CN115315269A - 在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法 - Google Patents

在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了施用一定剂量的T细胞用于治疗患有惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者的方法，以及相关方法、组合物、用途和制品。所述细胞表达用于靶向诸如CD19的淋巴瘤抗原的重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述方法用于：包括在深度预治疗或预后不良的受试者如在用一种或多种先前疗法治疗后复发或对用所述一种或多种先前疗法治疗难治的受试者中，治疗1‑3A级滤泡性淋巴瘤(FL 1‑3A)或边缘区淋巴瘤(MZL)。

Description

在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤 的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求对以下申请的优先权：2020年1月24日提交的标题为“在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法(METHODS FOR DOSING AND TREATMENTOF FOLLICULAR LYMPHOMA AND MARGINAL ZONE LYMPHOMA IN ADOPTIVE CELL THERAPY)”的美国临时申请号62/965,774、2020年6月10日提交的标题为“在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法(METHODS FOR DOSING AND TREATMENT OFFOLLICULAR LYMPHOMA AND MARGINAL ZONE LYMPHOMA IN ADOPTIVE CELL THERAPY)”的美国临时申请号63/037,542以及2020年8月21日提交的标题为“在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法(METHODS FOR DOSING AND TREATMENT OFFOLLICULAR LYMPHOMA AND MARGINAL ZONE LYMPHOMA IN ADOPTIVE CELL THERAPY)”的美国临时申请号63/068,975，将所述申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2021年1月13日创建的名为735042023440SeqList.TXT的文件提供，其大小为35,356字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本在一些方面涉及过继细胞疗法，所述过继细胞疗法涉及施用细胞的剂量以用于治疗患有惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者(包括高风险受试者)，以及相关方法、组合物、用途和制品。所述细胞通常表达用于靶向淋巴瘤细胞上的抗原(如CD19)的重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述惰性淋巴瘤是1-3A级滤泡性淋巴瘤(FL 1-3A)，如复发性或难治性FL。在一些实施方案中，所述疾病或病症是边缘区淋巴瘤(MZL)，如复发性或难治性MZL。在一些实施方案中，所述受试者是FL 1-3A或MZL受试者的特定组或子集中的受试者，如深度预治疗或预后不良的受试者。
背景技术
惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型是一种通常用化学免疫治疗剂(如抗CD20靶向疗法或烷基化剂)治疗的缓慢生长的淋巴瘤疾病。滤泡性淋巴瘤是最常见的亚型，占所有淋巴瘤病例的10％至20％。边缘区淋巴瘤占所有B细胞NHL病例的约8％至12％。许多患者最终会复发或变得对可用疗法难治，并且二线、三线以及特别是四线治疗受到限制。需要对于患有FL 1-3A和MZL的已经对于一种或多种先前疗法经历失败的患者的有效疗法。提供了满足此类需求的方法和用途。
发明内容
本文提供了治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
本文还提供了一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的用途，其中：所述剂量的T细胞包括与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；T细胞的所述剂量含有在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量具有大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
本文还提供了一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的药剂中的用途，其中所述剂量的T细胞包括与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；T细胞的所述剂量含有在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量具有大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
在一些实施方案中，所述至少一种先前疗法线是一种先前疗法线。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成所述一种先前疗法线后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成所述一种先前疗法线后在开始所述一种先前疗法线的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成用于治疗所述疾病的化学免疫治疗性组合疗法后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成用于治疗所述疾病的化学免疫治疗性组合疗法后在开始治疗的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何此类实施方案中，所述化学免疫治疗性组合疗法包括利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松龙(R-CHOP)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成用R-CHOP治疗后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在开始用R-CHOP治疗的24个月内具有疾病进展(POD24)。
在一些任何此类实施方案中，所述化学免疫治疗性组合疗法包括抗CD20单克隆抗体和烷基化剂。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成用抗CD20抗体和烷基化剂治疗后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在开始用抗CD20抗体和烷基化剂治疗的24个月内具有疾病进展(POD24)。
在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在开始所述一种先前疗法线24个月内具有疾病进展(POD24)，所述一种先前疗法线是抗CD20抗体和烷基化剂。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在完成所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。
在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且具有以下至少一项：归因于FL的症状；威胁性终末器官功能、继发于淋巴瘤的血细胞减少症或巨块病；脾肿大；并且在之前的六个月或更长时间内疾病进展稳定。在一些实施方案中，所述受试者具有归因于FL的症状。在一些实施方案中，所述受试者具有威胁性终末器官功能。在一些实施方案中，所述受试者具有归因于FL的症状。在一些实施方案中，所述受试者具有继发于淋巴瘤的血细胞减少症。在一些实施方案中，所述受试者具有巨块病。在一些实施方案中，巨块病是单个团块>7cm或者3个或更多个团块>3cm。在一些实施方案中，所述受试者具有脾肿大。在一些实施方案中，所述受试者在之前的六个月或更长时间内疾病进展稳定。
在一些实施方案中，所述至少一种先前疗法线是两种先前疗法线。在一些实施方案中，所述两种先前疗法线中的另一种选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂(PI3Ki)。在一些实施方案中，所述PI3Ki是艾拉利司、考泮利司或度维利司。
在一些实施方案中，所述受试者在完成先前疗法线的12个月内对治疗难治或已经复发。在一些实施方案中，先前疗法线是组合疗法或包含PI3Ki的单一疗法。在一些实施方案中，所述两种先前疗法线中的另一种是造血干细胞移植(HSCT)，并且所述受试者在HSCT后已经复发。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用抗CD20疗法治疗难治或在所述治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发(抗CD20难治性)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用抗CD20疗法治疗难治(抗CD20难治性)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在用抗CD20疗法治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发(抗CD20难治性)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用抗CD20抗体治疗难治或在所述治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用抗CD20抗体治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在用抗CD20抗体治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用抗CD20疗法和烷基化剂治疗难治或在所述治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对包括抗CD20疗法和烷基化剂的先前疗法线难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成包括抗CD20疗法和烷基化剂的先前疗法线的六个月内已经复发。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在2种或更多种疗法线后的抗CD20抗体维持期间或在维持完成后6个月内复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在2种或更多种疗法线后的抗CD20抗体维持疗法期间复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成所述抗CD20抗体维持疗法后6个月内复发。在一些实施方案中，将所述受试者在所述两种先前疗法线后用抗CD20抗体维持疗法治疗，并且所述受试者在所述抗CD20维持疗法期间复发。在一些实施方案中，将所述受试者用抗CD20抗体维持疗法治疗，并且所述受试者在完成所述抗CD20抗体维持疗法的六个月内复发。
在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆抗体。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20单克隆抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20单克隆抗体是利妥昔单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀或苯丁酸氮芥。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯丁酸氮芥。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在造血干细胞移植(任选地同种异体或自体HSCT)后复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在造血干细胞移植(HSCT)后复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述造血干细胞移植是同种异体HSCT。在一些任何所提供的实施方案中，所述造血干细胞移植是自体HSCT。
在一些任何所提供的实施方案中，所述至少一种先前疗法是两种先前疗法线。在一些任何此类实施方案中，所述两种先前疗法线中的另一种选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂，任选地其中所述PI3K抑制剂是艾拉利司、考泮利司或度维利司。在一些任何此类实施方案中，所述两种先前疗法线中的另一种选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是艾拉利司、考泮利司或度维利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是艾拉利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是考泮利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是度维利司。
在一些任何所提供的实施方案中，所述至少一种先前疗法是三种先前疗法线。在一些任何此类实施方案中，所述三种先前疗法线中的另两种各自独立地选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂，任选地其中所述PI3K抑制剂是艾拉利司、考泮利司或度维利司。在一些任何此类实施方案中，所述三种先前疗法线中的另两种各自独立地选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是艾拉利司、考泮利司或度维利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是艾拉利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是考泮利司。在一些实施方案中，所述PI3K抑制剂是度维利司。
在一些实施方案中，所述受试者对用抗CD20抗体治疗难治。在一些实施方案中，所述受试者对包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者在完成用抗CD20抗体治疗的六个月内复发。在一些实施方案中，所述受试者在完成包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线的六个月内复发。在一些实施方案中，将所述受试者在所述两种先前疗法线后用抗CD20抗体维持疗法治疗，并且所述受试者在所述抗CD20维持疗法期间或完成所述抗CD20抗体维持疗法的六个月内复发。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成先前疗法线(任选地在用组合疗法或具有PI3Ki的单一疗法治疗后)的12个月内已经复发或对治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成组合疗法的12个月内已经复发或对治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成具有PI3Ki的单一疗法的12个月内已经复发或对治疗难治。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成先前疗法线的12个月内已经复发或对治疗难治。在一些实施方案中，所述受试者在完成第一疗法线的12个月内已经复发或对治疗难治。在一些实施方案中，所述受试者在完成第二疗法线的12个月内已经复发或对治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成先前疗法线的12个月内已经复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成第一疗法线的12个月内已经复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成第二疗法线的12个月内已经复发。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成先前疗法线的12个月内对治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成第一疗法线的12个月内对治疗难治。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者在完成第二疗法线的12个月内对治疗难治。在一些实施方案中，所述先前疗法线是用组合疗法或具有PI3Ki的单一疗法的治疗。在一些实施方案中，所述先前疗法线是具有PI3Ki的单一疗法。在一些实施方案中，所述先前疗法线是用组合疗法的治疗。
在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆抗体。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀或苯丁酸氮芥。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯丁酸氮芥。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对所述至少一种先前疗法线已经复发，并且复发是在对所述先前疗法线的完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，复发是在对所述先前疗法线完全反应(CR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，复发是在对所述先前疗法线部分反应(PR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用所述至少一种或多种先前疗法的治疗难治，并且难治性治疗是所述先前疗法线后疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。在一些实施方案中，难治性治疗是所述先前疗法线后疾病稳定(SD)的最佳反应。在一些实施方案中，难治性治疗是所述先前疗法线后疾病进展(PD)的最佳反应。
在一些实施方案中，所述受试者对一种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对两种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对三种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对多于三种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对一种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对两种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对三种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对多于三种先前疗法线难治。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者具有至少一个PET阳性病灶和至少一个可测量的结节病灶或结节外病灶，任选地其中所述可测量的结节病灶在长轴线上大于1.5cm而不论短轴线如何，并且可测量的结节外病灶在长轴线和短轴线上大于1.0cm。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者具有至少一个PET阳性病灶和至少一个可测量的结节病灶或结节外病灶。在一些任何所提供的实施方案中，所述可测量的结节病灶在长轴线上大于1.5cm而不论短轴线如何，并且可测量的结节外病灶在长轴线和短轴线上大于1.0cm。
本文还提供了一种治疗边缘区淋巴瘤(MZL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；T细胞的所述剂量包含在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
本文还提供了一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的用途，其中：所述剂量的T细胞包括与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；T细胞的所述剂量含有在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量具有大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
本文还提供了一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的药剂中的用途，其中：所述剂量的T细胞包括与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；T细胞的所述剂量含有在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；T细胞的所述剂量具有大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包括含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
在一些任何所提供的实施方案中，所述MZL是选自以下的亚型：结节外MZL(ENMZL，主要是胃)、脾MZL(SMZL)和结节MZL(NMZL)。在一些实施方案中，所述MZL是结节外MZL(ENMZL，主要是胃)。在一些实施方案中，所述MZL是脾MZL(SMZL)。在一些实施方案中，所述MZL是结节MZL(NMZL)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗所述MZL的组合全身疗法或者是造血干细胞移植(HSCT)。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗所述MZL的组合全身疗法。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法中的至少一种是造血干细胞移植(HSCT)。
在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是组合全身疗法，并且所述组合全身疗法选自利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)或具有抗CD20抗体和烷基化剂的疗法。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是组合全身疗法，所述组合全身疗法是抗CD20抗体和烷基化剂。
在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆抗体。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。在一些任何此类实施方案中，所述抗CD20抗体是奥比妥珠单抗。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀或苯丁酸氮芥。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀。在一些任何此类实施方案中，所述烷基化剂是苯丁酸氮芥。
在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是利妥昔单抗与苯达莫司汀或利妥昔单抗与苯丁酸氮芥。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是利妥昔单抗和苯达莫司汀。在一些任何所提供的实施方案中，所述至少两种先前疗法线中的至少一种是利妥昔单抗和苯丁酸氮芥。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有脾MZL(SMZL)并且所述至少两种先前疗法线中的至少一种是脾切除术。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有结节外MZL(ENMZL)并且抗生素不是所述至少两种先前疗法线中的一种。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有非嗜PET(PET non-aviddisease)疾病，所述疾病具有在长轴线上大于2.0cm的至少一个可测量的结节病灶或至少一个可测量的结节外病灶。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有非嗜PET疾病，所述疾病具有在长轴线上大于2.0cm的至少一个可测量的结节病灶。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有非嗜PET疾病，所述疾病具有至少一个可测量的结节外病灶。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者未患有3B级FL(FL3B)。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者没有复合型DLBCL和FL的迹象，或转化的FL的迹象。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者没有复合型DLBCL和FL的迹象。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者没有转化的FL的迹象。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者未患有十二指肠型FL的世界卫生组织(WHO)子分类。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对所述至少一种先前疗法线已经复发，并且复发是在对所述先前疗法线的完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，复发是在对所述先前疗法线完全反应(CR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，复发是在对所述先前疗法线部分反应(PR)的初始反应后。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者对用所述至少一种或多种先前疗法的治疗难治，并且难治性治疗是所述先前疗法线后疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。在一些实施方案中，难治性治疗是所述先前疗法线后疾病稳定(SD)的最佳反应。在一些实施方案中，难治性治疗是所述先前疗法线后疾病进展(PD)的最佳反应。
在一些实施方案中，所述受试者对一种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对两种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对三种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对多于三种先前疗法线已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对一种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对两种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对三种先前疗法线难治。在一些实施方案中，所述受试者对多于三种先前疗法线难治。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者的ECOG体能状态为0。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者的ECOG体能状态为1。
在一些任何所提供的实施方案中，在施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前，所述受试者已经被施用淋巴细胞清除疗法。在一些任何提供的实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约7天内完成的。在一些任何提供的实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约2至7天完成的。
在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用环磷酰胺。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和环磷酰胺。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天以为或约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2并包含端值施用环磷酰胺，和/或以为或约20-40mg/m2，任选地30mg/m2施用氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天施用为或约300mg/m2(包含端值)的环磷酰胺和/或为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。在一些任何此类实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括每天并行施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些任何所提供的实施方案中，所述CD19是人CD19。
在一些任何所提供的实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)包含：含有抗体FMC63的可变重链区和可变轻链区的scFv、15个或更少的氨基酸的间隔子，并且含有免疫球蛋白铰链区或其修饰形式、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域和为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导。
在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式包含式X1PPX2P，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸(SEQ ID NO:58)。在一些实施方案中，X1是甘氨酸。在一些实施方案中，X1是半胱氨酸。在一些实施方案中，X1是精氨酸。在一些实施方案中，X2是半胱氨酸。在一些实施方案中，X2是苏氨酸。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG1铰链或其修饰形式。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG1铰链。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG1铰链的修饰形式。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG4铰链或其修饰形式。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG4铰链。在一些任何此类实施方案中，所述免疫球蛋白铰链或其修饰形式是IgG4铰链的修饰形式。
