案中，重组IL-2的浓度为从10IU/mL至200IU/mL或从约10至约200IU/mL。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100IU/mL至约1000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从1IU/mL至50IU/mL或从约1IU/mL至约50IU/mL。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。
在一些方面提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)孵育含有针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的T细胞的输入组合物，从而产生经刺激组合物，其中所述孵育是在如下情况下进行：(1)在一种或多种刺激条件下，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子；和/或(2)在一种或多种抗氧化剂存在下；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生含有工程化T细胞的工程化组合物。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。在一些实施方案中，重组IL-2的浓度为从10至200IU/mL或从约10至约200IU/mL；重组IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100IU/mL至约1000IU/mL；并且/或者重组IL-15的浓度为从1IU/mL至25IU/mL或从约1IU/mL至约25IU/mL。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。在一些实施方案中，所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在一些实施方案中，所述刺激试剂进一步包括与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。在一些实施方案中，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述固体支持物是或包括珠。在一些实施方案中，所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。在一些实施方案中，所述珠的直径为或为约4.5μm。在一些实施方案中，所述珠是惰性的。在一些实施方案中，所述珠是或包括聚苯乙烯表面。在一些实施方案中，所述珠是磁性或超顺磁性的。在一些实施方案中，珠与细胞的比率小于3:1或小于约3:1。在一些实施方案中，珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。在一些实施方案中，珠与细胞的比率为或为约1:1。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述引入包括用含有编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述引入是在转导佐剂存在下进行。在一些实施方案中，所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。在本文提供的方法的其他实施方案中，所述引入包括用含有编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。在一些实施方案中，所述载体是转座子，任选地Sleeping Beauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在促进所述工程化细胞的增殖或扩增的条件下培育所述工程化组合物，从而产生含有所述工程化T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述培育是在一种或多种细胞因子存在下进行，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2。在一些实施方案中，在所述培育之前将所述刺激试剂从所述工程化组合物中去除。
在一些实施方案中，在起始所述孵育后7天内或少于7天将所述刺激剂去除。在一些实施方案中，在起始所述孵育后从3天至6天或从约3天至约6天将所述刺激剂去除。在一些实施方案中，在起始所述孵育后4天时或约4天时将所述刺激剂去除。在一些实施方案中，去除所述珠包括使所述工程化组合物的细胞暴露于磁场。
在其他方面提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在一种或多种细胞因子存在下培育含有包括用重组受体工程化的细胞的CD4+原代人T细胞的工程化细胞组合物，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生含有工程化CD4+细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+重组受体表达细胞；和/或所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在本文提供的方法的一些实施方案中，重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/ml或从约50IU/mL至约500IU/ml。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500IU/mL至约2000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：(a)在刺激条件下孵育含有针对CD4+原代人T细胞进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生含有工程化T细胞的工程化组合物。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述培育是在表面活性剂存在下进行。在一些实施方案中，所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行。
在另一方面提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：在一种或多种细胞因子存在下培育含有包括用重组受体工程化的细胞的CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者的工程化细胞组合物，其中所述培育在表面活性剂存在下进行并且/或者所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行；其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生含有工程化CD4+和/或CD8+ T细胞的输出组合物。
在上述这些方法中的任一种的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞或CD4+和/或CD8+重组受体表达原代T细胞；和/或所述工程化细胞组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+和/或CD8+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。在一些实施方案中，重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/mL或从约50IU/mL至约500IU/mL；重组IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500IU/mL至约2000IU/mL；并且/或者重组IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+和重组受体表达原代人T细胞；和/或所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD8+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞或CD8+和重组受体表达原代人T细胞；和/或所述工程化细胞组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述表面活性剂包括泊洛沙姆(poloxamer)，任选地其中所述泊洛沙姆的存在浓度为从0.5μL/mL至5μL/mL或从约0.5μL/mL至约5μL/mL。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：(a)在刺激条件下孵育含有针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，从而产生经刺激组合物；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生含有工程化T细胞的工程化组合物。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述刺激试剂包括与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在一些实施方案中，所述刺激试剂进一步包括与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
在一些实施方案中，所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。在一些实施方案中，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。在一些实施方案中，所述固体支持物是或包括珠。在一些实施方案中，所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。在一些实施方案中，所述珠包括为或为约4.5μm的直径。在一些实施方案中，所述珠是惰性的。在一些实施方案中，所述珠是或包括聚苯乙烯表面。在一些实施方案中，所述珠是磁性或超顺磁性的。在一些实施方案中，珠与细胞的比率小于或小于约3:1。在一些实施方案中，珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。在一些实施方案中，珠与细胞的比率为或为约1:1。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述引入包括用含有编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述引入是在转导佐剂存在下进行。在一些实施方案中，所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述引入包括用含有编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。在一些实施方案中，所述载体是转座子，任选地Sleeping Beauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述工程化细胞组合物不包含刺激试剂和/或所述培育之前已将所述刺激试剂从所述组合物中基本上去除，所述刺激试剂含有能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的试剂。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述培育进行至少直到所述输出组合物包含阈值数量的T细胞。在一些实施方案中，所述培育在达到T细胞的所述阈值数量之后继续至少一天。在一些实施方案中，所述阈值数量比所述培育之前的所述工程化细胞组合物的数量大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多倍。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述培育进行2天至10天并包含端值，和/或所述培育进行至少10天。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，在所述培育之后，收集所述输出组合物的细胞。在一些实施方案中，所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从7天至15天或从约7天至约15天。在一些实施方案中，所述孵育的起始与所述收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从9天至13天或从约9天至约13天。在一些实施方案中，所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从8天至13天或从约8天至约13天。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。在一些实施方案中，在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。在一些实施方案中，所述低温保护剂包括DMSO。在一些实施方案中，将所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述孵育之前将CD4+和/或CD8+ T细胞从生物样品中分离。在一些实施方案中，所述分离包括基于CD4和/或CD8的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。在一些实施方案中，所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案中，所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。在一些实施方案中，所述受试者是人受试者。在一些实施方案，生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述靶抗原选自5T4、8H9、avb6整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症-睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述重组受体是或包括功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述重组受体是抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有抗原结合结构域的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包括抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在一些实施方案中，所述片段包括通过柔性接头连接的抗体可变区。在一些实施方案中，所述片段包括scFv。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包括细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包括CD3链任选CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域还包括共刺激信号传导区域。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区域包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，共刺激信号传导区域包括CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在一些实施方案中，所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，含有所述阈值数量或更大数量的细胞的所述输出组合物在所述方法的大于或大于约85％、大于或大于约90％或大于或大于约95％的重复之间产生。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法在少于21天(包含端值)中进行。
在其他方面提供了组合物，所述组合物含有通过本文的任何实施方案中所述的方法产生的工程化细胞。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物包括低温保护剂，任选地DMSO。
在另一方面提供了制品，所述制品含有本文所述的任何组合物，和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。在所述制品的一些实施方案中，所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。在一些实施方案中，所述输出组合物是工程化CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述输出组合物是CD8+ T细胞的工程化组合物。
在一些方面提供了制品，所述制品含有通过本文所述的任何方法产生的工程化CD4+ T细胞的组合物、通过本文所述的任何方法产生的工程化CD8+ T细胞的组合物，和用于将所述工程化CD4+ T细胞和所述工程化CD8+ T细胞给予至受试者的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定将所述CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分开给予至所述受试者。在其他实施方案中，所述说明书规定将所述CD4+ T细胞和所述CD8+ T细胞以所需比率给予至所述受试者。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法在少于21天(包含端值)中进行。
附图说明
图1示出了显示在实施例1中所述的用于产生抗CD19嵌合抗原受体(CAR)表达细胞的替代性(三角形)和示例性(圆圈)过程期间，在细胞的刺激、转导和扩增期间的不同时间点测量的从相同的白细胞单采术样品获得的CD4+(实心符号)和CD8+(空心符号)细胞组合物的总细胞计数的图。水平虚线指示满足收获标准所需的阈值细胞计数。
图2A-2D描绘了在来自实验1供体1(图2A)、实验1供体2(图2B)或实验2供体3(图2C)的CD4+细胞，或来自实验2供体3(图2D)的CD8+细胞中，使用通过差分DHM连续监测(“连续”，线)或手动采样(“手动”，点)评估的活细胞计数(VCC；x 106个细胞/mL)和细胞活力(％)。上图描绘了针对每种的测量值，下图描绘了线性回归分析以及R2和斜率，以用于比较连续监测和手动采样。
图3描绘了与手动扩增过程相比，在自动扩增过程中使用通过差分DHM连续监测评估的活细胞计数(VCC；x 106个细胞/mL)和细胞活力(％)。
具体实施方式
本文提供了用于生成或产生表达重组受体的工程化细胞(如工程化CD4+和/或CD8+ T细胞)的组合物的方法。在特定实施方案中，所述方法与包括以下的过程结合使用：将细胞在刺激条件下孵育；例如通过引入编码重组受体的多核苷酸来基因工程化细胞；和/或在促进细胞增殖和/或扩增的条件下培育所述工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是针对CD4+ T细胞进行富集的细胞组合物(在下文也称为经富集CD4+ T细胞的组合物)。在一些实施方案中，所述细胞是针对CD8+ T细胞进行富集的细胞组合物(在下文也称为经富集CD8+ T细胞的组合物)。在一些实施方案中，进行所述方法以生成或产生工程化T细胞的两种或单独的组合物，其中每一种均从来自相同生物样品(例如来自同一受试者)的细胞用相同重组受体工程化，如通过单独孵育、工程化和培育CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物。
可利用不同方法来产生基因工程化T细胞群，包括产生表达嵌合抗原受体的工程化T细胞。然而，在一些实施方案中，这些方法中的一些方法可能需要较长或相对长的时间量来产生工程化细胞。在一些实施方案中，一些现有方法从不同受试者获得的样品产生工程化T细胞所需的时间量可能不同。例如，在一些实施方案中，相同的方法对于一名受试者产生工程化细胞所需的时间可能比对于另一受试者长5、6、7天或更多天。在某些实施方案中，一些方法跨不同受试者成功地产生适合于疗法的工程化细胞的能力可能不同。在特定实施方案中，一些方法的易变性和/或缺乏可预测性可能给临床医生造成问题，例如如难以确定是否可以针对给定受试者产生细胞疗法，或者例如当尚不知道可利用细胞疗法的时间安排时难以计划或协调细胞疗法的给予。
所提供的实施方案解决了这些问题中的一个或多个。在特定实施方案中，与一些现有方法相比，所提供的方法在短或相对短的时间量内产生适合于疗法，例如自体细胞疗法的工程化T细胞。此外，在一些实施方案中，就从收集自不同受试者的样品产生工程化细胞所需的时间量而言，所提供的方法产生更一致且更不易变的过程。在特定实施方案中，所提供的方法能够从高比例的受试者成功地产生适合于细胞疗法的工程化T细胞。因此，在某些实施方案中，本文描述的方法提供了用于产生用于疗法的工程化T细胞的相对快速且高效的手段。这些特征可以允许用T细胞疗法如自体T细胞疗法治疗更多潜在的受试者，并且可以减轻与计划或协调用于受试者的细胞疗法相关的一些困难。
在一些实施方案中，与其他产物相比，所提供的方法在更宽范围的起始样品(包括原本可能未达到收获阈值的那些样品)中，缩短了扩增的持续时间和/或能够在较窄的持续时间窗口内产生产物，并且在一些方面可以减少由于细胞扩增不良而导致的失败。
在某些实施方案中，所提供的方法与产生表达重组受体例如嵌合抗原受体的工程化CD4+ T细胞的过程结合使用。在特定实施方案中，在重组IL-2存在下孵育和/或培育CD4+T细胞。通常，用于产生工程化CD4+ T细胞的替代性过程不涉及或不需要将重组IL-2与CD4+T细胞一起添加，因为在一些实施方案中，通常将经培养的CD4+ T细胞理解为产生和/或分泌IL-2。然而，在不希望受理论束缚的情况下，一些实施方案考虑源自一些患者(如患病的受试者和/或其T细胞含有与不健康细胞相关的一种或多种特征的受试者)的CD4+ T细胞不产生或分泌足够量的IL-2。在某些实施方案中，此类CD4+ T细胞在不补充重组IL-2的情况下将不能生长、增殖和/或扩增。因此，在某些实施方案中，通过将重组IL-2包含在用于培养和工程化CD4+ T细胞的过程中，所提供的方法扩大了可以提供可被工程化的CD4+ T细胞的受试者库，并且由此扩大了可用含有工程化CD4+ T细胞的自体细胞疗法进行治疗的受试者库。
在某些实施方案中，在基因工程化(例如转导或转染)细胞之前，在使用刺激试剂(例如抗CD3和抗CD28抗体缀合的珠)的刺激条件下孵育细胞。在一些实施方案中，在开始培育步骤之前以及在开始或起始孵育后在7天内或更早时(例如在或在约4天或5天时)，将所述刺激试剂从所述细胞分离或去除。特定的实施方案考虑，当在所述过程期间的较早的时间点将所述刺激试剂从所述细胞中去除或分离时，则与在不分离或去除所述刺激试剂或在所述过程期间的稍后时间点分立或去除刺激试剂的替代性过程中培育的细胞相比，所述细胞具有改善的存活率并且在培育步骤期间将经历更稳健的增殖和/或扩增。在此类实施方案中，与在替代性过程中培育的细胞相比，所述经培育细胞更快地实现目标或阈值细胞计数、密度和/或扩增。因此，在一些实施方案中，从开始或起始孵育起7天内或更早时将所述刺激试剂从所述细胞中去除或分离允许在比替代性过程更短的时间量内完成生成或产生工程化细胞的过程。
在一些实施方案中，本文提供的方法与在短持续时间内产生基因工程化T细胞的过程结合使用。在某些实施方案中，所述过程的短持续时间可以增加产生可以给予至受试者以进行细胞疗法的工程化T细胞组合物的速率、情况和/或概率。在一些实施方案中，用于治疗性细胞组合物的制造方案可能要求，在一定时间量内产生和释放细胞组合物以进行输注，例如，验证和/或确定其适合于给予至受试者。在一些方面，可能预期所提供的过程的短持续时间减少或消除了由于细胞组合物不能在所需的时间量内扩增而发生的过程失败。
在特定实施方案中，本文提供的方法与在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞结合使用。在一些实施方案中，所述培育是在允许对经培育细胞进行恒定混合和/或灌注的设置中进行，如在生物反应器中或与生物反应器相连。在一些实施方案中，所述培育的至少一部分是在恒定混合的情况下和在缓慢、恒定灌注的情况下进行的，以用新鲜培养基置换用过的培养基。在某些实施方案中，最初在静态条件下，例如在没有灌注或混合下培育细胞，然后当经培育细胞达到预定的细胞计数或密度时，和/或一旦已经将细胞初始培养预定时间量之后，在恒定的混合和灌注的情况下进行培育。在一些此类实施方案中，与在替代性过程中培育的细胞相比，所述经培育细胞更快地实现目标或阈值细胞计数、密度和/或扩增。因此，在一些实施方案中，与在静态条件下培育细胞的替代性过程相比，在恒定的混合和/或灌注的情况下进行培育允许在较短的时间量内完成生成或产生工程化细胞的过程。
在特定实施方案中，所提供的方法与高效产生或生成适合于在细胞疗法中使用的工程化细胞的过程结合使用。在某些实施方案中，用于所述过程的每个步骤的时间安排、条件和试剂改善了每个后续步骤和/或整个过程的效率。例如，在一些实施方案中，可以将细胞与试剂(例如刺激试剂或转导佐剂)一起孵育，所述试剂的浓度足够高以实现所需效果(例如刺激细胞或改善转导效率，但是所述试剂的浓度足够低以避免在后续处理步骤中减慢生长或降低存活率。此外，在一些实施方案中，对所述过程的步骤进行时间安排以在特定时间点开始或结束，以改善后续过程步骤和/或整个过程的效率。例如，在一些实施方案中，孵育和工程化(例如，转导或转染细胞)的步骤在所述过程中比在替代性方法中更早地完成，在某些实施方案中，这改善了存活率和/或健康状况，和/或在后续的培育步骤期间细胞增殖和扩增的速度。因此，在一个方面，每个步骤的特定时间安排、条件和试剂影响单独步骤以外的细胞，并且在某些实施方案中，影响整个过程的表现。
在一些实施方案中，所述方法与以可以比替代性过程更快和更高效的方式生成或产生适合于细胞疗法的基因工程化细胞的过程结合使用。在某些实施方案中，与由替代性过程可能实现的相比，本文提供的方法具有从更广泛的受试者群体生成或产生工程化细胞组合物的高成功率。在某些实施方案中，与通过替代性方法产生的细胞相比，通过所提供的方法产生或生成的工程化细胞可以具有更出色的健康状况、活力、激活，并且可以具有更高的重组受体表达。因此，在一些方面，与通过一些替代性方法可能实现的相比，所提供的方法产生用于细胞疗法的工程化细胞的速度和效率允许更容易地对更广泛的受试者群体进行细胞疗法治疗如自体疗法的计划和协调。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
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本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.用于产生工程化细胞的方法
本文提供了用于产生工程化细胞，如工程化CD4+ T细胞和/或工程化CD8+ T细胞的输出组合物的方法，所述工程化细胞表达重组蛋白，例如重组受体如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文提供的方法与制造、生成或产生细胞疗法结合使用，并且可以与另外的处理步骤，如分离(isolation)、分开(separation)、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤结合使用。在一些实施方案中，生成或产生工程化细胞，例如工程化CD4+ T细胞和/或工程化CD8+ T细胞的方法包括以下中的一项或多项：从受试者分离细胞、制备细胞、处理细胞、在刺激条件下孵育细胞和/或工程化(例如转导)细胞。在一些实施方案中，所述方法包括以如下顺序进行的处理步骤：首先从生物样品中分离，如选择或分开输入细胞，例如原代细胞；在刺激条件下孵育输入细胞，用载体颗粒，例如病毒载体颗粒进行工程化以例如通过转导或转染将重组多核苷酸引入所述细胞中；培育所述工程化细胞(例如转导的细胞)，如以扩增所述细胞；以及收集、收获所述细胞的全部或一部分，和/或用其填充容器，以将所述细胞配制于输出组合物中。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将所产生的输出组合物的细胞重新引入同一受试者中。在一些实施方案中，所述工程化细胞的输出组合物适合于在疗法，例如自体细胞疗法中使用。
在特定实施方案中，所提供的方法与从初始或输入细胞组合物产生表达重组受体的细胞的输出组合物结合使用。在一些实施方案中，所述细胞的组合物是经富集T细胞、经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞的组合物(在下文也分别称为经富集T细胞的组合物、经富集CD4+ T细胞的组合物和经富集CD8+ T细胞的组合物)。在一些实施方案中，所提供的方法与以下中的一项或多项结合使用：激活或刺激针对T细胞进行富集的细胞组合物；对经富集T细胞的组合物进行基因工程化，例如以通过转导或转染引入编码重组蛋白的多核苷酸；和/或例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞的工程化组合物。在某些实施方案中，所述方法还可以与从生物样品(如从受试者获取、收集和/或获得的生物样品)中分离或选择细胞以产生经富集T细胞的输入组合物结合使用。在特定实施方案中，所提供的方法可以与在已经将细胞孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育之后收获、收集和/或配制经富集T细胞的组合物结合使用。
在一些实施方案中，所提供的方法与经富集T细胞的单一组合物的分离、分开、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制组合使用。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是包含经富集CD4+ T细胞的细胞组合物。在某些实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞的组合物含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD4+ T细胞。在特定实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞的组合物含有至100％CD4+ T细胞或含有约100％CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述群体基本上由CD4+ T细胞组成。
在一些实施方案中，所提供的方法与产生经富集T细胞的两种或更多种单独的输出组合物结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法是对经富集T细胞的两种或更多种单独组合物(例如，经富集CD4+ T细胞的一种或多种单独组合物和经富集CD8+ T细胞的一种或多种单独组合物)分别进行。在某些实施方案中，所述方法可以与以下结合使用：分别激活和/或刺激经富集T细胞的两种或更多种组合物；分别工程化经富集T细胞的两种或更多种组合物；和/或分别培育经富集T细胞的两种或更多种组合物。在某些实施方案中，所述方法还可以与从生物样品中分离或选择不同细胞以产生经富集T细胞的单独的输入组合物结合使用，所述单独的输入组合物如经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的单独组合物。在特定实施方案中，所提供的方法可以与在已经将T细胞孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育之后分别收获、收集和/或配制经富集T细胞的单独组合物结合使用。
在特定的实施方案中，所提供的方法可以与以下结合使用：分别孵育经富集CD4+T细胞的至少一种单独组合物和经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；在所述孵育之后分别激活和/或刺激所述经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和所述经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；在所述激活和/或刺激之后分别工程化、转导和/或转染所述经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和所述经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；在所述工程化、转导和/或转染之后分别培育所述经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和所述经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；在所述培育之后分别收获和/或收集所述经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和所述经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；在所述收获和/或收集之后分别配制所述经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和所述经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物；和/或分别将所述配制的组合物给予至有需要的受试者。
在一些实施方案中，所述经富集T细胞的两种或更多种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种单独组合物包括CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述两种或更多种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物和经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，经富集CD4+ T细胞的单独组合物和经富集CD8+T细胞的单独组合物源自相同生物样品，如从单一受试者获得、收集和/或获取的相同生物样品，例如，最初从其分离、选择和/或富集。在一些实施方案中，首先使相同生物样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且使阴性级分进一步经历CD8+ T细胞的选择。在一其他实施方案中，首先使相同生物样品经历CD8+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且使阴性级分进一步经历CD4+ T细胞的选择。
在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述经富集CD8+ T细胞的组合物含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD8+ T细胞，或者含有或含有约100％CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+ T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，并且/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，细胞群基本上由CD8+ T细胞组成。
在一些实施方案中，用重组IL-2和/或在重组IL-2存在下孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育经富集CD4+ T细胞的组合物和/或经富集CD4+ T细胞的工程化组合物。在特定实施方案中，所述方法与在刺激条件下用重组IL-2和/或在重组IL-2存在下孵育经富集CD4+ T细胞的输入组合物结合使用。在一些实施方案中，所述方法与在促进增殖和/或扩增的条件下用重组IL-2和/或在重组IL-2存在下培育经富集CD4+ T细胞的工程化组合物结合使用。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述经富集T细胞的输入组合物是或包括将所述细胞与刺激试剂，例如章节I-B-1中所述的刺激试剂一起孵育。在某些实施方案中，在培育步骤之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除或分离。在某些实施方案中，在基因工程化，例如转染或转导之后将所述刺激试剂从所述细胞中去除或分离。在一些实施方案中，在从开始或起始与刺激试剂一起孵育起的设定时间量内，例如在从开始或起始所述孵育起的7天或更少天内，将所述刺激试剂从所述细胞中去除。在特定实施方案中，在刺激条件下的孵育是在一种或多种抗氧化剂例如含硫抗氧化剂和/或谷胱甘肽前体的存在下进行。
在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化所述经富集T细胞的组合物，例如经富集T细胞的经刺激组合物，例如以改善转染或转导的效率。在某些实施方案中，所述聚阳离子以低和/或相对低的量和/或浓度存在。
在某些实施方案中，所述培育步骤的至少一部分是在恒定的混合和/或灌注的情况下进行，例如在封闭系统中用生物反应器进行。在某些实施方案中，所述混合和/或灌注并入了用新鲜培养基或溶液对用过的或旧的细胞培养基或溶液的稳定和/或逐步置换。在特定实施方案中，在表面活性剂和/或减少或防止细胞剪切(如在恒定混合和/或灌注期间的剪切)的试剂存在下培育细胞。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如过继细胞疗法中)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在使细胞不暴露于非无菌条件的情况下进行。在这种方法的一些实施方案中，细胞的分离、分开或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激和配制都在封闭系统内进行。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭的系统或装置之外进行的。在一些此类实施方案中，在无菌条件下将经富集细胞的组合物从封闭系统或装置中转移出去，如通过无菌转移到单独的封闭系统中。
在特定实施方案中，可以在用于产生表达重组受体的经富集T细胞的输出组合物的过程的任何阶段或步骤之前、期间或之后，将所述经富集T细胞的组合物收集、配制用于在0℃以下、-20℃以下、或-70℃或-80℃或-70℃或-80℃以下进行冷冻保护、低温冷冻和/或储存。在一些实施方案中，可以将细胞储存少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时间量，或少于1、2、3、4、5、6、7、8周的时间量，或至少1、2、3、4、5、6、7或8周的时间量，或超过8周。储存后，可以将经富集T细胞的组合物解冻，并且可以从所述过程中的同一点恢复处理。在一些实施方案中，将经富集T细胞的输入组合物低温冷冻并储存，之后进行进一步处理，例如在刺激条件下孵育。在特定实施方案中，将经富集T细胞的培育和/或配制组合物低温冷冻并储存，之后将其例如作为自体细胞疗法给予至受试者。
在某些实施方案中，将经富集T细胞的单独细胞组合物合并为单一组合物。例如，在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞的组合物与经富集CD8+T细胞的组合物合并为经富集CD4+和CD8+ T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，所述单独组合物源自相同生物样品，如从单一受试者获得、收集和/或获取的相同生物样品，例如最初从其分离、选择和/或富集。在一些实施方案中，对于产生输出组合物的过程，例如与所提供的方法结合的过程的一个或多个步骤或阶段，所述单独组合物被分别处理。在一些实施方案中，可以在用于产生输出组合物的过程的任何步骤或阶段之前、期间或之后，将所述单独组合物合并为单一组合物。因此，在一些实施方案中，将来自相同生物样品的经富集T细胞的单独的输入、刺激、工程化、培育、配制和/或收获的组合物合并为单一组合物，并且在某些实施方案中，将其作为单一组合物进一步处理。在某些实施方案中，在将细胞给予至受试者之前，将经富集细胞的单独的输出组合物合并为单一输出组合物。
在某些实施方案中，在所述过程中的任何阶段或步骤，可以对细胞的一部分进行采样或收集，例如，如在分离、孵育、工程化、培育和/或配制期间，可以在所述组合物保持在封闭系统中时从经富集T细胞的组合物中取出细胞。在某些实施方案中，可以分析此类细胞的标记、特征或特性，包括但不限于活力、细胞凋亡、激活、刺激、生长和/或消耗。在一些实施方案中，在经富集T细胞的组合物保持在封闭系统中时，通过自动化过程对细胞进行采样或收集。在一些实施方案中，对采样或收集的细胞的分析是自动化的。在特定实施方案中，所述分析是在无菌条件下在封闭系统中进行。
在一些实施方案中，可以将通过所提供的方法产生和/或加工的细胞或细胞组合物与通过示例性和/或替代性过程加工或产生的细胞或细胞组合物进行比较。在一些实施方案中，替代性和/或示例性过程可以在一个或多个特定方面不同，但是在其他方面含有所比较的所提供方法的实施方案或方面的相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。例如，当所提供的方法与在试剂存在下孵育细胞结合使用时，可以将此类细胞与在示例性和/或替代性过程中未与所述试剂一起孵育的细胞进行比较。在一些实施方案中，除非另有说明，否则所提供的方法和示例性和/或替代性过程在其他方面是相似和/或相同的，如具有相似或相同的分离、选择、富集、激活、刺激、工程化、转染、转导、培育和/或配制的步骤。在一些实施方案中，除非另有说明，否则所提供的方法和替代性过程从相同或相似类型的生物样品中分离、选择和/或富集细胞，和/或处理相同细胞类型的细胞和/或输入细胞。
还提供了通过所述方法制备的细胞和组合物(包括药物组合物和配制品)，以及用于进行所述方法的试剂盒、系统和装置。还提供了使用通过所述方法制备的细胞和组合物的方法(包括治疗方法，如用于过继细胞疗法的方法)，以及用于给予受试者的药物组合物。
A.样品和细胞制备
在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品中分离、选择和/或富集细胞以产生经富集细胞例如T细胞的一种或多种输入组合物结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品如从受试者获得或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，细胞被分离、处理和/或工程化以用于所述治疗性干预)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括直接取自所述受试者的组织、流体和其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的加工样品。
在一些方面，所述样品是血液或血液源样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，在半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器，Baxter)中完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(如例如不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获所述工程化细胞之后冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。然后用介质将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以或以约1°/分钟的速率冷冻至-80℃或约-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，在一种或多种试剂存在下洗涤、离心和/或孵育细胞，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。例如作为选择方法的一部分的与一种或多种选择试剂一起孵育可以使用一种或多种选择试剂进行，以基于一种或多种特定分子在细胞中或细胞上的表达或存在，选择一种或多种不同的细胞类型，所述分子如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸。在一些实施方案中，可以使用任何已知的方法，所述方法使用一种或多种选择试剂，基于此类标记进行分离。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或给予免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的所需的基于亲和力的选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法引起所分离细胞与固体表面(例如颗粒)上特异性地结合至细胞上的标记的分子(例如，抗体或其他结合配偶体)之间的有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒如珠，例如磁珠来进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞一起在容器(如管或袋)中孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，所述分离或分开是使用国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体包被的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，所述部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类方法的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述量显著少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，所述分子任选地偶联到支架，如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用的或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL，诸如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为从5分钟至6小时或从约5分钟至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，如在旋转存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品如单采术样品的预先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入所述室中和推出所述室并实现离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在进行细胞与选择试剂的一起孵育的同一封闭系统中进行分离。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到用于基于免疫亲和力来分离细胞的系统中。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合所述试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至试剂(例如，抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于并非所需群体的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，所述过程步骤进一步包括对所孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择，如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。可以进行多轮相同的选择步骤，例如阳性或阴性选择步骤。在某些实施方案中，使阳性或阴性选择的级分经历选择过程，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将选择重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或超过九次。在某些实施方案中，将相同选择进行多达五次。在某些实施方案中，将相同选择步骤进行三次。
分离不需要导致特定细胞群或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对阴性选择靶向的标记具有特异性)一起孵育。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，同时阳性选择多种细胞类型。在某些实施方案中，将一个或多个分离步骤重复和/或进行多于一次。在一些实施方案中，使从分离步骤产生的阳性或阴性选择的级分经历相同分离步骤，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将单一分离步骤重复和/或进行多于一次，例如以增加阳性选择的细胞的产量、增加阴性选择细胞的纯度和/或从阴性选择的级分中进一步去除阳性选择的细胞。在某些实施方案中，将一个或多个分离步骤进行和/或重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤进行和/或重复一至十次、一至五次或三至五次。在某些实施方案中，将一个或多个选择步骤重复三次。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术来分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或表达高水平的一种或多种表面标记的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞。在一些实施方案中，通过与特异性地结合至此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以如直接或间接缀合至用于实现选择的固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠。例如，CD3+、CD28+ T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002556464920000281
M-450CD3/CD28 T细胞扩增器和/或
Figure BDA0002556464920000282
珠)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)的阴性选择，将T细胞从PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记进行阳性或阴性选择，将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+ T细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。
在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+ T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+ T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+ T细胞群的选择和对CD8+ T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，CD4+ T细胞群和对CD8+ T细胞群的选择以任一顺序依次进行。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US20170037369中所述的那些。在一些实施方案中，可以在选择之后将经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群合并。在一些方面，可以如本文所述在生物反应器袋中将经选择CD4+T细胞群和经选择CD8+ T细胞群合并。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，分别处理经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+ T细胞群，由此使经选择CD4+ T细胞群富集CD4+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育；并且使经选择CD8+ T细胞群富集CD8+ T细胞并且将其与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+ T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导，并且在扩增T细胞的条件下培育。