在一些任何此类实施方案中，所述间隔子包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的序列，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子由以下组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子包含SEQ ID NO:1所示的序列。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸。在一些任何此类实施方案中，所述间隔子由SEQ ID NO:1所示的序列组成。
在一些任何此类实施方案中，所述跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。在一些任何此类实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ IDNO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些任何此类实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些任何此类实施方案中，所述跨膜结构域由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
在一些任何此类实施方案中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12所示的序列，或是它的与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。在一些任何此类实施方案中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12所示的序列。在一些任何此类实施方案中，所述共刺激结构域由SEQ ID NO:12所示的序列组成。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的序列，或是它的与SEQID NO:13、14或15所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:13所示的序列。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:14所示的序列。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:15所示的序列。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域由SEQ ID NO:13所示的序列组成。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域由SEQ ID NO:14所示的序列组成。在一些任何此类实施方案中，所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域由SEQ ID NO:15所示的序列组成。
在一些任何此类实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ IDNO:55的CDRL2序列和/或SEQ ID NO:56的CDRL3序列以及SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQID NO:39的CDRH2序列和/或SEQ ID NO:54的CDRH3序列。在一些任何此类实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ ID NO:55的CDRL2序列和SEQ ID NO:56的CDRL3序列以及SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQ ID NO:39的CDRH2序列和SEQ ID NO:54的CDRH3序列。在一些任何此类实施方案中，所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列以及DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。在一些任何此类实施方案中，所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列以及DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。在一些任何此类实施方案中，所述scFv按顺序包含含有SEQ ID NO:41所示的序列的VH和含有SEQ ID NO:42所示的序列的VL。在一些任何此类实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:43所示的序列。在一些实施方案中，所述scFv以从N末端至C末端的顺序包含含有SEQ IDNO:42所示的序列的VL和含有SEQ ID NO:41所示的序列的VH。
在一些任何所提供的实施方案中，所述CAR以从N末端至C末端的顺序含有：为SEQID NO:43所示的scFv的细胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:1所示的间隔子、SEQ ID NO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域、和SEQ ID NO:13所示的CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是在约5x107个CAR+T细胞与约1.1x108个CAR+T细胞之间，包含每个端值。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是5x107个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是6x107个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是7x107个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是8x107个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是9x107个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1x108个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1.1x108个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1.2x108个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1.3x108个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1.4x108个CAR+T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1.5x108个CAR+T细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的，是相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或所述第一组合物的施用的起始和所述第二组合物的施用的起始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至12小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至6小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔0至2小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天进行的。在一些任何所提供的实施方案中，所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是相隔约0与约12小时之间进行的。在一些任何所提供的实施方案中，所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是相隔约0与约6小时之间进行的。在一些任何所提供的实施方案中，所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是相隔约0与约2小时之间进行的。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔约1分钟与约1小时之间进行的。在一些实施方案中，所述第一组合物的施用的起始与所述第二组合物的施用的起始是相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过2小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔少于2小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过1小时施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过30分钟施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过15分钟施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过10分钟施用。在一些任何所提供的实施方案中，将所述第一组合物和第二组合物相隔不超过5分钟施用。在一些任何所提供的实施方案中，所述第一组合物是在所述第二组合物之前施用。在一些实施方案中，所述第一组合物包含所述CD8+CAR表达T细胞，并且所述第二组合物包含所述CD4+T CAR表达细胞。
在一些任何所提供的实施方案中，将CD4+T细胞和CD8+T细胞的所述剂量静脉内施用。在一些任何所提供的实施方案中，所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，T细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，从其中衍生或分离出细胞的样品是血液或血液来源的样品。在一些实施方案中，从其中衍生或分离出细胞的样品是或源自单采术或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，在向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法之前，从所述受试者获得所述样品。在一些实施方案中，在向所述受试者施用CD4+T细胞和CD8+T细胞的所述剂量之前大约四至五周，从所述受试者获得白细胞单采术样品。在一些任何此类实施方案中，所述受试者是人。
在一些任何所提供的实施方案中，根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％或大于或大于约80％。在一些任何所提供的实施方案中，根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约50％。在一些任何所提供的实施方案中，根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约60％。在一些任何所提供的实施方案中，根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约70％。在一些任何所提供的实施方案中，根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约80％。在一些任何此类实施方案中，CRR是最佳总体反应(BOR)为多达24个月的完全反应(CR)的受试者的百分比。
在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有1、2或3A级FL，并且CRR是通过PET-CT评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有1级FL，并且CRR是通过PET-CT评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有2级FL，并且CRR是通过PET-CT评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有3A级FL并且CRR是通过PET-CT评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有MZL，并且CRR是通过CT评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有MZL，并且CRR是通过MRI评估的。在一些任何所提供的实施方案中，所述受试者患有MZL，并且CRR是通过CT和MRI扫描评估的。
附图说明
图1A示出了在初始群组中的患者中，在治疗后3个月显示完全反应(CR)或疾病进展(PD)的受试者中，治疗前肿瘤活检物中的差异性基因表达谱。
图1B示出了在初始群组中的患者中，在治疗后3个月与PD相关的各种富集的基因集，包括与滤泡性淋巴瘤细胞系样品(FL；FL_DLBCL_DN)相比，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系样品中更高表达的基因。
图2A示出了在较大群组中的患者中，在治疗后3个月显示完全反应(CR)或疾病进展(PD)的受试者中，治疗前肿瘤活检物中的差异性基因表达谱。
图2B示出了在更大群组中的患者中，在治疗后3个月与PD相关的各种富集的基因集，包括与滤泡性淋巴瘤(FL；DLBCL_LIKE_vs_FL以及SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_UP)相比，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中更高表达的基因。
图2C示出了在匹配的治疗前与治疗后第11天样品中与T细胞排除相关的各种富集的基因集，包括与滤泡性淋巴瘤(FL；DLBCL_LIKE_vs_FL以及SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_UP)相比，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中更高表达的基因。
图3示出了在FL肿瘤活检物与DLBCL肿瘤活检物之间的差异性基因表达。
图4A和图4B示出了在FL与DLBCL肿瘤之间，示例性基因EZH2(图4A)和CD3ε(图4B)的差异性基因表达。
图5A和图5B(初始群组)以及图5C(较大群组)示出了在被发现在DLBCL中升高的基因(命名为“DLBCL样基因集”；图5A)与在FL中升高的基因(命名为“FL样基因集”；图5B和图5C)之间以及继续展现出CR的受试者或继续展现出PD的受试者的单样品基因集富集分析(ssGSEA)得分，并且表明，如与在DLBCL中所见的那些肿瘤基因表达谱相比，肿瘤基因表达谱与在FL中所见的那些肿瘤基因表达谱更类似的受试者在治疗后3个月更有可能显示CR。
图5D示出了74名DLBCL受试者的无进展存活(PFS)曲线，在具有最高FL样基因表达的15名受试者与其他59名受试者之间进行比较。
具体实施方式
提供工程化细胞(例如，T细胞)和/或其组合物用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法和用途，所述疾病或病症通常是或包括癌症或肿瘤，如白血病或淋巴瘤，最特定地B细胞恶性肿瘤或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在任何所提供方法的特定实施方案中，将T细胞用针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)工程化。在一些方面，所述疾病或病症是B细胞淋巴瘤。在一些方面，所述疾病或病症是1-3A级滤泡性淋巴瘤(FL)。在一些方面，所述疾病或病症是边缘区淋巴瘤(MZL)。在一些方面，如与某些替代性方法相比，例如，在所治疗受试者的特定组中，所述方法和用途提供或实现改善的反应和/或更持久的反应或功效和/或降低的毒性或其他副作用的风险。在一些实施方案中，所述方法由于以下而是有利的：施用指定数量或相对数量的工程化细胞，施用限定比率的特定类型的细胞，治疗特定患者群体(如具有特定风险状况、分期和/或先前治疗史的那些)，和/或其组合。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，识别由淋巴瘤和/或其衍生细胞类型表达、与淋巴瘤和/或其衍生细胞类型相关和/或对淋巴瘤和/或其衍生细胞类型具有特异性的抗原。所述细胞通常在配制用于施用的组合物中施用；所述方法通常涉及将所述细胞的一个或多个剂量施用于所述受试者，所述一个或多个剂量可以包括特定数量或相对数量的细胞或所述工程化细胞，和/或所述组合物内限定比率的两种或更多种亚型(如CD4与CD8T细胞)或其组合物。
在一些实施方案中，例如通过过继细胞疗法如过继T细胞疗法将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的特定疾病或病症的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及用一定剂量的抗原受体表达细胞(例如CAR表达细胞)治疗患有淋巴瘤或B细胞恶性肿瘤(如惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL))的受试者。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及治疗受试者的特定组或子集，例如，被鉴定为患有高风险疾病的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有预后不良惰性NHL(如对于标准疗法是复发性或难治性(R/R)的和/或具有不良预后的NHL)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有对于标准疗法是复发性或是难治性(R/R)的NHL(如FL G1-3A或MZL)的受试者。在一些方面，所提供的方法、组合物、用途和制品实现改善的且优越的对可用疗法的反应。在一些实施方案中，改善的或优越的反应是与当前护理标准(SOC)比较的。
CD19是从早期发育直到分化为浆细胞的B细胞上存在的95kDa糖蛋白(Stamenkovic等人,J Exp Med.1988；168(3):1205-10)。它是免疫球蛋白超家族的成员，并且作为B细胞受体的正调节物通过降低B细胞激活的信号传导阈值发挥作用(Brentjens等人,Blood.2011；118(18):4817-28；LeBien等人,Blood.2008；112(5):1570-80)。CD19是一个有吸引力的治疗靶标，因为它是由大多数B细胞恶性肿瘤(包括B细胞NHL)表达的(Davila等人,Oncoimmunology.2012；(9):1577-83)。重要的是，除了B细胞谱系的CD19外，CD19未在造血干细胞或任何正常组织上表达。此外，CD19在循环中没有脱落，这限制了脱靶不良反应(Shank等人,Pharmacotherapy.2017；37(3):334-45)。
在特定实施方案中，本文提供的方法是基于施用针对CD19的CAR T细胞疗法，其中CAR含有针对CD19的scFv抗原结合结构域(例如来自FMC63)。所述CAR进一步包含含有来自CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，并且还掺入4-1BB共刺激结构域，所述共刺激结构域与细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT；例如神经学事件(NE))的发生率较低(与含有CD28的构建体相比)相关(Lu等人J Clin Oncol.2018；36:3041)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括CD8+和CD4+T细胞子集，所述子集在体外单独转导并扩增，并且以相等(约1:1)目标剂量施用。在一些实施方案中，施用的总CD4+和CD8+CAR+T细胞剂量存在低变异性，这两个参数与先前的研究中的毒性增加相关(Neelapu等人,N EnglMed.2017.377；2531-44；Turtle等人,Sci Transl Med.2016；8:355ra116；Hay等人,Blood.2017；130:2295-306)。
在一些实施方案中，所述方法包括将细胞施用于被选择或被鉴定为具有B细胞恶性肿瘤(如NHL(如，FL G1-3A或MZL))的某种预后或风险的受试者。淋巴瘤(如NHL)可以是多变的疾病。一些患有NHL的受试者可以在不进行治疗的情况下存活，而其他受试者可能需要立即干预。在一些实施方案中，所述方法、用途和制品涉及或用于治疗受试者，所述方法、用途和制品涉及例如，基于特定疾病类型、诊断标准、先前治疗和/或对先前治疗的反应，选择或鉴定特定组或子集的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗已经在用一种或多种先前疗法的治疗之后缓解后复发或对于所述一种或多种先前疗法变为难治性的受试者；或对一种或多种先前疗法(例如，一个或多个标准治疗线)已经复发或难治(R/R)的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗已经在用两种或更多种先前疗法治疗之后缓解后复发或对两种或更多种先前疗法变为难治性的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗对两种或更多种先前疗法(例如，两种或更多种标准疗法线)已经复发或难治(R/R)的受试者。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗已经在用三种或更多种先前疗法的治疗之后缓解后复发或对于所述三种或更多种先前疗法变为难治性的受试者；或对三种或更多种先前疗法(例如，三种或更多种标准疗法线)已经复发或难治(R/R)的受试者。
在一些实施方案中，在施用表达所述重组受体的细胞之前，所述受试者先前已用靶向所述疾病或病症(例如，NHL(如FL G1-3A或MZL))的疗法或治疗剂来治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已用造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)来治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用标准疗法治疗后具有较差预后和/或一个或多个先前治疗线已失败。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或者先前已经接受用于治疗疾病或障碍(如FL G1-3A或MZL)的除了淋巴细胞清除疗法和/或表达抗原受体的细胞的所述剂量以外的至少或至少约或约1、2、3、4种或更多种其他疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或者先前已经接受包括CD20靶向剂(例如抗CD20抗体)和烷基化剂的疗法。
某些针对CD19的CAR-T细胞疗法可用于治疗B细胞淋巴瘤，包括axicabtageneciloleucel(axi-cel)和tisagenlecleucel。在一项示例性研究中，axi-cel治疗的受试者实现54％的CR率，且40％为持久缓解(中值随访期，15.4个月)(Neelapu等人,N EnglMed.2017.377；2531-44)。大多数受试者发生CRS(93％)和NE(64％)，发作的中值时间分别为2天和5天，并且≥3级CRS(Lee分级标准(Lee等人,Blood.2014；124:188-95)和NE的发生率分别为13％和28％，并且43％接受托珠单抗(27％接受皮质类固醇)。在另一项示例性研究中，大约三分之一的接受tisagenlecleucel的患者在1年时维持持久缓解(Schuster等人,N Engl J Med.2019.380:45-56)。大多数受试者(58％)发生CRS，而21％具有NE。≥3级CRS(Penn分级标准，Porter等人,J Hematol Oncol.2018；11:35)和NE分别在22％和12％患者中报告(Schuster等人,N Engl J Med.2019.380:45-56)。尽管观察到治疗这些适应证的有利反应结局，但是毒性率仍然很高。此外，目前尚无批准的CAR T细胞疗法用于治疗患有某些淋巴瘤亚型的患者(包括患有FL G1-3A或MZL的患者)，并且特别是在具有某些高风险特征(如具有双重难治性状态或在初次诊断和/或开始治疗的24个月内疾病进展(POD24))的此类患者中。
FL是惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的最常见的亚型，占西方国家所有淋巴瘤病例的约10％至20％(国际癌症控制联盟(Union for International Cancer Control)[UICC],2014；Miranda-Filho等人,Cancer Causes Control.2010:30(5):489-99)。二线(2L)治疗最常见地包括在前线中使用的相同治疗方法，主要是化学免疫疗法方案。在FL中2L疗法后，r/r FL患者的选择受到限制。国家综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork)(NCCN,2019)和欧洲医学肿瘤学会(European Society for Medical Oncology，ESMO)(Dreyling,2016)指南二者均表明，如果在前线环境中实现了很长的缓解，通常会在2L治疗中重复相同的方案，这对于在前线中接受苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)的患者最常见，而由于担心心脏毒性，对于接受利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松龙(R-CHOP)的患者则不那么常见。高度选择的患者的二线治疗可能还包括自体或同种异体造血干细胞移植(HSCT)(NCCN,2019；Dreyling等人,2016Ann Oncol.2016；27(83-v90))。目前，四线FL及以上(4L+)不存在护理标准。目前在此环境中没有批准的药剂。此外，通过四线，患者通常已经用尽了可用的治疗选择。疾病的进展导致每种治疗与失败之间的间隔较短，这表明在疾病复发或进展时已接受过三种先前全身疗法的患者将构成高度未满足需求的患者群体。难治性环境中缺乏可用的治疗选择呈现了显著的未满足需求，特别是在三线及以上(3L+)方面。尽管在过去的二十年中，FL的预后基本上得到了改善，但是FL仍然无法治愈(Kahl等人,Blood.2016年4月28日；127(17):2055-63)。
边缘区淋巴瘤(MZL)是第三最常见的NHL组织学，占所有B细胞NHL病例的8％至12％(Swerdlow等人,2016；Blood,30:84-91；Al-Hamadani等人,Am J Hematol.,2015；90(9):790-5)。描述了三种亚型：结节外MZL(ENMZL，主要是胃)、脾MZL(SMZL)和结节MZL(NMZL)。鉴于其异质性，患有MZL的患者通常是未被充分代表的或被排除在其他惰性NHL的研究之外。此外，与治疗相关的毒性可能会限制老年患者(年龄中值67岁)的选择，并且MZL的临床历程也是异质的，其中与其他亚型相比结节弥散的MZL与较差的预后相关(Denlinger等人,Cancer Manag Res.2018；10:615-24)。依鲁替尼是针对MZL的常见疗法，因此到三线疗法(3L)前，许多患有MZL的患者可能已经用依鲁替尼治疗，并且因此对两种先前疗法线经历失败的患者被认为是高度未满足需求的群体。其他治疗选择包括2L+MZL中的来那度胺和利妥昔单抗组合。
可用证据指示，对提供有利的益处/风险特征和持久反应的其他治疗选择存在高度未满足需求，所述需求用可用疗法对具有二线(2L)、三线(3L)或四线及以上(4L+)1-3A级惰性FL的受试者是无法满足的。此外，对于包括MZL在内的NHL的稀有亚型具有有限的治疗选择。这些发现揭示了对于R/R NHL(尤其是在具有FL G1-3A或MZL高风险特征的受试者中)的重要治疗缺口，并且需要改善现有治疗方法。本文提供可以满足此类需求的实施方案。
在特定实施方案中，所提供的方法可以用于治疗特定NHL亚型或高风险组，如对治疗双重难治或具有POD24的患者，其中可用的治疗选择仍然有限。在一些情况下，包括其他CAR T细胞疗法在内的可用疗法可能与毒性的高风险相关。在一些方面，使用CAR T细胞疗法观察到了与细胞因子相关的毒性，如CRS和神经毒性(Bonifant等人,Mol TherOncolytics.2016；3:16011；Turtle等人,J Clin Invest.2016；126(6):2123-38)。例如，现有CAR T细胞疗法与严重的CAR T细胞有关毒性相关，所述毒性包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经病学事件(NE)，这可能限制施用于专门化治疗中心(Yescarta RiskEvaluation and Mitigation Strategy(REMS).Gilead Pharma 2019年9月10日；KymriahRisk Evaluation and Mitigation Strategy(REMS)Novartis 2019年9月10日)并影响在难以治疗的患者中的使用。具有良好益处/风险特征的CAR T细胞疗法可允许更广泛地包含包括高风险患者群体在内的受试者亚组。
本文的观察结果支持根据所提供的方法用针对CD19的CAR T细胞疗法治疗患有高风险疾病的受试者。例如，患有1-3A级FL或MZL的受试者和具有某些高风险特征(如具有双重难治性状态或在初次诊断和/或开始治疗的24个月内疾病进展(POD24))的患者可以根据所提供的方法进行治疗。在一些实施方案中，所提供的方法可以用于治疗已经被深度预治疗(例如用一种、两种、三种、四种或更多种先前疗法用于治疗疾病)的受试者。
因此，在一些实施方案中，所提供的方法、制品和/或组合物可以提供优于用于治疗(如用于过继细胞疗法)的其他可用方法或解决方案或方式的优点。特别地，所提供的实施方案包括针对患有R/R FL G1-3A和R/R MZL的受试者提供治疗的实施方案。在特定实施方案中，在患有R/R FL G1-3A受试者中，受试者具有双重难治性状态或初次诊断和/或开始治疗的24个月内疾病进展(POD24)。
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I.CD19靶向细胞疗法在1-3A级惰性滤泡性淋巴瘤(FL)和边缘区淋巴瘤(MZL)中的方法和用途
本文提供治疗方法，其涉及施用工程化细胞(如工程化T细胞)或含有工程化细胞的组合物。还提供了工程化细胞(例如，T细胞)和/或其组合物的方法和用途，包括用于治疗患有R/R FL G1-3A或R/R MZL的受试者的方法，所述治疗涉及施用所述工程化细胞和/或其组合物。在一些方面，还提供了工程化细胞(如工程化T细胞)或含有所述工程化细胞的组合物用于治疗R/R FL G1-3A或R/R MZL的用途。在一些方面，所述工程化细胞(如工程化T细胞)或含有工程化细胞的组合物的所述用途是根据本文所述的任何方法来进行。
在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，识别由淋巴瘤和/或其衍生细胞类型表达、与淋巴瘤和/或其衍生细胞类型相关和/或对淋巴瘤和/或其衍生细胞类型具有特异性的抗原。所述细胞通常以配制用于施用的组合物施用。在特定实施方案中，所述方法涉及将所述细胞的一个或多个剂量施用于所述受试者，所述一个或多个剂量包括特定数量或相对数量的细胞或所述工程化细胞，如所述组合物内限定比率的两种或更多种亚型(如CD4与CD8 T细胞)或其组合物。在一些实施方案中，以有效量施用工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物以实现疾病或障碍的治疗。用途包括工程化细胞或组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以实施此类治疗方法中的用途。在一些实施方案中，通过向患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者施用工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物来进行所述方法。在一些实施方案中，所述方法从而治疗所述受试者的所述疾病或病症或障碍。
用于施用用于过继细胞疗法的细胞的通用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClin Oncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
在一些实施方案中，例如通过过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)将细胞、群体和组合物施用于患有待治疗的惰性NHL的受试者。在一些方面，NHL可以基于卢加诺分类进行分期(参见例如，Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Cheson,B.D.(2015)Chin ClinOncol 4(1):5)。在一些情况下，所述分期通过罗马数字I至IV(1-4)来描述，并且影响淋巴系统外器官(结节外器官)的局限期(I或II)淋巴瘤指示为E。I期表示在一个结节或一组相邻结节中受累，或者不具有结节受累的单一结节外病灶(IE)。2期表示涉及膈同侧的两个或更多个结节组，或者依据结节程度具有有限的连续结节外受累的I期或II期(IIE)。III期表示涉及膈两侧的结节或膈上方的结节且脾脏受累。IV期表示涉及另外的非连续淋巴外受累。另外，“巨块病(bulky disease)”可以用于描述胸腔中的大型肿瘤，特别是对于II期肿瘤。疾病的程度通过正电子发射断层扫描(PET)-计算机断层扫描(CT，用于亲嗜性(avid)淋巴瘤)和CT(用于非亲嗜性淋巴瘤)确定。在一些任何实施方案中，在施用细胞的剂量之时或之前，要根据所提供的实施方案治疗的受试者患有正电子发射断层摄影术(PET)阳性疾病。
在一些实施方案中，所述方法涉及用一定剂量的抗原受体表达细胞(例如CAR表达细胞)治疗患有R/R FL G1-3A或R/R MZL的受试者。在特定实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中每种剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述受试者是18岁以上。在一些实施方案中，如果所述受试者先前接受过CD19靶向疗法，则必须确认所述受试者自完成先前CD19靶向疗法以后患有CD19阳性淋巴瘤。在一些实施方案中，所述受试者在筛选的6个月内患有组织学确认的疾病。在一些实施方案中，所述受试者具有足够的器官功能和血管通路。
在一些实施方案中，所述受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人,(1982)Am J ClinOncol.5:649-655)。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示，受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现体力活动中的一些限制，但是所述受试者能完全走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能大于50％走动。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如
Figure BDA0003852159880000161
等人,(1993)Br J Cancer67(4)773-775。反映ECOG体能状态的标准描述于下表1中：
Figure BDA0003852159880000162
所提供的方法用于治疗对先前疗法已经复发或难治(R/R)的受试者。在一些方面，所述受试者在对先前疗法完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应后已经复发。在一些实施方案中，所述受试者对用至少一种或多种先前疗法的治疗难治，并且所述难治性治疗是先前疗法后疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。
在一些实施方案中，所述受试者为至少18岁。在特定实施方案中，在年龄较大的一组受试者(包括大于60岁或更大的受试者)中，所提供的方法可以导致有利结局和低毒性率。
在一些实施方案中，所提供的方法实施平剂量，例如，CAR+细胞的总数、CAR+CD8+T细胞和/或CAR+CD4+T细胞的总数，如向所治疗的一组受试者(包括体重可变的受试者)中的每一个施用精确或固定剂量的一种或多种此类细胞类型。因此，所提供的方法包括这样的方法，在所述方法中，细胞的所述剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量不关联于或不基于受试者的体表面积或体重。在一些实施方案中，这种方法可以最大程度地减少或降低向受试者施用过多细胞(这可能会增加与施用CAR-T细胞相关的有毒结局的风险)的机会。
在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含在约5x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞与约1.1x108个重组受体(例如CAR)表达T细胞之间。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约5x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约6x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约7x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约0.75x108个重组受体(例如CAR)表达CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约8x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约9x107个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约1x108个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约1.1x108个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含为或约1.5x108个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。
在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情境下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情境下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，例如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物施用。在一些实施方案中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物施用。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指这样分割的剂量，使其在超过一天的时间内施用。这种类型的给药包括在本方法中并且被认为是单一剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量施用，例如随时间施用的分割剂量。例如，在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内施用受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天施用33％的剂量，并且在第二天施用剩余的67％。在一些方面，在第一天施用10％的剂量，在第二天施用30％的剂量，并且在第三天施用60％的剂量。在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过施用多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来施用，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地施用各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的多个组合物。例如，细胞的群体或亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别富含CD8+和富含CD4+的群体，例如，各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞的CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的施用包括施用第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，以及施用第二组合物，所述第二组合物包含所述剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞中的另一种。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的施用(例如，所述多种细胞组合物的施用)涉及分开施用所述细胞组合物。在一些方面，分开施用同时或按任何顺序依序进行。在特定实施方案中，单独施用是通过按任何顺序施用以下来依序进行：第一组合物，所述第一组合物包含CD8+T细胞的剂量或CD4+T细胞的剂量，以及第二组合物，所述第二组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且将所述第一组合物和所述第二组合物在彼此相隔48小时内施用，如彼此相隔不超过36小时或彼此相隔不超过24小时内施用。在一些实施方案中，将第一组合物和第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始和第二组合物的施用的开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的施用的开始和/或完成和第二组合物的施用的完成和/或开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物相隔少于2小时施用。
在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，所述第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前施用。在特定实施方案中，CD8+T细胞在CD4+T细胞之前施用。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包括限定或目标比率的表达重组受体(例如CAR)的CD4+细胞与表达重组受体(例如CAR)的CD8+细胞和/或限定或目标比率的CD4+细胞与CD8+细胞，所述比率任选地为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有不同细胞群的目标或所需比率(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如，1:1)的组合物或剂量的施用涉及施用含有所述群体中的一种的细胞组合物，然后施用包含所述群体中的另一种的单独细胞组合物，其中所述施用是以或大约以所述目标或所需比率来进行。在一些方面，定义比率的细胞的剂量或组合物的施用导致改善T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
A.1-3A级惰性滤泡性淋巴瘤(FL)
在一些实施方案中，所提供的方法涉及治疗患有滤泡性淋巴瘤(FL)的受试者的特定组或子集。在一些实施方案中，所述受试者患有1-3A级FL，包括患有复发性/难治性FLG1-3A的受试者。在一些实施方案中，所提供的方法涉及患有为惰性滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者。在一些实施方案中，所述受试者患有为1级FL的疾病。在一些实施方案中，所述受试者患有为2级FL的疾病。在一些实施方案中，所述受试者患有为3A级FL的疾病。
在特定方面，本文提供的方法包括向所述受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中每种剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。此类CAR-T细胞和用于它们的制造的方法描述于部分II中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括施用从或从约2.5x107至为或约1.5x108个(如从约5x107至为或约1x108个)总重组受体表达T细胞(例如CAR+T细胞)，如以如本文所述的所定义的比率(例如，为或约1:1比率)施用一定剂量的包括CD4+和CD8+T细胞在内的T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.4x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.3x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.2x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.1x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.0x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约9x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约8x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约7x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约6x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞。在特定实施方案中，施用的剂量是精确或平或固定数量的CAR+T细胞，或精确或平或固定数量的特定类型的CAR+T细胞(如CD4+CAR+T细胞和/或CD8+CAR+T细胞)，和/或一定数量的任何此类细胞，所述数量如与这个精确或平或固定数量相比在指定差异程度内，如不超过+或-(加或减，在一些情况下指示为±)5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在一些实施方案中，这样的平或固定数量的细胞是为或约2.5x107个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞、5×107个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞、或1x108个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞由CAR+T细胞组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量的细胞由CD3+CAR+T细胞组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量的细胞由CD4+CAR+T细胞和CD8+CAR+T细胞组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量的细胞不含或基本上不含CD3-细胞。在一些实施方案中，所述剂量的细胞不含或基本上不含CAR-细胞。在一些实施方案中，所述剂量的细胞不含或基本上不含CD3-CAR-细胞。
在一些实施方案中，所述剂量中的细胞数量包括2.5x107个CAR+T细胞(如1.25x107个CD4+CAR+T细胞和1.25x107个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量包括5×107个CAR+T细胞(如2.5x107个CD4+CAR+T细胞和2.5x107个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，，所述剂量包括1x108个CAR+T细胞(如0.5x108个CD4+CAR+T细胞和0.5x108个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些方面，所施用的细胞数在前述实施方案中此类数量的某一差异程度内，例如如与细胞的此类一个或多个数量相比，在加或减(±)5％、6％、7％、8％、9％或10％内，如在加或减8％内。在一些方面，所述剂量在一个范围内，在所述范围中在此类细胞(例如，总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞)的数量与一种或多种结局之间观察到相关(任选地线性关系)，所述结局指示治疗反应或其持续时间(例如，实现缓解、完全缓解和/或缓解的特定持续时间的可能性)和/或任何前述项的持续时间。
在一些实施方案中，所述施用包括根据前述实施方案中任一个的剂量施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
在一些实施方案中，如果受试者患有1-3A级滤泡性淋巴瘤(FL)，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果存在在两个垂直维度具有至少一个PET阳性病灶和至少一个可测量的结节或结节外病灶的PET阳性疾病，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，结节病灶在长轴线上大于1.5cm。在一些实施方案中，结节外病灶在长轴线和短轴线上>1.0cm。在一些实施方案中，FL展现肿瘤滤泡或与肿瘤滤泡相关，所述肿瘤滤泡显示减弱的套区、极化的损失和/或有形体巨噬细胞的不存在。在一些实施方案中，FL与中心细胞和中心母细胞的混合物相关。在一些实施方案中，FL与中心细胞无关。
在一些实施方案中，FL累及淋巴结和/或脾、骨髓、外周血和其他结节外部位。在一些实施方案中，FL累及淋巴结。在一些方面，与FL相关的示例性特征包括描述于以下中的那些：Choi等人(2018)Arch Pathol Lab Med 142:1330-1340；Luminari等人,(2012)Rev.Brad.Hematol.Hemoter.,34:54-59和Salles(2007)ASH Education Book,2007:216-25。在一些方面，在FL的情况下，用于评估疾病负荷程度的示例性参数包括诸如以下等参数：血红蛋白水平(例如，<12g/dL或<10g/dL)、红细胞沉降率(ESR)、乳酸脱氢酶(LDH)水平、和β2微球蛋白(B2M)值、基因表达、单核苷酸多态性(SNP；例如在IL-8、IL-2、Il-12B和IL1RN中)、miRNA表达以及蛋白质表达(例如，CD68、STAT1、FOXP3、CD57)。(Salles(2007)ASHEducation Book,2007:216-25)。在FL的情况下，疾病的程度或负荷可以通过Ann Arbor分期系统、肿瘤负荷、巨块病、疾病的结节或结节外部位的数量和/或骨髓受累来评估。
在一些实施方案中，所述FL是1级。在一些实施方案中，1级FL展现每个高倍视野(HPF)超过5个中心母细胞或与其相关。在一些实施方案中，所述FL是2级。在一些实施方案中，2级FL展现每个高倍视野(HPF)超过6个且少于15个中心母细胞或与其相关。在一些实施方案中，所述FL是3A级。在一些实施方案中，3A级FL展现每个高倍视野(HPF)超过15个中心母细胞或与其相关。在一些实施方案中，FL与滤泡内CD10、BCL6和BCL2的共表达相关。在一些实施方案中，FL与t(14；18)/IGH-BCL2和/或BCL6重排相关或以其为特征。在一些实施方案中，FL与t(14；18)(q32；q21)易位相关。在一些方面，t(14；18)(q32；q21)易位将BCL2表达置于免疫球蛋白(Ig)重基因座(IGH)增强子的控制下。在一些方面，在大约90％的1级和2级FL以及60％至70％的3级中检测到t(14；18)。
由于患有FL的患者的临床历程的异质性，治疗FL的挑战之一是鉴定需要替代治疗选择的高风险患者。已经鉴定了与高风险疾病相关的几种患者因素。在用化学免疫治疗方案(如R-CHOP)初步治疗新诊断的患者之后，大约25％的患者将在24个月内进展(Casulo等人Blood.2015；125(1):40-7)。具有24个月内疾病进展(POD24)的患者的5年总存活率(OS)为50％，而非POD24患者的5年OS为90％。POD24是重要的预后存活因子(Casulo,Br JHaematol.2019；186(4):513-23)。其他具有未满足需求的2L群体包括对一些支柱FL治疗(即抗CD20抗体和/或烷基化剂)难治的患者。特别地，高风险患者包括对抗CD20抗体和烷基化剂双重难治的患者。由于基于利妥昔单抗的疗法是护理标准，因此抗CD20疗法难治或抗CD20疗法后早期复发的患者具有较差的结局。到进展的时间和接受的先前疗法(例如，组合疗法、HSCT)也是定义FL中治疗失败的风险的要素。所提供的方法包括治疗作为高风险患者的受试者。在所提供的方法的一些实施方案中，2L和随后的疗法线中的高风险惰性1-3A级FL患者组包括POD24、利妥昔单抗难治性和双重难治性群体。
在一些实施方案中，所述受试者在一种或多种其他先前疗法(如至少两种先前疗法、至少三种先前疗法或至少四种先前疗法)后已经复发或对治疗难治。在一些实施方案中，所述受试者在一种或多种其他先前疗法(如一种先前疗法、两种先前疗法、三种先前疗法或四种先前疗法)后已经复发或对治疗难治。关于复发性/难治性(r/r)疾病或疾病进展的治疗的考虑和适应证除其他因素外还包括修饰的滤泡性淋巴瘤研究组(Groupe d'Etudedes Lymphomes Folliculaires，GELF)标准，其包括：归因于FL的症状(不限于B症状)；威胁性终末器官功能；继发于淋巴瘤的血细胞减少症；巨块病(单个团块>7cm或者3个或更多个团块>3cm)；脾肿大；和在至少6个月内进展稳定(国家综合癌症网络(NCCN)(NCCN,2019)。
在一些实施方案中，所述受试者在造血干细胞移植后已经复发。在一些实施方案中，所述移植是同种异体或自体HSCT。
在一些实施方案中，所述受试者对用至少一种先前疗法线治疗难治或在所述至少一种先前疗法线期间或完成所述至少一种先前疗法线后至多6个月已经复发，所述至少一种先前疗法线是用于治疗所述疾病的化学免疫治疗性组合疗法。在一些实施方案中，所述化学免疫治疗性组合疗法独立地选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂，如其中所述PI3K抑制剂是艾拉利司、考泮利司或度维利司。在一些实施方案中，所述先前疗法线是包括抗CD20单克隆抗体和烷基化剂在内的化学免疫治疗性组合疗法。
在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述一种先前疗法线包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述两种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的至少三种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少三种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗所述疾病的三种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述三种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。
在一些实施方案中，所述受试者对用抗CD20疗法和烷基化剂治疗难治，或在所述治疗期间或完成所述治疗后至多6个月复发。在一些实施方案中，所述受试者对用先前疗法线治疗难治，或在所述先前疗法线期间或完成所述先前疗法线后至多6个月复发，所述先前疗法线包括抗CD20疗法和烷基化剂。在一些实施方案中，所述受试者对用先前疗法线治疗难治，或在所述先前疗法线期间或完成所述先前疗法线后至多6个月复发，所述先前疗法线包括抗CD20疗法和烷基化剂。在一些实施方案中，所述受试者对用抗CD20疗法治疗难治，或在所述治疗期间或完成所述治疗后至多6个月已经复发。在一些实施方案中，在完成疗法线后，向所述受试者施用抗CD20抗体维持疗法。在一些实施方案中，所述受试者在2种或更多种疗法线后的抗CD20抗体维持期间或在维持完成后6个月内已经复发。在一些实施方案中，所述受试者在前述疗法线后的抗CD20抗体维持期间或在维持完成后6个月内已经复发。
在上述实施方案中的示例性抗CD20抗体可以包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(也称为GA101或RO5072759)、维妥珠单抗、奥比妥珠单抗、TRU-015(TrubionPharmaceuticals)、奥卡妥珠单抗(也称为AME-133v或奥卡妥珠单抗)和Pro131921(Genentech)。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD20抗体包括利妥昔单抗。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体包括奥比妥珠单抗。在上述实施方案中的示例性烷基化剂包括但不限于环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺和苯达莫司汀。在一些实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀。
在一些实施方案中，所述受试者在诊断的24个月内且在完成先前疗法线(如化学免疫治疗方案)后具有疾病进展。在用化学免疫治疗方案(如R-CHOP)初步治疗新诊断的患者之后，大约25％的患者将在24个月内进展(Casulo,2015)。具有24个月内疾病进展(POD24)的患者的5年总存活率(OS)为50％，而非POD24患者的5年OS为90％。POD24是重要的预后存活因子(Casulo,Br J Haematol.2019；186(4):513-23)。在一些实施方案中，所述受试者在完成用于治疗所述疾病的化学免疫治疗性组合疗法后在开始治疗的24个月内具有疾病进展(POD24)。在一些实施方案中，所述受试者在完成用于治疗所述疾病的化学免疫治疗性组合疗法后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。
在一些实施方案中，根据本文提供的任何方法治疗FL受试者群组。在一些实施方案中，FL群组包含对用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线已经复发或难治的受试者，其中所述一种先前疗法线包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述FL群组包含具有以下的受试者：(i)FL诊断的24个月内疾病进展(POD24)、所述一种先前疗法线开始的24个月内疾病进展(POD24)或二者，以及(ii)在受试者初始FL诊断的六个月内接受所述一种先前疗法线。在一些实施方案中，所述FL群组包含具有以下一项或多项的受试者：(i)归因于FL的症状；(ii)威胁性终末器官功能、继发于淋巴瘤的血细胞减少症或巨块病；(iii)脾肿大；和(iv)在至少6个月内疾病进展稳定。因此，在一些实施方案中，FL群组包含对用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线已经复发或难治的受试者，其中所述一种先前疗法线包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；并且所述群组(i)在FL诊断的24个月内疾病进展(POD24)、在开始所述一种先前疗法线的24个月内疾病进展(POD24)或二者，并且在受试者初始FL诊断的六个月内接受所述一种先前疗法线；或(ii)具有以下一项或多项：归因于FL的症状；威胁性终末器官功能、继发于淋巴瘤的血细胞减少症或巨块病；脾肿大；和在至少6个月内疾病进展稳定。在一些实施方案中，所述归因于FL的症状不限于B症状。在一些实施方案中，巨块病是单个团块>7cm或者3个或更多个团块>3cm。
在一些实施方案中，根据本文提供的任何方法治疗FL受试者群组。在一些实施方案中，FL群组包含对用于治疗1、2或3A级FL的两种先前疗法线已经复发或难治的受试者，其中所述两种先前疗法线中的一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，所述FL群组包含这样的受试者，所述受试者(i)在完成先前疗法线(例如，第一先前疗法线或第二先前疗法线)的12个月内患有复发性或难治性疾病并且已经接受先前组合疗法；(ii)HSCT后已经复发；和/或(iii)满足双重难治性的定义。因此，在一些实施方案中，所述FL群组包含这样的受试者，所述受试者(i)对用于治疗1、2或3A级FL的两种先前疗法线已经复发或难治，其中所述两种先前疗法线中的一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；以及(ii)在完成先前疗法线(例如，第一先前疗法线或第二先前疗法线)的12个月内患有复发性或难治性疾病并且已经接受先前组合疗法；HSCT后已经复发，和/或满足双重难治性的定义。在一些实施方案中，用PI3Ki的单一疗法是先前疗法线。在一些实施方案中，如果受试者(i)对包括抗CD20抗体和烷基化剂在内的全身疗法线难治；(ii)在完成包括抗CD20抗体和烷基化剂在内的先前全身疗法线后六个月内已经复发；和/或(iii)在两种先前线或疗法后提供的抗CD20抗体维持疗法期间或在完成两种先前线或疗法后提供的抗CD20抗体维持疗法的6个月内已经复发，则所述受试者是双重难治的。
在一些实施方案中，根据本文提供的任何方法治疗FL受试者群组。在一些实施方案中，FL群组包含对用于治疗1、2或3A级FL的三种或更多种(例如三种)先前疗法线已经复发或难治的受试者，其中所述三种或更多种先前疗法线中的一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗。在一些实施方案中，HSCT是所述三种或更多种先前疗法线中的一种。在一些实施方案中，FL群组包含双重难治性受试者。在一些实施方案中，如果受试者(i)对包括抗CD20抗体和烷基化剂在内的全身疗法线难治；(ii)在完成包括抗CD20抗体和烷基化剂在内的先前全身疗法线后六个月内已经复发；和/或(iii)在两种先前线或疗法后提供的抗CD20抗体维持疗法期间或在完成两种先前线或疗法后提供的抗CD20抗体维持疗法的6个月内已经复发，则所述受试者是双重难治的。
在一些实施方案中，所述受试者未患有3B级FL(FL3B)。在一些实施方案中，所述受试者没有复合型DLBCL和FL的迹象，或转化的FL的迹象。在一些实施方案中，所述受试者未患有十二指肠型FL的世界卫生组织(WHO)子分类。
B.边缘区淋巴瘤(MZL)
在一些实施方案中，所提供的方法涉及治疗患有边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的特定组或子集。在一些实施方案中，所述受试者患有复发性/难治性MZL。
MZL是一种异质的B细胞恶性肿瘤，它源自B细胞的转化，所述B细胞在次级淋巴滤泡中成熟，然后易位到黏膜相关淋巴组织(MALT)、脾或淋巴结的边缘区域。在一些实施方案中，MZL展现以超突变IgV基因为特征的边缘区淋巴细胞或与其相关。在一些实施方案中，所述边缘区淋巴细胞展现泛B+；CD5-/+；CD10-；CD23-；CD11c+/-；cyIg+(40％的细胞)、sIgM+亮；sIgD-免疫表型或与其相关。
描述了三种亚型：结节外MZL(ENMZL，主要是胃)、脾MZL(SMZL)和结节MZL(NMZL)。在一些方面，所述受试者患有结节外MZL。在一些方面，结节外MZL可以在胃肠道、甲状腺、乳腺、肺、脾和/或其他MALT部位的MALT中检测到。在一些实施方案中，结节外MZL可以在胃中检测到。在一些方面，所述结节外MZL展现易位t(11:18)(q21；q21)/API2/MLT融合物或与其相关。在一些方面，所述结节外MZL展现易位t(14:18)(q32；q21)/IgH/MLT1融合物或与其相关。在一些方面，所述结节外MZL展现t(3:14)/IgH/FOXP1融合物或与其相关。在一些实施方案中，所述受试者患有脾MZL，其中最初仅在脾、骨髓和/或血液中检测到疾病。在一些实施方案中，脾MZL展现脾肿大相关循环绒毛淋巴细胞或与其相关。在一些方面，所述脾MZL展现7q缺失或与其相关。在一些方面，所述缺失跨越7q32.1至7q32-3之间的区域。在一些方面，所述脾MZL展现7q易位或与其相关。在一些方面，所述易位以7q22-q32区域为中心。在一些方面，所述脾MZL展现3三体性或与其相关。在一些方面，所述脾MZL展现12三体性或与其相关。在一些实施方案中，所述受试者患有结节MZL，其中所述淋巴瘤首先限于淋巴结、骨髓和/或血液(Swerdlow等人,(2016)Blood,30:84-91)。