在特定实施方案中，使生物样品，例如PBMC或其他白细胞样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，从阴性级分选择CD8+ T细胞。在一些实施方案中，使生物样品经历CD8+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，从阴性级分选择CD4+ T细胞。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经历CD4+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使阴性级分经历基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序来进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+ T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+ T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+ T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+ T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:MetastasisResearch Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002556464920000301
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦(Totowa,NJ))。
在一些方面，将待分离的细胞的孵育样品或组合物与含有选择试剂的小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或
Figure BDA0002556464920000302
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体特异性地结合至需要分离(例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含结合至特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)的磁响应材料。用于磁分离方法中的许多熟知的磁响应材料是已知的，例如Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。也可以使用胶体尺寸的颗粒，如Owen美国专利号号4,795,698；和Liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附接至磁粒或磁珠的此类抗体或结合配偶体特异性地结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性地结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒通过对一种或多种标记具有特异性的一抗的包衣附接至细胞。在某些实施方案中，将所述细胞而不是珠用一抗或结合配偶体标记，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用的。
在一些方面，在如下程序中实现分离，其中将样品置于磁场中，并且附接有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活的细胞分选(MACS)(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)进行的。磁激活细胞分选(MACS)，例如CliniMACS系统能够高纯度选择附接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，在洗脱未附接的种类时，附接至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附接至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附接至细胞以用于给予患者。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择产生经富集T细胞，例如CD3+ T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+ T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和/或获得。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+ T细胞。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的输入组合物基本上由CD3+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集CD4+ T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD4+ T细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD4+ T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种组合物是或包括CD8+ T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述CD8+ T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD8+ T细胞组成。
在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将所述经富集T细胞的一种或多种输入组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制所述细胞的组合物的任何步骤之前冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻的所述一种或多种输入组合物。在特定实施方案中，将所述一种或多种低温冷冻的输入组合物例如在或在约-80℃下储存12小时至7天、24小时至120小时或2天至5天。在特定实施方案中，将所述一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天、3天、2天或1天的时间量。在一些实施方案中，将所述一种或多种低温冷冻的输入组合物在或在约-80℃下储存1天、2天、3天、4天、5天或6天或约1天、2天、3天、4天、5天或6天。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，所提供的方法与在刺激条件下孵育细胞结合使用。在一些实施方案中，所述刺激条件包括激活或刺激，和/或能够激活或刺激细胞(例如，CD4+ T细胞或CD8+ T细胞)中的信号，如从TCR和/或共受体产生的信号的条件。在一些实施方案中，所述刺激条件包括用刺激试剂(例如，激活或刺激，和/或能够激活或刺激细胞中的信号的试剂)和/或在所述刺激试剂存在下培养、培育、孵育、激活、繁殖细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述刺激试剂刺激和/或激活TCR和/或共受体。在特定实施方案中，所述刺激性试剂是在章节I-B-1中所述的试剂。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞，例如通过章节I-C中提供的技术转染和/或转导细胞之前，在刺激条件下孵育经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已从生物样品中分离、选择、富集或获得经富集T细胞的一种或多种组合物之后，在刺激条件下孵育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的输入组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在孵育之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成孵育之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独经刺激组合物合并为单一组合物。在一些实施方案中，如根据所提供的方法，在已经进行和/或完成孵育之后分别处理经刺激CD4+ T和经刺激CD8+ T细胞的单独经刺激组合物，由此将经刺激CD4+ T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育，并且将经刺激CD8+ T细胞群(例如与刺激性抗CD3/抗CD28磁珠刺激试剂一起孵育)用编码重组蛋白(例如CAR)(如与来自同一供体的用于工程化CD4+ T细胞的相同的重组蛋白)的病毒载体转导并且在扩增T细胞的条件下培育。
在一些实施方案中，所述在刺激条件下的孵育可以包括培养、培育、刺激、激活、繁殖，包括通过在如下刺激条件存在下进行孵育，所述刺激条件例如设计用于以下的条件：诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化，如用于引入重组抗原受体。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，刺激和/或在刺激条件下孵育是根据多种技术来进行，所述多种技术如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增细胞(例如T细胞)、细胞组合物和/或细胞群，如CD4+和CD8+ T细胞或其组合物、群体或亚群：向培养起始组合物中添加饲养细胞如非分裂外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得所得细胞群对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，在培养期间实现温度转变，如从37摄氏度至35摄氏度。任选地，孵育可以进一步包括添加非分裂的EBV转化的淋巴样干细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，以任何合适的量提供LCL饲养细胞，如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1。
在实施方案中，可以通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性的CD4+和CD8+的群体。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆。也可以使用幼稚T细胞。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用刺激试剂孵育、培养和/或培育细胞。在特定实施方案中，所述刺激性试剂是在章节I-B-1中所述的试剂。在某些实施方案中，所述刺激试剂含有或包括珠。示例性刺激试剂是或包括抗CD3/抗CD28磁珠。在某些实施方案中，当将细胞与刺激试剂发生接触和/或与刺激试剂一起孵育时，发生在刺激条件下孵育、培养和/或培育细胞的开始和/或起始。在特定实施方案中，在基因工程化细胞(例如，如通过转染或转导将重组多核苷酸引入细胞中)之前、期间和/或之后，孵育细胞。
在一些实施方案中，以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的刺激试剂和/或珠(例如抗CD3/抗CD28磁珠)与细胞的比率孵育所述经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述刺激试剂和/或珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，所述刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
在特定实施方案中，以小于3:1或每细胞少于3个刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)的比率(如1:1的比率)孵育所述细胞降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如，如因激活诱导的死亡所致)的量。在一些实施方案中，将所述细胞与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3(或3:1或每细胞少于3个珠)的珠与细胞的比率一起孵育。在特定实施方案中，以小于3:1或每细胞少于3个珠的比率(如1:1的比率)孵育所述细胞降低了孵育期间发生的细胞死亡(例如，如因激活诱导的死亡所致)的量。
在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂以小于3:1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且在孵育期间少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞经历激活诱导的细胞死亡。
在某些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)以小于3:1的珠与细胞的比率(如1:1的比率)一起孵育，并且与经历示例性和/或替代性过程(其中将经富集T细胞的组合物与刺激试剂以3:1或更大的比率一起孵育)的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，与所述刺激试剂一起孵育的所述经富集T细胞的组合物包含从1.0x 105个细胞/mL至1.0x 108个细胞/mL或从约1.0x 105个细胞/mL至约1.0x 108个细胞/mL，如至少或约至少或约1.0x 105个细胞/mL、5x 105个细胞/mL、1x 106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL。在一些实施方案中，与所述刺激试剂一起孵育的所述经富集T细胞的组合物包含约0.5x 106个细胞/mL、1x106个细胞/mL、1.5x 106个细胞/mL、2x 106个细胞/mL、2.5x 106个细胞/mL、3x 106个细胞/mL、3.5x 106个细胞/mL、4x 106个细胞/mL、4.5x 106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、5.5x 106个细胞/mL、6x 106个细胞/mL、6.5x 106个细胞/mL、7x 106个细胞/mL、7.5x 106个细胞/mL、8x 106个细胞/mL、8.5x 106个细胞/mL、9x 106个细胞/mL、9.5x 106个细胞/mL或10x 106个细胞/mL，如约2.4x106个细胞/mL。
在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃，例如为或为约37℃±2℃的温度下一起孵育。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下一起孵育。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物与所述刺激试剂在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下一起孵育。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-2。在一些实施方案中，所述刺激条件包括在如所述的刺激试剂(抗CD3/抗CD28磁珠)存在下和在一种或多种重组细胞因子存在下孵育经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞或经富集CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，将经富集CD4+ T细胞的组合物与IL-2，例如重组IL-2一起孵育。在不希望受理论束缚的情况下，特定的实施方案考虑从一些受试者获得的CD4+ T细胞不产生或不足够地产生如下量的IL-2，所述量允许在用于产生输出细胞(例如适合于在细胞疗法中使用的工程化细胞)的组合物的整个过程中的生长、分裂和扩增。在一些实施方案中，在重组IL-2存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+ T细胞的组合物增加了所述组合物的CD4+T细胞在孵育步骤期间和整个所述过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2存在下孵育所述经富集CD4+ T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2存在下孵育所述经富集CD4+ T细胞的组合物将从所述经富集CD4+ T细胞的组合物产生经富集CD4+ T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+ T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在某些实施方案中，用国际单位(IU)测量和/或定量一种或多种细胞因子的量或浓度。国际单位可以用于定量维生素、激素、细胞因子、疫苗、血液制品和类似的生物活性物质。在一些实施方案中，IU是或包括通过与具有比重和比强度的国际参考标准品(例如，人IL-2的WHO第一国际标准品，86/504)相比较的生物制剂效力的测量单位。国际单位是报告生物活性单位的唯一公认且标准化的方法，所述单位是由国际合作研究工作公布和推导的。在特定实施方案中，可以通过与类似的WHO标准产品的产品比较测试来获得细胞因子的组合物、样品或来源的IU。例如，在一些实施方案中，将人重组IL-2、IL-7或IL-15的组合物、样品或来源的IU/mg分别与WHO标准IL-2产品(NIBSC代码：86/500)，WHO标准IL-17产品(NIBSC代码：90/530)和WHO标准IL-15产品(NIBSC代码：95/554)进行比较。
在一些实施方案中，以IU/mg计的生物活性等同于(以ng/ml计的ED50)-1x106。在特定实施方案中，重组人IL-2或IL-15的ED50等同于使用CTLL-2细胞的细胞增殖的半最大刺激(XTT切割)所需的浓度。在某些实施方案中，重组人IL-7的ED50等同于PHA激活的人外周血淋巴细胞的增殖的半最大刺激所需的浓度。与IL-2的IU的测定和计算相关的细节论述于Wadhwa等人,Journal of Immunological Methods(2013),379(1-2):1-7；和Gearing和Thorpe,Journal of Immunological Methods(1988),114(1-2):3-9中；与IL-15的IU的测定和计算相关的细节论述于Soman等人Journal of Immunological Methods(2009)348(1-2):83-94中；所述文献通过引用以其整体特此并入。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15存在下在刺激条件下孵育经富集CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15存在下在刺激条件下孵育经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些方面，所述经富集T细胞组合物的孵育还包括刺激试剂，例如抗CD3/抗CD28磁珠的存在。
在一些实施方案中，将所述细胞与细胞因子，例如重组人细胞因子一起孵育，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与IL-2，例如人重组IL-2一起孵育，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-2一起孵育，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，在为或为约85IU/ml的重组IL-2存在下孵育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的所述组合物富集T细胞，例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的群体。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD8+ T细胞，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD4+ T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-2一起孵育的经富集CD8+ T细胞组合物也可以与重组IL-15如以所述量一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-7，例如人重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-7一起孵育，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在为或为约600IU/ml的重组IL-7存在下孵育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，与重组IL-7一起孵育的所述组合物富集T细胞，例如CD4+ T细胞的群体。在一些实施方案中，与重组IL-7一起孵育的经富集CD4+ T细胞组合物也可以与重组IL-2和/或重组IL-15如以所述量一起孵育。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，不将经富集CD8+ T细胞组合物与重组IL-7一起孵育。
在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物与重组IL-15，例如人重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与重组IL-15一起孵育，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的所述组合物富集T细胞，例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的群体。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD8+ T细胞，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD4+ T细胞组合物也可以与重组IL-7和/或重组IL-2如以所述量一起孵育。在一些实施方案中，与重组IL-15一起孵育的经富集CD8+ T细胞组合物也可以与重组IL-2如以所述量一起孵育。
在特定实施方案中，将所述细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)在一种或多种抗氧化剂存在下与所述刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素(luetin)、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽(gluthatione)、胱胺和胱硫醚(cysstathionine)和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。在一些方面，所述经富集T细胞组合物(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)与抗氧化剂一起孵育还包括刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)和一种或多种重组细胞因子(如所述的)的存在。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，所述含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，所述含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)包括在一种或多种抗氧化剂存在下孵育所述细胞。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂存在下用所述刺激试剂刺激所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的所述一种或多种抗氧化剂存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的所述一种或多种抗氧化剂存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述细胞(如经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)包括在NAC存在下孵育所述细胞。在特定实施方案中，在NAC存在下用所述刺激试剂刺激所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1-500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml孵育所述细胞。
在特定实施方案中，如与在不存在抗氧化剂的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞中的激活。在某些实施方案中，所述降低的激活通过细胞中一种或多种激活标记的表达来测量。在某些实施方案中，激活标记包括但不限于增加的细胞内复杂性(例如，如通过测量侧向散射(SSC)确定的)、增加的细胞大小(例如，如通过测量细胞直径和/或前向散射(FSC)确定的)、增加的CD27表达和/或减少的CD25表达。在一些实施方案中，当在孵育、工程化、转导、转染、扩增或配制期间或之后，或在孵育后进行的所述过程的任何阶段期间或之后进行检查时，所述组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在一些实施方案中，在所述过程完成后，所述组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞具有阴性、减少的或低的激活标记的表达和/或程度。
在一些实施方案中，将流式细胞术用于确定细胞的相对大小。在特定实施方案中，将FSC和SSC参数用于分析细胞以及基于大小和内部复杂性将细胞彼此区分。在特定实施方案中，可以测量已知大小的颗粒或珠作为确定细胞实际大小的标准。在一些实施方案中，将流式细胞术与染色剂例如标记的抗体组合使用，以测量或定量表面蛋白(如激活标记，例如CD25或CD27)的表达。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，细胞直径减少至少0.25μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm或超过5μm。在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过FSC测量的细胞大小减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，如通过SSC测量的细胞内复杂性减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD27表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在某些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，例如如通过流式细胞术测量的CD25表达增加至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物增加了例如在如章节I-D中所述的孵育或培育步骤或阶段期间的扩增。在一些实施方案中，经富集细胞的组合物在开始培育的14天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天内或3天内实现了2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或大于10倍的扩增。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的经培育细胞相比，所述组合物的细胞在培育期间经历快至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍的扩增速率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如因细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞的组合物，并且在完成孵育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历细胞凋亡。在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述组合物，并且与经历其中未将细胞在一种或多种抗氧化剂存在下孵育的示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂，例如NAC存在下孵育所述经富集T细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)的组合物，并且与在其中未在抗氧化剂存在下进行孵育的替代性和/或示例性过程中孵育的细胞相比，半胱天冬酶表达，例如半胱天冬酶3表达降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在一些实施方案中，在如所述的刺激条件或刺激试剂存在下孵育所述组合物或细胞(如经富集CD4+ T细胞和/或经富集CD8+ T细胞)。此类条件包括设计用于以下的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。示例性刺激试剂(如抗CD3/抗CD28磁珠)在下文描述。与刺激试剂一起孵育还可以在一种或多种刺激细胞因子存在下，如在重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15中的一种或多种的存在下，和/或在至少一种抗氧化剂如NAC存在下进行，如上文所述。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-7、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。在一些实施方案中，将经富集CD8+ T细胞的组合物在刺激条件下与刺激剂(即重组IL-2、重组IL-15)和NAC如以如所述量一起孵育。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和经设计以激活细胞的任何其他药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如经选择细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述量远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的量。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如约10mL至约200mL，或约20mL至约125mL，如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、105mL、110mL、115mL、120mL、125mL、130mL、135mL、140mL、145mL、150mL、160mL、170mL、180mL、190mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，如在旋转存在下进行，通常以相对低的力或速度旋转，如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间、18小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或约至少或约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
在一些实施方案中，在用于例如通过转导和/或转染将多核苷酸例如编码重组受体的多核苷酸引入细胞中的步骤(如通过章节I-C所述)之前和/或期间，在刺激条件下培养、培育和/或孵育所述细胞。在某些实施方案中，在基因工程化之前将所述细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在1小时与6小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在1天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在一些实施方案中，在工程化之前将所述细胞孵育2天或约2天。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育。在某些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育如下时间量：在12小时与36小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时之间和在2天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与8天之间、在4天与6天之间或在4天与5天之间。在特定实施方案中，在基因工程化细胞之前和/或期间将所述细胞在刺激条件下培养、培育和/或孵育如下时间量：少于10天、9天、8天、7天、6天或5天、4天，或如下时间量：少于168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时。在特定实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育4天、5天、6天或7天或约4天、5天、6天或7天。在一些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育4天或约4天。在特定实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育5天或约5天。在某些实施方案中，将所述细胞与刺激试剂一起和/或在刺激试剂存在下孵育少于7天。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育所述细胞包括将所述细胞与章节I-B-1中所述的刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，所述刺激试剂含有或包括珠，如顺磁珠，并且将细胞与刺激试剂以小于3:1(珠:细胞)的比率，如1:1的比率一起孵育。在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子和/或一种或多种抗氧化剂存在下将所述细胞与所述刺激试剂一起孵育。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15，和NAC存在下将经富集CD4+ T细胞的组合物与所述刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15，和NAC存在下将经富集CD8+ T细胞的组合物与所述刺激试剂以1:1(珠:细胞)的比率一起孵育。在一些实施方案中，在从开始或起始孵育起，例如从将刺激试剂添加至细胞或与细胞接触的时间起的6天、5天或4天时、6天、5天或4天内或约6天、5天或4天内，将所述刺激试剂从所述细胞去除和/或分离。
1.刺激试剂
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育经富集细胞的组合物是或包括将经富集细胞的组合物与能够激活和/或扩增T细胞的刺激试剂一起孵育和/或与其接触。在一些实施方案中，刺激试剂能够刺激和/或激活所述细胞中的一个或多个信号。在一些实施方案中，所述一个或多个信号由受体介导。在特定实施方案中，所述一个或多个信号是信号转导和/或第二信使(例如，cAMP和/或细胞内钙)的水平或量的变化，一种或多种细胞蛋白的量、细胞定位、构象、磷酸化、泛素化和/或截短的变化，和/或细胞活性(例如转录、翻译、蛋白降解、细胞形态、激活状态和/或细胞分裂)的变化或与其相关。在特定实施方案中，刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞)的一种或多种药剂(例如生物分子)缀合或连接的颗粒(例如珠)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠结合。在一些实施方案中，珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对所培养的细胞(例如，所培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附接药剂的任何颗粒。
在一些实施方案中，刺激试剂含有能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞)的一种或多种药剂，所述一种或多种药剂结合至或以其他方式附接至珠，例如结合至或附接至珠的表面。在某些实施方案中，珠是非细胞颗粒。在特定实施方案中，珠可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、磁珠等。在一些实施方案中，珠是琼脂糖珠。在某些实施方案中，珠是琼脂糖凝胶珠。
在特定实施方案中，刺激试剂含有单分散的珠。在某些实施方案中，单分散的珠包含彼此的直径标准差小于5％的尺寸分散体。
在一些实施方案中，珠含有一种或多种药剂，如与珠的表面偶联、缀合或连接(直接或间接)的药剂。在一些实施方案中，如本文考虑的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质凝集素或具有对所需靶标的亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，所需靶标是T细胞受体和/或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，所需靶标是CD3。在某些实施方案中，所需靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。所述一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附接至珠上。所述附接可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附接手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以经由直接附接至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附接至珠上。
在一些实施方案中，刺激试剂含有珠和一种或多种直接与细胞表面上的大分子相互作用的药剂。在某些实施方案中，珠(例如顺磁珠)经由对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如抗体)与所述细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如顺磁珠)用本文所述的第一药剂(如一抗(例如抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，并且然后添加第二药剂(如二抗(例如生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如链霉亲和素))，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性地结合。
在一些实施方案中，刺激试剂含有一种或多种药剂(例如抗体)，所述一种或多种药剂附接至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性地结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54(ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附接至珠(例如顺磁珠)的药剂(例如抗体)与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性地结合：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。
在一些实施方案中，附接至珠的一种或多种药剂是抗体。所述抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段。应当理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文考虑的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种(例如，鼠类物种)获得。在一些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，所述药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别共受体的抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD28抗体。在一些实施方案中，珠的直径大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm或大于约1000μm且不超过约1500μm。在一些实施方案中，珠的直径为约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在一些实施方案中，珠的直径为至少或至少约或约0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm或20μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约4.5μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约2.8μm。
在一些实施方案中，珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3或大于5g/cm3。在一些实施方案中，珠的密度在约0.001g/cm3与约100g/cm3、约0.01g/cm3与约50g/cm3、约0.1g/cm3与约10g/cm3、约0.1g/cm3与约.5g/cm3、约0.5g/cm3与约1g/cm3、约0.5g/cm3与约1.5g/cm3、约1g/cm3与约1.5g/cm3、约1g/cm3与约2g/cm3或约1g/cm3与约5g/cm3之间。在一些实施方案中，珠的密度为约0.5g/cm3、约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3、或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在特定实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约1.3g/cm3。
在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包含平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准差。
在一些实施方案中，珠的表面积在约0.001m2/每克颗粒(m2/g)至约1,000m2/g、约.010m2/g至约100m2/g、约0.1m2/g至约10m2/g、约0.1m2/g至约1m2/g、约1m2/g至约10m2/g、约10m2/g至约100m2/g、约0.5m2/g至约20m2/g、约0.5m2/g至约5m2/g或约1m2/g至约4m2/g之间。在一些实施方案中，颗粒或珠的表面积为约1m2/g至约4m2/g。
在一些实施方案中，珠在珠的表面处或附近含有可以与药剂偶联、连接或缀合的至少一种材料。在一些实施方案中，珠是表面官能化的，即包含能够与结合分子(例如，多核苷酸或多肽)形成共价键的官能团。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的羧基、氨基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基和/或氯甲基。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的琼脂糖和/或琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，珠表面包含附接的刺激试剂，所述刺激试剂可以结合或附接结合分子。在特定实施方案中，生物分子是多肽。在一些实施方案中，珠包含表面暴露的蛋白质A、蛋白质G或生物素。
在一些实施方案中，珠在磁场中反应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在特定实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不展示任何磁性特性，除非使它们暴露于磁场。
在特定实施方案中，珠包含磁核、顺磁核或超顺磁核。在一些实施方案中，磁核含有金属。在一些实施方案中，所述金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任何组合。在某些实施方案中，磁核包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如，CoTaZn)。在一些实施方案中，磁核包含铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，磁核包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁核包含磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)中的一种或多种。在一些实施方案中，内核包含氧化铁(例如，Fe3O4)。
在某些实施方案中，珠含有被表面官能化包衣(coat或coating)覆盖的磁核、顺磁核和/或超顺磁核。在一些实施方案中，包衣可以含有这样的材料，所述材料可以包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外包衣(coat或coating)包含聚苯乙烯。在特定实施方案中，外包衣是表面官能化的。
在一些实施方案中，刺激试剂包含珠，所述珠含有金属氧化物核(例如，氧化铁核)和包衣，其中所述金属氧化物核包含至少一种多糖(例如，葡聚糖)，并且其中所述包衣包含至少一种多糖(例如，氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(例如，聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物核是胶体氧化铁核。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约10μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在某些实施方案中，珠的直径为约3.5μm。
在一些实施方案中，刺激试剂包含附接至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和包衣(例如，保护包衣)，其中所述包衣包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁性(例如，超顺磁性)珠，其包含顺磁性(例如，超顺磁性)铁核(例如，包含磁铁矿(Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯包衣(coat或coating)。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠含有与所述一种或多种药剂附接的官能化表面。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠在表面上共价结合。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。在一些实施方案中，刺激试剂是或包括抗CD3/抗CD28磁珠。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体，以及能够与标记的抗体(例如，生物素化的抗体，如标记的抗CD3或抗CD28抗体)结合的抗体或其抗原片段。在某些实施方案中，珠具有约1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中；珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，珠是单分散的超顺磁珠，其具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度。
在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物与刺激试剂以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2:1的珠与细胞的比率一起孵育。在特定实施方案中，所述珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2:1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与0.9:1之间。在特定实施方案中，所述刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1:1。
2.刺激试剂从细胞中的去除
在某些实施方案中，将刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)从细胞中去除和/或分离。在不希望受理论束缚的情况下，特定的实施方案考虑，在一些情况下，在孵育期间，刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合可能随着时间而减少。在某些实施方案中，可以添加一种或多种药剂以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。在特定实施方案中，细胞培养条件(例如培养基温度或pH)的改变可以减少刺激试剂与细胞之间的结合和/或缔合。因此，在一些实施方案中，可以将刺激试剂与细胞分开地从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除，例如不会将细胞也从孵育、细胞培养系统和/或溶液中去除。
用于从细胞中去除刺激试剂(例如作为或含有颗粒如珠颗粒或可磁化颗粒的刺激试剂)的方法是已知的。在一些实施方案中，可以使用竞争性抗体(如未标记的抗体)的使用，其例如与刺激试剂的一抗结合并改变所述一抗对其细胞上的抗原的亲和力，从而允许温和脱离。在一些情况下，在脱离之后，竞争性抗体可以保持与颗粒(例如珠颗粒)缔合，而未反应的抗体被洗掉或可以被洗掉，并且细胞不含分离、选择、富集和/或激活抗体。这种试剂的例子是DETACaBEAD(Friedl等人1995；Entschladen等人1997)。在一些实施方案中，可以在可切割接头(例如DNA接头)存在下去除颗粒(例如珠颗粒)，由此使颗粒结合的抗体缀合至接头(例如，CELLection，Dynal)。在一些情况下，接头区提供了可切割位点，以在分离之后例如通过添加DNA酶或其他释放缓冲液从细胞中去除颗粒(例如珠颗粒)。在一些实施方案中，还可以采用其他酶促方法从细胞释放颗粒(例如珠颗粒)。在一些实施方案中，颗粒(例如珠颗粒或可磁化颗粒)是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述刺激试剂是磁性的、顺磁性的和/或超顺磁性的，和/或含有磁珠、顺磁珠和/或超顺磁珠，并且可以通过将细胞暴露于磁场来将刺激试剂从细胞中去除。含有用于产生磁场的磁体的合适设备的例子包括DynaMag CTS(Thermo Fisher)、磁分离器(Takara)和EasySep磁体(Stem Cell Technologies)。
在特定实施方案中，在完成所提供的方法之前，例如，在收获、收集和/或配制通过本文提供的方法产生的工程化细胞之前，将刺激试剂从细胞中去除或分离。在一些实施方案中，在工程化(例如转导或转染)细胞之前，将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化细胞的步骤之后，将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在培育细胞之前，例如，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经工程化，例如经转染或转导的细胞之前，将刺激试剂去除。