在特定方面，本文提供的方法包括向所述受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中每种剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。此类CAR-T细胞和用于它们的制造的方法描述于部分II中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括施用从或从约2.5x107至为或约1.5x108个(如从约5x107至为或约1x108个)总重组受体表达T细胞(例如CAR+T细胞)，如以如本文所述的所定义的比率(例如，为或约1:1比率)施用一定剂量的包括CD4+和CD8+T细胞在内的T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.1x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.0x108个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约9x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约8x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约7x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包括在为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约6x107个CAR表达T细胞之间(包含端值)的剂量。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞。在特定实施方案中，施用的剂量是精确或平或固定数量的CAR+T细胞，或精确或平或固定数量的特定类型的CAR+T细胞(如CD4+CAR+T细胞和/或CD8+CAR+T细胞)，和/或一定数量的任何此类细胞，所述数量如与这个精确或平或固定数量相比在指定差异程度内，如不超过+或-(加或减，在一些情况下指示为±)5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在一些实施方案中，这样的平或固定数量的细胞是为或约2.5x107个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞、5×107个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞、或1x108个总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞。在一些实施方案中，所述剂量中的细胞数量包括2.5x107个CAR+T细胞(如1.25x107个CD4+CAR+T细胞和1.25x107个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量包括5×107个CAR+T细胞(如2.5x107个CD4+CAR+T细胞和2.5x107个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述剂量包括1x108个CAR+T细胞(如0.5x108个CD4+CAR+T细胞和0.5x108个CD8+CAR+T细胞)或由其组成或基本上由其组成。在一些方面，所施用的细胞数在前述实施方案中此类数量的某一差异程度内，例如如与细胞的此类一个或多个数量相比，在加或减(±)5％、6％、7％、8％、9％或10％内，如在加或减8％内。在一些方面，所述剂量在一个范围内，在所述范围中在此类细胞(例如，总CAR+T细胞或CD8+和/或CD4+CAR+T细胞)的数量与一种或多种结局之间观察到相关(任选地线性关系)，所述结局指示治疗反应或其持续时间(例如，实现缓解、完全缓解和/或缓解的特定持续时间的可能性)和/或任何前述项的持续时间。
在一些实施方案中，所述施用包括根据前述实施方案中任一个的剂量施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
在一些实施方案中，如果受试者患有MZL，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果患有组织学确认的疾病，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果患有CT确认的疾病，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果患有PET确认的疾病，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果患有非嗜PET疾病，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，如果所述受试者的至少一个可测量的结节病灶在长轴线上大于2.0cm，则选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，所述患者具有至少一个可测量的结节病灶。在一些实施方案中，所述患者具有至少一个可测量的结节外病灶。
在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治。在一些实施方案中，所述受试者在用于治疗MZL的两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治。一种或多种先前疗法线可以包括用于治疗MZL的任何疗法。在一些实施方案中，一种或多种先前疗法线选自用以下的治疗：CD20靶向疗法(例如，抗CD20抗体，如利妥昔单抗或奥比妥珠单抗)、依鲁替尼或造血干细胞移植(HSCT)。在一些情况下，所述HSCT是同种异体的。在一些情况下，所述HSCT是自体的。
在特定实施方案中，所述受试者已经接受先前疗法线，所述先前疗法线是包括CD20靶向疗法(例如抗CD20抗体)在内的组合化学免疫治疗性疗法。在一些实施方案中，所述组合是组合全身疗法。所治疗的受试者包括对用用于治疗MZL的组合全身疗法治疗已经复发或难治的受试者。在一些实施方案中，所述组合全身疗法包括抗CD20抗体和烷基化剂。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体是奥比妥珠单抗。示例性烷基化剂包括但不限于环磷酰胺、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺和苯达莫司汀。在一些实施方案中，所述烷基化剂是苯达莫司汀。在一些实施方案中，所述烷基化剂是苯丁酸氮芥。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用利妥昔单抗和苯达莫司汀治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用利妥昔单抗和苯丁酸氮芥治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用奥比妥珠单抗和苯达莫司汀治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用奥比妥珠单抗和苯丁酸氮芥治疗。
在一些实施方案中，先前疗法线是利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)。在一些实施方案中，所述受试者对用利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)治疗已经复发或难治。在一些实施方案中，所述受试者对用来那度胺和利妥昔单抗治疗已经复发或难治。
在一些实施方案中，先前疗法线是造血干细胞移植(HSCT)。在一些实施方案中，所述受试者对造血干细胞移植(HSCT)已经复发或难治。在一些实施方案中，所述受试者先前已经接受同种异体HSCT并且复发或对其难治。在一些实施方案中，所述受试者先前已经接受自体HSCT并且复发或对其难治。
在一些实施方案中，根据本文提供的任何方法治疗MZL受试者群组。在一些实施方案中，MZL群组包含这样的受试者，所述受试者对用于治疗MZL的两种先前疗法线已经复发或难治，其中至少一种先前疗法线是组合全身疗法、用抗CD20抗体和烷基化剂的疗法或HSCT。在一些实施方案中，所述受试者在HSCT后复发。在一些实施方案中，所述MZL是脾MZL并且所述两种先前疗法线中的一种是脾切除术。在一些实施方案中，所述MZL是结节外MZL并且抗生素不是所述两种先前疗法线中的一种。
在一些实施方案中，所述受试者患有脾MZL并且所述至少两种先前疗法中的至少一种是脾切除术。在一些实施方案中，所述受试者患有脾MZL并且所述两种先前疗法中的至少一种是脾切除术。在一些实施方案中，受试者患有结节外MZL(ENMZL)并且抗生素不是所述至少两种先前疗法线中的一种。在一些实施方案中，受试者患有结节外MZL(ENMZL)并且抗生素不是所述两种先前疗法线中的一种。
C.反应、功效和存活
在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生耐药性，但是根据所提供的方法的施用有效治疗了所述受试者。在一些实施方案中，至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的根据所述方法治疗的受试者实现完全缓解(CR)。在一些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少80％或至少90％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，至少或至少约50％的根据所述方法治疗的受试者、至少或至少约60％的受试者、至少或至少约70％的受试者、至少或至少约80％的受试者或者至少或至少约90％的受试者实现CR和/或实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，评估有效治疗的标准包括总体反应率(ORR；在一些情况下也称为客观反应率)、完全反应(CR；在一些情况下也称为完全缓解)、反应持续时间(DOR)、无进展存活期(PFS)和/或总体存活期(OS)。
在一些实施方案中，至少40％、至少50％、至少60％或至少70％的根据本文提供的方法治疗的受试者实现完全缓解(CR；在一些情况下也称为完全反应)、展现超过为或约3个月、6个月或12个月或者超过13个月或者大约14个月的无进展存活期(PFS)和/或总体存活期(OS)。在一些实施方案中，平均而言，根据所述方法治疗的受试者展现超过为或约6个月、12个月或18个月的中值PFS或OS。在一些实施方案中，所述受试者在治疗后展现至少为或约6、12、18个月或更多个月或更长时间的PFS或OS。
在一些实施方案中，根据所提供的方法治疗的受试者展现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的CRR。在一些实施方案中，完全反应率(CRR)计算为最佳总体反应(BOR)长达12个月、长达18个月、长达24个月、长达36个月或更长时间的受试者的百分比。
在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准(Luganocriteria)。(Cheson等人,Blood.2016；128(21):2489-96)。在一些方面，反应评估利用任何临床、血液学和/或分子方法。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应涉及视情况使用正电子发射断层摄影术(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，在使用PET-CT评估嗜FDG组织学的反应的情况下，可以使用5分量表。在一些方面，所述5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。
在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应涉及在不同可测量部位的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残余肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的结节外部位中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累位点的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。
在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外位点，并且靶淋巴结/淋巴结肿块的病灶的最长横径(LDi)必须复原至≤1.5cm。其他评估部位包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态。其他位点可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在CR的情况下应不存在(Chessen等人,Blood.2016年11月24日；128(21):2489-96)。
在一些方面，使用卢加诺标准描述的部分反应(PR；在一些情况下也称为部分缓解)涉及在不同可测量位点的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些位点包括淋巴结和淋巴外位点，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残余肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残留疾病。
在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外部位的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估位点包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残余摄取，所述残余摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情境下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他位点可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常、复原但不增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。(Chessen等人,Blood.2016年11月24日；128(21):2489-96)。
在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为治疗疾病(如癌症)期间和之后受试者伴随疾病存活但疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR；在一些情况下也称为总体反应率)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总存活期(OS)被描述为从诊断日期或疾病(如癌症)治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。
在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，在从开始疗法起的一个时间段之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在治疗开始后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应可持续大于3个月或大于6个月。
在一些实施方案中，如与通过可比较方法使用替代性给药方案(如其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞剂量和/或淋巴细胞清除剂的方法)会观察到的降低相比，所述方法降低疾病或病症的负荷(例如，肿瘤细胞数、肿瘤大小、患者存活或无事件存活的持续时间)至更大程度和/或持续更长时间段。在一些方面，评估受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，指定疾病或病症负荷的量度。
在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞和/或淋巴细胞清除剂的剂量的方法)相比，所述方法改进所述受试者的无事件存活率或总存活率。例如，在一些实施方案中，在所述剂量后6个月时通过所述方法治疗的受试者的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总体存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者展现出无事件存活、无复发存活或存活至少6个月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些实施方案中，进展的时间得到改善，如进展的时间大于或大于约6个月或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞和/或淋巴细胞清除剂的剂量的方法)相比，在通过所述方法治疗后，复发的概率降低。例如，在一些实施方案中，在第一剂量后6个月时复发的概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。
在一些情况下，确定所施用细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所施用细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013年3月；5(177):177ra38)蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012年2月；10:29)，直接引入CAR中的特定位点中的表位标签如Strep-标签序列，借此使用Strep-标签的结合试剂直接评估CAR(Liu等人(2016)NatureBiotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(CAR或TCR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗
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或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。
在一些实施方案中，可以在施用所述细胞疗法后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR+T细胞的数量，例如，以确定所述细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在所述受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数受试者中可检测的CAR+T细胞(任选地CAR+CD8+T细胞和/或CAR+CD4+T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。在一些实施方案中，获自所述患者的生物学样品(例如血液)中的CAR+T细胞的数量可以经由关于CAR转基因的PCR确定。
D.毒性
在一些实施方案中，评估根据所提供的方法治疗的受试者的可能与所施用细胞相关的毒性的一种或多种体征或症状。施用过继T细胞疗法如用表达嵌合抗原受体的T细胞进行的治疗可以诱导毒性作用或结局，如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些例子中，此类效果或结局与高水平的循环细胞因子并行，高水平的循环细胞因子可能是观察到的毒性的基础。
在一些方面，毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物制品后可发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)。
通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。重度的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他重度的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。在一些方面，发热、特别是高热(≥38.5℃或≥101.3°F)与CRS或其风险相关。在一些情况下，CRS的特征或症状类似于感染。在一些实施方案中，在呈现CRS症状的受试者中也考虑感染，并且可以施用通过培养的监测和经验性抗生素疗法。与CRS相关的其他症状可以包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、肾和/或肝衰竭、凝血障碍、弥散性血管内凝血和毛细血管渗漏综合征。
可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如，抗IL-6抗体，例如，托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。CRS的结局、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定施用实现或不实现给定的CRS相关结局、体征或症状的情况下，可以指定特定结局、体征和症状和/或其量或程度。
在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后两周内发生。参见Abramson等人,J Clin Onc.2018；36(15_增刊):7505。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于3天或超过21天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负荷有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。
与CRS相关的示例性结局包括发热、僵直、寒战、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫发作样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、转氨酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。与CRS相关的其他示例性体征或症状包括血流动力学不稳定、发热型嗜中性粒细胞减少症、血清C反应蛋白(CRP)增加、凝血参数(例如，国际标准化比率(INR)、凝血酶原时间(PTI)和/或纤维蛋白原)变化、心脏和其他器官功能的变化、和/或绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。
在一些实施方案中，与CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫发作)。在一些实施方案中，可以与CRS同时观察到神经毒性(NT)。
示例性CRS相关结局包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结局进一步包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。
已经研发出CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25；Abramson等人,J Clin Onc.2018；36(15_增刊):7505)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负荷和sCRS症状二者密切相关。在一些实施方案中，反映CRS分级的标准是下表2中详述的那些。
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Figure BDA0003852159880000291
在一些实施方案中，高剂量血管加压药疗法包括下表3中所述的那些。
Figure BDA0003852159880000292
在一些实施方案中，毒性结局是重度CRS。在一些实施方案中，毒性结局是重度CRS的不存在(例如中度或轻度CRS)。
在一些实施方案中，可以测量发热和/或C反应蛋白(CRP)的水平。在一些实施方案中，CRS相关血清因子或CRS相关结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子的水平和/或浓度的增加，所述炎性细胞因子和/或趋化因子包括Flt-3L、分形趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、MIP-1、sIL-2Rα或肿瘤坏死因子α(TNFα)。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。
在一些实施方案中，与重度CRS或3级CRS或更高级CRS(如4级或更高级)相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如在指定温度(例如高于或高于约38摄氏度)发热两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或至少连续三天；高于或高于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如与至少两种细胞因子(例如，由以下各项组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))的治疗前水平相比，例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO2)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫)。在一些实施方案中，重度CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。
在一些实施方案中，CRS(如重度CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)CRP的血清水平为至少或至少约20mg/dL。在一些实施方案中，所述CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。
在一些实施方案中，重度CRS或3级CRS涵盖丙氨酸转氨酶的增加、天冬氨酸转氨酶的增加、寒战、发热性嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。在一些实施方案中，将重度CRS用另外的T细胞耗尽疗法(如环磷酰胺)治疗(Brudno等人,Blood.2016；127(26):3321-30)。
可以指定测量或检测各种结局的方法。
在一些方面，毒性结局是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、失语、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫发作(任选地如通过脑电图(EEG)证实)、升高的β淀粉样蛋白(Aβ)水平、升高的谷氨酸水平和升高的氧自由基水平。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如美国国家癌症研究所—常见毒性标准(National Cancer Institute—Common Toxicity Criteria)第5.00版(NCI CTCAE5.0版))
在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至23天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。
在一些实施方案中，重度神经毒性包括3级或更高分级神经毒性，如表4所示。
Figure BDA0003852159880000301
在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。
在一些实施方案中，在根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者中观察到的所得反应在大多数所治疗受试者中与任何毒性的低风险或重度毒性的低风险相关或导致任何毒性的低风险或重度毒性的低风险。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％或90％或更多的根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者未展现出任何分级的CRS或任何分级的神经毒性(NT)。在一些实施方案中，大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者未展现出重度CRS或3级或更高分级的CRS。在一些实施方案中，大于或大于约50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多的根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者未展现出重度神经毒性或3级或更高分级的神经毒性，如4级或5级神经毒性。
在一些实施方案中，至少或至少约45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的根据所述方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者未展现出早发性CRS或神经毒性和/或未展现出开始施用后早于1天、2天、3天或4天的CRS发作。在一些实施方案中，至少或至少约45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的根据所述方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者未展现出开始施用后早于3天、4天、5天、6天或7天的神经毒性发作。在一些方面，在根据所述方法和/或用所提供制品或组合物治疗的受试者之间神经毒性的中值发作是在根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后、或中值消退时间时或之后。在一些情况下，在根据所述方法治疗的受试者之间神经毒性的中值发作大于或大于约8、9、10或11天。
II.细胞疗法和工程化细胞
在一些实施方案中，用于根据所提供的组合疗法方法使用的细胞疗法(例如，T细胞疗法)包括施用表达重组受体(例如CAR)的工程化细胞，所述重组受体被设计为识别和/或特异性结合至与疾病或病症(如r/r/1-3A级FL或r/r/MZL，包括展现高风险特征的此类疾病或病症)相关的抗原。在特定实施方案中，由重组受体(例如CAR)结合或识别的抗原是CD19。在一些实施方案中，与所述抗原的结合导致反应，如针对这样的抗原的免疫应答。在一些实施方案中，细胞含有或者被工程化为含有重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。重组受体如CAR通常包括针对抗原具有特异性的细胞外抗原(或配体)结合结构域，其与一个或多个细胞内信号传导组分连接(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)。在一些方面，工程化细胞作为适于施用于受试者、如适于过继细胞疗法的药物组合物和配制品来提供。还提供了用于向受试者(例如，患者)施用细胞和组合物的治疗方法。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
A.嵌合抗原受体
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，所述工程化细胞(如T细胞)表达嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，所述嵌合受体含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域使提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，工程化的细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶标细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或病原细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在特定方面，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，任何此类抗原是在人B细胞上表达的抗原。
嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域是抗体分子的一个或多个抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是抗体分子的一部分，通常是所述抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)，如sdFv、纳米抗体、VHH和VNAR。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或者是其变体。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括源自FMC63的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)。Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:38和39分别所示的CDR-H1和CDR-H2，和SEQ ID NO:40或54所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:35所示的CDR-L1、和SEQ ID NO:36或55所示的CDR-L2和SEQ IDNO:37或56所示的CDR-L3序列。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR-L1序列、SEQ ID NO:36的CDR-L2序列和SEQ ID NO:37的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR-H1序列、SEQ ID NO:39的CDR-H2序列和SEQ ID NO:40的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:59所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:57至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:43至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括源自SJ25C1的VH和/或VL，其在一些方面可以是scFv。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987)。Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别在SEQID NO:44-46所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:44的CDR-L1序列、SEQ ID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDR-H1序列、SEQ ID NO:48的CDR-H2序列和SEQ ID NO:49的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:52所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQID NO:53所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:53至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是已知的，在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
下表5列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
Figure BDA0003852159880000341
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，指定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过对天然存在的完整抗体进行酶消化产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都衍生自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在一些方面，重组受体(例如嵌合抗原受体)包括细胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区)。在一些方面，重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如抗原)结合结构域的细胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区或结构域。
在一些实施方案中，重组受体(如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135或国际专利申请公开号WO 2014031687。
在一些实施方案中，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQID NO:1所示且由SEQ ID NO:2所示的序列编码的仅铰链间隔子。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任何一个至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或由其组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链(任选地IgG4铰链)或其修饰形式或由其组成；或(d)由以下组成或包含以下：SEQ ID NO:1、3-5、27-34或58所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体，或(e)包含式X1PPX2P(其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸)或由其组成。
在一些实施方案中，所述抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，所述抗原识别结构域(例如细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含在细胞外结构域(例如scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用与受体(例如，CAR)中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域(例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域)或其变体，或是包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区或结构域。在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。细胞内信号传导区包括模拟或类似以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能,如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区的截短部分(例如如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，所述细胞内(或胞质)信号传导区包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:13、14或15至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些实施方案中，CAR包括CD28或4-1BB(如人CD28或人4-1BB)的共刺激区域或结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:10或11至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:12至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，同一CAR包括初级(或激活)胞质信号传导区和共刺激信号传导组分二者。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括均在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，这两种受体分别将激活和抑制性信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，这种策略可以用于例如降低在如下背景中的脱靶效应的可能性，在所述背景中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在所述疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共同刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这种抑制性分子的信号传导结构域或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其用于减弱例如由激活和/或共刺激CAR诱导的细胞应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述抗原受体还包括标记，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记如细胞表面标记，所述替代标记可以用于确认细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，所述标记包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR或表皮生长因子受体，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸可操作地连接至编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6或17所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ链是人CD3-ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区还包含与CD3ζ细胞内结构域连接的CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28是人CD28。在一些实施方案中，4-1BB是人4-1BB。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区之间的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28来源的跨膜结构域的全部或一部分的跨膜结构域、CD28来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任一种)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28来源的跨膜结构域、4-1BB来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ来源的信号传导结构域。
在任何所提供的方法的特定实施方案中，所述CAR以从N末端至C末端的顺序含有：为SEQ ID NO:43所示的scFv的细胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:1所示的间隔子、SEQ IDNO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域、和SEQ ID NO:13所示的CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域。
B.用于基因工程化的核酸、载体和方法
在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。
在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然信号肽，如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25所示并且由SEQ ID NO:24所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码所述重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码所述重组受体的多核苷酸引入含有所培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines andTher.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括而不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码所述重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
在一些实施方案中，所述载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可以用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是被制备为在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A序列，如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:7或16中列出的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗
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或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，所述分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被将被过继转移细胞的宿主免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy,2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp.Hematol.,28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol.Ther.Nucl.Acids.,2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.,2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cellbased therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如以下中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
用于基因工程化的细胞和细胞的制备在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分开是基于亲和力或基于免疫亲和力的分开。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞))通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0003852159880000461
M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体还分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood,1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-且CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
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Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像
Figure BDA0003852159880000472
或
Figure BDA0003852159880000473
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。其他例子是胶体大小的颗粒，如在Owen的美国专利号4,795,698以及Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经受另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于施用于患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选
Figure BDA0003852159880000481
(Miltenyi Biotec，奥本，加利福尼亚州)来进行的。磁激活细胞分选
Figure BDA0003852159880000482
系统能够高纯度选择附接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，
Figure BDA0003852159880000483
以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结局和/或调整。
在一些方面，使用
Figure BDA0003852159880000484
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，
Figure BDA0003852159880000485
系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS
Figure BDA0003852159880000487
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS
Figure BDA0003852159880000486
系统配备有细胞处理单元，其允许自动化洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS
Figure BDA0003852159880000488
系统还可以包括机载相机和图像识别软件，所述图像识别软件通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS
Figure BDA0003852159880000489
系统还可以包括集成的细胞培育室，其实现细胞培养方案，如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，经由制备规模(荧光激活细胞分选，FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活或刺激TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/mL的浓度)的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，孵育是根据多种技术，如以下中所述的那些技术来进行：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，孵育还可以包括加入非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
C.工程化细胞的方法
在特定实施方案中，所述工程化细胞通过如下过程来产生，所述过程从一种或多种输入组合物和/或从单个生物样品产生经富集T细胞的输出组合物。在某些实施方案中，所述输出组合物含有表达重组受体(例如CAR，如抗CD19 CAR)的细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞适合于作为疗法(例如自体细胞疗法)施用于受试者。在一些实施方案中，所述输出组合物是经富集CD4+或CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，用于生成或产生工程化细胞的过程是通过包括以下步骤中的一些或全部的过程：收集或获得生物样品；从生物样品中分离、选择或富集输入细胞；冷冻保存和储存输入细胞；解冻和/或在刺激条件下孵育输入细胞；将所刺激的细胞进行工程化以表达或含有重组多核苷酸，例如编码重组受体如CAR的多核苷酸；将工程化细胞培育至例如阈值量、密度或扩增；将培育的细胞配制在输出组合物中；和/或冷冻保存和储存配制的输出细胞，直到细胞被释放用于输注和/或适合于被施用于受试者。在某些实施方案中，所述过程用经富集T细胞的两种或更多种输入组合物(如单独的CD4+组合物和单独的CD8+组合物)进行，所述两种或更多种输入组合物分别从相同的起始或初始生物样品处理和工程化，并以CD4+与CD8+T细胞的限定比率，例如1:1比率重新输注回受试者体内。在一些实施方案中，经富集T细胞是或包含工程化的T细胞，例如，转导以表达重组受体的T细胞。
在特定实施方案中，表达重组受体(例如抗CD19 CAR)的工程化细胞的输出组合物由细胞的初始和/或输入组合物产生。在一些实施方案中，所述输出组合物是经富集T细胞、经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞的组合物(在下文也分别称为经富集T细胞的组合物、经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+T细胞的组合物)。在一些实施方案中，富集CD4+T细胞的组合物含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述经富集CD4+T细胞的组合物含有100％CD4+T细胞、含有约100％CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD4+T细胞组成。在一些实施方案中，富集CD8+T细胞的组合物含有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD8+T细胞，或者含有或含有约100％CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+T细胞的组合物包括或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述细胞群基本上由CD8+T细胞组成。
在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的过程还可以包括以下中的一种或多种：激活和/或刺激细胞，例如输入组合物的细胞；和/或将激活和/或刺激的细胞进行基因工程化，例如以通过转导或转染引入编码重组蛋白的多核苷酸；和/或例如在促进增殖和/或扩增的条件下，培育工程化细胞。在特定实施方案中，所提供的方法可以与收获、收集和/或配制在细胞已经被孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育之后产生的输出组合物结合使用。
在一些实施方案中，通过用于选择、分离、激活、刺激、扩增、培育和/或配制细胞的过程产生或生成根据所提供的方法和用途使用的工程化细胞，如表达如所描述的抗CD19CAR的那些。在一些实施方案中，此类方法包括如所描述的任何一种。
在一些实施方案中，根据所提供的方法和用途使用的工程化细胞(如表达如所述的抗CD19 CAR的那些)通过如例如WO 2019/089855和WO 2015/164675中所述的示例性过程产生或生成。
在任何实施方案的一些中，用于生成、产生或制造所述工程化细胞(如表达如所述的抗CD19 CAR的那些)或包含此类细胞的组合物(如包含各自表达相同抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞的组合物)的示例性过程涉及使经富集CD4+和经富集CD8+细胞群分别经历处理步骤。在用于生成或制造工程化细胞的示例性过程的一些方面，CD4+和CD8+细胞分别选自例如通过白细胞单采术获得的人外周血单核细胞(PBMC)，产生单独的经富集CD4+细胞组合物和经富集CD8+细胞组合物。在一些方面，此类细胞可以被冷冻保存。在一些方面，可以随后将CD4+和CD8+组合物解冻，并使其分别经历刺激、转导和扩增的步骤。
在用于生成或制造工程化细胞的示例性过程的一些方面，将解冻的CD4+和CD8+细胞分别例如在与抗CD3和抗CD28抗体偶联的聚苯乙烯包被的顺磁珠(如在1:1珠与细胞比率下)的存在下进行刺激。在一些方面，在含有人重组IL-2、人重组IL-15和N-乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基中进行刺激。在一些方面，用于CD4+细胞的细胞培养基还可以包括人重组IL-7。
在用于生成或制造工程化细胞的示例性过程的一些方面，在引入珠后，用编码相同CAR(如相同的抗CD19 CAR)的慢病毒载体分别转导CD4+和CD8+细胞。在一些方面，所述CAR可以含有源自鼠类抗体的抗CD19 scFv、免疫球蛋白间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述载体可以编码截短受体，所述截短受体用作CAR表达的替代标记并且通过T2A序列连接至CAR构建体。在示例性方法的一些方面，在10μg/ml硫酸鱼精蛋白的存在下转导所述细胞。
在用于生成或制造工程化细胞的示例性方法的一些方面，在转导后，通过暴露于磁场将珠从所述细胞组合物中除去。在一些方面，通过生物反应器(例如，XuriTM W25生物反应器)，在连续混合和氧气转移的情况下，分别培育CD4+和CD8+细胞组合物以进行扩增。在一些情况下，将泊洛沙姆添加到培养基中。在一些方面，在IL-2和IL-15的存在下培育CD4+和CD8+细胞组合物两者。在一些方面，CD4+细胞培养基还包括IL-7。在一些情况下，在收获之前，将CD4+和CD8+细胞各自培育至4倍扩增。在一些方面，达到阈值后一天，分别收获、配制和冷冻保存来自每种组合物的细胞。在一些方面，用于生成、产生或制造所述工程化细胞(如表达如所述的抗CD19 CAR的那些)或包含此类细胞的组合物(如包含各自表达相同抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞的组合物)的示例性过程包括下表6中所述的那些。
Figure BDA0003852159880000511
Figure BDA0003852159880000521
*大约
在其他方面，用于生成、产生或制造所述工程化细胞或包含此类细胞的组合物的不同示例性过程包括与上述示例性过程的不同之处在于以下项的过程：在刺激期间未将NAC添加至培养基中；CD4+细胞培养基不含有IL-2；以3:1的珠与细胞比率刺激细胞；用更高浓度的硫酸鱼精蛋白转导细胞；在约第7天进行珠去除；并且在静态设置下(即不进行连续混合或灌注(例如，半连续和/或逐步灌注)的情况下)并且在无泊洛沙姆的情况下进行扩增。
在一些实施方案中，经富集CD4+T细胞的至少一种单独组合物和经富集CD8+T细胞的至少一种单独组合物是从单一生物样品(例如，来自同一供体(如患者或健康个体)的PBMC或其他白细胞样品)中分离、选择、富集或获得的。在一些实施方案中，最初从同一生物样品(如获得、收集、和/或获取自单一受试者的单一生物样品)中来源(例如分离、选择和/或富集)经富集CD4+T细胞的单独组合物和经富集CD8+T细胞的单独组合物。在一些实施方案中，首先使生物样品经历CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且进一步使阴性级分经历CD8+T细胞的选择。在其他实施方案中，首先使生物样品经历CD8+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分，并且进一步使阴性级分经历CD4+T细胞的选择。在一些实施方案中，如在国际PCT公开号WO2015/164675中所述进行选择方法。在一些实施方案中，如在国际PCT公开号WO 2019/089855中所述进行选择方法。在一些方面，首先对生物样品阳性选择CD8+T细胞以产生经富集CD8+T细胞的至少一种组合物，并且然后对阴性级分阳性选择CD4+T细胞以产生经富集CD4+T细胞的至少一种组合物，使得经富集CD8+T细胞的至少一种组合物和经富集CD4+T细胞的至少一种组合物是来自同一生物样品(例如来自同一供体患者或健康个体)的单独组合物。在一些方面，将富集的T细胞的两种或更多种分开的组合物(例如，至少一种是来自同一供体的富集的CD4+T细胞的组合物，并且至少一种是富集的CD8+T细胞的单独组合物)单独地冷冻(例如冷冻保护或冷冻保存)在冷冻保存介质中。
在一些方面，将来自同一生物样品的经富集T细胞的两种或更多种单独组合物(例如至少一种是经富集CD4+T细胞的组合物并且至少一种是经富集CD8+T细胞的单独组合物)通过与刺激试剂接触(例如通过与用于T细胞激活的CD3/CD28缀合的磁珠一起孵育)进行激活和/或刺激。在一些方面，例如使用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体对激活/刺激的细胞组合物中的每一种进行工程化、转导和/或转染，以在每种细胞组合物的CD4+T细胞和CD8+T细胞中表达相同的重组蛋白。在一些方面，所述方法包括从细胞组合物中去除刺激试剂，例如磁珠。在一些方面，分别培育含有工程化CD4+T细胞的细胞组合物和含有工程化CD8+T细胞的细胞组合物，例如用于其中的CD4+T细胞和CD8+T细胞群的扩增。在某些实施方案中，例如通过在配制缓冲液中洗涤细胞组合物来收获和/或收集和/或配制来自培育的细胞组合物。在某些实施方案中，将包含CD4+T细胞的配制细胞组合物和包含CD8+T细胞的配制细胞组合物冷冻(例如冷冻保护或冷冻保存)在冷冻保存介质中。在一些方面，每种配制品中的工程化CD4+T细胞和CD8+T细胞源自同一供体或生物样品并表达相同的重组蛋白(例如CAR，如抗CD19 CAR)。在一些方面，将单独的工程化CD4+配制品和单独的工程化CD8+配制品以限定比率(例如1:1)施用于有需要的受试者，如同一供体。
1.用于基因工程化的细胞和细胞的制备
在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的细胞(如T细胞)是已经进行基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR或TCR)的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下使用。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，如CD4+或CD8+T细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，如CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，核酸(如编码重组受体的核酸)是异源的，即通常在细胞或从所述细胞获得的样品中不存在，如从另一种生物体或细胞获得的核酸，所述核酸通常在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物体中没有发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，所述细胞是自体的。在一些方面，所述细胞是同种异体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如，从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品、以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过