在某些实施方案中，在一定时间量之后将刺激试剂从细胞分离和/或去除。在特定实施方案中，所述时间量是从开始和/或起始在刺激条件下孵育起的时间量。在特定实施方案中，认为在或大约在细胞与刺激试剂和/或含有刺激试剂的培养基或溶液接触时开始孵育。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内或者约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内将刺激试剂从细胞中去除或分离。在特定实施方案中，在开始或起始孵育后9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天或者约9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在开始或起始孵育后168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时或者约168小时、162小时、156小时、144小时、138小时、132小时、120小时、114小时、108小时、102小时或96小时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在开始和/或起始孵育后5天或约5天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。在一些实施方案中，在开始和/或起始孵育后4天或约4天时将刺激试剂从细胞中去除和/或分离。
C.工程化细胞
在一些实施方案中，所提供的方法涉及向患有疾病或病症的受试者给予表达重组抗原受体的细胞。用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
表达所述受体并且通过所提供的方法给予的细胞包括工程化细胞。基因工程化通常涉及将编码重组或工程化组分的核酸如通过逆转录病毒转导、转染或转化引入含有所述细胞的组合物中。
在一些实施方案中，本文所提供的方法与工程化经富集T细胞的一种或多种组合物结合使用。在某些实施方案中，工程化是或包括引入多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如章节II中描述的任何受体。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，在如通过章节I-D中提供的方法例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞之前，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化，例如转导或转染。在特定实施方案中，在所述一种或多种组合物已经在刺激条件(如在章节I.B中提供的方法中所述)下被刺激、激活和/或孵育之后，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是经刺激组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种经刺激组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在工程化之前解冻。
在某些实施方案中，所述经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的两种单独组合物如在如上所述的刺激条件下孵育之后分别基因工程化。在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物基因工程化。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在基因工程化之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD4+ T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD4+ T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD8+ T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD8+ T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且基因工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成基因工程化之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独工程化组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独组合物(如经刺激DD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)分别工程化，并且在已经进行和/或完成基因工程化之后分别处理以进行T细胞的培育和/或扩增。
在一些实施方案中，多核苷酸，例如编码重组蛋白的重组多核苷酸的引入通过使经富集CD4+或CD8+ T细胞(如经刺激CD4+或CD8+ T细胞)与含有所述多核苷酸的病毒颗粒接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(spinoculation)(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)，如为或为约693g的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与测量RCF的物体、物质或颗粒之间的距离)。在一些实施方案中，所述细胞(例如来自经富集CD4+ T细胞或经富集CD8+ T细胞的经刺激组合物的细胞)与病毒进行的接触、孵育和/或工程化的至少一部分在约100g与3200g、1000g与2000g、1000g与3200g、500g与1000g、400g与1200g、600g与800g、600g与700g或500g与700g之间的旋转下进行。在一些实施方案中，旋转在600g与700g之间，例如在或在约693g下进行。
在某些实施方案中，所述工程化、转导和/或转染的至少一部分在旋转，例如旋转接种和/或离心下进行。在一些实施方案中，将旋转进行、进行约、或进行至少或至少约5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、1形式、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、2天、3天、4天、5天、6天，或进行至少7天。在一些实施方案中，将旋转进行或进行约60分钟。在某些实施方案中，将旋转进行约30分钟。在一些实施方案中，将旋转在600g至700g之间，例如在或在约693g下进行约30分钟。
在某些实施方案中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量的范围为从约5x106个细胞至约100x 107个细胞，如从约10x 106个细胞至约100x 106个细胞、从约100x 106个细胞至约200x 106个细胞、从约200x 106个细胞至约300x 106个细胞、从约300x 106个细胞至约400x 106个细胞、从约400x 106个细胞至约500x 106个细胞或从约500x 106个细胞至约100x 107个细胞。在特定例子中，待工程化、转导和/或转染的活细胞的数量为约或少于约300x106个细胞。
在某些实施例中，所述工程化、转导和/或转染的至少一部分在如下体积(例如，旋转接种体积)下进行，所述体积从约5mL至约100mL，如从约10mL至约50mL、从约15mL至约45mL、从约20mL至约40mL、从约25mL至约35mL，或为或为约30mL。在某些实施方案中，旋转接种后的细胞团粒体积的范围为从约1mL至约25mL，如从约5mL至约20mL、从约5mL至约15mL、从约5mL至约10mL，或为或为约10mL。
在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的)的刺激物进行组合，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如通过章节I-B中所述的方法中的任一种。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
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和
Figure BDA0002556464920000591
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，系统包括有其他仪器和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在所述系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独的容器(如同一袋或单独的袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。旋转可以在结合细胞转导的孵育之前、期间和/或之后进行，和/或在一个或多个其他处理步骤中进行。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，在将组合物提供至空腔之前，可以将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气合并或混合。在一些实施方案中，将含有细胞的组合物和含有病毒载体颗粒的组合物以及任选的空气分别提供在空腔中并且在其中合并和混合。在一些实施方案中，可以以任何顺序将含有细胞的组合物、含有病毒载体颗粒的组合物和任选的空气提供至内部空腔。在此类一些实施方案中的任一种中，含有细胞和病毒载体颗粒的组合物是曾经合并或混合在一起的输入组合物，不论所述输入组合物是在离心室内部还是外部合并和/或混合，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是分别(如同时还是依次)提供至离心室。
在一些实施方案中，在转导方法中，在孵育细胞和病毒载体颗粒(如旋转)之前进行一定体积的气体(如空气)的摄入。在一些实施方案中，在转导方法中在细胞和病毒载体颗粒的孵育(如旋转)期间进行一定体积的气体(如空气)的摄入。
在一些实施方案中，构成转导组合物的细胞或病毒载体颗粒的液体体积以及任选的空气体积可以是预定体积。所述体积可以是被编程到系统中和/或由与所述系统相关联的电路控制的体积。
在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动控制转导组合物和任选的气体(如空气)的摄入，直到所需或预定体积已引入所述室的内部空腔中。在一些实施方案中，与所述系统相关联的传感器可以检测流入和流出离心室的液体和/或气体，如经由其颜色、流速和/或密度来检测，并且可以与相关的电路通讯以根据需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预定体积的摄入。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而不能够检测气体(例如，空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(如空气)通入至系统中。在一些此类实施方案中，当需要摄入气体(如空气)时，可以在传感器附近的管线中放置一条不透明的管件。在一些实施方案中，可以手动控制气体(如空气)的摄入。
在所提供的方法的方面中，使离心室的内部空腔经历高速旋转。在一些实施方案中，旋转在摄入液体输入组合物和任选的空气之前、同时、随后或间歇地实现。在一些实施方案中，旋转在摄入液体输入组合物和任选的空气之后实现。在一些实施方案中，旋转是通过使离心室以为或为约或至少或至少约800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3500g或4000g的内部空腔侧壁内表面处和/或细胞表面层处的相对离心力离心来进行的。在一些实施方案中，旋转是通过以大于或大于约1100g，如大于或大于约1200g、大于或大于约1400g、大于或大于约1600g、大于或大于约1800g、大于或大于约2000g、大于或大于约2400g、大于或大于约2800g、大于或大于约3000g或大于或大于约3200g的力离心来进行的。在一些实施方案中，旋转是通过以为或为约1600g的力离心来进行的。
在一些实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物和任选的空气在离心室中旋转或离心大于或大于约5分钟，如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或大于或大于约120分钟。在一些实施方案中，使转导组合物和任选的空气在离心室中旋转或离心大于5分钟，但不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心60分钟或约60分钟。
在一些实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物和任选的空气在离心室中旋转或离心以下时间：在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且所述旋转或离心是以至少或大于或约1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g的内部空腔侧壁内表面处和/或细胞表层处的力来进行的。在特定实施方案中，所述转导方法包括使转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以1600g或约1600g旋转或离心60分钟或约60分钟。
在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(如空气)从室排出。在一些实施方案中，将气体(如空气)排出至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器。在一些实施方案中，所述容器是空闲或空容器。在一些实施方案中，将室的空腔中的空气(如气体)通过过滤器排出，所述过滤器经由无菌管线可操作地连接至离心室的内部空腔。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔压出含有经孵育细胞和病毒载体颗粒(如已起始转导的细胞或已用病毒载体转导的细胞)的输出组合物之前、同时、间歇地或之后，从室排出空气。
在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为连续或半连续过程的一部分来进行。在一些实施方案中，连续过程涉及在孵育的至少一部分期间，例如在离心时，在器皿中连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为预先存在的单一组合物或通过将其部分连续吸入同一器皿，例如空腔中，且由此混合)，和/或自器皿连续压出或排出液体且任选地排出气体(如空气)。在一些实施方案中，连续摄入和连续压出至少部分同时进行。在一些实施方案中，连续摄入在孵育的一部分期间，例如在离心的一部分期间进行，并且连续压出在孵育的单独部分期间进行。两者可交替进行。因此，在进行孵育时连续摄入和压出可以允许处理(例如转导)更大的样品总体积。
在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在所述孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，以及在所述孵育的一部分期间，实现在室旋转期间通过至少一个开口自空腔连续压出液体及任选地排出气体(例如空气)。
在一些实施方案中，半连续孵育通过以下方式来进行：在实现将组合物摄入空腔中、孵育、自空腔压出液体以及任选地自空腔排出气体(例如空气)，如排除至输出容器中，与之后摄入含有更多细胞及其他试剂(例如病毒载体颗粒)用于处理的后续(例如第二、第三等)组合物之间交替，且重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现将转导组合物通过所述至少一个开口摄入空腔中，及在孵育之后，实现自空腔压出流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一转导组合物摄入所述内部空腔中；以及在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一转导组合物，由此使所述另一转导组合物中的所述细胞被所述载体转导。所述过程可以重复方式再继续进行数轮。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。
在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。
在一些实施方案中，所述方法包括孵育，其中细胞和病毒载体颗粒的孵育的另一部分在无旋转或离心的情况下进行，所述另一部分一般在孵育的包括室的旋转或离心的所述至少一部分之后进行。在某些实施方案中，细胞和病毒载体颗粒的孵育在无旋转或离心的情况下进行至少1小时、6小时、12小时、24小时、32小时、48小时、60小时、72小时、90小时、96小时、3天、4天、5天或大于5天。在某些实施方案中，将孵育72小时或约72小时。
在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。熟练技术人员可以熟练地评估或确定孵育是否已使得病毒载体颗粒整合至宿主基因组中，且因此凭经验确定进一步孵育的条件。在一些实施方案中，病毒载体到宿主基因组中的整合可以通过测量在孵育后由基因组中所含的病毒载体颗粒的核酸编码的重组蛋白(如异源蛋白)的表达水平来评估。可以使用用于评估重组分子的表达水平的多种熟知方法，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报告物构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从100g至3200g或从约100g至约3200g(例如为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，所述力如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与测量RCF的物体、物质或颗粒之间的距离)。
在一些实施方案中，在基因工程化(例如转导)的至少一部分期间，和/或在基因工程化之后，将细胞转移到生物反应器袋组件，以用于培养经基因工程化的细胞，如用于培育或扩增细胞，如上所述。
在某些实施方案中，在转导佐剂存在下工程化，例如转导或转染经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子存在下工程化经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种转导佐剂存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种转导佐剂存在下转染，例如与非病毒载体一起孵育经富集T细胞的组合物。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在诸如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种转导佐剂的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在转导佐剂不存在下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组转导佐剂。
在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的转导佐剂存在下工程化经富集细胞的组合物。在某些实施方案中，适用于所提供的方法的转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或源自纤连蛋白的片段或变体、RetroNectin及其组合。
在一些实施方案中，在细胞因子，例如重组人细胞因子存在下工程化所述细胞，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与1,000IU/ml之间、在10IU/ml与50IU/ml之间、在50IU/ml与100IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与1,000IU/ml之间。
在一些实施方案中，在IL-2，例如人重组IL-2存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度在1IU/ml与200IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与150IU/ml之间、在80IU/ml与120IU/ml之间、在60IU/ml与90IU/ml之间或在70IU/ml与90IU/ml之间。在特定实施方案中，在重组IL-2存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-2的浓度为或为约50IU/ml、55IU/ml、60IU/ml、65IU/ml、70IU/ml、75IU/ml、80IU/ml、85IU/ml、90IU/ml、95IU/ml、100IU/ml、110IU/ml、120IU/ml、130IU/ml、140IU/ml或150IU/ml。在一些实施方案中，在或在约85IU/ml存在下工程化所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述T细胞群是CD4+ T细胞群。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD8+ T细胞，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-7，例如人重组IL-7存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-7的浓度在100IU/ml与2,000IU/ml之间、在500IU/ml与1,000IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml之间、在500IU/ml与750IU/ml之间、在750IU/ml与1,000IU/ml之间或在550IU/ml与650IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-7存在下工程化所述经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约50IU/ml、100IU/ml、150IU/ml、200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml、450IU/ml、500IU/ml、550IU/ml、600IU/ml、650IU/ml、700IU/ml、750IU/ml、800IU/ml、750IU/ml、750IU/ml、750IU/ml或1,000IU/ml。在特定实施方案中，在或在约600IU/ml的IL-7存在下工程化所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，在重组IL-7存在下工程化的所述组合物富集T细胞，例如CD4+ T细胞的群体。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，在重组IL-15，例如人重组IL-15存在下工程化经富集T细胞的组合物，所述重组IL-5的浓度在0.1IU/ml与100IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间或在10IU/ml与100IU/ml之间。在特定实施方案中，在IL-15存在下工程化所述经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml或50IU/ml。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/mlIL-15中工程化。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物在或在约10IU/ml重组IL-15中孵育。在一些实施方案中，在重组IL-15存在下工程化的所述组合物富集T细胞，例如CD4+ T细胞和/或CD8+ T的群体。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD8+ T细胞，其中CD4+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物富集CD4+ T细胞，其中CD8+ T细胞未被富集并且/或其中从所述组合物阴性选择或耗尽CD8+ T细胞。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15存在下工程化经富集CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15存在下工程化经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，在一种或多种抗氧化剂存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于，一种或多种抗氧化剂包括生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育醌、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-二甲酸)、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、类黄酮、异黄酮、番茄红素、β-胡萝卜素、硒、泛醌、梅毒菌素、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、柠檬酸、L-肉碱、BHT、硫代甘油、抗坏血酸、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、胱胺和胱硫醚和/或甘氨酸-甘氨酸-组氨酸。
在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫氧化剂。在某些实施方案中，含硫抗氧化剂可以包括含硫醇抗氧化剂和/或例如在环结构内展现出一个或多个硫部分的抗氧化剂。在一些实施方案中，所述含硫抗氧化剂可以包括例如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和2,3-二巯基丙醇(DMP)、L-2-氧代-4-噻唑烷甲酸酯(OTC)和硫辛酸。在特定实施方案中，所述含硫抗氧化剂是谷胱甘肽前体。在一些实施方案中，所述谷胱甘肽前体是可以在细胞内的一个或多个步骤中被修饰成衍生的谷胱甘肽的分子。在特定实施方案中，谷胱甘肽前体可以包括但不限于N-乙酰半胱氨酸(NAC)、L-2-氧代噻唑烷-4-甲酸(丙半胱氨酸(Procysteine))、硫辛酸、S-烯丙基半胱氨酸或甲基甲硫氨酸锍氯化物。
在一些实施方案中，在一种或多种抗氧化剂存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1 500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的所述一种或多种抗氧化剂存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的所述一种或多种抗氧化剂存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括含硫抗氧化剂。在特定实施方案中，所述一种或多种抗氧化剂是或包括谷胱甘肽前体。
在一些实施方案中，在NAC存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在1ng/ml与100ng/ml之间、10ng/ml与1μg/ml之间、100ng/ml与10μg/ml之间、1μg/ml与100μg/ml之间、10μg/ml与1mg/ml之间、100μg/ml与1mg/ml之间、1,500μg/ml与2mg/ml、500μg/ml与5mg/ml之间、1mg/ml与10mg/ml之间或1mg/ml与100mg/ml之间的NAC存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在为或为约1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml的NAC存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，用或用约0.8mg/ml工程化所述细胞。
在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子存在下工程化经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在一种或多种聚阳离子存在下转导，例如与病毒载体颗粒一起孵育经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在一种或多种聚阳离子存在下转染，例如与非病毒载体一起孵育经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在诸如通过增加组合物中工程化(例如，转导或转染)的细胞的量、部分和/或百分比来增加基因递送的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转染的效率。在某些实施方案中，一种或多种聚阳离子的存在增加了转导的效率。在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化的细胞的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％含有或表达重组多核苷酸。在一些实施方案中，与在转导佐剂不存在下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在聚阳离子存在下，组合物中多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的细胞被工程化为含有或表达重组多核苷酸。
在某些实施方案中，例如，相对于在聚阴离子存在下工程化细胞的示例性和/或替代性方法，在低浓度或量的聚阳离子存在下工程化所述经富集细胞的组合物，例如经富集CD4+ T细胞或经富集CD8+ T细胞(如其经刺激T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在小于90％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于25％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1％、小于0.1％或小于0.01％的用于工程化细胞的示例性和/或替代性方法的聚阳离子的量或浓度的存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，在小于100μg/ml、小于90μg/ml、小于80μg/ml、小于75μg/ml、小于70μg/ml、小于60μg/ml、小于50μg/ml、小于40μg/ml、小于30μg/ml、小于25μg/ml、小于20μg/ml或小于μg/ml、小于10μg/ml的所述聚阳离子存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或为约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml或50μg/ml的所述聚阳离子存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在聚阳离子存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物减少了细胞死亡(例如因坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡所致)的量。在一些实施方案中，在低量聚阳离子(例如小于100μg/ml、50μg/ml或10μg/ml)存在下工程化所述经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物，并且在完成工程化步骤后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的细胞存活，例如未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在一些实施方案中，与在较高量或浓度的聚阳离子(例如，超过50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml或1,000μg/ml)存在下工程化细胞的替代性和/或示例性方法相比，在低浓度或量的聚阳离子存在下工程化所述组合物，并且与经历所述示例性和/或替代性过程的细胞相比，所述组合物的细胞具有大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍的存活率。
在一些实施方案中，所述聚阳离子带正电荷。在某些实施方案中，所述聚阳离子降低细胞与载体(例如病毒或非病毒载体)之间的斥力，并且介导载体与细胞表面的接触和/或结合。在一些实施方案中，所述聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。
在特定实施方案中，所述聚阳离子是硫酸鱼精蛋白。在一些实施方案中，在小于或约500μg/ml、小于或约400μg/ml、小于或约300μg/ml、小于或约200μg/ml、小于或约150μg/ml、小于或约100μg/ml、小于或约90μg/ml、小于或约80μg/ml、小于或约75μg/ml、小于或约70μg/ml、小于或约60μg/ml、小于或约50μg/ml、小于或约40μg/ml、小于或约30μg/ml、小于或约25μg/ml、小于或约20μg/ml或小于或约15μg/ml或小于或约10μg/ml的硫酸鱼精蛋白存在下工程化所述经富集T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，在为或为约1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、105μg/ml、110μg/ml、115μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、135μg/ml、140μg/ml、145μg/ml或150μg/ml的硫酸鱼精蛋白存在下工程化所述经富集细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞或经刺激CD8+ T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD4+ T细胞)的工程化组合物包含至少40％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的所述经富集CD4+ T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD4+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经工程化的所述经富集CD8+ T细胞，如经刺激T细胞(例如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，经工程化的所述经富集CD8+ T细胞，如经刺激T细胞(如经刺激CD8+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，工程化所述细胞包括与载体，例如病毒载体或非病毒载体一起培养、接触或孵育。在某些实施方案中，所述工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，进行、进行约或进行至少4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或超过7天。在特定实施方案中，所述工程化包括将细胞与载体一起培养、接触和/或孵育，持续或持续约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时，或持续或持续约2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，将所述工程化步骤进行或进行约24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或84小时。在某些实施方案中，将所述工程化进行约60小时或约84小时，进行或进行约72小时，或进行或进行约2天。
在一些实施方案中，所述工程化是在从约25℃至约38℃，如从约30℃至约37℃、从约36℃至约38℃，或为或为约37℃±2℃的温度下进行。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在从约2.5％至约7.5％，如从约4％至约6％，例如为或为约5％±0.5％的CO2水平下工程化。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在为或为约37℃的温度下和/或在为或为约5％的CO2水平下工程化。
在一些实施方案中，在进行用于基因工程化例如转导或转染细胞(例如CD4+和/或CD8+ T细胞)以含有编码重组受体的多核苷酸的一个或多个步骤之后，培育所述细胞。在一些实施方案中，培育可以包括培养、孵育、刺激、激活、扩增和/或繁殖。在一些此类实施方案中，进一步培育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于以下的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，进一步孵育是在高于室温的温度下进行，所述温度为例如高于或高于约25℃，例如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃。在一些实施方案中，进一步孵育是在为或为约37℃±2℃的温度下，例如在为或为约37℃的温度下实现。
在一些实施方案中，进一步孵育是在用于刺激和/或激活细胞的条件下进行，所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如刺激性和/或辅助性药剂)，例如配体。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，例如是适于递送初级信号以例如启动ITAM诱导的信号(例如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂，和/或促进共刺激信号(例如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如，其任选地结合至固体支持物如珠)和/或一种或多种细胞因子。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，
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M-450CD3/CD28T细胞扩增器和/或
Figure BDA0002556464920000722
珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，进一步孵育是在进行接触的相同容器或设备中进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在没有旋转或离心的情况下进行，这通常是在旋转下(例如与离心或旋转接种结合)进行的孵育的至少一部分之后进行。在一些实施方案中，进一步孵育是在固定相之外进行，例如在色谱基质之外、例如在溶液中进行。
在一些实施方案中，进一步孵育是在与进行接触的容器或设备不同的容器或设备中进行，例如通过将细胞组合物在与病毒颗粒和试剂接触之后转移(例如自动转移)至不同的容器或设备中。
在一些实施方案中，进一步培养或孵育例如以促进离体扩增进行大于或大于约24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，进一步培养或孵育进行不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天或不超过24小时。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或约至少或约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
在一些实施方案中，本文所提供的方法不包括进一步培养或孵育，例如，不包括离体扩增步骤，或者包括显著更短的离体扩增步骤。
在一些实施方案中，在工程化之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在特定实施方案中，在工程化之后将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，所述刺激性试剂是在章节I-B-1中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如章节I-B-2中所述将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。
1.载体和方法
还提供了编码重组受体的一种或多种多核苷酸(例如，核酸分子)、用于根据所提供的用于产生所述工程化细胞的方法将细胞基因工程化以表达此类受体的载体。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:61中所示并且由SEQID NO:60中所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽、SEQ ID NO:59中所示的CD8α信号肽或SEQ ID NO:58中所示的CD33信号肽。
在一些实施方案中，载体包括病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)、非病毒载体或转座子，例如Sleeping Beauty转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
a.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸、用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801UniversityBlvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸、用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有3'长末端重复序列(LTR)中的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以被病毒构建体中的启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包含增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身来防止整合，例如通过使一个或两个附接位点突变或缺失，或通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤段(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传方法；这些方法包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点二者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体也可含有如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择的标记，例如抗药性。
病毒载体基因组通常以可以转染到包装细胞系或生产细胞系中的质粒形式构建。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括生成病毒载体颗粒所必需的结构蛋白以及酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这减少或消除了通过重组而重构野生型病毒的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了原本可能生成有复制能力的病毒的重组事件的可能性。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式需要的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCCCCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许将重组质粒的RNA转录物包装至病毒颗粒中，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并由本领域技术人员使用标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，组合物中待转导的细胞的浓度为从1.0x 105个细胞/mL至1.0x 108个细胞/mL或从约1.0x 105个细胞/mL至约1.0x 108个细胞/mL，如止水或约至少或约1.0x 105个细胞/mL、5x 105个细胞/mL、1x 106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或为约或至少或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x 106IU/mL与1x 108IU/mL之间，例如在或在约5x 10 6IU/mL与5x 107IU/mL之间，例如至少6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x 106IU/mL、9x 106IU/mL、1x 107IU/mL、2x 107IU/mL、3x 107IU/mL、4x 107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100、例如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或一起孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少或约30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从0.5mL至500mL或从约0.5mL至约500mL，如从或从约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，将细胞与病毒载体颗粒一起孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
b.非病毒载体
在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，将重组核酸经由转座子转移到T细胞中。转座子(转座元件)是可以从基因组内的一个基因座移动到另一个基因座的DNA可移动区段。这些元件经由保守的“剪切粘贴”机制移动：转座酶催化转座子从其原始位置切除，并促进其在基因组中的其他位置的重新整合。如果转座酶是由另一个转座酶基因提供，则可以动员缺乏转座酶的元件。因此，可以将转座子用于将外来DNA掺入宿主基因组中而无需使用病毒转导系统。适合于与哺乳动物细胞(例如人原代白细胞)一起使用的转座子的例子包括但不限于SleepingBeauty和Piggybac。
基于转座子的转染是由转座酶和转座子组成的两组分系统。在一些实施方案中，所述系统包含转座子，所述转座子被工程化以包含外来DNA(本文也称为货物(cargo)DNA)(例如编码重组受体的基因)，其侧翼为由伴随的转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。在一些实施方案中，非病毒质粒编码在启动子的控制下的转座酶。将质粒转染到宿主细胞中导致转座酶的瞬时表达，由此在转染后的最初时期中，转座酶以足够水平表达以将转座子整合到基因组DNA中。在一些实施方案中，转座酶本身不整合到基因组DNA中，并且因此转座酶的表达随时间推移降低。在一些实施方案中，转座酶表达由宿主细胞以足以整合相应转座子的水平表达，持续以下时间：少于约4小时、少于约8小时、少于约12小时、少于约24小时、少于约2天、少于约3天、少于约4天、少于约5天、少于约6天、少于约7天、少于约2周、少于约3周、少于约4周、少于约周、或少于约8周。在一些实施方案中，引入宿主基因组中的货物DNA随后不会从宿主基因组中被去除，至少是因为宿主不表达能够切除货物DNA的内源转座酶。
Sleeping Beauty(SB)是转座子的Tc/1-水手超家族的合成成员，是由鲑科鱼基因组中具有的休眠元件重新构建的。基于SB转座子的转染是一个由转座酶和转座子组成的两组分系统，所述转座子含有导致精确整合到TA二核苷酸中的反向重复/同向重复(IR/DR)序列。将转座子设计成具有侧翼为IR/DR的目的表达盒。SB转座酶结合位于Sleeping Beauty转座子IR上的特异性结合位点。SB转座酶介导转座子的整合，所述转座子是编码货物序列的可移动元件，在所述货物序列的两侧都侧接具有催化性酶(SB)结合位点的反向末端重复序列。当SB通过剪切粘贴机制将基因序列在TA靶二核苷酸处插入脊椎动物染色体中时，获得稳定的表达。已将此系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代外周血白细胞。在一些实施方案中，将细胞与SB转座子接触、与SB转座子一起孵育和/或用SB转座子处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码重组受体或CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SBIR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含SB转座子的质粒接触、与包含SB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含SB转座子的质粒处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含编码侧翼没有SB IR序列的SB转座酶的基因。
PiggyBac(PB)是可以用于将货物DNA整合到宿主(例如人)的基因组DNA中的另一种转座子系统。PB转座酶识别位于转座子两个末端的PB转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且高效地将内容物从原始位点移出并将所述内容物高效地整合到TTAA染色体位点中。PB转座子系统使得能够将PB载体中两个ITR之间的目的基因动员到靶基因组中。已将PB系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代细胞。在一些实施方案中，将待转染的细胞与PB转座子接触、与PB转座子一起孵育、和/或用PB转座子处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含PB转座子的质粒接触、与包含PB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含PB转座子的质粒处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含编码侧翼没有PB IR序列的SB转座酶的基因。
在一些实施方案中，可以通过限制酶切割、连接和分子克隆的标准方法来产生用于主题方法中的转座子/转座酶的各种元件，例如一种或多种SB或PB载体。用于构建主题载体的一种方案包括以下步骤。首先，用来自初始来源(例如包含转座酶基因的载体)的限制性核酸内切酶切割经纯化的核酸片段，所述核酸片段含有所需组分核苷酸序列以及外部序列。然后使用常规分离方法(例如通过琼脂糖凝胶电泳)将含有所需核苷酸序列的片段与不同大小的不需要片段分离。将所需片段从凝胶上切下，并以适当的构型连接在一起，从而产生含有所需序列(例如对应于如上所述的主题载体的各种元件的序列)的环状核酸或质粒。然后，在需要的情况下，在原核宿主(例如大肠杆菌)中扩增如此构建的环状分子。这些步骤中涉及的切割、质粒构建、细胞转化和质粒产生的程序对本领域技术人员而言是熟知的，并且限制性酶切和连接所需的酶可商购获得。(参见，例如R.Wu,Ed.,Methods inEnzymology,第68卷,Academic Press,纽约(1979)；T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约(1982)；目录号1982-83,New EnglandBiolabs,Inc.；目录号1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc。如何构建主题方法中采用的载体的例子提供于下文的实验章节中。在WO 98/40510和WO 99/25817中也披露了代表性的Sleeping Beauty转座子系统的制备)。