Figure BDA0003852159880000541
或
Figure BDA0003852159880000542
梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性结合至细胞上的标记的分子(例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒如珠(例如磁珠)进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用在国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数量。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于亲和力的所需选择试剂混合，所述量远少于根据制造商的说明书在管或容器中进行类似选择以用于选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常采用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或至少约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至所述细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将所述选择缓冲液和选择试剂单独添加至所述细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间是从或从约5分钟至6小时，如从或从约30分钟至3小时，例如，至少或至少约30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这种过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，使所孵育的细胞经受分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与所述选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与所述选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到系统中用于基于免疫亲和力来分离细胞。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分开是基于亲和力或基于免疫亲和力的分开。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群(如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞))通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0003852159880000561
M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表面标记特异性结合。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+T细胞的选择，其中同时保留阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+T细胞选自阴性级分。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体还分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在一些实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，对中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含TCM细胞的CD8+群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-且CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于以下中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
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Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像
Figure BDA0003852159880000582
或
Figure BDA0003852159880000583
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。其他例子是胶体大小的颗粒，如在Owen的美国专利号4,795,698以及Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经受另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于施用于患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选
Figure BDA0003852159880000584
(Miltenyi Biotec，奥本，加利福尼亚州)来进行的。磁激活细胞分选
Figure BDA0003852159880000585
系统能够高纯度选择附接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，
Figure BDA0003852159880000586
以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结局和/或调整。
在一些方面，使用
Figure BDA0003852159880000591
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，
Figure BDA0003852159880000592
系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌、无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS
Figure BDA0003852159880000593
系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS
Figure BDA0003852159880000594
系统配备有细胞处理单元，其允许自动化洗涤和通过离心来分级分离细胞。CliniMACS
Figure BDA0003852159880000595
系统还可以包括机载相机和图像识别软件，所述图像识别软件通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS
Figure BDA0003852159880000596
系统还可以包括集成的细胞培育室，其实现细胞培养方案，如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140；Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)JBiophoton.1(5):355-376。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。在一些实施方案中，将细胞组合物储存在含有为或约5％、6％、7％、7.5％、8％、9％或10％二甲亚砜或由任何前述值限定的范围(如为或约7.5％)的DMSO的配制品中。在一些方面，将组合物储存在含有为或约0.5％、1％、2％或2.5％(v/v)的25％人白蛋白或由任何前述值限定的范围(如为或约1％(v/v))的25％人白蛋白的配制品中。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择产生经富集T细胞，例如CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和/或获得。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+T细胞。在特定实施方案中，所述经富集T细胞的输入组合物基本上由CD3+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集CD4+T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述CD4+T细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD4+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种组合物是或包括CD8+T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述CD8+T细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD8+T细胞组成。
2.激活和刺激
在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括设计为诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)的那些。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，孵育是根据多种技术，如以下中所述的那些技术来进行：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞加入到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，孵育还可以包括加入非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将所述刺激剂以一定的量添加至室空腔中的细胞，所述一定的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同细胞数量或相同细胞体积实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(例如至少或至少约或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将所述孵育缓冲液和刺激剂单独添加至所述细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，所述旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或至少约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些实施方案中，所述刺激导致例如在转导之前细胞的激活和/或增殖。
3.用于基因工程化的载体和方法
在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的工程化细胞(如T细胞)是已经基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR或TCR)的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是通过引入、递送或转移编码所述重组受体和/或其他分子的核酸序列来工程化。
在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的方法包括将编码重组受体(例如，抗CD19 CAR)的多核苷酸引入至细胞，例如像经刺激或激活的细胞中。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如任何所述的。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，所述经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别基因工程化。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如所述方法中的任一种。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
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和
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2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统以及处理仪器和机柜描述于例如以下中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从或从约100g至3200g(例如，为或约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中所述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到生物反应器袋组件中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如抗原受体，如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道(University Blvd.)10801号20110-2209))获得，或者使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可以用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将此缺失转移到原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被拷贝到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在经转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录之后产生的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加病毒RNA基因组在包装细胞系中的表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合型载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如使一个或两个附接位点突变或缺失来防止整合，或者通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径；这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点两者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体还可以含有这样的基因，其表达赋予可检测或可选择标记，如抗药性。
所述病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因递送系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef和/或Tat(HIV的主要反式激活因子))。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了所述一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并且在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性、多嗜性或双嗜性包膜，如辛德比斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中待转导的细胞的浓度是从或从约1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL，如至少或至少约或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或约或至少为或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，如在或在约5x106IU/mL与5x107IU/mL之间，如至少6x106IU/mL、7x106IU/mL、8x106IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100(如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小)的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，如至少或至少约30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以如下体积接触：从或从约0.5mL至500mL，如从或从约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cellbased therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改进治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改进安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如以下中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而得到的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
4.工程化细胞的培育、扩增和配制
在一些实施方案中，用于产生例如用于根据所提供的方法、用途、制品或组合物中的任一种的细胞疗法的工程化细胞的方法包括用于培育细胞(例如，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。因此，在一些实施方案中，将已通过用编码CAR的重组多核苷酸转导或转染工程化的CAR阳性T细胞的组合物在促进增殖和/或扩增的条件下培育。
在某些实施方案中，工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，如已用编码重组受体(例如CAR)的多核苷酸工程化的经富集T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下培育，如在基因工程化(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)的步骤之后。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物，如已用编码重组受体(例如CAR)的多核苷酸工程化的经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物，如已用编码重组受体(例如CAR)的多核苷酸工程化的经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物，如已各自用编码重组受体(例如CAR)的多核苷酸分别工程化的经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+T细胞的组合物例如在促进增殖和/或扩增的条件下分别培育。
在一些实施方案中，培育是在促进增殖和/或扩增的条件下进行的。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计成促进细胞的生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培育所述细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子(例如重组细胞因子)是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种重组细胞因子包括IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在存在如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)的情况下培育所述细胞(例如，工程化细胞)：在1IU/mL与2,000IU/mL之间、在10IU/mL与100IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在100IU/mL与1,000IU/mL之间、在500IU/mL与2,000IU/mL之间或在100IU/mL与1,500IU/mL之间。
在一些实施方案中，培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或约37℃±2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，所述孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行培育。在特定实施方案中，在与所提供系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行培育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的组合物从封闭系统中去除并且置于用于培育的生物反应器中和/或与其连接。合适的用于培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，生物反应器用于在培育步骤的至少一部分期间灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。在一些情况下，生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包含端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min、或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，在灌注的情况下，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率(例如，这取决于与培育起始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度)进行培育的至少一部分。在一些实施方案中，在摇摆运动(例如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(例如在5RPM与15RPM之间(如6RMP或10RPM)的速度))的情况下进行细胞培养物扩增的至少一部分。
在一些实施方案中，用于制造、生成或产生根据所提供的方法、用途或制品的细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育之前或之后配制细胞(如配制由处理步骤产生的基因工程化细胞)和/或一个或多个如所述的其他处理步骤。在一些实施方案中，一个或多个加工步骤(包括配制细胞)可以在封闭系统中进行。在一些情况下，将细胞在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)中加工可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或一个或多个如所述的其他加工步骤之前或之后配制细胞，如配制由转导加工步骤产生的基因工程化细胞。在一些实施方案中，将基因工程化细胞作为单位剂型组合物配制，所述单位剂型组合物包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。
在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。这种组合物可以根据所提供的方法如在治疗疾病、病症和障碍，或在检测、诊断和预后方法、以及用途和制品中使用。在一些情况下，可以以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量配制细胞。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器(如袋或小瓶)中。在一些实施方案中，小瓶可以是输注小瓶。在一些实施方案中，使小瓶配制为具有所述工程化细胞的单一单位剂量，所述单一单位剂量如包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用于受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。
在一些实施方案中，配制缓冲液含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用冷冻保存剂溶液配制细胞，所述冷冻保存剂溶液含有1.0％至30％的DMSO溶液，如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS、或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，加工步骤可以涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以交换在冷冻保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞冷冻，例如冷冻保护或冷冻保存在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻(例如，冷冻保护或冷冻保存)，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、或0.25％的HSA，或者在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导的和/或扩增的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，如至少或至少约或约或50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用与跟细胞处理系统相关的一个或多个系统或套件结合的离心室(例如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括用于与
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或Sepax
Figure BDA0003852159880000712
细胞处理系统一起使用的那些)来进行。在国际公开号WO 2016/073602中描述了示例性系统和过程。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔输送经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物输送至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
Figure BDA0003852159880000713
和
Figure BDA0003852159880000714
2系统。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供经配制组合物输送。在一些方面，所需数量或多个小瓶可以无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至所述端口或少于全部的所述端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物输送至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量输送至多个输出容器(例如，小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于施用的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3个小瓶一起构成用于施用的剂量。在一些实施方案中，4个小瓶一起构成施用剂量。
因此，所述容器(例如袋或小瓶)通常含有待施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用于受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。在一些方面，所提供的制品包括所述多个输出容器中的一个或多个。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有为或约或至少或至少约1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有为或约或至少或至少约1x106、2x106、5x106、1x107、5x107或1x108个为CD3+(如CD4+或CD8+)的CAR+T细胞或其活子集。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积是在为或约10mL与为或约100mL之间，如为或约或至少或至少约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积是在为或约1mL与为或约10mL之间，如在为或约1mL与为或约5mL之间。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积是在为或约4mL与为或约5mL之间。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.4mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.5mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.6mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.7mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.8mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约4.9mL。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积为或为约5.0mL。
在一些实施方案中，所配制的细胞组合物的浓度为大于或大于约0.5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约1.0x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约1.5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.0x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.6x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.7x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.8x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约2.9x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约3.0x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约3.5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约4.0x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL、大于或大于约4.5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL或大于或大于约5x106个重组受体表达(例如CAR+)/CD3+细胞或此类活细胞/mL。在一些实施方案中，CD3+细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，CD3+细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD3+T细胞是CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，容器(例如袋或小瓶)中的细胞可以是冷冻保存的。在一些实施方案中，容器(例如小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，例如根据本文所述的方法、用途和制品，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用于受试者以治疗疾病或病症。
III.组合物和配制品
在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。示例性组合物和配制品如上所述，包括与对细胞进行工程化的方法相结合产生的那些。此类组合物可以根据所提供的方法或用途和/或用所提供制品或组合物来使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞或药剂和/或通过施用方法确定。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品或组合物还可含有多于一种活性成分，其可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病或病症，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述药剂或细胞以盐(例如药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注施用所述组合物、通过多次推注施用所述组合物或通过连续输注施用所述组合物来递送。
所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注给药来施用。在一些实施方案中，其是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注施用或通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。
可以使用标准施用技术、配制品和/或设备施用细胞或药剂。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应性细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用药剂或细胞群。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便施用，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
在一些实施方案中，所施用细胞的剂量在冷冻保存的组合物中。在一些方面，在将冷冻保存的组合物解冻后施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟内施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约120分钟内施用组合物。
在一些实施方案中，用注射器施用细胞的剂量。在一些实施方案中，注射器的体积是为或约0.5、1、2、2.5、3、4、5、7.5、10、20或25mL或由任何前述值限定的范围。
还提供了制品和试剂盒，其含有表达重组受体的工程化细胞或其组合物，以及任选地使用说明书，例如根据所提供的方法进行施用的说明书。在一些实施方案中，说明书指定根据任何所提供的方法选择或鉴定用于疗法的受试者的标准。
在一些实施方案中，提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物，以及向受试者施用以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以指定本文所提供方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书指定施用用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于施用的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于施用的条件。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包括用于疗法(例如，淋巴细胞清除疗法和/或组合疗法，如本文所述的任一种)的一种或多种另外的药剂，并且任选地进一步包括用于施用用于疗法的另外的药剂的说明书。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包含用于淋巴细胞清除疗法的药剂，并且任选地进一步包括用于施用淋巴细胞清除疗法的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于施用的组合物的标签或包装说明书而包含在内。
IV.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(例如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(例如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，被施用一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结局或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的影响。
如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。在一些实施方案中，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在施用的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重和所施用的细胞群。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情况下，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。
贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与所述组合物中的总细胞数或组合物体积相比，或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于在要耗尽的所述细胞群或细胞上不存在的标记的阴性选择，增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在被富集组合物中以等于或甚至接近100％存在。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的存在，其中所述染色可通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似的水平，和/或显著高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平的水平，和/或与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平基本上相似的水平。
如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
V.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗1、2或3A级惰性滤泡性淋巴瘤(FL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有为复发性/难治性(r/r)1、2或3A级滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在开始所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线24个月内具有疾病进展(POD24)。
4.根据实施方案2或实施方案3所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在完成所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的至少一种先前疗法线是包括利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松龙(R-CHOP)在内的化学免疫治疗性组合疗法。
6.根据实施方案2-5所述的方法，其中所述受试者在初始FL诊断的六个月内接受了所述一种先前疗法线。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且具有以下至少一项：归因于FL的症状；威胁性终末器官功能、继发于淋巴瘤的血细胞减少症或巨块病；脾肿大；并且在之前的六个月或更长时间内疾病进展稳定。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是两种先前疗法线。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述两种先前疗法线中的另一种选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂(PI3Ki)，任选地其中所述PI3Ki是艾拉利司、考泮利司或度维利司。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成先前疗法线的12个月内对治疗难治或已经复发，任选地其中先前疗法线是组合疗法或包含PI3Ki的单一疗法。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述受试者在HSCT后已经复发。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是三种先前疗法线。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述三种先前疗法线中的另两种各自独立地选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂(PI3Ki)，任选地其中所述PI3Ki是艾拉利司、考泮利司或度维利司。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述受试者对用抗CD20抗体治疗难治。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述受试者对包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线难治。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成用抗CD20抗体治疗的六个月内复发。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线的六个月内复发。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者在两种或更多种疗法线后的抗CD20抗体维持疗法期间或完成所述抗CD20抗体维持疗法后的六个月内已经复发。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述受试者具有至少一个PET阳性病灶和至少一个可测量的结节病灶或结节外病灶，任选地其中所述可测量的结节病灶在长轴线上大于1.5cm而不论短轴线如何，并且可测量的结节外病灶在长轴线和短轴线上大于1.0cm。
20.一种治疗边缘区淋巴瘤(MZL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述MZL是选自以下的亚型：结节外MZL(ENMZL，主要是胃)、脾MZL(SMZL)和结节MZL(NMZL)。
22.根据实施方案20或实施方案21所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗MZL的组合全身疗法或者是造血干细胞移植(HSCT)。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗所述MZL的组合全身疗法，并且所述组合全身疗法选自利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)、或用抗CD20抗体和烷基化剂的疗法。
24.根据实施方案20-23中任一项所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是组合全身疗法，所述组合全身疗法是抗CD20抗体和烷基化剂。
25.根据实施方案20-24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脾MZL(SMZL)并且所述至少两种先前疗法线中的至少一种是脾切除术。
26.根据实施方案20-24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有结节外MZL(ENMZL)，并且抗生素不是所述至少两种先前疗法线中的一种。
27.根据实施方案20-26中任一项所述的方法，其中所述受试者患有非嗜PET疾病，所述疾病具有在长轴线上大于2.0cm的至少一个可测量的结节病灶或至少一个可测量的结节外病灶。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有3B级FL(FL3B)。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述受试者没有复合型DLBCL和FL的迹象，或转化的FL(tFL)的迹象。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有十二指肠型FL的世界卫生组织(WHO)子分类。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述受试者对至少一种先前疗法线已经复发，并且复发是在对所述至少一种先前疗法线完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应后。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述受试者对至少一种先前疗法线难治，并且难治性治疗是对所述至少一种先前疗法线的疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是单克隆抗CD20抗体。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中所述烷基化剂是苯达莫司汀或苯丁酸氮芥。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约7天内完成的。
40.根据实施方案38或实施方案39所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约2至7天内完成的。
41.根据实施方案38-40中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。
42.根据实施方案38-41中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天以为或约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2并包含端值施用环磷酰胺，和/或以为或约20-40mg/m2，任选地30mg/m2施用氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天。
43.根据实施方案38-42中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天并行施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中CD19是人CD19。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含：含有抗体FMC63的可变重链区和可变轻链区的scFv、15个或更少的氨基酸的间隔子，并且含有免疫球蛋白铰链区或其修饰形式、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域和为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。
46.根据实施方案45所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式包含式X1PPX2P，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸(SEQ ID NO:58)。
47.根据实施方案45或实施方案46所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式是IgG1铰链或其修饰形式。
48.根据实施方案45或实施方案46所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式是IgG4铰链或其修饰形式。
49.根据实施方案45-48中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。
50.根据实施方案45-49中任一项所述的方法，其中所述间隔子由以下组成：SEQID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。
51.根据实施方案45-50中任一项所述的方法，其中所述间隔子的长度为或为约12个氨基酸。
52.根据实施方案45-51中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含SEQ ID NO:1所示的序列。
53.根据实施方案45-52中任一项所述的方法，其中所述间隔子由SEQ ID NO:1所示的序列组成。
54.根据实施方案45-53中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。
55.根据实施方案45-54中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
56.根据实施方案45-55中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含SEQ IDNO:12所示的序列，或是它的与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
57.根据实施方案45-56中任一项所述的方法，其中所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的序列，或是它的与SEQ ID NO:13、14或15所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
58.根据实施方案45-57中任一项所述的方法，其中所述scFv包含SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ ID NO:55的CDRL2序列和SEQ ID NO:56的CDRL3序列；以及SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQ ID NO:39的CDRH2序列和SEQ ID NO:54的CDRH3序列。
59.根据实施方案45-57中任一项所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和GNTLPYTFG(SEQ IDNO:37)的CDRL3序列；以及DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ IDNO:39)的CDRH2序列和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。
60.根据实施方案45-59中任一项所述的方法，其中所述scFv以从N末端至C末端的顺序包含含有SEQ ID NO:42所示的序列的VL和含有SEQ ID NO:41所示的序列的VH。
61.根据实施方案45-60中任一项所述的方法，其中所述scFv包含SEQ ID NO:43所示的序列。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述CAR以从N末端至C末端的顺序含有：为SEQ ID NO:43所示的scFv的细胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:1所示的间隔子、SEQ ID NO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域、和SEQ ID NO:13所示的CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是在约5x107个CAR+T细胞与约1.1x108个CAR+T细胞之间，包含每个端值。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是5x107个CAR+T细胞。
65.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1x108个CAR+T细胞。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中：
将所述第一组合物和所述第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天、相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
67.根据实施方案1-66中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔少于2小时施用。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中将包含所述CD8+CAR表达T细胞的所述第一组合物在包含所述CD4+CAR表达T细胞的所述第二组合物之前施用。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中将CD4+T细胞和CD8+T细胞的所述剂量静脉内施用。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞，任选地其中所述样品是全血样品、单采术样品或白细胞单采术样品。
72.根据实施方案71所述的方法，其中在向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法之前，从所述受试者获得所述样品。
73.根据实施方案1-72中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
74.根据实施方案1-73中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％或大于或大于约80％。
76.根据实施方案75所述的方法，其中所述CRR是最佳总体反应(BOR)为多达24个月的完全反应(CR)的受试者的百分比。
77.根据实施方案75或实施方案76所述的方法，其中所述受试者患有1、2或3A级FL，并且所述CRR是通过PET-CT评估的。
78.根据实施方案75或实施方案76所述的方法，其中所述受试者患有MZL，并且所述CRR是通过CT评估的。
79.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
80.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的药剂中的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
81.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
82.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的药剂中的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
VI.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1对治疗前活检物基因表达谱和临床反应的分析
将含有表达对CD19具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞的治疗性CAR+T细胞组合物施用于患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的受试者。
所施用的治疗性T细胞组合物是通过包括基于免疫亲和力(例如，免疫磁性选择)从来自要治疗的单独受试者的白细胞单采术样品富集CD4+和CD8+细胞的过程来产生。将分离的CD4+和CD8+T细胞用抗CD3/抗CD28磁珠单独激活并用编码抗CD19 CAR的病毒载体(例如，慢病毒载体)单独转导，之后以低体积对工程化细胞群进行单独扩增和冷冻保存。所述CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH取向)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。
在静脉内施用之前解冻冷冻保存的细胞组合物。通过施用以大约1:1的目标比率施用的经配制CD4+CAR+细胞群和经配制CD8+CAR+群体，将治疗性T细胞剂量作为限定的细胞组合物来施用。
在施用CAR T细胞组合物后，监测受试者的临床反应，包括在施用后3个月，并且通过评估受试者是否具有疾病进展(PD)或完全反应(CR)来确定对CAR T细胞组合物的反应。在所治疗的患者中，53％的患者在用CAR T细胞组合物治疗后实现持久的CR，其中在高风险、侵袭性复发性/难治性大B细胞淋巴瘤患者中，重度细胞因子释放综合征(CRS)和神经系统事件的发生率较低。部分患者在CAR T细胞治疗之后1年未实现CR。
在施用淋巴细胞清除化学疗法之前和CAR T细胞施用后大约第11天，收集来自50名治疗受试者的初始群组的肿瘤活检物，并通过RNA测序(RNA-seq)来分析基因表达。具体而言，由分离自肿瘤活检物的RNA制备互补DNA(cDNA)样品，并通过RNA-seq进行分析。将样品分为治疗后展现出CR或PD的患者组，而来自展现出疾病稳定(SD)或部分反应(PR)的受试者的样品未包括在分析中。将使用RNA-seq从治疗前肿瘤活检物确定的基因表达水平与施用自体治疗性CAR T细胞组合物后的反应进行事后相关联。
图1A示出了在治疗后3个月显示CR或PD的受试者中，治疗前肿瘤活检物中的差异性基因表达谱。将Log2倍数变化截止值设定为大于0.6或小于-0.6，并将假发现率(FDR)设定为小于或等于10％，揭示在来自治疗后3个月显示CR的受试者(n＝16)的治疗前活检物中高表达的360种基因，以及在来自治疗后3个月具有PD的受试者(n＝29)的治疗前活检物中高表达的380种基因。在差异性表达的基因中，与T细胞相关的基因表达在来自治疗后3个月展现出CR的受试者的治疗前活检物中更高。EZH2(一种编码zeste的组蛋白赖氨酸甲基转移酶增强子同源物2的基因)和作为EZH2的靶标的基因的表达在于治疗后3个月后显示PD的受试者的治疗前活检物中更高。
如图1B中所示，被鉴定为在DLBCL中比在FL中以更高水平表达的基因的基因集(命名为“FL_DLBCL_DN”基因集；来自对75个可用DLBCL细胞系样品和75个可用FL细胞系样品中的差异性基因表达的分析，如下文实施例2中所述)也被发现高度富集与来自在治疗后3个月展现出PD的受试者的活检物相关的基因。
在对来自同一研究的另外24名患者的较大群组(总共74名受试者；“较大群组”)的分析中，观察到类似的结果。与上述类似，在这组受试者中，对74名受试者在治疗前获取肿瘤活检样品，对56名受试者在治疗后大约11天获取肿瘤活检样品，并且在治疗前和治疗后大约11天对这些受试者中的28名进行匹配的活检，以进行如上所述的RNA-seq分析。在较大群组中，进行治疗前活检的患者中有46％在治疗后3个月展现出CR，而进行第11天活检的患者中有56％在治疗后3个月展现出CR。为了确定RNA-seq研究群体的反应结局与未获得RNA-seq样品的受试者群体相比是否存在偏倚，比较了两个群体之间的CR、PD、部分反应(PR)和无进展存活期(PFS)结局。没有观察到显著差异。
还对较大群组的治疗前肿瘤活检物进行了差异性基因表达分析，以鉴定在治疗后3个月展现出CR的受试者中更高表达的基因，以及在治疗后3个月展现出PD的受试者中更高表达的基因。在这组受试者中，将Log2倍数变化截止值设定为大于0.6或小于-0.6，并将FDR设定为小于或等于10％，揭示在来自治疗后3个月显示CR的受试者(n＝22)的治疗前活检物中更高表达的230个基因，以及在来自治疗后3个月显示PD的受试者(n＝40)的治疗前活检物中更高表达的271个基因(图2A)。
在较大群组的进一步分析中，并且如图2B所示，治疗前肿瘤活检物的基因表达分析揭示，包含在DLBCL中比在FL中更高表达的基因的基因集(DLBCL_LIKE_VS_FL)和包含区分DLBCL与FL的最上调的基因的基因集(SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_UP)在治疗后3个月时展现出PD的患者中富集。相比之下，包含在FL中比在DLBCL中更高表达的基因的基因集(FL_LIKE_vs_DLBCL)和包含区分DLBCL与FL的最下调的基因的基因集(SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_DN)在治疗后3个月时展现出CR的患者中富集。
这些结果支持，在与受试者中施用CAR-T细胞后3个月时的PD相关的基因中，与FL相比在DLBCL中以更高水平表达的基因以及EZH2靶基因在治疗前活检样品中富集。
对于28个匹配的上述治疗前和治疗后第11天的样品，使用包括CAR转录本在内的几个T细胞基因的平均值来估计治疗后第11天的免疫浸润。使用该浸润水平的中值将受试者分为两组-高浸润的受试者(n＝14)和低浸润的受试者(n＝14)。对28个治疗前样品进行差异性基因表达分析，所述样品按其匹配的第11天“高”或“低”浸润水平分组，以鉴定在治疗前活检物中与施用抗CD19 CAR T细胞后的T细胞浸润相关的基因表达。如图2C所示，在“高”浸润组中的受试者展现出包含在FL中比在DLBCL中更高表达的基因的基因集(FL_LIKE_vs_DLBCL)和包含区分DLBCL与FL的最下调基因的基因集(SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_DN)的富集。在“低”浸润组中的受试者中，观察到包含在DLBCL中比在FL中更高表达的基因的基因集(DLBCL_LIKE_vs_FL)和包含区分DLBCL与FL的最上调基因的基因集(SHIPP_DLBCL_VS_FOLLICULAR_LYMPHOMA_UP)的富集。
这些数据表明FL样基因表达与增加的T细胞浸润以及改善的对治疗的反应相关。
实施例2对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)与滤泡性淋巴瘤(FL)的基因表达分析
使用内部数据集进行了研究，以探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)与滤泡性淋巴瘤(FL)之间的生物学差异。