在一些实施方案中，用转座子转导是用包含转座酶基因的质粒和包含转座子的质粒进行，所述转座子含有侧翼为由转座酶识别的反向重复/同向重复(IR/DR)序列的货物DNA序列。在某些实施方案中，货物DNA序列编码异源蛋白，例如重组T细胞受体或CAR。在一些实施方案中，质粒包含转座酶和转座子。在一些实施方案中，转座酶在遍在启动子或适合于驱动转座酶在靶细胞中表达的任何启动子的控制下。遍在启动子包括但不限于EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa和U6。在一些实施方案中，货物DNA包含选择盒，所述选择盒允许选择将货物DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。合适的选择盒包括但不限于编码以下的选择盒：卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、红霉素抗性基因和多粘菌素B抗性基因。
在一些实施方案中，将用于用转座子转导的组分(例如包含SB转座酶和SB转座子的质粒)引入靶细胞中。可以采用任何方便的方案，其中取决于靶细胞的位置，所述方案可以将系统组分体外或体内引入靶细胞中。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，可以例如通过使用标准转化技术，在容许靶细胞活力的细胞培养条件下将所述系统直接引入所述细胞中。此类技术包括但不必限于：病毒感染、转化、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995中找到。
在一些实施方案中，在一定条件下将SB转座子和SB转座酶来源引入多细胞生物体(例如哺乳动物或人)的靶细胞中，所述条件足以从携带转座子的载体切下侧翼为反向重复序列的核酸，并且随后将切下的核酸整合到靶细胞的基因组中。一些实施方案还包括确保靶细胞中存在必需的转座酶活性以及引入的转座子的步骤。取决于转座子载体本身的结构，即载体是否包括编码具有转座酶活性的产物的区域，所述方法还可以包括将编码必需转座酶活性的第二载体引入靶细胞中。
在一些实施方案中，包含转座子的载体核酸的量和编码引入细胞中的转座酶的载体核酸的量足以提供所需的将转座子核酸切下并插入靶细胞基因组中。这样，引入的载体核酸的量应提供足够量的转座酶活性和足够拷贝数的期望插入靶细胞中的核酸。引入靶细胞中的载体核酸的量取决于所采用的特定引入方案(例如所采用的特定离体给予方案)的效率而变化。
一旦载体DNA与必需的转座酶组合进入了靶细胞，就经由所提供的转座酶从载体上切下侧翼为反向重复序列的载体核酸区域(即位于Sleeping Beauty转座酶识别的反向重复序列之间的载体核酸)并将其插入靶细胞的基因组中。这样，在将载体DNA引入靶细胞中之后，随后进行转座酶介导的切除载体携带的外源核酸并将其插入靶细胞的基因组中。在特定实施方案中，载体整合到至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％至少7％至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、或至少20％的用SB转座子和/或SB转座酶转染的细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸整合到靶细胞基因组中是稳定的，即，载体核酸保持存在于靶细胞基因组中持续超过瞬时时间段，并且在一部分染色体遗传物质上传代至靶细胞的后代中。
在某些实施方案中，转座子用于将各种大小的核酸(即多核苷酸)整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约0.1kb至200kb、从约0.5kb至100kb、从约1.0kb至约8.0kb、从约1.0至约200kb、从约1.0至约10kb、从约10kb至约50kb、从约50kb至约100kb、或从约100kb至约200kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约200kb。在特定实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生富集T细胞的一种或多种培育组合物。
在某些实施方案中，在配制细胞之前，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(包括经刺激和经转导T细胞)的一种或多种组合物(如此类CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)。在一些方面，所述培育方法(如用于促进增殖和/或扩增)包括本文如在章节I-F中提供的方法。在特定实施方案中，在已对一种或多种经富集T细胞的组合物进行工程化(例如转导或转染)之后，培育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是工程化组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种工程化组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在培育之前解冻。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将引入有重组受体(例如CAR)的经富集T细胞的两种单独组合物在促进细胞的增殖和/或扩增的条件下分别培育，所述单独组合物是例如从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物。在一些实施方案中，所述条件是刺激条件。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD4+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞(如引入有编码重组受体的核酸和/或表达重组受体的工程化CD8+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞)的两种单独组合物例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。在一些实施方案中，培育经富集T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在培育之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经培育的经富集CD4+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+t细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用编码重组受体的重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)合并为单一组合物并且例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成培育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独培育的组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化CD4+和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。
在一些实施方案中，所述细胞，例如所述工程化细胞在一定体积的培养基中培育，所述体积为、为约或至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在一些实施方案中，以初始体积培育细胞，之后调整为不同体积。在特定实施方案中，在培育期间之后调整体积。在特定实施方案中，在培育期间从所述初始体积增加体积。在某些实施方案中，在培育期间，当细胞实现一定密度时增加体积。在某些实施方案中，所述初始体积为或为约500mL。
在特定实施方案中，在培育期间，当细胞实现一定密度或浓度时，从所述初始体积增加体积。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时增加体积：为、为约、或为至少0.1x 106个细胞/ml、0.2x 106个细胞/ml、0.4x 106个细胞/ml、0.6x 106个细胞/ml、0.8x 106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.4x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞实现为、为至少或为约0.6x 106个细胞/ml的密度和/或浓度时，从所述初始体积增加体积。在一些实施方案中，所述密度和/或浓度是培养物中活细胞的密度和/或浓度。在特定实施方案中，当细胞实现如下密度和/或浓度时增加体积：为、为约、或为至少0.1x 106个活细胞/ml、0.2x 106个活细胞/ml、0.4x 106个活细胞/ml、0.6x 106个活细胞/ml、0.8x 106个活细胞/ml、1x 106个活细胞/ml、1.2x 106个活细胞/ml、1.4x 106个活细胞/ml、1.6x 106个活细胞/ml、1.8x 106个活细胞/ml、2.0x 106个活细胞/ml、2.5x 106个活细胞/ml、3.0x 106个活细胞/ml、3.5x 106个活细胞/ml、4.0x 106个活细胞/ml、4.5x 106个活细胞/ml、5.0x 106个活细胞/ml、6x 106个活细胞/ml、8x 106个活细胞/ml或10x 106个活细胞/ml。在一些实施方案中，当活细胞实现为、为至少或为约0.6x 106个活细胞/ml的密度和/或浓度时，从所述初始体积增加体积。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，所述细胞实现一定密度和/或浓度，并且体积增加、增加约或增加至少100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在一些实施方案中，体积增加500mL。在特定实施方案中，体积增加到如下体积：为、为约或至少500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1,000mL、1,200mL、1,400mL、1,600mL、1,800mL、2,000mL、2,200mL或2,400mL。在某些实施方案中，体积增加到1,000mL的体积。在某些实施方案中，体积以如下速率增加：为、为至少或为约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟5mL、10mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、75mL、80mL、90mL或100mL。在某些实施方案中，所述速率为或为约每8分钟50mL。
在一些实施方案中，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以促进细胞生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在一些实施方案中，培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或为约37℃±2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、浓度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、浓度、数量或剂量的活细胞。在一些实施方案中，孵育进行如下时间：大于或大于约或为约或为24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。在一些实施方案中，可以在培育期间确定或监测细胞的密度、浓度和/或数量或剂量，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在培育之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在某些实施方案中，在工程化之后并且在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞之前将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。在一些实施方案中，所述刺激性试剂是本文例如在章节I-B-1中所述的刺激试剂。在特定实施方案中，如本文例如在章节I-B-2中所述将所述刺激试剂从所述细胞中去除和/或分离。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培育经富集T细胞，如工程化T细胞的组合物(例如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在特定实施方案中，将经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物用重组IL-2培育。在一些实施方案中，在重组IL-2存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物增加了所述组合物的CD4+ T细胞在培育步骤期间和整个所述过程中将继续存活、生长、扩增和/或激活的概率或可能性。在一些实施方案中，与未在重组IL-2存在下培育所述经富集CD4+ T细胞的组合物的替代性和/或示例性方法相比，在重组IL-2存在下培育所述经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物使得将从所述经富集CD4+ T细胞的组合物产生经富集CD4+ T细胞(例如适合于细胞疗法的工程化CD4+ T细胞)的输出组合物的概率和/或可能性增加至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％或至少200％CD4+。
在一些实施方案中，用细胞因子，例如重组人细胞因子培育所述细胞(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)，所述细胞因子的浓度在1IU/ml与2,000IU/ml之间、在10IU/ml与100IU/ml之间、在50IU/ml与500IU/ml之间、在100IU/ml与200IU/ml之间、在500IU/ml与1400IU/ml之间、在250IU/ml与500IU/ml之间或在500IU/ml与2,500IU/ml之间。
在一些实施方案中，用重组IL-2，例如人重组IL-2培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞的单独组合物)，所述重组IL-2的浓度在2IU/ml与500IU/ml之间、在10IU/ml与250IU/ml之间、在100IU/ml与500IU/ml或在100IU/ml与400IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-2培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-2的浓度为或为约50IU/ml、75IU/ml、100IU/ml、125IU/ml、150IU/ml、175IU/ml、200IU/ml、225IU/ml、250IU/ml、300IU/ml或400IU/ml。在一些实施方案中，用浓度为200IU/ml的重组IL-2培育所述经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞的组合物，如工程化CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，用IL-7，例如人重组IL-7培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)，所述IL-7的浓度在10IU/ml与5,000IU/ml之间、在500IU/ml与2,000IU/ml之间、在600IU/ml与1,500IU/ml之间、在500IU/ml与2,500IU/ml之间、在750IU/ml与1,500IU/ml之间或在1,000IU/ml与2,000IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-7培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-7的浓度为或为约100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml、400IU/ml、500IU/ml、600IU/ml、700IU/ml、800IU/ml、900IU/ml、1,000IU/ml、1,200IU/ml、1,400IU/ml或1,600IU/ml。在一些实施方案中，在浓度为或为约1,200IU/ml的重组IL-7存在下培育所述细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。
在一些实施方案中，用IL-15，例如人重组IL-15培育经富集T细胞的组合物(如工程化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)，所述IL-15的浓度在0.1IU/ml与200IU/ml之间、在1IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与25IU/ml之间、在25IU/ml与50IU/ml之间、在5IU/ml与15IU/ml之间或在10IU/ml与00IU/ml之间。在特定实施方案中，用IL-15培育所述经富集T细胞的组合物，所述IL-15的浓度为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml、50IU/ml、100IU/ml或200IU/ml。在特定实施方案中，用浓度为20IU/ml的重组IL-15培育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物。
在特定实施方案中，在IL-2和/或IL-15(如以如所述量)存在下培育经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物。在某些实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15(如以如所述量)存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物。在一些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，所述IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。
在特定实施方案中，所述培育是在封闭系统中进行。在某些实施方案中，所述培育是在无菌条件下在封闭系统中进行。在特定实施方案中，所述培育在与所提供的系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物从封闭系统中移取出并且放置于生物反应器中和/或连接至生物反应器以用于培育。适合于所述培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、SartoriusBioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，在培育步骤的至少一部分期间使用生物反应器灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，与在没有生物反应器的情况下培育的细胞，例如在静态条件下如在不混合、摇摆、运动和/或灌注的情况下培育的细胞相比，在封闭、连接和/或在生物反应器控制下的同时培育的细胞在培育期间经历更快的扩增。在一些实施方案中，在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育的细胞在14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内达到或实现阈值扩增、细胞计数和/或密度。在一些实施方案中，与在其中未在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育细胞的示例性和/或替代性过程中培育的细胞相比，在封闭、连接和/或在生物反应器的控制下的同时培育的细胞达到或实现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍的阈值扩增、细胞计数和/或密度。
在一些实施方案中，所述混合是或包括摇摆/或运动。在一些情况下，生物反应器可以经历运动或摇摆，这在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调整摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，且具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，培育的至少一部分是在灌注下进行，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率灌注，例如，这取决于与培育开始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度。在一些实施方案中，细胞培养物扩增的至少一部分是在摇摆运动下进行，所述摇摆运动具有在5°与10°之间(如6°)的角度，以及恒定摇摆速度，如在5RPM与15RPM之间，如6RMP或10RPM。
在一些实施方案中，培育步骤的至少一部分在恒定灌注(例如慢稳定速率的灌注)下进行。在一些实施方案中，灌注是或包括液体，例如用过的培养基的流出和新鲜培养基的流入。在某些实施方案中，灌注用新鲜培养基置换用过的培养基。在一些实施方案中，培育的至少一部分在灌注下进行，所述灌注具有如下稳定速率：为或为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。
在特定实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且在设定和/或预定时间量后，如在开始或起始培育后如下时间开始灌注：为或为约或至少12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或超过72小时。在特定实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x 106个细胞/ml、0.2x 106个细胞/ml、0.4x 106个细胞/ml、0.6x 106个细胞/ml、0.8x 106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.4x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml。在特定实施方案中，当活细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x 106个活细胞/ml、0.2x 106个活细胞/ml、0.4x 106个活细胞/ml、0.6x 106个活细胞/ml、0.8x 106个活细胞/ml、1x 106个活细胞/ml、1.2x 106个活细胞/ml、1.4x 106个活细胞/ml、1.6x 106个活细胞/ml、1.8x 106个活细胞/ml、2.0x 106个活细胞/ml、2.5x 106个活细胞/ml、3.0x 106个活细胞/ml、3.5x 106个活细胞/ml、4.0x 106个活细胞/ml、4.5x 106个活细胞/ml、5.0x 106个活细胞/ml、6x 106个活细胞/ml、8x 106个活细胞/ml或10x 106个活细胞/ml。
在特定实施方案中，在培育期间以不同速度进行灌注。例如，在一些实施方案中，灌注的速率取决于经培育细胞的密度和/或浓度。在某些实施方案中，当细胞达到设定或预定的密度或浓度时，增加灌注的速率。在培育期间灌注速率可以改变，例如从一种稳定灌注速率变为增加的稳定灌注速率，改变一次、两次、三次、四次、五次、超过五次、超过十次、超过15次、超过20次、超过25次、超过50次或超过100次。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x 106个细胞/ml、0.8x 106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.4x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml。在一些实施方案中，当细胞达到如下设定或预定的活细胞密度或浓度时增加稳定灌注速率：为、为约或至少0.6x 106个活细胞/ml、0.8x 106个活细胞/ml、1x 106个活细胞/ml、1.2x 106个活细胞/ml、1.4x 106个活细胞/ml、1.6x 106个活细胞/ml、1.8x 106个活细胞/ml、2.0x 106个活细胞/ml、2.5x 106个活细胞/ml、3.0x 106个活细胞/ml、3.5x 106个活细胞/ml、4.0x 106个活细胞/ml、4.5x 106个活细胞/ml、5.0x 106个活细胞/ml、6x 106个活细胞/ml、8x 106个活细胞/ml或10x 106个活细胞/ml。在一些实施方案中，可以确定或监测在培育期间(如在灌注下)细胞或活细胞的密度和/或浓度，如通过使用如所述的方法，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在没有灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时开始灌注。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，以如下速率开始灌注：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x 106个细胞/ml、0.2x 106个细胞/ml、0.4x 106个细胞/ml、0.6x 106个细胞/ml、0.8x 106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.4x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml。
在某些实施方案中，培育的至少一部分在某一速率的灌注下进行，并且当细胞的密度或浓度达到设定或预定的密度或浓度时，将灌注速率增加到如下速率：为、为约或至少100ml/天、200ml/天、250ml/天、275ml/天、290ml/天、300ml/天、350ml/天、400ml/天、450ml/天、500ml/天、550ml/天、575ml/天、580ml/天、600ml/天、650ml/天、700ml/天、750ml/天、800ml/天、850ml/天、900ml/天、950ml/天、1000ml/天、1100ml/天、1160ml/天、1200ml/天、1400ml/天、1600ml/天、1800ml/天、2000ml/天、2200ml/天或2400ml/天。在一些实施方案中，当经培育细胞或经培育活细胞达到如下密度或浓度时开始灌注：为、为约或至少0.1x 106个细胞/ml、0.2x 106个细胞/ml、0.4x 106个细胞/ml、0.6x 106个细胞/ml、0.8x106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.4x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml。在一些实施方案中，当以如下体积培育细胞时进行灌注：为、为约或至少300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。在一些实施方案中，所述体积是1000mL。
在某些实施方案中，在没有灌注或以某一速率灌注的条件下开始培育，并且当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x 106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少290ml/天。在某些实施方案中，当以为、为约或至少1000mL的体积培育细胞时，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.61x 106个细胞/ml的浓度时，以为、为约或至少290ml/天的速率灌注细胞。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少0.81x106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少580ml/天。在某些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.01x 106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。在一些实施方案中，当细胞的密度或浓度达到为、为约或至少1.2x 106个细胞/ml的浓度时，将灌注速率增加到为、为约或至少1160ml/天。
在所提供的实施方案的方面，通过在培育期间评估细胞的密度和/或浓度或评估活细胞的密度和/或浓度来确定灌注速率，包括如本文及上文所述的开始或增加灌注时的时间安排。在一些实施方案中，可以使用如所述的方法确定细胞的密度和/或浓度，所述方法包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在一些实施方案中，在表面活性剂存在下培育经富集细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物。在特定实施方案中，培育所述组合物的细胞减少了在培育期间例如由于混合、摇摆、运动和/或灌注而可能发生的剪切应力的量。在特定实施方案中，用表面活性剂培育所述经富集T细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物，并且在完成培育后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天期间或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或至少99.9％的T细胞存活，例如是有活力的并且/或者未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，在表面活性剂存在下培育所述经富集T细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物，并且少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞未经历如由于剪切或剪切诱导的应力而引起的细胞死亡，例如程序性细胞死亡、细胞凋亡和/或坏死。
在特定实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育经富集T细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育所述经富集T细胞，如工程化T细胞(例如工程化CD4+ T细胞或工程化CD8+ T细胞)的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的表面活性剂存在下培育所述经富集T细胞的组合物。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括降低液体和/或固体的表面张力的试剂。例如，表面活性剂包括脂肪醇(例如，甾基醇)、聚氧乙二醇辛基酚醚(例如Triton X-100)或聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(例如聚山梨醇酯20、40、60)。在某些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)、泊洛沙姆188(P188)。在示例性的实施方案中，化学确定的进料培养基中的表面活性剂的浓度为约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS80；约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS20；或约0.1％至约5.0％(w/v)的P188。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括添加到其中的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、三乙醇胺硬脂酸酯、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠)。
在一些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂基醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺(poloxamine)、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖(包括淀粉和淀粉衍生物如羟乙基淀粉(HES))、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，并且优选是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。此类聚合物以商标名泊洛沙姆出售，有时也被称为
Figure BDA0002556464920000972
F68或
Figure BDA0002556464920000971
P188。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的那些。这种表面活性剂的一个例子是
Figure BDA0002556464920000973
HS 15，即聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，合适的阳离子表面活性剂可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苄基氯化铵、酰基肉碱盐酸盐、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶
Figure BDA0002556464920000974
卤化物或长链烷基胺、例如像正辛胺和油胺。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电荷和负电荷。合适的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(如二豆蔻酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用包括阴离子磷脂和两性离子磷脂的磷脂混合物。此类混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。磷脂(无论是阴离子的、两性离子的还是磷脂混合物)都可以是盐化的或脱盐的、氢化的或部分氢化的，或天然的、半合成的或合成的。
在某些实施方案中，所述表面活性剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188。在一些实施方案中，在如下量的泊洛沙姆存在下培育经富集T细胞的组合物：在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、在0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、在0.5μl/ml与5μl/ml之间、在1μl/ml与3μl/ml或在2μl/ml与4μl/ml之间。在一些实施方案中，在如下量的表面活性剂存在下培育所述经富集T细胞的组合物：为、为约或至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml或50μl/ml。在某些实施方案中，在为或为约2μl/ml的泊洛沙姆存在下培育所述经富集T细胞的组合物。
在特定实施方案中，当细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，如通过收获细胞结束培育。在特定实施方案中，例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度，当细胞实现为或为约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增或大于10倍扩增时，结束培育。在一些实施方案中，阈值扩增为例如关于和/或相对于开始或起始培育时细胞的量或密度的4倍扩增。
在一些实施方案中，当细胞实现细胞的阈值总量，例如阈值细胞计数时，如通过收获细胞结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总有核细胞(TNC)计数时，结束培育。在一些实施方案中，当细胞实现阈值活细胞量，例如阈值活细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，阈值细胞计数为或为约或为至少50x 106个细胞、100x 106个细胞、200x 106个细胞、300x 106个细胞、400x 106个细胞、600x 106个细胞、800x 106个细胞、1000x 106个细胞、1200x 106个细胞、1400x 106个细胞、1600x 106个细胞、1800x 106个细胞、2000x 106个细胞、2500x 106个细胞、3000x 106个细胞、4000x 106个细胞、5000x 106个细胞、10,000x106个细胞、12,000x 106个细胞、15,000x 106个细胞或20,000x 106个细胞，或活细胞的任何前述阈值。在特定实施方案中，当细胞实现阈值细胞计数时，结束培育。在一些实施方案中，在实现所述阈值细胞计数后在以下时间时、在约以下时间时或在以下时间内结束培育：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现所述阈值细胞计数后1天或约1天时结束培育。在某些实施方案中，阈值密度为、为约或为至少0.1x 106个细胞/ml、0.5x 106个细胞/ml、1x 106个细胞/ml、1.2x 106个细胞/ml、1.5x 106个细胞/ml、1.6x 106个细胞/ml、1.8x 106个细胞/ml、2.0x 106个细胞/ml、2.5x 106个细胞/ml、3.0x 106个细胞/ml、3.5x 106个细胞/ml、4.0x 106个细胞/ml、4.5x 106个细胞/ml、5.0x 106个细胞/ml、6x 106个细胞/ml、8x 106个细胞/ml或10x 106个细胞/ml，或活细胞的任何前述阈值。在特定实施方案中，当细胞实现阈值密度时，结束培育。在一些实施方案中，在实现所述阈值密度后在以下时间时、在约以下时间时或在以下时间内结束培育：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现所述阈值密度后1天或约1天时结束培育。
在一些实施方案中，将培育步骤进行对于细胞实现阈值量、密度和/或扩增所需的时间量。在一些实施方案中，将培育进行如下时间量：为或为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在特定实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。在某些实施方案中，对于从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的多种单独组合物的细胞实现阈值密度所需的平均时间量为、为约或少于6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、2天、3天4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天、10天、1周、2周、3周或4周。
在某些实施方案中，将培育步骤进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或为约1000x 106个细胞、1200x 106个细胞、1400x 106个细胞、1600x 106个细胞、1800x 106个细胞、2000x 106个细胞、2500x 106个细胞、3000x 106个细胞、4000x 106个细胞或5000x 106个细胞。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1200x 106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1200x 106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行培育步骤直到细胞实现为或为约1000x 106个细胞的阈值细胞计数并且培养最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在某些实施方案中，培育是扩增步骤并且将其进行最少4天、5天、6天、7天、7天、8天、9天或10天，和/或直到细胞实现如下阈值细胞计数(或数量)或阈值活细胞计数(或数量)后的12小时、24小时、36小时、1天、2天或3天：为或为约1000x 106个细胞、1200x 106个细胞、1400x 106个细胞、1600x 106个细胞、1800x 106个细胞、2000x 106个细胞、2500x 106个细胞、3000x 106个细胞、4000x106个细胞或5000x 106个细胞。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1200x 106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少10天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1200x 106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少9天后1天，和/或直到细胞实现为或为约5000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1000x 106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少8天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。在一些实施方案中，进行扩增步骤直到细胞实现为或为约1400x 106个细胞的阈值细胞计数并且扩增最少5天后1天，和/或直到细胞实现为或为约4000x 106个细胞的阈值细胞计数后1天。
在一些实施方案中，将培育进行至少最少时间量。在一些实施方案中，将培育进行至少14天、至少12天、至少10天、至少7天、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天、至少36小时、至少24小时、至少12小时或至少6小时，即使在最少时间量之前实现阈值。在一些实施方案中，在一些情况下，增加进行培育的最少时间量可以在经培育细胞、经配制细胞和/或输出组合物的细胞中减少激活和/或降低一种或多种激活标记的水平。在一些实施方案中，最少培育时间从示例性过程的确定点(例如选择步骤；解冻步骤；和/或激活步骤)开始计数到收获细胞的那一天。
在所提供的实施方案的方面，在培育期间监测细胞或活细胞的密度和/或浓度或在培育期间进行，如直到实现如所述的阈值量、密度和/或扩增。在一些实施方案中，此类方法包括如所述的那些，包括光学方法，包括数字全息显微术(DHM)或差分数字全息显微术(DDHM)。
在某些实施方案中，经培育细胞是输出细胞。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集T细胞(如工程化T细胞)的组合物是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，已经进行培育的CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞是输出CD4+和/或CD8+ T细胞。在特定实施方案中，已经进行培育的经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物是经富集CD4+ T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，已经进行培育的经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+T细胞)的组合物是经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞。在特定实施方案中，所述培育的至少一部分是在恒定的混合和/或灌注(如通过生物反应器控制的混合或灌注)的情况下进行。在一些实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下并且用表面活性剂(例如泊洛沙姆，如泊洛沙姆188)培育细胞，以减少来自恒定混合和/或灌注的剪切和/或剪切应力。在一些实施方案中，在重组IL-2、IL-7、IL-15和泊洛沙姆存在下培育经富集CD4+ T细胞(如工程化CD4+ T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-15和泊洛沙姆存在下培育经富集CD8+ T细胞(如工程化CD8+ T细胞)的组合物，其中所述培育的至少一部分是在恒定混合和/或灌注的情况下进行。在一些实施方案中，进行培育直到细胞达到例如与开始培育时相比至少4倍的阈值扩增。
在培育期间监测细胞
在一些实施方案中，在培育步骤期间监测所述细胞。可以进行监测，例如以确定(例如，测量、定量)细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如，活细胞浓度)。在一些实施方案中，监测是以手动方式进行，如由人操作员进行。在一些实施方案中，监测是通过自动化系统进行。自动化系统可能需要最小手动输入或不需要手动输入来监测经培育细胞。在一些实施方案中，监测是以手动和自动化系统两种方式进行。
在某些实施方案中，通过不需要手动输入的自动化系统监测细胞。在一些实施方案中，自动化系统与生物反应器例如本文所述的生物反应器兼容，使得可以将经历培育的细胞从生物反应器中移取出、监测并随后返回至生物反应器。在一些实施例中，监测和培育以闭环配置进行。在一些方面，在闭环配置中，自动化系统和生物反应器保持无菌。在实施方案中，自动化系统是无菌的。在一些实施方案中，自动化系统是在线系统。
在一些实施方案中，自动化系统包括使用光学技术(例如显微镜检查)检测细胞形态、细胞活力、细胞死亡和/或细胞浓度(例如活细胞浓度)。本文考虑了适合于确定例如细胞特征、活力和浓度的任何光学技术。有用的光学技术的非限制性例子包括亮视野显微术、荧光显微术、微分干涉差(DIC)显微术、相差显微术、数字全息显微术(DHM)、差分数字全息显微术(DDHM)或其组合。差分数字全息显微术、DDHM和差分DHM可以在本文中互换使用。在某些实施方案中，自动化系统包括差分数字全息显微镜。在某些实施方案中，自动化系统包括包含照明手段(例如，激光、led)的差分数字全息显微术。DDHM方法和使用的描述可见于例如US 7,362,449；EP 1,631,788；US 9,904,248；和US 9,684,281中，所述专利通过引用以其整体并入本文。
DDHM允许对细胞进行无标签的无损成像，从而产生高对比度的全息图像。可以对图像进行对象分割和进一步分析以获得定量描述所成像的对象(例如，经培育细胞、细胞碎片)的多个形态特征。这样，可以使用例如图像采集、图像处理、图像分割和特征提取的步骤，直接从DDHM评估或计算各种特征(例如，细胞形态、细胞活力、细胞浓度)。在一些实施方案中，自动化系统包括数字记录装置以记录全息图像。在一些实施方案中，自动化系统包括计算机，所述计算机包括用于分析全息图像的算法。在一些实施方案中，自动化系统包括用于显示全息图像分析结果的监视器和/或计算机。在一些实施方案中，分析是自动化的(即，能够在不存在用户输入的情况下进行)。用于在培育步骤期间监测细胞的合适自动化系统的例子包括但不限于Ovizio iLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA，布鲁塞尔，比利时)。
在某些实施方案中，在培育步骤期间连续进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间实时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间的离散时间点进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每15分钟进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每30分钟进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每45分钟进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每2小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每4小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每6小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每8小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每10小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每12小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每14小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每16小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每18小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每20小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每22小时进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔一天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔两天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔三天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔四天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔五天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔六天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔七天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔八天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤的持续时间内至少每隔九天一次进行监测。在一些实施方案中，在培育步骤期间至少进行一次监测。
在一些实施方案中，可通过监测(包括使用如DHM或DDHM的光学技术)确定的细胞特征包括细胞活力、细胞浓度、细胞数量和/或细胞密度。在一些实施方案中，表征或确定细胞活力。在一些实施方案中，表征或确定细胞浓度、密度和/或数量。在一些实施方案中，表征或确定活细胞浓度、活细胞数量和/或活细胞密度。在一些实施方案中，通过自动化系统监测经培育细胞，直到达到如上所述的扩增的阈值。在一些实施方案中，一旦达到扩增的阈值，就收获经培育细胞，如通过自动或手动方法，例如由人操作者收获。扩增的阈值可以取决于通过自动化系统确定的培养细胞的总浓度、密度和/或数量。可替代地，扩增的阈值可以取决于活细胞的浓度、密度和/或数量。
在一些实施方案中，如在药学上可接受的载体存在下如所述地配制收获的细胞。在一些实施方案中，在低温保护剂存在下配制收获的细胞。
E.配制细胞
在一些实施方案中，所提供的用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育之前或之后配制细胞，如配制由所提供的处理步骤产生的基因工程化细胞，和/或一个或多个如所述的其他处理步骤。在一些实施方案中，与配制细胞相关的所提供的方法包括在封闭系统中处理经转导细胞，如使用上文所述的处理步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的细胞剂量是作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品来提供。此类组合物可以根据所提供的方法中使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法中。
在一些情况下，在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)中处理细胞可以包括在培养(例如培育和扩增)之前或之后配制细胞，如配制由所提供的转导处理步骤产生的基因工程化细胞，和/或一个或多个如所述的其他处理步骤。在一些情况下，所述细胞可以以用于剂量给予，如用于单一单位剂量给予或多剂量给予的量配制。在一些实施方案中，与配制细胞相关的所提供的方法包括在封闭系统中处理经转导细胞，如使用上文所述的处理步骤转导和/或扩增的细胞。
在某些实施方案中，配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育所述一种或多种组合物之后配制经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞(如工程化和经培育T细胞，例如输出T细胞)的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或经培育组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集，分别工程化和分别培育的经富集CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的两种单独组合物分别配制。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的两种单独组合物(如工程化和经培育CD4+ T细胞和工程化和经培育CD8+ T细胞的单独组合物)分别配制。在一些实施方案中，对经富集T细胞的单一组合物进行配制。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物，如工程化和/或经培育CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在配制之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)合并为单一组合物并且对其进行配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制之后将经富集CD4+和经富集CD8+ T细胞的单独经配制组合物合并为单一组合物。在特定实施方案中，将经富集CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物(如工程化和经培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物)分别配制为单独组合物。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD4+ T细胞(如工程化和经培育CD4+ T细胞，例如输出CD4+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，经配制的经富集CD4+ T细胞(如工程化和经培育CD4+ T细胞，例如输出CD4+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD8+ T细胞(如工程化和经培育CD8+ T细胞，例如输出CD8+ T细胞)的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+ T细胞(如工程化和经培育CD8+T细胞，例如输出CD8+ T细胞)的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的经配制组合物(如工程化和经培育T细胞的经配制组合物)是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，经配制CD4+ T细胞和/或经配制CD8+ T细胞是输出CD4+和/或CD8+ T细胞。在特定实施方案中，经富集CD4+T细胞的经配制组合物是经富集CD4+ T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，经富集CD8+ T细胞的经配制组合物是经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器(如袋或小瓶)中。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在0天与10天之间、在0与5天之间、在2天与7天之间、在0.5天与4天之间或在1天与3天之间配制细胞。在某些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在如下时间或在约如下时间或在如下时间内配制细胞：12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后1天内或约1天内配制细胞。
特定实施方案考虑，细胞在培育期间的早期阶段比在培育期间的晚期阶段处于激活程度更高的状态。此外，在一些实施方案中，可能期望配制处于比在培育期间发生或可能发生的峰值激活更低激活状态的细胞。在某些实施方案中，将细胞培育最少持续时间或时间量，例如使得与在培育期间的较早时间点时配制所述细胞的情况相比，以收获处于更低激活状态的细胞，而不管阈值何时实现。在一些实施方案中，在已经在培育期间实现阈值细胞计数、密度和/或扩增后在1天与3天之间培育细胞。在某些实施方案中，细胞在配制之前实现阈值细胞计数、密度和/或扩增，并且保持培育最少时间或持续时间。在一些实施方案中，不对已实现阈值的细胞进行配制，直到已经将它们培育最少持续时间和/或时间量，如在1天与14天之间、在2天与7天之间或在3天与6天之间的最少时间或持续时间，或为或为约2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天的最少培育时间或持续时间。在一些实施方案中，所述最少培育时间或持续时间在3天与6天之间。
在一些实施方案中，将细胞配制于药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将介质交换成药学上可接受或给予至受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括洗涤经转导和/或扩增的细胞以置换药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式(包含药学上可接受的载体或赋形剂)的例子可以是下文结合对于将细胞和组合物给予至受试者可接受的形式所述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物是作为无菌液体制剂来提供，所述无菌液体制剂例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)掺合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，所述配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存溶液是或含有例如至少或至少约7.5％DMSO。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以置换低温保存溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻，例如低温冷冻或低温保存，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。
在特定实施方案中，对所述经富集T细胞(例如，已经刺激、工程化和/或培育的T细胞)的组合物进行配制，低温冷冻，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，将经配制的低温冷冻细胞储存直到释放细胞以用于输注。在特定实施方案中，将经配制的低温冷冻细胞储存1天至6个月、1个月至3个月、1天至14天、1天至7天、3天至6天、6个月至12个月、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温冷冻并且储存以下时间量：为、为约、或少于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后将细胞解冻并且给予至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存5天或约5天。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述一个或多个处理步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞(如经培养或扩增细胞)。在一些实施方案中，所述处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括减少体积从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括增加体积从而根据减小细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理包括将一定体积的配制缓冲液添加至经转导和/或扩增细胞。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积为从10mL至1000mL或从约10mL至约1000mL，如至少或约至少或约50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤是在封闭系统中进行。此类处理步骤的示例可以使用离心室结合与细胞处理系统相关联的一种或多种系统或试剂盒来进行，如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括与
Figure BDA0002556464920001102
或Sepax
Figure BDA0002556464920001101
细胞处理系统一起使用的那些离心室。示例性系统和方法描述于国际公开号WO 2016/073602中。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔压出经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物压出至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合和或可操作连接并且/或者整合或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
Figure BDA0002556464920001105
和
Figure BDA0002556464920001104
2系统。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供压出经配制组合物。在一些方面，可以将所需数量的或多个小瓶无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至端口或少于全部的端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物压出至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单一单位剂量给予或多剂量给予)的量压出至多个输出容器(例如，生物医学材料器皿的小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，生物医学材料器皿的小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分给予的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于给予的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3个小瓶一起构成用于给予的剂量。
因此，本文所述的小瓶通常含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待给予至受试者的细胞的量或数量，或者是待给予的细胞的数量的两倍(或更多)。它可以是将向受试者给予的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本上相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x 106、2x 106、5x 106、1x 107、5x 107或1x 108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少或约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，容器(例如袋或小瓶)中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，容器(例如小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
F.方法和/或输出组合物的示例性特征
在特定实施方案中，所提供的方法与从一种或多种输入组合物和/或从单一生物样品产生或生成经富集T细胞的一种或多种输出组合物的过程结合使用。在某些实施方案中，所述一种或多种输出组合物含有表达重组受体(例如TCR或CAR)的细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞适合于作为疗法，例如自体细胞疗法给予至受试者。在一些实施方案中，所述一种或多种输出组合物是经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD4+ T细胞的输出组合物和经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生经富集T细胞的输出细胞和/或输出组合物的整个过程结合使用，所述过程如包括以下步骤中的一些或全部的过程：收集或获得生物样品；从所述生物样品中分离、选择或富集输入细胞；将所述输入细胞低温冷冻并储存；将所述输入细胞解冻并且/或者在刺激条件下孵育；工程化所述经刺激细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体(如CAR)的多核苷酸；将所述工程化细胞培育至阈值量、密度或扩增；在输出组合物中配制经培育细胞；和/或将所述经配制输出细胞低温冷冻并储存，直到释放所述细胞以用于输注和/或给予至受试者。在一些实施方案中，所述整个过程是用经富集T细胞(例如，CD4+ T细胞或CD4+和CD8+ T细胞)的单一组合物进行。在特定实施方案中，所述整个过程是用经富集T细胞的两种或更多种组合物，例如经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+ T细胞的组合物进行。在某些实施方案中，所述过程是用在生成或产生经富集T细胞的单一输出组合物的过程之前和/或期间合并的经富集T细胞的两种或更多种输入组合物进行。
在一些实施方案中，经富集CD4+ T细胞的至少一种单独组合物和经富集CD8+ T细胞的至少一种单独组合物从相同生物样品(例如，含有自体PBMC的相同单采术或白细胞单采术产物)中分离、选择和/或富集，所述生物样品从同一受试者(如患者或健康供体)获得、收集和/或获取。在一个方面，首先使相同生物样品经历CD4+ T细胞的阳性选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且可以使阴性级分进一步经历CD8+ T细胞的阳性选择。在另一个方面，首先使相同生物样品经历CD8+ T细胞的阳性选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且可以使阴性级分进一步经历CD4+ T细胞的阳性选择。在一些方面，将来自同一供体的经富集CD4+ T细胞的单独组合物和经富集CD8+ T细胞的单独组合物单独冷冻，例如在低温保存介质中低温冷冻或低温保持。在一些方面，将所述单独低温保存的细胞组合物在单独容器中储存和/或装运。在其他方面，将所述低温保存的细胞组合物解冻并且任选地洗涤。在一些方面，将来自同一供体的经富集T细胞的两种或更多种单独组合物(至少一种是经富集CD4+T细胞的组合物并且至少一种是经富集CD8+ T细胞的单独组合物)通过与刺激试剂接触(例如通过与用于T细胞激活的CD3/CD28缀合的磁珠一起孵育)分别激活和/或刺激，并且任选地调整，例如减少激活/刺激之后的单独经富集细胞组合物的体积，以便实现目标体积。在一些方面，例如使用编码重组蛋白(例如CAR)的相同逆转录病毒载体分别工程化、转导和/或转染所述经激活/刺激的经富集细胞组合物，以在单独的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组合物中表达相同重组蛋白。在一些方面，任选地调整，例如减少工程化之后的单独经富集细胞组合物的体积，以便实现目标体积。在一些方面，所述方法可以包括将刺激试剂(例如，磁珠)从单独组合物中去除。在一些方面，将含有单独工程化的CD4+ T细胞的组合物和含有单独工程化的CD8+ T细胞的组合物分别培育，例如以扩增其中的CD4+或CD8+ T细胞群。在某些实施方案中，将培育之后的单独细胞组合物分别收获和/或收集和/或分别配制，例如通过在配制缓冲液中洗涤所述细胞组合物。在某些实施方案中，将至少一种单独配制的经富集CD4+ T细胞组合物和至少一种单独配制的经富集CD8+ T细胞组合物冷冻，例如在低温保存介质中低温冷冻或低温保存。在一些方面，所述单独低温保存的配制品可以在单独容器中储存和/或装运。在一些方面，将源自同一供体并且表达相同重组蛋白(例如，CAR)的至少一种CD4+ T细胞配制品和至少一种CD8+ T细胞配制品分开给予至有需要的受试者。在一些方面，所述分开给予同时或按任何顺序依次进行。
在一些实施方案中，经富集CD4+ T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述输出组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD4+ T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，经富集CD8+ T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+ T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，将与所提供方法相关的过程与示例性和/或替代性过程进行比较。在特定实施方案中，替代性和/或示例性过程可以在一个或多个特定方面不同，但是在其他方面含有与所提供方法相关的过程的相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。在一些实施方案中，替代性和/或示例性过程和与所提供方法相关的过程相似或相同，不同之处在于：经富集CD4+ T细胞的组合物未与重组IL-2一起孵育和/或培育；所述细胞以大于3(或3:1)的刺激试剂与细胞的比率与刺激试剂一起孵育；在培育之前和/或在从开始在刺激条件下孵育起的6、5或4天内未将所述刺激试剂从细胞中去除或分离；未在抗氧化剂存在下孵育细胞；未用低量或低浓度(例如在1μg/ml与50μg/ml之间)的聚阳离子工程化细胞；未用表面活性剂培育细胞；和/或未在具有一致灌注和/或混合的条件下培育细胞。
在某些实施方案中，所述过程在如下的持续时间或时间量内完成：为或为约35天、34天、33天、32天、31天、30天、29天、28天、27天、26天、25天、24天、23天、22天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天或少于9天。在某些实施方案中，所述过程在21天内完成。在一些实施方案中，在以下情况时认为所述过程完成：所述组合物被收获和/或配制；所述组合物已备妥进行收获和/或配制；所述组合物已达到收获的目标阈值；和/或所述组合物被释放和/或已备妥进行配制后测试。
在一些实施方案中，所述过程在如下的持续时间或时间量内完成：为或为约35天、34天、33天、32天、31天、30天、29天、28天、27天、26天、25天、24天、23天、22天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天或少于9天，如从开始生物样品的收集和/或从生物样品中分离、选择、刺激和/或富集输入细胞到以下情况时所测量：所述输出细胞被释放以用于输注；所述输出细胞被收获和/或配制；所述输出细胞已备妥进行收获和/或配制；所述输出细胞已达到收获的目标阈值；和/或所述输出细胞被释放和/或已备妥进行配制后测试，包括用于低温冷冻组合物的储存时间。在特定实施方案中，当对从相同生物样品获得的经富集T细胞的多于一种组合物进行所述过程时，当来自相同生物样品的每种组合物的至少一种代表性样品已经完成所述过程时，所述过程完成。在一些实施方案中，所述过程在21天内完成，如从开始生物样品的收集和/或从生物样品中分离、选择、刺激和/或富集输入细胞到所述输出细胞被释放以用于输注所测量。
在一些实施方案中，所述过程在如下的持续时间或时间量内完成：为或为约35天、34天、33天、32天、31天、30天、29天、28天、27天、26天、25天、24天、23天、22天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天或少于9天，如从开始生物样品(例如单采术或白细胞单采术样品)的收集到以下情况时所测量：所述输出组合物被给予或已备妥被给予至受试者；所述输出细胞被收获和/或配制；所述输出细胞已备妥进行收获和/或配制；所述输出细胞已达到收获的目标阈值；和/或所述输出组合物被释放以进行测试，包括用于低温冷冻组合物的储存时间。在一些实施方案中，所述过程在21天内完成，如从开始生物样品的采集到所述输出细胞已备妥和/或被释放以输注到受试者时所测量。
在某些实施方案中，例如，当包括储存时间时，对于从一名受试者获得的样品，对于来自多名受试者的样品，和/或对于至少某一百分比的受试者(如患有特定适应症或疾病的那些，如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多的此类受试者)，完成所述过程的持续时间和/或时间量在10天与35天之间、在12天与33天之间、在17天与25天之间或在19天与23天之间。在某些实施方案中，例如，当包括储存时间时，对来自不同生物样品的多种起始组合物完成所述过程的中位时间量和/或持续时间(如当从受试者获取样品到产物已备妥或被释放用于输注至受试者时测量时)在15天与27天之间、在17天与25天之间或在19天与23天之间，或为或为约19天、20天、21天、22天或23天。在特定实施方案中，例如，当包括运输和/或储存时间时，对来自不同生物样品的多种组合物完成所述过程的平均时间量和/或持续时间在15天与27天之间、在17天与25天之间或在19天与23天之间，或为或为约19天、20天、21天、22天或23天。在特定实施方案中，例如，当包括储存时间时，对来自不同生物样品的多种组合物完成所述过程的持续时间在15天与27天之间、在17天与25天之间或在19天与23天之间，或为或为约19天、20天、21天、22天或23天。在某些实施方案中，如在例如来自不同生物样品和/或患有不同疾病的受试者的多种起始组合物中，所述过程的持续时间少于或不超过21天；在一些方面，在此类样品或患者中，在制造产品中，这种结果以大于85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的成功率实现。
在一些实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，完成所述过程的持续时间和/或时间量在7天与27天之间、在9天与25天之间、在11天与18天之间或在11天与15天之间。在某些实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，对来自不同生物样品的多种组合物完成所述过程所需的中位时间量和/或持续时间在7天与27天之间、在9天与25天之间、在11天与18天之间、在11天与15天之间，或为或为约11天、12天、13天、14天或15天。在特定实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，对来自不同生物样品的多种组合物完成所述过程所需的平均时间量和/或持续时间在7天与27天之间、在9天与25天之间、在11天与18天之间、在11天与15天之间，或为或为约11天、12天、13天、14天或15天。在一些实施方案中，当不包括低温冷冻细胞的储存时间时，对来自不同生物样品的多种组合物完成所述过程所需的平均时间量和/或持续时间少于21天。
在特定实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，对至少10％的从不同来源，例如不同生物样品获得的多种组合物和/或从不同生物样品中分离、富集和/或选择的经富集T细胞的不同输入组合物完成所述过程的时间量在7天与18天之间、在10天与17天之间或在11天与15天之间，或为或为约11天、12天或13天。在特定实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，对至少50％的来自不同生物来源的多种组合物完成所述过程所需的时间量在7天与27天之间、在9天与25天之间、在11天与18天之间或在11天与15天之间，或为或为约11天、12天、13天、14天或15天。在某些实施方案中，当不包括或考虑低温冷冻细胞的储存时间时，对至少90％的来自不同来源的多种组合物完成所述过程所需的时间量在7天与27天之间、在9天与25天之间、在11天与18天之间、或在11天与15天之间，或为或为约11天、12天、13天、14天或15天。在某些实施方案中，当不包括低温冷冻细胞的储存时间时，对至少90％的来自不同来源的多种组合物完成所述过程所需的时间量少于21天。
在一些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增程度(如特定的倍数扩增，如四倍或特定剂量)的时间发生的过程期间的持续时间和/或时间量在5天与25天之间、在7天与18天之间、在8天与15天之间，在8天与14天之间或在8天与15天之间，如在8天与13天之间或在9天与13天之间。在某些实施方案中，从开始或起始孵育到实现阈值的时间发生的所述过程的中位时间量和/持续时间在5天与25天之间、在7天与18天之间或在9天与13天之间，或为或为约8天、9天、10天、11天、12天或13天。在特定实施方案中，从开始或起始孵育到实现阈值的时间发生的所述过程的平均时间量和/持续时间在5天与25天之间、在7天与18天之间、在8天与13天之间或在9天与13天之间，或为或为约8天、9天、10天、11天、12天或13天。
在某些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到收集、配制和/或低温冷冻所述输出细胞的时间发生的过程期间的持续时间和/或时间量在5天与25天之间、在7天与18天之间、在8天与15天之间，在8天与14天之间或在8天与15天之间，如在8天与13天之间或在9天与13天之间。在某些实施方案中，从开始或起始孵育到实现阈值的时间发生的所述过程的中位时间量和/持续时间在5天与25天之间、在7天与18天之间或在9天与13天之间，或为或为约8天、9天、10天、11天、12天或13天。在特定实施方案中，从开始或起始孵育到实现阈值的时间发生的所述过程的平均时间量和/持续时间在5天与25天之间、在7天与18天之间、在8天与13天之间或在9天与13天之间，或为或为约8天、9天、10天、11天、12天或13天。在一些实施方案中，对于、对于约或对于至少85％、90％、95％的受试者，从开始或起始在刺激条件下孵育到收集、配制和/或低温冷冻所述输出细胞的时间发生的过程期间的持续时间和/或时间量在9天与15天之间。
在一些实施方案中，从自生物样品(例如，单采术和/或白细胞单采术)分离、富集和/或选择经富集CD4+和CD8+细胞的组合物到收集、配制和/或低温冷冻所述输出细胞的时间发生的过程期间的持续时间和/或时间量在5天与25天之间、在7天与18天之间、在8天与19天之间、在8天与14天之间或在10天与16天之间。在某些实施方案中，对于至少85％、至少90％、至少95％的受试者，在分离、富集和/或选择后在10天与16天之间收集、配制和收获所述输出细胞。
在一些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增的时间，所述过程的持续时间和/或时间量比示例性和/或替代性过程的持续时间和/或时间量少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的时间。在特定实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增的时间，所述过程期间的持续时间和/或时间量比示例性和/或替代性过程的持续时间和/或时间量短、短约、短至少0.5天、1天、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或超过14天。
在某些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增的时间，来自不同生物样品的多种组合物中的至少10％达到阈值量、密度和/或扩增所需的时间量在5天与20天之间、在7天与15天之间或在9天与11天之间，或为或为约7天、8天、9天或10天。在特定实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育，来自不同生物样品的多种组合物中的至少50％达到阈值量、密度和/或扩增所需的时间量在5天与25天之间、在7天与18天之间或在9天与13天之间，或为或为约7天、8天、9天、10天、11天、12天、或13天。在一些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育，来自不同生物样品的多种组合物中的至少90％达到阈值量、密度和/或扩增所需的时间量在5天与25天之间、在7天与18天之间或在9天与13天之间，或为或为约7天、8天、9天、10天、11天、12天、或13天。
在一些实施方案中，本文提供的方法与在少于示例性替代性过程的时间量内产生基因工程化T细胞的过程结合使用。在一些实施方案中，所述过程的短持续时间可以增加产生可以给予至受试者以进行细胞疗法的工程化T细胞组合物的速率、情况和/或概率。在某些实施方案中，用于治疗性细胞组合物的制造方案可能需要在一定时间量内产生和释放细胞组合物以进行输注。因此，在一些实施方案中，可能期望所述过程的较短持续时间减少或消除了由于细胞组合物不能在所需的时间内扩增而发生的过程失败。
在本文提供的过程的一些实施方案中，从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增的时间，细胞组合物达到阈值量、密度和/或扩增所需的时间量在约9天与约13天之间或在9天与13天之间，或为9天，而在替代性过程中，相应的时间量在约12天与约23天之间或在12天与23天之间，或为约15天或15天。在一些实施方案中，在所提供的过程和替代性过程两者中，样品收集、分离细胞组合物和低温冷冻所需的时间量在约1天与约2天之间或在1天与2天之间。在一些实施方案中，在所提供的过程和替代性过程两者中，将低温冷冻的细胞组合物储存约3天或3天。在一些实施方案中，在所提供的过程和替代性过程两者中，从实现阈值量、密度和/或扩增时或从收获所述细胞组合物时到所述输出组合物给予或已备妥给予至受试者时所需的时间量为或为约5天。在一些实施方案中，在所提供的过程中，从样品收集到所述输出组合物给予或已备妥给予至受试者时所需的总时间量为或为约19天，而在替代性过程中，相应的总时间量为或为约25天。
在某些实施方案中，在所提供的过程中，对于多种细胞组合物中的50％或约50％，从样品收集到所述输出组合物给予或已备妥给予至受试者(这将要求所述细胞组合物达到阈值量、密度和/或扩增)时所需的总时间量为或为约19天，而在替代性过程中，相应的总时间量为或为约25天。在某些实施方案中，在所提供的过程中，对于多种细胞组合物中的80％或约80％从样品收集到所述输出组合物给予或已备妥给予至受试者(这将要求所述细胞组合物达到阈值量、密度和/或扩增)时所需的总时间量为或为约21天，而在替代性过程中，相应的总时间量为或为约27天。在某些实施方案中，在所提供的过程中，对于多种细胞组合物中的90％或约90％，从样品收集到所述输出组合物给予或已备妥给予至受试者(这将要求所述细胞组合物达到阈值量、密度和/或扩增)时所需的总时间量为或为约21天，而在替代性过程中，相应的总时间量为或为约33天。
从开始或起始在刺激条件下孵育到在培育期间实现阈值量、密度和/或扩增的时间为
在某些实施方案中，所提供的方法与成功生成或产生适合于在细胞疗法中使用的工程化细胞的输出组合物结合使用。在一些实施方案中，如果在培育期间所述组合物的细胞实现阈值细胞计数、密度和/或扩增，则成功产生所述输出组合物。在特定实施方案中，如果所述细胞中的40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％细胞表达重组受体，则成功产生所述输出组合物。在特定实施方案中，如果输出组合物适合例如作为自体细胞疗法用于治疗性用途，则成功产生或生成所述输出组合物。在特定实施方案中，如果输出组合物的细胞满足一个或多个标准，则所述输出组合物适合于治疗性用途。在一些实施方案中，适合于在细胞疗法中使用的细胞和/或细胞组合物是无菌的(例如，缺乏可检测的微生物污染)、不含内毒素、不含有复制能力的病毒、有活力、有活性(例如，具有细胞溶解活性和/或响应于靶抗原释放细胞因子)和/或含有高比例的表达重组受体的细胞。
在特定实施方案中，所提供的方法具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的从输入细胞组合物和/或生物样品成功生成或产生经富集T细胞的输出组合物的概率或可能性。在某些实施方案中，所述可能性或概率在85％与100％之间、在90％与95％之间或在92％与94％之间。在某些实施方案中，所提供的方法从来自多种输入细胞组合物和/或多种生物样品的至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％组合物和/或样品成功生成或产生经富集T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所提供的方法从来自多种输入细胞组合物和/或多种生物样品的85％与100％之间、90％与95％之间或92％与94％之间的组合物和/或样品成功生成或产生经富集T细胞的输出组合物。
在某些实施方案中，所述过程在21天内完成并且具有至少85％、90％、95％或更大的成功率。在一些实施方案中，当所述输出细胞给予和/或已备妥给予至受试者时，认为所述过程完成。在一些实施方案中，当所述输出组合物已经收获和/或已备妥进行测试和/或评价(例如，如用于释放测定)时，认为所述过程完成。
在特定实施方案中，与所提供方法相关的过程成功生成或产生输出组合物的概率或可能性比替代性和/或示例性过程成功生成或产生输出组合物的概率或可能性大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在某些实施方案中，与所提供方法相关的过程的成功生成或产生经富集CD4+ T细胞的输出组合物的概率或可能性比替代性和/或示例性过程成功生成或产生经富集CD4+ T细胞的输出组合物的概率或可能性大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在特定实施方案中，与所提供方法相关的过程的成功生成或产生经富集CD8+ T细胞的输出组合物的概率或可能性比替代性和/或示例性过程成功生成或产生经富集CD8+ T细胞的输出组合物的概率或可能性大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在一些实施方案中，与所提供的方法结合生成或产生的所述一种或多种输出组合物含有表达重组受体，例如TCR或CAR的细胞。在一些实施方案中，表达重组受体可以包括但不限于具有一种或多种位于细胞膜和/或细胞表面的重组受体蛋白、具有可检测量的重组受体蛋白、具有可检测量的编码重组受体的mRNA、具有或含有编码重组受体的重组多核苷酸，和/或具有或含有作为重组受体表达的替代标记的mRNA或蛋白质。
在一些实施方案中，所述一种或多种输出组合物的至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物的至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD4+ T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，在30％与90％之间、在40％与85％之间、在50％与80％之间或在60％与80％之间的CD4+ T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，经富集CD4+ T的输出组合物的至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，经富集CD4+ T的输出组合物的在30％与90％之间、在40％与85％之间、在50％与80％之间或在60％与80％之间的细胞表达重组受体。
在某些实施方案中，输出组合物的至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD8+ T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，在30％与90％之间、在40％与85％之间、在50％与80％之间或在60％与80％之间的CD8+ T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，经富集CD8+ T的输出组合物的至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，经富集CD8+ T的输出组合物的在30％与90％之间、在40％与85％之间、在50％与80％之间或在60％与80％之间的细胞表达重组受体。
在一些实施方案中，所述输出组合物中表达重组受体的细胞的百分比大于通过替代性和/或示例性过程产生或生成的表达重组受体的细胞的百分比，如大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在某些实施方案中，所述输出组合物中表达重组受体的CD4+ T细胞的百分比大于通过替代性和/或示例性过程产生或生成的表达重组受体的CD4+ T细胞的百分比，如大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在一些实施方案中，所述输出组合物中表达重组受体的CD8+ T细胞的百分比大于通过替代性和/或示例性过程产生或生成的表达重组受体的CD8+ T细胞的百分比，如大至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％或至少10％，或者大超过10％。
在一些实施方案中，通过所提供的方法生成或产生的所述一种或多种输出组合物含有经激活细胞，和/或含有具有或显示一种或多种激活标记的细胞。在特定实施方案中，与通过示例性和/或替代性过程生成或产生的细胞相比，通过所提供的方法产生或生成的输出组合物的细胞的激活程度更高和/或具有或显示出更大量或程度的一种或多种激活标记。激活标记可以包括指示免疫细胞(如T细胞)中的激活状态、与所述激活状态相关和/或与所述激活状态相关联的任何已知标记。在一些实施方案中，激活标记包括但不限于细胞内复杂性增加(例如，如通过测量侧向散射(SSC)确定的)、细胞大小增加(例如，如通过测量细胞直径和/或前向散射(FSC)确定的)、CD27的表达增加和/或CD25的表达减少。
在一些实施方案中，通过所提供的方法生成或产生的输出细胞大于通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞。在一些实施方案中，如通过流式细胞术测量FSC和/或SSC参数，并将其与参考和/或标准进行比较以评估细胞的大小。在某些实施方案中，测量FSC参数并将其与参考或标准进行比较以评估细胞的大小。在一些实施方案中，所述输出组合物的细胞的细胞直径(例如，中位或平均细胞直径)比通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞的直径大至少0.25μm、0.5μm、0.75μm、1.0μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm或超过5μm。
在某些实施方案中，当给予至受试者时，所述输出细胞在体内具有活性并扩增，和/或能够激活和扩增。在特定实施方案中，所述输出细胞显示出指示体内功效、活性和/或扩增和/或与其相关的特征和/或特性。例如，在一些实施方案中，此类特征或特性可以包括与激活、增殖和/或扩增相关的蛋白质(如表面蛋白)的表达。在一些实施方案中，此类特征或特性可以包括因子(如细胞因子)例如响应于暴露于抗原的产生或分泌。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞相比，通过所提供的方法生成或产生的输出细胞具有更大的CD25表达。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞相比，所述输出CD4+ T细胞具有更大的CD25表达。在一些实施方案中，所述输出组合物的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％细胞对CD25染色呈阳性，例如表达可检测量的CD25。在特定实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞组合物相比，所述输出组合物含有更大部分的对CD25呈阳性的细胞。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出组合物的细胞表达多至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍的CD25，例如，如通过流式细胞术测量输出组合物的细胞中CD25的平均或中位表达所指示。
在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞中的CD27表达相比，通过所提供的方法生成或产生的输出细胞的CD27表达减少。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞部分相比，所述输出组合物中更大部分的细胞呈CD27阴性和/或具有低的或不可检测的CD27水平。在一些实施方案中，与替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞相比，所述输出组合物的细胞的CD27表达(例如，如通过流式细胞术测量的CD27的平均或中位表达)降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞相比，通过所提供的方法生成或产生的输出细胞具有更大的与细胞分裂相关的标记的表达。在一些实施方案中，所述输出细胞表达Ki67。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞部分相比，更大部分的输出CD4+ T细胞表达Ki67。在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD8+ T细胞部分相比，更大部分的输出CD8+ T细胞表达Ki67。在特定实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞组合物相比，所述输出组合物含有更大部分的对Ki67呈阳性的细胞。在一些实施方案中，所述输出组合物的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％细胞对Ki67染色呈阳性，例如表达可检测量的ki67。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出组合物的细胞表达多至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍的Ki67，例如，如通过流式细胞术测量输出组合物的细胞中Ki67的平均或中位表达所指示。
在一些实施方案中，例如响应于暴露于抗原，所述输出细胞具有增加的一种或多种细胞因子的产生和/或分泌，和/或能够增加一种或多种细胞因子的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出细胞具有增加的IFN-γ的产生和/或分泌，和/或能够增加IFN-γ的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出组合物的CD8+ T细胞(例如表达重组受体的CD8+ T细胞)具有增加的IFN-γ的产生和/或分泌，和/或能够增加IFN-γ的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞的所述产生或分泌大至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出细胞具有增加的TNF-α的产生和/或分泌，和/或能够增加TNF-α的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，所述输出组合物的CD8+ T细胞(例如表达重组受体的CD8+ T细胞)具有增加的TNF-α的产生和/或分泌，和/或能够增加TNF-α的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞的所述产生或分泌大至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的细胞相比，例如响应于暴露于抗原，所述输出细胞具有减少的一种或多种细胞因子的产生和/或分泌。在特定实施方案中，所述输出细胞具有减少的INF-γ的产生和/或分泌。在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的CD4+ T细胞相比，所述输出组合物的CD4+ T细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)具有减少的INF-γ的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)的INF-γ的产生或分泌降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少99％。
在特定实施方案中，所述输出细胞具有减少的IL-2的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的CD4+ T细胞相比，所述输出组合物的CD4+ T细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)具有减少的IL-2的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)的IL-2的产生或分泌降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少99％。
在某些实施方案中，所述输出细胞具有减少的GM-CSF的产生和/或分泌。在特定实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的CD4+ T细胞相比，所述输出组合物的CD4+ T细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)具有减少的GM-CSF的产生和/或分泌。在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)的GM-CSF的产生或分泌降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少99％。
在特定实施方案中，所述输出细胞具有减少的MIP1-α的产生和/或分泌。在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生或生成的CD4+ T细胞相比，所述输出组合物的CD4+ T细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)具有减少的MIP1-α的产生和/或分泌。在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程产生的细胞的产生或分泌相比，所述输出细胞(例如表达重组受体的CD4+ T细胞)的MIP1-α的产生或分泌降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少99％。
在特定实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的细胞相比，通过所提供的方法生成或产生的输出细胞具有更低的与细胞凋亡相关的标记的表达(例如，激活的半胱天冬酶和/或对膜联蛋白V的阳性染色的水平)。
在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞相比，所述输出CD4+ T细胞含有更少的膜联蛋白V+细胞。在一些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的CD4+细胞对膜联蛋白V染色呈阳性，例如结合和/或能够结合膜联蛋白V(如重组和/或标记膜联蛋白V)。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的表达重组受体的CD4+细胞对膜联蛋白V染色呈阳性。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞相比，所述输出CD8+ T细胞含有更少的膜联蛋白V+细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的CD8+细胞对膜联蛋白V染色呈阳性。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的表达重组受体的CD8+细胞对膜联蛋白V染色呈阳性。
在某些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞相比，所述输出CD4+ T细胞含有更少的对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性的细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的CD4+细胞对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的表达重组受体的CD4+细胞对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性。
在一些实施方案中，与通过替代性和/或示例性过程生成或产生的CD4+ T细胞相比，所述输出CD8+ T细胞含有更少的对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性的细胞。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的CD8+细胞对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于25％、少于20％、少于18％、少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于8％、少于6％、少于5％、少于3％、少于1％或少于0.1％的表达重组受体的CD8+细胞对激活半胱天冬酶(例如，激活半胱天冬酶3)呈阳性。
在某些实施方案中，将所述输出组合物的细胞给予至受试者。在一些实施方案中，给予所述输出组合物的细胞以治疗疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，将所述输出组合物的细胞给予至受试者并且所述受试者经历癌细胞和/或肿瘤体积的减少。在一些实施方案中，例如，与给予之前受试者中的癌细胞量和/或肿瘤体积相比，在给予所述输出组合物的细胞之后，所述受试者具有、具有约、具有至少25％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％的癌细胞量减少和/或肿瘤减小。在一些实施方案中，与在给予通过示例性替代性过程产生的输出细胞之后受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少相比，给予所述输出组合物的细胞导致受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少增加。