对以上实施例1所述的由分离自约75个滤泡性淋巴瘤(FL)和约75个弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)可用肿瘤细胞样品(福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤活检物)的RNA制备的互补DNA(cDNA)样品进行针对基因表达的RNA-seq。经分析的肿瘤细胞样品具有野生型或突变型EZH2，并且包括DLBCL的生发中心B细胞样(GCB)亚型和活化B细胞(ABC)亚型二者。如图3所示，在DLBCL和FL肿瘤细胞样品中观察到差异性基因表达，其中不同基因集在DLBCL(“DLBCL样”)和FL(“FL样”)肿瘤细胞样品中升高。在FL与DLBCL肿瘤细胞样品之间展现出差异表达的基因包括EZH2(图4A；编码zeste的增强子同源物2，一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶)和CD3E(图4B；编码T细胞表面糖蛋白CD3ε链，CD3-TCR复合物的ε多肽)。如图所示，与DLBCL肿瘤细胞样品相比，FL肿瘤细胞样品显示出较低的EZH2表达水平和较高的CD3E表达水平。
分析通过对治疗前肿瘤活检物(来自实施例1所述的受试者的初始群组，所述受试者然后被施用如所述的抗CD19治疗性T细胞组合物)进行RNA-seq获得的基因表达谱中来自图3所述研究的基因的表达，发现所述基因在DLBCL中比在FL中升高(称为“DLBCL样”或“DLBCL_LIKE_vs_FL”基因集)，或在FL中比在DLBCL中升高(称为“FL样”或“FL_LIKE_vs_DLBCL”基因集)。进行单样品基因集富集分析(ssGSEA)以计算每对样品与相应基因集的单独富集得分。如图5A所示，与继续展现出PD的受试者相比，在实施例1所述的研究中继续展现出CR的受试者具有DLBCL样基因集(DLBCL_LIKE_vs_FL)的更低ssGSEA得分。相反，如图5B所示，与继续展现出PD的受试者相比，在实施例1所述的研究中继续展现出CR的受试者具有FL样基因集(FL_LIKE_vs_DLBCL)的更高ssGSEA评分。
在实施例1中所述的较大群组中的受试者中的相似分析中，观察到相似的结果。治疗后3个月展现出CR的受试者具有FL样基因集的显著更高富集得分(图5C；n＝62)。此外，八名患者明显具有“FL样”基因表达得分；与非“FL样”受试者(CR＝22％)相比，这些具有最高“FL样”基因表达的受试者在治疗后3个月显示高CR率(CR＝100％)。一些具有高FL样得分的DLBCL受试者具有转化的滤泡性淋巴瘤(tFL)组织学，但也存在其他具有低FL样得分的tFL受试者。同样，一些非tFL受试者具有高FL样得分。在较大群组中的受试者中，比较了具有最高FL样得分的15名受试者与其余59名受试者的无进展存活(PFS)曲线，其中具有高FL样基因表达的受试者展现出明显更高的PFS(图5D)。
这些数据表明，患有DLBCL和FL的受试者的基因表达谱是不同的。具体而言，DLBCL和FL肿瘤活检物之间的基因表达差异与免疫细胞或基质细胞含量或肿瘤细胞状态有关。这些数据与如下的观察结果一致，即与患有DLBCL的受试者或具有发现在DLBCL受试者中升高的基因的较高表达的受试者相比，患有FL的受试者或具有发现在FL受试者中升高的基因的较高表达的受试者可能对T细胞浸润到肿瘤环境中具有较低的耐药性。此外，患有与FL肿瘤显现更相似的DLBCL肿瘤的受试者可以在CAR T细胞治疗后具有改善的PFS结局。
实施例3向患有滤泡性淋巴瘤(FL)或边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者施用抗CD19CAR 表达细胞
将含有CD4+CAR表达T细胞组合物与CD8+CAR表达T细胞组合物的限定组合物(约1:1比率)的抗CD19 CAR表达治疗性T细胞组合物施用于患有复发性/难治性(R/R)惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(包括1-3A级惰性滤泡性淋巴瘤(FL)和边缘区淋巴瘤(MZL))的受试者。
将受试者如下分为四个群组：群组1，四线以上(4L+)r/r/FL，包括双重难治性受试者；群组2，三线(3L)r/r FL，包括双重难治性受试者；群组3，二线(2L)r/r FL，包括在诊断和/或开始治疗的24个月内具有疾病进展(POD24)的受试者；以及群组4，三线以上(3L+)MZL。因此，招募了一组具有高风险特征的受试者，包括双重难治性受试者和诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)的受试者。双重难治性受试者是符合至少一项以下标准的那些：(i)对用包括抗CD20抗体和烷基化剂(例如苯达莫司汀)的先前疗法的治疗难治；(ii)在完成包括抗CD20单克隆抗体和烷基化剂(例如苯达莫司汀)在内的先前疗法的治疗后6个月内(即在6个月期间或至多6个月)已经复发；或(iii)在2种或更多种疗法线后在抗CD20维持期间或维持完成后6个月内已经复发。POD24受试者是用化学免疫治疗性组合疗法(如抗CD20抗体和烷基化剂(例如苯达莫司汀))治疗后在诊断或开始治疗的24个月内已经进展的那些。其他高风险特征包括在先前组合疗法完成后的12个月内复发，以及造血干细胞移植后失败。患有3B级FL(FL3B)的受试者被排除在招募外。此外，具有复合型DLBCL和FL或者转化的FL的迹象的受试者也被排除在招募之外。所有受试者的东部肿瘤协作组体能(ECOG)状态为0或1。示例性群组示于表E1中。
Figure BDA0003852159880000851
Figure BDA0003852159880000861
所施用的抗CD19 CAR表达治疗性T细胞组合物是通过包括基于免疫亲和力(例如，免疫磁性选择)从来自治疗的单独受试者的白细胞单采术样品富集CD4+和CD8+细胞的过程来产生。将分离的CD4+和CD8+T细胞单独激活并用编码抗CD19 CAR的病毒载体(例如，慢病毒载体)独立转导，之后以低体积对工程化细胞群进行单独扩增和冷冻保存。所述CAR含有源自鼠抗体的抗CD19 scFv(源自FMC63的可变区，VL-接头-VH取向)、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体进一步含有编码截短的受体的序列，所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记。
在静脉内施用之前解冻冷冻保存的CD4+和CD8+细胞组合物。通过施用以大约1:1的目标比率施用的经配制CD4+CAR+细胞群和经配制CD8+CAR+群体，将治疗性T细胞剂量作为限定的细胞组合物来施用。
在CAR+T细胞输注之前，受试者接受使用氟达拉滨(flu，30mg/m2/天)和环磷酰胺(Cy，300mg/m2/天)的淋巴细胞清除化疗持续三(3)天。在一些情况下，在施用淋巴细胞清除化学疗法之前，重新确认FL受试者的PET阳性疾病，以及重新确认MZL受试者的CT阳性疾病。
受试者在淋巴细胞清除之后2-7天接受CAR表达T细胞。向受试者施用单剂量的1x108(100x106)个CAR表达T细胞(每个单剂量分别经由以1:1比率的CD4+CAR表达T细胞和CD8+CAR表达T细胞的单独输注)。
在治疗之前的基线处和在治疗后的不同时间，基于通过正电子发射断层扫描(PET)和/或计算机断层扫描(CT)和/或磁共振成像(MRI)扫描的放射影像学肿瘤评估来评估对治疗的反应(例如基于卢加诺分类，参见例如Cheson等人,(2014)JCO32(27):3059-3067)。主要使用PET扫描评估FL受试者，而主要使用CT/MRI扫描评估MZL受试者。评估的反应结局还包括完全反应率(CRR)和总体反应率(ORR)。在一些情况下，还评估了反应持续时间(DOR)、无进展存活期(PFS)和总体存活期(OS)。
还监测了安全性评价，包括不良事件(AE)/严重的不良事件(SAE)收集、伴随药物治疗和程序评估、实验室评价、体格检查和生命体征评估。根据美国国家癌症研究所常见不良事件术语标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria forAdverse Events)(NCI CTCAE 5.0版)，收集、分级并报告AE和实验室异常(类型、频率和严重程度)。参见美国卫生与公众服务部，发表：11月27日,017。特别关注的不良事件(AESI)包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性(NT)、输注反应、巨噬细胞激活综合征(MAS)、肿瘤裂解综合征(TLS)、低丙球蛋白血症、长时间血细胞减少症、感染、第二原发肿瘤(SPM)和自身免疫事件。将细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NT)根据美国移植和细胞疗法学会(ASTCT)共有分级系统进行分级(Lee等人Biol Blood Marrow Transplant.2019年4月；25(4):625-38)。还监测了CRS和神经毒性的体征和症状。
评估的其他终点包括药代动力学(PK)，包括最大浓度(Cmax)、达最大浓度的时间(Tmax)、曲线下面积(AUC)和CAR表达T细胞的持久性(例如，如通过PCR评估)；药效学，包括外周B细胞发育不全的测量；健康相关的生活质量(HRQoL)，如通过EORTC QLQ-C30和/或FACT-LymS评估。
在一些情况下，评价反应、安全性和其他终点，持续治疗后至少或长达约24个月。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0003852159880000881
Figure BDA0003852159880000891
Figure BDA0003852159880000901
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
<120> 在过继细胞疗法中给药和治疗滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的方法
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<140> 尚未分配
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<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
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<223> 间隔子 (IgG4铰链)
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<213> 智人 (homo sapiens)
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
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Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
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Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
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Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
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Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
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<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)
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<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
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<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<220>
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 38
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 39
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 40
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 43
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 59
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 59
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (82)

1.一种治疗1、2或3A级惰性滤泡性淋巴瘤(FL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有为复发性/难治性(r/r)1、2或3A级滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在开始所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线24个月内具有疾病进展(POD24)。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且在完成所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的一种先前疗法线后在诊断的24个月内具有疾病进展(POD24)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述包括抗CD20抗体和烷基化剂的至少一种先前疗法线是包括利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松龙(R-CHOP)在内的化学免疫治疗性组合疗法。
6.根据权利要求2-5中的一项所述的方法，其中所述受试者在初始FL诊断的六个月内接受了所述一种先前疗法线。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，并且具有以下至少一项：归因于FL的症状；威胁性终末器官功能、继发于淋巴瘤的血细胞减少症、或巨块病；脾肿大；并且在之前的六个月或更长时间内疾病进展稳定。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是两种先前疗法线。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述两种先前疗法线中的另一种选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂(PI3Ki)，任选地其中所述PI3Ki是艾拉利司、考泮利司或度维利司。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成先前疗法线的12个月内对治疗难治或已经复发，任选地其中先前疗法线是组合疗法或包含PI3Ki的单一疗法。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述受试者在HSCT后已经复发。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种先前疗法线是三种先前疗法线。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述三种先前疗法线中的另两种各自独立地选自用以下的治疗：利妥昔单抗；奥比妥珠单抗；苯达莫司汀加利妥昔单抗(BR)；苯达莫司汀加奥比妥珠单抗(BO)；R-CHOP；利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松(R-CVP)；HSCT(任选地自体或同种异体HSCT)；来那度胺与利妥昔单抗组合；或PI3K抑制剂(PI3Ki)，任选地其中所述PI3Ki是艾拉利司、考泮利司或度维利司。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述受试者对用抗CD20抗体治疗难治。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述受试者对包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线难治。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成用抗CD20抗体治疗的六个月内复发。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述受试者在完成包括抗CD20抗体和烷基化剂的先前疗法线的六个月内复发。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述受试者在两种或更多种疗法线后的抗CD20抗体维持疗法期间或完成所述抗CD20抗体维持疗法后的六个月内已经复发。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述受试者具有至少一个PET阳性病灶和至少一个可测量的结节病灶或结节外病灶，任选地其中所述可测量的结节病灶在长轴线上大于1.5cm而不论短轴线如何，并且可测量的结节外病灶在长轴线和短轴线上大于1.0cm。
20.一种治疗边缘区淋巴瘤(MZL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者施用一定剂量的CD4+和CD8+T细胞，其中所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)，其中：
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述施用包括施用多种单独组合物，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述MZL是选自以下的亚型：结节外MZL(ENMZL，主要是胃)、脾MZL(SMZL)和结节MZL(NMZL)。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗所述MZL的组合全身疗法或者是造血干细胞移植(HSCT)。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是用于治疗所述MZL的组合全身疗法，并且所述组合全身疗法选自利妥昔单抗加环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)、或用抗CD20抗体和烷基化剂的疗法。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述至少两种先前疗法线中的至少一种是组合全身疗法，所述组合全身疗法是抗CD20抗体和烷基化剂。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脾MZL(SMZL)并且所述至少两种先前疗法线中的至少一种是脾切除术。
26.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有结节外MZL(ENMZL)，并且抗生素不是所述至少两种先前疗法线中的一种。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述受试者患有非嗜PET疾病，所述疾病具有在长轴线上大于2.0cm的至少一个可测量的结节病灶或至少一个可测量的结节外病灶。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有3B级FL(FL3B)。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述受试者没有复合型DLBCL和FL的迹象，或转化的FL(tFL)的迹象。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述受试者未患有十二指肠型FL的世界卫生组织(WHO)子分类。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述受试者对至少一种先前疗法线已经复发，并且复发是在对所述至少一种先前疗法线完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应后。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述受试者对至少一种先前疗法线难治，并且难治性治疗是对所述至少一种先前疗法线的疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述受试者的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是单克隆抗CD20抗体。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述烷基化剂是苯达莫司汀或苯丁酸氮芥。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前，向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约7天内完成的。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法的施用是在开始施用CD4+和CD8+T细胞的所述剂量之前约2至7天内完成的。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。
42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天以为或约200-400mg/m2，任选地为或约300mg/m2并包含端值施用环磷酰胺，和/或以为或约20-40mg/m2，任选地30mg/m2施用氟达拉滨，持续2-4天，任选地持续3天。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括每天并行施用为或约300mg/m2的环磷酰胺和为或约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中CD19是人CD19。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)包含：含有抗体FMC63的可变重链区和可变轻链区的scFv、15个或更少的氨基酸的间隔子，并且含有免疫球蛋白铰链区或其修饰形式、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域和为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式包含式X1PPX2P，其中X1是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X2是半胱氨酸或苏氨酸(SEQ ID NO:58)。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式是IgG1铰链或其修饰形式。
48.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中所述免疫球蛋白铰链区或其修饰形式是IgG4铰链或其修饰形式。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述间隔子由以下组成：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的序列，或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQID NO:34所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。
51.根据权利要求45-50中任一项所述的方法，其中所述间隔子的长度为或为约12个氨基酸。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的方法，其中所述间隔子包含SEQ ID NO:1所示的序列。
53.根据权利要求45-52中任一项所述的方法，其中所述间隔子由SEQ ID NO:1所示的序列组成。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12所示的序列或是它的与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
57.根据权利要求45-56中任一项所述的方法，其中所述CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的序列，或是它的与SEQ ID NO:13、14或15所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
58.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中所述scFv包含SEQ ID NO:35的CDRL1序列、SEQ ID NO:55的CDRL2序列和SEQ ID NO:56的CDRL3序列；以及SEQ ID NO:38的CDRH1序列、SEQ ID NO:39的CDRH2序列和SEQ ID NO:54的CDRH3序列。
59.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ IDNO:35)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的CDRL2序列和GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的CDRL3序列；以及DYGVS(SEQ ID NO:38)的CDRH1序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的CDRH2序列和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的CDRH3序列。
60.根据权利要求45-59中任一项所述的方法，其中所述scFv以从N末端至C末端的顺序包含含有SEQ ID NO:42所示的序列的VL和含有SEQ ID NO:41所示的序列的VH。
61.根据权利要求45-60中任一项所述的方法，其中所述scFv包含SEQ ID NO:43所示的序列。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述CAR以从N末端至C末端的顺序含有：为SEQ ID NO:43所示的scFv的细胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:1所示的间隔子、SEQID NO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域、和SEQ IDNO:13所示的CD3-ζ(CD3ζ)链的信号传导结构域。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是在约5x107个CAR+T细胞与约1.1x108个CAR+T细胞之间，包含每个端值。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是5x107个CAR+T细胞。
65.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中CD4+和CD8+T细胞的所述剂量是1x108个CAR+T细胞。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中：
将所述第一组合物和所述第二组合物相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时施用，或者其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用是在同一天、相隔约0与约12小时之间、相隔约0与约6小时之间或相隔约0与2小时之间进行的；和/或
所述第一组合物的施用的开始和所述第二组合物的施用的开始是相隔约1分钟与约1小时之间或相隔约5分钟与约30分钟之间进行的。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟施用。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物相隔少于2小时施用。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中将包含所述CD8+CAR表达T细胞的所述第一组合物在包含所述CD4+CAR表达T细胞的所述第二组合物之前施用。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中将CD4+T细胞和CD8+T细胞的所述剂量静脉内施用。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述T细胞是获自来自所述受试者的样品的原代T细胞，任选地其中所述样品是全血样品、单采术样品或白细胞单采术样品。
72.根据权利要求71所述的方法，其中在向所述受试者施用所述淋巴细胞清除疗法之前，从所述受试者获得所述样品。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中根据所述方法治疗的多名受试者中的完全反应率(CRR)大于或大于约50％、大于或大于约60％、大于或大于约70％或大于或大于约80％。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述CRR是最佳总体反应(BOR)为多达24个月的完全反应(CR)的受试者的百分比。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述受试者患有1、2或3A级FL，并且所述CRR是通过PET-CT评估的。
78.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述受试者患有MZL，并且所述CRR是通过CT评估的。
79.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
80.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有为1、2或3A级复发性/难治性(r/r)滤泡性淋巴瘤(FL)的疾病的受试者的药剂中的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗1、2或3A级FL的至少一种先前疗法线后已经复发或对治疗难治，其中所述至少一种先前疗法线中的至少一种包括用抗CD20抗体和烷基化剂的治疗；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于作为多种单独组合物施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
81.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
82.一定剂量的CD4+和CD8+T细胞在制造用于治疗患有或怀疑患有复发性/难治性(r/r)边缘区淋巴瘤(MZL)的受试者的药剂中的用途，其中：
所述剂量的T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)；
所述受试者在用于治疗MZL的至少两种先前疗法线后已经复发或对治疗难治；
T细胞的所述剂量包含为或约5x107个CAR表达T细胞与为或约1.5x108个CAR表达T细胞之间，包含端值；
T细胞的所述剂量包含大约1:1比率的表达所述CAR的CD4+T细胞与表达所述CAR的CD8+T细胞；并且
所述剂量被配制用于多种单独组合物的施用，其中所述多种单独组合物包含含有所述CD8+CAR表达T细胞的第一组合物和含有所述CD4+CAR表达T细胞的第二组合物。
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