在特定实施方案中，与在给予通过示例性替代性过程产生的输出细胞之后受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少相比，给予所述输出组合物的细胞导致受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少的如下增加：为、为约或至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在特定实施方案中，将所述输出组合物的细胞，例如所述输出组合物的细胞的一部分和/或剂量给予至受试者。在一些实施方案中，被给予所述输出组合物的细胞的所述受试者具有实现和/或经历完全反应(CR)的概率和/或可能性。在某些实施方案中，实现和/或经历CR的概率和/或可能性为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在某些实施方案中，实现和/或经历CR的概率和/或可能性为至少25％。在特定实施方案中，实现CR的概率和/或可能性为至少50％。
在某些实施方案中，被给予所述输出组合物的细胞的所述受试者具有实现和/或经历ORR的概率和/或可能性。在某些实施方案中，实现和/或经历ORR的概率和/或可能性为至少至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在某些实施方案中，实现和/或经历ORR的概率和/或可能性为至少80％。在特定实施方案中，实现ORR的概率和/或可能性为至少90％。在某些实施方案中，实现ORR的概率和/或可能性为或为约100％。
在一些实施方案中，所述输出细胞的功效(例如在给予所述输出组合物的细胞之后受试者将实现和/或经历CR或ORR的概率)大于含有通过替代性过程产生的表达重组受体的细胞的治疗性细胞组合物的所述功效。在某些实施方案中，与给予通过替代性过程产生的治疗性细胞组合物的细胞相比，在给予所述输出细胞之后实现CR或ORR的概率大至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、1倍、2倍、5倍、10倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，通过本文所提供的方法产生的输出细胞具有高和/或相对高程度的安全性。在一些实施方案中，将所述输出组合物的细胞，例如所述输出组合物的细胞的一部分和/或剂量给予至受试者。在一些实施方案中，被给予所述输出组合物的细胞的所述受试者具有小于80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的经历毒性(例如CRS或神经毒性)的风险、概率和/或可能性。在一些实施方案中，所述毒性是任何等级的神经毒性或CRS。在某些实施方案中，被给予所述输出组合物的细胞的所述受试者具有小于80％的经历任何等级的CRS或神经毒性的风险、概率和/或可能性。在特定实施方案中，被给予所述输出组合物的细胞的所述受试者具有小于80％的经历任何等级的CRS或神经毒性的风险、概率和/或可能性。
在一些实施方案中，所述输出组合物的细胞，例如所述输出组合物的细胞的一部分和/或剂量比通过替代性过程产生的输出组合物的细胞更安全。在一些实施方案中，经历任何等级、3级或更高、延长的3级或更高、4级或更高、或5级神经毒性的发生率或概率是在给予通过替代性过程产生的输出细胞之后的所述发生率和/或概率的小于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或小于95％。
在某些实施方案中，所提供的方法与生成经富集T细胞的一种或多种输出组合物的过程结合使用，所述经富集T细胞被工程化以表达重组受体且成功率为至少85％(例如，从多种不同生物样品和/或输入细胞组合物的至少85％成功生成输出细胞组合物)，如成功率在92％与94％之间。在一些实施方案中，所述过程包括以下步骤：在刺激条件下孵育细胞；工程化所述经刺激细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体(如CAR)的多核苷酸；以及将所述工程化细胞培育到阈值量、密度或扩增。在一些实施方案中，完成这些步骤所需的持续时间和/或时间量在8与15天之间或在9-13天之间。在某些实施方案中，所述过程包括以下步骤：收集或获得生物样品；从所述生物样品中分离、选择或富集输入细胞；将所述输入细胞低温冷冻并储存；将所述输入细胞解冻并且/或者在刺激条件下孵育；工程化所述经刺激细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体(如CAR)的多核苷酸；将所述工程化细胞培育至阈值数量、密度或扩增；在输出组合物中配制所述经培育细胞；以及将所述经配制输出细胞低温冷冻并储存，直到释放所述细胞以用于输注和/或给予至受试者。在一些实施方案中，所述过程在从获得或收集生物样品起的19-23天内完成。
在一些实施方案中，所提供的方法与产生经富集的T细胞的一种或多种组合物的过程结合使用，所述一种或多种组合物如来自单一来源，例如生物样品和/或从生物样品中分离、选择或富集的输入组合物。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括含有至少80％的CD4+ T细胞和至少50％的表达重组受体的CD4+ T细胞的经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物包括经富集CD4+ T细胞的组合物和含有至少80％的CD8+ T细胞和至少50％的表达重组受体的CD8+ T细胞的经富集CD8+ T细胞的组合物。
II.重组蛋白
在一些实施方案中，通过本文提供的方法处理、加工、工程化和/或产生的细胞含有或表达，或经工程化以含有或表达重组蛋白，如重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))。在某些实施方案中，本文提供的方法产生和/或能够产生经工程化以表达或含有重组蛋白的细胞或含有和/或富集所述细胞的群体或组合物。在一些实施方案中，处理、加工、工程化和/或产生CD4+ T细胞，或CD4+ T细胞的群体或组合物。
在一些实施方案中，所述细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，然后转导被激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
所述细胞通常表达重组受体，如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体(如转基因T细胞受体(TCR))。所述受体还包括其他嵌合受体。
A.嵌合抗原受体
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，嵌合受体(如嵌合抗原受体)含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域将提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活性细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，其提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061；美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；以及欧洲专利申请号EP2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何前述出版物中披露的CAR，所述出版物如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
所述嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，所述受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，所述抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，所述抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugateantibody)、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段(在本文中也称为“抗原结合片段”)。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，指代抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，指代重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能取决于用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母提供插入(例如“30a”)，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat定义与Chothia定义之间的折衷，基于由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的方案。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出了残基编号。FR位于CDR之间，例如其中FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，ChothiaCDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化。
表1.根据各种编号方案的CDR边界。
Figure BDA0002556464920001351
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单个指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定CDR序列。使用各种编号方案描述了所提供的抗体的示例性CDR序列，但应理解，所提供的抗体可以包含根据任何其他前述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所述的CDR。
同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)涵盖如由任何已知方案所定义的一个(或特定的)框架区。在一些情形中，指定了用于鉴定一个或多个特定的CDR、FR的方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见，例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:38和39中所示的CDRH1和H2，以及在SEQ ID NO:40或54中所示的CDRH3、和在SEQ ID NO:35中所示的CDRL1、和在SEQ ID NO:36或55中所示的CDR L2、和在SEQ ID NO:37或34中所示的CDR L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ ID NO:36的CDRL2序列和SEQ ID NO:37的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQ ID NO:39的CDRH2序列和SEQ ID NO:40的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41中所示的可变重链区和SEQ ID NO:42中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ IDNO:56中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:57中所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:43至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:47-49中分别所示的CDRH1、H2和H3，以及SEQ ID NO:44-46中分别所示的CDRL1、L2和L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:44的CDRL1序列、SEQ ID NO:45的CDRL2序列和SEQ ID NO:46的CDRL3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDRH1序列、SEQ ID NO:48的CDRH2序列和SEQ ID NO:49的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50中所示的可变重链区和SEQ ID NO:51中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ IDNO:52中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:53至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD20的抗体或抗体片段是如下抗体，所述抗体是或源自利妥昔单抗，例如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，所述抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD22的抗体或抗体片段是如下抗体，所述抗体是或源自m971，例如是m971 scFv。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(例如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞应答性。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际专利申请公开号WO2014031687、美国专利号8,822,647或公开的申请号US 2014/0271635。
在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些实施方案中，所述间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:1中所示)，并且由SEQ ID NO:2所示的序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:5中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4或5中的任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:25-33中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:25-33中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，所述抗原识别结构域(例如细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟在CAR的情况下通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或通过另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含在细胞外结构域(例如，scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，所述结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，受体含有衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如CD28细胞外部分。
所述细胞内信号传导结构域包括模拟或接近经过天然抗原受体经过的信号、这种受体与共刺激受体的组合的信号、和/或仅经过共刺激受体的信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些方面，CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分连接至一种或多种细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD3跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如条件是所述截短部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体的那些胞质序列，所述共受体在自然环境中与此类受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活组分和共刺激组分二者。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，所述激活结构域包括在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括激活或刺激CAR、共刺激CAR，它们均在相同细胞上表达(参见WO 2014/055668)。在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导了抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，可以使用这种策略以降低在如下情况下的脱靶效应的可能性：其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这种抑制性分子或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其用于减弱细胞的应答(例如，由激活和/或共刺激性CAR诱导的应答)。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在胞质部分中涵盖一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述抗原受体进一步包括标记，和/或表达所述CAR或其他抗原受体的细胞进一步包括替代标记，如细胞表面标记，所述标记可以用于证实细胞被转导或工程化以表达所述受体。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
用于截短的EGFR(例如，tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6或17中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是并未在T细胞上天然发现的或并未在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子(例如，非自身蛋白)，即没有被细胞过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一定所需作用的分子，如会在体内遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体后的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
例如，在一些实施方案中，所述CAR含有对抗原(包括如所述的任一种)具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR含有对抗原(包括如所述的任一种)具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD28(例如登录号P01747.1)的跨膜结构域或其变体，如包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:9至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的一个或多个细胞内信号传导组分含有人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:10或11至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB(例如登录号Q07011.1)的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或展现出与SEQID NO:12至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112AA胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:13、14或15至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ ID NO:1中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，所述间隔子是或含有任选地与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，如源自IgG4的铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有源自CD28的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、源自CD28的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的细胞内信号传导结构域和源自CD3ζ的信号传导结构域。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短形式，如无功能并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在7或16中所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002556464920001451
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，所述表位可以用于鉴定或选择已经工程化以表达tEGFR构建体和编码的外源蛋白质的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所披露的任一种。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游进一步包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:6或17中所示的T2A核糖体跳跃元件或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以表达截短的EGFR(EGFRt)作为非免疫原性选择表位(例如通过引入编码被T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体，以表达来自相同构建体的两种蛋白质)，然后所述非免疫原性选择表位可用作检测此类细胞的标记(参见例如美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:7或16中所示的tEGFR序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见，例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A元件。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)(T2A，例如，SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A，例如，SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
由给予至受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性地结合至在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或为所治疗的疾病或病症或其细胞特有的分子。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，所述细胞表达CAR，所述CAR特异性地结合至由疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关的抗原。
B.TCR
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且所述分子或其抗原结合部分能够与结合至MHC分子的肽特异性地结合。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与对肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要。在一些情况下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或对其的识别具有最大贡献或者是主要负责的CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health,1991,第5版)和与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+ T细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中经扩增的产物被克隆或组装以通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，使TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对抗原的特定亲和力或亲合力来选择。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已修饰或工程化的TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法实现，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)ProcNatl Acad Sci U S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够形成与CD3的TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，TCR在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)903830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够在保持TCR结合特异性的同时形成单条多肽链的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长而阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从10至45个氨基酸或从约10至约45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:29)。
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在dTCR或scTCR含有引入的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现对靶抗原的亲和力，其平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的手段扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术来制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其与编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑了其他已知的启动子。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目的TCR的T细胞克隆中分离的总cDNA进行PCR扩增，并且将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
III.给予方法
在一些实施方案中，通过所提供的方法(如在章节I中提供的)产生的经富集T细胞的输出组合物(如CD4+和CD8输出组合物的分离的组合物)作为细胞疗法(例如，过继细胞疗法)给予。在特定实施方案中，一种或多种细胞组合物(例如，本文所述的输出细胞组合物)作为细胞疗法给予。在一些实施方案中，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)。参见，例如Themeli等人(2013)NatBiotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在某些实施方案中，本文提供的方法从自单一生物样品分离、选择和/或富集的输入细胞产生经富集T细胞的单一输出组合物，其作为细胞疗法给予。在特定实施方案中，所述单一输出组合物是经富集CD4+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述单一输出组合物是经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，本文提供的方法从单一来源，例如生物样品和/或从生物样品中分离、选择或富集的输入组合物产生两种或更多种输出组合物，所述两种或更多种输出组合物给予至受试者。在一些实施方案中，将所述两种或更多种输出组合物分开给予至受试者。在某些实施方案中，将所述两种或更多种输出组合物合并为单一组合物并且给予至受试者。在某些实施方案中，所述两种或更多种输出组合物包括经富集CD4+ T细胞的输出组合物和经富集CD8+ T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，给予至受试者的经富集CD4+ T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述输出组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD4+ T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+ T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+ T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化相关的疾病或病症(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病、或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自以下：αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶像孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一些方面，疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些情况下，疾病或病症是NHL(例如或包括作为侵袭性NHL的NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30，或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR，β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴样肿瘤、骨髓瘤、与AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中所述细胞是从要接受所述细胞疗法的受试者或者从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
通过本文提供的方法(如章节I中所述)产生的细胞(例如工程化细胞)可以通过任何合适的手段给予。在特定实施方案中，将来自两种或更多种单独输出组合物(例如，通过本文提供的方法(如章节I中所述)产生的经富集T细胞的组合物)的细胞合并为待给予的单一细胞组合物。在某些实施方案中，将来自单独输出组合物的细胞各自分开给予至受试者。在某些实施方案中，将CD4+ T细胞与CD8+ T细胞分开给予。
在一些实施方案中，所述细胞可以是通过以下方式来给予：通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射，或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是例如在不超过3天的时间段内通过所述细胞的多次推注给予来给予，或通过所述细胞的连续输注给予来给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的给予是通过门诊递送进行的。
为了预防或治疗疾病，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是治疗目的给予细胞、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗给予受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。所述细胞在一些实施方案中是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，两者的时间足够接近，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述给予之前给予化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)例如以减小肿瘤负荷。
用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者在一些方面可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在起始细胞疗法之前将预调理剂给予至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在起始细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者给予预调理剂。在一些实施方案中，在起始细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者给予预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天一次给予环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或250mg/m2与350mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予环磷酰胺。在一些情形中，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予氟达拉滨。在一些情形中，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在给予细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面,所述生物活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减小)来测量。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防功效。例如，可以将所述群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践是已知的。参见，例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 11(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞给予受试者。在一些实施方案中，所述剂量的大小或时间安排是根据所述受试者的特定疾病或病症来确定。在一些情况下，鉴于所提供的描述，针对特定疾病的所述剂量的大小或时间安排可以凭经验来确定。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含在2x 105或约2x 105个细胞/kg与2x 106或约2x 106个细胞/kg之间，如在4x 105或约4x 105个细胞/kg与1x106或约1x 106个细胞/kg之间或在6x 105或约6x 105个细胞/kg与8x 105或约8x 105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含不超过2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x 105个细胞/kg、不超过或不超过约4x 105个细胞/kg、不超过或不超过约5x 105个细胞/kg、不超过或不超过约6x 105个细胞/kg、不超过或不超过约7x 105个细胞/kg、不超过或不超过约8x 105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x 106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x 106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含至少或至少约或为或为约2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或为约3x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约4x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约5x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约6x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约8x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约1x 106个细胞/kg、或至少或至少约或为或为约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，所述细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重该细胞量的范围给予受试者，例如像100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量是细胞的平坦剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从或从约1x 105至5x 108个总CAR表达T细胞、1x 105至2.5x 108个总CAR表达T细胞、1x 105至1x 108个总CAR表达T细胞、1x105至5x 107个总CAR表达T细胞、1x 105至2.5x 107个总CAR表达T细胞、1x 105至1x 107个总CAR表达T细胞、1x 105至5x 106个总CAR表达T细胞、1x 105至2.5x 106个总CAR表达T细胞、1x 105至1x 106个总CAR表达T细胞、1x 106至5x 108个总CAR表达T细胞、1x 106至2.5x 108个总CAR表达T细胞、1x 106至1x 108个总CAR表达T细胞、1x 106至5x 107个总CAR表达T细胞、1x 106至2.5x 107个总CAR表达T细胞、1x 106至1x 107个总CAR表达T细胞、1x 106至5x106个总CAR表达T细胞、1x 106至2.5x 106个总CAR表达T细胞、2.5x 106至5x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 106至2.5x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 106至1x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 106至5x 107个总CAR表达T细胞、2.5x 106至2.5x 107个总CAR表达T细胞、2.5x 106至1x 107个总CAR表达T细胞、2.5x 106至5x 106个总CAR表达T细胞、5x 106至5x 108个总CAR表达T细胞、5x 106至2.5x 108个总CAR表达T细胞、5x 106至1x 108个总CAR表达T细胞、5x 106至5x 107个总CAR表达T细胞、5x 106至2.5x 107个总CAR表达T细胞、5x 106至1x 107个总CAR表达T细胞、1x 107至5x 108个总CAR表达T细胞、1x 107至2.5x 108个总CAR表达T细胞、1x107至1x 108个总CAR表达T细胞、1x 107至5x 107个总CAR表达T细胞、1x 107至2.5x 107个总CAR表达T细胞、2.5x 107至5x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 107至2.5x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 107至1x 108个总CAR表达T细胞、2.5x 107至5x 107个总CAR表达T细胞、5x 107至5x108个总CAR表达T细胞、5x 107至2.5x 108个总CAR表达T细胞、5x 107至1x 108个总CAR表达T细胞、1x 108至5x 108个总CAR表达T细胞、1x 108至2.5x 108个总CAR表达T细胞或2.5x 108至5x 108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约1x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在约1x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如2x 106、5x 106、1x 107、5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括约1x 106与3x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如在约1x 107至2x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、5x 107、1x 108或1.5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予从1x 105至5x 108或从约1x 105至约5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从1x 105至1x 108或从约1x 105至约1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从5x 105至1x 107或从约5x 105至约1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、或从约1x 106至1x 107或从约1x 106至约1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量的CD8+ T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+ T细胞)包括约1x 106与1x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在约5x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x107、7.5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予从1x 107至0.75x 108或从约1x 107至约0.75x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞、从1x 107至2.5x 107或从约1x 107至约2.5x 107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从1x107至0.75x 108或从约1x 107至约0.75x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予或给予约1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107或1x 108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量的CD4+ T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+ T细胞)包括约1x 106与1x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD4+细胞，例如在约5x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x107、7.5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予从1x 107至0.75x 108或从约1x 107至约0.75x 108个总重组受体表达CD4+ T细胞、从1x 107至2.5x 107或从约1x 107至约2.5x 107个总重组受体表达CD4+ T细胞、从1x 107至0.75x 108或从约1x 107至约0.75x 108个总重组受体表达CD4+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞剂量包括给予或给予约1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107或1x 108个总重组受体表达CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的所述剂量作为单一剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在过继细胞疗法的情况下，给予给定“剂量”涵盖给予作为单一组合物和/或单次不间断给予(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)给予在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是在单一时间点给予或起始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段中以多次注射或输注(如每天一次，持续三天或两天)来给予，或者是在一天的时间段中通过多次输注来给予。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物给予。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指被分割使得在多于一天中给予的剂量。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单一剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量给予，例如随时间给予的分割剂量。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以在2天内或在3天内给予所述受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方案中，所述分割剂量的分布不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来给予，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地给予各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的所述多种组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别包含富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+ T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，其包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞，以及给予第二组合物，其包含另一剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的给予(例如，所述多种细胞组合物的给予)涉及分开给予细胞组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物是通过所提供的方法(如章节I中所述)产生的单独输出组合物。在一些方面，分开给予同时或按任何顺序依次进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的给予相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和第二组合物的给予的起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和/或完成和第二组合物的给予的完成和/或起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予的。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包含限定或目标比率的表达重组受体的CD4+ T细胞与表达重组受体的CD8+ T细胞和/或限定或目标比率的CD4+ T细胞与CD8+T细胞，所述比率任选地为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的给予涉及给予含有一个所述群体的细胞组合物，并且然后给予包含另一所述群体的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以目标或所需比率来进行的。在一些方面，以限定比率给予细胞的剂量或组合物导致T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性得到改善。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，将两个剂量给予受试者。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天给予的。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量给予受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的给予与连续剂量的给予之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是在给予第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给予所述另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)给予另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不给予剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包括两个剂量(例如，双剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中的一个或两个包括给予T细胞的分割剂量。
在一些实施方案中，所述细胞剂量通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，所述细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，所述细胞剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的细胞的所需总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，所述剂量基于此类特征的组合，此类特征是例如所需的总细胞数、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，细胞(如CD8+和CD4+ T细胞)的所述群体或亚型是以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)来给予，或在所述所需剂量的容忍差异内给予。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型是以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+的比率)存在，例如，在这个比率的某一容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来给予，或在所述所需剂量的容忍差异内给予。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或被给予所述细胞的受试者的所需的每单位体重的此类细胞数量(例如细胞/kg)。在一些方面，所述所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数量或每单位体重的所述群体或亚型的最小细胞数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或是基于一种或多种(例如，每种)单独亚型或亚群的所需固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+ T细胞的比率，和/或是基于所需的CD4+和/或CD8+ T细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+ T细胞或亚型)的所需输出比率来给予，或在所述所需输出比率的容忍范围内给予。在一些方面，所述所需比率可以是特定比率或者可以是比率的范围。例如，在一些实施方案中，所述所需比率(例如，CD4+与CD8+ T细胞的比率)在1:5或约1:5与5:1或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在1:3或约1:3与3:1或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在2:1或约2:1与1:5或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或为约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。在某些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的组合物以所需比率合并并且作为单一细胞组合物给予至受试者。在特定实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的组合物作为单独组合物以所需比率给予。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，所述剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的给予：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
A.反应、活性和存活期
在一些实施方案中，将通过本文提供的方法(例如，如章节I中所述)产生的细胞(例如，输出细胞)给予至受试者，并且监测所述受试者的反应、存活期和/或体征或毒性症状。
在一些实施方案中，至少35％、至少40％或至少50％的用细胞组合物(例如含有CAR+CD4+和CD8+ T细胞的治疗性细胞组合物)治疗的受试者产生缓解(CR)；和/或至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应率(ORR)。在一些实施方案中，至少或约至少50％的根据所述方法治疗的受试者、至少或约至少60％的受试者、至少或约至少70％的受试者、至少或约至少80％的受试者或至少或约至少90％的受试者实现CR和/或实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，有效治疗的所评估标准包括总体反应率(ORR)、完全反应(CR)、反应持续时间(DOR)、无进展存活期(PFS)和/或总存活期(OS)。
在一些实施方案中，至少40％或至少50％的根据本文提供的方法治疗的受试者实现完全缓解(CR)，展现出大于或大于约3个月、6个月或12个月的无进展存活期(PFS)和/或总存活期(OS)；平均而言，根据所述方法治疗的受试者展现出大于或大于约6个月、12个月或18个月的中值PFS或OS；和/或所述受试者在治疗后展现出至少或至少约6、12、18个月或更久的PFS或OS。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准(Luganocriteria)。(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。在一些方面，反应评估利用任何临床、血液学和/或分子方法。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应涉及视情况使用正电子发射断层成像(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，在使用PET-CT评估嗜FDG组织学的反应的情况下，可以使用5分量表。在一些方面中，所述5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取适度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应涉及在不同可测量位点的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的Waldeyer环或结节外位点中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累位点的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外位点，并且靶淋巴结/淋巴结肿块必须复原至病变的最长横径(LDi)≤1.5cm。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，如果不确定则应是IHC阴性。其他位点可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，其在CR的情况下应不存在(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323–338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。
在一些方面，使用卢加诺标准描述的部分反应(PR；在一些情况下也称为部分缓解)涉及在不同可测量位点的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些位点包括淋巴结和淋巴外位点，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残余疾病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外位点的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量进行计算。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残余摄取，所述残余摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情况下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他位点可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常，已复原但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。
在一些方面中，无进展存活期(PFS)被描述为治疗疾病(如癌症)期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从疾病(如癌症)的诊断日期或治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从起始治疗起一段时间之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在起始治疗后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应可持续超过3个月或超过6个月。
在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应；在一些方面，在实体瘤中确定。(Eisenhauer等人,European Journal of Cancer 45(2009)228-247。)在一些方面，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减少至<10mm。在其他方面，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线总直径为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面，进行性疾病(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，所述总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面中，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。
疾病负荷可以涵盖所述受试者中或所述受试者的器官、组织或体液(如肿瘤或例如可指示转移的另一位置的器官或组织)中所述疾病的总细胞数。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。在一些实施方案中，疾病负荷可以包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。
在一些实施方案中，受试者患有白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残余白血病来确定。
在一些方面，受试者(如患有CLL的受试者)的反应率是基于国际慢性淋巴细胞白血病研讨会(IWCLL)反应标准(Hallek等人,Blood 2008年6月15日；111(12):5446-5456)。在一些方面，这些标准描述如下：完全缓解(CR；在一些情况下也称为完全反应)，其在一些方面要求不存在通过免疫表型分析的外周血克隆淋巴细胞、不存在淋巴结病、不存在肝肿大或脾肿大、不存在全身症状且血细胞计数令人满意；完全缓解伴随不完全骨髓恢复(CRi)，其在一些方面被描述为上文的CR，但没有正常的血细胞计数；部分缓解(PR；在一些情况下也称为部分反应)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数下降≥50％、淋巴结病减少≥50％、或肝或脾减小≥50％，以及外周血细胞计数改善；进展性疾病(PD)，其在一些方面被描述为淋巴细胞计数增加≥50％至>5x109/L、淋巴结病增加≥50％、肝或脾大小增加≥50％、Richter转化或由于CLL所致的新的血细胞减少；和稳定疾病，其在一些方面被描述为不符合CR、CRi、PR或PD的标准。
在一些实施方案中，如果在给予细胞的所述剂量的1个月内，受试者的淋巴结大小小于或小于约20mm，大小小于或小于约10mm或大小小于或小于约10mm，则所述受试者展现CR或OR。
在一些实施方案中，在所述受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到CLL的指标克隆。在一些实施方案中，通过IgH深度测序评估CLL的指标克隆。在一些实施方案中，在给予所述细胞后为或为约或至少或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间，没有检测到所述指标克隆。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微术检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者展现形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者患有白血病。疾病负荷的程度可以通过评估血液或骨髓中的残余白血病来确定。
在一些实施方案中，如果例如如通过光学显微术检测，骨髓中存在大于或等于5％原始细胞，如骨髓中大于或等于10％原始细胞、骨髓中大于或等于20％原始细胞、骨髓中大于或等于30％原始细胞、骨髓中大于或等于40％原始细胞或骨髓中大于或等于50％原始细胞，则受试者展现形态学疾病。在一些实施方案中，如果骨髓中存在少于5％原始细胞，则受试者展现出完全或临床缓解。
在一些实施方案中，受试者可以展现完全缓解，但存在小部分形态学上(通过光学显微镜技术)不可检测的残余白血病细胞。如果受试者展现骨髓中小于5％原始细胞并且展现可分子检测的癌症，则称所述受试者展现最小残余疾病(MRD)。在一些实施方案中，可分子检测的癌症可以使用允许灵敏地检测少量细胞的多种分子技术中的任一种来评估。在一些方面，此类技术包括PCR测定，其可以确定通过染色体易位产生的独特Ig/T细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方案中，可以使用流式细胞术基于白血病特有的免疫表型来鉴定癌细胞。在一些实施方案中，癌症的分子检测可以检测少至100,000个正常细胞中的1个白血病细胞。在一些实施方案中，如果如通过PCR或流式细胞术检测到100,000个细胞中至少或大于1个白血病细胞，则受试者展现可分子检测的MRD。在一些实施方案中，受试者的疾病负荷是不可分子检测的或MRD-，使得在一些情况下使用PCR或流式细胞术技术无法检测到所述受试者中的白血病细胞。
在一些实施方案中，在所述受试者的骨髓中(或在大于50％、60％、70％、80％、90％或更多的根据所述方法治疗的受试者的骨髓中)没有检测到白血病(例如CLL)的指标克隆。在一些实施方案中，通过IGH深度测序来评估白血病(例如CLL)的指标克隆。在一些实施方案中，在给予所述细胞后为或为约或至少或至少约1、2、3、4、5、6、12、18或24个月的时间，没有检测到所述指标克隆。
在一些方面，MRD是通过流式细胞术来检测。可以使用流式细胞术监测骨髓和外周血样品中的癌细胞。在特定方面中，使用流式细胞术检测或监测骨髓中癌细胞的存在。在一些方面，使用通过流式细胞术进行的多参数免疫学检测来检测癌细胞(参见例如，Coustan-Smith等人,(1998)Lancet351:550-554)。在一些方面，使用通过质谱流式细胞术进行的多参数免疫学检测来检测癌细胞。在一些例子中，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50个参数来检测癌细胞。用于检测的抗原是基于所检测的癌症选择的(Foon和Todd(1986)Blood68:1-31)。
在一些实施方案中，与在使用通过替代性过程产生的细胞的可比方法的情况下会观察到的减少相比，给予通过本文提供的方法产生的细胞的剂量或组合物将疾病或病症的负荷(例如，肿瘤细胞数量、肿瘤大小、患者存活期或无事件存活期的持续时间)在更大程度上和/或在更长时间段内减少。在一些实施方案中，检测、评估或测量受试者的疾病或病症的负荷。在一些方面，可以通过检测受试者中或受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中的疾病细胞或疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)的总数来检测疾病负荷。在一些方面，评估受试者的存活、在某一时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，规定疾病或病症负荷的量度。
在一些实施方案中，与通过替代性方法产生的细胞相比，所述受试者的无事件存活率或总体存活率通过给予由所提供的方法(例如，章节I中所述的方法)产生的细胞得到改善。例如，在一些实施方案中，在所述剂量后6个月时通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用通过所提供的方法产生的细胞治疗的受试者展现出无事件存活、无复发存活或存活至少6个月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，至进展时间得到改善，如至进展时间大于或大于约6个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，在通过所述方法治疗之后，与其他方法，例如其中受试者接受含有通过替代性方法产生的细胞的细胞疗法的方法相比，复发的概率降低。例如，在一些实施方案中，在第一剂量后6个月时复发的概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
B.毒性
在某些实施方案中，将通过本文提供的方法(例如，如章节I中所述)产生的细胞(例如，输出细胞)给予至受试者，并且监测所述受试者的毒性体征或症状。
在某些实施方案中，例如，与给予替代性细胞疗法(如通过替代性过程产生的CAR+T细胞组合物)相比，通过所提供的方法产生的细胞(例如，输出细胞)的剂量或组合物导致较低比率和/或较低程度的毒性、毒性结果或症状、促进毒性的概况、因子或特性，如与细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性相关或指示细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的症状或结果。
在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法和/或通过替代性方法产生的细胞相比，给予通过所提供的方法产生的细胞不导致高的毒性或毒性结果的比率或可能性，或者降低毒性或毒性结果的比率或可能性，所述毒性或毒性结果如神经毒性(NT)、细胞因子释放综合征(CRS)。在一些实施方案中，给予通过所提供的方法产生的细胞(例如，输出细胞)导致以下事件或不增加以下事件的风险：严重NT(sNT)、严重CRS(sCRS)、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、至少在或在约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的CRP血浆水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者不展现任何等级的CRS或任何等级的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)不展现严重毒性结果(例如，严重CRS或严重神经毒性)，如不展现3级或更高级的神经毒性和/或不展现严重CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在给予所述细胞的一周、两周或一个月内)不如此展现。在一些实施方案中，被评估以确定某些毒性的参数包括不良事件(AE)、剂量限制性毒性(DLT)、CRS和NT。
给予过继T细胞疗法如用表达嵌合抗原受体的T细胞进行的治疗可以诱导毒性作用或结果，如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些例子中，此类效果或结果与高水平的循环细胞因子并行，高水平的循环细胞因子可能是观察到的毒性的基础。
在一些方面，毒性结果是细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或严重CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者给予其他生物制品后可发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509–1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709–2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。
通常，CRS由增大的例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎性反应和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。严重危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他严重危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。
可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如，抗IL-6抗体，例如，托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。CRS的结果、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或给予实现或不实现给定的CRS相关结果、体征或症状的情况下，可以规定特定结果、体征和症状和/或其量或程度。
在给予CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结果包括发热、寒颤、恶寒、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结果包括疲劳、恶心、头痛、癫痫、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。
已经研发CRS标准，其似乎与CRS的发作相关，以预测哪些患者更可能有风险患上sCRS(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子血清水平，如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fractalkine)和GM-CSF)，这七种细胞因子的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95)。在一些实施方案中，反映CRS等级的标准是下表2中详述的那些标准。
Figure BDA0002556464920001801
在一些实施方案中，受试者被认为响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的给予而产生“严重CRS”(“sCRS”)，条件是给予后所述受试者展示：(1)至少38摄氏度的发热至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与紧跟着给予后的水平相比，下组七种细胞因子中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或(b)与紧跟着给予后的水平相比，下组七种细胞因子中的至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5；以及(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一次静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO2<90％)或一种或多种神经障碍(包括精神状态改变、迟钝和/或癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括3级或更高级CRS，如表2中所示。
在一些实施方案中，与严重CRS或3级CRS或更高级CRS(如4级或更高级)相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如在指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)发热两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如与至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比，例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，严重CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如严重CRS)涵盖以下的组合：(1)持续发热(在至少38摄氏度发热至少三天)和(2)至少或至少约20mg/dL的血清CRP水平。在一些实施方案中，CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续给予中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，严重CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、恶寒、发热型嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。
可以指定测量或检测各种结果的方法。
在一些方面，毒性结果是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识模糊、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫(任选地如通过脑电图[EEG]证实)、β淀粉样蛋白(Aβ)水平升高、谷氨酸水平升高和氧自由基水平升高。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见，例如Guido Cavaletti&Paola Marmiroli NatureReviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。
在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经系统变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，在sCRS的其他症状消退后，会发生神经系统变化的恢复。在一些实施方案中，通过用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会促进神经系统变化的消退时间或程度。
在一些实施方案中，如果在给予后受试者展示限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的以下症状，则认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的给予而发生“严重神经毒性”：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不愉快的感觉)、神经痛(如沿着神经或一组神经的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，严重神经毒性包括3级或更高级神经毒性，如表3中所示。
Figure BDA0002556464920001821
在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结果或因素，包括与严重CRS或3级或更高级的CRS相关的症状、结果或因素。例如，根据本方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如，严重CRS或3级或更高级的CRS)的症状、结果或因素和/或具有减少的所述症状、结果或因素，如所述的(例如表2中所示的)任何症状、结果或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。
在一些实施方案中，给予通过所提供的方法产生的细胞减轻与神经毒性相关的结果，包括对神经系统和/或脑的损害，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子的水平，如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基。
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认所述受试者(如首次确定或确认)展现出持续发热时或此前不久的时间，给予用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，给予所述一种或多种靶向毒性的疗法。
IV.制品
还提供了制品和试剂盒，其含有通过本文提供的方法(如章节I中所述的方法)产生的表达重组受体的工程化细胞和/或章节I-F中所述的细胞的输出组合物；和任选的使用说明书，例如用于诸如通过章节III中所述的方法将所述工程化细胞给予至受试者的说明书。
在一些实施方案中，本文提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物；和向受试者给予以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以规定用于给予本文所提供的细胞的方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书规定给予用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于给予的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于给予的条件。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包含用于淋巴细胞清除疗法的药剂，并且任选地进一步包括用于给予淋巴细胞清除疗法的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于给予的组合物的标签或包装说明书而包含在内。
在一些实施方案中，所述制品可以具有容器(任选地小瓶)，所述容器含有表达重组受体的经富集CD4+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含，任选地包括第二容器(任选地第二小瓶)，所述第二容器含有表达重组受体的经富集CD8+ T细胞的组合物。在一些实施方案中，低温保护剂与所述细胞一起被包括。在一些方面，所述容器是小瓶或袋。在一些实施方案中，所述容器含有经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述容器内的经富集CD4+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述容器的所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述容器内的经富集CD4+ T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+ T细胞，和/或不含有CD8+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述容器内的经富集CD8+ T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述容器内的所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+ T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+ T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，说明书规定了待给予的细胞的剂量。例如，在一些实施方案中，所述说明书中规定的剂量包括在约1x 106与3x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如，在约1x 107至2x 108个范围内的此类细胞，如1x 107、5x 107、1x 108或1.5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。
在一些实施方案中，所述容器(如所述小瓶)包含大于或大于约10x 106个T细胞或重组受体表达T细胞、大于或大于约15x 106个T细胞或重组受体表达T细胞、大于或大于约25x 106个T细胞或重组受体表达T细胞。在一些方面，所述小瓶包含约1000万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml至约5000万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml至约2500万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml至约1500万个细胞/ml、1500万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约1500万个细胞/ml至约5000万个细胞/ml、约1500万个细胞/ml至约2500万个细胞/ml、约2500万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约2500万个细胞/ml至约5000万个细胞/ml、和约5000万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml。
在一些实施方案中，规定用于给予的多个小瓶或多种细胞或细胞单位剂量总地包含一定剂量的细胞，所述剂量包含从1x 105至5x 108或从约1x 105至约5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从1x 105至1x 108或从约1x 105至约1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从5x 105至1x 107或从约5x 105至约1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、或从约1x 106至1x 107或从约1x 106至约1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些方面，所述制品包含一个或多个单位剂量的所述CD4+和CD8+T细胞或CD4+受体+ T细胞和CD8+受体+ T细胞，其中所述单位剂量包含在1x 107或约1x 107个与2x108或约2x 108个之间的重组受体表达T细胞、在5x 107或约5x 107个与1.5x 108或约1.5x108个之间的重组受体表达T细胞、5x 107或约5x 107个重组受体表达T细胞、1x 108或约1x108个重组受体表达T细胞、或1.5x 108或约1.5x 108个重组受体表达T细胞，任选地其中所述制品中的信息规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。在一些情况下，所述制品包含一个或多个单位剂量的所述CD8+ T细胞，其中所述剂量包含在5x 106或约5x 106个与1x 108或约1x 108个之间的重组受体表达CD8+ T细胞，所述剂量包含在1x 107或约1x 107个与0.75x 108或约0.75x 108个之间的重组受体表达CD8+ T细胞，所述剂量包含2.5x 107或约2.5x 107个重组受体表达CD8+ T细胞，或所述剂量包含5x107或约5x 107个重组受体表达CD8+ T细胞，或所述剂量包含0.75x 108或约0.75x 108个重组受体表达CD8+ T细胞，任选地其中所述制品中的信息规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。在一些实施方案中，所述制品中的细胞总地包含一定剂量的细胞，所述剂量包含不超过1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x 106个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x 106个总重组受体表达T细胞或总T细胞。
在一些实施方案中，所述说明书可以规定给予的剂量方案和时间安排。例如，在一些实施方案中，所述说明书可以规定向所述受试者给予细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量。在一些实施方案中，所述说明书规定所述多个剂量的时间安排，例如，第二剂量是在第一剂量之后约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时给予；和/或规定每个剂量中的剂量量。
在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含表达重组受体的经富集CD4+ T细胞的组合物；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述经富集CD4+ T细胞的组合物的全部或一部分以及进一步给予表达重组受体的CD8+ T细胞的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定在给予所述CD8+ T细胞之前给予所述CD4+ T细胞。在一些情况下，所述说明书规定在给予所述CD4+ T细胞之前给予所述CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含表达重组受体的多种CD8+ T细胞；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述多种CD8+ T细胞的全部或一部分以及表达重组受体的CD4+ T细胞的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定给予所述细胞的剂量方案和时间安排。
在一些方面，所述说明书规定相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时给予所述CD4+ T细胞的全部或一部分以及所述CD8+ T细胞的全部或一部分。在一些情况下，所述说明书规定相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟给予所述CD4+ T细胞和所述CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述说明书规定了细胞或一种或多种细胞类型的剂量或数量和/或细胞类型(例如，单独群体或亚型)的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+ T细胞。例如，在一些实施方案中，所述说明书规定，所述细胞是以多个细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+ T细胞或亚型)的输出比率来给予，或在所述输出比率的容忍范围内给予，所述输出比率是在1:5或约1:5与5:1或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在1:3或约1:3与3:1或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在2:1或约2:1与1:5或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或为约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在某些实施方案中，所述说明书规定将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的组合物以所需比率合并并且作为单一细胞组合物给予至受试者。在特定实施方案中，所述说明书规定将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+ T细胞的组合物作为单独组合物以所需比率给予。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
V.定义
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，被给予一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗”(“treatment”)(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良影响或结果、或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。在一些实施方案中，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发生。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目的条件或参数以外其他都相同的条件相比时，或者替代地与另一种条件相比时，降低功能或活性。例如，与不存在细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在给予的情况下，药剂(例如，药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在所需剂量/量下和所需时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、和所给予的细胞群。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在所需剂量下和所需时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或在疾病较早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情况下，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物。例如，“一种/一个”(“a”)或“一种/一个”(“an”)意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与所述组合物中的总细胞数或组合物体积相比，或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于在要耗尽的所述细胞群或细胞上不存在的标记的阴性选择，增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在被富集组合物中以等于或甚至接近100％存在。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的存在，其中所述染色可通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似的水平，和/或显著高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平的水平，和/或与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平基本上相似的水平。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中重组IL-2的浓度为从10IU/mL至200IU/mL或从约10IU/mL至约200IU/mL。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100IU/mL至约1000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从1IU/mL至50IU/mL或从约1IU/mL至约50IU/mL。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。
6.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)孵育包含针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的T细胞的输入组合物，从而产生经刺激组合物，其中所述孵育是在以下情况下进行：
(1)在一种或多种刺激条件下，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子；和/或
(2)在一种或多种抗氧化剂存在下；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
7.根据实施方案6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
8.根据实施方案6或实施方案7所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
9.根据实施方案8所述的方法，其中：
重组IL-2的浓度为从10IU/mL至200IU/mL或从约10IU/mL至约200IU/mL；
重组IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100至约1000IU/mL；并且/或者
重组IL-15的浓度为从1IU/mL至25IU/mL或从约1IU/mL至约25IU/mL。
10.根据实施方案6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
11.根据实施方案6或实施方案10所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
12.根据实施方案6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；并且/或者
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
13.根据实施方案6或实施方案12所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
16.根据实施方案14或实施方案15所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
17.根据实施方案14-16中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
20.根据实施方案18或实施方案19所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
21.根据实施方案18-20中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
22.根据实施方案18-21中任一项所述的方法，其中所述珠是或包括聚苯乙烯表面。
23.根据实施方案18-22中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
24.根据实施方案18-23中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率小于3:1。
25.根据实施方案18-24中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。
26.根据实施方案18-25中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为或为约1:1。
27.根据实施方案5-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。
28.根据实施方案5-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。
29.根据实施方案5-28中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
32.根据实施方案30或实施方案31所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的方法，其中所述引入是在转导佐剂存在下进行。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述载体是转座子，任选地SleepingBeauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在促进所述工程化细胞的增殖或扩增的条件下培育所述工程化组合物，从而产生包含所述工程化T细胞的输出组合物。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述培育是在一种或多种细胞因子存在下进行，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2。
39.根据实施方案37或实施方案38所述的方法，其中在所述培育之前将所述刺激试剂从所述工程化组合物中去除。
40.根据实施方案39所述的方法，其中在起始所述孵育后7天内或少于7天将所述刺激剂去除。
41.根据实施方案39或实施方案40所述的方法，其中在起始所述孵育后从3天至6天或从约3天至约6天将所述刺激剂去除。
42.根据实施方案37-41中任一项所述的方法，其中在起始所述孵育后4天时或约4天时将所述刺激试剂去除。
43.根据实施方案39-42中任一项所述的方法，其中去除所述珠包括使所述工程化组合物的细胞暴露于磁场。
44.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在一种或多种细胞因子存在下培育包含含有用重组受体工程化的细胞的CD4+原代人T细胞的工程化细胞组合物，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化CD4+细胞的输出组合物。
45.根据实施方案44所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
46.根据实施方案44或45所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+重组受体表达细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
47.根据实施方案44-46中任一项所述的方法，其中重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/ml或从约50IU/mL至约500IU/ml。
48.根据实施方案38-47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500IU/mL至约2000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
49.根据实施方案44-48中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+原代人T细胞进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
50.根据实施方案49所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
51.根据实施方案49或实施方案50所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15。
52.根据实施方案37-51中任一项所述的方法，其中所述培育是在表面活性剂存在下进行。
53.根据实施方案37-52中任一项所述的方法，其中所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行。
54.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：在一种或多种细胞因子存在下培育包含含有用重组受体工程化的细胞的CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者的工程化细胞组合物，其中所述培育在表面活性剂存在下进行并且/或者所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化CD4+和/或CD8+ T细胞的输出组合物。
55.根据实施方案48所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞或CD4+和/或CD8+重组受体表达原代T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
56.根据实施方案48所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+和/或CD8+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
57.根据实施方案55所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
58.根据实施方案56或实施方案57所述的方法，其中：
重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/mL或从约50IU/mL至约500IU/mL；
重组IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500至约2000IU/mL；并且/或者
重组IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
59.根据实施方案54所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+和重组受体表达原代人T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
60根据实施方案59所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD8+ T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
61.根据实施方案54或实施方案55所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
62.根据实施方案54所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞或CD8+和重组受体表达原代人T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
63.根据实施方案54或实施方案62所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
64.根据实施方案52-63中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括泊洛沙姆，任选地其中所述泊洛沙姆的存在浓度为从0.5μL/mL至5μL/mL或从约0.5μL/mL至约5μL/mL。
65.根据实施方案64所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
66.根据实施方案54-65中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
67.根据实施方案66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
68.根据实施方案66或实施方案67所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
69.根据实施方案66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
70.根据实施方案66或实施方案69所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
71.根据实施方案66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；并且/或者
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
72.根据实施方案66或实施方案71所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
73.根据实施方案49-53和66-72中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
74.根据实施方案73所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
75.根据实施方案73或实施方案74所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
76.根据实施方案73-75中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
79.根据实施方案77或实施方案78所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
80.根据实施方案77-79中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
81.根据实施方案77-80中任一项所述的方法，其中所述珠是或包括聚苯乙烯表面。
82.根据实施方案77-81中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
83.根据实施方案77-82中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率小于3:1。
84.根据实施方案77-83中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。
85.根据实施方案77-84中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为或为约1:1。
86.根据实施方案49-53和66-85中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。
88.根据实施方案86或实施方案87所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。
89.根据实施方案86-88中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
90.根据实施方案49-53和66-89中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
91.根据实施方案90所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
92.根据实施方案90或实施方案91所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
93.根据实施方案49-53和66-92中任一项所述的方法，其中所述引入是在转导佐剂存在下进行。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。
95.根据实施方案49-53和66-89中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。
96.根据实施方案95所述的方法，其中所述载体是转座子，任选地SleepingBeauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
97.根据实施方案44-69中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物不包含刺激试剂和/或所述培育之前已将所述刺激试剂从所述组合物中基本上去除，所述刺激试剂包含能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的试剂。
98.根据实施方案37-97中任一项所述的方法，其中所述培育进行至少直到所述输出组合物包含阈值数量的T细胞。
99.根据实施方案98所述的方法，其中所述培育在达到T细胞的所述阈值数量之后继续至少一天。
100.根据实施方案98或实施方案99所述的方法，其中所述阈值数量比所述培育之前的所述工程化细胞组合物的数量大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多倍。
101.根据实施方案37-100中任一项所述的方法，其中所述培育进行2天至10天并包含端值，和/或所述培育进行至少10天。
102.根据实施方案37-101中任一项所述的方法，其中在所述培育之后，收集所述输出组合物的细胞。
103.根据实施方案102所述的方法，其中所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从7天至15天或从约7天至约15天。
104.根据实施方案102或所述方案102所述的方法，其中所述孵育的起始与所述收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从9天至13天或从约9天至约13天。
105.根据实施方案102-104中任一项所述的方法，其中所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从8天至13天或从约8天至约13天。
106.根据实施方案37-105中任一项所述的方法，所述方法进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。
107.根据实施方案106所述的方法，其中在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。
108.根据实施方案107所述的方法，其中所述低温保护剂包括DMSO。
109.根据实施方案106-108中任一项所述的方法，其中将所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
110.根据实施方案1-43和49-53和66-89中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述孵育之前将所述CD4+和/或所述CD8+ T细胞从生物样品中分离。
111.根据实施方案110所述的方法，其中所述分离包括基于CD4和/或CD8的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
112.根据实施方案110或实施方案111的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
113.根据实施方案110-112中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。
114.根据实施方案113所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
115.根据实施方案110-112中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
116.根据实施方案1-115中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
117.根据实施方案116所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
118.根据实施方案116或117所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
119.根据实施方案116-118中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自5T4、8H9、avb6整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症-睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
120.根据实施方案1-119中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
121.根据实施方案1-120中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
122.根据实施方案1-121中任一项所述的方法，其中所述重组受体是抗CD19 CAR。
123.根据实施方案121所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
124.根据实施方案123所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
125.根据实施方案124所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
126.根据实施方案124或实施方案125所述的方法，其中所述片段包含scFv。
127.根据实施方案123-126中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含间隔子和/或铰链区。
128.根据实施方案123-127中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。
129.根据实施方案128所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
130.根据实施方案129所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
131.根据实施方案130所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
132.根据实施方案128-131中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
133.根据实施方案128-132中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
134.根据实施方案133所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
135.根据实施方案133或实施方案134所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
136.根据实施方案133-135中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
137.根据实施方案98-101中任一项所述的方法，其中包含所述阈值数量或更大数量的细胞的所述输出组合物在所述方法的大于或大于约85％、大于或大于约90％或大于或大于约95％的重复之间产生。
138.一种包含工程化细胞的组合物，所述组合物通过根据实施方案1-137中任一项所述的方法产生。
139.根据实施方案138所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
140.根据实施方案138或实施方案139所述的组合物，其包含低温保护剂，任选地DMSO。
141.一种制品，所述制品包含根据实施方案138-140中任一项所述的组合物；和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。
142.根据实施方案141所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
143.根据实施方案141或142所述的制品，其中所述输出组合物是工程化CD4+ T细胞的组合物。
144.根据实施方案141或142所述的制品，其中所述输出组合物是CD8+ T细胞的工程化组合物。
145.一种制品，所述制品包含通过实施方案1-11、13-60、63-70或72-137中任一项所述的方法产生的工程化CD4+ T细胞的组合物、通过实施方案6-8、11-43、54-58、60-68或70-137中任一项所述的方法产生的工程化CD8+ T细胞的组合物；和用于将所述工程化CD4+T细胞和所述工程化CD8+ T细胞给予至受试者的说明书。
146.根据实施方案145所述的制品，其中所述说明书规定将所述CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分开给予至所述受试者。
147.根据实施方案145或146所述的制品，其中所述说明书规定将所述CD4+ T细胞和所述CD8+ T细胞以所需比率给予至所述受试者。
148.根据实施方案1-137中任一项所述的方法，其中所述方法在少于21天(包含端值)中进行。
VII.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：用于产生表达抗CD19 CAR的CD4+和CD8+细胞的治疗性组合物的过程。
通过如下过程产生各自表达相同抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞：所述过程涉及使经富集CD4+和经富集CD8+细胞群分别经历过程步骤。从已通过白细胞单采术获得的人外周血单核细胞(PBMC)中分别选择CD4+和CD8+细胞，从而产生单独的经富集CD4+和经富集CD8+细胞组合物，然后将其低温冷冻。随后将CD4+和CD8+组合物解冻，并分别经历刺激、转导和扩增的步骤。
将解冻的CD4+和CD8+细胞分别在与抗CD3和抗CD28抗体偶联的聚苯乙烯包被的顺磁珠存在下进行刺激，珠与细胞的比率为1:1。在含有人重组IL-2、人重组IL-15和N-乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基中进行刺激。所述CD4+细胞培养基还包含人重组IL-7。
引入所述珠之后，用编码相同抗CD19 CAR的慢病毒载体分别转导CD4+和CD8+细胞。CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv、免疫球蛋白间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区域和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。所述载体还编码截短的EGFR(EGFRt)，其用作CAR表达的替代标记，通过T2A序列连接至CAR构建体。在10μg/ml硫酸鱼精蛋白存在下转导细胞。
转导后，通过暴露于磁场将所述珠从所述细胞组合物中去除。然后通过生物反应器(Xuri W25生物反应器)，在连续混合和氧气转移的情况下，分别培育CD4+和CD8+细胞组合物以进行扩增。将泊洛沙姆添加到培养基中。在IL-2和IL-15存在下培育两种细胞组合物。CD4+细胞培养基还包含IL-7。在收获之前，将CD4+和CD8+细胞各自培育至4倍扩增。达到阈值后一天，分别收获、配制和低温冷冻来自每种组合物的细胞。将示例性过程汇总于表E1中。
表E1：用于产生CD4+和CD8+CAR-T细胞的示例性过程的汇总
Figure BDA0002556464920002051
Figure BDA0002556464920002061
*大约
将表E1中汇总的示例性过程与示例性替代性过程进行比较。所述替代性过程的不同之处在于：在刺激期间未将NAC添加至培养基中；CD4+细胞培养基不含有IL-2；以3:1的珠与细胞比率刺激细胞；用更高浓度的硫酸鱼精蛋白转导细胞；在约第7天进行珠去除；并且在静态设置下(即不进行连续混合或灌注(例如，半连续和/或逐步灌注)的情况下)并且在无泊洛沙姆的情况下进行扩增。
实施例2：对用于产生CD4+和CD8+CAR-T细胞的治疗性组合物的过程持续时间的评 估。
评估实施例1中所述的示例性和替代性过程的各种属性。在一个实验中，使用从相同的DLBCL人白细胞单采术样品中获得的单独的CD4+和CD8+细胞组合物，对示例性和替代性过程进行过程运行。在每个过程的刺激、转导和扩增期期间的不同时间点测量总细胞计数。如图1中所示，经历示例性过程的CD4+和CD8+细胞组合物更快地扩增并且达到示例性扩增程度(4倍扩增)，在本研究中，所述扩增程度在该研究中被指定为在收获之前，在短于使用替代性过程观察到的时间量内达到。
实施例1中的示例性过程和替代性过程的扩增期(在该研究中运行直到4倍扩增)的持续时间是根据从收集自患有DLBCL的受试者的白细胞单采术样品中获得的单独的CD4+和CD8+细胞组合物的多个过程运行评估的。基于用从收集自健康受试者和患有DLBCL的受试者的白细胞单采术样品获得的单独的CD4+和CD8+细胞组合物的一组示例性运行，评估示例性过程的该时期的持续时间。持续时间被测量为从刺激开始到收获(在该示例性研究中，在达到四倍扩增后一天进行收获)之间的时间长度。在该研究中，与替代性过程持续时间相比，观察到示例性过程的运行从扩增开始到4倍扩增或收获的持续时间较短，在此持续时间的不同运行之间具有较窄分布(如，在一项研究中在9与13天之间)。
对利用示例性过程和替代性过程的示例性生产方案(分别为示例性生产方案和替代性生产方案)的持续时间进行建模。一般来讲，建模结果与以下解释相一致：与其他生产方案相比，所述示例性过程能够实现相对较短的方案持续时间，并具有较小变化性。
实施例3：对用于产生CD4+和CD8+CAR-T细胞的治疗性组合物的过程的评估。
使用示例性过程处理从样品获得的一组示例性CD4+和CD8+细胞组合物(包括在替代性过程中展现出大于17天的扩增期(扩增至收获(4倍扩增))持续时间的那些和展现出等于或少于17天的扩增期持续时间的那些)。在刺激、转导和扩增期期间的不同时间点测量总细胞计数，直到实现收获阈值。
已经扩增4倍的CD4+和CD8+细胞组合物是用示例性过程从来自两种类型的组合物(在其他过程中在少于17天内观察到扩增到4倍或更多的那些，和在大于17天内观察到如此扩增的那些)的样品产生的，在持续时间内具有较小变化性范围。
实施例4：从获自患有慢性淋巴细胞性白血病的受试者的生物样品产生CD4+和CD8 +CAR-T细胞的治疗性组合物。
通过实施例I中所述的示例性过程，孵育、转导和培育CD4+和CD8+ T细胞的单独组合物，所述单独组合物选自从获自患有慢性淋巴细胞性白血病(CCL)的受试者的人白细胞单采术样品分离的PBMC。产生了各自表达相同的抗CD19 CAR的工程化CD4+ T细胞和工程话CD8+ T细胞的单独组合物。
实施例5：用于在培育期间确定细胞活力的连续在线成像。
使用在线差分数字全息显微术(DHM)获得了进行工程化以表达重组受体的过程中T细胞的各种光学参数。差分DHM允许以用于对象分割的高对比度图像对细胞进行无标签成像，并获得定量描述成像对象的多个光学或形态特征，例如，用于确定细胞计数和活力。
大体上如以上实施例1中所述，使用示例性工程化过程将来自健康人类供体的原代T细胞工程化以表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)。进行了两个实验：实验1用来自两个不同健康供体(供体1或供体2)的CD4+细胞进行两次实验运行，以及实验2使用来自第三供体(供体3)的CD4+细胞和CD8+细胞中的每一种进行实验运行。通过转移至生物反应器(例如，摇摆运动生物反应器)来培育细胞以进行扩增。培育包括在半连续灌注和连续混合情况下置换培养基。
在培养的长达大约120小时内使用在线差分DHM成像系统(“连续”)，例如OvizioiLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA，布鲁塞尔，比利时)连续捕获细胞的全息图像和光学参数。在线差分DHM系统包括连接至生物反应器的一次性管路系统，使得样品可以从生物反应器流经管路系统，其中成像系统捕获行进穿过的细胞的全息图像和光学参数，并且使样品返回到生物反应器。从图像确定细胞活力和活细胞计数(VCC)。还将工程化细胞的活力与通过手动采样(“手动”)和使用自动细胞计数器进行计数(在培养的长达大约120小时内的各个时间点采样)的结果进行比较。基于时程分析和线性回归比较了这两种方法。
图2A-图2D示出了在来自实验1供体1(图2A)，实验1供体2(图2B)或实验2供体3(图2C)的CD4+细胞，或来自实验2供体3(图2D)的CD8+细胞中，使用通过差分DHM连续监测或手动采样评估的活细胞计数(VCC)和活力。比较的R2和斜率示出在下表E2中。
表E2.采样方法之间的比较的R2和斜率。
Figure BDA0002556464920002081
结果显示，对于CD4+和CD8+细胞以及来自不同供体的细胞，作为连续监测和手动采样的VCC和活力高度相关。所述结果与在细胞工程化过程中的用于扩增细胞的培育期间通过差分DHM连续监测的效用一致。
实施例6：使用连续在线成像比较手动扩增和自动化扩增。
将通过在线成像和自动灌注连续监测细胞的完全自动化、无操作者的细胞扩增方法与手动扩增方法进行比较。
使用示例性工程化过程，将来自健康人供体的原代T细胞激活并用载体转导，以表达示例性嵌合抗原受体(CAR)。转导后，将细胞汇集并接种以进行两种不同的培养，一种是基于使用差分DHM的连续在线成像的自动化扩增，并且另一种是手动扩增方法。
在自动化扩增培养中，在摇摆运动生物反应器中培育细胞，其中在灌注和连续混合的情况下进行培养基置换。大体上如以上实施例5中所述，使用自动化差分DHM成像系统监测细胞活力和活细胞计数(VCC)。对于两种培养，在接种时的初始VCC是相似的(对于自动化培养0.12x 106个细胞/mL，对于手动培养为0.14x 106个细胞/mL)。自动化扩增中的灌注是基于通过软件算法计算的VCC的四小时滚动平均值，其中所述方法的进展要求VCC平均值大于目标VCC。对于3个灌注步骤，目标VCC为0.6x 106个细胞/mL、1x 106个细胞/mL和4x 106个细胞/mL。接种后不发生另外的操作者干预。在手动扩增培养中，基于手动采样和VCC评估进行灌注，在达到阈值VCC后添加特定体积的培养基。还通过流式细胞术评估细胞的细胞表面标记表达。
如图3中所示，在自动化扩增系统的情况下观察到更高的T细胞生长。如通过连续差分DHM成像评估的细胞活力和如通过流式细胞术评估的细胞表型在自动化扩增过程与手动扩增过程之间相似。
所述结果与无需人操作者的用于在T细胞工程化过程期间培育和监测细胞的连续DHM成像和自动化扩增过程的效用一致。在一些方面，这种方法可用于确定原代T细胞的生长动力学，并确定收获细胞以进行工程化或给予的时间。
本发明在范围上并不旨在受限于具体公开的实施方案，提供所述实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002556464920002101
Figure BDA0002556464920002111
Figure BDA0002556464920002121
Figure BDA0002556464920002131
Figure BDA0002556464920002141
Figure BDA0002556464920002151
序列表
<110> Juno Therapeutics, Inc.
Lee, Sarah Y.
<120> 产生工程化细胞的治疗性组合物的方法
<130> 73504-20132.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/580,409
<151> 2017-11-01
<150> US 62/596,771
<151> 2017-12-08
<150> US 62/721,603
<151> 2018-08-22
<160> 61
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (aa)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (nt)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223>铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223>铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179 )
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179 )
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>示例性接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头
<400> 24
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 25
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 26
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 34
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 56
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD33信号肽
<400> 58
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 59
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 60
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 60
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 61
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 61
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20

Claims (158)

1.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中重组IL-2的浓度为从10IU/mL至200IU/mL或从约10IU/mL至约200IU/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100IU/mL至约1000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从1IU/mL至50IU/mL或从约1IU/mL至约50IU/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。
6.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)孵育包含针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的T细胞的输入组合物，从而产生经刺激组合物，其中所述孵育是在以下情况下进行：
(1)在一种或多种刺激条件下，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子；和/或
(2)在一种或多种抗氧化剂存在下；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：
重组IL-2的浓度为从10IU/mL至200IU/mL或从约10IU/mL至约200IU/mL；
重组IL-7的浓度为从100IU/mL至1000IU/mL或从约100至约1000IU/mL；并且/或者
重组IL-15的浓度为从1IU/mL至25IU/mL或从约1IU/mL至约25IU/mL。
10.根据权利要求6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
11.根据权利要求6或权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
12.根据权利要求6所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；并且/或者
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
13.根据权利要求6或权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述珠是或包含聚苯乙烯表面。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率小于或小于约3:1。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为或为约1:1。
27.根据权利要求5-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。
28.根据权利要求5-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。
29.根据权利要求5-28中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述引入是在转导佐剂存在下进行。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述载体是转座子，任选地SleepingBeauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其进一步包括在促进所述工程化细胞的增殖或扩增的条件下培育所述工程化组合物，从而产生包含所述工程化T细胞的输出组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述培育是在一种或多种细胞因子存在下进行，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中在所述培育之前将所述刺激试剂从所述工程化组合物中去除。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在起始所述孵育后7天内或少于7天将所述刺激剂去除。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中在起始所述孵育后从3天至6天或从约3天至约6天将所述刺激剂去除。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的方法，其中在起始所述孵育后4天时或约4天时将所述刺激剂去除。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中去除所述珠包括使所述工程化组合物的细胞暴露于磁场。
44.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在一种或多种细胞因子存在下培育包含含有用重组受体工程化的细胞的CD4+原代人T细胞的工程化细胞组合物，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化CD4+细胞的输出组合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+重组受体表达细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/ml或从约50IU/mL至约500IU/ml。
48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15，任选地其中IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500IU/mL至约2000IU/mL并且/或者IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+原代人T细胞进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，其中至少一种细胞因子是或包括重组人IL-2，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
51.根据权利要求49或权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子进一步包括IL-7和/或IL-15。
52.根据权利要求37-51中任一项所述的方法，其中所述培育是在表面活性剂存在下进行。
53.根据权利要求37-52中任一项所述的方法，其中所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行。
54.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：在一种或多种细胞因子存在下培育包含含有用重组受体工程化的细胞的CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者的工程化细胞组合物，其中所述培育在表面活性剂存在下进行并且/或者所述培育的至少一部分是在连续混合和/或灌注的情况下进行；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化CD4+和/或CD8+T细胞的输出组合物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞或CD4+和/或CD8+重组受体表达原代T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD4+和/或CD8+T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中：
重组IL-2的浓度为从50IU/mL至500IU/mL或从约50IU/mL至约500IU/mL；
重组IL-7的浓度为从500IU/mL至2000IU/mL或从约500至约2000IU/mL；并且/或者
重组IL-15的浓度为从5IU/mL至50IU/mL或从约5IU/mL至约50IU/mL。
59.根据权利要求54所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞或CD4+和重组受体表达原代人T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述增殖或扩增导致用重组受体工程化的CD8+T细胞数量增加、增加约或增加至少2倍、3倍、4倍、5倍或大于5倍。
61.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
62.根据权利要求54所述的方法，其中：
所述工程化细胞组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞或CD8+和重组受体表达原代人T细胞；和/或
所述工程化细胞组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
63.根据权利要求54或权利要求62所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
64.根据权利要求52-63中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括泊洛沙姆，任选地其中所述泊洛沙姆的存在浓度为从0.5μL/mL至5μL/mL或从约0.5μL/mL至约5μL/mL。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
66.根据权利要求54-65中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物通过包括以下的方法产生：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+和CD8+原代人T细胞中的一者或两者进行富集的原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)一种或多种细胞因子，从而产生经刺激组合物；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而产生包含工程化T细胞的工程化组合物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和/或CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和/或CD8+原代人T细胞组成。
68.根据权利要求66或权利要求67所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和/或重组IL-15。
69.根据权利要求66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
70.根据权利要求66或权利要求69所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2、重组IL-7和重组IL-15。
71.根据权利要求66所述的方法，其中：
所述输入组合物包含大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；并且/或者
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
72.根据权利要求66或权利要求71所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子选自重组IL-2和重组IL-15。
73.根据权利要求49-53和66-72中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
75.根据权利要求73或权利要求74所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
76.根据权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
81.根据权利要求77-80中任一项所述的方法，其中所述珠是或包含聚苯乙烯表面。
82.根据权利要求77-81中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
83.根据权利要求77-82中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率小于3:1或小于约3:1。
84.根据权利要求77-83中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为从2:1至0.5:1或从约2:1至约0.5:1。
85.根据权利要求77-84中任一项所述的方法，其中所述珠与细胞的比率为或为约1:1。
86.根据权利要求49-53和66-85中任一项所述的方法，其中所述孵育是在一种或多种抗氧化剂存在下进行。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括含硫抗氧化剂。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括谷胱甘肽前体。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸(NAC)，任选地其中所述NAC的浓度为从0.2mg/mL至2.0mg/mL或从约0.2mg/mL至约2.0mg/mL。
90.根据权利要求49-53和66-89中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
93.根据权利要求49-53和66-92中任一项所述的方法，其中所述引入是在转导佐剂存在下进行。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述转导佐剂是或包括硫酸鱼精蛋白，任选地从1μg/ml至50μg/ml或从约1μg/ml至约50μg/ml的硫酸鱼精蛋白；源自纤连蛋白的转导佐剂；和/或RetroNectin。
95.根据权利要求49-53和66-89中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述载体是转座子，任选地Sleeping Beauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
97.根据权利要求44-69中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞组合物不包含刺激试剂和/或所述培育之前已将所述刺激试剂从所述组合物中基本上去除，所述刺激试剂包含能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的试剂。
98.根据权利要求37-97中任一项所述的方法，其中所述培育进行至少直到所述输出组合物包含阈值数量的T细胞、阈值数量的活T细胞、阈值浓度的T细胞或阈值浓度的活T细胞。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述培育在达到T细胞的阈值数量、活T细胞的阈值数量、T细胞的阈值浓度或活T细胞的阈值浓度之后继续至少一天。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述T细胞的阈值数量、活T细胞的阈值数量、T细胞的阈值浓度或活T细胞的阈值浓度比所述培育之前的所述工程化细胞组合物的所述数量或浓度、或活的数量或浓度大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或更多倍。
101.根据权利要求37-100中任一项所述的方法，其中所述培育进行2天至10天并包含端值，和/或所述培育进行至少10天。
102.根据权利要求37-100中任一项所述的方法，其中所述培育进行2天至10天并包含端值，和/或所述培育进行直到起始所述孵育后至少9天。
103.根据权利要求37-100中任一项所述的方法，其中所述培育进行至少4天。
104.根据权利要求37-101中任一项所述的方法，其中在所述培育之后，收集所述输出组合物的细胞。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从7天至15天或从约7天至约15天。
106.根据权利要求104或权利要求105所述的方法，其中所述孵育的起始与所述收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从9天至13天或从约9天至约13天。
107.根据权利要求104-106中任一项所述的方法，其中所述孵育的起始与收集所述输出组合物的细胞之间的时间量为从8天至13天或从约8天至约13天。
108.根据权利要求37-107中任一项所述的方法，其进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。
109.根据权利要求108所述的方法，其中在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述低温保护剂包括DMSO。
111.根据权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
112.根据权利要求1-43和49-53和66-89中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述孵育之前从生物样品中分离所述CD4+和/或所述CD8+T细胞。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述分离包括基于CD4和/或CD8的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
114.根据权利要求112或权利要求113所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
115.根据权利要求112-114中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
117.根据权利要求112-114中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
118.根据权利要求1-117中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
120.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
121.根据权利要求118-120中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自5T4、8H9、avb6整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症-睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、gp100、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
122.根据权利要求1-121中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
123.根据权利要求1-122中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
124.根据权利要求1-123中任一项所述的方法，其中所述重组受体是抗CD19CAR。
125.根据权利要求123所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外部分。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
128.根据权利要求126或权利要求127所述的方法，其中所述片段包含scFv。
129.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体进一步包含间隔子和/或铰链区。
130.根据权利要求125-129中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括CD3链任选CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
134.根据权利要求130-133中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
135.根据权利要求130-134中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
137.根据权利要求135或权利要求136所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
138.根据权利要求135-137中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
139.根据权利要求98-101中任一项所述的方法，其中包含所述阈值数量或更大数量的细胞的所述输出组合物在所述方法的大于或大于约85％、大于或大于约90％或大于或大于约95％的重复之间产生。
140.一种包含工程化细胞的组合物，所述组合物通过根据权利要求1-137中任一项所述的方法产生。
141.根据权利要求140所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
142.根据权利要求140或权利要求141所述的组合物，其包含低温保护剂，任选地DMSO。
143.一种制品，所述制品包含根据权利要求138-140中任一项所述的组合物；和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。
144.根据权利要求143所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
145.根据权利要求143或144所述的制品，其中所述输出组合物是工程化CD4+T细胞的组合物。
146.根据权利要求143或144所述的制品，其中所述输出组合物是CD8+T细胞的工程化组合物。
147.一种制品，所述制品包含通过权利要求1-11、13-60、63-70或72-139中任一项所述的方法产生的工程化CD4+T细胞的组合物、通过权利要求6-8、11-43、54-58、60-68或70-139中任一项所述的方法产生的工程化CD8+T细胞的组合物；和用于将所述工程化CD4+T细胞和所述工程化CD8+T细胞给予至受试者的说明书。
148.根据权利要求147所述的制品，其中所述说明书规定将所述CD4+T细胞和CD8+T细胞分开给予至所述受试者。
149.根据权利要求147或148所述的制品，其中所述说明书规定将所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞以所需比率给予至所述受试者。
150.根据权利要求1-139中任一项所述的方法，其中所述方法进行少于21天并包含端值。
151.根据权利要求1-139中任一项所述的方法，其中所述方法在少于21天并包含端值的95％置信区间内产生给予至和/或已备妥给予至受试者的输出组合物。
152.根据权利要求37-137中任一项所述的方法，其中在所述培育的至少一部分期间，监测所述细胞的细胞活力、浓度、密度、数量或其组合。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述监测通过光学方法任选显微术进行。
154.根据权利要求152或权利要求153所述的方法，其中所述监测通过以下进行：亮视野显微术、荧光显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、数字全息显微术(DHM)、差分数字全息显微术(DDHM)或其组合。
155.根据权利要求152-154中任一项所述的方法，其中所述监测通过差分数字全息显微术(DDHM)进行。
156.根据权利要求152-155中任一项所述的方法，其中所述监测在所述培育的至少一部分期间间歇或连续进行，任选地在所述培育期间至少每1小时、6小时、12小时、18小时、24小时或26小时进行。
157.根据权利要求152-156中任一项所述的方法，其中所述监测进行直到所述细胞达到T细胞的所述阈值数量、活T细胞的所述阈值数量、T细胞的所述阈值浓度或活T细胞的所述阈值浓度。
158.根据权利要求152-157中任一项所述的方法，其中所述监测和培育在封闭系统中进行。
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